ES2881392T3

ES2881392T3 - Métodos y composiciones para transformación de plantas rápida

Info

Publication number: ES2881392T3
Application number: ES16763144T
Authority: ES
Inventors: Ajith Anand; Maren L Arling; Silva Conceicao Alexandre Da; William James Gordon-Kamm; Craig Hastings; George J Hoerster; Theodore M Klein; Rota Carlos M La; Keith S Lowe; Shiv Bahadur Tiwari; Ning Wang; Xinli Emily Wu
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Priority date: 2015-10-30
Filing date: 2016-08-26
Publication date: 2021-11-29
Anticipated expiration: 2036-08-26
Also published as: DK3368676T3; CN108368517B; JP6990653B2; CA3001681A1; AU2016346630A1; BR112018008705A2; CN108368517A; US20250324934A1; EP3368676A1; US11330776B2; US20170121722A1; AU2016346630B2; BR112018008705B1; JP2018537080A; EP3368676B1; US20220124998A1; WO2017074547A1

Abstract

Un método para producir una planta transgénica, que comprende: (A) (a) transformar una célula de un explante de embrión inmaduro con una construcción de expresión que comprende: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o (iii) una combinación de (i) y (ii); (b) permitir la expresión del polipéptido de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo y la estructura vegetal regenerable se forma en 1-7 días de transformación de la célula o en 1-14 días de transformación de la célula; y (c) germinar la estructura vegetal regenerable para formar la planta transgénica; o (B) (a) transformar una célula de un explante de embrión inmaduro con una construcción de expresión que comprende: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido WUS2; (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido ODP2; o (iii) una combinación de las mismas; (b) permitir la expresión de un polipéptido de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo; y (c) germinar la estructura vegetal regenerable para formar la planta transgénica; en el que el polipéptido WUS2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; o en el que el polipéptido WUS2 está codificado por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3; y en el que el polipéptido ODP2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; o en el que el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN- AP2 está codificado por la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 17 o 21.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones para transformación de plantas rápida

Campo de la divulgación

La presente divulgación se refiere, en general, al campo de biología molecular de plantas, incluyendo manipulación genética de plantas. Más específicamente, la presente divulgación se refiere a métodos rápidos de alta eficacia y composiciones para producir una planta transformada en ausencia de citocinina y sin formación de callo.

Referencia a lista de secuencias presentada como

un archivo de texto mediante EFS-Web

La copia oficial de la lista de secuencias se presenta electrónicamente mediante EFS-Web como una lista de secuencias en formato ASCII con un archivo denominado 20160826_6752WOPCT_SeqList.txt, creado el 17 de agosto de 2016, y que tiene un tamaño de 1000 KB y se presente simultáneamente con la memoria descriptiva. La lista de secuencias contenida en este documento en formato ASCII forma parte de la memoria descriptiva y se incorpora en este documento por referencia en su totalidad.

Antecedentes

Los avances principales en la transformación de plantas se han producido durante los últimos varios años. La transformación de una diversidad de plantas agronómicamente importantes, por ejemplo, maíz, soja, colza, trigo, arroz índico, caña de azúcar y sorgo, y líneas endogámicas sigue siendo tanto difícil como largo. Tradicionalmente, la única manera de provoca una respuesta del cultivo ha sido optimizando los componentes del medio y/o el materia y fuente del explante. Esto ha dado lugar a éxito en algunos genotipos, pero muchas plantas de cultivo importantes, incluyendo endogámicos o variedades selectas, no logran producir una respuesta de cultivo favorable. Aunque la transformación de genotipos de modelo puede ser eficaz, el proceso de introgresión de transgenes en la producción de endogámicos es laborioso, caro y largo. Ahorraría un tiempo y dinero considerable que los genes pudieran introducirse en y evaluarse con mayor velocidad y eficacia.

A pesar de las limitaciones, la transformación mediada por Agrobacterium de monocotiledóneas tales como maíz, arroz y trigo sigue siendo una estrategia experimental ampliamente usada, a menudo con el uso de tejido meristemático tal como embriones inmaduros como los explantes de elección (por ejemplo, Ishida et al., 1996; Zhao et al., 2001; Frame et al., 2002). Para el arroz, también se ha informado de la transformación de semillas impregnadas (Toki et al., 2006). Hasta la fecha, los métodos más comunes usados para poner en contacto células con Agrobacterium incluyen: cultivar tejido de explante tal como embriones inmaduros ("cocultivo"), incluyendo posiblemente una etapa de "retardo" o "reposo" (no selectivo), seguido de cultivo en medio de selección que contiene una o más auxinas que permite la desdiferenciación de células para formar callo. Durante esta fase de formación de callo, el tejido del cello resistente transformado se selecciona en presencia de un agente de selección apropiado en un medio de selección. Esto va seguido del crecimiento de las células en condiciones que promueven la diferenciación del callo y la regeneración del callo en plantas en medio de regeneración y enraizamiento. Este proceso típicamente ha requerido al menos 10-12 semanas para producir plantas que puedan transferirse al suelo para mayor crecimiento. Este proceso también requiere varias transferencias manuales de tejido durante todo el proceso de transformación y usa varios tipos diferentes de medio.

Por tanto, el uso de protocolos convencionales de transformación y regeneración es largo e ineficaz, e influye negativamente en los plazos de desarrollo de productos transgénicos, dado que habitualmente hay una "ventana de desarrollo prioritario" limitada estacionalmente para tomar decisiones con respecto a las construcciones genéticas que priorizar para su uso en trabajo de campo a mayor escala basándose en los resultados obtenidos durante la investigación inicial. Los métodos convencionales disponibles de transformación y regeneración tienen múltiples inconvenientes que limitan la velocidad y eficacia con que pueden producirse y cribarse las plantas transgénicas. Por ejemplo, muchos métodos convencionales de transformación y regeneración requieren el uso de altos niveles de auxina o citocinina y requieren etapas que implican formación de callo embriogénico u organogénesis, que da lugar a procedimientos que tardar muchas semanas antes de producir plantas para crecimiento en un entorno de invernadero después de transformación. Se ha informado (Zhong et al. (1992) Planta 187:490-497) de que dichos métodos pueden tardar 12-23 semanas para producir plantas, que incluyen las etapas de suministrar 2,4-D para estimular la formación de embriones somáticos en maíz (que tarda hasta 8 semanas), producción de callo embriogénico a partir de los embriones somáticos primarios (que tarda hasta 8 semanas adicionales), formación de brotes (que tarda hasta 3 semanas adicional) y finalmente enraizamiento (que tarda hasta 1 a 3 semanas adicionales). Como alternativa, Zhong et al. suministra inmediatamente una citocinina junto con la auxina para estimular la morfogénesis directa para producir brotes y la formación directa de la planta de 8 a 28 semanas (Zhong et al. (1992) Planta 187:490-497).

A pesar de los avances en la biología molecular de las plantas, particularmente métodos de transformación y regeneración de plantas, sigue habiendo una necesidad de un sistema de alto rendimiento para producir plantas transgénicas rápida y eficazmente para proporcionar más tiempo y flexibilidad para tomar decisiones de investigación y desarrollo del producto.

Dicho sistema de alto rendimiento para transformación facilita la producción de grandes números de plantas transgénicas para ensayo génico y/o desarrollo de productos mientras se reducen los costes de material y trabajo.

Sumario

La invención proporciona un método para producir una planta transgénica, que comprende:

1. (A)

(a) transformar una célula de un explante de embrión inmaduro con una construcción de expresión que comprende:

(i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o

(iii) una combinación de (i) y (ii);

(b) permitir la expresión del polipéptido de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo y la estructura vegetal regenerable se forma en 1-7 días de transformación de la célula o en 1-14 días de transformación de la célula; y

(c) germinar la estructura vegetal regenerable para formar la planta transgénica; o

2. (B)

(i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido WUS2;

(ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido ODP2; o

(iii) una combinación de las mismas;

(b) permitir la expresión de un polipéptido de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo; y (c) germinar la estructura vegetal regenerable para formar la planta transgénica;

en el que el polipéptido WUS2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; o en el que el polipéptido WUS2 está codificado por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3; y en el que el polipéptido ODP2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; o en el que el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 está codificado por la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 17 o 21.

En diversos aspectos, la presente divulgación proporciona además métodos para producir una planta transgénica, que comprenden: (a) transformar una célula de un explante con una construcción de expresión que comprende: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; o (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o (iii) una combinación de (i) y (ii); y (b) permitir la expresión del polipéptido de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo; y (c) germinar la estructura vegetal regenerable para formar la planta transgénica. En un aspecto, la construcción de expresión comprende tanto la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX como la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2. En un aspecto, la construcción de expresión comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX. En un aspecto, la construcción de expresión comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2. En un aspecto, la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a AP2 se produce en menos de 1 día, menos de 2 días, menos de 5 días, menos de 7 días o menos de aproximadamente 14 días después del inicio de la transformación. En un aspecto, la construcción de expresión comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio. En un aspecto, la recombinasa específica de sitio se selecciona de FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxbl, TP907-1 o U153. En un aspecto, la recombinasa específica de sitio es un polipéptido de fusión desestabilizado. En un aspecto, el polipéptido de fusión desestabilizado es TETR(L17G)~CRE o ESR(L17G)~CRE. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En un aspecto, el promotor constitutivo unido de forma funcional a la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio y/o la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 se selecciona de UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1.2 KB), IN2-2, NOS, la versión -135 de 35S o ZM-ADF PRO (ALT2). En un aspecto, el promotor inducible unido de forma funcional a la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio y/o la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 se selecciona de AXIG1, DR5, XVE, GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A o promotores activados por tetraciclina, etametsulfurón o clorsulfurón. En un aspecto, el promotor regulado por el desarrollo unido de forma funcional a la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio y/o la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 se selecciona de PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, LGL, LEA-14A o LEA-D34. En un aspecto, el promotor inducible es un promotor inducible químicamente. En un aspecto, el promotor inducible químicamente es XVE. En un aspecto, el promotor inducible químicamente se reprime por TETR, ESR o CR, y la desrepresión se produce tras la adición de ligados relacionados con tetraciclina o de sulfonilurea. En un aspecto, el represor es TETR y el ligando relacionado con tetraciclina es doxiciclina o anhidrotetraciclina. En un aspecto, el represor es ESR y el ligando de sulfonilurea es etametsulfurón, clorsulfurón, metsulfurón-metilo, sulfometurón-metilo, clorimurónetilo, nicosulfurón, primisulfurón, tribenurón, sulfosulfurón, trifloxisulfurón, foramsulfurón, yodosulfurón, prosulfurón, tifensulfurón, rimsulfurón, mesosulfurón o halosulfurón. En un aspecto, el promotor inducible es un promotor inducible por auxina. En un aspecto, el promotor inducible por auxina es AXIG1. En un aspecto, el promotor AXIG1 comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 39. En un aspecto, el promotor inducible comprende un elemento de respuesta a auxina. En un aspecto, el promotor inducible contiene uno o más motivos potenciadores de DR5. En un aspecto, el promotor es un promotor constitutivo débil modificado para represión y desrepresión. En un aspecto, una o más secuencias operadoras en el promotor se han colocado cerca de o solapando con la secuencia TATA y/o el sitio de inicio de la transcripción. En un aspecto, el promotor se selecciona de NOS, AXIG1, ZM-GOS2, CC-UBI1-PRO o ZM-ADF4-PRO. En un aspecto, el promotor inducible es el promotor DR5 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 40. En un aspecto, el promotor es un promotor desreprimible. En un aspecto, el promotor desreprimible es TETR, ESR o CR. En un aspecto, el promotor regulado por el desarrollo se selecciona de PLTP, PLTP1, PLTP2 o PLTP3. En un aspecto, el promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 o PLTP3 deriva de una monocotiledónea. En un aspecto, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz, sorgo o arroz. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz. En un aspecto, el promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 o PLTP3 deriva de una dicotiledónea. En un aspecto, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En un aspecto, el promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 o PLTP3 comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1-2 o 55-61, el promotor PLTP comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1 o 2. En un aspecto, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX se selecciona de polipéptido WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WoX4, WOX5 o WOX9. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un nucleótido de monocotiledónea. En un aspecto, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un nucleótido de dicotiledónea. En un aspecto, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX codifica una secuencia de aminoácidos que comprende una cualquiera de SEQ ID NO:4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX comprende una cualquiera de SEQ ID NO:3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15. En un aspecto, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS1. En un aspecto, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En un aspecto, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz o arroz. En un aspecto, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz. En un aspecto, el polipéptido WUS1 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. En un aspecto, el polipéptido WUS1 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 3. En un aspecto, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS2. En un aspecto, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En un aspecto, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz o arroz. En un aspecto, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz. En un aspecto, el polipéptido WUS2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6. En un aspecto, el polipéptido WUS2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 5. En un aspecto, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS3. En un aspecto, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz, sorgo, arroz o Setaria. En un aspecto, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz o arroz. En un aspecto, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz. En un aspecto, el polipéptido WUS3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8. En un aspecto, el polipéptido WUS3 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO:7. En un aspecto, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WOX5. En un aspecto, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5A. En un aspecto, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5 de maíz, sorgo, arroz o Setaria. En un aspecto, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5 de maíz o arroz. En un aspecto, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5 de maíz. En un aspecto, el polipéptido WOX5 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. En un aspecto, el polipéptido WOX5 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 13. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido ODP2, BBM2, BMN2 o BMN3. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido de monocotiledónea. En un aspecto, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz o arroz. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido de dicotiledónea. En un aspecto, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65 o 67. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 17, 19, 21,62, 64, 66 o 68. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido ODP2. En un aspecto, el polipéptido ODP2 es un polipéptido de monocotiledónea. En un aspecto, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz, arroz o Setaria sp. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz o arroz. En un aspecto, el ODP2 es un polipéptido de dicotiledónea. En un aspecto, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En un aspecto, el polipéptido ODP2 comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 63, 65 o 67. En un aspecto, el polipéptido ODP2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 17, 21, 62, 64, 66 o 68. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido BBM2. En un aspecto, el polipéptido BBM2 es un polipéptido de monocotiledónea. En un aspecto, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz, caña de azúcar, arroz o Setaria sp. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz o arroz. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz. En un aspecto, el polipéptido BBM2 es un polipéptido de dicotiledónea. En un aspecto, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En un aspecto, el polipéptido BBM2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. En un aspecto, el polipéptido BBM2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 19. En un aspecto, la estructura vegetal regenerable se forma en aproximadamente 0 a aproximadamente 7 días de transformación de la célula o en aproximadamente 0 a aproximadamente 14 días de transformación de la célula y la planta transgénica se forma en aproximadamente 14 días de transformación de la célula a aproximadamente 60 días de transformación de la célula. En un aspecto, el método se realiza en ausencia de medio de enraizamiento. En un aspecto, el método se realiza en presencia de medio de enraizamiento. En un aspecto, el explante es un embrión inmaduro. En un aspecto, el embrión inmaduro es un embrión inmaduro de 1-5 mm. En un aspecto, el embrión inmaduro es un embrión inmaduro de 3,5-5 mm. En un aspecto, se usa citocinina exógena durante la germinación después de aproximadamente 7 días de transformación de la célula o después de aproximadamente 14 días de transformación de la célula. En un aspecto, la expresión de un polipéptido de (a) es transitoria. En un aspecto, la germinación se realiza en presencia de citocinina exógena.

En diversos aspectos, la presente divulgación proporciona además métodos para producir una planta transgénica, que comprenden: (a) transformar una célula de un explante con una construcción de expresión que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; o (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o (iii) una combinación de las mismas; (b) permitir la expresión de un polipéptido de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo; y (c) germinar la estructura vegetal regenerable para formar la planta transgénica; en el que el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16; o en el que el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX está codificado por la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15; y en el que el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65 o 67; o en el que el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 está codificado por la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 17, 19, 21,62, 64, 66 o 68. En un aspecto, la construcción de expresión comprende tanto la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX como la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2. En un aspecto, la construcción de expresión comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX. En un aspecto, la construcción de expresión comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2. En un aspecto, la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a AP2 se produce en menos de 1 día, menos de 2 días, menos de 5 días, menos de 7 días o menos de aproximadamente 14 días después del inicio de la transformación. En un aspecto, la construcción de expresión comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio. En un aspecto, la recombinasa específica de sitio se selecciona de FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxbl, TP907-1 o U153. En un aspecto, la recombinasa específica de sitio es un polipéptido de fusión desestabilizado. En un aspecto, el polipéptido de fusión desestabilizado es TETR(L17G)~CRE o ESR(L17G)~CRE. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En un aspecto, el promotor constitutivo unido de forma funcional a la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio y/o la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 se selecciona de UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1.2 KB), IN2-2, NOS, la versión -135 de 35S o ZM-ADF PRO (ALT2). En un aspecto, el promotor inducible unido de forma funcional a la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio y/o la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 se selecciona de AXIG1, DR5, XVE, GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A o promotores activados por tetraciclina, etametsulfurón o clorsulfurón. En un aspecto, el promotor regulado por el desarrollo unido de forma funcional a la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio y/o la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 se selecciona de PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, LGL, LEA-14A o lEa -D34. En un aspecto, el promotor inducible es un promotor inducible químicamente. En un aspecto, el promotor inducible químicamente es XVE. En un aspecto, el promotor inducible químicamente se reprime por TETR, ESR o CR, y la desrepresión se produce tras la adición de ligados relacionados con tetraciclina o de sulfonilurea. En un aspecto, el represor es TETR y el ligando relacionado con tetraciclina es doxiciclina o anhidrotetraciclina. En un aspecto, el represor es ESR y el ligando de sulfonilurea es etametsulfurón, clorsulfurón, metsulfurón-metilo, sulfometurón-metilo, clorimurón-etilo, nicosulfurón, primisulfurón, tribenurón, sulfosulfurón, trifloxisulfurón, foramsulfurón, yodosulfurón, prosulfurón, tifensulfurón, rimsulfurón, mesosulfurón o halosulfurón. En un aspecto, el promotor inducible es un promotor inducible por auxina. En un aspecto, el promotor inducible por auxina es AXIG1. En un aspecto, el promotor AXIG1 comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 39. En un aspecto, el promotor inducible comprende un elemento de respuesta a auxina. En un aspecto, el promotor inducible contiene uno o más motivos potenciadores de DR5. En un aspecto, el promotor es un promotor constitutivo débil modificado para represión y desrepresión. En un aspecto, una o más secuencias operadoras en el promotor se han colocado cerca de o solapando con la secuencia TATA y/o el sitio de inicio de la transcripción. En un aspecto, el promotor se selecciona de nOs , AXIG1, ZM-GOS2, CC-UBI1-PRO o ZM-ADF4-PRO. En un aspecto, el promotor inducible es el promotor DR5 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 40. En un aspecto, el promotor es un promotor desreprimible. En un aspecto, el promotor desreprimible es TETR, ESR o CR. En un aspecto, el promotor regulado por el desarrollo se selecciona de PLTP, PLTP1, PLTP2 o PLTP3. En un aspecto, el promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 o PLTP3 deriva de una monocotiledónea. En un aspecto, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz, sorgo o arroz. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz. En un aspecto, el promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 o PLTP3 deriva de una dicotiledónea. En un aspecto, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En un aspecto, el promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 o PLTP3 comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1-2 o 55-61, el promotor PlTp comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1 o 2. En un aspecto, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX se selecciona de polipéptido WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 o WOX9. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un nucleótido de monocotiledónea. En un aspecto, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un nucleótido de dicotiledónea. En un aspecto, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX codifica una secuencia de aminoácidos que comprende una cualquiera de SEQ ID NO:4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX comprende una cualquiera de SEQ ID NO:3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15. En un aspecto, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS1. En un aspecto, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En un aspecto, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz o arroz. En un aspecto, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz. En un aspecto, el polipéptido WUS1 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. En un aspecto, el polipéptido WUS1 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 3. En un aspecto, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS2. En un aspecto, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En un aspecto, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz o arroz. En un aspecto, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz. En un aspecto, el polipéptido WUS2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6. En un aspecto, el polipéptido WUS2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 5. En un aspecto, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS3. En un aspecto, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz, sorgo, arroz o Setaria. En un aspecto, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz o arroz. En un aspecto, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz. En un aspecto, el polipéptido WUS3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8. En un aspecto, el polipéptido WUS3 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO:7. En un aspecto, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WOX5. En un aspecto, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5A. En un aspecto, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5 de maíz, sorgo, arroz o Setaria. En un aspecto, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5 de maíz o arroz. En un aspecto, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5 de maíz. En un aspecto, el polipéptido WOX5 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. En un aspecto, el polipéptido WOX5 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 13. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido ODP2, BBM2, BMN2 o BMN3. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido de monocotiledónea. En un aspecto, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz o arroz. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido de dicotiledónea. En un aspecto, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65 o 67. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 17, 19, 21, 62, 64, 66 o 68. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido ODP2. En un aspecto, el polipéptido ODP2 es un polipéptido de monocotiledónea. En un aspecto, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz, arroz o Setaria sp. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz o arroz. En un aspecto, el ODP2 es un polipéptido de dicotiledónea. En un aspecto, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En un aspecto, el polipéptido ODP2 comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 63, 65 o 67. En un aspecto, el polipéptido ODP2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 17, 21, 62, 64, 66 o 68. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido BBM2. En un aspecto, el polipéptido BBM2 es un polipéptido de monocotiledónea. En un aspecto, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz, caña de azúcar, arroz o Setaria sp. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz o arroz. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz. En un aspecto, el polipéptido BBM2 es un polipéptido de dicotiledónea. En un aspecto, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En un aspecto, el polipéptido BBM2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. En un aspecto, el polipéptido BBM2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 19. En un aspecto, la estructura vegetal regenerable se forma en aproximadamente 0 a aproximadamente 7 días de transformación de la célula o en aproximadamente 0 a aproximadamente 14 días de transformación de la célula y la planta transgénica se forma en aproximadamente 14 días de transformación de la célula a aproximadamente 60 días de transformación de la célula. En un aspecto, el método se realiza en ausencia de medio de enraizamiento. En un aspecto, el método se realiza en presencia de medio de enraizamiento. En un aspecto, el explante es un embrión inmaduro. En un aspecto, el embrión inmaduro es un embrión inmaduro de 1-5 mm. En un aspecto, el embrión inmaduro es un embrión inmaduro de 3,5-5 mm. En un aspecto, se usa citocinina exógena durante la germinación después de aproximadamente 7 días de transformación de la célula o después de aproximadamente 14 días de transformación de la célula. En un aspecto, la expresión de un polipéptido de (a) es transitoria. En un aspecto, la germinación se realiza en presencia de citocinina exógena.

En diversos aspectos, la presente divulgación proporciona además métodos para producir una planta transgénica, que comprenden: (a) transformar una célula de un explante con una construcción de expresión que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido WUS2; o (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido ODP2; o (iii) una combinación de las mismas; (b) permitir la expresión de un polipéptido de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo; y (c) germinar la estructura vegetal regenerable para formar una planta transgénica; en el que polipéptido WUS2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; o en el que el polipéptido WUS2 está codificado por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3; y en el que el polipéptido ODP2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; o en el que el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 está codificado por la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 17 o 21. En un aspecto, la construcción de expresión comprende tanto la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX como la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2. En un aspecto, la construcción de expresión comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX. En un aspecto, la construcción de expresión comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2. En un aspecto, la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a AP2 se produce en menos de 1 día, menos de 2 días, menos de 5 días, menos de 7 días o menos de aproximadamente 14 días después del inicio de la transformación. En un aspecto, la construcción de expresión comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio. En un aspecto, la recombinasa específica de sitio se selecciona de FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxbl, TP907-1 o U153. En un aspecto, la recombinasa específica de sitio es un polipéptido de fusión desestabilizado. En un aspecto, el polipéptido de fusión desestabilizado es TETR(L17G)~CRE o ESR(L17G)~CRE. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En un aspecto, el promotor constitutivo unido de forma funcional a la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio y/o la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 se selecciona de UBI, LLDAV, EVCV, DmMv , BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1.2 KB), IN2-2, NOS, la versión -135 de 35S o ZM-ADF PRO (ALT2). En un aspecto, el promotor inducible unido de forma funcional a la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio y/o la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 se selecciona de AXIG1, DR5, XVE, GLB1, OLE, LTP2, hSp17.7, HSP26, HSP18A o promotores activados por tetraciclina, etametsulfurón o clorsulfurón. En un aspecto, el promotor regulado por el desarrollo unido de forma funcional a la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio y/o la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 se selecciona de PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, LGL, LEA-14A o LEA-D34. En un aspecto, el promotor inducible es un promotor inducible químicamente. En un aspecto, el promotor inducible químicamente es XVE. En un aspecto, el promotor inducible químicamente se reprime por TETR, ESR o CR, y la desrepresión se produce tras la adición de ligados relacionados con tetraciclina o de sulfonilurea. En un aspecto, el represor es TETR y el ligando relacionado con tetraciclina es doxiciclina o anhidrotetraciclina. En un aspecto, el represor es ESR y el ligando de sulfonilurea es etametsulfurón, clorsulfurón, metsulfurón-metilo, sulfometurón-metilo, clorimurónetilo, nicosulfurón, primisulfurón, tribenurón, sulfosulfurón, trifloxisulfurón, foramsulfurón, yodosulfurón, prosulfurón, tifensulfurón, rimsulfurón, mesosulfurón o halosulfurón. En un aspecto, el promotor inducible es un promotor inducible por auxina. En un aspecto, el promotor inducible por auxina es AXIG1. En un aspecto, el promotor AXIG1 comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 39. En un aspecto, el promotor inducible comprende un elemento de respuesta a auxina. En un aspecto, el promotor inducible contiene uno o más motivos potenciadores de DR5. En un aspecto, el promotor es un promotor constitutivo débil modificado para represión y desrepresión. En un aspecto, una o más secuencias operadoras en el promotor se han colocado cerca de o solapando con la secuencia TATA y/o el sitio de inicio de la transcripción. En un aspecto, el promotor se selecciona de NOS, AXIG1, ZM-GOS2, CC-UBI1-PRO o ZM-ADF4-PRO. En un aspecto, el promotor inducible es el promotor DR5 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 40. En un aspecto, el promotor es un promotor desreprimible. En un aspecto, el promotor desreprimible es TETR, ESR o CR. En un aspecto, el promotor regulado por el desarrollo se selecciona de PLTP, PLTP1, PLTP2 o PLTP3. En un aspecto, el promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 o PLTP3 deriva de una monocotiledónea. En un aspecto, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz, sorgo o arroz. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz. En un aspecto, el promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 o PLTP3 deriva de una dicotiledónea. En un aspecto, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En un aspecto, el promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 o PLTP3 comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1-2 o 55-61, el promotor PLTP comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1 o 2. En un aspecto, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX se selecciona de polipéptido WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WoX4, WOX5 o WOX9. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un nucleótido de monocotiledónea. En un aspecto, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un nucleótido de dicotiledónea. En un aspecto, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX codifica una secuencia de aminoácidos que comprende una cualquiera de SEQ ID NO:4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX comprende una cualquiera de SEQ ID NO:3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15. En un aspecto, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS1. En un aspecto, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En un aspecto, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz o arroz. En un aspecto, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz. En un aspecto, el polipéptido WUS1 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. En un aspecto, el polipéptido WUS1 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 3. En un aspecto, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS2. En un aspecto, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En un aspecto, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz o arroz. En un aspecto, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz. En un aspecto, el polipéptido WUS2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6. En un aspecto, el polipéptido WUS2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 5. En un aspecto, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS3. En un aspecto, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz, sorgo, arroz o Setaria. En un aspecto, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz o arroz. En un aspecto, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz. En un aspecto, el polipéptido WUS3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8. En un aspecto, el polipéptido WUS3 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO:7. En un aspecto, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WOX5. En un aspecto, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5A. En un aspecto, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5 de maíz, sorgo, arroz o Setaria. En un aspecto, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5 de maíz o arroz. En un aspecto, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5 de maíz. En un aspecto, el polipéptido WOX5 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. En un aspecto, el polipéptido WOX5 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 13. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido ODP2, BBM2, BMN2 o BMN3. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido de monocotiledónea. En un aspecto, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz o arroz. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido de dicotiledónea. En un aspecto, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65 o 67. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 17, 19, 21,62, 64, 66 o 68. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido ODP2. En un aspecto, el polipéptido ODP2 es un polipéptido de monocotiledónea. En un aspecto, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz, arroz o Setaria sp. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz o arroz. En un aspecto, el ODP2 es un polipéptido de dicotiledónea. En un aspecto, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En un aspecto, el polipéptido ODP2 comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 63, 65 o 67. En un aspecto, el polipéptido ODP2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 17, 21, 62, 64, 66 o 68. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido BBM2. En un aspecto, el polipéptido BBM2 es un polipéptido de monocotiledónea. En un aspecto, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz, caña de azúcar, arroz o Setaria sp. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz o arroz. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz. En un aspecto, el polipéptido BBM2 es un polipéptido de dicotiledónea. En un aspecto, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En un aspecto, el polipéptido BBM2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. En un aspecto, el polipéptido BBM2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 19. En un aspecto, la estructura vegetal regenerable se forma en aproximadamente 0 a aproximadamente 7 días de transformación de la célula o en aproximadamente 0 a aproximadamente 14 días de transformación de la célula y la planta transgénica se forma en aproximadamente 14 días de transformación de la célula a aproximadamente 60 días de transformación de la célula. En un aspecto, el método se realiza en ausencia de medio de enraizamiento. En un aspecto, el método se realiza en presencia de medio de enraizamiento. En un aspecto, el explante es un embrión inmaduro. En un aspecto, el embrión inmaduro es un embrión inmaduro de 1-5 mm. En un aspecto, el embrión inmaduro es un embrión inmaduro de 3,5-5 mm. En un aspecto, se usa citocinina exógena durante la germinación después de aproximadamente 7 días de transformación de la célula o después de aproximadamente 14 días de transformación de la célula. En un aspecto, la expresión de un polipéptido de (a) es transitoria. En un aspecto, la germinación se realiza en presencia de citocinina exógena.

En diversos aspectos, la presente divulgación proporciona además métodos para producir una planta transgénica, que comprenden: (a) transformar una célula de un explante con una construcción de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; (b) permitir la expresión del polipéptido de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo; y (c) germinar la estructura vegetal regenerable para formar la planta transgénica. En un aspecto, la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX se produce en menos de 1 día, menos de 2 días, menos de 5 días, menos de 7 días o menos de aproximadamente 14 días después del inicio de la transformación. En un aspecto, la construcción de expresión comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio. En un aspecto, la recombinasa específica de sitio se selecciona de f Lp , Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxbl, TP907-1 o U153. En un aspecto, la recombinasa específica de sitio es un polipéptido de fusión desestabilizado. En un aspecto, el polipéptido de fusión desestabilizado es TETR(L17G)~CRE o ESR(L17G)~CRE. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En un aspecto, el promotor constitutivo unido de forma funcional a la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio y/o la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX se selecciona de UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1.2 KB), IN2-2, NOS, la versión -135 de 35S o ZM-ADF PRO (ALT2). En un aspecto, el promotor inducible unido de forma funcional a la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio y/o la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX se selecciona de AXIG1, DR5, XVE, GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A o promotores activados por tetraciclina, etametsulfurón o clorsulfurón. En un aspecto, el promotor regulado por el desarrollo unido de forma funcional a la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio y/o la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX se selecciona de PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, LGL, LEA-14A o LEA-D34. En un aspecto, el promotor inducible es un promotor inducible químicamente. En un aspecto, el promotor inducible químicamente es XVE. En un aspecto, el promotor inducible químicamente se reprime por TETR, ESR o CR, y la desrepresión se produce tras la adición de ligados relacionados con tetraciclina o de sulfonilurea. En un aspecto, el represor es TETR y el ligando relacionado con tetraciclina es doxiciclina o anhidrotetraciclina. En un aspecto, el represor es ESR y el ligando de sulfonilurea es etametsulfurón, clorsulfurón, metsulfurón-metilo, sulfometurón-metilo, clorimurón-etilo, nicosulfurón, primisulfurón, tribenurón, sulfosulfurón, trifloxisulfurón, foramsulfurón, yodosulfurón, prosulfurón, tifensulfurón, rimsulfurón, mesosulfurón o halosulfurón. En un aspecto, el promotor inducible es un promotor inducible por auxina. En un aspecto, el promotor inducible por auxina es AXIG1. En un aspecto, el promotor AXIG1 comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 39. En un aspecto, el promotor inducible comprende un elemento de respuesta a auxina. En un aspecto, el promotor inducible contiene uno o más motivos potenciadores de DR5. En un aspecto, el promotor es un promotor constitutivo débil modificado para represión y desrepresión. En un aspecto, una o más secuencias operadoras en el promotor se han colocado cerca de o solapando con la secuencia TATA y/o el sitio de inicio de la transcripción. En un aspecto, el promotor se selecciona de NOS, AXIG1, ZM-GOS2, CC-UBI1-PRO o ZM-ADF4-PRO. En un aspecto, el promotor inducible es el promotor DR5 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 40. En un aspecto, el promotor es un promotor desreprimible. En un aspecto, el promotor desreprimible es TETR, ESR o CR. En un aspecto, el promotor regulado por el desarrollo se selecciona de PLTP, PLTP1, PLTP2 o PLTP3. En un aspecto, el promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 o PLTP3 deriva de una monocotiledónea. En un aspecto, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz, sorgo o arroz. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz. En un aspecto, el promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 o PLTP3 deriva de una dicotiledónea. En un aspecto, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En un aspecto, el promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 o PLTP3 comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1-2 o 55-61, el promotor PLTP comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1 o 2. En un aspecto, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX se selecciona de polipéptido WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, w OX5 o WOX9. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un nucleótido de monocotiledónea. En un aspecto, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un nucleótido de dicotiledónea. En un aspecto, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX codifica una secuencia de aminoácidos que comprende una cualquiera de SEQ ID NO:4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX comprende una cualquiera de SEQ ID NO:3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15. En un aspecto, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS1. En un aspecto, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En un aspecto, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz o arroz. En un aspecto, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz. En un aspecto, el polipéptido WUS1 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. En un aspecto, el polipéptido WUS1 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 3. En un aspecto, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS2. En un aspecto, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En un aspecto, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz o arroz. En un aspecto, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz. En un aspecto, el polipéptido WUS2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6. En un aspecto, el polipéptido WUS2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 5. En un aspecto, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS3. En un aspecto, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz, sorgo, arroz o Setaria. En un aspecto, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz o arroz. En un aspecto, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz. En un aspecto, el polipéptido WUS3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8. En un aspecto, el polipéptido WUS3 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO:7. En un aspecto, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WOX5. En un aspecto, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5A. En un aspecto, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5 de maíz, sorgo, arroz o Setaria. En un aspecto, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5 de maíz o arroz. En un aspecto, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5 de maíz. En un aspecto, el polipéptido WOX5 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. En un aspecto, el polipéptido WOX5 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 13. En un aspecto, la estructura vegetal regenerable se forma en aproximadamente 0 a aproximadamente 7 días de transformación de la célula o en aproximadamente 0 a aproximadamente 14 días de transformación de la célula y la planta transgénica se forma en aproximadamente 14 días de transformación de la célula a aproximadamente 60 días de transformación de la célula. En un aspecto, el método se realiza en ausencia de medio de enraizamiento. En un aspecto, el método se realiza en presencia de medio de enraizamiento. En un aspecto, el explante es un embrión inmaduro. En un aspecto, el embrión inmaduro es un embrión inmaduro de 1-5 mm. En un aspecto, el embrión inmaduro es un embrión inmaduro de 3,5-5 mm. En un aspecto, se usa citocinina exógena durante la germinación después de aproximadamente 7 días de transformación de la célula o después de aproximadamente 14 días de transformación de la célula. En un aspecto, la expresión de un polipéptido de (a) es transitoria. En un aspecto, la germinación se realiza en presencia de citocinina exógena.

En diversos aspectos, la presente divulgación proporciona además métodos para producir una planta transgénica, que comprenden: (a) transformar una célula de un explante con una construcción de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; (b) permitir la expresión del polipéptido de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo; y (c) germinar la estructura vegetal regenerable para formar la planta transgénica. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a AP2 se produce en menos de 1 día, menos de 2 días, menos de 5 días, menos de 7 días o menos de aproximadamente 14 días después del inicio de la transformación. En un aspecto, la construcción de expresión comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio. En un aspecto, la recombinasa específica de sitio se selecciona de FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxbl, TP907-1 o U153. En un aspecto, la recombinasa específica de sitio es un polipéptido de fusión desestabilizado. En un aspecto, el polipéptido de fusión desestabilizado es TETR(L17G)~CRE o ESR(L17G)~CRE. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En un aspecto, el promotor constitutivo unido de forma funcional a la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio y/o la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 se selecciona de UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1.2 KB), IN2-2, NOS, la versión -135 de 35S o ZM-AdF PRO (ALT2). En un aspecto, el promotor inducible unido de forma funcional a la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio y/o la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 se selecciona de AXIG1, DR5, XVE, GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, Hs P26, HSP18A o promotores activados por tetraciclina, etametsulfurón o clorsulfurón. En un aspecto, el promotor regulado por el desarrollo unido de forma funcional a la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio y/o la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 se selecciona de PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, LGL, LEA-14A o lEa -D34. En un aspecto, el promotor inducible es un promotor inducible químicamente. En un aspecto, el promotor inducible químicamente es XVE. En un aspecto, el promotor inducible químicamente se reprime por TETR, ESR o CR, y la desrepresión se produce tras la adición de ligados relacionados con tetraciclina o de sulfonilurea. En un aspecto, el represor es TETR y el ligando relacionado con tetraciclina es doxiciclina o anhidrotetraciclina. En un aspecto, el represor es ESR y el ligando de sulfonilurea es etametsulfurón, clorsulfurón, metsulfurón-metilo, sulfometurón-metilo, clorimurónetilo, nicosulfurón, primisulfurón, tribenurón, sulfosulfurón, trifloxisulfurón, foramsulfurón, yodosulfurón, prosulfurón, tifensulfurón, rimsulfurón, mesosulfurón o halosulfurón. En un aspecto, el promotor inducible es un promotor inducible por auxina. En un aspecto, el promotor inducible por auxina es AXIG1. En un aspecto, el promotor AXIG1 comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 39. En un aspecto, el promotor inducible comprende un elemento de respuesta a auxina. En un aspecto, el promotor inducible contiene uno o más motivos potenciadores de DR5. En un aspecto, el promotor es un promotor constitutivo débil modificado para represión y desrepresión. En un aspecto, una o más secuencias operadoras en el promotor se han colocado cerca de o solapando con la secuencia TATA y/o el sitio de inicio de la transcripción. En un aspecto, el promotor se selecciona de NOS, AXIG1, ZM-GOS2, CC-UBI1-PRO o ZM-ADF4-PRO. En un aspecto, el promotor inducible es el promotor DR5 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 40. En un aspecto, el promotor es un promotor desreprimible. En un aspecto, el promotor desreprimible es TETR, ESR o CR. En un aspecto, el promotor regulado por el desarrollo se selecciona de PLTP, PLTP1, PLTP2 o PLTP3. En un aspecto, el promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 o PLTP3 deriva de una monocotiledónea. En un aspecto, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz, sorgo o arroz. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz. En un aspecto, el promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 o PLTP3 deriva de una dicotiledónea. En un aspecto, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En un aspecto, el promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 o PLTP3 comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1-2 o 55-61, el promotor PLTP comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1 o 2. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido ODP2, BBM2, BMN2 o BMN3. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido de monocotiledónea. En un aspecto, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz o arroz. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido de dicotiledónea. En un aspecto, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65 o 67. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 17, 19, 21, 62, 64, 66 o 68. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido ODP2. En un aspecto, el polipéptido ODP2 es un polipéptido de monocotiledónea. En un aspecto, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz, arroz o Setaria sp. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz o arroz. En un aspecto, el ODP2 es un polipéptido de dicotiledónea. En un aspecto, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En un aspecto, el polipéptido ODP2 comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 63, 65 o 67. En un aspecto, el polipéptido ODP2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 17, 21, 62, 64, 66 o 68. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido BBM2. En un aspecto, el polipéptido BBM2 es un polipéptido de monocotiledónea. En un aspecto, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz, caña de azúcar, arroz o Setaria sp. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz o arroz. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz. En un aspecto, el polipéptido BBM2 es un polipéptido de dicotiledónea. En un aspecto, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En un aspecto, el polipéptido BBM2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. En un aspecto, el polipéptido BBM2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 19. En un aspecto, la estructura vegetal regenerable se forma en aproximadamente 0 a aproximadamente 7 días de transformación de la célula o en aproximadamente 0 a aproximadamente 14 días de transformación de la célula y la planta transgénica se forma en aproximadamente 14 días de transformación de la célula a aproximadamente 60 días de transformación de la célula. En un aspecto, el método se realiza en ausencia de medio de enraizamiento. En un aspecto, el método se realiza en presencia de medio de enraizamiento. En un aspecto, el explante es un embrión inmaduro. En un aspecto, el embrión inmaduro es un embrión inmaduro de 1 -5 mm. En un aspecto, el embrión inmaduro es un embrión inmaduro de 3,5-5 mm. En un aspecto, se usa citocinina exógena durante la germinación después de aproximadamente 7 días de transformación de la célula o después de aproximadamente 14 días de transformación de la célula. En un aspecto, la expresión de un polipéptido de (a) es transitoria. En un aspecto, la germinación se realiza en presencia de citocinina exógena.

En diversos aspectos, la presente divulgación proporciona además métodos para producir una planta transgénica, que comprenden: (a) transformar una célula de un explante con una construcción de expresión que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; (b) permitir la expresión del polipéptido de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo; y (c) germinar la estructura vegetal regenerable para formar la planta transgénica. En un aspecto, la construcción de expresión comprende tanto la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX como la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2. En un aspecto, la construcción de expresión comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX. En un aspecto, la construcción de expresión comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2. En un aspecto, la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a AP2 se produce en menos de 1 día, menos de 2 días, menos de 5 días, menos de 7 días o menos de aproximadamente 14 días después del inicio de la transformación. En un aspecto, la construcción de expresión comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio. En un aspecto, la recombinasa específica de sitio se selecciona de FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxbl, TP907-1 o U153. En un aspecto, la recombinasa específica de sitio es un polipéptido de fusión desestabilizado. En un aspecto, el polipéptido de fusión desestabilizado es TETR(L17G)~CRE o ESR(L17G)~CRE. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En un aspecto, el promotor constitutivo unido de forma funcional a la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio y/o la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 se selecciona de UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B p Ro (1.2 KB), IN2-2, n Os , la versión -135 de 35S o ZM-ADF PRO (ALT2). En un aspecto, el promotor inducible unido de forma funcional a la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio y/o la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 se selecciona de AXIG1, DR5, XVE, GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A o promotores activados por tetraciclina, etametsulfurón o clorsulfurón. En un aspecto, el promotor regulado por el desarrollo unido de forma funcional a la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio y/o la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 se selecciona de PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, LGL, l Ea -14A o LEA-D34. En un aspecto, el promotor inducible es un promotor inducible químicamente.

En un aspecto, el promotor inducible químicamente es XVE. En un aspecto, el promotor inducible químicamente se reprime por TETR, ESR o CR, y la desrepresión se produce tras la adición de ligados relacionados con tetraciclina o de sulfonilurea. En un aspecto, el represor es TETR y el ligando relacionado con tetraciclina es doxiciclina o anhidrotetraciclina. En un aspecto, el represor es ESR y el ligando de sulfonilurea es etametsulfurón, clorsulfurón, metsulfurón-metilo, sulfometurón-metilo, clorimurón-etilo, nicosulfurón, primisulfurón, tribenurón, sulfosulfurón, trifloxisulfurón, foramsulfurón, yodosulfurón, prosulfurón, tifensulfurón, rimsulfurón, mesosulfurón o halosulfurón. En un aspecto, el promotor inducible es un promotor inducible por auxina. En un aspecto, el promotor inducible por auxina es AXIG1. En un aspecto, el promotor AXIG1 comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 39. En un aspecto, el promotor inducible comprende un elemento de respuesta a auxina. En un aspecto, el promotor inducible contiene uno o más motivos potenciadores de DR5. En un aspecto, el promotor es un promotor constitutivo débil modificado para represión y desrepresión. En un aspecto, una o más secuencias operadoras en el promotor se han colocado cerca de o solapando con la secuencia TATA y/o el sitio de inicio de la transcripción. En un aspecto, el promotor se selecciona de NOS, AXIG1, ZM-GOS2, CC-UBI1-PRO o ZM-ADF4-PRO. En un aspecto, el promotor inducible es el promotor DR5 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 40. En un aspecto, el promotor es un promotor desreprimible. En un aspecto, el promotor desreprimible es TETR, ESR o CR. En un aspecto, el promotor regulado por el desarrollo se selecciona de PlTP, PLTP1, PLTP2 o PLTP3. En un aspecto, el promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 o PLTP3 deriva de una monocotiledónea. En un aspecto, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz, sorgo o arroz. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz. En un aspecto, el promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 o PLTP3 deriva de una dicotiledónea. En un aspecto, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En un aspecto, el promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 o PLTP3 comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1-2 o 55-61, el promotor PLTP comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1 o 2. En un aspecto, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX se selecciona de polipéptido WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 o WOX9. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un nucleótido de monocotiledónea. En un aspecto, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un nucleótido de dicotiledónea. En un aspecto, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX codifica una secuencia de aminoácidos que comprende una cualquiera de SEQ ID NO:4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX comprende una cualquiera de SEQ ID NO:3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15. En un aspecto, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS1. En un aspecto, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En un aspecto, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz o arroz. En un aspecto, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz. En un aspecto, el polipéptido WUS1 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. En un aspecto, el polipéptido WUS1 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 3. En un aspecto, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS2. En un aspecto, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En un aspecto, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz o arroz. En un aspecto, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz. En un aspecto, el polipéptido WUS2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6. En un aspecto, el polipéptido WUS2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 5. En un aspecto, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS3. En un aspecto, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz, sorgo, arroz o Setaria. En un aspecto, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz o arroz. En un aspecto, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz. En un aspecto, el polipéptido WUS3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8. En un aspecto, el polipéptido WUS3 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO:7. En un aspecto, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WOX5. En un aspecto, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5A. En un aspecto, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5 de maíz, sorgo, arroz o Setaria. En un aspecto, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5 de maíz o arroz. En un aspecto, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5 de maíz. En un aspecto, el polipéptido WOX5 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. En un aspecto, el polipéptido WOX5 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 13. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido ODP2, BBM2, BMN2 o BMN3. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido de monocotiledónea. En un aspecto, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz o arroz. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido de dicotiledónea. En un aspecto, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65 o 67. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 17, 19, 21, 62, 64, 66 o 68. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido ODP2. En un aspecto, el polipéptido ODP2 es un polipéptido de monocotiledónea. En un aspecto, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz, arroz o Setaria sp. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz o arroz. En un aspecto, el ODP2 es un polipéptido de dicotiledónea. En un aspecto, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En un aspecto, el polipéptido ODP2 comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 63, 65 o 67. En un aspecto, el polipéptido ODP2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 17, 21, 62, 64, 66 o 68. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido BBM2. En un aspecto, el polipéptido BBM2 es un polipéptido de monocotiledónea. En un aspecto, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz, caña de azúcar, arroz o Setaria sp. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz o arroz. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz. En un aspecto, el polipéptido BBM2 es un polipéptido de dicotiledónea. En un aspecto, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En un aspecto, el polipéptido BBM2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. En un aspecto, el polipéptido BBM2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 19. En un aspecto, la estructura vegetal regenerable se forma en aproximadamente 0 a aproximadamente 7 días de transformación de la célula o en aproximadamente 0 a aproximadamente 14 días de transformación de la célula y la planta transgénica se forma en aproximadamente 14 días de transformación de la célula a aproximadamente 60 días de transformación de la célula. En un aspecto, el método se realiza en ausencia de medio de enraizamiento. En un aspecto, el método se realiza en presencia de medio de enraizamiento. En un aspecto, el explante es un embrión inmaduro. En un aspecto, el embrión inmaduro es un embrión inmaduro de 1-5 mm. En un aspecto, el embrión inmaduro es un embrión inmaduro de 3,5-5 mm. En un aspecto, se usa citocinina exógena durante la germinación después de aproximadamente 7 días de transformación de la célula o después de aproximadamente 14 días de transformación de la célula. En un aspecto, la expresión de un polipéptido de (a) es transitoria. En un aspecto, la germinación se realiza en presencia de citocinina exógena.

En diversos aspectos, la presente divulgación proporciona además métodos para producir una planta transgénica, que comprenden: (a) transformar una célula de un explante con una construcción de expresión que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; o (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o (iii) una combinación de (i) y (ii); (b) permitir la expresión del polipéptido de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo; y (c) germinar la estructura vegetal regenerable de (b) para formar la planta transgénica en aproximadamente 14 días a aproximadamente 60 días. En un aspecto, la construcción de expresión comprende tanto la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX como la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2. En un aspecto, la construcción de expresión comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX. En un aspecto, la construcción de expresión comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2. En un aspecto, la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a AP2 se produce en menos de 1 día, menos de 2 días, menos de 5 días, menos de 7 días o menos de aproximadamente 14 días después del inicio de la transformación. En un aspecto, la construcción de expresión comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio. En un aspecto, la recombinasa específica de sitio se selecciona de FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxbl, TP907-1 o U153. En un aspecto, la recombinasa específica de sitio es un polipéptido de fusión desestabilizado. En un aspecto, el polipéptido de fusión desestabilizado es TETR(L17G)~CRE o ESR(L17G)~CRE. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En un aspecto, el promotor constitutivo unido de forma funcional a la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio y/o la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 se selecciona de UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B p Ro (1.2 KB), IN2-2, n Os , la versión -135 de 35S o ZM-ADF PRO (ALT2). En un aspecto, el promotor inducible unido de forma funcional a la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio y/o la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 se selecciona de AXIG1, DR5, XVE, GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A o promotores activados por tetraciclina, etametsulfurón o clorsulfurón. En un aspecto, el promotor regulado por el desarrollo unido de forma funcional a la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio y/o la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 se selecciona de PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, LGL, l Ea -14A o LEA-D34. En un aspecto, el promotor inducible es un promotor inducible químicamente. En un aspecto, el promotor inducible químicamente es XVE. En un aspecto, el promotor inducible químicamente se reprime por TETR, ESR o CR, y la desrepresión se produce tras la adición de ligados relacionados con tetraciclina o de sulfonilurea. En un aspecto, el represor es TETR y el ligando relacionado con tetraciclina es doxiciclina o anhidrotetraciclina. En un aspecto, el represor es ESR y el ligando de sulfonilurea es etametsulfurón, clorsulfurón, metsulfurón-metilo, sulfometurón-metilo, clorimurón-etilo, nicosulfurón, primisulfurón, tribenurón, sulfosulfurón, trifloxisulfurón, foramsulfurón, yodosulfurón, prosulfurón, tifensulfurón, rimsulfurón, mesosulfurón o halosulfurón. En un aspecto, el promotor inducible es un promotor inducible por auxina. En un aspecto, el promotor inducible por auxina es AXIG1. En un aspecto, el promotor AXIG1 comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 39. En un aspecto, el promotor inducible comprende un elemento de respuesta a auxina. En un aspecto, el promotor inducible contiene uno o más motivos potenciadores de DR5. En un aspecto, el promotor es un promotor constitutivo débil modificado para represión y desrepresión. En un aspecto, una o más secuencias operadoras en el promotor se han colocado cerca de o solapando con la secuencia TATA y/o el sitio de inicio de la transcripción. En un aspecto, el promotor se selecciona de NOS, AXIG1, ZM-GOS2, CC-UBI1-PRO o ZM-ADF4-PRO. En un aspecto, el promotor inducible es el promotor DR5 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 40. En un aspecto, el promotor es un promotor desreprimible. En un aspecto, el promotor desreprimible es TETR, ESR o CR. En un aspecto, el promotor regulado por el desarrollo se selecciona de PLTP, PLTP1, PLTP2 o PLTP3. En un aspecto, el promotor PlTp , PLTP1, PLTP2 o PLTP3 deriva de una monocotiledónea. En un aspecto, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz, sorgo o arroz. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz. En un aspecto, el promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 o PLTP3 deriva de una dicotiledónea. En un aspecto, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En un aspecto, el promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 o PLTP3 comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1-2 o 55-61, el promotor PLTP comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1 o 2. En un aspecto, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX se selecciona de polipéptido WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 o WOX9. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un nucleótido de monocotiledónea. En un aspecto, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un nucleótido de dicotiledónea. En un aspecto, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX codifica una secuencia de aminoácidos que comprende una cualquiera de SEQ ID NO:4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX comprende una cualquiera de SEQ ID NO:3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15. En un aspecto, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS1. En un aspecto, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En un aspecto, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz o arroz. En un aspecto, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz. En un aspecto, el polipéptido WUS1 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. En un aspecto, el polipéptido WUS1 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 3. En un aspecto, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS2. En un aspecto, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En un aspecto, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz o arroz. En un aspecto, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz. En un aspecto, el polipéptido WUS2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6. En un aspecto, el polipéptido WUS2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 5. En un aspecto, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS3. En un aspecto, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz, sorgo, arroz o Setaria. En un aspecto, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz o arroz. En un aspecto, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz. En un aspecto, el polipéptido WUS3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8. En un aspecto, el polipéptido WUS3 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO:7. En un aspecto, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WOX5. En un aspecto, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5A. En un aspecto, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5 de maíz, sorgo, arroz o Setaria. En un aspecto, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5 de maíz o arroz. En un aspecto, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5 de maíz. En un aspecto, el polipéptido WOX5 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. En un aspecto, el polipéptido WOX5 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 13. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido ODP2, BBM2, BMN2 o BMN3. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido de monocotiledónea. En un aspecto, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz o arroz. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido de dicotiledónea. En un aspecto, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65 o 67. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 17, 19, 21, 62, 64, 66 o 68. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido ODP2. En un aspecto, el polipéptido ODP2 es un polipéptido de monocotiledónea. En un aspecto, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz, arroz o Setaria sp. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz o arroz. En un aspecto, el ODP2 es un polipéptido de dicotiledónea. En un aspecto, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En un aspecto, el polipéptido ODP2 comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 63, 65 o 67. En un aspecto, el polipéptido ODP2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 17, 21, 62, 64, 66 o 68. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido BBM2. En un aspecto, el polipéptido BBM2 es un polipéptido de monocotiledónea. En un aspecto, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz, caña de azúcar, arroz o Setaria sp. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz o arroz. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz. En un aspecto, el polipéptido BBM2 es un polipéptido de dicotiledónea. En un aspecto, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En un aspecto, el polipéptido BBM2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. En un aspecto, el polipéptido BBM2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 19. En un aspecto, la estructura vegetal regenerable se forma en aproximadamente 0 a aproximadamente 7 días de transformación de la célula o en aproximadamente 0 a aproximadamente 14 días de transformación de la célula. En un aspecto, el método se realiza en ausencia de medio de enraizamiento. En un aspecto, el método se realiza en presencia de medio de enraizamiento. En un aspecto, el explante es un embrión inmaduro. En un aspecto, el embrión inmaduro es un embrión inmaduro de 1-5 mm. En un aspecto, el embrión inmaduro es un embrión inmaduro de 3,5-5 mm. En un aspecto, se usa citocinina exógena durante la germinación después de aproximadamente 7 días de transformación de la célula o después de aproximadamente 14 días de transformación de la célula. En un aspecto, la expresión de un polipéptido de (a) es transitoria. En un aspecto, la germinación se realiza en presencia de citocinina exógena.

En diversos aspectos, la presente divulgación proporciona además métodos para producir una planta transgénica, que comprenden: (a) transformar una célula de un explante con una construcción de expresión que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; o (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o (iii) una combinación de (i) y (ii); (b) permitir la expresión del polipéptido de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo, y en la que la estructura vegetal regenerable se forma en aproximadamente 0-7 días o aproximadamente 0-14 días de transformación de la célula; y (c) germinar la estructura vegetal regenerable de (b) para formar la planta transgénica en aproximadamente 14 días a aproximadamente 60 días de transformación de la célula. En un aspecto, la construcción de expresión comprende tanto la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX como la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2. En un aspecto, la construcción de expresión comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX. En un aspecto, la construcción de expresión comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2. En un aspecto, la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a AP2 se produce en menos de 1 día, menos de 2 días, menos de 5 días, menos de 7 días o menos de aproximadamente 14 días después del inicio de la transformación. En un aspecto, la construcción de expresión comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio. En un aspecto, la recombinasa específica de sitio se selecciona de FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxbl, TP907-1 o U153. En un aspecto, la recombinasa específica de sitio es un polipéptido de fusión desestabilizado. En un aspecto, el polipéptido de fusión desestabilizado es TETR(L17G)~CRE o ESR(L17G)~CRE. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En un aspecto, el promotor constitutivo unido de forma funcional a la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio y/o la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 se selecciona de UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1.2 KB), IN2-2, NOS, la versión -135 de 35S o ZM-ADF PRO (ALT2). En un aspecto, el promotor inducible unido de forma funcional a la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio y/o la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 se selecciona de AXIG1, DR5, XVE, GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A o promotores activados por tetraciclina, etametsulfurón o clorsulfurón. En un aspecto, el promotor regulado por el desarrollo unido de forma funcional a la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio y/o la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 se selecciona de PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, LGL, LEA-14A o LEA-D34. En un aspecto, el promotor inducible es un promotor inducible químicamente. En un aspecto, el promotor inducible químicamente es XVE. En un aspecto, el promotor inducible químicamente se reprime por TETR, ESR o CR, y la desrepresión se produce tras la adición de ligados relacionados con tetraciclina o de sulfonilurea. En un aspecto, el represor es TETR y el ligando relacionado con tetraciclina es doxiciclina o anhidrotetraciclina. En un aspecto, el represor es ESR y el ligando de sulfonilurea es etametsulfurón, clorsulfurón, metsulfurón-metilo, sulfometurón-metilo, clorimurónetilo, nicosulfurón, primisulfurón, tribenurón, sulfosulfurón, trifloxisulfurón, foramsulfurón, yodosulfurón, prosulfurón, tifensulfurón, rimsulfurón, mesosulfurón o halosulfurón. En un aspecto, el promotor inducible es un promotor inducible por auxina. En un aspecto, el promotor inducible por auxina es AXIG1. En un aspecto, el promotor AXIG1 comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 39. En un aspecto, el promotor inducible comprende un elemento de respuesta a auxina. En un aspecto, el promotor inducible contiene uno o más motivos potenciadores de DR5. En un aspecto, el promotor es un promotor constitutivo débil modificado para represión y desrepresión. En un aspecto, una o más secuencias operadoras en el promotor se han colocado cerca de o solapando con la secuencia TATA y/o el sitio de inicio de la transcripción. En un aspecto, el promotor se selecciona de NOS, AXIG1, ZM-GOS2, CC-UBI1-PRO o ZM-ADF4-PRO. En un aspecto, el promotor inducible es el promotor DR5 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 40. En un aspecto, el promotor es un promotor desreprimible. En un aspecto, el promotor desreprimible es TETR, ESR o CR. En un aspecto, el promotor regulado por el desarrollo se selecciona de PLTP, PLTP1, PLTP2 o PLTP3. En un aspecto, el promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 o PLTP3 deriva de una monocotiledónea. En un aspecto, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz, sorgo o arroz. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz. En un aspecto, el promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 o PLTP3 deriva de una dicotiledónea. En un aspecto, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En un aspecto, el promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 o PLTP3 comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1-2 o 55-61, el promotor PLTP comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1 o 2. En un aspecto, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX se selecciona de polipéptido WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WoX4, WOX5 o WOX9. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un nucleótido de monocotiledónea. En un aspecto, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un nucleótido de dicotiledónea. En un aspecto, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX codifica una secuencia de aminoácidos que comprende una cualquiera de SEQ ID NO:4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX comprende una cualquiera de SEQ ID NO:3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15. En un aspecto, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS1. En un aspecto, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En un aspecto, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz o arroz. En un aspecto, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz. En un aspecto, el polipéptido WUS1 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. En un aspecto, el polipéptido WUS1 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 3. En un aspecto, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS2. En un aspecto, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En un aspecto, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz o arroz. En un aspecto, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz. En un aspecto, el polipéptido WUS2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6. En un aspecto, el polipéptido WUS2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 5. En un aspecto, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS3. En un aspecto, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz, sorgo, arroz o Setaria. En un aspecto, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz o arroz. En un aspecto, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz. En un aspecto, el polipéptido WUS3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8. En un aspecto, el polipéptido WUS3 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO:7. En un aspecto, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WOX5. En un aspecto, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5A. En un aspecto, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5 de maíz, sorgo, arroz o Setaria. En un aspecto, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5 de maíz o arroz. En un aspecto, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5 de maíz. En un aspecto, el polipéptido WOX5 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. En un aspecto, el polipéptido WOX5 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 13. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido ODP2, BBM2, BMN2 o BMN3. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido de monocotiledónea. En un aspecto, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz o arroz. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido de dicotiledónea. En un aspecto, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65 o 67. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 17, 19, 21,62, 64, 66 o 68. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido ODP2. En un aspecto, el polipéptido ODP2 es un polipéptido de monocotiledónea. En un aspecto, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz, arroz o Setaria sp. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz o arroz. En un aspecto, el ODP2 es un polipéptido de dicotiledónea. En un aspecto, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En un aspecto, el polipéptido ODP2 comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 63, 65 o 67. En un aspecto, el polipéptido ODP2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 17, 21, 62, 64, 66 o 68. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido BBM2. En un aspecto, el polipéptido BBM2 es un polipéptido de monocotiledónea. En un aspecto, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz, caña de azúcar, arroz o Setaria sp. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz o arroz. En un aspecto, la monocotiledónea es maíz. En un aspecto, el polipéptido BBM2 es un polipéptido de dicotiledónea. En un aspecto, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En un aspecto, el polipéptido BBM2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. En un aspecto, el polipéptido BBM2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 19. En un aspecto, el método se realiza en ausencia de medio de enraizamiento. En un aspecto, el método se realiza en presencia de medio de enraizamiento. En un aspecto, el explante es un embrión inmaduro. En un aspecto, el embrión inmaduro es un embrión inmaduro de 1-5 mm. En un aspecto, el embrión inmaduro es un embrión inmaduro de 3,5-5 mm. En un aspecto, se usa citocinina exógena durante la germinación después de aproximadamente 7 días de transformación de la célula o después de aproximadamente 14 días de transformación de la célula. En un aspecto, la expresión de un polipéptido de (a) es transitoria. En un aspecto, la germinación se realiza en presencia de citocinina exógena.

La presente divulgación comprende métodos y composiciones para la transformación rápida y eficaz de plantas, por ejemplo, plantas monocotiledóneas tales como maíz. En diversos aspectos, la presente divulgación proporciona además métodos para producir una planta transgénica, que comprenden: (a) transformar una célula de un explante con una construcción de expresión que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; o (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o (iii) una combinación de (i) y (ii); y (b) permitir la expresión del polipéptido de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo; y (c) germinar la estructura vegetal regenerable para formar la planta transgénica. En un aspecto, la estructura vegetal regenerable se produce en aproximadamente 0 a aproximadamente 7 días o en aproximadamente 0 a aproximadamente 14 días de transformación de la célula. En un aspecto, la germinación comprende transferir la estructura vegetal regenerable a un medio de maduración que comprende una citocinina exógena y formar la planta transgénica. En un aspecto, la construcción de expresión comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio seleccionada de FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxbl, TP907-1 o U153. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En un aspecto, la germinación (c) se realiza en presencia de citocinina exógena. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 está unida de forma funcional a un promotor seleccionado de un promotor inducible, un promotor regulado por el desarrollo o un promotor constitutivo. En un aspecto, el promotor constitutivo unido de forma funcional a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 se selecciona de UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV(AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBIPRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2PRO, ZM-H1B PRO (1.2 KB), IN2-2, NOS, la versión -135 de 35S o ZM-ADF PRO (ALT2); el promotor inducible unido de forma funcional a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 se selecciona de AXIG1, DR5, XVE, GLB1, OLE, LTP2, hSp17.7, Hs P26, HSP18A, o promotores activados por tetraciclina, etametsulfurón o clorsulfurón; y el promotor regulado por el desarrollo unido de forma funcional a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 se selecciona de PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, SDR, LGL, LEA-14A o LEA-D34. En un aspecto, el explante deriva de una monocotiledónea o una dicotiledónea. En un aspecto, se produce una semilla de la planta por el método.

En diversos aspectos, la presente divulgación proporciona además métodos para producir una planta transgénica, que comprenden: (a) transformar una célula de un explante con una construcción de expresión que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; o (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o (iii) una combinación de (i) y (ii); y (b) permitir la expresión de un polipéptido de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo; y (c) germinar la estructura vegetal regenerable para formar la planta transgénica; en el que el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16; o en el que el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX está codificado por la secuencia de nucleótidos de cualquiera de SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15; y en el que el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65 o 67; o en el que el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 está codificado por la secuencia de nucleótidos de cualquiera de s Eq ID NO: 17, 19, 21, 62, 64, 66 o 68. En un aspecto, la estructura vegetal regenerable se produce en aproximadamente 0 a aproximadamente 7 días o en aproximadamente 0 a aproximadamente 14 días de transformación de la célula. En un aspecto, la germinación comprende transferir la estructura vegetal regenerable a un medio de maduración que comprende una citocinina exógena y formar la planta transgénica. En un aspecto, la construcción de expresión comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio seleccionada de FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxbl, TP907-1 o U153. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En un aspecto, la germinación (c) se realiza en presencia de citocinina exógena. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 está unida de forma funcional a un promotor seleccionado de un promotor inducible, un promotor regulado por el desarrollo o un promotor constitutivo. En un aspecto, el promotor constitutivo unido de forma funcional a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 se selecciona de UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV(AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1.2 KB), IN2-2, NOS, la versión -135 de 35S o ZM-ADF PRO (ALT2); el promotor inducible unido de forma funcional a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 se selecciona de AXIG1, DR5, XVE, GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, hSp18A, o promotores activados por tetraciclina, etametsulfurón o clorsulfurón; y el promotor regulado por el desarrollo unido de forma funcional a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 se selecciona de PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, SDR, LGL, LEA-14A o LEA-D34. En un aspecto, el explante deriva de una monocotiledónea o una dicotiledónea. En un aspecto, se produce una semilla de la planta por el método.

En diversos aspectos, la presente divulgación proporciona además métodos para producir una planta transgénica, que comprenden: (a) transformar una célula de un explante con una construcción de expresión que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; o (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o (iii) una combinación de (i) y (ii); (b) permitir la expresión del polipéptido de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo; y (c) germinar la estructura vegetal regenerable de (b) durante aproximadamente 14 a aproximadamente 60 días para formar una plántula; y (d) permitir que la plántula de (c) crezca en una planta. En un aspecto, la estructura vegetal regenerable se produce en aproximadamente 0 a aproximadamente 7 días o en aproximadamente 0 a aproximadamente 14 días de transformación de la célula. En un aspecto, la germinación comprende transferir la estructura vegetal regenerable a un medio de maduración que comprende una citocinina exógena y formar la planta transgénica. En un aspecto, la construcción de expresión comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio seleccionada de FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxbl, TP907-1 o U153. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En un aspecto, la germinación (c) se realiza en presencia de citocinina exógena. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 está unida de forma funcional a un promotor seleccionado de un promotor inducible, un promotor regulado por el desarrollo o un promotor constitutivo. En un aspecto, el promotor constitutivo unido de forma funcional a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 se selecciona de UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV(AY) PRO, CYMV p Ro FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1.2 KB), IN2-2, NOS, la versión -135 de 35S o ZM-ADF PRO (ALT2); el promotor inducible unido de forma funcional a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 se selecciona de AXIG1, DR5, XVE, GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A, o promotores activados por tetraciclina, etametsulfurón o clorsulfurón; y el promotor regulado por el desarrollo unido de forma funcional a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 se selecciona de PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, SDR, LGL, l Ea -14A o LEA-D34. En un aspecto, el explante deriva de una monocotiledónea o una dicotiledónea. En un aspecto, se produce una semilla de la planta por el método.

En diversos aspectos, la presente divulgación proporciona además métodos para producir una planta transgénica, que comprenden (a) transformar una o más células de un explante con una construcción de expresión que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; o (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o (iii) una combinación de (i) y (ii); y (b) permitir la expresión del polipéptido de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo; y germinar la estructura vegetal regenerable para formar la planta transgénica. En un aspecto, la presente divulgación proporciona además métodos para producir una plántula obtenida de una estructura vegetal regenerable preparada usando los métodos divulgados. En un aspecto, la presente divulgación proporciona además métodos para producir una planta obtenida de la estructura vegetal regenerable. En diversos aspectos, la germinación se realiza en presencia de citocinina exógena. En un aspecto, la presente divulgación proporciona además kits que comprenden (a) una construcción de expresión que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; o (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o (iii) una combinación de (i) y (ii); y (b) instrucciones para obtener una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo; y (c) instrucciones para germinar la estructura vegetal regenerable para formar una planta transgénica.

La presente divulgación comprende métodos y composiciones para la transformación rápida y eficaz de plantas, por ejemplo, plantas monocotiledóneas tales como maíz. En diversos aspectos, la presente divulgación proporciona métodos para producir una planta transgénica, que comprenden (a) transformar una célula de un explante con una construcción de expresión que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; o (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o (iii) una combinación de (i) y (ii); y (b) permitir la expresión del polipéptido de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo; y (c) germinar la estructura vegetal regenerable para formar la planta transgénica. En diversos aspectos, la estructura vegetal regenerable se produce en aproximadamente 0-7 días o aproximadamente 0-14 días de transformación de la célula. En diversos aspectos, la germinación comprende transferir la estructura vegetal regenerable a un medio de maduración que comprende una citocinina exógena y formar la planta transgénica. En diversos aspectos, la germinación se realiza en presencia de citocinina exógena. En diversos aspectos, la construcción de expresión comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio seleccionada de FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxbl, TP907-1 o U153. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En diversos aspectos, el promotor inducible es GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A o XVE. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX está unida de forma funcional a un promotor seleccionado de un promotor inducible, un promotor regulado por el desarrollo o un promotor constitutivo. En diversos aspectos, el promotor constitutivo se selecciona de UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1.2 KB), IN2-2, NOS, la versión -135 de 35S o Zm -ADF PRO (AlT2); el promotor inducible se selecciona de GLB1, o Le, LTP2, AXIG1 DR5, HSP17.7, HSP26, HSP18A o XVE; y el promotor regulado por el desarrollo se selecciona de PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, LGL, LEA-14A o LEA-D34. En diversos aspectos, el explante deriva de una monocotiledónea o una dicotiledónea. En diversos aspectos, se proporciona una semilla de la planta producida por el método.

En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona métodos para producir una planta transgénica, que comprenden (a) transformar una célula de un explante con una construcción de expresión que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; o (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o (iii) una combinación de las mismas; y (b) permitir la expresión de un polipéptido de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo; y (c) germinar la estructura vegetal regenerable para formar la planta transgénica; en el que el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16; o en el que el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX está codificado por la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15; y en el que el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65 o 67; o en el que el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 está codificado por la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 17, 19, 21, 62, 64, 66 o 68. En diversos aspectos, la estructura vegetal regenerable se produce en aproximadamente 0-7 días o aproximadamente 0-14 días de transformación de la célula. En diversos aspectos, la germinación comprende transferir la estructura vegetal regenerable a un medio de maduración que comprende una citocinina exógena y formar la planta transgénica. En diversos aspectos, la germinación se realiza en presencia de citocinina exógena. En diversos aspectos, la construcción de expresión comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio seleccionada de FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxbl, TP907-1 o U153. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En diversos aspectos, el promotor inducible es GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A o XVE. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX está unida de forma funcional a un promotor seleccionado de un promotor inducible, un promotor regulado por el desarrollo o un promotor constitutivo. En diversos aspectos, el promotor constitutivo se selecciona de UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1.2 KB), IN2-2, NOS, la versión -135 de 35S o ZM-ADF PRO (ALT2); el promotor inducible se selecciona de GLB1, OLE, LTP2, AXIG1 dR5, HSP17.7, HSP26, HSP18A o XVE; y el promotor regulado por el desarrollo se selecciona de PLTP, pLt P1 , PLTP2, PLTP3, LGL, LEA-14A o LEA-D34. En diversos aspectos, el explante deriva de una monocotiledónea o una dicotiledónea. En diversos aspectos, se proporciona una semilla de la planta producida por el método.

En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona métodos para producir una planta transgénica, que comprenden: (a) transformar una célula de un explante con una construcción de expresión que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o (iii) una combinación de (i) y (ii); (b) permitir la expresión del polipéptido de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo; y (c) permitir que la estructura vegetal regenerable de (b) madure en una plántula durante aproximadamente 14 a aproximadamente 60 días; y (d) permitir que la plántula de (c) crezca en una planta. En diversos aspectos, la estructura vegetal regenerable se produce en aproximadamente 0-7 días o aproximadamente 0-14 días de transformación de la célula. En diversos aspectos, la germinación comprende transferir la estructura vegetal regenerable a un medio de maduración que comprende una citocinina exógena y formar la planta transgénica. En diversos aspectos, la germinación se realiza en presencia de citocinina exógena. En diversos aspectos, la construcción de expresión comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio seleccionada de FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxbl, TP907-1 o U153. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En diversos aspectos, el promotor inducible es GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A o XVE. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX está unida de forma funcional a un promotor seleccionado de un promotor inducible, un promotor regulado por el desarrollo y un promotor constitutivo. En diversos aspectos, el promotor constitutivo se selecciona de UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1.2 KB), IN2-2, NOS, la versión - 135 de 35S y z M-ADF PRO (ALT2); el promotor inducible se selecciona de GLB1, OLE, LTp2, AXIG1 dR5, HSP17.7, HSP26, HSP18A o XVE; y el promotor regulado por el desarrollo se selecciona de PLTP, pLt P1 , PLTP2, PLTP3, LGL, LEA-14A o LEA-D34. En diversos aspectos, el explante deriva de una monocotiledónea o una dicotiledónea. En diversos aspectos, se proporciona una semilla de la planta producida por el método.

En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona métodos para producir una planta transgénica, que comprenden (a) transformar una célula de un explante con una construcción de expresión que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; o (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o (iii) una combinación de (i) y (ii); y (b) permitir la expresión del polipéptido de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo; y (c) germinar la estructura vegetal regenerable para formar la planta transgénica. En diversos aspectos, la construcción de expresión comprende tanto la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX como la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2. En diversos aspectos, la construcción de expresión comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX. En diversos aspectos, la construcción de expresión comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2. En diversos aspectos, la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a AP2 se produce en menos de 1 día, menos de 2 días, menos de 5 días, menos de 7 días o menos de aproximadamente 14 días después del inicio de la transformación. En diversos aspectos, la germinación se realiza en presencia de citocinina exógena. En diversos aspectos, la construcción de expresión comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio. En diversos aspectos, la recombinasa específica de sitio es FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxbl, TP907-1 o U153. En diversos aspectos, la recombinasa específica de sitio es un polipéptido de fusión desestabilizado. En diversos aspectos, el polipéptido de fusión desestabilizado es TETR(L17G)~CRE o ESR(L17G)~CRE. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En diversos aspectos, el promotor inducible es GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26 o HSP18A. En diversos aspectos, el promotor inducible es un promotor inducible químicamente. En diversos aspectos, el promotor inducible químicamente es XVE. En diversos aspectos, el promotor inducible químicamente se reprime por TETR, ESR o CR, y la desrepresión se produce tras la adición de ligados relacionados con tetraciclina o de sulfonilurea. En diversos aspectos, el represor es TETR y el ligando relacionado con tetraciclina es doxiciclina o anhidrotetraciclina. En diversos aspectos, el represor es ESR y el ligando de sulfonilurea es etametsulfurón, clorsulfurón, metsulfurón-metilo, sulfometurón-metilo, clorimurón-etilo, nicosulfurón, primisulfurón, tribenurón, sulfosulfurón, trifloxisulfurón, foramsulfurón, yodosulfurón, prosulfurón, tifensulfurón, rimsulfurón, mesosulfurón o halosulfurón. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX está unida de forma funcional a un promotor constitutivo. En diversos aspectos, el promotor constitutivo es UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1.2 KB), IN2-2, NOS, la versión -135 de 35S o ZM-ADF PRO (ALT2). En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX está unida de forma funcional a un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 está unida de forma funcional a un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En diversos aspectos, el promotor regulado por el desarrollo es un promotor PLTP. En diversos aspectos, el promotor PLTP deriva de una monocotiledónea. En diversos aspectos, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz, sorgo o arroz. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz. En diversos aspectos, el promotor PLTP deriva de una dicotiledónea. En diversos aspectos, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En diversos aspectos, el promotor PLTP comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1-2 o 55-61. En diversos aspectos, el promotor PLTP comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1 o 2. En diversos aspectos, el promotor inducible es un promotor inducible por auxina. En diversos aspectos, el promotor inducible por auxina es AXIG1. En diversos aspectos, el promotor AXIG1 comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 39. En diversos aspectos, el promotor comprende un elemento de respuesta a auxina. En diversos aspectos, el promotor contiene uno o más motivos potenciadores de DR5. En diversos aspectos, el promotor es un promotor constitutivo débil modificado para represión y desrepresión. En diversos aspectos, una o más secuencias operadoras en el promotor se han colocado cerca de o solapando con la secuencia TATA y/o el sitio de inicio de la transcripción. En diversos aspectos, el promotor es NOS, AXIG1, ZM-GOS2, CC-UBI1-PRO o ZM-ADF4-PRO. En diversos aspectos, el promotor es un promotor DR5 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 40. En diversos aspectos, el promotor es un promotor desreprimible. En diversos aspectos, el promotor desreprimible es TETR, ESR o CR. En diversos aspectos, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 o WOX9. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un nucleótido de monocotiledónea. En diversos aspectos, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un nucleótido de dicotiledónea. En diversos aspectos, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX codifica una secuencia de aminoácidos que comprende una cualquiera de SEQ ID NO:4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX comprende una cualquiera de SEQ ID NO:3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15. En diversos aspectos, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS1. En diversos aspectos, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En diversos aspectos, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz o arroz. En diversos aspectos, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz. En diversos aspectos, el polipéptido WUS1 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. En diversos aspectos, el polipéptido WUS1 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 3. En diversos aspectos, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS2. En diversos aspectos, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En diversos aspectos, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz o arroz. En diversos aspectos, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz. En diversos aspectos, el polipéptido WUS2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6. En diversos aspectos, el polipéptido WUS2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 5. En diversos aspectos, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS3. En diversos aspectos, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz, sorgo, arroz o Setaria. En diversos aspectos, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz o arroz. En diversos aspectos, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz. En diversos aspectos, el polipéptido WUS3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8. En diversos aspectos, el polipéptido WUS3 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO:7. En diversos aspectos, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WOX5. En diversos aspectos, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5A. En diversos aspectos, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5 de maíz, sorgo, arroz o Setaria. En diversos aspectos, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5 de maíz o arroz. En diversos aspectos, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5 de maíz. En diversos aspectos, el polipéptido WOX5 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. En diversos aspectos, el polipéptido WOX5 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 13. En diversos aspectos, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido ODP2, BBM2, BMN2 o BMN3. En diversos aspectos, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido de monocotiledónea. En diversos aspectos, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz o arroz. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz. En diversos aspectos, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido de dicotiledónea. En diversos aspectos, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En diversos aspectos, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65 o 67. En diversos aspectos, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 17, 19, 21,62, 64, 66 o 68. En diversos aspectos, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido ODP2. En diversos aspectos, el polipéptido ODP2 es un polipéptido de monocotiledónea. En diversos aspectos, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz, arroz o Setaria sp. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz o arroz. En diversos aspectos, el ODP2 es un polipéptido de dicotiledónea. En diversos aspectos, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En diversos aspectos, el polipéptido ODP2 comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 63, 65 o 67. En diversos aspectos, el polipéptido ODP2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 17, 21, 62, 64, 66 o 68. En diversos aspectos, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido BBM2. En diversos aspectos, el polipéptido BBM2 es un polipéptido de monocotiledónea. En diversos aspectos, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz, caña de azúcar, arroz o Setaria sp. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz o arroz. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz. En diversos aspectos, el polipéptido BBM2 es un polipéptido de dicotiledónea. En diversos aspectos, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En diversos aspectos, el polipéptido BBM2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. En diversos aspectos, el polipéptido BBM2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 19. En diversos aspectos, el explante deriva de una monocotiledónea. En diversos aspectos, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En diversos aspectos, el explante deriva de una dicotiledónea. En diversos aspectos, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En diversos aspectos, la estructura vegetal regenerable se forma en aproximadamente 0 a aproximadamente 7 días de transformación de la célula o en aproximadamente 0 a aproximadamente 14 días de transformación de la célula y la planta transgénica se forma en aproximadamente 14 días de transformación de la célula a aproximadamente 60 días de transformación de la célula. En diversos aspectos, el método se realiza en ausencia de medio de enraizamiento. En diversos aspectos, el método se realiza en presencia de medio de enraizamiento. En diversos aspectos, el explante es un embrión inmaduro. En diversos aspectos, el embrión inmaduro es un embrión inmaduro de 1-5 mm. En diversos aspectos, el embrión inmaduro es un embrión inmaduro de 3,5-5 mm. En diversos aspectos, se usa citocinina exógena durante la germinación después de aproximadamente 7 días de transformación de la célula o después de aproximadamente 14 días de transformación de la célula. En diversos aspectos, la expresión de un polipéptido de (a) es transitoria. En diversos aspectos, se proporciona una semilla de la planta producida por el método.

En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona métodos para producir una planta transgénica, que comprenden (a) transformar una célula de un explante con una construcción de expresión que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; o (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o (iii) una combinación de las mismas; (b) permitir la expresión de un polipéptido de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo; y (c) germinar la estructura vegetal regenerable para formar la planta transgénica; en el que el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16; o en el que el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX está codificado por la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15; y en el que el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65 o 67; o en el que el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 está codificado por la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 17, 19, 21, 62, 64, 66 o 68. En diversos aspectos, la construcción de expresión comprende tanto la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX como la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2. En diversos aspectos, la construcción de expresión comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX. En diversos aspectos, la construcción de expresión comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2. En diversos aspectos, la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a AP2 se produce en menos de 1 día, menos de 2 días, menos de 5 días, menos de 7 días o menos de aproximadamente 14 días después del inicio de la transformación. En diversos aspectos, la construcción de expresión comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio. En diversos aspectos, la recombinasa específica de sitio es FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxbl, TP907-1 o U153. En diversos aspectos, la recombinasa específica de sitio es un polipéptido de fusión desestabilizado. En diversos aspectos, el polipéptido de fusión desestabilizado es TETR(L17G)~CRE o ESR(L17G)~CRE. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En diversos aspectos, el promotor inducible es GLB1, OLE, lTp2, HSP17.7, HSP26 o HSP18A. En diversos aspectos, el promotor inducible es un promotor inducible químicamente. En diversos aspectos, el promotor inducible químicamente es XVE. En diversos aspectos, el promotor inducible químicamente se reprime por TETR, ESR o CR, y la desrepresión se produce tras la adición de ligados relacionados con tetraciclina o de sulfonilurea. En diversos aspectos, el represor es TETR y el ligando relacionado con tetraciclina es doxiciclina o anhidrotetraciclina. En diversos aspectos, el represor es ESR y el ligando de sulfonilurea es etametsulfurón, clorsulfurón, metsulfurón-metilo, sulfometurón-metilo, clorimurón-etilo, nicosulfurón, primisulfurón, tribenurón, sulfosulfurón, trifloxisulfurón, foramsulfurón, yodosulfurón, prosulfurón, tifensulfurón, rimsulfurón, mesosulfurón o halosulfurón. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX está unida de forma funcional a un promotor constitutivo. En diversos aspectos, el promotor constitutivo es UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1.2 KB), IN2-2, NOS, la versión -135 de 35S o ZM-ADF PRO (ALT2). En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX está unida de forma funcional a un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 está unida de forma funcional a un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En diversos aspectos, el promotor regulado por el desarrollo es un promotor PLTP. En diversos aspectos, el promotor PLTP deriva de una monocotiledónea. En diversos aspectos, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz, sorgo o arroz. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz. En diversos aspectos, el promotor PLTP deriva de una dicotiledónea. En diversos aspectos, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En diversos aspectos, el promotor PLTP comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1-2 o 55-61. En diversos aspectos, el promotor PLTP comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1 o 2. En diversos aspectos, el promotor inducible es un promotor inducible por auxina. En diversos aspectos, el promotor inducible por auxina es AXIG1. En diversos aspectos, el promotor AXIG1 comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 39. En diversos aspectos, el promotor comprende un elemento de respuesta a auxina. En diversos aspectos, el promotor contiene uno o más motivos potenciadores de DR5. En diversos aspectos, el promotor es un promotor constitutivo débil modificado para represión y desrepresión. En diversos aspectos, una o más secuencias operadoras en el promotor se han colocado cerca de o solapando con la secuencia TATA y/o el sitio de inicio de la transcripción. En diversos aspectos, el promotor es NOS, AXIG1, ZM-GOS2, CC-UBI1-PRO o ZM-ADF4-PRO. En diversos aspectos, el promotor es un promotor DR5 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 40. En diversos aspectos, el promotor es un promotor desreprimible. En diversos aspectos, el promotor desreprimible es TETR, ESR o CR. En diversos aspectos, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es SEQ ID NO: 4. En diversos aspectos, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX está codificado por SEQ ID NO: 3. En diversos aspectos, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es SEQ ID NO:6. En diversos aspectos, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX está codificado por SEQ ID NO: 5. En diversos aspectos, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es SEQ ID NO:8. En diversos aspectos, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX está codificado por SEQ ID NO:7. En diversos aspectos, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es SEQ ID NO: 14. En diversos aspectos, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX está codificado por SEQ ID NO: 13. En diversos aspectos, el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 es SEQ ID NO: 20. En diversos aspectos, el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 está codificado por SEQ ID NO: 19. En diversos aspectos, el explante deriva de una monocotiledónea. En diversos aspectos, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En diversos aspectos, el explante deriva de una dicotiledónea. En diversos aspectos, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En diversos aspectos, la estructura vegetal regenerable se forma en aproximadamente 0 a aproximadamente 7 días de transformación de la célula o en aproximadamente 0 a aproximadamente 14 días de transformación de la célula y la planta transgénica se forma en aproximadamente 14 días de transformación de la célula a aproximadamente 60 días de transformación de la célula. En diversos aspectos, el método se realiza en ausencia de medio de enraizamiento. En diversos aspectos, el método se realiza en presencia de medio de enraizamiento. En diversos aspectos, el explante es un embrión inmaduro. En diversos aspectos, el embrión inmaduro es un embrión inmaduro de 1 -5 mm. En diversos aspectos, el embrión inmaduro es un embrión inmaduro de 3,5-5 mm. En diversos aspectos, se usa citocinina exógena durante la germinación después de aproximadamente 7 días de transformación de la célula o después de aproximadamente 14 días de transformación de la célula. En diversos aspectos, la expresión de un polipéptido de (a) es transitoria. En diversos aspectos, se proporciona una semilla de la planta producida por el método.

En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona métodos para producir una planta transgénica, que comprenden (a) transformar una célula de un explante con una construcción de expresión que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido WUS2; o (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido ODP2; o (iii) una combinación de las mismas; (b) permitir la expresión de un polipéptido de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo; y (c) germinar la estructura vegetal regenerable para formar la planta transgénica; en el que el polipéptido WUS2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; o en el que el polipéptido WUS2 está codificado por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3; y en el que el polipéptido ODP2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; o en el que el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 está codificado por la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 17 o 21. En diversos aspectos, la construcción de expresión comprende tanto la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX como la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2. En diversos aspectos, la construcción de expresión comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX. En diversos aspectos, la construcción de expresión comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2. En diversos aspectos, la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a AP2 se produce en menos de 1 día, menos de 2 días, menos de 5 días, menos de 7 días o menos de aproximadamente 14 días después del inicio de la transformación. En diversos aspectos, la germinación se realiza en presencia de citocinina exógena. En diversos aspectos, la construcción de expresión comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio. En diversos aspectos, la recombinasa específica de sitio es FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxbl, TP907-1 o U153. En diversos aspectos, la recombinasa específica de sitio es un polipéptido de fusión desestabilizado. En diversos aspectos, el polipéptido de fusión desestabilizado es TETR(L17G)~CRE o ESR(L17G)~CRE. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En diversos aspectos, el promotor inducible es GLB1, OLE, lTp2, HSP17.7, HSP26 o HSP18A. En diversos aspectos, el promotor inducible es un promotor inducible químicamente. En diversos aspectos, el promotor inducible químicamente es XVE. En diversos aspectos, el promotor inducible químicamente se reprime por TETR, ESR o CR, y la desrepresión se produce tras la adición de ligados relacionados con tetraciclina o de sulfonilurea. En diversos aspectos, el represor es TETR y el ligando relacionado con tetraciclina es doxiciclina o anhidrotetraciclina. En diversos aspectos, el represor es ESR y el ligando de sulfonilurea es etametsulfurón, clorsulfurón, metsulfurón-metilo, sulfometurón-metilo, clorimurón-etilo, nicosulfurón, primisulfurón, tribenurón, sulfosulfurón, trifloxisulfurón, foramsulfurón, yodosulfurón, prosulfurón, tifensulfurón, rimsulfurón, mesosulfurón o halosulfurón. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX está unida de forma funcional a un promotor constitutivo. En diversos aspectos, el promotor constitutivo es UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1.2 KB), IN2-2, NOS, la versión -135 de 35S o ZM-ADF PRO (ALT2). En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX está unida de forma funcional a un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 está unida de forma funcional a un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En diversos aspectos, el promotor regulado por el desarrollo es un promotor PLTP. En diversos aspectos, el promotor PLTP deriva de una monocotiledónea. En diversos aspectos, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz, sorgo o arroz. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz. En diversos aspectos, el promotor PLTP deriva de una dicotiledónea. En diversos aspectos, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En diversos aspectos, el promotor PLTP comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1-2 o 55-61. En diversos aspectos, el promotor PLTP comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1 o 2. En diversos aspectos, el promotor inducible es un promotor inducible por auxina. En diversos aspectos, el promotor inducible por auxina es AXIG1. En diversos aspectos, el promotor AXIG1 comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 39. En diversos aspectos, el promotor comprende un elemento de respuesta a auxina. En diversos aspectos, el promotor contiene uno o más motivos potenciadores de DR5. En diversos aspectos, el promotor es un promotor constitutivo débil modificado para represión y desrepresión. En diversos aspectos, una o más secuencias operadoras en el promotor se han colocado cerca de o solapando con la secuencia TATA y/o el sitio de inicio de la transcripción. En diversos aspectos, el promotor es NOS, AXIG1, ZM-GOS2, CC-UBI1-PRO o ZM-ADF4-PRO. En diversos aspectos, el promotor es un promotor DR5 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 40. En diversos aspectos, el promotor es un promotor desreprimible. En diversos aspectos, el promotor desreprimible es TETR, ESR o CR. En diversos aspectos, el explante deriva de una monocotiledónea. En diversos aspectos, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En diversos aspectos, el explante deriva de una dicotiledónea. En diversos aspectos, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En diversos aspectos, la estructura vegetal regenerable se forma en aproximadamente 0 a aproximadamente 7 días de transformación de la célula o en aproximadamente 0 a aproximadamente 14 días de transformación de la célula y la planta transgénica se forma en aproximadamente 14 días de transformación de la célula a aproximadamente 60 días de transformación de la célula. En diversos aspectos, el método se realiza en ausencia de medio de enraizamiento. En diversos aspectos, el método se realiza en presencia de medio de enraizamiento. En diversos aspectos, el explante es un embrión inmaduro. En diversos aspectos, el embrión inmaduro es un embrión inmaduro de 1-5 mm. En diversos aspectos, el embrión inmaduro es un embrión inmaduro de 3,5-5 mm. En diversos aspectos, se usa citocinina exógena durante la germinación después de aproximadamente 7 días de transformación de la célula o después de aproximadamente 14 días de transformación de la célula. En diversos aspectos, la expresión de un polipéptido de (a) es transitoria. En diversos aspectos, se proporciona una semilla de la planta producida por el método.

En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona métodos para producir una planta transgénica, que comprenden (a) transformar una célula de un explante con una construcción de expresión que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; y (b) permitir la expresión del polipéptido de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo; y (c) germinar la estructura vegetal regenerable para formar la planta transgénica. En diversos aspectos, la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX se produce en menos de 1 día, menos de 2 días, menos de 5 días, menos de 7 días o menos de aproximadamente 14 días después del inicio de la transformación. En diversos aspectos, la germinación se realiza en presencia de citocinina exógena. En diversos aspectos, la construcción de expresión comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio. En diversos aspectos, la recombinasa específica de sitio es FLP, Cre, s Sv 1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxbl, TP907-1 o U153. En diversos aspectos, la recombinasa específica de sitio es un polipéptido de fusión desestabilizado. En diversos aspectos, el polipéptido de fusión desestabilizado es TETR(L17G)~CRE o ESR(L17G)~CRE. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En diversos aspectos, el promotor inducible es GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26 o HSP18A. En diversos aspectos, el promotor inducible es un promotor inducible químicamente. En diversos aspectos, el promotor inducible químicamente es XVE. En diversos aspectos, el promotor inducible químicamente se reprime por TETR, ESR o CR, y la desrepresión se produce tras la adición de ligados relacionados con tetraciclina o de sulfonilurea. En diversos aspectos, el represor es TETR y el ligando relacionado con tetraciclina es doxiciclina o anhidrotetraciclina. En diversos aspectos, el represor es ESR y el ligando de sulfonilurea es etametsulfurón, clorsulfurón, metsulfurón-metilo, sulfometurón-metilo, clorimurón-etilo, nicosulfurón, primisulfurón, tribenurón, sulfosulfurón, trifloxisulfurón, foramsulfurón, yodosulfurón, prosulfurón, tifensulfurón, rimsulfurón, mesosulfurón o halosulfurón. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX está unida de forma funcional a un promotor constitutivo. En diversos aspectos, el promotor constitutivo es UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1.2 KB), IN2-2, NOS, la versión -135 de 35S o ZM-ADF PRO (ALT2). En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX está unida de forma funcional a un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En diversos aspectos, el promotor regulado por el desarrollo es un promotor PLTP. En diversos aspectos, el promotor PLTP deriva de una monocotiledónea. En diversos aspectos, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz, sorgo o arroz. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz. En diversos aspectos, el promotor PLTP deriva de una dicotiledónea. En diversos aspectos, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En diversos aspectos, el promotor PLTP comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1-2 o 55-61. En diversos aspectos, el promotor PLTP comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1 o 2. En diversos aspectos, el promotor inducible es un promotor inducible por auxina. En diversos aspectos, el promotor inducible por auxina es AXIG1. En diversos aspectos, el promotor AXIG1 comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 39. En diversos aspectos, el promotor comprende un elemento de respuesta a auxina. En diversos aspectos, el promotor contiene uno o más motivos potenciadores de DR5. En diversos aspectos, el promotor es un promotor constitutivo débil modificado para represión y desrepresión. En diversos aspectos, una o más secuencias operadoras en el promotor se han colocado cerca de o solapando con la secuencia TATA y/o el sitio de inicio de la transcripción. En diversos aspectos, el promotor es NOS, AXIG1, ZM-GOS2, CC-UBI1-PRO o ZM-ADF4-PRO. En diversos aspectos, el promotor es un promotor DR5 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 40. En diversos aspectos, el promotor es un promotor desreprimible. En diversos aspectos, el promotor desreprimible es TETR, ESR o CR. En diversos aspectos, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 o WOX9. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un nucleótido de monocotiledónea. En diversos aspectos, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un nucleótido de dicotiledónea. En diversos aspectos, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX codifica una secuencia de aminoácidos que comprende una cualquiera de SEQ ID NO:4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX comprende una cualquiera de SEQ ID NO:3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15. En diversos aspectos, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS1. En diversos aspectos, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En diversos aspectos, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz o arroz. En diversos aspectos, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz. En diversos aspectos, el polipéptido WUS1 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. En diversos aspectos, el polipéptido WUS1 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 3. En diversos aspectos, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS2. En diversos aspectos, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En diversos aspectos, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz o arroz. En diversos aspectos, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz. En diversos aspectos, el polipéptido WUS2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6. En diversos aspectos, el polipéptido WUS2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 5. En diversos aspectos, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS3. En diversos aspectos, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz, sorgo, arroz o Setaria. En diversos aspectos, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz o arroz. En diversos aspectos, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz. En diversos aspectos, el polipéptido WUS3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8. En diversos aspectos, el polipéptido WUS3 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO:7. En diversos aspectos, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WOX5. En diversos aspectos, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5A. En diversos aspectos, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5 de maíz, sorgo, arroz o Setaria. En diversos aspectos, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5 de maíz o arroz. En diversos aspectos, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5 de maíz. En diversos aspectos, el polipéptido WOX5 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. En diversos aspectos, el polipéptido WOX5 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 13. En diversos aspectos, el explante deriva de una monocotiledónea. En diversos aspectos, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En diversos aspectos, el explante deriva de una dicotiledónea. En diversos aspectos, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En diversos aspectos, la estructura vegetal regenerable se forma en aproximadamente 0 a aproximadamente 7 días de transformación de la célula o en aproximadamente 0 a aproximadamente 14 días de transformación de la célula y la planta transgénica se forma en aproximadamente 14 días de transformación de la célula a aproximadamente 60 días de transformación de la célula. En diversos aspectos, el método se realiza en ausencia de medio de enraizamiento. En diversos aspectos, el método se realiza en presencia de medio de enraizamiento. En diversos aspectos, el explante es un embrión inmaduro. En diversos aspectos, el embrión inmaduro es un embrión inmaduro de 1 -5 mm. En diversos aspectos, el embrión inmaduro es un embrión inmaduro de 3,5-5 mm. En diversos aspectos, se usa citocinina exógena durante la germinación después de aproximadamente 7 días de transformación de la célula o después de aproximadamente 14 días de transformación de la célula. En diversos aspectos, la expresión de un polipéptido de (a) es transitoria. En diversos aspectos, se proporciona una semilla de la planta producida por el método.

En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona métodos para producir una planta transgénica, que comprenden (a) transformar una célula de un explante con una construcción de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; y (b) permitir la expresión del polipéptido de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo; y (c) germinar la estructura vegetal regenerable para formar la planta transgénica. En diversos aspectos, la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a AP2 se produce en menos de 1 día, menos de 2 días, menos de 5 días, menos de 7 días o menos de aproximadamente 14 días después del inicio de la transformación. En diversos aspectos, la construcción de expresión comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio. En diversos aspectos, la germinación se realiza en presencia de citocinina exógena. En diversos aspectos, la recombinasa específica de sitio es FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxbl, TP907-1 o U153. En diversos aspectos, la recombinasa específica de sitio es un polipéptido de fusión desestabilizado. En diversos aspectos, el polipéptido de fusión desestabilizado es TETR(L17G)~CRE o ESR(L17G)~CRE. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En diversos aspectos, el promotor inducible es GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26 o HSP18A. En diversos aspectos, el promotor inducible es un promotor inducible químicamente. En diversos aspectos, el promotor inducible químicamente es XVE. En diversos aspectos, el promotor inducible químicamente se reprime por TETR, ESR o CR, y la desrepresión se produce tras la adición de ligados relacionados con tetraciclina o de sulfonilurea. En diversos aspectos, el represor es TETR y el ligando relacionado con tetraciclina es doxiciclina o anhidrotetraciclina. En diversos aspectos, el represor es ESR y el ligando de sulfonilurea es etametsulfurón, clorsulfurón, metsulfurón-metilo, sulfometurón-metilo, clorimurón-etilo, nicosulfurón, primisulfurón, tribenurón, sulfosulfurón, trifloxisulfurón, foramsulfurón, yodosulfurón, prosulfurón, tifensulfurón, rimsulfurón, mesosulfurón o halosulfurón. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 está unida de forma funcional a un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En diversos aspectos, el promotor regulado por el desarrollo es un promotor PLTP. En diversos aspectos, el promotor PLTP deriva de una monocotiledónea. En diversos aspectos, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz, sorgo o arroz. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz. En diversos aspectos, el promotor PLTP deriva de una dicotiledónea. En diversos aspectos, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En diversos aspectos, el promotor PLTP comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1-2 o 55-61. En diversos aspectos, el promotor PLTP comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1 o 2. En diversos aspectos, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido ODP2, BBM2, BMN2 o BMN3. En diversos aspectos, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido de monocotiledónea. En diversos aspectos, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz o arroz. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz. En diversos aspectos, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido de dicotiledónea. En diversos aspectos, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En diversos aspectos, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65 o 67. En diversos aspectos, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 17, 19, 21, 62, 64, 66 o 68. En diversos aspectos, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido ODP2. En diversos aspectos, el polipéptido ODP2 es un polipéptido de monocotiledónea. En diversos aspectos, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz, arroz o Setaria sp. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz o arroz. En diversos aspectos, el ODP2 es un polipéptido de dicotiledónea. En diversos aspectos, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En diversos aspectos, el polipéptido ODP2 comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 63, 65 o 67. En diversos aspectos, el polipéptido ODP2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 17, 21,62, 64, 66 o 68. En diversos aspectos, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido BBM2. En diversos aspectos, el polipéptido BBM2 es un polipéptido de monocotiledónea. En diversos aspectos, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz, caña de azúcar, arroz o Setaria sp. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz o arroz. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz. En diversos aspectos, el polipéptido BBM2 es un polipéptido de dicotiledónea. En diversos aspectos, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En diversos aspectos, el polipéptido BBM2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. En diversos aspectos, el polipéptido BBM2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 19. En diversos aspectos, el explante deriva de una monocotiledónea. En diversos aspectos, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En diversos aspectos, el explante deriva de una dicotiledónea. En diversos aspectos, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En diversos aspectos, la estructura vegetal regenerable se forma en aproximadamente 0 a aproximadamente 7 días de transformación de la célula o en aproximadamente 0 a aproximadamente 14 días de transformación de la célula y la planta transgénica se forma en aproximadamente 14 días de transformación de la célula a aproximadamente 60 días de transformación de la célula. En diversos aspectos, el método se realiza en ausencia de medio de enraizamiento. En diversos aspectos, el método se realiza en presencia de medio de enraizamiento. En diversos aspectos, el explante es un embrión inmaduro. En diversos aspectos, el embrión inmaduro es un embrión inmaduro de 1-5 mm. En diversos aspectos, el embrión inmaduro es un embrión inmaduro de 3,5-5 mm. En diversos aspectos, se usa citocinina exógena durante la germinación después de aproximadamente 7 días de transformación de la célula o después de aproximadamente 14 días de transformación de la célula. En diversos aspectos, la expresión de un polipéptido de (a) es transitoria. En diversos aspectos, se proporciona una semilla de la planta producida por el método.

En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona métodos para producir una planta transgénica, que comprenden (a) transformar una célula de un explante con una construcción de expresión que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; (b) permitir la expresión del polipéptido de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo; y (c) germinar la estructura vegetal regenerable para formar la planta transgénica. En un aspecto, la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a AP2 se produce en menos de 1 día, menos de 2 días, menos de 5 días, menos de 7 días o menos de aproximadamente 14 días después del inicio de la transformación. En diversos aspectos, la germinación se realiza en presencia de citocinina exógena. En diversos aspectos, la construcción de expresión comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio. En diversos aspectos, la recombinasa específica de sitio es FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxbl, TP907-1 o U153. En diversos aspectos, la recombinasa específica de sitio es un polipéptido de fusión desestabilizado. En diversos aspectos, el polipéptido de fusión desestabilizado es TETR(L17G)~CRE o ESR(L17G)~CRE. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En diversos aspectos, el promotor inducible es GLB1, o Le , Lt P2, HSP17.7, HSP26 o HSP18A. En diversos aspectos, el promotor inducible es un promotor inducible químicamente. En diversos aspectos, el promotor inducible químicamente es XVE. En diversos aspectos, el promotor inducible químicamente se reprime por TETR, ESR o CR, y la desrepresión se produce tras la adición de ligados relacionados con tetraciclina o de sulfonilurea. En diversos aspectos, el represor es TETR y el ligando relacionado con tetraciclina es doxiciclina o anhidrotetraciclina. En diversos aspectos, el represor es ESR y el ligando de sulfonilurea es etametsulfurón, clorsulfurón, metsulfurón-metilo, sulfometurón-metilo, clorimurón-etilo, nicosulfurón, primisulfurón, tribenurón, sulfosulfurón, trifloxisulfurón, foramsulfurón, yodosulfurón, prosulfurón, tifensulfurón, rimsulfurón, mesosulfurón o halosulfurón. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX está unida de forma funcional a un promotor constitutivo. En diversos aspectos, el promotor constitutivo es UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1.2 KB), IN2-2, NOS, la versión -135 de 35S o ZM-ADF PRO (ALT2). En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX está unida de forma funcional a un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 está unida de forma funcional a un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En diversos aspectos, el promotor regulado por el desarrollo es un promotor PLTP. En diversos aspectos, el promotor PLTP deriva de una monocotiledónea. En diversos aspectos, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz, sorgo o arroz. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz. En diversos aspectos, el promotor PLTP deriva de una dicotiledónea. En diversos aspectos, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En diversos aspectos, el promotor PLTP comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1-2 o 55-61. En diversos aspectos, el promotor PLTP comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1 o 2. En diversos aspectos, el promotor inducible es un promotor inducible por auxina. En diversos aspectos, el promotor inducible por auxina es AXIG1. En diversos aspectos, el promotor AXIG1 comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 39. En diversos aspectos, el promotor comprende un elemento de respuesta a auxina. En diversos aspectos, el promotor contiene uno o más motivos potenciadores de DR5. En diversos aspectos, el promotor es un promotor constitutivo débil modificado para represión y desrepresión. En diversos aspectos, una o más secuencias operadoras en el promotor se han colocado cerca de o solapando con la secuencia TATA y/o el sitio de inicio de la transcripción. En diversos aspectos, el promotor es NOS, AXIG1, ZM-GOS2, CC-UBI1-p Ro o ZM-ADF4-PRO. En diversos aspectos, el promotor es un promotor DR5 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 40. En diversos aspectos, el promotor es un promotor desreprimible. En diversos aspectos, el promotor desreprimible es TETR, ESR o CR. En diversos aspectos, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 o WOX9. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un nucleótido de monocotiledónea. En diversos aspectos, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un nucleótido de dicotiledónea. En diversos aspectos, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX codifica una secuencia de aminoácidos que comprende una cualquiera de SEQ ID NO:4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX comprende una cualquiera de SEQ ID NO:3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15. En diversos aspectos, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS1. En diversos aspectos, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En diversos aspectos, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz o arroz. En diversos aspectos, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz. En diversos aspectos, el polipéptido WUS1 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. En diversos aspectos, el polipéptido WUS1 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 3. En diversos aspectos, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS2. En diversos aspectos, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En diversos aspectos, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz o arroz. En diversos aspectos, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz. En diversos aspectos, el polipéptido WUS2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6. En diversos aspectos, el polipéptido WUS2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 5. En diversos aspectos, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS3. En diversos aspectos, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz, sorgo, arroz o Setaria. En diversos aspectos, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz o arroz. En diversos aspectos, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz. En diversos aspectos, el polipéptido WUS3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8. En diversos aspectos, el polipéptido WUS3 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO:7. En diversos aspectos, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WOX5. En diversos aspectos, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5A. En diversos aspectos, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5 de maíz, sorgo, arroz o Setaria. En diversos aspectos, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5 de maíz o arroz. En diversos aspectos, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5 de maíz. En diversos aspectos, el polipéptido WOX5 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. En diversos aspectos, el polipéptido WOX5 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 13. En diversos aspectos, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido ODP2, BBM2, BMN2 o BMN3. En diversos aspectos, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido de monocotiledónea. En diversos aspectos, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz o arroz. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz. En diversos aspectos, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido de dicotiledónea. En diversos aspectos, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En diversos aspectos, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65 o 67. En diversos aspectos, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 17, 19, 21,62, 64, 66 o 68. En diversos aspectos, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido ODP2. En diversos aspectos, el polipéptido ODP2 es un polipéptido de monocotiledónea. En diversos aspectos, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz, arroz o Setaria sp. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz o arroz. En diversos aspectos, el ODP2 es un polipéptido de dicotiledónea. En diversos aspectos, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En diversos aspectos, el polipéptido ODP2 comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 63, 65 o 67. En diversos aspectos, el polipéptido ODP2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 17, 21, 62, 64, 66 o 68. En diversos aspectos, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido BBM2. En diversos aspectos, el polipéptido BBM2 es un polipéptido de monocotiledónea. En diversos aspectos, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz, caña de azúcar, arroz o Setaria sp. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz o arroz. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz. En diversos aspectos, el polipéptido BBM2 es un polipéptido de dicotiledónea. En diversos aspectos, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En diversos aspectos, el polipéptido BBM2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. En diversos aspectos, el polipéptido BBM2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 19. En diversos aspectos, el explante deriva de una monocotiledónea. En diversos aspectos, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En diversos aspectos, el explante deriva de una dicotiledónea. En diversos aspectos, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En diversos aspectos, la estructura vegetal regenerable se forma en aproximadamente 0 a aproximadamente 7 días de transformación de la célula o en aproximadamente 0 a aproximadamente 14 días de transformación de la célula y la planta transgénica se forma en aproximadamente 14 días de transformación de la célula a aproximadamente 60 días de transformación de la célula. En diversos aspectos, el método se realiza en ausencia de medio de enraizamiento. En diversos aspectos, el método se realiza en presencia de medio de enraizamiento. En diversos aspectos, el explante es un embrión inmaduro. En diversos aspectos, el embrión inmaduro es un embrión inmaduro de 1 -5 mm. En diversos aspectos, el embrión inmaduro es un embrión inmaduro de 3,5-5 mm. En diversos aspectos, se usa citocinina exógena durante la germinación después de aproximadamente 7 días de transformación de la célula o después de aproximadamente 14 días de transformación de la célula. En diversos aspectos, la expresión de un polipéptido de (a) es transitoria. En diversos aspectos, se proporciona una semilla de la planta producida por el método.

En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona métodos para producir una planta transgénica, que comprenden (a) transformar una célula de un explante con una construcción de expresión que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; o (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o (iii) una combinación de (i) y (ii); y (b) permitir la expresión del polipéptido de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo; y (c) germinar la estructura vegetal regenerable de (b) para formar la planta transgénica en aproximadamente 14 días a aproximadamente 60 días. En diversos aspectos, la construcción de expresión comprende tanto la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX como la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2. En diversos aspectos, la construcción de expresión comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX. En diversos aspectos, la construcción de expresión comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2. En diversos aspectos, la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a AP2 se produce en menos de 1 día, menos de 2 días, menos de 5 días, menos de 7 días o menos de aproximadamente 14 días después del inicio de la transformación. En diversos aspectos, la germinación se realiza en presencia de citocinina exógena. En diversos aspectos, la construcción de expresión comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio. En diversos aspectos, la recombinasa específica de sitio es FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxbl, TP907-1 o U153. En diversos aspectos, la recombinasa específica de sitio es un polipéptido de fusión desestabilizado. En diversos aspectos, el polipéptido de fusión desestabilizado es TETR(L17G)~CRE o ESR(L17G)~CRE. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En diversos aspectos, el promotor inducible es GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26 o HSP18A. En diversos aspectos, el promotor inducible es un promotor inducible químicamente. En diversos aspectos, el promotor inducible químicamente es XVE. En diversos aspectos, el promotor inducible químicamente se reprime por TETR, ESR o CR, y la desrepresión se produce tras la adición de ligados relacionados con tetraciclina o de sulfonilurea. En diversos aspectos, el represor es TETR y el ligando relacionado con tetraciclina es doxiciclina o anhidrotetraciclina. En diversos aspectos, el represor es ESR y el ligando de sulfonilurea es etametsulfurón, clorsulfurón, metsulfurón-metilo, sulfometurón-metilo, clorimurón-etilo, nicosulfurón, primisulfurón, tribenurón, sulfosulfurón, trifloxisulfurón, foramsulfurón, yodosulfurón, prosulfurón, tifensulfurón, rimsulfurón, mesosulfurón o halosulfurón. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX está unida de forma funcional a un promotor constitutivo. En diversos aspectos, el promotor constitutivo es UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1.2 KB), IN2-2, NOS, la versión -135 de 35S o ZM-ADF PRO (ALT2). En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX está unida de forma funcional a un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 está unida de forma funcional a un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En diversos aspectos, el promotor regulado por el desarrollo es un promotor PLTP. En diversos aspectos, el promotor PLTP deriva de una monocotiledónea. En diversos aspectos, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz, sorgo o arroz. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz. En diversos aspectos, el promotor PLTP deriva de una dicotiledónea. En diversos aspectos, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En diversos aspectos, el promotor PLTP comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1-2 o 55-61. En diversos aspectos, el promotor PLTP comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1 o 2. En diversos aspectos, el promotor inducible es un promotor inducible por auxina. En diversos aspectos, el promotor inducible por auxina es AXIG1. En diversos aspectos, el promotor AXIG1 comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 39. En diversos aspectos, el promotor comprende un elemento de respuesta a auxina. En diversos aspectos, el promotor contiene uno o más motivos potenciadores de DR5. En diversos aspectos, el promotor es un promotor constitutivo débil modificado para represión y desrepresión. En diversos aspectos, una o más secuencias operadoras en el promotor se han colocado cerca de o solapando con la secuencia TATA y/o el sitio de inicio de la transcripción. En diversos aspectos, el promotor es NOS, AXIG1, ZM-GOS2, CC-UBI1-p Ro o ZM-ADF4-PRO. En diversos aspectos, el promotor es un promotor DR5 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 40. En diversos aspectos, el promotor es un promotor desreprimible. En diversos aspectos, el promotor desreprimible es TETR, ESR o CR. En diversos aspectos, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 o WOX9. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un nucleótido de monocotiledónea. En diversos aspectos, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un nucleótido de dicotiledónea. En diversos aspectos, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX codifica una secuencia de aminoácidos que comprende una cualquiera de SEQ ID NO:4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX comprende una cualquiera de SEQ ID NO:3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15. En diversos aspectos, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS1. En diversos aspectos, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En diversos aspectos, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz o arroz. En diversos aspectos, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz. En diversos aspectos, el polipéptido WUS1 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. En diversos aspectos, el polipéptido WUS1 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 3. En diversos aspectos, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS2. En diversos aspectos, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En diversos aspectos, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz o arroz. En diversos aspectos, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz. En diversos aspectos, el polipéptido WUS2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6. En diversos aspectos, el polipéptido WUS2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 5. En diversos aspectos, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS3. En diversos aspectos, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz, sorgo, arroz o Setaria. En diversos aspectos, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz o arroz. En diversos aspectos, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz. En diversos aspectos, el polipéptido WUS3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8. En diversos aspectos, el polipéptido WUS3 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO:7. En diversos aspectos, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WOX5. En diversos aspectos, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5A. En diversos aspectos, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5 de maíz, sorgo, arroz o Setaria. En diversos aspectos, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5 de maíz o arroz. En diversos aspectos, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5 de maíz. En diversos aspectos, el polipéptido WOX5 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. En diversos aspectos, el polipéptido WOX5 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 13. En diversos aspectos, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido ODP2, BBM2, BMN2 o BMN3. En diversos aspectos, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido de monocotiledónea. En diversos aspectos, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz o arroz. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz. En diversos aspectos, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido de dicotiledónea. En diversos aspectos, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En diversos aspectos, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65 o 67. En diversos aspectos, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 17, 19, 21,62, 64, 66 o 68. En diversos aspectos, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido ODP2. En diversos aspectos, el polipéptido ODP2 es un polipéptido de monocotiledónea. En diversos aspectos, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz, arroz o Setaria sp. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz o arroz. En diversos aspectos, el ODP2 es un polipéptido de dicotiledónea. En diversos aspectos, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En diversos aspectos, el polipéptido ODP2 comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 63, 65 o 67. En diversos aspectos, el polipéptido ODP2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 17, 21, 62, 64, 66 o 68. En diversos aspectos, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido BBM2. En diversos aspectos, el polipéptido BBM2 es un polipéptido de monocotiledónea. En diversos aspectos, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz, caña de azúcar, arroz o Setaria sp. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz o arroz. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz. En diversos aspectos, el polipéptido BBM2 es un polipéptido de dicotiledónea. En diversos aspectos, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En diversos aspectos, el polipéptido BBM2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. En diversos aspectos, el polipéptido BBM2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 19. En diversos aspectos, el explante deriva de una monocotiledónea. En diversos aspectos, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En diversos aspectos, el explante deriva de una dicotiledónea. En diversos aspectos, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En diversos aspectos, la estructura vegetal regenerable se forma en aproximadamente 0 a aproximadamente 7 días de transformación de la célula o en aproximadamente 0 a aproximadamente 14 días de transformación de la célula. En diversos aspectos, el método se realiza en ausencia de medio de enraizamiento. En diversos aspectos, el método se realiza en presencia de medio de enraizamiento. En diversos aspectos, el explante es un embrión inmaduro. En diversos aspectos, el embrión inmaduro es un embrión inmaduro de 1-5 mm. En diversos aspectos, el embrión inmaduro es un embrión inmaduro de 3,5-5 mm. En diversos aspectos, se usa citocinina exógena durante la germinación después de aproximadamente 7 días de transformación de la célula o después de aproximadamente 14 días de transformación de la célula. En diversos aspectos, la expresión de un polipéptido de (a) es transitoria. En diversos aspectos, se proporciona una semilla de la planta producida por el método.

En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona métodos para producir una planta transgénica, que comprenden (a) transformar una célula de un explante con una construcción de expresión que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; o (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o (iii) una combinación de (i) y (ii); y (b) permitir la expresión del polipéptido de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo, y en la que la estructura vegetal regenerable se forma en aproximadamente 0-7 días o aproximadamente 0-14 días de transformación de la célula; y (c) germinar la estructura vegetal regenerable de (b) para formar la planta transgénica en aproximadamente 14 días a aproximadamente 60 días. En diversos aspectos, la construcción de expresión comprende tanto la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX como la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2. En diversos aspectos, la construcción de expresión comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX. En diversos aspectos, la construcción de expresión comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2. En diversos aspectos, la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a AP2 se produce en menos de 1 día, menos de 2 días, menos de 5 días, menos de 7 días o menos de aproximadamente 14 días después del inicio de la transformación. En diversos aspectos, la germinación se realiza en presencia de citocinina exógena. En diversos aspectos, la construcción de expresión comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio. En diversos aspectos, la recombinasa específica de sitio es FLP, Cre, s Sv 1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxbl, TP907-1 o U153. En diversos aspectos, la recombinasa específica de sitio es un polipéptido de fusión desestabilizado. En diversos aspectos, el polipéptido de fusión desestabilizado es TETR(L17G)~CRE o ESR(L17G)~CRE. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En diversos aspectos, el promotor inducible es GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26 o HSP18A. En diversos aspectos, el promotor inducible es un promotor inducible químicamente. En diversos aspectos, el promotor inducible químicamente es XVE. En diversos aspectos, el promotor inducible químicamente se reprime por TETR, ESR o CR, y la desrepresión se produce tras la adición de ligados relacionados con tetraciclina o de sulfonilurea. En diversos aspectos, el represor es TETR y el ligando relacionado con tetraciclina es doxiciclina o anhidrotetraciclina. En diversos aspectos, el represor es ESR y el ligando de sulfonilurea es etametsulfurón, clorsulfurón, metsulfurón-metilo, sulfometurón-metilo, clorimurón-etilo, nicosulfurón, primisulfurón, tribenurón, sulfosulfurón, trifloxisulfurón, foramsulfurón, yodosulfurón, prosulfurón, tifensulfurón, rimsulfurón, mesosulfurón o halosulfurón. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX está unida de forma funcional a un promotor constitutivo. En diversos aspectos, el promotor constitutivo es UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1.2 KB), IN2-2, NOS, la versión -135 de 35S o ZM-ADF PRO (ALT2). En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX está unida de forma funcional a un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 está unida de forma funcional a un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. En diversos aspectos, el promotor regulado por el desarrollo es un promotor PLTP. En diversos aspectos, el promotor PLTP deriva de una monocotiledónea. En diversos aspectos, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz, sorgo o arroz. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz. En diversos aspectos, el promotor PLTP deriva de una dicotiledónea. En diversos aspectos, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En diversos aspectos, el promotor PLTP comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1-2 o 55-61. En diversos aspectos, el promotor PLTP comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1 o 2. En diversos aspectos, el promotor inducible es un promotor inducible por auxina. En diversos aspectos, el promotor inducible por auxina es AXIG1. En diversos aspectos, el promotor AXIG1 comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 39. En diversos aspectos, el promotor comprende un elemento de respuesta a auxina. En diversos aspectos, el promotor contiene uno o más motivos potenciadores de DR5. En diversos aspectos, el promotor es un promotor constitutivo débil modificado para represión y desrepresión. En diversos aspectos, una o más secuencias operadoras en el promotor se han colocado cerca de o solapando con la secuencia TATA y/o el sitio de inicio de la transcripción. En diversos aspectos, el promotor es NOS, AXIG1, ZM-GOS2, CC-UBI1-PRO o ZM-ADF4-PRO. En diversos aspectos, el promotor es un promotor DR5 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 40. En diversos aspectos, el promotor es un promotor desreprimible. En diversos aspectos, el promotor desreprimible es TETR, ESR o CR. En diversos aspectos, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 o WOX9. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un nucleótido de monocotiledónea. En diversos aspectos, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un nucleótido de dicotiledónea. En diversos aspectos, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX codifica una secuencia de aminoácidos que comprende una cualquiera de SEQ ID NO:4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX comprende una cualquiera de SEQ ID NO:3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15. En diversos aspectos, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS1. En diversos aspectos, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En diversos aspectos, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz o arroz. En diversos aspectos, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz. En diversos aspectos, el polipéptido WUS1 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. En diversos aspectos, el polipéptido WUS1 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 3. En diversos aspectos, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS2. En diversos aspectos, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En diversos aspectos, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz o arroz. En diversos aspectos, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz. En diversos aspectos, el polipéptido WUS2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6. En diversos aspectos, el polipéptido WUS2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 5. En diversos aspectos, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS3. En diversos aspectos, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz, sorgo, arroz o Setaria. En diversos aspectos, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz o arroz. En diversos aspectos, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz. En diversos aspectos, el polipéptido WUS3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8. En diversos aspectos, el polipéptido WUS3 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO:7. En diversos aspectos, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WOX5. En diversos aspectos, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5A. En diversos aspectos, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5 de maíz, sorgo, arroz o Setaria. En diversos aspectos, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5 de maíz o arroz. En diversos aspectos, el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5 de maíz. En diversos aspectos, el polipéptido WOX5 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. En diversos aspectos, el polipéptido WOX5 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 13. En diversos aspectos, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido ODP2, BBM2, BMN2 o BMN3. En diversos aspectos, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido de monocotiledónea. En diversos aspectos, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz o arroz. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz. En diversos aspectos, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido de dicotiledónea. En diversos aspectos, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En diversos aspectos, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65 o 67. En diversos aspectos, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 17, 19, 21,62, 64, 66 o 68. En diversos aspectos, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido ODP2. En diversos aspectos, el polipéptido ODP2 es un polipéptido de monocotiledónea. En diversos aspectos, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz, arroz o Setaria sp. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz o arroz. En diversos aspectos, el ODP2 es un polipéptido de dicotiledónea. En diversos aspectos, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En diversos aspectos, el polipéptido ODP2 comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 63, 65 o 67. En diversos aspectos, el polipéptido ODP2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 17, 21, 62, 64, 66 o 68. En diversos aspectos, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido BBM2. En diversos aspectos, el polipéptido BBM2 es un polipéptido de monocotiledónea. En diversos aspectos, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz, caña de azúcar, arroz o Setaria sp. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz o arroz. En diversos aspectos, la monocotiledónea es maíz. En diversos aspectos, el polipéptido BBM2 es un polipéptido de dicotiledónea. En diversos aspectos, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En diversos aspectos, el polipéptido BBM2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. En diversos aspectos, el polipéptido BBM2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 19. En diversos aspectos, el explante deriva de una monocotiledónea. En diversos aspectos, la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En diversos aspectos, el explante deriva de una dicotiledónea. En diversos aspectos, la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En diversos aspectos, el método se realiza en ausencia de medio de enraizamiento. En diversos aspectos, el método se realiza en presencia de medio de enraizamiento. En diversos aspectos, el explante es un embrión inmaduro. En diversos aspectos, el embrión inmaduro es un embrión inmaduro de 1 -5 mm. En diversos aspectos, el embrión inmaduro es un embrión inmaduro de 3,5-5 mm. En diversos aspectos, se usa citocinina exógena durante la germinación después de aproximadamente 7 días de transformación de la célula o después de aproximadamente 14 días de transformación de la célula. En diversos aspectos, la expresión de un polipéptido de (a) es transitoria. En diversos aspectos, se proporciona una semilla de la planta producida por el método.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona además kits que comprenden (a) una construcción de expresión que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; o (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o (iii) una combinación de (i) y (ii); y (b) instrucciones para obtener una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo. En diversos aspectos, el kit proporciona instrucciones para obtener una planta transformada en aproximadamente 14 días a aproximadamente 60 días. En diversos aspectos, el kit proporciona instrucciones para obtener una planta a partir de un explante transformado usando el kit.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona además kits que comprenden (a) una construcción de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; y (b) instrucciones para obtener una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo. En diversos aspectos, el kit proporciona instrucciones para obtener una planta transformada en aproximadamente 14 días a aproximadamente 60 días. En diversos aspectos, el kit proporciona instrucciones para obtener una planta a partir de un explante transformado usando el kit.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona además kits que comprenden (a) una construcción de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o (iii) una combinación de (i) y (ii); y (b) instrucciones para obtener una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo. En diversos aspectos, el kit proporciona instrucciones para obtener una planta transformada en aproximadamente 14 días a aproximadamente 60 días. En diversos aspectos, el kit proporciona instrucciones para obtener una planta a partir de un explante transformado usando el kit.

En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona una semilla de la planta producir a partir de los métodos divulgados en este documento.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra una imagen representativa de un embrión inmaduro tratado usando los métodos divulgados (véase el ejemplo 5). Las flechas indican embriones recién formados representativos sobre la superficie después del tratamiento.

La figura 2 muestra una imagen representativa de un embrión inmaduro tratado usando los métodos divulgados (véase el ejemplo 5). La imagen muestra embriones fluorescentes sobre la superficie después del tratamiento.

La figura 3 muestra una imagen representativa de múltiples embriones somáticos maduros derivados de un solo embrión inmaduro cigótico original obtenido usando los métodos divulgados (véase el ejemplo 7) después de crecimiento sobre medio de maduración durante 13 días.

La figura 4 muestra una imagen representativa de plantas obtenidas de 45 embriones inmaduros cigóticos originalmente transformados usando los métodos divulgados (véase el ejemplo 7).

La figura 5 muestra brotes de germinación temprana derivados de embriones somáticos formados rápidamente dos semanas después de infección con Agrobacterium de embriones inmaduros de la variedad de trigo Pioneer elite Spring HC0456D.

La figura 6 muestra una imagen representativa de divisiones anticlinales tempranas sobre la superficie del escutelo (flechas) de un embrión cigótico inmaduro dos días después de transfección de Agrobacterium.

La figura 7 muestra una imagen representativa de un embrión somático globular pequeño que se forma sobre la superficie del escutelo a partir de un embrión cigótico inmaduro transfectado dos días después de transfección de Agrobacterium.

La figura 8 muestra una imagen representativa de un embrión somático globular más grande que se forma sobre la superficie del escutelo a partir del embrión cigótico inmaduro transfectado dos días después de transfección de Agrobacterium.

La figura 9 muestra una imagen representativa de un embrión somático en fase de transición que se formó sobre la superficie del escutelo a partir del embrión cigótico inmaduro transfectado cuatro días después de transfección de Agrobacterium, que muestra la superficie lisa del embrión somático y la ausencia de conexiones vasculares con el embrión cigótico subyacente.

La figura 10 muestra una imagen representativa de múltiples embriones somáticos en fase de transición que se han formado sobre la superficie del escutelo a partir de los embriones cigóticos inmaduros transfectados cuatro días después de transfección de Agrobacterium, lo que demuestra que embriones somáticos en cercana proximidad derivaron de la superficie del embrión cigótico subyacente y no a través de embriogénesis somática secundaria.

La figura 11 muestra una imagen de mayor aumento representativa que demuestra el alto índice mitótico dentro de los embriones somáticos en desarrollo, como se indica por las estructuras de metafase y anafase observadas en múltiples células dentro del campo de visión (que se indica por las flechas).

La figura 12 muestra un embrión inmaduro de maíz 10 días después de transformarse con un ADN T que contiene AXIG1 PRO::WUS2 con PLTP PRO::BBM. Se observan numerosos embriones somáticos, de los que algunos se han fusionado juntos según se desarrollaban, y una hoja de desarrollo temprano, que crecen desde la superficie del escutelo. Después de tinción durante 20 minutos con Oil Red O, y lavado dos veces en isoproponol al 70 %, los lípidos que se acumulaban durante el desarrollo del embrión somático se tiñeron de rojo (flechas negras), mientras que la hoja en desarrollo (marcada con una flecha blanca) y el escutelo cigótico transformado originalmente (marcado con una flecha blanca) acumulaban muy poco tinte, lo que indica el menos nivel típico de depósito de lípidos en estos tejidos.

La figura 13 muestra una micrografía óptica de células de embrión somático después de que el embrión se haya presionado entre un cubreobjetos y un portaobjetos y después se haya teñido con Oil Red O. Se observaron claramente gotas de lípido que se tiñen de rojo (ejemplificadas por las flechas negras) dispersadas dentro de las células.

La figura 14 muestra la cuantificación de transcrito Illumina para un gen EF1A de soja expresado constitutivamente representativo que se está expresando en todos los tejidos vegetales muestreados.

La figura 15 muestra la cuantificación de transcrito Illumina para el gen LTP3 específico de embrión/semilla, siendo indicativos los niveles de transcrito respectivos de la actividad promotora en diversos órganos vegetales y diferentes fases del desarrollo.

La figura 16 muestra la respuesta de transformación medida por la frecuencia de cotiledones inmaduros tratados que producían embriones somáticos después de transformación mediada por Agrobacterium para introducir un ADN T que contiene un casete de expresión con el gen WUS de Arabidopsis detrás de uno de cinco promotores; promotor de Gm-fitocromo P450 (P450 PRO); promotor de Gm-glucosil hidrolasa (GH PRO); promotor de Gmproteína de homeodominio/de dominio Start (HSD PRO); promotor de Gm-LTP3 (LTP3 PRO); promotor de Gmestrictosidina sintasa de tipo 1 (SSL1 PRO); el control negativo sin expresión de WUS (NEG CON). Para cada promotor, los extremos superior e inferior del recuadro indican el cuartil superior e inferior para la distribución de los datos, mientras que la línea dentro del recuadro representa la mediana. Para el P450 PRO se incluyeron solamente dos réplicas en este análisis y, por tanto, no se calculó la mediana.

La figura 17A muestra una micrografía óptica y la figura 17B muestra la imagen de epifluorescencia correspondiente de embriones somáticos que se movieron al medio de maduración para completar el desarrollo del embrión (mostrado en el medio de maduración 35 días después de se transformara el cotiledón inmaduro subyacente con un ADN T que contenía Gm-LTP3 PRO::At-WUS). La flecha apunta a uno de los cotiledones somáticos de fluorescencia roja; las barras de escala representan 2 mm de longitud.

Descripción detallada

Las divulgaciones en este documento se describirán más completamente en adelante en este documento con referencia a los dibujos adjuntos en los que se muestran algunos, pero no todos los posibles aspectos.

Como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, la expresión "que comprende" puede incluir el aspecto de "que consiste en". Salvo que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el normalmente entendido por un experto en la materia a la que pertenecen las composiciones y métodos divulgados. En esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones posteriores, se hará referencia a varios términos que se definirán en este documento.

I. Métodos y composiciones para producir plantas transgénicas

La presente divulgación comprende métodos y composiciones para producir una planta transgénica, que comprenden (a) transformar una célula de un explante con una construcción de expresión que comprende: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o (iii) una combinación de (i) y (ii); y (b) permitir la expresión del polipéptido de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo; y (c) germinar la estructura vegetal regenerable para formar la planta transgénica. La estructura vegetal regenerable se produce en aproximadamente 0 - 7 días o aproximadamente 0 -14 días de transformación. En un aspecto, la germinación comprende transferir la estructura vegetal regenerable a un medio de maduración que comprende una citocinina exógena y formar la planta transgénica. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX puede estimular la formación de una estructura vegetal regenerable. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 puede estimular la formación de una estructura vegetal regenerable.

En un aspecto, se controla la expresión del polipéptido de (a) en cada célula transformada del método. La expresión controlada se estimula durante un periodo particular de tiempo. El control de la expresión del polipéptido de (a) puede conseguirse mediante una diversidad de métodos como se divulgan en este documento a continuación.

Debe apreciarse que los métodos de la presente divulgación producen estructuras vegetal regenerables individuales que se forman directamente a partir de una sola célula en, o dentro, del explante que se ha transformado, sin que se produzca proliferación de célula o tejido derivado de una sola célula intermedia antes del inicio de la estructura vegetal regenerable. En contraste, los métodos descritos previamente de transformación y regeneración conocidos en la técnica implican proliferación de célula o tejido derivado de una sola célula intermedia, que comprende tipos de patrones de crecimiento denominados callo, callo no diferenciado, callo embriogénico y callo organogénico. En diversos aspectos, el término "callo" se refiere a un grupo de células indiferenciadas en crecimiento incontrolado. Un callo puede obtenerse cultivando una célula diferenciada de un tejido vegetal en un medio que contiene un regulador del crecimiento vegetal tal como auxina (por ejemplo, 2,4-D) o citocinina (en el que el medio con citocinina se denomina medio de desdiferenciación). Ejemplos de auxinas que pueden añadirse a medio de histocultivo para estimular la embriogénesis incluyen las auxinas de origen natural tales como ácido indolo-3-acético (IAA), ácido cloroindolo-3-acético (CL-IAA), ácido 2-fenilacético (PAA), ácido indolo-3-propiónico (IPA) y ácido indolo-3-butérico (IBA), además de auxinas sintéticas tales como ácido 1-naftalenoacético (NAA), ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) y ácido 2,4,5-triclorofenoxiacético (2,4,5-T). Ejemplos de citocininas que pueden añadirse a medio de histocultivo para estimular la morfogénesis (y, en particular, el desarrollo del meristemo y los brotes) incluyen bencilaminopurina (BAP), zeatina, cinetina, tidiazurón (TDZ), meta-topolina y metoxitopolinas. Las auxinas y citocininas que se añaden a medio de histocultivo son exógenas. Debe entenderse además que los métodos descritos previamente de transformación y regeneración conocidos en la técnica también implican proliferación de célula o tejido derivado de una sola célula intermedia, que comprende tipos de patrones de crecimiento denominados proliferación de meristemo, que abarca formación de meristemo de novo (Gordon Kamm et al. (2007) Development 134: 3539-3548), formación de múltiples brotes (Zhong et al. (1992) Planta 187:483-489) y cultivo de tejido verde (Cho et al. (1998) Plant Sci 138:229-244; Cho et al. (2004) Plant Cell Rep 22:483-489), que requiere todo ello citocinina en el medio (por ejemplo, documentos US8395020B2; US8581035B2).

En los métodos divulgados, pueden usarse diversos explantes, incluyendo embriones inmaduros, embriones cigóticos de 1-5 mm, embriones de 3-5 mm y embriones derivados de semilla derivada de espiga madura, bases foliares, hojas de plantas maduras, puntas de hojas, inflorescencias inmaduras, panícula, espiga inmadura y sedas. En diversos aspectos, el explante derivado de la planta usado para la transformación incluye embriones inmaduros, embriones cigóticos de 1-5 mm y embriones de 3,5-5 mm. En un aspecto, los embriones usados en los métodos divulgados pueden derivar de semilla derivada de espiga madura, bases foliares, hojas de plantas maduras, puntas de hojas, inflorescencias inmaduras, panícula, espiga inmadura y sedas.

La estructura vegetal regenerable se define como una estructura multicelular que puede formar una planta fértil completamente funcional, tal como, aunque sin limitación, embriones somáticos, callo embriogénico, meristemos somáticos y/o callo organogénico.

Embrión somático se define como una estructura multicelular que progresa a través de las fases de desarrollo que son similares al desarrollo de un embrión cigótico, incluyendo la formación de embriones en fase globular y de transición, formación de un eje embrionario y un escutelo, y acumulación de lípidos y almidón. Los embriones somáticos individuales derivados de un embrión cigótico germinan para producir plantas no quiméricas individuales, que pueden derivar originalmente de una sola célula.

Callo embriogénico se define como una mezcla desmenuzable o no desmenuzable de células indiferenciadas o parcialmente indiferenciadas que delimitan embriones somáticos primarios y secundarios proliferantes que pueden regenerarse en plantas fértiles maduras.

Meristemo somático se define como una estructura multicelular que es similar al meristemo apical que forma parte de un embrión derivado de semilla, caracterizado por tener una cúpula apical indiferenciada flanqueada por primordios foliares y delimitada por principios vasculares, dando lugar la cúpula apical a una planta vegetativa aérea. Dichos meristemos somáticos pueden formar grupos individuales o fusionados de meristemos.

Callo organogénico se define como una mezcla compacta de estructuras vegetales crecientes diferenciadas, incluyendo, aunque sin limitación meristemos apicales, meristemos de la raíz, hojas y raíces.

La germinación es el crecimiento de una estructura regenerable para formar una plántula que sigue creciendo para producir una planta.

Una planta transgénica se define como una planta fértil madura que contiene un transgén.

El explante usado en los métodos divulgados puede derivar de una monocotiledónea incluyendo, aunque sin limitación, cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. Como alternativa, el explante usado en los métodos divulgados puede derivar de una dicotiledónea incluyendo, aunque sin limitación, col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón.

En un aspecto adicional, el explante usado en los métodos divulgados puede derivar de una planta que es un miembro de la familia Poaceae. Ejemplos no limitantes de plantas adecuadas de las que puede derivar un explante incluyen cultivos de cereales incluyendo, aunque sin limitación, cebada, maíz, avena, arroz, centeno, sorgo, trigo, mijo, triticale; cultivos de tallos y hojas incluyendo, aunque sin limitación, bambú, carrizo, poa de los prados, juncos, ballico, caña de azúcar; hierbas de pasto, hierbas ornamentales y otras hierbas tales como pasto varilla y césped.

En un aspecto adicional, el explante usado en los métodos divulgados puede derivar de cualquier planta, incluyendo plantas superiores, por ejemplo, clases de Angiospermae y Gymnospermae. Plantas de las subclases de las Dicotylodenae y las Monocotyledonae son adecuadas. Las especies adecuadas pueden venir de la familia Acanthaceae, Alliaceae, Alstroemeriaceae, Amaryllidaceae, Apocynaceae, Arecaceae, Asteraceae, Berberidaceae, Bixaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Cannabaceae, Caryophyllaceae, Cephalotaxaceae, Chenopodiaceae, Colchicaceae, Cucurbitaceae, Dioscoreaceae, Ephedraceae, Erythroxylaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Lamiaceae, Linaceae, Lycopodiaceae, Malvaceae, Melanthiaceae, Musaceae, Myrtaceae, Nyssaceae, Papaveraceae, Pinaceae, Plantaginaceae, Poaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Salicaceae, Sapindaceae, Solanaceae, Taxaceae, Theaceae y Vitaceae.

Especies adecuadas de las que puede derivar el explante usado en los métodos divulgados incluyen miembros del género Abelmoschus, Abies, Acer, Agrostis, Allium, Alstroemeria, Ananas, Andrographis, Andropogon, Artemisia, Arundo, Atropa, Berberis, Beta, Bixa, Brassica, Calendula, Camellia, Camptotheca, Cannabis, Capsicum, Carthamus, Catharanthus, Cephalotaxus, Chrysanthemum, Cinchona, Citrullus, Coffea, Colchicum, Coleus, Cucumis, Cucurbita, Cynodon, Datura, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Ephedra, Erianthus, Erythroxylum, Eucalyptus, Festuca, Fragaria, Galanthus, Glycine, Gossypium, Helianthus, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Jatropha, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Lycopodium, Manihot, Medicago, Mentha, Miscanthus, Musa, Nicotiana, Oryza, Panicum, Papaver, Parthenium, Pennisetum, Petunia, Phalaris, Phleum, Pinus, Poa, Poinsettia, Populus, Rauwolfia, Ricinus, Rosa, Saccharum, Salix, Sanguinaria, Scopolia, Secale, Solanum, Sorghum, Spartina, Spinacea, Tanacetum, Taxus, Theobroma, Triticosecale, Triticum, Uniola, Veratrum, Vinca, Vitis, y Zea.

En un aspecto adicional, el explante usado en los métodos divulgados puede derivar de una planta que es importante o interesante para agricultura, horticultura, biomasa para la producción de moléculas de combustible líquido y otros productos químicos y/o silvicultura. Ejemplos no limitantes incluyen, por ejemplo, Panicum virgatum (pasto varilla), Sorghum bicolor (sorgo, hierba del Sudán), Miscanthus giganteus (miscanto), Saccharum sp. (caña), Populus balsamifera (álamo), Zea mays (maíz), Glycine max (soja), Brassica napus (colza), Triticum aestivum (trigo), Gossypium hirsutum (algodón), Oryza sativa (arroz), Helianthus annuus (girasol), Medicago sativa (alfalfa), Beta vulgaris (remolacha azucarera), Pennisetum glaucum (espadaña), Panicum spp., Sorghum spp., Miscanthus spp., Saccharum spp., Erianthus spp., Populus spp., Andropogon gerardii (hierba tallo azul grande), Pennisetum purpureum (hierba de elefante), Phalaris arundinacea (alpiste cinta), Cynodon dactylon (gramilla colorada), Festuca arundinacea (festuca alta), Spartina pectinata (espartillo de la pradera), Arundo donax (caña común), Secale cereale (centeno), Salix spp. (sauce), Eucalyptus spp. (eucalipto), Triticosecale spp. (triticum-trigo X centeno), bambú, Carthamus tinctorius (cártamo), Jatropha curcas (jatrofa), Ricinus communis (ricino), Elaeis guineensis (palma), Linum usitatissimum (lino), Brassica juncea, Manihot esculenta (mandioca), Lycopersicon esculentum (tomate), Lactuca sativa (lechuga), Musa paradisiaca (plátano), Solanum tuberosum (patata), Brassica oleracea (brécol, coliflor, coles de Bruselas), Camellia sinensis (té), Fragaria ananassa (fresa), Theobroma cacao (cacao), Coffea arabica (café), Vitis vinifera (uva), Ananas comosus (piña), Capsicum annum (pimiento picante y dulce), Allium cepa (cebolla), Cucumis melo (melón), Cucumis sativus (pepino), Cucurbita maxima (calabaza), Cucurbita moschata (calabaza), Spinacea oleracea (espinaca), Citrullus lanatus (sandía), Abelmoschus esculentus (quingombó), Solanum melongena (berenjena), Papaver somniferum (adormidera), Papaver orientale, Taxus baccata, Taxus brevifolia, Artemisia annua, Cannabis sativa, Camptotheca acuminate, Catharanthus roseus, Vinca rosea, Cinchona officinalis, Colchicum autumnale, Veratrum californica, Digitalis lanata, Digitalis purpurea, Dioscorea spp., Andrographis paniculata, Atropa belladonna, Datura stomonium, Berberis spp., Cephalotaxus spp., Ephedra sinica, Ephedra spp., Erythroxylum coca, Galanthus wornorii, Scopolia spp., Lycopodium serratum (=Huperzia serrata), Lycopodium spp., Rauwolfia serpentina, Rauwolfia spp., Sanguinaria canadensis, Hyoscyamus spp., Calendula officinalis, Chrysanthemum parthenium, Coleus forskohlii, Tanacetum parthenium, Parthenium argentatum (guayule), Hevea spp. (caucho), Mentha spicata (menta), Mentha piperita (menta), Bixa orellana, Alstroemeria spp., Rosa spp. (rosa), Dianthus caryophyllus (clavel), Petunia spp. (petunia), Poinsettia pulcherrima (poinsetia), Nicotiana tabacum (tabaco), Lupinus albus (altramuz), Uniola paniculata (avena), césped inclinado (Agrostis spp.), Populus tremuloides (álamo), Pinus spp. (pino), Abies spp. (abeto), Acer spp. (arce), Hordeum vulgare (cebada), Poa pratensis (pasto azul), Lolium spp. (ballico), Phleum pratense (fleo) y coníferas. Son de interés plantas que se cultivan para la producción de energía, los llamados cultivos energéticos, tales como cultivos energéticos basados en celulosa como Panicum virgatum (pasto varilla), Sorghum bicolor (sorgo, hierba del Sudán), Miscanthus giganteus (miscanto), Saccharum sp. (caña), Populus balsamifera (álamo), Andropogon gerardii (hierba tallo azul grande), Pennisetum purpureum (hierba de elefante), Phalaris arundinacea (alpiste cinta), Cynodon dactylon (gramilla colorada), Festuca arundinacea (festuca alta), Spartina pectinata (espartillo de la pradera), Medicago sativa (alfalfa), Arundo donax (caña común), Secale cereale (centeno), Salix spp. (sauce), Eucalyptus spp. (eucalipto), Triticosecale spp. (triticum-trigo X centeno) y bambú; y cultivos energéticos basados en almidón como Zea mays (maíz) y Manihot esculenta (mandioca); y cultivos energéticos basados en sacarosa como Saccharum sp. (caña de azúcar) y Beta vulgaris (remolacha azucarera); y cultivos energéticos productores de biodiésel como Glycine max (soja), Brassica napus (colza), Helianthus annuus (girasol), Carthamus tinctorius (cártamo), Jatropha curcas (jatrofa), Ricinus communis (ricino), Elaeis guineensis (palma), Linum usitatissimum (lino) y Brassica juncea.

Como se usa en este documento, una "planta fuente de energía renovable de biomasa'' significa que tiene o produce material (sin procesar o procesado) que comprende energía solar almacenada que puede convertirse en energía eléctrica, combustibles líquidos y otros productos químicos útiles. En términos generales, dichas plantas comprenden cultivos energéticos especializados, así como plantas agrícolas y leñosas. Ejemplos de plantas fuente de energía renovable de biomasa incluyen: Panicum virgatum (pasto varilla), Sorghum bicolor (sorgo, hierba del Sudán), Miscanthus giganteus (miscanto), Saccharum sp. (caña), Populus balsamifera (álamo), Andropogon gerardii (hierba tallo azul grande), Pennisetum purpureum (hierba de elefante), Phalaris arundinacea (alpiste cinta), Cynodon dactylon (gramilla colorada), Festuca arundinacea (festuca alta), Spartina pectinata (espartillo de la pradera), Medicago sativa (alfalfa), Arundo donax (caña común), Secale cereale (centeno), Salix spp. (sauce), Eucalyptus spp. (eucalipto), Triticosecale spp. (triticum-trigo X centeno), bembú, Zea mays (maíz), Manihot esculenta (mandioca), Saccharum sp. (caña de azúcar), Beta vulgaris (remolacha azucarera), Glycine max (soja), Brassica napus (colza), Helianthus annuus (girasol), Carthamus tinctorius (cártamo), Jatropha curcas (jatrofa), Ricinus communis (ricino), Elaeis guineensis (palma), Linum usitatissimum (lino) y Brassica juncea.

En un aspecto, la construcción de expresión comprende tanto una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX como una secuencia de nucleótidos que codifica una polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2. En diversos aspectos, la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a AP2 se produce en menos de 1 día, menos de 2 días, menos de 5 días, menos de 7 días o menos de 14 días después del inicio de la transformación.

En un aspecto, la construcción de expresión comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX. En diversos aspectos, la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX se produce en menos de 1 día, menos de 2 días, menos de 5 días, menos de 7 días o menos de 14 días después del inicio de la transformación.

En un aspecto, la construcción de expresión comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2. En diversos aspectos, la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a AP2 se produce en menos de 1 día, menos de 2 días, menos de 5 días, menos de 7 días o menos de 14 días después del inicio de la transformación.

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o ambas secuencias de nucleótidos pueden ser la diana de escisión por una recombinasa específica de sitio. Por tanto, la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o ambas secuencias de nucleótidos pueden controlarse por escisión en un momento deseado después de la transformación. Se entiende que cuando se usa una recombinasa específica de sitio para controlar la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o ambas secuencias de nucleótidos en la construcción de expresión, la construcción de expresión comprende sitios de escisión específica de sitio apropiados que flanquean la secuencia polinucleotídica a escindir, por ejemplo, sitios Cre lox si se utiliza recombinasa Cre. No es necesario que la recombinasa específica de sitio esté colocalizada en la construcción de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o ambas secuencias de nucleótidos. Sin embargo, en un aspecto, la construcción de expresión comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio.

La recombinasa específica de sitio usada para controlar la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o ambas secuencias polinucleotídicas, puede elegirse de una diversidad de recombinasas específicas de sitio adecuadas. Por ejemplo, en diversos aspectos, la recombinasa específica de sitio es FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxb1, TP907-1 o U153. La recombinasa específica de sitio puede ser un polipéptido de fusión desestabilizado. El polipéptido de fusión desestabilizado puede ser TETR(G17A)~CRE o ESR(G17A)~CRE.

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo. Los promotores regulados por el desarrollo adecuados incluyen GLB1, OLE y proteína 2 de transferencia de lípidos (LTP2) (Kalla et al., 1994, Plant J.

6:849-860 y documento US5525716). Los promotores inducibles adecuados incluyen promotores de choque término inducibles ambientalmente incluyendo HSP17.7, HSP26 o HSP18A. Como alternativa, el promotor inducible unido de forma funcional a la recombinasa específica de sitio puede ser un promotor inducible químicamente, por ejemplo, el promotor XVE.

En un aspecto, el promotor inducible químicamente unido de forma funcional a la recombinasa específica de sitio es XVE. El promotor inducible químicamente puede representarse por el represor de tetraciclina (TETR), el represor de etametsulfurón (ESR) o el represor de clorsulfurón (CR), y la desrepresión se produce tras la adición de ligados relacionados con tetraciclina o de sulfonilurea. El represor puede ser TETR y el ligando relacionado con tetraciclina es doxiciclina o anhidrotetraciclina. (Gatz, C., Frohberg, C. y Wendenburg, R. (1992) Stringent repression and homogeneous de-repression by tetracycline of a modified CaMV 35S promoter in intact transgenic tobacco plants, Plant J. 2, 397-404). Como alternativa, el represor puede ser ESR y el ligando de sulfonilurea es etametsulfurón, clorsulfurón, metsulfurónmetilo, sulfometurón-metilo, clorimurón-etilo, nicosulfurón, primisulfurón, tribenurón, sulfosulfurón, trifloxisulfurón, foramsulfurón, yodosulfurón, prosulfurón, tifensulfurón, rimsulfurón, mesosulfurón o halosulfurón (documento US20110287936).

En un aspecto, cuando la construcción de expresión comprende sitios de escisión por recombinasa específica de sitio, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o ambas secuencias de nucleótidos pueden estar unidos de forma funcional a un promotor inducible por auxina, un promotor regulado por el desarrollo o un promotor constitutivo. Promotores constitutivos ejemplares útiles en este contexto incluyen UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1.2 Kb ), IN2-2, NOS, la versión -135 del 35S PRO (o versiones más largas del promotor 35S) y ZM-ADF PRO (ALT2). Promotores inducibles por auxina ejemplares útiles en este contexto incluyen AXIG1 y DR5. Promotores regulados por el desarrollo ejemplares útiles en este contexto incluyen PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, LGL, LEA-14A y LEA-D34.

La duración apropiada para la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o ambas secuencias de nucleótidos puede conseguirse mediante el uso de un promotor regulado por el desarrollo, por ejemplo, un promotor tal como una proteína de transferencia de fosfolípidos (PLTP). Los promotores PLTP incluyen PLTP, PLTP1, PLTP2 y PLTP3 como se describe adicionalmente a continuación. En un aspecto particular, el promotor PLTP comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1-2 y 55-61. El promotor PLTP usado puede ser un promotor PLTP de Zea mays o Sorghum bicolor tal como el de SEQ ID NO: 1 o 2 (solicitud provisional de Estados Unidos n.° 62/271230). Otros promotores regulados por el desarrollo apropiados que pueden usarse con los métodos de la presente divulgación incluyen los promotores derivados de genes que codifican la proteína fructosa-1,6-bisfosfatasa, proteína con plegamiento de Rossmann de unión a NAD(P), proteína similar a la proteína asociada a membrana plasmática de adipocitos, proteína de dominio de hierro-azufre Rieske [2Fe-2S], proteína de reducción 6 de clororrespiración, D-glicerato 3-cinasa, proteína similar cloroplástica, proteína 7 de unión a clorofila a-b, proteína similar cloroplástica, proteína reprimible por ultravioleta-B, proteína de la familia de unión a hemo Soul, proteína psi-N de la subunidad del centro de reacción del fotosistema I y proteína deshidrogenasa/reductasa de cadena corta. Los promotores pueden derivar de los genes que codifican las proteínas anteriores en plantas monocotiledóneas, tales como maíz, arroz o sorgo. Promotores regulados por el desarrollo adecuados útiles en los métodos de la presente divulgación incluyen los mostrados en SEQ ID NO: 1-2, 28-40, 55-61,81 83 y 86-88 y 106.

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o ambas secuencias polinucleotídicas pueden estar unidas de forma funcional a un promotor inducible por auxina. En diversos aspectos, el promotor inducible por auxina puede ser AXIG1. En particular, el promotor inducible por auxina puede ser SEQ ID NO:39. El promotor también puede comprender uno o más elementos de respuesta a auxina. En un aspecto adicional, el promotor puede comprender uno o más motivos DR5. En particular, el promotor puede ser SEQ ID NO:40.

En un aspecto, el promotor es un promotor constitutivo débil modificado para represión y desrepresión. En un aspecto adicional, el promotor constitutivo débil modificado para represión y desrepresión comprende una o más secuencias operadoras en el promotor que se han colocado cerca de o solapando con la secuencia TATA y/o el sitio de inicio de la transcripción. Por ejemplo, promotores adecuados de este tipo incluyen, aunque sin limitación, los promotores NOS, IN2-2, la versión -135 de 35S, CC-UBI1-PRO y ZM-ADF4-PRO.

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o ambas secuencias de nucleótidos pueden estar unidas de forma funcional a un promotor regulado por el desarrollo. Promotores regulados por el desarrollo adecuados incluyen promotores derivados de los genes vegetales para fructosa-1,6-bisfosfatasa, proteína con plegamiento de Rossmann de unión a NAD(P), proteína simular a proteína asociada a membrana plasmática de adipocitos, proteína de dominio de hierro-azufre Rieske [2Fe-2S], proteína de reducción 6 de clororrespiración, D-glicerato 3-cinasa, proteína similar cloroplástica, proteína 7 de unión a clorofila a-b, proteína similar cloroplástica, proteína reprimible por ultravioleta-B, proteína de la familia de unión a hemo Soul, proteína psi-N de la subunidad del centro de reacción del fotosistema I y deshidrogenasa/reductasa de cadena corta. En diversos aspectos, estos promotores derivan de los genes correspondientes en monocotiledóneas tales como maíz y arroz. Como alternativa, estos promotores pueden derivar de los genes correspondientes en dicotiledóneas. En aspectos particulares, los promotores regulados por el desarrollo comprenden una cualquiera de SEQ ID NO: 1 -2, 28-40, 55-61, 81 -83 y 86-88 y 106.

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o ambas secuencias de nucleótidos pueden estar unidas de forma funcional a un promotor desreprimible. Los promotores desreprimibles útiles incluyen 35S:Top3, NOS::Top, NOS:Top2, UBI:Top3, BSV:Top3, AXIG1:Top, IN2-2:Top y DR5:Top (donde Top es la abreviatura de la secuencia operadora de 18 bases a la que se une TETR, ESR o CR para reprimir la expresión).

En un aspecto, la presente divulgación proporciona métodos de transformación que permiten selección de crecimiento positivo. Un experto en la materia puede apreciar que los métodos convencionales de transformación de plantas han dependido predominantemente de esquemas de selección negativa, en que se usa un antibiótico o herbicida (un agente selectivo negativo) para inhibir o destruir células o tejidos no transformados, y las células o tejidos transgénicos siguen creciendo debido a la expresión de un gen de resistencia. En contraste, los métodos de la presente divulgación pueden usarse sin aplicación de un agente selectivo negativo. Por tanto, aunque las células de tipo silvestre pueden crecer sin impedimentos, en comparación, las células que contienen los casetes de expresión de WUS2 y ODP2 divulgados pueden identificarse fácilmente debido a su tasa de crecimiento acelerado con respecto al tejido de tipo silvestre circundante. Además de simplemente observar crecimiento más rápido, los métodos de la presente divulgación proporcionan células transgénicas que contienen los casetes de expresión de WUS2 y ODP2 que muestran morfogénesis más rápida, manifestada como formación de estructura vegetal regenerable, con respecto a células no transformadas. Por consiguiente, cada crecimiento diferencial y desarrollo morfogenético puede usarse para distinguir fácilmente estructuras vegetales regenerables transgénicas del tejido no transformado circundante, un proceso que se denomina en este documento "selección de crecimiento positiva".

En diversos aspectos, los métodos de la presente divulgación pueden realizarse sin usar medio de enraizamiento. Como alternativa, en un aspecto, los métodos de la presente divulgación pueden realizarse usando medio de enraizamiento. Como se usa en este documento, "medio de enraizamiento" o "medio de enraizamiento selectivo" se refiere a un medio de histocultivo que comprende sales basales, fuentes de carbono, vitaminas, minerales y fitohormonas vegetales. En un aspecto, las fitohormonas vegetales pueden proporcionarse en concentraciones o relaciones variables, en las que se desarrollan tejidos de la raíz y proliferan a partir de células colocadas sobre el medio de enraizamiento selectivo. En un aspecto, el medio de enraizamiento selectivo contiene glufosinato, imazapyr, etametsulfurón, manosa u otros agentes selectivos. En un aspecto, el medio de enraizamiento selectivo contiene auxina y citocinina, citocinina en solitario o sin fitohormonas vegetales.

En un aspecto, los métodos de la presente divulgación se realizan sin usar una citocinina durante la formación de la estructura vegetal regenerable y/o durante la germinación. En un aspecto adicional, los métodos de la presente divulgación pueden realizarse sin usar una citocinina entre la transformación y al menos aproximadamente 7 días después de iniciar la transformación. En un aspecto adicional, los métodos de la presente divulgación pueden realizarse sin usar una citocinina entre la transformación y al menos aproximadamente 14 días después de iniciar la transformación.

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o cada secuencia de nucleótidos está unida de forma funcional a un promotor PLTP. Los promotores PLTP incluyen PLTP, PLTP1, PLTP2 y PLTP3. El promotor PLTP puede derivar de una monocotiledónea, incluyendo, aunque sin limitación, maíz, cebada, avena, centeno, caña de azúcar, mijo, sorgo, trigo, Setaria sp. o arroz. En un aspecto adicional, el promotor PLTP es un promotor PLTP de maíz, arroz o Setaria sp. En un aspecto particular, el promotor PLTP comprende SEQ ID NO: 1-2 y 55-61. En un aspecto particular, el promotor PLTP es un promotor PLTP de maíz o arroz. En un aspecto adicional, el promotor PLTP es un promotor PLTP de maíz. En un aspecto adicional, el promotor PLTP es un promotor PLTP de arroz. En un aspecto, el promotor PLTP comprende SEQ ID NO: 1 o 2. El promotor PLTP también puede derivar de una dicotiledónea incluyendo, aunque sin limitación, col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. Otros promotores regulados por el desarrollo útiles en este contexto incluyen LGL, LEA-14A y LEA-D34. En un aspecto particular, otros promotores útiles en los presente métodos incluyen una cualquiera de SEQ ID NO: 28-40, 81 -83, 86-88 y 106.

En un aspecto, la presente divulgación comprende métodos para producir una planta transgénica, que comprenden (a) transformar una célula de un explante con una construcción de expresión que comprende: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o (iii) una combinación de las mismas; y (b) permitir la expresión de un polipéptido de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo; y (c) germinar la estructura vegetal regenerable para formar la planta transgénica; en el que el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16; o en el que el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX está codificado por la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15; y en el que el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65 o 67; o en el que el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 está codificado por la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 17, 19, 21,62, 64, 66 o 68.

La estructura vegetal regenerable se produce en aproximadamente 0 - 7 días o aproximadamente 0 -14 días de transformación. En un aspecto, la germinación comprende transferir la estructura vegetal regenerable a un medio de maduración que comprende una citocinina exógena y formar la planta transgénica. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX puede estimular la formación de una estructura vegetal regenerable. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 puede estimular la formación de una estructura vegetal regenerable.

En un aspecto, la presente divulgación comprende métodos para producir una planta transgénica, que comprenden (a) transformar una célula de un explante con una construcción de expresión que comprende: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido WUS2; (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido ODP2; o (iii) una combinación de las mismas; y (b) permitir la expresión de un polipéptido de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo; y (c) germinar la estructura vegetal regenerable para formar una planta transgénica; en el que polipéptido WUS2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; o en el que el polipéptido WUS2 está codificado por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3; y en el que el polipéptido ODP2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, 63, 65 o 67; o en el que el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 está codificado por la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de SeQ ID NO: 17, 21,62, 64, 66 o 68.

En un aspecto, la presente divulgación comprende métodos para producir una planta transgénica, que comprenden (a) transformar una célula de un explante con una construcción de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; y (b) permitir la expresión del polipéptido de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo; y (c) germinar la estructura vegetal regenerable para formar la planta transgénica.

En un aspecto, la presente divulgación comprende métodos para producir una planta transgénica, que comprenden (a) transformar una o más células de un explante con una construcción de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; y (b) permitir la expresión del polipéptido de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo; y (c) germinar la estructura vegetal regenerable para formar la planta transgénica.

En un aspecto, la presente divulgación comprende métodos para producir una planta transformada, que comprenden (a) transformar una o más células de un explante con una construcción de expresión que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; y (b) permitir la expresión de los polipéptidos de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo; y (c) germinar la estructura vegetal regenerable para formar la planta transgénica.

En un aspecto, la presente divulgación comprende métodos para producir una planta transformada, que comprenden (a) transformar una célula de un explante con una construcción de expresión que comprende: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o (iii) una combinación de (i) y (ii); (b) permitir la expresión del polipéptido de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo; y (c) germinar la estructura vegetal regenerable para formar la planta transgénica en aproximadamente 14 días a aproximadamente 60 días.

El término "planta" se refiere a plantas completas, órganos vegetales, tejidos vegetales, semillas, células vegetales, semillas y descendencia de las mismas. Las células vegetales incluyen, sin limitación, células de semillas, cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callo, hojas, raíces, brotes, gametófitos, esporófitos, polen y microesporas.

Las partes de plantas incluyen tejidos diferenciados e indiferenciados incluyendo, aunque sin limitación, los siguientes: raíces, tallos, brotes, hojas, polen, semillas, tejido tumoral y diversas formas de células y cultivo (por ejemplo, células individuales, protoplastos, embriones y tejido de callo). El tejido vegetal puede estar en una planta o en un órgano de la planta, histocultivo o cultivo celular.

La presente divulgación también incluye plantas obtenidas por cualquiera de los métodos divulgados o composiciones de este documento.

En un aspecto, la presente divulgación comprende métodos para producir una planta transgénica, que comprenden (a) transformar una célula de un explante con una construcción de expresión que comprende: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o (iii) una combinación de (i) y (ii); (b) permitir la expresión del polipéptido de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo; y (c) germinar la estructura vegetal regenerable para formar la planta transgénica en aproximadamente 14 días a aproximadamente 60 días.

La presente divulgación también incluye semillas de una planta obtenida por cualquiera de los métodos o composiciones divulgadas en este documento.

En un aspecto, la presente divulgación comprende kits que comprenden: (a) una construcción de expresión que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o (iii) una combinación de (i) y (ii); y (b) instrucciones para obtener una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo; y (c) instrucciones para germinar la estructura vegetal regenerable para formar la planta transgénica.

En un aspecto, la presente divulgación comprende kits que comprenden (a) una construcción de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; y (b) instrucciones para obtener una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo; y (c) instrucciones para germinar la estructura vegetal regenerable para formar la planta transgénica.

En un aspecto, la presente divulgación comprende kits que comprenden (a) una construcción de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; y (b) instrucciones para obtener una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo; y (c) instrucciones para germinar la estructura vegetal regenerable para formar la planta transgénica.

Los kits divulgados pueden comprender además instrucciones para germinar la estructura vegetal regenerable para formar la planta transgénica en aproximadamente 14 días a aproximadamente 60 días después de la transformación del explante.

II Proteínas de dominio de unión a ADN-AP2 (ODP2IBBM)

Los métodos de la presente divulgación comprenden secuencias polinucleotídicas y secuencias de aminoácidos de polipéptidos de proteína 2 del desarrollo de óvulos (ODP2), y polipéptidos relacionados, por ejemplo, proteínas de la familia de proteínas Babyboom (BBM). En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido ODP2, BBM2, BMN2 o BMN3. Los polipéptidos ODP2 de la divulgación contiene dos dominios APETALA2 (AP2) predichos y son miembros de la familia de proteínas AP2 (PFAM acceso PF00847). Los dominios AP2 del polipéptido ODP2 de maíz están localizados de aproximadamente el aminoácido S273 a N343 y de aproximadamente S375 a R437 de SEQ ID NO:2. La familia AP2 de supuestos factores de transcripción ha demostrado regular una amplia gama de procesos de desarrollo, y los miembros de la familia se caracterizan por la presencia de un dominio de unión a ADN AP2. Se prevé que este núcleo conservado formará una alfa hélice anfipática que se une a ADN. El dominio AP2 se identificó por primera vez en APETALA2, una proteína de Arabidopsis que regula la identidad del meristemo, la especificación del órgano floral, el desarrollo de la cubierta de la semilla y la expresión del gen homeótico floral. El dominio AP2 ahora se ha descubierto en una diversidad de proteínas.

Los polipéptidos ODP2 de la divulgación comparten homología con varios polipéptidos dentro de la familia de AP2, por ejemplo, véase la figura 1 del documento US 8420893 que proporciona una alineación de los polipéptidos ODP2 de maíz y arroz con otras ocho proteínas que tienen dos dominios AP2. También se proporciona una secuencia consenso de todas las proteínas que aparecen en la alineación del documento US 8420893 en la figura 1 del mismo.

El polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 puede derivar de una monocotiledónea. En diversos aspectos, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 deriva de cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 deriva de maíz, cebada, avena, centeno, caña de azúcar, mijo, sorgo, trigo, Setaria sp. o arroz. En un aspecto adicional, la monocotiledónea es maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En un aspecto adicional más, la monocotiledónea es maíz o arroz. En un aspecto adicional, la monocotiledónea es maíz. En un aspecto adicional, la monocotiledónea es arroz.

El polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 puede derivar de una dicotiledónea. El polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 puede derivar de col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón.

El polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 puede derivar de una planta que es un miembro de la familia Poaceae. Ejemplos no limitantes de plantas adecuadas de las que pueden derivar los dos dominios de unión a ADN-AP2 incluyen cultivos de cereales incluyendo, aunque sin limitación, cebada, maíz, avena, arroz, centeno, sorgo, trigo, mijo, triticale; cultivos de tallos y hojas incluyendo, aunque sin limitación, bambú, carrizo, poa de los prados, juncos, ballico, caña de azúcar; hierbas de pasto, hierbas ornamentales y otras hierbas tales como pasto varilla y césped.

En un aspecto adicional, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 usado en los métodos divulgados puede derivar de cualquier planta, incluyendo plantas superiores, por ejemplo, clases de Angiospermae y Gymnospermae. Plantas de las subclases de las Dicotylodenae y las Monocotyledonae son adecuadas. Especies adecuadas pueden provenir de la familia Acanthaceae, Alliaceae, Alstroemeriaceae, Amaryllidaceae, Apocynaceae, Arecaceae, Asteraceae, Berberidaceae, Bixaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Cannabaceae, Caryophyllaceae, Cephalotaxaceae, Chenopodiaceae, Colchicaceae, Cucurbitaceae, Dioscoreaceae, Ephedraceae, Erythroxylaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Lamiaceae, Linaceae, Lycopodiaceae, Malvaceae, Melanthiaceae, Musaceae, Myrtaceae, Nyssaceae, Papaveraceae, Pinaceae, Plantaginaceae, Poaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Salicaceae, Sapindaceae, Solanaceae, Taxaceae, Theaceae, y Vitaceae.

Especies adecuadas de las que puede derivar el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 incluyen miembros del género Abelmoschus, Abies, Acer, Agrostis, Allium, Alstroemeria, Ananas, Andrographis, Andropogon, Artemisia, Arundo, Atropa, Berberis, Beta, Bixa, Brassica, Calendula, Camellia, Camptotheca, Cannabis, Capsicum, Carthamus, Catharanthus, Cephalotaxus, Chrysanthemum, Cinchona, Citrullus, Coffea, Colchicum, Coleus, Cucumis, Cucurbita, Cynodon, Datura, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Ephedra, Erianthus, Erythroxylum, Eucalyptus, Festuca, Fragaria, Galanthus, Glycine, Gossypium, Helianthus, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Jatropha, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Lycopodium, Manihot, Medicago, Mentha, Miscanthus, Musa, Nicotiana, Oryza, Panicum, Papaver, Parthenium, Pennisetum, Petunia, Phalaris, Phleum, Pinus, Poa, Poinsettia, Populus, Rauwolfia, Ricinus, Rosa, Saccharum, Salix, Sanguinaria, Scopolia, Secale, Solanum, Sorghum, Spartina, Spinacea, Tanacetum, Taxus, Theobroma, Triticosecale, Triticum, Uniola, Veratrum, Vinca, Vitis, y Zea.

En un aspecto adicional, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 puede derivar de una planta que es importante o interesante para agricultura, horticultura, biomasa para la producción de moléculas de combustible líquido y otros productos químicos y/o silvicultura. Ejemplos no limitantes incluyen, por ejemplo, Panicum virgatum (pasto varilla), Sorghum bicolor (sorgo, hierba del Sudán), Miscanthus giganteus (miscanto), Saccharum sp. (caña), Populus balsamifera (álamo), Zea mays (maíz), Glycine max (soja), Brassica napus (colza), Triticum aestivum (trigo), Gossypium hirsutum (algodón), Oryza sativa (arroz), Helianthus annuus (girasol), Medicago sativa (alfalfa), Beta vulgaris (remolacha azucarera), Pennisetum glaucum (espadaña), Panicum spp., Sorghum spp., Miscanthus spp., Saccharum spp., Erianthus spp., Populus spp., Andropogon gerardii (hierba tallo azul grande), Pennisetum purpureum (hierba de elefante), Phalaris arundinacea (alpiste cinta), Cynodon dactylon (gramilla colorada), Festuca arundinacea (festuca alta), Spartina pectinata (espartillo de la pradera), Arundo donax (caña común), Secale cereale (centeno), Salix spp. (sauce), Eucalyptus spp. (eucalipto), Triticosecale spp. (triticum-trigo X centeno), bambú, Carthamus tinctorius (cártamo), Jatropha curcas (jatrofa), Ricinus communis (ricino), Elaeis guineensis (palma), Linum usitatissimum (lino), Brassica juncea, Manihot esculenta (mandioca), Lycopersicon esculentum (tomate), Lactuca sativa (lechuga), Musa paradisiaca (plátano), Solanum tuberosum (patata), Brassica oleracea (brécol, coliflor, coles de Bruselas), Camellia sinensis (té), Fragaria ananassa (fresa), Theobroma cacao (cacao), Coffea arabica (café), Vitis vinifera (uva), Ananas comosus (piña), Capsicum annum (pimiento picante y dulce), Allium cepa (cebolla), Cucumis melo (melón), Cucumis sativus (pepino), Cucurbita maxima (calabaza), Cucurbita moschata (calabaza), Spinacea oleracea (espinaca), Citrullus lanatus (sandía), Abelmoschus esculentus (quingombó), Solanum melongena (berenjena), Papaver somniferum (adormidera), Papaver orientale, Taxus baccata, Taxus brevifolia, Artemisia annua, Cannabis sativa, Camptotheca acuminate, Catharanthus roseus, Vinca rosea, Cinchona officinalis, Colchicum autumnale, Veratrum californica, Digitalis lanata, Digitalis purpurea, Dioscorea spp., Andrographis paniculata, Atropa belladonna, Datura stomonium, Berberis spp., Cephalotaxus spp., Ephedra sinica, Ephedra spp., Erythroxylum coca, Galanthus wornorii, Scopolia spp., Lycopodium serratum (=Huperzia serrata), Lycopodium spp., Rauwolfia serpentina, Rauwolfia spp., Sanguinaria canadensis, Hyoscyamus spp., Calendula officinalis, Chrysanthemum parthenium, Coleus forskohlii, Tanacetum parthenium, Parthenium argentatum (guayule), Hevea spp. (caucho), Mentha spicata (menta), Mentha piperita (menta), Bixa orellana, Alstroemeria spp., Rosa spp. (rosa), Dianthus caryophyllus (clavel), Petunia spp. (petunia), Poinsettia pulcherrima (poinsetia), Nicotiana tabacum (tabaco), Lupinus albus (altramuz), Uniola paniculata (avena), césped inclinado (Agrostis spp.), Populus tremuloides (álamo), Pinus spp. (pino), Abies spp. (abeto), Acer spp. (arce), Hordeum vulgare (cebada), Poa pratensis (pasto azul), Lolium spp. (ballico), Phleum pratense (fleo) y coníferas. Son de interés plantas que se cultivan para la producción de energía, los llamados cultivos energéticos, tales como cultivos energéticos basados en celulosa como Panicum virgatum (pasto varilla), Sorghum bicolor (sorgo, hierba del Sudán), Miscanthus giganteus (miscanto), Saccharum sp. (caña), Populus balsamifera (álamo), Andropogon gerardii (hierba tallo azul grande), Pennisetum purpureum (hierba de elefante), Phalaris arundinacea (alpiste cinta), Cynodon dactylon (gramilla colorada), Festuca arundinacea (festuca alta), Spartina pectinata (espartillo de la pradera), Medicago sativa (alfalfa), Arundo donax (caña común), Secale cereale (centeno), Salix spp. (sauce), Eucalyptus spp. (eucalipto), Triticosecale spp. (triticum-trigo X centeno) y bambú; y cultivos energéticos basados en almidón como Zea mays (maíz) y Manihot esculenta (mandioca); y cultivos energéticos basados en sacarosa como Saccharum sp. (caña de azúcar) y Beta vulgaris (remolacha azucarera); y cultivos energéticos productores de biodiésel como Glycine max (soja), Brassica napus (colza), Helianthus annuus (girasol), Carthamus tinctorius (cártamo), Jatropha curcas (jatrofa), Ricinus communis (ricino), Elaeis guineensis (palma), Linum usitatissimum (lino) y Brassica juncea.

El polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 puede derivar de una planta fuente de energía renovable de biomasa. Ejemplos de plantas fuente de energía renovable de biomasa incluyen las descritas en este documento.

En particular, la presente divulgación proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65 y 67. Se proporcionan además polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico (SEQ ID NO: 17, 19, 21,62, 64, 66 y 68) descrita en este documento, y fragmentos y variantes de la misma.

En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido ODP2. En un aspecto adicional, el polipéptido ODP2 deriva de un polipéptido de monocotiledónea. En aspectos particulares, el polipéptido ODP2 deriva de maíz, cebada, avena, centeno, caña de azúcar, mijo, sorgo, trigo, Setaria sp. o arroz. En un aspecto, el polipéptido ODP2 deriva de maíz, arroz o Setaria sp. En un aspecto, el polipéptido ODP2 deriva de maíz o arroz. En un aspecto particular, el polipéptido ODP2 deriva de maíz. En un aspecto particular, el polipéptido ODP2 deriva de arroz. En un aspecto adicional, el polipéptido ODP2 deriva de un polipéptido de dicotiledónea. En aspectos particulares, el polipéptido ODP2 deriva de col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. El polipéptido ODP2 expresado por la construcción de expresión de los métodos y composiciones divulgadas puede ser el polipéptido que comprende SEQ ID NO: 18, 63, 65 o 67. El polipéptido ODP2 puede estar codificado por el polinucleótido de SEQ ID NO: 17, 21,62, 64, 66 o 68.

En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es un polipéptido BBM2. El polipéptido BBM2 puede ser un polipéptido de monocotiledónea incluyendo, aunque sin limitación monocotiledóneas tales como maíz, cebada, avena, centeno, caña de azúcar, mijo, sorgo, trigo, Setaria sp. o arroz. En aspectos particulares, la monocotiledónea es maíz, caña de azúcar, arroz o Setaria sp. En un aspecto particular adicional, la monocotiledónea es maíz o arroz. En un aspecto particular adicional más, la monocotiledónea es maíz. Como alternativa, el polipéptido BBM2 puede ser un polipéptido de dicotiledónea incluyendo, aunque sin limitación, en el que la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón. En un aspecto, el polipéptido BBM2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:20. En un aspecto adicional, el polipéptido BBM2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 19.

La presente divulgación abarca composiciones de ácido nucleico o proteína ODP2/BBM aislada o sustancialmente purificada. Una molécula de ácido nucleico o proteína "aislada" o "purificada", o parte biológicamente activa de la misma, está sustancial o esencialmente libre de componentes que acompañan normalmente o interactúan con la molécula de ácido nucleico o proteína encontrada en su entorno de origen natural. Por tanto, una molécula de ácido nucleico o proteína aislada o purificada está sustancialmente libre de otro material celular o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros compuestos químicos cuando se sintetiza químicamente. De forma óptima, un ácido nucleico "aislado" está libre de secuencias (de forma óptima secuencias codificantes de proteína) que flanquean de forma natural el ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del que deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diversos aspectos, la molécula de ácido nucleico aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean de forma natural la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la que deriva el ácido nucleico. Una proteína que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína que tienen menos de aproximadamente un 30 %, 20 %, 10 %, 5 % o 1 % (en peso seco) de proteína contaminante. Cuando la proteína de la divulgación o parte biológicamente activa de la misma se produce de forma recombinante, de forma óptima el medio de cultivo representa menos de un 30 %, 20 %, 10 %, 5 % o 1 % (en peso seco) de precursores químicos o productos químicos que no son la proteína de interés.

Los fragmentos y variantes de las secuencias de nucleótidos y proteínas divulgadas codificadas por las mismas también están englobadas por la presente divulgación. Por "fragmento" se pretende una parte de la secuencia de nucleótidos o una parte de la secuencia de aminoácidos y, por tanto, la proteína codificada por la misma. Los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden codificar fragmentos proteínicos que conservan la actividad biológica de la proteína natural y, por tanto, tienen actividad ODP2. Como alternativa, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos útiles como sondas de hibridación en general no codifican fragmentos proteínicos que conservan actividad biológica. Por tanto, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden variar de al menos aproximadamente 20 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos y hasta la secuencia de nucleótidos de longitud completa que codifica las proteínas de la divulgación.

Por "actividad ODP2" o "actividad de proteína 2 de desarrollo del óvulo" se pretende el polipéptido ODP2 que tiene al menos una de las siguientes actividades ejemplares: aumenta la capacidad regenerativa de una célula vegetal; hace que la célula vegetal sea embriogénica; aumenta las eficacias de transformación de una célula vegetal; altera el contenido de aceite de una célula vegetal; se une a ADN; aumenta la toleración a agresión abiótica; aumenta o mantiene el rendimiento en agresión abiótica; aumenta la formación asexual de embriones; altera el contenido de almidón; altera el tamaño del embrión o activa la transcripción. Los métodos para ensayar dicha actividad son conocidos en la técnica y se describen más completamente a continuación.

Un fragmento de una secuencia de nucleótidos de ODP2/BBM que codifica una parte biológicamente activa de una proteína ODP2/BBM de la divulgación codificará al menos 15, 25, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 709 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en una proteína ODP2/BBM de longitud completa de la divulgación. Los fragmentos de una secuencia de nucleótidos de ODP2 que son útiles como sondas de hibridación o cebadores de PCR en general no tienen que codificar una parte biológicamente activa de una proteína ODP2/BBM.

Por tanto, un fragmento de una secuencia de nucleótidos de ODP2/BBM puede codificar una parte biológicamente activa de una proteína ODP2/BBM, o puede ser un fragmento que puede usarse como sonda de hibridación o cebador de PCR usando métodos divulgados a continuación. Una parte biológicamente activa de una proteína ODP2/BBM puede prepararse aislando una parte de una de las secuencias de nucleótidos de ODP2/BBM de la divulgación, expresando la parte codificada de la proteína ODP2/BBM (por ejemplo, por expresión recombinante in vitro) y evaluando la actividad de la parte codificada de la proteína ODP2/BBM. Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos de ODP2/BBM comprenden al menos 16, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300 o 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200 nucleótidos contiguos, o hasta el número de nucleótidos presentes en una secuencia de nucleótidos de ODP2/BBM de longitud completa divulgada en este documento (por ejemplo, SEQ ID NO:17, 19 y 21).

"Variantes" pretende significar secuencias sustancialmente similares. Para los polinucleótidos, una variante comprende una eliminación y/o adición de uno o más nucleótidos en uno o más sitios internos dentro del polinucleótido natural y/o una sustitución de uno o más nucleótidos en uno o más sitios en el polinucleótido natural. Como se usa en este documento, un polinucleótido o polipéptido "natural" comprende una secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos de origen natural, respectivamente. Para los polinucleótidos, las variantes conservativas incluyen aquellas secuencias que, a causa de la degeneración del código genético, codifican la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos ODP2/BBM de la divulgación. Los polinucleótidos ODP2/BBM2 variantes también incluyen polinucleótidos derivados sintéticamente, tales como los generados, por ejemplo, usando mutagénesis dirigida al sitio, pero que aún codifican una proteína ODP2 de la divulgación. En general, las variantes de un polinucleótido particular de la divulgación tendrán al menos aproximadamente un 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con ese polinucleótido particular, que se determina por programas de alineación de secuencias y parámetros descritos en otra parte en este documento.

Proteína "variante" pretende significar una proteína derivada de la proteína natural por eliminación o adición de uno o más aminoácidos en uno o más sitios internos en la proteína natural y/o sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína natural. Las proteínas variantes englobadas por la presente divulgación son biológicamente activas, es decir, siguen teniendo la actividad biológica deseada de la proteína natural, es decir, el polipéptido tiene actividad ODP2/BBM (es decir, modulación de la capacidad regenerativa de una planta, conversión de la planta en embriogénica, aumento de la eficacia de transformación de una planta, alteración del contenido de aceite de una planta, aumento de la proliferación celular, aumento de la tolerancia a agresión abiótica, aumento o mantenimiento del rendimiento en agresión abiótica, modificación del contenido de almidón, aumento de la formación asexual de embriones, unión a ADN o regulación de la transcripción) como se describe en este documento. Dichas variantes pueden ser el resultado de, por ejemplo, polimorfismo genético o manipulación humana. Las variantes biológicamente activas de una proteína ODP2/BBM natural de la divulgación tendrán al menos aproximadamente un 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la proteína natural determinada por programas de alineación de secuencias y parámetros descritos en otra parte en este documento. Una variante biológicamente activa de una proteína de la divulgación puede diferir de esa proteína en tan poco como 1-15 residuos aminoacídicos, tal poco como 1-10, tal como 6-10, tan poco como 5, tan poco como 4, 3, 2 o incluso 1 residuo aminoacídico.

Las proteínas ODP2/BBM de la divulgación pueden alterarse de diversas maneras incluyendo sustituciones, eliminaciones, truncamientos, fusiones e inserciones aminoacídicas. Los métodos para dichas manipulaciones en general son conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden prepararse variantes de secuencia de aminoácidos de las proteínas ODP2 por mutaciones en el ADN. Los métodos para mutagénesis y alteraciones de la secuencia de nucleótidos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; patente de Estados Unidos n.° 4.873.192; Walker y Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nueva York) y las referencias citadas en ese documento. Pueden encontrarse directrices en cuanto a sustituciones aminoacídicas apropiadas que no afectan a la actividad biológica de la proteína de interés en el modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.). Las sustituciones conservativas, tales como intercambio de un aminoácido con otro que tenga propiedades similares, pueden ser óptimas.

III Polipéptidos de homeosecuencia WUS/WOX

Los métodos de la presente divulgación comprenden secuencias polinucleotídicas y secuencias de aminoácidos de polipéptidos de homeosecuencia WUS/WOX. La proteína Wuschel, denominada en adelante en este documento WUS, desempeña una función clave en el inicio y mantenimiento del meristemo apical, que contiene una combinación de células madre pluripotentes (Endrizzi, et al., (1996) Plant Journal 10:967-979; Laux, et al., (1996) Development 122:87-96; y Mayer, et al., (1998) Cell 95:805-815). Las plantas de Arabidopsis mutantes para el gen WUS contienen células madre que son se especifican de forma incorrecta y que parecen experimentar diferenciación. WUS codifica una proteína de homeodominio novedosa que supuestamente funciona como regulador transcripcional (Mayer, et al., (1998) Cell 95:805-815). Se cree que la población de células madre de meristemos de los brotes de Arabidopsis se mantienen mediante un bucle regulador entre los genes CLAVATA (CLV) que promueven el inicio orgánico y el gen WUS que es necesaria para la identidad de las células madre, reprimiendo WUS mediante los genes CLV a nivel de transcrito, y siendo suficiente la expresión de WUS para inducir la identidad celular del meristemo y la expresión del marcador de células madre CLV3 (Brand, et al., (2000) Science 289:617-619; Schoof, et al., (2000) Cell 100:635-644). Se ha demostrado que la expresión constitutiva de WUS en Arabidopsis da lugar a proliferación de brotes accidentales a partir de las hojas (en la planta) (Laux, T., Talk Presented at the XVI International Botanical Congress Meeting, 1-7 de agosto de 1999, St. Louis, Mo.).

En un aspecto, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 o WOX9 (van der Graaff et al., 2009, Genome Biology 10:248). El polipéptido de homeosecuencia w Us /WOX puede ser un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX de monocotiledónea. En diversos aspectos, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX puede ser un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX de cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. Como alternativa, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX puede ser un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX de dicotiledónea. En particular, la presente divulgación proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NOS: 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16. Se proporcionan además polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico (SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 y 15) descrita en este documento, y fragmentos y variantes de la misma.

El polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX puede derivar de una planta que es un miembro de la familia Poaceae. Ejemplos no limitantes de plantas adecuadas de las que pueden derivar el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX incluyen cultivos de cereales incluyendo, aunque sin limitación, cebada, maíz, avena, arroz, centeno, sorgo, trigo, mijo, triticale; cultivos de tallos y hojas incluyendo, aunque sin limitación, bambú, carrizo, poa de los prados, juncos, ballico, caña de azúcar; hierbas de pasto, hierbas ornamentales y otras hierbas tales como pasto varilla y césped.

En un aspecto adicional, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX usado en los métodos divulgados puede derivar de cualquier planta, incluyendo plantas superiores, por ejemplo, clases de Angiospermae y Gymnospermae. Plantas de las subclases de las Dicotylodenae y las Monocotyledonae son adecuadas. Especies adecuadas pueden provenir de la familia Acanthaceae, Alliaceae, Alstroemeriaceae, Amaryllidaceae, Apocynaceae, Arecaceae, Asteraceae, Berberidaceae, Bixaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Cannabaceae, Caryophyllaceae, Cephalotaxaceae, Chenopodiaceae, Colchicaceae, Cucurbitaceae, Dioscoreaceae, Ephedraceae, Erythroxylaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Lamiaceae, Linaceae, Lycopodiaceae, Malvaceae, Melanthiaceae, Musaceae, Myrtaceae, Nyssaceae, Papaveraceae, Pinaceae, Plantaginaceae, Poaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Salicaceae, Sapindaceae, Solanaceae, Taxaceae, Theaceae, y Vitaceae.

Especies adecuadas de las que puede derivar el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX incluyen miembros del género Abelmoschus, Abies, Acer, Agrostis, Allium, Alstroemeria, Ananas, Andrographis, Andropogon, Artemisia, Arundo, Atropa, Berberis, Beta, Bixa, Brassica, Calendula, Camellia, Camptotheca, Cannabis, Capsicum, Carthamus, Catharanthus, Cephalotaxus, Chrysanthemum, Cinchona, Citrullus, Coffea, Colchicum, Coleus, Cucumis, Cucurbita, Cynodon, Datura, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Ephedra, Erianthus, Erythroxylum, Eucalyptus, Festuca, Fragaria, Galanthus, Glycine, Gossypium, Helianthus, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Jatropha, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Lycopodium, Manihot, Medicago, Mentha, Miscanthus, Musa, Nicotiana, Oryza, Panicum, Papaver, Parthenium, Pennisetum, Petunia, Phalaris, Phleum, Pinus, Poa, Poinsettia, Populus, Rauwolfia, Ricinus, Rosa, Saccharum, Salix, Sanguinaria, Scopolia, Secale, Solanum, Sorghum, Spartina, Spinacea, Tanacetum, Taxus, Theobroma, Triticosecale, Triticum, Uniola, Veratrum, Vinca, Vitis, y Zea.

En un aspecto adicional, el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX puede derivar de una planta que es importante o interesante para agricultura, horticultura, biomasa para la producción de moléculas de combustible líquido y otros productos químicos y/o silvicultura. Ejemplos no limitantes incluyen, por ejemplo, Panicum virgatum (pasto varilla), Sorghum bicolor (sorgo, hierba del Sudán), Miscanthus giganteus (miscanto), Saccharum sp. (caña), Populus balsamifera (álamo), Zea mays (maíz), Glycine max (soja), Brassica napus (colza), Triticum aestivum (trigo), Gossypium hirsutum (algodón), Oryza sativa (arroz), Helianthus annuus (girasol), Medicago sativa (alfalfa), Beta vulgaris (remolacha azucarera), Pennisetum glaucum (espadaña), Panicum spp., Sorghum spp., Miscanthus spp., Saccharum spp., Erianthus spp., Populus spp., Andropogon gerardii (hierba tallo azul grande), Pennisetum purpureum (hierba de elefante), Phalaris arundinacea (alpiste cinta), Cynodon dactylon (gramilla colorada), Festuca arundinacea (festuca alta), Spartina pectinata (espartillo de la pradera), Arundo donax (caña común), Secale cereale (centeno), Salix spp. (sauce), Eucalyptus spp. (eucalipto), Triticosecale spp. (triticum-trigo X centeno), bambú, Carthamus tinctorius (cártamo), Jatropha curcas (jatrofa), Ricinus communis (ricino), Elaeis guineensis (palma), Linum usitatissimum (lino), Brassica juncea, Manihot esculenta (mandioca), Lycopersicon esculentum (tomate), Lactuca sativa (lechuga), Musa paradisiaca (plátano), Solanum tuberosum (patata), Brassica oleracea (brécol, coliflor, coles de Bruselas), Camellia sinensis (té), Fragaria ananassa (fresa), Theobroma cacao (cacao), Coffea arabica (café), Vitis vinifera (uva), Ananas comosus (piña), Capsicum annum (pimiento picante y dulce), Allium cepa (cebolla), Cucumis melo (melón), Cucumis sativus (pepino), Cucurbita maxima (calabaza), Cucurbita moschata (calabaza), Spinacea oleracea (espinaca), Citrullus lanatus (sandía), Abelmoschus esculentus (quingombó), Solanum melongena (berenjena), Papaver somniferum (adormidera), Papaver orientale, Taxus baccata, Taxus brevifolia, Artemisia annua, Cannabis sativa, Camptotheca acuminate, Catharanthus roseus, Vinca rosea, Cinchona officinalis, Colchicum autumnale, Veratrum californica, Digitalis lanata, Digitalis purpurea, Dioscorea spp., Andrographis paniculata, Atropa belladonna, Datura stomonium, Berberis spp., Cephalotaxus spp., Ephedra sinica, Ephedra spp., Erythroxylum coca, Galanthus wornorii, Scopolia spp., Lycopodium serratum (=Huperzia serrata), Lycopodium spp., Rauwolfia serpentina, Rauwolfia spp., Sanguinaria canadensis, Hyoscyamus spp., Calendula officinalis, Chrysanthemum parthenium, Coleus forskohlii, Tanacetum parthenium, Parthenium argentatum (guayule), Hevea spp. (caucho), Mentha spicata (menta), Mentha piperita (menta), Bixa orellana, Alstroemeria spp., Rosa spp. (rosa), Dianthus caryophyllus (clavel), Petunia spp. (petunia), Poinsettia pulcherrima (poinsetia), Nicotiana tabacum (tabaco), Lupinus albus (altramuz), Uniola paniculata (avena), césped inclinado (Agrostis spp.), Populus tremuloides (álamo), Pinus spp. (pino), Abies spp. (abeto), Acer spp. (arce), Hordeum vulgare (cebada), Poa pratensis (pasto azul), Lolium spp. (ballico), Phleum pratense (fleo) y coníferas. Son de interés plantas que se cultivan para la producción de energía, los llamados cultivos energéticos, tales como cultivos energéticos basados en celulosa como Panicum virgatum (pasto varilla), Sorghum bicolor (sorgo, hierba del Sudán), Miscanthus giganteus (miscanto), Saccharum sp. (caña), Populus balsamifera (álamo), Andropogon gerardii (hierba tallo azul grande), Pennisetum purpureum (hierba de elefante), Phalaris arundinacea (alpiste cinta), Cynodon dactylon (gramilla colorada), Festuca arundinacea (festuca alta), Spartina pectinata (espartillo de la pradera), Medicago sativa (alfalfa), Arundo donax (caña común), Secale cereale (centeno), Salix spp. (sauce), Eucalyptus spp. (eucalipto), Triticosecale spp. (triticum-trigo X centeno) y bambú; y cultivos energéticos basados en almidón como Zea mays (maíz) y Manihot esculenta (mandioca); y cultivos energéticos basados en sacarosa como Saccharum sp. (caña de azúcar) y Beta vulgaris (remolacha azucarera); y cultivos energéticos productores de biodiésel como Glycine max (soja), Brassica napus (colza), Helianthus annuus (girasol), Carthamus tinctorius (cártamo), Jatropha curcas (jatrofa), Ricinus communis (ricino), Elaeis guineensis (palma), Linum usitatissimum (lino) y Brassica juncea.

El polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX puede derivar de una fuente de energía renovable de biomasa. Ejemplos de plantas fuente de energía renovable de biomasa incluyen las descritas en este documento.

El polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX usado en los métodos y composiciones divulgados puede ser un polipéptido WUS1. En un aspecto, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En un aspecto adicional, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz o arroz. En un aspecto adicional, el polipéptido WUS1 es un polipéptido WUS1 de maíz. En particular, el polipéptido WUS1 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4 o el polipéptido WUS1 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO:3.

El polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX usado en los métodos y composiciones divulgados puede ser un polipéptido WUS2. En diversos aspectos, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS de cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo. En un aspecto, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En un aspecto adicional, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz o arroz. En un aspecto adicional, el polipéptido WUS2 es un polipéptido WUS2 de maíz. En particular, el polipéptido WUS2 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6 o el polipéptido WUS2 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO:5.

El polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX usado en los métodos y composiciones divulgados puede ser un polipéptido WUS3. En un aspecto, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En un aspecto adicional, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz o arroz. En un aspecto adicional, el polipéptido WUS3 es un polipéptido WUS3 de maíz. En particular, el polipéptido WUS3 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8 o el polipéptido WUS3 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO:7.

El polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX usado en los métodos y composiciones divulgados puede ser un polipéptido WOX2A. En un aspecto, el polipéptido WOX2A es un polipéptido WOX2A de maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En un aspecto adicional, el polipéptido WOX2A es un polipéptido WUS2A de maíz o arroz. En un aspecto adicional, el polipéptido WOX2A es un polipéptido WOX2A de maíz. En particular, el polipéptido WOX2A comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10 o el polipéptido WOX2A está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO:9.

El polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX usado en los métodos y composiciones divulgados puede ser un polipéptido WOX4. En un aspecto, el polipéptido WOX4 es un polipéptido WOX4 de maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En un aspecto adicional, el polipéptido WOX4 es un polipéptido WUS4 de maíz o arroz. En un aspecto adicional, el polipéptido WOX4 es un polipéptido WOX4 de maíz. En particular, el polipéptido WOX4 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:12 o el polipéptido WOX4 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO:11.

El polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX usado en los métodos y composiciones divulgados puede ser un polipéptido WOX5A. En un aspecto, el polipéptido WOX5A es un polipéptido WOX5A de maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En un aspecto adicional, el polipéptido WOX5A es un polipéptido WUS5A de maíz o arroz. En un aspecto adicional, el polipéptido WOX5A es un polipéptido WOX5A de maíz. En particular, el polipéptido WOX5A comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:14 o el polipéptido WOX5A está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 13.

El polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX usado en los métodos y composiciones divulgados puede ser un polipéptido WOX9. En un aspecto, el polipéptido WOX9 es un polipéptido WOX9 de maíz, sorgo, arroz o Setaria sp. En un aspecto adicional, el polipéptido WOX9 es un polipéptido WUS9 de maíz o arroz. En un aspecto adicional, el polipéptido WOX9 es un polipéptido WOX9 de maíz. En particular, el polipéptido WOX9 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16 o el polipéptido WOX9 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO:15.

La presente divulgación abarca composiciones de ácido nucleico o proteína WUS/WOX aislada o sustancialmente purificada. Los fragmentos y variantes de las secuencias de nucleótidos y proteínas WUS/WOX codificadas por las mismas también están englobadas por la presente divulgación. Por "fragmento" se pretende una parte de la secuencia de nucleótidos o una parte de la secuencia de aminoácidos y, por tanto, la proteína codificada por la misma. Los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden codificar fragmentos proteínicos que conservan la actividad biológica de la proteína natural y, por tanto, tienen actividad WUS/WOX. Como alternativa, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos útiles como sondas de hibridación en general no codifican fragmentos proteínicos que conservan actividad biológica. Por tanto, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden variar de al menos aproximadamente 20 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos y hasta la secuencia de nucleótidos de longitud completa que codifica las proteínas de la divulgación.

Un fragmento de una secuencia de nucleótidos WUS/WOX que codifica una parte biológicamente activa de una proteína WUS/WOX de la divulgación codificará al menos 15, 25, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 709 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en una proteína WUS/WOX de longitud completa de la divulgación. Los fragmentos de una secuencia de nucleótidos WUS/WOX útiles como sondas de hibridación o cebadores de PCR en general no tienen que codificar una parte biológicamente activa de una proteína WUS/WOX.

Por tanto, un fragmento de una secuencia de nucleótidos WUS/WOX puede codificar una parte biológicamente activa de una proteína WUS/WOX, o puede ser un fragmento que puede usarse como sonda de hibridación o cebador de PCR usando métodos divulgados a continuación. Una parte biológicamente activa de una proteína WUS/WOX puede prepararse aislando una parte de una de las secuencias de nucleótidos WUS/WOX de la divulgación, expresando la parte codificada de la proteína WUX/WOX (por ejemplo, por expresión recombinante in vitro) y evaluando la actividad de la parte codificada de la proteína WUS/WOX. Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos WUS/WOX comprenden al menos 16, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300 o 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200 nucleótidos contiguos, o hasta el número de nucleótidos presentes en una secuencia de nucleótidos WUS/WOX de longitud completa divulgada en este documento (por ejemplo, SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 y 15).

"Variantes" pretende significar secuencias sustancialmente similares. Para los polinucleótidos, las variantes conservativas incluyen aquellas secuencias que, a causa de la degeneración del código genético, codifican la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos WUS/WOX de la divulgación. Los polinucleótidos variantes también incluyen polinucleótidos derivados sintéticamente, tales como los generados, por ejemplo, usando mutagénesis dirigida al sitio, pero que aún codifican una proteína WUS/WOX de la divulgación. En general, las variantes de un polinucleótido particular de la divulgación tendrán al menos aproximadamente un 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con ese polinucleótido particular, que se determina por programas de alineación de secuencias y parámetros descritos en otra parte en este documento.

Proteína "variante" pretende significar una proteína derivada de la proteína natural por eliminación o adición de uno o más aminoácidos en uno o más sitios internos en la proteína natural y/o sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína natural. Las proteínas variantes englobadas por la presente divulgación son biológicamente activas, es decir, siguen teniendo la actividad biológica deseada de la proteína natural, es decir, el polipéptido tiene actividad WUS/WOX. Dichas variantes pueden ser el resultado de, por ejemplo, polimorfismo genético o manipulación humana. Las variantes biológicamente activas de una proteína WUS/WOX natural de la divulgación tendrán al menos aproximadamente un 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la proteína natural determinada por programas de alineación de secuencias y parámetros descritos en otra parte en este documento. Una variante biológicamente activa de una proteína de la divulgación puede diferir de esa proteína en tan poco como 1-15 residuos aminoacídicos, tal poco como 1-10, tal como 6-10, tan poco como 5, tan poco como 4, 3, 2 o incluso 1 residuo aminoacídico.

Las proteínas WUS/WOX de la divulgación pueden alterarse de diversas maneras incluyendo sustituciones, eliminaciones, truncamientos e inserciones aminoacídicas. Los métodos para dichas manipulaciones en general son conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden prepararse variantes de secuencia de aminoácidos de las proteínas WUS/WOX por mutaciones en el ADN. Los métodos para mutagénesis y alteraciones de la secuencia de nucleótidos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; patente de Estados Unidos n.° 4.873.192; Walker y Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nueva York) y las referencias citadas en ese documento. Pueden encontrarse directrices en cuanto a sustituciones aminoacídicas apropiadas que no afectan a la actividad biológica de la proteína de interés en el modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.). Las sustituciones conservativas, tales como intercambio de un aminoácido con otro que tenga propiedades similares, pueden ser óptimas.

IV. Métodos de transformación

Los métodos y composición de la divulgación pueden utilizar una diversidad de métodos de transformación según lo apropiado. Es decir, los protocolos de transformación, así como los protocolos para introducir secuencias de nucleótidos en plantas pueden variar dependiendo del tipo de planta o célula vegetal, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea, que es la diana de transformación. Los métodos adecuados de introducción de secuencias de nucleótidos en células vegetales y posterior inserción en el genoma de la planta incluyen microinyección (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334), electroporación (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606), transformación mediada por Agrobacterium (Townsend et al., patente de Estados Unidos n.° 5.563.055; Zhao et al., patente de Estados Unidos n.° 5.981.840), transferencia génica directa (Paszkowski et al. (1984) EMBO J.3:2717-2722) y aceleración de partículas balísticas (véase, por ejemplo, Sanford et al., patente de Estados Unidos n.° 4.945.050; Tomes et al., patente de Estados Unidos n.° 5.879.918; Tomes et al., patente de Estados Unidos n.° 5.886,244; Bidney et al., patente de Estados Unidos n.° 5.932.782; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment," en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg y Phillips (Springer-Verlag, Berlín); y McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926). Véase también Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebolla); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja); Finer y McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P: 175-182 (soja); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (maíz); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); Tomes, patente de Estados Unidos n.° 5.240.855; Buising et al., patente de Estados Unidos n.° 5.322.783 y 5.324.646; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer in Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment," en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg (Springer-Verlag, Berlín) (maíz); Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (maíz); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833-839 (maíz); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (Londres) 311:763-764; Bowen et al., patente de Estados Unidos n.° 5.736.369 (cereales); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) en The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, Nueva York), pág. 197-209 (polen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 y Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformación mediada por fibras); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporación); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 y Christou y Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (maíz mediante Agrobacterium tumefaciens).

Los métodos y composición de la presente divulgación pueden usarse para transformación de cualquier especie de planta incluyendo, aunque sin limitación, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Ejemplos de especies de plantas de interés incluyen, aunque sin limitación, maíz (Zea mays), Brassica sp. (por ejemplo, B. napus, B. rapa, B. júncea), particularmente aquellas especies de Brassica útiles como fuente de aceite de semilla, alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeno (Secale cereale), sorgo (Sorghumbicolor, Sorghum vulgare), mijo (por ejemplo, espadaña (Pennisetumglaucum), mijo común (Panicum miliaceum), panizo (Setaria italica), coracán (Eleusine coracana)), girasol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), patata (Solanum tuberosum), cacahuetes (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucífera), piña (Ananas comosus), árboles cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia sinensis), plátano (Musa spp.), aguacate (Persea americana), higo (Ficus casica), guayaba (Psidium guajava), mango (Mangifera indica), oliva (Olea europaea), papaya (Carica papaya), anacardo (Anacardium occidentale), macadamia (Macadamia integrifolia), almendra (Prunus amygdalus), remolacha azucarera (Beta vulgaris), caña de azúcar (Saccharum spp.), avena, cebada, hortalizas, plantas ornamentales y coníferas.

Las hortalizas incluyen tomates (Lycopersicon esculentum), lechuga (por ejemplo, Lactuca sativa), judías verdes (Phaseolus vulgaris), habas (Phaseolus limensis), guisantes (Lathyrus spp.) y miembros del género Cucumis tales como pepino (C. sativus), cantalupo (C. cantalupensis) y melón (C. melo). Las plantas ornamentales incluyen azalea (Rhododendron spp.), hortensia (Macrophylla hydrangea), hibisco (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipanes (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petunias (Petunia hybrida), claveles (Dianthus caryophyllus), poinsetia (Euphorbia pulcherrima) y crisantemo.

Las coníferas que pueden emplearse en la práctica de la presente divulgación incluyen, por ejemplo, pinos tales como pino taeda (Pinus taeda), pino del incienso (Pinus elliotii), pino ponderosa (Pinus ponderosa), pino murrayana (Pinus contorta) y pino de Monterrey (Pinus radiata); pino Oregón (Pseudotsuga menziesii); tsuga occidental (Tsuga canadensis); tsuga oriental (Tsuga heterophylla); tsuga montañosa (Tsuga mertensiana); alerce o pino alerce (Larixoccidentalis); pícea blanca (Picea glauca); secuoya (Sequoia sempervirens); abetos verdaderos tales como abeto plateado (Abies amabilis) y abeto balsámico (Abies balsamea); y cedros tales como cedro rojo occidental (Thuja plicata) y falso ciprés de Nootka (Chamaecyparis nootkatensis). Las especies de eucaliptos pueden emplearse en la práctica de la presente divulgación, incluyendo E. grandis (y sus híbridos, como "urograndis"), E. globulus, E. camaldulensis, E. tereticornis, E. viminalis, E. nitens, E. saligna y E. urophylla. De forma óptima, las plantas de la presente divulgación son plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, alfalfa, girasol, Brassica, soja, algodón, cártamo, cacahuete, sorgo, trigo, mijo, tabaco, etc.), de forma más óptima plantas de maíz y soja, de forma aún más óptima, plantas de maíz.

Plantas de interés particular incluyen plantas de cereales que proporcionan semillas de interés, plantas de semillas oleaginosas y plantas leguminosas. Semillas de interés incluyen semillas de cereales, tales como maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, centeno, etc. Plantas de semillas oleaginosas incluyen algodón, soja, cártamo, girasol, Brassica, maíz, alfalfa, palma, coco, etc. Plantas leguminosas incluyen, aunque sin limitación, judías y guisantes. Las judías incluyen, aunque sin limitación, guar, algarrobo, fenugreco, soja, judías de jardín, caupí, soja verde, judía blanca, haba, lentejas y garbanzos.

Un marcador de selección comprende un segmentos de ADN que permite identificar o seleccionar una o frente a una molécula o una célula que la contiene, a menudo en condiciones particulares. Estos marcadores pueden codificar una actividad, tal como, aunque sin limitación, producción de ARN, péptido o proteína, o pueden proporcionar un sitio de unión para ARN, péptidos, proteínas, compuestos inorgánicos y orgánicos o composiciones. Ejemplos de marcadores de selección incluyen, aunque sin limitación, segmentos de ADN que comprenden sitios de enzimas de restricción; segmentos de ADN que codifican productos que proporcionan resistencia contra compuestos de lo contrario tóxicos (por ejemplo, antibióticos, tales como espectinomicina, ampicilina, kanamicina, tetraciclina, Basta, neomicina fosfotransferasa II (NEO) e higromicina fosfotransferasa (HPT)); segmentos de ADN que codifican productos que de lo contrario están ausentes en la célula destinataria (por ejemplo, genes de ARNt, marcadores auxotróficos); segmentos de ADN que codifican productos que pueden identificarse fácilmente (por ejemplo, marcadores fenotípicos tales como p-galactosidasa, GUS; proteínas fluorescentes tales como proteína fluorescente verde (GFP), cian (CFP), amarilla (YFP), roja (RFP), y proteínas de superficie celular); la generación de nuevos sitios de cebador para PCR (por ejemplo, la yuxtaposición de dos secuencias de ADN que no estaban yuxtapuesta previamente), la inclusión de secuencias de ADN que no actúan sobre o actúan mediante una endonucleasa de restricción u otra enzima modificadora de ADN, producto químico, etc.; y la inclusión de secuencias de ADN requeridas para una modificación específica (por ejemplo, metilación) que permite su identificación.

Marcadores de selección adicionales incluyen genes que confieren resistencia a compuestos herbicidas, tales como glifosato, sulfonilureas, glufosinato amonio, bromoxinil, imidazolinonas y 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Véase en general, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511; Christopherson etal. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314-6318; Yao et al. (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley et al. (1980) en The Operon, pág. 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48:555-566; Brown et al. (1987) Cell 49:603-612; Figge et al. (1988) Cell 52:713-722; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5400-5404; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549-2553; Deuschle et al. (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1917-1921; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952-3956; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-5076; Wyborski et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillen y Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlín); Gill et al. (1988) Nature 334:721-724. La lista anterior de marcadores de selección no se entiende como limitante. Puede usarse cualquier marcador de selección en los métodos y composiciones.

Como el periodo de embriogénesis somática y maduración de embriones para el método descrito está así truncado, la pauta de selección debe producirse rápidamente en consecuencia para eliminar eficazmente los embriones no transgénicos y las plantas T0 germinadas resultantes. Como resultado, dependiendo de la rigurosidad del agente selectivo durante periodos cortos, el porcentaje de "escapes" recuperados (o plantas T0 regeneradas que son de tipo silvestre) aumenta. Para eliminar los escapes, la selección in vitro tradicional de los acontecimientos transgénicos en cereales se ha producido durante un periodo de 1,5 a 3 meses con múltiples subcultivos en medio de selección que se requiere para acumular suficiente tejido de callo para la regeneración (Gordon-Kamm et al., 1990, Plant Cell 2:603-618; Negrotto et al., 2000, Plant Cell Reports; Zhao et al., 2001, Mol. Breed. 8, 323-333; Wu et al., 2014, In Vitro Cell. Dev. Biol. 50:9-18; véase Kan Wang, 2014, Agrobacterium Protocols, Vol. 1, tercera edición, Springer-Verlag, Nueva York para revisión). La presente divulgación elimina mucho de esta selección de larga duración eliminando el cultivo de callo y en su lugar progresando directamente a través de embriogénesis rápida y germinación en plantas T0 independientes (representando cada una un acontecimiento de integración separado), que requieren agentes selectivos que trabajen rápidamente.

Determinados marcadores de selección útiles en el presente método incluyen, aunque sin limitación, el gen HRA de maíz (Lee et al., 1988, EMBO J 7:1241-1248) que confiere resistencia a sulfonilureas e imidazolinonas, el gen GAT que confiere resistencia a glifosato (Castle et al., 2004, Science 304:1151-1154), genes que confieren resistencia a espectinomicina tal como el gen aadA (Svab et al., 1990, Plant Mol Biol. 14:197-205) y el gen bar que confiere resistencia a glufosinato amonio (White et al., 1990, Nucl. Acids Res. 25:1062), y PAT (o moPAT para maíz, véase Rasco-Gaunt et al., 2003, Plant Cell Rep.21:569-76) y el gen PMI que permite el crecimiento en medio que contiene manosa (Negrotto et al., 2000, Plant Cell Rep. 22:684-690) son muy útiles para la selección rápida durante el breve tiempo transcurrido englobado por la embriogénesis somática y la maduración de embriones del método. Sin embargo, dependiendo del marcador de selección usado y el cultivo, endogámico o variedad que se esté transformando, puede variar el porcentaje de escapes de tipo silvestre. En maíz y sorgo, el gen HRA es eficaz en reducir la frecuencia de escapes de tipo silvestre.

V. Métodos para mejorar rasgos y características vegetales

La presente divulgación proporciona composiciones y métodos novedosos para producir plantas transgénicas con eficacia y velocidad aumentadas. Los métodos y composiciones divulgadas pueden comprender además polinucleótidos que proporcionan rasgos y características mejoradas.

Como se usa en este documento, "rasgo" se refiere a una característica fisiológica, morfológica, bioquímica o física de una planta o material o célula vegetal particular. En algunos casos, esta característica es visible a simple vista, tal como tamaño de la semilla o la planta, o puede medirse por técnicas bioquímicas, tal como detectando el contenido de proteínas, almidón o aceite de la semilla u hojas, o por observación de un proceso metabólico o fisiológico, por ejemplo, midiendo la captación de dióxido de carbono, o por la observación del nivel de expresión de un gen o genes, por ejemplo, empleando análisis de Northern, RT-PCR, ensayos de expresión génica en micromatriz o sistemas de expresión de genes indicadores, o por observaciones agrícolas tales como tolerancia a las agresiones, producción o tolerancia a patógenos. Un "rasgo potenciado", como se usa al describir los aspectos de la presente divulgación incluye eficacia del uso de agua o tolerancia a las sequías mejorada o potenciada, tolerancia a agresión osmótica, tolerancia a agresión por alta salinidad, tolerancia a agresión térmica, tolerancia potenciada al frío, incluyendo tolerancia a germinación en frío, producción aumentada, eficacia del uso de nitrógeno potenciada, crecimiento y desarrollo temprano de la planta, crecimiento y desarrollo de la planta tardío, contenido potenciado de proteínas en la planta y producción potenciada de aceite en las semillas.

Puede usarse cualquier polinucleótido de interés en los métodos de la divulgación. Diversos cambios en el fenotipo son de interés incluyendo modificación de la composición de ácidos grasos en una planta, alteración del contenido de aminoácidos, contenido de almidón o contenido de carbohidratos de una planta, alteración del mecanismo de defensa contra patógenos de la planta, influencia en el tamaño del grano , y carga de sacarosa. El gen de interés también puede estar implicado en la regulación del flujo entrante de nutrientes, y en la regulación de la expresión de genes de fitato, particularmente para reducir los niveles de fitato en la semilla. Estos resultados pueden conseguirse proporcionando la expresión de productos heterólogos o la expresión aumentada de productos endógenos en las plantas. Como alternativa, los resultados pueden conseguirse proporcionando una reducción de la expresión de uno o más productos endógenos, particularmente enzimas o cofactores en la planta. Estos cambios provocan un cambio en el fenotipo de la planta transformada.

Los genes de interés son un reflejo de los mercados comerciales y los intereses de los implicados en el desarrollo del cultivo. Los cultivos y mercados de interés cambian, y según se abren las naciones en desarrollo a los mercados mundiales, surgirán también nuevos cultivos y tecnologías. Además, según aumenta la comprensión de los rasgos y características agronómicas tales como la producción y heterosis, la elección de genes para su transformación cambiará en consecuencia.

Las categorías generales de genes de interés incluyen, por ejemplo, aquellos genes implicados en la información, tales como dedos de cinc, aquellos implicados en la comunicación, tales como cinasas y aquellos implicados en tareas constitutivas, tales como proteínas de choque térmico. Categorías más específicas de transgenes, por ejemplo, incluyen genes que codifican rasgos importantes para agronomía, resistencia a insectos, resistencia a enfermedades, resistencia a herbicidas, esterilidad, características del grano y productos comerciales. Los genes de interés incluyen, en general, aquellos implicados en el contenido de aceite, almidón, carbohidratos o el metabolismo de los nutrientes, así como aquellos que afectan al tamaño del grano y la carga de sacarosa.

Los polinucleótidos introducidos en un explante por los métodos y composiciones divulgados pueden estar unidos de forma funcional a un promotor adecuado. "Promotor" significa una región de ADN que está en dirección 5' del inicio de la transcripción y está implicada en el reconocimiento y unión de la ARN polimerasa y otras proteínas para iniciar la transcripción, incluyendo o no la UTR 5'. Un "promotor vegetal" es un promotor que puede iniciar la transcripción en células vegetales sea su origen o no de una célula vegetal. Promotores vegetales ejemplares incluyen, aunque sin limitación, los que se obtienen de plantas, virus de plantas y bacterias que comprenden genes expresados en células vegetales tales como de Agrobacterium o Rhizobium. Ejemplos de promotores bajo control del desarrollo incluyen promotores que inician la transcripción preferentemente en determinados tejidos, tales como hojas, raíces o semillas. Dichos promotores se denominan "con preferencia de tejido". Los promotores que inician la transcripción solamente en determinados tejidos se denominan "específicos de tejido". Un promotor específico de "tipo celular" dirige principalmente la expresión en determinados tipos celulares en uno o más órganos, por ejemplo, células vasculares en raíces y hojas. Un promotor "inducible" o "reprimible" puede ser un promotor que está bajo control ambiental o exógeno. Ejemplos de condiciones ambientales que pueden lograr la transcripción por promotores inducibles incluyen condiciones anaeróbicas, o determinados productos químicos, o la presencia de luz. Como alternativa, el control exógeno de un promotor inducible o reprimible puede lograrse proporcionando un producto químico adecuado u otro agente que, mediante interacción con polipéptidos diana, provoca la inducción o represión del promotor. Los promotores específicos de tejido, con preferencia de tejido, específicos de tipo celular e inducibles constituyen la clase de promotores "no constitutivos". Un promotor "constitutivo" es un promotor que es activo en la mayoría de circunstancias. Como se usa en este documento, "orientación antisentido" incluye referencias a una secuencia polinucleotídica que está unida de forma funcional a un promotor en una orientación donde se transcribe la hebra de antisentido. La hebra de antisentido es suficientemente complementaria a un producto de transcripción endógeno, de modo que la traducción del producto de transcripción endógeno a menudo se inhibe. "Unido de forma funcional" se refiere a la asociación de dos o más fragmentos de ácido nucleico en un solo fragmento de ácido nucleico, de modo que la función de uno se ve afectada por el otro. Por ejemplo, un promotor está unido de forma funcional con una secuencia codificante cuando puede afectar a la expresión de esa secuencia codificante (es decir, que la secuencia codificante está bajo el control transcripcional del promotor). Las secuencias codificantes pueden unirse de forma funcional a secuencias reguladoras en orientación de sentido o de antisentido.

Los rasgos agronómicamente importantes tales como contenido de aceite, almidón y proteínas pueden alterarse genéticamente además de usando métodos de fitomejoramiento tradicionales. Las modificaciones incluyen aumentar el contenido de ácido oleico, aceites saturados e insaturados, aumentar los niveles de lisina y azufre, proporcionar aminoácidos esenciales y también la modificación del almidón. Se describen modificaciones de la proteína hordotionina en las patentes de Estados Unidos n.° 5.703.049, 5.885.801,5.885.802 y 5.990.389. Otro ejemplo es la proteína de semilla rica en lisina y/o azufre codificada por la albúmina 2S de soja descrita en la patente de Estados Unidos n.° 5.850.016, y el inhibidor de quimotripsina de cebada, descrito en Williamson etal. (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106.

Pueden prepararse derivados de las secuencias codificantes por mutagénesis dirigida al sitio para aumentar el nivel de aminoácidos preseleccionados en el polipéptido codificado. Por ejemplo, podrían usarse proteínas vegetales ricas en metionina tales como de semillas de girasol (Lilley et al. (1989) Proceedings of the World Congress on Vegetable Protein Utilization in Human Foods and Animal Feedstuffs, ed. Applewhite (American Oil Chemists Society, Champaign, Ill.), pág.

497-502); maíz (Pedersen et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:6279; Kirihara et al. (1988) Gene 71:359); y arroz (Musumura et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:123). Otros genes agronómicamente importantes codifican látex, Floury 2, factores de crecimiento, factores de almacenamiento en semillas y factores de transcripción.

Los genes de resistencia a insectos pueden codificar resistencia a plagas que son un gran obstáculo para la producción, tales como el gusano de la raíz, gusano cortador y barrenador del maíz europeo. Dichos genes incluyen, por ejemplo, genes de proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (patentes de Estados Unidos n.° 5.366.892; 5.747.450; 5.736.514; 5.723.756; 5.593.881; y Geiser et al. (1986) Gene 48:109); y similares.

Los genes que codifican rasgos de resistencia a enfermedades incluyen genes de destoxificación, tales como contra fumonosina (patente de Estados Unidos n.° 5.792.931); genes de avirulencia (avr) y resistencia a enfermedades (R) (Jones et al. (1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262:1432; y Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089).

Los rasgos de resistencia a herbicidas pueden incluir genes que codifican resistencia a herbicidas que actúan inhibiendo la acción de la acetolactato sintasa (ALS), en particular los herbicidas de tipo sulfonilurea (por ejemplo, el gen de la acetolactato sintasa (ALS) que contiene mutaciones que dan lugar a dicha resistencia, en particular las mutaciones S4 y/o Hra), genes que codifican resistencia a herbicidas que actúan inhibiendo la acción de la glutamina sintasa, tal como fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar), glifosato (por ejemplo, el gen EPSPS y el gen GAT; véase, por ejemplo, la publicación de Estados Unidos n.° 20040082770 y el documento WO 03/092360) u otros genes de este tipo conocidos en la técnica. El gen bar codifica resistencia al herbicida basta, el gen nptlI codifica resistencia a los antibióticos kanamicina y geneticina, y los mutantes del gen ALS codifican resistencia al herbicida clorsulfurón.

También pueden codificarse genes de esterilidad en un casete de expresión y proporcionar una alternativa al descope físico. Ejemplos de genes usados de estas maneras incluyen genes con preferencia de tejido masculino y genes con fenotipos de esterilidad masculina tales como QM, descrito en la patente de Estados Unidos n.° 5.583.210. Otros genes incluyen cinasas y aquellos que codifican compuestos tóxicos para el desarrollo de gametófitos masculinos o femeninos.

La calidad del grano se refleja en rasgos tales como los niveles y tipos de aceites, saturados e insaturados, la calidad y cantidad de aminoácidos esenciales, y los niveles de celulosa. En el maíz, se describen proteínas hordotionina modificadas en las patentes de Estados Unidos n.° 5.703.049, 5.885.801,5.885.802 y 5.990.389.

También pueden codificarse rasgos comerciales en un gen o genes que podrían aumentar, por ejemplo, la producción de almidón para etanol, o proporcionar expresión de proteínas. Otro uso comercial importante de las plantas transformadas es la producción de polímeros y bioplásticos, tal como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 5.602.321. Genes tales como p-cetotiolasa, PHBasa (polihidroxibutirato sintasa) y acetoacetil-CoA reductasa (véase Schubert et al. (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847) facilitan la expresión de polihidroxialcanoatos (PHA).

Los productos exógenos incluyen enzimas y productos vegetales, así como aquellos de otras fuentes, incluyendo procariotas y otros eucariotas. Dichos productos incluyen enzimas, cofactores y hormonas. El nivel de proteínas, particularmente proteínas modificadas que tienen distribución mejorada de aminoácidos para mejorar el valor nutritivo de la planta, puede aumentarse. Esto se consigue mediante la expresión de dichas proteínas que tienen un contenido potenciado de aminoácidos.

En un aspecto, rasgos agronómicos adicionales de interés que pueden introducirse en un explantes con eficacia y velocidad aumentadas son rasgos tales como producción aumentada u otro rasgo que proporcione un valor aumentado de la planta incluyendo, por ejemplo, calidad mejorada de la semilla. Son de particular interés rasgos que proporcionan eficacia del uso de agua o tolerancia a las sequías mejorada o potenciada, tolerancia a agresión osmótica, tolerancia a agresión por alta salinidad, tolerancia a agresión térmica, tolerancia potenciada al frío, incluyendo tolerancia a germinación en frío, producción aumentada, eficacia del uso de nitrógeno potenciada, crecimiento y desarrollo temprano de la planta, crecimiento y desarrollo de la planta tardío, contenido potenciado de proteínas en la planta y producción potenciada de aceite en las semillas.

Muchos rasgos agronómicos pueden afectar a la "producción" incluyendo, sin limitación, la altura de la planta, el número de vainas, la posición de las vainas en la planta, el número de internudos, la incidencia de desintegración de la vaina, tamaño del grano, eficacia de nodulación y fijación de nitrógeno, eficacia de asimilación de nutrientes, resistencia a agresión biótica y abiótica, asimilación de carbono, arquitectura de la planta, resistencia a encamado, porcentaje de germinación de las semillas, vigor de las plántulas y rasgos juveniles. Otros rasgos que pueden afectar a la producción incluyen eficacia de germinación (incluyendo germinación en condiciones de agresión), tasa de crecimiento (incluyendo tasa de crecimiento en condiciones de agresión), número de espigas, número de semillas por espiga, tamaño de la semilla, composición de la semilla (almidón, aceite, proteínas) y características del llenado de la semilla. También es de interés la generación de plantas transgénicas que demuestran propiedades fenotípicas deseables que puedan conferir o no un aumento en la producción global de la planta. Dichas propiedades incluyen potenciación de la morfología de la planta, la fisiología de la planta o componentes mejorados de la semilla madura recogida de la planta transgénica.

La "producción aumentada" de una planta transgénica de la presente divulgación puede evidenciarse y medirse de varias maneras, incluyendo comprobación del peso, número de semillas por planta, peso de las semillas, número de semillas por área unitaria (es decir, semillas o peso de las semillas, por 4050 m2 (acre)), fanegas por 4050 m2 (acre), toneladas por 4050 m2 (acre), kilogramos por hectárea. Por ejemplo, la producción de maíz puede medirse como la producción de granos de maíz con cáscara por unidad de área de producción, por ejemplo, en fanegas por 4050 m2 (acre) o toneladas métricas por hectárea, a menudo presentada en una base ajustada a la humedad, por ejemplo, a un 15,5 % de humedad. La producción aumentada puede ser el resultado de la utilización mejorada de compuestos bioquímicos clave, tales como nitrógeno, fósforo y carbohidratos, o de la tolerancia mejorada a las agresiones ambientales, tales como frío, calor, sequía, salinidad y ataque por plagas o patógenos. También puede usarse ADN recombinante potenciador de rasgos para proporcionar plantas transgénicas que tienen crecimiento y desarrollo mejorado y, finalmente, producción aumentada, como resultado de la expresión modificada de reguladores del crecimiento de la planta o la modificación del ciclo celular o las rutas de fotosíntesis.

VI. Métodos para suprimir genes

En un aspecto, los métodos y composiciones divulgados pueden usarse para introducir en plantas con eficacia y velocidad aumentadas polinucleótidos útiles para supresión génica de un gen diana en una planta. La reducción de la actividad de genes específicos (también conocido como silenciamiento génico o supresión génica) es deseable para varios aspectos de manipulación genética en plantas. Los expertos en la materia conocen bien muchas técnicas para silenciamiento génico incluyendo, aunque sin limitación, tecnología de antisentido (véase, por ejemplo, Sheehy et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8805-8809; y patentes de Estados Unidos n.° 5.107.065; 5.453.566; y 5.759.829); cosupresión (por ejemplo, Taylor (1997) Plant Cell 9:1245; Jorgensen (1990) Trends Biotech. 8(12):340-344; Flavell (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. Us A 91:3490-3496; Finnegan et al. (1994) Bio/Technology 12: 883-888; y Neuhuber et al. (1994) Mol. Gen. Genet.

244:230-241); interferencia de ARN (Napoli et al. (1990) Plant Cell 2:279-289; patente de Estados Unidos n.° 5.034.323; Sharp (1999) Genes Dev. 13:139-141; Zamore et al. (2000) Cell 101:25-33; Javier (2003) Nature 425:257-263; y Montgomery et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:15502-15507), silenciamiento génico inducido por virus (Burton, et al. (2000) Plant Cell 12:691-705; y Baulcombe (1999) Curr. Op. Plant Bio. 2:109-113); ribozimas específicas de ARN diana (Haseloff et al. (1988) Nature 334: 585-591); estructuras de horquilla (Smith et al. (2000) Nature 407:319-320; documentos WO 99/53050; Wo 02/00904; y WO 98/53083); ribozimas (Steinecke et al. (1992) Em Bo J. 11:1525; patente de Estados Unidos n.° 4.987.071; y Perriman et al. (1993) Antisense Res. Dev. 3:253); modificación dirigida mediada por oligonucleótidos (por ejemplo, documentos WO 03/076574 y WO 99/25853); moléculas dirigidas a dedos de Zn (por ejemplo, documentos Wo 01/52620; WO 03/048345; y WO 00/42219); microARN artificiales (documento US8106180; Schwab et al. (2006) Plant Cell 18:1121-1133); y otros métodos o combinaciones de los métodos anteriores conocidos por los expertos en la materia.

VII. Métodos para introducir tecnologías de edición genómica en plantas

En un aspecto, los métodos y composiciones divulgados pueden usarse para introducir en plantas con eficacia y velocidad aumentadas polinucleótidos útiles para abordar un sitio específico para modificación en el genoma de una planta. Las modificaciones específicas de sitio que pueden introducirse con los métodos y composiciones divulgadas incluyen las producidas usando cualquier método para introducir una modificación específica de sitio incluyendo, aunque sin limitación, mediante el uso de oligonucleótidos de reparación génica (por ejemplo, publicación de Estados Unidos 2013/0019349), o mediante el uso de tecnologías de rotura bicatenaria tales como TALEN, meganucleasas, nucleasas de dedos de cinc y CRISPR-Cas. Por ejemplo, los métodos y composiciones divulgados pueden usarse para introducir un sistema de CRISPR-Cas en plantas, con fines de modificación genómica de una secuencia diana en el genoma de una planta o célula vegetal, para seleccionar plantas, para eliminar una base o una secuencia, para edición génica y para insertar un polinucleótido de interés en el genoma de una planta. Por tanto, los métodos y composiciones divulgadas pueden usarse conjuntamente con un sistema de CRISPR-Cas para proporcionar un sistema eficaz para modificar o alterar sitios diana y nucleótidos de interés dentro del genoma de una planta, célula vegetal o semilla.

En un aspecto, la presente divulgación comprende métodos y composiciones para producir una planta transgénica, en los que el método comprende introducir un polinucleótido de interés en un sitio diana en el genoma de una célula vegetal, comprendiendo el método (a) transformar una o más células de un explante con una construcción de expresión que comprende: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o (iii) una combinación de (i) y (ii); y (b) permitir la expresión del polipéptido de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable, en ausencia de citocinina, en la que no se forma callo; y en la que la transformación comprende además una primera construcción de expresión que puede expresar un nucleótido guía y una segunda construcción de ADN recombinante que puede expresar la endonucleasa Cas, en la que el nucleótido guía y la endonucleasa Cas pueden formar un complejo que posibilita que la endonucleasa Cas introduzca una rotura bicatenaria en el sitio diana. Como alternativa, la construcción de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 también puede comprender una secuencia de nucleótidos que puede expresar el nucleótido guía y una secuencia de nucleótidos que puede expresar la endonucleasa Cas.

En un aspecto, el gen de la endonucleasa Cas es una endonucleasa Cas9 optimizada para plantas, en el que la endonucleasa Cas9 optimizada para plantas puede unirse a y crear una rotura bicatenaria en una secuencia diana genómica del genoma de la planta.

La endonucleasa Cas se guía mediante el nucleótido guía para reconocer e introducir opcionalmente una rotura bicatenaria en un sitio diana específico en el genoma de una célula. El sistema de CRISPR-Cas proporciona un sistema eficaz para modificar sitios diana dentro del genoma de una planta, célula vegetal o semilla. Se proporcionan además métodos y composiciones que emplean un sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas para proporcionar un sistema eficaz para modificar sitios diana dentro del genoma de una célula y para editar una secuencia de nucleótidos en el genoma de una célula. Una vez identificado el sitio diana genómico, puede emplearse una diversidad de métodos para modificar adicionalmente los sitios diana, de modo que contienen una diversidad de polinucleótidos de interés. Las composiciones y métodos divulgados pueden usarse para introducir un sistema de CRISPR-Cas para editar una secuencia de nucleótidos en el genoma de una célula. La secuencia de nucleótidos a editar (la secuencia de nucleótidos de interés) puede ubicarse dentro o fuera de un sitio diana que se reconoce por una endonucleasa Cas.

Los locus de CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas intercaladas de forma regular) (también conocidos como SPIDR-repeticiones directas intercaladas SPacer) constituyen una familia de locus de ADN recientemente descritos. Los locus de CRISPR consisten en repeticiones de ADN cortas y muy conservadas (típicamente de 24 a 40 pb, repetidas de 1 a 140 veces - también denominadas repeticiones CRISPR) que son parcialmente palindrómicas. Las secuencias repetidas (habitualmente específicas para una especie) están intercaladas por secuencias variables de longitud constante (típicamente de 20 a 58 dependiendo del locus CRISPR (documento WO2007/025097, publicado el 1 de marzo de 2007).

Los locus de CRISPR se reconocieron en primer lugar en E. coli (Ishino et al. (1987) J. Bacterial. 169:5429-5433; Nakata etal. (1989) J. Bacterial. 171:3553-3556). Se han identificado repeticiones de secuencia cortas intercaladas similares en Haloferax mediterranei, Streptococcus pyogenes, Anabaena y Mycobacterium tuberculosis (Groenen et a/.(1993) Mol. Microbiol. 10:1057-1065; Hoe et al. (1999) Emerg. Infect. Dis. 5:254- 263; Masepohl et al. (1996) Biochim. Biophys. Acta 1307:26-30; Mojica et al. (1995) Mol. Microbiol. 17:85-93). Los locus de CRISPR difieren de otras SSR en la estructura de las repeticiones, que se han denominado repeticiones espaciadas de forma regular cortas (SRSR) (Janssen et al. (2002) OMICS J. Integ. Biol. 6:23-33; Mojica et al. (2000) Mol. Microbiol. 36:244-246). Las repeticiones son elementos cortos que aparecen en grupos, que siempre están espaciados de forma regular por secuencias variables de longitud constante (Mojica et al. (2000) Mol. Microbiol. 36:244-246).

El gen Cas incluye un gen que está generalmente acoplado, asociado o cerca de, o en las cercanías de locus de CRISPR flanqueantes. Las expresiones "gen Cas" y "gen (Cas) asociado a CRISPR" se usan indistintamente en este documento. Se presenta una revisión extensa de la familia de la proteína Cas en Haft et al. (2005) Computational Biology, PLoS Comput Biol 1 (6): e60, doi:10.1371 / journal.pcbi.0010060.

Además de las cuatro familias génicas descritas inicialmente, se han descrito 41 familias génicas (Cas) asociadas a CRISPR adicionales en el documento WO/2015/026883. Esta referencia muestra que los sistemas de CRISPR pertenecen a clases diferentes, con diferentes patrones de repetición, conjuntos de genes e intervalos de especie. El número de genes Cas en un locus CRISPR dado puede variar entre especies. La endonucleasa Cas se refiere a una proteína Cas codificada por un gen Cas, en la que la proteína Cas puede introducir una rotura bicatenaria en una secuencia diana de ADN. La endonucleasa Cas se guía mediante el polinucleótido guía para reconocer e introducir opcionalmente una rotura bicatenaria en un sitio diana específico en el genoma de una célula. Como se usa en este documento, la expresión "sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas" incluye un complejo de una endonucleasa Cas y un polinucleótido guía que puede introducir una rotura bicatenaria en una secuencia diana de ADN. La endonucleasa Cas desenrolla el ADN bicatenario en cercana proximidad al sitio diana genómico y escinde ambas hebras de ADN tras el reconocimiento de una secuencia diana mediante un nucleótido guía, pero solamente si el motivo adyacente de protoespaciador (PAM) correcto está orientado aproximadamente en el extremo 3' de la secuencia diana (véase la figura 2A y la figura 2B del documento WO/2015/026883, publicado el 26 de febrero de 2015).

En un aspecto, el gen de la endonucleasa Cas es una endonucleasa Cas9, tal como, aunque sin limitación, genes Cas9 enumerados en SEQ ID NO: 462, 474, 489, 494, 499, 505 y 518 del documento WO2007/025097, publicado el 1 de marzo de 2007. En otro aspecto, el gen de la endonucleasa Cas es endonucleasa Cas9 optimizada para plantas, maíz o soja, tal como, aunque sin limitación, las mostradas en la figura 1A del documento WO/2015/026883. En otro aspecto, el gen de la endonucleasa Cas está unido de forma funcional a una señal de dirección nuclear de SV40 en dirección 5' de la región de codones de Cas y una señal de localización nuclear VirD2 bipartita (Tinland et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7442-6) en dirección 3' de la región de codones de Cas.

En un aspecto, el gen de endonucleasa Cas es un gen de endonucleasa Cas9 de SEQ ID NO:1, 124, 212, 213,214, 215, 216, 193 o nucleótidos 2037-6329 de SEQ ID NO:5, o cualquier fragmento o variante funcional de la misma, del documento WO/2015/026883.

Las expresiones "fragmento funcional", "fragmento que es funcionalmente equivalente" y "fragmento funcionalmente equivalente" se usan indistintamente en este documento. Estas expresiones se refieren a un parte o subsecuencia de la secuencia de la endonucleasa Cas de la presente divulgación en que se retiene la capacidad de crear una rotura bicatenaria.

Las expresiones "variante funcional", "variante que es funcionalmente equivalente" y "variante funcionalmente equivalente" se usan indistintamente en este documento. Estas expresiones se refieren a una variante de la endonucleasa Cas de la presente divulgación en que se retiene la capacidad de crear una rotura bicatenaria. Los fragmentos y variantes pueden obtenerse mediante métodos tales como mutagénesis dirigida al sitio y construcción sintética.

En un aspecto, el gen de la endonucleasa Cas es un gen Cas9 de Streptococcus pyogenes con codones optimizados para plantas que puede reconocer cualquier secuencia genómica de la forma N(12-30)NGG que puede abordarse en principio abordarse.

Las endonucleasas son enzimas que escinden el enlace fosfodiéster dentro de una cadena polinucleotídica, e incluyen endonucleasas de restricción que escinden ADN en sitios específicos sin dañar las bases. Las endonucleasas de restricción incluyen endonucleasas de tipo I, tipo II, tipo III y tipo IV, que además incluyen subtipos. En los sistemas de tipo I y tipo III, están contenidas tanto la actividad metilasa como la actividad de restricción en un solo complejo. Las endonucleasas también incluyen meganucleasas, también conocidas como endonucleasas de asentamiento (HEasas), que como las endonucleasas de restricción, se unen y cortan en un sitio de reconocimiento específico, sin embargo, los sitios de reconocimiento para las meganucleasas son típicamente más largos, de aproximadamente 18 pb o más (solicitud de patente PCT/US 12/30061 presentada el 22 de marzo de 2012). Las meganucleasas se han clasificado en cuatro familias basadas en los motivos de secuencia conservados, las familias son las familias de secuencia LAGLIDADG, GIY-YIG, H-N-H e His-Cys. Estos motivos participan en la coordinación de iones metálicos e hidrólisis de enlaces fosfodiéster. Las meganucleasas son destacables por sus sitios de reconocimiento largos, y por tolerar algunos polimorfismos de secuencia en sus sustratos de ADN. La convención de nomenclatura para las meganucleasas es similar a la convención para otras endonucleasas de restricción. Las meganucleasas también se caracterizan por el prefijo F-, I- o PI- para enzimas codificadas por ORF independientes, intrones e inteínas, respectivamente. Una etapa en el proceso de reconocimiento implica la escisión polinucleotídica en o cerca del sitio de reconocimiento. Esta actividad de escisión puede usarse para producir una rotura bicatenaria. Para revisiones de recombinasas específicas de sitio y sus sitios de reconocimiento, véase, Sauer (1994) Curr Op Biotechnol 5:521-7; y Sadowski (1993) FASEB 7:760-7. En algunos ejemplos, la recombinasa es de las familias integrasa o resolvasa. Las nucleasas efectoras TAL son una clase de nucleasas específicas de secuencia que pueden usarse para generar roturas bicatenarias en secuencias diana específicas en el genoma de una planta u otro organismo. (Miller, et al. (2011) Nature Biotechnology 29:143-148). Las nucleasas con dedos de cinc (ZFN) son agentes que inducen roturas bicatenarias genomanipulados que comprenden un dominio de unión al ADN de tipo dedos de cinc y un dominio de un agente inductor de rotura bicatenaria. La especificidad por el sitio de reconocimiento la confiere el dominio de dedos de cinc, que típicamente comprende dos, tres o cuatro dedos de cinc, por ejemplo, que tiene una estructura C2H2, sin embargo, se conocen otras estructuras de dedos de cinc y se han genomanipulado. Los dominios de dedos de cinc son susceptibles al diseño de polipéptidos que se unen específicamente a una secuencia de reconocimiento polinucleotídica seleccionada. Las ZFN incluyen un dominio de dedos de cinc de unión a ADN genomanipulado unido a un dominio de endonucleasa no específico, por ejemplo, dominio de nucleasa de una endonucleasa de tipo Ms tal como Fokl. Pueden fusionarse funcionalidades adicionales al dominio de unión de dedos de cinc, incluyendo dominios activadores transcripcionales, dominios represores de la transcripción y metilasas. En algunos ejemplos, se requiere dimerización del dominio nucleasa para la actividad de escisión. Cada dedo de cinc reconoce tres pares de bases consecutivas en el ADN diana. Por ejemplo, un dominio de 3 dedos reconocía una secuencia de 9 nucleótidos contiguos, con un requisito de dimerización de la nucleasa, se usan dos conjuntos de tripletes de dedos de cinc para unirse a una secuencia de reconocimiento de 18 nucleótidos.

Las bacterias y arqueobacterias han desarrollado defensas inmunitarias adaptativas llamadas sistemas asociados a repeticiones palindrómicas cortas agrupadas intercaladas de forma regular (CRISPR)/CRISPR (Cas) que usan ARN corto para dirigir la degradación de ácidos nucleicos exógenos (documento WO2007/025097, publicado el 1 de marzo de 2007). El sistema de CRISPR/Cas de tipo II de bacterias emplea un ARNcr y ARNcrtra para guiar la endonucleasa Cas a su diana de ADN. El ARNcr (ARN de CRISPR) contiene la región complementaria a una hebra de la diana de ADN bicatenario y forma pares de bases con el ARNcrtra (ARN de CRISPR de activación en trans) que forma un ARN bicatenario que dirige la endonucleasa Cas para escindir la diana de ADN.

Como se usa en este documento, la expresión ''nucleótido guía" se refiere a una fusión sintética de dos moléculas de ARN, un ARNcr (ARN de CRISPR) que comprende un dominio de dirección variable y un ARNcrtra. En un aspecto, el nucleótido guía comprende un dominio de dirección variable de secuencias de 12 a 30 nucleótidos y un fragmento de ARN que puede interactuar con una endonucleasa Cas.

Como se usa en este documento, la expresión "polinucleótido guía", se refiere a una secuencia polinucleotídica que puede formar un complejo con una endonucleasa Cas y posibilita que la endonucleasa Cas reconozca y opcionalmente escinda un sitio diana de ADN. El polinucleótido guía puede ser una molécula sencilla o una molécula doble. La secuencia polinucleotídica guía puede ser una secuencia de ARN, una secuencia de ADN o una combinación de las mismas (una secuencia de combinación de ARN-ADN). Opcionalmente, el polinucleótido guía puede comprender al menos una modificación de nucleótido, enlace o unión fosfodiéster tal como, aunque sin limitación, ácido nucleico bloqueado (ANB), 5-metil dC, 2,6-diaminopurina, 2'-fluoro A, 2'-fluoro U, 2'-O-metil ARN, enlace fosforotioato, enlace a una molécula de colesterol, enlace a una molécula de polietilenglicol, enlace a una molécula espaciadora 18 (cadena de hexaetilenglicol) o enlace covalente 5' a 3' que provoca circularización. Un polinucleótido guía que únicamente comprende ácidos ribonucleicos también se denomina "nucleótido guía".

El polinucleótido guía puede ser una molécula doble (también denominada polinucleótido guía bicatenario) que comprende un primer dominio de secuencia de nucleótidos (denominado dominio de dirección variable o dominio VT) que es complementario a una secuencia de nucleótidos en un ADN diana y un segundo dominio de secuencia de nucleótidos (denominado dominio de reconocimiento de endonucleasa Cas o dominio CER) que interactúa con un polipéptido de endonucleasa Cas. El dominio CER del polinucleótido guía de molécula doble comprende dos moléculas diferentes que hibridan a lo largo de una región de complementariedad. Las dos moléculas diferentes pueden ser secuencias de a Rn , de ADN y/o de combinación de ARN-ADN. En un aspecto, la primera molécula del polinucleótido guía bicatenario que comprende un dominio VT ligado a un dominio CER se denomina "ADNcr" (cuando está compuesto de un tramo contiguo de nucleótidos de ADN) o "ARNcr" (cuando está compuesto de un tramo contiguo de nucleótidos de ARN) o "ADN-ARNcr" (cuando está compuesto de una combinación de nucleótidos de ADN y ARN). El nucleótidocr puede comprender un fragmento del ARNc que existe de forma natural en bacterias y arqueobacterias. En un aspecto, el tamaño del fragmento del ARNc que existe de forma natural en bacterias y arqueobacterias que está presente en un nucleótidocr divulgado en este documento puede variar de, aunque sin limitación, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más nucleótidos.

En un aspecto, la segunda molécula del polinucleótido guía bicatenario que comprende un dominio CER se denomina "ARNcrtra" (cuando está compuesto de un tramo contiguo de nucleótidos de ARN) o "ADNcrtra" (cuando está compuesto de un tramo contiguo de nucleótidos de ADN) o "ADN-ARNcrtra" (cuando está compuesto de una combinación de nucleótidos de ADN y ARN). En un aspecto, el ARN que guía el complejo de ARN-endonucleasa Cas9, es un ARN bicatenario que comprende un ARNcr-ARNcrtra bicatenario.

El polinucleótido guía también puede ser una molécula sencilla que comprende un primer dominio de secuencia de nucleótidos (denominado dominio de dirección variable o dominio VT) que es complementario a una secuencia de nucleótidos en un ADN diana y un segundo dominio de nucleótidos (denominado dominio de reconocimiento de endonucleasa Cas o dominio CER) que interactúa con un polipéptido de endonucleasa Cas. Por "dominio" se entiende un tramo contiguo de nucleótidos que puede ser de secuencia de ARN, ADN y/o combinación de ARN-ADN. El dominio VT y/o el dominio CER de un polinucleótido guía sencillo puede comprender una secuencia de ARN, una secuencia de ADN o una secuencia de combinación de ARN-ADN. En un aspecto, el polinucleótido guía sencillo comprende un nucleótidocr (que comprende un dominio VT ligado a un dominio CER) ligado a un nucleótidocrtra (que comprende un dominio CER), en el que el enlace es una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de a Rn , una secuencia de ADN o una secuencia de combinación de ARN-ADN. El polinucleótido guía sencillo compuesto de secuencias del nucleótidocr y el nucleótidocrtra puede denominarse "nucleótido guía sencillo" (cuando está compuesto de un tramo contiguo de nucleótidos de ARN) o "ADN guía sencillo" (cuando está compuesto de un tramo contiguo de nucleótidos de ADN) o "nucleótido-ADN guía sencillo" (cuando está compuesto de una combinación de nucleótidos de ARN y ADN). En un aspecto de la divulgación, el nucleótido guía sencillo comprende un ARNc o fragmento de ARNc y un ARNcrtra o fragmento de ARNcrtra del sistema de CRISPR/Cas de tipo II que puede formar un complejo con una nucleasa Cas de tipo II, en el que el complejo de nucleótido guía y endonucleasa Cas puede dirigir la endonucleasa Cas a un sitio diana genómico de la planta, posibilitando que la endonucleasa Cas introduzca una rotura bicatenaria en el sitio diana genómico. Un aspecto de usar un polinucleótido guía sencillo frente a un polinucleótido guía bicatenario es que tiene que prepararse solamente un casete de expresión para expresar el polinucleótido guía sencillo.

La expresión "dominio de dirección variable" o "dominio VT" se usa indistintamente en este documento e incluye una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una hebra (secuencia de nucleótidos) de un sitio diana de ADN bicatenario. El % de complementación entre el primer dominio de secuencia de nucleótidos (dominio VT) y la secuencia diana puede ser al menos un 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 63%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%. El dominio diana variable puede ser de al menos 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos de longitud. En un aspecto, el dominio de dirección variable comprende un tramo contiguo de 12 a 30 nucleótidos. El dominio de dirección variable puede estar compuesto de una secuencia de ADN, una secuencia de ARN, una secuencia de ADN modificada, una secuencia de ARN modificada o cualquier combinación de las mismas.

La expresión "dominio de reconocimiento de endonucleasa Cas" o "dominio CER" de un polinucleótido guía se usa indistintamente en este documento e incluye una secuencia de nucleótidos (tal como un segundo dominio de secuencia de nucleótidos de un polinucleótido guía), que interactúa con un polipéptido de endonucleasa Cas. El dominio CER puede estar compuesto de una secuencia de ADN, una secuencia de ARN, una secuencia de ADN modificada, una secuencia de ARN modificada (véanse, por ejemplo, las modificaciones descritas en este documento), o cualquier combinación de las mismas.

La secuencia de nucleótidos que conecta el nucleótidocr y el nucleótidocrtra de un polinucleótido guía sencillo puede comprenden una secuencia de ARN, una secuencia de ADN o una secuencia de combinación de ARN-ADN. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que conecta el nucleótidocr y el nucleótidocrtra de un polinucleótido guía sencillo puede ser de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 nucleótidos de longitud. En otro aspecto, la secuencia de nucleótidos que conecta el nucleótidocr y el nucleótidocrtra de un polinucleótido guía sencillo puede comprender una secuencia de tetrabucle tal como, aunque sin limitación, una secuencia de tetrabucle GAAA.

La modificación de la secuencia de nucleótidos del polinucleótido guía, el dominio VT y/o el dominio CER puede seleccionarse de, aunque sin limitación, el grupo que consiste en un capuchón 5', una cola poliadenilada 3', una secuencia de ribointerruptor, una secuencia de control de la estabilidad, una secuencia que forma un ARNbc bicatenario, una modificación o secuencia que dirige el polinucleótido guía a una localización subcelular, una modificación o secuencia que proporciona rastreo, una modificación o secuencia que proporciona un sitio de unión para proteínas, un ácido nucleico bloqueado (LNA), un nucleótido 5-metil dC, un nucleótido 2,6-diaminopurina, un nucleótido 2'-fluoro A, un nucleótido 2'-fluoro U; un nucleótido de 2'-O-metil ARN, un enlace fosforotioato, unión a una molécula de colesterol, unión a una molécula de polietilenglicol, unión a una molécula espaciadora 18, una unión covalente 5' a 3' o cualquier combinación de las mismas. Estas modificaciones pueden provocar al menos un rasgo característico beneficioso adicional, en las que el rasgo característico beneficioso adicional se selecciona del grupo de una estabilidad modificada o regulada, una dirección subcelular, rastreo, un marcador fluorescente, un sitio de unión para una proteína o complejo proteínico, afinidad de unión modificada a secuencia diana complementaria, resistencia modificada a degradación celular y permeabilidad celular aumentada.

En un aspecto, el nucleótido guía y la endonucleasa Cas pueden formar un complejo que posibilita que la endonucleasa Cas introduzca una rotura bicatenaria en un sitio diana de ADN.

En un aspecto de la divulgación, el dominio diana variable es de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos de longitud.

En un aspecto de la divulgación, el nucleótido guía comprende un ARNc (o fragmento de ARNc) y un ARNcrtra (o fragmento de ARNcrtra) del sistema de CRISPR/Cas de tipo II que puede formar un complejo con una nucleasa Cas de tipo II, en el que el complejo de nucleótido guía y endonucleasa Cas puede dirigir la endonucleasa Cas a un sitio diana genómico de la planta, posibilitando que la endonucleasa Cas introduzca una rotura bicatenaria en el sitio diana genómico. En un aspecto, el nucleótido guía puede introducirse en una planta o célula vegetal directamente usando cualquier método conocido en la técnica tal como, aunque sin limitación, bombardeo de partículas y aplicaciones tópicas.

En un aspecto, el nucleótido guía puede introducirse indirectamente introduciendo una molécula de ADN recombinante que comprenden la secuencia de ADN guía correspondiente unida de forma funcional a un promotor específico de plantas que puede transcribir el nucleótido guía en la célula vegetal. La expresión "ADN guía correspondiente" incluye una molécula de ADN que es idéntica a la molécula de ARN, pero tiene una "T" sustituida en el lugar de cada "U" de la molécula de ARN.

En un aspecto, el nucleótido guía se introduce mediante bombardeo de partículas o usando los métodos y composiciones divulgadas para transformación con Agrobacterium de una construcción de ADN recombinante que comprende el ADN guía correspondiente unido de forma funcional a un promotor de polimerasa III U6 de plantas.

En un aspecto, el ARN que guía el complejo de endonucleasa Cas9 de ARN es un ARN bicatenario que comprende un ARNcr-ARNcrtra bicatenario. Una ventaja de usar un nucleótido guía frente a un ARNcr-ARNcrtra bicatenario es que tiene que prepararse solamente un casete de expresión para expresar el nucleótido guía fusionado.

La expresiones "sitio diana", "secuencia diana", "ADN diana", "locus diana", "sitio diana genómico", "secuencia diana genómica" y "locus diana genómico" se usan indistintamente en este documento y se refieren a una secuencia polinucleotídica en el genoma (que incluye ADN de cloroplastos y mitocondrial) de una célula vegetal en que se induce una rotura bicatenaria en el genoma de la célula vegetal por una endonucleasa Cas. El sitio diana puede ser un sitio endógeno en el genoma de la planta o, como alternativa, el sitio diana puede ser heterólogo a la planta y, de ese modo, no existir de forma natural en el genoma, o el sitio diana puede encontrarse en una localización genómica heteróloga en comparación con donde existe de forma natural.

Como se usan en este documento, las expresiones "secuencia diana endógena" y "secuencia diana natural" se usan indistintamente en este documento para referirse a una secuencia diana que es endógena o natural al genoma de una planta y está en la posición endógena o natural de esa secuencia diana en el genoma de la planta. En un aspecto, el sitio diana puede ser similar a un sitio de reconocimiento de ADN o sitio diana que se reconoce específicamente y/o se une por un agente que induce rotura bicatenaria tal como una endonucleasa LIG3-4 (publicación de patente de Estados Unidos 2009-0133152 A1 publicada el 21 de mayo de 2009) o una meganucleasa MS26++ (solicitud de patente de Estados Unidos 13/526912 presentada el 19 de junio de 2012).

Un "sitio diana artificial" o "secuencia diana artificial" se usan indistintamente en este documento y se refieren a una secuencia diana que se ha introducido en el genoma de una planta. Dicha secuencia diana artificial puede ser idéntica en secuencia a una secuencia diana endógena o natural en el genoma de una planta, pero estar localizada en una posición diferente (es decir, una posición no endógena o no natural) en el genoma de una planta.

Un "sitio diana alterado", "secuencia diana alterada", "sitio diana modificado" y "secuencia diana modificada" se usan indistintamente en este documento y se refieren a una secuencia diana como se divulga en este documento que comprende al menos una alteración en comparación con una secuencia diana no alterada. Dichas "alteraciones" incluyen, por ejemplo: (i) remplazo de al menos un nucleótido, (ii) una eliminación de al menos un nucleótido, (iii) una inserción de al menos un nucleótido o (iv) cualquier combinación de (i) -(iii).

VIII. Métodos para introducir nucleótidos para integración específica de sitio

En un aspecto, los métodos y composiciones divulgados pueden usarse para introducir en plantas con eficacia y velocidad aumentadas polinucleótidos útiles para la integración dirigida de secuencias de nucleótidos en una planta. Por ejemplo, los métodos y composiciones divulgados pueden usarse para introducir casetes de transferencia que comprenden secuencias de nucleótidos de interés flanqueadas por sitios de recombinación no idénticos, que se usan para transformar una planta que comprende un sitio diana. En un aspecto, el sitio diana contiene al menos un conjunto de sitios de recombinación no idénticos correspondientes a aquellos en el casete de transferencia. El intercambio de las secuencias de nucleótidos flanqueadas por los sitios de recombinación se logra mediante una recombinasa. Por tanto, los métodos y composiciones divulgados pueden usarse para la introducción de casetes de transferencia para la integración dirigida de secuencias de nucleótidos, en los que los casetes de transferencia que están flanqueados por sitios de recombinación no idénticos se reconocen por una recombinasa que reconoce e implementa la recombinación en los sitios de recombinación no idénticos. Por consiguiente, los métodos y composición divulgados pueden usarse para mejorar la eficacia y velocidad de desarrollo de las plantas, derivadas de estructuras vegetales regenerables, que contienen sitios de recombinación no idénticos.

En un aspecto, la presente divulgación comprende métodos y composiciones para producir una planta transgénica, en los que el método comprende introducir un polinucleótido de interés en un sitio diana en el genoma de una célula vegetal, comprendiendo el método (a) transformar una o más células de un explante con una construcción de expresión que comprende: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o (iii) una combinación de (i) y (ii); y (b) permitir la expresión del polipéptido de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable, en ausencia de citocinina, en la que no se forma callo; en la que la transformación comprende además transformar una célula de un explante con un casete de transferencia que comprende una secuencia de nucleótidos de interés flanqueada por sitios de recombinación no idénticos; y en el que el explante deriva de una planta con un genoma que comprende un sitio diana flanqueado por sitios de recombinación no idénticos que corresponden a los sitios flanqueantes del casete de transferencia. El método puede comprender además proporcionar una recombinasa que reconoce e implementa la recombinación en los sitios de recombinación no idénticos, proporcionándose la recombinasa a la una o más células del explante, una estructura vegetal regenerable, una plántula derivada de la estructura vegetal regenerable, o una planta derivada de una plántula derivada de una estructura vegetal regenerable.

Por tanto, los métodos y composiciones divulgados pueden comprender además composiciones y métodos para la integración direccional, dirigida de nucleótidos exógenos en una planta transformada, que se proporcionan. En un aspecto, los métodos divulgados usan sitios de recombinación novedosos en un sistema de dirección génica que facilita la dirección direccional de genes deseados y secuencias de nucleótidos en sitios de recombinación correspondientes previamente introducidos en el genoma de la planta diana.

En un aspecto, se introduce una secuencia de nucleótidos flanqueada por dos sitios de recombinación no idénticos en una o más células de un explante derivado del genoma del organismo diana que establece un sitio diana para la inserción de secuencias de nucleótidos de interés. Una vez establecida una planta estable o tejido cultivado, se introduce una segunda construcción, o secuencia de nucleótidos de interés, flanqueada por sitios de recombinación correspondientes como los que flanquean el sitio diana, en la planta o tejidos transformados de forma estable en presencia de una proteína recombinasa. Este proceso provoca el intercambio de las secuencias de nucleótidos entre los sitios de recombinación no idénticos del sitio diana y el casete de transferencia.

Se reconoce que la planta transformada preparada de esta manera puede comprender múltiples sitios diana; es decir, conjuntos de sitios de recombinación no idénticos. De esta manera, están disponibles múltiples manipulaciones del sitio diana en la planta transformada. Por sitio diana en la planta transformada se pretende una secuencia de ADN que se ha insertado en el genoma de la planta transformada y comprende sitios de recombinación no idénticos.

Ejemplos de sitios de recombinación para su uso en el método divulgado son conocidos en la técnica e incluyen sitios FRT (véase, por ejemplo, Schlake y Bode (1994) Biochemistry 33: 12746-12751; Huang et al. (1991) Nucleic Acids Research 19: 443-448; Paul D. Sadowski (1995) En Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology vol. 51, pág. 53-91; Michael M. Cox (1989) En Mobile DNA, Berg y Howe (eds) American Society of Microbiology, Washington D. C., pág. 116-670; Dixon et al. (1995) 18: 449-458; Umlauf y Cox (1988) The EMBO Journal 7: 1845-1852; Buchholz et al. (1996) Nucleic Acids Research 24: 3118- 3119; Kilby et al. (1993) Trends Genet. 9: 413-421: Rossant y Geagy (1995) Nat. Med. 1: 592-594; Albert et al. (1995) The Plant J. 7: 649-659: Bayley et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 353-361; Odell et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 223: 369-378; y Dale y Ow (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10558-105620.) ; Lox (Albert et al. (1995) Plant J. 7: 649-659; Qui et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1706-1710; Stuurman et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32: 901 -913; Odell et al. (1990) Mol. Gen. Gevet. 223: 369-378; Dale et al. (1990) Gene 91: 79-85; y Bayley et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 353-361.) El plásmido 2g, encontrado en la mayoría de cepas de origen natural de Saccharomyces cerevisiae, codifica una recombinasa específica de sitio que promueve una inversión del ADN entre dos repeticiones invertidas. Esta inversión desempeña una función central en la amplificación del número de copias del plásmido.

La proteína, denominada proteína FLP, cataliza acontecimientos de recombinación específica de sitio. El sitio de recombinación mínimo (FRT) se ha definido y contiene dos repeticiones invertidas de 13 pares de bases (pb) que rodean un espaciador asimétrico de 8 pb. La proteína FLP escinde el sitio en las uniones de las repeticiones y el espaciador y se une covalentemente al ADN mediante un 3'fosfato. Las recombinasas específicas de sitio como FLP escinden y vuelven a ligar el ADN en secuencias diana específicas, provocando una recombinación definida de manera precisa entre dos sitios idénticos. Para funcionar, el sistema necesita los sitios de recombinación y la recombinasa. No se necesitan factores auxiliares. Por tanto, el sistema completo puede insertarse y funcionar en células vegetales. El sistema de recombinación específico de sitio de FLP\FRT de levadura ha demostrado funcionar en plantas. Hasta la fecha, el sistema se ha utilizado para la escisión de ADN indeseado. Véase, Lyznik et at. (1993) Nucleic Acid Res. 21: 969-975. En contraste, la presente divulgación utiliza FRT no idénticas para el intercambio, dirección, disposición, inserción y control de la expresión de secuencias de nucleótidos en el genoma de la planta.

En un aspecto, se necesita un organismo transformado de interés, tal como un explante de una planta, que contiene un sitio diana integrado en su genoma. El sitio diana se caracteriza por estar flanqueado por sitios de recombinación no idénticos. Se requiere adicionalmente un casete de dirección que contenga una secuencia de nucleótidos flanqueada por correspondientes sitios de recombinación no idénticos como aquellos sitios contenidos en el sitio diana del organismo transformado. Se requiere una recombinasa que reconoce los sitios de recombinación no idénticos y cataliza la recombinación específica de sitio.

Se reconoce que la recombinasa puede proporcionarse mediante cualquier medio conocido en la técnica. Es decir, puede proporcionarse en el organismo o célula vegetal transformando el organismo con un casete de expresión que pueda expresar la recombinasa en el organismo, por expresión transitoria o proporcionando ARN mensajero (ARNm) para la recombinasa o la proteína recombinasa.

Por "sitios de recombinación no idénticos" se pretende que los sitios de recombinación flanqueantes no sean idénticos en secuencia y no recombinarán o la recombinación entre los sitios será mínima. Es decir, un sitio de recombinación flanqueante puede ser un sitio FRT donde el segundo sitio de recombinación puede ser un sitio FRT mutado. Los sitios de recombinación no idénticos usados en los métodos de la divulgación evitan o suprimen enormemente la recombinación entre los dos sitios de recombinación flanqueantes y la escisión de la secuencia de nucleótidos contenida en los mismos. Por consiguiente, se reconoce que puede utilizarse cualquier sitio de recombinación no idéntico adecuado en la divulgación, incluyendo sitios FRT y FRT mutantes, sitios FRT y lox, sitios lox y lox mutantes, así como otros sitios de recombinación conocidos en la técnica.

Por sitio de recombinación no idéntico adecuado supone que en presencia de recombinasa activa, la escisión de secuencias entre dos sitios de recombinación no idénticos se produce, si acaso, con una eficacia considerablemente menor que el intercambio mediado por recombinación que dirige la disposición de las secuencias de nucleótidos en el genoma de la planta. Por tanto, sitios no idénticos adecuados para su uso en la divulgación incluyen aquellos sitios donde la eficacia de recombinación entre los sitios es baja; por ejemplo, donde la eficacia es de menos de aproximadamente un 30 a aproximadamente un 50 %, preferiblemente menos de aproximadamente un 10 a aproximadamente un 30 %, más preferiblemente menos de aproximadamente un 5 a aproximadamente 10 %. Como se indica anteriormente, los sitios de recombinación en el casete de dirección corresponden a los del sitio diana de la planta transformada. Es decir, si el sitio diana de la planta transformada contiene sitios de recombinación no idénticos flanqueantes de FRT y FRT mutante, el casete de dirección contendrá los mismos sitios de recombinación no idénticos de FRT y FRT mutante.

Además, se reconoce que la recombinasa, que se usa en los métodos divulgados, dependerá de los sitios de recombinación en el sitio diana de la planta transformada y el casete de dirección. Es decir, si se utilizan sitios FRT, se necesitará la recombinasa FLP. De la misma manera, cuando se utilizan sitios lox, se requiere la recombinasa Cre. Si los sitios de recombinación no idénticos comprenden tanto un sitio FRT como uno lox, tanto la recombinasa FLP como la Cre serán necesarias en la célula vegetal.

La recombinasa FLP es una proteína que cataliza una reacción específica de sitio que está implicada en la amplificación del número de copias del plásmido 2p de S. cerevisiae durante la replicación del ADN. La proteína FLP se ha clonado y expresado. Véase, por ejemplo, Cox (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80: 4223-4227. La recombinasa FLP para su uso en la divulgación puede ser la derivada del género Saccharomyces. Puede ser preferible sintetizar la recombinasa usando codones preferidos de plantas para su expresión óptima en una planta de interés. Véase, por ejemplo, la solicitud de Estados Unidos n.° de serie 08/972.258 presentada el 18 de noviembre de 1997, titulada "Novel Nucleic Acid Sequence Encoding FLP Recombinase".

La recombinasa Cre del bacteriófago cataliza la recombinación específica de sitio entre dos sitios lox. La recombinasa Cre es conocida en la técnica. Véase, por ejemplo, Guo et al. (1997) Nature 389: 40-46; Abremski et al. (1984) J. Biol. Chem. 259: 1509-1514; Chen et al. (1996) Somat. Cell Mol. Genet. 22: 477-488; y Shaikh et al. (1977) J. Biol. Chem. 272: 5695-5702. Dicha una secuencia Cre también puede sintetizarse usando codones preferidos de plantas.

Cuando sea apropiado, las secuencias de nucleótidos a insertar en el genoma de la planta pueden optimizarse para expresión aumentada en la planta transformada. Cuando se usan genes de mamífero, levadura o bacterianos en la divulgación, pueden sintetizarse usando codones preferidos de plantas para expresión mejorada. Se reconoce que para la expresión en monocotiledóneas, también pueden sintetizarse genes de dicotiledóneas usando codones preferidos de monocotiledóneas. Hay métodos disponibles en la técnica para sintetizar genes preferidos de plantas. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 5.380.831,5.436.391 y Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 477-498.

Los codones preferidos de plantas pueden determinarse a partir de los codones utilizados más frecuentemente en las proteínas expresadas en la planta de interés. Se reconoce que pueden construirse secuencias preferidas de monocotiledóneas o dicotiledóneas, así como secuencias preferidas de plantas para especies de plantas particulares. Véanse, por ejemplo, los documentos EPA 0359472; EPA 0385962; WO 91/16432; Perlak et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 3324-3328; y Murray et al. (1989) Nucleic Acids Research, 17: 477-498. Patente de Estados Unidos n.° 5.380.831; y patente de Estados Unidos n.° 5.436.391. Se reconoce además que la totalidad o cualquier parte de la secuencia génica puede optimizarse o ser sintética. Es decir, también pueden usarse secuencias completamente optimizadas o parcialmente optimizadas.

Se conocen modificaciones de secuencia adicionales que potencian la expresión génica en un hospedador celular y pueden usarse en la divulgación. Estas incluyen la eliminación de secuencias que codifican señales de poliadenilación putativas, señales de sitio de corte y empalme de exones e intrones, repeticiones de tipo transposón y otras secuencias bien caracterizadas de este tipo, que pueden ser perjudiciales para la expresión génica. El contenido de G-C de la secuencia puede ajustarse a niveles promedio para un hospedador celular dado, calculado por referencia a genes conocidos expresados en la célula hospedadora. Cuando es posible, la secuencia se modifica para evitar las estructuras de ARN secundarias en forma de horquilla previstas.

La presente divulgación también abarca sitios diana de recombinación de FLP (FRT) novedosos. El FRT se ha identificado como una secuencia mínima que comprende dos repeticiones de 13 pares de bases, separadas por un espaciador de 8 bases, de la siguiente manera: 5'-GAAGTTCCTATTC [TCTAGAAA] GTATAGGAACTTC3' en el que los nucleótidos dentro de los corchetes indican la región espaciadora. Los nucleótidos en la región espaciadora pueden remplazarse con una combinación de nucleótidos, siempre que las dos repeticiones de 13 bases estén separadas por ocho nucleótidos. Parece que la secuencia de nucleótidos real del espaciador no es crucial; sin embargo, para la práctica de la divulgación, algunas sustituciones de nucleótidos en la región espaciadora pueden funcionar mejor que otras. El espaciador de ocho pares de bases está implicado en el emparejamiento de ADN-ADN durante el intercambio de hebras. La asimetría de la región determina la dirección de alineación del sitio en el acontecimiento de recombinación, que posteriormente dará lugar a inversión o escisión. Como se indica anteriormente, la mayor parte del espaciador puede mutarse sin pérdida de función. Véase, por ejemplo, Schlake y Bode (1994) Biochemistry 33: 12746-12751.

Pueden usarse sitios mutantes FRT novedosos en la práctica de los métodos divulgados. Dichos sitios mutantes pueden construirse por mutagénesis basada en PCR. Aunque dichos sitios FRT mutantes son conocidos (véanse SEQ ID NO: 2, 3, 4 y 5 del documento WO/1999/025821, publicado el 27 de mayo de 1999), se reconoce que pueden usarse otros sitios FRT mutantes en la práctica de la divulgación. La presente divulgación no es el uso de un sitio FRT o de recombinación particular, sino que en su lugar pueden utilizarse sitios de recombinación o sitios FRT no idénticos para inserción y expresión dirigidas de secuencias de nucleótidos en un genoma de planta. Por tanto, pueden construirse otros sitios FRT mutantes y utilizarse basándose en la presente divulgación.

Como se analiza anteriormente, poner un ADN genómico que contiene un sitio diana con sitios de recombinación no idénticos junto con un vector que contiene un casete de transferencia con correspondientes sitios de recombinación no idénticos, en presencia de la recombinasa, provoca recombinación. La secuencia de nucleótidos del casete de transferencia localizado entre los sitios de recombinación flanqueantes se intercambia con la secuencia de nucleótidos del sitio diana localizado entre los sitios de recombinación flanqueantes. De esta manera, las secuencias de nucleótidos de interés pueden incorporarse de forma precisa en el genoma del hospedador.

Se reconoce que pueden ponerse en práctica muchas variaciones de la divulgación. Por ejemplo, pueden construirse sitios diana que tienen múltiple sitios de recombinación no idénticos. Por tanto, pueden apilarse u ordenarse múltiples genes o secuencias de nucleótidos en localizaciones precisas en el genoma vegetal. Asimismo, una vez se ha establecido un sitio diana dentro del genoma, pueden introducirse sitios de recombinación adicionales incorporando dichos sitios dentro de la secuencia de nucleótidos del casete de transferencia y la transferencia de los sitios a la secuencia diana. Por tanto, una vez se ha establecido un sitio diana, es posible añadir posteriormente sitios, o alterar sitios a través de recombinación.

Otra variación incluye proporcionar un promotor o región de inicio de la transcripción unida de forma funcional con el sitio diana en un organismo. Preferiblemente, el promotor estará 5' al primer sitio de recombinación. Al transformar el organismo con un casete de transferencia que comprende una región codificante, se producirá la expresión de la región codificante tras la integración del casete de transferencia en el sitio diana. Este aspecto proporciona un método para seleccionar células transformadas, particularmente células vegetales, proporcionando una secuencia marcadora de selección como secuencia codificante.

Otras ventajas del presente sistema incluyen la capacidad de reducir la complejidad de la integración de transgenes o ADN transferido en un organismo utilizando casetes de transferencia como se analizan anteriormente y seleccionando organismos con patrones de integración simples. De la misma manera, pueden identificarse sitios preferidos dentro del genoma comparando varios acontecimientos de transformación. Un sitio preferido dentro del genoma incluye uno que no altera la expresión de las secuencias esenciales y proporciona expresión adecuada de la secuencia transgénica.

Los métodos divulgados también proporcionan un medio para combinar múltiples casetes en una localización dentro del genoma. Pueden añadirse o eliminarse sitios de recombinación en sitios diana dentro del genoma.

Puede usarse cualquier medio conocido en la técnica para poner los tres componentes del sistema juntos en la divulgación. Por ejemplo, una planta puede transformarse de forma estable para que albergue el sitio diana en su genoma. La recombinasa puede expresarse o proporcionarse de forma transitoria. Como alternativa, puede integrarse de forma estable una secuencia de nucleótidos que pueda expresar la recombinasa en el genoma de la planta. En presencia del sitio diana correspondiente y la recombinasa, el casete de transferencia, flanqueado por sitios de recombinación no idénticos correspondientes, se inserta en el genoma de la planta transformada.

Como alternativa, los componentes del sistema pueden ponerse juntos cruzando sexualmente plantas transformadas. En este aspecto, una planta transformada, progenitora uno, que contiene un sitio diana integrado en su genoma, puede cruzarse sexualmente con una segunda planta, progenitora dos, que se ha transformado genéticamente con un casete de transferencia que contiene sitios de recombinación no idénticos flanqueantes, que corresponden a los de la planta uno. O la planta uno o la planta dos contiene dentro de su genoma una secuencia de nucleótidos que expresa recombinasa. La recombinasa puede estar bajo el control de un promotor constitutivo o inducible.

Los promotores inducibles incluyen los descritos en este documento anteriormente, así como promotores inducibles por calor, promotores sensibles a estradiol y promotores inducibles por productos químicos. Los promotores inducibles por patógenos incluyen los de proteínas relacionadas con patogénesis (proteínas PR), que se inducen después de infección por un patógeno; por ejemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1,3-glucanasa, quitinasa, etc. Véase, por ejemplo, Redolfi, etal. (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89: 245-254; Uknes etal. (1992) The Plant Cell 4: 645-656; y Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4: 111-116. De esta manera, puede controlarse la expresión de la recombinasa y la posterior actividad en los sitios de recombinación.

Los promotores constitutivos para su uso en la expresión de genes en plantas son conocidos en la técnica. Dichos promotores incluyen, aunque sin limitación, el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (Depicker et al. (1982) Mol. Appl. Genet. 1: 561-573; Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812), promotor de la ubiquitina (Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689), promotores de genes tales como la ribulosa bisfosfato carboxilasa (De Almeida et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 218: 78-98), actina (McElroy et al. (1990) Plant J. 2: 163-171), histona y DnaJ (Baszczynski et al. (1997) Maydica 42: 189-201).

Las composiciones y métodos divulgados son útiles en dirigir la integración de secuencias de nucleótidos transferidas a un sitio cromosómico específico. La secuencia de nucleótidos puede codificar cualquier secuencia de nucleótidos de interés. Genes de interés particulares incluyen los que proporcionan un rasgo característico funcional fácilmente analizable a la célula y/u organismo hospedador, tal como genes marcadores, así como otros genes que alteran el fenotipo de las células destinatarias. Por tanto, los genes que logran el crecimiento de la planta, la altura, la susceptibilidad a enfermedades, insectos y el valor nutritivo pueden utilizarse en la divulgación. La secuencia de nucleótidos también puede codificar una secuencia de "antisentido" para inactivar o modificar la expresión génica.

Se reconoce que las secuencias de nucleótidos se utilizarán en una unidad o casete de expresión funcional. Por unidad o casete de expresión funcional se pretende la secuencia de nucleótidos de interés con un promotor funcional y, en la mayoría de los casos, una región de terminación. Hay diversas maneras de conseguir la unidad de expresión funcional dentro de la práctica de la divulgación. En un aspecto de la divulgación, el ácido nucleico de interés se transfiere o inserta en el genoma como una unidad de expresión funcional.

Como alternativa, la secuencia de nucleótidos puede insertarse en un sitio dentro del genoma que está 3' a una región promotora. En este último caso, la inserción de la secuencia codificante 3' a la región promotora es tal que se consigue una unidad de expresión funcional tras la integración. Por conveniencia, para la expresión en plantas, el ácido nucleico que codifica sitios diana y los casetes de transferencia, incluyendo las secuencias de nucleótidos de interés, pueden estar contenidos dentro de casetes de expresión. Los casetes de expresión comprenderán una región de inicio transcripcional o promotor, unido de forma funcional al ácido nucleico que codifica el péptido de interés. Dicho casete de expresión está provisto de una pluralidad de sitios de restricción para la inserción del gen o genes de interés para que esté bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras.

La región de inicio transcripcional, el promotor, puede ser natural u homólogo o exógeno o heterólogo al hospedador, o podría ser la secuencia natural o una secuencia sintética. Por exógeno se pretende que la región de inicio transcripcional no se encuentre en el hospedador de tipo silvestre en que se introduce la región de inicio transcripcional. Puede usarse un promotor natural o heterólogo con respecto a la secuencia codificante de interés.

El casete transcripcional incluirá, en la dirección 5'-3' de transcripción, una región de inicio transcripcional y traduccional, una secuencia de ADN de interés y una región de terminación transcripcional y traduccional funcional en plantas. La región de terminación puede ser natural con la región de inicio transcripcional, puede ser natural con la secuencia de ADN de interés, o puede derivar de otra fuente. Están disponibles regiones de terminación convenientes del gen inhibidor de la proteinasa de la patata (PinII) o secuencias del plásmido Ti de A. tumefaciens, tal como las regiones de terminación de la nopalina sintasa, la octopina sintasa y la opalina sintasa. Véase también, Guerineau et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141-144; Proudfoot (1991) Cell 64: 671-674; Sanfacon etal. (1991) Genes Dev. 5: 141-149; Mogen etal. (1990) Plant Cell 2 : 1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91: 151-158; Ballas et al. 1989) Nucleic Acids Res. 17: 7891-7903; Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15: 9627-9639.

Los casetes de expresión adicionalmente pueden contener secuencias líder 5' en la construcción del casete de expresión. Dichas secuencias líder pueden actuar potenciando la traducción. Los líderes de traducción son conocidos en la técnica e incluyen: líderes de picornavirus, por ejemplo, líder de EMCV (región no codificante 5' del virus de la encefalomiocarditis) (Elroy-Stein, O., Fuerst, T. R., y Moss, B. (1989) PNAS USA, 86: 6126-6130); líderes de potyvirus, por ejemplo, líder de TEV (virus del grabado del tabaco) (Allison et al. (1986)); líder de MDMV (virus del mosaico enano del maíz); (Virology, 154: 9-20), y proteína de unión de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana (BiP), (Macejak, D. G., y P. Sarnow (1991) Nature, 353: 90-94); líder no traducido de la proteína de envuelta MARNA del virus del mosaico de la alfalfa (ARN 4 de AMV), (Jobling, S. A., y Gehrke, L., (1987) Nature, 325: 622-625; líder del virus del mosaico del tabaco (TMV) (Gallie et al. (1989) Molecular Biology of RNA, páginas 237-256, Gallie et al. (1987) Nucl. Acids Res. 15: 3257-3273; líder del virus del moteado clorótico del maíz (MCMV) (Lornmel, S. A. et al. (1991) Virology, 81: 382-385). Véase también, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiology, 84: 965-968; y secuencias no traducidas 5' del maíz endógenas. También pueden utilizarse otros métodos conocidos para potenciar la traducción, por ejemplo, intrones.

Los casetes de expresión pueden contener uno o más de un gen o secuencia de ácido nucleico a transferir y expresar en la planta transformada. Por tanto, cada secuencia de ácido nucleico se unirá de forma funcional a secuencias reguladoras 5' y 3'. Como alternativa, pueden proporcionarse múltiples casetes de expresión.

Parte experimental

Ejemplo 1: Plásmidos.

Se usaron plásmidos que comprenden ADN T descrito en la tabla 1 en experimentos descritos en este documento a continuación. Los plásmidos enumerados en la tabla 1 portan un ADN T que contiene los componentes indicados.

T l 1. m n n l mí i .

Ejemplo 2: Medio de cultivo.

Se hace referencia a diversos medios en los ejemplos para su uso en transformación y cultivo celular. Las composiciones de los medios se describen a continuación en las tablas 2-9.

T l 2. M i liv r r n f rm i n r .

Tabla 3. Composición del medio de infección líquido de tri o WI4.

Tabla 4. Composición de medio de cocultivo de tri o WC n.° 10.

T l . m i i n m i liv i v r ri DB 4.

Tabla 6. Composición del medio de inducción de teido verde de tri o DBC6.

Tabla 7. Composición de medio de re eneración de tri o MSA.

Tabla 8. Composición de medio de re eneración de tri o MSB.

Tabla 9. Formaciones de medio para transformación, selección y regeneración de maíz.

Tabla 9 continuación.

Ejemplo 3: Bombardeo de partículas.

Antes del bombardeo, se aislaron 10-12 embriones inmaduros DAP de espigas del endogámico Pioneer PH184C y se colocaron en medio de cultivo más sacarosa al 16 % durante tres para plasmolisar las células escutelares.

Típicamente se usaron cuatro plásmidos para cada bombardeo de partículas; 1) el plásmido donador (100 ng/pl) que contenía el casete donador flanqueado por FRT para intercambio de casete mediado por recombinasa, 2) un plásmido (2,5 ng/pl) que contenía el casete de expresión UBI PRO::FLPm::PinII, 3) un plásmido (10 ng/pl) que contenía el casete de expresión UBI PRO::ODP2::PinII, y 4) un plásmido (5 ng/ul) que contenía el casete de expresión UBI::WUS2::PinII. Para fijar el ADN a partículas de oro de 0,6 pm, los cuatro plásmidos se mezclaron añadiendo 10 pl de cada plásmido juntos en un tubo de microcentrifugadora de baja unión (Sorenson Bioscience 39640T) para un total de 40 pl. A esta suspensión, se le añadieron 50 pl de partículas de oro de 0,6 pm (30 pg/pl) y 1,0 pl de Transit 20/20 (n.° Cat MIR5404, Mirus Bio LLC), y la suspensión se puso en un agitador giratorio durante 10 minutos. La suspensión se centrifugó a 10000 RPM (~9400 x g) y se descartó el sobrenadante. Las partículas de oro se resuspendieron en 120 pl de etanol al 100 %, se sonicaron brevemente a baja energía y se pipetearon 10 pl en cada casilla. Las casillas entonces se secan al aire para retirar todo el etanol restante. El bombardeo de partículas se realizó usando Biolistics PDF-1000, a 28 pulgadas de mercurio usando un disco de rotura de 200 PSI.

Ejemplo 4: Transformación mediada por A grobacterium de maíz.

A. Preparación de placa fundamental de Agrobacterium .

Agrobacterium tumefaciens que portaba un vector donador binario se sembró en estrías a partir de una alícuota congelada a -80 °C en medio 12V sólido y se cultivó a 28 °C en la oscuridad durante 2-3 días para generar una placa fundamental.

B. Crecimiento de A grobacterium en medio sólido.

Se cogió una sola colonia o múltiples colonias de Agrobacterium de la placa fundamental y se sembró en estrías en una segunda placa que contenía medio 8101 y se incubó a 28 °C en la oscuridad durante 1-2 días. Se añadió medio de infección de Agrobacterium (medio 700; 5 ml) y 3'-5'-dimetoxi-4'-hidroxiacetofenona 100 mM (acetosiringona; 5 pl) a un tubo cónico de 14 ml en una campana. Se suspendieron aproximadamente 3 inóculos completos de Agrobacterium de la segunda placa en el tubo y el tubo entonces se mezcló con agitadora vorticial para generar una suspensión uniforme. La suspensión (1 ml) se transfirió a un tubo de espectrofotómetro y se ajustó la densidad óptica (550 nm) de la suspensión a una lectura de aproximadamente 0,35-2,0. La concentración Agrobacterium fue de aproximadamente 0,5 a 2,0 x 109 ufc/ml. La suspensión final de Agrobacterium se dividió en alícuotas en tubos de microcentrifugadora de 2 ml, que contenían cada uno aproximadamente 1 ml de la suspensión. Las suspensiones se usaron entonces lo antes posible.

C. Crecimiento de A grobacterium en medio líquido.

Como alternativa, Agrobacterium puede prepararse para transformación por crecimiento en medio líquido. Un día antes de la infección, se preparó un matraz de 125 ml con 30 ml de medio 557A (10,5 g/l de fosfato de potasio dibásico, 4,5 g/l de fosfato de potasio monobásico anhidro, 1 g/l de sulfato de amonio, 0,5 g/l de citrato de sodio deshidrato, 10 g/l de sacarosa, sulfato de magnesio 1 mM) y 30 pl de espectinomicina (50 mg/ml) y 30 pl de acetosiringona (20 mg/ml). Se suspendió medio inóculo de Agrobacterium de una segunda placa en los matraces y se colocó en un agitador orbital establecida a 200 rpm y se incubó a 28 °C durante una noche. El cultivo de Agrobacterium se centrifugó a 5000 rpm durante 10 min. El sobrenadante se retiró y se añadió el medio de infección de Agrobacterium con solución de acetosiringona. Las bacterias se resuspendieron por mezcla en agitadora vorticial y la densidad óptica (550 nm) de la suspensión de Agrobacterium a una lectura de aproximadamente 0,35 a 2,0.

D. Transformación de maíz.

Se esterilizaron superficialmente mazorcas de una cultivariedad de maíz (Zea mays L.) durante 15-20 min en lejía al 20 % (v/v) (hipoclorito de sodio al 5,25 %) más 1 gota de Tween 20 seguido de 3 lavados en agua estéril. Los embriones inmaduros (IE) se aislaron de las mazorcas y se colocaron en 2 ml del medio de infección de Agrobacterium con solución de acetosiringona. El tamaño óptimo de los embriones varía basándose en el endogámico, pero para transformación con WUS2 y ODP2 podría usarse una intervalo de tamaños amplio de tamaños de embriones inmaduros. La solución se trasvasó y se añadió 1 ml de suspensión de Agrobacterium a los embriones y el tubo se mezcló con agitadora vorticial durante 5-10 segundos. El tubo de microcentrifugadora se dejó reposar durante 5 min en la campana. La suspensión de Agrobacterium y embriones se vertió en medio de cocultivo 7101 (véase la tabla 9). Cualquier embrión que quedara en el tubo se transfirió a la placa usando una espátula estéril. La suspensión de Agrobacterium se trasvasó y los embriones se colocaron con el eje hacia abajo en el medio. La placa se selló con película Parafilm M® (plástico flexible resistente a la humedad, disponible en Bemis Company, Inc., 1 Neenah Center 4.a planta, PO Box 669, Neenah, WI 54957) y se incubó en la oscuridad a 21 °C durante 1-3 días de cocultivo.

Los embriones se transfirieron a medio de reposo (medio 605T) sin selección. De tres a 7 días después, se transfirieron a medio de maduración (medio 289Q) complementado con un agente selectivo.

Ejemplo 5: Expresión de ODP2 y WUS2.

El siguiente experimento demostró que la expresión de ODP2 y WUS2 inmediatamente después de infección con Agrobacterium provocó embriogénesis somática directa.

A. El promotor PLTP que dirige ODP2 y el promotor NOS que dirige la expresión de WUS2 provocaron la formación rápida de embriones somáticos directos.

Se recogieron embriones inmaduros (2-2,5 mm de longitud) de maíz endogámico Pioneer PH184C aproximadamente 11 días después de la polinización, y se infectaron con la cepa de Agrobacterium AGL1 que contenía un ADN T con la siguiente composición; RB NOS PRO::Top2::ZM-WUS2::IN2-1 TERM ZM-PLTP Pr O::ZM-ODP2::OS-T28 TERM GZ-W64A TERM UBI PRO::UBI1ZM INTRÓN::ESR::SB-SAG12 TERM SB-ALS PRO:: HRA::SB-PEPC1 TERM LTP2 PRO::ZS-AMARILLO::PINII TERM-LB, como se describe en el ejemplo 3. Para PLTP PRO, véase SEQ ID NO. 1. La agrobacteria se hizo crecer en medio líquido hasta una densidad óptica de 0,5 (a 520 nm) y los embriones inmaduros (53, 52 y 56 embriones de tres mazorcas separadas) se incubaron en la suspensión de Agrobacterium durante 5 minutos antes de retirarlos del líquido para colocarlos en medio 710I sólido.

Después de 24 horas, los embriones se movieron a medio 605T para empezar la selección frente a Agrobacterium. Después de 6 días, se observaron numerosos embriones somáticos pequeños en la superficie de cada uno de los 124 embriones inmaduros tratados. Cada embrión inmaduro contenía numerosos embriones somáticos individuales distintos, estando muchos en soporte de suspensores claramente definidos. Los embriones representativos producidos por la expresión de ODP2 y WUS 2 se muestran en la figura 1 y la figura 2, por ejemplo, véanse las flechas que apuntan a embriones recién formados en la figura 1. También se observan embriones fluorescentes recién formados en la figura 2. La imagen de la figura 1 se capturó 4 días después de que empezara la infección con Agrobacterium, usando un estereomicroscopio con iluminación desde arriba. La longitud global del embrión cigótico es de aproximadamente 1,5 mm. Los embriones mostrados en la figura 2 se transformaron con los casetes de expresión AXIG1::WUS2:: IN2 y PLTP::ODP2::OS-T28, junto con un casete de expresión UBI PRO::ZS-VERDE::PINII. La imagen muestra embriones fluorescentes que crecer en la superficie escutelar del embrión cigótico originalmente transformado después de tratamiento usando los métodos divulgados. Esta imagen se capturó 4 días después del inicio de la infección con Agrobacterium, usando un estereomicroscopio con accesorios de epifluorescencia y un conjunto de filtro Leica GFP convencional. La longitud global del embrión cigótico es de aproximadamente 1,5 mm.

Siete días después de la agroinfección, los embriones se transfirieron a medio de maduración (medio 289Q con 0,1 mg/l de imazapyr), usando herbicida imidazolinona para seleccionar embriones transgénicos. Después de 14 días en el medio de maduración, los embriones maduros se movieron a medio de enraizamiento (medio 13158H; medio 13158 más 25 mg/l de cefotaxima) y se muestrearon trozos foliares para análisis de PCR. De los 53 embriones derivados de la primera mazorca, se analizaron 12 plantas resistentes a herbicida usando análisis por PCR y se enviaron al invernadero entre 32 34 días después del inicio del experimento, que se empezó cuando se inició la transformación con Agrobacterium. Las plantas se muestrearon para PCR tomando dos muestras de cada planta, una de cada una de los dos hojas opuestas (de lados opuestos de la planta) para confirmar que las plantas no eran quiméricas. Los resultados de PCR para cada par de muestras de todas las plantas indicó que no se producían plantas quiméricas, y que las plantas T0 eran homogéneamente transgénicas.

B. Comparación de ausencia de selección con herbicida, ausencia de selección con herbicida con la adición de aminoácidos de cadena ramificada, o selección con imazapyr.

Se realizaron dos réplicas de este experimento, siendo las únicas diferencias entre las dos réplicas el número de embriones inmaduros de partida y los números de embriones (o plantas) que se mueven a las fases sucesivas del experimento. Para ambas réplicas, se infectaron embriones inmaduros del endogámico Pioneer PH184C con la cepa de Agrobacterium AGL1 (THY-) que contenía el siguiente ADN T (de PHP77833); RB NOS PRO::Top2::ZM-WUS2::IN2-1 TERM ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2::OS-T28 TERM GZ-W64A TERM UBI PRO:UBI1ZM INTRÓN:ESR::SB-SAG12 TERM SB-ALS PRO:: HRA::SB-PEPC1 TERM LTP2 PRO::ZS-AMARILLO::PINII TERM-LB. Después de una infección de 5 minutos en la suspensión de Agrobacterium líquida, los embriones inmaduros se transfirieron a medio de cultivo sólido (medio 2701) durante una noche. El siguiente día, los embriones se movieron a uno de tres medios, 605T; 605T con 0,1 mg/l de etametsulfurón (que también contenía el herbicida imazapyr (0,1 mg/l) para la selección) más aminoácidos de cadena ramificada (abreviados como "AA", que contenían leucina, isoleucina o valina 100 mM); o 605T con 0,1 mg/l de etametsulfurón (que también contenía el herbicida imazapyr (0,1 mg/l) para la selección) sin aminoácidos de cadena ramificada. Los embriones se movieron a medio de maduración 12 días después, transfiriéndose los embriones del medio 605T al medio 289Q con 0,1 mg/l de imazapyr (selección durante la maduración), transfiriéndose los embriones del medio 605T con 0,1 mg/l etametsulfurón con AA siendo transferido a medio 289Q (selección temprana, pero no selección durante la maduración), y moviéndose los embriones de medio 605T con 0,1 mg/l etametsulfurón a medio 289Q (selección temprana). Dieciséis días después, los embriones con embriones somáticos sanos se movieron a medio de regeneración medio 272V.

Para la primera réplica de este experimento, 206 embriones se trataron con Agrobacterium y un día después 106, 67 o 33 embriones se movieron a medio 605T (sin selección durante la primera semana), medio 605T con 0,1 mg/l de etametsulfurón con AA (selección temprana con AA) o medio 605T con 0,1 mg/l de etametsulfurón (selección temprana sin AA), respectivamente. Para la siguiente transferencia, 45, 16 y 0 embriones se movieron a su medio de maduración respectivo. Para la transferencia final a medio de enraizamiento, 18, 10 y 0 plántulas (acontecimientos individuales) se movieron. De estos acontecimientos, 16 y 10 se muestrearon para PCR y se descubrió que 6 y 2 plantas tenían una sola copia de los transgenes integrados, observándose 0 y 2 escapes (plantas de tipo silvestre que sobrevivieron al proceso de selección), respectivamente. Para esta réplica del experimento, el tiempo transcurrido total desde la infección con Agrobacterium hasta el invernadero fue 48 días. Estos resultados indicaron que la selección temprana sin selección continuada en la maduración de los embriones permitió que sobrevivieran escapes de tipo silvestre (junto con algunos acontecimientos transgénicos). Sin embargo, la selección temprana sin aminoácidos de cadena ramificada complementarios parecía ser agresiva durante la fase cuando se formaban los embriones somáticos y, por tanto, no se producían acontecimientos. Iniciar la selección al principio de la fase de maduración fue lo más eficaz para la recuperación de acontecimientos sin escapes.

Para la segunda réplica, un total de 196 embriones se trataron con Agrobacterium en líquido durante 5 minutos y después se cocultivaron durante un día en medio 7101. En este punto, 94, 66 o 36 embriones se movieron a medio 605T, medio 605T con 0,1 mg/l de etametsulfurón con AA o medio 605T con 0,1 mg/l de etametsulfurón, respectivamente. Doce días después, los 94 embriones en 605T se dividieron (47 cada uno) en medio 289Q con 0,1 mg/l de imazapyr o en medio 289Q con 0,5 mg/l de imazapyr. Los embriones tanto del medio 605T con 0,1 mg/l de etametsulfurón con AA como del medio 605T con 0,1 mg/l de etametsulfurón se movieron a 289Q (sin selección adicional). Después de la maduración, las plántulas sanas (acontecimientos) se transfirieron a medio de enraizamiento 13158H, moviendo 14, 11, 13 y 0 acontecimientos de los cuatro tratamientos de maduración anteriores, respectivamente. Finalmente, 4, 5 y 2 plantas se enviaron al invernadero para los tres tratamientos de los que se recuperaron los acontecimientos, y se produjo solamente un acontecimiento de una sola copia de la selección con 0,5 mg/l de imazapyr durante la maduración.

C. Comparación de dos promotores, ZM-PLTP PRO::Top1 y DR5 PRO::Top3, que dirigen la expresión de ODP2.

Para ambos tratamientos, se recogieron embriones inmaduros del endogámico Pioneer PH184C, se trataron con la cepa de Agrobacterium AGL1 (THY-) que contenía los plásmidos respectivos, se transfirieron a medio 605T después de un día en medio de cocultivo 7101 con Agrobacterium, se cultivaron en medio 605T durante 10 días, se movieron a 13226D con 0. 1 mg/l de etametsulfurón durante dos días y después se transfirieron a medio de maduración (289Q con 0,1 mg/l de imazapyr) durante 13 días. Después de la maduración, las plántulas (acontecimientos) se movieron a medio de enraizamiento (germinación) 13158 durante diez días (fase de enraizamiento).

1. Promotor ZM-PLTP que dirige la expresión de ZM-ODP2.

Ochenta embriones inmaduros se trataron con Agrobacterium que contenía PHP78157 (SEQ ID NO. 23). Inicialmente, todos los embriones inmaduros tratados respondieron produciendo rápidamente muchos embriones somáticos individuales sobre la superficie de cada escutelo. Al final de la fase de enraizamiento, se produjeron 18 plántulas. Un subconjunto de diez plantas se envió al invernadero y se muestreó para análisis por PCR (el tiempo total transcurrido al invernadero fue 46 días). De estos diez, seis eran de múltiples copias y/o contenían la cadena principal plasmídica (BB), y había 4 escapes.

ii. Promotor DR5 que dirige la expresión de ODP2.

Setenta embriones inmaduros se trataron con Agrobacterium que contenía PHP78156, que portaba el ADN T que contiene lo siguiente: RB NOS PRO::Top2::WUS2::IN2-1 TERM DR5 PRO:Top3:ODP2::OS-T28 TERM GZ-W64A TERM UBI PRO::ESR::SB-SAG12 TERM SB-ALS PRO:: HRA::SB-PEPC1 TERM LTP2 PRO::ZS-AMARILLO::PINII TERM-LB (SEQ ID NO: 24).

Inicialmente, todos los embriones inmaduros tratados respondieron produciendo rápidamente muchos embriones somáticos individuales sobre la superficie de cada escutelo. Al final de la fase de enraizamiento, se produjeron 18 plántulas. Un subconjunto de 12 plantas se envió al invernadero y se muestreó para análisis por PCR (el tiempo total transcurrido al invernadero fue 46 días). De estas doce plantas analizadas por PCR, 6 eran de múltiples copias/BB+, 4 eran de una sola copia y sin cadena principal (BB-), y había 2 escapes.

Ejemplo 6: ZM-PLTP::ZM-ODP2 ZM-AXIG1 PRO::ZM-WUS2.

La expresión de ODP2 bajo el control del promotor PLTP y la expresión de WUS2 bajo el control del promotor AXIG1 provocó recuperación mejorada de la planta, altas frecuencias de las plantas enviadas al invernadero y mayor frecuencia de acontecimientos de una sola copia.

Se recogieron embriones inmaduros de dos endogámicos de maíz (HC69 y PH184C) y se infectaron con Agrobacterium (cepa LBA4404 THY-) que contenía PHP79023 (SEQ ID NO: 25) o PHP79024 (SEQ ID NO: 26). Para el endogámico HC69, se transformaron 67 embriones inmaduros con PHP79024, produciendo finalmente 26 plantas que eran resistentes a 0,1 mg/l de imazapyr (38,8 % de frecuencia con respecto al número de embriones de partida). En comparación, cuando se transformaban 65 embriones HC69 con PHP79023, se enviaron 10 plantas resistentes a herbicida al invernadero (15,4 % de frecuencia). Además, las plantas producidas usando PHP79024 eran más vigorosas y saludables en el invernadero.

Plantas transgénicas procedentes de ambos plásmidos de partida se enviaron al invernadero 33 días después de infección con Agrobacterium.

Para el endogámico PH184C, se transformaron 64 embriones inmaduros con PHP79024, produciendo finalmente 30 plantas que eran resistentes a 0,1 mg/l de imazapyr (46,8% de frecuencia con respecto al número de embriones de partida). En comparación, cuando se transformaban 73 embriones PH184C con PHP79023, se enviaron 27 plantas resistentes a herbicida al invernadero (37 % de frecuencia). Además, las plantas producidas usando PHP79024 eran más vigorosas y saludables en el invernadero. Plantas transgénicas procedentes de ambos plásmidos de partida se enviaron al invernadero 33 días después de infección con Agrobacterium. Por tanto, para ambos endogámicos, usar el promotor DR5 para dirigir la expresión de WUS2 (junto con PLTP PRO::ODP2) produjo rápidamente embriones somáticos transgénicos que podían germinar en plantas T0 transgénicas, pero la combinación de AXIG1 PRO::WUS2 PLTP PRO::ODP2 era incluso más eficaz, ambas en términos de la frecuencia global de producción de plantas transgénicas, pero también en términos de vigor y salud de T0 en el invernadero.

Ejemplo 7: Separación de embriones somáticos del escutelo de sostén.

La recuperación de plantas transgénicas independientes se mejoró por separación de embriones somáticos del escutelo de sostén de los embriones inmaduros cigóticos originales. Se transformaron embriones inmaduros del endogámico Pioneer PHH5G usando la cepa de Agrobacterium AGL1 (THY-) que portaba el plásmido PHP79066 (SEQ ID NO: 28) (véase la tabla 1). Después de cocultivo de 45 embriones inmaduros con Agrobacterium en medio 7101 durante un día, los embriones inmaduros se movieron a medio de reposo (medio 605T) sin selección durante 12 días. Los embriones se movieron a medio de maduración durante 13 días, y se observaron claramente múltiples embriones somáticos maduros derivados de un solo embrión inmaduro cigótico original (figura 3). En este punto, los embriones se retiraron de medio sólido y se colocaron en un cultivo líquido (medio 289R). El tubo que contenía el tejido de maíz suspendido entonces se mezcló en agitadora vorticial a alta potencia durante 30-60 segundos, inspeccionando visualmente la suspensión cada 10-15 segundos hasta que parecía que el tejido estaba disperso. La suspensión líquida entonces se vertió en medio de enraizamiento sólido (medio 13158H con 0,1 mg/l de herbicida imazapyr) y el líquido se retiró por pipeteo de la placa. A partir de este material, se produjeron más de 200 plantas (plantas representativas mostradas en la figura 4), que provocaron un promedio de 4,4 plantas recuperadas por cada embrión de partida que se transformó. De las aproximadamente 200 plantas T0, 152 se muestrearon para análisis por PCR, todas se transformaron basándose en los resultados de PCR (sin escapes) y 43 plantas eran de una sola copia para los transgenes sin cadena principal de Agro (28,3 % de una sola copia sin BB). Basándose en esta frecuencia, el número total de plantas T0 recuperadas y el número de partida de embriones, la producción de acontecimientos T0 útiles de calidad (una sola copia, sin cadena principal) fue de más de un 100 % basado en el número de embriones de partida.

Ejemplo 8: Escisión mediada por CRE.

A. Escisión mediada por UBI::CRE::PINII.

Se recogieron embriones inmaduros de endogámicos Pioneer HC69 (293 embriones) y PH184C (241 embriones), y se transformaron con la cepa de Agrobacterium AGL1 (THY-) que portaba el plásmido PHP80334 (SEQ ID NO: 42) que contenía los elementos genéticos mostrados en la tabla 1. Después de 5 minutos de exposición a Agrobacterium en medio líquido 710I, los embriones se sembraron en placa en medio 710I solidificado en agar para cocultivo durante una noche. Después de un día de cocultivo, los embriones se movieron a medio de reposo (605T sin selección) durante 7 días, se transfirieron a medio de maduración (289Q con 0,1 mg/l de imazapyr) durante 14 días, y después se movieron a medio de enraizamiento (germinación) durante al menos 14 días antes de mover las plantas al invernadero. Basándose en el número original de embriones transformados, un 19,1 % y un 13,8 % de los embriones originales produjeron una planta transgénica en HC69 y PH184C, respectivamente. Para determinar la frecuencia de escisión, se realizaron siete reacciones de PCR para ensayar la ausencia de los casetes de expresión CRE, WUS2, ODP2, ZS-VERDE1 y ESR (es decir, todos los segmentos polinucleotídicos que estaban originalmente entre los dos sitios LOXP en el ADN T) y la presencia del casete de expresión HRA. Los resultados de PCR revelaron que un 21 % de las plantas HC69 contenían solamente el casete de expresión HRA (que confería resistencia al herbicida imazapyr) habiendo escindido el segmento entre los dos sitios LOXP originales. Por tanto, estas plantas ya no contenían los casetes de expresión CRE, WUS2, ODP2, ZS-VERDE1 y ESR. Cuando se analizaban las plantas para la presencia del casete HRA habiendo escindido los demás casetes, la frecuencia de escisión para PH184C era incluso mayor que para HC69, mostrando un 47 % de las plantas que se había producido escisión completa perfecta.

Se observó una diferencia en la respuesta de crecimiento temprana cuando el plásmido que contenía UBI PRO:: CRE se comparaba con construcciones que no estaba diseñadas para escisión. En contraste con las construcciones que no son de escisión que contienen AXIG1 PRO::WUS2 PLTP PRO::ODP2, en las que eran visibles embriones somáticos a los 6 días después de infección con Agrobacterium, no había embriones somáticos fluorescentes observados en el tratamiento con UBI PRO::CRE durante este intervalo. El promotor de la ubiquitina (UBI PRO) es un promotor constitutivo muy fuerte que se ha usado ampliamente durante muchos años (Christensen y Quail, (1996) Transgenic Research 5:213-218). Debido a su fuerza y patrón de expresión ubicua, se prevé que UBI PRO::CRE empezaría a expresarse inmediatamente tras introducirse en la célula, por tanto, se prevé que los casetes de expresión WUS y ODP2 podrían escindirse antes de poder estimular la formación de embriones somáticos. Sorprendentemente, sin embargo, cuando los embriones cigóticos originales se colocaban en medio de maduración, se observaba que se formaban múltiples embriones en lo que originalmente había sido un solo embrión cigótico. La maduración en el herbicida imazapyr fue una selección muy rigurosa frente al crecimiento de tipo silvestre, y coherente con esto, los resultados de PCR confirmaron que las plantas resultantes eran transgénicas y que un 60 % de las plantas T0 de una sola copia analizadas por PCR mostraban la existencia de escisión perfecta de Wu S, ODP2, CRE, ZS-VERDE1 y ESR. El ADN T de PHP80334 contiene los casetes de expresión AXIG1 PRO::WUS2, PLTP PRO::ODP2, UBI PRO::CRE, UBI PRO::ZS-VERDE y ESR localizados dentro de los sitios de recombinación loxP. Cuando este ADN T se introducía en células embrionarias inmaduras, no se observaba fluorescencia verde que indicara que se producía escisión antes de que pudiera acumularse proteína fluorescente verde a niveles visibles (típicamente menos de 24 horas en un casete de expresión UBI PRO: :ZS-VERDE no escindido). Estos datos muestran que una costa estimulación de WUS y ODP2 es eficaz para la formación rápida de embriones somáticos de novo y germinación de estos embriones somáticos para producir plantas T0 transgénicas.

B. Escisión mediada por GLB1 ::CRE.

Se recogieron embriones inmaduros de endogámicos Pioneer PH184C, y se transformaron con la cepa de Agrobacterium AGL1 (THY-) que portaba el plásmido PHP80338 (SEQ ID NO: 43) que contenía los elementos genéticos mostrados en la tabla 1. Los métodos de transformación, selección y germinación de las plantas fueron los mismos que los descritos para el experimento UBI PRO::CRE en el ejemplo 8-A anterior. El análisis por PCR de plantas T0 demostró que un 58 % de las plantas de una sola copia habían experimentado escisión completa de los genes de desarrollo (ODP2 y WUS) y CRE. Sustituir promotores que se sabe que dirigen la expresión durante el desarrollo embrionario (LTP2, OLE, END-2) o que se estimulan por agresión (IN2-1) también provocó la escisión de los genes de desarrollo (ODP2, WUS2) y CRE antes de la germinación para producir plantas T0 transgénicas.

En una comparación de diferentes promotores que dirigen la expresión de CRE, se recogieron embriones inmaduros del endogámico Pioneer HC69 o PH184C y se transformaron con la cepa de Agrobacterium LBA4404 (Thy-) que porta un plásmido que contiene un ADN T con los siguientes componentes; RB-loxP-AXIG1 PRO::WUS2::In2-1 Te RM PLTP PRO::ODP2::PINII TERM "X PRO"::CRE::OS-T28 TERM-loxP SB-ALS PRO::ZM-HRA::PINII TERM, donde "X PRO" era UBI PRO, WOX2a PRO, IN2 PRO, LTP2 PRO, OLE PRO, GLB1 PRO, HSP17.7 PRO o HSP26 PRO de maíz que se usaron para dirigir la escisión de WUS, ODP2 y CRE. Después de 5 minutos de exposición a Agrobacterium en medio líquido 710I, los embriones se sembraron en placa en medio 7101 solidificado en agar para cocultivo durante una noche. Después del cocultivo de un día, los embriones se movieron a medio de reposo (605T sin selección) durante 7 días, se transfirieron a medio de maduración (289Q con 0,1 mg/l de imazapyr) durante 14 días, y después se movieron a medio de enraizamiento (germinación) durante al menos 14 días antes de mover las plantas al invernadero.

Tabla 10. Fr n i r n f rm i n i i n r r m r iri n l x r i n r m in RE.

Como se muestra en la tabla 10, las eficacias de transformación se midieron mediante el número de plantas T0 recuperadas de un número dado de embriones inmaduros de partida y las frecuencias de escisión se muestran para WUS2, ODP2 y CRE. La tabla 10 también muestra el número de embriones inmaduros que se infectaron con Agrobacterium, el número de plantas T0 producidas, la frecuencia de transformación calculada [(n.° de plantas T0/n.° de embriones infectados) * 100] y la frecuencia de escisión final basada en el análisis de PCR para la presencia o ausencia de WUS, ODP2, CRE y HRA. Para el endogámico PH184C, no se observó escisión en los tratamientos de control negativo en que el ADN T contenía WOX2a::CRE::PINII o IN2::CRE::PINII (PHP80558 o PHP80560, respectivamente). Sin embargo, para tratamientos en que el promotor que dirige CRE se expresaba fuertemente en toda la planta (UBI), se expresaba fuertemente en embriones en desarrollo (LTP2, OLE, GLB1) o se inducía fuertemente por tratamiento con calor (HSP17.7, HSP26), las frecuencias de escisión variaron entre un 40 y un 60 %. Para UBI PRO, la escisión de WUS2 y ODP2 fue rápida, provocando una frecuencia de transformación reducida (9 %) y que la frecuencia de escisión medida en las plantas T0 fuera alta a un 60 %. Para los promotores expresados durante desarrollo embrionario intermedio a tardío (LTP2, OLE y GLB1) las frecuencias de transformación fueron mayores que para UBI (33, 26 y 22 %, respectivamente) mientras que las frecuencias de escisión fueron ligeramente inferiores que para UBI (50, 40 y 47 %, respectivamente). El tratamiento en que se usó HSP17.7 para controlar la expresión de CRE produjo los mejores resultados globales en ambas categorías, produciendo la frecuencia de transformación más alta (54 %) y la frecuencia de escisión más alta (67 %). HSP26 produjo resultados que estaban en el mismo intervalo que los promotores embrionarios, con frecuencias de transformación y escisión de un 32 % y 54 %, respectivamente.

Cuando se usaban los promotores de desarrollo embrionario para la escisión, se observaban numerosos embriones somáticos en estos tratamientos (similar a los experimentos donde no estaban presentes componentes de escisión) que indicaban que la expresión se retardaba hasta una fase posterior de desarrollo embrionario, pero cuando se desencadenaba por el desarrollo, la expresión era uniformemente fuerte por todos los embriones, provocando escisión eficaz de WUS2, ODP2 y CRE. Para los promotores termosensibles, la exposición a calor (es decir, 42 °C durante dos horas repetida en tres días consecutivos) se postergaba hasta que los embriones se movían a medio de maduración, provocando números altos de embriones somáticos que se formaban rápidamente después de transformación, seguido de posterior escisión eficaz.

Ejemplo 9: Recuperación mejorada de acontecimientos de recombinación específica de sitio.

Se recogieron mazorcas inmaduras de PH184C y se extrajeron embriones inmaduros de 2,0 mm de los granos en el día del tratamiento por bombardeo de partículas. Los embriones se colocaron en medio osmótico elevado (medio 13224B) durante tres horas antes del bombardeo de partículas. Los embriones inmaduros se bombardearon con una relación equimolar de plásmidos que contenían los siguientes casetes de expresión; FRT1 :PMI::PINII TERM:FRT87 UBI PRO:UBI1ZM INTRÓN::MO-FLP::PINII TERM ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2::PINII TERM ZM-AXIG1 PRO::ZM-WUS2::PINII TERM. Después del bombardeo de partículas, los embriones inmaduros permanecieron en el medio osmótico elevado durante una noche, y después se transfirieron a medio de reposo (medio 13266K con 150 mg/l de G418) durante 8 días. Después del periodo de reposo, los embriones se transfirieron a medio de maduración (medio 289O con 150 mg/l de G418) durante 21 días, y después se movieron a medio de enraizamiento (medio 272X con 150 mg/l de G418) durante 14-17 días (hasta que las raíces fueron bastante grandes para trasplante al suelo). En la fase de plántula, se muestreó tejido foliar para análisis por PCR para confirmar que los genes dentro de los sitios FRT1 y FRT87 flanqueantes del locus diana original ya no estaban presentes y que los nuevos genes dentro del casete donador habían recombinado en el locus diana correctamente, y se identificaron los acontecimientos RMCE (intercambio de casete mediado por recombinasa) precisos. Esto redujo el ciclo SSI completo, desde la transformación hasta tener plantas derivadas de RMCE preciso en el invernadero, en 43-50 días, dependiendo del tiempo que requiriera producir raíces adecuadas. Como alternativa, se desarrolló un método de SSI mediado por Agrobacterium usando construcciones con AXIG1 PRO::WUS2 PLTP PTO::ODP2. Se suministraron dos ADN T en dos experimentos separados; conteniendo el primer ADN T los casetes de expresión PMI, WUS2, ODP2 y DsROJO dentro de los sitios de recombinación FRT1 y FRT87 flanqueantes (RB- UBI PRO:UBI1ZM INTRÓN::MO-FLP::PINII TERM CaMV35S TERM FRT1 :PMI::PINII TERM ZM-AXIG1 PRO::ZM-WUS2::IN2-1 TERM ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2::OS-T28 TERM UBI PRO::UBI1ZM INTRÓN::DsROJO: FRT87-LB) (RV003866) y conteniendo el segundo ADN T solamente PMI y DsROJO dentro de los sitios FRT1 y FRT87 (RB- ZM-AXIG1 PRO::ZM-WUS2::IN2-1 TERM ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2::OS-T28 TERM UBI PRO:UBI1ZM INTRÓN::MO-FLP::PINII TERM CaMV35S TERM FRT1 :PMI::PINII TERM UBI PRO::UBI1ZM INTRÓN::DsROJO: FRT87-LB) (RV004886). Cada uno de los ADN T se suministró mediante transformación mediada por Agro en líneas diana con sitios de descarga FRT 1-FRT87 como se describe en la solicitud provisional de Estados Unidos n.° 62/296639. Se identificaron acontecimientos RMCE precisos usando un ensayo de PCR múltiple como se describe en USPSP n.° 5907 y los datos se resumen en la tabla 11. El uso de los casetes de expresión AXIG1 PRO::WUS2 PLTP PTO::ODP2 para Agro SSI redujo el proceso SSI completo en varias semanas (al menos 3-4 semanas), en comparación con el método de transformación normal para generar acontecimientos SSI.

Tabla 11. R r i n n imi n RM E n x rim n A r I n x r i n W 2 y ODP2.

Ejemplo 10: Recuperación mejorada de acontecimientos que contienen modificaciones genómicas mediadas por CAS9/CRISPR.

El corte mediado por CAS9 del genoma del maíz se usa para introducir cambios de un solo codón en el gen ALS2 de maíz. Para generar alelos editados ALS2, se clona un fragmento de 794 pb de homología en un vector plasmídico y se ensayan dos oligos de ADN monocatenarios de 127 nucleótidos como molde de reparación, que contienen varios cambios nucleotídicos en comparación con la secuencia natural. Los moldes de reparación de 794 pb incluyen un cambio mononucleotídico que dirigirá la edición de secuencias de ADN correspondientes al cambio de prolina en la posición del aminoácido 165 en serina (P165S), así como tres cambios adicionales dentro del sitio diana ALS-CR4 y la secuencia PAM. La modificación de la secuencia PAM dentro del molde de reparación altera el codón de metionina (AUG) en isoleucina (AUU), que se produce de forma natural en el gen ALS1. Los medios usados para el bombardeo de partículas, la selección y la regeneración son similares a los usados en este documento. Se bombardean aproximadamente 1000 embriones inmaduros por tratamiento con los dos oligos o moldes de reparación de un solo plásmido, UBI PRO:UBI1ZM INTRÓN:CAS9::PINII, POLIII PRO::ALS~CR4 ARNg, UBIPRO:UBI1ZM INTRÓN:MOPAT~DSROJO::PINII TERM, ZM-PLTP PRO: :ZM-ODP2: :PINII TERM y ZM-AXIG1 PRO::ZM-WUS2::PINII TERM. Después del bombardeo de partículas, los embriones inmaduros se colocaron en medios que contenían 3 mg/l de bialafós para seleccionar embriones somáticos resistentes a herbicida. Después del periodo de reposo de 8 días, los embriones se transfirieron a medio de maduración con bialafós durante 21 días, y después se mueven a medio de enraizamiento durante 14-17 días (hasta que las raíces eran suficientemente grandes para trasplante al suelo). Cinco semanas después de la transformación, se transfirieron doscientas plántulas jóvenes independientes (por tratamiento) seleccionadas aleatoriamente que crecían en medio selectivo a medio reciente con bialafós en recipientes PlantCon™ (recipientes de plástico estériles que pueden alojar plantas de hasta 15,24 cm (6") de altura). Las plántulas restantes (aproximadamente 800 por tratamiento) se transfirieron al medio sólido en PlantCons™ (recipiente de histocultivo de plantas preesterilizado disponible en MP Biomedicals LLC, 3 Hutton Center Drive, Suite 100, Santa Anna, CA 92707) que contenía 100 ppm de clorsulfurón como selección directa para un gen ALS2 editado. Un mes después, 384 de las plántulas muestreadas aleatoriamente (sin selección), y siete plántulas que sobrevivieron a selección con clorsulfurón se muestrearon para análisis. Se detectaron alelos ALS2 editados en 9 plántulas: dos derivadas de las plántulas seleccionadas aleatoriamente que crecían en bialafós y generadas usando el molde de ADN de reparación de 794 pb, y los 7 restantes derivados de plántulas resistentes a clorsulfurón editadas usando los oligos monocatenarios de 127 nt. El análisis del gen ALS1 reveló únicamente secuencia de tipo silvestre, que confirma la alta especificidad del ARNg ALS-CR4.

Las nueve plantas que contenían alelos ALS2 editados se enviaron al invernadero y se muestrearon para análisis molecular adicional y ensayo de la descendencia. El análisis de secuencia de ADN de alelos ALS2 confirma la presencia de la modificación P165S, así como los otros cambios nucleotídicos asociados con los respectivos moldes de reparación. La descendencia T1 y T2 de dos plantas T0 se analizó para evaluar la herencia de los alelos ALS2 editados. Las plantas de la descendencia derivadas de cruces usando polen de plantas Hi-II de tipo silvestre se analizaron por secuenciación y demostraron transmisión sexual de los alelos editados observados en la planta original con relación de segregación 1:1 esperada (57:56 y 47:49, respectivamente). Para ensayar si la secuencia ALS editada confería resistencia a herbicida, se pulverizaron plantas T1 segregantes de cuatro semanas de edad seleccionadas con alelos ALS2 editados y de tipo silvestre con cuatro concentraciones diferentes de clorsulfurón (50, 100 (1x), 200 y 400 mg/litro). Tres semanas después del tratamiento, las plantas con un alelo editado mostraban fenotipo normal, mientras que las plantas con solamente alelos de tipo silvestre demostraban signos fuertes de senescencia. Además, los embriones aislados de semillas derivadas de plantas polinizadas con polen HI-II de tipo silvestre se germinaron en medio con 100 ppm de clorsulfurón. Catorce días después de la germinación, las plantas con alelos editados mostraron altura normal y un sistema de raíces bien desarrollado, mientras que las plantas con alelos de tipo silvestre eran cortas y no desarrollaban raíces.

En el experimento anterior, cuando no se incluían los casetes de expresión ODP2 y WUS2 (en dos plásmidos separados) con los plásmidos que contenían los moldes de reparación, Cas9, ALS-CR4 ARNg, y MoPAT-DsROJO, no se recuperaron acontecimientos después del bombardeo de partículas de 1000 embriones inmaduros y selección en bialafós en el endogámico Pioneer PHH5G (control negativo). En comparación, cuando los plásmidos que contenían PLTP PRO::ODP2::PINII y AXIG1 PRO::WUS2::PINII TERM se añadían a la mezcla plasmídica para preparación de partículas de oro y bombardeo de partículas, se recuperaron acontecimientos que contenían ediciones génicas mediadas por CAS/CRISPR en el gen ALS. Después del bombardeo de partículas de aproximadamente 1000 embriones inmaduros de endogámico Pioneer PHH5G, se recuperaron más de 1000 plántulas resistentes a bialafós, y de estas, se determinó que nueve contenían ediciones al gen ALS2 genómico que confiere resistencia al herbicida clorsulfurón.

Ejemplo 11: Transformación de alta eficacia y producción rápida de plantas T0 en sorgo.

Se realizó transformación de sorgo usando un protocolo optimizado mediado por Agrobacterium (Wu et al., 2014, In Vitro Cellular and Developmental Biology 50:8-14) con los métodos que se resumen a continuación.

A. Material de sorgo y proceso de transformación.

Se usó TX430, una variedad de sorgo sin taninos, en este estudio. Las temperaturas en el invernadero promediaron 29 °C durante el día y 20 °C por la noche con un fotoperiodo de 12 h día/noche y se proporcionó iluminación complementaria mediante una relación 3:1 de lámparas de haluro metálico (1000 W) y de sodio de alta presión (1000 W). Los componentes de los medios usados en este estudio se enumeran en la tabla 2. El protocolo de transformación basal se describe con detalle como "tratamiento C" en Zhao et al. (Plant Mol. Biol. (2000) 44:789-798). En resumen, se esterilizaron granos inmaduros de sorgo recién recogidos con lejía al 50 % y Tween-20 al 0,1 % durante 30 min al vacío y después se aclararon con agua estéril tres veces. Los embriones se sometieron a las cinco siguientes etapas secuenciales: (1) Infección con Agrobacterium: los embriones se incubaron en una suspensión de Agrobacterium (DO = 1,0 a 550 nm) con medio PHI-I durante 5 min; (2) cocultivo: los embriones se cultivaron en medio PHI-T después de infección durante 3 d a 25 °C en la oscuridad; (3) reposo: los embriones se cultivaron en medio PHI-T más 100 mg/l de carbenicilina durante 7 d a 28 °C en la oscuridad; (4) selección: los embriones se cultivaron en medio PHI-U durante 2 semanas, seguido de cultivo en medio PHI-V durante el resto del proceso de selección a 28 °C en la oscuridad, usando intervalos de subcultivo de 2-3 semanas; (5) regeneración: se cultivó callo en medio PHI-X durante 2-3 semanas en la oscuridad para estimular el desarrollo de brotes, seguido de cultivo durante 1 semana en condiciones de 16 h de luz (40-120 |uE m-2 s-1) y 8 h de oscuridad a 25 °C, y un subcultivo final en medio PHI-Z durante 2-3 semanas bajo las luces (16 h, 40-120 gE m-2 s-1) para estimular el crecimiento de raíces. Las plántulas regeneradas se trasplantaron al suelo y crecieron en el invernadero (Zhao etal. 2000). Las plantas T0 se autopolinizaron para producir descendencia T1 para análisis adicional.

En otro experimento, los embriones se sometieron a las cinco siguientes etapas secuenciales: (1) Infección con Agrobacterium con PHP79023: los embriones se incubaron en una suspensión de Agrobacterium (DO = 1,0 a 550 nm) con medio PHI-I durante 5 min; (2) cocultivo: los embriones se cultivaron en medio PHI-T después de infección durante 7 d a 25 °C en la oscuridad; (3) selección durante maduración: los embriones se maduraron en medio 289M con 0,1 mg/l de imazapyr durante 4 semanas, seguido de enraizamiento en medio 13113A con 0,1 mg/l de imazapyr (el medio 13113A contiene sales MS diluidas al 50 % y vitaminas, 0,05 g/l de mioinositol, 20 g/l de sacarosa y 3 g/l de Phytagel, pH 5,6). Las plántulas regeneradas se trasplantaron al suelo y crecieron en el invernadero (Zhao et al. 2000). Las plantas T0 se autopolinizaron para producir descendencia T1 para análisis adicional.

B. Cepas de A grobacterium y vectores usados con sorgo.

Se usó la cepa de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Lazo et al. (1991) Biotechnology 9:963-967), que contenía un primer plásmido que contenía los genes vir de Agrobacterium (Komari (1990) Plant Cell 9:303-306; Komari et al. (1996) Plant J 10:165-174) y un segundo plásmido (PHP80334) que contenía un ADN T con los siguientes componentes: RB ZM-AXIG1 PRO::ZM-WUS2::IN2-1 TERM ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2::OS-T28 TERM GZ-W64A TERM UBI PRO:UBI1ZM INTRÓN:ESR::SB-SAG12 TERM SB-ALS PRO:: HRA::SB-PEPC1 TERM UBI PRO:UBI1ZM INTRÓN:ZS-VERDE1 ::PINII TERM:SB-ACTINA TERM-LB. Para comparaciones, se usó otra Agrobacterium que contenía un segundo plásmido con solamente un casete de expresión UBI PRO:UBI1 ZM INTRÓN:PMI::PINII TERM en el ADN T (sin casetes de expresión ZM-WUS2 o ZM-ODP2) que representa el tratamiento de control en este experimento.

C. Resultados de transformación de sorgo.

La frecuencia de transformación global fue de un 20 % cuando se usaba el plásmido de control, y de las plantas T0 enviadas al invernadero y analizadas usando qPCR, un 40 % eran de una sola copia son cadena principal de Agrobacterium. Para el tratamiento de control, la duración desde el inicio de la infección con Agrobacterium hasta que se enviaron plantas T0 al invernadero varió de 10 - 13 semanas.

La frecuencia de transformación global fue de un 32 % cuando se usaba el plásmido que contenía Zm-PLTP PRO::ZM-ODP2 DR5 PRO::ZM-WUS2 (véase PHP79023 en la tabla 1), y de las plantas T0 enviadas el invernadero y analizadas usando qPCR, un 42 % eran de una sola copia sin cadena principal de Agrobacterium, progresando directamente a la formación de embriones somáticos a partir de los embriones inmaduros cigóticos infectados originalmente, seguido de maduración de embriones somáticos, germinación in vitro y formación de raíces. Usar esta combinación de promotores y genes de desarrollo redujo sustancialmente el tiempo desde la infección con Agrobacterium hasta el envío de plantas T0 al invernadero en aproximadamente la mitad con respecto al tratamiento de control.

En un experimento adicional usando el plásmido PHP82240 con un ADN T que contenía RB-ZM-AXIG1 PRO::ZM-WUS2::IN2-1 TERM ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2::OS-T28 TERM SB-ALS PRO::ZM-HRA::PINII TERM un casete de expresión constitutiva de DsROJO-LB, se demostró que la formación directa de embriones somáticos de sorgo se mejoraba mediante el uso de PHP82240 con siete días de cocultivo en medio 7101 con 50 mg/l de carbenicilina. Esta combinación de plásmido y cocultivo de siete días provocó la duplicación de la frecuencia de transformación global de un 17,7 % a un valor final de un 38,9 %, mientras se reducía el tiempo desde la infección con Agrobacterium hasta el envío de las plantas T0 al invernadero en aproximadamente la mitad con respecto al tratamiento de control (reduciendo este periodo a 5-6 semanas de tiempo transcurrido total).

Ejemplo 12: Transformación de alta eficacia y producción rápida de plantas T0 en trigo.

A. Métodos de transformación de trigo.

Se retiró una alícuota de la cepa de Agrobacterium LBA4404 que contenía el vector de interés del almacenamiento a -80 °C y se sembró en estrías en medio LB sólido que contenía un agente selectivo (kanamicina o espectinomicina, dependiendo de los plásmidos que contiene la cepa bacteriana). La agrobacteria se cultivó en la placa LB a 21 °C en la oscuridad durante 2-3 días, tiempo en que se seleccionó una sola copia de la placa, se sembró en estrías en una placa de medio 810D que contenía el agente selectivo y después se incubó a 28 °C en la oscuridad durante una noche. El cultivo de Agrobacterium se transfirió de la placa usando una espátula estéril y se suspendió en ~5 ml de medio de infección de trigo (WI4) con acetosiringona (AS) 400 uM. La densidad óptica (600 nm) de la suspensión se ajustó hasta aproximadamente 0,1 a 0,7 usando el mismo medio.

Se recogieron de cuatro a cinco adiciones que contenían semillas inmaduras (con embriones de 1,4-2,3 mm), y los embriones inmaduros se aislaron de las semillas inmaduras. Los granos de trigo se esterilizaron superficialmente durante 15 min en lejía al 20 % (v/v) (hipoclorito de sodio al 5,25 %) más 1 gota de Tween 20, seguido de 2-3 lavados en agua estéril. Se siguió el resto del protocolo de trigo que incluía infección con Agrobacterium, cocultivo, cultivo durante el periodo de reposo, maduración de embriones somáticos y enraizamiento, como se describe en los ejemplos 4 y 5, incluyendo la etapa de selección en 0,1 mg/l de imazapyr y maduración para la producción de plantas de trigo T0 transgénicas.

B. Resultados de transformación de trigo.

Se usó la cepa de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Lazo et al. 1991, Biotechnology 9:963-967), que contenía un primer plásmido auxiliar superbinario (pVIR9, solicitud provisional de Estados Unidos n.° 62/252229) y un segundo plásmido (PHP79066), conteniendo los genes de desarrollo un ADN T con los siguientes componentes; r B ZM-AXIG1 PRO::ZM-WUS2::IN2-1 TERM ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2::OS-T28 TERM SB-ALS PRO:: HRA::SB-PEPC1 TERM LTP2 PRO::ZS-AMARILLO1 N1::PINII TERM LB. Para comparaciones, se usó otra Agrobacterium que contenía un segundo plásmido (PHP24600) con el siguiente ADN T: RB CAMV35S Te RM: PAT: CAMVS PRO+ UBIZM PRO: DS-ROJO: PINII TERM LB, que representaba el tratamiento de control en este experimento.

Cuando se usaba el plásmido de control para transformar embriones inmaduros de trigo de la variedad de trigo Pioneer elite Spring HC0456D, no se observaban estructuras regenerables en los primeros 7-10 días después de infección con Agrobacterium, mientras que los embriones inmaduros que se infectaban con la construcción génica de desarrollo PHP79066 producía estructuras regenerables 7-10 días después de la infección usando el medio de cultivo de maíz descrito en los ejemplos 4 y 5. Los embriones infectados con la construcción PHP79066 produjeron estructuras similares a plantas en 2 semanas (figura 5), en comparación con el callo proliferante observado para la construcción de control (no mostrada). Las plántulas enraizadas se recuperaron después de transformación con PHP79066 en 6 semanas después de la infección.

Cuando se usaba el plásmido que contenía ZM-AXIG1 PRO::ZM-WUS2::IN2-1 TERM ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2::OS-T28 TERM SB-ALS PRO:: HRA::SB-PEPC1 TERM LTP2:ZS-AMARILLO::PINII TERM para la transformación, la frecuencia de transformación global era de un 64 % (en comparación con un 6 % para el control). Se analizó un subconjunto de cuatro plantas usando qPCR, y tres eran positivas tanto para WUS como para el transgén ZS-AMARILLO. Usando esta combinación de genes de desarrollo, las plantas T0 regeneraban en 8-11 semanas después de la infección, reduciendo el tiempo desde la infección con Agrobacterium hasta el envío de plantas T0 al invernadero en dos-tres semanas.

Ejemplo 13: Observaciones de la formación rápida de embriones de novo en maíz y producción de plantas T0.

A. Morfología de embriones somáticos en desarrollo.

Después de la transformación de embriones inmaduros del endogámico Pioneer PH184C con la cepa de Agrobacterium LBA4404 que portaba un ADN T que contenía los casetes de expresión ZM-AXIG1 PRO::ZM-WUS2::IN2-11 TERM ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2::PINII UBI PRO: UBI1ZM INTRÓN:ZS-VERDE::PINII TERM, se formaban rápidamente embriones somáticos sobre la superficie del escutelo (es decir, en 4-6 días). Se observaron embriones somáticos individuales, formados directamente a los 2, 4, 7 y 12 días después del inicio de la infección con Agrobacterium. En el endogámico PH184C, cuando se usaba la combinación de NOS PRO::ZM-WUS2::PINII TERM ZM-PLTP::ODP2::PINII TERM, los embriones somáticos individuales se observaban adheridos al escutelo del embrión cigótico transformado originalmente mediante un anclaje delgado de células que parecía recordar el suspensor. Según continuaba el desarrollo del embrión, se observaban rasgos morfológicos adicionales que se observan normalmente en embriones cigóticos, incluyendo la formación de un anillo coleoptilar distintivo alrededor del meristemo apical en el origen del desarrollo del meristemo apical, y la formación del escutelo (que se vuelve blanco y opaco) que rodea el eje del embrión.

Para ilustrar adicionalmente la morfología de los embriones somáticos de formación rápida, se muestrearon embriones cigóticos con embriones somáticos nacientes sobresalientes a los 2, 4, 6 y 7 días después del inicio de la infección con Agrobacterium, y se fijaron en glutaraldehído de calidad EM al 2,5 % en tampón fosfato 100 mM (pH 7,0) a temperatura ambiente con rotación a 100 rpm durante 4 horas. Después de lavar con tampón fosfato 100 mM (pH 7,0) tres veces durante 15 minutos cada una, las muestras se deshidrataron por etapas; 1-2 horas en EtOH al 70 %, 1-2 horas en EtOH al 80 %, 1 -2 horas en EtOH al 95 %, 1 -2 horas en EtOH al 100 % y 2 horas en EtOH al 100 %. El tejido entonces se infiltró con metacrilato de glicol Technovit 7100 activado siguiendo la recomendación del fabricante, durante 2 horas, y de nuevo con Technovit 7100 activado renovado durante una noche. Las muestras de tejido infiltrado se colocaron en moldes, y el Technovit 7100 se polimerizó mediante la adición de 1 ml de Hardener II en 15 ml de Technovit 7100 activado. Los moldes se colocaron a vacío doméstico en un desecador de vacío y se dejaron polimerizar durante una noche. Se colocaron secciones semidelgadas de 2 pm sobre gotas de agua en portaobjetos de vidrio y se secaron en una placa de calentamiento a 45 °C. Las secciones se tiñeron con ácido peryódico-reactivo de Schiff (Sigma) de acuerdo con las instrucciones y después se tiñeron con contraste con Naphthol Blue Black al 0,5 % en solución de ácido acético al 7 % durante 5 minutos y se lavaron de nuevo en agua desionizada. Las secciones entonces se montaron en Permount con cubreobjetos de vidrio y se observaron.

La figura 6 a la figura 11 muestran un transcurso temporal para embriones inmaduros cigóticos HC69 en diversos días después de infección con Agrobacterium con LBA4404 con un ADN T que contenía lo siguiente: RB- AXIG1 PRO::ZM-WUS2::IN2-1 TERM ZM-PLTP PRO::ODP2::PINII TERM-LB. Una de las primeras indicaciones de estimulación de crecimiento localizado fue la observación de divisiones anticlinales en células sobre la superficie del escutelo infectado (figura 6), que fue la primeras alteración visible en esta capa superficial que normalmente se expande mediante divisiones periclinales que acompañan al crecimiento del embrión. Las divisiones celulares localizadas continuadas produjeron grupos pequeños de células que empezaban a sobresalir desde la superficie del embrión cigótico (figura 6), y este crecimiento produjo rápidamente embriones cada vez más grandes globulares (figura 8) y globulares/fase de transición (figura 8), que después de solamente 4 días después de la infección contenían hasta 700-800 células por embrión somático, y mostraban la capa epidérmica lisa típica normalmente observada en proembriones, y sin conexiones vasculares con el embrión cigótico subyacente. Aunque los embriones somáticos en desarrollo se observaran en cercana proximidad (figura 10) representaban estructuras derivadas independientemente. Durante todo el crecimiento de los embriones somáticos en los primeros 6-7 días después de la infección con Agrobacterium, se observó una alta frecuencia de estructuras mitóticas (es decir células que experimentan claramente profase, metafase, anafase o citocinesis) (figura 11), que fue indicativa de la tasa de crecimiento extremadamente rápida de estos embriones somáticos.

B. Tinción para demostrar la acumulación de lípidos en los embriones somáticos en desarrollo.

Se muestrearon embriones somáticos formados directamente que se desarrollaban en la superficie escutelar de embriones cigóticos inmaduros después de transformación mediada por Agrobacterium (con un ADN T que contenía AXIG1 PRO::ZM-WUS2::IN2-1 TEr M ZM-PLTP PRO::ODP2::PINII TERM) a los 2, 4 y 7 días después de infección con Agrobacterium, se lavaron durante 5 minutos en isopropanol al 70 %, y después se tiñeron durante 20 minutos en una solución al 0,5 % de "Oil Red O" en isopropanol al 70 %, se lavaron durante 2 minutos en isopropanol y después se lavaron dos veces en agua durante 5 minutos cada una (todo a temperatura ambiente). A los dos días después de infección con Agrobacterium, había muy poca tinción lipídica presente, evidenciada por el color rojo que se forma en el tejido, en los embriones inmaduros cigóticos. A los cuatro días después de empezar la infección con Agrobacterium, eran claramente visibles numerosas estructuras globulares (embriones somáticos recién formados) creciendo desde la superficie del embrión cigótico originalmente transformado, y estos nuevos embriones somáticos se teñían claramente de rojo, lo que indica la acumulación de lípidos. A los siete días, se observó una mezcla de estructuras; algunas eran claramente embriones somáticos que seguían desarrollándose y se teñían de rojo (flechas negras en la figura 12), y algunos embriones somáticos que estaban empezando a diferenciar los meristemos y las hojas que ya habían empezado a perder la tinción roja asociada con la acumulación de lípidos (figura 12). También observado en la figura 12, el escutelo del embrión cigótico infectado con Agrobacterium original estaba casi desprovisto de lípidos en estas condiciones de cultivo.

Como alternativa, se visualizaba lípido colocando un embrión somático entre un cubreobjetos y un portaobjetos y aplicando presión hasta que se extruía una monocapa de células. Después de usar el método de tinción con Oil Red O descrito anteriormente, se observaron numerosas gotas de aceite dispersadas dentro de las células del embrión somático cuando se visualizaban en el microscopio óptico (figura 13).

Los lípidos pueden detectarse usando protocolos de tinción similares en embriones somáticos seccionados. Se muestrean embriones somáticos individuales formados directamente a los 2, 4, 8 y 12 días después de empezar la infección con Agrobacterium, y se fijan, se deshidratan, se infiltran con plástico y se seccionan como se describe anteriormente. Para la tinción de lípidos, se prepara una solución de "Oil Red O" al 0,5 % en fosfato de trietilo al 60 % (acuoso) y se filtra. Las secciones de tejido en el portaobjetos se aclaran brevemente con fosfato de trietilo al 60 %, y después se tiñen durante 10-20 minutos en "Oil Red O". Después de la tinción, las secciones se aclaran de nuevo con fosfato de trietilo durante 1 2 segundos y después se lavan con agua desionizada destilada. Las secciones entonces se tiñen con contraste con Celestine Blue al 0,5 % en sulfato de amonio férrico acuoso al 5 % durante 15 minutos y se lavan de nuevo en agua DI. Las secciones entonces se montan usando medio de montaje acuoso y se observan. En los embriones somáticos en desarrollo, los lípidos que se acumulan en el escutelo aparecen rojos, y sobre la sección completa (incluyendo el escutelo y el eje del embrión) los núcleos en cada célula se teñirán de azul.

Ejemplo 14: Transformación usando WUS2 en solitario. ODP2 en solitario o WUS/ODP2 en combinación.

Se recogieron embriones inmaduros de tres endogámicos Pioneer (PH184C, HC69 y PHH5G) y los embriones de cada endogámico se dividieron en alícuotas uniformemente para transformación con la cepa de Agrobacterium LBA4404 que contenía uno de los siguientes PHP79066 (SEQ ID NO: 27), PHP80912 (SEQ ID NO: 53) y PHP80913 (SEQ ID NO: 54; cada uno de ellos se describe en detalle en la tabla 1).

Después de transformación mediada con Agrobacterium, los tres endogámicos diferentes respondieron de manera diferente a las diferentes combinaciones transgénicas (tabla 12). Para el endogámico PH184C, se infectaron 230 embriones inmaduros para cada tratamiento, produciendo un 84, 10 y 100 % de los embriones cigóticos infectados originalmente embriones somáticos en la superficie escutelar cuando se expresaba AXIG1: :WUS2 en solitario, PLTP::ODP2 en solitario o la combinación tanto de WUS2 como de ODP2, respectivamente. Después de 7 días, todos los embriones se movieron a medio de maduración y después de germinación, produciendo 68, 8 y 52 embriones plantas T0 para los tres tratamientos respectivos (eficacias de transformación T0 de un 30 %, 3 % y 23 %, respectivamente). Para cada endogámico HC69, se usaron 80 embriones inmaduros para cada tratamiento, produciéndose eficazmente embriones somáticos y plantas T0 en los tres tratamientos, produciendo frecuencias de plantas T0 transgénicas finales (con respecto al número de embriones de partida) de un 85 %, 56 % y 68 % para AXIG1::WUS2, PLTP::ODP2 o los tratamientos combinados WUS2 ODP2, respectivamente. Finalmente, para el endogámico PHH5G, se infectaron 168 embriones inmaduros para cada uno de los tres tratamientos, con frecuencias de plantas T0 transgénicas finales (con respecto al número de embriones de partida) de un 27 %, 0 % o 48 % para AXIG1: :WUS2, PLTP: :ODP2 o los tratamientos combinados WUS2 ODP2, respectivamente. Estos datos demostraron que, aunque los endogámicos mostraban diferentes respuestas a WUS en solitario, ODP2 en solitario o la combinación, la expresión de los factores de transcripción individuales fueron eficaces en producir embriones somáticos transgénicos y plantas T0.

Tabla 12. Respuesta de transformación en tres endogámicos después de suministro de WUS2 en solitario, ODP2 en solitario o la combinación de WUS2 con ODP2

Ejemplo 15: Transferencia mejorada de plántulas producidas de embriones somáticos individuales al invernadero.

Se infectaron embriones inmaduros (9-11 DAP) de tres genotipos (HC69, PHH5G y PH184C) con PHP79066. Los embriones se transfirieron a medio de cocultivo (7101) durante 1-3 días, medio de reposo 605G (medio 605J 2 mg/l de meropenem) durante 7 días, y después a medio de maduración 13329 (289O 0,1 mg/l de imazapyr). Después de 3-4 semanas en medio de maduración, se transfirieron brotes individuales fuertes a lechos EXcel (40/80) (International Horticulture Technologies, LLC, 2410 Airline Hwy, Hollister, CA, 95023) y se pulverizaron con Moisturin (WellPlant, Inc., 940 Spice Islands Drive, Sparks, NV, 89431). Los brotes se cultivaron bajo luces LED Valoya (Valoya Oy Lauttasaarentie 54A, 00200 Helsinki, Finlandia) Ns 2 de serie R (220-305 gmol/m2/s) a 27 °C durante 2-3 semanas. Los lechos se regaron con sales 6 N y vitaminas más 0,1 mg/l de imazapyr cada 2-3 días según lo necesario. Después del establecimiento de las raíces, los lechos se transfirieron al invernadero de recepción de T0 y se hicieron crecer durante dos semanas adicionales. A la conclusión de este periodo, se recogieron datos de supervivencia para cada uno de los genotipos y se dan a continuación en la tabla 13.

T l 1 . rviv n i m r l n T r n f ri l inv rn r .

Ejemplo 16: Resultados sobre el uso de promotor PLTP de sorgo para producir directamente embriones somáticos en maíz.

El promotor PLTP de Sorghum bicolor (SB-PLTP PRO) se proporciona como SEQ ID NO:2. Se transformaron embriones inmaduros del endogámico Pioneer PH184C o PHH5G con la cepa de Agrobacterium LBA4404 que portaba el plásmido RV012608 que contenía un ADN T (SEQ ID NO:95), RB ZM-AXIG1 PRO::ZM-WUS2::IN2-1 TERM SB-PLTP1 PRO::ZM-ODP2:: OS-T28 TERM GZ-W64A TERM UBI PRO:UBI1ZM INTRÓN:ESR::SB-SAG12 TERM SB-ALS PRO::HRA::SB-PEPC1 TERM UBI PRO::ZS-VERDE1 ::PINII TERM:SB-ACTINA TERM-LB. Se formaron muchos embriones somáticos diferenciados en la superficie de los embriones cigóticos endogámicos después de 4-6 días en cultivo. Estos embriones somáticos tempranos eran claramente distintos entre sí (es decir, con tejido no transgénico intermedio entre los embriones somáticos en formación) y se confirmó que eran transgénicos, basándose en la expresión de la proteína de fluorescencia verde. Cuando estos embriones se transferían a medio de maduración con 0,1 mg/l de imazapyr, los embriones seguían desarrollándose, y cuando se transferían a medio de germinación, se producían tanto brotes como alargamiento de las raíces.

Ejemplo 17: Resultados usando homólogos de ODP2 de maíz, homólogos de WUS2 y promotores PLTP de fuentes de genes homólogos para producir embriones somáticos en maíz.

Se muestra una lista de parálogos de WUS/WOX (genes y proteínas codificadas de miembros de la familia) y miembros de la familia ODP2/BBM y sus correspondientes números de identificación de secuencia en la tabla 14 a continuación.

Tabla 14. Secuencias WUS/WOX ODP2/BBM

Para estos estudios descritos en las secciones A, B y C a continuación, se utilizó una configuración de un solo ADN T (SEQ ID NO: 104), partiendo del siguiente control positivo: RB ZM-AXIG1 PRO::ZM-WUS2::IN2-1 TERM ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2:: OS-T28 TERM GZ-W64A TERM UBI PRO:UBI1ZM INTRÓN:ESR::SB-SAG12 TERM SB-ALS PRO:: HRA::SB-PEPC1 TERM UBI PRO::ZS-VERDE1 ::PINII TERM:SB-ACTINA TERM-LB. Dentro del contexto de este ADN T, todos los componentes del ADN T permanecieron igual excepto por tres variables descritas a continuación. En la primera variable, ZM-WUS2 (en el plásmido de control) se remplazó por ZM-WOX2A, ZM-WOX4, ZM-WOX5A o WUS1 de sorgo (SB). En la segunda variable, ZM-PLTP PRO (del tratamiento de control) se remplazó por promotores de dos parálogos de maíz (ZM-PLTP1 y ZM-PLTP2) o de tres ortólogos de Poaceae (Sorghum bicolor SB-PLTP1, Setaria italica SI-PLTP1 u Oryza sativa OS-PLTP1). Cuando se introdujo el ADN T de control (todos los componentes de maíz como se muestran anteriormente) en el escutelo de endogámicos Pioneer PH1V5T, PH1V69 y PHH5G, aproximadamente la mitad del área superficial escutelar se cubría por embriones somáticos recién desarrollados después de 7 días. Esta respuesta se puntuó como "2". En el extremo superior del espectro de respuesta, el escutelo estaba completamente cubierto por un césped de embriones somáticos en desarrollo individuales 4-7 días después de la infección. A esta respuesta se le da una puntuación relativa de "4" y todos los demás tratamientos se clasificaron de "0" (sin respuesta) a "4" (la producción más prolífica de embriones somáticos). Cuando no se introducían casetes de expresión WUS2 u ODP2, por ejemplo en PHP24600, SEQ ID NO:69), PH1V5T producía un nivel bajo de embriones somáticos (puntuación de 1), mientras que tanto PH1V69 como PHH5G no producían respuesta (puntuación de 0).

A. Sustitución de miembros de la familia ZM-WOX o WUS1 de sorgo en el lugar de ZM-WUS2 producía grados variables de embriones somáticos formados rápidamente.

En este experimento, un plásmido de control positivo, que contenía ZM-AXIG1 PRO::ZM-WUS2 ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2 en el ADN T (SEQ ID NO: 104) producía una respuesta intermedia (puntuación de 2) en endogámicos PH1V5T y PHH5G, mientras producía una puntuación menor de "1" en endogámico PH1V69. En comparación, cuando se sustituían tres miembros de la familia WOX de maíz en el lugar de ZM-WUS2, se observaba una serie de respuestas de embriogénesis somática (tabla 15), que variaban desde una mayor respuesta de embrión somático de ZM-WOX2A, una respuesta baja a ausente para ZM-WOX4 y una respuesta baja para WOX5 (secuencias de ADN T proporcionadas en SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101 y SEQ ID NO:102, respectivamente). Aunque WOX5 y WOX4 producían menos embriones somáticos en la superficie del embrión inmaduro transformado, aún había una respuesta positiva para los tres endogámicos con WOX5 y un subconjunto de endogámicos para WOX4. Para tratamientos que producían una respuesta de bajo nivel, el endogámico PH1V5T era difícil de interpretar porque mostraba niveles bajos de crecimiento en ausencia de casetes de expresión WUS2 y ODP2. Sin embargo, para dichos tratamientos, los otros dos endogámicos llegaron a ser muchos más informativos porque no mostraban crecimiento de fondo y una respuesta de nivel bajo (1) era inequívoca.

T l 1 . R r n f rm i n n mi if r n h m l W

ZM-WUS1 y ZM-WUS3 también se compararon con ZM-WUS2 para la estimulación de respuestas de crecimiento rápido después de transformación. En este experimento, un plásmido que contenía UBI::GFP::PINII TERM se cobombardeó usando un protocolo convencional de bombardeo de partículas para maíz (véase Svitachev et al., 2015, Plant Physiology 169:931-945) en relaciones equimolares junto con un plásmido que contenía UBI PRO::WUS1::PINII TERM, UBI PRO::WUS2::PINII TERM o UBI PRO::WUS3::PINII TERM. Se observaron los embriones en un microscopio de epifluorescencia Leica Mzfl III con un filtro GFP. Después de 7 días, la superficie del escutelo que se bombardeó estaba cubierta con estructuras multicelulares de crecimiento rápido con fluorescencia GFP en el centro. Para los tres parálogos de WUS3, la tasa de crecimiento fue rápida, la respuesta fue amplia a través de la superficie del escutelo bombardeado, y no podían discernirse diferencias entre los tres parálogos de WUS. Basándose en esta observación, se esperaría que ZM-WUS1 y ZM-WUS3 produjeran un grado de embriogénesis somática rápida similar a ZM-WUS2 cuando se coloque detrás del promotor AXIG1 y se combine en un ADN T con ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2 para transformación en embriones inmaduros de maíz.

Un tratamiento final en este experimento fue sustituir WUS1 de sorgo (SB) (secuencia de ADN T proporcionada como SEQ ID NO:103) en el lugar de WUS2 de maíz. Este tratamiento produjo la respuesta más rápida y prolífica de embriones somáticos de cualquier tratamiento, estando aproximadamente un 80 % de los embriones infectados completamente cubiertos con embriones somáticos.

B. La sustitución de promotores PLTP de parálogos de maíz o tres ortólogos de Poaceae diferentes produjo grados variables de embriogénesis somática rápida.

Usar diversos promotores "homólogos" produjo un intervalo de embriogénesis somática rápida en tres endogámicos Pioneer diferentes (tabla 16) con respecto al tratamiento de control (ZM-PLTP PRO), en que el control produjo puntuaciones entre 1 y 2.

T l 1 . R r n f rm i n n mi if r n h m l r m r PLTP

En este experimento, el promotor ZM-PLTP1 produjo las puntuaciones más altas de embriogénesis somática a los siete días después de la infección, que variaron de 3 (aproximadamente un 75 % cubierto con embriones somáticos en PH1V5T) a 4 (totalmente cubierto como en PH1V69 y PHH5G). ZM-PLTP2 también produjo resultados mejores que el control, con una puntuación uniforme de 3 entre los tres endogámicos. Para promotores PLTP1 de otros miembros de Poaceae, los promotores de sorgo y arroz produjeron una respuesta de nivel intermedio (2) en dos endogámicos y una baja respuesta (1) en endogámico, mientras que el promotor de Setaria provocó una respuesta de nivel bajo en dos endogámicos y una respuesta de nivel intermedio en un endogámico. Todos los promotores PLTP ensayados produjeron estimulación positiva de embriogénesis somática después de siete días.

C. ZM PLTP PRO::ZM-LEC1 en combinación con AXIG1::WUS2 o PLTP::ODP2 provocó producción rápida de embriones somáticos.

En experimentos previos se demostró que UBI PRO::ZM-LEC1 estimulaba frecuencias de transformación en el híbrido de maíz transformable Hi-II (véase, Lowe etal., 2007, documento US7.268.271).

En este experimento ZM-PLTP::ZM-LEC1 se sustituyó por AXIG1 ::WUS2 o PLTP::ODP2 en un vector de control para evaluar el impacto sobre la embriogénesis somática rápida en tres endogámicos. Las condiciones para infección con Agrobacterium, histocultivo y puntuación para embriogénesis en siete días fueron las mismas que las descritas en ejemplos anteriores. Aunque las dos nuevas combinaciones produjeron puntuaciones mayores que el control, como puede observarse en la tabla 17, AXIG1 ::WUS2 PLTP::LEC1 produjo la respuesta más fuerte de embriones somáticos entre los tres endogámicos. Por tanto, PLTP::LEC1 en combinación con casetes de expresión WUS2 o ODP2 fue eficaz en estimular la formación rápida de embriones somáticos.

Tabla 17. Respuesta de transformación de endo ámicos a diferentes combinaciones con LEC1

D. El uso de WUS y ODP2 de arroz en combinación o WUS y ODP2 de Setaria en combinación produjo formación de embriones somáticos después de transformación de embriones inmaduros de maíz.

Partiendo de una construcción de maíz que contenía NOS PRO::ZM-WUS2::IN2 UBI PRO::ZM-ODP2::PINII UBI PRO::ZS-VERDE::PINII, se sintetizaron ortólogos para WUS2 y ODP2 identificados en Oryza sativa y Setaria italica y se sustituyeron en el lugar de los genes de maíz en la construcción anterior. Los embriones inmaduros del endogámico PHH5G y PH184C se transformaron usando la cepa de Agrobacterium LBA4404 que contenía PHP80911 (WUS2 y ODP2 de maíz), PHP79530 (genes de arroz) o PHP79531 (genes de panizo). Después de 14 días en medio de cultivo, los embriones inmaduros se examinaron bajo el microscopio de disección y el estereomicroscopio de epifluorescencia y se puntuaron usando la escala de embriogénesis somática (0-4), descrita previamente. Para el endogámico PH184C, las puntuaciones de embriones somáticos 14 días después de infección con Agrobacterium fueron 2, 2 y 1 (para los pares de genes de maíz, mijo y arroz, respectivamente). Para el endogámico PHH5G, las puntuaciones de embriones somáticos 14 días después de infección con Agrobacterium fueron 3, 3 y 2 (para los pares de genes de maíz, mijo y arroz, respectivamente). Estos embriones inmaduros se expusieron a la expresión de WUS2 y ODP2 durante dos veces la cantidad de tiempo que lo hacía el material en las secciones 5A, 5B y 5C anteriores, que provocaba una puntuación de embriogénesis somática mayor que si los datos se hubieran recogido a los 7 días. Las combinaciones de los genes WUS y ODP2 equivalentes de cada especie estimularon la formación de embriones somáticos. En ausencia de WUS2 o ODP2, no se observó formación de embriones somáticos en PHH5G.

En Poaceae, el maíz y el arroz están en extremos opuestos de la filogenia con mijo en el centro. Basándose en los resultados con las secuencias divergentes descritas anteriormente para WUS, ODP2 y PLTP, este trabajo demostró que combinaciones de miembros entre las gramíneas pueden usarse de manera eficaz para estimular rápidamente la embriogénesis somática después de transformación.

Ejemplo 18. Uso del promotor LTP3 de soja para controlar la expresión de WUS para mejorar la transformación de soja.

Para identificar nuevos promotores que pudieran mejorar los métodos de transformación usando el gen WUS de Arabidopsis, se revisó el uso de este gen. Se expresaron altos nivel de expresión para WUS de Arabidopsis (por ejemplo, usando el EF1A PRO de soja), inmediatamente después de la transformación mediada por Agrobacterium y durante todo el crecimiento del callo aumentaron las tasas de formación de acontecimientos. Sin embargo, que siguiera expresándose este factor de transcripción a este nivel impidió la regeneración de acontecimientos. Posibles soluciones serían escindir este gen antes de la regeneración de las plántulas y restringir la expresión ectópica de WUS de Arabidopsis en embriones somáticos en diferenciación y maduración. Basándose en esto, se buscaron nuevos promotores que se expresaran en células cultivadas, embriones y semillas inmaduras en desarrollo, con expresión nula o mucho menor en otros tejidos vegetales. El promotor LTP3 de soja cumplió estos criterios, un gen de fosfolípido transferasa de soja previamente inidentificado. Como se muestra en la figura 14 y la figura 15, cuando se compara con la expresión constitutiva del EF1A PRO (figura 14), la expresión de LTP3 (figura 15) fue i) fuerte en semillas inmaduras en desarrollo y ii) débil o nula en otras muestras y partes de una planta, mientras que la expresión de EF1A se observó en todos los tejidos.

La cepa de Agrobacterium AGL1, que contiene un ADN T con los casetes de expresión GM-LTP3 PRO::AT-WUS::UBI14 TERM GM-UBQ PRO::TAGRFP::UBQ3 TERM, se usó para transformar la variedad de soja Pioneer PHY21. Cuatro días después de que se iniciara la infección con Agrobacterium, el tejido se lavó con medio de cultivo estéril para retirar el exceso de bacterias. Nueve días después, el tejido se movió a medio de maduración de embriones somáticos, y 22 días después, los embriones somáticos transgénicos estaba listos para secado. En este punto, los embriones somáticos maduros bien formados emitían fluorescencia roja en un estereomicroscopio de epifluorescencia con un conjunto de filtro RFP. Los embriones somáticos que se desarrollaron eran funcionales y germinaron para producir plantas saludables en el invernadero. Este método rápido de producción de embriones somáticos y germinación para formar plantas redujo el periodo típico desde la infección con Agrobacterium hasta mover las plantas T0 transgénicas al invernadero de cuatro meses (para transformación convencional de soja) a dos meses.

Como se muestra en el diagrama de representación de recuadros en la figura 16 que presenta la distribución de respuestas de embriogénesis somática de explantes de cotiledón inmaduro 2 semanas después de infección con Agrobacterium, el uso del promotor LTP3 para dirigir la expresión de At-WUS provocó una mejora sustancial en la embriogénesis somática (en comparación con otros promotores ensayados, véase la figura 16) o con respecto al control negativo sin casete de expresión de WUS (véase la figura 16).

El aumento en la respuesta de embriones somáticos entre la población de cotiledones inmaduros infectados también estuvo acompañado por el rápido desarrollo de embriones somáticos, que se observó tanto en microcopia óptica para evaluar la morfología (figura 17A) como de epifluorescencia para observar fluorescencia roja (figura 17B). Muestra embriones somáticos de soja transgénicos maduros que estaban listos para desecación y, después de ello, germinación solamente 5 semanas después de infección con Agrobacterium. Cuando se transformaban cotiledones inmaduros sin LTP3::At-WUS (tratamiento de control) los embriones somáticos maduros no solamente se producían a una frecuencia enormemente reducida (véase la figura 16), sino que la duración desde la infección con Agrobacterium hasta una fase comparable de madurez de los embriones somáticos requería nueve semanas de cultivo.

Ejemplo 19. Marcador de selección activado por escisión HRA para aumentar la recuperación de plantas T0 en que los casetes de expresión WUS2, ODP2 y CRE se escindían y el gen de rasgo restante era de una sola copia.

Para construir un vector con expresión de HRA activada por escisión, el gen HRA se interrumpió mediante el intrón ST-LS1 que contenía un solo sitio diana loxP en el centro del intrón, y se ensayó para demostrar que el intrón que contenía loxP funcionaba apropiadamente. Dos mitades del casete de expresión de HRA (dividido en el sitio loxP) se movieron a extremos opuestos del ADN T teniendo cada mitad su propio sitio loxP interno, que estaba más cerca del centro del ADN T que las mitades de HRA. Dentro de los dos sitios loxP estaban los casetes de expresión AXIG1 PRO::WUS2::IN2 TERM, PLTP PRO::ODP2::OS-T28 TERM, ZM-GLB1 PRO::CRE::pinII y SB-UBI PRO::ZS-VERDE::OS-UBI TERM (véase PHP81814 en la tabla 1 y SEQ ID NO:80).

Esta construcción produjo una alta frecuencia de formación rápida de embriones somáticos con escisión de los casetes WUS/ODP2/CRE/ZS-VERDE combinados para activar la expresión de HRA, y recuperación de plantas T0 de una sola copia. En un conjunto de experimentos, se usó un total combinado de 2332 embriones inmaduros (del endogámico PHH5G) para transformación mediante la cepa de Agrobacterium LBA4404 THY- que porta PHP81814. De los embriones totales infectados, se recuperó un total de 604 plantas T0, y de estas 604 plantas T0 un total de 215 ya no contenían los casetes de expresión WUS2, ODP2, CRE y SZ-VERDE (escindidos totalmente). Se produjo una recuperación global de acontecimientos de calidad de un 9,2 % (número de acontecimientos perfectos con respecto al número de embriones de partida).

En un conjunto separado de tres experimentos con endogámico HC69, 741 embriones inmaduros se transformaron con Agrobacterium que contenía PHP81814, y produjo 315 plantas T0 en el invernadero, de las que 30 eran de una sola copia para HRA con todos los demás genes escindidos para una frecuencia de acontecimientos de calidad de un 4 %.

Ejemplo 20. Uso de promotores con patrones de expresión específicos de embrión para dirigir la expresión de WUS2 y/u ODP2 para mejorar la transformación de maíz.

Para estos experimentos, se usa una configuración de un solo ADN T, partiendo de la siguientes configuración usada como control positivo: RB ZM-AXIG1 PRO::ZM-WUS2::IN2-1 TERM ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2::OS-T28 TERM GZ-W64A TERM UBI PRO:UBI1ZM INTRÓN:ESR::SB-SAG12 TERM SB-ALS PRO:: HRA::SB-PEPC1 TERM UBI PRO::ZS-VERDE1::PINII TERM:SB-ACTINA TERM-LB. El control positivo se compara con plásmidos con promotores específicos de embrión que dirigen la expresión de WUS2 y ODP2. El plásmido PHP24600 se usa como control negativo (sin expresión de transgenes WUS2 y ODP2) para proporcionar una medida inicial menor para comparaciones.

Cuando se usa ZM-SRD PRO, ZM-LGL PRO, ZM-LEA14-A PRO o promotores ZM-LEA-D-34 (SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82 y SEQ ID NO:83, respectivamente) para remplazar ZM-AXIG1 PRO que dirige la expresión de WUS2 en esta construcción, se espera que las frecuencias de transformación aumentadas y la estimulación de embriogénesis somática rápida sean similares a las observadas con el vector de control positivo, siendo ambas sustancialmente mayores que el tratamiento de control negativo (PHP24600). Asimismo, cuando se usa ZM-SRD PRO, ZM-LGL PRO, ZM-LEA14-A PRO o los promotores ZM-LEA-D-34 para remplazar ZM-PLTP PRO que dirige la expresión de ODP2 en esta construcción, se espera de nuevo que las frecuencias de transformación aumentadas y la estimulación de embriogénesis somática rápida sean similares a las observadas con el vector de control positivo, siendo ambas sustancialmente mayores que el tratamiento de control negativo (PHP24600).

Ejemplo 21. Identificación de secuencias

Se hace referencia a diversas secuencias en la divulgación. Los identificadores de secuencia se encuentran a continuación en la tabla 18.

Tabla 18.

Como se usa en este documento, las formas singulares "uno", "una", y "el", "la" incluyen referentes plurales salvo que el contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, una referencia a "una célula" incluye una pluralidad de dichas células y una referencia a "la proteína" incluye referencias a una o más proteínas y equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la materia, y así sucesivamente. Todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el normalmente entendido por un experto en la materia a la que pertenece esta divulgación salvo que se indique claramente lo contrario.

Todas las patentes, publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas del nivel de especialización de los expertos en la materia a la que pertenece esta divulgación.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir una planta transgénica, que comprende:

(A)

(i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX;

(ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; o

(iii) una combinación de (i) y (ii);

(b) permitir la expresión del polipéptido de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo y la estructura vegetal regenerable se forma en 1 -7 días de transformación de la célula o en 1-14 días de transformación de la célula; y

(B)

(i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido WUS2;

(ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido ODP2; o

(iii) una combinación de las mismas;

(b) permitir la expresión de un polipéptido de (a) en cada célula transformada para formar una estructura vegetal regenerable en ausencia de citocinina exógena, en la que no se forma callo; y

(c) germinar la estructura vegetal regenerable para formar la planta transgénica;

2. El método de la reivindicación 1, en el que:

(I) el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID n O: 4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16; o en el que el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX está codificado por la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15; y en el que el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65 o 67; o en el que el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 está codificado por la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 17, 19, 21,62, 64, 66 o 68; o (II) la planta transgénica se forma en 14 días a 60 días.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que la construcción de expresión comprende tanto la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX como la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la construcción de expresión comprende:

(i) la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX; o

(ii) la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2; y/o en el que la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX y/o la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que comprende dos dominios de unión a AP2 se produce en menos de 1 día, menos de 2 días, menos de 5 días, menos de 7 días o menos de 14 días después del inicio de la transformación;

y/o en el que la construcción de expresión comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio; preferiblemente en el que la recombinasa específica de sitio se selecciona de FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxb1, TP907-1 o U153;

y/o en el que la recombinasa específica de sitio es un polipéptido de fusión desestabilizado; preferiblemente en el que el polipéptido de fusión desestabilizado es TEt R(L17G)~CRE o ESR(L17G)~CRE;

y/o en el que la secuencia de nucleótidos que codifica una recombinasa específica de sitio está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, en el que:

(i) la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo; o

(ii) la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende dos dominios de unión a ADN-AP2 está unida de forma funcional a un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo.

6. El método de la reivindicación 4 o 5, en el que:

(A) el promotor constitutivo se selecciona de UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1.2 KB), IN2-2, NOS, la versión -135 de 35S o ZM-ADF PRO (AlT2);

(B) el promotor inducible se selecciona de AXIG1, DR5, XVE, GLB1, OLE, LTP2, HSP17,7, HSP26, HSP18A o promotores activados por tetraciclina, etametsulfurón o clorsulfurón; preferiblemente en el que:

(I) el promotor inducible es un promotor inducible químicamente; más preferiblemente en el que el promotor inducible químicamente es XVE;

y/o en el que el promotor inducible químicamente se reprime por TETR, ESR o CR, y la desrepresión se produce tras la adición de ligandos relacionados con tetraciclina o de sulfonilurea; más preferiblemente en el que el represor:

(i) es TETR y el ligando relacionado con tetraciclina es doxiciclina o anhidrotetraciclina; o

(ii) es ESR y el ligando de sulfonilurea es etametsulfurón, clorsulfurón, metsulfurón-metilo, sulfometurón-metilo, clorimurón-etilo, nicosulfurón, primisulfurón, tribenurón, sulfosulfurón, trifloxisulfurón, foramsulfurón, yodosulfurón, prosulfurón, tifensulfurón, rimsulfurón, mesosulfurón o halosulfurón;

(II) el promotor inducible es un promotor inducible por auxina; preferiblemente en el que el promotor inducible por auxina es uno AXIG1; más preferiblemente en el que el promotor AXIG1 comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 39; o

(III) el promotor inducible comprende un elemento de respuesta a auxina; o

(C) el promotor regulado por el desarrollo se selecciona de PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, LGL, LEA-14A o LEA-D34.

7. El método de la reivindicación 5 o 6, en el que el promotor inducible contiene uno o más motivos potenciadores de DR5.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que:

(A) el promotor es un promotor constitutivo débil modificado para represión y desrepresión; preferiblemente en el que:

(i) una o más secuencias operadoras en el promotor se han colocado cerca de o solapando con la secuencia TATA y/o el sitio de inicio de la transcripción; o

(ii) el promotor se selecciona de NOS, AXIG1, ZM-GOS2, CC-UBI1-PRO o ZM-ADF4-PRO;

(B) el promotor inducible es el promotor DR5 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 40; o (C) el promotor es un promotor desreprimible; preferiblemente en el que el promotor desreprimible es TETR, ESR o CR.

9. El método de la reivindicación 5 o 6, en el que el promotor regulado por el desarrollo se selecciona de PLTP, PLTP1, PLTP2 o PLTP3; preferiblemente en el que el promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 o PLTP3:

(A) deriva de:

(i) una monocotiledónea; más preferiblemente en el que la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo; o

(ii) una dicotiledónea; más preferiblemente en el que la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón; o

(B) comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1-2 o 55-61; más preferiblemente en el que el promotor PLTP comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1 o 2.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX se selecciona de polipéptido WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 o WOX9; y/o en el que:

(A) la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es:

(i) un nucleótido de monocotiledónea; preferiblemente en el que la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo; o

(ii) un nucleótido de dicotiledónea; preferiblemente en el que la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón;

(B) la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX:

(i) codifica una secuencia de aminoácidos que comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16; o

(ii) comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15;

(C) el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS1; preferiblemente en el que el polipéptido WUS1:

(i) es un polipéptido WUS1 de maíz, sorgo, arroz o Setaria sp.;

(ii) comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; o

(iii) está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 3;

(D) el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS2; preferiblemente en el que el polipéptido WUS2:

(i) es un polipéptido WUS2 de maíz, sorgo, arroz o Setaria sp.;

(ii) comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; o

(iii) está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 5;

(E) el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WUS3; preferiblemente en el que el polipéptido WUS3:

(i) es un polipéptido WUS3 de maíz, sorgo, arroz o Setaria;

(ii) comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; o

(iii) está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 7;

(F) el polipéptido de homeosecuencia WUS/WOX es un polipéptido WOX5; preferiblemente en el que el polipéptido WOX5 es un polipéptido WOX5A; y/o en el que el polipéptido WOX5:

(i) es un polipéptido WOX5 de maíz, sorgo, arroz o Setaria;

(ii) comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; o

(iii) está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 13.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -9, en el que el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2:

(I) es un polipéptido ODP2, BBM2, BMN2 o BMN3;

y/o en el que el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2 es:

(i) un polipéptido de monocotiledónea; preferiblemente en el que la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo; o

(ii) es un polipéptido de dicotiledónea; preferiblemente en el que la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón;

(II) comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65 o 67;

(III) está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 17, 19, 21, 62, 64, 66 o 68; o

(IV) es:

(A) un polipéptido ODP2; preferiblemente en el que el polipéptido ODP2:

(i) es un polipéptido de monocotiledónea; más preferiblemente en el que la monocotiledónea es cebada, maíz, mijo, avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, caña de azúcar, pasto varilla, triticale, césped o trigo;

(ii) es un polipéptido de dicotiledónea; más preferiblemente en el que la dicotiledónea es col rizada, coliflor, brécol, mostaza, col, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, mandioca, soja, colza, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón;

(iii) comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 63, 65 o 67; o

(iv) está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 17, 21,62, 64, 66 o 68; o

(B) un polipéptido BBM2; preferiblemente en el que el polipéptido BBM2:

(iii) comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; o

(iv) está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 19.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que la planta transgénica se forma en 14 días de transformación de la célula a 60 días de transformación de la célula;

y/o en el que el método se realiza:

(i) en ausencia de medio de enraizamiento; o

(ii) en presencia de medio de enraizamiento;

y/o en el que el embrión inmaduro es:

(i) un embrión inmaduro de 1-5 mm; o

(ii) un embrión inmaduro de 3,5-5 mm;

y/o en el que se usa citocinina exógena durante la germinación después de 7 días de transformación de la célula o después de 14 días de transformación de la célula.

13. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que la expresión de un polipéptido de (a) es transitoria.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que la germinación se realiza en presencia de citocinina exógena.