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ES2885686T3 - Conjugados anticuerpo-fármaco hidrófilos - Google Patents

Conjugados anticuerpo-fármaco hidrófilos Download PDF

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ES2885686T3
ES2885686T3 ES15748980T ES15748980T ES2885686T3 ES 2885686 T3 ES2885686 T3 ES 2885686T3 ES 15748980 T ES15748980 T ES 15748980T ES 15748980 T ES15748980 T ES 15748980T ES 2885686 T3 ES2885686 T3 ES 2885686T3
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ES
Spain
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drug
ligand
alkyl
optionally substituted
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ES15748980T
Other languages
English (en)
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Svetlana Doronina
Robert Lyon
Peter Senter
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Seagen Inc
Original Assignee
Seagen Inc
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Publication date
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Abstract

Un compuesto conjugado fármaco-ligando hidrófilo que tiene la Fórmula I: **(Ver fórmula)** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde: L es un ligando que se une específicamente a una diana, en donde el ligando es un anticuerpo; cada LA es un componente de unión de ligando unido covalentemente al átomo de azufre de un grupo tiol del ligando, en donde LA tiene la estructura de: **(Ver fórmula)** o en donde la línea ondulada indica el punto de unión a LH y \\ indica el punto de unión al átomo de azufre del grupo tiol de L; LH es un enlazador hidrófilo, en donde el enlazador hidrófilo tiene la estructura seleccionada del grupo que consiste en: **(Ver fórmula)** en donde R21 se selecciona del grupo que consiste en -CH2NH2, -CH2CH2NH2, -CH2OH, -CH2CH2OH, -CH2CO2H, -CH2CH2CO2H, -CH2 CH2CH2CO2H y - CH2CH2CH2CH2CO2H- y R22 se selecciona del grupo que consiste en CH2NH2, CH2CH2NH2, CH2OH y CH2CH2OH, **(Ver fórmula)** y **(Ver fórmula)** en donde en cada una de las estructuras LH, las líneas onduladas izquierda y derecha indican uniones covalentes a DE y LA, respectivamente; DE es una auristatina; el subíndice p' es 1; y el subíndice p es un número entero de 8-12, en donde el compuesto del conjugado fármaco-ligando tiene un índice de hidrofilicidad de menos de dos, en donde: DE tiene la fórmula: **(Ver fórmula)** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde: la línea ondulada en la estructura de la auristatina indica unión covalente al enlazador hidrófilo; R1 y R2 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidrógeno (H) y alquilo -C1-C8 opcionalmente sustituido, con la condición de que tanto R1 como R2 no sean H, a menos que tanto R3 como R3' no sean H; R3 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo -C1-C8 opcionalmente sustituido; R3' se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo -C1-C8 opcionalmente sustituido y al menos uno de R3 y R3' no sea H; R4 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo -C1-C8 opcionalmente sustituido; R5 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo -C1-C8 opcionalmente sustituido; o R4 y R5 forman conjuntamente un anillo carbocíclico y tiene la fórmula -(CRaRb)n- en donde Ra y Rb se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo -C1-C8 opcionalmente sustituido y el subíndice n se selecciona del grupo que consiste en 2, 3, 4, 5 y 6; R6 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo -C1-C8 opcionalmente sustituido; R7 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo -C1-C8 opcionalmente sustituido; cada R8 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, -OH, alquilo -C1-C8 opcionalmente sustituido y -O-(alquilo C1-C8) opcionalmente sustituido; y R12 se selecciona de las cadenas laterales del grupo que consiste en treonina, serina, asparagina, ácido aspártico, glutamina, ácido glutámico, homoserina, hidroxivalina, furilalanina, treonina(PO3H2), pirazolilalanina, triazolilalanina y tiazolilalanina; o una sal farmacéuticamente aceptable.

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados anticuerpo-fármaco hidrófilos
Antecedentes de la invención
Ha surgido un gran interés en torno al uso de anticuerpos monoclonales (AcM) para el suministro dirigido de agentes citotóxicos a las células cancerosas. El diseño de conjugados anticuerpo-fármaco, mediante la unión de un agente citotóxico a un anticuerpo, normalmente a través de un enlazador, implica la consideración de una variedad de factores. Estos factores incluyen la identidad y la ubicación del grupo o grupos químicos para la conjugación del agente citotóxico, el mecanismo de liberación del agente citotóxico, el o los elementos estructurales (si los hay) que proporcionan la liberación del agente y la modificación estructural del agente libre liberado, si la hay. Además, si el agente citotóxico se va a liberar después de la internalización del anticuerpo, los elementos estructurales y el mecanismo de liberación del agente deben estar en consonancia con el tráfico intracelular del conjugado.
Si bien se han evaluado varias clases de fármacos diferentes para su suministro a través de anticuerpos, solo unas pocas clases de fármacos han demostrado ser suficientemente activas como conjugados anticuerpo-fármaco, a la vez que tienen un perfil de toxicidad adecuado, para garantizar el desarrollo clínico. Una de esas clases son las auristatinas, relacionadas con el producto natural dolastatina 10. Las auristatinas representativas incluyen MMAE (N-metilvalina-valina-dolaisoleuina-dolaproína-norefedrina) y MMAF (N-metilvalina-valina-dolaisoleuina-dolaproínafenilalanina).
MMAE es un ejemplo de un agente citotóxico que es activo como fármaco libre y es muy potente después de la conjugación con un anticuerpo monoclonal (AcM) y se libera después de la internalización en las células. MMAE se ha conjugado con éxito a un AcM en el aminoácido del extremo N-terminal de MMAE mediante un enlazador basado en un péptido escindible por catepsina B que contiene maleimidocaproil-valina-citrulina (mc-vc-) y un grupo autoinmolativo p-aminobencil-carbamoilo (PABc ) para producir conjugados anticuerpo-fármaco de la siguiente estructura, AcM-(mc-vc-PABC-MMAE)p. (En la fórmula anterior, p se refiere al número de unidades (mc-vc-PABC-MMAE) por AcM o anticuerpo). Tras la escisión del enlace entre el péptido vc y el grupo PABC autoinmolativo, el grupo PABC se libera de m Ma E, dejando libre a MMAE.
Otra auristatina, MMAF, es menos activa como fármaco libre (en comparación con MMAE), pero es muy potente después de la conjugación con un anticuerpo, internalización y liberación en las células. MMAF se ha conjugado con éxito a un anticuerpo monoclonal (AcM) en el aminoácido del extremo N-terminal de MMAF a través de un enlazador basado en un péptido escindible por catepsina B que contiene maleimidocaproil-valina-citrulina (mc-vc-) y un grupo autoinmolativo p-aminobencil-carbamoilo (PABC) para producir conjugados anticuerpo-fármaco de la estructura AcM-(mc-vc-PABC-MMAF)p. (p se refiere al número de unidades (mc-vc-PABC-MMAF) por AcM o anticuerpo). Tras la escisión del enlace entre el péptido y la subunidad PABC, el grupo PABC autoinmolativo se libera de MMAF, dejando libre a MMAF.
MMAF también es activo como un conjugado no escindible, que contiene el fármaco-enlazador maleimidocaproil MMAF (mcMMAF). Cuando este conjugado, AcM-(mcMMAF)p, se internaliza en las células, la especie activa liberada es cys-mcMMAF. Debido a que el enlazador no es escindible, el maleimidocaproilo y un residuo de cisteína del anticuerpo permanecen unidos al extremo N-terminal de MMAF. Se informó, además, que MMAF es activo como un conjugado en el extremo C-terminal, unido en su aminoácido C-terminal, fenilalanina, a un péptido-enlazador maleimidocaproilo. Cuando este conjugado, (MMAF-péptido-mc)p-AcM se internaliza en las células, la especie activa, MMAF, se libera después de la escisión del enlace MMAF(fenilalanina)-péptido.
En modelos animales, estos conjugados de MMAE y MMAF generalmente exhibieron una disminución dependiente de la carga del fármaco en las propiedades farmacocinéticas. En particular, a medida que aumentó el número de unidades fármaco-enlazador unidas a cada anticuerpo, disminuyó la farmacocinética (PK) de los conjugados.
Por lo tanto, otro factor importante en el diseño de conjugados anticuerpo-fármaco es la cantidad de fármaco que se puede suministrar por agente de direccionamiento (es decir, el número de agentes citotóxicos unidos a cada agente de direccionamiento (por ejemplo, un anticuerpo), denominado carga de fármaco o cargamento de fármaco). Históricamente, las suposiciones eran que las cargas de fármacos más altas eran superiores a las cargas de fármacos más bajas (por ejemplo, 8 cargas frente a 4 cargas). El razonamiento era que los conjugados con mayor carga suministrarían más fármaco (agentes citotóxicos) a las células objetivo. Este razonamiento fue respaldado por las observaciones de que los conjugados con mayores cargas de fármaco eran más activos contra las líneas celulares in vitro. Sin embargo, algunos estudios posteriores revelaron que esta suposición no se confirmó en modelos animales. Se observó que los conjugados que tenían cargas de fármaco de 4 u 8 de ciertas auristatinas tenían actividades similares en modelos de ratón. Véase, por ejemplo, Hamblett y otros, Clinical Cancer Res.
10:7063-70 (2004). Hamblett y otros, informaron además que los ADC con mayor carga se eliminaron más rápidamente de la circulación en los modelos animales. Esta eliminación más rápida sugirió un riesgo de PK para las especies con mayor carga en comparación con las especies con menor carga. Véase Hamblett y otros. Además, los conjugados con mayor carga tenían MTD más bajos en ratones y, como resultado, tenían índices terapéuticos informados más limitados. Id. Por el contrario, se informó que los ADC con una carga de fármaco de 2 en los sitios diseñados en un anticuerpo monoclonal tenían una farmacocinética e índices terapéuticos iguales o mejores en comparación con ciertos ADC con 4 cargas. Por ejemplo, véase Junutula y otros, Clinical Cancer Res. 16: 4769 (2010). Por lo tanto, las tendencias recientes son desarrollar ADC con bajas cargas de fármaco.
Los enfoques alternativos para superar el riesgo de PK de los ADC con mayor carga han sido agregar grupos solubilizantes a los ADC. Por ejemplo, se han incluido polímeros de polietilenglicol u otros polímeros solubles en agua en enlazadores (por ejemplo, entre el fármaco y el sitio de unión de un anticuerpo) en un intento de superar los riesgos de PK. Otro enfoque ha sido añadir polímeros de fármacos a un anticuerpo, donde cada polímero contiene una gran cantidad de fármacos. Sin embargo, estas alternativas no han logrado necesariamente el resultado deseado. Además, la adición de grupos solubilizantes puede aumentar la complejidad de fabricación de tales conjugados.
WO 2009/117531 describe compuestos enlazadores de fármacos y conjugados de ligandos enlazadores de fármacos que tienen auristatinas unidas a través del extremo C-terminal.
Por lo tanto, existe la necesidad de formatos de conjugados anticuerpo-fármaco (y más generalmente de formatos para otros conjugados), que permitan una carga de fármaco más alta, pero que mantengan otras características convenientes de los conjugados con menor carga, tales como las propiedades farmacocinéticas favorables. Sorprendentemente, la presente invención aborda estas necesidades.
Breve resumen de la invención
La presente invención proporciona, entre otros, conjugados hidrófilos ligando-enlazador-fármaco. Al diseñar los conjugados para que tengan una hidrofilicidad similar a la del agente de direccionamiento no conjugado (por ejemplo, un ligando tal como un anticuerpo), los conjugados retienen la capacidad de proporcionar propiedades farmacocinéticas (PK) similares a las del agente de direccionamiento no conjugado in vivo. Los conjugados también pueden tener mayores cargas de fármaco (es decir, mayor número de fármaco-enlazadores hidrófilos por agente de direccionamiento), en comparación con los conjugados de menor carga, mientras retienen tales propiedades de PK convenientes y tienen la misma o mejor actividad in vivo. (Por ejemplo, conjugados con 4 u 8 cargas pueden tener las mismas o mejores propiedades PK que sus contrapartes con 2 o 4 cargas, respectivamente; dichos conjugados con 4 u 8 cargas pueden tener la misma o mejor actividad que sus 2 o 4 contrapartes cargadas, respectivamente). Por tanto, los agentes de direccionamiento seleccionados sobre la base de ciertas propiedades convenientes pueden conjugarse con enlazadores de fármacos sin perjudicar sustancialmente propiedades convenientes tales como las propiedades PK del agente de direccionamiento solo. La presente solicitud también describe métodos para preparar y usar tales conjugados.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 representa un esquema sintético ilustrativo para el ensamblaje de los conjugados ligando-enlazadorfármaco descritos en la presente descripción.
La Figura 2 muestra los resultados de un estudio en ratones que compara la estabilidad farmacocinética de un anticuerpo no conjugado, dos ADC hidrófilos y tres ADC de control. Los ADC se muestran en orden de arriba a abajo.
La Figura 3 muestra los resultados de un estudio en ratones que compara la estabilidad farmacocinética de cinco ADC hidrófilos y un ADC de control.
La Figura 4 muestra los resultados de la cromatografía HIC de conjugados de anticuerpo y fármaco.
La Figura 5 muestra los resultados de la cromatografía HIC de conjugados de anticuerpo y fármaco.
La Figura 6 muestra los resultados de los estudios de xenoinjerto de ratón que comparan las actividades de los ADC cargados con 4 y cargados con 8.
La Figura 7 muestra los resultados de los estudios de xenoinjerto de ratón que comparan las actividades de los ADC cargados con 4 y cargados con 8.
La Figura 8 muestra los resultados de los estudios de xenoinjertos de ratón que comparan las actividades de los ADC cargados con 4 y cargados con 8.
La Figura 9 muestra los resultados de los estudios de xenoinjertos de ratón que comparan las actividades de los ADC cargados con 4 y cargados con 8.
Abreviaturas y definiciones
A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos y frases, tal como se usan en la presente descripción, pretenden tener los siguientes significados. Cuando se usan nombres comerciales en la presente descripción, el nombre comercial incluye la formulación del producto, el fármaco genérico y el o los ingredientes farmacéuticos activos del producto con nombre comercial, a menos que el contexto indique lo contrario.
El término "índice de hidrofilicidad" se refiere a una medida de la hidrofilicidad de un conjugado en relación con la hidrofilicidad del agente de direccionamiento solo (es decir, un ligando, normalmente un anticuerpo). El índice de hidrofilicidad se mide como el tiempo de retención de un conjugado con el del correspondiente agente de direccionamiento no conjugado (solo) en condiciones de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), como se describe adicionalmente en la presente descripción. Por ejemplo, se puede determinar el tiempo de retención de un conjugado ligando-enlazador-fármaco, en relación con el tiempo de retención del ligando no conjugado (normalmente un anticuerpo). En modalidades seleccionadas, el tiempo de retención del conjugado no es más de dos minutos más lento que el tiempo de retención del ligando no conjugado, según se determina como se describe en los ejemplos (denominado índice de hidrofilicidad de 2). En determinadas modalidades, el tiempo de retención del conjugado no es más de un minuto más lento que el tiempo de retención del ligando no conjugado, según se determina como se describe en los ejemplos (denominado índice de hidrofilicidad de 1). En determinadas modalidades, el tiempo de retención del conjugado no es más de medio minuto más lento que el tiempo de retención del ligando no conjugado, según se determina como se describe en los ejemplos (denominado índice de hidrofilicidad de 0,5). Si se usa una columna y/o método de interacción hidrófoba diferente, se puede calibrar mediante el uso de conjugados de la Tabla 2 como referencias para determinar las movilidades del conjugado de referencia (tiempos de elución) en la columna y/o método seleccionados. Las movilidades de referencia determinadas en la columna de interacción hidrófoba y/o método seleccionados pueden usarse luego para calcular un índice de hidrofilicidad de un compuesto de prueba (como se determinaría siguiendo el Ejemplo 3). Por ejemplo, pueden usarse enlazadores de fármaco auristatina T-Glu-Dpr-MA, un mc-MMAF y un mc-vc-PABC-MMAE para formar conjugados para usar como referencias. En otro ejemplo, un ADC de auristatina T-Glu-Dpr-MA-h1F6, un ADC de h1F6-mc-MMAF y un ADC de h1F6-mc-vc-PABC-MMAE pueden usarse como referencias.
El término "alquilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, significa, a menos que se indique lo contrario, un radical hidrocarburo de cadena lineal o ramificado, que tiene el número de átomos de carbono designado (es decir C1-8 significa de uno a ocho carbonos). Los ejemplos de grupos alquilo incluyen metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, isobutilo, sec-butilo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo y similares. El término "alquenilo" se refiere a un grupo alquilo insaturado que tiene uno o más dobles enlaces. De manera similar, el término "alquinilo" se refiere a un grupo alquilo insaturado que tiene uno o más triples enlaces. Ejemplos de tales grupos alquilo insaturados incluyen vinilo, 2-propenilo, crotilo, 2-isopentenilo, 2-(butadienilo), 2,4-pentadienilo, 3-(1,4-pentadienilo), etinilo, 1- y 3-propinilo, 3-butinilo y los homólogos e isómeros superiores. El término "cicloalquilo" se refiere a anillos de hidrocarburos que tienen el número indicado de átomos en el anillo (por ejemplo, cicloalquilo C3-6) y que están completamente saturados o que no tienen más de un doble enlace entre los vértices del anillo. "Cicloalquilo" también se refiere a anillos de hidrocarburos bicíclicos y policíclicos tales como, por ejemplo, biciclo[2.2.1]heptano, biciclo[2.2.2]octano, etc. El término "heterocicloalcano" o "heterocicloalquilo" se refiere a un grupo cicloalquilo que contiene de uno a cinco heteroátomos seleccionados entre N, O y S, en donde los átomos de nitrógeno y azufre están opcionalmente oxidados, y el átomo o átomos de nitrógeno están opcionalmente cuaternizados. El heterocicloalcano puede ser un sistema de anillo monocíclico, bicíclico o policíclico. Los ejemplos no limitantes de grupos heterocicloalcanos incluyen pirrolidina, imidazolidina, pirazolidina, butirolactama, valerolactama, imidazolidinona, hidantoína, dioxolano, ftalimida, piperidina, 1,4-dioxano, morfolina, tiomorfolina, óxido de S- tiomorfolina, óxido de S-S tiomorfolina piperazina, pirano, piridona, 3-pirrolina, tiopirano, pirona, tetrahidrofurano, tetrhidrotiofeno, quinuclidina y similares. Se puede unir un grupo heterocicloalcano al resto de la molécula a través de un anillo de carbono o un heteroátomo.
El término "alquileno" por sí mismo o como parte de otro sustituyente significa un radical divalente derivado de un alcano, como se ejemplifica por -CH2CH2CH2CH2-. Normalmente, un grupo alquilo (o alquileno) tendrá de 1 a 24 átomos de carbono, en la presente invención se prefieren aquellos grupos que tengan 10 o menos átomos de carbono. Un "alquilo inferior" o "alquileno inferior" es un grupo alquilo o alquileno de cadena más corta, que generalmente tiene cuatro o menos átomos de carbono. De manera similar, "alquenileno" y "alquinileno" se refieren a las formas insaturadas de "alquileno" que tienen dobles o triples enlaces, respectivamente.
Como se usa en la presente descripción, una línea ondulada, "E5=a ", que cruza un enlace simple, doble o triple en cualquier estructura química representada en la presente descripción, representa el punto de unión del enlace simple, doble o triple al resto de la molécula.
Los términos "alcoxi", "alquilamino" y "alquiltio" (o tioalcoxi) se usan en su sentido convencional y se refieren a los grupos alquilo unidos al resto de la molécula mediante un átomo de oxígeno, un grupo amino o un átomo de azufre, respectivamente. Además, para los grupos dialquilamino, las porciones de alquilo pueden ser iguales o diferentes y también pueden combinarse para formar un anillo de 3-7 miembros con el átomo de nitrógeno al que está unido cada una. Por consiguiente, un grupo representado como dialquilamino o -NRaRb significa incluir piperidinilo, pirrolidinilo, morfolinilo, azetidinilo y similares.
Los términos "halo" o "halógeno", por sí mismos o como parte de otro sustituyente, significan, a menos que se indique lo contrario, un átomo de flúor, cloro, bromo o yodo. Además, términos como "haloalquilo" pretenden incluir monohaloalquilo y polihaloalquilo. Por ejemplo, el término " haloalquilo C1-4 " es la media para incluir trifluorometilo, 2,2,2-trifluoroetilo, 4-clorobutilo, 3-bromopropilo, y similares.
El término "arilo" significa, a menos que se indique lo contrario, un grupo hidrocarbonado poliinsaturado, normalmente aromático, que puede ser un solo anillo o múltiples anillos (hasta tres anillos) que están fusionados entre sí o unidos covalentemente. El término "heteroarilo" se refiere a grupos (o anillos) arilo que contienen de uno a cinco heteroátomos seleccionados entre N, O y S, en donde los átomos de nitrógeno y azufre están opcionalmente oxidados y el átomo o átomos de nitrógeno están opcionalmente cuaternizados. Se puede unir un grupo heteroarilo al resto de la molécula a través de un heteroátomo. Los ejemplos no limitantes de grupos arilo incluyen fenilo, naftilo y bifenilo, mientras que los ejemplos no limitantes de grupos heteroarilo incluyen piridilo, piridazinilo, pirazinilo, pirimindinilo, triazinilo, quinolinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, cinolinilo, ftalazinilo benzotriazinilo, purinilo, bencimidazolilo, benzopirazolilo, benzotriazolilo, bencisoxazolilo, isobenzofurililo, isoindolilo, indolizinilo, benzotriazinilo, tienopiridinilo, tienopirimidinilo, pirazolopirimidinilo, imidazopiridines, benzotiaxolilo, benzofuranilo, benzotienilo, indolilo, quinolilo, isoquinolilo, isotiazolilo, pirazolilo, indazolilo, pteridinilo, imidazolilo, triazolilo, tetrazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiadiazolilo, pirrolilo, tiazolilo, furilo, tienilo y similares. Los sustituyentes para cada uno de los sistemas de anillos de arilo y heteroarilo indicados anteriormente, cuando se describen como "sustituidos", se seleccionan del grupo de sustituyentes aceptables que se describen más abajo.
El término "arilalquilo" pretende incluir aquellos radicales en los que un grupo arilo está unido a un grupo alquilo (por ejemplo, bencilo, fenetilo y similares). De manera similar, el término "heteroaril-alquilo" pretende incluir aquellos radicales en los que un grupo heteroarilo está unido a un grupo alquilo (por ejemplo, piridilmetilo, tiazoliletilo y similares).
Los términos anteriores (por ejemplo, "alquilo", "arilo" y "heteroarilo"), en algunas modalidades, incluirán formas tanto sustituidas como no sustituidas del radical indicado. Los sustituyentes preferidos para cada tipo de radical se proporcionan más abajo.
A menos que el contexto indique lo contrario, los sustituyentes de los radicales alquilo (que incluye aquellos grupos a menudo denominados alquileno, alquenilo, alquinilo y cicloalquilo) pueden ser una variedad de grupos seleccionados de: -halógeno, -OR', -NR'R", -SR', -SiR'R"R'",-OC(O)R', -C(O)R', -CO2 R', -CONR'R", -OC (O)NR'R", -NR"C (O)R', -NR'-C(O)NR" R''', -NR"C(O)2R', -NH-C(NH2)=NH, -NR'C(NH2)=NH, -NH-C(NH2)=NR', -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", - NR'S(O)2R", -CN y -NO2 en un número que va de cero a (2 m'+1), donde m' es el número total de átomos de carbono en dicho radical. R', R" y R"" se refieren cada uno independientemente a hidrógeno, alquilo C1-8, arilo no sustituido, arilo sustituido con 1-3 halógenos, alquilo C1-8 no sustituido, alcoxi C1-8 o grupos tioalcoxi C1-8, o grupos alquilo C1-4 no sustituido. Cuando R' y R'' están unidos al mismo átomo de nitrógeno, pueden combinarse con el átomo de nitrógeno para formar un anillo de 3, 4, 5, 6 o 7 miembros. Por ejemplo, se entiende que -NR'R" incluye 1-pirrolidinilo y 4-morfolinilo.
De manera similar, los sustituyentes para los grupos arilo y heteroarilo varían y generalmente se seleccionan entre: -halógeno, -OR', -OC(O)R', -NR'R", -SR', -R', -CN, -NO2, -CO2 R', -CONR'R", -C(O)R', -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR" C(O)2R ', -NR'-C(O)NR"R''', -NH-C(NH2)=NH, -NR'C(NH2)=NH, -NH-C(NH2) =NR', -S(O)R', -S(O)2 R', -S(O)2 NR'R", -NR'S(O)2 R", -N3, perfluoro alcoxi (C1-C4) y perfluoro alquilo (C1-C4), en un número comprendido entre cero y el número total de valencias abiertas en el sistema de anillo aromático; y donde R', R" y R'" se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo C1-8, haloalquilo C1-8, cicloalquilo C3-6, alquenilo C2-8, alquinilo C2-8, arilo y heteroarilo no sustituido, (arilo no sustituido)-alquilo C1-4 y ariloxi alquilo-C1-4 no sustituido. Otros sustituyentes adecuados incluyen cada uno de los sustituyentes arilo anteriores unidos a un átomo del anillo mediante un alquileno de entre 1 y 4 átomos de carbono.
El término "base" se refiere a un grupo funcional que desprotona el agua para producir un ion hidróxido. Las bases ilustrativas son aminas y heterociclos que contienen nitrógeno. Las bases representativas incluyen -N (R3)(R4) en donde R3 y R4 se seleccionan independientemente de H o alquilo C1-6, preferentemente H o metilo,
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en donde R5, R6, R7 y R8, en cada aparición, se seleccionan independientemente entre hidrógeno o alquilo Ci-6, preferentemente H o metilo, y e es 0-4. En algunos aspectos, la base es una base nitrogenada.
El término "anticuerpo", se usa en la presente descripción en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoespecíficos, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpos que exhiben la actividad biológica deseada (es decir, unión específica a un antígeno diana). Un anticuerpo intacto tiene principalmente dos regiones: una región variable y una región constante. La región variable se une e interactúa específicamente con un antígeno diana. La región variable incluye regiones determinantes complementarias (CDR) que reconocen y se unen a un sitio de unión específico en un antígeno particular. La región constante puede ser reconocida e interactuar con el sistema inmunológico (véase, por ejemplo, Janeway y otros, 2001, Immuno. Biology, 5ta Ed., Garland Publishing, Nueva York). Un anticuerpo puede ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase. El anticuerpo puede derivarse de cualquier especie adecuada. En algunas modalidades, el anticuerpo es de origen humano o murino. Un anticuerpo monoclonal puede ser, por ejemplo, humano, humanizado o quimérico.
El término "anticuerpo monoclonal", como se usa en la presente descripción, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos y se dirigen contra un único sitio antigénico. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo por algún método en particular.
Un "anticuerpo intacto" es uno que comprende una región variable de unión al antígeno, así como también un dominio constante de cadena ligera (Cl) y dominios constantes de cadena pesada, Ch1, Ch2, Ch3 y Ch4, según sea apropiado para la clase de anticuerpos. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo, dominios constantes de secuencia nativa humana) o una variante de la secuencia de aminoácidos de estos.
Un "fragmento de anticuerpo" comprende una porción de un anticuerpo intacto, que comprende la región variable o de unión al antígeno del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpos monocatenarios, scFv, scFv-Fc, fragmentos de anticuerpos multiespecíficos formados a partir del fragmento o fragmentos de anticuerpo producidos por una biblioteca de expresión de Fab, o fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los anteriores que se unen específicamente a un antígeno diana (por ejemplo, un antígeno de célula cancerosa, un antígeno viral o un antígeno microbiano).
Un "antígeno" es una entidad a la que se une específicamente un anticuerpo. Un antígeno puede ser, por ejemplo, proteico (por ejemplo, una proteína, polipéptido o péptido), no proteico (por ejemplo, un carbohidrato) o una combinación de los dos.
Los términos "unión específica" y "que se une específicamente" significan que el agente de direccionamiento o ligando, tal como un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, se unirá, de una manera muy selectiva, con su correspondiente antígeno diana y no con una multitud de otros antígenos. Para un anticuerpo, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo normalmente se une con una afinidad de al menos aproximadamente 1x10-7 M, y preferentemente 10-8 M a 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M o 10-12 M y se une al antígeno predeterminado con una afinidad que es al menos dos veces mayor que su afinidad de unión a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína) distinto del antígeno predeterminado o un antígeno estrechamente relacionado que tienen el mismo epítopo.
El término "inhibir" o "inhibición de" significa reducir en una cantidad medible o prevenir por completo.
El término "cantidad terapéuticamente efectiva " se refiere a una cantidad de un conjugado (por ejemplo, un conjugado anticuerpo fármaco) que es efectiva para tratar una enfermedad o trastorno en un mamífero. En el caso del cáncer, una cantidad terapéuticamente efectiva del conjugado puede reducir la cantidad de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, retrasar hasta cierto punto y, preferentemente, detener) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; inhibir (es decir, retrasar hasta cierto punto y, preferentemente, detener) la metástasis tumoral; inhibir el crecimiento tumoral; y/o aliviar uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. En la medida en que el fármaco pueda inhibir el crecimiento y/o destruir las células cancerosas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. Para la terapia contra el cáncer, la eficacia puede medirse, por ejemplo, evaluando el tiempo hasta la progresión de la enfermedad (TTP) y/o determinando la tasa de respuesta (RR).
El término "sustancial" o "sustancialmente" se refiere a una mayoría, es decir >50 % de una población, de una mezcla o una muestra, preferentemente más del 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de una población.
Los términos "escindido intracelularmente" y "escisión intracelular" se refieren a un proceso o reacción metabólica dentro de una célula en un conjugado ligando-enlazador-fármaco (por ejemplo, un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC), o similar), mediante el cual la unión covalente (la unidad enlazadora), entre el resto De y la unidad de ligando (por ejemplo, un anticuerpo (Ac)) se rompe, lo que da como resultado la liberación de la unidad De. Los restos escindidos del conjugado ligando-enlazador-fármaco son, por tanto, metabolitos intracelulares.
El término "actividad citotóxica" se refiere a un efecto citotóxico o de destrucción de células de un compuesto conjugado ligando-enlazador-fármaco, normalmente a través de la unidad de fármaco liberada, en la célula diana. La actividad citotóxica se puede expresar como el valor IC50 (también denominado como la concentración inhibidora máxima media), que es la concentración (molar o masa) por unidad de volumen a la que la mitad de las células sobreviven a la exposición al conjugado.
El término "agente citotóxico" como se usa en la presente descripción se refiere a una sustancia que destruye las células o de otra manera provoca la destrucción de las células.
Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen la condición o trastorno fisiológico en mamíferos que se caracteriza normalmente por un crecimiento celular no regulado. Un "tumor" comprende células cancerosas.
Una "enfermedad autoinmunitaria" es una enfermedad o trastorno que surge de y está dirigido contra los propios tejidos o proteínas de un individuo.
Los ejemplos de un "paciente" incluyen, pero no se limitan a, un ser humano, una rata, un ratón, una cobaya, un mono, un cerdo, una cabra, una vaca, un caballo, un perro, un gato, un pájaro y un ave. En una modalidad ilustrativa, el paciente es un ser humano.
Los términos "tratar" o "tratamiento", a menos que el contexto indique lo contrario, se refieren a tratamiento terapéutico y medidas profilácticas para evitar recaídas, en donde el objetivo es inhibir o desacelerar (disminuir) un cambio o trastorno fisiológico no deseado, tal como el desarrollo o la propagación del cáncer. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio de los síntomas, disminución de la extensión de la enfermedad, un estado estabilizado de la enfermedad (es decir, que no empeora), retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad, y remisión (ya sea parcial o completa), ya sea detectable o indetectable. "Tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no recibe tratamiento. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya padecen la afección o trastorno.
En el contexto del cáncer, el término "tratar" incluye cualquiera o todos de los siguientes: inhibir el crecimiento de células tumorales, células cancerosas o de un tumor; inhibir la replicación de células tumorales o células cancerosas, disminuir la carga tumoral general o disminuir el número de células cancerosas, y mejorar uno o más síntomas asociados con la enfermedad.
En el contexto de una enfermedad autoinmunitaria, el término "tratar" incluye cualquiera o todos de los siguientes: inhibir la replicación de células asociadas con un estado de la enfermedad autoinmunitaria que incluye, pero sin limitarse a, células que producen un anticuerpo autoinmunitario, disminuir la carga de anticuerpos autoinmunitarios y mejorar uno o más síntomas de una enfermedad autoinmunitaria.
La frase "sal farmacéuticamente aceptable", como se usa en la presente descripción, se refiere a sales orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables de un compuesto (por ejemplo, un fármaco, un enlazador-fármaco o un conjugado ligando-enlazador-fármaco). El compuesto puede contener al menos un grupo amino y, por consiguiente, se pueden formar sales de adición de ácido con el grupo amino. Las sales ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, sales de sulfato, trifluoroacetato, citrato, acetato, oxalato, cloruro, bromuro, yoduro, nitrato, bisulfato, fosfato, fosfato ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato ácido, tartrato, oleato, tanato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucuronato, sacarato, formiato, benzoato, glutamato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato y pamoato (es decir, 1,1'-metilen-bis-(2-hidroxi-3-naftoato)). Una sal farmacéuticamente aceptable puede implicar la inclusión de otra molécula, tal como un ion acetato, un ion succinato u otro contraión. El contraión puede ser cualquier porción orgánica o inorgánica que estabilice la carga en el compuesto original. Además, una sal farmacéuticamente aceptable puede tener más de un átomo cargado en su estructura. Los ejemplos donde múltiples átomos cargados son parte de la sal farmacéuticamente aceptable pueden tener múltiples contraiones. Por lo tanto, una sal farmacéuticamente aceptable puede tener uno o más átomos cargados y/o uno o más contraiones.
Descripción detallada
General
La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que ciertas combinaciones de grupos de unión y agentes citotóxicos pueden usarse para preparar conjugados ligando-enlazador-fármaco que tienen una hidrofilicidad similar a la del ligando no conjugado (es decir, un agente de direccionamiento). La presente invención se refiere, específicamente, a conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) (es decir, conjugados ligando-enlazadorfármaco en donde el agente de direccionamiento es un anticuerpo). Al mantener una hidrofilicidad del conjugado similar a la del ligando no conjugado, los conjugados resultantes pueden tener cargas de fármaco más altas (por ejemplo, al menos 4 u 8 enlazadores de fármaco por ligando), mientras se mantienen ciertas características convenientes del ligando solo, tal como una eliminación reducida in vivo, perfil farmacocinético aumentado in vivo, exposición aumentada de los conjugados a la o las células diana, etc. Ventajosamente, tales conjugados hidrófilos pueden diseñarse para tener una hidrofilicidad similar a la del ligando sin la necesidad de incluir grupos solubilizantes adicionales, tales como polietilenglicol u otros polímeros solubles en agua. (Los conjugados ligandoenlazador-fármaco también se denominan en la presente descripción como conjugados fármaco-ligando, conjugados ligando-fármaco o conjugados ligando fármaco).
Los grupos de enlace hidrófilos (también denominados como enlazadores o unidades enlazadoras) de los conjugados están diseñados para aumentar la hidrofilicidad. El grupo de unión permite la liberación eficiente del agente citotóxico (también denominado unidad de fármaco o fármaco) en la célula diana, suficiente para inducir citotoxicidad o un efecto citostático en el caso de un agente citotóxico. Normalmente, los enlazadores hidrófilos están diseñados para una liberación eficiente de la unidad de fármaco una vez que el conjugado se ha internalizado en la célula diana. Los sitios de reconocimiento adecuados para la liberación de la unidad de fármaco por escisión son aquellos que permiten una separación eficiente de la unidad del grupo de enlace hidrófilo. Normalmente, el sitio de reconocimiento es un sitio de escisión de péptidos (tal como se forma en combinación con un agente citotóxico que tiene un carácter de aminoácido o péptido en el sitio de unión al grupo de enlace). Los ejemplos de sitios de escisión peptídicos incluyen aquellos reconocidos por proteasas intracelulares, tales como aquellos presentes en los lisosomas. Donde el grupo de enlace está unido a un aminoácido de un resto efector (De), se forma un enlace peptídico escindible con la unidad De. El enlace peptídico escindible es susceptible de escindirse por proteasas cuando el conjugado alcanza su sitio objetivo.
Las unidades de fármaco de la presente invención son auristatinas que están diseñadas para tener una mayor hidrofilicidad en combinación con una unidad enlazadora hidrófila. Ventajosamente, las unidades de fármaco pueden diseñarse para que tengan sustituyentes hidrófilos, al tiempo que conservan una potente actividad citotóxica. Las unidades de fármaco auristatina están unidas en su extremo C-terminal a una unidad enlazadora, como se describe con más detalle en la presente descripción.
Por consiguiente, LH es un enlazador hidrófilo que contiene dos o tres aminoácidos, en donde el primer aminoácido forma un sitio de escisión con la parte de la unidad de fármaco a la que está unido.
La hidrofilicidad del conjugado se puede determinar comparando la hidrofilicidad del conjugado con la del agente de direccionamiento no conjugado (es decir, ligando o unidad de ligando), denominado como índice de hidrofilicidad. En determinadas modalidades, el tiempo de retención del conjugado no es más de dos minutos más lento que el tiempo de retención del ligando no conjugado, según se determina como se describe en los ejemplos. En algunas otras modalidades, el tiempo de retención del conjugado no es más de un minuto más lento que el tiempo de retención del ligando no conjugado, según se determina como se describe en los ejemplos. En ciertas otras modalidades, el tiempo de retención del conjugado no es más de medio minuto más lento que el tiempo de retención del ligando no conjugado, según se determina como se describe en los ejemplos. Con referencia a los ejemplos, el ejemplo 3 describe un método preferido para determinar el índice de hidrofilicidad de un conjugado. Alternativamente, se puede calibrar una columna y/o método de interacción hidrófoba diferente mediante el uso de conjugados de la Tabla 2 como referencias para determinar las movilidades conjugadas de referencia (tiempos de elución) de las referencias en la columna y/o método seleccionados. Las movilidades de referencia determinadas en la columna de interacción hidrófoba y/o método seleccionados pueden usarse luego para calcular un índice de hidrofilicidad de un compuesto de prueba (como se determinaría siguiendo el Ejemplo 3). Por ejemplo, pueden usarse enlazadores de fármaco auristatina T-Glu-Dpr-MA, un mc-MMAF y un mc-vc-PABC-MMAE para formar conjugados para usar como referencias. En otro ejemplo, un ADC de auristatina T-Glu-Dpr-MA-h1F6, un ADC de h1F6-mc-MMAF y un ADC de h1F6-mc-vc-PABC-MMAE pueden usarse como referencias.
En vista de lo anterior, se proporciona un conjugado ligando-enlazador-fármaco que comprende una unidad de ligando y múltiples unidades enlazador-fármaco unidas a la unidad de ligando. La unidad enlazadora comprende un ensamblaje enlazador hidrófilo (LH), que incluye un componente de unión de ligando, tal como mediante un enlace tioéter. La unidad de fármaco comprende un agente citotóxico que tiene un componente de unión para la conexión a la unidad enlazadora. En otro grupo de modalidades, se proporcionan conjugados ligando-enlazador-fármaco, en los que la parte enlazadora comprende un conjunto enlazador hidrófilo y la unidad de fármaco comprende un agente citotóxico.
Los conjugados ligando-enlazador-fármaco de la presente invención pueden administrarse a un paciente para el tratamiento de un cáncer. Los conjugados ligando-enlazador-fármaco se pueden administrar en una cantidad terapéuticamente efectiva y en un programa terapéuticamente efectivo. En algunos aspectos, la dosis del conjugado puede ser igual o menor que la de un conjugado de dos cargas comparables (administrado en un programa comparable). En algunos aspectos, la dosis del conjugado puede ser igual o menor que la de un conjugado de cuatro cargas comparable (administrado en un programa comparable). En algunos aspectos, la dosis de conjugado puede ser igual o menor que la de un conjugado de dos cargas comparables, mientras que el programa de dosificación puede ser el mismo o menos frecuente. En algunos aspectos, la dosis de conjugado puede ser igual o menor que la de un conjugado de cuatro cargas comparables, mientras que el programa de dosificación puede ser el mismo o menos frecuente. En algunos aspectos adicionales, la dosis del conjugado puede ser menor y el programa de dosificación puede ser el mismo o menos frecuente que el de un conjugado de dos cargas comparables. En algunos aspectos adicionales, la dosis de conjugado puede ser menor y el programa de dosificación puede ser el mismo o menos frecuente que el de un conjugado de cuatro cargas comparable. El conjugado comparador puede ser, por ejemplo, el mismo conjugado ligando-fármaco-enlazador que tiene una carga de fármaco de 2 o 4.
Conjugado ligando-enlazador-fármaco
En un aspecto, se proporcionan conjugados ligando-enlazador-fármaco que tienen la siguiente fórmula:
Figure imgf000009_0001
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo,
en donde:
L es un ligando que se une específicamente a una diana, en donde el ligando es un anticuerpo;
cada LA es un componente de unión de ligando unido covalentemente al átomo de azufre de un grupo tiol del ligando, en donde LA tiene la estructura de:
en c
Figure imgf000009_0002
del grupo tiol de l;
LH es un enlazador hidrófilo, en donde el enlazador hidrófilo tiene la estructura seleccionada del grupo que consiste en:
Figure imgf000009_0003
en donde R21 se selecciona del grupo que consiste en -CH2NH2, -CH2CH2NH2, -CH2OH, -CH2CH2OH, -CH2CO2H, -CH2CH2CO2H, -CH2 CH2CH2CO2H y -CH2CH2CH2CH2CO2H; y
R22 se selecciona del grupo que consiste en CH2NH2, CH2CH2NH2, CH2OH y CH2CH2OH,
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000011_0001
en donde en cada una de las estructuras LH, las líneas onduladas izquierda y derecha indican uniones covalentes a De y LA, respectivamente;
DE es una auristatina;
el subíndice p es un número entero de 8 a 12; y
subíndice p' es 1,
en donde el compuesto conjugado fármaco-ligando tiene un índice de hidrofobicidad de menos dos, y
en donde De tiene la fórmula:
Figure imgf000011_0002
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
en donde:
la línea ondulada en la estructura de auristatina indica unión covalente al enlazador hidrófilo;
R1 y R2 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidrógeno (H) y
alquilo -C1-C8 opcionalmente sustituido; con la condición de que tanto R1 como R2 no sean H, a menos que tanto R3 como R3' no sean H;
R3 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo C1-C8 opcionalmente sustituido,
R3 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo -C1-C8 opcionalmente sustituido y
al menos uno de R3 y R3' no sea H;
R4 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo -C1-C8 opcionalmente sustituido;
R5 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo -C1-C8 opcionalmente sustituido;
o R4 y R5 forman conjuntamente un anillo carbocíclico y tienen la fórmula -(CRaRb)n-,
en donde Ra y Rb se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H y alquilo -C1-C8 opcionalmente sustituido y n se selecciona del grupo que consiste en 2, 3, 4, 5 y 6;
R6 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo -C1-C8 opcionalmente sustituido;
R7 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo -C1-C8 opcionalmente sustituido;
cada R8 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, -OH, alquilo -C1-C8 opcionalmente sustituido y -O-(alquilo C 1-C8) opcionalmente sustituido;
R12 se selecciona de entre las cadenas laterales del grupo que consiste en treonina, serina, asparagina, ácido aspártico, glutamina, ácido glutámico, homoserina, hidroxivalina, alanina furilo, treonina (PO3H2), alanina pirazolilo, triazolilo alanina y tiazolilo alanina; o una sal farmacéuticamente aceptable.
Varios componentes del conjugado ligando-enlazador-fármaco de Fórmula I se proporcionan con más detalle más abajo.
En algunos aspectos, los conjugados ligando-enlazador-fármaco comprenden una unidad de ligando y al menos ocho unidades enlazador-fármaco, en donde la unidad de ligando y cada una de las unidades de fármaco se unen por una unidad o unidades enlazadoras que comprende un enlazador hidrófilo (LH) ensamblado.
En algunos aspectos, los conjugados ligando-enlazador-fármaco comprenden una unidad de ligando y al menos diez unidades enlazador-fármaco, en donde la unidad de ligando y cada una de las unidades de fármaco se unen por una unidad o unidades enlazadoras que comprenden un enlazador hidrófilo (LH) ensamblado.
Unidad de fármaco
Con referencia a la unidad de fármaco de Fórmula I, [0072] [0073] [0074] R12 se selecciona de las cadenas laterales del grupo de aminoácidos hidrófilos que consiste en treonina, serina, asparagina, ácido aspártico, glutamina, ácido glutámico, homoserina., hidroxivalina, furil alanina, treonina (PO3H2), pirazolil alanina, triazolil alanina y tiazolil alanina.
En algunas modalidades, R12 es la cadena lateral de treonina.
Unidades de fármaco ilustrativas son las formas dimetil o monometil de auristatina T.
Figure imgf000012_0001
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
La unidad enlazadora
Con referencia a la unidad enlazadora de Fórmula I, LA se une covalentemente a un átomo de azufre del ligando. En algunos aspectos, el átomo de azufre es el de un residuo de cisteína que puede formar un enlace disulfuro entre cadenas de un anticuerpo. En otro aspecto, el átomo de azufre es el de un residuo de cisteína que se ha introducido en la unidad de ligando (por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio o reacción química). En aspectos adicionales, los átomos de azufre a los que se unen los LA se seleccionan de residuos de cisteína que forman un enlace disulfuro entre cadenas de un anticuerpo y residuos de cisteína que se han introducido en la unidad de ligando (por ejemplo, por mutagénesis dirigida al sitio o por reacción química).
En algunas modalidades, LH es un enlazador escindible hidrófilo que tiene la fórmula:
Figure imgf000012_0002
aminoácidos 1 2 3
en donde R21 se selecciona
de -CH2NH2, -CH2CH2 NH2, -CH2OH, -CH2CH2OH, -CH2CO2H, -CH2CH2CO2H, -CH2CH2CH2CO2H y -CH2CH2CH2CH2CO2H; y R22 se selecciona de -CH2NH2, -CH2CH2NH2, -CH2OH y -CH2CH2OH. Las líneas onduladas izquierda y derecha indican uniones a la unidad de fármaco y LA, o la rama de LH, respectivamente.
En ciertas modalidades, LH tiene la fórmula:
Las líneas onduladas izquierda y derecha indican uniones a la unidad de fármaco y LA, respectivamente.
En ciertas modalidades, LH tiene la fórmula:
Figure imgf000013_0001
Las líneas onduladas izquierda y derecha indican uniones a la unidad de fármaco y LA, o la rama de LH, respectivamente.
En ciertas modalidades, LH tiene la fórmula:
Figure imgf000013_0002
Las líneas onduladas izquierda y derecha indican uniones a la unidad de fármaco y LA, o la rama de LH, respectivamente.
En ciertas modalidades, LH tiene la fórmula:
Figure imgf000013_0003
Las líneas onduladas izquierda y derecha indican uniones a la unidad de fármaco y LA, o la rama de LH, respectivamente.
En ciertas modalidades, LH tiene la fórmula:
Las líneas onduladas izquierda y derecha indican uniones a la unidad de fármaco y LA, o la rama de LH, respectivamente.
En ciertas modalidades, LH tiene la fórmula:
Figure imgf000014_0001
Las líneas onduladas izquierda y derecha indican uniones a la unidad de fármaco y LA, respectivamente.
En ciertas modalidades, LH tiene la fórmula:
Figure imgf000014_0002
Las líneas onduladas izquierda y derecha indican uniones a la unidad de fármaco y LA, o la rama de LH, respectivamente.
La subunidad LA se describe con más detalle más abajo.
Con referencia de nuevo al conjugado ligando-enlazador-fármaco de Fórmula I, en algunas modalidades adicionales, los conjugados ligando-enlazador-fármaco tienen una fórmula seleccionada de:
en donde S se refiere a un átomo de azufre del ligando.
Las modalidades específicas incluyen las siguientes:
Figure imgf000015_0001
en donde S se refiere a un átomo de azufre del ligando, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo. Estas modalidades quedan fuera del alcance de la invención.
LA - El componente de unión de ligando
Con referencia de nuevo a la fórmula I, LA es un componente de unión de ligando. LA puede ser una maleimida o un grupo de maleimida o succinimida hidrolizada (ilustrada más abajo como un resto de ácido succínico). Cuando La está unido a una unidad de ligando, es un grupo de maleimida o succinimida hidrolizada (ilustrada como un resto de ácido succínico). Por consiguiente, en algunas modalidades, LA tiene la fórmula:
Figure imgf000015_0002
en donde la línea ondulada indica el punto de unión a LH y \\ indica el punto de unión a L, la unidad de ligando.
En otras modalidades, LA tiene la fórmula:
Figure imgf000016_0001
en donde la línea ondulada indica el punto de unión a LH y \\ indica el punto de unión a L, la unidad de ligando.
En el contexto de la presente invención, LA es el vestigio de un grupo maleimida usado para la unión de la porción de ligando. El diseño de LH y LA permite la fácil adición de una unidad de ligando, así como también proporciona un grupo de ácido carboxílico adicional que aumenta la hidrofilicidad del conjugado ligando-fármaco. Además, el nitrógeno de maleimida se convierte en una a-amina del aminoácido 3 (con referencia a LH).
L - El ligando
Con referencia de nuevo a la Fórmula I, la unidad de ligando (L-) es un agente de direccionamiento que se une específicamente a un resto diana. El ligando puede unirse específicamente a un componente celular o a otras moléculas diana de interés. El resto diana, o diana, se encuentra normalmente en la superficie celular. En algunos aspectos, la unidad de ligando actúa para suministrar la unidad de fármaco a la población de células diana en particular con la que interactúa la unidad de ligando. En todas las modalidades, el ligando es un anticuerpo.
LA se une covalentemente a un átomo de azufre del ligando. En algunos aspectos, el átomo de azufre es el de un residuo de cisteína que forma un enlace disulfuro entre cadenas de un anticuerpo. En otro aspecto, el átomo de azufre es el de un residuo de cisteína que se ha introducido en la unidad de ligando (por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio o reacción química). En aspectos adicionales, los átomos de azufre a los que LA se une se seleccionan de residuos de cisteína que forman un enlace disulfuro entre cadenas de un anticuerpo y residuos de cisteína que se han introducido en la unidad de ligando (por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio o reacción química). En algunas modalidades, el residuo de cisteína a se introduce en la región Fc en la posición 239 de acuerdo con el sistema de numeración de índice de la UE como en Kabat ( Kabat EA y otros (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition, NIH Publication No 913242).
En algunos aspectos, una unidad de ligando forma un enlace con la maleimida presente en LH a través de un grupo sulfhidrilo del ligando para formar una succinimida tiosustituida. El grupo sulfhidrilo puede estar presente en el ligando en el estado natural del ligando, por ejemplo, un anticuerpo de origen natural, o puede introducirse en el ligando mediante modificación química. La hidrólisis de la succinimida restante produce la porción LA.
En un aspecto, la unidad de ligando tiene uno o más residuos de lisina que pueden modificarse químicamente para introducir uno o más grupos sulfhidrilo. Los reactivos que pueden usarse para modificar las lisinas incluyen, pero no se limitan a, N-succinimidil S-acetiltioacetato (SATA) e hidrocloruro de 2-imminotiolano (reactivo de Traut).
En otra modalidad, la unidad de ligando puede tener uno o más grupos carbohidrato que pueden modificarse químicamente para tener uno o más grupos sulfhidrilo.
En otra modalidad, los grupos sulfhidrilo se pueden generar mediante la reducción de los disulfuros intercatenarios. Por consiguiente, en algunas modalidades, una unidad enlazadora se conjuga con un residuo de cisteína de los disulfuros intercatenarios reducidos.
En otra modalidad adicional, el grupo sulfhidrilo se introduce químicamente en el anticuerpo, por ejemplo, mediante la introducción de un residuo de cisteína. Por consiguiente, en algunas modalidades, la unidad enlazadora se conjuga con un residuo de cisteína introducido.
Los anticuerpos policlonales útiles son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpos derivadas de sueros de animales inmunizados. Los anticuerpos monoclonales útiles son poblaciones homogéneas de anticuerpos contra un determinante antigénico particular (por ejemplo, un antígeno de célula cancerosa, un antígeno viral, un antígeno microbiano, una proteína, un péptido, un carbohidrato, una sustancia química, un ácido nucleico o fragmentos de los mismos). Un anticuerpo monoclonal (AcM) contra un antígeno de interés puede prepararse mediante el uso de cualquier técnica conocida en la técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo.
Los anticuerpos monoclonales útiles incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales humanos, anticuerpos monoclonales humanizados o anticuerpos monoclonales quiméricos humano-ratón (u otras especies). Los anticuerpos incluyen anticuerpos de longitud completa y fragmentos de unión al antígeno de los mismos. Los anticuerpos monoclonales humanos se pueden preparar mediante cualquiera de las numerosas técnicas conocidas en la técnica (por ejemplo, Teng y otros, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80:7308-7312; Kozbor y otros, 1983, Immunology Today 4: 72-79; y Olsson y otros, 1982, Meth. Enzymol. 92:3-16).
El anticuerpo puede ser un fragmento de unión a antígeno, derivado o análogo de un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a células diana (por ejemplo, antígenos de células cancerosas, antígenos virales o antígenos microbianos) u otros anticuerpos unidos a células o matriz tumorales. En este sentido, "unión a antígeno" significa que el fragmento, derivado o análogo es capaz de unirse específicamente a los restos diana. Específicamente, en una modalidad ilustrativa, la antigenicidad del idiotipo de la molécula de inmunoglobulina se puede potenciar mediante la eliminación de las secuencias marco y secuencias CDR que son extremos C-terminales de la secuencia CDR que reconoce específicamente el antígeno. Para determinar qué secuencias de CDR se unen al antígeno, pueden usarse péptidos sintéticos que contienen las secuencias de CDR en ensayos de unión con el antígeno mediante cualquier método de ensayo de unión conocido en la técnica (por ejemplo, el ensayo de BIA core) (véase, por ejemplo, Kabat y otros, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, National Institute of Health, Bethesda, Md; Kabat E y otros, 1980, J. Immunology 125(3):961-969).
Otros anticuerpos útiles incluyen fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos tales como, pero sin limitarse a, fragmentos (Fab')2, fragmentos Fab, Fv, anticuerpos monocatenarios, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, scFv, scFv-FV o cualquier otra molécula derivada de un anticuerpo y que tiene la misma especificidad que el anticuerpo.
Además, los anticuerpos recombinantes, como los anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que comprenden porciones tanto humanas como no humanas, que pueden prepararse mediante el uso de técnicas estándar de ADN recombinante, son anticuerpos útiles. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes porciones se derivan de diferentes especies animales, tales como, por ejemplo, aquellas que tienen una región variable derivada de un monoclonal murino y regiones constantes de una inmunoglobulina humana (Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 4,816,567; y la patente de Estados Unidos núm. 4,816,397). Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpos de especies no humanas que tienen una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la especie no humana y una región marco derivada de una molécula de inmunoglobulina humana (Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 5,585,089). Tales anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica, por ejemplo, mediante el uso de métodos descritos en la publicación internacional núm. WO 87/02671; publicación de patente Europea núm. 0 184 187; publicación de patente Europea núm. 0 171 496; publicación de patente Europea núm. 0 173494; publicación internacional núm. WO 86/01533; patente de Estados Unidos núm.
4,816,567; publicación de patente Europea núm. 012023; Berter y otros, 1988, Science 240:1041-1043; Liu y otros, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443; Liu y otros, 1987, J. Immunol. 139: 3521-3526; Sun y otros, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218; Nishimura y otros, 1987, Cancer. Res. 47: 999-1005; Wood y otros, 1985, Nature 314: 446-449; y Shaw y otros, 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559; Morrison, 1985, Science 229: 1202­ 1207; Oi y otros, 1986, BioTechniques 4:214; patente de Estados Unidos núm. 5,225,539; Jones y otros, 1986, Nature 321: 552-525; Verhoeyan y otros, 1988, Science 239:1534; y Beidler y otros, 1988, J. Immunol. 141:4053-4060.
Los anticuerpos completamente humanos son particularmente convenientes y se pueden producir mediante el uso de ratones transgénicos que son incapaces de expresar genes de la región variable de cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina endógenas, pero que pueden expresar genes de la región variable de cadenas ligeras y pesadas humanas.
Los anticuerpos pueden tener modificaciones (por ejemplo, sustituciones, deleciones y/o adiciones) en los residuos de aminoácidos que interactúan con los receptores de Fc. En particular, los anticuerpos pueden tener modificaciones en los residuos de aminoácidos identificados como implicados en la interacción entre el dominio anti-Fc y el receptor FcRn (véase, por ejemplo, la publicación internacional núm. WO 97/34631). Los anticuerpos también pueden tener modificaciones en los residuos de aminoácidos identificados como implicados en la interacción entre el dominio anti-Fc y el receptor III de Fc gamma.
Los anticuerpos inmunoespecíficos para un antígeno de células cancerosas pueden obtenerse comercialmente o producirse mediante cualquier método conocido por un experto en la técnica tal como, por ejemplo, síntesis química o técnicas de expresión recombinante. La secuencia de nucleótidos que codifica anticuerpos inmunoespecíficos para un antígeno de células cancerosas puede obtenerse, por ejemplo, de la base de datos GenBank o una base de datos similar, las publicaciones bibliográficas o mediante clonación y secuenciación rutinarias.
En una modalidad específica, pueden usarse anticuerpos para el tratamiento del cáncer. Los anticuerpos inmunoespecíficos para un antígeno de células cancerosas pueden obtenerse comercialmente o producirse mediante cualquier método conocido por un experto en la técnica tal como, por ejemplo, técnicas de expresión recombinante. La secuencia de nucleótidos que codifica anticuerpos inmunoespecíficos para un antígeno de células cancerosas puede obtenerse, por ejemplo, de la base de datos GenBank o una base de datos similar, las publicaciones bibliográficas o mediante clonación y secuenciación rutinarias.
En otra modalidad específica, se usan anticuerpos para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria de acuerdo con las composiciones y métodos de la invención. Los anticuerpos inmunoespecíficos para un antígeno de una célula que es responsable de producir anticuerpos autoinmunitarios pueden obtenerse de cualquier organización (por ejemplo, un científico universitario o una empresa) o producirse mediante cualquier método conocido por un experto en la técnica, como, por ejemplo, técnicas de síntesis química o de expresión recombinante.
En ciertas modalidades, los anticuerpos útiles pueden unirse a un receptor o un complejo receptor. El receptor o complejo receptor puede comprender, por ejemplo, un miembro de la superfamilia de genes de inmunoglobulina, un miembro de la superfamilia del receptor de TNF, una integrina, un receptor de citocina, un receptor de quimiocina, una proteína de histocompatibilidad principal, una lectina o una proteína de control del complemento.
En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo CD70 humanizado (véase, por ejemplo, US 2009/0148942), un anticuerpo CD19 humanizado (véase, por ejemplo, US 2009/0136526), un anticuerpo CD30 quimérico o humanizado (véase, por ejemplo, US 2010/0239571), un anticuerpo CD33 humanizado ( US 2013/0309223), un anticuerpo Beta6 humanizado (véase, por ejemplo, WO 2013/123152), o un anticuerpo Liv-1 humanizado (véase, por ejemplo, US 2013/0259860).
Carga de fármacos - "p"
Con referencia generalmente de nuevo a los conjugados ligando-enlazador-fármaco de Fórmula I, el número de unidades fármaco-enlazador por ligando se representa por p. Cuando se hace referencia a conjugados individuales, p es un número entero que representa el número de moléculas de fármaco-enlazador por ligando. Cuando se hace referencia a una composición que contiene múltiples conjugados, p representa el número promedio de fármacoenlazadores por ligando. La variable p varía de 8 a 12.
El número promedio de unidades fármaco-enlazador por unidad de ligando en una preparación a partir de una reacción de conjugación puede caracterizarse por medios convencionales tales como espectroscopía de masas, ensayo ELISA, HIC y HPLC. También se puede determinar la distribución cuantitativa de los conjugados ligandoenlazador-fármaco en términos de p. En algunos casos, la separación, la purificación y la caracterización de los conjugados ligando-fármaco homogéneos, en donde p es un cierto valor del conjugado ligando-fármaco con otras cargas de fármaco, puede lograrse por medios como HPLC de fase inversa o electroforesis.
Ensayos de actividad
Existen varios ensayos diferentes que pueden usarse para determinar si un conjugado ligando-fármaco ejerce un efecto citotóxico en una línea celular. En un ejemplo para determinar si un conjugado ligando-fármaco ejerce un efecto citotóxico sobre una línea celular, se usa un ensayo de incorporación de timidina. Por ejemplo, las células a una densidad de 5000 células/pocillo de una placa de 96 pocillos se cultivan durante un período de 72 horas y se exponen a 0,5 pCi de 3H-timidina durante las 8 horas finales del período de 72 horas, y la incorporación de 3H-timidina en las células del cultivo se mide en presencia y ausencia del conjugado ligando-fármaco. El conjugado ligando-fármaco tiene un efecto citotóxico sobre las células si las células del cultivo han reducido la incorporación de 3H-timidina en comparación con las mismas células cultivadas bajo las mismas condiciones, pero no en contacto con el conjugado ligando-fármaco. (Véase también Klussman y otros., Bioconjugate Chemistry 15: 765-773 (2004); Doronina y otros, Bioconjugate Chemistry 17: 114-124 (2006).)
En otro ejemplo, para determinar si un conjugado ligando-fármaco ejerce un efecto citotóxico en una línea celular, la viabilidad celular se mide por determinación en una célula de la absorción de un colorante tal como rojo neutro, azul tripán o azul ALAMAR™ (véase, por ejemplo, Page y otros, 1993, Intl. J. of Oncology 3:473-476). En dicho ensayo, las células se incuban en un medio que contiene el colorante, las células se lavan y el colorante restante, que refleja la absorción celular del colorante, se mide espectrofotométricamente. El colorante de unión a proteínas sulforrodamina B (SRB) también se puede usar para medir la citotoxicidad (Skehan y otros, 1990, J. Nat'l Cancer Inst. 82:1107-12). Los conjugados ligando-fármaco preferidos incluyen aquellos con un valor de IC50 (definido como la concentración de AcM que produce un 50 % de muerte celular) de menos de 1000 ng/ml, preferentemente menos de 500 ng/ml, con mayor preferencia menos de 100 ng/ml, incluso con la máxima preferencia de menos de 50 o incluso menos de 10 ng/ml en la línea celular.
Tratamiento de enfermedades
Los conjugados ligando-enlazador-fármaco de Fórmula I pueden usarse en el tratamiento del cáncer. Los conjugados ligando-enlazador-fármaco se pueden administrar en una cantidad terapéuticamente efectiva y en un programa terapéuticamente efectivo. En algunos aspectos, la dosis de conjugado puede ser igual o menor que la de un conjugado de dos cargas comparables. En algunos aspectos, la dosis de conjugado puede ser igual o menor que la de un conjugado de cuatro cargas comparable. En algunos aspectos, la dosis de conjugado puede ser igual o menor que la de un conjugado de dos cargas comparables, mientras que el programa de dosificación puede ser el mismo o menos frecuente. En algunos aspectos, la dosis de conjugado puede ser igual o menor que la de un conjugado de cuatro cargas comparables, mientras que el programa de dosificación puede ser el mismo o menos frecuente. En algunos aspectos adicionales, la dosis de conjugado puede ser mayor y el programa de dosificación puede ser el mismo o menos frecuente que el de un conjugado de dos cargas comparables. En algunos aspectos adicionales, la dosis de conjugado puede ser menor y el programa de dosificación puede ser el mismo o menos frecuente que el de un conjugado de cuatro cargas comparable. El conjugado comparador puede ser, por ejemplo, el mismo conjugado ligando-fármaco-enlazador que tiene una carga de fármaco de 2 o 4.
Tratamiento para el cáncer
Los conjugados ligando-enlazador-fármaco son útiles para inhibir la multiplicación de una célula tumoral o célula cancerosa, provocar apoptosis en una célula tumoral o cancerosa, o para tratar el cáncer en un paciente. Los conjugados ligando-enlazador-fármaco pueden usarse por consiguiente, en una variedad de situaciones para el tratamiento de cánceres. Los conjugados ligando-fármaco pueden usarse para suministrar un fármaco a una célula tumoral u otra célula cancerosa. Sin estar ligado a la teoría, la unidad de ligando de un conjugado ligando-enlazadorfármaco puede unirse específicamente a una diana (por ejemplo, un antígeno en una célula cancerosa), y el conjugado ligando-fármaco puede ser absorbido (internalizado) dentro de un célula tumoral o célula cancerosa a través de endocitosis mediada por receptores u otro mecanismo de internalización. El antígeno puede estar unido a una célula tumoral o célula cancerosa o puede ser una proteína de la matriz extracelular asociada con la célula tumoral o célula cancerosa. Una vez dentro de la célula, el fármaco (agente citotóxico) puede liberarse dentro de la célula. Alternativamente, la unidad de fármaco o el fármaco se puede escindir del conjugado ligando-enlazadorfármaco fuera de la célula tumoral o de la célula cancerosa, y la unidad de fármaco o el fármaco puede penetrar posteriormente en la célula.
Los conjugados ligando-enlazador-fármaco pueden proporcionar un direccionamiento al fármaco contra el cáncer o el tumor específico de la conjugación, reduciendo así la toxicidad general del fármaco (si se administra solo).
En una modalidad, la unidad de ligando puede unirse específicamente a la célula tumoral o la célula cancerosa.
En otra modalidad, la unidad de ligando puede unirse específicamente a un antígeno de una célula tumoral o célula cancerosa que se encuentra en la superficie de la célula tumoral o célula cancerosa.
En otra modalidad, la unidad de ligando puede unirse específicamente a un antígeno de la célula tumoral o de la célula cancerosa que es una proteína de la matriz extracelular asociada con la célula tumoral o la célula cancerosa.
La especificidad de la unidad de ligando para una célula tumoral o una célula cancerosa en particular puede ser importante para determinar los tumores o cánceres que se tratan con mayor efectividad.
Los tipos particulares de cánceres que se pueden tratar con conjugados ligando-enlazador-fármaco incluyen, pero no se limitan a, tumores sólidos (tal como cáncer de células renales, cáncer de hígado y cáncer de piel) y cánceres de transmisión sanguínea (como leucemia mieloblástica aguda (AML), leucemia mielocítica crónica (CML), leucemia linfocítica crónica (CLL) y mieloma múltiple). Se pueden tratar las leucemias y linfomas agudos y crónicos (tales como el linfoma de Hodgkin y el linfoma no Hodgkin).
Los cánceres, que incluye, pero sin limitarse a, un tumor, metástasis u otra enfermedad o trastorno caracterizado por un crecimiento celular descontrolado, pueden tratarse o inhibirse mediante la administración de los conjugados ligando-enlazador-fármaco.
El conjugado ligando-fármaco y un agente quimioterapéutico pueden administrarse a un paciente que lo necesite en una cantidad efectiva. El agente quimioterapéutico puede ser aquel con el que no se ha encontrado que el tratamiento del cáncer sea refractario, o aquel con el que se ha encontrado que el tratamiento del cáncer es refractario. Los conjugados ligando-fármaco se pueden administrar a un paciente que también se ha sometido a una cirugía como tratamiento para el cáncer.
El paciente también puede recibir un tratamiento adicional, como radioterapia. El conjugado ligando-fármaco se puede administrar al mismo tiempo que el agente quimioterapéutico o con radioterapia. Alternativamente, el agente quimioterapéutico o la radioterapia pueden administrarse antes o después de la administración de un conjugado de ligando fármaco.
Los conjugados ligando-fármaco se pueden usar para tratar el cáncer en los casos en los que la quimioterapia o la radioterapia han demostrado o pueden resultar demasiado tóxicas, por ejemplo, producen efectos secundarios inaceptables o insoportables para el sujeto que está siendo tratado.
Composiciones y métodos de administración
La presente invención proporciona además composiciones farmacéuticas que comprenden los conjugados ligandoenlazador-fármaco descritos en la presente descripción y un portador farmacéuticamente aceptable. Los conjugados ligando-enlazador-fármaco pueden estar en cualquier forma que permita que el compuesto se administre a un paciente para el tratamiento de un cáncer. Por ejemplo, los conjugados pueden estar en forma de líquido o sólido. La vía de administración preferida es la parenteral. La administración parenteral incluye técnicas de inyección o infusión subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraesternal. Las composiciones se pueden administrar por vía parenteral. Alternativamente, las composiciones se pueden administrar por vía intravenosa.
Las composiciones farmacéuticas de los conjugados ligando-enlazador-fármaco se pueden formular para permitir que un compuesto esté biodisponible tras la administración del conjugado a un paciente. Las composiciones pueden tomar la forma de una o más unidades de dosificación, donde, por ejemplo, un frasco puede ser una unidad de dosificación individual.
Los materiales usados para preparar las composiciones farmacéuticas pueden no ser tóxicos en las cantidades usadas. Será evidente para los expertos en la técnica que la dosis óptima del o los ingredientes activos en la composición farmacéutica dependerá de una variedad de factores. Los factores de interés incluyen, sin limitación, el tipo de animal (por ejemplo, un ser humano), la forma particular del compuesto, la forma de administración y la composición empleada.
Las composiciones farmacéuticas pueden estar, por ejemplo, en forma líquida. El líquido puede ser útil para suministrarlo mediante inyección. En una composición para administración mediante inyección o administración intravenosa, también se pueden incluir uno o más de un tensioactivo, conservante, agente humectante, agente dispersante, agente de suspensión, tampón, estabilizador y/o agente isotónico.
Las composiciones líquidas, ya sean soluciones, suspensiones u otra forma similar, pueden incluir, además, uno o más de los siguientes: diluyentes estériles tales como agua para inyección, solución salina, preferentemente solución salina fisiológica, solución de Ringer, cloruro de sodio isotónico, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil parabeno; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como aminoácidos, acetatos, citratos o fosfatos; detergentes tales como tensioactivos no iónicos, polioles; y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. Una composición parenteral puede envasarse en una ampolla, una jeringa desechable o un frasco de dosis individuales o múltiples fabricado de vidrio, plástico u otro material. La solución salina fisiológica es un adyuvante ilustrativo. Una composición inyectable es preferentemente estéril.
La cantidad del conjugado que es efectiva en el tratamiento de un trastorno o afección particular dependerá de la naturaleza del trastorno o afección y puede determinarse mediante técnicas clínicas estándar. Además, pueden emplearse opcionalmente ensayos in vitro o in vivo para ayudar a identificar los intervalos de dosis óptimos. La dosis precisa que se empleará en las composiciones farmacéuticas también dependerá de la vía de administración y de la gravedad de la enfermedad o trastorno, y debería decidirse de acuerdo con el criterio del médico y las circunstancias de cada paciente.
Las composiciones comprenden una cantidad de un compuesto de modo que se obtenga una dosis adecuada. Normalmente, esta cantidad es al menos aproximadamente 0,01 % de un compuesto en peso de la composición.
Para la administración intravenosa, la composición puede comprender de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 mg de un conjugado ligando-enlazador-fármaco por kg de peso corporal del animal. En un aspecto, la composición puede incluir de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 mg de un conjugado ligando-fármaco por kg de peso corporal del animal. En otro aspecto, la cantidad administrada estará en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 7,5 mg/kg de peso corporal de un compuesto.
Generalmente, la dosis de un compuesto administrada a un paciente es normalmente de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg del peso corporal del sujeto. En algunas modalidades, la dosis administrada a un paciente está entre aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 7,5 mg/kg del peso corporal del sujeto. En algunas modalidades, la dosis administrada a un paciente está entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 5 mg/kg del peso corporal del sujeto. En algunas modalidades, la dosis administrada a un paciente está entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 4 mg/kg del peso corporal del sujeto. En algunas modalidades, la dosis administrada está entre aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 3 mg/kg o aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 2 mg/kg del peso corporal del sujeto. En algunas modalidades, la dosis administrada está entre aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg del peso corporal del sujeto. En algunas modalidades, la dosis administrada está entre aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg del peso corporal del sujeto. En algunas modalidades, la dosis administrada está entre aproximadamente 0,1 a 4 mg/kg, incluso con mayor preferencia de 0,1 a 3,2 mg/kg, o incluso con mayor preferencia de 0,1 a 2,7 mg/kg del peso corporal del sujeto durante un ciclo de tratamiento.
Los conjugados ligando-enlazador-fármaco pueden ser adecuados para la administración por cualquier vía conveniente, por ejemplo, mediante infusión o inyección en bolo, mediante absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal). La administración puede ser sistémica o local. Se conocen varios sistemas de suministro, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, cápsulas y pueden usarse para administrar un compuesto.
El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante o excipiente con el que se administra un compuesto. Tales portadores farmacéuticos pueden ser líquidos, como el agua. Los portadores pueden ser solución salina, goma arábiga, gelatina, pasta de almidón, talco, queratina, sílice coloidal, urea. Además, pueden usarse agentes auxiliares, estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes. En una modalidad, cuando se administra a un paciente, el compuesto o las composiciones y los portadores farmacéuticamente aceptables son estériles. El agua es un portador ilustrativo cuando los compuestos se administran por vía intravenosa. También se pueden emplear soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los portadores farmacéuticos adecuados incluyen, además, excipientes tales como almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol. Las presentes composiciones, si se desea, también pueden contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponadores del pH.
En una modalidad, los conjugados se formulan de acuerdo con procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para la administración intravenosa a animales, particularmente seres humanos. Normalmente, los portadores o vehículos para la administración intravenosa son soluciones tamponadas acuosas isotónicas y estériles. Cuando sea necesario, las composiciones pueden incluir, además, un agente solubilizante. Las composiciones para la administración intravenosa pueden comprender opcionalmente un anestésico local tal como lidocaína para aliviar el dolor en el lugar de la inyección. Generalmente, los ingredientes se suministran tanto por separado o mezclados en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente cerrado como una ampolla o bolsita que indica la cantidad del agente activo. Donde se va a administrar un conjugado por infusión, se puede dispensar, por ejemplo, con una botella de infusión que contenga agua o solución salina de calidad farmacéutica estéril. Donde el conjugado se administra mediante inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina para que los ingredientes se puedan mezclar antes de la administración.
Las composiciones farmacéuticas se formulan generalmente como estériles, sustancialmente isotónicas y en total conformidad con todas las normativas de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP) de la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden los conjugados de fármaco ligando de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades preferidas, todos, o sustancialmente todos, o más del 50 % de los conjugados de fármaco ligando presentes en la composición farmacéutica comprenden una succinimida hidrolizada tiosustituida. En algunas modalidades preferidas, más del 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de los conjugados de fármaco ligando presentes en la composición farmacéutica comprenden una succinimida tiosustituida hidrolizada.
Métodos para preparar conjugados ligando-fármaco
En la presente descripción se describen métodos para preparar conjugados ligando-fármaco.
Los métodos pueden comprender las etapas de proporcionar un fármaco-enlazador o unidad enlazadora como se describe en la presente descripción, conjugando dicho fármaco-enlazador o unidad enlazadora con un grupo sulfhidrilo de una unidad de ligando para formar un conjugado. El o los grupos maleimida o succinimida tiosustituida del conjugado pueden sufrir una reacción de hidrólisis.
La velocidad de hidrólisis de succinimida tiosustituida puede manipularse ajustando las condiciones de reacción después de la conjugación del fármaco-enlazador con el ligando, por ejemplo, ajustando el pH o la temperatura. Todo, sustancialmente todo, o al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o incluso 95 % de la succinimida tiosustituida puede hidrolizarse sin manipulación de las condiciones de reacción, es decir, la reacción de hidrólisis ocurre bajo las mismas condiciones de reacción que la reacción de conjugación. Alternativamente, todo, sustancialmente todo, o al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o incluso 95 % de la succinimida tiosustituida puede hidrolizarse desde 20 minutos hasta 4 horas después de la conjugación preferentemente de 20 minutos a 2 horas después de la conjugación. Las condiciones de conjugación son preferentemente a un pH de aproximadamente 7,4 y una temperatura de aproximadamente 22 °C.
Los métodos para preparar un conjugado ligando-fármaco pueden comprender las etapas de proporcionar un fármaco-enlazador o unidad enlazadora; conjugar dicho fármaco-enlazador o unidad enlazadora con un grupo sulfhidrilo de un ligando para formar un conjugado ligando-fármaco conjugado que comprende una succinimida tiosustituida no hidrolizada; permitir que la succinimida tiosustituida no hidrolizada se someta a una reacción de hidrólisis, en donde todo, sustancialmente todo, o al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o incluso 85 % de la succinimida se hidroliza de 10 minutos a 4 horas después de la conjugación. Todo, sustancialmente todo, o al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o incluso 95 % de la succinimida puede hidrolizarse en 10 minutos, 20 minutos, 40 minutos, 60 minutos, 90 minutos o 120 minutos después de la conjugación, o la reacción de hidrólisis puede ocurrir bajo las mismas condiciones de reacción que la reacción de conjugación. Las condiciones de conjugación preferidas son un pH de aproximadamente 7,4 y una temperatura de aproximadamente 22 °C.
Ensamblaje de los conjugados ligando-fármaco
Los conjugados ligando-fármaco de la presente invención se pueden ensamblar siguiendo el esquema general que se describe en la Figura 1.
Ejemplos
General
A menos que se indique lo contrario, los materiales se obtuvieron de proveedores comerciales con el grado de pureza más alto disponible y se usaron sin purificaciones adicionales. DMF anhidra y CH2Cl2 se adquirieron de Aldrich. Fmoc-Dolaproína-OH fue sintetizado a medida por Albany Molecular Research, Inc. (Albany, Nueva York). Se preparó Dolavalina-Val-Dil-OH como se describe en otra parte. Fmoc-Dpr (ivDde)-OH y resina de cloruro de 2-clorotritilo (malla 200-300, DVB al 1 %, sustitución 1 mmol gramo) se adquirieron de Novabiochem. La síntesis en fase sólida se realizó en jeringas de plástico (National Scientific Company) provistas de un filtro cortado de una lámina porosa de grado medio de PE fritware (Scienceware). Se usó un agitador Burrell wrist action® (Burrell Scientific, Pittsburg, PA) para la agitación. Todos los rendimientos en fase sólida informados se basan en el nivel de sustitución inicial de la resina y constituyen un balance de masa de material puro aislado, a menos que se indique lo contrario.
Las purificaciones por HPLC preparativa se realizaron en un instrumento Varian equipado con una columna de fase inversa C12 Phenomenex Synergy MAX-RP 4p, 250 x 10 mm, eluyendo con TFA al 0,05 % en un gradiente de aguaacetonitrilo.
Los datos de los espectros de masas se obtuvieron en una XEVO TOF MS interconectada con una HPLC Waters 2795 equipada con una columna de fase inversa C12 Phenomenex Synergi 2,0 x 150 mm, 4 pm, 80 A. El eluyente consistió en un gradiente lineal de acetonitrilo del 5 % al 95 % en ácido fórmico acuoso al 0,1 % durante 10 min, seguido de acetonitrilo isocrático al 95 % durante 5 min a una velocidad de flujo de 0,4 ml/min.
El anticuerpo h1F6 humanizado se une específicamente al antígeno CD70 humano ( Cancer Res 2006, 66(4), pág.
2328; Patente de Estados Unidos núm. 8,067,546). El anticuerpo hBU12 humanizado se une específicamente al antígeno CD19 humano (Blood, 2009, 113 (18), pág. 4362; Patente de Estados Unidos núm. 7,968,687). Las líneas celulares de carcinoma de células renales humanas 786-0 y Caki-1 que expresan CD70 humano, y las células DOHH2 de linfoma folicular transformado humano que expresan CD19 humano se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, Virginia). Todas las líneas celulares se cultivaron de acuerdo con las recomendaciones de los proveedores y se verificaron de forma rutinaria para detectar contaminación por micoplasmas.
Abreviaturas: DPR significa ácido diaminopropiónico; ivDde es 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-iliden)-3-metilbutil-. Ejemplo 1: Procedimientos generales para la síntesis
Síntesis de Maleimido-Dpr (Boc)-OH
Se disolvieron ácido Np -Boc-L-2,3-diaminopropiónico (1 mmol) y anhídrido maleico (98 mg, 1 mmol) en ácido acético (1 ml) en un matraz de fondo redondo de 50 ml y la solución se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. Después, la solución se concentró hasta un aceite bajo presión reducida. El intermediario de ácido maleico se precipitó añadiendo -10 ml de CH2Cl2/hexano, 1/1, v /v, y el precipitado se recogió mediante filtración al vacío. A continuación, este material se suspendió en tolueno (9 ml), seguido de la adición de DMA (0,3 ml) y trietilamina (0,42 ml, 3 mmol). La mezcla se agitó a 40-60 °C en atmósfera de N2 hasta que todo el material estaba en solución. A continuación, se equipó el matraz con un condensador y la solución se calentó a 120 °C y se mantuvo a reflujo durante 4 horas sobre tamices moleculares. La mezcla de reacción se filtró a través de un embudo de vidrio sinterizado y se concentró hasta casi la sequedad a presión reducida. El residuo se disolvió en acetato de etilo (10 ml), se transfirió a un embudo de decantación y se lavó con ácido cítrico al 10 % en agua (2 x 10 ml) y salmuera (2 x 10 ml). La capa orgánica se secó sobre sulfato de magnesio, se concentró bajo presión reducida y se secó bajo alto vacío durante la noche produciendo un producto como un polvo blanco con un 72 % de rendimiento. 1H RMN (DMSO): ó 1,29 (s, 9 H), 3,41 (m, 1H), 3,52 (m, 1H) 4,57 (dd, 1H). 6,97 (t, 1H), 7,07 (s, 2H). LCMS (ESI) calculado para (M Na) 307,09; m/z 307,17, encontrado.
Procedimientos generales para la síntesis de auristatina-AA1-MDpr.
La Figura 1 ilustra una síntesis ilustrativa de fármaco-enlazadores auristatina-(AA2)-AA1-MDpr. Los enlazadores de fármacos de la presente invención se pueden sintetizar siguiendo la síntesis ilustrada en la Figura 1.
Carga de resina. En un recipiente de reacción en fase sólida de 20 ml (jeringa de plástico con filtro de PET) se añadió 1 g de resina de cloruro de 2-clorotritilo (1 mmol en base a la etiqueta del fabricante), seguido de una solución de Fmoc-Dpr (ivDde)-OH o Fmoc-Lys(ivDde)-OH (1,5 mmol, 1,5 equiv), y DIEA (1 mmol, 1 equiv) en 10 ml de CH2Cl2/DMF, 1/1, v/v seco. El recipiente se agitó durante 5 min y luego se añadió más DIEA (1,5 mmol, 1,5 equiv). La mezcla se agitó durante 2 horas más a TA. Se añadió metanol (2,5 ml) para inactivar los sitios que no habían reaccionado. Después de 30 min, la resina se lavó con DMF (5 x 10 ml), CH2Cl2 (5 x 10 ml), éter etílico (5 x 10 ml) y se secó al vacío.
La carga se determinó tratando la pequeña cantidad de resina (2-4 mg) con piperidina al 20 %/DMF (2 ml) durante 2 horas en un matraz volumétrico (10 o 20 ml). El volumen se ajustó con d MF; se midió la absorción a 301 nm. La carga se calculó mediante la siguiente ecuación:
Carga (mmol/g) = (volumen del matraz x A301)/(7800 x mg) x 1000
La carga promedio fue ~ 0,6 mmol/g
Paso de eliminación de Fmoc. La resina que contenía péptido protegido con Fmoc se trató con piperidina al 20 % en DMF (10 ml por gramo de resina) durante 2 h a temperatura ambiente. Luego, la resina se lavó con DMF (5 x 1 ml por gramo de resina), CH2Cl2 (5 x 1 ml por gramo de resina), éter etílico (5 x 1 ml por gramo de resina) y se secó al vacío.
Paso de acoplamiento. A la resina (1 equiv) que contiene el aminoácido N-terminal (AA) desprotegido, se le añadió una solución de Fmoc-AA-OH (2 equiv), HATU (2 equiv) y DIEA (4 equiv) en DMF (1 ml por gramo de resina). El recipiente de reacción se agitó durante 3-4 h. Luego, la resina se lavó con DMF (5 x 1 ml por gramo de resina), CH2Cl2 (5 x 1 ml por gramo de resina), éter etílico (5 x 1 ml por gramo de resina) y se secó al vacío. La finalización de la reacción se confirmó mediante una prueba de Kaiser negativa cuando fue apropiado.
El acoplamiento de Dolavalina-Val-Dil-OH N-terminal se realizó de manera similar.
Desprotección de ivDde y acoplamiento de MDpr (Boc)-OH. Después de acoplar el tripéptido de Dolavalina-Val-Dil-OH, la resina se trató con 2 % de hidrazina/DMF (1 ml por gramo de resina) durante 2 horas a TA. Luego, la resina se lavó con DMF (5 x 1 ml por gramo de resina), CH2Cl2 (5 x 1 ml por gramo de resina), éter etílico (5 x 1 ml por gramo de resina) y se secó al vacío. Se añadió a la resina una solución de Fmoc-MDpr(Boc)-OH (2 equiv), HATU (2 equiv) Y DIEA (4 equiv) en DMF (1 ml por gramo de resina) y la mezcla se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente (TA). La finalización de la reacción se confirmó mediante una prueba de Kaiser negativa. La resina se lavó con DMF (5 x 1 ml por gramo de resina), CH2O2 (5 x 1 ml por gramo de resina), éter etílico (5 x 1 ml por gramo de resina) y se secó al vacío.
Escisión de la resina y desprotección. La resina que contenía péptidos se trató con 20 % de TFA/CH2Cl2 (2 ml por gramo de resina) durante 10 min a temperatura ambiente y la solución se recogió en un matraz de fondo redondo. La resina se lavó con 20 % de TFA/CH2Cl2 (2 x 0,5 ml por gramo de resina). Las soluciones combinadas se dejaron a TA durante 3 horas. Después de la desprotección, se confirmó la finalización mediante LC-MS. Los volátiles se eliminaron a presión reducida en Rotavap y el producto final se purificó mediante HPLC preparativa de fase inversa. Todos los fármaco-enlazadores se obtuvieron con > 95 % de pureza mediante HPLC de fase inversa a 215 nm. Se prepararon fármaco-enlazadores con MA maleimida de una manera similar a la descrita anteriormente mediante el uso de ácido a-maleimidoacético-NHS (Molecular Biosciences, Boulder CO) en lugar de MDpr(Boc)-OH.
Los fármaco-enlazadores con un ensanchador de etilendiamina (EDA) se prepararon mediante un procedimiento similar al que se informó anteriormente (Bioconjugate Chem. 2008, 19, 1960-1963).
Ejemplo 2: Enlazadores de fármacos
Los enlazadores de fármacos fuera del alcance de la presente invención se sintetizaron como se describió anteriormente. La fórmula general fue la siguiente:
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Posición 5
Dpr: X = COOH, n = 1
Lys: X = COOH, n = 4
(En esta fórmula, tenga en cuenta que la designación de AA2 y AA1 se invierte. R corresponde a R12).
La siguiente Tabla 1 resume las síntesis y caracterizaciones de los diversos enlazadores de fármacos. En la tabla, la primera columna (izquierda) se refiere al número del compuesto. La segunda columna (izquierda) se refiere al aminoácido en el extremo C-terminal de la auristatina. Las columnas tercera, cuarta y quinta se refieren a los componentes del enlazador. En la columna 3, se identifican los componentes de aminoácidos del enlazador. En la columna 4, se identifican componentes adicionales de aminoácidos y/o no aminoácidos del enlazador. En la columna 5, se identifica la composición del resto maleimida del enlazador. La sexta columna se refiere al rendimiento del fármaco-enlazador. Las columnas séptima y octava se refieren a las masas calculadas y observadas de los fármacoenlazadores, determinadas por espectroscopía de masas. La última columna (a la derecha) se refiere al tiempo de retención de HIC de los ADC que contienen los enlazadores de fármacos como 8 cargas (generalmente determinadas como se describe en el Ejemplo 3).
Tabla 1
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(continuación)
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Abreviaturas:
Ala se refiere a L-alanina; Asn se refiere a asparagina; Asp se refiere a L-aspartato; Gln se refiere a L-glutamina; Glu se refiere a L-glutamato; Ile se refiere a L-isoleucina; Leu se refiere a L-leucina; Lys se refiere a L-lisina; Phe se refiere a L-fenilalanina; FosfoThr se refiere a L-fosfotreonina; Thr se refiere a L-treonina; hSer se refiere a L-hidroxiserina:
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ValOH se refiere a L-hidroxivalina:
Figure imgf000026_0002
Pirazol se refiere a:
Figure imgf000026_0003
Triazol se refiere a:
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Fur se refiere a:
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MA se refiere a acetilo de maleimido; Dpr se refiere a ácido diaminopropiónico; MDpr se refiere al ácido maleimido diaminopropiónico; EDA se refiere a etilendiamina; mc-MMAF se refiere al conector maleimidocaproil MMAF; mc-vc-PABC-MMAF se refiere a maleimidocaproil-valina-citrulina-p-aminobencilcarbamoilo MMAF; mc-vc-PABC-MMAF se refiere a maleimidocaproil-valina-citrulina-p-aminobencilcarbamoilo MMAE.
Ejemplo 3: Conjugados de anticuerpo y fármaco
Preparación de conjugados anticuerpo-fármaco. Ejemplo para ADC h1F6.
Se prepararon conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) h1F6 con ocho fármacos por anticuerpo mediante reducción completa del anticuerpo seguido de reacción con el fármaco-enlazador deseado. El anticuerpo (10 mg/ml) se redujo completamente mediante la adición de 10 equivalentes molares de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,4 (Invitrogen, Carlsbad, CA) con 1 mM de ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), seguido de incubación a 37 °C durante- 1 h. El exceso de TCEP se eliminó mediante dilución 10X con PBS y concentración del anticuerpo, se repitió 2 veces mediante el uso de un filtro giratorio MWCO de 30 KD (EMD Millipore, Billerica, MA). La reducción completa del anticuerpo se confirmó mediante análisis de HPLC de fase inversa donde las cadenas ligeras y pesadas se resuelven completamente del anticuerpo no reducido. A continuación, se añadió el fármaco-enlazador (10 equivalentes) a partir de una solución madre preparada en DMSO (10 mM). La reacción se dejó reposar a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 horas para permitir la conjugación y la posterior hidrólisis del anillo de tiosuccinimida (MDpr). La mezcla de reacción se purificó y se intercambió con tampón en PBS mediante el uso de columnas de desalación PD-10 (GE Healthcare, Piscataway, NJ). La relación fármaco/Ac del producto final se estimó mediante análisis PLRP-MS y varió entre 7,8 y 8,0 fármacos/Ac. Además, cada ADC se analizó mediante cromatografía de exclusión por tamaño donde las especies de HMW variaron entre 0,5 y el 2,0 %.
Cromatografía de interacción hidrófoba
El análisis de los ADC se realizó mediante cromatografía de interacción hidrófoba (HIC). La HIC se realiza ejecutando un gradiente lineal desde 0-100 % Fase móvil B (MPB) donde la fase móvil A (MPA) consiste en 1,5 M de sulfato de amonio, 25 mM de fosfato de potasio, pH 7,0, y MPB consiste en 75 % de potasio 25 mM de fosfato, pH 7,0, isopropanol al 25 %. La separación se logró mediante el uso de una columna Tosoh t-Butyl (TSK-Gel Butyl-NPR 4,6 x 35 mm, PN: 14947) calentada a 25 °C. Los compuestos de prueba se prepararon diluyendo 70 |jg de ADC en MPA de manera que la concentración total de sal sea mayor o igual a 1,0 M de sulfato de amonio en un volumen total de 100 jL. Las muestras se inyectaron a 90 j l y se eluyeron mediante el uso de un gradiente de 12 minutos. Seguimiento a A = 280 nm. Los ADC con mayor hidrofobicidad, o un mayor número de fármacos por molécula, eluyen en tiempos de retención posteriores.
Las Figuras 4 y 5 muestran los resultados de los análisis de HIC de varios ADC cargados con 8, en comparación con el anticuerpo no conjugado original (h1F6). Los ADC se prepararon como se describió anteriormente. Los resultados muestran generalmente que el aumento de la hidrofilicidad de la auristatina, en combinación con un enlazador hidrófilo, disminuye la hidrofobicidad aparente del conjugado.
La siguiente Tabla 2 resume las composiciones de varios enlazadores de fármacos de la Tabla 1 y los análisis de los conjugados de fármaco de anticuerpo cargados con 8 resultantes con el anticuerpo h1F6. El tiempo de retención de HIC (HIC RT) se determinó como se describió anteriormente. Se usaron como controles los ADC de h1F6 que contenían los enlazadores de fármacos MC-vc-PABC-MMAE, MC-vc-PABC-MMAF y MC-MMAF.
Tabla 2
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(continuación)
Figure imgf000028_0001
Ejemplo 4 - Ensayos de actividad in vitro
Los ensayos de citotoxicidad in vitro se realizaron generalmente como se describió anteriormente (véase supra, Ensayos de actividad). Brevemente, se recogieron cultivos de células en fase logarítmica y las células se sembraron en placas a densidades de siembra en el intervalo de 500 a 10000 células/pocillo de acuerdo con las condiciones predeterminadas. Después de incubar 24 horas para permitir la reconstitución de la proteína de la superficie, se añadieron diluciones seriadas de los conjugados de prueba y los cultivos se incubaron durante 4 días más. Evaluación del crecimiento celular y la reducción del colorante para generar valores de CI50 se realizó mediante el uso de azul de Alamar (Biosource International, Camarillo, CA) ensayo de reducción de colorante. Brevemente, se preparó una solución al 40 % (p/v) de azul de Alamar en medio completo justo antes de que se añadieran los cultivos. Noventa y dos horas después de la exposición al fármaco, se añadió una solución de azul de Alamar a las células para constituir el 10 % del volumen de cultivo. Las células se incubaron durante 4 h y se midió la reducción del colorante en un lector de placas fluorescentes Fusion HT (Packard Instruments, Meriden, CT).
Se usaron líneas celulares de cáncer de células renales claras 786-0 renal y Caki-1. Estas líneas celulares expresaron aproximadamente 190 000 y 135 000 moléculas de CD70 humanas por célula, respectivamente. Los enlazadores de fármacos unidos al anticuerpo h1F6 se describen en las Tablas 1 y 2. Con referencia a las siguientes Tablas 3A-C, los ADC de h1F6 tienen una carga de fármaco promedio de 8 fármacos/anticuerpo, a menos que se indique lo contrario. Los ADC h1F6 hidrófila probado mostró actividad (valores de CI50) comparables a, o mejores que, el control, h1F6-mcMMAF (1269), en estos estudios.
Tabla 3A
Figure imgf000028_0002
(continuación)
Figure imgf000029_0001
Tabla 3B
Resumen de IC50 para ADC basados en auristatina
Figure imgf000029_0002
Tabla 3C
Figure imgf000030_0001
Ejemplo 5: Estudios de farmacocinética
Radiomarcaje de anticuerpos y ADC
Se realizaron experimentos farmacocinéticos (PK) mediante el uso de anticuerpo o ADC marcados radiactivamente. Los compuestos de prueba de PK se marcaron radiactivamente mediante el uso del siguiente procedimiento. A una solución de anticuerpo o ADC en 500 mM de fosfato de potasio (pH 8,0) y 500 mM de cloruro de sodio se añadieron 55 pCi de propionato de N-succinimidilo[propionato-2,3-3H]-(Moravek Biochemicals, cat. Núm.: MT 919, 80 Ci/mmol, 1 mCi/ml, solución 9:1 de hexano:acetato de etilo) por mg de anticuerpo o ADC. La mezcla resultante se agitó con vórtex y se dejó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla se centrifugó a 4000 x g durante 5 minutos y la capa acuosa inferior se retiró y se dividió en unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra-15 (Millipore, cat. Núm.: UFC903024, MWCO de 30 kDa). La radiactividad no conjugada se eliminó mediante 4 rondas de dilución y centrifugación a 4000 x g. Los productos resultantes se filtraron a través de unidades de filtro centrífugo Ultrafree-MC estériles de 0,22 pm (Millipore, cat. Núm.: UFC30GV0S) y la concentración final de anticuerpo o ADC se midió mediante espectrofotometría. La actividad específica (pCi/mg) de cada producto se determinó mediante conteo de centelleo líquido.
Estudios de Farmacocinética
Las propiedades farmacocinéticas de un anticuerpo no conjugado y varios ADC de ese anticuerpo (carga de fármaco de 8) se examinaron en varios modelos de roedores. En cada experimento, se inyectaron 3 mg de ADC o anticuerpo marcado radiactivamente por kg de peso del animal a través de la vena de la cola. Cada compuesto de prueba se dosificó una vez en 3 réplicas animales. Se extrajo sangre en tubos con K2EDTA a través de la vena safena o mediante punción cardíaca para las hemorragias terminales en varios momentos. El plasma se aisló mediante centrifugación durante 10 minutos a 10000 x g. Se añadió a una muestra de 10 pl de plasma en cada momento, 4 ml de cóctel de centelleo líquido Ecoscint-A (National Diagnostics) y se midió la radiactividad total mediante conteo del centelleo líquido. Los valores resultantes de desintegraciones por minuto se convirtieron a pCi y se usó la actividad específica de los compuestos de prueba marcados radiactivamente para calcular la concentración de anticuerpo o ADC que quedaba en el plasma en cada momento.
Con referencia a la Figura 2, se compararon las propiedades farmacocinéticas de h1F6 y dos ADC hidrófilos del mismo con las propiedades de los tres ADC de control. Los ADC hidrófilos fueron h1F6-4 (8-cargado (auristatina-T) -Glu-Dpr-MA)8 - h1F6) y h1 F6-11 ((auristatina F)-Ile-EDA-MDpr)s - h1F6). Los resultados muestran que los ADC hidrófilos exhibieron una estabilidad farmacocinética mejorada durante el transcurso de este estudio en ratones. La auristatina hidrófila con una auristatina-T exhibió una estabilidad cercana a la del anticuerpo no conjugado. El diseño hidrófilo de ADC h1 F6-11 exhibió una estabilidad de pK mejorada en comparación con los controles, dos de los cuales incluyen una forma monometil de la misma auristatina (auristatina F frente a monometil auristatina F).
Con referencia a la Figura 3, se compararon las propiedades farmacocinéticas de los conjugados hidrófilos de otro anticuerpo monoclonal con las propiedades de un conjugado de control, AcM-mcMMAF. Todos los ADC tenían una carga de fármaco promedio de 8. Cada uno de los ADC hidrófilos exhibió una estabilidad farmacocinética mejorada, en comparación con el ADC de control.
Se compararon dos ADC hidrófilos de los mismos con las propiedades de los tres ADC de control. Los ADC hidrófilos fueron h1F6-8 (carga 8 (auristatina-tiazol) -Glu-Lys-MDpr)g-h1F6) y h1 F6-11 ((auristatina F) -Ile-EDA-MDpr)8 -h1F6). Los resultados muestran que los ADC hidrófilos exhibieron una estabilidad farmacocinética mejorada durante el transcurso de este estudio en ratones. En particular, el diseño hidrófilo de h1F6-1 1 exhibió una estabilidad mejorada en comparación con los controles, dos de los cuales incluyen una forma monometil de la misma auristatina (auristatina F frente a monometil auristatina F).
Ejemplo 6 - Experimentos de terapia in vivo
Las células 786-O se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) y se propagaron en las condiciones de cultivo recomendadas por la ATCC. Para establecer los tumores 786-0, se implantaron 5 x 106 células en el flanco derecho de ratones hembras donantes atímicos nu/nu (Harlan, Indianápolis, IN). Cuando los tumores del donante eran de aproximadamente 500 mm3, los ratones se sacrificaron y los tumores se extirparon asépticamente y ~ se cargaron fragmentos de 0,5 x 0,5 mm en un trocar de calibre 13 esterilizado para su implantación en ratones nu/nu. Cuando los tumores alcanzaron ~ 100 mm3, los ratones se asignaron aleatoriamente a grupos de tratamiento.
Para establecer tumores DOHH2, se implantaron 5 x 106 células en el flanco derecho de ratones CB-17 SCID (Harlan, Indianápolis, IN). Cuando los tumores eran aproximadamente ~ 100 mm3, los ratones se asignaron aleatoriamente a grupos de tratamiento.
Los grupos experimentales se trataron mediante inyección intraperitoneal con compuestos en la dosis y el programa indicados o, alternativamente, se dejaron sin tratar. Los tumores se midieron periódicamente y los volúmenes se calcularon mediante el uso de la Fórmula V = ((L x W2)/2). Los animales se sacrificaron cuando los tumores alcanzaron el volumen de 1000 mm3 o al final del estudio, lo que ocurriera primero.
Los tiempos de cuadriplicación del tumor se eligieron como tiempo hasta el punto final (TTE), que se determinó mediante el uso del análisis de regresión no lineal para el crecimiento exponencial de cada conjunto de datos de crecimiento tumoral individual de cada animal experimental. La mediana del tiempo de cuadriplicación del tumor se calculó en base al volumen del tumor al comienzo del tratamiento. A los animales que no alcanzaron el punto final se les asignó un valor de TTE igual al último día del estudio.
El análisis estadístico se realizó mediante el uso del software Prism (GraphPad) para Windows. Se usó la prueba del orden logarítmico del TTE para analizar la significancia de las diferencias entre los dos grupos, con diferencias consideradas significativas a 0,01< P < 0,05, y altamente significativas a P < 0,01.
Con referencia a la Figura 6, la actividad de los ADC con carga 4 y 8 (4d/Ac y 8d/Ac, respectivamente) se ensayó en estudios de xenoinjerto de ratón de dosis única. Primero, en referencia al control, h1F6-mc-vc-PABC-MMAF, el ADC cargado con 4 dio mejor actividad que el ADC cargado con 8. Por el contrario, los ADC con 8 cargas de h1F6-6 hidrófilo (auristatina T-Glu-Dpr-MDPr) y h1 F6-13 (auristatina tiazol-Glu-EDA-MDPr) exhibieron una mayor actividad que las contrapartes con 4 cargas.
Con referencia a la Figura 7, se ensayó la actividad de diferentes ADC con carga 4 y carga 8 en estudios de xenoinjerto de ratón de dosis única. Nuevamente en este modelo, el ADC hidrófilo con carga 8 de hBU12-6 (auristatina T-Glu-Dpr-MDPr) exhibió una mayor actividad que su contraparte con carga 4.
Con referencia a la Figura 8, se ensayó la actividad de varios ADC con carga 4 y 8 en estudios de xenoinjerto de ratón de dosis única. En este modelo, los ADC con 8 cargas de h1F6-12 (auristatina T-Ile-EDA-MDPr) y h1F6-5 (auristatina F-Glu-Dpr-MDPr) exhibieron una mayor actividad que las contrapartes con 4 cargas. El ADC h1 F6-11 cargado con 8 (auristatina F-Ile-EDA-MDPr) exhibió la tendencia opuesta.
Con referencia a la Figura 9, se ensayó la actividad de varios ADC con carga 4 y 8 en estudios de xenoinjerto de ratón de dosis única. En este modelo, los ADC con 8 cargas de h1 F6-17, h1F6-20, h1F6-24 y h1F6-29 exhibieron una mayor actividad que las contrapartes con 4 cargas.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    Un compuesto conjugado fármaco-ligando hidrófilo que tiene la Fórmula I:
    Figure imgf000032_0001
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
    en donde:
    L es un ligando que se une específicamente a una diana, en donde el ligando es un anticuerpo; cada LA es un componente de unión de ligando unido covalentemente al átomo de azufre de un grupo tiol del ligando, en donde LA tiene la estructura de:
    Figure imgf000032_0002
    en donde la línea ondulada indica el punto de unión a LH y \\ indica el punto de unión al átomo de azufre del grupo tiol de L;
    LH es un enlazador hidrófilo, en donde el enlazador hidrófilo tiene la estructura seleccionada del grupo que consiste en:
    Figure imgf000032_0003
    en donde R21 se selecciona del grupo que consiste en -CH2NH2, -CH2CH2NH2, -CH2OH, -CH2CH2OH, -CH2CO2H, -CH2CH2CO2H, -CH2 CH2CH2CO2H y - CH2CH2CH2CH2CO2H-y
    R22 se selecciona del grupo que consiste en CH2NH2, CH2CH2NH2, CH2OH y CH2CH2OH,
    Figure imgf000032_0004
    Figure imgf000033_0001
    en donde en cada una de las estructuras LH, las líneas onduladas izquierda y derecha indican uniones covalentes a De y LA, respectivamente;
    De es una auristatina;
    el subíndice p' es 1; y
    el subíndice p es un número entero de 8-12,
    en donde el compuesto del conjugado fármaco-ligando tiene un índice de hidrofilicidad de menos de dos, en donde:
    De tiene la fórmula:
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
    en donde:
    la línea ondulada en la estructura de la auristatina indica unión covalente al enlazador hidrófilo;
    R1 y R2 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidrógeno (H) y alquilo -C1-C8 opcionalmente sustituido, con la condición de que tanto R1 como R2 no sean H, a menos que tanto R3 como R3' no sean H;
    R3 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo -C1-C8 opcionalmente sustituido;
    R3’ se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo -C1-C8 opcionalmente sustituido y al menos uno de R3 y R3' no sea H;
    R4 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo -C1-C8 opcionalmente sustituido;
    R5 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo -C1-C8 opcionalmente sustituido;
    o R4 y R5 forman conjuntamente un anillo carbocíclico y tiene la fórmula -(CRaRb)n- en donde Ra y Rb se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo -C1-C8 opcionalmente sustituido y el subíndice n se selecciona del grupo que consiste en 2, 3, 4, 5 y 6;
    R6 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo -C1-C8 opcionalmente sustituido;
    R7 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo -C1-C8 opcionalmente sustituido;
    cada R8 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, -OH, alquilo -C1-C8 opcionalmente sustituido y -O-(alquilo C1-C8) opcionalmente sustituido; y
    R12 se selecciona de las cadenas laterales del grupo que consiste en treonina, serina, asparagina, ácido aspártico, glutamina, ácido glutámico, homoserina, hidroxivalina, furilalanina, treonina(PO3H2), pirazolilalanina, triazolilalanina y tiazolilalanina; o una sal farmacéuticamente aceptable.
    El compuesto conjugado fármaco-ligando de la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el subíndice p es 8.
    Un compuesto conjugado fármaco-ligando de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 para su uso en el tratamiento de un paciente con cáncer,
    en donde el ligando del compuesto conjugado fármaco-ligando se une específicamente a una célula diana asociada con el cáncer
    preferentemente en donde el compuesto conjugado fármaco-ligando se administra al paciente en una dosis de 0,1 a 10 mg/kg,
    y/o en donde:
    (a) el subíndice p es al menos 8 y la dosis del compuesto conjugado fármaco-ligando para dicha administración es igual o menor que la de un conjugado de dos cargas comparable que tiene el mismo enlazador de fármaco; o
    (b) el subíndice p es al menos 8 y la dosis del compuesto conjugado fármaco-ligando para dicha administración es igual o menor que la de un conjugado de cuatro cargas comparable que tiene el mismo enlazador fármaco,
    en donde la dosis del compuesto conjugado fármaco-ligando para dicha administración es igual o menor que la de un conjugado con dos o cuatro cargas comparable en el mismo programa de dosificación o menos frecuente,
    y/o en donde el paciente es un ser humano.
    Una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva del compuesto conjugado fármacoligando de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable,
    para su uso en el tratamiento de un paciente con cáncer, en donde opcionalmente:
    (a) el compuesto conjugado fármaco-ligando está en una forma de dosificación unitaria para inyección; o
    (b) la cantidad de compuesto conjugado fármaco-ligando en la composición farmacéutica está en el intervalo de 0,1 a 10 mg/kg del peso del paciente; o
    (c) el compuesto conjugado fármaco-ligando es para administración intravenosa al paciente.
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