ES2887773T3 - Procedimiento para el aislamiento de subpoblaciones de células progenitoras cardíacas y usos relacionados en el campo médico - Google Patents
Procedimiento para el aislamiento de subpoblaciones de células progenitoras cardíacas y usos relacionados en el campo médico Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento para el aislamiento de subpoblaciones de células progenitoras cardíacas humanas, que comprende las siguientes etapas: a) picar una muestra de tejido cardíaco que contiene una población de células cardíacas; b) digestión progresiva 4 veces del tejido cardíaco con una mezcla enzimática hasta lograr una suspensión celular y lograr una filtración a través de filtros de tamaño comprendido entre 30 μM y 100 μM; c) digestión adicional del tejido cardíaco residual obtenido en la etapa b) durante 16 horas con una mezcla enzimática hasta lograr una suspensión celular y filtración a través de filtros de tamaño comprendido entre 30 μM y 100 μM; d) cultivar la suspensión celular obtenida en la etapa b) y c) en un medio de cultivo adecuado para propagar las células cardíacas; e) expansión preliminar de la suspensión celular obtenida en la etapa d) en un medio de cultivo adecuado para expandir las células cardíacas en presencia de una solución enzimática o no enzimática; f) expansión secundaria de las células cardíacas obtenidas en la etapa e) en un medio de cultivo adecuado para expandir aún más las células cardíacas en presencia de una solución enzimática o no enzimática; g) aislar una o más subpoblaciones de células cardíacas mediante selección positiva y/o negativa mediante el uso de anticuerpos monoclonales dirigidos contra uno o más antígenos de superficie expresados en la población inicial de células progenitoras cardíacas.
Description
DESCRIPCIÓN
Procedimiento para el aislamiento de subpoblaciones de células progenitoras cardíacas y usos relacionados en el campo médico
La presente invención se refiere a un procedimiento para el aislamiento de subpoblaciones de células progenitoras cardíacas a partir de una muestra de tejido cardíaco, a la población así obtenida y a los usos relacionados en el campo médico para la terapia celular o el campo del trasplante de células y/o de tejidos cardíacos.
Las progenitoras son todas las poblaciones de células que tienen la capacidad de proliferarse y diferenciarse, y que también realizan una función de soporte para las células y tejidos circundantes. Las progenitoras son células raras ubicadas en los tejidos de los seres vivos con el fin de perpetuar su funcionalidad mediante el intercambio de células dañadas. Inicialmente se descubrieron en tejidos con el mayor intercambio celular como la médula ósea y el tejido epitelial, pero ahora es bien sabido que existe una población de células progenitoras que viven en diferentes tejidos, también con una capacidad regenerativa reducida.
El descubrimiento de las progenitoras residentes en el corazón adulto ha revolucionado el dogma del corazón como un órgano incapaz de autorrenovarse.
Este descubrimiento ha conducido a estudios sobre progenitoras cardíacas residentes con el objetivo de desarrollar una terapia capaz de regenerar el miocardio después de una lesión isquémica o de otro tipo. Se han propuesto y estudiado diferentes tipos de células, caracterizadas por diferentes marcadores de superficie y algunas se han sometido a prueba en ensayos clínicos de fase I, y algunos de fase II, inicialmente aprobados por la FDA en los Estados Unidos y más recientemente también en el resto del mundo, pero todavía no en Italia.
Este conocimiento de las progenitoras cardíacas ha ampliado los horizontes de investigación con el fin de introducir terapias innovadoras dentro de lo que se define como medicina regenerativa.
El uso de células madre (incluyendo las progenitoras cardíacas residentes) para ensayos clínicos debe seguir criterios rigurosos. Se aseguran de que la traducción de células madre se realice de acuerdo con los mismos estándares regulatorios utilizados para la producción de medicamentos.
Las Buenas Prácticas de Fabricación (GMP) son directrices para la producción de medicamentos de conformidad con la actual farmacopea de referencia (americana, europea, etc.). En Italia, el ensayo clínico de fase I para productos de terapia celular (CTP) está sujeto a la opinión previa del Instituto Italiano de Salud (ISS). Por lo tanto, desde la perspectiva del posible uso clínico de las progenitoras cardíacas, es fundamental desarrollar y validar los procedimientos para su preparación con referencia a las GMP de conformidad con las directrices del 2004 de la ISS sobre los c Tp .
Los protocolos de aislamiento disponibles en la técnica (véase ref. [4], [5], [6]) permiten aislar poblaciones de progenitoras cardíacas (CD117+) usando un sistema de selección magnética para investigar el alcance. De hecho, para seleccionar la población de progenitoras cardíacas utilizando el sistema de selección magnética para producciones GMP y ensayos clínicos, es necesario, en primer lugar, expandir ampliamente la población inicial no seleccionada cuya selección es deseada. El sistema de selección con alcance de investigación permite la selección a partir de un número de células de aproximadamente 1*10®, 1x107, mientras que el sistema de selección de grado GMP que está disponible hoy en día no funciona a partir de un número tan pequeño de células iniciales. Para que el sistema de selección inmunomagnética funcione, es necesario seleccionar un número de células inicial de aproximadamente 1*109 (células sanguíneas periféricas o de la médula ósea), que es la primera condición obligatoria para seleccionar una población de progenitoras en condiciones de grado g Mp que está adoptando una estrategia para maximizar la población inicial seleccionable acercándose a la cantidad de 1*109 células.
El documento de patente WO2011/057249 divulga células madre cardíacas humanas que expresan c-kit (CD117) y son negativas para otros marcadores, incluido CD90, es decir, las células madre cardíacas son CD117+/CD90- pero contrariamente a la subpoblación reivindicada, también CD105-.
Nuria Gago Loppez et al., 2014 divulga una población CD90- de células derivadas de la cardiosferas humanas que son multipotentes y cardiogénicas. Las células se derivan de biopsias de ventrículos y el Solicitante muestra, en los datos suplementarios, que son diferentes de la subpoblación seleccionada de acuerdo con el procedimiento de aislamiento de la invención.
Dergilev et al. 2016 divulga el aislamiento de hCPC de los apéndices de la aurícula derecha con clasificación de células magnéticas utilizando un kit de CD117 MicroBead humana. El inmunofenotipo de la población aislada es c-kit+/CD90- que, de nuevo, es diferente del reivindicado.
Monsanto et al., 2017 divulga el aislamiento de 3 poblaciones de células madre cardíacas a partir de una única biopsia de corazón humano. La población de EPC es CD90-. Las células se derivaron de biopsias de ventrículo y son diferentes de la subpoblación de la invención de la aurícula humana. Del mismo modo, Cheng et al. 2014 divulga poblaciones de células derivadas de la cardiosfera (CDC) que se derivan de biopsias de ventrículo que son diferentes de la subpoblación reivindicada de aurícula humana. Detert et al., 2017 divulgaron hCPClow que no es CD90- como la subpoblación de hCPC reivindicada.
Ninguno de los documentos de la técnica anterior divulga una población de células progenitoras cardíacas humanas de la aurícula cardíaca humana caracterizada por ser obtenida mediante el procedimiento de aislamiento de la invención mediante selección negativa usando anticuerpos monoclonales anti-CD90 que es CD90- y está caracterizado por el perfil de marcador reivindicado.
Por lo tanto, hasta la fecha, no existe ningún procedimiento en el mercado para la producción de progenitoras cardíacas que se pueda utilizar en ensayos clínicos en Italia en donde la ISS ya requiere niveles de producción de GMP para los estudios de fase I, como la legislación para la producción de medicamentos.
Desde la perspectiva de la terapia celular en el campo cardiovascular, el tipo celular tiene un papel fundamental para el éxito terapéutico. Al analizar el tejido cardíaco como fuente, actualmente se han propuesto tres tipos diferentes de células, ya ensayadas en ensayos clínicos de fase I y en algunos de fase II.
En particular:
1) la población de células madre cardíacas (CSC), seleccionadas para la expresión superficial del antígeno CD117, c-kit [1];
2) células derivadas de la cardiosfera (CDC), no aisladas por un marcador, sino por su capacidad para formar agregados esféricos [2];
3) estudios y ensayos de fase I que utilizan un enfoque de terapia combinada mediante el uso de una combinación de células CSC-ckit+ y células madre mesenquimales de médula ósea (MSC) [3].
Los tres tipos de células enumerados anteriormente tienen ventajas y desventajas dependiendo del tipo de célula y la técnica de fabricación que permite su obtención. Por ejemplo, la población de células derivadas de la cardiosfera no seleccionada por ningún marcador (CDC) tiene la ventaja de ser fácil de obtener en grandes cantidades, pero la desventaja de ser una población heterogénea que no está claramente caracterizada. Por otro lado, la población de CSC tiene la ventaja de estar enriquecida con células madre/progenitoras muy bien caracterizadas y la función terapéutica contrastada en cuanto al aumento funcional del miocardio y la calidad de vida de los pacientes tratados; sin embargo, la población antes mencionada presenta la desventaja de ser una población endógena extremadamente rara, con capacidades de proliferación reducidas, por lo tanto, difíciles de obtener en un número clínicamente significativo.
El último enfoque actualmente disponible (combinación de CSC y MSC) podría tener una mejor ventaja terapéutica ya que las combinaciones de células podrían producir mejores resultados, pero al mismo tiempo el mecanismo subyacente a la posible mejora sigue sin estar claro; además, la combinación celular introduce variabilidad en la determinación de las relaciones de eficacia y la población más activa en el miocardio dañado.
Los autores de la presente invención han desarrollado ahora un procedimiento para el aislamiento de subpoblaciones de células progenitoras cardíacas humanas (hCPC) que permite resolver los diferentes problemas técnicos que afectan a los procesos de aislamiento de la técnica antecedente, particularmente en términos de eficiencia en la obtención de un número clínicamente significativo de hCPC y estándares de alta pureza.
De hecho, el procedimiento de aislamiento de progenitoras cardíacas de acuerdo con la invención permite expandir de forma controlada diferentes subpoblaciones de células cardíacas a partir del cultivo primario, manteniendo sus características fenotípicas y obteniendo un número clínicamente significativo de células en lugar de períodos de tiempo reducidos.
Otro objetivo del procedimiento de acuerdo con la invención es el de aislar células de cualquier biopsia procedente de cualquier fuente cardíaca (únicamente a modo de ejemplo, aurícula izquierda y derecha, septo, ápice, biopsia ventricular) incluso a partir de una pequeña cantidad de material de partida.
El procedimiento de aislamiento de acuerdo con la invención también es ventajoso ya que es extremadamente versátil, es decir, adaptado para la selección de cualquier subpoblación presente en la población original que exprese positiva y/o negativamente un antígeno de superficie, también en condiciones GMP. Las condiciones GMP (Buenas Prácticas de Fabricación) significan un nivel de desarrollo de acuerdo con las buenas prácticas de fabricación: protocolo/reactivo/sustancia ensayada utilizando reactivos, herramientas y expedientes técnicos que permiten que la producción se lleve a cabo en un taller farmacéutico autorizado para la producción de un lote
clínico potencial (por ejemplo, dentro de un protocolo clínico).
La subpoblación altamente seleccionada aislada de este modo en un número clínicamente significativo puede discriminarse mediante selección positiva o negativa (o ambas) de marcadores de superficie, mediante detección con anticuerpos específicos.
El sector terapéutico de interés de la población de células que se puede obtener con el procedimiento de aislamiento de la presente invención es, a modo de ejemplo no limitativo, las enfermedades cardíacas que actualmente no tienen un tratamiento eficaz.
Por lo tanto, mediante el procedimiento para el aislamiento de la población de células progenitoras de acuerdo con la presente invención es posible extender la aplicación terapéutica de progenitoras cardíacas a un gran número de sujetos. En particular, el presente procedimiento ofrece la posibilidad de obtener un instrumento de terapia celular extremadamente versátil para la insuficiencia cardíaca avanzada (de origen isquémico y no isquémico) y la miocardiopatía isquémica refractaria. El procedimiento es aplicable además en un contexto de terapia celular autóloga y alogénica, considerando la identidad celular mantenida después de la crioconservación.
Por lo tanto, el objeto de la presente invención es un procedimiento para el aislamiento de subpoblaciones de células progenitoras cardíacas humanas (hCPC) que comprende las siguientes etapas:
a) picar una muestra de tejido cardíaco que contiene una población de células cardíacas;
b) digestión progresiva 4 veces del tejido cardíaco con una mezcla enzimática hasta lograr una suspensión celular y filtración a través de filtros de tamaño comprendido entre 30 pM y 100 pM;
c) digestión adicional del tejido cardíaco residual obtenido en la etapa b) durante 16 horas con una mezcla enzimática hasta lograr una suspensión celular y filtración a través de filtros de tamaño comprendido entre 30 pM y 100 pM;
d) cultivar la suspensión celular obtenida en la etapa b) y c) en un medio de cultivo adecuado para propagar las células cardíacas;
e) expansión preliminar de la suspensión celular obtenida en la etapa d) en un medio de cultivo adecuado para expandir las células cardíacas en presencia de una solución enzimática o no enzimática;
f) expansión secundaria de las células cardíacas obtenidas en la etapa e) en un medio de cultivo adecuado para expandir aún más las células cardíacas en presencia de una solución enzimática o no enzimática; g) aislar una o más subpoblaciones de células cardíacas mediante selección positiva y/o negativa mediante el uso de anticuerpos monoclonales dirigidos contra uno o más antígenos de superficie expresados en la población inicial de células progenitoras cardíacas. Preferentemente, dicha etapa de aislamiento se lleva a cabo mediante clasificación inmunomagnética.
La muestra de tejido cardíaco de la etapa a) puede provenir de cualquier región del órgano cardíaco y sus anexos que contengan células progenitoras, ya sea de tejido fresco o congelado. En una realización particularmente preferente, dicha muestra de tejido cardíaco es una muestra bióptica.
Preferentemente, dicha muestra de tejido cardíaco contiene una población primaria de células cardíacas de la aurícula derecha, la aurícula izquierda, el septo, el ápice o biopsia ventricular (véase Figura 3). Incluso más preferentemente, la muestra de tejido cardíaco es de la aurícula derecha.
De acuerdo con realizaciones alternativas del procedimiento mencionado anteriormente, la muestra de tejido cardíaco inicial puede provenir indistintamente de sujetos adultos, niños o fetos. La etapa de picado de la etapa a) puede ocurrir en modo manual o automático. El modo manual prevé el uso de pinzas o tijeras quirúrgicas en condiciones estériles.
La etapa b) se puede realizar en cuatro etapas de digestión enzimática con el fin de obtener una suspensión celular viable (digestión 4x30'). La etapa c) permite completar la digestión del tejido cardíaco residual obtenido en la etapa b) y maximizar el número de células viables expandibles in vitro en condiciones GMP. Preferentemente, la digestión de 16 horas de la etapa b) se lleva a cabo durante la noche (O/N). La Figura 4 muestra la comparación de las células obtenidas después de la etapa de digestión 4x30' del tejido cardíaco empleado en los procedimientos previamente utilizados por los inventores (véase referencias [4] y [5]) solas o en combinación con la digestión completa del fragmento de tejido cardíaco obtenido añadiendo 16 horas más de digestión. El tratamiento de acuerdo con la invención permite duplicar el número de células obtenido al final de la etapa b) (pasaje P0-P1).
La digestión enzimática de las etapas b y c) tiene lugar preferentemente con una mezcla enzimática que comprende un medio basal, preferentemente Ham's/F12, y una solución enzimática. Preferentemente, dicha solución enzimática comprende una mezcla de colagenasas y/o proteasas. Incluso más preferentemente, dicha mezcla de colagenasas y/o proteasas comprende una o más enzimas seleccionadas de colagenasa I,
colagenasa II, colagenasa IV, tripsina, EDTA, Accutase™, colagenasa A, Dispase™ y Liberase™ (es decir, NB4 o NB6 (GMP)), Serva).
Preferentemente, el medio ideal para multiplicar y expandir las células cardíacas en las etapas d), e) y f)) comprende un medio basal, preferentemente Ham's/F12, suero, preferentemente suero bovino fetal (FBS) al 10%, otros factores necesarios para el crecimiento celular, específicamente L-glutatión 2 mM, 5*103 U/ml de eritropoyetina humana, 10 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF o FGF2) y antibióticos, específicamente penicilina hasta 1000 U/ml y estreptomicina hasta 1000 |jg/ml. Este medio se indica a continuación como F12H. Las iniciales F12G indican el mismo medio, pero usado en condiciones GMP. Alternativamente, también es posible utilizar otros medios para el crecimiento de las poblaciones de células cardíacas, en particular, el medio basal se puede seleccionar del grupo que consiste en MEM, DMEM, Medio199, DMEM/F12, iMDM, medio neurobasal, Eb M-2, a-MEM, mesencult o Hc Sc EM. Alternativamente al suero bovino, también se puede usar suero de caballo. Como factores de crecimiento adicionales o alternativos, es posible utilizar factor de crecimiento endotelial (EGF), factor inhibidor de leucemia (LIF), selenito de sodio, insulina, ácido ascórbico, heparina, hidrocortisona, transferrina, 2-mercaptoetanol, L-glutamato, B27, factor de crecimiento transformante beta 1, proteína morfogenética ósea 2 (BMP-2) y proteína morfogenética ósea 4 (BMP-4), factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-1 e IGF-2), activina A, cardiotrofina-1, extracto de cerebro bovino (BBE) y trombina. Como antibióticos, se pueden utilizar alternativamente gentamicina y anfotericina B.
Además, como alternativa al plástico para cultivos celulares, también es posible hacer crecer las células sobre diferentes plásticos o sobre diferentes soportes, como polilisina, fibronectina o gelatina porcina.
De acuerdo con una realización particularmente preferente, dicha mezcla enzimática comprende medio basal Ham's/F12 y la mezcla de colagenasa NB4 o NB6 Serva.
Preferentemente, dicha mezcla de colagenasa está presente en una concentración comprendida entre 0,1 y 3 mg/ml.
Gracias a la completa digestión enzimática de la muestra bióptica, el procedimiento antes mencionado permite la extracción de células y clones celulares de forma más rápida y eficaz con respecto a los protocolos conocidos.
Las etapas e) y f de doble expansión de la suspensión celular se pueden realizar en una o más etapas manteniendo la expresión de los principales marcadores de superficie mediante el uso de una solución enzimática o no enzimática que no dañe la membrana celular. Preferentemente, dicha solución enzimática o no enzimática se selecciona del grupo que consiste en Tryple™ Select, una mezcla de tripsina y/o EDTA, tampón de disociación celular (GIBCO™), Accutase™ o Dispase™.
Preferentemente, el medio de cultivo adecuado para expandir las células cardíacas es F12H como se describió anteriormente.
La población celular obtenida del cultivo primario de la etapa c) se puede crioconservar manteniendo la expresión de los principales marcadores de superficie.
Se considera comúnmente que las células madre/progenitoras no embrionarias crecen muy lentamente en el medio y que es necesario separarlas de las células diferenciadas, para evitar diluciones y/o diferenciaciones no deseadas.
Gracias al procedimiento de acuerdo con la presente invención, las células madre y progenitoras cardíacas crecen más rápidamente cuando se mantienen en una población mixta de células diferenciadas.
Con este nuevo expediente de procedimiento que prevé una etapa de expansión preliminar y una etapa de expansión secundaria, a diferencia de los procedimientos conocidos en la técnica antecedente (véase ref. [1], [4], [5]), es posible expandir masivamente la subpoblación de progenitoras de interés antes del proceso de aislamiento celular final (véase Figura 7) y para mejorar la pureza final.
Esta etapa de expansión adicional permite obtener al menos 10 veces el número de células de partida en comparación con el estado de la técnica (ref. [4], Figura 7), considerando como material de partida un fragmento de aurícula de peso medio de 141,4 ± 28,29 mg y permitiendo seleccionar la población de interés también en condiciones de grado GMP (véase Ejemplo 4). Otra ventaja debida al número creciente de células iniciales antes de la selección es que el procedimiento de la invención no requiere más etapas de expansión posteriores a la selección de las células seleccionadas porque el número obtenido ya es suficiente para ser empleado en ensayos clínicos de terapia celular (considerando el número de células inyectadas en el ensayo clínico en este sector). Esto conduce a otra ventaja en términos de "calidad", porque al evitar la etapa de expansión posterior a la selección es posible evitar la dilución de la población de interés seleccionada, que, como se conoce por la literatura, no es expandible como tal porque el cultivo tiene el problema intrínseco de la diferenciación parcial de
la propia población.
Por lo tanto, el aislamiento de la población de interés puede obtenerse a partir de un número mucho mayor de células (al menos 10 veces con respecto al estado de la técnica), aislando así un número significativamente elevado de células progenitoras seleccionadas.
El procedimiento basado en el aislamiento de una población mediante el uso de anticuerpos específicos que reconocen un antígeno de superficie, permite aislar cualquier subpoblación de células cardíacas, incluso rara, gracias a un sistema de amplificación de señales.
El procedimiento propuesto es un procedimiento decididamente más rápido (en promedio 22 días) con respecto a otros utilizados para obtener una población celular similar (véase Figura 6b). De hecho, el estado de la técnica muestra que se necesita una media de 66,5 días para obtener un producto celular de calidad decisivamente inferior (en términos de número y pureza).
Por lo tanto, el procedimiento de acuerdo con la presente invención permite obtener una o más subpoblaciones de células cardíacas con alta pureza para uno o más marcadores de superficie seleccionados, así como una cantidad clínicamente significativa de células.
Los anticuerpos específicos usados en la etapa de aislamiento g) del procedimiento de acuerdo con la invención son preferentemente anticuerpos monoclonales marcados (por ejemplo, con biotina), más preferentemente marcados con una molécula fluorescente.
Preferentemente, dicha molécula fluorescente se selecciona de fluoresceína (FITC), aloficocianina (APC) u otro marcador fluorescente adecuado para combinarse con un sistema de selección magnética. Es posible realizar un marcado directo o indirecto de los anticuerpos mencionados anteriormente.
Además, dichos anticuerpos pueden ser primarios o secundarios (solo para marcado indirecto).
De acuerdo con una realización preferente, la separación según la etapa g) es una separación inmunomagnética y los anticuerpos monoclonales se acoplan a perlas magnéticas.
Los posibles sistemas de selección alternativos que se pueden utilizar para llevar a cabo la separación según la etapa g) de acuerdo con la invención son la Tecnología de Separación Magnética Dynabeads de Thermo Fisher Scientific, EasySep™ Magnet STEMCELL o clasificación de células por citometría de flujo (es decir, FacsAria BD).
De acuerdo con una realización preferente del procedimiento, cuando la muestra de tejido cardíaco proviene de la aurícula derecha o del septo (véase el siguiente Ejemplo 5 de caracterización usando análisis FACS) es posible usar anticuerpos monoclonales opcionalmente marcados con un marcador fluorescente preferentemente seleccionados de biotina, FITC y APC, dirigidos contra uno o más antígenos seleccionados del grupo de antígenos enumerados en la siguiente Tabla 1:
Tabla 1
De acuerdo con una realización preferente del procedimiento de aislamiento de acuerdo con la invención, los anticuerpos monoclonales para realizar la selección positiva y/o negativa de las subpoblaciones de células progenitoras cardíacas de interés según la etapa g) del procedimiento de acuerdo con la invención son anti-CD117 y/o anti-CD90. Por lo tanto, de acuerdo con una realización preferente de la presente invención se refiere a una subpoblación de células progenitoras cardíacas humanas obtenidas mediante el procedimiento de aislamiento descrito anteriormente caracterizado por un perfil de antígenos de superficie seleccionados entre
CD90- y CD117+/CD90-, dependiendo de si se utiliza la selección negativa (véase Ejemplo 2) o la selección doble positiva y negativa simultánea (véase Ejemplo 3). En particular, la subpoblación de células progenitoras cardíacas humanas hCPC CD90- mostró un alto potencial angiogénico y cardioprotector (véase Figuras 20-21), además de un efecto antiinflamatorio significativo (véase Figura 22). También la subpoblación CD117+/CD90-mostró un efecto antiinflamatorio significativo (véase Figura 22). La producción reducida de colágeno revelada por la subpoblación hCPC CD90- la convierte en un candidato adecuado para trasplante (véase Figura 23).
Por lo tanto, un objeto adicional de la presente invención es una subpoblación de células progenitoras cardíacas humanas de la aurícula humana seleccionadas mediante el procedimiento de aislamiento descrito anteriormente exclusivamente mediante selección negativa usando anticuerpos monoclonales anti-CD90, caracterizadas por un perfil de marcador de superficie CD90-; expresando marcadores mesenquimales CD29, CD44, CD73, CD105 y CD200; al no expresar los marcadores hematopoyéticos CD34, CD45, CD14 y el marcador del sistema inmunológico HLA-DR.
La invención se refiere además al uso de subpoblaciones de células cardíacas humanas obtenidas mediante el procedimiento de aislamiento descrito anteriormente en la terapia de células cardiovasculares o en el campo del trasplante de células y/o tejidos cardíacos.
Las enfermedades que pueden beneficiarse de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, enfermedad cardíaca aguda y crónica, enfermedades de origen isquémico o no isquémico, enfermedades o lesiones miocárdicas, enfermedades cardiovasculares de origen genético, defectos cardíacos congénitos, enfermedad cardíaca valvular, arritmia incluyendo formas malignas, insuficiencia cardíaca congestiva y no congestiva, fibrosis subendocárdica, hipertrofia ventricular izquierda o derecha, dilatación del ventrículo izquierdo, infarto agudo de miocardio, reestenosis, miocarditis, miocardiopatía dilatada idiopática, miocardiopatía isquémica crónica, miocardiopatía distrófica (por ejemplo, distrofia de Duchenne o Becker), enfermedades y/o trastornos pericárdicos, angina de pecho incluyendo formas refractarias, enfermedades o trastornos de los vasos sanguíneos (aterosclerosis, aneurismas, inflamación arterial, todas las enfermedades de las arterias, arteriolas y capilares y estructuras relacionadas, incluyendo el estrechamiento de las arterias periféricas y la isquemia crítica de las extremidades inferiores), hipertensión, enfermedades autoinmunes.
La protección cardíaca, la capacidad inmunorreguladora y el potencial de regeneración cardíaca de las células seleccionadas con el procedimiento mencionado anteriormente de acuerdo con la invención, lo convierten en un instrumento adecuado para el tratamiento de diversas enfermedades que incluyen también los procesos de reparación de heridas o la terapia de regeneración.
La presente invención se describirá ahora, con fines ilustrativos no limitativos, de acuerdo con una realización preferente de la misma, con particular referencia a las figuras adjuntas, en las que:
- La Figura 1, paneles A) y B) muestran una vista del fragmento de aurícula derecha recién extraído durante la cirugía de derivación aorta-coronaria, antes de la limpieza, el pesaje y el picado. Los paneles C) y D) muestran las dos caras del fragmento después de un corte longitudinal. El panel E) muestra los fragmentos obtenidos después del picado manual. El panel F) ilustra un diagrama que muestra el peso medio (expresado en mg de tejido) con la desviación estándar relacionada de la aurícula recolectada y procesada. - La Figura 2 muestra dos histogramas de digestión del tejido cardíaco mediante el uso de solución enzimática de conformidad con estándares de investigación o GMP. El uso de solución enzimática en investigación y GMP permite obtener un número equivalente de células al final de la etapa 0 (P0-P1).
- La Figura 3 muestra dos diagramas que reflejan los ejemplos de aislamiento de la población celular que contiene las progenitoras cardíacas de diferentes fuentes de tejido cardíaco (aurícula y septo). De diferentes regiones del corazón se puede obtener un número comparable de células al final de la primera etapa (P1-P2) en las mismas condiciones.
- La Figura 4 muestra un gráfico que demuestra cómo la digestión completa del fragmento de tejido cardíaco obtenido al agregar una digestión O/N del tejido aún no digerido después de la primera etapa de digestión (4x30') duplica el número de células que se obtienen en el final de la etapa 1 (P1-P2).
- La Figura 5 muestra las imágenes obtenidas bajo el microscopio óptico de un cultivo primario in vitro 5 días después de ser cultivado. El panel B) muestra un clon, presuntamente generado a partir de una única célula progenitora, muy frecuente en este tipo de cultivo.
- En la Figura 6, panel A) se muestra un diagrama que ilustra el tiempo promedio necesario para cada etapa en el medio de cultivo, comparando muestras frescas y congeladas, de la cual se aprecia claramente cómo se puede reproducir la técnica en ambos casos sin variaciones estadísticamente significativas a los tiempos de crecimiento. El panel B) muestra la suma de los días desde el cultivo primario hasta la selección de la población de interés (P3) tanto en muestras procesadas frescas como congeladas, subdivididas por etapas. También se demostró la posibilidad de congelación en relación con el mantenimiento del fenotipo de interés. El panel C) muestra los diagramas que demuestran la expresión del antígeno c-kit (CD117) antes y después de congelar la población no seleccionada.
- La Figura 7 muestra un gráfico que ilustra el número de células obtenidas de la expansión completa de
cuatro muestras de tejido cardíaco (aurícula derecha) hasta el final de la etapa 2 (P2-P3).
- La Figura 8 muestra los análisis citofluorimétricos que reportan del porcentaje de células progenitoras de interés durante las diferentes etapas. El panel A) muestra un gráfico que ilustra el mantenimiento del porcentaje de c-kit (CD117) en la población no seleccionada durante las etapas P2 y P3. El panel B) comprende los diagramas que muestran la expresión del antígeno c-kit en las etapas de cultivo P2 y P3. - La Figura 9 muestra un ejemplo de selección positiva para el antígeno c-kit. Los diagramas proporcionados muestran dicha población identificada por parámetros físicos, mientras que la expresión del antígeno de interés se resalta mediante un anticuerpo fluorescente. El panel A) comprende los diagramas que muestran la población analizada identificada por parámetros físicos, mientras que la expresión del antígeno de interés se resalta mediante un anticuerpo fluorescente. El panel B) presenta una imagen que representa la población marcada solo con el isotipo conjugado con APC antes de la selección utilizada como control negativo del marcado no específico (puerta interior R2); el panel C) ilustra la expresión del marcador de la población antes de la selección (puerta interior R3) y el panel D) muestra la selección de la población positiva después de la selección (puerta interior R3).
- La Figura 10 muestra un ejemplo de selección negativa para el antígeno CD90. Los diagramas proporcionados muestran la población analizada identificada por parámetros físicos (panel A), mientras que la expresión del antígeno de interés se resalta utilizando un anticuerpo biotinilado acoplado a un anticuerpo fluorescente secundario. El panel B) muestra una imagen que representa la población marcada solo con el anticuerpo secundario (anti-biotina marcada con FITC) antes de la selección (puerta interior H). El panel C) muestra la expresión del marcador en la población antes de la selección (dentro de la puerta H) y el panel D) muestra la selección de la población negativa después de la selección (dentro de la puerta H).
- La Figura 11 muestra un ejemplo de la selección doble de una población negativa para un marcador (CD90) y positiva para otro marcador (c-kit). Los diagramas proporcionados muestran la población analizada identificada por parámetros físicos en el panel A); el panel B) presenta una imagen que representa la población marcada solo con el isotipo conjugado con FITC antes de la selección y APC (panel C) usado como control negativo del marcado no específico. Los paneles D) y E) muestran la expresión de los antígenos de interés CD90 conjugados con fluorocromo FITC (panel D) y c-kit conjugado con fluorocromo APC (panel E). En particular, el panel D) muestra la población de interés para la selección negativa (puerta interior «-»); el panel E) muestra la población de interés para la selección positiva (puerta interior «+») y el panel F) muestra la selección de la población identificada por la expresión de dos marcadores después de la selección (puerta interior «L-+»).
- La Figura 12 ilustra un diagrama del procedimiento de aislamiento de acuerdo con la invención que también permite seleccionar la población que expresa el antígeno de interés (c-kit) caracterizado por una intensidad de fluorescencia media intermedia o baja (panel A). El panel B) muestra una tabla que compara el número de células, la pureza y la viabilidad celular de la población celular obtenida con el procedimiento de acuerdo con la invención con respecto al estado de la técnica [4].
- La Figura 13, panel A) muestra un diagrama del proceso de siembra de células en una placa equipada con insertos de cultivo Transwell® que permiten el crecimiento simultáneo de diferentes tipos de células que están físicamente separadas, pero comparten el mismo medio de cultivo para un posible crecimiento después de la selección. En el caso ejemplificado, las células seleccionadas se colocan dentro de los insertos Transwell® en la cámara superior y las células soportadas se colocan en la cámara inferior. El panel B) muestra algunos ejemplos de cultivos de las células seleccionadas. Cuando se vuelven a colocar en cultivo, las células son viables y comienzan a crecer nuevamente, formando también clones (una característica peculiar de las células madre/progenitoras).
- La Figura 14 muestra gráficos (inmunoselección) que demuestran el mantenimiento del antígeno de interés CD90 recién seleccionado (en este ejemplo, la selección negativa visible dentro de la puerta I) y también después del subcultivo de las células seleccionadas.
- La Figura 15 muestra un ejemplo de mantenimiento del marcador utilizado para la selección inmediatamente después de la selección y después de la congelación y descongelación. En el ejemplo, la selección positiva se realizó para el marcador de superficie CD90 que es expresado por el 98,67% de la población inmediatamente después del aislamiento y el 97,32% después de la descongelación de las células.
- La Figura 16 es un diagrama que muestra una población de progenitoras cardíacas después de la selección caracterizada por positividad para c-kit en condiciones GMP evaluadas con los dos posibles marcados, usando como control negativo el isotipo APC (histograma completo), el anticuerpo humano APC anti-c-kit (línea discontinua gris) y el anticuerpo anti-biotina marcado con APC (línea continua clara).
- La Figura 17 muestra una tabla de los antígenos de superficie evaluados en la muestra de tejido cardíaco de la aurícula y el septo.
- La Figura 18 muestra la diferenciación endotelial de subpoblaciones de hCPC evaluadas mediante el ensayo Cultrex. Los resultados muestran la formación de estructuras tubulares en hCPC-ns, hCPC-CD117+, hCPC-CD90+ y hCPC-CD90‘ en la membrana Cultrex. En el panel A), los gráficos de barras muestran la cuantificación de estructuras de tipo tubular por campo microscópico; en el panel B), los gráficos de barras muestran el número de puntos de ramificación entre estructuras tubulares. En estas condiciones, la subpoblación hCPC-CD90‘ produce una estructura significativamente más tubular en 4 horas en
comparación con las otras subpoblaciones consideradas (hCPC-ns); (n = 4) * p < 0,05, ** p < 0,05, *** p < 0,001.
- La Figura 19 muestra la diferenciación endotelial de subpoblaciones de hCPC evaluadas por análisis FACS.
El gráfico de barras muestra la comparación entre células VE-caderina/CD144+, CD146+ y VEGFR-2/KDR+ en células hCPC-CD117+ y hCPCCD90‘ después de cultivar en un medio EGM-2 proangiogénico. En estas condiciones, las células hCPC-CD90 mostraron una expresión significativamente mayor de los marcadores endoteliales CD144 y KDR. (n = 4) * p < 0,05.
- La Figura 20 muestra los perfiles de expresión de factores de crecimiento y citoquinas en subpoblaciones de hCPC. Los gráficos de barras muestran un aumento en la liberación de citoquinas y factores de crecimiento en diferentes subpoblaciones de hCPC (hCPC-CD117+, hCPC-CD90‘ y hCPC-CD90+) en comparación con la población no seleccionada (hCPC-ns). A partir de la comparación, la subpoblación hCPC-CD90‘ muestra un perfil de secreción aumentado para muchos factores, alcanzando la significación estadística para IL-6 e IL-8 en comparación con la subpoblación hCPC-CD117+ (n = 3) * p < 0,05.
- La Figura 21 muestra el potencial cardioprotector de las subpoblaciones de hCPC. Los gráficos de barras muestran la liberación de la isoforma I de troponina cardíaca (cTnI) en cardiomiocitos derivados de iPS (CM-d-hiPSCs) de pacientes con miocardiopatía distrófica (Duchenne y Becker). Es evidente que la subpoblación hCPC-CD90‘ muestra el efecto cardioprotector más alto y significativo en ambas poblaciones de CM-d-hiPSCs, induciendo la liberación más baja de troponina. (n = 6) * p < 0,05, ** p < 0,05, *** p < 0,001.
- La Figura 22 muestra el efecto antiinflamatorio de las subpoblaciones de hCPC. Los gráficos de barras muestran la liberación de TNF-a en cardiomiocitos derivados de iPS (CM-d-hiPSCs) de pacientes con miocardiopatía distrófica. Panel A): liberación de TNF-a en el sobrenadante de CM-d-hiPSCs (de pacientes con Duchenne) cocultivado en presencia de hCPC-ns, hCPC-CD117+, hCPC-CD90+ y hcPc-CD90‘ después de 3 días desde el inicio del cocultivo; en estas condiciones, la subpoblación hCPC-CD90‘ muestra un efecto antiinflamatorio significativo, reduciendo la liberación de TNF-a (n = 4). Panel B: Liberación de TNF-a en el sobrenadante de CM-d-hiPSCs (de pacientes con Becker) cocultivado con hCPC-ns, hCPC-CD117+, hCPC-CD90+ y hCPCCD90‘ 7 días después del inicio del co-cultivo; en estas condiciones, las subpoblaciones hCPC-CD90‘ y hCPC-CD117+/CD90‘ muestran un efecto antiinflamatorio significativo (n = 6). * p < 0,05, ** p < 0,05, *** p < 0,001.
- La Figura 23 muestra la diferenciación de miofibroblasto de subpoblaciones de hCPC evaluadas mediante la producción de colágeno in vitro después del tratamiento con TGF-p1 durante 5 días. La comparación muestra que la subpoblación hCPC-CD90‘ tiene la capacidad más baja para producir colágeno en comparación con otras poblaciones consideradas (hCPC-ns, hCPC-CD117+ y hCPC-CD90+); (n = 3) * p < 0,
EJEMPLO 1: Procedimiento para el aislamiento de una población de células progenitoras cardíacas humanas mediante selección positiva
MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS
Cultivo primario
La muestra de aurícula humana con un peso comprendido entre 36,8 y 631,8 mg (véase Figura 1) se recolecta en el quirófano y se transfiere inmediatamente a un recipiente estéril que contiene al menos una solución estéril para evitar la deshidratación de la misma (solución salina tamponada con fosfato, PBS o solución fisiológica) y preferentemente una solución que también mantenga la viabilidad del tejido (por ejemplo, cualquier medio de cultivo). Alternativamente, también es posible usar otra solución que contenga albúmina de suero bovino (BSA) o albúmina de suero humano (HSA) o suero bovino fetal (FBS). A partir de ese momento la muestra puede mantenerse a temperatura controlada (+4 °C) y procesarse en 48 horas o congelarse en nitrógeno líquido en una solución que contenga al menos FBS y DMSO ya que la congelación no tiene ningún efecto en la obtención de un cultivo (véase Figura 6a-b). Para el procesamiento, después de una preparación adecuada con especial referencia al proceso de eliminación del epicardio, el fragmento se pesa y se pica con pinzas y tijeras microquirúrgicas en fragmentos de aproximadamente 1-2 mm3 y se transfiere a un tubo junto con la solución de digestión (generalmente 1,7 ml de solución por cada 100 mg de tejido de partida). La solución de digestión comprende medio de cultivo basal, preferentemente Ham's/F12 que contiene colagenasa NB4 (SERVA) a la concentración de 3 mg/ml (véase Figura 2).
Digestión del fragmento
1. Los tubos que contienen los fragmentos de tejido se transfieren a un oscilador rotativo que permite el movimiento de los fragmentos dentro del tubo a una temperatura de 37 °C hasta que la solución se enturbia debido a la digestión eficaz de los propios fragmentos (generalmente de 30 a 40 minutos o hasta 4 horas).
2. El(los) tubo(s) se recupera(n) y los fragmentos que aún no han sido digeridos se pueden depositar en el fondo del tubo; la solución "digerida" (que contiene las células) se recupera y se transfiere a un tubo que, después de la adición de PBS, se centrifugará para permitir que las células sean depositadas en el fondo (se centrifuga a 4 °C a 400 g durante 10 minutos u 800 g durante 5 minutos).
3. Se retira el sobrenadante, se resuspenden las células en medio completo y se transfiere el tubo que contiene las células en hielo, pendiente de digestiones posteriores. En el caso específico, el medio completo está compuesto por: Ham's/F12 que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS), L-glutatión 2 mM y 5 * l03 U/ml de eritropoyetina humana, 10 ng/mL de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF o FGF2) y antibióticos (penicilina hasta 1000 U/ml y estreptomicina hasta 1000 pg/ml): F12H.
Mientras tanto, se añade una nueva solución de digestión al tubo que contiene los fragmentos de tejido aún no digeridos, repitiendo las etapas 1-3 anteriores por un total de 4 veces.
Las cuatro digestiones conservadas en hielo se recogen y se transfieren a una jeringa conectada a un filtro de jeringa, preferentemente de 70 pM para filtrarse en un tubo nuevo. Los 4 tubos con medio completo se lavan y el líquido de lavado también se transfiere a la misma jeringa para filtrar.
En el caso específico, se utiliza medio Ham's/F12 que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS), L-glutatión 2 mM y 5*10'3 U/ml de eritropoyetina humana, 10 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF o FGF2) y antibióticos (penicilina hasta 1000 U/ml y estreptomicina hasta 1000 pg/ml): F12H.
La solución filtrada se siembra en una cápsula estéril tal como una placa de Petri (generalmente una placa de 100 mm de diámetro por cada 100 mg de medio de partida) (Día 1).
Para permitir la digestión total de los fragmentos todavía en el tubo o tubos, se añade una nueva solución de digestión, preferentemente a una concentración de hasta 0,3 mg/ml.
El(los) tubo(s) que contienen los fragmentos de tejido se transfieren a un oscilador rotativo que permite el movimiento de los fragmentos dentro de los tubos a una temperatura de 37 °C durante toda una noche (aproximadamente 16 horas).
La solución digerida se filtra usando un filtro de malla de nailon, preferentemente de 70 pM, y se recoge el filtrado. El mismo filtro se lava con PBS y la solución filtrada se centrifuga para permitir que las células se asienten en el fondo.
Se retira el sobrenadante, las células se resuspenden en medio completo F12H y se colocan en una cápsula estéril como una placa de Petri (generalmente una placa de 100 mm de diámetro por cada 100 mg de medio de partida). El tubo se puede lavar con medio completo F12H y el líquido de lavado se puede transferir a la misma placa de Petri, para recuperar cualquier célula que permanezca en el tubo (Día 2).
A las 48 horas de haber sido cultivado (Día 3 para digestiones 4x30' y Día 4 para los fragmentos digeridos toda la noche) se retira completamente el medio de cultivo que contiene los detritos, las células muertas o que no se hayan adherido, la placa se lava con PBS y se agrega nuevo medio F12H fresco (Figura 4).
Se cambia el medio, preferentemente cada 2 días.
El crecimiento de las células se revisa bajo el microscopio y cuando se alcanza aproximadamente el 70% de confluencia o cuando los clones presentes se vuelven demasiado confluentes, se realiza la amplificación de las células (Figura 5).
Amplificación de la población no seleccionada
4. Se retira el medio de cultivo, se lava la superficie de la cápsula de Petri donde se siembran las células con PBS y se agrega la solución que puede desprender las células del plástico que se va a incubar a una temperatura controlada de 37 °C para el tiempo necesario para obtener una suspensión celular. Para este proceso es posible utilizar una solución enzimática (tripsina) o una solución no enzimática (Tryple Select, EDTA, tampón de disociación celular Gibco™ o Cell Stripper™).
5. La reacción se interrumpe mediante la adición de una solución que contenga FBS (si se ha utilizado la solución enzimática) o PBS (si se ha utilizado la solución sin enzima). La solución que contiene las células se centrifuga en un tubo.
6. Las células se cuentan y se vuelven a sembrar en medio F12H en una dilución 1:10 o preferentemente a la concentración de 1200-1500 células/cm2. El medio se cambia, preferentemente cada 2 días.
El crecimiento de las células se revisa bajo el microscopio y cuando se alcanza el 70% de confluencia, se realiza una amplificación adicional de las células (repitiendo las etapas 4 a 6). De hecho, la etapa adicional no compromete la frecuencia del antígeno de interés que identifica la población de interés que se seleccionará posteriormente (Figura 8). Alternativamente, también es posible crioconservar la población celular obtenida y completar el aislamiento en una fecha posterior, ya que la crioconservación no compromete la frecuencia del antígeno de interés que identifica la población de interés que se seleccionará (véase Figura 6c).
Aislamiento de la población de interés mediante selección positiva
La población a aislar se separa de la cápsula de Petri utilizando el procedimiento no enzimático (véase sección "Amplificación de la población no seleccionada"), las células se cuentan y se resuspenden en el tampón de aislamiento preferentemente frío (Tampón de Lavado, WB); en el caso específico, se utiliza PBS que contiene ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y albúmina de suero bovino (BSA o HSA): las células se resuspendieron a la concentración de 100 pl cada 1*10® células.
Una parte de las células (100.000 células) se usa para el análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) antes de la selección.
Las células fueron marcadas con inmunoglobulina de isotipo IgG conjugada con la misma molécula fluorescente enlazada al anticuerpo que reconoce la población de interés (en este ejemplo APC), y se incubaron durante 15 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente o con el anticuerpo anti-biotina marcado con APC e incubado durante 15 minutos en la oscuridad a 4 °C. Después del marcado, las células se lavaron con WB y se analizaron con FACS (tubo identificado como isotipo) (véase Figura 9a-b).
Las células restantes fueron marcadas con el anticuerpo para la selección; las células fueron marcadas con anticuerpo anti-CD117 humano marcado con biotina a la concentración de 2 pg cada 1*10® células durante 20 minutos a 4 °C en agitación.
Después del marcado, las células se lavaron con WB preferentemente frío y se centrifugaron. Se retiró el sobrenadante y se resuspendieron las células en WB a la concentración de 160 pl cada 1*10® células.
Una parte de las células (100.000 células) se usa para el análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) antes de la selección. Las células fueron marcadas con anticuerpo anti-biotina marcado con APC y se incubaron durante 15 minutos en la oscuridad a 4 °C. Después del marcado, las células se lavaron con WB y se analizaron a través de FACS (tubo identificado como Marcado) (Figura 9c).
Las células restantes son marcadas con el anticuerpo secundario; se utilizaron microesferas con anticuerpos anti-biotina a la concentración de 40 pl cada 1*107 células, marcando las células durante 15-20 minutos a 4 °C en agitación.
Después del marcado, las células se lavaron con WB preferentemente frío y se centrifugaron. Se retiró el sobrenadante y las células se resuspendieron en WB frío; las células se resuspendieron en un volumen de 500 pl hasta 1,5*10® células o de 1 ml hasta 15*107 células para la separación magnética posterior.
Separación magnética
La separación magnética se puede realizar utilizando, a modo de ejemplo, las columnas y el imán fabricados por la empresa Miltenyi. La columna se activa usando WB preferentemente frío (500 pl para la columna MS y 1 ml para la columna LS). La población negativa se recoge en un tubo (NEG). Las células se transfieren a las columnas magnéticas (hasta 1,5*10® células en una columna MS o 15-30*107 células en una columna LS). Las columnas se lavan 3 veces añadiendo WB preferentemente frío (500 pl para la columna MS y 1 ml para la columna LS). La población positiva se recupera exprimiendo el contenido de la columna en un tubo después de separarlo del imán y se agrega WB preferentemente frío (1 ml para la columna MS y 2 ml para la columna LS) (POS). Para aumentar la pureza de la selección, las células positivas seleccionadas (POS) se pueden pasar a una nueva columna magnética MS o LS en función del número esperado. Para aumentar el número de células positivas seleccionadas, es posible pasar las células del tubo NEG a una nueva columna magnética MS o LS dependiendo del número inicial. Las células positivas (POS) y negativas (NEG) se centrifugaron, se resuspendieron en medio F12H y se contaron.
También en este caso, una parte de las células (100.000 células) se usa para el análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) (Figura 9d) después de la selección con el fin de verificar la pureza de las mismas. Las células fueron marcadas con un anticuerpo anti-biotina marcado con APC y se incubaron durante 15 minutos en la oscuridad a 4 °C (Miltenyi). Después del marcado, las células se lavaron con WB y se analizaron mediante FACS.
Después de la selección, las células se pueden congelar o sembrar en placas Transwell® particulares equipadas con insertos de cultivo que permiten el cultivo simultáneo de diferentes tipos de células que están físicamente separadas, pero comparten el mismo medio de cultivo (Figura 13). En particular, las células positivas se sembraron en medio F12H en el fondo de la placa de cultivo a una concentración comprendida entre 4.000 20.000 células/cm2 y las células negativas en el inserto Transwell® a una concentración comprendida entre 3.000-10.000 células/cm2 o viceversa.
EJEMPLO 2: Procedimiento para el aislamiento de una población de células progenitoras cardíacas humanas mediante selección negativa
Las etapas de digestión del fragmento, cultivo primario y expansión antes de la selección son las mismas que en el Ejemplo 1.
Aislamiento de la población de interés mediante selección negativa
La población a aislar se separa de la placa de Petri utilizando el procedimiento no enzimático (véase sección "Amplificación de la población no seleccionada"), las células se cuentan y se resuspenden en el tampón de aislamiento frío (WB); las células se resuspendieron a la concentración de l0o pl cada 1*107 células.
Una parte de las células (100.000) se usa para el análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) antes de la selección negativa. Las células fueron marcadas con inmunoglobulina (isotipo IgG) conjugada con la misma molécula fluorescente enlazada al anticuerpo que reconoce la población de interés (en este ejemplo FITC, BD), 1 pl de anticuerpo y se incubaron durante 15 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. o con el anticuerpo anti-biotina FITC (Miltenyi), 10 pl de anticuerpo y se incubó durante 15 minutos en la oscuridad a 4 °C.
Después del marcado, las células se lavaron con WB y se analizaron a través de FACS (tubo identificado como Isotipo, véase Figura 10a-b).
Las células restantes fueron marcadas con el anticuerpo para la selección; las células fueron marcadas con anticuerpo anti-CD90 humano conjugado con biotina (Miltenyi) a la concentración de 10 pl cada 1*107 células durante 10 minutos a 4 °C o en hielo.
Después del marcado, las células se lavaron con WB frío y se centrifugaron. Se retiró el sobrenadante y se resuspendieron las células en WB a la concentración de 160 pl cada 1*10® células.
Una parte de las células (100.000) se usa para el análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) antes de la selección. Las células fueron marcadas con anticuerpo anti-biotina marcado con FITC (Miltenyi), 10 pl de anticuerpo y se incubaron durante 15 minutos en la oscuridad a 4 °C. Después del marcado, las células se lavaron con W b y se analizaron a través de FACS (tubo identificado como Marcado, Figura 10c).
Las células restantes son marcadas con el anticuerpo secundario; se utilizaron microesferas con anticuerpos anti-biotina (Miltenyi) a la concentración de 40 pl cada 1*107 células, marcando las células durante 15-20 minutos a 4 °C en agitación.
Después del marcado, las células se lavaron con WB frío y se centrifugaron. Se retiró el sobrenadante y las células se resuspendieron en WB frío; las células se resuspendieron a la concentración de 500 pl hasta 30*107 células para la separación magnética posterior.
Separación magnética
La separación magnética se puede realizar utilizando las columnas y el imán fabricados por la empresa Miltenyi. La columna se activa utilizando WB frío (2 ml para la columna LD). Las células se transfirieron a las columnas magnéticas (hasta 30*107 células en una columna LD). Las columnas se lavaron dos veces añadiendo WB frío cada vez (1 ml para la columna LD). La población negativa se recoge en un tubo (NEG). Para aumentar la pureza de la selección, las células negativas seleccionadas (NEG) se pasaron a una nueva columna magnética MS o LS en función del número esperado. En este caso, la población negativa se recuperó después de pasar las células a una columna preactivada (con WB frío) sin ningún lavado posterior de la propia columna. Si también se va a recoger la población positiva, se recupera exprimiendo el contenido de la columna en un tubo de 15 ml después de separarlo del imán y agregar WB frío (POS). Para aumentar la pureza de la selección, las células positivas seleccionadas (POS) se pasaron a una nueva columna magnética MS o LS en función del número esperado. Las células positivas (POS) y negativas (NEG) se centrifugaron, se resuspendieron en medio F12H y se contaron.
Una parte de las células (100.000 células) se usa para el análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) después de la selección con el fin de verificar la pureza de las mismas. Las células fueron marcadas con anticuerpo anti-biotina FITC (Miltenyi), 10 pl de anticuerpo y se incubaron durante 15 minutos en la oscuridad a 4 °C. Después del marcado, las células se lavaron con W b y se analizaron mediante FACS (Figura 10d).
Después de la selección, las células se pueden congelar (véase la Figura 15 para un ejemplo con selección positiva) o sembrar a una concentración comprendida entre 3000-5000 células/cm2, considerando el hecho de
que su fenotipo seleccionado no cambia (Figura 14).
EJEMPLO 3: Procedimiento para el aislamiento de una población de células progenitoras cardíacas humanas mediante selección combinada positiva y negativa
Las etapas de digestión del fragmento, cultivo primario y expansión antes de la selección son las mismas que en el Ejemplo 1.
Aislamiento de la población de interés mediante selección combinada positiva y negativa
La población a aislar se separa de la placa de Petri mediante el procedimiento no enzimático (véase sección "Amplificación de la población no seleccionada"), las células se cuentan y se resuspenden en el tampón de aislamiento frío (WB); las células no se resuspendieron a la concentración de 100 pl cada 1*107 células.
Una parte de las células (400.000) se usa para el análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) antes de la selección (Figura 11A-E). Posteriormente, las células fueron divididas en cuatro tubos diferentes.
El primer tubo (identificado como Isotipo FITC) fue marcado con las inmunoglobulinas (isotipo IgG) conjugadas con la misma molécula fluorescente enlazada al anticuerpo que reconoce la población de interés (en este ejemplo FITC, BD), 1 pl de anticuerpo y se incubó durante l5 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente, el segundo tubo (identificado como Isotipo APC, véase Figura 11C) fue marcado con las inmunoglobulinas conjugadas con la misma molécula fluorescente enlazada al anticuerpo que reconoce la población de interés (en este ejemplo APC, BD), el tercer y cuarto tubo (identificados respectivamente como CD90 FITC y c-kit APC, véase Figuras 11D, E) se marcaron con los respectivos anticuerpos específicos (CD90 FITC y c-kit APC, BD) hasta 5 pl de anticuerpo y se incubó durante 15 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Después del marcado, las células se lavaron con WB y se analizaron mediante FACS.
Las células restantes fueron marcadas con el primer anticuerpo para la selección (selección negativa); las células fueron marcadas con anticuerpo anti-CD90 humano conjugado con biotina (Miltenyi) a la concentración de 10 pl cada 1*107 células durante 10 minutos a 4 °C o en hielo.
Después del marcado, las células se lavaron con WB frío y se centrifugaron. Se retiró el sobrenadante y se resuspendieron las células en WB a la concentración de 160 pl cada 1*10® células.
Las células son marcadas con el anticuerpo secundario; se utilizaron microesferas con anticuerpos anti-biotina (Miltenyi) a la concentración de 40 pl cada 1*107 células, marcando las células durante 15-20 minutos a 4 °C en agitación. Después del marcado, las células se lavaron con WB frío y se centrifugaron. Se retiró el sobrenadante y las células se resuspendieron en WB frío; las células se resuspendieron a la concentración de 500 pl hasta 30*107 células para la separación magnética posterior.
Separación magnética negativa
La separación magnética se puede realizar utilizando las columnas y el imán fabricados por la empresa Miltenyi. La columna se activa utilizando WB frío (2 ml para la columna LD). Las células se transfieren a las columnas magnéticas (hasta 30*107 células en una columna LD). Las columnas se lavaron dos veces añadiendo WB frío cada vez (1 ml para la columna LD). La población negativa se recoge en un tubo (NEG). Para aumentar la pureza de la selección, las células negativas seleccionadas (POS) se pasaron a una nueva columna magnética MS o LS en función del número esperado. En este caso, la población negativa se recuperó después de pasar las células a una columna preactivada (con WB frío) sin ningún lavado posterior de la propia columna. Si también se va a recoger la población positiva, se recupera exprimiendo el contenido de la columna en un tubo después de separarlo del imán y agregar WB frío (POS). Para aumentar la pureza de la selección, las células positivas seleccionadas (POS) se pueden pasar a una nueva columna magnética MS o LS en función del número esperado.
Las células negativas (NEG) se centrifugaron, se resuspendieron en WB frío y se contaron; las células no se resuspendieron a la concentración de 100 pl cada 1*10® células. Las células fueron marcadas con el anticuerpo para la selección (selección positiva); las células fueron marcadas con anticuerpo anti-CD117 humano conjugado con biotina (Biolegend) a la concentración de 2 pg cada 1*10® células durante 20 minutos a 4 °C en agitación. Después del marcado, las células se lavaron con WB frío y se centrifugaron. Se retiró el sobrenadante y se resuspendieron las células en WB a la concentración de 1®0 pl cada 1*10® células para marcarlas con el anticuerpo secundario; se utilizaron microesferas con anticuerpos anti-biotina (Miltenyi) a la concentración de 40 pl cada 1*107 células, marcando las células durante 15-20 minutos a 4 °C en agitación.
Después del marcado, las células se lavaron con WB frío y se centrifugaron. Se retiró el sobrenadante y las
células se resuspendieron en WB frío; las células se resuspendieron a la concentración de 500 |jl hasta 1,5*10® células o a la concentración de 1 ml hasta 15*107 células para la separación magnética posterior.
Separación magnética positiva
La separación magnética se puede realizar utilizando las columnas y el imán fabricados por la empresa Miltenyi. La columna se activa usando WB frío (500 j l para la columna m S y 1 ml para la columna LS). La población negativa se recoge en un tubo (NEG-NEG). Las células se transfirieron a las columnas magnéticas (hasta 1,5*10® células en una columna MS o hasta 30*107 células en una columna LS). Las columnas se lavaron 3 veces añadiendo WB frío cada vez (500 j l para la columna MS y 1 ml para la columna LS). La población positiva se recuperó exprimiendo el contenido de la columna en un tubo después de separarlo del imán y agregar WB frío (1 ml para la columna MS y 2 ml para la columna LS) (POS). Para aumentar la pureza de la selección, las células positivas seleccionadas (NEG-POS) se pasaron a una nueva columna magnética MS o LS en función del número esperado. Para aumentar el número de células positivas seleccionadas, las células del tubo NEG-NEG se pasaron a una nueva columna magnética MS o LS dependiendo del número inicial. Las células positivas (NEG-POS) y negativas (NEG-NEG) se centrifugaron, se resuspendieron en medio F12H y se contaron.
Una parte de las células (200.000 células) se utilizó para el análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) después de la selección para verificar la pureza de las mismas (véase Figura 11F). Las células fueron marcadas con anticuerpos de ratón marcados con APC anti-CD117 humano (BD, hasta 5 j l ) y con anticuerpos marcados con FITC anti-CD90 humano (BD, 1 jl).
Después de la selección, las células se pueden congelar o sembrar en placas Transwell® en particular equipadas con insertos de cultivo que permiten el cultivo simultáneo de diferentes tipos de células que están físicamente separadas, pero comparten el mismo medio de cultivo. En particular, las células doblemente seleccionadas (positividad para un marcador y negatividad para otro) se sembraron en medio F12H en el fondo de la placa de cultivo a una concentración comprendida entre 4000-20000 células/cm12 y las células del mismo paciente. en el inserto Transwell® a una concentración comprendida entre 3000-10000 células/cm2 o viceversa (Figura 13).
EJEMPLO 4: Implementación del procedimiento de aislamiento de células progenitoras cardíacas en condiciones GMP
MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS
Cultivo primario
La muestra de aurícula humana (con un peso comprendido entre 36,8 y 631,8 mg) se recoge en el quirófano y se transfiere inmediatamente a un recipiente estéril que contiene una solución estéril para evitar la deshidratación de la misma (solución salina tamponada con fosfato, PBS o solución fisiológica) y preferentemente una solución que también mantenga la viabilidad del tejido (es decir, cualquier medio de cultivo).
Alternativamente, también es posible usar otra solución que contenga albúmina de suero bovino (BSA) o suero bovino fetal (FBS).
A partir de este momento, la muestra puede mantenerse a temperatura controlada (+4 °C) y preferentemente procesarse dentro de las 48 horas o congelarse en nitrógeno líquido en una solución adecuada para el crioconservante. Para su procesamiento, el fragmento se pica mecánicamente. Si el picado prevé una limpieza previa de la aurícula del epicardio que lo recubre, el fragmento se limpia antes de pesarlo, en caso contrario para protocolos que no requieran limpieza del fragmento, se pesa con el epicardio que aún lo cubra.
Para el picado mecánico se pueden utilizar diferentes equipos que hacen que la etapa sea automatizable. Por ejemplo, se utilizaron las máquinas Medimachine (BD) y GentleMACS (Miltenyi).
Digestión del fragmento
A continuación, los tejidos picados se digieren utilizando colagenasa NB-® (grado GMP) adaptando el procedimiento ya desarrollado para el estudio básico (Figura 2):
1. Los tubos que contienen los fragmentos de tejido se transfieren a un oscilador rotativo que permite el movimiento de los fragmentos dentro del tubo a una temperatura de 37 °C hasta que la solución se enturbia debido a la digestión eficaz de los propios fragmentos (generalmente de 30 a 40 minutos o hasta 4 horas).
2. El(los) tubo(s) se recupera(n) y los fragmentos que aún no han sido digeridos se pueden depositar en el fondo del tubo; la solución "digerida" (que contiene las células) se recupera y se transfiere a un tubo que, después de la adición de PBS, se centrifugará a 4 °C para permitir que las células se asienten en el fondo.
1®
3. Se retira el sobrenadante y las células se resuspenden en medio completo. En el caso específico, se utiliza medio Ham's/F12 que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS) grado GMP, L-Glutatión 2 mM y 5*10'c 3 U/ml de eritropoyetina humana, 10 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF o FGF2) y antibióticos (penicilina hasta 1000 U/ml y estreptomicina hasta 1000 pg/ml): se transfiere F12G y el tubo que contiene las células en hielo, pendiente de digestiones posteriores.
Mientras tanto, se añade una nueva solución de digestión al tubo que contiene los fragmentos de tejido aún no digeridos, repitiendo las etapas anteriores 1 a 3 por un total de 4 veces.
Las digestiones conservadas en hielo se recogen y transfieren a una jeringa conectada a un filtro de jeringa, preferentemente de 70 pM para filtrarse en un tubo nuevo. Los tubos con medio completo F12G se lavan y el líquido de lavado también se transfiere a la misma jeringa para filtrar.
La solución filtrada se siembra en una cápsula estéril tal como una placa de Petri (generalmente una placa de 100 mm de diámetro por cada 100 mg de medio de partida) (Día 1).
Para permitir la digestión total de los fragmentos aún en el(los) tubo(s) se añade una nueva solución de digestión, preferentemente a una concentración de hasta 0,3 mg/ml.
Los tubos que contienen los fragmentos de tejido se transfieren a un oscilador rotativo que permite el movimiento de los fragmentos dentro del tubo a una temperatura de aproximadamente 37 °C durante una noche entera (aproximadamente 16 horas).
La solución digerida se filtra usando un filtro de malla de nailon, preferentemente de 70 pM, y se recoge el filtrado. El mismo filtro se lava con PBS y la solución filtrada se centrifuga para permitir que las células se asienten en el fondo.
Se retira el sobrenadante, las células se resuspenden en medio completo F12G y se colocan en una cápsula estéril como una placa de Petri (generalmente una placa de 100 mm de diámetro por cada 100 mg de medio de partida). El tubo se puede lavar con medio completo F12G y el líquido de lavado se puede transferir a la misma placa de Petri, para recuperar cualquier célula que permanezca en el tubo (Día 2).
A las 48 horas de haber sido cultivado (Día 3 para digestiones 4x30' y Día 4 para los fragmentos digeridos toda la noche) se retira completamente el medio de cultivo que contiene los detritos, las células muertas o que no se han adherido, la placa se lava con PBS y se agrega nuevo medio F12G fresco (Figura 4).
Se cambia el medio, preferentemente cada 2 días.
El crecimiento de las células se revisa bajo el microscopio y cuando se alcanza aproximadamente el 70% de confluencia o cuando los clones presentes se vuelven demasiado confluentes, se realiza la amplificación de las células (Figura 5).
Amplificación de la población no seleccionada
4. Se retira el medio de cultivo y se lava la superficie de la cápsula de Petri donde se siembran las células con PBS y se agrega la solución no enzimática que es capaz de despegar las células del plástico (TrypLE Select, Life Technologies). La solución no enzimática se incuba con las células a temperatura controlada, alrededor de 37 °C durante el tiempo necesario para obtener una suspensión celular, de unos 3 a 10 minutos.
5. La solución se inactiva agregando PBS. La solución que contiene las células se centrifuga en un tubo. 6. Las células se cuentan y se vuelven a sembrar en medio F12G en una dilución 1:10 o preferentemente a la concentración de 1200-1500 células/cm2. El medio se cambia cada dos días.
Se cuenta el crecimiento de las células bajo el microscopio y cuando se alcanza aproximadamente el 70% de confluencia, se realiza una amplificación adicional de las células (véase las etapas 4 a 6). Para la amplificación extensiva se utilizaron matraces múltiples con 3 (525 cm2) y 5 (875 cm2) capas, tales como pilas de células con 5 capas (3180 cm2).
Aislamiento de la población de interés mediante selección positiva
La población que se va a aislar se separa del matraz múltiple/pila de células utilizando el procedimiento no enzimático (véase sección "Amplificación de la población no seleccionada"), las células se cuentan y se resuspenden en el tampón de aislamiento (WB) preferentemente frío; en el caso específico, se usa PBS que contiene EDTA y HSA: las células se resuspendieron a la concentración de 100 pl cada 1*10® células.
Una parte de las células (100.000) se usa para el análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) antes de la selección. Las células fueron marcadas con inmunoglobulina (isotipo IgG) conjugada con la misma molécula fluorescente enlazada al anticuerpo que reconoce la población de interés (en este ejemplo APC), y se incubaron durante 15 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente o con los anticuerpos antibiotina marcados con APC (Miltenyi), incubados durante 15 minutos en la oscuridad a 4 °C. Después del marcado, las células se lavaron con WB y se analizaron con FACS (tubo identificado como Isotipo).
Las células restantes fueron marcadas con el anticuerpo para la selección; las células fueron marcadas con anticuerpo anti-CD117 humano marcado con biotina (Biolegend) a la concentración de 2 |jg cada 1*10® células durante aproximadamente 20 minutos a 4 °C en agitación. Después del marcado, las células se lavaron con WB frío y se centrifugaron. Se retiró el sobrenadante y se resuspendieron las células en WB a la concentración de 160 j l cada 1*10® células.
Una parte de las células (100.000) se usa para el análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) antes de la selección. Las células fueron marcadas con anticuerpo anti-biotina marcado con APC (Miltenyi), 10 j l de anticuerpo y se incubaron durante 15 minutos en la oscuridad a 4 °C. Después del marcado, las células se lavaron con W b y se analizaron a través de FACS (tubo identificado como Marcado).
Las células restantes son marcadas con el anticuerpo secundario; se utilizaron microesferas con anticuerpos anti-biotina CliniMACS (Miltenyi) a la concentración de 40 j l cada 1*107 células, marcando las células durante 15-20 minutos a aproximadamente 4 °C en agitación. Después del marcado, las células se lavaron con WB frío y se centrifugaron. Se retiró el sobrenadante y las células se resuspendieron en WB frío; las células se resuspendieron en un volumen de 1 ml cada 1,6*10® células para la separación magnética posterior.
Separación magnética
La separación magnética se realiza utilizando el instrumento de selección magnética destinado a uso clínico; se utilizó CliniMACS Plus fabricado por la empresa Miltenyi. Utilizando un programa relevante se utilizaron las células positivas, separadas de la población inicial y recolectadas en una bolsa relevante, al igual que para las células negativas.
Una parte de las células (100.000) se usa para el análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) después de la selección con el fin de verificar la pureza de las mismas. Las células fueron marcadas con anticuerpo anti-biotina marcado con APC (Miltenyi), 10 j l de anticuerpo y se incubaron durante 15 minutos en la oscuridad a 4 °C. Después del marcado, las células se lavaron con WB y se analizaron mediante FACS (Figura 1®).
Después de la selección, las células pueden congelarse sin perder la expresión del marcador (véase Figura 15, en CD90 positivo) para el que fueron seleccionadas y luego listas para uso clínico para la terapia celular o trasplantes.
EJEMPLO 5: Identificación de los marcadores de superficie seleccionables en dos fuentes diferentes de células cardíacas
MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS
Las etapas de digestión del fragmento, cultivo primario y expansión antes de la selección son las mismas que en el Ejemplo 1.
En este ejemplo se utilizaron tres muestras diferentes de aurícula y tres muestras diferentes de septo.
Al final del tercer pasaje, se contaron las tres aurículas, se unieron en una sola muestra y se marcaron con el marcador fluorescente VioBlue450 que hace que todas las células en el canal V450 sean fluorescentes. Del mismo modo, se contaron las tres muestras del septo, se unieron en una sola muestra y se marcaron con el marcador fluorescente CFSE que hace que todas las células en el canal FITC sean fluorescentes.
Las dos poblaciones de células se identificaron utilizando el citómetro de flujo basándose en el marcado utilizado y, posteriormente, las dos poblaciones de células se utilizaron para evaluar un panel de antígenos de superficie.
Los antígenos de superficie evaluados en la muestra de tejido cardíaco de la aurícula y el septo se muestran en la Tabla ilustrada en la Figura 17.
El marcado se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante del kit comercial LEGENDScreen™ Lyophilized Antibody Panel Human Cell Screening (PE) Kit, de BioLegend.
Usando una estrategia de puerta apropiada, las dos poblaciones de células se caracterizaron para todos los antígenos de superficie ilustrados en la Figura 17.
La Tabla 2 representa los antígenos de superficie expresados por las dos poblaciones de células diferentes y la expresión media de cada antígeno en las dos fuentes de células. Todos los antígenos expresados por al menos una de las dos fuentes utilizadas pueden seleccionarse tanto con selección positiva (véase Ejemplo 1) como con selección negativa (véase Ejemplo 2) o, si se combinan adecuadamente, también con una selección múltiple de más de un marcador (como se muestra, por ejemplo, en el Ejemplo 3).
Tabla 2
EJEMPLO 6: Estudio comparativo con respecto a los procedimientos de aislamiento de células cardíacas del estado de la técnica
Se realizó una comparación entre el número de células, la pureza y la viabilidad celular de la población celular obtenida con el procedimiento de acuerdo con la invención con respecto al estado de la técnica [4].
En la técnica antecedente, la selección se realiza usando el Clasificador de Células Facs (por ejemplo, usando la herramienta FacsAria BD) [4]. Sin embargo, en este caso, solo es posible seleccionar la población de células que expresan en niveles altos del antígeno utilizado para la selección (población brillante), mientras que no es posible obtener también las células positivas que expresan el antígeno de interés, pero a niveles bajos (población Dim positiva).
Con el procedimiento de acuerdo con la presente invención, es posible seleccionar todas las células que expresan el antígeno de interés, independientemente del nivel de expresión del mismo.
La Figura 12 ilustra un diagrama del procedimiento de aislamiento de acuerdo con la invención que también permite seleccionar la población que expresa el antígeno de interés (c-kit) caracterizada por una intensidad de fluorescencia media intermedia o baja (panel a). El panel b) muestra una tabla que compara el número de células, la pureza y la viabilidad celular de la población celular obtenida con el procedimiento de acuerdo con la invención con respecto al estado de la técnica [4].
EJEMPLO 7: Caracterización fenotípica y funcional de subpoblaciones de células progenitoras cardíacas humanas CD90- y CD117+/CD90~ obtenidas mediante el procedimiento de la invención
MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS
Pacientes y muestras de tejido
Se obtuvieron muestras de aurícula humana derecha de pacientes sometidos a procedimientos electivos de cirugía cardíaca. Se obtuvo el consentimiento informado previamente aprobado por el comité de ética local para cada paciente de acuerdo con la Declaración de Helsinki.
Citometría de flujo (FACS)
Se realizó un análisis inmunofenotípico de marcadores mesenquimales, hematopoyéticos e inflamatorios usando citometría de flujo multicolor en células hCPC-CD90-. Después del desprendimiento utilizando una solución no enzimática, las células se resuspendieron en PBS que contenía 0,1% de BSA (Gibco, USA) y EDTA 2 mM (Gibco, USA) y se incubaron en la oscuridad durante 15 minutos con combinaciones apropiadas de los siguientes anticuerpos monoclonales o isotipo correspondiente: CD29-PE, CD44-PE, CD73-PE, CD105-APC, CD14 FITC, CD34-FITC, CD45-PE, HLA-DR-FITC, CD146-FITC (BD Pharmingen, Italia), CD200-FITC, KDR-PE (R & D Systems, USA) y CD144-Alexa700 (clon 16B1; eBioscience). A continuación, las muestras se lavaron con 1 ml de tampón de lavado y se centrifugaron durante 10 minutos a 400 * g a 4 °C para eliminar los anticuerpos no enlazados. Las células se resuspendieron en 250 pl de tampón de lavado y se analizaron en el citómetro de flujo.
Ensayo funcional endotelial y diferenciación
Para evaluar la capacidad de las células hCPC-ns y las diferentes subpoblaciones derivadas de ellas para formar estructuras vasculares in vitro, las células se sembraron en la membrana basal de Cultrex (Trevigen, USA). Se dejó que Cultrex polimerizara en placas de 48 pocillos a 37 °C, CO2 al 5% durante 30 min. Las células se separaron usando una solución no enzimática, se contaron, se diluyeron a 8*104 células/ml en medio de crecimiento endotelial completo 2 (EGM-2, Lonza, Italia) y se sembraron en cada pocillo que contenía la matriz de cultrex. Las placas se incubaron a 37 °C, CO2 al 5% durante 4 horas, después de lo cual se contó el número de estructuras capilares y el número de sus puntos de ramificación. Como control positivo en estos experimentos, se utilizaron células HUVEC (Lonza, Italia) en las mismas condiciones de cultivo. El compromiso endotelial se analizó cultivando hCPC-ns y las diferentes subpoblaciones derivadas de ellas (hCPC-CD117+, hCPC-CD90‘) durante 3 semanas en EGM-2 tras lo cual se determinó el inmunofenotipo por citometría de flujo.
Secreción de citoquinas en el medio de cultivo
Para determinar la expresión de citoquinas en el medio de cultivo, el medio acondicionado de células hCPC-ns y las diferentes subpoblaciones derivadas de ellas (hCPC-CD117+, hCPC-CD90+, hCPC-CD90‘) se recogió para medir la cantidad de factores solubles liberados en el medio de cultivo en 48 horas. Posteriormente, se utilizó un inmunoensayo multiplex basado en microesferas (ensayo Bio-Plex, Bio-Rad Laboratories) para comparar las citoquinas, quimiocinas y factores de crecimiento liberados en el medio de cultivo. El medio de cultivo se centrifugó a 4000 g durante 10 minutos. El sobrenadante se recogió y se congeló a 80 °C hasta su uso. Las
muestras se evaluaron por duplicado debido a la presencia de los siguientes factores angiogénicos: el factor derivado de células estromales (SDF-1), el GRO (oncogén regulado por crecimiento)-alfa (GRO-a), el factor de células madre (SCF)), el factor inhibidor de la leucemia (LIF), interleucina-6 (IL-6), IL-8, IL-10, la proteína quimioatrayente de monocitos 1 (MCP-1), la proteína inflamatoria de macrófagos 1 beta (MIP-1b), las células T normales de activación reguladas expresadas y secretadas (RANTES), el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), utilizando la tecnología Luminex (Bio-Plex, Bio-Rad), de conformidad con las instrucciones de uso.
Análisis de niveles cardíacos de Troponina-I (cTnI)
Para determinar la concentración de cTnI en los cardiomiocitos derivados de iPs (CM-d-hiPSCs), se estableció un cocultivo en transwell® (poro 0,4 pm) entre CM-d-hiPSCs y células hCPC-ns (y las diferentes subpoblaciones derivadas de ellas, hCPC-CD117+, hCPC-CD90+, hCPC-CD90‘). Después de 7 días desde el comienzo del cocultivo, se recogió el medio acondicionado y se usó para el ensayo ELISA de troponina cardíaca. El medio acondicionado se centrifugó durante 10 minutos a 4000 g y el sobrenadante se utilizó para la determinación de la concentración de cTnI, utilizando el kit ELISA quimioluminiscente (Calbiotech) de conformidad con las instrucciones contenidas en el kit.
Análisis de TNF-a
Para determinar la concentración de TNF-a en cardiomiocitos derivados de iPs (CM-d-hiPSCs), se estableció un cocultivo en transwell® (poro 0,4 pm) entre CM-d-hiPSCs y células hCPC-ns (y las diferentes subpoblaciones derivadas de ellas, hCPC-CD117+, hCPC-CD90+, hCPC-CD90‘). Después de 3 y 7 días desde el inicio del cocultivo, se recogió el medio acondicionado y después de centrifugación (10 a 4000g) se utilizó para el ensayo ELISA (Invitrogen), de conformidad con las instrucciones contenidas en el kit. Para normalizar el contenido de TNF sobre la concentración de proteína de cada muestra en el mismo medio acondicionado usado para el ensayo ELISA, la dosificación de proteína también se llevó a cabo usando BCA (Pierce), midiendo la absorbancia a 540 nm.
Ensayo de sircol
El contenido de colágeno soluble total en lisados celulares y sobrenadante de hCPC-ns y las diferentes subpoblaciones derivadas de ellos, hCPC-CD117+, hCPC-CD90+, hCPC-CD90‘, tratados con TGF-p1 durante 5 días, se midió usando el ensayo de sircol (Biocolor) como se describe en el protocolo del fabricante. La cantidad de colágeno se calculó de acuerdo con una curva estándar.
Análisis estadístico
Los resultados cuantitativos se expresan como media ± desviación estándar (DE) o error estándar (EE). Las variables se analizaron mediante la prueba t de Student. La significación estadística se evaluó con GraphPad Prism 5 y se consideró estadísticamente significativo un valor de P < 0,05.
RESULTADOS
Recientemente, ha surgido la idea de que las células madre y/o células progenitoras utilizadas en terapia celular tienen un efecto positivo sobre el miocardio dañado mediante la producción de factores solubles que ejercen una acción cardioprotectora y antiapoptótica, aumentando la angiogénesis y modulando el proceso inflamatorio. Por lo tanto, es crucial encontrar una población celular que pueda modular de manera eficiente estos procesos.
Caracterización inmunofenotípica de células hCPC-CD90-
De acuerdo con lo reportado previamente [4], la subpoblación de células hCPC-CD90‘ mantiene igualmente las características fenotípicas de las células mesenquimales, que expresan marcadores mesenquimales típicos (por ejemplo, CD29, CD44, CD73 y CD200), y no que expresan marcadores hematopoyéticos (por ejemplo, CD14 y CD34) y del sistema inmunológico (HLA-DR). La Tabla 3 muestra la caracterización de hCPC-CD90‘ en citometría de flujo e indica la expresión de marcadores mesenquimales (CD29, CD44, CD73, CD105 y CD200), del sistema inmunológico (HLA-DR) y hematopoyéticos (CD34, CD45 y CD14). Los datos se expresan como media ± DE (n = 9).
Tabla 3
Diferenciación endotelial de células hCPC-CD90-
La diferenciación de células hCPC-CD90- se evaluó mediante ensayos funcionales y citometría de flujo. Después de la expansión, se evaluó la capacidad de las células para formar estructuras tubulares en la matriz sintética de cultrex, mostrando un aumento significativo en el número de ramificaciones de nuevas estructuras tubulares después de 4 horas con respecto a las demás poblaciones analizadas ((hCPC-CD117+, hCPC-CD90+, hCPC-CD90-) (Figura 18). Además, las células hCPC-CD90‘ se cultivaron en medio proangiogénico EGM-2 durante 3 semanas para establecer su capacidad de diferenciarse en células endoteliales maduras. Los resultados mostraron que las hCPC-CD90‘ son más propensas a diferenciarse en células endoteliales, como lo indica el aumento de la expresión de los marcadores endoteliales CD144/Ve-caderina y KDR/VEGFR2 en comparación con otras poblaciones consideradas de hCPC (hCPC-ns y hCPC-CD117+), alcanzando significación estadística en comparación con las células hCPC-CD117+ (Figura 19).
Análisis de la secreción de citoquinas, quimiocinas y factores de crecimiento mediante células hCPC-CD90-
Se probó el potencial proangiogénico de diferentes subpoblaciones de hCPC mediante el uso de análisis multiplex comparando el contenido de citoquinas en el sobrenadante de hCPC-ns, hCPC-CD117+, hCPC-CD90+ y hCPC-CD90‘. Como se muestra en la Tabla 4, se encontraron varias citoquinas angiogénicas en el sobrenadante de hCPC y subpoblaciones derivadas de ellas: SDF-1, Gro-a, SCF, LIF, IL-6, IL-8, IL-10, MCP-1, MIP-lb, RANTES, HGF y VEGF.
Tabla 4
La Tabla indica la expresión de cada citoquina en pg/ml/105 liberada por las células en 48 horas y los resultados de la comparación estadística de factores producidos por los 3 tipos de células con la prueba t de Student. *= comparación con respecto a hCPC-ns; p < 0,05 con prueba t. Los datos se expresan como media ± DE (n = 3).
En particular, los presentes inventores encontraron que los niveles de citoquinas proangiogénicas (Gro-a e IL-8) y proinflamatorias (IL-6, MCP-1 y MIP-1b) se enriquecieron significativamente en el sobrenadante de hCPC-c D90‘ en comparación con la población no seleccionada (hCPC-ns) de los mismos pacientes, lo que sugiere que la población seleccionada muestra una mayor capacidad para producir factores en comparación con la población no seleccionada de la misma muestra. Además, analizaron el enriquecimiento del factor de secreción en las subpoblaciones hCPC-CD117+, hCPC-CD90+ y hCPC-CD90‘, frente a la contraparte no seleccionada de los mismos pacientes (Figura 20). El resultado muestra una sobreexpresión de casi todos los factores considerados en la hCPC-CD90‘ con respecto a la subpoblación hCPC-CD117+ alcanzando la significación estadística para IL-6 e IL-8.
hCPC-CD90- media la reversión de las principales características fisiopatológicas de la distrofia muscular de Duchenne y Becker
Los cardiomiocitos derivados de iPS de pacientes distróficos (DMD) (distrofia de Duchenne y Becker) exhiben una serie de déficits fenotípicos, típicos de la distrofia muscular, que incluyen un aumento en la muerte de cardiomiocitos y liberación de citoquinas proinflamatorias como el factor de necrosis tumoral (TNF)-a, como se describe para otras enfermedades del miocardio [6]. El descubrimiento de una población celular que antagonice múltiples vías fisiopatológicas de DMD es crucial en la perspectiva de una posible explotación en la terapia celular. Por esta razón, se cultivaron varias poblaciones de hCPC en presencia de cardiomiocitos derivados de iPS de pacientes distróficos. El sobrenadante se recogió después de 3 y 7 días desde el inicio del cocultivo y se usó para evaluar los índices de daño cardíaco que ocurren en el trastorno distrófico: la liberación de troponina I cardíaca y de TNF-a en medio de cultivo.
Efecto cardioprotector de la subpoblación hCPC-CD90-
Para evaluar el efecto cardioprotector de diferentes poblaciones de hCPC, se cultivaron conjuntamente en presencia de CM-d-hiPSCs de pacientes con Duchenne y Becker. Los resultados mostraron que la subpoblación de hCPC-CD90‘ es la única, entre las analizadas, capaz de disminuir significativamente la muerte de CM-dhiPSCs de pacientes con Duchenne y Becker (medida por la liberación de cTnl en el cultivo) después de 7 días de cultivo (Figura 21).
Efecto antiinflamatorio de las subpoblaciones hCPC-CD90- y hCPC CD117+/CD90-
Para evaluar el efecto antiinflamatorio de diferentes poblaciones de hCPC, se cocultivaron células en presencia de CM-d-hiPSCs de pacientes con Duchenne y Becker. Los resultados mostraron que la subpoblación hCPC-CD90' es la única, una entre las analizadas, capaz de mitigar significativamente el daño que ocurre en CM-dhiPSCs de pacientes con Duchenne después de 3 días de cultivo, como lo demuestra la liberación reducida de TNF-a en medio de cultivo. En cuanto a las CM-d-hiPSCs de los pacientes con Becker, que muestran un fenotipo menos dañado, responden positivamente a diferentes subpoblaciones consideradas (hCPC-CD117+, hCPC-CD90' y hCPC-CD117+/CD90), mostrando una disminución significativa en la liberación de TNF-a en el medio de cultivo. En estas condiciones, la población celular, que parece inducir el efecto más significativo, es la subpoblación hCPC-CD117+/CD90‘ seguida de la subpoblación hCPC CD90' (Figura 22).
Efecto in vitro del tratamiento con hCPC con TGF-B1
En el contexto de la terapia celular utilizando células progenitoras de origen mesenquimal, es necesario observar la capacidad de estas células para diferenciarse en miofibroblastos que producen colágeno, debido a que este fenómeno no deseado podría comprometer la recuperación del miocardio dañado.
De hecho, aunque la deposición de colágeno es una parte esencial y, normalmente, reversible de la cicatrización de heridas, la reparación fisiológica del tejido puede evolucionar hacia una respuesta fibrótica progresivamente irreversible cuando se produce la acumulación de tejido conectivo fibrótico (como colágeno y fibronectina) que conduce a cicatrices permanentes, insuficiencia cardíaca y, en última instancia, a la muerte, tal como en la insuficiencia cardíaca.
En este contexto, es crucial tener células que, incluso en un contexto profibrótico (con el aumento de la expresión de TGF-p1), no participen en la deposición de colágeno. Por este motivo, analizamos el efecto del tratamiento con TGF-p1 (5 días) para inducir en diferentes poblaciones de hCPC la producción de colágeno soluble en el medio de cultivo.
Los resultados de la cuantificación de colágeno en estas células y en el medio de cultivo mediante el ensayo de Sircol mostraron que la subpoblación de hCPC-CD90‘ tiene la capacidad más baja para producir colágeno en comparación con las otras poblaciones consideradas (hCPC-ns, hCPC-CD117+ y hCPC-CD90+) (Figura 23).
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Claims (17)
1. Procedimiento para el aislamiento de subpoblaciones de células progenitoras cardíacas humanas, que comprende las siguientes etapas:
a) picar una muestra de tejido cardíaco que contiene una población de células cardíacas;
b) digestión progresiva 4 veces del tejido cardíaco con una mezcla enzimática hasta lograr una suspensión celular y lograr una filtración a través de filtros de tamaño comprendido entre 30 pM y 100 pM;
c) digestión adicional del tejido cardíaco residual obtenido en la etapa b) durante 16 horas con una mezcla enzimática hasta lograr una suspensión celular y filtración a través de filtros de tamaño comprendido entre 30 pM y 100 pM;
d) cultivar la suspensión celular obtenida en la etapa b) y c) en un medio de cultivo adecuado para propagar las células cardíacas;
e) expansión preliminar de la suspensión celular obtenida en la etapa d) en un medio de cultivo adecuado para expandir las células cardíacas en presencia de una solución enzimática o no enzimática;
f) expansión secundaria de las células cardíacas obtenidas en la etapa e) en un medio de cultivo adecuado para expandir aún más las células cardíacas en presencia de una solución enzimática o no enzimática;
g) aislar una o más subpoblaciones de células cardíacas mediante selección positiva y/o negativa mediante el uso de anticuerpos monoclonales dirigidos contra uno o más antígenos de superficie expresados en la población inicial de células progenitoras cardíacas.
2. Procedimiento para el aislamiento de subpoblaciones de células progenitoras cardíacas humanas de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha muestra de tejido cardíaco de la etapa a) se selecciona del grupo que consiste en aurícula derecha, aurícula izquierda, septo, ápice o biopsia ventricular.
3. Procedimiento para el aislamiento de subpoblaciones de células progenitoras cardíacas humanas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el picado de la etapa a) se produce en modo manual o automático.
4. Procedimiento para el aislamiento de subpoblaciones de células progenitoras cardíacas humanas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicha mezcla enzimática de la etapa b) y c) comprende un medio basal y una solución enzimática.
5. Procedimiento para el aislamiento de subpoblaciones de células progenitoras cardíacas humanas de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicha solución enzimática comprende una mezcla de colagenasas y/o proteasas.
6. Procedimiento para el aislamiento de subpoblaciones de células progenitoras cardíacas humanas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-5, en el que dicha mezcla de colagenasas y/o proteasas comprende una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste en colagenasa I, colagenasa II, colagenasa IV, tripsina, EDTA, Accutase™, colagenasa A, Dispase™ y Liberase™.
7. Procedimiento para el aislamiento de subpoblaciones de células progenitoras cardíacas humanas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en el que dicho medio basal es Ham's/F12.
8. Procedimiento para el aislamiento de subpoblaciones de células progenitoras cardíacas humanas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-7, en el que dicha mezcla de colagenasa está presente en una concentración comprendida entre 0,1 y 3 mg/ml.
9. Procedimiento para el aislamiento de subpoblaciones de células progenitoras cardíacas humanas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que dicho medio adecuado para multiplicar y expandir las células cardíacas de las etapas d), e) y f) es medio Ham's/F12 suplementado con suero bovino fetal al 10%, L-glutatión 2 mM y 5 * 10'3 U/ml de eritropoyetina humana, 10 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico y antibióticos.
10. Procedimiento para el aislamiento de subpoblaciones de células progenitoras cardíacas humanas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que la solución enzimática o no enzimática de la etapa e) y f) para expansión celular se selecciona del grupo que consiste en Tryple™ Select, una mezcla de tripsina y/o EDTA, Tampón de disociación celular™, Cell Stripper™, Accutase™ o Dispase™.
11. Procedimiento para el aislamiento de subpoblaciones de células progenitoras cardíacas humanas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que dichos anticuerpos monoclonales de la etapa
g) están marcados con biotina o una molécula fluorescente, preferentemente seleccionada entre FITC o APC.
12. Procedimiento para el aislamiento de subpoblaciones de células progenitoras cardíacas humanas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que dichos anticuerpos de la etapa g) son anticuerpos monoclonales contra uno o más antígenos seleccionados del grupo que consiste en:
3. Procedimiento para el aislamiento de subpoblaciones de células progenitoras cardíacas humanas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la selección de la etapa g) se lleva a cabo mediante separación inmunomagnética.
4. Procedimiento para el aislamiento de subpoblaciones de células progenitoras cardíacas humanas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en el que dichos anticuerpos monoclonales de la etapa g) son anti-CD117 y/o anti-CD90.
15. Subpoblación de células progenitoras cardíacas humanas de aurícula humana obtenidas por el procedimiento de aislamiento de acuerdo con la reivindicación 14 exclusivamente mediante selección negativa utilizando anticuerpos monoclonales anti-CD90, caracterizada por un perfil de marcador de superficie CD90-; expresando marcadores mesenquimales CD29, CD44, CD73, CD105 y CD200; al no expresar los marcadores hematopoyéticos CD34, CD45, CD14 y el marcador del sistema inmunológico HLA-DR.
16. Subpoblación de células progenitoras cardíacas humanas de acuerdo con la reivindicación 15, para uso en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, sola o en combinación con otra subpoblación de células progenitoras cardíacas humanas.
17. Subpoblación de células progenitoras cardíacas humanas de acuerdo con la reivindicación 16, para uso en trasplante de células y/o tejidos cardíacos, sola o en combinación con otra subpoblación de células progenitoras cardíacas humanas.
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