ES2891347T3 - Métodos para diagnosticar y evaluar la esteatohepatitis no alcohólica - Google Patents
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Abstract
Un método para el diagnóstico de esteatohepatitis no alcohólica (NASH) o para determinar la actividad, el estadio o la gravedad de NASH en un sujeto, que comprende el paso de medir el nivel en sangre, suero o plasma de: (i) macroglobulina alfa 2; (ii) hemoglobina glucosilada (HbA1c); (iii) propéptido N-terminal de colágeno tipo III; (iv) hsa-miR-34a-5p; y (v) hsa-miR-200a-3p.
Description
DESCRIPCIÓN
Métodos para diagnosticar y evaluar la esteatohepatitis no alcohólica
Campo de la invención
La invención se refiere a un método para el diagnóstico de esteatohepatitis no alcohólica (NASH), para determinar la actividad, el estadio o la gravedad de NASH o para clasificar a un sujeto como receptor potencial o no receptor de un tratamiento de NASH. También se refiere a un kit para implementar el método de la invención, y los compuestos para uso en un método para el tratamiento de NASH, donde el sujeto que se va a tratar es identificado, evaluado o clasificado de acuerdo con el método de la invención.
Antecedentes de la invención
La esteatohepatitis no alcohólica (NASH) es una enfermedad progresiva del hígado caracterizada histológicamente por acumulación de ácidos grasos, daño de los hepatocitos e inflamación que se asemeja a la hepatitis alcohólica. NASH es una etapa crítica en el proceso que se extiende desde la esteatosis hepática hasta la cirrosis y la insuficiencia hepática. Una historia cuidadosa de la falta de una ingesta significativa de alcohol es esencial para establecer este diagnóstico. NASH es una de las causas más comunes de aminotransferasas elevadas en pacientes remitidos para evaluación a hepatólogos. La obesidad y la diabetes tipo 2 están asociadas con NASH. Dado que la prevalencia de estas enfermedades está aumentando, también se espera que aumente la prevalencia de NASH y, por lo tanto, esta enfermedad se está convirtiendo en un problema público emergente en los Estados Unidos, así como en otros países.
Aunque se han realizado varios intentos para proponer métodos no invasivos para diagnosticar y determinar la actividad, el estadio o la gravedad de la NASH, a día de hoy, el análisis histológico de las biopsias hepáticas sigue siendo el enfoque óptimo para diferenciar la NASH de la esteatosis en etapa temprana. La esteatosis, la inflamación lobulillar y portal, la lesión de los hepatocitos en forma de globo y apoptosis y la fibrosis son características de NASH evaluadas a partir de la biopsia. Sin embargo, la biopsia de hígado tiene varios inconvenientes obvios. Primero, el material recolectado en la biopsia hepática representa solo una parte muy pequeña del hígado del sujeto diagnosticado, lo que genera dudas sobre si la muestra recolectada es representativa del estado global del órgano del sujeto. Además, la biopsia hepática es un procedimiento muy invasivo que puede resultar engorroso, preocupante y doloroso para el paciente, y que genera preocupaciones sobre la morbilidad y la mortalidad. Por último, en vista de lo anterior, la biopsia hepática no puede proponerse razonablemente como un procedimiento de rutina para determinar si una persona de la población general, o incluso pacientes en riesgo de NASH, padece NASH y/o para determinar la actividad, el estadio, o la gravedad de la NASH en dicha persona. El documento WO2013/068348 se refiere a oligómeros de LNA para mejorar la función hepática.
Por lo tanto, existe una fuerte necesidad de proporcionar medios precisos, no invasivos para diagnosticar y determinar la actividad, el estadio o la gravedad de NASH en un sujeto.
Sumario de la invención
La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas.
La presente invención se basa en un análisis muy fino y completo de una gran cantidad de variables determinadas a partir de más de 300 muestras de alta calidad obtenidas de pacientes con NASH durante un ensayo clínico realizado por el Solicitante (estudio GFT505-212-7 - NCT01694849), que incluye datos histológicos obtenidos de biopsias hepáticas de los pacientes. Este estudio condujo al descubrimiento de factores circulantes clave (o biomarcadores) indicativos de NASH y de su gravedad o etapa o actividad.
En consecuencia, un primer aspecto de la invención se refiere a un método para el diagnóstico de esteatohepatitis no alcohólica (NASH) o para determinar la actividad, el estadio o la gravedad de NASH en un sujeto, que comprende la medida del nivel de al menos un marcador de micro-ARN circulante en sangre, suero o plasma de NASH y al menos otro marcador circulante en sangre, suero o plasma de daño hepático.
Preferiblemente, este primer aspecto de la presente divulgación se refiere a un método para el diagnóstico de esteatohepatitis no alcohólica (NASH) o para determinar la actividad, el estadio o la gravedad de NASH en un sujeto, que comprende el paso de medir el nivel de al menos un marcador seleccionado del grupo (i), (ii) o (iii), y al menos un marcador seleccionado del grupo (iv) o (v) definido como sigue:
(i) macroglobulina alfa 2
(ii) hemoglobina glucosilada (HbAlc), nivel de glucosa en ayunas, nivel de fructosamina
(iii) Propéptido N-terminal de colágeno tipo III
(iv) hsa-miR-34 (en particular hsa-miR-34a, más particularmente hsa-miR-34a-5p), hsa-miR-122 (en particular hsamiR-122-5p) y hsa-miR-192 (en particular hsa-miR-192-5p)
(v) hsa-miR-200 (en particular hsa-miR-200a, más particularmente hsa-miR-200a-3p).
En un aspecto particular, el método comprende la implementación de las siguientes medidas a partir de una muestra en sangre, suero o plasma de dicho sujeto:
(i) determinar el nivel de macroglobulina alfa 2;
(ii) determinar el nivel de al menos un marcador seleccionado en el grupo que consiste en HbA1 c, nivel de glucosa en ayunas, nivel de fructosamina;
(iii) determinar el nivel de propéptido N-terminal del colágeno tipo III;
(iv) determinar el nivel de al menos un marcador seleccionado en el grupo que consiste en hsa-miR-34, hsa-miR-122 y hsa-miR-192; y
(v) determinar el nivel de hsa-miR-200;
en el que un aumento de dichos niveles en relación con el de una muestra de control es indicativo de NASH y/o de la actividad, el estadio o la gravedad de NASH.
En un aspecto adicional de la divulgación:
• la medición (ii) comprende determinar el nivel de al menos HbA1c; y/o
• La medición (iv) comp rende determinar el nivel de al menos hsa-miR-34.
En otro aspecto, el método del primer aspecto comprende determinar el nivel de macroglobulina alfa 2, HbA1c, propéptido N-terminal de colágeno tipo III, hsa-miR-34 y hsa-miR-200.
En aún otro aspecto, se calcula una puntuación de NASH a partir de los niveles determinados en las medidas (i) a (v) y en los que se diagnostica NASH y/o se determina la etapa o actividad o gravedad de NASH sobre la base de dicha puntuación de NASH.
En otro aspecto, la puntuación de NASH se calcula de acuerdo con la siguiente función logística:
eY
S “ 1 eY
en la que
Y=k+a*A+b*B+c*C+d*D+f!sF
en la que
S es la puntuación de NASH;
A es el nivel de macroglobulina alfa 2 en g/L;
B es el nivel de HbA1c en porcentaje;
C es el nivel de propéptido N-terminal de colágeno tipo III en ng/mL;
D es el nivel de hsa-miR-34 en Cq;
F es el nivel de hsa-miR-200 en Cq;
k es un número comprendido entre 5.26 y 36.76;
a es un número comprendido entre 0.11 y 1.07;
b es un número comprendido entre 0 y 1.02;
c es un número comprendido entre 0 y 0.23;
d es un número comprendido entre -0.77 y 0;
f es un número comprendido entre -0.78 y 0.
En una variante específica de esta realización:
k es un número comprendido entre 5.26 y 36.76;
a es un número comprendido entre 0.11 y 1.07;
b es un número comprendido entre 0.001 y 1.02;
c es un número comprendido entre 0.001 y 0.23;
d es un número comprendido entre -0.77 y -0.001;
f es un número comprendido entre -0.78 y -0.04.
En un aspecto adicional, una puntuación de NASH superior a un valor umbral comprendido entre 0.102 y 0.6465 es indicativo de una NASH grave o de una actividad de NASH moderada o alta.
En una variante de esta realización:
k es igual a 25.13;
a es igual a 0.60;
b es igual a 0.48;
c es igual a 0.1;
d es igual a -0.43; y
f es igual a -0.45;
y en el que el valor umbral está comprendido entre 0.102 y 0.462, y es más particularmente igual a 0.23.
En una variante alternativa de esta realización:
k es igual a 21.35;
a es igual a 0.62;
b es igual a 0.55;
c es igual a 0.14;
d es igual a -0.38; y
f es igual a -0.39;
y en la que el valor umbral está comprendido entre 0.2319 y 0.6465, y es más particularmente igual a 0.4343
Un segundo aspecto de la presente divulgación se refiere a un método para clasificar a un sujeto como receptor o no receptor de un tratamiento para la esteatohepatitis no alcohólica (NASH), que comprende la medida del nivel de al menos un marcador de micro-ARN circulante en sangre, suero o plasma de NASH y al menos otro marcador de daño hepático circulante en sangre, suero o plasma.
Preferiblemente, este segundo aspecto se refiere a un método para clasificar a un sujeto como receptor o no receptor de un tratamiento para la esteatohepatitis no alcohólica (NASH), que comprende el paso de medir el nivel de al menos un marcador seleccionado de cualquier grupo (i), (ii) o (iii), y al menos un marcador seleccionado del grupo (iv) o (v) definido como sigue:
(i) macroglobulina alfa 2
(ii) hemoglobina glucosilada (HbA1c), nivel de glucosa en ayunas, nivel de fructosamina
(iii) Propéptido N-terminal de colágeno tipo III
(iv) hsa-miR-34 (en particular hsa-miR-34a, más particularmente hsa-miR-34a-5p), hsa-miR-122 (en particular hsamiR-122-5p) y hsa-miR-192 (en particular hsa-miR-192-5p)
(v) hsa-miR-200 (en particular hsa-miR-200a, más particularmente hsa-miR-200a-3p).
En un aspecto particular de la divulgación, el método comprende la implementación de las siguientes medidas a partir de una muestra en sangre, suero o plasma de dicho sujeto:
(i) determinar el nivel de macroglobulina alfa 2;
(ii) determinar el nivel de al menos un marcador seleccionado en el grupo que consiste en HbA1 c, nivel de glucosa en ayunas, nivel de fructosamina;
(iii) determinar el nivel de propéptido N-terminal del colágeno tipo III;
(iv) determinar el nivel de al menos un marcador seleccionado en el grupo que consiste en hsa-miR-34 (en particular hsa-miR-34a, más particularmente hsa-miR-34a-5p), hsa-miR-122 (en particular hsa-miR-122-5p) y hsa-miR-192 (en particular hsa-miR-192-5p); y
(v) determinar el nivel de hsa-miR-200 (en particular hsa-miR-200a, más particularmente hsa-miR-200a-3p); en el que se calcula una puntuación de NASH a partir de los niveles determinados en las medidas (i) a (v) y en el que el sujeto se clasifica como receptor o no receptor del tratamiento para NASH basándose en dicha puntuación.
En un aspecto adicional:
• la medición (ii) comprende determinar el nivel de al menos HbA1c; y/o
• la medición (iv) comprende determinar el nivel de al menos hsa-miR-34 (en particular hsa-miR-34a, más particularmente hsa-miR-34a-5p).
En otro aspecto, el método comprende determinar el nivel de macroglobulina alfa 2, HbA1c, propéptido N-terminal de colágeno tipo III, hsa-miR-34 (en particular hsa-miR-34a, más particularmente hsa-miR-34a- 5p) y hsa-miR-200 (en particular hsa-miR-200a, más particularmente hsa-miR-200a-3p).
En aún otro aspecto, la puntuación de NASH se calcula de acuerdo con la siguiente función logística:
en la que
Y=k+a*A+b*B+c*C+d*D+f!:F
en la que
S es la puntuación de NASH;
A es el nivel de macroglobulina alfa 2 en g/L;
B es el nivel de HbA1c en porcentaje;
C es el nivel de propéptido N-terminal de colágeno tipo III en ng/mL;
D es el nivel de hsa-miR-34 en Cq;
F es el nivel de hsa-miR-200 en Cq;
k es un número comprendido entre 5.26 y 36.76;
a es un número comprendido entre 0.11 y 1.07;
b es un número comprendido entre 0 y 1.02;
c es un número comprendido entre 0 y 0.23;
d es un número comprendido entre -0.77 y 0;
f es un número comprendido entre -0.78 y 0.
En una variante de esta realización:
k es un número comprendido entre 5.26 y 36.76;
a es un número comprendido entre 0.11 y 1.07;
b es un número comprendido entre 0.001 y 1.02;
c es un número comprendido entre 0.001 y 0.23;
d es un número comprendido entre -0.77 y -0.001;
f es un número comprendido entre -0.78 y -0.04.
En aún otro aspecto, el sujeto se clasifica como receptor del tratamiento si S es superior a un valor umbral comprendido entre 0.102 y 0.6465.
En una variante de esta realización:
k es igual a 25.13;
a es igual a 0.6;
b es igual a 0.48;
c es igual a 0.1;
d es igual a -0.43; y
f es igual a -0.45;
y en la que el valor umbral está comprendido entre 0.102 y 0.462, y es más particularmente igual a 0.23.
En una variante alternativa de este aspecto:
k es igual a 21.35;
a es igual a 0.62;
b es igual a 0.55;
c es igual a 0.14;
d es igual a -0.38; y
f es igual a -0.39;
y en la que el valor umbral está comprendido entre 0.2319 y 0.6465, y es más particularmente igual a 0.4343.
Un tercer aspecto de la presente divulgación se refiere a un método para calcular un puntaje de NASH que es indicativo de esteatohepatitis no alcohólica (NASH), o de la actividad, el estadio o la gravedad de NASH en un sujeto, en el que dicho puntaje se basa en la medida de al menos un marcador seleccionado del grupo (i), (ii) o (iii), y al menos un marcador seleccionado del grupo (iv) o (v) definido como sigue:
(i) macroglobulina alfa 2
(ii) hemoglobina glucosilada (HbAlc), nivel de glucosa en ayunas, nivel de fructosamina
(iii) Propéptido N-terminal de colágeno tipo III
(iv) hsa-miR-34 (en particular hsa-miR-34a, más particularmente hsa-miR-34a-5p), hsa-miR-122 (en particular hsamiR-122-5p) y hsa-miR-192 (en particular hsa-miR-192-5p)
(v) hsa-miR-200 (en particular hsa-miR-200a, más particularmente hsa-miR-200a-3p).
En un aspecto, las siguientes medidas (i) av) se determinan a partir de una muestra en sangre, suero o plasma de dicho sujeto:
(i) el nivel de macroglobulina alfa 2;
(ii) el nivel de al menos un marcador seleccionado en el grupo que consiste en HbA1c, nivel de glucosa en ayunas, nivel de fructosamina;
(iii) el nivel de propéptido N-terminal del colágeno tipo III;
(iv) el nivel de al menos un marcador seleccionado en el grupo que consiste en hsa-miR-34 (en particular hsa-miR-34a, más particularmente hsa-miR-34a-5p), hsa-miR-122 (en particular hsa -miR-122-5p) y hsa-miR-192 (en particular hsa-miR-192-5p); y
(v) el nivel de hsa-miR-200 (en particular hsa-miR-200a, más particularmente hsa-miR-200a-3p).
En un aspecto particular, el método comprende determinar el nivel de macroglobulina alfa 2, HbA1c, propéptido N-terminal de colágeno tipo III, hsa-miR-34 (en particular hsa-miR-34a, más particularmente hsa-miR-34a -5p) y hsa
miR-200 (en particular hsa-miR-200a, más particularmente hsa-miR-200a-3p), en el que la puntuación de NASH se calcula de acuerdo con la siguiente función logística:
en la que
Y=k+a*A+b*B+c*C+d*D+f!:F
en la que
S es la puntuación de NASH;
A es el nivel de macroglobulina alfa 2 en g/L;
B es el nivel de HbAlc en porcentaje;
C es el nivel de propéptido N-terminal de colágeno tipo III en ng/mL;
D es el nivel de hsa-miR-34 en Cq;
F es el nivel de hsa-miR-200 en Cq;
k es un número comprendido entre 5.26 y 36.76;
a es un número comprendido entre 0.11 y 1.07;
b es un número comprendido entre 0 y 1.02;
c es un número comprendido entre 0 y 0.23;
d es un número comprendido entre -0.77 y 0;
f es un número comprendido entre -0.78 y 0.
En una variante específica de esta realización:
k es un número comprendido entre 5.26 y 36.76;
a es un número comprendido entre 0.11 y 1.07;
b es un número comprendido entre 0.001 y 1.02;
c es un número comprendido entre 0.001 y 0.23;
d es un número comprendido entre -0.77 y -0.001;
f es un número comprendido entre -0.78 y -0.04.
En otra variante específica de esta realización:
k es igual a 25.13;
a es igual a 0.6;
b es igual a 0.48;
c es igual a 0.1;
d es igual a -0.43; y
f es igual a -0.45.
En aún otra variante específica de esta realización:
k es igual a 21.35;
a es igual a 0.62;
b es igual a 0.55;
c es igual a 0.14;
d es igual a -0.38; y
f es igual a -0.39.
En un cuarto aspecto, la presente divulgación se refiere a un kit que comprende medios para determinar el nivel de: (i) macroglobulina alfa 2;
(ii) al menos un marcador seleccionado en el grupo que consiste en HbA1c, nivel de glucosa en ayunas, nivel de fructosamina;
(iii) propéptido N-terminal de colágeno tipo III;
(iv) al menos un marcador seleccionado en el grupo que consiste en has-miR-34 (en particular hsa-miR-34a, más particularmente hsa-miR-34a-5p), hsa-miR-122 (en particular hsa-miR- 122-5p) y hsa-miR-192 (en particular hsa-miR-192-5p); y
(v) hsa-miR-200 (en particular hsa-miR-200a, más particularmente hsa-miR-200a-3p).
En una realización, el kit del cuarto aspecto comprende medios para determinar el nivel de macroglobulina alfa 2, HbA1c, propéptido N-terminal de colágeno tipo III, hsa-miR-34 (en particular hsa-miR-34a, más particularmente hsamiR-34a-5p) y hsa-miR-200 (en particular hsa-miR-200a, más particularmente hsa-miR-200a-3p).
En un quinto aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para tratar la esteatohepatitis no alcohólica (NASH) en un sujeto, que comprende:
(a) diagnosticar NASH o determinar la actividad, el estadio o la gravedad de NASH en un sujeto de acuerdo con el método descrito anteriormente;
(b) administrar un tratamiento para NASH a dicho sujeto con base en el paso (a).
En un sexto aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para tratar la esteatohepatitis no alcohólica (NASH) en un sujeto, que comprende:
(a) clasificar dicho sujeto de acuerdo con el método descrito anteriormente;
(b) administrar un tratamiento para NASH al sujeto si dicho sujeto está clasificado como receptor del tratamiento de acuerdo con el paso (a).
En un aspecto adicional, el tratamiento comprende administrar al sujeto un compuesto de fórmula (I):
en la que
X1 representa un halógeno, un grupo R1 o G1-R1;
A representa un grupo CH = CH o CH2-CH2;
X2 representa un grupo G2-R2;
G1 y G2, idénticos o diferentes, representan un átomo de oxígeno o azufre;
R1 representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo no sustituido, un grupo arilo o un grupo alquilo que está sustituido con uno o más átomos de halógeno, un grupo alcoxi o alquiltio, grupos cicloalquilo, grupos cicloalquiltio o grupos heterocíclicos;
R2 representa un grupo alquilo sustituido con al menos un grupo -COOR3, en el que R3 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que está sustituido o no con uno o más átomos de halógeno, grupos cicloalquilo o grupos heterocíclicos.
R4 y R5, idénticos o diferentes, que representan un grupo alquilo sustituido o no con uno o más átomos de halógeno, grupos cicloalquilo, grupos heterocíclicos;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otro aspecto, el compuesto se selecciona en el grupo que consiste en 1-[4-metiltiofenil]-3-[3,5-dimetil-4-carboxidimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1-ona, 1-[4-metiltiofenil]-3-[3,5-dimetil-4-isopropiloxi carbonildimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1 -ona, 1 -[4-metiltiofenil]-3-[3,5-dimetil-4-tertbutiloxicarbonildimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1-ona, 1-[4-trifluorometilfenil]-3-[3,5-dimetil-4-tertbutiloxicarbonil dimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1 -ona, 1 -[4-trifluorometilfenil]-3-[3,5-dimetil-4-carboxidimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1 -ona, 1 -[4-trifluorometil oxifenil]-3-[3,5-dimetil-4-tertbutiloxicarbonildimetilmetiloxi fenil]prop-2-en-1-ona, 1-[4-trifluorometiloxifenil]-3-[3,5-dimetil-4-carboxidimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1-ona, ácido 2-[2,6-d¡met¡l-4-[3-[4-(metiltio)fenil]-3-oxo-propil]fenoxi]-2-metilpropanoico, e isopropil éster del ácido 2-[2,6-dimetil-4-[3-[4-(metiltio) fenil]-3-oxo-propil]fenoxi]-2-metil-propanoico; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo .
En otro aspecto, el compuesto es 1-[4-metiltiofenil]-3-[3,5-dimetil-4-carboxidimetilmetiloxi fenil]prop-2-en-1-ona o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo .
En otro aspecto particular, el tratamiento comprende administrar al sujeto un compuesto de la Tabla 1 como se muestra a continuación.
Otros aspectos y realizaciones resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada.
Leyendas de las figuras
Las Figuras 1a a 1g muestran la comparación de la puntuación de NASH de acuerdo con el método de la invención derivada del modelo de remuestreo con base estadística (Figura 1a) con las puntuaciones existentes.
Descripción detallada de la invención
La invención se refiere a un método para el diagnóstico de esteatohepatitis no alcohólica (NASH) o para determinar la actividad, el estadio o la gravedad de NASH en un sujeto. También se relaciona con un método para clasificar a un sujeto como receptor o no receptor de un tratamiento para la esteatohepatitis no alcohólica (NASH). Esta clasificación también puede ser la base para determinar adicionalmente si un sujeto debe someterse a una confirmación adicional de NASH mediante métodos conocidos en la técnica, tales como someterse a una biopsia de hígado.
La invención surge de la identificación de un conjunto definido de marcadores circulantes que, cuando se consideran colectivamente, son indicativos de NASH y/o de la actividad, etapa o gravedad de NASH en el sujeto sometido a prueba de NASH o de su gravedad o estadio o actividad. La invención se refiere en particular a un método para el diagnóstico de esteatohepatitis no alcohólica (NASH) o para determinar la actividad, el estadio o la gravedad de NASH en un sujeto, combinando la determinación del nivel de micro-ARN circulante(s) (miARN(s)) y otros marcadores circulantes de daño hepático.
Además, los datos recopilados por los inventores se procesaron de acuerdo con dos enfoques bioestadísticos diferentes que conducen a la determinación de una puntuación que es indicativa de la enfermedad y/o su gravedad o etapa o actividad, proporcionando así una herramienta poderosa, precisa y altamente predictiva para el médico para determinar fácilmente si un sujeto sufre de NASH, o para determinar el estadio o la actividad o la gravedad de la enfermedad. Esta puntuación, también denominada "puntuación de NASH" en la siguiente descripción, es una herramienta invaluable tanto para el médico como para los sujetos que la necesitan, ya que permite el diagnóstico o la determinación de la gravedad o etapa o actividad de NASH utilizando un procedimiento no invasivo, es decir, sin depender de la biopsia hepática.
Los métodos de la presente divulgación comprenden la medida de al menos un marcador que es un marcador de micro-ARN y al menos otro marcador circulante de daño hepático. Los métodos de la invención comprenden más particularmente la medida del nivel de al menos un marcador seleccionado de los grupos (i), (ii) y (iii), y al menos un marcador seleccionado de los grupos (iv) y (v) siguientes.
En una realización particular, los métodos comprenden la medición del nivel de:
• al menos un marcador seleccionado en los grupos (i), (ii) y (iii) y al menos un marcador de cada grupo (iv) y (v);
• al menos un marcador seleccionado de cada grupo (i) y (ii) o (ii) y (iii) o (i) y (iii), y al menos un marcador seleccionado de los grupos (iv) y (v);
• al menos un marcador seleccionado de cada grupo (i), (ii) y (iii) y al menos un marcador seleccionado de los grupos (iv) y (v);
• al menos un marcador en cada grupo de marcadores (i), (ii), (iii), (iv) y (v) a continuación, es decir:
o el marcador enumerado en (i); y
o al menos un marcador enumerado en (ii); y
o el marcador enumerado en (iii); y
o al menos un marcador enumerado en (iv);
o el marcador enumerado en (v).
Los grupos de marcadores se definen de la siguiente manera:
(i) macroglobulina alfa 2
(ii) hemoglobina glucosilada (HbA1c), nivel de glucosa en ayunas, nivel de fructosamina
(iii) Propéptido N-terminal de colágeno tipo III
(iv) hsa-miR-34 (en particular hsa-miR-34a, más particularmente hsa-miR-34a-5p), hsa-miR-122 (en particular hsamiR-122-5p) y hsa-miR-192 (en particular hsa-miR-192-5p)
(v) hsa-miR-200 (en particular hsa-miR-200a, más particularmente hsa-miR-200a-3p).
De acuerdo con la presente invención, "esteatohepatitis no alcohólica" o "NASH" se define como la presencia de esteatosis hepática, hinchazón de hepatocitos e inflamación hepática. Según esta definición básica de la enfermedad, NASH puede incluir además fibrosis hepática.
De acuerdo con la presente invención, el sujeto es un mamífero, en particular un sujeto humano. La invención, gracias a su naturaleza no invasiva, se puede implementar en cualquier sujeto, tal como un sujeto sin predisposición conocida o sospechada a la NASH. Sin embargo, en una realización particular, el sujeto es un sujeto en riesgo de tener NASH o de desarrollar NASH en el futuro, tal como un sujeto que tiene obesidad, diabetes, que padece síndrome metabólico o que tiene enzimas hepáticas elevadas, o que previamente estaba diagnosticado con enfermedad del hígado graso no alcohólico (o esteatosis hepática). El sujeto también puede ser un sujeto con NASH ya identificado, permitiendo así que el método de la invención determine los riesgos de evolución de la enfermedad hacia un hepatocarcinoma o trasplante de hígado o una enfermedad cardiovascular.
Los niveles de los marcadores medidos se determinan a partir de un fluido corporal del sujeto, que puede ser en particular una muestra en sangre, más particularmente en suero o plasma.
El nivel de los marcadores identificados por los inventores puede determinarse mediante métodos convencionales bien conocidos en la técnica, tal como inmunoensayos (por ejemplo, ELISA), o ensayos moleculares y bioquímicos (PCR cuantitativa, ensayos colorimétricos) o métodos analíticos (tal como espectrometría de masas)), dependiendo del tipo de biomarcador (tal como una proteína, un micro-ARN, nivel de glucosa,...). Cuando el marcador probado es un micro-ARN, su medición puede llevarse a cabo de acuerdo con varios métodos bien conocidos en la técnica, tal como el que se presenta en los ejemplos siguientes. En resumen, las medidas se llevan a cabo a partir de ARN total extraído de una muestra en plasma, en particular una muestra en plasma libre de plaquetas y libre de células. Se puede agregar un control interno apropiado (tal como un micro-ARN de secuencia y cantidad conocidas, por ejemplo, C. elegans miR-39) a la muestra antes de la extracción del ARN. Los valores de Cq se determinan utilizando PCR cuantitativa. Hay kits comerciales disponibles para realizar tales ensayos. Por ejemplo, el ensayo Taqman miRNA qRT-PCR: Taqman MicroRNA Reverse transcription Kit, TaqMan MicroRNA Assay 20X y TaqMan Universal Master Mix II (Applied Biosystems) se pueden utilizar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La transcripción reversa se puede realizar utilizando sistemas de PCR fácilmente disponibles, tales como el termociclador GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems), con parámetros de ciclización apropiados tal como 16 °C durante 30 minutos seguido de 42 °C durante 30 minutos y 85 °C durante 5 minutos antes de mantener a 4 °C. La transcripción reversa se puede implementar en formato multiplexado. A continuación, la PCT cuantitativa se lleva a cabo utilizando un sistema de PCR cuantitativo tal como el CFX96™ Real-Time System (C1000 Touch™ Thermal Cycler, BioRad). Las condiciones de ciclización pueden ser las siguientes: 95 °C durante 10 minutos seguido de 95 °C durante 15 segundos y 60 °C durante 60 segundos para un total de 50 ciclos y 30 °C durante 30 segundos. El modo de determinación de Cq puede establecerse en Regresión en el sistema de PCR cuantitativa. En una realización particular, el valor de Cq determinado de acuerdo con el método de la invención es el valor de Cq que se puede obtener usando los parámetros y el material específicos anteriores. Los valores de Cq de las muestras pueden excluirse del análisis si los valores están por encima de la Cq máxima de la curva estándar de cada miARN. La curva estándar se puede utilizar para evaluar la eficacia de la reacción. Se puede realizar una dilución en serie en ocho puntos a partir de la muestra de ADNc más concentrada, para garantizar que la curva estándar cubra todas las concentraciones de plantilla potenciales que se pueden encontrar durante el estudio. La curva estándar se puede construir trazando el logaritmo de la cantidad inicial de la plantilla frente a los valores de Cq obtenidos.
De acuerdo con la presente divulgación, a un sujeto se le diagnostica NASH, o se le diagnostica potencialmente NASH o probabilidad de tener NASH, cuando todos los niveles de marcadores seleccionados y medidos en cada grupo (i) a
(v) aumentan en comparación a valores de referencia obtenidos de una muestra de control (o de referencia). La muestra de referencia puede corresponder a una muestra de fluido corporal, tal como una muestra en sangre, suero o plasma obtenida de uno o más sujetos, tal como dos o más, que no tienen NAFLD o NASH.
En la presente divulgación, los niveles de biomarcadores medidos como se describió anteriormente también pueden usarse para determinar una puntuación de enfermedad, también denominada puntuación de NASH. La puntuación de la enfermedad puede compararse con un valor umbral que distingue entre actividad de NASH baja, moderada y alta, o NASH moderada y grave. De acuerdo con la presente invención, esta información puede usarse ventajosamente para determinar si un sujeto recibirá o no un tratamiento terapéutico para NASH. Solo se tratarán aquellos sujetos con una actividad de NASH de moderada a alta o con NASH grave. En consecuencia, la presente invención se refiere a un método para clasificar a un sujeto como receptor o no receptor de un tratamiento para la esteatohepatitis no alcohólica (NASH), comprendiendo dicho método la determinación de los niveles de los marcadores como se definió anteriormente, el cálculo de una puntuación de NASH, y la clasificación del sujeto como receptor o no receptor del tratamiento con base en dicha puntuación de NASH. Además, la clasificación del sujeto también puede usarse para determinar una actividad de NASH baja o una NASH moderada en el sujeto, y proporcionar al sujeto recomendaciones de dieta y estilo de vida basadas en esta clasificación para revertir la NASH.
De acuerdo con la presente divulgación, los sujetos clasificados como de actividad de NASH moderada a alta, o como pacientes de NASH grave, se consideran receptores, o receptores potenciales, de un tratamiento para NASH. En el contexto de la presente invención, una actividad de NASH de moderada a alta o un paciente de Na Sh grave se define como, o equivalente a, un paciente que presenta los siguientes grados derivados de la biopsia hepática:
• grado de esteatosis > 1
• grado de hinchamiento de hepatocitos > 1
• grado de inflamación lobulillar > 1
• NAS (puntuación de actividad de NAFLD) > 4 (NAS se define como la suma del grado de esteatosis, el grado de hinchazón de los hepatocitos y el grado de inflamación lobulillar)
• estadio de fibrosis > 2 (tal como una fibrosis igual a 2, 3 o 4, en particular 2 o 3)
En un aspecto particular, la puntuación de NASH de la divulgación se calcula a partir de los siguientes niveles de marcadores medidos como se indica anteriormente:
• nivel de macroglobulina alfa 2 (LVBPA2M GL); y
• nivel de HbA1c (LBBC_HBA1 C_PERC); y
• nivel de propéptido N-terminal de colágeno tipo III (LVB_P3NP); y
• nivel de hsa-miR-34 (en particular miR-34a, más particularmente miR-34a-5p) (LVMK_HSA_MIR34A_MULTI1_CQ); y
• nivel de hsa-miR-200 (en particular hsa-miR-200a, más particularmente hsa-miR-200a-3p) (LVMK_HSA_MIR200A_MULTI1_CQ).
En una realización adicional particular, la puntuación se define como una función logística:
en la que
Y=k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F
en la que
S es la puntuación de NASH;
A es el nivel de macroglobulina alfa 2 en g/L;
B es el nivel de HbAlc en porcentaje (por ejemplo, B es igual a 10 si el porcentaje de HbAlc medido es 10 %);
C es el nivel de propéptido N-terminal del colágeno tipo III en ng/ml;
D es el nivel de hsa-miR-34 (en particular hsa-miR-34a, más particularmente hsa-miR-34a-5p) en Cq;
F es el nivel de hsa-miR-200 (en particular c hsa-miR-200a, más particularmente hsa-miR-200a-3p) en Cq;
k es un número comprendido entre 5.26 y 36.76;
a es un número comprendido entre 0.11 y 1.07;
b es un número comprendido entre 0 y 1.02;
c es un número comprendido entre 0 y 0.23;
d es un número comprendido entre -0.77 y 0;
f es un número comprendido entre -0.78 y 0.
En una realización particular adicional, la puntuación se calcula de acuerdo con la función logística anterior, en la que: k es un número comprendido entre 5.26 y 36.76;
a es un número comprendido entre 0.11 y 1.07;
b es un número comprendido entre 0.001 y 1.02;
c es un número comprendido entre 0.001 y 0.23;
d es un número comprendido entre -0.77 y -0.001;
f es un número comprendido entre -0.78 y -0.04.
Por lo tanto, la puntuación de NASH es la probabilidad de tener una actividad de NASH de moderada a alta o una NASH grave. Si S según se determina para un sujeto es mayor o igual a un valor umbral, el sujeto se clasifica como para ser tratado para NASH, o para ser potencialmente tratado para NASH. Si S es menor que un valor umbral, el sujeto se clasifica como para no ser tratado y/o el sujeto se clasifica como receptor, o receptor potencial, de consejos dietéticos y de estilo de vida para controlar su baja actividad de NASH o NASH moderada.
De acuerdo con una realización particular, el sujeto se clasifica como receptor, o receptor potencial, de un tratamiento si S es superior o igual a un valor umbral comprendido entre 0.102 y 0.6465.
En una realización particular, derivada del modelo mediano como se describe en la parte experimental de esta solicitud: k es igual a 25.13;
a es igual a 0.6;
b es igual a 0.48;
c es igual a 0.1;
d es igual a -0.43; y
f es igual a -0.45;
y en la que el valor umbral está comprendido entre 0.102 y 0.462, y es más particularmente igual a 0.23.
En una realización particular, derivada del modelo de remuestreo con base estadística como se describe en la parte experimental de esta solicitud:
k es igual a 21.35;
a es igual a 0.62;
b es igual a 0.55;
c es igual a 0.14;
d es igual a -0.38; y
f es igual a -0.39;
y en la que el valor umbral está comprendido entre 0.2319 y 0.6465, y es más particularmente igual a 0.4343.
La presente divulgación también se refiere a un kit que comprende medios para determinar el nivel de:
(i) macroglobulina alfa 2;
(ii) al menos un marcador seleccionado en el grupo que consiste en HbA1c, nivel de glucosa en ayunas, nivel de fructosamina;
(iii) propéptido N-terminal de colágeno tipo III;
(iv) al menos un marcador seleccionado en el grupo que consiste en hsa-miR-34 (en particular hsa-miR-34a, más particularmente miR-34a-5p), hsa-miR-122 (en particular hsa-miR-122- 5p) y hsa-miR-192 (en particular hsa-miR-192-5p); y
(v) hsa-miR-200 (en particular hsa-miR-200a, más particularmente hsa-miR-200a-3p).
En un aspecto particular, dicho kit comprende medios para determinar el nivel de macroglobulina alfa 2, HbA1c, propéptido N-terminal de colágeno tipo III, hsa-miR-34 (en particular hsa-miR-34a, más particularmente miR-34a -5p) y hsa-miR-200a (en particular hsa-miR-200a, más particularmente hsa-miR-200a-3p).
El kit de la divulgación es útil para implementar los métodos descritos anteriormente y puede incluir además opcionalmente instrucciones para implementar dichos métodos. El kit puede comprender reactivos y reguladores apropiados para realizar mediciones de los niveles de marcadores identificados anteriormente. En particular, el kit puede comprender anticuerpos específicos para una proteína a cuantificar y/o cebadores útiles para cuantificar los niveles de micro-ARN, como es bien conocido en la técnica.
La presente divulgación se refiere además a un método para tratar NASH en un sujeto, que comprende:
(a) diagnosticar NASH o determinar la actividad, el estadio o la gravedad de NASH en un sujeto de acuerdo con los métodos proporcionados anteriormente;
(b) administrar un tratamiento para NASH a dicho sujeto con base en el paso (a).
La presente divulgación se refiere además a un método para tratar NASH en un sujeto, que comprende:
(a) clasificar dicho sujeto de acuerdo con el método de clasificación como se define anteriormente;
(b) administrar un tratamiento para NASH al sujeto si dicho sujeto está clasificado como receptor del tratamiento de acuerdo con el paso (a).
La presente divulgación se refiere además a un método para gestionar la actividad de NASH baja, o NASH moderada en un sujeto, que comprende:
(a) clasificar dicho sujeto de acuerdo con el método de clasificación como se define anteriormente;
(b) proporcionar recomendaciones de dieta y estilo de vida al sujeto si dicho sujeto se clasifica como no receptor del tratamiento de acuerdo con el paso (a).
El método para tratar NASH de acuerdo con la presente divulgación comprende la administración de uno o más compuestos al sujeto que lo necesita, tal como un compuesto de fórmula (I):
en la que
X1 representa un halógeno, un grupo R1 o G1-R1;
A representa un grupo CH = CH o CH2-CH2;
X2 representa un grupo G2-R2;
G1 y G2, idénticos o diferentes, representan un átomo de oxígeno o azufre;
R1 representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo no sustituido, un grupo arilo o un grupo alquilo que está sustituido con uno o más átomos de halógeno, un grupo alcoxi o alquiltio, grupos cicloalquilo, grupos cicloalquiltio o grupos heterocíclicos;
R2 representa un grupo alquilo sustituido con al menos un grupo -COOR3, en el que R3 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que está sustituido o no con uno o más átomos de halógeno, grupos cicloalquilo o grupos heterocíclicos.
R4 y R5, idénticos o diferentes, que representan un grupo alquilo sustituido o no con uno o más átomos de halógeno, grupos cicloalquilo, grupos heterocíclicos;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En una realización particular de este método para el tratamiento de NASH, el compuesto de fórmula (I) se selecciona del grupo que consiste en 1-[4-metiltiofenil]-3-[3,5-dimetil-4-carboxidimetilmetiloxi fenil]prop-2-en-1-ona, 1-[4-metiltiofenil]-3-[3,5-dimetil-4-isopropiloxi carbonildimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1-ona, 1 -[4-metiltiofenil]-3-[3,5-dimetil-4-tertbutiloxicarbonildimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1 -ona, 1 -[4-trifluorometilfenil]-3-[3,5-dimetil-4-tertbutiloxicarbonil dimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1 -ona, 1 -[4-trifluorometilfenil]-3-[3,5-dimetil-4-carboxidimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1 -ona, 1 -[4-trifluorometil oxifenil]-3-[3,5-dimetil-4-tertbutiloxicarbonildimetilmetiloxi fenil]prop-2-en-1-ona, 1-[4-trifluorometiloxifenil]-3-[3,5-dimetil-4-carboxidimetilmetil oxifenil]prop-2-en-1 -ona, ácido 2-[2,6-dimetil-4-[3-[4-(metiltio)fenil]-3-oxo-propil]fenoxi]-2-metilpropanoico, e isopropil éster del ácido 2-[2,6-dimetil-4-[3-[4-(metiltio) fenil]-3-oxo-propil]fenoxi]-2-metil-propanoico; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo . En otra realización particular de la invención, el compuesto de fórmula (I) es 1 -[4-metiltiofenil]-3-[3,5-dimetil-4-carboxidimetilmetiloxi fenil]prop-2-en-1-ona o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo .
Otros compuestos que podrían usarse en el método para el tratamiento de NASH de la presente divulgación pueden incluir, sin limitación, un compuesto seleccionado de las siguientes clases y compuestos específicos de la tabla 1.
Tabla 1
Ejemplos
Recolección y análisis de muestras
Estudio clínico
El ensayo clínico (ensayo de fase 2 GOLDEN-505 en NASH (GFT505-212-7 - NCT01694849) es un estudio multicéntrico, aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo para evaluar la eficacia y seguridad de Elafibranor (1-[4-metiltiofenil]-3-[3,5-dimetil-4-carboxidimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1-ona) una vez al día sobre esteatohepatitis en pacientes con esteatohepatitis no alcohólica (NASH).
Se realizó una biopsia hepática para confirmar el diagnóstico de NASH después de la exclusión apropiada de la enfermedad hepática de otra etiología. La NASH se diagnosticó como esteatohepatitis evaluada mediante biopsia hepática en los 6 meses anteriores a la aleatorización. La confirmación de la esteatohepatitis se basó en la lectura central de las biopsias hepáticas. Los pacientes con NASH se definieron con un NAS > 3 que incluía esteatosis grado > 1 y hinchazón de hepatocitos > 1 e inflamación lobulillar > 1.
El estudio fue aprobado por los organismos reguladores correspondientes en cada centro participante y todos los pacientes habían dado su consentimiento para participar en la investigación médica.
Muestreo de sangre y pruebas de laboratorio.
Las muestras de sangre se recolectaron de acuerdo con el Central Laboratory Protocol and Manual- Genfit - GFT505-212-7.
De acuerdo con el protocolo del estudio, se realizaron los siguientes análisis.
HEMATOLOGÍA incluye hemoglobina, hematocrito, recuento de RBC, leucocitos, recuento diferencial de leucocitos (neutrófilos, linfocitos, eosinófilos, monocitos, basófilos -abs. y valores %), plaquetas y reticulocitos.
BIOQUÍMICA El panel I incluye glucosa plasmática, triglicéridos (TG), creatinina, aclaramiento de creatinina, gammaglutamiltransferasa (GGT), aspartato aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ALT), creatinfosfoquinasa (CPK), fosfatasa alcalina, hormona estimulante de la hormona tiroidea (TSH) y HbA1c.
BIOQUÍMICA El panel II incluye glucosa plasmática, creatinina, aclaramiento de creatinina, proteína total, albúmina, sodio, potasio, cloruro, calcio, ácido úrico, urea expresada como nitrógeno ureico en sangre (BUN), aspartato aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ALT), gamma-glutamiltransferasa (GGT), fosfatasa alcalina, creatinfosfoquinasa (CPK), bilirrubina total, bilirrubina conjugada, proteína C-reactiva (hsCRP), relación AST/ALT y HbA1c.
URINÁLISIS incluye:
• Análisis con tira reactiva (gravedad específica, pH, RBC, leucocitos, glucosa, proteínas, cetonas, bilirrubina, urobilinógeno y nitrito)
• El análisis por microscopía incluye RBC, WBC, cilindros, cristales, bacterias, células epiteliales y levaduras. • Análisis químico (albúmina y creatinina)
SEROLOGÍA incluye HIV ab I/II, HCV ab, HCV RNA (solo probado sólo se analiza tras la recepción de muestras de visita de ARN del VHC y en caso de resultado 'reactivo' o 'indeterminado' para HCV Ab) y HbsAg.
PANEL DE LÍPIDOS incluye triglicéridos (TG), colesterol total, no HDL-C (cálculo), colesterol de lipoproteínas de alta densidad (HDL-C), lipoproteínas de baja densidad (LDL-C) (cálculo), colesterol de lipoproteínas de muy baja densidad calculado (VLDL -C) (cálculo), apolipoproteína AI (ApoAI) y apolipoproteína B (ApoB).
QUÍMICA DE LA ORINA incluye alfa-1-microglobulina, beta-N-acetilglucosaminidasa (beta-NAG) y lipocalina asociada a neutrófilos-gelatinasa (N-Gal)
MARCADORES DE SEGURIDAD incluyen homocisteína, NT-ProBNP, troponina T, cistatina C y Beta2-microglobulina.
PARÁMETROS GLUCÉMICOS Y OTROS LÍPIDOS incluyen leptina, insulina, evaluación del modelo homeostático (HOMA-IR), glucosa sérica (para el cálculo de HOMA-IR), fructosamina, péptido C y ácidos grasos libres (FFA).
MARCADORES INFLAMATORIOS incluyen haptoglobina, fibrinógeno, factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), interleucina 6 (IL-6) e inhibidor del activador del plasminógeno 1 (PAI-1) Ag (citrato).
MARCADORES DE HÍGADO incluyen citoqueratina-18 (CK18) (M65 y M30), adinopectina, ferritina, macroglobulina alfa2, FGF19 y FGF21, ácido hialurónico (Advia centaur, reactivo adquirido por Siemens Bélgica y cargado a Genfit en el paso a través), N-terminal pro -péptido de colágeno tipo III (PIIINP) (Advia centaur, reactivo adquirido por Siemens Bélgica) e inhibidor tisular de la metaloproteasa de matriz-1 (TIMP-1) (Advia centaur, reactivo adquirido por Siemens).
Recolección y almacenamiento de muestras
Las muestras en sangre utilizadas en este estudio de biomarcadores se extrajeron de pacientes del estudio 505.212.7 antes del período de tratamiento. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito para la recolección, almacenamiento y uso de muestras adicionales de cada paciente.
La sangre recolectada en tubos que contenían citrato de 2.7 ml se procesó separando el plasma libre de células de las células sanguíneas dentro de los 15 minutos posteriores a la recolección mediante centrifugación a 1,500 xg durante 15 minutos. El plasma sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo. Los tubos se mantuvieron a -70 °C.
Para proceder a la extracción de ARN, los tubos de plasma se centrifugaron a 13,000 xg durante 2 min para sedimentar y eliminar las plaquetas. El plasma libre de plaquetas sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo, se congeló en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C.
Extracción de ARN total y cuantificación de miARN
El ARN total con miARN conservados se extrajo de 400 gl de plasma libre de plaquetas mediante el kit de extracción miRNeasy (miRNeasy Serum/Plasma Kit (n° de cat. 217184)) y utilizando una relación plasma/QIAzol de 1:5 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se añadió miR-39 sintético sembrado en C. elegans a las muestras [3,125 fmoles] antes de la extracción de ARN como control interno del proceso de extracción de ARN. La elución se realizó en 18 gl de regulador de elución.
La expresión de miARN maduros se detectó de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando el ensayo Taqman miARN qRT-PCR: TaqMan MicroRNA Reverse transcription Kit (Ref: 4366596, Applied Biosystems, Carlsbad, CA), TaqMan MicroARN Assay 20X (Ref: 4440887, Applied Biosystems) y TaqMan Universal Master Mix II (Ref: 4440040, Applied Biosystems).
La transcripción reversa se realizó utilizando un termociclador GeneAmp® PCR System 9700 (Ref: 200005, Applied Biosystems) con condiciones de ciclización de 16 °C durante 30 minutos seguido de 42 °C durante 30 minutos y 85 °C durante 5 minutos antes de mantenerlo a 4°C. °C. La transcripción reversa se multiplexó con 4 cebadores inversos específicos de miARN para conservar la muestra de ARN.
La PCR cuantitativa se realizó usando un CFX96™ Real-Time System (C1000 Touch™ Thermal Cycler, BioRad) con condiciones de ciclización de 95 °C durante 10 minutos seguido de 95 °C durante 15 segundos y 60 °C durante 60 segundos para un total de 50 ciclos y 30 °C durante 30 seg.
Las secuencias de cebadores específicos para miARN de potencial interés se eligieron de acuerdo con la siguiente tabla 2.
Tabla 2: secuencias de miARN probado
Los datos utilizados en la construcción del algoritmo estaban en formato Cq. El modo de determinación de Cq fue Regresión.
Análisis estadístico
Objetivo y definición
El objetivo de estos análisis fue descubrir biomarcadores que puedan estar relacionados con la identificación de los pacientes con NASH que se van a tratar. Los pacientes que se van a tratar (TBT) se definieron como:
• Estadio de fibrosis > 2 y
• NAS > 4 y
• Inflamación lobulillar grado > 1 y
• Grado de esteatosis > 1 y
• Grado de hinchazón > 1.
Se declaró que otros pacientes no iban a ser tratados (NTBT). Para el análisis, los pacientes con TBT se categorizaron como 1 y NTBT como 0 en la variable de respuesta. Como se muestra arriba, las variables explicativas abarcaron un amplio rango de biomarcadores medidos en sangre (hematología, bioquímica, coagulación, marcadores hepáticos, miARN circulante) o en muestras urinarias (tira reactiva, sedimento), siempre que sean demográficas (edad, sexo, raza), registros regionales (centro de estudios, país, continente) o médicos (diabetes).
Gestión de conjuntos de datos
El conjunto de datos utilizado en este estudio provenía del ensayo Golden-505 e inicialmente estaba compuesto por 274 pacientes y 121 variables. La gestión del conjunto de datos incluyó los siguientes pasos:
1. Eliminación de 28 pacientes sin medición de miARN
2. Eliminación de 9 variables con más de 10 valores perdidos
3. Eliminación de 7 pacientes con valores extremos y 28 con valores perdidos restantes
Resultó en un conjunto de datos con 211 pacientes y 112 variables que se utilizaron para probar la colinealidad entre las variables explicativas.
Prueba de colinealidad
La correlación de Pearson se calculó de dos en dos entre variables cuantitativas. Cuando dos variables presentaron una correlación superior a 0.7, se realizó una prueba univariante de diferencia en su media con relación a la variable de respuesta que define a los pacientes TBT. La variable seleccionada fue la más significativa. Las variables colineales y seleccionadas se presentan en la Tabla 2.
Se eliminaron treinta y cinco variables colineales únicas y el conjunto de datos final utilizado en el análisis incluyó 77 variables (identificación del paciente, variable de respuesta, 5 grados histológicos y 70 variables explicativas) y 211 pacientes (95 TBT y 116 NTBT).
Modelo mediano
El conjunto de datos se particionó un millón de veces en 2/3 del conjunto de entrenamiento y en 1/3 del conjunto de verificación, estratificado según la distribución de pacientes TBT y NTBT. En estas diferentes particiones posibles, 27,477 no presentaron diferencias significativas entre los conjuntos de entrenamiento y verificación en todas las variables explicativas y grados histológicos y se utilizaron para el análisis.
Se realizó una regresión logística entre la variable de respuesta y 70 variables explicativas, seguida de una selección de variables utilizando el Criterio de información de Akaike (AIC), en los 27,477 conjuntos de entrenamiento. Resultó en 27,477 coeficientes diferentes para las 70 variables. El modelo de mediana se creó combinando variables con un coeficiente de mediana diferente de cero (Tabla 4).
Tabla 4. Resultados del modelo de mediana (cor: variable colineal)
Luego, el modelo se verificó calculando el área bajo la curva ROC (AUC) para cada uno de los 27.477 conjuntos. El AUC fue de 0.82 (IC del 95 %: 0.72-0.91). Utilizando la mediana del AUC, se definieron 3 umbrales para predecir a los pacientes como TBT o NTBT:
1. El umbral más cercano al punto con 1-Especificidad = 0 % y Sensibilidad = 100 % fue igual a 0.23. La tabla de contingencia correspondiente se presenta en la Tabla 5a y produjo los siguientes índices:
Precisión total: 80.28 %
Sensibilidad: 81.25 %
Especificidad: 79.49 %
PPV (Valor predictivo positivo): 76.47 %
NPV (Valor predictivo negativo): 83.78 %
2. El umbral que da una sensibilidad superior al 90 % es igual a 0.102. La tabla de contingencia correspondiente se presenta en la Tabla 5b y produjo los siguientes índices:
Precisión total: 63.38 %
Sensibilidad: 90.63 %
Especificidad: 41.03 %
PPV (Valor predictivo positivo): 55.77 %
NPV (Valor predictivo negativo): 84.21 %
3. El umbral que da una especificidad superior al 90 % fue de 0.462. La tabla de contingencia correspondiente se presenta en la Tabla 5c y produjo los siguientes índices:
Precisión total: 70.42 %
Sensibilidad: 43.75 %
Especificidad: 92.31 %
PPV (Valor predictivo positivo): 82.35 %
NPV (Valor predictivo negativo): 66.67 %
Tabla 5a. Tabla de contingencia de pacientes TBT/NTBT observados y predichos por el modelo de mediana y un umbral de 0.23.
Tabla 5b. Tabla de contingencia de pacientes TBT/NTBT observados y predichos por el modelo de mediana y un umbral de 0.102.
Tabla 5c. Tabla de contingencia de pacientes TBT/NTBT observados y predichos por el modelo de mediana y un umbral de 0.462.
Modelo de remuestreo con base estadística
Utilizando los 211 pacientes, se calculó una regresión logística como modelo completo utilizando las 70 variables explicativas y se obtuvo un modelo óptimo seleccionando las variables con el AIC (Tabla 6). Luego, se probó la significancia de los coeficientes de las variables utilizando 1000 muestras de Bootstrap (Tabla 6).
Tabla 6. Resultados del modelo de remuestreo con base estadística (cor: variable colineal)
De suma importancia, es muy satisfactorio observar que las variables identificadas con el modelo de remuestreo con base estadística son las mismas que las identificadas con el modelo de mediana descrito anteriormente. Esta observación refuerza la relevancia estadística y la confianza de estas variables como predictivas de NASH y de su etapa o gravedad.
El modelo óptimo se verifica calculando el AUC en 1000 muestras de arranque. El AUC fue de 0.82 (IC del 95 %: 0.76 0.87). Utilizando el AUC del modelo óptimo, se definieron 3 umbrales para predecir a los pacientes como TBT o NTBT: 1. El umbral más cercano al punto con 1-Especificidad = 0 % y Sensibilidad = 100 %, fue de 0.4343. La tabla de contingencia correspondiente se presenta en la Tabla 7a y produjo los siguientes índices:
o Precisión total: 75.36 %
o Sensibilidad: 74.74 %
o Especificidad: 75.86 %
o PPV: 71.72 %
o NPV (Valor predictivo negativo): 78.57 %
2. El umbral que da una sensibilidad superior al 90 % es igual a 0.2319. La tabla de contingencia correspondiente se presenta en la Tabla 7b y produjo los siguientes índices:
o Precisión total: 65.88 %
o Sensibilidad: 90.53 %
o Especificidad: 45.69 %
o PPV (Valor predictivo positivo): 57.72 %
o NPV (Valor predictivo negativo): 85.48 %
3. El umbral que da una especificidad superior al 90 % fue de 0.6465. La tabla de contingencia correspondiente se presenta en la Tabla 7c y produjo los siguientes índices:
o Precisión total: 73.46 %
o Sensibilidad: 52.63 %
o Especificidad: 90.52 %
o PPV (Valor predictivo positivo): 81.97 %
o NPV (Valor predictivo negativo): 70.00 %
Tabla 7a. Tabla de contingencia de pacientes TBT/NTBT observados y predichos por el modelo de remuestreo con base estadística y un umbral de 0.4343.
Tabla 7b. Tabla de contingencia de pacientes TBT/NTBT observados y predichos por el modelo de remuestreo con base estadística y un umbral de 0.2319.
Tabla 7c. Tabla de contingencia de pacientes TBT/NTBT observados y predichos por el modelo de remuestreo con base estadística y un umbral de 0.6465.
Comparación con otros métodos de puntuación de NASH
Los métodos para establecer las puntuaciones de NASH se describieron previamente en la literatura:
• el Índice de Angulo (Angulo et al, 2007)
• ELF (Guha et al, 2008) (see also the ELF specification sheet http://www.healthcare.siemens.com/clinicalspecialities/liver-disease/elf-test-now-avail)
• Fibrotest (Ratziu et al, 2006)
• Fibrómetro (Cales et al, 2009)
• FLI (Bedogni et al, 2006)
• Grado de esteatosis o Prueba de Esteato (Poynard et al, 2005)
Por tanto, los inventores evaluaron la puntuación de NASH de la invención con respecto a varios de estos métodos anteriores.
Las Figuras 1a a 1g muestran la comparación de la puntuación de NASH de acuerdo con el método de la invención derivada del modelo de remuestreo con base estadística (Figura 1a) con las puntuaciones existentes.
Los datos presentados en este documento muestran una mejora espectacular de la precisión de la identificación de los pacientes con NASH, o pacientes potenciales con NASH, en la determinación de la actividad, el estadio o la gravedad de NASH. Este hallazgo es de suma importancia y será una herramienta invaluable para mejorar la eficiencia del manejo del paciente.
Referencias
Angulo P, Hui JM, Marchesini G, Bugianesi E, George J, Farrell GC, Enders F, Saksena S, Burt AD, Bida JP, Lindor K, Sanderson s O, Lenzi M, Adams LA, Kench J, Therneau TM, Day CP (2007) The NAFLD fibrosis score: a noninvasive system that identifies liver fibrosis in patients with NAFLD. Hepatology 45: 846-854
Bedogni G, Bellentani S, Miglioli L, Masutti F, Passalacqua M, Castiglione A, Tiribelli C (2006) The Fatty Liver Index: a simple and accurate predictor of hepatic steatosis in the general population. BMC Gastroenterol 6: 33
Cales P, Laine F, Boursier J, Deugnier Y, Moal V, Oberti F, Hunault G, Rousselet MC, Hubert I, Laafi J, Ducluzeaux PH, Lunel F (2009) Comparison of blood tests for liver fibrosis specific or not to NAFLD. J Hepatol 50: 165-173
Guha IN, Parkes J, Roderick P, Chattopadhyay D, Cross R, Harris S, Kaye P, Burt AD, Ryder SD, Aithal GP, Day CP, Rosenberg WM (2008) Noninvasive markers of fibrosis in nonalcoholic fatty liver disease: Validating the European Liver Fibrosis Panel and exploring simple markers. Hepatology 47: 455-460
Poynard T, Ratziu V, Naveau S, Thabut D, Charlotte F, Messous D, Capron D, Abella A, Massard J, Ngo Y, Munteanu M, Mercadier A, Manns M, Albrecht J (2005) The diagnostic value of biomarkers (SteatoTest) for the prediction of liver steatosis. Comp Hepatol 4: 10
Ratziu V, Massard J, Charlotte F, Messous D, Imbert-Bismut F, Bonyhay L, Tahiri M, Munteanu M, Thabut D, Cadranel JF, Le Bail B, de Ledinghen V, Poynard T (2006) Diagnostic value of biochemical markers (FibroTest-FibroSURE) for the prediction of liver fibrosis in patients with non-alcoholic fatty liver disease. BMC Gastroenterol 6: 6
Claims (16)
1. Un método para el diagnóstico de esteatohepatitis no alcohólica (NASH) o para determinar la actividad, el estadio o la gravedad de NASH en un sujeto, que comprende el paso de medir el nivel en sangre, suero o plasma de: (i) macroglobulina alfa 2;
(ii) hemoglobina glucosilada (HbA1c);
(iii) propéptido N-terminal de colágeno tipo III;
(iv) hsa-miR-34a-5p; y
(v) hsa-miR-200a-3p.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la implementación de las siguientes mediciones a partir de una muestra en sangre, suero o plasma de dicho sujeto:
(i) determinar el nivel de macroglobulina alfa 2;
(ii) determinar el nivel de HbA1c;
(iii) determinar el nivel de propéptido N-terminal del colágeno tipo III;
(iv) determinar el nivel de hsa-miR-34a-5p; y
(v) determinar el nivel de hsa-miR-200a-3p;
en el que un aumento de dichos niveles en relación con el de una muestra de control es indicativo de NASH y/o de la actividad, el estadio o la gravedad de NASH.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que se calcula una puntuación de NASH a partir de los niveles determinados en las mediciones (i) a (v) y en el que se diagnostica NASH y/o se determina la etapa o actividad de NASH o la gravedad sobre la base de dicha puntuación de NASH.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que se calcula una puntuación de NASH de acuerdo con la siguiente función logística:
en la que
Y=k+a* A+b* B+c* C+d* D+f" F
en la que
S es la puntuación de NASH;
A es el nivel de macroglobulina alfa 2 en g/L;
B es el nivel de HbA1c en porcentaje;
C es el nivel de propéptido N-terminal del colágeno tipo III en ng/ml;
D es el nivel de hsa-miR-34a-5p en Cq;
F es el nivel de hsa-miR-200a-3p en Cq;
k es un número comprendido entre 5.26 y 36.76;
a es un número comprendido entre 0.11 y 1.07;
b es un número comprendido entre 0 y 1.02;
c es un número comprendido entre 0 y 0.23;
d es un número comprendido entre -0.77 y 0; y
f es un número comprendido entre -0.78 y 0.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que una puntuación de NASH superior a un valor umbral comprendido entre 0.102 y 0.6465 es indicativo de una NASH grave o de una actividad de NASH moderada o alta.
6. Un método para clasificar a un sujeto como receptor o no receptor de un tratamiento para NASH, que comprende el paso de medir el nivel de:
(i) macroglobulina alfa 2;
(ii) hemoglobina glucosilada (HbA1c);
(iii) propéptido N-terminal de colágeno tipo III;
(iv) hsa-miR-34a-5p; y
(v) hsa-miR-200a-3p.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, que comprende la implementación de las siguientes mediciones a partir de una muestra en sangre, suero o plasma de dicho sujeto:
(i) determinar el nivel de macroglobulina alfa 2;
(ii) determinar el nivel de HbA1c;
(iii) determinar el nivel de propéptido N-terminal del colágeno tipo III;
(iv) determinar el nivel de hsa-miR-34a-5p; y
(v) determinar el nivel de hsa-miR-200a-3p;
en el que se calcula una puntuación de NASH a partir de los niveles determinados en las medidas (i) a (v) y en el que el sujeto se clasifica como receptor o no receptor del tratamiento para NASH con base en dicha puntuación.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, que comprende determinar el nivel de macroglobulina alfa 2, HbA1c, propéptido N-terminal de colágeno tipo III, hsa-miR-34a-5p y hsa-miR-200a-3p en el que la puntuación de NASH se calcula de acuerdo con la siguiente función logística:
en la que
Y=k+a*A+b*B+c*C+d*D+f!F
en la que
S es la puntuación de NASH;
A es el nivel de macroglobulina alfa 2 en g/L;
B es el nivel de HbA1c en porcentaje;
C es el nivel de propéptido N-terminal del colágeno tipo III en ng/ml;
D es el nivel de hsa-miR-34a-5p en Cq;
F es el nivel de hsa-miR-200a-3p en Cq;
k es un número comprendido entre 5.26 y 36.76;
a es un número comprendido entre 0.11 y 1.07;
b es un número comprendido entre 0 y 1.02;
c es un número comprendido entre 0 y 0.23;
d es un número comprendido entre -0.77 y 0;
f es un número comprendido entre -0.78 y 0.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el sujeto se clasifica como receptor del tratamiento si S es superior a un valor umbral comprendido entre 0.102 y 0.6465.
10. Un método para calcular una puntuación de NASH que es indicativa de esteatohepatitis no alcohólica (NASH), o de la actividad, el estadio o la gravedad de NASH en un sujeto, en el que dicha puntuación se basa en la medición de:
(i) macroglobulina alfa 2;
(ii) hemoglobina glucosilada (HbA1c);
(iii) propéptido N-terminal de colágeno tipo III;
(iv) hsa-miR-34a-5p; y
(v) hsa-miR-200a-3p.
11. El método de la reivindicación 10, que comprende determinar el nivel de macroglobulina alfa 2, HbA1 c, propéptido N-terminal de colágeno tipo III, hsa-miR-34a-5p y hsa-miR-200a-3p, en el que la puntuación de NASH se calcula de acuerdo con lo siguiente
función logística:
en la que
Y=k+a* A+b* B+c* C+d* D+f" F
en la que
S es la puntuación de NASH;
A es el nivel de macroglobulina alfa 2 en g/L;
B es el nivel de HbA1c en porcentaje;
C es el nivel de propéptido N-terminal de colágeno tipo III en ng/mL;
D es el nivel de hsa-miR-34a-5p en Cq;
F es el nivel de hsa-miR-200a-3p en Cq;
k es un número comprendido entre 5.26 y 36.76;
a es un número comprendido entre 0.11 y 1.07;
b es un número comprendido entre 0 y 1.02;
c es un número comprendido entre 0 y 0.23;
d es un número comprendido entre -0.77 y 0;
f es un número comprendido entre -0.78 y 0.
12. Un kit que comprende medios para determinar el nivel de:
(i) macroglobulina alfa 2;
(ii) HbA1c;
(iii) propéptido N-terminal de colágeno tipo III;
(iv) hsa-miR-34a-5p; y
(v) hsa-miR-200a-3p;
en el que el kit comprende como medio anticuerpos específicos para una proteína que se va a cuantificar y cebadores útiles para cuantificar los niveles de micro-ARN.
13. Un compuesto adecuado para el tratamiento de NASH, para su uso en un método para tratar NASH en un sujeto que comprende los pasos de:
(a) diagnosticar NASH o determinar la actividad, el estadio o la gravedad de NASH en el sujeto de acuerdo con el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o clasificar dicho sujeto de acuerdo con el método de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11; y
(b) administrar dicho compuesto a dicho sujeto con base en el paso (a).
14. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que dicho compuesto es un compuesto de fórmula (I):
en la que
X1 representa un halógeno, un grupo R1 o G1-R1;
A representa un grupo CH = CH o CH2-CH2;
X2 representa un grupo G2-R2;
G1 y G2, idénticos o diferentes, representan un átomo de oxígeno o azufre;
R1 representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo no sustituido, un grupo arilo o un grupo alquilo que está sustituido con uno o más átomos de halógeno, un grupo alcoxi o alquiltio, grupos cicloalquilo,
grupos cicloalquiltio o grupos heterocíclicos;
R2 representa un grupo alquilo sustituido con al menos un grupo -COOR3, en el que R3 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que está sustituido o no con uno o más átomos de halógeno, grupos cicloalquilo o grupos heterocíclicos.
R4 y R5, idénticos o diferentes, que representan un grupo alquilo sustituido o no con uno o más átomos de halógeno, grupos cicloalquilo, grupos heterocíclicos;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
15. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el compuesto se selecciona en el grupo que consiste en 1-[4-metiltiofenil]-3-[3,5-dimetil-4-carboxidimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1-ona, 1-[4-metiltiofenil]-3-[3,5-dimetil-4-isopropiloxi carbonildimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1 -ona, 1 -[4-metiltiofenil]-3-[3,5-dimetil-4-tertbutiloxicarbonildimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1-ona, 1-[4-trifluorometilfenil]-3-[3,5-dimetil-4-tertbutiloxicarbonil dimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1 -ona, 1 -[4-trifluorometilfenil]-3-[3,5-dimetil-4-carboxidimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1 -ona, 1 -[4-trifluorometil oxifenil]-3-[3,5-dimetil-4-te rtbutiloxicarbonildimetilmetiloxi fenil]prop-2-en-1-ona, 1-[4-trifluorometiloxifenil]-3-[3,5-dimetil-4-carboxidimetilmetil oxifenil]prop-2-en-1 -ona, ácido 2-[2,6-dimetil-4-[3-[4-(metiltio)fenil]-3-oxo-propil]fenoxi]-2-metilpropanoico, e isopropil éster del ácido 2-[2,6-dimetil-4-[3-[4-(metiltio) fenil]-3-oxo-propil]fenoxi]-2-metil-propanoico; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo .
16. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 14 o 15, en el que dicho compuesto es 1 -[4-metiltiofenil]-3-[3,5-dimetil-4-carboxidimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1-ona o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
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