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ES2880010T3 - Composiciones y métodos para tratar el cáncer con inmunoterapia antimesotelina - Google Patents

Composiciones y métodos para tratar el cáncer con inmunoterapia antimesotelina Download PDF

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ES2880010T3
ES2880010T3 ES18713034T ES18713034T ES2880010T3 ES 2880010 T3 ES2880010 T3 ES 2880010T3 ES 18713034 T ES18713034 T ES 18713034T ES 18713034 T ES18713034 T ES 18713034T ES 2880010 T3 ES2880010 T3 ES 2880010T3
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car
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cancer
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Rimas Orentas
Dina Schneider
Boro Dropulic
Dimiter Dimitrov
Zhongyu Zhu
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US Department of Health and Human Services
Original Assignee
Lentigen Technology Inc
US Department of Health and Human Services
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Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un receptor quimérico de antígeno (CAR) que comprende al menos un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende un dominio de unión al antígeno mesotelina codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 3, 5 o 7, al menos un dominio transmembranario y al menos un dominio de señalización intracelular.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para tratar el cáncer con inmunoterapia antimesotelina
Declaración con respecto a investigación o desarrollo financiado federalmente
Esta invención se creó en el desempeño de un acuerdo cooperativo de investigación y desarrollo con los National Institutes of Health, una agencia del departamento de salud y servicios humanos. El gobierno de los Estados Unidos tiene determinados derechos en esta invención.
Campo de la divulgación
Esta solicitud se refiere al campo del cáncer, particularmente a dominios de unión al antígeno mesotelina y receptores quiméricos de antígeno (CAR) que contienen dichos dominios de unión a antígeno mesotelina y métodos de uso de los mismos.
Antecedentes
El cáncer es una de las amenazas más mortales para la salud humana. Solo en los Estados Unidos, el cáncer afecta a casi 1,3 millones de nuevos pacientes cada año y es la segunda causa principal de muerte después de enfermedad cardiovascular, representando aproximadamente 1 de cada 4 muertes. Los tumores sólidos son responsables de la mayoría de esas muertes. Aunque ha habido avances importantes en el tratamiento médico de determinados canceres, la tasa de supervivencia global de 5 años para todos los cánceres ha mejorado únicamente en aproximadamente un 10 % en los últimos 20 años. Los cánceres, o tumores malignos, metastatizan y crecen rápidamente de manera incontrolada, haciendo que el tratamiento sea extremadamente difícil.
La mesotelina es una glucoproteína de membrana ligada a glucosilfosfatidil inositol de 40 kD cuya expresión en individuos normales está restringida a la pleura de revestimiento de células mesoteliales, el peritoneo y el pericardio. Por el contrario, la mesotelina se sobreexpresa por varios tumores sólidos, incluyendo mesotelio maligno, adenocarcinoma de ovario, estómago, pulmón y pancreático, así como carcinoma de las vías biliares y cáncer de mama triple negativo (Ordonez NG, Am J Surg Pathol 1993;27:1418-28., Hassan R, Laszik ZG, Lerner M, Raffeld M, Postier R, Brackett D. Am J Clin Pathol 2005; 124:838-45; Chou J, et al., Breast Cancer Res Treat 2012; 133: 799­ 804). La función biológica de la mesotelina aún no está clara; sin embargo, la mesotelina se une a CA125, una glucoproteína plasmática en células tumorales, lo que sugiere que la mesotelina puede contribuir a la metástasis peritoneal y pleural (Kaneko, et al., 2009, J Biol Chem 284: 3739-3749; Rump, et al., 2004, J Biol Chem 279: 9190­ 9198). La expresión de la mesotelina está asociada con quimiorresistencia, supervivencia sin enfermedad más corta y supervivencia global peor de pacientes con cáncer de ovario epitelial (EOC) (Cheng, et al., 2009, Br J Cancer 100: 1144-1153). Por consiguiente, la mesotelina representa una diana atractiva para inmunoterapias. Basándose en la frecuencia de expresión tumoral, las dianas principales de tratamiento antimesotelina son mesoteliomas y adenocarcinomas pancreáticos (cerca de un 100 % de los tumores expresan antígeno), seguido por cáncer de ovario (un 67-100 % de tumores expresan antígeno) y adenocarcinomas pulmonares (un 41-53 % son positivos a mesotelina), revisado en Raffit Hassan, Mitchell Ho. Eur J Cancer. Enero de 2008; 44(1): 46-53. El primer anticuerpo terapéutico contra el cáncer dirigido a mesotelina, K1, se obtuvo de un hibridoma de ratón [Chang K, Pastan I, Willingham MC. Int J Cancer 1992; 50: 373-81.]. Posteriormente, se desarrolló un anticuerpo antimesotelina de mayor afinidad denominado SS1 por presentación en fagos y mutagénesis de punto caliente [Chowdhury PS, Viner JL, Beers R, Pastan I. Proc Natl Acad Sci U S A 1998;95:669-74; Chowdhury PS, Pastan I, Nat Biotech 1999; 17:568-72].
Los receptores quiméricos de antígeno (CAR) son moléculas híbridas que comprenden tres unidades esenciales: (1) un motivo de unión a antígeno extracelular, (2) motivos de unión/transmembranarios y (3) motivos de señalización intracelular de linfocitos T (Long AH, Haso WM, Orentas RJ. Lessons learned from a highly-active CD22-specific chimeric antigen receptor. Oncoimmunology. 2013; 2 (4):e23621). El motivo de unión a antígeno de un CAR se forma normalmente después de un fragmento monocatenario variable (scFv), el dominio de unión mínimo de una molécula de inmunoglobulina (Ig). También se han manipulado motivos de unión a antígeno alternativos, tales como ligandos de receptor (es decir, IL-13 se ha manipulado para que se una a receptor de IL-13 expresado en tumor), receptores inmunitarios intactos, péptidos derivados de colecciones y moléculas efectoras del sistema inmunitario innato (tales como NKG2D). Dianas celulares alternativas para la expresión de CAR (tales como linfocitos T NK o gamma-delta) también están en desarrollo (Brown CE et al., Clin Cancer Res. 2012;18(8):2199-209; Lehner M et al., PLoS One.
2012; 7 (2):e31210). Queda mucho trabajo con respecto a definir la población de linfocitos T más activa para transducir con vectores CAR, determinar las técnicas óptimas de cultivo y expansión y definir los detalles moleculares de la propia estructura proteínica del CAR.
Los motivos de unión de un CAR pueden ser un dominio estructural relativamente estable, tal como el dominio constante de IgG, o diseñarse para que sean un conector flexible prolongado. Los motivos estructurales, tales como los derivados de dominios constantes de IgG, puede usarse para prolongar el dominio de unión de scFv más allá de la superficie de la membrana plasmática de linfocitos T. Esto puede ser importante para algunas dianas tumorales donde el dominio de unión está particularmente cerca de la membrana de la superficie celular del tumor (tal como el disialogangliósido GD2; Orentas et al., observaciones no publicadas). Hasta la fecha, los motivos de señalización usados en CAR siempre incluyen la cadena CD3-Z porque este motivo central es la señal clave para la activación de los linfocitos T. Los primeros CAR de segunda generación presentados reflejaban dominios de señalización de CD28 y la secuencia transmembranaria de CD28. Este motivo se usó en CAR de tercera generación que contenían motivos de señalización de CD137 (4-1BB) también (Zhao Y et al., J Immunol. 2009; 183 (9): 5563-74). Con la aparición de nueva tecnología, la activación de linfocitos T con microesferas unidas a anticuerpo antiCD3 y antiCD28, y la presencia de la "señal 2" canónica de CD28 ya no se requería que estuviera codificado por el propio CAR. Usando la activación de microesferas, se descubrió que los vectores de tercera generación no eran superiores a los vectores de segunda generación en ensayos in vitro, y no proporcionaban un beneficio claro sobre los vectores de segunda generación en modelos de ratón de leucemia (Haso W, Lee DW, Shah NN, Stetler-Stevenson M, Yuan CM, Pastan IH, Dimitrov DS, Morgan RA, FitzGerald DJ, Barrett DM, Wayne AS, Mackall CL, Orentas RJ. Anti-CD22-chimeric antigen receptors targeting B cell precursor acute lymphoblastic leukemia, Blood. 2013; 121 (7):1165-74; Kochenderfer JN et al., Blood.
2012; 119 (12):2709-20). Esto se ve apoyado por el éxito clínico de CAR específicos de CD19 que están en formato de señalización de CD28/CD3-Z (Lee DW et al., American Society of Hematology Annual Meeting. Nueva Orleans, LA; 7-10 de diciembre de 2013) y CD137/CD3-Z (Porter DL et al., N Engl J Med. 2011; 365 (8): 725-33) de segunda generación. Además de CD137, otros miembros de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral tales como OX40 también pueden proporcionar señales de persistencia importantes en linfocitos T transducidos con CAR (Yvon E et al., Clin Cancer Res. 2009;15(18):5852-60). Igual de importantes son las condiciones de cultivo en que se cultivan las poblaciones de linfocitos T CAR.
Las dificultades actuales en la adaptación más amplia y eficaz del tratamiento con CAR para el cáncer se refieren a la escasez de dianas atractivas. Crear agentes de unión a antígenos de superficie celular ahora se puede conseguir fácilmente, pero descubrir un antígeno de superficie celular que sea específico para un tumor mientras sea escaso en tejidos normales, sigue siendo una dificultad formidable. Una posible manera de imbuir mayor especificidad de célula diana para los linfocitos T que expresan CAR es usar estrategias combinatorias de CAR. En un sistema, las unidades de señalización CD3-Z y CD28 se dividen entre dos construcciones de CAR diferentes expresadas en la misma célula; en otra, se expresan dos CAR en el mismo linfocito T, pero uno tiene una menor afinidad y, por tanto, requiere el acoplamiento del CAR alternativo en primer lugar para la actividad completa del segundo (Lanitis E et al., Cancer Immunol Res. 2013;1 (1 ):43-53; Kloss CC et al., Nat Biotechnol. 2013;31(1):71-5). Una segunda dificultad para la generación de un solo CAR basado en scFv como agente inmunoterápico, es la heterogeneidad de las células tumorales. Al menos un grupo ha desarrollado una estrategia de CAR para glioblastoma por la que la población de células efectoras se dirige a múltiples antígenos (HER2, IL-13Ra, EphA2) al mismo tiempo con la esperanza de evitar la excrecencia de poblaciones negativas al antígeno diana (Hegde M et al., Mol Ther. 2013;21 (11) :2087-101).
La inmunoterapia basada en linfocitos T se ha convertido en una nueva frontera en la biología sintética; se idean múltiples promotores y productos génicos para encauzar estas células altamente potentes al microentorno tumoral, donde los linfocitos T pueden evadir las señales reguladoras negativas y mediar la destrucción eficaz del tumor. La eliminación de linfocitos T indeseados a través de la dimerización inducida por fármaco de las construcciones de caspasa 9 inducibles con AP1903 demuestra una manera en que un potente conmutador que puede controlar las poblaciones de linfocitos T puede iniciarse farmacológicamente (Di Stasi A et al., N Engl J Med. 2011 ;365(18):1673-83). La creación de poblaciones de linfocitos T efectores que sean inmunes a los efectos reguladores negativos del factor transformante factor-p por la expresión de un receptor señuelo demuestra además el grado al que pueden manipularse los linfocitos T efectores para una actividad antitumoral óptima (Foster AE et al., J Immunother.
2008;31 (5):500-5).
Por tanto, aunque parece que los CAR pueden desencadenar la activación de linfocitos T de una manera similar a un receptor de linfocitos T endógeno, un impedimento principal a la aplicación clínica de esta tecnología hasta la fecha ha sido la expansión limitada in vivo de los linfocitos T CAR+, la rápida desaparición de las células después de la infusión y la actividad clínica decepcionante. El documento WO 2015/090230 divulga CAR antimesotelina basado en scFv y uso del mismo. Aunque se han hecho varios intentos por abordar tumores positivos a mesotelina por otros grupos, incluyendo el reciente trabajo que ha mostrado que los linfocitos T humanos que portan un CAR antimesotelina humana de origen murino (denominado SS1) muestran funciones efectoras independiente de MHC in vitro e inducen la regresión de xenoinjertos de mesotelioma humano in vivo en ratones inmunodeficientes (Carpenito, et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106: 3360-3365), han llegado a ser evidentes varias dificultades para esta estrategia, incluyendo la toxicidad a las células vecinas, la ausencia de eficacia o la necesidad de suministro localizado al tumor. Por consiguiente, hay una necesidad urgente y desde hace tiempo en la técnica de descubrir composiciones y métodos para el tratamiento del cáncer usando CAR que puedan mostrar atributos terapéuticos pretendidos sin los inconvenientes mencionados anteriormente.
La presente invención aborda estas necesidades proporcionando composiciones de CAR y métodos terapéuticos que pueden usarse para tratar los cánceres y otras enfermedades y/o afecciones. En particular, la presente invención divulgada y descrita en este documento proporciona CAR que pueden usarse para el tratamiento de enfermedades, trastornos o afecciones asociadas con una expresión desregulada de mesotelina y cuyos CAR contienen dominios de unión al antígeno mesotelina que muestran una alta expresión superficial en linfocitos T transducidos, muestran un alto grado de citólisis y expansión y persistencia in vivo en linfocitos T transducidos.
Sumario
En este documento se divulgan anticuerpos antimesotelina novedosos o dominios de unión a antígeno de los mismos y receptores quiméricos de antígeno (CAR) que contienen dichos dominios de unión a antígeno mesotelina, así como células hospedadoras (por ejemplo, linfocitos T) que expresan los receptores y moléculas de ácido nucleico que codifican los receptores. Los CAR muestran una alta expresión superficial en linfocitos T transducidos, con un alto grado de citólisis y expansión y persistencia de los linfocitos T transducidos in vivo. También se divulgan métodos de uso de los CAR divulgados, células hospedadoras y moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, para tratar un cáncer en un sujeto.
Por tanto, en un aspecto, se divulga un polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo humano antimesotelina o un fragmento del mismo que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1,3, 5 y 7.
En un aspecto, se divulga un polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo completamente humano antimesotelina o un fragmento del mismo, en el que el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende un fragmento seleccionado del grupo que consiste en un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 , un fragmento Fv y un Fv monocatenario (scFv).
En un aspecto, se divulga un polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo completamente humano antimesotelina o un fragmento del mismo, en el que el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 4, 6 y 8.
En una realización, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un receptor quimérico de antígeno (CAR) que comprende, del extremo N al extremo C, al menos un dominio de unión al antígeno mesotelina codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, 5 y 7, al menos un dominio transmembranario y al menos un dominio de señalización intracelular.
En un aspecto, se divulga una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el CAR, en la que el dominio de unión al antígeno mesotelina extracelular codificado comprende al menos un fragmento variable monocatenario de un anticuerpo que se une a mesotelina.
En otro aspecto, se divulga una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el CAR, en la que el dominio de unión al antígeno mesotelina extracelular codificado comprende al menos una región variable de la cadena pesada de un anticuerpo que se une a mesotelina.
En otro aspecto más, se divulga una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el CAR, en la que el dominio de unión al antígeno mesotelina extracelular del CAR codificado comprende además al menos un antígeno de unión a antígeno basado en lipocalina (anticalinas) que se une a mesotelina.
En un aspecto, se divulga una molécula de ácido nucleico asilada en la que el dominio de unión al antígeno mesotelina extracelular codificado está conectado al dominio transmembranario mediante un dominio conector.
En otra realización de una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el CAR de la invención, el dominio de unión al antígeno extracelular mesotelina codificado está precedido por una secuencia que codifica un péptido líder o señal.
En otra realización más, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el CAR que comprende al menos un dominio de unión al antígeno mesotelina codificado por una secuencia de nucleidos que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, 5 y 7, y en la que el CAR codifica adicionalmente un dominio de unión a antígeno extracelular dirigido a un antígeno que incluye, aunque sin limitación, CD19, CD20, CD22, ROR1, mesotelina, CD33, CD38, CD123 (IL3RA), CD138, BCMA (CD269), GPC2, GPC3, FGFR4, c-Met, PSmA, glucolípido F77, eGf RvIII, GD-2, NY-ESO-1 TCR, MAGE A3 TCR o cualquier combinación de los mismos.
En determinados aspectos, se divulga una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el CAR, en la que el dominio de unión a antígeno extracelular codificado adicionalmente comprende un dominio de unión a antígeno scFv antiCD19, un dominio de unión a antígeno scFv antiCD20, un dominio de unión a antígeno scFv antiCD22, un dominio de unión a antígeno scFv antiRORl, un dominio de unión a antígeno scFv antimesotelina, un dominio de unión a antígeno scFv antiCD33, un dominio de unión a antígeno scFv antiCD38, un dominio de unión a antígeno scFv antiCD123 (IL3RA), un dominio de unión a antígeno scFv antiCD138, un dominio de unión a antígeno scFv antiBCMA (CD269), un dominio de unión a antígeno scFv antiGPC2, un dominio de unión a antígeno scFv antiGPC3, un dominio de unión a antígeno scFv antiFGFR4, un dominio de unión a antígeno scFv anticMet, un dominio de unión a antígeno scFv antiPMSA, un dominio de unión a antígeno scFv antiglucolípido F77, un dominio de unión a antígeno scFv antiEGFRvIII, un dominio de unión a antígeno scFv antiGD-2, un dominio de unión a antígeno scFv antiNY-ESo-1 TCR, un dominio de unión a antígeno scFv antiMAGE A3 TCR o una secuencia de aminoácidos con un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % de identidad de la misma, o cualquier combinación de los mismos.
En un aspecto, los CAR proporcionados en este documento comprenden además un dominio conector o espaciador.
En una realización de una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el CAR de la invención, el dominio de unión al antígeno mesotelina extracelular, el dominio de señalización intracelular o ambos están conectados al dominio transmembranario por un dominio conector o espaciador.
En una realización, el dominio conector codificado deriva del dominio extracelular de CD8 o CD28 y está unido a un dominio transmembranario.
En otra realización, el dominio transmembranario que comprende un dominio transmembranario de una proteína se selecciona del grupo que consiste en la cadena alfa, beta o zeta del receptor de linfocitos T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 y CD154, o una combinación de los mismos.
En otra realización más, el dominio de señalización intracelular codificado comprende además un dominio intracelular CD3 zeta.
En una realización, el dominio de señalización intracelular codificado está dispuesto en un lado C terminal con respecto al dominio intracelular CD3 zeta.
En otra realización, el al menos un dominio de señalización intracelular codificado comprende un dominio coestimulador, un dominio de señalización primaria o una combinación de los mismos.
En realizaciones adicionales, el al menos un dominio coestimulador codificado comprende un dominio de señalización funcional de OX40, CD70, CD27, CD28, CD5, ICAM-1, LFA-1 (CD11 a/CD18), ICOS (CD278), DAP10, DAP12 y 4-1BB (CD137) o una combinación de los mismos.
En una realización, la molécula de ácido nucleico aislada que codifica el CAR contiene además una secuencia líder o péptido señal, en la que la secuencia de nucleótidos del péptido líder o señal comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 9.
En otra realización más, la secuencia líder codificada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.
En un aspecto, se divulga en este documento un receptor quimérico de antígeno (CAR) que comprende, del extremo N al extremo C, al menos un dominio de unión al antígeno mesotelina, al menos un dominio transmembranario y al menos un dominio de señalización intracelular.
En un aspecto, se divulga un CAR en el que el dominio de unión al antígeno mesotelina extracelular comprende al menos un fragmento variable monocatenario de un anticuerpo que se une al antígeno, o al menos una región variable de la cadena pesada de un anticuerpo que se une al antígeno o una combinación de los mismos.
En otro aspecto, se divulga un CAR en el que el al menos un dominio transmembranario comprende un dominio transmembranario de una proteína seleccionada del grupo que consiste en la cadena alfa, beta o zeta del receptor de linfocitos T CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 y CD154, o una combinación de los mismos.
En algunos aspectos, el CAR codifica adicionalmente un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende CD19, CD20, CD22, ROR1, mesotelina, CD33, CD38, CD123 (IL3RA), CD138, BCMA (CD269), GPC2, GPC3, FGFR4, c-Met, PSMA, glucolípido F77, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1 TCR, MAGE A3 TCR, o una secuencia de aminoácidos con un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % de identidad de la misma, o cualquier combinación de los mismos.
En un aspecto, el dominio de unión a antígeno extracelular comprende un dominio de unión a antígeno scFv antiCD19, un dominio de unión a antígeno scFv antiCD20, un dominio de unión a antígeno scFv antiCD22, un dominio de unión a antígeno scFv antiRORl, un dominio de unión a antígeno scFv antimesotelina, un dominio de unión a antígeno scFv antiCD33, un dominio de unión a antígeno scFv antiCD38, un dominio de unión a antígeno scFv antiCD123 (IL3RA), un dominio de unión a antígeno scFv antiCD138, un dominio de unión a antígeno scFv antiBCMA (CD269), un dominio de unión a antígeno scFv antiGPC2, un dominio de unión a antígeno scFv antiGPC3, un dominio de unión a antígeno scFv antiFGFR4, un dominio de unión a antígeno scFv antiMet, un dominio de unión a antígeno scFv antiPMSA, un dominio de unión a antígeno scFv antiglucolípido F77, un dominio de unión a antígeno scFv antiEGFRvIII, un dominio de unión a antígeno scFv antiGD-2, un dominio de unión a antígeno scFv antiNY-ESo-1 TCR, un dominio de unión a antígeno scFv antiMAGE A3 TCR o una secuencia de aminoácidos con un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % de identidad de la misma, o cualquier combinación de los mismos.
En otro aspecto, se divulga un CAR en el que el al menos un dominio de señalización intracelular comprende un dominio coestimulador y un dominio de señalización primaria.
En otro aspecto más, se divulga un CAR en el que el al menos un dominio de señalización intracelular comprende un dominio coestimulador que comprende un dominio de señalización funcional de una proteína seleccionada del grupo que consiste en OX40, CD70, CD27, CD28, CD5, ICAM-1, LFA-1 (CD11 a/CD18), ICOS (CD278), DAP10, DAP12 y 4-1BB (CD137), o una combinación de los mismos.
En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11 (secuencia de ácido nucleico de pLTG1901 Ef1 a MH1P--CD8TM-4-1BB-CD3 zeta (figura 2A)). En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico codifica un CAR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 (secuencia de aminoácidos de pLTG1901 Ef1 a MH1P--CD8TM-4-1BB-CD3 zeta (figura 2A)).
En otra realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 13. (secuencia de ácido nucleico de pLTG1902 Ef1 a MH2P CD8TM-4-1BB-CD3 zeta (figura 2B)). En una realización, la secuencia de ácido nucleico codifica un CAR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. (secuencia de aminoácidos de pLTG1902 Ef1a MH2P CD8TM-4-1BB-CD3 zeta amino (figura 2B)).
En otra realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 15 (secuencia de ácido nucleico de pLTG1903 Ef1a MH6P CD8TM-4-1BB-CD3 zeta (figura 2C)). En una realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 (secuencia de ácido nucleico de pLTG1903 Ef1a MH6P CD8TM-4-1BB-CD3 zeta (figura 2C)).
En otra realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 17 (secuencia de ácido nucleico de pLTG1904 Ef1a M1-4S CD8TM-4-1BB-CD3 zeta (figura 2D)). En una realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 (secuencia de aminoácidos de pLTG1904 Ef1a M1-4S CD8TM-4-1BB-CD3 zeta (figura 2D)).
En un aspecto, los CAR divulgados en este documento se modifican para que expresen o contengan un marcador detectable para su uso en diagnóstico, control y/o predicción del resultado del tratamiento tal como supervivencia sin progresión de pacientes con cáncer o para controlar el progreso de dicho tratamiento.
En una realización, la molécula de ácido nucleico que codifica el CAR de la invención puede estar contenida en un vector, tal como un vector vírico. El vector es un vector de ADN, un vector de ARN, un vector plasmídico, un vector cosmídico, un vector del virus del herpes, un vector del virus del sarampión, un vector lentivírico, un vector adenovírico o un vector retrovírico o una combinación de los mismos.
En determinadas realizaciones, el vector comprende además un promotor en el que el promotor es un promotor inducible, un promotor específico de tejido, un promotor constitutivo, un promotor suicida o cualquier combinación de los mismos.
En otra realización más, el vector que expresa el CAR puede modificarse adicionalmente para que incluya uno o más elementos funcionales para controlar la expresión de linfocitos T CAR o para eliminar linfocitos T-CAR en virtud de un conmutador suicida. El conmutador suicida puede incluir, por ejemplo, una cascada de señalización inductora de apoptosis o un fármaco que induce muerte celular. En una realización preferida, el vector que expresa el CAR puede modificarse adicionalmente para que exprese una enzima tal como timidina cinasa (TK) o citosina desaminasa (CD).
En otra realización, también se proporcionan células hospedadoras que incluyen la molécula de ácido nucleico que codifica el CAR de la invención. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es un linfocito T, tal como un linfocito T primario obtenido de un sujeto. En una realización, la célula hospedadora es un linfocito T CD8+.
En otra realización más, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz antitumoral de una población de linfocitos T humanos, en la que los linfocitos T comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor quimérico de antígeno (CAR), en la que el CAR comprende al menos un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende un dominio de unión al antígeno mesotelina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 4, 6 y 8, al menos un dominio conector, al menos un dominio transmembranario y al menos un dominio de señalización intracelular, en la que los linfocitos T son linfocitos T de un ser humano que tiene cáncer. El cáncer incluye, entre otros, un cáncer hemático tal como leucemia (por ejemplo, leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia linfocítica aguda (ALL) o leucemia mielógena crónica (CML), linfoma (por ejemplo, linfoma de células del manto, linfoma no hodgkiniano o linfoma de Hodgkin o mieloma múltiple, o una combinación de los mismos.
En una realización, el al menos un dominio transmembranario del CAR contiene un dominio transmembranario de una proteína seleccionada del grupo que consiste en la cadena alfa, beta o zeta del receptor de linfocitos T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 y CD154, o una combinación de los mismos.
En otra realización, el cáncer humano incluye un carcinoma en el adulto que comprende cáncer bucal y de faringe (lengua, boca, faringe, cabeza y cuello), cánceres del sistema digestivo (esófago, estómago, intestino delgado, colon, recto, ano, hígado, vías biliares interhepáticas, vesícula biliar, páncreas), cánceres del sistema respiratorio (laringe, pulmones y bronquios), cánceres de huesos y articulaciones, cánceres de tejidos blandos, cánceres de piel (melanoma, carcinoma basocelular y escamocelular), tumores pediátricos (neuroblastoma, rabdomiosarcoma, osteosarcoma, sarcoma de Ewing), tumores del sistema nervioso central (cerebral, astrocitoma, glioblastoma, glioma) y cánceres de mama, el sistema genital (cuello uterino, cuerpo uterino, ovario, vulva, vagina, próstata, testículos, pene, endometrio), el sistema urinario (vejiga, riñón y pelvis renal, uréter), el ojo y órbita, el sistema endocrino (tiroides) y el cerebro y otros sistemas nerviosos o cualquier combinación de los mismos.
En otra realización más, el cáncer es un cáncer resistente no sensible a uno o más agentes quimioterápicos. El cáncer incluye cáncer hematopoyético, cáncer pancreático por síndrome mielodisplásico, cáncer de cabeza y cuello, tumores cutáneos, enfermedad residual mínima (MRD) en leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), neoplasias de linfocitos B en el adulto incluyendo, CLL (leucemia linfocítica crónica), CML (leucemia mielógena crónica), linfoma no hodgkiniano (NHL), neoplasias de linfocitos B pediátricas (incluyendo ALL de estirpe B (leucemia linfocítica aguda)), mieloma múltiple, cáncer pulmonar, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de colon, melanoma u otro cáncer hemático y tumores sólidos, o cualquier combinación de los mismos.
En otra realización, se proporcionan métodos de preparación de linfocitos T que contienen CAR (a partir de ahora en este documento "linfocitos T-CAR"). Los métodos incluyen transducir un linfocito T con un vector o molécula de ácido nucleico que codifica un CAR de la invención que se une específicamente a mesotelina, preparando de ese modo el linfocito T-CAR.
En otro aspecto más, se divulga un método de generación de una población de células manipuladas en el ARN, que comprende introducir un ARN transcrito in vivo o ARN sintético de una molécula de ácido nucleico que codifica un CAR divulgado en una célula de un sujeto, generando de ese modo una célula CAR.
En otro aspecto más, se divulga un método para diagnosticar una enfermedad, trastorno o afección asociada con la expresión de mesotelina en una célula, que comprende a) poner en contacto la célula con un anticuerpo humano antimesotelina o fragmento del mismo, en el que el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 4, 6 y 8; y b) detectar la presencia de mesotelina, en el que el presencia de mesotelina diagnostica la enfermedad, trastorno o afección asociada con la expresión de mesotelina.
En un aspecto, la enfermedad, trastorno o afección asociada con la expresión de mesotelina es cáncer incluyendo cáncer hematopoyético, cáncer pancreático por síndrome mielodisplásico, cáncer de cabeza y cuello, tumores cutáneos, enfermedad residual mínima (MRD) en leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), neoplasias de linfocitos B en el adulto incluyendo, CLL (leucemia linfocítica crónica), CML (leucemia mielógena crónica), linfoma no hodgkiniano (NHL), neoplasias de linfocitos B pediátricas (incluyendo ALL de estirpe B (leucemia linfocítica aguda)), mieloma múltiple, cáncer pulmonar, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de colon, melanoma u otro cáncer hemático y tumores sólidos, o cualquier combinación de los mismos.
En otro aspecto, se divulga un método de diagnóstico, pronóstico o determinación del riesgo de una enfermedad relacionada con mesotelina en un mamífero, que comprende detectar la expresión de mesotelina en una muestra derivada del mamífero, que comprende: a) poner en contacto la célula con un anticuerpo humano antimesotelina o fragmento del mismo, en el que el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 4, 6 y 8; y b) detectar la presencia de mesotelina, en el que el presencia de mesotelina diagnostica una enfermedad relacionada con mesotelina en el mamífero.
En otro aspecto, se divulga un método de inhibición de la inhibición de linfocitos T dependiente de mesotelina, que comprende poner en contacto una célula con un anticuerpo humano antimesotelina o fragmento del mismo, en el que el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 4, 6 y 8. En un aspecto, la célula se selecciona del grupo que consiste en una célula tumoral que expresa mesotelina, un macrófago asociado a tumor y cualquier combinación de los mismos.
En otro aspecto, se divulga un método de bloqueo de inhibición de linfocitos T mediado por una célula que expresa mesotelina y alteración del microentorno tumoral para inhibir el crecimiento tumoral en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de una composición que comprende un anticuerpo antimesotelina aislado o fragmento del mismo, en el que el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 4, 6 y 8. En un aspecto, la célula se selecciona del grupo que consiste en una célula tumoral que expresa mesotelina, un macrófago asociado a tumor y cualquier combinación de los mismos.
En otro aspecto, se divulga un método de inhibición, supresión o prevención de la inmunosupresión de una respuesta inmunitaria antitumoral o antineoplásica en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de una composición que comprende un anticuerpo antimesotelina aislado o fragmento del mismo, en el que el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 4, 6 y 8. En una realización, el anticuerpo o fragmento del mismo inhibe la interacción entre una primera célula con un linfocito T, en el que la primera célula se selecciona del grupo que consiste en una célula tumoral que expresa mesotelina, un macrófago asociado a tumor o cualquier combinación de los mismos.
En otro aspecto, se divulga un método para inducir una inmunidad antitumoral en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un linfocito T transducido con vector o molécula de ácido nucleico que codifica un CAR divulgado.
En otro aspecto, se divulga un método de tratamiento o prevención del cáncer en un mamífero, que comprende administrar al mamífero uno o más de los CAR divulgados, en una cantidad eficaz para tratar o prevenir el cáncer en el mamífero. El método incluye administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de células hospedadoras que expresan un CAR divulgado que se une específicamente a mesotelina y/o uno o más de los antígenos mencionados anteriormente, en condiciones suficientes para formar un complejo inmunitario del dominio de unión a antígeno en el CAR y el dominio extracelular de mesotelina y/o uno o más de los antígenos mencionados anteriormente en el sujeto.
En otro aspecto más, se divulga un método para tratar a un mamífero que tiene una enfermedad, trastorno o afección asociada con una expresión elevada de un antígeno tumoral, comprendiendo el método administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz antitumoral de una población de linfocitos T, en la que los linfocitos T comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor quimérico de antígeno (CAR), en la que el CAR incluye al menos un dominio de unión al antígeno mesotelina extracelular que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6 y 8, o cualquier combinación de las mismas, al menos un dominio conector o espaciador, al menos un dominio transmembranario, al menos un dominio de señalización intracelular y en la que los linfocitos T son linfocitos T del sujeto que tiene cáncer.
En otra realización más, se proporciona una composición farmacéutica para su uso en un método de tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesita, en el que la composición farmacéutica comprende una cantidad eficaz antitumoral de una población de linfocitos T, en la que los linfocitos T comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor quimérico de antígeno (CAR), en la que el CAR comprende al menos un dominio de unión al antígeno mesotelina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6 y 8, o cualquier combinación de las mismas, al menos un dominio conector o espaciador, al menos un dominio transmembranario, al menos un dominio de señalización intracelular, en la que los linfocitos T son linfocitos T del sujeto que tiene cáncer. En algunas realizaciones de los métodos mencionados anteriormente, el al menos un dominio transmembranario comprende una cadena alfa, beta o zeta transmembranaria del receptor de linfocitos T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 y CD154, o una combinación de los mismos.
En otro aspecto más, se divulga un método para generar una población persistente de linfocitos T genomanipulados en un ser humano diagnosticado con cáncer. En una realización, el método comprende administrar a un ser humano un linfocito T genomanipulado para que exprese un CAR, en el que el CAR comprende al menos un dominio de unión al antígeno mesotelina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6 o 8 o cualquier combinación de las mismas, al menos un dominio transmembranario y al menos un dominio de señalización intracelular, en el que la población persistente de linfocitos T genomanipulados o la población de descendencia de los linfocitos T persiste en el ser humano durante al menos un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses, siete meses, ocho meses, nueve meses, diez meses, once meses, doce meses, dos años o tres años después de la administración.
En un aspecto, la descendencia de linfocitos T en el ser humano comprende un linfocito T de memoria. En otro aspecto, el linfocito T es un linfocito T autólogo.
En todos los aspectos de métodos descritos en este documento, cualquiera de los cánceres, enfermedades, trastornos o afecciones mencionadas anteriormente asociadas con una expresión elevada de un antígeno tumoral puede tratarse o prevenirse o mejorarse usando uno o más de los CAR divulgados en este documento,
En otro aspecto más, se divulga un kit para preparar un linfocito T con receptor quimérico de antígeno como se describe supra o para prevenir, tratar o mejorar cualquiera de los cánceres, enfermedades, trastornos o afecciones asociadas con una expresión elevada de un antígeno tumoral en un sujeto como se describe supra, que comprende un recipiente que comprende una cualquiera de las moléculas de ácido nucleico, vectores, células hospedadoras o composiciones divulgadas supra o cualquier combinación de los mismos, e instrucciones para usar el kit.
Se entenderá que los CAR, células hospedadoras, ácidos nucleicos y métodos son útiles más allá de los aspectos específicos y realizaciones que se describen en detalle en este documento. Las características y ventajas anteriores de la divulgación llegarán a ser más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, que prosigue con referencia a las figuras adjuntas.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 representa un esquema de la estructura general de dominios de los CAR con secuencias de dominio de unión al antígeno mesotelina extracelular novedosas. Un receptor quimérico de antígeno está compuesto de un dominio scFv de unión a mesotelina extracelular, un dominio espaciador y transmembranario de CD8, un dominio coestimulador de CD137 de señalización intracelular y dominio de señalización CD3 z.
La figura 2 representa varios receptores quiméricos de antígeno (CAR) que contienen secuencias de dominio de unión al antígeno mesotelina extracelular novedosas. El esquema general para los CAR incluye, del extremo N al extremo C, un péptido señal, scFv antimesotelina, conector extracelular, dominio transmembranario, 4-1BB, CD3 zeta. La figura 2A representa un vector lentivírico que expresa el CAR que contiene la secuencia de ácido nucleico de CD8TM-4-1BB-CD3 zeta de unión de scFv a mesotelina pLTG1901 Ef1a MH1P y la secuencia de aminoácidos codificada. La figura 2B representa un vector lentivírico que expresa el CAR que contiene la secuencia de ácido nucleico de CD8TM-4-1BB-CD3 zeta de unión de scFv a mesotelina pLTG1902 Ef1 a MH2P y la secuencia de aminoácidos codificada. La figura 2C representa un vector lentivírico que expresa el CAR que contiene la secuencia de ácido nucleico de CD8TM-4-1BB-CD3 zeta de unión de scFv a mesotelina pLTG1903 Ef1 a MH6P y la secuencia de aminoácidos codificada. La figura 2D representa un vector lentivírico que expresa el CAR que contiene la secuencia de ácido nucleico de CD8TM-4-1BB-CD3 zeta de unión de scFv a mesotelina pLTG1904 Ef1 a M1-4S y la secuencia de aminoácidos codificada.
La figura 3 representa la expresión de CAR antimesotelina en linfocitos T. los linfocitos T humanos primarios derivados de dos donadores sanos (A y B) se transdujeron con vectores lentivíricos que codificaban las construcciones de CAR antimesotelina pLTG1901, pLTG1902, pLTG1903 y pLTG1904, respectivamente. El control simulado constituye linfocitos T que se expandieron en ausencia de transducción lentivírica. En el día 10 de cultivo, se evaluó la expresión superficial del CAR por citometría de flujo. Se usó reactivo antiF(ab')2 humano-PE para facilitar la detección de la expresión superficial del CAR antimesotelina.
La figura 4 representa la actividad antitumoral de CAR que contienen el motivo de unión de scFv antimesotelina, el dominio transmembranario de CD8 y el motivo de señalización 4-1BB/cadena CD3-zeta. Los linfocitos T CAR antimesotelina se ensayaron en un ensayo de destrucción in vitro frente a líneas diana que expresan de forma estable luciferasa de luciérnaga. A431 - negativo a mesotelina, A431-MSLN - positivo a mesotelina. Los linfocitos T CAR se obtuvieron de sangre de dos donadores sanos (paneles A y B). Los linfocitos T CAR y las células tumorales se combinaron por triplicado a las relaciones indicadas de efector a diana (E:T) y se cultivaron durante la noche. Después, se evaluó la luminiscencia de las células tumorales supervivientes en cada pocillo como se describe en los métodos. Los controles negativos en este ensayo fueron pLTG1398-GFP y los linfocitos T transducidos de forma simulada son controles negativos. Las barras representan la desviación típica para cada grupo.
Descripción detallada
Definiciones
Como se usa en este documento, las formas singulares "un/o", "una" y "el/la" se refieren tanto al singular como al plural, salvo que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, la expresión "un antígeno" incluye un solo antígeno o múltiples antígenos y puede considerarse equivalente a la expresión "al menos un antígeno". Como se usa en este documento, el término "comprende" significa "incluye". Por tanto, "que comprende un antígeno" significa "que incluye antígeno" sin excluir otros elementos. La expresión "y/o" significa "y" u "o". Tiene que entenderse además que todos y cada uno de los tamaños de base o tamaños de aminoácido y todos los valores de peso molecular o masa molecular dados para ácidos nucleicos o polipéptidos son aproximados y se proporcionan con fines descriptivos, salvo que se indique de otro modo. Aunque pueden usarse muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento, a continuación, se describen métodos y materiales adecuados particulares. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluyendo las explicaciones de términos. Además, los materiales, métodos y ejemplos son únicamente ilustrativos y no pretenden ser limitantes. Para facilitar la revisión de las diversas realizaciones, se proporcionan las siguientes explicaciones de términos:
El término "aproximadamente", cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad, una duración temporal y similares, se entiende que abarca variaciones de - 20 % o, en algunos casos, - 10 % o, en algunos casos, - 5 % o, en algunos casos, - 1 % o, en algunos casos, - 0,1 % del valor especificado, ya que dichas variaciones son apropiadas para realizar los métodos divulgados.
Salvo que se indique de otro modo, los términos técnicos en este documento se usan de acuerdo con el uso convencional. Pueden encontrarse definiciones de términos comunes en biología molecular en Benjamin Lewin, Genes VII, publicado por Oxford University Press, 1999; Kendrew et al., (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994; y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995; y otras referencias similares.
La presente divulgación divulga anticuerpos contra mesotelina o fragmentos de los mismos, así como receptores quiméricos de antígeno (CAR) que tienen dichos dominios de unión al antígeno mesotelina. La potenciación de la actividad funcional del CAR se refiere directamente a la potenciación de la actividad funcional del linfocito T que expresa CAR. Como resultado de una o más de estas modificaciones, los CAR muestran tanto un alto grado de citólisis inducida por citocinas como expresión en superficie celular sobre linfocitos T transducidos, junto con un nivel aumentado de expansión de linfocitos T in vivo y persistencia del linfocito T que expresa CAR transducido.
La capacidad única de combinar restos funcionales derivados de diferentes dominios proteínicos ha sido una característica innovadora clave de los receptores quiméricos de antígeno (CAR). La elección de cada uno de estos dominios proteínicos es una característica de diseño clave, como lo es la manera en que se combinan específicamente. Cada dominio del diseño es un componente esencial que puede usarse entre diferentes plataformas de CAR para manipular la función de los linfocitos. Por ejemplo, la elección del dominio de unión extracelular puede hacer que un CAR de lo contrario ineficaz sea eficaz.
Los componentes estructurales invariables de las secuencias proteínicas derivadas de inmunoglobulina usadas para crear el dominio de unión a antígeno extracelular de un CAR pueden ser completamente neutros o pueden autoasociarse y dirigir el linfocito T a un estado de agotamiento metabólico, haciendo de este modo que el linfocito T terapéutico que expresa ese CAR sea mucho menos eficaz. Esto se produce independientemente de la función de unión a antígeno del dominio CAR. Además, la elección del uno o más dominios de señalización intracelular también puede gobernar la actividad y la durabilidad de la población de linfocitos terapéuticos usadas para inmunoterapia. Aunque la capacidad de unirse al antígeno diana y la capacidad de transmitir una señal de activación al linfocito T a través de estos dominios extracelulares e intracelulares, respectivamente, son aspectos importantes del diseño del CAR, lo que también ha llegado a ser evidente es que la elección de la fuente de los fragmentos de unión a antígeno extracelulares puede tener un efecto significativo sobre la eficacia del CAR y de ese modo tiene una función definidora para la función y utilidad clínica del CAR.
Sorprendente e inesperadamente, ahora se ha descubierto que el uso de un dominio de unión a antígeno scFv de mesotelina extracelular completamente humano en un CAR, en lugar de usar fragmentos de unión a antígeno scFv de mesotelina derivados de ratón para generar CAR antimesotelina que sean propensos a inducir respuesta inmunitaria antirratón y la eliminación de T CAR en un hospedador (véase el ensayo clínico patrocinado por UPenn usando la secuencia de scFv SS1 derivada de ratón, NCT02159716), también determina la actividad funcional de un linfocito T que expresa CAR. Los CAR divulgados en este documento se expresan a un alto nivel en una célula. Una célula que expresa CAR tiene una tasa de proliferación in vivo alta, produce grandes cantidades de citocinas y tiene una alta actividad citotóxica contra una célula que tiene, en su superficie, un antígeno mesotelina al que se une un CAR. El uso de un dominio de unión al antígeno mesotelina extracelular humano provoca la generación de un CAR que funciona mejor in vivo, mientras que evita la inducción de inmunidad antiCAR en la respuesta inmunitaria del hospedador y la destrucción de la población de linfocitos T CAR. Los CAR que expresan el dominio de unión a antígeno scFv de mesotelina extracelular completamente humano muestran actividades/propiedades superiores incluyendo i) prevención de poca persistencia y función de T CAR como se observa con secuencias de unión derivadas de ratón; ii) ausencia de suministro regional (es decir, intrapleural) del CAR para que sea eficaz; y iii) capacidad de generar diseños de linfocitos T CAR basados tanto en agentes de unión con alta como baja afinidad a mesotelina. Esta última propiedad permite a los investigadores afinar mejor la eficacia frente a la toxicidad y/o la especificidad de tejido del producto T CAR, ya que los agentes de unión de menor afinidad pueden tener mayor especificidad por tumores frente a tejidos normales debido a la mayor expresión de mesotelina en tumores que en tejido normal, lo que puede evitar la toxicidad inespecífica de tumor en la diana y la destrucción de células vecinas.
Lo que sigue es una descripción detallada de los CAR, que incluye una descripción de su dominio de unión al antígeno mesotelina extracelular, el dominio transmembranario y el dominio intracelular, junto con descripción adicional de los CAR, anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, conjugados, nucleótidos, expresión, vectores y células hospedadoras, métodos de tratamiento, composiciones y kits que emplean los CAR divulgados.
A. Receptores quiméricos de antígeno (CAR)
Los CAR divulgados en este documento comprenden al menos un dominio de unión al antígeno mesotelina que puede unirse a mesotelina, al menos un dominio transmembranario y al menos un dominio intracelular.
Un receptor quimérico de antígeno (CAR) es una proteína o polipéptido híbrido construido artificialmente que contiene los dominios de unión a antígeno de un anticuerpo (por ejemplo, fragmento variable monocatenario (scFv)) ligado a dominios de señalización de linfocitos T mediante el dominio transmembranario. Las características de los CAR incluyen su capacidad de redirigir la especificidad y reactividad de los linfocitos T hacia una diana seleccionada de una manera no restringida al MHC, y explotar las propiedades de unión a antígeno de anticuerpos monoclonales. El reconocimiento de antígeno no restringido a MHC aporta a los linfocitos T que expresan los CAR la capacidad de reconocer el antígeno independiente del procesamiento del antígeno, superando por tanto un mecanismo principal de escape del tumor. Además, cuando se expresan en linfocitos T, los CAR ventajosamente no dimerizan con las cadenas alfa y beta del receptor de linfocitos T (TCR) endógeno.
Como se divulga en este documento, los dominios de señalización de linfocitos T intracelulares de los CAR pueden incluir, por ejemplo, un dominio de señalización del receptor de linfocitos T, un dominio de señalización coestimulador de linfocitos T o ambos. El dominio de señalización del receptor de linfocitos T se refiere a una parte del CAR que comprende el dominio intracelular de un receptor de linfocitos T tal como, por ejemplo, y no modo de limitación, la parte intracelular de la proteína CD3 zeta. El dominio de señalización coestimulador se refiere a una parte del CAR que comprende el dominio intracelular de una molécula coestimuladora, que es una molécula de superficie celular distinta de un receptor de antígeno o sus ligandos que son necesarios para una respuesta eficaz de los linfocitos contra el antígeno.
1. Dominio extracelular
En un aspecto, el CAR comprende un elemento de unión específico de diana denominado de otro modo dominio o resto de unión a antígeno. La elección de dominio depende del tipo y número de ligandos que definen la superficie de una célula diana. Por ejemplo, el dominio de unión a antígeno puede elegirse para que reconozca un ligando que actúa como marcador de superficie celular sobre células diana asociadas con un estado patológico particular. Por tanto, ejemplos de marcadores de superficie celular que pueden actuar como ligandos para el dominio de unión a antígeno en el CAR incluyen los asociados con infecciones víricas, bacterianas y parasitarias, enfermedad autoinmunitaria y células cancerosas.
En un aspecto, el CAR puede manipularse para abordar un antígeno tumoral de interés por medio de manipulación de un dominio de unión a antígeno deseado que se une específicamente a un antígeno en una célula tumoral. Los antígenos tumorales son proteínas que se producen por células tumorales que provocan una respuesta inmunitaria, particularmente respuestas inmunitarias mediadas por linfocitos T. La selección del dominio de unión a antígeno dependerá del tipo particular de cáncer a tratar. Los antígenos tumorales incluyen, por ejemplo, un antígeno asociado a glioma, antígeno carcinoembrionario (CEA), gonadotropina coriónica humana beta, alfafetoproteína (AFP), AFP reactiva a lectina, tiroglobulina, RAGE-1, m N-CA IX, retrotranscriptasa de telomerasa humana, RU1, RU2 (AS), carboxilo esterasa intestinal, mut hsp70-2, M-CSF, prostasa, antígeno específico prostático (PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, p53, prosteína, PSMA, Her2/neu, survivina y telomerasa, antígeno tumoral 1 de carcinoma de próstata (PCTA-1), MAGE, ELF2M, elastasa de neutrófilos, efrinaB2, CD22, factor de crecimiento insulínico (IGF)-I, IGF-II, receptor de IGF-I y mesotelina.
Los antígenos tumorales divulgados en este documento se incluyen simplemente a modo de ejemplo. La lista no pretende ser exclusiva y serán fácilmente evidentes ejemplos adicionales para los expertos en la materia.
En un aspecto, el antígeno tumoral comprende uno o más epítopos cancerosos antigénicos asociados con un tumor maligno. Los tumores malignos expresan varias proteínas que pueden servir como antígenos diana para un ataque inmunitario. Estas moléculas incluyen, aunque sin limitación, antígenos específicos de tejidos tales como MART-1, tirosinasa y GP 100 en melanoma y fosfatasa ácida prostática (PAP) y antígeno específico prostático (PSA) en cáncer de próstata. Otras moléculas diana pertenecen al grupo de moléculas relacionadas con transformación tales como el oncogén HER-2/Neu/ErbB-2. Otro grupo más de antígenos diana son antígenos oncofetales tales como el antígeno carcinoembrionario (CEA). En linfoma de linfocitos B, la inmunoglobulina de idiotipo específico de tumor constituye un antígeno de inmunoglobulina verdaderamente específico de tumor que es único para el tumor individual. Los antígenos de diferenciación de linfocitos B tales como CD19, CD20 y CD37 don otros candidatos para antígenos diana en linfoma de linfocitos B. Algunos de estos antígenos (CEA, HER-2, CD19, CD20, idiotipo) se han usado como dianas para inmunoterapia pasiva con anticuerpos monoclonales con éxito limitado.
En un aspecto, el antígeno tumoral es mesotelina y los tumores asociados con la expresión de mesotelina comprenden mesotelioma pulmonar, cánceres de ovario y pancreático que expresan altos niveles de la proteína extracelular mesotelina o cualquier combinación de los mismos.
El tipo de antígeno tumoral también puede ser un antígeno específico de tumor (TSA) o un antígeno asociado a tumor (TAA). Un TSA es único para las células tumorales y no se produce en otras células en el organismo. Un TAA no es único para una célula tumoral y, en su lugar, también se expresa en una célula normal en condiciones que no logran inducir un estado de tolerancia inmunológica al antígeno. La expresión del antígeno en el tumor puede producirse en condiciones que posibilitan que el sistema inmunitario responda al antígeno. Los TAA pueden ser antígenos que se expresan en células normales durante el desarrollo fetal cuando el sistema inmunitario es inmaduro y no puede responder o pueden ser antígenos que estén normalmente presentes a niveles extremadamente bajos en células normales, pero que se expresan a niveles mucho mayores en células tumorales.
Ejemplos no limitantes de TSA o TAA incluyen los siguientes: antígenos de diferenciación tales como MART-1/MelanA (MART-I), gp100 (Pmel 17), tirosinasa, TRP-1, TRP-2 y antígenos multiestirpe específicos de tumor tales como MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15; antígenos embrionarios sobreexpresados tales como CEA; oncogenes sobreexpresados y genes supresores tumorales mutados tales como p53, Ras, HER-2/neu; antígenos tumorales únicos resultantes de translocaciones cromosómicas tales como BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; y antígenos víricos, tales como los antígenos del virus de Epstein Barr EBVA y los antígenos E6 y E7 del virus del papiloma humano (HPV). Otros antígenos grandes basados en proteínas incluyen TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, beta-catenina, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, alfa-fetoproteína, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3\CA 27.29\BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733\EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90\proteína de unión a Mac-2\proteína asociada a ciclofilina C, TAAL6, TAG72, TLP y TPS.
En un aspecto, la parte de dominio de unión a antígeno del CAR se dirige a un antígeno que incluye, aunque sin limitación, CD19, CD20, CD22, ROR1, CD33, c-Met, PSMA, glucolípido F77, EGFRvIII, GD-2, MY-ESO-1 TCR, MAGE A3 TCR y similares.
En el CAR de la invención, la parte de dominio de unión a antígeno del CAR se dirige al antígeno mesotelina extracelular.
En un aspecto, la molécula de ácido nucleico aislada que codifica el dominio de unión a antígeno scFv de mesotelina extracelular comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia con un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de la misma. En una realización, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada en la que el dominio de unión a antígeno scFv de mesotelina extracelular codificado comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o una secuencia de aminoácidos con un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico aislada que codifica el dominio de unión a antígeno scFv de mesotelina extracelular comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3.
En una realización, el dominio de unión a antígeno scFv de mesotelina extracelular codificado comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico aislada que codifica el dominio de unión a antígeno scFv de mesotelina extracelular comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5.
En una realización, el dominio de unión a antígeno scFv de mesotelina extracelular codificado comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico aislada que codifica el dominio de unión a antígeno scFv de mesotelina extracelular comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: ’7.
En una realización, el dominio de unión a antígeno scFv de mesotelina extracelular codificado comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
La generación y características de unión de los fragmentos de unión a antígeno scFv de mesotelina específicos o agentes de unión a antígeno descritos en este documento se muestran en el ejemplo 1.
En las diversas realizaciones de los CAR específicos de mesotelina divulgados en este documento, el esquema general se expone en la figura 1 e incluye, del extremo N al extremo C, un péptido señal o líder, un scFv antimesotelina, conector extracelular, dominio transmembranario de CD8, 4-1BB, CD3 zeta en el que texto en negrita representa los sitios de clonación para dominios de unión.
En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11 y codifica el CAR que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 12 [pLTG1901 :Ef1a Mh 1 P-CD8TM-4-1BB-CD3 zeta (pLTG1901) (como se representa en la figura 2A)].
En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11 o una secuencia con un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de la misma, y codifica el CAR que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 12 o una secuencia con un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de la misma. [pLTG1901 :Ef1a MH1P-CD8TM-4-1BB-CD3 zeta (pLTG1901) (como se representa en la figura 2A)].
En otra realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 13 y codifica el CAR que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14 [pLTG1902:Ef1a MH2P-CD8TM-4-1BB-CD3 zeta (pLTG1902) (como se representa en la figura 2B)].
En otro aspecto, la secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 13 o una secuencia con un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de la misma, y codifica el CAR que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14 o una secuencia con un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de la misma. [pLTG1902:Ef1a MH2P-CD8TM-4-1BB-CD3 zeta (pLTG1902) (como se representa en la figura 2B)].
En otra realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 15 y codifica el CAR que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 16 [pLTG1903:Ef1 a-MH6P-CD8TM-4-1 BB-CD3 zeta (pLTG1903) (como se representa en la figura 2C)].
En otro aspecto, la secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 15 o una secuencia con un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de la misma, y codifica el CAR que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 16 o una secuencia con un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de la misma. [pLTG1903:Ef1a-MH6P-CD8TM-4-1BB-CD3 zeta pLTG1903 (como se representa en la figura 2C)].
En otra realización más, la secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 17 y codifica el CAR que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 18 [pLTG1904:Ef1a-M1-4S-CD8TM-4-1 BB-CD3 zeta pLTG1904 (como se representa en la figura 2D)].
En otro aspecto más, la secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 17 o una secuencia con un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de la misma, y codifica el CAR que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 18 o una secuencia con un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de la misma. [pLTG1904:Ef1a-M1-4S-CD8TM-4-1BB-CD3 zeta pLTG1903 (como se representa en la figura 2D)].
La expresión superficial de los CAR que contienen agentes de unión a antígeno scFv de mesotelina se muestra en el ejemplo 2 infra y se resume en la tabla 2. El nivel de expresión para cada CAR que contiene agente de unión a antígeno scFv de mesotelina se determinó por análisis citométrico de flujo de linfocitos T transducidos con LV de dos donadores sanos usando el fragmento de anticuerpo antiF(ab ')2 humano conjugado con ficoeritrina (PE) para la detección de CAR (véase el ejemplo 2, figura 3). Las construcciones de CAR antimesotelina 1901 y 1903 (trazos continuos) no se detectaron en la superficie de linfocitos T. Por el contrario, los CAR antimesotelina 1902 y 1904 (trazos continuos) mostraron alta expresión superficial en comparación con la construcción de control de GFP (1298, trazos sombreados) que no tiene expresión superficial T CAR o actividad citolítica. Asimismo, no se detectó expresión de CAR en los linfocitos T transducidos de control negativo (grupo simulado, no mostrado), lo que demuestra además la especificidad del método de detección usado. (Véase el ejemplo 2, figura 3 y tabla 2).
Como se muestra en el ejemplo 2 y la figura 4, respectivamente, la alta actividad citolítica inesperada de los CAR que contienen dominio de unión a antígeno scFv de mesotelina se demostró cuando se creaban y ensayaban vectores lentivíricos (LV) que expresaban los siguientes CAR para la actividad antileucemia. Cada CAR experimental contiene el motivo de señalización 4-1 BB/cadena CD3 zeta y el motivo/dominio de unión antimesotelina específico indica en el mismo. La línea celular A431-MSLN se usó como diana en ensayos de citólisis. Tres de las construcciones T-CAR presentaban el scFv de unión antimesotelina conectado en el mismo marco de lectura al conector CD8 y las regiones transmembranarias y un motivo de señalización 4-1BB/cadena CD3 zeta mostraron fuerte actividad lítica a las relaciones de efector a diana (E:T) enumeradas en el eje de abscisas (véase la figura 4, pLTG1902 y pLTG1904, triángulo y círculo vacío, respectivamente). Sorprendentemente, se observó fuerte actividad citolítica con la construcción pLTG1903 (rombo vacío), aunque la expresión superficial de esta construcción de CAR no pudo confirmarse por citometría de flujo. Además, la construcción pLTG1901 (triángulo relleno), que también era indetectable en la superficie de linfocitos T por citometría de flujo, no mostró actividad lítica apreciable (véase la figura 4, pLTG1901, triángulo relleno), lo que demuestra que no todos los dominios de unión a antígeno scFv de mesotelina derivados de ser humano se comportan de manera similar en el contexto del entorno CAR en que se crearon.
Sin intención de limitarse a ningún mecanismo particular de acción, se cree que las posibles razones para la función terapéutica potenciada asociada con los CAR ejemplares de la invención incluyen, por ejemplo, y no a modo de limitación, a) movimiento lateral mejorado dentro de la membrana plasmática que permite una transducción de la señal más eficaz, b) localización superior dentro de los microdominios de membrana plasmática, tales como balsas lipídicas y mayor capacidad de interactuar con las cascadas de señalización transmembranarias asociadas con la activación de linfocitos T, c) localización superior de la membrana plasmática por movimiento preferente lejos de las interacciones amortiguadoras o moduladoras a la baja, tales como menos proximidad a o interacción con fosfatasas tales como CD45, y d) ensamblaje superior en complejos de señalización del receptor de linfocitos T (es decir, la sinapsis inmunitaria) o cualquier combinación de los mismos.
Aunque la divulgación se ha ilustrado como dominios de unión a antígeno scFv de mesotelina extracelular ejemplares, pueden usarse otras variantes nucleotídicas y/o aminoacídicas dentro de los dominios de unión a antígeno scFv de mesotelina para obtener los dominios de unión al antígeno mesotelina para uso en los CAR descritos en este documento.
Dependiendo del antígeno deseado a abordar, el CAR puede manipularse adicionalmente para que incluya el dominio de unión a antígeno apropiado que sea específico para la diana antigénica deseada. Por ejemplo, si CD19 es el antígeno deseado que tiene que abordarse, puede usarse un anticuerpo para CD19 como la incorporación del dominio de unión a antígeno en el CAR.
En una realización ejemplar, la parte de dominio de unión a antígeno del CAR se dirige adicionalmente a CD19. Preferiblemente, el dominio de unión a antígeno en el CAR es scFv antiCD19, en el que la secuencia de ácido nucleico del scFv antiCD19 comprende la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 29. En una realización, el scFv antiCD19 comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30. En otra realización, la parte scFv antiCD19 del CAR comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 30.
En un aspecto, se divulga un CAR que puede unirse a uno que no TSA o uno que no es TAA incluyendo, por ejemplo, y no a modo de limitación, un antígeno derivado de Retroviridae (por ejemplo, virus de la inmunodeficiencia humana tales como VIH-1 y VIH-LP), Picornaviridae (por ejemplo, poliovirus, virus de la hepatitis A, enterovirus, coxaquivirus humano, rinovirus y ecovirus), virus de la rubéola, coronavirus, virus de la estomatitis vesicular, virus de la rabia, virus del Ébola, virus paragripal, virus de las paperas, virus del sarampión, virus sincitial respiratorio, virus de la gripe, virus de la hepatitis B, parvovirus, Adenoviridae, Herpesviridae [por ejemplo, virus del herpes simple (VHS) de tipo 1 y tipo 2, virus de la varicela-zóster, citomegalovirus (CMV) y virus del herpes], Poxviridae (por ejemplo, virus de la viruela, virus de la variolovacuna y poxvirus) o virus de la hepatitis C, o cualquier combinación de los mismos.
En otro aspecto, se divulga un CAR que puede unirse a un antígeno derivado de una cepa bacteriana de estafilococos, estreptococos, Escherichia coli, Pseudomonas o Salmonella. Particularmente, se proporciona un CAR que puede unirse a un antígeno derivado de una bacteria infecciosa, por ejemplo, Helicobacter pylori, Legionella pneumophilia, una cepa bacteriana de Mycobacteria sps. (por ejemplo, M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii o M. gordonea), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitides, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes, estreptococos del grupo A, estreptococos del grupo B (Streptococcus agalactiae), Streptococcus pneumoniae o Clostridium tetani, o una combinación de los mismos.
2. Dominio transmembranario
Con respecto al dominio transmembranario, el CAR comprende uno o más dominios transmembranarios fusionados al dominio de unión al antígeno mesotelina extracelular del CAR.
El dominio transmembranario puede obtenerse de una fuente natural o de una fuente sintética. Cuando la fuente es natural, el dominio puede obtenerse de cualquier proteína unida a membrana o transmembranaria.
Las regiones transmembranarias de uso particular en los CAR descritos en este documento pueden obtenerse de (es decir, comprenden al menos la región o regiones transmembranarias de) la cadena alfa, beta o zeta del receptor de linfocitos T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. Como alternativa, el dominio transmembranario puede ser sintético, en cuyo caso comprenderá predominantemente residuos hidrófobos como leucina y valina. Preferiblemente, se encontrará un triplete de fenilalanina, triptófano y valina en cada extremo de un dominio transmembranario sintético. Opcionalmente, un corto conector oligo- o polipeptídico, preferiblemente de una longitud de entre 2 y 10 aminoácidos puede formar la unión entre el dominio transmembranario y el dominio de señalización citoplásmico del CAR. Un doblete de glicina-serina proporciona un conector particularmente adecuado.
En una realización, el dominio transmembranario que se asocia de forma natural con uno de los dominios en el CAR se usa además de los dominios transmembranarios descritos supra.
En algunos casos, el dominio transmembranario puede seleccionarse o mediante sustitución de aminoácidos para evitar la unión de dichos dominios a los dominios transmembranarios de las mismas proteínas superficiales de membrana o diferentes para minimizar interacciones con otros miembros del complejo receptor.
En una realización, el dominio transmembranario en el CAR de la invención es el dominio transmembranario de CD8. En una realización, el dominio transmembranario de CD8 comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 19. En una realización, el dominio transmembranario de CD8 comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. En otra realización, el dominio transmembranario de CD8 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.
En una realización, el dominio transmembranario codificado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones), pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, o una secuencia con un 95-99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.
En algunos casos, el dominio transmembranario del CAR comprende el dominio de CD8.alfa.bisagra. En una realización, el dominio de bisagra de CD8 comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 21. En una realización, el dominio de bisagra de CD8 comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22. En otra realización, el dominio de bisagra de CD8 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 o una secuencia con un 95-99 % de identidad de la misma.
En una realización, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada en la que el dominio conector codificado se obtiene del dominio extracelular de CD8 y se une al dominio de CD8 transmembranario, el dominio de CD28 transmembranario o una combinación de los mismos.
3. Dominio espaciador
En el CAR, puede disponerse un dominio espaciador entre el dominio extracelular y el dominio transmembranario o entre el dominio intracelular y el dominio transmembranario. El dominio espaciador significa cualquier oligopéptido o polipéptido que sirva para conectar el dominio transmembranario con el dominio extracelular y/o el dominio transmembranario con el dominio intracelular. El dominio espaciador comprende hasta 300 aminoácidos, preferiblemente de 10 a 100 aminoácidos y mucho más preferiblemente de 25 a 50 aminoácidos.
En varias realizaciones, el conector puede incluir un elemento espaciador que, cuando está presente, aumenta el tamaño del conector de modo que la distancia entre la molécula efectora o el marcador detectable y el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se aumenta. Los espaciadores ejemplares son conocidos por los expertos en la materia e incluyen los enumerados en las patentes de Estados Unidos n.° 7 964 566 7 498 298, 6 884 869, 6323 315, 6 239 104, 6034 065, 5 780 588, 5 665 860, 5663 149, 5635 483, 5 599 902, 5 554 725, 5530 097, 5521 284, 5 504 191, 5410 024, 5138 036, 5076 973, 4986 988, 4978 744, 4879 278, 4816 444 y 4486 414, así como las publicaciones de patente de Estados Unidos n.° 20110212088 y 20110070248.
El dominio espaciador preferiblemente tiene una secuencia que promueve la unión de un CAR con un antígeno y potencia la señalización en una célula. Ejemplos de un aminoácido que se espera que promueva la unión incluyen cisteína, un aminoácido cargado, y serina y treonina en un posible sitio de glucosilación, y estos aminoácidos pueden usarse como un aminoácido que constituye el dominio espaciador.
Como dominio espaciador, pueden usarse los números de aminoácido 118 a 178 (SEQ ID NO: 23) que es una región de bisagra de cD8.alfa. ((Nc BI RefSeq: NP.sub.--001759.3), los números de aminoácido 135 a 195 de CD8.beta. (GenBank: AAA35664.1), los números de aminoácido 315 a 396 de CD4 (NCBI RefSeq: NP.sub.--000607.1) o los números de aminoácido 137 a 152 de CD28 (NCBI RefSeq: NP.sub.--006130.1). Además, como dominio espaciador, puede usarse una parte de una región constante de una cadena H o cadena L de anticuerpo (región CH1 o región CL, por ejemplo, un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 24). Además, el dominio espaciador puede ser una secuencia sintetizada artificialmente.
Además, en el CAR, puede unirse una secuencia de péptido señal al extremo N. La secuencia de péptido señal existe en el extremo N de muchas proteínas secretoras y proteínas de membrana, y tiene una longitud de 15 a 30 aminoácidos. Como muchas de las moléculas proteínicas mencionadas anteriormente como dominio intracelular tienen secuencias de péptido señal, los péptidos señal pueden usarse como péptido señal para el CAR. En una realización, el péptido señal comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 10).
4. Dominio intracelular
El dominio citoplásmico o de lo contrario el dominio de señalización intracelular del CAR es responsable de la activación de al menos una de las funciones efectoras normales del inmunocito en que se ha colocado el CAR. La expresión "función efectora" se refiere a una función especializada de una célula. La función efectora de un linfocito T, por ejemplo, puede ser actividad citolítica o actividad auxiliar incluyendo la secreción de citocinas. Por tanto, la expresión "dominio de señalización intracelular" se refiere a la parte de una proteína que transduce la señal de función efectora y dirige la célula a realizar una función especializada. Aunque habitualmente puede emplearse el dominio de señalización intracelular completo, en muchos casos no es necesario usar la cadena completa. En la medida en que se usa una parte truncada del dominio de señalización intracelular, dicha parte truncada puede usarse en el lugar de la cadena intacta siempre que transduzca la señal de función efectora. La expresión dominio de señalización intracelular, por tanto, pretende incluir cualquier parte truncada del dominio de señalización intracelular suficiente para transducir la señal de función efectora.
Ejemplos preferidos de dominios de señalización intracelular para su uso en el CAR incluyen las secuencias citoplásmicas del receptor de linfocitos T (TCR) y correceptores que actúan en concierto para iniciar la transducción de señales después del acoplamiento del receptor de antígenos, así como cualquier derivado o variante de estas secuencias y cualquier secuencia sintética que tenga la misma capacidad funcional.
Se sabe que las señales generadas a través del TCR en solitario son insuficientes para la activación completa del linfocito T y que también se requiere una señal secundario o coestimuladora. Por tanto, puede decirse que la activación de linfocitos T está mediada por dos clases distintas de secuencia de señalización citoplásmica: las que inician la activación primaria dependiente de antígeno a través del TCR (secuencias de señalización citoplásmica primarias) y las que actúan de una manera independiente del antígeno para proporcionar una secundaria o coestimuladora (secuencias de señalización citoplásmica secundarias).
Las secuencias de señalización citoplásmica primarias regulan la activación primaria del complejo TCR de una manera estimuladora o de una manera inhibidora. Las secuencias de señalización citoplásmica primarias que actúan de una manera estimuladora pueden contener motivos de señalización que se conocen como motivos de activación basados en tirosina de inmunorreceptor o ITAM.
Ejemplos de secuencias de señalización citoplásmica primarias que contienen ITAM que son de uso particular en los CAR divulgados en este documento incluyen las derivadas de TCR zeta (CD3 Zeta), FcR gamma, FcR beta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b y CD66d. Ejemplos no limitantes específicos del ITAM incluyen péptidos que tienen secuencias de los números de aminoácido 51 a 164 de CD3.zeta. (NCBI RefSeq: NP.sub.--932170.1), los números de aminoácido 45 a 86 de Fc.épsilon.RI.gamma. (NCBI RefSeq: NP.sub.--004097.1), los números de aminoácido 201 a 244 de Fc.épsilon.RI.beta. (NCBI RefSeq: NP.sub.--000130.1), los números de aminoácido 139 a 182 de CD3.gamma. (NCBI RefSeq: NP.sub.--000064.1), los números de aminoácido 128 a 171 de CD3 .delta. (NCBI RefSeq: NP.sub.--000723.1), los números de aminoácido 153 a 207 de CD3.épsilon. (NCBI RefSeq: NP.sub.--000724.1), los números de aminoácido 402 a 495 de CD5 (NCBI RefSeq: NP.sub.--055022.2), los números de aminoácido 707 a 847 de 0022 (NCBI RefSeq: NP.sub.-001762.2), los números de aminoácido 166 a 226 de CD79a (NCBI RefSeq: NP.sub.--001774.1), los números de aminoácido 182 a 229 de CD79b (NCBI RefSeq: NP.sub.--000617.1) y los números de aminoácido 177 a 252 de CD66d (NCBI RefSeq: NP.sub.--001806.2), y sus variantes que tienen la misma función que estos péptidos tienen. El número de aminoácido basado en la información de secuencia de aminoácidos de NCBI RefSeq ID o GenBank descrita en este documento se numeran basándose en la longitud completa del precursor (que comprende una secuencia de péptido señal, etc.) de cada proteína. En una realización, la molécula de señalización citoplásmica en el CAR comprende una secuencia de señalización citoplásmica derivada de CD3 zeta.
En una realización preferida, el dominio intracelular del CAR puede diseñarse para que comprenda el dominio de señalización de CD3-zeta por sí mismo o combinado con cualquier otro dominio o dominios citoplásmicos deseados útiles en el contexto del CAR. Por ejemplo, el dominio intracelular del CAR puede comprender una parte de cadena CD3 zeta y una región de señalización coestimuladora. La región de señalización coestimuladora se refiere a una parte del CAR que comprende el dominio intracelular de una molécula coestimuladora. Una molécula coestimuladora es una molécula de superficie celular distinta de un receptor de antígenos o sus ligandos que es necesaria para una respuesta eficaz de los linfocitos contra un antígeno. Ejemplos de dichas moléculas coestimuladoras incluyen CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, Ic Os , antígeno-1 asociado a función de linfocitos (LfA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 y un ligando que se une específicamente con CD83, y similares. Ejemplos no limitantes específicos de dichas moléculas coestimuladoras incluyen péptidos que tienen secuencias los números de aminoácido 236 a 351 de CD2 (NCBI RefSeq: NP.sub.--001758.2), los números de aminoácido 421 a 458 de CD4 (NCBI RefSeq: NP.sub.--000607.1), los números de aminoácido 402 a 495 de CD5 (NCBI RefSeq: NP.sub.--055022.2), los números de aminoácido 207 a 235 de CD8.alfa. (NCBI RefSeq: NP.sub.--001759.3), los números de aminoácido 196 a 210 de CD83 (GenBank: AAA35664.1), los números de aminoácido 181 a 220 de CD28 (NCBI RefSeq: NP.sub.--006130.1), los números de aminoácido 214 a 255 de CD137 (4-1BB, NCBI RefSeq: NP.sub.--001552.2), los números de aminoácido 241 a 277 de CD134 (OX40, NCBI RefSeq: NP.sub.--003318.1) y los números de aminoácido 166 a 199 de ICOS (NCBI RefSeq: NP.sub.--036224.1), y sus variantes que tienen la misma función que estos péptidos tienen. Por tanto, aunque la divulgación en este documento se ejemplifica principalmente con 4-1BB como elemento de señalización coestimulador, otros elementos coestimuladores están dentro del alcance de la divulgación.
Las secuencias de señalización citoplásmica dentro de la parte de señalización citoplásmica del CAR pueden unirse entre sí en un orden aleatorio o especificado. Opcionalmente, un corto conector oligo- o polipeptídico, preferiblemente de una longitud de entre 2 y 10 aminoácidos puede formar el enlace. Un doblete de glicina-serina proporciona un conector particularmente adecuado.
En una realización, el dominio intracelular se diseña para que comprenda el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de CD28. En otra realización, el dominio intracelular se diseña para que comprenda el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de 4-1BB. En otra realización más, el dominio intracelular se diseña para que comprenda el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de CD28 y 4-1BB.
En una realización, el dominio intracelular en el CAR se diseña para que comprenda el dominio de señalización de 4-1BB y el dominio de señalización de CD3-zeta, en el que el dominio de señalización de 4-1 BB comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO: 25 y el dominio de señalización de CD3-zeta comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO: 27.
En una realización, el dominio intracelular en el CAR se diseña para que comprenda el dominio de señalización de 4-1BB y el dominio de señalización de CD3-zeta, en el que el dominio de señalización de 4-1 BB comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 y el dominio de señalización de CD3-zeta comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28.
En una realización, el dominio intracelular en el CAR se diseña para que comprenda el dominio de señalización de 4-1BB y el dominio de señalización de CD3-zeta, en el que el dominio de señalización de 4-1 BB comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 26 y el dominio de señalización de CD3-zeta comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 28.
5. Descripción adicional de CAR
En este documento también se divulgan partes funcionales de los CAR divulgados en este documento. La expresión "parte funcional" cuando se usa en referencia a un CAR se refiere a cualquier parte o fragmento de uno o más de los CAR divulgados en este documento, que es una parte o fragmento que retiene la actividad biológica del CAR del que forma parte (el CAR precursor). Las partes funcionales abarcan, por ejemplo, aquellas partes de un CAR que retienen la capacidad de reconocer células diana o detectar, tratar o prevenir una enfermedad, a un grado similar, al mismo grado o a un grado mayor que el CAR precursor. En referencia al CAR precursor, la parte funcional puede comprender, por ejemplo, aproximadamente un 10 %, 25 %, 30 %, 50 %, 68 %, 80 %, 90 %, 95 % o más del c A r precursor.
La parte funcional puede comprender aminoácidos adicionales en el extremo amino o carboxi de la parte, o en ambos extremos, que son aminoácidos adicionales no encontrados en la secuencia de aminoácidos del CAR precursor. De forma deseable, los aminoácidos adicionales no interfieren con la función biológica de la parte funcional, por ejemplo, reconocer células diana, detectar cáncer, tratar o prevenir cáncer, etc. De forma más deseable, los aminoácidos adicionales potencian la actividad biológica en comparación con la actividad biológica del CAR precursor.
Se incluyen en la divulgación variantes funcionales de los CAR divulgados en este documento. La expresión "variante funcional", como se usa en este documento, se refiere a un CAR, polipéptido o proteína que tiene identidad o similitud de secuencia sustancial o significativa con un CAR precursor, reteniendo dicha variante funcional la actividad biológica del CAR del que es una variante. Las variantes funcionales abarcan, por ejemplo, aquellas variantes del CAR descritas en este documento (el CAR precursor) que retiene la capacidad de reconocer células diana en un grado similar, el mismo grado o a un grado mayor, que el CAR precursor. En referencia al CAR precursor, la variante funcional puede ser, por ejemplo, al menos aproximadamente un 30 %, 50 %, 75 %, 80 %, 90 %, 98 % o más idéntico en la secuencia de aminoácidos al CAR precursor.
Una variante funcional puede comprender, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos del CAR precursor con al menos una sustitución aminoacídica conservativa. como alternativa o adicionalmente, las variantes funcionales pueden comprender la secuencia de aminoácidos del CAR precursor con al menos una sustitución aminoacídica no conservativa. en este caso, es preferible que la sustitución aminoacídica no conservativa no interfiera con o inhiba la actividad biológica de la variante funcional. La sustitución aminoacídica no conservativa puede potenciar la actividad biológica de la variante funcional, de modo que la actividad biológica de la variante funcional esté aumentada en comparación con el CAR precursor.
Las sustituciones aminoacídicas de los CAR son preferiblemente sustituciones aminoacídicas conservativas. Las sustituciones aminoacídicas conservativas son conocidas en la técnica e incluyen sustituciones aminoacídicas en que un aminoácido que tiene determinadas propiedades físicas y/o químicas se intercambia por otro aminoácido que tiene las mismas propiedades químicas o físicas o similares. Por ejemplo, la sustitución aminoacídica conservativa puede ser un aminoácido polar ácido/cargado negativamente sustituido por otro aminoácido polar ácido/cargado negativamente (por ejemplo, Asp o Glu), un aminoácido con una cadena lateral apolar sustituido por otro aminoácido con una cadena lateral apolar (por ejemplo, Ala, Gly, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Cys, Val, etc.), un aminoácido polar básico/cargado positivamente sustituido por otro aminoácido polar básico/cargado positivamente (por ejemplo, Lys, His, Arg, etc.), un aminoácido no cargado con una cadena lateral polar sustituido por otro aminoácido no cargado con una cadena lateral polar (por ejemplo, Asn, Gin, Ser, Thr, Tyr, etc.), un aminoácido con una cadena lateral con ramificación beta sustituido por otro aminoácido con una cadena lateral con ramificación beta (por ejemplo, Ile, Thr y Val), un aminoácido con una cadena lateral aromática sustituido por otro aminoácido con una cadena lateral aromática (por ejemplo, His, Phe, Trp y Tyr) etc.
El CAR puede consistir esencialmente en la secuencia o secuencias de aminoácidos especificadas descritas en este documento, de modo que otros componentes, por ejemplo, otros aminoácidos, no cambien materialmente la actividad biológica de la variante funcional.
Los CAR (incluyendo partes funcionales y variantes funcionales) pueden ser de cualquier longitud, es decir, pueden comprender cualquier número de aminoácidos, con la condición de que los CAR (o partes funcionales o variantes funcionales de los mismos) retengan su actividad biológica, por ejemplo, la capacidad de unirse específicamente al antígeno, detectar células enfermas en un mamífero o tratar prevenir una enfermedad en un mamífero, etc. Por ejemplo, el CAR puede ser de aproximadamente 50 a aproximadamente 5000 aminoácidos de longitud, tal como de 50, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o más aminoácidos de longitud.
Los CAR (incluyendo partes funcionales y variantes funcionales de la invención) pueden comprender aminoácidos sintéticos en lugar de uno o más aminoácidos de origen natural. Dichos aminoácidos sintéticos son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, ácido aminociclohexano carboxílico, norleucina, ácido -amino n-decanoico, homoserina, S-acetilaminometil-cisteína, trans-3- y trans-4-hidroxiprolina, 4-aminofenilalanina, 4-nitrofenilalanina, 4-clorofenilalanina, 4-carboxifenilalanina, p-fenilserina, p-hidroxifenilalanina, fenilglicina, a-naftilalanina, ciclohexilalanina, ciclohexilglicina, ácido indolin-2-carboxílico, ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico, ácido aminomalónico, monoamida de ácido aminomalónico, N'-bencil-N'-metil-lisina, N',N'-dibencil-lisina, 6-hidroxilisina, ornitina, ácido-aminociclopentano carboxílico, ácido a-aminociclohexano carboxílico, ácido a-aminocicloheptano carboxílico, ácido a-(2-amino-2-norbornano)-carboxílico, ácido Y-diaminobutírico, ácido p-diaminopropiínico, homofenilalanina y a-terc-butilglicina.
Los CAR (incluyendo partes funcionales y variantes funcionales) pueden glucosilarse, amidarse, carboxilarse, fosforilarse, esterificarse, N-acilarse, ciclarse mediante, por ejemplo, un puente disulfuro o convertirse en una sal de adición de ácido y/u opcionalmente dimerizarse o polimerizarse, o conjugarse.
Los CAR (incluyendo partes funcionales y variante funcionales de los mismos) pueden obtenerse por métodos conocidos en la técnica. Los CAR pueden prepararse por cualquier método adecuado de preparación de polipéptidos o proteínas. Se describen métodos adecuados de síntesis de novo de polipéptidos y proteínas en las referencias, tales como Chan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, Reino Unido, 2000; Peptide and Protein Drug Analysis, ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, ed. Westwood et al., Oxford University Press, Oxford, Reino Unido, 2001; y patente de Estados Unidos 5449752. Además, los péptidos y proteínas pueden producirse de forma recombinante usando los ácidos nucleicos descritos en este documento usando métodos recombinantes convencionales. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3.a ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001; y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates y John Wiley & Sons, NY, 1994. Además, algunos de los CAR (incluyendo partes funcionales y variantes funcionales de los mismos) pueden aislarse y/o purificarse de una fuente, tal como una planta, una bacteria, un insecto, un mamífero, por ejemplo, una rata, un ser humano, etc. Los métodos de aislamiento y purificación son bien conocidos en la técnica. Como alternativa, los CAR descritos en este documento (incluyendo partes funcionales y variantes funcionales de los mismos) pueden sintetizarse comercialmente por empresas. A este respecto, los CAR pueden ser sintéticos, recombinantes, aislados y/o purificados.
B. Anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno
Un aspecto además un CAR, un linfocito T que expresa un CAR, un anticuerpo o dominio de unión a antígeno o parte del mismo, que se une específicamente a uno o más de los antígenos divulgados en este documento. Como se usa en este documento, un "linfocito T que expresa un CAR" o un "linfocito T CAR" significa un linfocito T que expresa un CAR y tiene una especificidad antigénica determinada por, por ejemplo, el dominio de dirección derivado del anticuerpo del CAR.
Como se usa en este documento, un "dominio de unión a antígeno" puede incluir un anticuerpo y fragmentos de unión a antígeno del mismo. El término "anticuerpo" se usa en este documento en el sentido más amplio y abarca diversas estructuras de anticuerpo incluyendo, aunque sin limitación, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, siempre que muestren la actividad de unión a antígeno deseada. Ejemplos no limitantes de anticuerpos incluyen, por ejemplo, inmunoglobulinas intactas y variantes y fragmentos de las mismas conocidos en la técnica que retienen la afinidad de unión por antígeno.
Un "anticuerpo monoclonal" es un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que componen la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades mínimas. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos, estando dirigidos contra un solo epítopo antigénico. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar que requiere producción del anticuerpo por ningún método particular. En algunos ejemplos, un anticuerpo monoclonal es un anticuerpo producido por un solo clon de linfocitos B o por una célula en que se ha transfectado ácido nucleico codificante de las regiones variables ligeras y pesadas de un solo anticuerpo (o un fragmento de unión a antígeno del mismo) o una descendencia de la misma. En algunos ejemplos, los anticuerpos monoclonales se aíslan de un sujeto. Los anticuerpos monoclonales pueden tener sustituciones aminoacídicas conservativas que no tienen sustancialmente ningún efecto sobre la unión al antígeno u otras funciones de la inmunoglobulina. Métodos ejemplares de producción de anticuerpos monoclonales son conocidos, por ejemplo, véase Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, 2-a ed. Cold Spring Harbor Publications, Nueva York (2013).
Típicamente, una inmunoglobulina tiene cadenas pesadas (H) y cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Los genes de inmunoglobulina incluyen los genes de la región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como la miríada de genes del dominio variable de inmunoglobulina. Hay dos tipos de cadena ligera, lambda (A) y kappa (k). Hay cinco clases de cadena pesada principal (o isotipos) que determinan la actividad funcional de una molécula de anticuerpo: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE.
Cada cadena pesada y ligera contiene una región constante (o dominio constante) y una región variable (o dominio variable; véase, por ejemplo, Kindt et al., Kuby Immunology, 6.a ed., W.H. Freeman y Co., página 91 (2007)). En varias realizaciones, las regiones variables de la cadena pesada y ligera se combinan para unirse específicamente al antígeno. En realizaciones adicionales, únicamente se requiere la región variable de la cadena pesada. Por ejemplo, anticuerpos de camélido de origen natural que consisten en una cadena pesada únicamente son funcionales y estables en ausencia de cadena ligera (véase, por ejemplo, Hamers-Casterman et al., Nature, 363:446-448, 1993; Sheriff et al., Nat. Struct. Biol., 3:733-736, 1996). Referencias a "VH" o "VH" se refieren a la región variable de una cadena pesada de anticuerpo, incluyendo la de un fragmento de unión a antígeno, tal como Fv, scFv, dsFv o Fab. Referencias a "VL o "VL" se refieren al dominio variable de una cadena ligera de anticuerpo, incluyendo la de un Fv, scFv, dsFv o Fab.
Las regiones variables de la cadena ligera y pesada contienen una región "estructural" interrumpida por tres regiones hipervariables, también denominadas "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR" (véase, por ejemplo, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Las secuencias de las regiones estructurales de diferentes cadenas ligeras o pesadas están relativamente conservadas dentro de una especie. La región estructural de un anticuerpo, que son las regiones estructurales combinadas de las cadenas ligeras y pesadas constituyentes, sirve para colocar y alinear las CDR en el espacio tridimensional.
Las CDR son principalmente responsables de la unión a un epítopo de un antígeno. Los límites de la secuencia de aminoácidos de una CDR dada pueden determinarse fácilmente usando cualquiera de varios esquemas bien conocidos, incluyendo los descritos por Kabat et al. ("Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991; esquema de numeración de "Kabat"), Al-Lazikani et al., (JMB 273,927-948, 1997; esquema de numeración de "Chothia") y Lefranc et al. ("IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains," Dev. Comp. Immunol., 27:55-77, 2003; esquema de numeración "IMGT"). Las CDR de cada cadena típicamente se denominan CDR1, CDR2 y CDR3 (del extremo N al extremo C), y también se identifican típicamente por la cadena en que está localizada la CDR particular. Por tanto, una CDR3 de VH es la CDR3 del dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo en que se encuentra, mientras que una CDR1 de VL es la CDR1 del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo en que se encuentra. Las CDR de la cadena ligera a veces se denominan LCDR1, LCDR2 y LCDR3. Las CDR de la cadena pesada a veces se denominan LCDR1, LCDR2 y LCDR3.
Un "fragmento de unión a antígeno" es una parte de un anticuerpo de longitud completa que retiene la capacidad de reconocer específicamente el antígeno afín, así como diversas combinaciones de dichas partes. Ejemplos no limitantes de fragmentos de unión a antígeno incluyen Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenarias (por ejemplo, scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados por fragmentos de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos de unión a antígeno producidos por la modificación de anticuerpos completos o los sintetizados de novo usando metodologías de ADN recombinante (véase, por ejemplo, Kontermann y Dubel (Ed), Antibody Engineering, Vol. 1-2, 2.a Ed., Springer Press, 2010).
Un anticuerpo monocatenario (scFv) es una molécula genomanipulada que contiene los dominios VH y VL de uno o más anticuerpos unidos por un conector polipeptídico adecuado como una molécula monocatenaria genéticamente fusionada (véase, por ejemplo, Bird et al., Science, 242:423 426, 1988; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85:5879 5883, 1988; Ahmad et al., Clin. Dev. Immunol., 2012, doi:10.1155/2012/980250; Marbry, IDrugs, 13:543-549, 2010). La orientación intramolecular del dominio VH y el dominio VL en un scFv, típicamente no es decisiva para los scFv. Por tanto, pueden usarse scFv con ambas posibles disposiciones (dominio VH-dominio conector-dominio-VL; dominio VL-dominio conector-dominio-VH).
En un dsFv, las cadenas variables de la cadena pesada y ligera se han mutado para introducir un enlace disulfuro para estabilizar la asociación de las cadenas. También se incluyen diacuerpos, que son anticuerpos bivalentes, biespecíficos en que los dominios VH y VL se expresan en una sola cadena polipeptídica, pero usando un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, forzando de ese modo a que los dominios se emparejen con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión a antígeno (véase, por ejemplo, Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90:6444 6448, 1993; Poljak et al., Structure, 2:1121 1123, 1994).
Los anticuerpos también incluyen formas genomanipuladas tales como anticuerpos quiméricos (tales como anticuerpos murinos humanizados) y anticuerpos heteroconjugados (tales como anticuerpos biespecíficos). Véase también, Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3.a Ed., W.H. Freeman & Co., Nueva York, 1997.
Pueden construirse anticuerpos que no son de origen natural usando síntesis peptídica en fase sólida, pueden producirse de forma recombinante o pueden obtenerse, por ejemplo, por cribado de colecciones combinatorias que consisten en cadenas pesadas variables y cadenas ligeras variables como se describe por Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989). Estos y otros métodos de preparación, por ejemplo, de anticuerpos quiméricos, humanizados, con CDR injertadas, monocatenarios y bifuncionales, son bien conocidos por los expertos en la materia (Winter y Harris, Immunol. Today 14:243-246 (1993); Ward et al., Nature 341:544-546 (1989); Harlow y Lane, supra, 1988; Hilyard et al., Protein Engineering: A practical approach (IRL Press 1992); Borrabeck, Antibody Engineering, 2.a ed. (Oxford University Press 1995).
Un "anticuerpo que se une al mismo epítopo" como anticuerpo se referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competición en un 50 % o más, y a la inversa, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un ensayo de competición en un 50 % o más. Los ensayos de competición de anticuerpos son conocidos y en este documento se proporciona un ensayo de competición ejemplar.
Un anticuerpo "humanizado" o fragmento de unión a antígeno incluye una región estructural humana y una o más CDR de un anticuerpo no humano (tal como de ratón, rata o sintético) o fragmento de unión a antígeno. El anticuerpo no humano o fragmento de unión a antígeno que proporciona las CDR se denomina "donador" y el anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno que proporciona la región estructural se denomina "aceptador". En una realización, todas las CDR son de la inmunoglobulina donadora en una inmunoglobulina humanizada. Las regiones constantes no tienen que estar presentes, pero si están, pueden ser sustancialmente idénticas a las regiones constantes de inmunoglobulina humana, tal como al menos aproximadamente un 85-90 %, tal como aproximadamente un 95 % o más idénticas. Por tanto, todas las partes de un anticuerpo humanizado o fragmento de unión a antígeno, excepto posiblemente las CDR, son sustancialmente idénticas a las partes correspondientes de secuencias de anticuerpo humano naturales.
Un "anticuerpo quimérico" es un anticuerpo que incluye secuencias derivadas de dos anticuerpos diferentes, que típicamente son de diferente especie. En algunos ejemplos, un anticuerpo quimérico incluye una o más CDR y/o regiones estructurales de un anticuerpo humano y c Dr y/o regiones estructurales de otro anticuerpo humano.
Un "anticuerpo completamente humano" o "anticuerpo humano" es un anticuerpo que incluye secuencias de (o derivadas de) el genoma humano y no incluye secuencias de otra especie. En algunas realizaciones, un anticuerpo humano incluye CDR, regiones estructurales y (si está presente) una región Fc de (o derivadas de) el genoma humano. Los anticuerpos humanos pueden identificarse y aislarse usando tecnologías para crear anticuerpos basados en secuencias derivadas del genoma humano, por ejemplo, por presentación en fagos o usando animales transgénicos (véase, por ejemplo, Barbas et al. Phage display: A Laboratory Manuel. 1.a Ed. Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2004. Print.; Lonberg, Nat. Biotech., 23: 1117-1125, 2005; Lonenberg, Curr. Opin. Immunol., 20:450-459, 2008).
Un anticuerpo puede tener uno o más sitios de unión. Si hay más de un sitio de unión, los sitios de unión pueden ser idénticos entre sí o pueden ser diferentes. Por ejemplo, una inmunoglobulina de origen natural tiene dos sitios de unión idénticos, un anticuerpo monocatenario o fragmento Fab tiene un sitio de unión, mientras que un anticuerpo biespecífico o bifuncional tiene dos sitios de unión diferentes.
Los métodos de ensayo de anticuerpos para la capacidad de unirse a cualquier parte funcional del CAR son conocidos en la técnica e incluyen cualquier ensayo de unión de anticuerpo-antígeno tal como, por ejemplo, radioinmunoensayo (RIA), ELISA, transferencia de Western, inmunoprecipitación y ensayos de inhibición competitiva (véase, por ejemplo, Janeway et al., infra, publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2002/0197266 A1, y patente de Estados Unidos n.° 7338 929).
Además, un CAR, un linfocito T que expresa un CAR, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede ser que comprenda un marcador detectable tal como, por ejemplo, un radioisótopo, un fluoróforo (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE)), una enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano rusticano) y partículas de elementos (por ejemplo, partículas de oro).
C. Conjugados
Un CAR, un linfocito T que expresa un CAR o anticuerpos monoclonales, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, específicos para uno o más de los antígenos divulgados en este documento pueden conjugarse con un agente, tal como una molécula efectora o marcador detectable usando muchos medios conocidos por los expertos en la materia. Pueden usarse medios de fijación tanto covalentes como no covalentes. Los conjugados incluyen, aunque sin limitación, moléculas en que hay un enlace covalente de una molécula efectora o un marcador detectable con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une específicamente a uno o más de los antígenos divulgados en este documento. Un experto en la materia apreciará que pueden usarse diversas moléculas efectoras y marcadores detectables incluyendo (aunque sin limitación) agentes quimioterápicos, agentes antiangiogénicos, toxinas, agentes radiactivos tales como 125I, 32P, 14C, 3H y 35S y otros marcadores, restos diana y ligandos, etc.
La elección de una molécula efectora particular o marcador detectable depende de la molécula diana o célula particular y el efecto biológico deseado. Por tanto, por ejemplo, la molécula efectora puede ser una citotoxina que se usa para conseguir la muerte de una célula diana particular (tal como una célula tumoral).
El procedimiento para fijar una molécula efectora o marcador detectable a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno varía de acuerdo con la estructura química del efector. Los polipéptidos típicamente contienen una diversidad de grupos funcionales; tal como ácido carboxílico (COOH), amina libre (NH2) o grupos sulfhidrilo (-SH), que están disponibles para la reacción con un grupo funcional adecuado en un anticuerpo para provocar la unión de la molécula efectora o marcador detectable. Como alternativa, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se derivatiza para exponer o fijar grupos funcionales reactivos adicionales. La derivatización puede implicar la fijación de cualquiera de varias moléculas conectoras conocidas tales como las disponibles en Pierce Chemical Company, Rockford, IL. El conector puede ser cualquier molécula usada para unir el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno a la molécula efectora o marcador detectable. El conector puede formar enlaces covalentes tanto con el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno como con la molécula efectora o marcador detectable. Los conectores adecuados son bien conocidos por los expertos en la materia e incluyen, aunque sin limitación, conectores de carbono lineales o de cadena ramificada, conectores de carbono heterocíclicos o conectores peptídicos. Cuando el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno y la molécula efectora o marcador detectable son polipéptidos, los conectores pueden unirse a los aminoácidos constituyentes a través de sus grupos laterales (tal como a través de un enlace disulfuro a cisteína) o a los grupos amino y carboxilo de carbono alfa de los aminoácidos terminales.
En varias realizaciones, el conector puede incluir un elemento espaciador que, cuando está presente, aumenta el tamaño del conector de modo que la distancia entre la molécula efectora o el marcador detectable y el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se aumente. Los espaciadores ejemplares son conocidos por los expertos en la materia e incluyen los enumerados en las patentes de Estados Unidos n.° 7 964 566 7 498 298, 6884 869, 6 323 315, 6 239 104, 6034 065, 5780 588, 5 665 860, 5 663 149, 5635 483, 5 599 902, 5 554 725, 5530 097, 5521 284, 5 504 191, 5410 024, 5138 036, 5076 973, 4986 988, 4978 744, 4879 278, 4816 444 y 4486 414, así como las publicaciones de patente de Estados Unidos n.° 20110212088 y 0110070248.
En algunos aspectos, el conector es escindible en condiciones intracelulares, de modo que la escisión del conector libere la molécula efectora o el marcador detectable del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno en el entorno intracelular. En otros aspectos más, el conector no es escindible y la molécula efectora o marcador detectable se libera, por ejemplo, por degradación del anticuerpo. En algunos aspectos, el conector es escindible por un agente de escisión que está presente en el entorno intracelular (por ejemplo, dentro de un lisosoma o endosoma o caveola). El conector puede ser, por ejemplo, un conector peptídico que se escinde por una enzima peptidasa o proteasa intracelular incluyendo, aunque sin limitación, una proteasa lisosómica o endosómica. En algunos aspectos, el conector peptídico es de al menos dos aminoácidos de longitud o al menos tres aminoácidos de longitud. Sin embargo, el conector puede ser de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos de longitud, tal como de 1 -2, 1 -3, 2-5, 3­ 10, 3-15, 1-5, 1-10, 1-15 aminoácidos de longitud. Las proteasas pueden incluir catepsinas B y D y plasmina, todas ellas conocidas por hidrolizar derivados de fármacos dipeptídicos produciendo la liberación de fármaco activo dentro de las células diana (véase, por ejemplo, Dubowchik y Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123). Por ejemplo, puede usarse un conector peptídico que es escindible por la proteasa dependiente de tiol catepsina B (por ejemplo, un conector de fenilalanina-leucina o de glicina-fenilalanina-leucina-glicina). Otros ejemplos de dichos conectores se describen, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos n.° 6214 345. En un aspecto específico, el conector peptídico escindible por una proteasa intracelular es un conector de valina-citrulina o un conector de fenilalanina-lisina (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 6214345, que describe la síntesis de doxorrubicina con el conector de valina-citrulina).
En otros aspectos, el conector escindible es sensible al pH, es decir, sensible a la hidrólisis a determinados valores de pH. Típicamente, el conector sensible al pH es hidrolizable en condiciones ácidas. Por ejemplo, puede usarse un conector inestable en ácido que es hidrolizable en el lisosoma (por ejemplo, una hidrazona, semicarbazona, tiosemicarbazona, amida cis aconítica, ortoéster, acetal, cetal o similares). (Véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 5122368; 5 824 805; 5622 929; Dubowchik y Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661). Dichos conectores son relativamente estables en condiciones de pH neutro, tales como las de la sangre, pero son inestables por debajo de pH 5,5 o 5,0, el pH aproximado del lisosoma. En determinados aspectos, el conector hidrolizable es un conector tioéter (tal como, por ejemplo, un tioéter fijado al agente terapéutico mediante un enlace acilhidrazona (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 5622 929).
En otros aspectos, el conector es escindible en condiciones reductoras (por ejemplo, un conector disulfuro). Una diversidad de conectores disulfuro se conoce en la técnica incluyendo, por ejemplo, los que pueden formarse usando SATA N-succinimidil-S-acetiltioacetato), SPDP (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato), s Pd B (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)butirato) y SMPT (N-succinimidil-oxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridil-diiio)tolueno), SPDB y SMPT. (Véase, por ejemplo, Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak et al., en Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987); Phillips et al., Cancer Res. 68:92809290, 2008). Véase también la patente de Estados Unidos n.° 4880935).
En otros aspectos más, el conector es un conector de malonato (Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93), un conector de maleimidobenzoílo (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1299-1304) o un análogo de 3'-N-amida (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1305-12).
En otros aspectos más, el conector no es escindible y la molécula efectora o marcador detectable se libera por degradación del anticuerpo. (Véase la publicación de Estados Unidos n.° 2005/0238649).
En varios aspectos, el conector es resistente a escisión en un entorno extracelular. Por ejemplo, no más de aproximadamente un 20 %, no más de aproximadamente un 15 %, no más de aproximadamente un 10 %, no más de aproximadamente un 5 %, no más de aproximadamente un 3 % o no más de aproximadamente un 1 % de los conectores, en una muestra de conjugado, se escinden cuando el conjugado está presente en un entorno extracelular (por ejemplo, en plasma). Que un conector sea resistente o no a la escisión en un entorno extracelular puede determinarse, por ejemplo, incubando el conjugado que contiene el conector de interés con plasma durante un periodo de tiempo predeterminado (por ejemplo, 2, 4, 8, 16 o 24 horas) y después cuantificando la cantidad de molécula efectora libre o marcador detectable presente en el plasma. Una diversidad de conectores ejemplares que pueden usarse en conjugados se describe en el documento WO 2004-010957, la publicación de Estados Unidos n.° 2006/0074008, la publicación de Estados Unidos n.° 20050238649 la publicación de Estados Unidos n.° 2006/0024317.
En varios aspectos, se divulgan conjugados de un CAR, un linfocito T que expresa un CAR, un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo y una o más toxinas de molécula pequeña tales como calicheamicina, maitansinoides, dolastatinas, auristatinas, un tricoteceno y CC1065, y los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina.
Los compuestos de maitansina adecuados para su uso como restos de toxina maitansinoide son bien conocidos en la técnica y pueden aislarse de fuentes naturales de acuerdo con métodos conocidos, producirse usando técnicas de genomanipulación (véase, Yu et al. (2002) PNAS 99:7968-7973) o maitansinol y análogos de maitansinol preparados sintéticamente de acuerdo con métodos conocidos. Los maitansinoides son inhibidores mitóticos^ que actúan inhibiendo la polimerización de la tubulina. La maitansina se aisló por primera vez del arbusto de África oriental Maytenus serrata (patente de Estados Unidos n.° 3 896 111). Posteriormente, se descubrió que determinados microbios también producen maitansinoides, tales como maitansinol y ésteres de maitansinol C-3 (patente de Estados Unidos n.° 4 151 042). El maitansinol sintético y derivados y análogos del mismo se divulgan, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos n.2 4 137230; 4 248 870; 4 256 746; 4260 608; 4265 814; 4 294 757; 4 307 016; 4 308 268; 4 308 269; 4309 428; 4 313 946; 4315 929; 4 317 821; 4 322 348; 4 331 598; 4361 650; 4364 866; 4 424 219; 4450 254; 4362 663 y 4371 533. Se divulgan conjugados que contienen maitansinoides, métodos de preparación de los mismos y su uso terapéutico, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos n.° 5208 020; 5 416 064; 6441 163 y la patente europea EP 0425235 B1.
Pueden emplearse toxinas adicionales con un CAR, un linfocito T que expresa un CAR, un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo. Las toxinas ejemplares incluyen exotoxina de Pseudomonas (PE), ricina, abrina, toxina diftérica y subunidades de la misma, ribotoxina, ribonucleasa, saporina y calicheamicina, así como las toxinas botulínicas A a F. Estas toxinas son bien conocidas en la técnica y muchas están fácilmente disponibles en fuentes comerciales (por ejemplo, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO). Las toxinas contempladas también incluyen variantes de las toxinas (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 5079 163 y 4689 401).
La saporina es una toxina derivada de Saponaria officinalis que altera la síntesis proteínica inactivando la parte 60S del complejo ribosómico (Stirpe et al., Bio/Technology, 10:405-412, 1992). Sin embargo, la toxina no tiene mecanismo de entrada específica en células y, por lo tanto, requiere conjugación con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que reconozca una proteína de superficie celular que se internaliza para captarse de manera eficaz por las células.
La toxina diftérica se aísla de Corynebacterium diphtheriae. Típicamente, la toxina diftérica para su uso en inmunotoxinas se muta para reducir o eliminar la toxicidad no específica. Un mutante conocido como tal, CRM107 que tiene actividad enzimática completa, pero toxicidad no específica notablemente reducida, se ha conocido desde la década de 1970 (Laird y Groman, J. Virol. 19:220, 1976), y se ha usado en ensayos clínicos en seres humanos. Véase la patente de Estados Unidos n.° 5792 458 y la patente de Estados Unidos n.° 5208 021.
La ricina es la lectina RCA60 de Ricinus communis (semilla de ricino). Para ejemplos de ricina, véase la patente de Estados Unidos n.° 5079 163 y la patente de Estados Unidos n.° 4689401. La aglutinina de Ricinus communis (RCA) se produce en dos formas denominadas RCA60 y RCA120 de acuerdo con sus pesos moleculares de aproximadamente 65 y 120 kDa, respectivamente (Nicholson y Blaustein, J. Biochim. Biophys. Acta 266:543, 1972). La cadena A es responsable de inactivar la síntesis proteínica y destruir células. La cadena B une la ricina a residuos de galactosa de superficie celular y facilita el transporte de la cadena A al citosol (Olsnes et al., Nature 249:627-631, 1974 y patente de Estados Unidos n.° 3060 165).
Las ribonucleasas también se han conjugado con moléculas de dirección para su uso como inmunotoxinas (véase Suzuki et al., Nat. Biotech. 17:265-70, 1999). Se analizan ribotoxinas ejemplares tales como a-sarcina y restrictocina en, por ejemplo, Rathore et al., Gene 190:31-5, 1997; y Goyal y Batra, Biochem. 345 Pt 2:247-54, 2000. Las calicheamicinas se aislaron por primera vez de Micromonospora echinospora y son miembros de la familia de antibióticos antitumorales de enediína que provocan roturas bicatenarias en el ADN que dan lugar a apoptosis (véase, por ejemplo, Lee et al., J. Antibiot. 42:1070-87,1989). El fármaco es el resto tóxico de una inmunotoxina en ensayos clínicos (véase, por ejemplo, Gillespie et al., Ann. Oncol. 11:735-41,2000).
La abrina incluye lectinas tóxicas de Abrus precatorius. Los principios tóxicos, abrina a, b, c y d tienen un peso molecular de aproximadamente 63 y 67 kDa y están compuestos de dos cadenas A y B polipeptídicas unidas por disulfuro. La cadena A inhibe la síntesis proteínica; la cadena B (abrina b) se une a residuos de D-galactosa (véase, Funatsu et al., Agr. Biol. Chem. 52:1095, 1988; y Olsnes, Methods Enzymol. 50:330-335, 1978).
Un CAR, un linfocito T que expresa un CAR, anticuerpos monoclonales, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, específicos para uno o más de los antígenos divulgados en este documento, también pueden conjugarse con un marcador detectable, por ejemplo, un marcador detectable con capacidad de detección por ELISA, espectrofotometría, citometría de flujo, microscopia o técnicas de imágenes de diagnóstico (tales como tomografía computarizada (TC), exploraciones de tomografía axial computarizada (TAC), imágenes de resonancia magnética (RM), imágenes de resonancia magnética nuclear (RMN), tomografía por resonancia magnética (TRM), ultrasonidos, examen por fibra óptica y examen laparoscópico). Ejemplos no limitantes específicos de marcadores detectables incluyen fluoróforos, agentes quimioluminiscentes, enlaces enzimáticos, isótopos radiactivos y metales pesados o compuestos (por ejemplo, nanocristales de óxido de hierro superparamagnéticos para la detección por RM). Por ejemplo, marcadores detectables útiles incluyen compuestos fluorescentes incluyendo fluoresceína, isotiocionato de fluoresceína, rodamina, cloruro de 5-dimetilamina-1-nafalensulfonilo, ficoeritrina, lantánidos fosforescentes y similares. Los marcadores bioluminiscentes también son de uso, tales como luciferasa, proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente amarilla (YFP). Un CAR, un linfocito T que expresa un CAR, un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo también puede conjugarse con enzimas que son útiles para la detección, tal como peroxidasa de rábano rusticano, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa y similares. Cuando un CAR, un linfocito T que expresa un CAR, un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo se conjuga con una enzima detectable, puede detectarse añadiendo reactivos adicionales que la enzima usa para producir un producto de reacción que puede discernirse. Por ejemplo, cuando el agente peroxidasa de rábano rusticano está presente, la adición de peróxido de hidrógeno y diaminobencina da lugar a un producto de reacción coloreado, que es visualmente detectable. Un CAR, un linfocito T que expresa un CAR, un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo también puede conjugarse con biotina y detectarse a través de medición indirecta de unión de avidina o estreptavidina. Debe apreciarse que la propia avidina puede conjugarse con una enzima o un marcador fluorescente.
Un CAR, un linfocito T que expresa un CAR, un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo puede conjugarse con un agente paramagnético, tal como gadolinio. Los agentes paramagnéticos tales como óxido de hierro superparamagnético también son de uso como marcadores. Los anticuerpos también pueden conjugarse con lantánidos (tal como europio y disprosio) y manganeso. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno también puede marcarse con un epítopo lipeptídico predeterminado reconocido por un indicador secundario (tal como secuencias de pares de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, marcas epitópicas).
Un CAR, un linfocito T que expresa un CAR, un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo también puede conjugarse con un aminoácido radiomarcado. El radiomarcador puede usarse con fines tanto de diagnóstico como terapéuticos. Por ejemplo, el radiomarcador puede usarse para detectar uno o más de los antígenos divulgados en este documento y células que expresan el antígeno por rayos X, espectros de emisión u otras técnicas de diagnóstico. Además, el radiomarcador puede usarse terapéuticamente como toxina para el tratamiento de tumores en un sujeto, por ejemplo, para el tratamiento de un neuroblastoma. Ejemplos de marcadores para polipéptidos incluyen, aunque sin limitación, los siguientes radioisótopos o radionucleótidos: 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I.
Los medios de detección de dichos marcadores detectables son bien conocidos por los expertos en la materia. Por tanto, por ejemplo, los radiomarcadores pueden detectarse usando película fotográfica o contadores de centelleo, los marcadores fluorescentes pueden detectarse usando un fotodetector para detectar la iluminación emitida. Los marcadores enzimáticos se detectan típicamente proporcionando a la enzima un sustrato y detectando el producto de reacción producido por la acción de la enzima sobre el sustrato, y los marcadores colorimétricos se detectan visualizando simplemente el marcador coloreado.
D. Nucleótidos, vectores de expresión y células hospedadoras
En este documento se divulga además un acido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de los CAR, un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo descrito en este documento (incluyendo partes funcionales y variantes funcionales de los mismos). La invención proporciona una molécula de acido nucleico aislada que codifica un CAR que comprende al menos un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende un dominio de unión al antígeno mesotelina codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 3, 5 o 7, al menos un dominio transmembranario y al menos un dominio de señalización intracelular. Los ácidos nucleicos de la invención pueden comprender una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de las secuencias líder, dominios transmembranarios y/o dominios de señalización de linfocitos T intracelular descritos en este documento.
Eb algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos puede estar modificada en los codones. Sin limitarse a una teoría particular, se cree que la optimización de codones de la secuencia de nucleótidos aumenta la eficacia de traducción de los transcritos de ARNm. La optimización de codones de la secuencia de nucleótidos puede implicar sustituir un codón natural por otro codón que codifique el mismo aminoácido, pero puede traducirse por ARNt que está más fácilmente disponible dentro de una célula, aumentado por tanto la eficacia de traducción. La optimización de la secuencia de nucleótidos también puede reducir las estructuras de ARNm secundarias que interferirían con la traducción, aumentando por tanto la eficacia de traducción.
En una realización de la invención, el ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos de codones modificados que codifica el dominio de unión a antígeno del CAR innovador.
"Ácido nucleico", como se usa en este documento, incluye "polinucleótido", "oligonucleótido" y "molécula de ácido nucleico" y en general significa un polímero de ADN o ARN, que puede ser monocatenario o bicatenario, sintetizado u obtenido (por ejemplo, aislado y/o purificado) de fuentes naturales, que puede contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados y que puede contener un enlace internucleotídico natural, no natural o alterado, tal como un enlace fósforoamidato o un enlace fósforotioato, en lugar del fosfodiéster encontrado entre los nucleótidos de un oligonucleótido no modificado. En algunas realizaciones, el ácido nucleico no comprende ninguna inserción, eliminación, inversión y/o sustitución. Sin embargo, puede ser adecuado en algunos casos, como se analiza en este documento, que el ácido nucleico comprenda una o más inserciones, eliminaciones, inversiones y/o sustituciones.
Un ácido nucleico recombinante puede ser uno que tenga una secuencia que no es de origen natural o tenga una secuencia que se genera por combinación artificial de dos segmentos de secuencia de lo contrario separados. Esta combinación artificial a menudo se consigue por síntesis química o, más comúnmente, por manipulación artificial de segmentos aislados de ácidos nucleicos, por ejemplo, por técnicas de genomanipulación, tales como las descritas en Sambrook et al., supra. Los ácidos nucleicos pueden construirse basándose en síntesis química y/o reacciones de ligamiento enzimático usando procedimientos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., supra, y Ausubel et al., supra. Por ejemplo, un ácido nucleico puede sintetizarse químicamente usando nucleótidos de origen natural o nucleótidos modificados de manera variada diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física de la estructura bicatenaria formada tras hibridación (por ejemplo, derivados fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina). Ejemplos de nucleótidos modificados que pueden usarse para generar los ácidos nucleicos incluyen, aunque sin limitación, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil) uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1 - metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, adenina N6 sustituida, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-mannosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wibutoxosina, seudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo y 2,6-diaminopurina. Como alternativa, puede adquirirse uno o más de los ácidos nucleicos de la invención de empresas, tal como Integrated DNA Technologies (Coralville, IA, EE. UU.).
También se divulga en este documento un ácido nucleico aislado o purificado que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en este documento o una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en este documento.
La secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas puede hibridar en condiciones de alta rigurosidad. Por "condiciones de alta rigurosidad" se entiende que la secuencia de nucleótidos hibrida específicamente con una secuencia diana (la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en este documento) en una cantidad que es detectablemente más fuerte que la hibridación no específica. Las condiciones de alta rigurosidad incluyen condiciones que distinguirían un polinucleótido con una secuencia complementaria exacta, o una que contuviera solamente unos pocos emparejamientos incorrectos dispersos de una secuencia aleatoria que resultara que tuviera unas pocas regiones pequeñas (por ejemplo, 3-10 bases) que coincidieran con la secuencia de nucleótidos. Dichas regiones pequeñas de complementariedad se funden más fácilmente que un complemento de longitud completa de 14-17 o más bases, y la hibridación de alta rigurosidad las hace fácilmente distinguibles. Las condiciones de rigurosidad relativamente alta incluirían, por ejemplo, condiciones de bajo contenido salino y/o alta temperatura, tal como se proporciona por NaCl aproximadamente 0,02-0,1 M o equivalente, a temperaturas de aproximadamente 50-70 °C. Dichas condiciones de alta rigurosidad toleran pocos, si acaso, emparejamientos incorrectos entre la secuencia de nucleótidos y el molde o hebra diana, y sin particularmente adecuadas par detectar la expresión de cualquiera de los CAR innovadores. En general se aprecia que las condiciones pueden volverse más rigurosas por la adición de cantidades crecientes de formamida.
También se divulga un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente un 70 % o más, por ejemplo, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 % idéntica a cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en este documento.
En una realización, los ácidos nucleicos de la invención pueden incorporarse en un vector de expresión recombinante.
Para los propósitos de este documento, la expresión "vector de expresión recombinante" significa una construcción oligonucleotídica o polinucleotídica genéticamente modificada que permite la expresión de un ARNm, proteína, polipéptido o péptido por una célula hospedadora cuando la construcción comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el ARNm, proteína, polipéptido o péptido, y el vector se pone en contacto con la célula en condiciones suficientes para tener el ARNm, proteína, polipéptido o péptido expresado dentro de la célula. Los vectores no son de origen natural como conjunto.
Sin embargo, partes de los vectores pueden ser de origen natural. Los vectores de expresión recombinantes pueden comprender cualquier tipo de nucleótidos incluyendo, aunque sin limitación, ADN y ARN, que pueden ser monocatenarios o bicatenarios, sintetizados u obtenidos en parte de fuentes naturales, y que pueden contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados. Los vectores de expresión recombinantes pueden comprender enlaces internucleotídicos de origen natural o que no son de origen natural o ambos tipos de enlaces. Preferiblemente, los nucleótidos o enlaces internucleotídicos que no son de origen natural o alterados no impiden la transcripción o replicación del vector.
En una realización, el vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector de expresión recombinante adecuado y puede usarse para transformar o transfectar cualquier célula hospedadora adecuada. Los vectores adecuados incluyen los diseñados para la propagación y expansión o para la expresión o ambas, tales como plásmidos y virus. El vector puede seleccionarse del grupo que consiste en la serie pUC (Fermentas Life Sciences, Glen Burnie, MD), la serie pBluescript (Stratagene, LaJolla, CA), la serie pET (Novagen, Madison, WI), la serie pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) y la serie pEX (Clontech, Palo Alto, CA).
También pueden usarse vectores bacteriófagos, tales como Aaí’TIO, A'óTI 1, AZapll (Stratagene), EMBL4 y ANMI 149. Ejemplos de vectores de expresión de plantas incluyen pBIOl, pBI101.2, pBHOl .3, pBI121 y pBIN19 (Clontech). Ejemplos de vectores de expresión de animales incluyen pEUK-Cl, pMAM y pMAMneo (Clontech). El vector de expresión recombinante puede ser un vector vírico, por ejemplo, un vector retrovírico o un vector lentivírico. Un vector lentivírico es un vector derivado de al menos una parte de un genoma lentivírico, incluyendo especialmente un vector lentivírico de autoinactivación como se proporciona en Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009). Otros ejemplos de vectores lentivíricos que pueden usarse en clínica incluyen, por ejemplo, y no a modo de limitación, la tecnología de suministro génico LENTIVECTOR.RTM. de Oxford BioMedica plc, el sistema de vector LENTIMAX.TM. de Lentigen y similares. Tipos no clínicos de vectores lentivíricos también están disponibles y serían conocidos por los expertos en la materia.
Varias técnicas de transfección son conocidas en general en la técnica (véase, por ejemplo, Graham et al., Virology, 52: 456-467 (1973); Sambrook et al., supra; Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier (1986); y Chu et al, Gene, 13: 97 (1981).
Los métodos de transfección incluyen coprecipitación con fosfato de calcio (véase, por ejemplo, Graham et al., supra), microinyección directa en células cultivadas (véase, por ejemplo, Capecchi, Cell, 22: 479-488 (1980)), electroporación (véase, por ejemplo, Shigekawa et al., BioTechniques, 6: 742-751 (1988)), transferencia génica mediada por liposomas (véase, por ejemplo, Mannino et al., BioTechniques, 6: 682-690 (1988)), transducción mediada por lípido (véase, por ejemplo, Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413-7417 (1987)) y suministro de ácidos nucleicos usando microproyectiles de alta velocidad (véase, por ejemplo, Klein et al, Nature, 327: 70-73 (1987)).
En una realización, los vectores de expresión recombinantes pueden prepararse usando técnicas convencionales de ADN recombinante descritas en, por ejemplo, Sambrook et al., supra y Ausubel et al., supra. Las construcciones de vectores de expresión, que son circulares o lineales, pueden prepararse para que contengan un sistema de replicación funcional en una célula hospedadora procariota o eucariota. Los sistemas de replicación pueden obtenerse, por ejemplo, de ColEl, plásmido 2 p, A, SV40, virus del papiloma bovino y similares.
El vector de expresión recombinante puede comprender secuencias reguladoras, tales como codones de inicio y terminación de la transcripción y la traducción, que son específicos para el tipo de célula hospedadora (por ejemplo, bacteria, hongo, planta o animal) en que tiene que introducirse el vector, según lo apropiado, y teniendo en consideración si el vector está basado en ADN o ARN. El vector de expresión recombinante puede comprender sitios de restricción para facilitar la clonación.
El vector de expresión recombinante puede incluir uno o más genes marcadores, que permiten la selección de células hospedadoras transformadas o transfectadas. Los genes marcadores incluyen resistencia a biocidas, por ejemplo, resistencia a antibióticos, metales pesados, etc., complementación en un hospedador auxotrófico para proporcionar prototrófia y similares. Los genes marcadores adecuados para los vectores de expresión innovadores incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a neomicina/G418, genes de resistencia a higromicina, genes de resistencia a histidinol, genes de resistencia a tetraciclina y genes de resistencia a ampicilina.
El vector de expresión recombinante puede comprender un promotor natural o no natural unido de forma funcional a la secuencia de nucleótidos que codifica el CAR (incluyendo partes funcionales y variantes funcionales del mismo) o a la secuencia de nucleótidos que es complementaria a o que hibrida con la secuencia de nucleótidos que codifica el CAR. La selección de promotores, por ejemplo, fuertes, débiles, inducibles, específicos de tejidos y específicos del desarrollo, pertenece a las habilidades normales del experto. Asimismo, la combinación de una secuencia de nucleótidos con un promotor también pertenece a las habilidades del experto. El promotor puede ser un promotor no vírico o un promotor vírico, por ejemplo, un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor de SV40, un promotor de RSV o un promotor encontrado en la repetición terminal larga del virus de células madre murinas.
Los vectores de expresión recombinantes pueden diseñarse para expresión transitoria, para expresión estable o para ambas. Además, los vectores de expresión recombinantes pueden prepararse para expresión constitutiva o para expresión inducible.
Además, los vectores de expresión recombinantes pueden prepararse para que incluyan un gen suicida. Como se usa en este documento, la expresión "gen suicida" se refiere a un gen que provoca que la célula que expresa el gen suicida muera. El gen suicida puede ser un gen que confiere sensibilidad a un agente, por ejemplo, un fármaco, sobre la célula en que se expresa el gen y provoca que la célula muera cuando la célula se pone en contacto con o se expone al agente. Los genes suicidas son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Suicide Gene Therapy: Methods and Reviews, Springer, Caroline J. (Cancer Research R.U. Centre for Cancer Therapeutics at the Institute of Cancer Research, Sutton, Surrey, R.U.), Humana Press, 2004) e incluyen, por ejemplo, el gen de la timidina cinasa (HSV) del virus del herpes simple (VHS), citosina desaminasa, nucleósido purínico fosforilasa y nitrorreductasa.
Una realización proporciona además una célula hospedadora que comprende cualquiera de los vectores de expresión recombinantes de la invención.
Como se usa en este documento, la expresión "célula hospedadora" se refiere a cualquier tipo de célula que puede contener el vector de expresión recombinantes innovador. La célula hospedadora puede ser una célula eucariota, por ejemplo, vegetal, animal, fúngica o algácea, o puede ser una célula procariota, por ejemplo, bacterias o protozoos. La célula hospedadora puede ser una célula cultivada o una célula primaria, es decir, aislada directamente de un organismo, por ejemplo, un ser humano. La célula hospedadora puede ser una célula adherente o una célula suspendida, es decir, una célula que crece en suspensión. Las células hospedadoras adecuadas son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, células de E coli DH5a, células de ovario de hámster chino, células VERO de mono, células COS, células HEK293 y similares. Con el propósito de amplificar o replicar el vector de expresión recombinante, la célula hospedadora puede ser una célula procariota, por ejemplo, una célula DH5a. Con el propósito de producir un CAR recombinante, la célula hospedadora puede ser una célula de mamífero. La célula hospedadora puede ser una célula humana. Aunque la célula hospedadora puede ser de cualquier tipo celular, puede originarse a partir de cualquier tipo de tejido y puede ser de cualquier fase del desarrollo, la célula hospedadora puede ser un linfocito de la sangre periférica (PBL) o un linfocito monomorfonucleado de la sangre periférica (PBMC). La célula hospedadora puede ser un linfocito T.
Para los propósitos de este documento, el linfocito T puede ser cualquier linfocito T, tal como un linfocito T cultivado, por ejemplo, un linfocito T primario o un linfocito T de una línea cultivada de linfocitos T, por ejemplo, Jurkat, SupTl, etc. o un linfocito T obtenido de un mamífero. Si se obtiene de un mamífero, el linfocito T puede obtenerse de numerosas fuentes incluyendo, aunque sin limitación, sangre, médula ósea, ganglio linfático, el timo u otros tejidos o líquidos. Los linfocitos T también pueden enriquecerse o purificarse. El linfocito T puede ser un linfocito T humano. El linfocito T puede ser un linfocito T aislado de un ser humano. El linfocito T puede ser cualquier tipo de linfocito T y puede ser de cualquier fase del desarrollo incluyendo, aunque sin limitación, linfocitos T doble positivos CD4+/CD8+, linfocitos T auxiliares CD4+, por ejemplo, linfocitos Thi y Th2, linfocitos T CD8+ (por ejemplo, linfocitos T citotóxicos), células de infiltración tumoral, linfocitos T de memoria, linfocitos T vírgenes y similares. El linfocito T puede ser un linfocito T CD8+ o un linfocito T CD4+.
En una realización, los CAR de la invención pueden usarse en células que no son linfocito T adecuadas. Dichas células son aquellas con una función inmunoefectora tal como, por ejemplo, linfocitos NK y células similares a linfocitos T generadas a partir de células madre pluripotentes.
También se proporciona por una invención una población de células que comprende al menos una célula hospedadora de la invención.
La población de células puede ser una población heterogénea que comprende la célula hospedadora que comprende cualquiera de los vectores de expresión recombinantes de la invención, además de al menos otra célula, por ejemplo, una célula hospedadora (por ejemplo, un linfocito T), que no comprende ninguno de los vectores de expresión recombinantes o una célula distinta de un linfocito T, por ejemplo, un linfocito B, un macrófago, un neutrófilo, un eritrocito, un hepatocito, una célula endotelial, una célula epitelial, una célula muscular, una célula cerebral, etc. Como alternativa, la población de células puede ser una población sustancialmente homogénea en que la población comprende principalmente células hospedadoras (por ejemplo, consiste esencialmente en) que comprende el vector de expresión recombinante. La población también puede ser una población clonal de células en que todas las células de la población son clones de una sola célula hospedadora que comprende un vector de expresión recombinante, de modo que todas las células de la población comprendan el vector de expresión recombinante. En una realización de la invención, la población de células es una población clonal que comprende células hospedadoras que comprenden un vector de expresión recombinante como se describe en este documento.
Los CAR (incluyendo partes funcionales y variantes de los mismos), ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospedadoras (incluyendo poblaciones de las mismas) y anticuerpos (incluyendo partes de unión a antígeno de los mismos), puede aislarse y/o purificarse. Por ejemplo, una preparación de células hospedadoras purificadas (o aisladas) es una en que la célula hospedadora es más pura que células en su entorno natural dentro del organismo. Dichas células hospedadoras pueden producirse, por ejemplo, por técnicas convencionales de purificación. En algunas realizaciones, una preparación de una célula hospedadora se purifica de modo que la célula hospedadora representa al menos aproximadamente un 50 %, por ejemplo, al menos aproximadamente un 70 %, del contenido total de células de la preparación. Por ejemplo, la pureza puede ser de al menos aproximadamente un 50 %, puede ser mayor de aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 70 % o aproximadamente un 80 %, o puede ser de aproximadamente un 100 %.
E. Métodos de tratamiento
Se contempla que los CAR divulgados en este documento pueden usarse en métodos de tratamiento o prevención de una enfermedad en un mamífero. A este respecto, se divulga un método de tratamiento o prevención del cáncer en un mamífero, que comprende administrar al mamífero los CAR, los ácidos nucleicos, los vectores de expresión recombinantes, las células hospedadoras, la población de células, los anticuerpos y/o las partes de unión a antígeno de los mismos, y/o las composiciones farmacéuticas en una cantidad eficaz para tratar o prevenir el cáncer en el mamífero.
Un aspecto comprende además linforreducir al mamífero antes de administrar los CAR divulgados en este documento. Ejemplos de linforreducción incluyen, aunque pueden no limitarse a ellos, quimioterapia de linforreducción no mielosupresora, quimioterapia de linforreducción mielosupresora, irradiación corporal total, etc.
Para los propósitos de los métodos, en los que se administran células hospedadoras o poblaciones de células, las células pueden ser células que son alogénicas o autólogas para el mamífero. Preferiblemente, las células son autólogas para el mamífero. Como se usa en este documento, alogénico significa cualquier material derivado de un animal diferente de la misma especie que el individuo en el que se introduce el material. Se dice que dos o más individuos son alogénicos entre sí cuando los genes en uno o más locus no son idénticos. En algunos aspectos, el material alogénico de individuos de la misma especie puede ser suficientemente diferente genéticamente para interactuar antigénicamente. Como se usa en este documento, "autólogo" significa cualquier material derivado del mismo individuo en el que después tienen que reintroducirse en el individuo.
El mamífero mencionado en este documento puede ser cualquier mamífero. Como se usa en este documento, el término "mamífero" se refiere a cualquier mamífero incluyendo, aunque sin limitación, mamíferos del orden Rodentia, tales como ratones y hámsteres, y mamíferos del orden Logomorpha, tales como conejos. Los mamíferos pueden ser del orden Carnívora, incluyendo félidos (gatos) y cánidos (perros). Los mamíferos pueden ser del orden Artiodactyla, incluyendo bóvidos (vacas) y pórcidos (cerdos) o del orden Perssodactyla, incluyendo équidos (caballos). Los mamíferos pueden ser del orden Primates, Ceboidea o Simioidea (monos) o del orden Anthropoidea (seres humanos y simios). Preferiblemente, el mamífero es un ser humano.
Con respecto a los métodos, el cáncer puede ser cualquier cáncer, incluyendo cualquiera de cáncer linfocítico agudo, leucemia mieloide aguda, rabdomiosarcoma alveolar, cáncer de vejiga (por ejemplo, carcinoma de vejiga), cáncer de hueso, cáncer cerebral (por ejemplo, meduloblastoma), cáncer de mama, cáncer del ano, el canal anal o anorrectal, cáncer del ojo, cáncer de las vías biliares intrahepáticas, cáncer de las articulaciones, cáncer del cuello, de la vesícula biliar o la pleura, cáncer de la nariz, la cavidad nasal o el oído medio, cáncer de la cavidad bucal, cáncer de la vulva, leucemia linfocítica crónica, cáncer mieloide crónico, cáncer de colon, cáncer esofágico, cáncer cervicouterino, fibrosarcoma, tumor carcinoide gastrointestinal, cáncer de cabeza y cuello (por ejemplo, carcinoma escamocelular de cabeza y cuello), linfoma de Hodgkin, cáncer de la hipofaringe, cáncer renal, cáncer de laringe, leucemia, neoplasias hemáticas, cáncer de hígado, cáncer de pulmón (por ejemplo, carcinoma pulmonar no microcítico y adenocarcinoma pulmonar), linfoma, mesotelioma, mastocitoma, melanoma, mieloma múltiple, cáncer de la nasofaringe, linfoma no hodgkiniano, leucemia linfocítica B crónica, tricoleucemia, leucemia linfocítica aguda (ALL) y linfoma de Burkitt, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer del peritoneo, del epiplón y el mesenterio, cáncer de faringe, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer renal, cáncer de piel, cáncer del intestino delgado, cáncer de partes blandas, tumores sólidos, sarcoma sinovial, cáncer gástrico, cáncer testicular, cáncer tiroideo y cáncer de uréter.
Los términos "tratar" y "prevenir", así como expresiones derivadas de los mismos, como se usan en este documento, no implican necesariamente tratamiento o prevención de un 100 % o completo. En su lugar, hay grados variables de tratamiento o prevención que un experto en la materia reconoce que tiene un posible efecto beneficio o efecto terapéutico. A este respecto, los métodos pueden proporcionar cualquier cantidad o cualquier nivel de tratamiento o prevención del cáncer en un mamífero.
Además, el tratamiento o prevención proporcionado por el método puede incluir el tratamiento o prevención de una o más afecciones o síntomas de la enfermedad, por ejemplo, cáncer, que se está tratando o previniendo. Además, para los propósitos de este documento, "prevención" puede abarcar el retardo de la aparición de la enfermedad, o un síntoma o afección de la misma.
Otro aspecto divulga un método de detección de la presencia de cáncer en un mamífero, que comprende: (a) poner en contacto una muestra que comprende una o más células del mamífero con los CAR, los ácidos nucleicos, los vectores de expresión recombinantes, las células hospedadoras, la población de células, los anticuerpos y/o las partes de unión a antígeno de los mismos, o las composiciones farmacéuticas, formando de ese modo un complejo, (b) y detectar el complejo, en el que la detección del complejo es indicativa de la presencia de cáncer en el mamífero.
La muestra puede obtenerse por cualquier método adecuado, por ejemplo, biopsia o necropsia. Una biopsia es la retirada de tejido y/o células de un individuo. Dicha retirada puede ser recoger tejido y/o células del individuo para realizar experimentación sobre el tejido y/o células retiradas. Esta experimentación puede incluir experimentos para determinar si el individuo tiene y/o está padeciendo una determinada afección o estado patológico. La afección o enfermedad puede ser, por ejemplo, cáncer.
Con respecto a un aspecto del método de detección de la presencia de un trastorno proliferativo, por ejemplo, cáncer, en un mamífero, la muestra que comprende células del mamífero puede ser una muestra que comprende células completas, lisados de las mismas o una fracción de los lisados de células completas, por ejemplo, una fracción nuclear o citoplásmica, una fracción proteínica completa o una fracción de ácido nucleico. Si la muestra comprende células completas, las células pueden ser cualquier célula de mamífero, por ejemplo, las células de cualquier órgano o tejido, incluyendo glóbulos o células endoteliales.
El contacto puede tener lugar in vitro o in vivo con respecto al mamífero. Preferiblemente, el contacto es in vitro.
Además, la detección del complejo puede producirse a través de muchas maneras conocidas en la técnica. Por ejemplo, los CAR divulgados en este documento, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospedadoras, poblaciones de células o anticuerpos, o partes de unión a antígeno de los mismos, descritos en este documento, pueden marcarse con un marcador detectable tal como, por ejemplo, un radioisótopo, un fluoróforo (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE)), una enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano rusticano) y partículas de elementos (por ejemplo, partículas de oro) como se divulga supra.
Los métodos de ensayo de un CAR para la capacidad de reconocer células diana y para la especificidad de antígeno son conocidos en la técnica. Por ejemplo, Clay et al., J. Immunol, 163: 507-513 (1999), muestra métodos de medición de la liberación de citocinas (por ejemplo, interferón-Y, factor estimulador de colonias de granulocitos/monocitos (GM-CSF), factor de necrosis tumoral a (TNF-a) o interleucina 2 (IL-2)). Además, la función del CAR puede evaluarse por la medición de la citotoxicidad celular, como se describe en Zhao et al., J. Immunol, 174: 4415-4423 (2005).
Otro aspecto divulga el uso de los CAR, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospedadoras, poblaciones de células, anticuerpos o partes de unión a antígeno de los mismos, y/o composiciones farmacéuticas divulgadas en este documento, para el tratamiento o prevención de un trastorno proliferativo, por ejemplo, cáncer, en un mamífero. El cáncer puede ser cualquiera de los cánceres descritos en este documento.
Puede usarse cualquier método de administración para los agentes terapéuticos divulgados, incluyendo administración local y sistémica. Por ejemplo, puede usarse administración tópica, oral, intravascular tal como intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, intradérmica, intratecal y subcutánea. El modo particular de administración y la pauta posológica las seleccionará el médico a cargo, teniendo en cuenta los detalles del caso (por ejemplo, el sujeto, la enfermedad, el estado patológico implicado y si el tratamiento es profiláctico). En casos en que se está administrando más de un agente o composición, puede usarse una o más vías de administración; por ejemplo, un agente quimioterápico puede administrarse por vía oral y un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o conjugado o composición puede administrarse por vía intravenosa. Los métodos de administración incluyen inyección para la que el CAR, linfocito T CAR, conjugados, anticuerpo, fragmentos de unión a antígeno o composiciones se proporcionan en un vehículo farmacéuticamente aceptable atóxico tal como agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa, seroalbúmina humana al 5 %, aceites fijos, oleato de etilo o liposomas. En algunos aspectos, puede usarse administración local de los compuestos divulgados, por ejemplo, aplicando el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno a una región de tejido de la que se ha retirado un tumor, o una región sospechosa de ser propensa a desarrollo de tumor. En algunos aspectos, puede ser beneficiosa la liberación intratumoral (o casi tumoral) mantenida de la preparación farmacéutica que incluye una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno. En otros ejemplos, el conjugado se aplica como un colirio de forma tópica a la córnea, o de manera intravítrea en el ojo.
Los agentes terapéuticos divulgados pueden formularse en forma farmacéutica unitaria adecuada para administración individual de dosificaciones precisas. Además, los agentes terapéuticos divulgados pueden administrarse en una pauta de una sola dosis o de múltiples dosis. Una pauta de múltiples dosis es una en que un ciclo principal de tratamiento puede ser con más de una dosis separada, por ejemplo, 1-10 dosis, seguido de otras dosis administradas a intervalos de tiempo posteriores según lo necesario para mantener o reforzar la acción de las composiciones. El tratamiento puede implicar dosis al día o múltiples días de uno o más compuestos durante un periodo de unos pocos días a meses, o incluso años. Por tanto, la pauta posológica también se determinará, al menos en parte, basándose en las necesidades particulares del sujeto a tratar y dependerá del criterio del facultativo de administración.
Las dosificaciones típicas de los anticuerpos o conjugados pueden variar de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 30 mg/kg, tal como de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/kg.
En ejemplos particulares, al sujeto se le administra una composición terapéutica que incluye uno o más de los conjugados, anticuerpos, composiciones, CAR, linfocitos T CAR o agentes adicionales en una pauta posológica de múltiples días, tal como al menos dos días consecutivos, 10 días consecutivos y así sucesivamente, por ejemplo, durante un periodo de semanas, meses o años. En un ejemplo, al sujeto se le administra los conjugados, anticuerpos, composiciones o agentes adicionales durante un periodo de al menos 30 días, tal como al menos 2 meses, al menos 4 meses, al menos 6 meses, al menos 12 meses, al menos 24 meses o al menos 36 meses.
En algunos aspectos, los métodos divulgados incluyen proporcionar cirugía, radioterapia y/o agentes quimioterápicos al sujeto en combinación con un anticuerpo divulgado, fragmento de unión a antígeno, conjugado, CAR o linfocito T que expresa un CAR (por ejemplo, secuencialmente, de forma sustancialmente simultánea o simultáneamente). Los métodos y dosificaciones terapéuticas de dichos agentes y tratamientos son conocidos por los expertos en la materia, y pueden determinarse por un médico experto. La preparación y pautas posológicas para el agente adicional pueden usarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante o como se determina empíricamente por el facultativo experto. La preparación y pautas posológicas para dicha quimioterapia también se describen en Chemotherapy Service, (1992) Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md.
En algunos aspectos, la politerapia puede incluir la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor adicional del cáncer a un sujeto. Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos adicionales que pueden usarse con la politerapia incluyen agentes de unión a los microtúbulos, intercalantes del ADN o reticulantes, inhibidores de la síntesis de ADN, inhibidores de la transcripción de ADN y ARN, anticuerpos, enzimas, inhibidores enzimáticos, reguladores génicos e inhibidores de la angiogénesis. Estos agentes (que se administran a una cantidad terapéuticamente eficaz) y tratamientos pueden usarse en solitario o en combinación. Por ejemplo, puede administrarse cualquier agente antineoplásico o antiangiogénico adecuado en combinación con los CAR, linfocitos T-CAR, anticuerpos, fragmento de unión a antígeno o conjugados divulgados en este documento. Los métodos y dosificaciones terapéuticas de dichos agentes son conocidos por los expertos en la materia, y puede determinarlos un médico experto.
Agentes quimioterápicos adicionales incluyen, aunque sin limitación, agentes alquilantes, tales como mostazas nitrogenadas (por ejemplo, clorambucilo, clormetina, ciclofosfamida, ifosfamida y melfalán), nitrosoureas (por ejemplo, carmustina, fotemustina, lomustina y estreptozocina), compuestos de platino (por ejemplo, carboplatino, cisplatino, oxaliplatino y BBR3464), busulfán, dacarbazina, mecloretamina, procarbazina, temozolomida, tiotepa y uramustina; antimetabolitos, tales como ácido fólico (por ejemplo, metotrexato, pemetrexed y raltitrexed), purina (por ejemplo, cladribina, clofarabina, fludarabina, mercaptopurina y tioguanina), pirimidina (por ejemplo, capecitabina), citarabina, fluorouracilo y gemcitabina; alcaloides vegetales, tales como podófilos (por ejemplo, etopósido y tenipósido), taxano (por ejemplo, docetaxel y paclitaxel), vinca (por ejemplo, vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina); antibióticos citotóxicos/antitumorales, tales como miembros de la familia de antraciclina (por ejemplo, daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, mitoxantrona y valrubicina), bleomicina, rifampicina, hidroxiurea y mitomicina; inhibidores de la topoisomerasa, tales como topotecán e irinotecán; anticuerpos monoclonales, tales como alemtuzumab, bevacizumab, cetuximab, gemtuzumab, rituximab, panitumumab, pertuzumab y trastuzumab; fotosensibilizantes, tales como ácido aminolevulínico, aminolevulinato de metilo, porfímero sódico y verteporfina; y otros agentes, tales como alitretinoína, altretamina, amsacrina, anagrelida, trióxido arsénico, asparaginasa, axitinib, bexaroteno, bevacizumab, bortezomib, celecoxib, denileucina diftitox, erlotinib, estramustina, gefitinib, hidroxicarbamida, imatinib, lapatinib, pazopanib, pentostatina, masoprocol, mitotano, pegaspargasa, tamoxifeno, sorafenib, sunitinib, vemurafinib, vandetanib y tretinoína. La selección y dosificaciones terapéuticas de dichos agentes son conocidas por los expertos en la materia y puede determinarlas un médico experto.
La politerapia puede proporcionar sinergia y demostrarse sinérgica, es decir, el efecto conseguido cuando los ingredientes activos usados conjuntamente es mayor de la suma de los efectos que resulta de usar los compuestos por separado. Un efecto sinérgico puede conseguirse cuando los ingredientes activos: (1) se coformulan y administran o suministran simultáneamente en una formulación de dosificación unitaria combinada; (2) se suministran por alternancia o en paralelo como formulaciones separadas; o (3) se administran mediante alguna otra pauta. Cuando se suministran en alternancia, puede conseguirse un efecto sinérgico cuando los compuestos se administran o suministran secuencialmente, por ejemplo, mediante diferentes inyecciones en jeringas separadas. En general, durante la alternancia, se administra una dosificación eficaz de cada ingrediente activo secuencialmente, es decir, en serie, mientras que en politerapia las dosificaciones eficaces de dos o más ingredientes activos se administran conjuntamente.
En un aspecto, una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une específicamente a uno o más de los antígenos divulgados en este documento o un conjugado del mismo se administra a un sujeto que tiene un tumor después de tratamiento antineoplásico. Después de que haya pasado una cantidad suficiente de tiempo para permitir que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o conjugado administrado forme un complejo inmunitario con el antígeno expresado en la célula cancerosa respectiva, se detecta el complejo inmunitario. La presencia (o ausencia) del complejo inmunitario indica la eficacia del tratamiento. Por ejemplo, un aumento en el complejo inmunitario en comparación con un control tomado antes del tratamiento indica que el tratamiento no es eficaz, mientras que una disminución en el complejo inmunitario en comparación con un control tomado antes del tratamiento indica que el tratamiento es eficaz.
F. Composiciones biofarmacéuticas
En este documento se divulgan composiciones biofarmacéuticas o biológicas (a partir de ahora en este documento, "composiciones") para su uso en genoterapia, inmunoterapia y/o terapia celular que incluyen uno o más de los CAR divulgados o linfocitos T que expresan un CAR, anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno, conjugados, CAR o linfocitos T que expresan un CAR que se une específicamente a uno o más antígenos divulgados en este documento, en un vehículo (tal como un vehículo farmacéuticamente aceptable). Las composiciones pueden prepararse en formas farmacéuticas unitarias para su administración a un sujeto. La cantidad y cronología de administración son a juicio del médico a cargo para conseguir el resultado deseado. Las composiciones pueden formularse para administración sistémica (tal como intravenosa) o local (tal como intratumoral). En un ejemplo, un CAR divulgado o linfocitos T que expresan un CAR, anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, conjugado, se formula para administración parenteral, tal como administración intravenosa. Las composiciones que incluyen un CAR o linfocito T que expresa un CAR, un conjugado, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno como se divulga en este documento son de uso, por ejemplo, para el tratamiento y detección de un tumor, por ejemplo, y no a modo de limitación, un neuroblastoma. En algunos ejemplos, las composiciones son útiles para el tratamiento o detección de un carcinoma. Las composiciones que incluyen un CAR o linfocito T que expresa un CAR, un conjugado, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno como se divulga en este documento también son de uso, por ejemplo, para la detección de angiogénesis patológica.
Las composiciones para administración pueden incluir una solución del CAR o linfocito T que expresa un CAR, conjugado, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno disuelto en un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un vehículo acuoso. Puede usarse una diversidad de vehículos acuosos, por ejemplo, solución salina tamponada y similares. Estas soluciones son estériles y en general están libres de materia indeseable. Estas composiciones pueden esterilizarse por técnicas de esterilización convencionales bien conocidas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarlas a las condiciones fisiológicas tales como agentes de ajuste del pH y tamponantes, agentes de ajuste de la toxicidad, agentes adyuvantes y similares, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio y similares. La concentración de un CAR o linfocito T que expresa un CAR, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o conjugado en estas formulaciones puede variar ampliamente, y se seleccionará principalmente basándose en los volúmenes de fluido, las viscosidades, el peso corporal y similares de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado y las necesidades del sujeto. Los métodos reales de preparación de dichas formas farmacéuticas para su uso en genoterapia, inmunoterapia y/o terapia celular son conocidos, o serán evidentes para los expertos en la materia.
Una composición típica para administración intravenosa incluye de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 30 mg/kg de anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o conjugado por sujeto por día (o la dosis correspondiente de un CAR, o linfocito T que expresa un CAR, conjugado que incluye el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno). Los métodos reales para preparar composiciones administrables serán conocidos o evidentes para los expertos en la materia y se describen en mayor detalle en publicaciones tales como Remington's Pharmaceutical Science, 19.a ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1995).
Un CAR o linfocito T que expresa un CAR, anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno o conjugados pueden proporcionarse en forma liofilizada y rehidratarse con agua estéril antes de la administración, aunque también se proporcionan en soluciones estériles de concentración conocida. Los CAR o linfocitos T que expresan un CAR, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o solución de conjugado se añaden después a una bolsa de infusión que contiene cloruro de sodio al 0,9 %, USP y, en algunos casos, se administran a una dosificación de 0,5 a 15 mg/kg de peso corporal. Hay experiencia considerable disponible en la técnica en la administración de fármacos de anticuerpo o fragmento de unión a antígeno y conjugado; por ejemplo, se han comercializado fármacos de anticuerpo en Estados Unidos desde la aprobación de RITUXAN® en 1997. Un CAR o linfocito T que expresa un CAR, anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno y conjugados de los mismos pueden administrarse por infusión lenta, en lugar de en inyección intravenosa lenta o rápida. En un ejemplo, se administra una dosis de carga mayor, con dosis de mantenimiento posteriores que se administran a un nivel menor. Por ejemplo, una dosis de carga inicial de 4 mg/kg de anticuerpo o fragmento de unión a antígeno (o la dosis correspondiente de un conjugado que incluye el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno) puede infundirse durante un periodo de unos 90 minutos, seguida de dosis de mantenimiento semanales durante 4-8 semanas de 2 mg/kg infundidas durante un periodo de 30 minutos si la dosis previa se toleró bien.
Pueden prepararse formulaciones parenterales de liberación controlada como implantes, inyecciones oleosas o como sistemas en partículas. Para una perspectiva general amplia de los sistemas de suministro de proteínas véase Banga, A.J., Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing, and Delivery Systems, Technomic Publishing Company, Inc. Lancaster, PA, (1995). Los sistemas en partículas incluyen microesferas, micropartículas, microcápsulas, nanocápsulas, nanoesferas y nanopartículas. Las microcápsulas contienen la proteína terapéutica, tal como una citotoxina o un fármaco, como núcleo central. En las microesferas, el agente terapéutico se dispersa por toda la partícula. Las partículas, microesferas y microcápsulas más pequeñas de aproximadamente 1 pm en general se denominan nanopartículas, nanoesferas y nanocápsulas, respectivamente. Los capilares tienen un diámetro de aproximadamente 5 pm de modo que solamente las nanopartículas se administran por vía intravenosa. Las micropartículas típicamente son de aproximadamente 100 pm de diámetro y se administran por vía subcutánea o vía intramuscular. Véase, por ejemplo, Kreuter, J., Colloidal Drug Delivery Systems, J. Kreuter, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY, pág. 219-342 (1994); y Tice y Tabibi, Treatise on Controlled Drug Delivery, A. Kydonieus, ed., Marcel Dekker, Inc. Nueva York, NY, pág. 315-339, (1992).
Los polímeros pueden usarse para liberación controlada iónica de los CAR o linfocitos T que expresan un CAR, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o composiciones de conjugado divulgadas en este documento. Diversas matrices poliméricas degradables y no degradables para su uso en suministro controlado de fármacos son conocidas en la técnica (Langer, Accounts Chem. Res. 26:537-542, 1993). Por ejemplo, el copolímero de bloque, polaxámero 407, existe como un líquido viscoso, aunque móvil a baja temperaturas, pero forma un gel semisólido a temperatura corporal. Se ha demostrado que es un vehículo eficaz para formulación y suministro mantenido de interleucina-2 recombinante y ureasa (Johnston et al., Pharm. Res. 9:425-434, 1992; y Pec et al., J. Parent. Sci. Tech. 44(2):58-65, 1990). Como alternativa, se ha usado hidroxiapatita como microvehículo para liberación controlada de proteínas (Ijntema et al., Int. J. Pharm. 112:215-224, 1994). En otro aspecto más, se usan liposomas para liberación controlada, así como dirección de fármacos del fármaco encapsulado en lípidos (Betageri et al., Liposome Drug Delivery Systems, Technomic Publishing Co., Inc. Lancaster, PA (1993)). Se conocen numerosos sistemas adicionales para suministro controlado de proteínas terapéuticas (véase la patente de Estados Unidos n.° 5055303; patente de Estados Unidos n.° 5 188837; patente de Estados Unidos n.° 4235 871; patente de Estados Unidos n.° 4501 728; patente de Estados Unidos n.° 4837 028; patente de Estados Unidos n.° 4957 735; patente de Estados Unidos n.° 5019 369; patente de Estados Unidos n.° 5055 303; patente de Estados Unidos n.° 5514 670; patente de Estados Unidos n.° 5413 797; patente de Estados Unidos n.° 5268 164; patente de Estados Unidos n.° 5004 697; patente de Estados Unidos n.° 4 902 505; patente de Estados Unidos n.° 5506 206; patente de Estados Unidos n.° 5271 961; patente de Estados Unidos n.° 5254 342 y patente de Estados Unidos n.° 5534 496).
G. Kits
En un aspecto, también se divulgan kits que emplean los CAR divulgados en este documento. Por ejemplo, kits para tratar un tumor en un sujeto o preparar un linfocito T CAR que expresa uno o más de los CAR divulgados en este documento. Los kits típicamente incluirán un anticuerpo divulgado, fragmento de unión a antígeno, conjugado, molécula de ácido nucleico, CAR o linfocito T que expresa un CAR como se divulga en este documento. Más de uno de los anticuerpos divulgados, fragmentos de unión a antígeno, conjugados, moléculas de ácido nucleico, CAR o linfocitos T que expresan un CAR puede incluirse en el kit.
El kit puede incluir un recipiente y una etiqueta o prospecto en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas, etc. Los recipientes pueden formarse a partir de una diversidad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente típicamente aloja una composición que incluye uno o más de los anticuerpos divulgados, fragmentos de unión a antígeno, conjugados, moléculas de ácido nucleico, CAR o linfocitos T que expresan un CAR. En varios aspectos, el recipiente puede tener una vía de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Una etiqueta o prospecto indica que la composición se usa para tratar la afección particular.
La etiqueta o prospecto típicamente incluirá además instrucciones para el uso de los anticuerpos divulgados, fragmentos de unión a antígeno, conjugados, moléculas de ácido nucleico, CAR o linfocitos T que expresan un CAR, por ejemplo, en un método de tratamiento o prevención de un tumor o de preparación de un linfocito T CAR. El prospecto típicamente incluye instrucciones normalmente incluidas en envases comerciales de productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, contraindicaciones y/o advertencias con respecto al uso de dichos productos terapéuticos. Los materiales instructivos pueden estar escritos, en un formato electrónico (tal como a disquete de ordenador o disco compacto) o pueden ser visuales (tal como archivos de vídeo). Los kits también pueden incluir componentes adicionales para facilitar la aplicación particular para la que está diseñado el kit. Por tanto, por ejemplo, el kit puede contener adicionalmente un medio de detección de un marcador (tal como sustratos enzimáticos para marcadores enzimáticos, conjuntos de filtro para detectar marcadores fluorescentes, marcadores secundarios apropiados tal como un anticuerpo secundario o similares). Los kits pueden incluir adicionalmente tampones y otros agentes usados de forma rutinaria para la práctica de un método particular. Dichos kits y contenidos apropiados son bien conocidos por los expertos en la materia.
Ejemplos
Esta invención se ilustra además por los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse de ninguna manera como limitaciones de imposición sobre el alcance de la misma.
Ejemplo 1
Identificación de dominios de unión al antígeno mesotelina
Aislamiento de anticuerpos específicos de mesotelina a partir de una colección de scFv completamente humanos presentados en fagos
Materiales y métodos:
a) Producción de anticuerpos específicos de mesotelina scFv humanos presentados en fagos
Se usó una colección de presentación en fagos (diversidad aproximada de 1010 especificidades únicas) de scFv humanos vírgenes (fragmento variable monocatenario recombinante de inmunoglobulina), construida a partir de linfocitos B de sangre periférica de 50 donadores sanos (Z. Y. Zhu y D. S. Dimitrov, datos no publicados), para la selección de scFv específicos para mesotelina humana recombinante. Se incubaron colecciones amplificadas de 1012 scFv presentados en fagos con 5, 3 y 1 pg de mesotelina recubierta en un volumen 5 x 100 pl, se distribuyeron equitativamente en 5 pocillos de una placa de 96 pocillos durante 2 h a temperatura ambiente durante la primera, segunda y tercera rondas de bioselección, respectivamente. Después de cada ronda de incubación, los pocillos se lavaron 5 veces para la primera ronda y 10 veces para las posteriores rondas con solución salina tamponada con fosfato que contenía Tween 20 (PBST) al 0,05 % para retirar los fagos no unidos específicamente, los fagos unidos se mezclaron con células competente TG1 durante 1 hora a 37 °C y los fagos se amplificaron a partir de las células infectadas y se usaron en la siguiente ronda de bioselección. Después de la tercera ronda de bioselección, se cogieron aleatoriamente 380 clones de las células TG1 infectadas y cada uno se inoculó en 150 pl de medio 2YT que contenía 100 pg/ml de carbenicilina y glucosa al 0,2 % en placas de 96 pocillos usando el sistema de recogida de colonias automatizado BioRobotics BioPick (Genomic Solutions, Ann Arbor, MI). Después de que los cultivos bacterianos alcanzaran una densidad óptica de a 600 nm (DO600) de 0,5, se añadió el fago auxiliar M13K07 a una multiplicidad de infección (MOI) de 10 y kanamicina a 50 pg/ml (concentración final) al medio y las placas se incubaron más a 30 °C durante la noche en un agitador a 250 rpm. Los sobrenadantes de los fagos se mezclaron con leche desnatada al 3 % en PBS a una relación de volumen de 4:1 y se usaron para enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) para identificar clones de fagos que presentaban scFv con alta afinidad de unión a mesotelina. Los sobrenadantes se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente con mesotelina humana recombinante recubierta a 50 ng por pocillo en placas de 96 pocillos y se lavaron cinco veces con PBST (después de incubación durante la noche a 4 °C se bloqueó con leche desnatada al 3 % en PBS y se lavó tres veces con PBS que contenía Tween 20 al 0,05 %). Los fagos unidos a mesotelina se detectaron usando anticuerpo de cabra anti-M13 conjugado con peroxidasa de rábano rusticano. Después de incubación con el anticuerpo, el anticuerpo no unido específicamente se retiró lavando los pocillos, y se añadió el sustrato 3,3,'5,5'-tetrametilbencidina (TMB), y se midió la absorbancia de la solución a 450 nm (A450). Los clones que se unieron a mesotelina con A450 de >1,0 se seleccionaron para caracterización adicional.
b) Expresión y purificación de scFv solubles seleccionados.
Se secuenció el ADN de la VH y VL de los clones seleccionados, y los scFv codificados por clones con secuencias únicas se expresaron y se purificaron como se describe a continuación. Los plásmidos extraídos de estos clones se usaron para transformación de células HB2151. Se cogió una sola colonia de la placa que contenía células recién transformadas, se inoculó en 200 ml de medio 2YT que contenía 100 pg/ml de ampicilina y glucosa al 0,2 %, y se incubó a 37 °C con agitación a 250 rpm. Cuando la DO del cultivo a 600 nm alcanzó 0,90, se añadió isopropil-p-dtiogalactopiranósido a una concentración final 0,5 mM, y el cultivo se incubó adicionalmente durante la noche a 30 °C. El sedimento bacteriano se recogió después de centrifugación a 8000 x g durante 20 min y se resuspendió en tampón PBS que contenía 0,5 mU de polimixina B (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Después de 30 min de incubación con rotación a 50 rpm a temperatura ambiente, el sedimento resuspendido se centrifugó a 25000 x g durante 25 min a 4 °C, y el sobrenadante se usó para la purificación de scFv usando la resina Ni-NTA siguiendo el protocolo del proveedor (Qiagen).
c) Ensayo de unión ELISA
Se recubrieron 50 pl de la mesotelina humana recombinante diluida en PBS a 2 ug/ml en una placa de 96 pocillos a 4 °C durante la noche. Se diluyó en serie el scFv purificado (de antes) con marcas de His y Flag y se añadió en los pocillos recubiertos con proteína diana. Después de lavar, se añadió un anticuerpo antiFlag conjugado con HRP diluido 1:3000 durante 1 h a TA. Después de lavar, se añadió sustrato 3,3,5,5'-tetrametilbencidina (TMB), se añadió H2SO41 N para detener la reacción después de incubación a temperatura ambiente durante 10 minutos, y se leyó la D.O. a 450 nm para cuantificar la capacidad relativa del scFv de unirse a mesotelina.
Resultados:
Basándose en los resultados del ensayo de unión ELISA, se identificaron cuatro clones de ScFs separados específicos para mesotelina humana recombinante y se marcaron como los agentes de unión scFv humanos antimesotelina MH1P, MH2P, MH6P y M1-4S, respectivamente. La generación de receptores quiméricos de antígeno que expresan los agentes de unión scFv humanos antimesotelina MH1P, MH2P, MH6P y M1-4S se resumen en el ejemplo 2, infra.
Ejemplo 2
CAR que expresan secuencias de unión de scFv completamente humanas antimesotelina
En este ejemplo, se describen linfocitos T CAR antimesotelina derivados de cuatro secuencias de agentes de unión scFv completamente humanos novedosas. Las construcciones T CAR antimesotelina novedosas han demostrado expresión de alto nivel en linfocitos T humanos primarios y actividad citolítica específica y potente contra células tumorales positivas a mesotelina.
Materiales y métodos:
(a) Líneas celulares
Se adquirió la línea celular de carcinoma escamoso humano A431 de la American Tissue Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). La línea A431 original y sus subclones se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (ATCC) complementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10 %.
Se generó el subclón A431 que expresaba luciferasa transduciendo de forma estable células A431 de tipo silvestre con vector lentivírico que codificaba luciferasa de luciérnaga (Lentigen Technology, Inc., Gaithersburg, MD), seguido de dilución limitante y selección de clones positivos a luciferasa. Asimismo, el subclón A431-MSLN se derivó por transducción del clon positivo a luciferasa A431 con un vector lentivírico que codificaba la isoforma 1 del gen de mesotelina humana (RefSeq ID NM_005823,4), seguido de selección de clones positivos a mesotelina.
(b) Creación de receptor quimérico de antígeno (CAR) - vectores de expresión
Las secuencias de los dominios de unión a antígeno de CAR, scFv, se derivaron de los agentes de unión scFv humanos antimesotelina MH1P, MH2P, MH6P y M1-4S. Las construcciones T CAR se generaron ligando el agente de unión scFv en el mismo marco a los dominios de unión y transmembranario de CD8a (secuencia UniProt ID P01732, aa 138-206) y después al dominio de señalización de 4-1BB (CD137, aa 214-255, secuencia UniProt ID Q07011) y el dominio de señalización de CD3 zeta (CD247, aa 52-163, secuencia Ref ID: NP_000725,1). Las secuencias de las construcciones CAR se clonaron en una cadena principal plasmídica lentivírica de tercera generación (Lentigen Technology Inc., Gaithersburg, MD). Los sobrenadantes que contenían vector lentivírico (LV) se generaron por transfección transitoria de células HEK 293T y el vector se sedimentó por centrifugación de los sobrenadantes que contenían vector lentivírico, y se almacenaron a -80 °C.
(c) Purificación y transducción de linfocitos T primarios
Se purificaron los linfocitos T primarios humanos de donadores normales a partir de placas leucoplaquetarias después de selección con microesferas inmunomagnéticas de células CD4+ y CD8+ de acuerdo con el protocolo del fabricante (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania), se cultivaron en medio TexMACS complementado con 40 UI/ml de IL-2 a una densidad de 0,3 a 2 x 106 células/ml, se activaron con reactivo CD3/CD28 MACS® GMP TransAct (Miltenyi Biotec) y se transdujeron en el día 3 con vectores lentivíricos que codificaban construcciones CAR en presencia de 10 ug/ml de sulfato de protamina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) durante la noche, y el medio se intercambió en el día 4. En el día 5, los cultivos se transfirieron a medio TexMACS complementado con 200 UI/ml de IL-2, y se propagaron hasta la recolección en el día 10-13.
(d) Ensayos de efector inmunitario (CTL y citocina)
Para determinar la citotoxicidad mediada por células (ensayo de CTL), se combinaron 5000 células diana transducidas de forma estable con luciferasa de luciérnaga con linfocitos T CAR a diversas relaciones de efector a diana y se incubaron durante la noche. Se añadió reactivo SteadyGlo (Promega, Madison WI) a cada pocillo y la luminiscencia resultante se cuantificó como recuentos por segundo (CPS de la muestra). Se usaron pocillos de solamente diana (CPS máx.) y pocillos de solamente diana más Tween-20 al 1 % (CPS mín.) para determinar el intervalo del ensayo. El porcentaje de lisis específica se calculó como: (1-(CPS de la muestra-CPS mín.)/(CPS máx.-CPS mín.)).
(e) Análisis citométrico de flujo
Para la tinción celular, se recogió medio millón de linfocitos T CAR transducidos del cultivo, se lavaron dos veces en tampón AutoMACS frío complementado con seroalbúmina bovina al 0,5 % (Miltenyi Biotec), y se detectó la expresión superficial de CAR por tinción con reactivo fragmento F(ab')2 de cabra-PE anti-IgG humana (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) a dilución 1:200 e incubación durante 30 minutos a 4 °C. Se usaron células no transducidas como controles negativos. Se excluyeron células muertas en todos los estudios por tinción con 7AAD (BD Biosciences, San José, CA). Las células se lavaron dos veces y se resuspendieron en 200 ul de tampón de tinción antes del análisis cuantitativo por citometría de flujo. El análisis citométrico de flujo se realizó en un analizador MACSQuant®10 (Miltenyi Biotec) y se generaron diagramas de los datos usando el programa informático MACSQuantify (Miltenyi Biotec).
Resultados:
Para evaluar las secuencias de unión de scFv completamente humanas antimesotelina novedosas, se diseñaron construcciones de CAR que incorporaban cada una de las secuencias MH1P, MH2P, MH6P o M1-4S como dominio de unión a antígeno tumoral. En cada diseño de CAR, el dominio dirigido al tumor estaba seguido de un conector y dominios transmembranarios derivados de la proteína CD8 humana, un dominio coestimulador de 4-1BB y un dominio de señalización de CD3 zeta (tabla 1).
Tabla 1: Lista de construcciones de CAR dirigidas a mesotelina
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Los linfocitos T transducidos con receptores quiméricos de antígeno antimesotelina demuestran expresión superficial y actividad citolítica.
a) Expresión superficial de CAR antimesotelina
Para evaluar los cuatro CAR antimesotelina novedosos, se generaron vectores lentivíricos (LV) que codificaban las construcciones de CAR MH1P, MH2P, MH6P y M1-4S bajo el control del promotor de Ef1 a humano como se describe en materiales y métodos. Después, se transdujeron los linfocitos T primarios humanos derivados de dos donadores sanos separados con los cuatro vectores lentivíricos que codificaban los CAR. Las células no transducidas del mismo donador (simuladas) o las células transducidas con GFP del mismo donador sirvieron como controles negativos.
Los linfocitos T se activaron en el día de cultivo 0 con reactivo TransAct CD3 CD28 en presencia de IL-2 como se describe en materiales y métodos. En el día de cultivo 10, se detectó la expresión de CAR antimesotelina sobre la superficie de linfocitos T mediante reactivo de cabra anti-F(ab')2 humano-PE y se analizó por citometría de flujo. Las construcciones de CAR antimesotelina pLTG1902 y pLTG1904 demostraron alta expresión de CAR superficial. Inesperadamente, las construcciones pLTG1901 y pLTG1903 no pudieron detectarse sobre la superficie de los linfocitos T por este método.
b) Ensayo citolítico de CAR antimesotelina
Para demostrar la función citolítica de los linfocitos T CAR generados, se realizó un ensayo de destrucción basado en luciferasa usando la línea A431-MSLN que expresa de forma estable mesotelina humana. La línea original A431, que es negativa a mesotelina, se usó como control de especificidad de destrucción. Los linfocitos T CAR y las células diana se combinaron a relaciones de efector a diana (E:T) de 20, 10 y 5, y se coincubaron durante la noche, después se evaluó la destrucción por luminiscencia como se describe en materiales y métodos (figura 3). Las construcciones T CAR pLTG1902, pLTG1903 y pLTG1904 mostraron fuerte citotoxicidad dependiente de la relación contra la línea A431-MSLN, mientras que la construcción de GFP de control negativo pLTG1398 y la simulación (linfocitos T no transducidos del mismo donador) no eran citolíticas. Además, no se observó citólisis en la línea A431 negativa a mesotelina, lo que indica que el efecto de destrucción observado es específico de mesotelina. De forma destacable, el CAR pLTG1901 no se detectó en la superficie de los linfocitos T (figura 2) y no mostró actividad citolítica contra células A431-MSLN. Por el contrario, el CAR pLTG1903 que tampoco pudo detectarse en la superficie de los linfocitos T por citometría de flujo, demostró fuerte citotoxicidad contra la línea A431-MSLN, lo que sugiere que esta construcción también se expresaba en linfocitos T. El resultado obtenido con el CAR pLTG1903 demostró la impredecibilidad de la correlación de la expresión en la superficie celular con la capacidad de destrucción de células tumorales in vitro.
En resumen, se demostró la alta funcionalidad de las construcciones de CAR completamente humanas antimesotelina novedosas pLTG1902, pLTG1903 y pLTG1904 (tabla 2). La construcción pLTG1901 no tuvo efecto citolítico, en concordancia con la ausencia de expresión superficial detectable por citometría de flujo.
Tabla 2 - Resumen de expresión y función - scFv CAR antimesotelina
Figure imgf000035_0001
Secuencias de la divulgación
Las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos enumeradas a continuación se muestran usando abreviaturas de letras convencionales para las bases nucleotídicas, y el código de tres letras para aminoácidos, como se define en 37 C.F.R. 1.822. Solamente se muestra una hebra de la secuencia de ácido nucleico, pero la hebra complementaria se entiende incluida por cualquier referencia a la hebra presentada. En la lista de secuencias adjunta:
SEQ ID NO: 1 es la secuencia de nucleótidos del dominio de unión de scFv al antígeno mesotelina MH1P
caggtacagctgcagcagtcaggtccaggactggtgaagccctcgcggaccctc tcactcacctgtgccatctccggggacagtgtctctagcaacagtgctgcttggaactgg atcaggcagtccccatcgagaggccttgagtggctgggaaggacatactacaggtccaag tggtataatgattatgcagtatctgtgaaaagtcgaataaccatcaacccagacacatcc aagaaccagttctccctgcagctgaactctgtgactcccgaggacacggctgtgtattac tgtgcaagagggaagggtggtaagaagggtggtgcttttgatatctggggccaagggaca atggtcaccgtctcttcaggaggtggcgggtctggtggaggcggtagcggcggtggcgga tcctcttctgagctgactcaggaccctgctgtgtctgtggccttgggacagacagtcagg atcacatgccaaggagacagcctcagaagctattatgcaagctggtaccagcagaagcca ggacaggctcctgtacttgtcatctatggtaaaaacaaccggccctcagggatcccagac cgattctctggctcctcctcaggcaacacagcttccttgaccatcactggggctcaggcg gaagatgaggctgaatattactgtagctccagcactcgtaatcatgtgttcttcggcaga
Gggaccaaggtcaccgtcctaggt
SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoácidos del dominio de unión de scFv al antígeno mesotelina MH1P
Q V Q L Q S G P G L V K P S R T L
S L T C A I S G D S V S S N S A A W N W I R Q S P S R G L E W L G R T Y Y R S K W Y N D Y A V S V K S R I T I N P D T S K N Q F S L Q L N S V T P E D T A V Y Y C A R G K G G K K G G A F D I W G Q G T M V T V S S G G G G S G G G G S G G G G S S S E L T Q D P A V S V A L G Q T V R I T C Q G D S L R S Y Y A S W Y Q Q K P G Q A P V L V I Y G K N N R P S G I P D R F S G S S S G N T A S L T I T G A Q A E D E A E Y Y C S S S T R N H V F F G R G T K V T V L G
S E Q ID NO : 3 es la se c u e n c ia de n u c le ó tid o s de l d o m in io de un ión d e scF v al a n tíg e n o m e s o te lin a M H 2P
gaggtgcagctggtgcagtctgggggaggcttggtacagcctggcaggtcccag agactctcctgtgcagcctctggattcacctttgatgattatgccatgcactgggtccgg caagctccagggaagggcctggagtgggtctcaggtattagttggaatagtggtagcata ggctatgcggactctgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcc ctgtatctgcaaatgaacagtctgagagctgaggacacggccttgtattactgtgcaaaa gatatttcgtcgtcagctggtaacgcttttgatatctggggccaagggacaatggtcacc gícícíícaggaggíggcgggícíggíggaggcggíagcggcggíggcggaíccícíící gagctgactcaggaccctgctgtgtctgtggccttgggacagacagtcaggatcacatgc caaggagacagactcagaagctattatgcaagctggtaccagcagaagccaggacaggcc cctgtacttgtcatctatggtaaaaacaaccggccctcagggatcccagaccgcttctct ggctccgactcaggagacacagcttccttgaccatcactggggctcaggcggaagatgag gctgactattactgtcactcccgtgacagtggtggtaaccatgtggtattcggcggaggc
Acccagctgaccgtcctcggt
SEQ ID NO: 4 es la secuencia de aminoácidos del dominio de unión de scFv al antígeno mesotelina MH2P
E V Q L V Q S G G G L V Q P G R S Q R L S C A A S G F T F D D Y A M H W V R Q A P G K G L E W V S G I S W N S G S I G Y A D S V K G R F T I S R D N A K N S L Y L Q M N S L R A E D T A L Y Y C A K D I S S S A G N A F D I W G Q G T M V T V S S G G G G S G G G G S G G G G S S S E L T Q D P A V S V A L G Q T V R I T C Q G D R L R S Y Y A S W Y Q Q K P G Q A P V L V I Y G K N N R P S G I P D R F S G S D S G D T A S L T I T G A Q A E D E A D Y Y C H S R D S G G N H V V F G G G T Q L T V L G
SEQ ID NO: 5 es la secuencia de nucleótidos del dominio de unión de scFv al antígeno mesotelina M1-4S gaggtccagctggtacagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctg agactctcctgtgcagcctctggattcacctttgatgattatgccatgcactgggtccgg caagctccagggaagggcctggagtgggtctcaggtattagttggaatagtggtagcata ggctatgcggactctgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcc ctgtatctgcaaatgaacagtctgagagctgaggacacggccttgtattactgtgcaaaa gatttatcgtcagtggctggaccctttaactactggggccagggcaccctggtcaccgtc tcctcaggaggtggcgggtctggtggaggcggtagcggcggtggcggatcctcttctgag ctgactcaggaccctgctgtgtctgtggccttgggacagacagtcaggatcacatgccaa ggagacagcctcagaagctattatgcaagctggtaccagcagaagccaggacaggcccct gtacttgtcatctatggtaaaaacaaccggccctcagggatcccagaccgattctctggc tccagctcaggaaacacagcttccttgaccatcactggggctcaggcggaggatgaggct gactattactgtaactcccgggacagcagtggtaaccatctggtattcggcggaggcacc
Cagctgaccgtcctcggt
SEQ ID NO: 6 es la secuencia de aminoácidos del dominio de unión de scFv al antígeno mesotelina M1-4S
E V Q L V Q S G G G L V Q P G G S L
R L S C A A S G F T F D D Y A M H W V R Q A P G K G L E W V S G I S W N S G S I G Y A D S V K G R F T I S R D N A K N S L Y L Q M N S L R A E D T A L Y Y C A K D L S S V A G P F N Y W G Q G T L V T V S S G G G G S G G G G S G G G G S S S E L T Q D P A V S V A L G Q T V R I T C Q G D S L R S Y Y A S W Y Q Q K P G Q A P V L V I Y G K N N R P S G I P D R F S G S S S G N T A S L T I T G A Q A E D E A D Y Y C N S R D S S G N H L V F G G G T Q L T V L G
SEQ ID NO: 7 es la secuencia de nucleótidos del dominio de unión de scFv al antígeno mesotelina MH6P caggtccagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtg aaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcaccggctactatatgcactgggtgcga caggcccctggacaagggcttgagtggatgggacggatcaaccctaacagtggtggcaca aactatgcacagaagtttcagggcagggtcaccatgaccaggaacacgtccatcagcaca gcctacatggagctgagcaggctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgaga tccggctactactacggtttggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca ggaggtggcgggtctggtggaggcggtagcggcggtggcggatcccagtctgtgttgacg cagccgccctcagcgtctgggacccccgggcagcgggtcaccatctcttgttctggaagt cgctccaacatcggaagaaacactgtcaactggtatcaacaactcccaggactggccccc aaactcatcatccagaggagtgatcagcggccctcaggggtccctgaccgattctctggc tccaagtctgtcacctcagcctccctggccatcagtgggctccggtccgaggatgaggct gattattactgcggaacatgggataacagcctgagtgcttatgtcttcggaactgggacc
aagctgaccgtcctaggt
SEQ ID NO: 8 es la secuencia de aminoácidos del dominio de unión de scFv al antígeno mesotelina MH6P
Figure imgf000038_0001
D Y Y C G T W D N S L S A Y V F G T G T K L T V L G
SEQ ID NO: 9 es la secuencia de nucleótidos de la secuencia del péptido líder/señal
atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgaactgccgcatccggcgtttctgctgattccg
SEQ ID NO: 10 es la secuencia de aminoácidos de la secuencia del péptido líder/señal
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
SEQ ID NO: 11 es la secuencia de nucleótidos de la secuencia de ácido nucleico de pLTG1901 Ef1 a MH1P--CD8TM-4-1BB-CD3 zeta
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCGCATCCGGCGTT TCTGCTG ATTCCGCAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCG GACCCTC TCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTGCTTG GAACTGG ATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACA GGTCCAAG TGGTATAATGATTATGCAGTATCTGTGAAAAGTCGAATAACCATCAACCCAGA CACATCC
AAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGT
GTATTAC TGTGCAAGAGGGAAGGGTGGTAAGAAGGGTGGTGCTTTTGATATCTGGGGCC AAGGGACA AT GGTC AC CGT CTCTT C AGGAGGTGGC GGGT CT GGT GGAGGCGGT AGC GGCGG TGGCGGATCCTCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAG ACAGTCAGG ATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGC AGAAGCCA GGACAGGCTCCTGTACTTGTCATCTATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGAT CCCAGAC CGATTCTCTGGCTCCTCCTCAGGCAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCT CAGGCG GAAGATGAGGCTGAATATTACTGTAGCTCCAGCACTCGTAATCATGTGTTCTT CGGCAGA GGGACCAAGGTCACCGTCCTCGGTGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCG GCCGCCG ACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTG CCGCCCG GCCGCGGGTGGAGCCGTGCAT ACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGAT ATCT A CATTTGG GCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTT TACTGC AAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCC CGTGCAG ACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGG GGGGATGC GAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGG CCAGAAT CAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGG ACAAGCGA CGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAG GAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAAT CGGGATGAAGGGA
GAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACC GCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
SEQ ID NO: 12 es la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de pLTGI 901 Ef1 a MH1P--CD8TM-4-1BB-CD3 zeta
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKPSRTLSLTCAISGDSVSSNSAA
WNW IRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDT AVYY C ARGKGGKKGGAFDIW GQGTMVTV S S GGGGS GGGGS GGGGS S SELT QDP AV S V ALGQTVR ITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTIT GAQA EDEAEYYCS S STRNHVFF GRGTKVTVLGAAATTTP APRPPTP APTI AS QPLSLRPEA CRP AAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPF MRPVQ TTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYD VLDKR RGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQ GLSTATK DTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 13 es la secuencia de nucleótidos de la secuencia de ácido nucleico de pLTG1902 Ef1a MH2P CD8TM-4-1BB-CD3 zeta (figura 2B)
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCGCATCCGGCGTT TCTGCTG ATTCCGGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAG GTCCCAG AGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGG GTCCGG
C A AGCTCC AGGGAAGGGCCTGGAGT GGGT CT C AGGT ATT AGTT GGAAT AGT G GTAGCATA GGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAA GAACTCC CTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTG TGCAAAA GATATTTCGTCGTCAGCTGGTAACGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAAT GGTCACC GTCTCTTCAGGAGGTGGCGGGTCTGGTGGAGGCGGTAGCGGCGGTGGCGGAT CCTCTTCT GAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGAT CACATGC CAAGGAGACAGACTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAG GACAGGCC CCTGTACTTGTCATCTATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCG CTTCTCT GGCTCCGACTCAGGAGACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGA AGATGAG GCTGACTATTACTGTCACTCCCGTGACAGTGGTGGTAACCATGTGGTATTCGG CGGAGGC ACCCAGCTGACCGTCCTCGGTGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCC GCCGACT CCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCG CCCGGCC GCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACAT TTGGGCC CCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTAC TGCAAG AGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGT GCAGACG ACT C AGGAAGAGGACGGAT GCTCGT GC AGATTCC CT GAGGAGGAAGAGGGGG GATGCGAA CTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCA GAATCAG
CTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACA
AGCGACGC GGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAA GGACTGTAC
AGGGAGAG CGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCA CTAAGGAT ACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
SEQ ID NO: 14 es la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de pLTG1902 Ef1a MH2P CD8TM-4-1BB-CD3 zeta (figura 2B)
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVQSGGGLVQPGRSQRLSCAASGFTFDDYAM HWVR QAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAL YYCAK DIS S S AGNAFDIWGQGTMVTV S S GGGGS GGGGSGGGGS S SELTQDP AV S V ALGQT VRITC QGDRLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSDSGDTASLTITGA QAEDE AD YY CHS RD S GGNHV VF GGGT QLTVLGAAATTTP APRPPTP APTI AS QPL SLRPE A CRPA AGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFM RPVQT TQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDV LDKRR GRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQG LSTATKD TYDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 15 es la secuencia de nucleótidos de la secuencia de ácido nucleico de pLTG1903 Ef1a MH6P CD8TM-4-1BB-CD3 zeta (figura 2C)
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCGCATCCGGCGTT TCTGCTG ATTCCGCAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGG CCTCAGTG AAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCGGCTACTATATGCACTG GGTGCGA CAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGACGGATCAACCCTAACAGTG GTGGCACA AACTATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGAACACGTCCA TCAGCACA GCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTG TGCGAGA TCCGGCTACTACTACGGTTTGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGT CTCCTCA GGAGGTGGCGGGTCTGGTGGAGGCGGTAGCGGCGGTGGCGGATCCCAGTCTG TGTTGACGCAGCCGCCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGCGGGTCACCATCTCTTG TTCTGGAAGTCGCTCCAACATCGGAAGAAACACTGTCAACTGGTATCAACAACTCCC AGGACTGGCCCCC AAACTCATCATCCAGAGGAGTGATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATT CTCTGGC TCCAAGTCTGTCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGA TGAGGCT GATTATTACTGCGGAACATGGGATAACAGCCTGAGTGCTTATGTCTTCGGAAC TGGGACC AAGCTGACCGTCCTCGGTGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCC GACTCCG GCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCC GGCCGCG GGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTG GGCCCCG CTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGC AAGAGG GGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCA GACGACT
CAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGAT
GCGAACTG CGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAA TCAGCTC TACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGC GACGCGGA CGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGA CTGTACAAC GAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGG GAGAGCGG AGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTA AGGATACC TACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
SEQ ID NO: 16 es la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de pLTG1903 Ef1a MH6P CD8TM-4-1BB-CD3 zeta (figura 2C)
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYY MHWVR QAPGQGLEWMGRINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRNTSISTAYMELSRLRSDDTA VYYCAR S GYYY GLD V W GQGTTVTV S S GGGGS GGGGS GGGGS QSVLTQPPSAS GTPGQRVT ISCSGS RSNIGRNTVNWYQQLPGLAPKLIIQRSDQRPSGVPDRFSGSKSVTSASLAISGLRSE DEA DYYCGTWDNSLSAYVFGTGTKLTVLGAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEAC RPAA GGAVHTRGLDF ACDIYIW APL AGT C GVLLLS LVITL YCKRGRKKLL YIFKQPFMRP VQTT QEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVL DKRRG RDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKM AEAY SEIGMKGERRRGKGHDGLY QGL STATKDT YDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 17 es la secuencia de nucleótidos de la secuencia de ácido nucleico de pLTG1904 Ef1 a M1-4S CD8TM-4-1BB-CD3 zeta (figura 2D)
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCGCATCCGGCGTT TCTGCTG ATTCCGGAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGG GTCCCTG AGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGG GTCCGG C A AGCTCC AGGGAAGGGCCTGGAGT GGGT CT C AGGT ATT AGTT GGAAT AGT G GTAGCATA GGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAA GAACTCC CTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTG TGCAAAA GATTTATCGTCAGTGGCTGGACCCTTTAACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGT CACCGTC TCCTCAGGAGGTGGCGGGTCTGGTGGAGGCGGTAGCGGCGGTGGCGGATCCT CTTCTGAG CTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCAC ATGCCAA GGAGACAGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGAC AGGCCCCT GTACTTGTCATCTATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATT CTCTGGC TCCAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAGGA TGAGGCT GACTATTACTGTAACTCCCGGGACAGCAGTGGTAACCATCTGGTATTCGGCGG AGGCACC CAGCTGACCGTCCTCGGTGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCC GACTCCG GCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCC GGCCGCG
GGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTG
GGCCCCG CTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGC AAGAGG GGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCA GACGACT C AGGA AGAGGAC GGAT GCT C GT GC AGATT C C C T GAGGAGGA AGAGGGGGGAT GCGAACTG CGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAA TCAGCTC TACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGC GACGCGGA CGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGA CTGTACAAC GAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGG GAGAGCGG AGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTA AGGATACC TACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
SEQ ID NO: 18 es la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de pLTG1904 Ef1a M1-4S CD8TM-4-1BB-CD3 zeta (figura 2D)
MLLL VTSLLLCELPHP AFLLIPEV QL VQ S GGGLV QP GGSLRL S C AAS GFTFDD Y AM HWVR QAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAL YYCAK DL S S V AGPFNYW GQGTL VTV S S GGGGS GGGGS GGGGS S S ELT QDP AV S V ALGQT VRITCQ GD SLRS YY AS WY QQKPGQ AP VLVIY GKNNRP SGIPDRFSGSSS GNT AS LTITGAQ A EDEA DYYCNSRDSSGNHLVFGGGTQLTVLGAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEAC RPAA GGAVHTRGLDF ACDIYIW APL AGT C GVLLLS LVITL Y C KRGRKKLL YIFKQPFMRP VQTT QEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVL DKRRG RDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKM AEAY SEIGMKGERRRGKGHDGLY QGL STATKDT YDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 19 es la secuencia de nucleótidos del ADN del dominio transmembranario de CD8
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc accctttact gc
SEQ ID NO: 20 es la secuencia de aminoácidos del dominio transmembranario de CD8
lie Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
Val lie Thr Leu Tyr Cys
SEQ ID NO: 21 es la secuencia de nucleótidos del ADN del dominio de bisagra de CD8
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg
gacttcgcct gtgat
SEQ ID NO: 22 es la secuencia de aminoácidos del dominio de bisagra de CD8
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr lie Ala
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp lie Tyr
SEQ ID NO: 23 es la secuencia de aminoácidos de los números de aminoácido 118 a 178 de la región de bisagra de CD8.alfa (NCBI RefSeq: NP.sub.-001759.3)
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr lie Phe Lys Gln Pro Phe Met
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
SEQ ID NO: 24 es la secuencia de aminoácidos de la secuencia CL de IgG humana
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu lie Ser Asp
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
SEQ ID NO: 25 es la secuencia de nucleótidos del ADN del dominio de señalización de 4-1BB
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt
gaactg
SEQ ID NO: 26 es la secuencia de aminoácidos del dominio de señalización de 4-1 BB
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr lie Phe Lys Gln Pro Phe Met
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
SEQ ID NO: 27 es la secuencia de nucleótidos del ADN del dominio de señalización de CD3-zeta
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc
5 SEQ ID NO: 28 es la secuencia de aminoácidos de CD3zeta
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu lie Gly Met Lys Gly Glu Arg
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
SEQ ID NO: 29 es la secuencia de nucleótidos de scFv CD19
0
gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcaccatcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg gggaccaagc tggagatcac aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc ggatctgagg tgaaactgca ggagtcagga cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac tataattcag ctctcaaatc cagactgacc atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat gacacagcca tttactactg tgccaaacat tattactacg gtggtagcta tgctatggac tactggggcc aaggaacctc agtcaccgtc tcctca
SEQ ID NO: 30 es la secuencia de aminoácidos de scFv CD19
Asp lie Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr lie Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp lie Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu lie Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr lie Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp lie Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Thr Gly Gly Gly Gly Ser 100
\ 5 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu
Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp lie Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val lie Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr lie lie Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala lie Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un receptor quimérico de antígeno (CAR) que comprende al menos un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende un dominio de unión al antígeno mesotelina codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 3, 5 o 7, al menos un dominio transmembranario y al menos un dominio de señalización intracelular.
2. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, en la que el al menos un dominio de unión al antígeno mesotelina codificado, el al menos un dominio de señalización intracelular o ambos están conectados al dominio transmembranario mediante un dominio conector o espaciador, opcionalmente en la que el dominio conector o espaciador codificado deriva del dominio extracelular de CD8 o CD28, y está conectado a un dominio transmembranario.
3. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, en la que el dominio de unión al antígeno mesotelina extracelular codificado está precedido por una secuencia de nucleótidos líder que codifica un péptido líder, opcionalmente en la que la secuencia de nucleótidos líder comprende una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 9 que codifica la secuencia de aminoácidos líder de SEQ ID NO: 10.
4. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, en la que el dominio transmembranario comprende un dominio transmembranario de una proteína que comprende la cadena alfa, beta o zeta del receptor de linfocitos T, CD8, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 y CD154, o cualquier combinación de los mismos.
5. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, en la que el al menos un dominio de señalización intracelular codificado comprende además un dominio intracelular de CD3 zeta, opcionalmente en la que el al menos un dominio de señalización intracelular codificado está dispuesto en un lado C terminal con respecto al dominio intracelular de CD3 zeta.
6. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, en la que el al menos un dominio de señalización intracelular codificado comprende un dominio coestimulador, un dominio de señalización primario o cualquier combinación de los mismos, opcionalmente en la que el al menos un dominio coestimulador codificado comprende un dominio de señalización funcional de OX40, CD70, CD27, CD28, CD5, ICAM-1, LFA-1 (CD11 a/CD18), ICOS (CD278), DAP10, DAP12 y 4-1BB (CD137), o cualquier combinación de los mismos.
7. Un receptor quimérico de antígeno (CAR) que comprende al menos un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende un dominio de unión al antígeno mesotelina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, 6 u 8, al menos un dominio transmembranario y al menos un dominio de señalización intracelular.
8. El CAR de la reivindicación 7, en el que el CAR comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, 16 o 18.
9. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.
10. El vector de la reivindicación 9, en el que el vector se selecciona del grupo que consiste en un vector de ADN, un vector de ARN, un vector plasmídico, un vector cosmídico, un vector del virus del herpes, un vector del virus del sarampión, un vector lentivírico, vector adenovírico, un vector retrovírico y una combinación de los mismos.
11. Una célula que comprende el vector de la reivindicación 9.
12. Un método de preparación de una célula que comprende transducir un linfocito T con el vector de la reivindicación 9.
13. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz antitumoral de una población de linfocitos T humanos, en la que los linfocitos T comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor quimérico de antígeno (CAR), en la que el CAR comprende al menos un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende un dominio de unión al antígeno mesotelina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, 6 u 8, al menos un dominio conector, al menos un dominio transmembranario y al menos un dominio de señalización intracelular, en la que los linfocitos T son linfocitos T de un sujeto humano que tiene un cáncer.
14. Una composición farmacéutica para su uso en un método de tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesita, en la que la composición farmacéutica comprende una cantidad eficaz antitumoral de una población de linfocitos T, en la que los linfocitos T comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor quimérico de antígeno (CAR), en la que el CAR comprende al menos un dominio de unión a antígeno extracelular que comprende un dominio de unión al antígeno mesotelina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, 6 u 8, al menos un dominio conector o espaciador, al menos un dominio transmembranario, al menos un dominio de señalización intracelular, en la que los linfocitos T son linfocitos T del sujeto que tiene cáncer.
15. La composición para el uso de la reivindicación 14, en la que el cáncer se selecciona de cáncer hematopoyético, cáncer pancreático por síndrome mielodisplásico, cáncer de cabeza y cuello, tumores cutáneos, enfermedad residual mínima (MRD) en leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia mielógena crónica (CML), linfoma no hodgkiniano (NHL), leucemia linfocítica aguda (ALL), mieloma múltiple, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de colon y melanoma.
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