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ES2889548T3 - Método para introducir mutaciones - Google Patents

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ES2889548T3
ES2889548T3 ES19707096T ES19707096T ES2889548T3 ES 2889548 T3 ES2889548 T3 ES 2889548T3 ES 19707096 T ES19707096 T ES 19707096T ES 19707096 T ES19707096 T ES 19707096T ES 2889548 T3 ES2889548 T3 ES 2889548T3
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dna polymerase
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Leigh G Monahan
Joyce To
Catherine M Burke
Michael Imelfort
Aaron E Darling
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Longas Technologies Pty Ltd
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Abstract

Un método para introducir mutaciones de sustitución en al menos una molécula de ADN diana, que comprende: a. proporcionar al menos una muestra que comprende al menos una molécula de ADN diana; y b. amplificar la al menos una molécula de ADN diana usando una ADN polimerasa de alta fidelidad de bajo sesgo que tiene un bajo sesgo de amplificación de plantilla; en donde la etapa de amplificar la al menos una molécula de ADN diana se lleva a cabo en presencia de un análogo de nucleótido y comprende al menos 2 rondas de replicación de la al menos una molécula de ADN diana, en donde en una primera ronda de replicación la ADN polimerasa incorpora el análogo de nucleótido en lugar de un nucleótido y en una segunda ronda de replicación, el análogo de nucleótido se empareja con un nucleótido natural para introducir una mutación de sustitución en la hebra complementaria.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para introducir mutaciones
Campo de la invención
Esta invención se refiere a un método para introducir mutaciones en una o más moléculas de ácido nucleico, un uso de una ADN polimerasa de bajo sesgo en un método para introducir mutaciones en una o más moléculas de ácido nucleico.
Antecedentes de la invención
Pueden usarse ADN polimerasas para introducir mutaciones en secuencias de ácidos nucleicos. Esto puede resultar útil en varias aplicaciones. Por ejemplo, las técnicas de mutagénesis pueden ser útiles en aplicaciones que incluyen la secuenciación asistida por técnicas de mutagénesis (SAM) y para introducir mutaciones en secuencias de proteínas para detectar mutaciones que afecten a la actividad de la proteína.
Pueden introducirse mutaciones usando ADN polimerasas que tienen baja fidelidad. Las ADN polimerasas de baja fidelidad cometen errores durante la replicación que dan como resultado la introducción de mutaciones. Sin embargo, muchas ADN polimerasas de baja fidelidad solo introducen mutaciones a una tasa de menos del 2 % por reacción de mutación (ronda de replicación), y para algunas aplicaciones son útiles tasas de mutagénesis más altas. Además, las ADN polimerasas de baja fidelidad pueden introducir mutaciones de manera sesgada. Tales ADN polimerasas pueden denominarse ADN polimerasas de alto sesgo.
Las mutaciones pueden introducirse replicando secuencias, usando ADN polimerasas, en presencia de análogos de nucleótidos tales como dPTP. Las ADN polimerasas pueden incorporar los análogos de nucleótidos en lugar de un nucleótido natural. A continuación, en un ciclo posterior de replicación, el análogo de nucleótido puede emparejarse con un nucleótido natural que no estaba presente en la secuencia original, introduciendo de este modo una mutación. La introducción de mutaciones mediante la replicación de secuencias en presencia de análogos de nucleótidos puede usarse para lograr tasas de mutaciones más altas.
Las ADN polimerasas de uso común (como la polimerasa Taq) se pueden usar para incorporar análogos de nucleótidos en lugar de un nucleótido natural. Sin embargo, estas polimerasas son polimerasas de alto sesgo. Las ADN polimerasas de alto sesgo pueden mostrar dos posibles sesgos: el sesgo de mutación y el sesgo de amplificación de la plantilla.
Algunas polimerasas de alto sesgo tienen un alto sesgo de mutación, ya que no mutan los cuatro nucleótidos naturales (adenina, citosina, guanina y timina) de manera uniforme al azar. Por ejemplo, las ADN polimerasas de alto sesgo pueden mutar algunos nucleótidos con mayor frecuencia que otros. Los pares de adenina/timina están conectados por dos enlaces de hidrógeno, mientras que los pares de guanina/citosina están conectados por tres enlaces de hidrógeno. Por tanto, es posible que las ADN polimerasas de alto sesgo tengan más probabilidades de introducir mutaciones en los pares de adenina/timina que en los pares de guanina/citosina.
Las polimerasas de alto sesgo, que tienen un alto sesgo de mutación, pueden no incorporar análogos de nucleótidos al azar. Por ejemplo, las polimerasas de alto sesgo pueden favorecer el reemplazo de ciertas bases con análogos de nucleótidos. El DPTP puede interconvertirse entre dos formas tautoméricas diferentes, una forma imino y una forma amino. El tautómero imino puede formar pares de bases Watson-Crick con la adenina, mientras que la forma amino puede formar pares de bases Watson-Crick con la guanina (Kong Thoo Lin P, Brown D M (1989). "Synthesis and duplex stability of oligonucleotides containing cytosine-thymine analogues Nucleic Acids Research. 17: 10373-10383; Stone M J et al. (1991). "Molecular basis for methoxyamine-initiated mutagenesis: 1H nuclear magnetic resonance studies of base-modified oligodeoxynucleotides". Journal of Molecular Biology. 222: 711-723; Nedderman A N R et al. (1993). "Molecular basis for methoxyamine initiated mutagenesis: 1H nuclear magnetic resonance studies of oligonucleotide duplexes containing base-modified cytosine residues". Journal of Molecular Biology. 230: 1068-1076; Moore M H et al. (1995). "Direct observation of two base-pairing modes of a cytosine-thymine analogue with guanine in a DNAZ-form duplex. Significance for base analogue mutagenesis". Journal of Molecular Biology. 251: 665-673). Esto significa efectivamente que la replicación en presencia de dPTP puede usarse para introducir sustituciones en lugar de adenina, citosina, guanina o timina en una secuencia de nucleótidos. Sin embargo, en solución acuosa, se ha demostrado que la proporción entre las formas imino y amino de dPTP es de alrededor 10:1 (Harris V H et al. (2003). "The effect of tautomeric constant on the specificity of nucleotide incorporation during DNA replication: support for the rare tautomer hypothesis of substitution mutagenesis". Journal of Molecular Biology. 326: 1389-1401). Por consiguiente, cuando se usa una polimerasa como la polimerasa Taq para introducir mutaciones usando dPTP, introduce sustituciones de adenina y timina con mucha más frecuencia que las sustituciones de guanina y citosina (Zaccolo M et al. (1996). "An approach to random mutagenesis of DNA using mixtures of triphosphate derivatives of nucleoside analogues". Journal of Molecular Biology. 255: 589-603; Harris V H et al. (2003). "The effect of tautomeric constant on the specificity of nucleotide incorporation during DNA replication: support for the rare tautomer hypothesis of substitution mutagenesis". Journal of Molecular Biology. 326: 1389-1401).
En segundo lugar, las polimerasas de alto sesgo pueden mostrar un sesgo de amplificación de la plantilla, es decir, pueden replicar algunas moléculas de ácido nucleico plantilla con una mayor tasa de éxito por ciclo de PCR que otras. Durante muchos ciclos de PCR, este sesgo puede crear diferencias extremas en el número de copias entre las plantillas. Las regiones de una molécula de ácido nucleico plantilla pueden formar estructuras secundarias o pueden contener una mayor proporción de algunos nucleótidos (por ejemplo, nucleótidos de guanina o citosina) que otras. Una polimerasa de alto sesgo puede ser más eficaz para amplificar, por ejemplo, moléculas de ácido nucleico de plantilla ricas en guanina y citosina en comparación con moléculas de ácido nucleico de plantilla ricas en adenina y timina, o puede ser más eficaz para amplificar moléculas de ácido nucleico de plantilla que no forman estructuras secundarias.
Muchas de las aplicaciones de la mutagénesis son más eficaces si la mutagénesis se puede realizar con un sesgo bajo (tanto el sesgo de mutación como la amplificación de la plantilla).
El ensamblaje preciso de las secuencias del genoma ha demostrado ser difícil, ya que muchas plataformas de secuenciación de segunda generación solo son capaces de secuenciar fragmentos cortos de ácido nucleico y requieren que las secuencias de ácido nucleico diana se amplifiquen durante el proceso de secuenciación para proporcionar suficientes moléculas de ácido nucleico para la etapa de secuenciación. Si el usuario desea secuenciar una secuencia de ácido nucleico más grande, esto puede lograrse secuenciando regiones de las moléculas de ácido nucleico diana. A continuación, el usuario debe ensamblar computacionalmente la secuencia de la secuencia completa del ácido nucleico a partir de las secuencias de las regiones.
El ensamblaje de una secuencia de ácido nucleico usando secuencias de regiones puede resultar difícil. En particular, cuando las regiones largas de las secuencias son muy similares entre sí, puede ser difícil determinar si las secuencias de dos regiones son ambas secuencias de réplicas de la misma molécula de ácido nucleico plantilla original o corresponden a secuencias de dos moléculas de ácido nucleico plantilla originales diferentes. De manera similar, puede ser difícil determinar si las secuencias de dos regiones corresponden a secuencias de réplicas de la misma porción de una molécula de ácido nucleico plantilla, o corresponden realmente a dos repeticiones diferentes dentro de la molécula de ácido nucleico plantilla. Estas dificultades pueden evitarse introduciendo mutaciones en las moléculas de ácido nucleico diana antes de la amplificación. El usuario puede identificar a continuación los fragmentos que tienen los mismos patrones de mutación que probablemente se hayan originado a partir de la misma porción de la misma molécula de ácido nucleico plantilla original. Este tipo de método de secuenciación a veces se denomina secuenciación asistida por mutagénesis (SAM).
Shen et al, DNA REPAIR PROTOCOLS. METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, HUMANA PRESS, EE.UU., (20020101), vol. 192, ISBN 978-1-62703-541-5, páginas 167 - 174 describe métodos de PCR para la mutagénesis y recombinación del ADN. Choi et al, NUCLEIC ACIDS RESEARCH, (20160218), vol. 44, n.° 3, doi:10.1093/nar/gkv1509, ISSN 0305-1048, páginas 1022 - 1035 describe que el uso de nucleótidos modificados y no naturales proporciona conocimientos únicos sobre la replicación pro-mutagénica catalizada por la polimerasa eta. Masayasu et al, MOLECULES, (20101112), vol. 15, n.° 11, doi:10.3390/molecules15118229, páginas 8229 - 8240 describe un estudio sobre la idoneidad de la ADN polimerasa KOD para la producción enzimática de ácidos nucleicos artificiales utilizando nucleósidos trifosfato modificados con base/azúcar. Petrie et al, NUCLEIC ACIDS RESEARCH, (201012), vol. 38, n.° 22, páginas 8095 - 8104 describe el análisis de secuenciación profunda de mutaciones resultantes de la incorporación de análogos de dNTP. Elshawadfy et al FRONTIERS IN MICROBIOLOGY, (20140527), vol. 5 se refiere a híbridos de ADN polimerasa derivados de la familia B de enzimas de Pyrococcus furiosus y Thermococcus kodakarensis: que mejoran el rendimiento en la reacción en cadena de la polimerasa. Yamashita et al, MOLECULAR BIOTECHNOLOGY, HUMANA PRESS, BOSTON, vol. 59, n.° 6, doi:10.1007/S12033-017-0008-9, ISSN 1073-6085, (20170508), páginas 221 - 233 se refiere a la caracterización de ADN polimerasas recombinantes de Thermococcus kodakaraensis (KOD) producidas usando el sistema de vector de expresión del gusano de sedabaculovirus.
Sumario de la invención
Los métodos de secuenciación descritos anteriormente son más eficaces cuando las mutaciones que se introducen en las moléculas de ácido nucleico diana son uniformemente aleatorias. Si las mutaciones son uniformemente aleatorias, entonces la probabilidad, por ejemplo, de que cualquier porción dada de una molécula de ácido nucleico plantilla tenga un patrón de mutación único es mayor. Por tanto, existe la necesidad de identificar ADN polimerasas que sean capaces de introducir mutaciones uniformemente al azar (tienen un bajo sesgo de mutación).
Además, los métodos de secuenciación que utilizan ADN polimerasas que tienen un alto sesgo de amplificación de plantilla pueden ser limitados. Las ADN polimerasas que tienen un alto sesgo de amplificación de plantilla replicarán y/o mutarán algunas moléculas de ácido nucleico diana mejor que otras, por lo que un método de secuenciación que use una ADN polimerasa de alto sesgo puede no ser capaz de secuenciar bien algunas moléculas de ácido nucleico diana.
Los presentes inventores han identificado polimerasas que son polimerasas de bajo sesgo (tienen tanto un sesgo de amplificación de plantilla bajo como un sesgo de mutación bajo), por lo que son particularmente útiles en un método para introducir mutaciones en al menos una molécula de ácido nucleico diana.
El usuario puede desear utilizar los métodos de la invención en más de una muestra a la vez. En tales casos, sería ventajoso para el usuario poder identificar qué molécula de ácido nucleico diana proviene de qué muestra original. Tal identificación podría lograrse marcando las moléculas de ácido nucleico diana con etiquetas de muestra. Sin embargo, las propias etiquetas de muestra pueden mutar durante el método y, por lo tanto, los presentes inventores han determinado cómo diseñar etiquetas de muestra que se puedan distinguir unas de otras incluso si están mutadas.
El usuario también puede desear asegurarse de que los métodos de la invención se utilicen para mutar y amplificar moléculas de ácido nucleico diana largas con preferencia en comparación con moléculas de ácido nucleico cortas. Los presentes inventores han descubierto que esto se puede lograr mediante la introducción de sitios de unión de cebadores especiales en cada extremo de las moléculas de ácido nucleico diana.
Por tanto, en un primer aspecto de la invención, se proporciona un método para introducir mutaciones de sustitución en al menos una molécula de ADN diana que comprende:
a. proporcionar al menos una muestra que comprende al menos una molécula de ADN diana; y
b. amplificar la al menos una molécula de ADN diana usando una ADN polimerasa de alta fidelidad de bajo sesgo que tiene un bajo sesgo de amplificación de plantilla;
en donde la etapa de amplificar la al menos una molécula de ADN diana se lleva a cabo en presencia de un análogo de nucleótido y comprende al menos 2 rondas de replicación de la al menos una molécula de ADN diana, en donde en una primera ronda de replicación la ADN polimerasa incorpora el análogo de nucleótido en lugar de un nucleótido y en una segunda ronda de replicación, el análogo de nucleótido se empareja con un nucleótido natural para introducir una mutación de sustitución en la hebra complementaria.
En un segundo aspecto de la invención, se proporciona un uso de una ADN polimerasa de alta fidelidad de bajo sesgo que tiene un sesgo de amplificación de plantilla bajo en un método para introducir mutaciones en al menos una molécula de ADN diana, en donde el método comprende:
a. proporcionar al menos una muestra que comprende al menos una molécula de ADN diana; y
b. amplificar la al menos una molécula de ADN diana usando la ADN polimerasa;
en donde la etapa de amplificar la al menos una molécula de ADN diana se lleva a cabo en presencia de un análogo de nucleótido y comprende al menos 2 rondas de replicación de la al menos una molécula de ADN diana, en donde en una primera ronda de replicación la ADN polimerasa incorpora el análogo de nucleótido en lugar de un nucleótido y en una segunda ronda de replicación, el análogo de nucleótido se empareja con un nucleótido natural para introducir una mutación de sustitución en la hebra complementaria.
En un tercer aspecto de la invención, se proporciona un método para determinar una secuencia de al menos una molécula de ADN diana que comprende las etapas de:
a. realizar los métodos de la invención para proporcionar al menos una molécula de ADN diana mutada;
b. opcionalmente fragmentar y/o amplificar la al menos una molécula de ADN diana mutada para proporcionar al menos una molécula de ADN diana mutada fragmentada y/o amplificada;
c. secuenciar regiones de la al menos una molécula de ADN diana mutada de la al menos una molécula de ADN diana mutada fragmentada y/o amplificada para proporcionar lecturas de la secuencia mutada; y
d. ensamblar una secuencia para al menos una porción de la al menos una molécula de ADN diana usando las lecturas de la secuencia mutada.
En un cuarto aspecto de la invención, se proporciona un método para diseñar una proteína que comprende las etapas de:
a. realizar los métodos de la invención para proporcionar al menos una molécula de ADN diana mutada;
b. insertar la al menos una molécula de ADN diana mutada en un vector; y
c. expresar una proteína codificada por la al menos una molécula de ADN diana mutada; opcionalmente en donde:
i) el método comprende las etapas de:
a. amplificar la al menos una molécula de ADN diana que comprende el análogo de nucleótido en ausencia del análogo de nucleótido para proporcionar al menos una molécula de ADN diana mutada;
b. insertar la al menos una molécula de ADN diana mutada en un vector; y
c. expresar una proteína codificada por la al menos una molécula de ADN diana mutada; y/o
ii) el método comprende además una etapa de probar la actividad o evaluar la estructura de la proteína codificada por la al menos una molécula de ADN diana mutada; y/o
iii) el vector es un plásmido, un virus, un cósmido o un cromosoma artificial; y/o
iv) la etapa de expresar una proteína codificada por la al menos una molécula de ADN diana mutada se logra transformando células bacterianas, transfectando células eucariotas o transduciendo células eucariotas con el vector.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra el nivel de mutación logrado con tres polimerasas diferentes en presencia o ausencia de dPTP. El panel A muestra los datos obtenidos usando Taq (Jena Biosciences), el panel B muestra los datos obtenidos usando LongAmp (New England Biolabs) y el panel C muestra los datos usando Primestar GXL (Takara). Las barras de color gris oscuro muestran los resultados obtenidos en ausencia de dPTP y las barras de color gris pálido muestran los resultados obtenidos en presencia de dPTP 0,5 mM.
La Figura 2 describe las tasas de mutación obtenidas por mutagenesis de dPTP usando una polimerasa de Thermococcus (Primestar GXL; Takara) en plantillas con contenido de G+C diverso. La mediana de la tasa de mutaciones observadas fue ~7 % para muestras con contenido bajo de GC de S. aureus (33 % GC), mientras que la mediana para otras plantillas fue de aproximadamente el 8 %.
La Figura 3 es un listado de secuencias.
La Figura 4 representa la autohibridación de moléculas de ácido nucleico cuando se usan un primer sitio de unión de cebador y un segundo sitio de unión de cebador que se hibridan entre sí.
La Figura 6 representa los tamaños de las moléculas de ácido nucleico diana amplificadas usando adaptadores que se hibridan entre sí (línea derecha) o usando adaptadores estándar (línea izquierda).
La Figura 7 proporciona una representación gráfica de la mutación utilizando el análogo de nucleótido dPTP (denominado "P" en la Figura 7).
Descripción detallada de la invención
Definiciones generales
A menos que se definan de otra manera, los términos científicos y técnicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende normalmente un experto en la materia a la que pertenece la presente invención.
En general, la expresión "que comprende" se pretende que signifique incluido, aunque sin limitación. Por ejemplo, la expresión "un método para introducir mutaciones en al menos una molécula de ácido nucleico diana que comprende" ciertas etapas debe interpretarse en el sentido de que el método incluye las etapas enumeradas, pero que se pueden realizar etapas adicionales.
En algunas realizaciones de la invención, la expresión "que comprende" se sustituye por la expresión "que consiste en'. La expresión "que consiste en" pretende ser limitante. Por ejemplo, la expresión "un método para introducir mutaciones en al menos una molécula de ácido nucleico diana que consiste en" ciertas etapas debe entenderse en el sentido de que el método incluye las etapas enumeradas, y que no se realizan etapas adicionales.
Para los fines de esta invención, para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias (tales como dos secuencias de polinucleótidos), las secuencias se alinean con fines de una comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una primera secuencia para un alineamiento óptimo con una segunda secuencia). A continuación, se comparan los restos de nucleótido o aminoácidos en cada una de las posiciones. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo resto que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces los restos son idénticos en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones multiplicado por 100). Normalmente, la comparación de secuencias se lleva a cabo a lo largo de la secuencia de referencia. Por ejemplo, para evaluar si una secuencia de prueba es al menos un 95 % idéntica al SEQ ID NO. 2 (la secuencia de referencia), el experto llevaría a cabo una alineación a lo largo del SEQ ID NO. 2 e identificaría cuántas posiciones en la secuencia de prueba eran idénticas a las de SEQ ID NO. 2. Si al menos el 80 % de las posiciones son idénticas, la secuencia de prueba es al menos el 80 % idéntica al SEQ ID NO.
2. Si la secuencia es más corta que el SEQ ID NO. 2, los huecos deben considerarse posiciones no idénticas.
El experto conoce diferentes programas informáticos que están disponibles para determinar la homología o identidad entre dos secuencias. Por ejemplo, la comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede llevarse a cabo mediante un algoritmo matemático. En una realización, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos se determina utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) que se ha incorporado al programa GAP en el paquete de software Accelrys GCG (disponible en http://www.accelrys.com/products/gcg/), usando una matriz Blosum 62 o una matriz PAM250 y una ponderación por hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y una ponderación por longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
Un método para introducir mutaciones en al menos una molécula de ácido nucleico diana
En un aspecto, la invención proporciona un método para introducir mutaciones en al menos una molécula de ácido nucleico diana. En un aspecto adicional, la invención proporciona un uso de una ADN polimerasa de bajo sesgo en un método para introducir mutaciones en al menos una molécula de ácido nucleico diana.
Las mutaciones pueden ser mutaciones de sustitución, mutaciones de inserción o mutaciones de deleción. Para los fines de la presente invención, la expresión "mutación de sustitución" debe interpretarse en el sentido de que un nucleótido se reemplaza con un nucleótido diferente. Por ejemplo, la conversión de la secuencia ATCC en la secuencia AGCC es una mutación de sustitución. Para los fines de la presente invención, la expresión "mutación de inserción" debe interpretarse en el sentido de que se añade al menos un nucleótido a una secuencia. Por ejemplo, la conversión de la secuencia ATCC en la secuencia ATTCC es un ejemplo de una mutación de inserción (insertándose un nucleótido T adicional). Para los fines de la presente invención, la expresión "mutación de deleción" debe interpretarse en el sentido de que se elimina al menos un nucleótido de una secuencia. Por ejemplo, la conversión de la secuencia ATTCC en ATCC es un ejemplo de una mutación de deleción (eliminándose un nucleótido T). Preferentemente, las mutaciones son mutaciones de sustitución.
Para los fines de la presente invención, una "molécula de ácido nucleico" se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos o análogos de los mismos. En los métodos y usos de la invención, la molécula de ácido nucleico diana está formada por desoxirribonucleótidos, es decir, la molécula de ácido nucleico diana es una molécula de ADN. Por tanto, para los fines de la presente invención, se puede considerar que las referencias a "molécula de ácido nucleico diana" se refieren a una "molécula de ADN diana".
La al menos una "molécula de ácido nucleico diana" puede ser cualquier molécula de ácido nucleico diana en la cual al usuario del método le gustaría introducir mutaciones. La molécula de ácido nucleico diana puede formar parte de una molécula de ácido nucleico más grande, tal como un cromosoma. La molécula de ácido nucleico diana puede comprender un gen, múltiples genes o un fragmento de un gen. La molécula de ácido nucleico diana puede ser mayor de 1 kpb, mayor de 1,5 kpb, mayor de 2 kpb, mayor de 4 kpb, mayor de 5 kpb, mayor de 7 kpb, mayor de 8 kpb, entre 1 kpb y 50 kpb, o entre 1 kpb y 20 kpb de tamaño.
La expresión "al menos una molécula de ácido nucleico diana" se considera que es intercambiable con la expresión "las al menos una molécula de ácido nucleico diana".
La "al menos una molécula de ácido nucleico diana" puede ser monocatenaria o puede formar parte de un complejo bicatenario. La al menos una molécula de ácido nucleico diana está hecha de desoxirribonucleótidos y así puede formar parte de un complejo de ADN bicatenario. En cuyo caso, se considerará que una hebra (por ejemplo, la hebra codificante) será la al menos una molécula de ácido nucleico diana, y la otra hebra es una molécula de ácido nucleico que es complementaria con la al menos una molécula de ácido nucleico diana.
El método para introducir mutaciones en al menos una molécula de ácido nucleico diana puede comprender:
a. proporcionar al menos una muestra que comprende al menos una molécula de ácido nucleico diana; y b. amplificar la al menos una molécula de ácido nucleico diana usando una ADN polimerasa de bajo sesgo.
Provisión de al menos una muestra que comprende al menos una molécula de ácido nucleico diana
El método para introducir mutaciones en al menos una molécula de ácido nucleico diana puede comprender una etapa de proporcionar al menos una muestra que comprende al menos una molécula de ácido nucleico diana.
La al menos una muestra puede comprender cualquier muestra que comprenda al menos una molécula de ácido nucleico diana. La al menos una muestra puede obtenerse de cualquier fuente. Por ejemplo, la al menos una muestra puede comprender una muestra de ácidos nucleicos derivados de un ser humano, por ejemplo, una muestra extraída de un hisopo de piel de un paciente humano.
Como alternativa, la al menos una muestra puede derivarse de otras fuentes, tales como una muestra de un suministro de agua. Una muestra de este tipo podría contener miles de millones de moléculas de ácido nucleico plantilla. Sería posible mutar cada uno de estos miles de millones de moléculas de ácido nucleico diana simultáneamente usando los métodos de la invención, por lo que no hay límite superior en el número de moléculas de ácido nucleico diana que podrían usarse en los métodos de la invención.
En una realización, la etapa a. comprende proporcionar más de una muestra. Por ejemplo, la etapa a. puede comprender proporcionar 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 15, 20, 25, 50, 75 o 100 muestras. Opcionalmente, la etapa a.
comprende proporcionar más de 2000, menos de 1000, menos de 750, o menos de 500 muestras. En una realización adicional, la etapa a. comprende proporcionar entre 2 y 100, entre 2 y 75, entre 2 y 50, entre 2 y 25, entre 5 y 15, o entre 7 y 15 muestras.
Amplificar la al menos una molécula de ácido nucleico diana usando una ADN polimerasa de bajo sesgo
Los métodos de la invención comprenden amplificar la al menos una molécula de ácido nucleico diana usando una ADN polimerasa de bajo sesgo.
Amplificar la al menos una molécula de ácido nucleico diana se refiere a replicar la al menos una molécula de ácido nucleico diana para proporcionar al menos una molécula de ácido nucleico que sea complementaria a la al menos una molécula de ácido nucleico diana y/o réplicas de la al menos una molécula de ácido nucleico diana. Amplificar la al menos una molécula de ácido nucleico diana usando una ADN polimerasa de bajo sesgo, aumenta el número de réplicas de la al menos una molécula de ácido nucleico diana e introduce mutaciones en la al menos una molécula de ácido nucleico diana. Dado que se introducen mutaciones, las réplicas no son necesariamente idénticas a la al menos una molécula de ácido nucleico diana original. La al menos una molécula de ácido nucleico diana original y las réplicas de la al menos una molécula de ácido nucleico diana pueden denominarse colectivamente como "al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada".
Por ejemplo, amplificar la al menos una molécula de ácido nucleico diana usando una ADN polimerasa de bajo sesgo puede comprender incubar la muestra que comprende la al menos una molécula de ácido nucleico diana con la ADN polimerasa de bajo sesgo y cebadores adecuados en condiciones adecuadas para la ADN polimerasa de bajo sesgo para catalizar la generación de réplicas de la al menos una molécula de ácido nucleico diana.
Los cebadores adecuados comprenden moléculas cortas de ácido nucleico complementarias a regiones que flanquean al menos una molécula de ácido nucleico diana o regiones que flanquean moléculas de ácido nucleico que son complementarias a la al menos una molécula de ácido nucleico diana. Por ejemplo, si la molécula de ácido nucleico diana forma parte un cromosoma, los cebadores pueden ser complementarios a las regiones del cromosoma inmediatamente 3' al extremo 3' de la molécula de ácido nucleico diana y moléculas de ácido nucleico complementarias a las regiones inmediatamente 5' al extremo 5' de la molécula de ácido nucleico diana, o los cebadores serán complementarios a las regiones del cromosoma inmediatamente 3' al extremo 3' de una molécula de ácido nucleico complementaria a la molécula de ácido nucleico diana y moléculas de ácido nucleico complementarias a las regiones inmediatamente 5' al extremo 5' de una molécula de ácido nucleico complementaria a la molécula de ácido nucleico diana. Como alternativa, el usuario puede introducir sitios de unión de cebadores (secuencias cortas de ácido nucleico) en regiones que flanquean las al menos una molécula de ácido nucleico diana. Esto se describe con más detalle en la sección titulada "códigos de barras, muestras y adaptadores".
Las condiciones adecuadas incluyen una temperatura a la que la ADN polimerasa de bajo sesgo puede catalizar la generación de réplicas de la al menos una molécula de ácido nucleico diana. Por ejemplo, puede usarse una temperatura entre 40 °C y 90 °C, entre 50 °C y 80 °C, entre 60 °C y 70 °C, o alrededor de 68 °C.
La etapa de amplificar la al menos una molécula de ácido nucleico diana comprende múltiples rondas de replicación. Por ejemplo, la etapa de amplificar la al menos una molécula de ácido nucleico diana comprende:
i) una ronda de replicación de la al menos una molécula de ácido nucleico diana para proporcionar al menos una molécula de ácido nucleico que sea complementaria con la al menos una molécula de ácido nucleico diana; y ii) una ronda de replicación de la al menos una molécula de ácido nucleico diana para proporcionar réplicas de la al menos una molécula de ácido nucleico diana.
Opcionalmente, la etapa de amplificar la al menos una molécula de ácido nucleico diana comprende al menos 4, al menos 6, al menos 8 o al menos 10 rondas de replicación de al menos una molécula de ácido nucleico diana. Algunas de estas rondas de replicación de la al menos una molécula de ácido nucleico diana tienen lugar en presencia de análogos de nucleótidos. Opcionalmente, la etapa de amplificar la al menos una molécula de ácido nucleico diana comprende al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 o al menos 6 rondas de replicación a una temperatura entre 60 °C y 80 °C.
Opcionalmente, la etapa de amplificar la al menos una molécula de ácido nucleico diana se lleva a cabo usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR es un proceso que implica múltiples rondas de las siguientes etapas para replicar una molécula de ácido nucleico:
a) fusión;
b) hibridación;
c) extensión; y
d) elongación.
La molécula de ácido nucleico (tal como al menos una molécula de ácido nucleico diana) se mezcla con cebadores adecuados y una polimerasa, tal como una ADN polimerasa de bajo sesgo de la invención. En la etapa de fusión, la molécula de ácido nucleico se calienta a una temperatura superior a 90 °C de modo que una molécula de ácido nucleico bicatenaria se desnaturalice (se separe en dos hebras). En la etapa de hibridación, la molécula de ácido nucleico se enfría a una temperatura inferior a 75 °C, por ejemplo, entre 55 °C y 70 °C, alrededor de 55 °C, o alrededor de 68 °C para permitir que los cebadores hibriden con la molécula de ácido nucleico. En la etapa de extensión, la molécula de ácido nucleico se calienta a una temperatura superior a 60 °C para permitir que la ADN polimerasa catalice la extensión del cebador, la adición de nucleótidos complementarios a la hebra plantilla. En la etapa de elongación, la molécula de ácido nucleico se calienta a una temperatura a la que la ADN polimerasa tiene una alta actividad, tal como una temperatura entre 60 °C y 70 °C, para catalizar la adición de otros ácidos nucleicos complementarios con el fin de completar la nueva hebra de ácido nucleico.
Opcionalmente, el método de la invención comprende múltiples rondas de PCR usando la ADN polimerasa de bajo sesgo.
La ADN polimerasa de bajo sesgo
Los métodos de la invención comprenden una etapa de amplificar la al menos una molécula de ácido nucleico diana usando una ADN polimerasa de bajo sesgo. Como se analiza a continuación, la ADN polimerasa de bajo sesgo utilizada en los métodos y usos de la invención es una ADN polimerasa de alta fidelidad de bajo sesgo y, así, las referencias a la "ADN polimerasa de bajo sesgo" pueden considerarse referencias a una "ADN polimerasa de alta fidelidad de bajo sesgo".
De acuerdo con la presente invención, una "ADN polimerasa de bajo sesgo" es una ADN polimerasa que (a) presenta un bajo sesgo de mutación y/o (b) presenta un bajo sesgo de amplificación de plantilla. La ADN polimerasa de bajo sesgo utilizada en los métodos y usos de la invención tiene un bajo sesgo de amplificación de plantilla.
Sesgo de mutación bajo
Una ADN polimerasa de bajo sesgo que presenta un bajo sesgo de mutación es una ADN polimerasa que puede mutar adenina y timina, adenina y guanina, adenina y citosina, timina y guanina, timina y citosina, o guanina y citosina a tasas similares. En una realización, la ADN polimerasa de bajo sesgo es capaz de mutar adenina, timina, guanina y citosina a tasas similares.
Opcionalmente, la ADN polimerasa de bajo sesgo es capaz de mutar adenina y timina, adenina y guanina, adenina y citosina, timina y guanina, timina y citosina, o guanina y citosina en una proporción de tasas de 0,5-1,5:0,5-1,5, 0,6-1,4:0,6-1,4, 0,7-1,3:0,7-1,3, 0,8-1,2:0,8-1,2, o alrededor 1:1 respectivamente. Preferentemente, la ADN polimerasa de bajo sesgo es capaz de mutar guanina y adenina en una proporción de tasas de 0,5-1,5:0,5-1,5, 0,6-1,4:0,6-1,4, 0,7-1,3:0,7-1,3, 0,8-1,2:0,8-1,2, o alrededor de 1:1 respectivamente. Preferentemente, la ADN polimerasa de bajo sesgo es capaz de mutar timina y citosina en una proporción de tasas de 0,5-1,5:0,5-1,5, 0,6-1,4:0,6-1,4, 0,7-1,3:0,7-1,3, 0,8-1,2 :0,8-1,2 , o alrededor de 1:1 respectivamente.
En dichas realizaciones, en una etapa de amplificar la al menos una molécula de ácido nucleico diana usando una ADN polimerasa de bajo sesgo, la a Dn polimerasa muta los nucleótidos adenina y timina, adenina y guanina, adenina y citosina, timina y guanina, timina y citosina, o guanina y citosina en la al menos una molécula de ácido nucleico diana en una proporción de tasas de 0,5-1,5:0,5-1,5, 0,6-1,4:0,6-1,4, 0,7-1,3:0,7-1,3, 0,8-1,2:0,8-1,2, o alrededor de 1:1 respectivamente. Preferentemente, la ADN polimerasa de bajo sesgo muta los nucleótidos guanina y adenina en la al menos una molécula de ácido nucleico diana en una proporción de tasas de 0,5-1,5:0,5-1,5, 0,6-1,4:0,6-1,4, 0,7-1,3:0,7-1,3, 0,8-1,2:0,8-1,2, o alrededor de 1:1 respectivamente. Preferentemente, la ADN polimerasa de bajo sesgo muta los nucleótidos timina y citosina en la al menos una molécula de ácido nucleico diana en una proporción de tasas de 0,5-1,5:0,5-1,5, 0,6-1,4:0,6-1,4, 0,7-1,3:0,7-1,3, 0,8-1,2:0,8-1,2, o alrededor de 1:1 respectivamente.
Opcionalmente, la ADN polimerasa de bajo sesgo es capaz de mutar adenina, timina, guanina y citosina en una proporción de tasas de 0,5-1,5:0,5-1,5:0,5-1,5:0,5-1,5, 0,6-1,4:0,6-1,4:0,6-1,4:0,6-1,4, 0,7-1,3:0,7-1,3:0,7-1,3:0,7-1,3, 0,8-1,2:0,8-1,2:0,8-1,2:0,8-1,2, o alrededor de 1:1:1:1 respectivamente. Preferentemente, la ADN polimerasa de bajo sesgo es capaz de mutar adenina, timina, guanina y citosina en una proporción de tasas de 0,7-1,3:0,7-1,3:0,7-1,3:0,7-1.3.
En dichas realizaciones, en una etapa de amplificar la al menos una molécula de ácido nucleico diana usando una ADN polimerasa de bajo sesgo, la ADN polimerasa puede mutar los nucleótidos adenina, timina, guanina y citosina en la al menos una molécula de ácido nucleico diana en una proporción de tasas de 0,5-1,5:0,5-1,5:0,5-1,5:0,5-1,5, 0,6-1,4:0,6-1,4:0,6-1,4:0,6-1,4, 0,7-1,3:0,7-1,3:0,7-1,3:0,7-1,3, 0,8-1,2:0,8-1,2:0,8-1,2:0,8-1,2, o alrededor de 1:1:1:1 respectivamente. Preferentemente, la ADN polimerasa de bajo sesgo muta los nucleótidos adenina, timina, guanina y citosina en la al menos una molécula de ácido nucleico diana en una proporción de tasas de 0,7-1,3:0,7-1,3:0,7-1,3:0,7-1.3.
La adenina, timina, citosina y/o guanina pueden sustituirse con otro nucleótido. Por ejemplo, si la ADN polimerasa de bajo sesgo es capaz de mutar adenina, la amplificación de la al menos una molécula de ácido nucleico diana en presencia de la ADN polimerasa de bajo sesgo puede sustituir al menos un nucleótido de adenina en la molécula de ácido nucleico por timina, guanina o citosina. De manera similar, si la ADN polimerasa de bajo sesgo es capaz de mutar timina, la amplificación de al menos una molécula de ácido nucleico diana en presencia de la ADN polimerasa de bajo sesgo puede sustituir al menos un nucleótido de timina por adenina, guanina o citosina. Si la ADN polimerasa de bajo sesgo es capaz de mutar guanina, la amplificación de la al menos un nucleótido diana en presencia de la ADN polimerasa de bajo sesgo puede sustituir al menos un nucleótido de guanina por timina, adenina o citosina. Si la ADN polimerasa de bajo sesgo es capaz de mutar citosina, la amplificación de la al menos un nucleótido diana en presencia de la ADN polimerasa de bajo sesgo puede sustituir al menos un nucleótido de citosina por timina, guanina o adenina.
Es posible que la ADN polimerasa de bajo sesgo no pueda sustituir un nucleótido directamente, pero aún puede mutar ese nucleótido reemplazando el nucleótido correspondiente en la hebra complementaria. Por ejemplo, si la molécula de ácido nucleico diana comprende timina, habrá un nucleótido de adenina presente en la posición correspondiente de la al menos una molécula de ácido nucleico que es complementaria de la al menos una molécula de ácido nucleico diana. La ADN polimerasa de bajo sesgo puede reemplazar el nucleótido adenina de la al menos una molécula de ácido nucleico que es complementaria de la al menos una molécula de ácido nucleico diana con una guanina y, así, cuando se replica la al menos una molécula de ácido nucleico que es complementaria a la al menos una molécula de ácido nucleico diana, esto dará como resultado que una citosina esté presente en la correspondiente al menos una molécula de ácido nucleico diana replicada donde originalmente había una timina (una sustitución de timina por citosina).
En una realización, la ADN polimerasa de bajo sesgo muta entre el 1 % y el 15 %, entre el 2 % y el 10 %, o alrededor del 8 % de los nucleótidos en el al menos un ácido nucleico diana. En dichas realizaciones, la etapa de amplificar la al menos una molécula de ácido nucleico diana usando una ADN polimerasa de bajo sesgo se lleva a cabo de tal manera que entre el 1 % y el 15 %, entre el 2 % y el 10 %, o alrededor del 8 % de los nucleótidos en el al menos un ácido nucleico diana se mutan. Por ejemplo, si el usuario desea mutar alrededor del 8 % de los nucleótidos en la molécula de ácido nucleico diana, y la ADN polimerasa de bajo sesgo muta alrededor del 1 % de los nucleótidos por ronda de replicación, la etapa de amplificar al menos una molécula de ácido nucleico diana usando una ADN polimerasa de bajo sesgo usando una ADN polimerasa de bajo sesgo puede comprender 8 rondas de replicación.
En una realización, la ADN polimerasa de bajo sesgo es capaz de mutar entre el 0 % y el 3 %, entre el 0 % y el 2 %, entre el 0,1 % y el 5 %, entre el 0,2 % y el 3 %, o alrededor del 1,5 % de los nucleótidos en la al menos una molécula de ácido nucleico diana por ronda de replicación. En una realización, la ADN polimerasa de bajo sesgo muta entre el 0 % y el 3 %, entre el 0 % y el 2 %, entre el 0,1 % y el 5 %, entre el 0,2 % y el 3 %, o alrededor del 1,5 % de los nucleótidos en la al menos una molécula de ácido nucleico diana por ronda de replicación. La cantidad real de mutación que tiene lugar en cada ronda puede variar, pero el promedio puede estar entre el 0 % y el 3 %, entre el 0 % y el 2 %, entre el 0,1 % y el 5 %, entre el 0,2 % y el 3 %, o alrededor del 1,5 %.
Si una ADN polimerasa es capaz de mutar un nucleótido y, si es así, en qué tasa
Se puede determinar amplificando una molécula de ácido nucleico de secuencia conocida en presencia de la ADN polimerasa de bajo sesgo para un número determinado de rondas de replicación si la ADN polimerasa de bajo sesgo es capaz de mutar un cierto porcentaje de los nucleótidos en la al menos una molécula de ácido nucleico diana por ronda de replicación. A continuación, se puede secuenciar la molécula de ácido nucleico amplificada resultante y calcular el porcentaje de nucleótidos que se mutan por ronda de replicación. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico de secuencia conocida puede amplificarse usando 10 rondas de PCR en presencia de la ADN polimerasa de bajo sesgo. A continuación, se puede secuenciar la molécula de ácido nucleico resultante. Si la molécula de ácido nucleico resultante comprende un 10 % de nucleótidos que son diferentes de los nucleótidos correspondientes en la secuencia original conocida, entonces el usuario comprenderá que la ADN polimerasa de bajo sesgo es capaz de mutar el 1 % de los nucleótidos en la al menos una molécula de ácido nucleico diana en promedio por ronda de replicación. De manera similar, para ver si la ADN polimerasa de bajo sesgo muta un cierto porcentaje de los nucleótidos en la al menos una molécula de ácido nucleico diana en un método dado, el usuario podría realizar el método en una molécula de ácido nucleico de secuencia conocida y usar la secuenciación para determinar el porcentaje de nucleótidos que mutan una vez que se completa el método.
La ADN polimerasa de bajo sesgo es capaz de mutar un nucleótido tal como la adenina, si, cuando se usa para amplificar una molécula de ácido nucleico, proporciona una molécula de ácido nucleico en la que algunos casos de ese nucleótido están sustituidos o eliminados. Preferentemente, el término "mutar" se refiere a la introducción de mutaciones de sustitución y, en algunas realizaciones, el término "mutar"se puede sustituir por "introduce sustituciones de'.
La ADN polimerasa de bajo sesgo muta un nucleótido tal como la adenina en al menos una molécula de ácido nucleico diana en el método de la invención si, cuando se lleva a cabo la etapa de amplificar la al menos una molécula de ácido nucleico diana usando una ADN polimerasa de bajo sesgo, esta etapa da como resultado al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada en la que se mutan algunos casos de ese nucleótido. Por ejemplo, si la ADN polimerasa de bajo sesgo muta la adenina en la al menos una molécula de ácido nucleico diana, cuando se lleva a cabo la etapa de amplificar la al menos una molécula de ácido nucleico diana usando una ADN polimerasa de bajo sesgo, esta etapa da como resultado una mutación en al menos una molécula de ácido nucleico diana en la que al menos una adenina ha sido sustituida o eliminada.
Para determinar si una ADN polimerasa es capaz de introducir ciertas mutaciones, el experto simplemente necesita probar la ADN polimerasa usando una molécula de ácido nucleico de secuencia conocida. Una molécula de ácido nucleico adecuada de secuencia conocida es un fragmento de un genoma bacteriano de secuencia conocida, tal como E.coli MG1655. El experto podría amplificar la molécula de ácido nucleico de secuencia conocida usando PCR en presencia de la ADN polimerasa de bajo sesgo. A continuación, el experto podría secuenciar la molécula de ácido nucleico amplificada y determinar si su secuencia es la misma que la secuencia conocida original. Si no, el experto podría determinar la naturaleza de las mutaciones. Por ejemplo, si el experto deseara determinar si una ADN polimerasa es capaz de mutar la adenina utilizando un análogo de nucleótido, el experto podría amplificar la molécula de ácido nucleico de secuencia conocida utilizando PCR en presencia del análogo de nucleótido, y secuenciar la molécula de ácido nucleico amplificada resultante. Si el ADN amplificado tiene mutaciones en posiciones correspondientes a los nucleótidos de adenina en la secuencia conocida, entonces el experto sabrá que la ADN polimerasa podría mutar la adenina usando un análogo de nucleótido.
Las proporciones de tasas se pueden calcular de manera similar. Por ejemplo, si el experto desea determinar la proporción de tasa a la que mutan los nucleótidos guanina y citosina, el experto podría amplificar una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia conocida usando PCR en presencia de la ADN polimerasa de bajo sesgo. A continuación, el experto podría secuenciar la molécula de ácido nucleico amplificada resultante e identificar cuántos de los nucleótidos de guanina se han sustituido o eliminado y cuántos de los nucleótidos de citosina se han sustituido o eliminado. La proporción de tasa es la proporción entre el número de nucleótidos de guanina que se han sustituido o eliminado y el número de nucleótidos de citosina que se han sustituido o eliminado. Por ejemplo, si se han reemplazado o eliminado 16 nucleótidos de guanina y se han reemplazado o eliminado 8 nucleótidos de citosina, los nucleótidos guanina y citosina han mutado en una proporción de tasa de 16:8 o 2:1 respectivamente.
Utilización de análogos de nucleótidos
Es posible que la ADN polimerasa de bajo sesgo no pueda reemplazar los nucleótidos con otros nucleótidos directamente (al menos no con alta frecuencia), pero la ADN polimerasa de bajo sesgo aún puede mutar una molécula de ácido nucleico utilizando un análogo de nucleótido. La ADN polimerasa de bajo sesgo puede reemplazar nucleótidos con otros nucleótidos naturales (es decir, citosina, guanina, adenina o timina) o con análogos de nucleótidos.
La ADN polimerasa de bajo sesgo es una ADN polimerasa de alta fidelidad. Las ADN polimerasas de alta fidelidad tienden a introducir muy pocas mutaciones en general, ya que son muy precisas. Sin embargo, los presentes inventores han descubierto que algunas ADN polimerasas de alta fidelidad aún pueden mutar una molécula de ácido nucleico diana, ya que pueden introducir análogos de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico diana.
En una realización, en ausencia de análogos de nucleótidos, la ADN polimerasa de alta fidelidad introduce menos del 0,01 %, menos del 0,0015 %, menos del 0,001 %, entre el 0 % y el 0,0015 %, o entre el 0 % y el 0,001 % de mutaciones por ronda de replicación.
La ADN polimerasa de bajo sesgo es capaz de incorporar análogos de nucleótidos en la al menos una molécula de ácido nucleico diana. La ADN polimerasa de bajo sesgo incorpora análogos de nucleótidos en la al menos una molécula de ácido nucleico diana. La ADN polimerasa de bajo sesgo puede mutar la adenina, timina, guanina y/o citosina usando un análogo de nucleótidos. La ADN polimerasa de bajo sesgo muta la adenina, timina, guanina y/o citosina en la al menos una molécula de ácido nucleico diana usando un análogo de nucleótido. La ADN polimerasa reemplaza guanina, citosina, adenina y/o timina con un análogo de nucleótido. La ADN polimerasa puede reemplazar guanina, citosina, adenina y/o timina con un análogo de nucleótido.
La incorporación de análogos de nucleótidos en la al menos una molécula de ácido nucleico diana puede usarse para mutar nucleótidos, ya que pueden incorporarse en lugar de los nucleótidos existentes y pueden emparejarse con nucleótidos en la hebra opuesta. Por ejemplo, el dPTP puede incorporarse en una molécula de ácido nucleico en lugar de un nucleótido de pirimidina (puede reemplazar a la timina o la citosina); por favor véase la Figura 7. Una vez en una hebra de ácido nucleico, puede emparejarse con adenina cuando está en forma imino tautomérica. Por tanto, cuando se forma una hebra complementaria, esa hebra complementaria puede tener una adenina presente en una posición complementaria al dPTP. De manera similar, una vez en una hebra de ácido nucleico, puede emparejarse con guanina cuando está en forma amino tautomérica. Por tanto, cuando se forma una hebra complementaria, esa hebra complementaria puede tener una guanina presente en una posición complementaria al dPTP.
Por ejemplo, si se introduce un dPTP en la al menos una molécula de ácido nucleico diana de la invención, cuando se forma una al menos una molécula de ácido nucleico que es complementaria a la al menos una molécula de ácido nucleico diana, la al menos una molécula de ácido nucleico complementaria a la al menos una molécula de ácido nucleico diana comprenderá una adenina o una guanina en una posición complementaria al dPTP en la al menos una molécula de ácido nucleico diana (dependiendo de si el dPTP está en su forma amino o imino). Cuando se replica la al menos una molécula de ácido nucleico que es complementaria a la al menos una molécula de ácido nucleico diana, la réplica resultante de la al menos una molécula de ácido nucleico diana comprenderá una timina o una citosina en una posición correspondiente al dPTP en la al menos una molécula de ácido nucleico diana. Por tanto, se puede introducir una mutación en la timina o la citosina en la al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada.
Como alternativa, si se introduce un dPTP en al menos una molécula de ácido nucleico que es complementaria a la al menos una molécula de ácido nucleico diana, cuando se forma una réplica de la al menos una molécula de ácido nucleico diana, la réplica de la al menos una molécula de ácido nucleico diana comprenderá una adenina o una guanina en una posición complementaria al dPTP en la al menos una molécula de ácido nucleico complementaria a la al menos una molécula de ácido nucleico diana (dependiendo de la forma tautomérica del dPTP). Por tanto, se puede introducir una mutación en la adenina o la guanina en la al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada.
En una realización, la ADN polimerasa de bajo sesgo puede reemplazar la citosina o la timina con un análogo de nucleótido. En una realización adicional, la ADN polimerasa de bajo sesgo introduce nucleótidos de guanina o adenina utilizando un análogo de nucleótido en una proporción de tasas de 0,5-1,5:0,5-1,5, 0,6-1,4:0,6-1,4, 0,7-1,3:0,7-1,3, 0,8-1,2:0,8-1,2, o alrededor de 1:1 respectivamente. Los nucleótidos de guanina o adenina pueden ser introducidos por la ADN polimerasa de bajo sesgo emparejándolos frente a un análogo de nucleótido tal como dPTP. En una realización adicional, la ADN polimerasa de bajo sesgo introduce nucleótidos de guanina o adenina usando un análogo de nucleótido en una proporción de tasas de 0,7-1,3:0,7-1,3 respectivamente.
El experto puede determinar, usando métodos convencionales, si la ADN polimerasa de bajo sesgo es capaz de incorporar análogos de nucleótidos en la al menos una molécula de ácido nucleico diana o mutar la adenina, timina, guanina y/o citosina en la al menos una molécula de ácido nucleico diana usando un análogo de nucleótido usando métodos convencionales.
Por ejemplo, para determinar si la ADN polimerasa de bajo sesgo es capaz de incorporar análogos de nucleótidos en la al menos una molécula de ácido nucleico diana, el experto podría amplificar una molécula de ácido nucleico usando una ADN polimerasa de bajo sesgo para dos rondas de replicación. La primera ronda de replicación debe tener lugar en presencia del análogo de nucleótido y la segunda ronda de replicación debe tener lugar en ausencia del análogo de nucleótido. Las moléculas de ácido nucleico amplificadas resultantes podrían secuenciarse para ver si se han introducido mutaciones y, de ser así, cuántas mutaciones. El usuario debería repetir el experimento sin el análogo de nucleótido y comparar el número de mutaciones introducidas con y sin el análogo de nucleótido. Si el número de mutaciones que se han introducido con el análogo de nucleótido es significativamente mayor que el número de mutaciones que se han introducido sin el análogo de nucleótido, el usuario puede concluir que la ADN polimerasa de bajo sesgo puede incorporar análogos de nucleótidos. De manera similar, el experto puede determinar si una ADN polimerasa incorpora análogos de nucleótidos o muta la adenina, timina, guanina y/o citosina usando un análogo de nucleótidos. El experto simplemente necesita realizar el método en presencia de análogos de nucleótidos y ver si el método conduce a mutaciones en posiciones originalmente ocupadas por la adenina, timina, guanina y/o citosina.
El método comprende una etapa de amplificar la al menos una molécula de ácido nucleico diana usando una ADN polimerasa de bajo sesgo, donde la etapa de amplificar la al menos una molécula de ácido nucleico diana usando una ADN polimerasa de bajo sesgo se lleva a cabo en presencia del análogo de nucleótido y la etapa de amplificar la al menos una molécula de ácido nucleico diana proporciona al menos una molécula de ácido nucleico diana que comprende el análogo de nucleótido.
Los análogos de nucleótidos adecuados incluyen dPTP (2'desoxi-P-nucleósido-5'-trifosfato), 8-Oxo-dGTP (7,8-dihidro-8-oxoguanina), 5Br-dUTP (5-bromo-2'-desoxi uridina-5'-trifosfato), 20H-dATP (2-hidroxi-2'-desoxiadenosina-5-trifosfato), dKTP (9-(2-Desoxi-(3-D-ribofuranosil)-N6-metoxi-2,6-diaminopurina-5'-trifosfato) y dITP (2'-desoxiinosina 5'-trifosfato). El análogo de nucleótido puede ser dPTP. Los análogos de nucleótidos pueden usarse para introducir las mutaciones de sustitución descritas en la Tabla 1.
T l 1
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Se pueden usar los diferentes análogos de nucleótidos, solos o en combinación, para introducir diferentes mutaciones en la al menos una molécula de ácido nucleico diana. Por consiguiente, la ADN polimerasa de bajo sesgo puede introducir mutaciones de sustitución de guanina por adenina, mutaciones de sustitución de citosina por timina, mutaciones de sustitución de adenina por guanina y mutaciones de sustitución de timina por citosina utilizando un análogo de nucleótido. La ADN polimerasa de bajo sesgo puede ser capaz de introducir mutaciones de sustitución de guanina por adenina, mutaciones de sustitución de citosina por timina, mutaciones de sustitución de adenina por guanina y mutaciones de sustitución de timina por citosina, opcionalmente usando un análogo de nucleótido.
La ADN polimerasa de bajo sesgo puede ser capaz de introducir mutaciones de sustitución de guanina por adenina, mutaciones de sustitución de citosina por timina, mutaciones de sustitución de adenina por guanina y mutaciones de sustitución de timina por citosina en una proporción de tasas de 0,5-1,5:0,5-1,5:0,5-1,5:0,5-1,5, 0,6-1,4:0,6-1,4:0,6-1,4:0,6-1,4, 0,7-1,3:0,7-1,3:0,7-1,3:0,7-1,3, 0,8-1,2:0,8-1,2:0,8-1,2:0,8-1,2, o alrededor de 1:1:1:1 respectivamente. Preferentemente, la ADN polimerasa de bajo sesgo es capaz de introducir mutaciones de sustitución de guanina por adenina, mutaciones de sustitución de citosina por timina, mutaciones de sustitución de adenina por guanina y mutaciones de sustitución de timina por citosina en una proporción de tasas de 0,7-1,3:0,7-1,3:0,7-1,3:0,7-1,3 respectivamente. Métodos adecuados para determinar si la ADN polimerasa de bajo sesgo es capaz de introducir mutaciones de sustitución y en qué proporción de tasas se describen bajo el encabezado "si una ADN polimerasa es capaz de mutar un nucleótido y, si es así, en qué tasa".
En algunos métodos la ADN polimerasa de bajo sesgo introduce mutaciones de sustitución de guanina por adenina, mutaciones de sustitución de citosina por timina, mutaciones de sustitución de adenina por guanina y mutaciones de sustitución de timina por citosina en una proporción de tasas de 0,5-1,5:0,5-1,5:0,5-1,5:0,5-1,5, 0,6-1,4:0,6-1,4:0,6-1,4:0,6-1,4, 0,7-1,3:0,7-1,3:0,7-1,3:0,7-1,3, 0,8-1,2:0,8-1,2:0,8-1,2:0,8-1,2, o alrededor de 1:1:1:1 respectivamente. Preferentemente, la ADN polimerasa de bajo sesgo introduce mutaciones de sustitución de guanina por adenina, mutaciones de sustitución de citosina por timina, mutaciones de sustitución de adenina por guanina y mutaciones de sustitución de timina por citosina en una proporción de tasas de 0,7-1,3:0,7-1,3:0,7-1,3:0,7-1,3 respectivamente. Los métodos adecuados para determinar si las mutaciones de sustitución se introducen y en qué proporción de tasas se describen bajo el encabezado "si una ADN polimerasa es capaz de mutar un nucleótido y, si es así, en qué tasa".
Generalmente, cuando una ADN polimerasa de bajo sesgo usa un análogo de nucleótido para introducir una mutación, esto requiere más de una ronda de replicación. En la primera ronda de replicación, la a Dn polimerasa de bajo sesgo introduce el análogo de nucleótido en lugar de un nucleótido, y en una segunda ronda de replicación, ese análogo de nucleótido se empareja con un nucleótido natural para introducir una mutación de sustitución en la hebra complementaria. La segunda ronda de replicación se puede llevar a cabo en presencia del análogo de nucleótido. Sin embargo, el método puede comprender además una etapa de amplificar la al menos una molécula de ácido nucleico diana que comprende análogos de nucleótidos en ausencia de análogos de nucleótidos. La etapa de amplificar la al menos una molécula de ácido nucleico diana que comprende análogos de nucleótidos en ausencia de análogos de nucleótidos puede llevarse a cabo usando la ADN polimerasa de bajo sesgo.
Opcionalmente, el método proporciona al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada y el método comprende una etapa adicional de amplificar la al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada usando la ADN polimerasa de bajo sesgo.
Sesgo de amplificación de plantilla bajo
La ADN polimerasa de bajo sesgo tiene un bajo sesgo de amplificación de plantilla. Una ADN polimerasa de bajo sesgo tiene un bajo sesgo de amplificación de plantilla si es capaz de amplificar diferentes moléculas de ácido nucleico diana con grados similares de éxito por ciclo. Las ADN polimerasas de alto sesgo pueden tener dificultades para amplificar las moléculas de ácido nucleico plantilla que comprenden un alto contenido de G:C o contienen un alto grado de estructura secundaria. En una realización, la ADN polimerasa de bajo sesgo de la invención tiene un bajo sesgo de amplificación de plantilla para moléculas de ácido nucleico de plantilla que tienen menos de 25.000, menos de 10.000, entre 1 y 15.000 o entre 1 y 10.000 nucleótidos de longitud.
En una realización, para determinar si una ADN polimerasa tiene un bajo sesgo de amplificación de plantilla, el experto podría amplificar una gama de secuencias diferentes utilizando la ADN polimerasa y ver si las diferentes secuencias se amplifican a diferentes niveles secuenciando el ADN amplificado resultante. Por ejemplo, el experto podría seleccionar una gama de moléculas de ácido nucleico cortas (posiblemente 50 nucleótidos) que tengan diferentes características, incluyendo una molécula de ácido nucleico que tenga un alto contenido de GC, una molécula de ácido nucleico que tenga un bajo contenido de GC, una molécula de ácido nucleico que tenga un gran grado de estructura secundaria y una molécula de ácido nucleico que tenga un grado bajo de estructura secundaria. A continuación, el usuario podría amplificar esas secuencias utilizando la ADN polimerasa y cuantificar el nivel al que se amplifica cada una de las moléculas de ácido nucleico. En una realización, si los niveles están en el 25 %, 20 %, 10 %, u 5 % entre sí, entonces la ADN polimerasa tiene un bajo sesgo de amplificación de plantilla.
Como alternativa, en una realización, una ADN polimerasa tiene un bajo sesgo de amplificación de plantilla si es capaz de amplificar fragmentos de 7-10 kpb con una D de Kolmolgorov-Smirnov de menos de 0,1, menos de 0,09 o menos de 0,08. La D de Kolmolgorov-Smirnov D con la que una ADN polimerasa de bajo sesgo particular es capaz de amplificar fragmentos de 7-10 kpb se puede determinar usando un ensayo proporcionado en el Ejemplo 4.
La ADN polimerasa de bajo sesgo es una ADN polimerasa de alta fidelidad. Una ADN polimerasa de alta fidelidad es una ADN polimerasa que no es muy propensa a errores y, por lo tanto, generalmente no introduce un gran número de mutaciones cuando se usa para amplificar una molécula de ácido nucleico diana en ausencia de análogos de nucleótidos. Las ADN polimerasas de alta fidelidad no se utilizan generalmente en métodos para introducir mutaciones, ya que generalmente se considera que las ADN polimerasas propensas a errores son más eficaces. Sin embargo, la presente solicitud demuestra que ciertas polimerasas de alta fidelidad son capaces de introducir mutaciones usando un análogo de nucleótido, y que esas mutaciones pueden introducirse con un sesgo menor en comparación con las ADN polimerasas propensas a errores tales como la polimerasa Taq.
Las ADN polimerasas de alta fidelidad tienen una ventaja adicional. Pueden usarse ADN polimerasas de alta fidelidad para introducir mutaciones cuando se usan con análogos de nucleótidos, pero en ausencia de análogos de nucleótidos, pueden replicar una molécula de ácido nucleico diana con gran precisión. Esto significa que el usuario puede mutar la al menos una molécula de ácido nucleico diana con alto efecto y amplificar la al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada con alta precisión usando la misma ADN polimerasa. Si se usa una ADN polimerasa de baja fidelidad para mutar la molécula de ácido nucleico diana, es posible que deba eliminarse de la mezcla de reacción antes de amplificar la molécula de ácido nucleico diana.
Las ADN polimerasas de alta fidelidad pueden tener una actividad de corrección de errores. Una actividad de corrección de errores puede ayudar a la ADN polimerasa a amplificar una secuencia de ácido nucleico diana con alta precisión. Por ejemplo, una a Dn polimerasa de bajo sesgo puede comprender un dominio de corrección de errores. Un dominio de corrección de errores puede confirmar si un nucleótido añadido por la polimerasa es correcto (comprueba que se empareja correctamente con el ácido nucleico correspondiente de la hebra complementaria) y, si no, lo escinde de la molécula de ácido nucleico. Los inventores han descubierto sorprendentemente que en algunas ADN polimerasas, el dominio de corrección de errores aceptará emparejamientos de nucleótidos naturales con análogos de nucleótidos. El experto conoce la estructura y secuencia de los dominios de corrección de errores adecuados. Las ADN polimerasas que comprenden un dominio de corrección de errores incluyen miembros de las familias de ADN polimerasa I, II y III, tal como la polimerasa Pfu (derivada de Pyrococcus furiosus), la polimerasa T4 (derivada del bacteriófago T4) y las polimerasas termocócicas que se describen con más detalle a continuación.
En una realización, en ausencia de análogos de nucleótidos, la ADN polimerasa de alta fidelidad introduce menos del 0,01 %, menos del 0,0015 %, menos del 0,001 %, entre el 0 % y el 0,0015 %, o entre el 0 % y el 0,001 % de mutaciones por ronda de replicación.
Además, la ADN polimerasa de bajo sesgo puede comprender un dominio de potenciación de la procesividad. Un dominio de potenciación de la procesividad permite que una ADN polimerasa amplifique una molécula de ácido nucleico diana más rápidamente. Esto es ventajoso ya que permite que los métodos de la invención se lleven a cabo más rápidamente.
Polimerasas termocócicas
En una realización, la ADN polimerasa de bajo sesgo es un fragmento o variante de un polipéptido que comprendel SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6 o SEQ ID NO.7. Los polipéptidos de SEQ ID NO. 2, 4, 6 y 7 son polimerasas termocócicas. Las polimerasas del SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6 o SEQ ID NO 7 son ADN polimerasas de bajo sesgo que tienen alta fidelidad y pueden mutar moléculas de ácido nucleico diana incorporando un análogo de nucleótido tal como dPTP. Las polimerasas del SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6 o SEQ ID NO. 7 son particularmente ventajosas ya que tienen un bajo sesgo de mutación y un bajo sesgo de amplificación de plantilla. También son muy procesivas y son polimerasas de alta fidelidad que comprenden un dominio de corrección de errores, lo que significa que, en ausencia de análogos de nucleótidos, pueden amplificar moléculas de ácido nucleico diana mutadas de forma rápida y precisa.
La ADN polimerasa de bajo sesgo puede comprender un fragmento de al menos 400, al menos 500, al menos 600, al menos 700, o al menos 750 aminoácidos contiguos de:
a. una secuencia de SEQ ID NO. 2;
b. una secuencia al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntica al SEQ ID NO. 2;
c. una secuencia de SEQ ID NO. 4;
d. una secuencia al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntica al SEQ ID NO. 4;
e. una secuencia de SEQ ID NO. 6;
f. una secuencia al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntica al SEQ ID NO. 6;
g. una secuencia de SEQ ID NO. 7; o
h. una secuencia al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntica al SEQ ID NO. 7.
Preferentemente, la ADN polimerasa de bajo sesgo comprende un fragmento de al menos 700 aminoácidos contiguos de:
a. una secuencia de SEQ ID NO. 2;
b. una secuencia al menos 98 % o al menos 99 % idéntica al SEQ ID NO. 2;
c. una secuencia de SEQ ID NO. 4;
d. una secuencia al menos 98 % o al menos 99 % idéntica al SEQ ID NO. 4;
e. una secuencia de SEQ ID NO. 6;
f. una secuencia al menos 98 % o al menos 99 % idéntica al SEQ ID NO. 6;
g. una secuencia de SEQ ID NO. 7; o
h. una secuencia al menos 98 % o al menos 99 % idéntica al SEQ ID NO. 7.
La ADN polimerasa de bajo sesgo puede comprender:
a. una secuencia de SEQ ID NO. 2;
b. una secuencia al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntica al SEQ ID NO. 2;
c. una secuencia de SEQ ID NO. 4;
d. una secuencia al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntica al SEQ ID NO. 4;
e. una secuencia de SEQ ID NO. 6;
f. una secuencia al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntica al SEQ ID NO. 6;
g. una secuencia de SEQ ID NO. 7; o
h. una secuencia al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntica al SEQ ID NO. 7.
Preferentemente, la ADN polimerasa de bajo sesgo comprende:
a. una secuencia de SEQ ID NO. 2;
b. una secuencia al menos 98 % o al menos 99 % idéntica al SEQ ID NO. 2;
c. una secuencia de SEQ ID NO. 4;
d. una secuencia al menos 98 % o al menos 99 % idéntica al SEQ ID NO. 4;
e. una secuencia de SEQ ID NO. 6;
f. una secuencia al menos 98 % o al menos 99 % idéntica al SEQ ID NO. 6;
g. una secuencia de SEQ ID NO. 7; o
h. una secuencia al menos 98 % o al menos 99 % idéntica al SEQ ID NO. 7.
La ADN polimerasa de bajo sesgo puede ser una polimerasa termocócica o un derivado de la misma. Las ADN polimerasas de SEQ ID NO 2, 4, 6 y 7 son polimerasas termocócicas. Las polimerasas termocócicas son ventajosas, ya que generalmente son polimerasas de alta fidelidad que pueden usarse para introducir mutaciones usando un análogo de nucleótido con baja tasa de mutación y sesgo de amplificación de plantilla.
Una polimerasa termocócica es una polimerasa que tiene la secuencia polipeptídica de una polimerasa aislada de una cepa del género Thermococcus. Un derivado de una polimerasa termocócica puede ser un fragmento de al menos 400, al menos 500, al menos 600, al menos 700, o al menos 750 aminoácidos contiguos de una polimerasa termocócica, o al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 % idéntico a un fragmento de al menos 400, al menos 500, al menos 600, al menos 700, o al menos 750 aminoácidos contiguos de una polimerasa termocócica. El derivado de una polimerasa termocócica puede ser al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 % idéntico a una polimerasa termocócica. El derivado de una polimerasa termocócica puede ser al menos 98 % idéntico a una polimerasa termocócica.
Una polimerasa termocócica de cualquier cepa puede ser eficaz en el contexto de la presente invención. En una realización, la polimerasa termocócica se deriva de una cepa termocócica seleccionada del grupo que consiste en T. kodakarensis, T. celer, T. siculi, y T. sp KS-1. Las polimerasas termocócicas de estas cepas se describen en el SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6 y SEQ ID NO. 7.
Opcionalmente, la ADN polimerasa de bajo sesgo es una polimerasa que tiene una alta actividad catalítica a temperaturas entre 50 °C y 90 °C, entre 60 °C y 80 °C, o alrededor de 68 °C.
Códigos de barras, etiquetas de muestras y adaptadores
El método puede comprender además introducir códigos de barras en las moléculas de ácido nucleico diana. Para los fines de la presente invención, un código de barras es una secuencia de nucleótidos degenerada o generada aleatoriamente. El término "código de barras" es sinónimo de las expresiones "identificadores moleculares únicos" (UMI) o "etiquetas moleculares únicas" (UMT). El método puede comprender introducir 1, 2 o más códigos de barras en las moléculas de ácido nucleico diana. En una realización preferida, el método comprende introducir varios códigos de barras en las moléculas de ácido nucleico diana, de manera que, una vez introducidos los códigos de barras, la mayoría de las moléculas de ácido nucleico diana originales comprenden códigos de barras únicos en comparación con otras moléculas de ácido nucleico diana originales.
La introducción de códigos de barras en las moléculas de ácido nucleico diana puede ser útil si el método para introducir mutaciones de la invención se usa como parte de un método para determinar una secuencia. El uso de códigos de barras puede ayudar al usuario a identificar de cuál de las al menos una molécula de ácido nucleico diana original se deriva cada secuencia de al menos una de las moléculas de ácido nucleico diana (o al menos una molécula de ácido nucleico diana amplificada o fragmentada). Si los códigos de barras utilizados en cada molécula de ácido nucleico diana original son diferentes, el usuario puede secuenciar los códigos de barras o las moléculas de ácido nucleico diana, y las secuencias de moléculas de ácido nucleico diana que comprenden los mismos códigos de barras probablemente sean secuencias de moléculas de ácido nucleico diana que se originaron de la misma molécula de ácido nucleico diana original.
El método para introducir mutaciones en al menos una molécula de ácido nucleico diana puede comprender introducir etiquetas de muestra en las moléculas de ácido nucleico diana. Una etiqueta de muestra es una serie corta de ácidos nucleicos de secuencia conocida (especificada). Por ejemplo, el método de la invención se puede realizar en múltiples moléculas de ácido nucleico diana tomadas de diferentes muestras. Esas muestras pueden agruparse, pero antes de la agrupación, se puede introducir una etiqueta de muestra en las moléculas de ácido nucleico diana en una muestra (las moléculas de ácido nucleico diana se marcan con una etiqueta de muestra). Las moléculas de ácido nucleico diana de diferentes muestras pueden marcarse con diferentes etiquetas de muestra. Opcionalmente, las moléculas de ácido nucleico diana de la misma muestra se marcan con la misma etiqueta de muestra o una etiqueta de muestra del mismo subgrupo de etiquetas de muestra. Por ejemplo, si el usuario decide usar dos muestras, las moléculas de ácido nucleico diana de la primera muestra pueden etiquetarse con una primera etiqueta de muestra que tiene una secuencia específica y las moléculas de ácido nucleico diana de la segunda muestra pueden etiquetarse con una segunda etiqueta de muestra que tiene una segunda secuencia especificada. De manera similar, si el usuario decide usar dos muestras, las moléculas de ácido nucleico diana de la primera muestra pueden etiquetarse con una etiqueta de muestra de un primer subgrupo de etiquetas de muestra y las moléculas de ácido nucleico diana de la segunda muestra pueden etiquetarse con una etiqueta de muestra de un segundo subgrupo de etiquetas de muestra. El usuario comprenderá que cualquier molécula de ácido nucleico diana que comprenda la primera etiqueta de muestra o una etiqueta de muestra del primer subgrupo de etiquetas de muestra se originó a partir de la primera muestra, y cualquier molécula de ácido nucleico diana que comprenda la segunda etiqueta de muestra o una etiqueta de muestra del segundo subgrupo de etiquetas de muestra se originó a partir de la segunda muestra. Es posible determinar qué etiqueta se ha utilizado para marcar una secuencia de ácido nucleico diana secuenciando la secuencia de ácido nucleico diana. Los métodos de secuenciación adecuados se describen con más detalle a continuación.
En una realización, las etiquetas de muestra se introducen (las moléculas de ácido nucleico diana se marcan con una etiqueta de muestra) antes de la etapa de amplificar la al menos una molécula de ácido nucleico diana usando una ADN polimerasa de bajo sesgo. Esto es ventajoso, ya que significa que las muestras pueden agruparse en una etapa temprana del método, lo que reduce el tiempo de manipulación, el número de reactivos necesarios y la posibilidad de introducir errores en la manipulación de muestras. Sin embargo, si las etiquetas de muestra se introducen antes de la etapa de amplificar la al menos una molécula de ácido nucleico diana usando una ADN polimerasa de bajo sesgo, es posible que las etiquetas de muestra sean mutadas por la ADN polimerasa de bajo sesgo. Los presentes inventores han diseñado grupos de etiquetas de muestras que se diseñan de tal manera que se pueden distinguir entre sí incluso si han mutado.
En una realización, se usa un grupo de etiquetas de muestra y las moléculas de ácido nucleico diana de diferentes muestras se marcan con diferentes etiquetas de muestra del grupo. Las moléculas de ácido nucleico diana de la misma muestra pueden marcarse con la misma etiqueta de muestra del grupo o con una etiqueta de muestra del mismo subgrupo de etiquetas de muestras del grupo. Por ejemplo, si el grupo de etiquetas de muestra comprende etiquetas de muestra denominadas A, B, C y D, todas las moléculas de ácido nucleico diana en una primera muestra pueden marcarse usando A o A/B, y todas las moléculas de ácido nucleico diana en una segunda muestra se puede marcar usando C o C/D. Cada etiqueta de muestra del grupo de etiquetas de muestra puede diferir sustancialmente de todas las demás etiquetas de muestra del grupo en al menos 1 diferencia de mutación de baja probabilidad. Cada etiqueta de muestra del grupo de etiquetas de muestra puede diferir de todas las demás etiquetas de muestra del grupo en al menos 1 diferencia de mutación de baja probabilidad.
En un aspecto, la divulgación proporciona un grupo de etiquetas de muestra, en donde cada etiqueta de muestra del grupo difiere sustancialmente de todas las demás etiquetas de muestra del grupo en al menos 1 diferencia de mutación de baja probabilidad. Cada etiqueta de muestra puede diferir de todas las demás etiquetas de muestra del grupo en al menos 1 diferencia de mutación de baja probabilidad.
Con la expresión "difiere sustancialmente de todas las demás etiquetas de muestra del grupo en al menos 1 diferencia de mutación de baja probabilidad" se pretende decir que cada etiqueta se ha diseñado de tal manera que si las etiquetas de muestra son mutadas por al menos 1 mutación de baja probabilidad, las etiquetas seguirán siendo casi diferentes entre sí (sustancialmente todas o todas las demás etiquetas). En una realización, la expresión "sustancialmente todas las demás etiquetas" se refiere a al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 98 % de todas las demás etiquetas de muestra. Una mutación de baja probabilidad es una mutación que ocurre con poca frecuencia en el método para introducir mutaciones de la invención. Por ejemplo, una mutación de baja probabilidad puede ser una mutación de transversión o una mutación indel. Las mutaciones de transversión y las mutaciones indel ocurren con poca frecuencia cuando el método para introducir mutaciones de la invención se realiza usando dPTP como análogo de nucleótidos. Una mutación de transversión es un reemplazo de un nucleótido de purina por un nucleótido de pirimidina (adenina por citosina, adenina por timina, guanina por citosina o guanina por timina), o un nucleótido de pirimidina por un nucleótido de purina (citosina por adenina, citosina por guanina, timina por adenina, o timina por guanina). Una mutación indel es una mutación por deleción o una mutación por inserción. Las etiquetas adecuadas pueden diseñarse computacionalmente usando métodos estadísticos. Por ejemplo, el experto podrá determinar qué tipo de mutación es una mutación de baja probabilidad en un método para introducir mutaciones de la invención. El experto puede realizar el método para introducir mutaciones de la invención y determinar los tipos de mutaciones que se han introducido secuenciando el producto de la molécula de ácido nucleico. Las mutaciones que ocurren con mayor frecuencia son mutaciones de alta probabilidad y las mutaciones que ocurren con menor frecuencia son mutaciones de baja probabilidad.
El usuario podría generar etiquetas de muestra adecuadas utilizando el método para diseñar un grupo de etiquetas de muestra.
Opcionalmente, cada etiqueta de muestra difiere sustancialmente de todas las demás etiquetas de muestra del grupo en al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, entre 3 y 50, entre 3 y 25, o entre 3 y 10 diferencias de baja probabilidad de mutación. Opcionalmente, cada etiqueta de muestra difiere de todas las demás etiquetas de muestra del grupo en al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, entre 3 y 50, entre 3 y 25, o entre 3 y 10 diferencias de baja probabilidad de mutación.
Cada etiqueta de muestra puede diferir de sustancialmente todas las demás etiquetas de muestra del grupo en al menos 2 diferencias de mutación de alta probabilidad. Una diferencia de mutación de alta probabilidad, es una mutación que ocurre con frecuencia en un método para introducir mutaciones de la invención. Por ejemplo, una diferencia de mutación de alta probabilidad puede ser una mutación de transición. Una mutación de transición es un reemplazo de un nucleótido de purina por otro nucleótido de purina (adenina por guanina o guanina por adenina), o un nucleótido de pirimidina por otro nucleótido de pirimidina (citosina por timina o timina por citosina).
Cada etiqueta de muestra puede diferir de todas las demás etiquetas de muestra del grupo en al menos 2 diferencias de mutación de alta probabilidad, es decir, cada etiqueta de muestra se ha diseñado de modo que si las etiquetas de muestra se mutan en al menos 2 mutaciones de alta probabilidad, las etiquetas seguirán siendo diferentes entre sí.
Opcionalmente, cada etiqueta de muestra difiere sustancialmente de todas las demás etiquetas de muestra del grupo en al menos 3, entre 2 y 50, entre 3 y 25, o entre 3 y 10 diferencias de alta probabilidad de mutación. Opcionalmente, cada etiqueta de muestra difiere de todas las demás etiquetas de muestra del grupo en al menos 3, entre 2 y 50, entre 5 y 25, o entre 5 y 10 diferencias de alta probabilidad de mutación.
En una realización, cada etiqueta de muestra es al menos 8 nucleótidos, al menos 10 nucleótidos, al menos 12 nucleótidos, entre 8 y 50 nucleótidos, entre 10 y 50 nucleótidos, o entre 10 y 50 nucleótidos de longitud.
Las etiquetas de muestras adecuadas son las de las SEQ ID NOs: 8-136.
El método puede comprender además introducir adaptadores en cada una de las moléculas de ácido nucleico diana. Los adaptadores pueden comprender un sitio de unión del cebador. Para los fines de la invención, los sitios de unión del cebador son secuencias conocidas de nucleótidos que son suficientemente largas para que los cebadores se hibriden específicamente. Opcionalmente, los sitios de unión del cebador son al menos 8, al menos 10, al menos 12, entre 8 y 50, o entre 10 y 25 nucleótidos de longitud.
El método puede comprender introducir un primer adaptador en el extremo 3' de la al menos una molécula de ácido nucleico diana y un segundo adaptador en el extremo 5' de la al menos una molécula de ácido nucleico diana, en donde el primer adaptador y el segundo adaptador pueden hibridarse entre sí.
También se describe en el presente documento un método para amplificar preferentemente moléculas de ácido nucleico que tienen una longitud superior a 1 kpb que comprende:
a. proporcionar al menos una muestra que comprende moléculas de ácido nucleico diana;
b. introducir un primer adaptador en el extremo 3' de las moléculas de ácido nucleico diana y un segundo adaptador en el extremo 5' de las moléculas de ácido nucleico diana; y
c. amplificar las moléculas de ácido nucleico diana utilizando cebadores que son complementarios a una parte del primer adaptador,
en donde el primer adaptador y el segundo adaptador pueden hibridarse entre sí.
El segundo adaptador puede comprender una parte que es complementaria a un primer sitio de unión del cebador y el primer adaptador puede comprender el primer sitio de unión del cebador.
Los presentes inventores han descubierto que al introducir un primer adaptador y un segundo adaptador que pueden hibridarse entre sí en la al menos una molécula de ácido nucleico diana, pueden asegurar que los métodos de la invención amplifican y/o mutan preferentemente las moléculas de ácido nucleico diana largas. Si el primer adaptador se puede hibridar con el segundo adaptador, entonces pueden hacerlo en los métodos de la invención dando como resultado al menos una molécula de ácido nucleico auto-hibridada (como se indica en la Figura 5). Las moléculas de ácido nucleico diana auto-hibridadas no se replican y, por lo tanto, no serán amplificadas y/o mutadas por los métodos de la invención. La probabilidad de que el primer adaptador y el segundo adaptador se hibriden entre sí durante los métodos de la invención será mayor para las moléculas de ácido nucleico diana más cortas que para las moléculas de ácido nucleico diana más largas. Por estas razones, la adición de un primer adaptador y un segundo adaptador a la al menos una molécula de ácido nucleico diana de la invención puede usarse para amplificar preferentemente al menos una molécula de ácido nucleico diana más grande.
El método para amplificar preferentemente moléculas de ácido nucleico puede ser un método para amplificar preferentemente moléculas de ácido nucleico diana que tienen más de 1,5 kpb. El método puede comprender además una etapa de secuenciación de las moléculas de ácido nucleico diana. Ejemplos de posibles métodos de secuenciación incluyen la secuenciación de Maxam Gilbert, la secuenciación de Sanger, la secuenciación por nanoporos o la secuenciación que comprende PCR puente. En una realización típica, las etapas de secuenciación implican PCR puente. Opcionalmente, la etapa de PCR puente se lleva a cabo utilizando un tiempo de extensión superior a 5, superior a 10 , superior a 15 o superior a 20 segundos. Un ejemplo del uso de la PCR puente se encuentra en los secuenciadores analizadores de genomas de Illumina.
Es posible que un usuario determine si un primer adaptador y un segundo adaptador se pueden hibridar entre sí. En una realización, el usuario puede identificar si un primer adaptador y un segundo adaptador pueden hibridarse entre sí proporcionando una molécula de ácido nucleico que comprende el primer adaptador y viendo si un cebador que comprende el segundo adaptador es capaz de iniciar la replicación de la molécula de ácido nucleico en condiciones de PCR.
Como alternativa, en una realización, se puede considerar que el primer adaptador y el segundo adaptador pueden emparejarse entre sí si hibridan en las siguientes condiciones: se combinan concentraciones equimolares de los dos cebadores (por ejemplo, 50 pM), a continuación se incuban a alta temperatura tal como 95 °C durante 5 minutos para garantizar que los cebadores sean monocatenarios. A continuación, la solución se enfría lentamente a temperatura ambiente (25 °C) durante un período de aproximadamente 45 minutos.
Los métodos pueden comprender amplificar las moléculas de ácido nucleico diana usando cebadores que son idénticos entre sí o sustancialmente idénticos entre sí. Los cebadores pueden ser complementarios a una parte del primer adaptador. Dos cebadores son "sustancialmente idénticos" entre sí si tienen una secuencia idéntica, o una secuencia que difiere en 1, 2 o 3 nucleótidos. En una realización preferida, los métodos de la invención comprenden amplificar las moléculas de ácido nucleico diana usando cebadores que son idénticos en secuencia o difieren en una única diferencia de nucleótidos.
En una realización, el primer adaptador y el segundo adaptador comprenden secuencias que son complementarias entre sí o sustancialmente complementarias entre sí. El primer adaptador puede ser sustancialmente complementario al segundo adaptador si el primer adaptador es complementario a una molécula de ácido nucleico que es al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 99 % idéntico al segundo adaptador.
El usuario puede usar cebadores que comprenden sitios de unión del cebador, y estos cebadores pueden usarse para amplificar preferentemente réplicas de la al menos una molécula de ácido nucleico diana que se generaron en la última ronda de replicación. Por ejemplo, se puede usar un primer conjunto de cebadores que comprenden un tercer sitio de unión del cebador en una ronda de replicación. En una ronda adicional de replicación, puede usarse un segundo conjunto de cebadores que se unen al tercer sitio de unión del cebador. El segundo conjunto de cebadores solo replicará réplicas de la al menos una molécula de ácido nucleico diana que se generó en una ronda previa de replicación, utilizando el primer conjunto de cebadores.
Pueden usarse un tercer y más conjuntos de cebadores. Preferentemente replicar réplicas de una ronda previa de replicación es ventajoso ya que puede asegurar que cada molécula de ácido nucleico diana amplificada comprenda un alto nivel de mutación (ya que solo al menos una molécula de ácido nucleico diana que ha estado expuesta a al menos una ronda de amplificación se replicará por la ADN polimerasa de bajo sesgo).
Por consiguiente, los métodos de la invención pueden comprender:
(a) introducir un primer adaptador que comprende un primer sitio de unión del cebador en el extremo 3' de la al menos una molécula de ácido nucleico diana o moléculas de ácido nucleico diana y un segundo adaptador que comprende una porción que es complementaria al primer sitio de unión del cebador en el extremo 5' de la al menos una molécula de ácido nucleico diana o moléculas de ácido nucleico diana, en donde el primer adaptador y el segundo adaptador pueden hibridarse entre sí;
(b) amplificar las moléculas de ácido nucleico diana usando un primer conjunto de cebadores que son complementarios al primer sitio de unión del cebador y comprenden un segundo sitio de unión del cebador, opcionalmente usando una ADN polimerasa de bajo sesgo; y
(c) amplificar las moléculas de ácido nucleico diana usando un segundo conjunto de cebadores que son complementarios al segundo sitio de unión del cebador, opcionalmente usando una ADN polimerasa de bajo sesgo.
El segundo conjunto de cebadores puede comprender un tercer sitio de unión del cebador, y las etapas de amplificación adicionales pueden llevarse a cabo usando un tercer o más conjuntos de cebadores que son complementarios al tercer o más sitios de unión del cebador.
Los códigos de barras, etiquetas de muestra y/o adaptadores pueden introducirse usando cualquier método adecuado incluyendo PCR, etiquetado y cizallamiento físico o digestión por restricción de ácidos nucleicos diana combinados con la subsiguiente ligación del adaptador (opcionalmente ligación del extremo adhesivo). Por ejemplo, la PCR se puede llevar a cabo en al menos una molécula de ácido nucleico plantilla diana usando un primer conjunto de cebadores capaces de hibridar con al menos una molécula de ácido nucleico diana. Los códigos de barras, etiquetas de muestra y adaptadores pueden introducirse en cada una de las al menos una molécula de ácido nucleico diana mediante p Cr utilizando cebadores que comprenden una porción (una porción del extremo 5') que comprende un código de barras, una etiqueta de muestra y/o adaptador y una porción (una porción del extremo 3') que tiene una secuencia que es capaz de hibridar (opcionalmente complementaria a) la al menos una molécula de ácido nucleico diana. Dichos cebadores se hibridarán con una molécula de ácido nucleico diana, la extensión del cebador de PCR proporcionará entonces una molécula de ácido nucleico que comprende un código de barras, una etiqueta de muestra y/o un adaptador. Puede usarse un ciclo adicional de PCR con estos cebadores para añadir un código de barras, una etiqueta de muestra y/o un adaptador al otro extremo de la al menos una molécula de ácido nucleico diana. Los cebadores pueden estar degenerados, es decir, la porción del extremo 3' de los cebadores puede ser similar pero no idéntica entre sí.
Los códigos de barras, etiquetas de muestra y/o adaptadores pueden introducirse usando etiquetado. Los códigos de barras, etiquetas de muestra y/o adaptadores se pueden introducir mediante etiquetado directo, o introduciendo una secuencia definida mediante etiquetado seguido de dos ciclos de PCR utilizando cebadores que comprenden una porción capaz de hibridar con la secuencia definida y una porción que comprende un código de barras, una etiqueta de muestra y/o un adaptador. Los códigos de barras, etiquetas de muestra y/o adaptadores pueden introducirse mediante digestión por restricción de la al menos una molécula de ácido nucleico diana original seguida de ligación de ácidos nucleicos que comprenden el código de barras, una etiqueta de muestra y/o un adaptador. La digestión por restricción de la al menos una molécula de ácido nucleico original debe realizarse de manera que la digestión dé como resultado una molécula de ácido nucleico que comprenda la región a secuenciar (la al menos una molécula de ácido nucleico plantilla diana). Los códigos de barras, etiquetas de muestra y/o adaptadores pueden introducirse cortando la al menos una molécula de ácido nucleico diana, seguido de reparación de extremos, adición de una cola de poliA y a continuación la ligación de ácidos nucleicos que comprenden el código de barras, una etiqueta de muestra y/o un adaptador.
Un método para determinar una secuencia de al menos una molécula de ácido nucleico diana
Un aspecto de la invención se refiere a un método para determinar una secuencia de al menos una molécula de ácido nucleico diana que comprende el método para introducir mutaciones de la invención.
Como se describe anteriormente, el método para introducir mutaciones de la invención puede ser útil como parte de un método para determinar una secuencia de al menos una molécula de ácido nucleico diana, ya que las mutaciones pueden permitir al experto ensamblar secuencias.
Como se describe en la sección Antecedentes, los métodos de secuenciación se pueden mejorar incorporando etapas que introducen mutaciones en al menos una molécula de ácido nucleico diana que se va a secuenciar. Un usuario a menudo amplificará y/o fragmentará la al menos una molécula de ácido nucleico diana antes de secuenciarla. A continuación, el usuario ensamblará una secuencia consenso para al menos una de las moléculas de ácido nucleico diana a partir de las secuencias de regiones de la al menos una molécula de ácido nucleico diana amplificada o fragmentada. La introducción de mutaciones en la al menos una molécula de ácido nucleico diana antes de la amplificación o fragmentación puede ayudar al usuario a identificar cuál de las al menos una molécula de ácido nucleico plantilla original se derivó de cada secuencia de regiones de al menos una molécula de ácido nucleico diana amplificada o fragmentada, y así mejorar la precisión de las secuencias de consenso.
Cuanto más aleatorias sean las mutaciones que se introduzcan, más fácil será identificar de cuál de la al menos una molécula de ácido nucleico diana original se deriva cada secuencia de al menos una molécula de ácido nucleico diana amplificada o fragmentada. El método de introducción de mutaciones de la invención, que utiliza una ADN polimerasa de bajo sesgo, se puede utilizar para introducir mutaciones de forma sustancialmente aleatoria, por lo que es ideal para su inclusión en un método para determinar una secuencia de al menos una molécula de ácido nucleico diana.
El método para determinar una secuencia de al menos una molécula de ácido nucleico diana puede comprender las etapas de:
a. realizar el método para introducir mutaciones en al menos una molécula de ácido nucleico diana de la invención para proporcionar al menos una molécula de ADN diana mutada;
b. opcionalmente fragmentar y/o amplificar la al menos una molécula de ADN diana mutada para proporcionar al menos una molécula de ADN diana mutada fragmentada y/o amplificada;
c. secuenciar regiones de la al menos una molécula de ADN diana mutada de la al menos una molécula de ADN diana mutada fragmentada y/o amplificada para proporcionar lecturas de la secuencia mutada; y
d. ensamblar una secuencia para al menos una porción de la al menos una molécula de ADN diana usando las lecturas de la secuencia mutada.
En general, las etapas de secuenciación se pueden llevar a cabo utilizando cualquier método de secuenciación. Ejemplos de posibles métodos de secuenciación incluyen la secuenciación de Maxam Gilbert, la secuenciación de Sanger, la secuenciación por nanoporos o la secuenciación que comprende PCR puente. En una realización típica, las etapas de secuenciación implican PCR puente. Opcionalmente, la etapa de PCR puente se lleva a cabo utilizando un tiempo de extensión superior a 5, superior a 10, superior a 15 o superior a 20 segundos. Un ejemplo del uso de la PCR puente se encuentra en los secuenciadores analizadores de genomas de Illumina.
El método puede comprender regiones de secuenciación de al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada para proporcionar lecturas de secuencia mutada. Las regiones pueden corresponder a un fragmento que puede comprender una parte sustancial de la al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada. Puede ser que la al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada completa no se pueda secuenciar por alguna razón, pero el usuario aún puede encontrar útil la secuencia de una porción de la al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada. Las regiones de la al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada pueden comprender la longitud completa de la al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada.
El método puede comprender ensamblar una secuencia para al menos una porción de la al menos una molécula de ácido nucleico diana a partir de las lecturas de la secuencia mutada. La secuencia se puede ensamblar alineando las lecturas de la secuencia mutada y agrupando las lecturas que comparten el mismo patrón de mutación. Se ensamblará una secuencia a partir de lecturas de secuencia mutada en el mismo grupo. El montaje se puede realizar mediante software tal como Clustal W2, IDBA-UD o SOAPdenovo.
Una etapa de amplificación de la al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada podría realizarse mediante cualquier técnica de amplificación adecuada, tal como PCR. De manera adecuada, la PCR se lleva a cabo utilizando la a Dn polimerasa de bajo sesgo en condiciones como las descritas bajo el título "amplificación de la al menos una molécula de ácido nucleico diana usando una ADN polimerasa de bajo sesgo".
Se podría llevar a cabo una etapa de fragmentación de la al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada usando cualquier método apropiado. Por ejemplo, la fragmentación se puede llevar a cabo usando digestión por restricción o usando PCR con cebadores complementarios de al menos una región interna de la al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada. Preferentemente, la fragmentación se lleva a cabo utilizando una técnica que produce fragmentos arbitrarios. La expresión "fragmento arbitrario" se refiere a un fragmento generado aleatoriamente, por ejemplo un fragmento generado por etiquetado. Los fragmentos generados usando enzimas de restricción no son "arbitrarios" ya que la digestión por restricción se produce en secuencias de ADN específicas definidas por la enzima de restricción que se utiliza. Incluso más preferentemente, la fragmentación se lleva a cabo mediante etiquetado. Si la fragmentación se lleva a cabo mediante etiquetado, la reacción de etiquetado introduce opcionalmente una región de adaptador en la al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada. Esta región de adaptador es una secuencia corta de ADN que puede codificar, por ejemplo, adaptadores para permitir la secuenciación de la al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada usando tecnología Illumina.
La etapa de fragmentación puede comprender una etapa adicional de enriquecimiento de la al menos una molécula de ácido nucleico diana fragmentada mutada. La etapa de enriquecimiento de la al menos una molécula de ácido nucleico diana fragmentada mutada puede llevarse a cabo mediante PCR. De manera adecuada, la PCR se lleva a cabo utilizando la ADN polimerasa de bajo sesgo en condiciones como las descritas bajo el título "amplificación de la al menos una molécula de ácido nucleico diana usando una ADN polimerasa de bajo sesgo".
Un método para diseñar una proteína
El método para introducir mutaciones de la invención puede ser útil como parte de un método para diseñar una proteína. Por ejemplo, la ingeniería de proteínas puede implicar la búsqueda de mutaciones que aumenten o disminuyan la actividad de una proteína o cambien su estructura. Como parte de la ingeniería de proteínas, un usuario puede desear mutar aleatoriamente la proteína y ver cómo las mutaciones afectan a la actividad o estructura de la proteína. El presente método es un método que da como resultado una mutagénesis altamente aleatoria y, por tanto, puede usarse ventajosamente como parte de un método para manipular una proteína.
Por consiguiente, en un aspecto de la invención se proporciona un método para diseñar una proteína que comprende el método para introducir mutaciones de la invención.
El método comprende las etapas de:
a. realizar un método para introducir mutaciones de la invención para proporcionar al menos una molécula de ADN diana mutada;
b. insertar la al menos una molécula de ADN diana mutada en un vector; y
c. expresar una proteína codificada por la al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada.
El método puede comprender las etapas de:
a. realizar un método para introducir mutaciones de la invención para proporcionar al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada;
b. amplificar la al menos una molécula de ácido nucleico diana usando una ADN polimerasa de bajo sesgo en la presencia de un análogo de nucleótido para proporcionar moléculas de ácido nucleico diana que comprenden un análogo de nucleótido;
c. amplificar las moléculas de ácido nucleico diana que comprenden un análogo de nucleótido en ausencia de análogos de nucleótidos para proporcionar al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada;
d. insertar la al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada en un vector; y
e. expresar una proteína codificada por la al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada.
Se puede usar cualquier vector adecuado. Opcionalmente el vector es un plásmido, un virus, un cósmido o un cromosoma artificial. Normalmente, el vector comprende además una secuencia de control unida operativamente a la secuencia insertada, permitiendo así la expresión de un polipéptido. Preferentemente, el vector comprende además iniciadores, promotores, potenciadores y otros elementos apropiados que pueden ser necesarios y que están colocados en la orientación correcta, para permitir la expresión de un polipéptido.
Opcionalmente, la etapa de expresar la al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada se logra transformando células bacterianas, transfectando células eucariotas o transduciendo células eucariotas con el vector. Opcionalmente, las células bacterianas son células de Escherichia coli (E.coli).
Por ejemplo, la etapa de expresar la al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada puede comprender insertar la al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada en un vector plasmídico y transformar E. coli con el plásmido. El plásmido puede comprender elementos de control adecuados para expresarse en E.coli tal como un promotor lac o T7 (Dubendorff JW, Studier FW (1991). "Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor". Journal of Molecular Biology. 219 (1): 45-59.)). Las técnicas de expresión adecuadas se describen en Sambrook, J. et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York.
Como alternativa, la etapa de expresar la al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada puede comprender la expresión de fragmentos producidos directamente a partir de la etapa de amplificar las moléculas de ácido nucleico diana usando un método in vitro.
El método puede comprender además una etapa de probar la actividad o evaluar la estructura de la proteína codificada por la al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada.
La etapa de probar la actividad o evaluar la estructura de la proteína codificada por la al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada puede llevarse a cabo usando cualquier tipo de técnicas bien conocidas. Por ejemplo, el experto conocerá las técnicas adecuadas para evaluar la estructura de una proteína, incluidas las técnicas de resonancia magnética nuclear (RMN), las técnicas de microscopía tal como la microscopía crioelectrónica, las técnicas de dispersión de rayos X de ángulo pequeño o las técnicas cristalografía de rayos X.
De manera similar, el experto conocerá las técnicas que podrían usarse para evaluar la actividad de una proteína. El método utilizado dependerá de la proteína que está codificada por la al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada. Por ejemplo, si la proteína que está codificada por la al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada es un factor de coagulación de la sangre, el experto probaría la proteína para determinar la actividad de coagulación, por ejemplo, usando un ensayo de coagulación cromogénico. Como alternativa, si la proteína que está codificada por la al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada es una enzima, el experto podría probar la actividad de la enzima midiendo la velocidad a la que cataliza su reacción, por ejemplo, midiendo la reducción de la concentración de un producto de partida o aumento de la concentración de un producto final de la reacción catalizada por la enzima.
Un método para el diseño de un grupo de etiquetas de muestra
También se describe en el presente documento un método para diseñar un grupo de etiquetas de muestra adecuadas para su uso en un método para introducir mutaciones en al menos una molécula de ácido nucleico diana que comprende:
a. analizar el método para introducir mutaciones en al menos una molécula de ácido nucleico diana y determinar el número medio de mutaciones de baja probabilidad que tienen lugar durante el método para introducir mutaciones en al menos una molécula de ácido nucleico diana; y
b. determinar secuencias para un grupo de etiquetas de muestra en donde cada etiqueta de muestra difiere sustancialmente de todas las etiquetas de muestra del grupo por más diferencias de mutación de probabilidad baja que el número promedio de mutaciones de probabilidad baja que tienen lugar durante el método para introducir mutaciones en al menos una molécula de ácido nucleico diana.
Por ejemplo, el usuario puede generar una primera etiqueta de muestra putativa utilizando un programa informático para generar una secuencia aleatoria. La primera etiqueta de muestra putativa se agrega al grupo de etiquetas de muestra. El usuario puede entonces generar una segunda etiqueta de muestra putativa de la misma manera, y comparar la secuencia de la segunda etiqueta de muestra putativa con la primera etiqueta de muestra putativa para ver si la segunda etiqueta de muestra difiere de la primera etiqueta de muestra, de modo que incluso si se introdujeran un número de mutaciones de baja probabilidad en la segunda etiqueta de muestra putativa, aún sería diferente de la primera etiqueta de muestra putativa. En caso afirmativo, entonces se añade la segunda etiqueta de muestra putativa al grupo de etiquetas de muestra. En caso negativo, entonces se descarta la segunda etiqueta de muestra putativa. Esto puede repetirse para una tercera y más etiquetas de muestra putativas.
Como se ha descrito anteriormente, es ventajoso añadir etiquetas de muestra a al menos una molécula de ácido nucleico diana en un método para introducir mutaciones en al menos una molécula de ácido nucleico diana. Sin embargo, si las etiquetas de muestra se agregan antes de que se introduzcan las mutaciones, esto puede significar que las etiquetas de muestra están mutadas y no pueden usarse para distinguir moléculas de ácido nucleico diana que se originaron a partir de la misma o diferentes muestras. Esto se puede evitar diseñando las etiquetas de muestra de modo que incluso si están mutadas, sean lo suficientemente diferentes entre sí para que el usuario pueda distinguirlas.
El método puede comprender además:
a.
(i) analizar el método para introducir mutaciones en al menos una molécula de ácido nucleico diana y determinar el número medio de mutaciones de alta probabilidad que tienen lugar durante el método para introducir mutaciones en al menos una molécula de ácido nucleico diana; y
(ii) determinar secuencias para un grupo de etiquetas de muestra en donde cada etiqueta de muestra difiere sustancialmente de todas las etiquetas de muestra del grupo por más diferencias de mutación de probabilidad alta que el número promedio de mutaciones de probabilidad alta que tienen lugar durante el método para introducir mutaciones en al menos una molécula de ácido nucleico diana.
Una mutación de baja probabilidad puede ser una mutación de transversión o una mutación indel. Una mutación de alta probabilidad puede ser una mutación de transición.
El método puede ser un método implementado por ordenador.
También se describe en el presente documento un medio legible por ordenador configurado para realizar el método para diseñar un grupo de etiquetas de muestra adecuadas para su uso en un método para introducir mutaciones en al menos una molécula de ácido nucleico diana.
También se describe en el presente documento un grupo de etiquetas de muestra que se pueden obtener mediante el método para diseñar etiquetas de muestra de la divulgación. Opcionalmente, el grupo de etiquetas de muestra se obtiene mediante el método para diseñar etiquetas de muestra de la divulgación.
Utilización de dNTP en concentraciones diferentes
La etapa de amplificar el al menos un ácido nucleico diana usando una ADN polimerasa de bajo sesgo en los métodos de la invención puede llevarse a cabo usando dNTP a concentraciones diferentes.
En el presente documento se describe un método para introducir mutaciones en al menos una molécula de ácido nucleico diana que comprende:
a. proporcionar al menos una muestra que comprende al menos una molécula de ácido nucleico diana; y b. introducir mutaciones en la al menos una molécula de ácido nucleico diana mediante la amplificación de la al menos una molécula de ácido nucleico diana usando una ADN polimerasa para proporcionar al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada,
en donde la etapa b. se lleva a cabo utilizando dNTP a concentraciones diferentes.
Para poder amplificar el al menos un ácido nucleico diana utilizando una ADN polimerasa (tal como una ADN polimerasa de bajo sesgo), el ácido nucleico diana puede exponerse a la ADN polimerasa y los dNTP en condiciones adecuadas para que tenga lugar la replicación del ADN, por ejemplo en un sistema de p Cr . Si se lleva a cabo una etapa de amplificación del al menos un ácido nucleico diana utilizando dNTP en concentraciones diferentes, el ácido nucleico diana se expone a una ADN polimerasa (tal como una ADN polimerasa de bajo sesgo) y dNTP, en donde las concentraciones de los dNTP son diferentes entre sí.
Se pretende que el término dNTP se refiera a desoxinucleótidos. Específicamente, en el contexto de la presente solicitud, se pretende que el término "dNTP" se refiera a una solución que comprende dTTP (trifosfato de desoxitimidina) o dUTP (desoxiuridina), dGTP (trifosfato de desoxiguanidina), dCTP (trifosfato de desoxicitidina) y dATP (trifosfato de desoxiadenosina). Opcionalmente, "dNTP" se refiere a una solución que comprende dTTP (trifosfato de desoxitimidina), dGTP (trifosfato de desoxiguanidina), dCTP (trifosfato de desoxicitidina) y dATP (trifosfato de desoxiadenosina).
La expresión "dNTP en concentraciones diferentes" se refiere a que los cuatro dNTP están presentes en solución a diferentes concentraciones entre sí. Por ejemplo, un dNTP puede estar presente en una concentración más alta en comparación con (que) los otros tres dNTP, dos dNTP pueden estar presentes en una concentración más alta en comparación con (que) los otros dos dNTP, o tres dNTP pueden estar presentes en una concentración más alta en comparación con (que) el otro dNTP.
DGTP puede estar presente en una concentración más alta en comparación con (que) dCTP, dTTP y dATP, dGTP puede estar presente en una concentración más alta en comparación con (que) dTTP y dATP, dGTP puede estar presente en una concentración más alta en comparación con (que) dATP, dGTP puede estar presente en una concentración más alta en comparación con (que) dTTP, dCTP puede estar presente en una concentración más alta en comparación con (que) dGTP, dTTP y dATP, dCTP puede estar presente en una concentración más alta en comparación con (que) dTTP y dATP, dCTP puede estar presente en una concentración más alta en comparación con (que) dATP, dCTP puede estar presente en una concentración más alta en comparación con (que) dTTP, dTTP puede estar presente en una concentración más alta en comparación con (que) dGTP, dCTP y dATP, dTTP puede estar presente en una concentración más alta en comparación con (que) dGTP y dCTP, dTTP puede estar presente en una concentración más alta en comparación con (que) dCTP, dTTP puede estar presente en una concentración más alta en comparación con (que) dGTP, dATP puede estar presente en una concentración más alta en comparación con (que) dGTP, dTTP y dCTP, dATP puede estar presente en una concentración más alta en comparación con (que) dGTP y dCTP, dATP puede estar presente en una concentración más alta en comparación con (que) dGTP, dATP puede estar presente en una concentración más alta en comparación con dGTP, dCTP y dATP pueden estar presentes en una concentración más alta en comparación con (que) dGTP y dCTP, o dGTP y dCTP pueden estar presentes en una concentración más alta en comparación con (que) dATP y dTTP.
El usuario puede preparar soluciones de dNTP en concentraciones diferentes de cualquier manera conveniente. DATP, dTTP, dGTP y dTTP están comercializados y el usuario simplemente necesita mezclarlos en una proporción adecuada.
Opcionalmente, el método:
(i) comprende una etapa adicional de amplificar la al menos una molécula de ácido nucleico diana que comprende análogos de nucleótidos en ausencia de análogos de nucleótidos y la etapa adicional de amplificar la al menos una molécula de ácido nucleico diana que comprende análogos de nucleótidos en ausencia de análogos de nucleótidos se lleva a cabo utilizando dNTP en concentraciones diferentes; o
(ii) proporciona al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada, y comprende una etapa adicional de amplificar la al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada usando la ADN polimerasa de bajo sesgo y la etapa adicional de amplificar la al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada utilizando la ADN polimerasa de bajo sesgo se lleva a cabo utilizando dNTP a concentraciones diferentes.
Opcionalmente, la introducción de mutaciones en la al menos una molécula de ácido nucleico diana mediante la amplificación de la al menos una molécula de ácido nucleico diana usando una ADN polimerasa para proporcionar al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada se lleva a cabo en presencia de un análogo de nucleótido. Opcionalmente, el método para introducir mutaciones en al menos una molécula de ácido nucleico diana comprende una etapa de amplificar la al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada en ausencia del análogo de nucleótido, y opcionalmente esta etapa se lleva a cabo usando dNTP a concentraciones diferentes.
Cuando se usa un análogo de nucleótido para introducir mutaciones en al menos una molécula de ácido nucleico diana, esto generalmente implicará dos etapas de amplificación. En la primera etapa de amplificación, el análogo de nucleótido se incorpora en la molécula de ácido nucleico diana (una etapa de mutación). En la segunda etapa de amplificación, el análogo de nucleótido se empareja con un nucleótido natural, introduciendo de este modo una mutación en una hebra de la molécula de ácido nucleico diana (etapa de recuperación). Cuando la molécula de ácido nucleico diana se amplifica más, esta mutación se transmitirá a ambas hebras de la molécula de ácido nucleico diana. Opcionalmente, tanto la primera etapa de amplificación (mutación) como la segunda etapa de amplificación (recuperación) pueden llevarse a cabo usando dNTP a concentraciones diferentes. Opcionalmente los dNTP a concentraciones diferentes son diferentes en la primera etapa de amplificación (mutación) y la segunda etapa de amplificación (recuperación). Por ejemplo, los dNTP en concentraciones diferentes pueden comprender dTTP en una concentración más baja que otros dNTP en la primera etapa de amplificación (mutación) y los dNTP en concentraciones diferentes pueden comprender dATP en una concentración más baja que otros dNTP en la segunda etapa de amplificación (recuperación). La etapa de amplificar la al menos una molécula de ácido nucleico diana usando una ADN polimerasa de bajo sesgo o las etapas que proporcionan al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada pueden corresponder a una o más "etapas de mutación". Una etapa adicional de amplificar la al menos una molécula de ácido nucleico diana que comprende análogos de nucleótidos en ausencia de análogos de nucleótidos o una etapa adicional de amplificar la al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada puede corresponder a una o más "etapas de recuperación".
Opcionalmente, el análogo de nucleótido es dPTP.
En una realización, los dNTP en concentraciones diferentes se usan para alterar el perfil de mutaciones que se introducen. Los dNTP a concentraciones diferentes se utilizan en métodos que comprenden la introducción de mutaciones en al menos una molécula de ácido nucleico diana. Por tanto, los métodos dan como resultado moléculas de ácido nucleico diana que comprenden mutaciones (tales como las moléculas de ácido nucleico diana mutadas descritas en el presente documento). El número de mutaciones, el tipo de mutaciones y la posición de cada una de las mutaciones que se introducen en una determinada molécula de ácido nucleico diana mediante los métodos pueden denominarse como el "perfil de mutaciones" que se introducen. Se pretende que la expresión "tipo de mutación" se refiera a la naturaleza de la mutación, es decir, una mutación de sustitución, una mutación de adición o una mutación de deleción, y si es una mutación de sustitución, cuál fue el nucleótido inicial y cuál fue el nucleótido inicial mutado a (por ejemplo, una mutación de A a G ¿tiene un nucleótido de partida A que está mutado a G)?
El usuario puede determinar el "perfil de mutaciones" que se introduce mediante un método dado replicando una molécula de ácido nucleico diana de prueba, sometiendo a continuación algunas de las réplicas a los métodos que comprenden introducir mutaciones de la invención, pero reservando algunas de las réplicas (sin mutarlas). A continuación, el usuario puede secuenciar las réplicas que se han sometido a los métodos que comprenden introducir mutaciones de la invención y las réplicas reservadas. Finalmente, el usuario puede alinear las secuencias de las réplicas que se han sometido a los métodos que comprenden introducir mutaciones de la invención, y las réplicas reservadas para determinar el número de mutaciones, tipo de mutaciones y posición de cada mutación que se ha introducido. Como alternativa, el usuario puede usar una molécula de ácido nucleico diana de prueba de secuencia conocida. El usuario simplemente necesitará someter la molécula de ácido nucleico diana de prueba a los métodos que comprenden introducir mutaciones de la invención, y a continuación secuenciará la molécula de ácido nucleico diana mutada resultante para ver qué perfil de mutaciones se ha introducido.
El usuario puede desear alterar el perfil de mutación de diferentes formas. Por ejemplo, como se ha descrito anteriormente, es ventajoso poder reducir el sesgo de mutación. Por consiguiente, en una realización, los dNTP en concentraciones diferentes se usan para reducir el sesgo en el perfil de mutaciones que se introducen. En una realización adicional, el método es un método para introducir mutaciones en un perfil de mutación de bajo sesgo.
La presente solicitud demuestra que el uso de dNTP en concentraciones diferentes puede usarse para reducir el sesgo en el perfil de mutaciones que se introducen. Por ejemplo, si se usa una ADN polimerasa (tal como una ADN polimerasa de bajo sesgo descrita anteriormente) para mutar una molécula de ácido nucleico diana e introducir un mayor número de mutaciones de G a A en comparación con otras mutaciones, el usuario puede reducir la concentración de los dATP en relación con otros dNTP, y esto puede disminuir la frecuencia a la que se incorporan los nucleótidos A en lugar de los dGTP y, por lo tanto, disminuir el número de mutaciones de G a A.
De manera similar, si se usa un análogo de nucleótido para introducir mutaciones en una molécula de ácido nucleico diana, se puede usar la alteración de las concentraciones relativas de los dNTP para alterar el perfil de mutación. Por ejemplo, se puede utilizar dPTP para introducir mutaciones de G a A, de C a T, de A a G y de T a C. Como se ha descrito con mayor detalle anteriormente, el dPTP puede reemplazar un nucleótido T o un nucleótido C, y dependiendo de si el dPTP está en su forma amino o imino, este posteriormente puede emparejarse con un nucleótido A o un nucleótido G. Esto conduce a dos escenarios. En el primer escenario, el dPTP reemplaza T en (por ejemplo) la hebra con sentido (etapa de mutación), a continuación puede emparejarse con A (sin mutación) o G (mutación de A a G) en la hebra antisentido. Si el dPTP reemplaza T y se empareja con G en la hebra antisentido, la G mutante se emparejará con una C para introducir una mutación de T a C en una réplica de la hebra con sentido (etapa de recuperación). A la inversa, el dPTP puede reemplazar T en la hebra antisentido, lo que puede conducir a una mutación de A a G en la hebra con sentido y una mutación de T a C en una réplica de la hebra antisentido. En el segundo escenario, el dPTP reemplaza C en (por ejemplo) la hebra con sentido, a continuación puede emparejarse con A (mutación de G a A) o G (sin mutación) en la hebra antisentido (etapa de mutación). Si el dPTP reemplaza C y se empareja con A en la hebra antisentido, la A mutante se emparejará con una T para introducir una mutación de C a T en una réplica de la hebra con sentido (etapa de recuperación). A la inversa, el dPTP puede reemplazar C en la hebra antisentido, lo que puede conducir a una mutación de G a A en la hebra con sentido y una mutación de C a T en una réplica de la hebra antisentido.
La presente solicitud demuestra que si la tasa de mutaciones de G a A y C a T es mayor que la tasa de mutaciones de A a G y de T a C, entonces se reduce la concentración de dTTP en comparación con los otros dNTP (y preferentemente en comparación con la concentración de dCTP) fomentará la incorporación de dPTP en lugar de dTTP, aumentando los casos del primer escenario establecido anteriormente en relación con el segundo escenario, lo que significa que las mutaciones de A a G y de T a C introducidas en el primer escenario aumentarán. De manera similar, la presente solicitud demuestra que si el nivel de dATP se reduce durante la etapa de recuperación, entonces aumenta el nivel de mutaciones de G a A y de C a T. Esto se debe a que en el escenario 2 anterior, si el dATP está presente en una concentración más baja en comparación con los otros dNTP (y preferentemente en comparación con la concentración de dGTP), esto significará que el dPTP que se ha incorporado en lugar de un nucleótido C se emparejará con mayor frecuencia con G y se introducirán menos mutaciones de G a A o de C a T. Los dos escenarios se exponen en la Figura 7.
Incluso las ADN polimerasas de bajo sesgo divulgadas en el presente documento introducen mutaciones en una molécula de ácido nucleico diana con un pequeño sesgo. La presente solicitud demuestra que el uso de concentraciones diferentes de dNTP con una ADN polimerasa de bajo sesgo puede eliminar virtualmente cualquier sesgo de mutación.
Basándose en la información proporcionada en la presente solicitud, está al alcance del experto determinar cómo la alteración de las concentraciones de varios dNTP afectará al perfil de mutación dependiendo de si se usa un análogo de nucleótido y, en caso afirmativo, cuál. Por consiguiente, en algunas realizaciones, los métodos que usan dNTP a concentraciones diferentes comprenden una etapa de identificación de un dNTP cuyo nivel debería aumentarse o disminuirse para reducir el sesgo en el perfil de mutaciones que se introducen.
Opcionalmente, los dNTP a concentraciones diferentes comprenden dTTP a una concentración más baja que otros dNTP. Como se describe anteriormente, esto puede aumentar la tasa de mutaciones de T a C y de A a G que se introducen cuando se usa dPTP como análogo de nucleótido. Opcionalmente, los dNTP a concentraciones diferentes comprenden dTTP a una concentración de menos del 75 %, menos del 70 %, menos del 60 %, menos del 55 %, entre el 25 % y el 75 %, entre el 25 % y el 70 %, entre el 25 % y el 60 %, o alrededor del 50 % de la concentración de dATP, dCTP o dGTP. Opcionalmente, los dNTP a concentraciones diferentes comprenden dTTP a una concentración de menos del 60 % de la concentración de dCTP. Opcionalmente, los dNTP a concentraciones diferentes comprenden dTTP a una concentración de entre el 25 % y el 60 % de la concentración de dCTP.
Opcionalmente, los dNTP a concentraciones diferentes comprenden dATP a una concentración más baja en comparación con otros dNTP. Como se describe anteriormente, esto puede disminuir la tasa de mutaciones de G a C o de C a T que se introducen cuando se usa dPTP como análogo de nucleótido. Opcionalmente, los dNTP a concentraciones diferentes comprenden dATP a una concentración de menos del 75 %, menos del 70 %, menos del 60 %, menos del 55 %, entre el 25 % y el 75 %, entre el 25 % y el 70 %, entre el 25 % y el 60 %, o alrededor del 50 % de la concentración de dTTP, dCTP o dGTP. Opcionalmente, los dNTP a concentraciones diferentes comprenden dATP a una concentración de menos del 75 %, menos del 70 %, menos del 60 %, menos del 55 %, entre el 25 % y el 75 %, entre el 25 % y el 70 %, entre el 25 % y el 60 %, o alrededor del 50 % de la concentración de dGTP. Opcionalmente, los dNTP a concentraciones diferentes comprenden dATP a una concentración de menos del 60 % de la concentración de dGTP. Opcionalmente, los dNTP a concentraciones diferentes comprenden dATP a una concentración entre el 25 % y el 60 % de la concentración de dGTP.
Como se ha expuesto en los escenarios anteriores, cuando se usa dPTP como análogo de nucleótido, la reducción de dTTP aumenta las mutaciones de T a C y de A a G al fomentar el reemplazo de nucleótidos T en la molécula de ácido nucleico diana con dPTP. Por tanto, los dNTP a concentraciones diferentes que comprenden dTTP a una concentración más baja que otros dNTP se utilizan preferentemente en una etapa de mutagénesis (por ejemplo, una etapa de PCR en presencia de dPTP). De manera similar, cuando se usa dPTP como análogo de nucleótido, la reducción de los dATP reduce el número de los dPTP que han reemplazado a los nucleótidos C y se emparejan con dATP y, por lo tanto, aumentan las mutaciones de G a A y de C a T. Dado que el emparejamiento de dPTP con dATP tiende a ocurrir durante una etapa de recuperación, la reducción de los dATP durante la etapa de recuperación aumenta el número de mutaciones de G a A y de C a T. Opcionalmente, por lo tanto, la etapa de amplificar la al menos una molécula de ácido nucleico diana que comprende análogos de nucleótidos en ausencia de análogos de nucleótidos o amplificar la al menos una molécula de ácido nucleico diana mutada en ausencia del análogo de nucleótido se lleva a cabo usando dNTP en concentraciones diferentes, y los dNTP en concentraciones diferentes comprenden dATP en una concentración más baja en comparación con otros dNTP.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Mutación de las moléculas de ácido nucleico usando PrimeStar GXL de otras polimerasas
Las moléculas de ADN se fragmentaron hasta el tamaño apropiado (por ejemplo, 10 kb) y se unió un sitio de cebado de secuencia definida (adaptador) en cada extremo usando etiquetado.
La primera etapa es una reacción de etiquetado para fragmentar el ADN. Se sometieron 50 ng de ADN genómico de alto peso molecular en 4 pl o menos de volumen de una o más cepas bacterianas a etiquetado en las siguientes condiciones. Se combinan 50 ng de ADN con 4 pl de transposasa Nextera (diluida a 1:50) y 8 pl de tampón de etiquetado 2X (Tris 20 mM [pH 7,6], MgCl 20 mM, dimetilformamida al 20 % (v/v)) en un volumen total de 16 pl. La reacción se incubó a 55 °C durante 5 minutos, se añadieron 4 pl de tampón NT (o SDS al 0,2 %) a la reacción y la reacción se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos.
La reacción de etiquetado se limpió usando perlas SPRIselect (Beckman Coulter) siguiendo las instrucciones del fabricante para una selección del tamaño del lado izquierdo usando 0,6 volúmenes de perlas, y el ADN se eluyó en agua de grado molecular.
A esto le siguió la PCR con una combinación de dNTP y dPTP estándar durante 6 ciclos limitados. Usando Primestar GXL, se añadieron 12,5 ng de ADN etiquetado y purificado a un volumen de reacción total de 25 pl, que contenía 1 x tampón GXL, 200 pM de cada uno de dATP, dTTP, dGTP y dCTP, así como dPTP 0,5 mM, y 0,4 pM de cebadores personalizados (Tabla 2).
T l 2:
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Tabla 2. Cebadores personalizados utilizados para mutagénesis por PCR en plantillas de 10 kpb. XXXXXX es una secuencia de código de barras de 6-8 nt definida y específica de la muestra. NNNNNN es una región de 6 nt de nucleótidos aleatorios.
La reacción se sometió a los siguientes ciclos térmicos en presencia de Primestar GXL. Extensión inicial del hueco a 68 °C durante 3 minutos, seguido de 6 ciclos a 98 °C durante 10 segundos, 55 °C durante 15 segundos y 68 °C durante 10 minutos.
La siguiente etapa es una PCR sin dPTP, para eliminar dPTP de las plantillas y reemplazarlos con una mutación de transición ("PCR de recuperación"). Las reacciones de PCR se limpiaron con perlas SPRIselect para eliminar el exceso de dPTP y los cebadores, a continuación se sometieron a 10 rondas adicionales (mínimo 1 ronda, máximo 20) de amplificación utilizando cebadores que se hibridan con los extremos del fragmento introducidos durante los ciclos de incorporación de dPTP (Tabla 3).
T l
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A esto le siguió una etapa de extracción en gel para seleccionar por tamaño los fragmentos amplificados y mutados en un intervalo de tamaño deseado, por ejemplo, de 7-10 kb. La extracción en gel se puede realizar manualmente o mediante un sistema automatizado tal como BluePippin. Esto fue seguido por una ronda adicional de PCR durante 16­ 20 ciclos ("PCR de enriquecimiento").
Después de amplificar un número definido de plantillas mutadas largas, se llevó a cabo la fragmentación aleatoria de las plantillas para generar un grupo de fragmentos más cortos superpuestos para la secuenciación. La fragmentación se realizó mediante etiquetado.
Los fragmentos de ADN largos de la etapa anterior se sometieron a una reacción de etiquetado estándar (por ejemplo, Nextera XT o Nextera Flex), excepto que la reacción se dividió en tres grupos para la amplificación por PCR. Esto permite la amplificación selectiva de los fragmentos derivados de cada extremo de la plantilla original (incluido el código de barras de la muestra), así como los fragmentos internos de la plantilla larga que se han etiquetado nuevamente en ambos extremos. Esto crea efectivamente tres grupos para secuenciar en un instrumento Illumina (por ejemplo, MiSeq o HiSeq).
El método se repitió usando una Taq estándar (Jena Biosciences) y una mezcla de Taq y una polimerasa de corrección de errores (DeepVent) llamada LongAmp (New England Biolabs).
Los datos obtenidos de este experimento se representan en la Figura 1. No se usó dPTP como control. Las lecturas se mapearon contra el genoma de E. coli y se logró una tasa media de mutación de ~ 8 %.
Ejemplo 2 - Comparación de las frecuencias de mutación de diferentes ADN polimerasas
La mutagénesis se realizó con varias ADN polimerasas diferentes (Tabla 4). El ADN genómico de la cepa de E. coli MG1655 se etiquetó para producir fragmentos largos y las perlas se limpiaron como se describe en el método del Ejemplo 1. Esto fue seguido por "mutagénesis PCR" durante 6 ciclos en presencia de dPTP 0,5 mM, purificación de perlas SPRIselect y 14-16 ciclos adicionales de "PCR de recuperación" en ausencia de dPTP. Las plantillas resultantes de mutación larga se sometieron a continuación a una reacción de etiquetado estándar (véase el Ejemplo 1) y los fragmentos "internos" se amplificaron y secuenciaron en un instrumento Illumina MiSeq.
Las tasas de mutación se describen en la Tabla 4, las cuales normalizaron las frecuencias de sustitución de bases mediante reacciones de mutagénesis de dPTP medidas utilizando la secuenciación de Illumina de ADN del genoma de referencia conocido. Para la polimerasa Taq, solo ~12 % de las mutaciones ocurren en los sitios G+C de la plantilla, incluso cuando se usa en un tampón optimizado para las polimerasas de Thermococcus. Las polimerasas de tipo termococcus dan lugar al 58-69 % de las mutaciones en los sitios G+C de la plantilla, mientras que la polimerasa derivada de Pyrococcus produce el 88 % de las mutaciones en los sitios G+C de la plantilla.
Las enzimas se obtuvieron en Jena Biosciences (Taq), Takara (variantes Primestar), Merck Millipore (KOD DNA Polymerase) y New England Biolabs (Phusion).
Taq se probó con el tampón suministrado y también con el tampón Primestar GXL (Takara) para este experimento. Todas las demás reacciones se llevaron a cabo con el tampón estándar suministrado para cada polimerasa.
T l 4
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Ejemplo 3 - Determinación de las tasas de mutagénesis de dPTP
Realizamos mutagénesis de dPTP en varias muestras de ADN genómico con diferentes niveles de contenido de G+C (33-66 %) utilizando una polimerasa de Thermococcus (Primestar GXL; Takara) en un solo conjunto de condiciones de reacción. La mutagénesis y la secuenciación se realizaron como se describe en el método del ejemplo 3, excepto que se realizaron 10 ciclos de "PCR de recuperación". Como estaba previsto, las tasas de mutación fueron aproximadamente similares entre las muestras (tasa media 7-8 %) a pesar de la diversidad del contenido de G+C (figura 2 ).
Ejemplo 4 - medición del sesgo de amplificación de la plantilla
El sesgo de amplificación de la plantilla se midió para dos polimerasas: Kapa HiFi, que es una polimerasa de corrección de errores comúnmente utilizada en los protocolos de secuenciación de Illumina, y PrimeStar GXL, que es una polimerasa de la familia KOD conocida por su capacidad para amplificar fragmentos largos. En el primer experimento, se utilizó Kapa HiFi para amplificar un número limitado de plantillas de ADN genómico de E. coli con tamaños de alrededor de 2 kbp. A continuación se secuenciaron los extremos de estos fragmentos amplificados. Se realizó un experimento similar con PrimeStar GXL en fragmentos de alrededor de 7-10 kbp de E. coli. Las posiciones de cada secuencia final leída se determinaron mapeando respecto al genoma de referencia de E. coli. Se midieron las distancias entre los extremos de los fragmentos vecinos. Estas distancias se compararon con un conjunto de distancias muestreadas al azar de la distribución uniforme. La comparación se realizó mediante la prueba no paramétrica de Kolmolgorov-Smirnov, D. Cuando dos muestras provienen de la misma distribución, el valor de D se acerca a cero. Para la polimerasa PrimeStar de bajo sesgo, observamos D = 0,07 cuando se midió en 50.000 extremos de fragmentos, en comparación con una muestra aleatoria uniforme de 50.000 posiciones genómicas. Para la polimerasa Kapa HiFi, observamos D = 0,14 en 50.000 extremos de fragmentos.
Ejemplo 5: Uso de dos sitios de unión del cebador idénticos y una única secuencia de cebador para la amplificación preferencial de plantillas más largas
Como se describe anteriormente, el etiquetado se puede usar para fragmentar moléculas de ADN e introducir simultáneamente sitios de unión de cebadores (adaptadores) en los extremos de los fragmentos. El sistema de etiquetado Nextera (Illumina) utiliza enzimas transposasas cargadas con uno de dos adaptadores únicos (a los que se hace referencia aquí como X e Y). Esto genera una mezcla aleatoria de productos, algunos con secuencias finales idénticas (X-X, Y-Y) y algunos con extremos únicos (X-Y). Los protocolos estándar de Nextera utilizan dos secuencias de cebadores distintas para amplificar selectivamente los productos "X-Y" que contienen diferentes adaptadores en cada extremo (según se requiera para la secuenciación con la tecnología Illumina). Sin embargo, también es posible usar una única secuencia de cebador para amplificar fragmentos "X-X" o "Y-Y" con adaptadores terminales idénticos.
Para generar plantillas mutadas largas que contienen adaptadores finales idénticos, se sometieron primero 50 ng de ADN genómico de alto peso molecular (cepa MG1655 de E. coli) a etiquetado y a continuación se limpió con perlas SPRIselect como se describe en el Ejemplo 1. A esto le siguieron 5 ciclos de "PCR de mutagénesis" con una combinación de dNTP y dPTP estándar, la cual se realizó como se detalla en el Ejemplo 1 excepto que se utilizó una única secuencia de cebador (Tabla 5).
La reacción de PCR se limpió con perlas SPRIselect para eliminar el exceso de dPTP y cebadores, a continuación se sometió a 10 ciclos adicionales de "PCR de recuperación" en ausencia de dPTP para reemplazar dPTP en las plantillas con mutaciones de transición. La PCR de recuperación se realizó con un solo cebador que se hibrida con los extremos del fragmento introducidos durante los ciclos de incorporación de dPTP, permitiendo de este modo la amplificación selectiva de las plantillas mutadas generadas en la etapa de PCR anterior.
T l :
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Tabla 5. Cebadores utilizados para generar plantillas mutadas con la misma estructura básica de adaptador en ambos extremos. Se usó el cebador "single mut" para la mutagénesis por PCR en fragmentos de ADN generados por etiquetado con Nextera. Este cebador contiene una porción 5' que introduce un sitio de unión del cebador adicional en los extremos del fragmento. El cebador "single rec" es capaz de hibridar con este sitio y se usó durante la PCR de recuperación para amplificar selectivamente las plantillas mutadas generadas con el cebador single_mut. XXXXXXXXXXXXX es una secuencia de código de barras de 13 nt definida y específica de la muestra. NNN es una región de 3 nt de nucleótidos aleatorios.
Como control, se generaron moldes mutados con diferentes adaptadores en cada extremo usando un protocolo idéntico al descrito anteriormente, excepto que se usaron dos secuencias de cebadores distintas durante la PCR de mutagénesis (mostrada en la Tabla 2) y la PCR de recuperación (Tabla 3). Los productos finales de la PCR se limpiaron con perlas SPRIselect y se analizaron en un chip de ADN de alta sensibilidad utilizando el 2100 Bioanalzyer System (Agilent). Como se muestra en la Figura xxx, las plantillas generadas con adaptadores finales idénticos eran significativamente más largas en promedio que la muestra de control que contenía adaptadores dobles. Las plantillas de control se pudieron detectar hasta un tamaño mínimo de ~800 pb, mientras que no se observaron plantillas por debajo de 2000 pb para la muestra de adaptador único.
Se analizaron plantillas mutadas con adaptadores finales idénticos (azul) y plantillas de control con adaptadores dobles en un bioanalizador Agilent 2100 (kit de ADN de alta sensibilidad) para comparar perfiles de tamaño. El uso de adaptadores terminales idénticos inhibe la amplificación de plantillas <2 kpb. Los datos se presentan en la Figura 6.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método para introducir mutaciones de sustitución en al menos una molécula de ADN diana, que comprende:
a. proporcionar al menos una muestra que comprende al menos una molécula de ADN diana; y
b. amplificar la al menos una molécula de ADN diana usando una ADN polimerasa de alta fidelidad de bajo sesgo que tiene un bajo sesgo de amplificación de plantilla;
en donde la etapa de amplificar la al menos una molécula de ADN diana se lleva a cabo en presencia de un análogo de nucleótido y comprende al menos 2 rondas de replicación de la al menos una molécula de ADN diana, en donde en una primera ronda de replicación la ADN polimerasa incorpora el análogo de nucleótido en lugar de un nucleótido y en una segunda ronda de replicación, el análogo de nucleótido se empareja con un nucleótido natural para introducir una mutación de sustitución en la hebra complementaria.
2. Uso de una ADN polimerasa de alta fidelidad de bajo sesgo que tiene un sesgo de amplificación de plantilla bajo en un método para introducir mutaciones en al menos una molécula de ADN diana, en donde el método comprende:
a. proporcionar al menos una muestra que comprende al menos una molécula de ADN diana; y
b. amplificar la al menos una molécula de ADN diana usando la ADN polimerasa;
en donde la etapa de amplificar la al menos una molécula de ADN diana se lleva a cabo en presencia de un análogo de nucleótido y comprende al menos 2 rondas de replicación de la al menos una molécula de ADN diana, en donde en una primera ronda de replicación la ADN polimerasa incorpora el análogo de nucleótido en lugar de un nucleótido y en una segunda ronda de replicación, el análogo de nucleótido se empareja con un nucleótido natural para introducir una mutación de sustitución en la hebra complementaria.
3. El método o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la ADN polimerasa muta los nucleótidos adenina, timina, guanina y citosina en la al menos una molécula de ADN diana en una proporción de tasas de 0,5-1,5:0,5-1,5:0,5-1,5:0,5-1,5, 0,6-1,4:0,6-1,4:0,6-1,4:0,6-1,4, 0,7-1,3:0,7-1,3:0,7-1,3:0,7-1,3, 0,8-1,2:0,8-1,2:0,8-1,2:0,8-1,2, o alrededor de 1:1:1:1 respectivamente, opcionalmente en donde la ADN polimerasa muta los nucleótidos adenina, timina, guanina y citosina en la al menos una molécula de ADN diana en una proporción de tasas de 0,7-1,3:0,7-1,3:0,7-1,3:0,7-1,3 respectivamente.
4. El método o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la ADN polimerasa muta entre el 1 % y el 15 %, entre el 2 % y el 10 %, o alrededor del 8 % de los nucleótidos en la al menos una molécula de ADN diana y/o en donde la ADN polimerasa muta entre el 0 % y el 3 %, o entre el 0 % y el 2 % de los nucleótidos en la al menos una molécula de ADN diana por ronda de replicación.
5. El método o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la ADN polimerasa muta los nucleótidos adenina, timina, guanina y/o citosina en la al menos una molécula de ADN diana usando un análogo de nucleótido y/o en donde la ADN polimerasa reemplaza la guanina, la citosina, la adenina y/o la timina con un análogo de nucleótido, y/o en donde la ADN polimerasa introduce nucleótidos de guanina o adenina utilizando un análogo de nucleótido en una proporción de tasas de 0,5-1,5:0,5-1,5, 0,6-1,4:0,6-1,4, 0,7-1,3:0,7-1,3, 0,8-1,2:0,8-1,2, o alrededor de 1:1 respectivamente, y/o en donde la ADN polimerasa introduce nucleótidos de guanina o adenina utilizando un análogo de nucleótido en una proporción de tasas 0,7-1,3:0,7-1,3 respectivamente.
6. El método o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el análogo de nucleótido es dPTP, opcionalmente en donde la ADN polimerasa introduce mutaciones de sustitución de guanina por adenina, mutaciones de sustitución de citosina por timina, mutaciones de sustitución de adenina por guanina y mutaciones de sustitución de timina por citosina, opcionalmente en donde la ADN polimerasa introduce mutaciones de sustitución de guanina por adenina, mutaciones de sustitución de citosina por timina, mutaciones de sustitución de adenina por guanina y mutaciones de sustitución de timina por citosina en una proporción de tasas de 0,5-1,5:0,5-1,5:0,5-1,5:0,5-1,5, 0,6-1,4:0,6-1,4:0,6-1,4:0,6-1,4, 0,7-1,3:0,7-1,3:0,7-1,3:0,7-1,3, 0,8-1,2:0,8-1,2:0,8-1,2:0,8-1,2, o alrededor de 1:1:1:1 respectivamente, opcionalmente en donde la ADN polimerasa introduce mutaciones de sustitución de guanina por adenina, mutaciones de sustitución de citosina por timina, mutaciones de sustitución de adenina por guanina y mutaciones de sustitución de timina por citosina en una proporción de tasas de 0,7-1,3:0,7-1,3:0,7-1,3:0,7-1,3 respectivamente.
7. El método o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde, en ausencia de análogos de nucleótidos, la ADN polimerasa de alta fidelidad introduce menos del 0,01 %, menos del 0,0015 %, menos del 0,001 %, entre el 0 % y el 0,0015 %, o entre el 0 % y el 0,001 % de mutaciones por ronda de replicación.
8. El método o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el método comprende una etapa adicional de amplificar la al menos una molécula de ADN diana que comprende análogos de nucleótidos en ausencia de análogos de nucleótidos, opcionalmente en donde la etapa de amplificar la al menos una molécula de ADN diana que comprende análogos de nucleótidos en ausencia de análogos de nucleótidos se lleva a cabo usando la ADN polimerasa.
9. El método o uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método proporciona al menos una molécula de ADN diana mutada y el método además comprende una etapa adicional de amplificar la al menos una molécula de ADN diana mutada usando la ADN polimerasa.
10. El método o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la ADN polimerasa comprende un dominio de corrección de errores y/o un dominio potenciador de la procesividad, y/o en donde la ADN polimerasa comprende un fragmento de al menos 400, al menos 500, al menos 600, al menos 700, o al menos 750 aminoácidos contiguos de:
a. una secuencia de SEQ ID NO. 2;
b. una secuencia al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntica al SEQ ID NO. 2;
c. una secuencia de SEQ ID NO. 4;
d. una secuencia al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntica al SEQ ID NO. 4;
e. una secuencia de SEQ ID NO. 6;
f. una secuencia al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntica al SEQ ID NO. 6;
g. una secuencia de SEQ ID NO. 7; o
h. una secuencia al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntica al SEQ ID NO. 7;
opcionalmente en donde la ADN polimerasa comprende:
a. una secuencia de SEQ ID NO. 2;
b. una secuencia al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntica al SEQ ID NO. 2;
c. una secuencia de SEQ ID NO. 4;
d. una secuencia al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntica al SEQ ID NO. 4;
e. una secuencia de SEQ ID NO. 6;
f. una secuencia al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntica al SEQ ID NO. 6;
g. una secuencia de SEQ ID NO. 7; o
h. una secuencia al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntica al SEQ ID NO. 7; opcionalmente en donde:
i) la ADN polimerasa comprende una secuencia al menos 98 % idéntica al SEQ ID NO. 2;
ii) la ADN polimerasa comprende una secuencia al menos 98 % idéntica al SEQ ID NO. 4;
iii) la ADN polimerasa comprende una secuencia al menos 98 % idéntica al SEQ ID NO. 6; o
iv) la ADN polimerasa comprende una secuencia al menos 98 % idéntica al SEQ ID NO. 7;
y/o
en donde la ADN polimerasa de bajo sesgo es una polimerasa termocócica o un derivado de la misma, opcionalmente en donde la polimerasa termocócica se deriva de una cepa termocócica seleccionada del grupo que consiste en T. kodakarensis, T. siculi, T. celer y T. sp KS-1.
11. El método o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además:
A) introducir códigos de barras y/o etiquetas de muestra en la al menos una molécula de ADN diana, opcionalmente en donde:
a) se usa un grupo de etiquetas de muestra y las moléculas de ADN diana de diferentes muestras se marcan con diferentes etiquetas de muestra del grupo, opcionalmente en donde cada etiqueta de muestra difiere sustancialmente de todas las demás etiquetas de muestra del grupo en al menos 1 diferencia de mutación de baja probabilidad o al menos 3 diferencias de mutación de alta probabilidad, opcionalmente en donde cada etiqueta de muestra difiere sustancialmente de todas las demás etiquetas de muestra del grupo en al menos 3 diferencias de mutación de baja probabilidad y/o cada etiqueta de muestra difiere sustancialmente de todas las demás etiquetas de muestra del grupo en entre 3 y 25, o entre 3 y 10 diferencias de mutación de baja probabilidad y/o la mutación de baja probabilidad es una mutación de transversión o una mutación indel y/o en donde la mutación de alta probabilidad es una mutación de transición;
o
b) cada etiqueta de muestra difiere sustancialmente de todas las demás etiquetas de muestra del grupo en al menos 5 diferencias de mutación de alta probabilidad, opcionalmente en donde cada etiqueta de muestra difiere sustancialmente de todas las demás etiquetas de muestra del grupo en entre 5 y 25, o entre 5 y 10 diferencias de mutación de alta probabilidad, opcionalmente en donde la mutación de alta probabilidad es una mutación de transición;
y/o
B) introducir adaptadores en cada una de las al menos una molécula de ADN diana, opcionalmente en donde introducir adaptadores en cada una de las al menos una molécula de ADN diana comprende introducir un primer adaptador en el extremo 3' de la al menos una molécula de ADN diana y un segundo adaptador en el extremo 5' de la al menos una molécula de ADN diana, en donde el primer adaptador y el segundo adaptador pueden hibridarse entre sí, opcionalmente en donde la al menos una molécula de a Dn diana se amplifica utilizando cebadores que son idénticos entre sí y complementarios a una porción del primer adaptador, y/o en donde el primer adaptador es complementario de una molécula de ADN que es al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 % o 100 % idéntico al segundo adaptador, y/o en donde los cebadores comprenden un segundo sitio de unión del cebador, y el método comprende amplificar la al menos una molécula de ADN diana usando los cebadores, eliminar los cebadores y amplificar adicionalmente la al menos una molécula de ADN diana usando un segundo conjunto de cebadores que se hibridan con el segundo sitio de unión del cebador;
y/o
C) introducir códigos de barras, etiquetas de muestra y adaptadores en cada una de las moléculas de ADN diana, y/o en donde los códigos de barras, las etiquetas de muestra y/o los adaptadores se introducen mediante etiquetado o mediante cizallamiento y ligación.
12. El método o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la al menos una molécula de ADN diana es mayor de 1 kpb, mayor de 1,5 kpb, mayor de 2 kpb, mayor de 4 kpb, mayor de 5 kbp, mayor de 7 kpb, o mayor de 8 kpb.
13. Un método para determinar una secuencia de al menos una molécula de ADN diana, que comprende las etapas de:
a. realizar el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3-12 para proporcionar al menos una molécula de ADN diana mutada;
b. opcionalmente fragmentar y/o amplificar la al menos una molécula de ADN diana mutada para proporcionar al menos una molécula de ADN diana mutada fragmentada y/o amplificada;
c. secuenciar regiones de la al menos una molécula de ADN diana mutada o la al menos una molécula de ADN diana mutada fragmentada y/o amplificada para proporcionar lecturas de la secuencia mutada; y
d. ensamblar una secuencia para al menos una porción de la al menos una molécula de ADN diana usando las lecturas de la secuencia mutada.
14. Un método para diseñar una proteína que comprende las etapas de:
a. realizar el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3-12 para proporcionar al menos una molécula de ADN diana mutada;
b. insertar la al menos una molécula de ADN diana mutada en un vector; y
c. expresar una proteína codificada por la al menos una molécula de ADN diana mutada;
opcionalmente en donde:
i) el método comprende las etapas de:
a. amplificar la al menos una molécula de ADN diana que comprende el análogo de nucleótido en ausencia del análogo de nucleótido para proporcionar al menos una molécula de ADN diana mutada;
b. insertar la al menos una molécula de ADN diana mutada en un vector; y
c. expresar una proteína codificada por la al menos una molécula de ADN diana mutada; y/o
ii) el método comprende además una etapa de probar la actividad o evaluar la estructura de la proteína codificada por la al menos una molécula de ADN diana mutada; y/o
iii) el vector es un plásmido, un virus, un cósmido o un cromosoma artificial; y/o
iv) la etapa de expresar una proteína codificada por la al menos una molécula de ADN diana mutada se logra transformando células bacterianas, transfectando células eucariotas o transduciendo células eucariotas con el vector.
15. El método o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la etapa de amplificar la al menos una molécula de ADN diana usando una ADN polimerasa de alta fidelidad de bajo sesgo se lleva a cabo usando dNTP a concentraciones diferentes; y/o
I) en donde:
A)
i) el método comprende una etapa adicional de amplificar la al menos una molécula de ADN diana que comprende análogos de nucleótidos en ausencia de análogos de nucleótidos y la etapa adicional de amplificar la al menos una molécula de ADN diana que comprende análogos de nucleótidos en ausencia de análogos de nucleótidos se lleva a cabo utilizando dNTP en concentraciones diferentes; o
ii) el método proporciona al menos una molécula de ADN diana mutada, el método comprende una etapa adicional de amplificar la al menos una molécula de ADN diana mutada usando la ADN polimerasa opcionalmente en ausencia de análogos de nucleótidos y la etapa adicional de amplificar la al menos una molécula de ADN diana mutada usando la ADN polimerasa se lleva a cabo utilizando dNTP en concentraciones diferentes; y/o
B) los dNTP en concentraciones diferentes se usan para alterar el perfil de mutaciones que se introducen, opcionalmente en donde los dNTP en concentraciones diferentes se usan para reducir el sesgo en el perfil de las mutaciones que se introducen; y/o
C) los dNTP en concentraciones diferentes comprenden dATP, dCTP, dTTP y dGTP y uno de dos de dATP, dCTP, dTTP o dGTP están en una concentración menor en comparación con otros dNTP; y/o
D) la utilización de los dNTP a concentraciones diferentes comprende una etapa de identificación de un dNTP cuyo nivel debería aumentarse o disminuirse para reducir el sesgo en el perfil de mutaciones que se introducen; y/o
E) los dNTP a concentraciones diferentes comprenden dTTP a una concentración menor que otros dNTP, opcionalmente en donde los dNTP a concentraciones diferentes comprenden dTTP a una concentración de menos del 75 %, menos del 70 %, menos del 60 %, menos del 55 %, entre el 25 % y el 75 %, entre el 25 % y el 70 %, entre el 25 % y el 60 %, o alrededor del 50 % de la concentración de dATP, dCTP o dGTP, opcionalmente en donde los dNTP a concentraciones diferentes comprenden dTTP a una concentración de menos del 75 %, menos del 70 %, menos del 60 %, menos del 55 %, entre el 25 % y el 75 %, entre el 25 % y el 70 %, entre el 25 % y el 60 %, o alrededor del 50 % de la concentración de dCTP, opcionalmente en donde los dNTP a concentraciones diferentes comprenden dTTP a una concentración de menos del 60 % de la concentración de dCTP, opcionalmente los dNTP a concentraciones diferentes comprenden dTTP a una concentración de entre el 25 % y el 60 % de la concentración de dCTP;
y/o
F) los dNTP a concentraciones diferentes comprenden dATP a una concentración menor en comparación con otros dNTP, opcionalmente en donde los dNTP a concentraciones diferentes comprenden dATP a una concentración de menos del 75 %, menos del 70 %, menos del 60 %, menos del 55 %, entre el 25 % y el 75 %, entre el 25 % y el 70 %, entre el 25 % y el 60 %, o alrededor del 50 % de la concentración de dTTP, dCTP o dGTP, opcionalmente en donde los dNTP a concentraciones diferentes de dNTP comprenden dATP a una concentración de menos del 75 %, menos del 70 %, menos del 60 %, menos del 55 %, entre el 25 % y el 75 %, entre el 25 % y el 70 %, entre el 25 % y el 60 %, o alrededor del 50 % de la concentración de dGTP, opcionalmente en donde los dNTP a concentraciones diferentes comprenden dATP a una concentración de menos del 60 % de la concentración de dGTP, opcionalmente en donde los dNTP a concentraciones diferentes comprenden dATP a una concentración de entre el 25 % y el 60 % de la concentración de dGTP;
y/o
Il) el método es un método para introducir mutaciones en un perfil de mutación de bajo sesgo.
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