ES2879823T3

ES2879823T3 - Amplificación de ácidos nucleicos

Info

Publication number: ES2879823T3
Application number: ES14864826T
Authority: ES
Inventors: Kamila Belhocine; Josephine Lee; Pranav Patel; Aaron Richardson; Scott Tabakman
Original assignee: Labrador Diagnostics LLC
Current assignee: Labrador Diagnostics LLC
Priority date: 2013-11-22
Filing date: 2014-09-17
Publication date: 2021-11-23
Anticipated expiration: 2034-09-17
Also published as: CN106255763A; CA2927315A1; HK1232259A1; JP2022172384A; CN114807321A; JP2017500020A; EP3071713A1; MX370616B; BR112016011692A2; WO2015076919A1; EP3071713B1; CN106255763B; IL245687A0; EP3071713A4; KR20160088316A; EP3957741A1; MX2016006602A; AU2014353462A1; JP2019201670A

Abstract

Un método para copiar un molde polinucleotídico, el método comprende: incubar una mezcla de reacción que comprende el molde polinucleotídico, un primer cebador y un segundo cebador en condiciones sin termociclado, en donde al inicio de la incubación: el molde polinucleotídico comprende una primera porción y una segunda porción; el primer cebador comprende una primera región y una segunda región, en donde la primera región comprende un extremo 5' del cebador, la segunda región comprende un extremo 3' del cebador y la segunda región es complementaria a la primera porción del molde polinucleotídico; el segundo cebador comprende una primera región y una segunda región, en donde la primera región comprende un extremo 5' del cebador, la segunda región comprende un extremo 3' del cebador y la segunda región es complementaria a una secuencia que es complementaria a la segunda porción del molde polinucleotídico; la primera región del primer cebador es complementaria a la primera región del segundo cebador; y en donde el molde polinucleotídico comprende, además, una tercera porción, en donde la tercera porción está situada en el molde polinucleotídico entre la primera porción y la segunda porción, y en donde la primera región del segundo cebador es complementaria a la tercera porción del molde polinucleotídico. y se generan múltiples copias del molde polinucleotídico.

Description

DESCRIPCIÓN

Amplificación de ácidos nucleicos

Antecedentes

Existe una necesidad creciente de métodos y reactivos para la amplificación de ácidos nucleicos. La generación de múltiples copias de un ácido nucleico particular a menudo es necesaria o útil para que el ácido nucleico se use en una aplicación determinada. Por ejemplo, para analizar la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico de interés, con frecuencia, el ácido nucleico se replica para aumentar su número de copias antes de analizar la secuencia. En otro ejemplo, para determinar la presencia o ausencia de un ácido nucleico particular en una muestra, una muestra puede tratarse en condiciones tales que si el ácido nucleico particular está presente en la muestra, puede amplificarse. En otro ejemplo, un ácido nucleico para usar como una sonda puede copiarse repetidamente para generar una gran cantidad de ácidos nucleicos que contienen la misma secuencia que el molde original de ácido nucleico, de esta manera se generan muchas copias del ácido nucleico que pueden usarse como una sonda.

Se conocen diversos métodos para la amplificación de ácidos nucleicos. Por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa ("PCR") (ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Núm. 4,683,202) es un método popular para la amplificación de ácidos nucleicos. Para realizar con éxito una reacción de PCR, la reacción debe realizarse a varias temperaturas diferentes, que se repiten durante varios ciclos. Esto requiere de un equipamiento u otros mecanismos para cambiar repetidamente la temperatura de la reacción de PCR. Otro método para la amplificación de ácidos nucleicos se denomina amplificación isotérmica mediada por bucle ("LAMP") (ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Núm. 6,410,278). Las reacciones LAMP pueden realizarse de forma isotérmica, pero típicamente implican el uso de cuatro cebadores diferentes que reconocen un total de seis secuencias distintas en el ácido nucleico diana. Otro método isotérmico que usa cebadores TAB se describió por Prithiviraj y otros (Biochemical and Biophysical Research Communications (2012) 420738-742)

Para facilitar la generación de ácidos nucleicos amplificados para las numerosas y cada vez mayores aplicaciones que usan ácidos nucleicos amplificados, son convenientes los métodos y reactivos nuevos para la amplificación de ácidos nucleicos.

Resumen

En la presente descripción se proporcionan métodos y composiciones relacionados con la amplificación de ácidos nucleicos y la generación de concatámeros. El alcance de la invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

En algunas modalidades, en la presente descripción se proporciona un método para generar un concatámero que comprende dos o más copias de un molde de ácido nucleico bicatenario, el método comprende: (A) tratar un ácido nucleico bicatenario primario que comprende el molde de ácido nucleico bicatenario con una primera copia de un primer cebador y una polimerasa en condiciones tales que se sintetice un producto de extensión de la primera copia del primer cebador que se hibrida con una primera cadena del molde de ácido nucleico bicatenario, en donde el primer cebador comprende un nucleótido terminal 5', un nucleótido terminal 3' y dos regiones: (i) una región de cola que comprende: (a) el nucleótido terminal 5' del cebador (b) un nucleótido más interno, en donde el nucleótido más interno está aguas abajo del nucleótido terminal 5' (c) una sección intermedia entre el nucleótido terminal 5' y el nucleótido más interno, que comprende uno o más nucleótidos, y (ii) una región de unión al molde que comprende (a) el nucleótido terminal 3' del cebador (b) un nucleótido más interno, en donde el nucleótido más interno está aguas arriba del nucleótido terminal 3' (c) una sección intermedia entre el nucleótido terminal 3' y el nucleótido más interno, que comprende uno o más nucleótidos, y la región de unión al molde de la primera copia del primer cebador hibrida con la primera cadena del molde de ácido nucleico bicatenario, (B) tratar el producto de extensión de la primera copia del primer cebador de la etapa (A) con un segundo cebador y una polimerasa en condiciones tales que se sintetice un producto de extensión del segundo cebador que se hibrida con el producto de extensión de la primera copia del primer cebador de la etapa (A), en donde el segundo cebador comprende un nucleótido terminal 5', un nucleótido terminal 3', y dos regiones: (i) una región de cola que comprende (a) el nucleótido terminal 5' del cebador (b) un nucleótido más interno, en donde el nucleótido más interno está aguas abajo del nucleótido terminal 5' (c) una sección intermedia entre el nucleótido terminal 5' y el nucleótido más interno, que comprende uno o más nucleótidos, e (ii) una región de unión al molde que comprende (a) el nucleótido terminal 3' del cebador (b) un nucleótido más interno, en donde el nucleótido más interno está aguas arriba del nucleótido terminal 3' (c) una sección intermedia entre el nucleótido terminal 3' y el nucleótido más interno, que comprende uno o más nucleótidos, la región de cola del segundo cebador contiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de la región de cola del primer cebador, si las secuencias están alineadas de manera que el nucleótido terminal 5' del segundo cebador esté alineado con el nucleótido más interno de la región de cola del primer cebador y el nucleótido terminal 5' del primer cebador esté alineado con el nucleótido más interno de la región de cola del segundo cebador, la región de unión al molde del segundo cebador se hibrida con el producto de extensión de la primera copia del primer cebador de la etapa (A), y el producto de extensión del segundo cebador contiene un nucleótido terminal 5', un nucleótido terminal 3' y una región terminal 3' que comprende el nucleótido terminal 3', en donde la región terminal 3' contiene la misma secuencia de nucleótidos ya que la secuencia de nucleótidos de la región de cola del segundo cebador se lee en la dirección 5' a 3', y el nucleótido final de la región terminal 3' es el nucleótido terminal 3' del producto de extensión del segundo cebador, (C) tratar el producto de extensión del segundo cebador de la etapa (B) con una segunda copia del primer cebador y una polimerasa en condiciones tales que se sintetice un producto de extensión de la segunda copia del primer cebador que se hibrida con el producto de extensión del segundo cebador de la etapa (B), para producir una primera copia de un ácido nucleico secundario que comprende el producto de extensión del segundo cebador de la etapa (B) y el producto de extensión de la segunda copia del primer cebador, en donde el producto de extensión de la segunda copia del primer cebador contiene un nucleótido terminal 5', un nucleótido terminal 3' y una región terminal 3' que comprende el nucleótido terminal 3', en donde la región terminal 3' contiene la misma secuencia de nucleótidos que la secuencia de nucleótidos de la región de cola del primer cebador que se lee en la dirección 5' a 3', y el nucleótido final de la región terminal 3' es el nucleótido terminal 3' del producto de extensión del segundo cebador, (D) repetir al menos la etapa (C) una o más veces adicionales para generar al menos una segunda copia del ácido nucleico secundario de la etapa (C) y la segunda copia del ácido nucleico secundario de la etapa (D) en condiciones tales que la región terminal 3' del producto de extensión de la segunda copia del primer cebador de la primera copia del ácido nucleico secundario se hibrida a la región terminal 3' del producto de extensión del segundo cebador de la segunda copia del acido nucleico secundario, para producir una estructura cruzada que comprende el producto de extensión de la segunda copia del primer cebador de la primera copia del ácido nucleico secundario y el producto de extensión del segundo cebador de la segunda copia del ácido nucleico secundario, (F) tratar la estructura cruzada de la etapa (E) con una polimerasa en condiciones tales que se sintetice un producto de extensión del producto de extensión de la segunda copia del primer cebador de la primera copia del ácido nucleico secundario y un producto de extensión del producto de extensión del segundo cebador de la segunda copia del ácido nucleico secundario se sintetiza, para producir un concatámero que comprende dos copias del molde de ácido nucleico bicatenario de la etapa (A), en donde el concatámero comprende el producto de extensión del producto de extensión de la segunda copia del primer cebador de la primera copia del ácido nucleico secundario y el producto de extensión del producto de extensión del segundo cebador de la segunda copia del ácido nucleico secundario.

En algunas modalidades, en la presente descripción se proporciona un método para generar un concatámero que comprende dos o más copias de un molde polinucleotídico o una secuencia análoga de este, el método comprende: (A) tratar un ácido nucleico primario que comprende el molde polinucleotídico con una primera copia de un primer cebador y una polimerasa en condiciones tales que se sintetice un producto de extensión de la primera copia del primer cebador que se hibrida con el molde polinucleotídico, en donde el primer cebador comprende un nucleótido terminal 5', un nucleótido terminal 3' y dos regiones: (i) una región de cola que comprende (a) el nucleótido terminal 5' del cebador, (b) un nucleótido más interno, en donde el nucleótido más interno está aguas abajo del nucleótido terminal 5' (c) una sección intermedia entre el nucleótido terminal 5' y el nucleótido más interno, que comprende uno o más nucleótidos, e (ii) una región de unión al molde que comprende (a) el nucleótido terminal 3' del cebador (b) un nucleótido más interno, en donde el nucleótido más interno está aguas arriba del nucleótido terminal 3' (c) una sección intermedia entre el nucleótido terminal 3' y el nucleótido más interno, que comprende uno o más nucleótidos, y la región de unión al molde de la primera copia del primer cebador hibrida con el molde polinucleotídico, (B) tratar el producto de extensión de la primera copia del primer cebador de la etapa (A) con un segundo cebador y una polimerasa en condiciones tales que se sintetice un producto de extensión del segundo cebador que se hibrida con el producto de extensión de la primera copia del primer cebador de la etapa (A), en donde el segundo cebador comprende un nucleótido terminal 5', un nucleótido terminal 3', y dos regiones: (i) una región de cola que comprende (a) el nucleótido terminal 5'del cebador (b) un nucleótido más interno, en donde el nucleótido más interno está aguas abajo del nucleótido terminal 5' (c) una sección intermedia entre el nucleótido terminal 5' y el nucleótido más interno, que comprende uno o más nucleótidos (ii) una región de unión al molde que comprende (a) el nucleótido terminal 3' del cebador (b) un nucleótido más interno, en donde el nucleótido más interno está aguas arriba del nucleótido terminal 3' (c) una sección intermedia entre el nucleótido terminal 3' y el nucleótido más interno, que comprende uno o más nucleótidos, la región de cola del segundo cebador contiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de la región de cola del primer cebador, si las secuencias están alineadas de manera que el nucleótido terminal 5' del segundo cebador esté alineado con el nucleótido más interno de la región de cola del primer cebador y el nucleótido terminal 5' del primer cebador esté alineado con el nucleótido más interno de la región de cola del segundo cebador, la región de unión al molde del segundo cebador se hibrida con el producto de extensión de la primera copia del primer cebador de la etapa (A), y el producto de extensión del segundo cebador contiene un nucleótido terminal 5', un nucleótido terminal 3' y una región terminal 3' que comprende el nucleótido terminal 3', en donde la región terminal 3' contiene la misma secuencia de nucleótidos ya que la secuencia de nucleótidos de la región de cola del segundo cebador se lee en la dirección 5' a 3', y el nucleótido final de la región terminal 3' es el nucleótido terminal 3' del producto de extensión del segundo cebador, (C) tratar el producto de extensión del segundo cebador de la etapa (B) con una segunda copia del primer cebador y una polimerasa en condiciones tales que se sintetice un producto de extensión de la segunda copia del primer cebador que se hibrida con el producto de extensión del segundo cebador de la etapa (B), para producir una primera copia de un ácido nucleico secundario que comprende el producto de extensión del segundo cebador de la etapa (B) y el producto de extensión de la segunda copia del primer cebador, en donde el producto de extensión de la segunda copia del primer cebador contiene un nucleótido terminal 5', un nucleótido terminal 3' y una región terminal 3' que comprende el nucleótido terminal 3', en donde la región terminal 3' contiene la misma secuencia de nucleótidos que la secuencia de nucleótidos de la región de cola del primer cebador que se lee en la dirección 5' a 3', y el nucleótido final de la región terminal 3' es el nucleótido terminal 3' del producto de extensión del segundo cebador, (D) repetir al menos la etapa (C) una o más veces adicionales para generar al menos una segunda copia del ácido nucleico secundario que comprende el producto de extensión del segundo cebador de la etapa (B) y el producto de extensión de la segunda copia del primer cebador de la etapa (C), (E) tratar la primera copia del ácido nucleico secundario de la etapa (C) y la segunda copia del ácido nucleico secundario de la etapa (D) en condiciones tales que la región terminal 3' del producto de extensión de la segunda copia del primer cebador de la primera copia del ácido nucleico secundario se hibrida a la región terminal 3' del producto de extensión del segundo cebador de la segunda copia del acido nucleico secundario, para producir una estructura cruzada que comprende el producto de extensión de la segunda copia del primer cebador de la primera copia del ácido nucleico secundario y el producto de extensión del segundo cebador de la segunda copia del ácido nucleico secundario, (F) tratar la estructura cruzada de la etapa (E) con una polimerasa en condiciones tales que se sintetice un producto de extensión del producto de extensión de la segunda copia del primer cebador de la primera copia del ácido nucleico secundario y un producto de extensión del producto de extensión del segundo cebador de la segunda copia del ácido nucleico secundario se sintetiza, para producir un concatámero que comprende dos copias del molde polinucleotídico de la etapa (A), en donde el concatámero comprende el producto de extensión del producto de extensión de la segunda copia del primer cebador de la primera copia del ácido nucleico secundario y el producto de extensión del producto de extensión del segundo cebador de la segunda copia del ácido nucleico secundario. En algunas modalidades, la polimerasa de ácido nucleico de la etapa (A) es una polimerasa de ADN. En algunas modalidades, la polimerasa de ácido nucleico de la etapa (A) es una transcriptasa inversa.

En algunas modalidades, en la presente descripción se proporciona un método para generar un concatámero que comprende dos o más copias de un molde de ácido nucleico bicatenario, el método comprende, (A) preparar una mezcla de reacción que comprende: (i) un ácido nucleico primario que comprende el molde de ácido nucleico bicatenario (ii) una polimerasa de ácido nucleico aislada, (iii) un primer cebador que comprende un nucleótido terminal 5', un nucleótido terminal 3' y dos regiones: (a) una región de cola que comprende (1) el nucleótido terminal 5' del cebador (2) un nucleótido más interno, en donde el nucleótido más interno está aguas abajo del nucleótido terminal 5' (3) una sección intermedia entre el nucleótido terminal 5' y el nucleótido más interno, que comprende uno o más nucleótidos, y (b) una región de unión al molde que comprende (1) el nucleótido terminal 3' del cebador (2) un nucleótido más interno, en donde el nucleótido más interno está aguas arriba del nucleótido terminal 3' (3) una sección intermedia entre el nucleótido terminal 3' y el nucleótido más interno, que comprende uno o más nucleótidos, en donde la región de unión al molde es complementaria a una primera cadena del molde de ácido nucleico, (iv) un segundo cebador que comprende un nucleótido terminal 5', un nucleótido terminal 3' y dos regiones: (a) una región de cola que comprende (1) el nucleótido terminal 5'del cebador (2) un nucleótido más interno, en donde el nucleótido más interno está aguas abajo del nucleótido terminal 5' (3) una sección intermedia entre el nucleótido terminal 5' y el nucleótido más interno, que comprende uno o más nucleótidos, y (b) una región de unión al molde que comprende (1 ) el nucleótido terminal 3' del cebador (2) un nucleótido más interno, en donde el nucleótido más interno está aguas arriba del nucleótido terminal 3' (3) una sección intermedia entre el nucleótido terminal 3' y el nucleótido más interno, que comprende uno o más nucleótidos, y en donde la región de unión al molde es complementaria a una segunda cadena del molde de ácido nucleico, y en donde la región de cola del segundo cebador contiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de la región de cola del primer cebador, si las secuencias están alineadas de manera que el nucleótido terminal 5' del segundo cebador esté alineado con el nucleótido más interno de la región de cola del primer cebador y el nucleótido terminal 5' del primer cebador está alineado con el nucleótido más interno de la región de cola del segundo cebador, y (B) incubar la mezcla de reacción durante al menos 3 minutos sin termociclado.

En algunas modalidades, en la presente descripción se proporciona un método para generar un concatámero que comprende dos o más copias de un molde polinucleotídico, el método comprende, (A) preparar una mezcla de reacción que comprende: (i) un ácido nucleico que comprende el molde polinucleotídico (ii) una polimerasa de ácido nucleico aislada, (iii) un primer cebador que comprende un nucleótido terminal 5', un nucleótido terminal 3' y dos regiones: (a) una región de cola que comprende (1) el nucleótido terminal 5' del cebador (2) un nucleótido más interno, en donde el nucleótido más interno está aguas abajo del nucleótido terminal 5' (3) una sección intermedia entre el nucleótido terminal 5' y el nucleótido más interno, que comprende uno o más nucleótidos, y (b) una región de unión al molde que comprende (1) el nucleótido terminal 3' del cebador (2) un nucleótido más interno, en donde el nucleótido más interno está aguas arriba del nucleótido terminal 3' (3) una sección intermedia entre el nucleótido terminal 3' y el nucleótido más interno, que comprende uno o más nucleótidos, y en donde la región de unión al molde es complementaria al molde polinucleotídico, (iv) un segundo cebador que comprende un nucleótido terminal 5', un nucleótido terminal 3' y dos regiones: (a) una región de cola que comprende (1) el nucleótido terminal 5' del cebador (2) un nucleótido más interno, en donde el nucleótido más interno está aguas abajo del nucleótido terminal 5' (3) una sección intermedia entre el nucleótido terminal 5' y el nucleótido más interno, que comprende uno o más nucleótidos, y (b) una región de unión al molde que comprende (1 ) el nucleótido terminal 3' del cebador (2 ) un nucleótido más interno, en donde el nucleótido más interno está aguas arriba del nucleótido terminal 3' (3) una sección intermedia entre el nucleótido terminal 3' y el nucleótido más interno, que comprende uno o más nucleótidos, y en donde la región de unión al molde es complementaria a una secuencia de nucleótidos complementaria al molde polinucleotídico, y en donde la región de cola del segundo cebador contiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de la región de cola del primer cebador, si las secuencias de los cebadores están alineadas de manera que el nucleótido terminal 5' del segundo cebador esté alineado con el nucleótido más interno de la región de cola del primer cebador y el nucleótido terminal 5' del primer cebador está alineado con el nucleótido más interno de la región de cola del segundo cebador, y (B) incubar la mezcla de reacción a una temperatura no superior a 80 C durante al menos 3 minutos.

En algunas modalidades, en la presente descripción se proporciona un método para generar un concatámero que comprende dos o más copias de un molde de ácido nucleico bicatenario, el método comprende incubar juntas una primera copia y una segunda copia de una molécula de ácido nucleico bicatenario que comprende el molde de ácido nucleico bicatenario y una polimerasa, en donde la molécula de ácido nucleico bicatenario comprende una primera cadena y una segunda cadena, cada una de las cuales contiene una pluralidad de nucleótidos, la primera cadena comprende un nucleótido terminal 5' y un nucleótido terminal 3' y contiene el formato general de regiones en la dirección 5' a 3': A1-B-A2, la segunda cadena comprende un nucleótido terminal 5' y un nucleótido terminal 3' y contiene el formato general de regiones en la dirección 5' a 3': C1-D-C2, la región B comprende la secuencia de nucleótidos de una primera cadena del molde de ácido nucleico bicatenario, la región D comprende la secuencia de nucleótidos de una segunda cadena del molde de ácido nucleico bicatenario, en la molécula de ácido nucleico bicatenario, la región A1 se hibrida con C2, B se hibrida con D y A2 se hibrida con C1, una estructura cruzada que comprende la primera cadena de la primera copia de la molécula de ácido nucleico bicatenario y se genera la segunda cadena de la segunda copia de la molécula de ácido nucleico bicatenario, en donde la región A2 de la primera cadena se hibrida con la región C2 de la segunda cadena, un producto de extensión de la primera cadena de la estructura cruzada se sintetiza y un producto de extensión de la segunda cadena de la estructura cruzada se sintetiza, para producir un concatámero que comprende el producto de extensión de la primera cadena de la estructura cruzada que hibridó con el producto de extensión de la segunda cadena de la estructura cruzada, en donde el concatámero contiene dos copias del molde de ácido nucleico bicatenario.

En las modalidades, en la presente descripción se proporciona un método para copiar un molde polinucleotídico, el método comprende: incubar el molde polinucleotídico en una mezcla de reacción que comprende múltiples copias de un primer cebador y múltiples copias de un segundo cebador, en donde: el primer cebador comprende una primera región y una segunda región, en donde la segunda región del primer cebador comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una primera porción del molde polinucleotídico; el segundo cebador comprende una primera región y una segunda región, en donde la segunda región del segundo cebador comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos asociada, en donde la secuencia de nucleótidos asociada es complementaria a una segunda porción del molde polinucleotídico; y después de la incubación del molde polinucleotídico con las copias múltiples del primer cebador y las copias múltiples del segundo cebador, se forma al menos una cadena concatámero, en donde la cadena concatámero comprende un extremo 5' y un extremo 3', y comprende una secuencia de nucleótidos que tiene la estructura general en la dirección 5' a 3' de: C'-T-C'-T -X-C', en donde: C' representa la secuencia de nucleótidos de la primera región del segundo cebador, T representa la secuencia de nucleótidos del molde polinucleotídico o una secuencia análoga de este, y X representa cualquier número y secuencia de nucleótidos.

En algunas modalidades, en un método proporcionado en la presente descripción que implica la formación de una cadena concatámero que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene la estructura general en la dirección 5'a 3' de: C'-T-C'-T -X-C', la cadena concatámero es una primera cadena concatámero y se forma, además, una segunda cadena concatámero, en donde la segunda cadena concatámero comprende un extremo 5' y un extremo 3', y comprende una secuencia de nucleótidos que tiene la estructura general en la dirección 5' a 3' de: C-X'-T'-C-T'-C, en donde: C representa la secuencia de nucleótidos de la primera región del primer cebador, T' representa una secuencia de nucleótidos que es complementaria al molde polinucleotídico, y X' representa una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de X.

En las modalidades, en la presente descripción se proporciona un método para evaluar un molde polinucleotídico diana en una muestra biológica, el método comprende: A) incubar la muestra biológica o una porción de esta en una mezcla de reacción que comprende múltiples copias de un primer cebador y múltiples copias de un segundo cebador, en donde: el primer cebador comprende una primera región y una segunda región, en donde la segunda región del primer cebador comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una primera porción del molde polinucleotídico; el segundo cebador comprende una primera región y una segunda región, en donde la segunda región del segundo cebador comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos asociada, en donde la secuencia de nucleótidos asociada es complementaria a una segunda porción del molde polinucleotídico; y después de la incubación del molde polinucleotídico con las múltiples copias del primer cebador y las múltiples copias del segundo cebador, se forma al menos una cadena concatámero, en donde la cadena concatámero comprende un extremo 5' y un extremo 3', y comprende una secuencia de nucleótidos que tiene la estructura general en la dirección 5' a 3' de: C'-T-C'-T -X-C', en donde: C' representa la secuencia de nucleótidos de la primera región del segundo cebador, T representa la secuencia de nucleótidos del molde polinucleotídico o una secuencia análoga de este, y X representa cualquier número y secuencia de nucleótidos; y B) medir una cantidad de ácido nucleico amplificado en la mezcla de reacción de A) en uno o más puntos después del inicio de la etapa de incubación de A). En las modalidades, medir una cantidad de ácido nucleico amplificado en la mezcla de reacción puede comprender determinar un nivel de fluorescencia en la mezcla de reacción. En las modalidades, el método puede comprender, además, determinar un tiempo de inflexión de amplificación de ácido nucleico en la mezcla de reacción.

En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica una cadena concatámero que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene la estructura general en la dirección 5' a 3' de: C'-T-C'-T -X-C', X puede contener una secuencia que tiene la estructura general en la dirección 5' a 3' de [(C'-T)ⁿ] donde C' representa la secuencia de nucleótidos de la primera región del segundo cebador, T representa la secuencia de nucleótidos del molde polinucleotídico o una secuencia análoga de este, y N es cualquier número entero entre 0 y 2000. En las modalidades, N puede ser cualquier número entero entre 0 y 10, 0 y 100, 0 y 1000, 0 y 5000, 0 y 10000, 1 y 10, 1 y 100, 1 y 1000, 1 y 2000, 1 y 5000, o 1 y 10000.

En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica una cadena concatámero que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene la estructura general en la dirección 5' a 3' de: C'-T-C'-T -X-C', X no puede contener más de 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 500, 1000, 10000, 50000, 100000 o 500000 nucleótidos. En las modalidades, en un método, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica una cadena concatámero que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene la estructura general en la dirección 5' a 3' de: C'-T-C'-T -X-C', X puede contener al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 500, 1000, 10 000, 50 000, 100 000 o 500 000 nucleótidos. En las modalidades, en un método, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica una cadena concatámero que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene la estructura general en la dirección 5' a 3' de: C'-T-C'-T -X-C', X puede contener al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 500, 1000, 10000, 50000, 100000, nucleótidos y no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 500, 1000, 10000, 50000, 100000 o 500000 nucleótidos.

En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica una cadena concatámero que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene la estructura general en la dirección 5' a 3' de: C'-T-C'-T -X-C', entre al menos un C' y T, están presentes uno o más nucleótidos adicionales que no forman parte de la secuencia C' o T. El uno o más nucleótidos adicionales pueden estar, por ejemplo, entre 1 y 10 , 1 y 20, 1 y 100, o 1 y 1000 nucleótidos.

En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica una cadena concatámero que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene la estructura general en la dirección 5' a 3' de: C'-T-C'-T -X-C', al menos una secuencia C' o T puede faltar uno o más nucleótidos. En el caso de que falten 2 o más nucleótidos, los nucleótidos que faltan pueden ser contiguos o pueden estar en ubicaciones separadas. El uno o más nucleótidos que faltan pueden estar, por ejemplo, entre 1 y 10, 1 y 20, 1 y 100, o 1 y 1000 nucleótidos.

En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica una cadena concatámero que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene la estructura general en la dirección 5' a 3' de: C'-T-C'-T -X-C', al menos una secuencia C' o T puede tener una o más mutaciones puntuales. En el caso de que estén presentes dos o más mutaciones puntuales, las mutaciones puntuales pueden ser contiguas o pueden estar en ubicaciones separadas. La una o más mutaciones puntuales pueden ser, por ejemplo, entre 1 y 10 , 1 y 20, 1 y 100, o 1 y 1000 mutaciones puntuales.

En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica una cadena concatámero que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene la estructura general en la dirección 5' a 3' de: C'-T-C'-T -X-C', la secuencia de nucleótidos tiene dos o las tres de las siguientes características: i) entre al menos un C' y T, están presentes uno o más nucleótidos adicionales que no forman parte de la secuencia C' o T; ii) al menos una secuencia C' o T falta uno o más nucleótidos; y iii) al menos una secuencia C' o T contiene una o más mutaciones puntuales.

En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica una cadena concatámero que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene la estructura general en la dirección 5' a 3' de: C'-T-C'-T -X-C', en las modalidades en las que el molde polinucleotídico es una molécula de ARN, la T puede representar la secuencia de nucleótidos de una secuencia de ADN que es análoga a la secuencia de ARN del molde polinucleotídico.

En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica una cadena concatámero que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene la estructura general en la dirección 5' a 3' de: C'-T-C'-T -X-C', la cadena concatámero comprende, además, uno o más nucleótidos en el extremo 5' de la secuencia C' más situada en el extremo 5'. El uno o más nucleótidos puede estar, por ejemplo, entre 1 y 10 , 1 y 20, 1 y 100, o 1 y 1000 nucleótidos.

En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica una cadena concatámero que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene la estructura general en la dirección 5' a 3' de: C'-T-C'-T -X-C', la cadena concatámero comprende, además, uno o más nucleótidos en el extremo 3' de la secuencia C' más situada en el extremo 3'. El uno o más nucleótidos puede estar, por ejemplo, entre 1 y 10 , 1 y 20, 1 y 100, o 1 y 1000 nucleótidos.

En las modalidades, en la presente descripción se proporciona un método para generar un concatámero que comprende al menos dos copias de un molde de ácido nucleico bicatenario, el método comprende: incubar en una mezcla de reacción al menos una primera molécula molde y una segunda molécula molde, en donde: la primera molécula molde comprende una primera cadena de ácido nucleico y una segunda cadena de ácido nucleico, en donde: la primera cadena de ácido nucleico de la primera molécula molde comprende una secuencia de nucleótidos que tiene la estructura general en la dirección 5' a 3' de: H'-S-Yi-H', en donde: H' representa la secuencia de nucleótidos de una primera secuencia de homología, S representa la secuencia de nucleótidos de una primera cadena del molde de ácido nucleico bicatenario, y Yi representa cualquier número y secuencia de nucleótidos; y la segunda cadena de ácido nucleico de la primera molécula molde comprende una secuencia de nucleótidos que tiene la estructura general en la dirección 5' a 3' de: H-Yi'-S'-H, en donde: H representa la secuencia de nucleótidos de una segunda secuencia de homología, en donde la primera secuencia de homología y la segunda secuencia de homología son complementarias entre sí, Yi' representa una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de Yi, y S' representa la secuencia de nucleótidos de una segunda cadena molde de ácido nucleico bicatenario, en donde la primera cadena y la segunda cadena del molde de ácido nucleico bicatenario son complementarias entre sí; y la segunda molécula molde comprende una primera cadena de ácido nucleico y una segunda cadena de ácido nucleico, en donde: la primera cadena de ácido nucleico de la segunda molécula molde comprende una secuencia de nucleótidos que tiene la estructura general en la dirección 5' a 3' de: H-S-Y2-H', en donde: H' representa la secuencia de nucleótidos de la primera secuencia de homología, S representa la secuencia de nucleótidos de la primera cadena del molde de ácido nucleico bicatenario, e Y2 representa cualquier número y secuencia de nucleótidos; y la segunda cadena de ácido nucleico de la primera molécula molde comprende una secuencia de nucleótidos que tiene la estructura general en la dirección 5' a 3' de: H-Y2-S-H, en donde: H representa la secuencia de nucleótidos de la segunda secuencia de homología, Y2' representa una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de Y2, y S' representa la secuencia de nucleótidos de la segunda cadena del molde de ácido nucleico bicatenario; y después de la incubación de la primera molécula molde con la segunda molécula molde en la mezcla de reacción, se forma al menos un concatámero que comprende al menos dos copias del molde de ácido nucleico bicatenario, en donde el concatámero comprende una primera cadena concatámero y una segunda cadena concatámero, en donde la primera cadena concatámero comprende un extremo 5' y un extremo 3', y comprende una secuencia de nucleótidos que tiene la estructura general en la dirección 5' a 3' de: H'-S-Y2-H'-S-Yi-H', en donde cada uno de H', Yi, S e Y2 representan secuencias de nucleótidos como se describió anteriormente; y en donde la segunda cadena concatámero comprende un extremo 5' y un extremo 3', y comprende una secuencia que tiene la estructura general en la dirección 5' a 3' de: H-Yi'-S'-H-Y2'-S'-H, en donde cada uno de H', Yi, S e Y2 representan secuencias de nucleótidos como se describió anteriormente.

En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica una primera cadena concatámero que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene la estructura general en la dirección 5' a 3' de: H-S-Y2-H-S-Y1-H', al menos uno de o ambos Yi e Y2 pueden representar 0 nucleótidos.

En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica una primera cadena concatámero que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene la estructura general en la dirección 5' a 3' de: H'-S-Y2-H'-S-Yi-H', Yi puede contener una secuencia que tiene la estructura general en la dirección 5' a 3' de [(H'-S)ⁿⁱ] en donde H' y S representan secuencias de nucleótidos como se describe anteriormente, y N i es cualquier número entero entre 0 y 2000.

En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica una primera cadena concatámero que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene la estructura general en la dirección 5' a 3' de: H'-S-Y2-H'-S-Yi-H', Y2 puede contener una secuencia que tiene la estructura general en la dirección 5' a 3' de [(H'-S)ⁿ2] en donde H' y S representan secuencias de nucleótidos como se describe anteriormente, y N2 es cualquier número entero entre 0 y 2000.

En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica una primera molécula molde y una segunda molécula molde, la primera molécula molde y la segunda molécula molde son ambas moléculas de ADN bicatenario.

En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica una primera cadena de ácido nucleico de una primera molécula molde comprenden, en donde la primera cadena de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que tiene la estructura general en la dirección 5'a 3' de: H'-S-Yi-H', en donde H' representa la secuencia de nucleótidos de una primera secuencia de homología, la primera secuencia de homología puede contener no más de 4, 5, 6, 7, 8, 9, i0 , i i , i2 , i3 , i4 , i5 , 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o i00 nucleótidos. En las modalidades, la primera secuencia de homología puede contener al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, i0 , i i , i2 , i3 , i4 , i5 , 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o i00 nucleótidos. En las modalidades, la primera secuencia de homología puede contener al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, i0 , i i , i2 , i3 , i4 , i5 , 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o i00 y no más de 5, 6, 7, 8, 9, i0 , i i , i2 , i3 , i4 , i5 , 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, i 00 o 200 nucleótidos.

En las modalidades, una mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción comprenden una polimerasa de ácido nucleico. En las modalidades, una polimerasa de ácido nucleico es una polimerasa de ADN que tiene actividad de desplazamiento de cadena. En las modalidades, una polimerasa de ácido nucleico es una polimerasa de ARN. En las modalidades, una polimerasa de ácido nucleico es una transcriptasa inversa. En las modalidades, una mezcla de reacción, el recipiente o el kit comprenden más de un tipo de polimerasa de ácido nucleico, tal como una polimerasa de ADN que tiene actividad de desplazamiento de cadena y una transcriptasa inversa. En las modalidades, una mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción comprenden nucleótidos y tampón.

En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica un molde polinucleotídico, el molde polinucleotídico es una molécula monocatenaria. En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica un molde polinucleotídico, el molde polinucleotídico comprende una cadena de un molde de ácido nucleico bicatenario. En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica un molde polinucleotídico, el molde polinucleotídico es una molécula de ADN o ARN.

En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica un molde de ácido nucleico, el molde de ácido nucleico es una molécula de ARN o ADN. En las modalidades, un molde de ácido nucleico puede ser una molécula monocatenaria o bicatenaria.

En las modalidades, en un método proporcionados en la presente descripción que implica la incubación de una mezcla de reacción, durante la incubación de la mezcla de reacción, la temperatura de la mezcla de reacción no excede 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 37, 35, 30, 25, o 20 C. En las modalidades, en un método proporcionado en la presente descripción, todas las etapas del método se realizan a una temperatura no mayor que 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 37, 35, 30, 25, o 20 C. En las modalidades, una mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción se mantiene a una temperatura no mayor que 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 37, 35, 30, 25, o 20 C. En las modalidades, un método proporcionado en la presente descripción se realiza sin termociclado.

En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica un molde polinucleotídico que comprende una primera porción, la primera porción no contiene más de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, o 200 nucleótidos. En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica un molde polinucleotídico que comprende una primera porción, la primera porción contiene al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, o 200 nucleótidos. En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica un molde polinucleotídico que comprende una primera porción, la primera porción contiene al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 y no más de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o 200 nucleótidos.

En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica un cebador que comprende una primera región, la primera región contiene al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 nucleótidos. En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica un cebador que comprende una primera región, la primera región no contiene más de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 nucleótidos. En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica un cebador que comprende una primera región, la primera región contiene al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 y no más de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 nucleótidos. En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica un primer cebador que comprende una primera región y un segundo cebador que comprende una primera región, tanto el primer cebador como el segundo cebador pueden tener cualquiera de las características descritas anteriormente. En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica un primer cebador que comprende una primera región y un segundo cebador que comprende una primera región, la primera región del primer cebador y la primera región del segundo cebador pueden contener el mismo número de nucleótidos. En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica un primer cebador que comprende una primera región y un segundo cebador que comprende una primera región, la primera región del primer cebador y la primera región del segundo cebador pueden contener un número diferente de nucleótidos.

En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica un cebador que comprende una segunda región, la segunda región contiene al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 nucleótidos. En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica un cebador que comprende una segunda región, la segunda región no contiene más de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 nucleótidos. En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica un cebador que comprende una segunda región, la segunda región contiene al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 y no más de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 nucleótidos. En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica un primer cebador que comprende una segunda región y un segundo cebador que comprende una segunda región, tanto el primer cebador como el segundo cebador pueden tener cualquiera de las características descritas anteriormente. En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica un primer cebador que comprende una segunda región y un segundo cebador que comprende una segunda región, la segunda región del primer cebador y la segunda región del segundo cebador pueden contener el mismo número de nucleótidos. En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica un primer cebador que comprende una segunda región y un segundo cebador que comprende una segunda región, la segunda región del primer cebador y la segunda región del segundo cebador pueden contener un número diferente de nucleótidos.

En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que involucra un segundo cebador que contiene una segunda región y un molde polinucleotídico que comprende una segunda porción, la secuencia de nucleótidos de la segunda región del segundo cebador es la misma que la secuencia de nucleótidos de la segunda porción del molde polinucleotídico.

En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica un cebador que comprende una región de cola, la región de cola contiene al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 nucleótidos. En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica un cebador que comprende una región de cola, la región de cola no contiene más de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 nucleótidos. En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica un cebador que comprende una región de cola, la región de cola contiene al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 y no más de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 nucleótidos. En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica un primer cebador que comprende una región de cola y un segundo cebador que comprende una región de cola, tanto el primer cebador como el segundo cebador pueden tener cualquiera de las características descritas anteriormente. En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica un primer cebador que comprende una región de cola y un segundo cebador que comprende una región de cola, la región de cola del primer cebador y la región de cola del segundo cebador pueden contener el mismo número de nucleótidos. En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica un primer cebador que comprende una región de cola y un segundo cebador que comprende una región de cola, la región de cola del primer cebador y la región de cola del segundo cebador pueden contener un número diferente de nucleótidos.

En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica un cebador que comprende una región de unión al molde, la región de unión al molde contiene al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 nucleótidos. En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica un cebador que comprende una región de unión al molde, la región de unión al molde no contiene más de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 nucleótidos. En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica un cebador que comprende una región de unión al molde, la región de unión al molde contiene al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 y no más de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 nucleótidos. En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica un primer cebador que comprende una región de unión al molde y un segundo cebador que comprende una región de unión al molde, tanto el primer cebador como el segundo cebador pueden tener cualquiera de las características descritas anteriormente. En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica un primer cebador que comprende una región de unión al molde y un segundo cebador que comprende una región de unión al molde, la región de unión al molde del primer cebador y la región de unión al molde del segundo cebador pueden contener el mismo número de nucleótidos. En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica un primer cebador que comprende una región de unión al molde y un segundo cebador que comprende una región de unión al molde, la región de unión al molde del primer cebador y la región de unión al molde del segundo cebador pueden contener un número diferente de nucleótidos.

En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica un molde polinucleotídico, el molde polinucleotídico puede contener al menos 8, 9, 10, 11 , 12 , 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000, 2000 o 5000 nucleótidos. En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica un molde polinucleotídico, el molde polinucleotídico puede contener no más de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000 o 10000 nucleótidos. En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica un molde polinucleotídico, el molde polinucleotídico puede contener al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000, 2000 o 5000, y no más de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000 o 10000 nucleótidos.

En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica un molde de ácido nucleico bicatenario, cada cadena del molde de ácido nucleico bicatenario puede contener al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000, 2000 o 5000 nucleótidos. En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica un molde de ácido nucleico bicatenario, cada cadena de del molde de ácido nucleico bicatenario puede contener no más de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000 o 10 000 nucleótidos. En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que implica un molde de ácido nucleico bicatenario, cada cadena del molde de ácido nucleico bicatenario puede contener al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000, 2000 o 5000, y no más de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000 o 10000 nucleótidos.

En las modalidades, una mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción no contiene una enzima recombinasa.

En las modalidades, en un método, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción pueden contener o implicar múltiples copias de un cebador. Las múltiples copias pueden ser, por ejemplo, al menos 5, 10, 15, 20, 50, 100, 500, 1000, 10000, 100000 o 1000000 de copias del cebador.

En las modalidades, una mezcla de reacción o el recipiente proporcionados en la presente descripción pueden comprender al menos una porción de una muestra biológica de un sujeto. La muestra biológica puede ser, por ejemplo, saliva, sangre, orina, un hisopo bucal o un hisopo nasal. El sujeto puede ser un ser humano.

En algunas modalidades, todas las etapas de un método proporcionado en la presente descripción se realizan a una temperatura no superior a 70, 65, 60, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, o 10 C. En algunas modalidades, algunas de las etapas de un método proporcionado en la presente descripción se realizan a una temperatura de no más de 70, 65, 60, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 o 10 C.

En algunas modalidades, dos o más etapas de un método proporcionado en la presente descripción se realizan simultáneamente en la misma mezcla de reacción. En algunas modalidades, todas las etapas de un método proporcionado en la presente descripción se realizan simultáneamente en la misma mezcla de reacción.

En algunas modalidades, en un método proporcionado en la presente descripción, un molde de ácido nucleico se amplifica al menos 10, 100, 1000, 10000, 100000 o 1000000 de veces dentro de 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 120 o 180 minutos desde el inicio del método. En algunas modalidades, en un método proporcionado en la presente descripción, el número de copias de un molde de ácido nucleico en una mezcla de reacción aumenta al menos 10, 100, 1000, 10000, 100000 o 1000000 de veces dentro de 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 120 o 180 minutos desde el inicio del método.

En las modalidades, un molde de ácido nucleico proporcionado en la presente descripción puede ser un molde de ácido nucleico monocatenario o bicatenario.

En las modalidades, en la presente descripción se proporciona un recipiente, que comprende una comunicación fluida en el mismo: un primer cebador en donde el primer cebador comprende una primera región y una segunda región, y en donde la segunda región del primer cebador comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una primera porción de un molde polinucleotídico; un segundo cebador, en donde el segundo cebador comprende una primera región y una segunda región, y en donde la segunda región del segundo cebador comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos asociada, en donde la secuencia de nucleótidos asociada es complementaria a una segunda porción del molde polinucleotídico; y al menos una cadena concatámero, en donde la cadena concatámero comprende un extremo 5' y un extremo 3', y comprende una secuencia de nucleótidos que tiene la estructura general en la dirección 5' a 3' de: C'-T-C'-T -X-C', en donde: C' representa la secuencia de nucleótidos de la primera región del segundo cebador, T representa la secuencia de nucleótidos del molde polinucleotídico o una secuencia análoga de este, y X representa cualquier número y secuencia de nucleótidos.

En algunas modalidades, en la presente descripción se proporciona un recipiente, que comprende en comunicación fluida en el mismo: (A) una polimerasa de ácido nucleico aislada, (B) un molde de ácido nucleico que comprende al menos una primera cadena, (C) un primer cebador que comprende un nucleótido terminal 5', un nucleótido terminal 3' y dos regiones: (i) una región de cola que comprende (a) el nucleótido terminal 5' del cebador (b) un nucleótido más interno, en donde el nucleótido más interno está aguas abajo del nucleótido terminal 5' (c) una sección intermedia entre el nucleótido terminal 5' y el nucleótido más interno, que comprende uno o más nucleótidos, y (ii) una región de unión al molde que comprende (a) el nucleótido terminal 3' del cebador (b) un nucleótido más interno, en donde el nucleótido más interno está aguas arriba del nucleótido terminal 3' (c) una sección intermedia entre el nucleótido terminal 3' y el nucleótido más interno, que comprende uno o más nucleótidos, en donde la región de unión al molde es complementaria a una primera cadena del molde de ácido nucleico, y (D) un segundo cebador que comprende un nucleótido terminal 5', un nucleótido terminal 3' y dos regiones: (i) una región de cola que comprende (a) el nucleótido terminal 5' del cebador (b) un nucleótido más interno, en donde el nucleótido más interno está aguas abajo del nucleótido terminal 5' (c) una sección intermedia entre el nucleótido terminal 5' y el nucleótido más interno, que comprende uno o más nucleótidos, e (ii) una región de unión al molde que comprende (a) el nucleótido terminal 3' del cebador (b) un nucleótido más interno, en donde el nucleótido más interno está aguas arriba del nucleótido terminal 3' (c) una sección intermedia entre el nucleótido terminal 3' y el nucleótido más interno, que comprende uno o más nucleótidos, y en donde la región de unión al molde es complementaria a una secuencia de nucleótidos complementaria a la primera cadena del molde de ácido nucleico, y en donde la región de cola del segundo cebador contiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de la región de cola del primer cebador, si las secuencias de los cebadores están alineadas de manera que el nucleótido terminal 5' del segundo cebador esté alineado con el nucleótido más interno de la región de cola del primer cebador y el nucleótido terminal 5' del primer cebador está alineado con el nucleótido más interno de la región de cola del segundo cebador.

En las modalidades, en la presente descripción se proporciona un kit que comprende dos o más recipientes aislados de forma fluida, los recipientes comprenden conjuntamente: un primer cebador, en donde el primer cebador comprende una primera región y una segunda región, y en donde la segunda región del primer cebador comprende una secuencia de nucleótido que es complementaria a una primera porción de un molde polinucleotídico; un segundo cebador, en donde el segundo cebador comprende una primera región y una segunda región, y en donde la segunda región del segundo cebador comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos asociada, en donde la secuencia de nucleótidos asociada es complementaria a una segunda porción del molde polinucleotídico; y una ADN polimerasa aislada que tiene actividad de desplazamiento de cadena; en donde: la primera región del primer cebador y la primera región del segundo cebador son complementarias.

En algunas modalidades, en la presente descripción se proporciona un kit para detectar un ácido nucleico diana de interés que comprende al menos una primera cadena, el kit comprende dos o más recipientes aislados de forma fluida, los recipientes comprenden conjuntamente: (A) una polimerasa de ácido nucleico aislada, (B) un primer cebador que comprende un nucleótido terminal 5', un nucleótido terminal 3' y dos regiones: (i) una región de cola que comprende (a) el nucleótido terminal 5' del cebador (b) un nucleótido más interno, en donde el nucleótido más interno está aguas abajo del nucleótido terminal 5' (c) una sección intermedia entre el nucleótido terminal 5' y el nucleótido más interno, que comprende uno o más nucleótidos, e (ii) una región de unión al molde que comprende (a) el nucleótido terminal 3' del cebador (b) un nucleótido más interno, en donde el nucleótido más interno está aguas arriba del nucleótido terminal 3' (c) una sección intermedia entre el nucleótido terminal 3' y el nucleótido más interno, que comprende uno o más nucleótidos, en donde la región de unión al molde es complementaria a la primera cadena del ácido nucleico diana, y (C) un segundo cebador que comprende un nucleótido terminal 5', un nucleótido terminal 3' y dos regiones: (i) una región de cola que comprende (a) el nucleótido terminal 5' del cebador (b) un nucleótido más interno, en donde el nucleótido más interno está aguas abajo del nucleótido terminal 5' (c) una sección intermedia entre el nucleótido terminal 5' y el nucleótido más interno, que comprende uno o más nucleótidos e (ii) una región de unión al molde que comprende (a) el nucleótido terminal 3' del cebador (b) un nucleótido más interno, en donde el nucleótido más interno está aguas arriba del nucleótido terminal 3' (c) una sección intermedia entre el nucleótido terminal 3' y el nucleótido más interno, que comprende uno o más nucleótidos, y en donde la región de unión al molde es complementaria a una secuencia de nucleótidos complementaria a la primera cadena del ácido nucleico diana, y en donde la región de cola del segundo cebador contiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de la región de cola del primer cebador, si las secuencias de los cebadores están alineadas de manera que el nucleótido terminal 5' del segundo cebador esté alineado con el nucleótido más interno de la región de cola del primer cebador y el nucleótido terminal 5' del primer cebador está alineado con el nucleótido más interno de la región de cola del segundo cebador.

En algunas modalidades, un kit proporcionado en la presente descripción comprende un ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico diana de interés.

En algunas modalidades, una mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción comprenden un colorante de ácido nucleico.

En algunas modalidades, en un recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que comprende una polimerasa de ácido nucleico aislada, la polimerasa de ácido nucleico aislada es una polimerasa de ADN. En algunas modalidades, en un recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que comprende una polimerasa de ácido nucleico aislada, la polimerasa de ácido nucleico aislada es una transcriptasa inversa. En algunas modalidades, en un recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que comprende una polimerasa de ácido nucleico aislada, el recipiente o el kit comprenden tanto una ADN polimerasa como una transcriptasa inversa.

En algunas modalidades, en un método, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que comprende una polimerasa de ácido nucleico, la polimerasa de ácido nucleico tiene actividad de desplazamiento de cadena.

En algunas modalidades, un método proporcionado en la presente descripción comprende tratar uno o más de los componentes de reacción o etapas del método con un colorante de ácido nucleico.

En algunas modalidades, en un método, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que comprende un molde de ácido nucleico, el molde es una molécula de ADN. En algunas modalidades, en un método, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que comprenden un molde de ácido nucleico, el molde es una molécula de ARN.

En algunas modalidades, en un método, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que comprenden un primer cebador, la región de cola del primer cebador comprende al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos. En algunas modalidades, en un método, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que comprenden un primer cebador, la región de cola del primer cebador comprende no más de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 o 60 nucleótidos.

En algunas modalidades, en un método, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que comprenden un segundo cebador, la región de cola del segundo cebador comprende al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos. En algunas modalidades, en un método, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que comprenden un segundo cebador, la región de cola del segundo cebador comprende no más de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 o 60 nucleótidos.

En algunas modalidades, en un método, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que comprenden un primer cebador, la región de unión al molde del primer cebador comprende al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos. En algunas modalidades, en un método, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que comprenden un primer cebador, la región de unión al molde del primer cebador comprende no más de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 o 60 nucleótidos.

En algunas modalidades, en un método, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que comprenden un segundo cebador, la región de unión al molde del segundo cebador comprende al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos. En algunas modalidades, en un método, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción que comprenden un segundo cebador, la región de unión al molde del segundo cebador comprende no más de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 o 60 nucleótidos.

En algunas modalidades, en los métodos y composiciones proporcionados en la presente descripción en donde una molécula de ARN es la molécula molde o ácido nucleico primario, la amplificación del molde puede referirse a la generación de copias de cadenas de ADN correspondientes a la molécula de ARN.

En algunas modalidades, un método proporcionado en la presente descripción comprende medir una señal fluorescente de un ensayo que comprende el método.

En algunas modalidades, puede incluirse una ligasa de ácido nucleico con un método o composición proporcionados en la presente descripción. En algunas modalidades, un molde de ácido nucleico puede amplificarse más rápidamente con un método proporcionado en la presente descripción cuando se incluye una ligasa en una mezcla de reacción para un método proporcionado en la presente descripción, en comparación a cuando no se incluye una ligasa de ácido nucleico en la reacción. En las modalidades, una mezcla de reacción, el recipiente o el kit proporcionados en la presente descripción puede contener una enzima que tiene actividad ligasa.

En las modalidades, en la presente descripción se proporciona un método para analizar un patógeno en una muestra, el método comprende realizar un método como se proporciona en la presente descripción para amplificar el ácido nucleico del patógeno. En las modalidades, el ácido nucleico diana que se usa en una composición o método proporcionado en la presente descripción puede ser ácido nucleico de un patógeno. En las modalidades, el primer y segundo cebador que se usan en un método proporcionado en la presente descripción pueden contener cada uno regiones que son complementarias a una secuencia en el ácido nucleico del patógeno, o que son complementarias a una secuencia que es complementaria a una secuencia en el ácido nucleico del patógeno. En las modalidades, el ácido nucleico del patógeno puede ser ADN o ARN. Los patógenos pueden incluir, sin limitación, virus, bacterias, hongos y protistas. Una muestra puede ser de un sujeto y puede tener cualquiera de las características de la muestra descritas en otra parte de la presente descripción.

En las modalidades, un método proporcionado en la presente descripción para la amplificación de un ácido nucleico puede usarse para un método de diagnóstico externo a un cuerpo humano o animal. Por ejemplo, puede obtenerse una muestra de un ser humano o animal, y en la muestra puede analizarse un ácido nucleico diana de interés con un método proporcionado en la presente descripción para la amplificación del ácido nucleico.

En las modalidades, un método proporcionado en la presente descripción puede incluir: a) proporcionar uno o más reactivos para realizar un método como se proporciona en la presente descripción (por ejemplo, uno o más del primer cebador, segundo cebador, molde de ácido nucleico, polimerasa de ácido nucleico, nucleótidos, tampón, agua, etcétera) en una mezcla de reacción, y b) incubar la mezcla de reacción a una temperatura sustancialmente isotérmica, en donde la temperatura de la mezcla de reacción no difiera de una temperatura central en más o menos de 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 grado Celsius durante la incubación. En las modalidades, una temperatura central puede ser, por ejemplo, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 u 80 grados Celsius.

En las modalidades, un método proporcionado en la presente descripción puede realizarse a una temperatura sustancialmente isotérmica. En las modalidades, una temperatura sustancialmente isotérmica puede ser cualquiera de 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 u 80 grados Celsius, más o menos 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 grado Celsius.

En las modalidades, un método proporcionado en la presente descripción puede realizarse a una o más temperaturas, ninguna o una que supere los 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30 o 25 grados Celsius.

En las modalidades, los métodos proporcionados en la presente descripción pueden realizarse sin termociclado/las mezclas de reacción pueden incubarse en condiciones sin termociclado (es decir, sin ciclos de aumento y disminución de las temperaturas de incubación para separar cadenas o permitir la hibridación de cebadores como se usa, por ejemplo, en los métodos basados en PCR).

En las composiciones y métodos proporcionados en la presente descripción que implican un primer cebador que comprende una primera región y un segundo cebador que comprende una primera región, en donde la primera región del primer cebador es complementaria a la primera región del segundo cebador, en las modalidades, la primera región del primer cebador y la primera región del segundo cebador contienen secuencias de nucleótidos de manera que una estructura bicatenaria que se formaría mediante el apareamiento de la primera región del primer cebador con la primera región del segundo cebador de acuerdo con las reglas de apareamiento de bases de Watson-Crick no formaría una secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción.

En las composiciones y métodos proporcionados en la presente descripción que implican una polimerasa de ácido nucleico, en las modalidades, la polimerasa de ácido nucleico tiene actividad exonucleasa 3' a 5'.

En las modalidades, en la presente descripción se proporciona un método para amplificar una cadena de ácido nucleico diana, el método comprende: incubar una mezcla de reacción que comprende la cadena de ácido nucleico diana, un primer cebador y un segundo cebador en condiciones sustancialmente isotérmicas, en donde: la cadena del ácido nucleico diana comprende una primera porción y una segunda porción; el primer cebador comprende una primera región y una segunda región, en donde la primera región comprende un extremo 5' del cebador, la segunda región comprende un extremo 3' del cebador y la segunda región es complementaria a la primera porción de la cadena de ácido nucleico; el segundo cebador comprende una primera región y una segunda región, en donde la primera región comprende un extremo 5' del cebador, la segunda región comprende un extremo 3' del cebador y la segunda región es complementaria a una secuencia que es complementaria a la segunda porción de la cadena de ácido nucleico; la primera región del primer cebador es complementaria a la primera región del segundo cebador; y se amplifica la cadena de ácido nucleico diana. Opcionalmente, la cadena de ácido nucleico diana puede comprender, además, una tercera porción en donde la tercera porción está situada en la cadena de ácido nucleico diana entre la primera porción y la segunda porción, y en donde la primera región del segundo cebador es complementaria a la tercera porción de la cadena de ácido nucleico diana.

En las modalidades, en cualquiera de los métodos proporcionados en la presente descripción, un molde polinucleotídico, una cadena de ácido nucleico diana o similar puede contener un motivo interno, en donde la región de cola de un cebador proporcionado en la presente descripción para amplificar la cadena de ácido nucleico diana es complementaria al motivo interno de la cadena.

En las modalidades, un método proporcionado en la presente descripción puede comprender, además, añadir a una mezcla de reacción proporcionada en la presente descripción una sonda de péptido-ácido nucleico (PNA) y un colorante que se une al híbrido ADN-PNA, en donde la sonda de PNA es complementaria a un ácido nucleico diana para amplificación en la mezcla de reacción, o un complemento de este.

En las modalidades, una mezcla de reacción proporcionada en la presente descripción puede comprender una ADN polimerasa que tiene actividad de desplazamiento de cadena.

Cuando un ácido nucleico se describe en la presente descripción como "amplificado" o similar, el ácido nucleico puede describirse, además, como "copiado" o similar.

En las modalidades, en un cebador descrito en la presente descripción por tener una primera región y una segunda región, la primera región puede contener el extremo 5' del cebador y la segunda región puede contener el extremo 3' del cebador.

En las modalidades, en un cebador descrito en la presente descripción como que tiene una región de cola y una región de unión al molde, la primera región puede contener el extremo 5' del cebador y la segunda región puede contener el extremo 3' del cebador.

En las modalidades, en la presente descripción se proporciona un método para copiar un molde polinucleotídico, el método comprende: incubar una mezcla de reacción que comprende el molde polinucleotídico, un primer cebador y un segundo cebador en condiciones sin termociclado, en donde: el molde polinucleotídico comprende una primera porción y una segunda porción; el primer cebador comprende una primera región y una segunda región, en donde la primera región comprende un extremo 5' del cebador, la segunda región comprende un extremo 3' del cebador y la segunda región es complementaria a la primera porción del molde polinucleotídico; el segundo cebador comprende una primera región y una segunda región, en donde la primera región comprende un extremo 5' del cebador, la segunda región comprende un extremo 3' del cebador y la segunda región es complementaria a una secuencia que es complementaria a la segunda porción del molde polinucleotídico; la primera región del primer cebador es complementaria a la primera región del segundo cebador; y se generan múltiples copias del molde polinucleotídico. Opcionalmente, el molde polinucleotídico puede comprender, además, una tercera porción, en donde la tercera porción está situada en el molde polinucleotídico entre la primera porción y la segunda porción, y en donde la primera región del segundo cebador es complementaria a la tercera porción del molde polinucleotídico.

En las modalidades, en la presente descripción se proporciona un método para amplificar un molde polinucleotídico, el método comprende incubar el molde polinucleotídico en una mezcla de reacción que comprende un primer cebador y un segundo cebador, en donde: el molde polinucleotídico comprende una primera porción, una segunda porción y una tercera porción, en donde la tercera porción está situada en el molde polinucleotídico entre la primera porción y la segunda porción; el primer cebador comprende una primera región y una segunda región, en donde la segunda región del primer cebador es complementaria a la primera porción del molde polinucleotídico; y el segundo cebador comprende una primera región y una segunda región, en donde la segunda región del segundo cebador es complementaria a una secuencia que es complementaria a la segunda porción del molde polinucleotídico, la primera región del segundo cebador es complementaria a la primera región del primer cebador, y la primera región del segundo cebador es complementaria a la tercera porción del molde polinucleotídico.

En las modalidades, en la presente descripción se proporciona un método para evaluar la identidad de un nucleótido en una posición de interés en una secuencia de nucleótidos en un molde polinucleotídico, el método comprende: A) proporcionar copias del molde polinucleotídico en cada una de al menos una primera mezcla de reacción y una segunda mezcla de reacción, en donde: el molde polinucleotídico comprende una primera porción, una segunda porción y una tercera porción, en donde la tercera porción está situada en el molde polinucleotídico entre la primera porción y la segunda porción y en donde la posición de interés está en la tercera porción; la primera mezcla de reacción comprende copias del molde polinucleotídico, un primer cebador y un segundo cebador, en donde: el primer cebador comprende una primera región y una segunda región, en donde la primera región comprende un extremo 5' del cebador, la segunda región comprende un extremo 3' del cebador, y la segunda región es complementaria a una primera porción del molde polinucleotídico; el segundo cebador comprende una primera región y una segunda región, en donde la primera región comprende un extremo 5' del cebador, la segunda región comprende un extremo 3' del cebador y la segunda región es complementaria a una secuencia que es complementaria a una segunda porción del molde polinucleotídico; la primera región del primer cebador es complementaria a la primera región del segundo cebador; y la primera región del segundo cebador es complementaria a la tercera porción del molde polinucleotídico; la segunda mezcla de reacción comprende copias del molde polinucleotídico, un tercer cebador y un cuarto cebador, en donde: el tercer cebador comprende una primera región y una segunda región, en donde la primera región comprende un extremo 5' del cebador, la segunda región comprende un extremo 3' del cebador, y la segunda región es complementaria a una primera porción del molde polinucleotídico; el cuarto cebador comprende una primera región y una segunda región, en donde la primera región comprende un extremo 5' del cebador, la segunda región comprende un extremo 3' del cebador y la segunda región es complementaria a una secuencia que es complementaria a una segunda porción del molde polinucleotídico; la primera región del tercer cebador es complementaria a la primera región del cuarto cebador; y la primera región del cuarto cebador es complementaria a la tercera porción del molde polinucleotídico; y la secuencia de nucleótidos de la primera región del segundo cebador difiere de la secuencia de nucleótidos de la primera región del cuarto cebador por un único nucleótido, en donde la posición del nucleótido diferente en el segundo y cuarto cebador corresponde a la posición del nucleótido de interés en el molde polinucleotídico si la secuencia de nucleótidos de la primera región del segundo cebador o cuarto cebador está orientada con la secuencia de nucleótidos de la tercera porción del molde polinucleotídico para una máxima complementación de las secuencias; B) incubar la primera mezcla de reacción y la segunda mezcla de reacción en condiciones sin termociclado; y C) comparar la velocidad o cantidad de amplificación del molde polinucleotídico en la primera mezcla de reacción con la velocidad o cantidad de amplificación del molde polinucleotídico en la segunda mezcla de reacción, en donde la velocidad o cantidad de amplificación del molde polinucleotídico es indicativa del grado de complementación entre la primera región del segundo o cuarto cebador y la secuencia de nucleótidos de la tercera porción del molde polinucleotídico.

Opcionalmente, en las modalidades proporcionadas en la presente descripción que implican un molde polinucleotídico, el molde polinucleotídico es una cadena de ADN.

Opcionalmente, en las modalidades proporcionadas en la presente descripción que implican un molde polinucleotídico, el molde polinucleotídico es una cadena de ARN.

Opcionalmente, en las modalidades proporcionadas en la presente descripción que implican un molde polinucleotídico, el molde polinucleotídico es una cadena de una molécula de ácido nucleico dúplex. En las modalidades, la molécula de ácido nucleico dúplex es una molécula de ADN dúplex o una molécula de ARN dúplex.

Opcionalmente, en las modalidades proporcionadas en la presente descripción que implican una mezcla de reacción, el recipiente o el kit, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit comprende una ADN polimerasa que tiene actividad de desplazamiento de cadena.

Opcionalmente, en las modalidades proporcionadas en la presente descripción que implican una mezcla de reacción, el recipiente o el kit, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit comprende una transcriptasa inversa.

Opcionalmente, en las modalidades proporcionadas en la presente descripción que implican una mezcla de reacción, el recipiente o el kit, la mezcla de reacción, el recipiente o el kit comprende un colorante de ácido nucleico, nucleótidos o tampones.

Opcionalmente, en las modalidades proporcionadas en la presente descripción que implican un molde polinucleotídico que contiene una primera porción, una segunda porción y una tercera porción, el molde polinucleotídico puede tener la estructura general de elementos, en la dirección 3' a 5', de: 1P-1S-3P-2S-2P, en donde "1P" es la primera porción, "IS" es un primer espacio, "3P" es la tercera porción, "2S" es un segundo espacio y "2P" es la segunda porción. El "primer espacio" y el "segundo espacio" son porciones del molde polinucleotídico que contienen nucleótidos que no forman parte de la primera porción, segunda porción o tercera porción. En las modalidades, la primera porción puede tener, por ejemplo, entre 6 y 30 nucleótidos o cualquier otro número de nucleótidos como se describe en otra parte de la presente descripción. En las modalidades, el primer espacio puede ser, por ejemplo, entre 2 y 30 nucleótidos o cualquier otro número de nucleótidos como se describe en otra parte de la presente descripción. En las modalidades, la tercera porción puede tener, por ejemplo, entre 4 y 14 nucleótidos o cualquier otro número de nucleótidos como se describe en otra parte de la presente descripción. En las modalidades, el primer espacio puede ser, por ejemplo, entre 2 y 30 nucleótidos o cualquier otro número de nucleótidos como se describe en otra parte de la presente descripción. En las modalidades, la primera porción puede tener, por ejemplo, entre 6 y 30 nucleótidos o cualquier otro número de nucleótidos como se describe en otra parte de la presente descripción.

En las modalidades, en los métodos proporcionados en la presente descripción que implican la incubación de un molde polinucleotídico en una mezcla de reacción, puede generarse una cadena concatámero que comprende al menos 2 , 3, 4, 5 o 10 copias del molde polinucleotídico durante la incubación de la mezcla de reacción.

En las modalidades, en la presente descripción se proporciona un método para amplificar una molécula de ácido nucleico bicatenario, el método comprende incubar la molécula de ácido nucleico bicatenario en una mezcla de reacción que comprende un primer cebador y un segundo cebador, en donde: la molécula de ácido nucleico bicatenario comprende una primera cadena y una segunda cadena, en donde la primera cadena comprende una primera porción y una tercera porción y la segunda cadena comprende una segunda porción; el primer cebador comprende una primera región y una segunda región, en donde la segunda región del primer cebador es complementaria a la primera porción de la primera cadena; y el segundo cebador comprende una primera región y una segunda región, en donde la segunda región del segundo cebador es complementaria a la segunda porción de la segunda cadena, la primera región del segundo cebador es complementaria a la tercera porción de la primera cadena, y la primera región del segundo cebador es complementaria a la primera región del primer cebador.

En las modalidades, en la presente descripción se proporciona una mezcla de reacción que comprende: un molde polinucleotídico, un primer cebador y un segundo cebador, en donde: el molde polinucleotídico comprende una primera porción, una segunda porción y una tercera porción, en donde la tercera porción está situada en el molde polinucleotídico entre la primera porción y la segunda porción; el primer cebador comprende una primera región y una segunda región, en donde la primera región comprende un extremo 5' del cebador, la segunda región comprende un extremo 3' del cebador y la segunda región es complementaria a la primera porción del molde polinucleotídico; el segundo cebador comprende una primera región y una segunda región, en donde la primera región comprende un extremo 5' del cebador, la segunda región comprende un extremo 3' del cebador y la segunda región es complementaria a una secuencia que es complementaria a la segunda porción del molde polinucleotídico; la primera región del primer cebador es complementaria a la primera región del segundo cebador; y la primera región del segundo cebador es complementaria a la tercera porción del molde polinucleotídico.

En las modalidades, en la presente descripción se proporciona un kit para la amplificación de un molde polinucleotídico, el kit comprende: un primer cebador y un segundo cebador, en donde: el primer cebador comprende una primera región y una segunda región, en donde la primera región comprende un extremo 5' del cebador, la segunda región comprende un extremo 3' del cebador, y la segunda región es complementaria a una primera porción del molde polinucleotídico; el segundo cebador comprende una primera región y una segunda región, en donde la primera región comprende un extremo 5' del cebador, la segunda región comprende un extremo 3' del cebador y la segunda región es complementaria a una secuencia que es complementaria a una segunda porción del molde polinucleotídico; la primera región del primer cebador es complementaria a la primera región del segundo cebador; y la primera región del segundo cebador es complementaria a una tercera porción del molde polinucleotídico, en donde la tercera porción está situada en el molde polinucleotídico entre la primera porción y la segunda porción.

Opcionalmente, en las modalidades proporcionadas en la presente descripción que implican un kit, los componentes del kit pueden distribuirse entre al menos dos recipientes separados aislados de forma fluida.

En las modalidades, en la presente descripción se proporciona un kit que comprende dos o más recipientes aislados de forma fluida, los recipientes comprenden conjuntamente: un primer cebador, un segundo cebador, un tercer cebador y un cuarto cebador, en donde: el primer cebador comprende una primera región y una segunda región, en donde la primera región comprende un extremo 5' del cebador, la segunda región comprende un extremo 3' del cebador y la segunda región es complementaria a una primera porción de un molde polinucleotídico; el segundo cebador comprende una primera región y una segunda región, en donde la primera región comprende un extremo 5' del cebador, la segunda región comprende un extremo 3' del cebador y la segunda región es complementaria a una secuencia que es complementaria a una segunda porción del molde polinucleotídico; el tercer cebador comprende una primera región y una segunda región, en donde la primera región comprende un extremo 5' del cebador, la segunda región comprende un extremo 3' del cebador y la segunda región es complementaria a la primera porción del molde polinucleotídico; el cuarto cebador comprende una primera región y una segunda región, en donde la primera región comprende un extremo 5' del cebador, la segunda región comprende un extremo 3' del cebador y la segunda región es complementaria a una secuencia que es complementaria a una segunda porción del molde polinucleotídico; la primera región del primer cebador es complementaria a la primera región del segundo cebador; la primera región del tercer cebador es complementaria a la primera región del cuarto cebador; y la secuencia de nucleótidos de la primera región del primer cebador difiere de la secuencia de nucleótidos de la primera región del tercer cebador en un único nucleótido. Opcionalmente, la primera región del segundo cebador y la primera región del cuarto cebador son ambas complementarias a una tercera porción del molde polinucleotídico, en donde la tercera porción está situada en el molde polinucleotídico entre la primera porción y la segunda porción. Opcionalmente, la segunda región de cada uno del primer cebador, segundo cebador, tercer cebador y cuarto cebador tiene una longitud de entre 6 y 30 nucleótidos. Opcionalmente, la segunda región de cada uno del primer cebador, segundo cebador, tercer cebador y cuarto cebador tiene una longitud de entre 6 y 30 nucleótidos.

En las modalidades proporcionadas en la presente descripción que implican un kit, el kit puede comprender una cadena de ácido nucleico de control que comprende la secuencia de nucleótidos de un molde polinucleotídico para detectarse con los reactivos del kit.

En los métodos y composiciones proporcionados en la presente descripción, opcionalmente, pueden incluirse una sonda de PNA y el colorante DiSc2(5). La sonda de PNA puede aparearse específicamente con una secuencia diana para la amplificación en la reacción relevante, y copias de esta, de manera que se formen dúplex de ADN-PNA. Los métodos proporcionados en la presente descripción pueden incluir la detección de un cambio de color del colorante DiSc2(5) después de la unión del colorante a los dúplex de ADN-PNA. En las modalidades, pueden añadirse una sonda de PNA y un colorante a una mezcla de reacción proporcionada en la presente descripción, después del inicio o después de la finalización de la reacción. En las modalidades, puede añadirse una sonda de PNA y un colorante a una mezcla de reacción proporcionada en la presente descripción al menos 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 minutos después del inicio de la reacción. En las modalidades, puede añadirse una sonda de PNA y un colorante a una mezcla de reacción proporcionada en la presente descripción no más de 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 minutos después del inicio de la reacción.

Las referencias en la presente descripción para generar una copia o amplificar un molde polinucleotídico o molde de ácido nucleico incluyen la generación de una copia que contiene la secuencia del molde polinucleotídico / molde de ácido nucleico, así como también generar una copia que contiene una secuencia análoga del molde polinucleotídico / molde de ácido nucleico, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, si un molde polinucleotídico es ARN, generar una copia del molde puede incluir generar una copia que es una molécula de ADN que contiene la versión de ADN de la secuencia de ARN del molde polinucleotídico (es decir, en la secuencia de ADN, contiene "T" s en lugar de "U").

Breve descripción de los dibujos

En los dibujos,

La FIGURA 1 es un esquema general de un método proporcionado en la presente descripción; los paneles 1A-1K representan las etapas o características del método. La FIGURA 1 incluye las siguientes secuencias de nucleótidos: 103: AACGGTTGCTC (SEQ ID NO: 1); 104: GAGCAACCGTT (SEQ ID NO: 2); 105: ATGGGAGC (SEQ ID NO: 3); 106: CCATAACG (SEQ ID NO: 4); 111: ATGGGAGCAACCGTT (SEQ ID NO: 5); 112: CCATAACGGTTGCTCCCAT (SEQ ID NO: 6); 113: ATGGGAGCAACCGTTATGG (SEQ ID NO: 7); 121: CCATAACGGTTGCTCCCATAACGGTTGCTCCCAT (SEQ ID NO: 8); 122:

ATGGGAGCAACCGTTATGGGAGCAACCGTTATGG (SEQ ID NO: 9).

La FIGURA 2A muestra secuencias de nucleótidos de determinados cebadores usados con métodos proporcionados en la presente descripción. La FIGURA 2A incluye las siguientes secuencias de nucleótidos: cebador P1, 37 nucleótidos: CGCCGGATGGCTCTTGGGAAACCAAACCGTACCAACC (SEQ ID NO: 10);

Cebador P1, 35 nucleótidos: CCGGATGGCTCTTGGGAAACCAAACCGTACCAACC (SEQ ID NO: 11);

Cebador P1, 33 nucleótidos: GGATGGCTCTTGGGAAACCAAACCGTACCAACC (SEQ ID NO: 12); Cebador

P1, 31 nucleótidos: ATGGCTCTTGGGAAACCAAACCGTACCAACC (SEQ ID NO: 13);

Cebador P1, 30 nucleótidos: TGGCTCTTGGGAAACCAAACCGTACCAACC (SEQ ID NO: 14); Cebador P1, 29 nucleótidos: GGCTCTTGGGAAACCAAACCGTACCAACC (SEQ ID NO: 15); Cebador P1, 28 nucleótidos:

GCTCTTGGGAAACCAAACCGTACCAACC (SEQ ID NO: 16); Cebador P1, 27 nucleótidos: CTCTTGGGAAACCAAACCGTACCAACC (SEQ ID NO: 17); Cebador P1, 26 nucleótidos:

TCTTGGGAAACCAAACCGTACCAACC (SEQ ID NO: 18); Cebador P1, 25 nucleótidos:

CTTGGGAAACCAAACCGTACCAACC (SEQ ID NO: 19); Cebador P1, 24 nucleótidos:

TTGGGAAACCAAACCGTACCAACC (SEQ ID NO: 20); Cebador P1, 23 nucleótidos:

TGGGAAACCAAACCGTACCAACC (SEQ ID NO: 21); Cebador P2, 36 nucleótidos:

GTTTCCCAAGAGCCATCCGGCGATGCGGAATGTACC (SEQ ID NO: 22); Cebador P2, 34 nucleótidos:

GTTTCCCAAGAGCCATCCGGATGCGGAATGTACC (SEQ ID NO: 23); Cebador P2, 32 nucleótidos:

GTTTCCCAAGAGCCATCCATGCGGAATGTACC (SEQ ID NO: ); Cebador P2, 30 nucleótidos GTTTCCCAAGAGCCATATGCGGAATGTACC (SEQ ID NO: 25); ; Cebador P2, 29 nucleótidos GTTTCCCAAGAGCCAATGCGGAATGTACC (SEQ ID NO: 26); Cebador P2, 28 nucleotides GTTTCCCAAGAGCCATGCGGAATGTACC (SEQ ID NO: 27); Cebador P2, 27 nucleótidos GTTTCCCAAGAGCATGCGGAATGTACC (SEQ ID NO: 28); Cebador P2, 26 nucleótidos GTTTCCCAAGAGATGCGGAATGTACC (SEQ ID NO: 29); Cebador P2, 25 nucleótidos GTTTCCCAAGAATGCGGAATGTACC (SEQ ID NO: 30); Cebador P2, 24 GTTTCCCAAGATGCGGAATGTACC (SEQ ID NO: 31); ' ebador P2, 23 nucleótidos GTTTCCCAAATGCGGAATGTACC (SEQ ID NO: 32); y Cebador P2, 22 nucleótidos GTTTCCCAATGCGGAATGTACC (SEQ ID NO: 33).

La FIGURA 2B es un gráfico que representa los resultados de las reacciones realizadas de acuerdo con un método proporcionado en la presente descripción.

Las FIGURAS 3A y 3B muestran las secuencias de nucleótidos de determinados cebadores usados con los métodos proporcionados en la presente descripción. La FIGURA 3A incluye las siguientes secuencias de nucleótidos: C5:

ATGGCTCTTGGGAAACTGAAACCGTACCAACC (SEQ ID NO: 34); D5:

GTTTCCCAAGAGCCATGGATGCGGAATGTACC (SEQ ID NO: 35); C6:

GGCTCTTGGGAAACTGAAACCGTACCAACC (SEQ ID NO: 36); D6:

GTTTCCCAAGAGCCGGATGCGGAATGTACC (SEQ ID NO: 37); C7:

CTCTTGGGAAACTGAAACCGTACCAACC (SEQ ID NO: 38); D7:

GTTTCCCAAGAGGGATGCGGAATGTACC (SEQ ID NO: 39); C8:

TCTTGGGAAACTGAAACCGTACCAACC (SEQ ID NO: 40); D8:

GTTTCCCAAGAGGATGCGGAATGTACC (SEQ ID NO: 41); C9:

CTTGGGAAACTGAAACCGTACCAACC (SEQ ID NO: 42); D9:

GTTTCCCAAGGGATGCGGAATGTACC (SEQ ID NO: 43); C10:

TTGGGAAACTGAAACCGTACCAACC (SEQ ID NO: 44); D10:

GTTTCCCAAGGATGCGGAATGTACC (SEQ ID NO: 45); C11:

TGGGAAACTGAAACCGTACCAACC (SEQ ID NO: 46); D11:

GTTTCCCAGGATGCGGAATGTACC (SEQ ID NO: 47); C12:

GGGAAACTGAAACCGTACCAACC (SEQ ID NO: 48); y D12:

GTTTCCCGGATGCGGAATGTACC (SEQ ID NO: 49). La FIGURA 3B incluye las siguientes secuencias de nucleótidos: A1: ATGGCTCTTGGGAAACTGCCTGAAACCGTACCAACC (SEQ ID NO: 50); B1:

GTTTCCCAAGAGCCATACAGGGATGCGGAATGTACC (SEQ ID NO: 51); A2:

GGCTCTTGGGAAACTGCCTGAAACCGTACCAACC (SEQ ID NO: 52); B2:

GTTTCCCAAGAGCCACAGGGATGCGGAATGTACC (SEQ ID NO: 53); A3:

CTCTTGGGAAACTGCCTGAAACCGTACCAACC (SEQ ID NO: 54); B3:

GTTTCCCAAGAGACAGGGATGCGGAATGTACC (SEQ ID NO: 55); A4:

TCTTGGGAAACTGCCTGAAACCGTACCAACC (SEQ ID NO: 56); B4:

GTTTCCCAAGAACAGGGATGCGGAATGTACC (SEQ ID NO: 57); A5:

CTTGGGAAACTGCCTGAAACCGTACCAACC (SEQ ID NO: 58); B5:

GTTTCCCAAGACAGGGATGCGGAATGTACC (SEQ ID NO: 59); A6:

TTGGGAAACTGCCTGAAACCGTACCAACC (SEQ ID NO: 60); B6:

GTTTCCCAAACAGGGATGCGGAATGTACC (SEQ ID NO: 61); A7:

TGGGAAACTGCCTGAAACCGTACCAACC (SEQ ID NO: 62); B7:

GTTTCCCAACAGGGATGCGGAATGTACC (SEQ ID NO: 63); A8:

GGGAAACTGCCTGAAACCGTACCAACC (SEQ ID NO: 64); y B8:

GTTTCCCACAGGGATGCGGAATGTACC (SEQ ID NO: 65).

Las FIGURAS 3C y 3D son gráficos que representan los resultados de las reacciones realizadas de acuerdo con un método proporcionado en la presente descripción.

La FIGURA 4 es un gráfico que representa los resultados de las reacciones realizadas de acuerdo con un método proporcionado en la presente descripción.

La FIGURA 5 es un gráfico que representa los resultados de las reacciones realizadas de acuerdo con un método proporcionado en la presente descripción.

La FIGURA 6 es un gráfico que representa los resultados de las reacciones realizadas de acuerdo con un método proporcionado en la presente descripción.

La FIGURA 7 es un alineamiento de secuencia que representa las secuencias de nucleótidos de los productos generados en reacciones realizadas de acuerdo con un método proporcionado en la presente descripción. La FIGURA 7 incluye las siguientes secuencias de nucleótidos (en orden desde la secuencia superior en la alineación hasta la secuencia interioren la alineación): SEQ ID NO: 66:

TCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTTGTACAGAAGGGGAA

GACCAAATTCTTGAGA; SEQ fD NO: 67:

TCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTTGTACAGAAGGGGAA

GACCAAATTCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTT; SEQ ID

NO: 68:

T'CTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTTGTACAGAAGGGGAA

GACCAAATTCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTT; SEQ ID

NO: 69:

TCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTTGTACAGAAGGGGAA

G ACCAAATTCTTG AGAG AACCCACTAACAGTAGAAGTACCAT ACATTT; SEQ ID

NO: 70:

TCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTI’GTACTGAAGGGGAA

GACCAAATTCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTT; SEQ ID

NO: 71:

T CTT G AGAGAACC C ACTAACAGTAGAAGTAC C ATACATTT GT AC AGAAGGGGAA

GACCAAATT’CTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTT; SEQ ID

NO: 72:

GACCAAATTCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTT; SEQ ID

NO: 74:

TCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTTGTACAGAAGGGGAA

GACCAAATTCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTT; SEQ ID

NO: 75:

TCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTl’GTACAGAAGGGGAA

GACCAATTCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTT; SEQ ID

NO: 76:

GAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTTGTACAGAAGGGGAAGACCAAAT

GAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTT; SEQ ID NO: 77:

TCTTGAGAGAACCCACTAACTCTTGAGAGAACCCACTAAC; y la SEQ ID NO: 78:

GGAAGACCAAATTCTTGAGA.

Las FIGURAS 8A-8C son esquemas generales de las características de modalidades de moléculas proporcionadas en la presente descripción.

La FIGURA 9 es un esquema general de las características de modalidades de moléculas proporcionadas en la presente descripción.

Las FIGURAS 10A-10C son esquemas generales de las características de modalidades de moléculas proporcionadas en la presente descripción.

La FIGURA 11 es un gráfico que representa los resultados de las reacciones realizadas de acuerdo con un método proporcionado la presente descripción.

La FIGURA 12 es un gráfico que representa los resultados de las reacciones realizadas de acuerdo con un método proporcionado en la presente descripción.

Se observa que los dibujos y elementos en ellos no están necesariamente dibujados a forma o escala. Por ejemplo, la forma o escala de los elementos de los dibujos pueden simplificarse o modificarse para facilitar o claridad de la presentación. Además, debe entenderse que los dibujos y elementos de los mismos son únicamente con fines ilustrativos y representativos, y no deben interpretarse como limitantes de ninguna manera.

Descripción detallada

Las modalidades específicas se muestran a modo de ejemplo en los dibujos y se describirán en detalle en la presente descripción. Debe entenderse, sin embargo, que no existe la intención de limitar la invención a las formas particulares descritas.

En algunas modalidades, en la presente descripción se proporcionan métodos y composiciones relacionados con la amplificación de ácidos nucleicos y la generación de concatámeros.

En los métodos proporcionados en la presente descripción, la generación de concatámeros de ácido nucleico también amplifica el número de copias del molde de ácido nucleico / ácido nucleico particular en el concatámero. Por consiguiente, en la presente descripción las referencias a métodos y composiciones para la generación de concatámeros también se aplican a la amplificación de ácidos nucleicos.

Como se usa en la presente descripción, un "polinucleótido" se refiere a una cadena polimérica que contiene dos o más nucleótidos. "Polinucleótidos" incluye cebadores, oligonucleótidos, cadenas de ácido nucleico, etcétera. Un polinucleótido puede contener nucleótidos estándar o no estándar. Típicamente, un polinucleótido contiene un fosfato 5' en un extremo (“extremo 5'”) y un grupo hidroxilo 3' en el otro extremo (“extremo 3'”) de la cadena. El nucleótido más 5' de un polinucleótido puede denominarse en la presente descripción el “nucleótido terminal 5'” del polinucleótido. El nucleótido más 3' de un polinucleótido puede denominarse en la presente descripción el “nucleótido terminal 3'” del polinucleótido.

El término "aguas abajo" como se usa en la presente descripción en el contexto de un polinucleótido que contiene un nucleótido terminal 5' y un nucleótido terminal 3' se refiere a una posición en el polinucleótido que está más cerca del nucleótido terminal 3' que una posición de referencia en el polinucleótido. Por ejemplo, en un cebador que tiene la secuencia: 5' ATAAGC 3', la "G" está aguas abajo de la "T" y de todas las "A".

El término "cadena arriba" como se usa en la presente descripción en el contexto de un polinucleótido que contiene un nucleótido terminal 5' y un nucleótido terminal 3', se refiere a una posición en el polinucleótido que está más cerca del nucleótido terminal 5' que una posición de referencia en el polinucleótido. Por ejemplo, en un cebador que tiene la secuencia: 5' ATAAGC 3', la "T" está aguas arriba de la "G", la "C" y las dos "A" más cercanas a la "G".

Como se usa en la presente descripción, "ácido nucleico" incluye tanto ADN como ARN, que incluye los ADN y ARN que contienen nucleótidos no estándar. Un "ácido nucleico" contiene al menos un polinucleótido (una "cadena de ácido nucleico"). Un "ácido nucleico" puede ser monocatenario o bicatenario.

Como se usa en la presente descripción, un "concatámero" se refiere a una molécula de ácido nucleico que contiene en su interior dos o más copias de un ácido nucleico particular, en el que las copias están unidas en serie. Dentro del concatámero, las copias del ácido nucleico particular pueden unirse directamente entre sí, o pueden unirse indirectamente (por ejemplo, puede haber nucleótidos entre las copias del ácido nucleico particular). En un ejemplo, el ácido nucleico particular puede ser el de un molde de ácido nucleico bicatenario, de manera que un concatámero puede contener dos o más copias del molde de ácido nucleico bicatenario. En otro ejemplo, el ácido nucleico particular puede ser el de un molde polinucleotídico, de manera que un concatámero puede contener dos o más copias del molde polinucleotídico.

Como se usa en la presente descripción, un ácido nucleico o molécula "diana" se refiere a un ácido nucleico de interés. Un ácido nucleico/molécula diana puede ser de cualquier tipo, que incluye ADN o ARN monocatenario o bicatenario (por ejemplo, ARNm).

Como se usa en la presente descripción, las secuencias "complementarias" se refieren a dos secuencias de nucleótidos que, cuando se alinean en sentido antiparalelo entre sí, contienen múltiples bases de nucleótidos individuales que pueden aparearse entre sí de acuerdo con las reglas estándar de apareamiento de bases (por ejemplo, AT, g C o AU), de manera que las moléculas que contienen las secuencias puedan aparearse específicamente entre sí. No es necesario que cada base de nucleótidos en dos secuencias sea capaz de aparearse entre sí para que las secuencias se consideren "complementarias". Las secuencias pueden considerarse complementarias, por ejemplo, si al menos 30 %, 40 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de las bases de nucleótidos en dos secuencias pueden aparearse entre sí cuando las secuencias están alineadas de manera óptima para la complementación. Además, las secuencias aún pueden considerarse "complementarias" cuando las longitudes totales de las dos secuencias son significativamente diferentes entre sí. Por ejemplo, un cebador de 15 nucleótidos puede considerarse "complementario" de un polinucleótido más largo que contiene cientos de nucleótidos si múltiples bases de los nucleótidos individuales del cebador pueden aparearse con las bases de nucleótidos en el polinucleótido más largo cuando el cebador está alineado en sentido antiparalelo a una región particular del polinucleótido más largo. Además, las secuencias "complementarias" pueden contener uno o más análogos de nucleótidos o análogos de nucleobase. Como se usa en la presente descripción, "perfectamente complementaria" o "complementación perfecta" o similares se refiere a dos secuencias que son 100 % complementarias entre sí (es decir, donde no hay errores de apareamiento entre los nucleótidos de las secuencias cuando las secuencias se aparean para una máxima complementación).

Como se usa en la presente descripción, el término "aislado" aplicado a proteínas, ácidos nucleicos u otras biomoléculas se refiere a una molécula que se purificó o separó de un componente de su entorno natural (por ejemplo, una proteína purificada de una célula en la cual se produce de manera natural). Una molécula "aislada" puede estar en contacto con otras moléculas (por ejemplo, como parte de una mezcla de reacción). Como se usa en la presente descripción, las moléculas "aisladas" también incluyen proteínas o ácidos nucleicos que se producen de manera recombinante que tienen una secuencia de aminoácidos o nucleótidos que se producen de manera natural. Los ácidos nucleicos "aislados" incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos contenidas en células que normalmente expresan el polipéptido donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una ubicación cromosómica diferente a la de las células naturales. En algunas modalidades, los polipéptidos "aislados" se purifican hasta al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 100 % de homogeneidad como se evidencia por SDS-PAGE de los polipéptidos seguido del método de tinción con azul Coomassie, plata u otro método de tinción de proteínas.

Como se usa en la presente descripción, una molécula de ácido nucleico que se describe como que contiene la "secuencia" de un molde u otro ácido nucleico también puede considerarse que contiene el molde u otro ácido nucleico en sí misma (por ejemplo, una molécula que se describe como que contiene la secuencia de un molde también puede describirse como que contiene el molde), a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Como se usa en la presente descripción, cuando un primer polinucleótido se describe como "hibridado", "que hibrida" o similar con un segundo polinucleótido, la totalidad del primer polinucleótido o cualquier porción de este pueden hibridar con el segundo polinucleótido y viceversa.

Como se usa en la presente descripción, una referencia a "tratar" un objeto dado a una condición u otro objeto o similar se refiere a exponer directa o indirectamente el objeto dado a la condición u otro objeto mencionado. Por lo tanto, aunque una etapa de "tratamiento" puede implicar una acción relacionada distinta (por ejemplo, añadir una enzima a un recipiente, agitar un recipiente, etcétera), no todas las etapas de "tratamiento" requieren una acción relacionada distinta. Por ejemplo, una reacción que implica uno o más reactivos puede establecerse en un recipiente, y una vez que se ha iniciado la reacción, pueden ocurrir múltiples eventos o etapas en el recipiente sin más intervención humana o mecánica con los contenidos del recipiente. Uno o más de estos múltiples eventos o etapas en el recipiente pueden describirse como "tratar" un objeto en el recipiente, incluso si no se produce una intervención separada con los contenidos del recipiente después del inicio de la reacción.

Las modalidades de los métodos y composiciones proporcionados en la presente descripción pueden describirse con referencia a la Figura 1. Puede proporcionarse un ácido nucleico primario 101 (Figura 1A). El ácido nucleico primario 101 puede contener la secuencia de un molde de ácido nucleico 102. El molde de ácido nucleico 102 puede ser un ácido nucleico bicatenario que contiene una primera cadena 103 y una segunda cadena 104. En la Figura 1, la primera cadena 103 del molde de ácido nucleico bicatenario tiene una secuencia de nucleótidos ilustrativa en la dirección 5' a 3' de: AACGGTTGCTC (SEQ ID NO: 1). La primera cadena 103 también contiene un nucleótido terminal 5' (la A más 5') y un nucleótido terminal 3' (la C más 3'). La segunda cadena 104 tiene una secuencia de nucleótidos ilustrativa en la dirección 5' a 3' de: GAGCAACCGTT (SEQ ID NO: 2). La segunda cadena 104 también contiene un nucleótido terminal 5' (la G más 5') y un nucleótido terminal 3' (la T más 3').

También pueden proporcionarse un primer cebador 105 y un segundo cebador 106 (Figura 1B). En la Figura 1, el primer cebador 105 tiene una secuencia de nucleótidos ilustrativa en la dirección 5' a 3' de: ATGGGAGC (SEQ ID NO: 3). El primer cebador también contiene un nucleótido terminal 5' (la A más 5') y un nucleótido terminal 3' (la C más 3'). El segundo cebador 106 tiene una secuencia de nucleótidos ilustrativa en la dirección 5' a 3' de: CCATAACG (SEQ ID NO: 4). El segundo cebador también contiene un nucleótido terminal 5' (la C más 5') y un nucleótido terminal 3' (la G más 3'). Aunque el molde de ácido nucleico 102 de la Figura 1 tiene una longitud de 11 nucleótidos y una secuencia de nucleótidos ilustrativa, estos son ilustrativos y no deben considerarse limitantes.

El primer cebador 105 puede comprender dos regiones: i) una región de cola y ii) una región de unión al molde (región "molde"). La región de cola del primer cebador 105 puede contener tres componentes: a) el nucleótido terminal 5' del cebador, b) un nucleótido más interno, en donde el nucleótido más interno está aguas abajo del nucleótido terminal 5', y c) una sección intermedia entre el nucleótido terminal 5' y el nucleótido más interno, que comprende uno o más nucleótidos. En la Figura 1, la región de cola del primer cebador 105 tiene una secuencia de nucleótidos ilustrativa en la dirección 5' a 3' de: ATGG, de la cual el nucleótido terminal 5' del cebador es la A, la sección central es la TG del medio, y el nucleótido más interno es la G más 3'. La región de unión al molde del primer cebador 105 puede contener tres componentes: a) el nucleótido terminal 3' del cebador, b) un nucleótido más interno, en donde el nucleótido más interno está aguas arriba del nucleótido terminal 3', y c) una sección intermedia entre el nucleótido terminal 3' y el nucleótido más interno, que comprende uno o más nucleótidos. En la Figura 1, la región de unión al molde del primer cebador 105 tiene una secuencia de nucleótidos ilustrativa en la dirección 5' a 3' de: GAGC, de la cual el nucleótido terminal 3' del cebador es la C, la sección central es la AG del medio, y el nucleótido más interno es la G más 5'.

El segundo cebador 106 puede comprender dos regiones: i) una región de cola y ii) una región de unión al molde. La región de cola del primer cebador 106 puede contener tres componentes: a) el nucleótido terminal 5' del cebador, b) un nucleótido más interno, en donde el nucleótido más interno está aguas abajo del nucleótido terminal 5', y c) una sección intermedia entre el nucleótido terminal 5' y el nucleótido más interno, que comprende uno o más nucleótidos. En la Figura 1, la región de cola del segundo cebador 106 tiene una secuencia de nucleótidos ilustrativa en la dirección 5' a 3' de: CCAT, de la cual el nucleótido terminal 5' del cebador es la C más 5', la sección central es la CA del medio, y el nucleótido más interno es la T. La región de unión al molde del segundo cebador 106 puede contener tres componentes: a) el nucleótido terminal 3' del cebador, b) un nucleótido más interno, en donde el nucleótido más interno está aguas arriba del nucleótido terminal 3', y c) una sección intermedia entre el nucleótido terminal 3' y el nucleótido más interno, que comprende uno o más nucleótidos. En la Figura 1, la región de unión al molde del segundo cebador 106 tiene una secuencia de nucleótidos ilustrativa en la dirección 5' a 3' de: AACG, de la cual el nucleótido terminal 3' del cebador es la G, la sección central es la AC del medio, y el nucleótido más interno es la A más 5'.

En algunas modalidades, la región de cola del segundo cebador puede contener una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de la región de cola del primer cebador, si las secuencias de los cebadores están alineadas de manera que el nucleótido terminal 5' del segundo cebador está alineado con el nucleótido más interno de la región de cola del primer cebador y el nucleótido terminal 5' del primer cebador está alineado con el nucleótido más interno de la región de cola del segundo cebador. Por ejemplo, en la Figura 1, la región de cola del segundo cebador 106 tiene una secuencia de nucleótidos en la dirección 5' a 3' de CCAT, y la región de cola del primer cebador 105 tiene una secuencia de nucleótidos en la dirección 5' a 3' de ATGG. Estas secuencias son complementarias cuando el nucleótido terminal 5' del segundo cebador (C) está alineado con el nucleótido más interno de la región de cola del primer cebador (G) y el nucleótido terminal 5' del primer cebador (A) está alineado con el nucleótido más interno de la región de cola del segundo cebador (T) 107 (Figura 1B).

Debe notarse que aunque la región de cola del segundo cebador puede contener una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de la región de cola del primer cebador, típicamente, los productos formados por la hibridación del primer cebador con el segundo cebador no son convenientes o útiles para los métodos o composiciones proporcionados en la presente descripción. Por consiguiente, en algunas modalidades, pueden implementarse etapas para minimizar la formación de productos híbridos del primer cebador -segundo cebador. Tales etapas pueden incluir, por ejemplo, no incubar previamente un primer cebador y un segundo cebador en condiciones en las que los cebadores pueden interactuar durante un período de tiempo prolongado antes de iniciar un método proporcionado en la presente descripción.

El ácido nucleico primario 101 puede tratarse con una primera copia del primer cebador 105a y una polimerasa 108 en condiciones tales que la región de unión al molde de la primera copia del primer cebador 105a se hibrida con la primera cadena del molde de ácido nucleico 103. (Figura 1C) y se forma un producto de extensión de la primera copia del primer cebador 111 (Figura ID). La polimerasa 108 puede catalizar la formación del producto de extensión de la primera copia del primer cebador 111. La polimerasa puede tener actividad de desplazamiento de cadena. Durante la síntesis del producto de extensión de la primera copia del primer cebador 111 , la polimerasa puede desplazar la segunda cadena del molde de ácido nucleico 104 de la primera cadena del molde de ácido nucleico 103. Típicamente, el producto de extensión se genera a partir del extremo 3' de la primera copia del primer cebador 105a. Durante la generación del producto de extensión de la primera copia del primer cebador 111 , la primera copia del primer cebador 105a puede unirse covalentemente al producto de extensión sintetizado, de manera que la primera copia del primer cebador pasa a formar parte de la molécula descrita en la presente descripción como el "producto de extensión de la primera copia del primer cebador". El producto de extensión de la primera copia del primer cebador 111 es complementario a la primera cadena del molde de ácido nucleico 103. En algunas modalidades, cuando la primera copia del primer cebador 105a se hibrida con la primera cadena del molde de ácido nucleico 103, la región de unión al molde, pero no la región de cola de la primera copia del primer cebador 105a, se hibrida con la primera cadena del molde de ácido nucleico.

En algunas modalidades, las condiciones para que la región de unión al molde de la primera copia del primer cebador 105a hibride con la primera cadena del molde de ácido nucleico 103 y se forme un producto de extensión de la primera copia del primer cebador 111 pueden incluir cualquier condición suficiente para sustentar la síntesis de ácidos nucleicos basada en polimerasa. Las condiciones ilustrativas para la síntesis de ácidos nucleicos basada en polimerasa se conocen en la técnica y se proporcionan, por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, M.R. Green and J. Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012).

En las modalidades, la región de unión al molde del primer cebador o segundo cebador puede sustentar la extensión dependiente del molde del cebador por una polimerasa de ácido nucleico, que puede extender el cebador desde el extremo 3' del cebador.

El producto de extensión de la primera copia del primer cebador 111 puede tratarse con el segundo cebador 106 y una polimerasa 108 en condiciones tales que la región de unión al molde del segundo cebador 106 se hibrida con el producto de extensión de la primera copia del primer cebador 111 (Figura IE) y se forme un producto de extensión del segundo cebador 112 (Figura 1F). La polimerasa 108 puede catalizar la formación del producto de extensión del segundo cebador 106. La polimerasa puede tener actividad de desplazamiento de cadena. La polimerasa puede ser el mismo tipo de polimerasa que se usa para generar un producto de extensión de la primera copia del primer cebador 111, o puede ser diferente. Durante la síntesis del producto de extensión del segundo cebador 112, la polimerasa puede desplazar la primera cadena del molde de ácido nucleico 103 del producto de extensión de la primera copia del primer cebador 111. Típicamente, el producto de extensión se genera a partir del extremo 3' del segundo cebador 106. Durante la generación del producto de extensión del segundo cebador 112, el segundo cebador 106 puede unirse covalentemente al producto de extensión sintetizado, de manera que el segundo cebador se convierta en parte de la molécula descrita en la presente descripción como el "producto de extensión del segundo cebador". El producto de extensión del segundo cebador 112 es complementario al producto de extensión de la primera copia del primer cebador 111. En algunas modalidades, cuando el segundo cebador 106 hibrida con el producto de extensión de la primera copia del primer cebador 111, la región de unión al molde, pero no la región de cola del segundo cebador 106, se hibrida con el producto de extensión de la primera copia del primer cebador 111. El producto de extensión del segundo cebador 112 contiene un nucleótido terminal 5', un nucleótido terminal 3' y una región terminal 3'. El nucleótido final de la región terminal 3' (T) es el nucleótido terminal 3' del producto de extensión del segundo cebador (T), y la región terminal 3' contiene la misma secuencia de nucleótidos que la secuencia de nucleótidos de la región de cola del segundo cebador que se lee en la dirección de 5' a 3' (CCAT).

En algunas modalidades, las condiciones para que la región de unión al molde del segundo cebador 106 hibride con el producto de extensión de la primera copia del primer cebador 111 y se forme un producto de extensión del segundo cebador 112 pueden incluir cualquier condición suficiente para sustentar la síntesis de ácidos nucleicos basada en polimerasa, que incluye cualquier condición discutida en otra parte de la presente descripción. Las condiciones pueden ser las mismas que se usan para generar un producto de extensión de la primera copia del primer cebador 111, o pueden ser diferentes.

El producto de extensión del segundo cebador 112 puede tratarse con una segunda copia del primer cebador 105b y una polimerasa 108 en condiciones tales que la región de unión al molde de la segunda copia del primer cebador 105b hibrida con el producto de extensión del segundo cebador 112 (Figura 1G) y se forme un producto de extensión de la segunda copia del primer cebador 113 (Figura 1H). La polimerasa 108 puede catalizar la formación del producto de extensión de la segunda copia del primer cebador 113. La polimerasa puede tener actividad de desplazamiento de cadena. La polimerasa puede ser el mismo tipo de polimerasa que se usa para generar un producto de extensión de la primera copia del primer cebador 111 o un producto de extensión del segundo cebador 112 , o puede ser diferente. Durante la síntesis del producto de extensión de la segunda copia del primer cebador 113, la polimerasa puede desplazar el producto de extensión de la primera copia del primer cebador 111 del producto de extensión del segundo cebador 112. Típicamente, el producto de extensión se genera a partir del extremo 3' de la segunda copia del primer cebador 105b. Durante la generación del producto de extensión de la segunda copia del primer cebador 113, la segunda copia del primer cebador 105b puede unirse covalentemente al producto de extensión sintetizado, de manera que la segunda copia del primer cebador se convierta en parte de la molécula descrita en la presente descripción como el "producto de extensión de la segunda copia del primer cebador". El producto de extensión de la segunda copia del primer cebador 113 es complementario al producto de extensión del segundo cebador 112. En algunas modalidades, cuando la segunda copia del primer cebador 105b hibrida con el producto de extensión del segundo cebador 112, tanto la región de unión al molde como la región de cola de la segunda copia del primer cebador 105b hibridan con el producto de extensión del segundo cebador 112. El producto de extensión de la segunda copia del primer cebador 113 contiene un nucleótido terminal 5', un nucleótido terminal 3' y una región terminal 3'. El nucleótido final de la región terminal 3' (G) es el nucleótido terminal 3' del producto de extensión del segundo cebador (G), y la región terminal 3' contiene la misma secuencia de nucleótidos que la secuencia de nucleótidos de la región de cola del primer cebador que se lee en la dirección de 5' a 3' (ATGG).

En algunas modalidades, las condiciones para que la región de unión al molde de la segunda copia del primer cebador 105b hibride con el producto de extensión del segundo cebador 112 y se forme un producto de extensión de la segunda copia del primer cebador 113 pueden incluir cualquier condición suficiente para sustentar la síntesis de ácidos nucleicos basada en polimerasa, que incluye cualquier condición discutida en otra parte de la presente descripción.

Las condiciones pueden ser las mismas que se usan para generar un producto de extensión de la primera copia del primer cebador 111 o un producto de extensión del segundo cebador 112 , o pueden ser diferentes.

La generación del producto de extensión de la segunda copia del primer cebador 113 puede resultar en la generación de una molécula que comprende el producto de extensión de la segunda copia del primer cebador 113 y el producto de extensión del segundo cebador 112 , que puede denominarse en la presente descripción como el "ácido nucleico secundario" 115. Dentro del ácido nucleico secundario 115, el producto de extensión de la segunda copia del primer cebador 113 puede aparearse con el producto de extensión del segundo cebador 112. Además, el ácido nucleico secundario 115 contiene la secuencia del molde de ácido nucleico 102. El ácido nucleico secundario 115 tiene una longitud de nucleótidos mayor que el molde de ácido nucleico 102 solo, ya que además de la secuencia del molde de ácido nucleico 102, puede incluir la secuencia de las regiones de cola del primer cebador y el segundo cebador, y las secuencias complementarias de estos. Específicamente, un ácido nucleico secundario 115 puede tener una primera región terminal 116 y una segunda región terminal 117. La primera región terminal 116 puede comprender la región terminal 3' del producto de extensión del segundo cebador 112, y el complemento de este. La segunda región final 117 puede comprender la región terminal 3' del producto de extensión de la segunda copia del primer cebador 113, y el complemento de este.

Pueden formarse o proporcionarse una primera copia 115a y una segunda copia 115b del ácido nucleico secundario 115 (Figura II). La primera copia 115a y la segunda copia 115b del ácido nucleico secundario 115 pueden generarse mediante cualquier proceso por el cual pueda generarse un ácido nucleico que tenga la estructura general del ácido nucleico secundario 115, que incluye cualquier proceso discutido en otra parte de la presente descripción. Por ejemplo, el proceso completo descrito anteriormente para generar un ácido nucleico secundario 115 a partir de un ácido nucleico primario 101 puede repetirse dos veces, para generar la primera copia 115a y la segunda copia 115b del ácido nucleico secundario. En otro ejemplo, la primera copia 115a y la segunda copia 115b del ácido nucleico secundario pueden generarse a partir de una única copia de un producto de extensión de una primera copia del primer cebador 111. En este ejemplo, pueden generar se dos copias 112 a, 112 b de un producto de extensión del segundo cebador a partir de la copia única del producto de extensión de una primera copia de un primer cebador 111, lo que puede ocurrir si una primera copia del producto de extensión del segundo cebador 112 a se desplaza de la copia única del producto de extensión de la primera copia del primer cebador 111, de esta manera se permite la generación de una segunda copia del producto de extensión del segundo cebador 112 b a partir de la copia única del producto de extensión de una primera copia de un primer cebador 111. Entonces, por ejemplo, puede generarse un producto de extensión de la segunda copia del primer cebador 113a, 113b a partir de cada copia del producto de extensión del segundo cebador 112a, 112b, respectivamente. También pueden realizarse y usarse procedimientos adicionales para la generación de una primera copia 115a y una segunda copia 115b del ácido nucleico secundario con los métodos proporcionados en la presente descripción.

La primera copia 115a y la segunda copia 115b del ácido nucleico secundario pueden tratarse en condiciones tales que la región terminal 3' del producto de extensión de la segunda copia del primer cebador de la primera copia del ácido nucleico secundario 113a hibrida con la región terminal 3' del producto de extensión del segundo cebador de la segunda copia del ácido nucleico secundario 112 b, para producir una estructura cruzada 118 que comprende estas cadenas (Figura 1J) (por simplicidad, las cadenas 113b y 112a no se muestran). La estructura cruzada 118 puede tratarse adicionalmente con una polimerasa en condiciones tales que se formen productos de extensión de ambas cadenas componentes 112b, 113a, los productos de extensión que pueden denominarse en la presente descripción como una "primera cadena concatámero" 121 y una segunda cadena concatámero"122, respectivamente. La primera cadena concatámero 121 y la segunda cadena concatámero 122 pueden hibridarse juntas, y pueden denominarse conjuntamente como un concatámero 120 (Figura 1K). El concatámero 120 puede contener dos o más copias del molde de ácido nucleico 102. Dentro del concatámero 120, algunas o todas de las dos o más copias del molde de ácido nucleico 102 pueden estar separadas entre sí por las secuencias de las regiones de cola del primer cebador 105 y el segundo cebador 106, donde las secuencias de las regiones de cola hibridan entre sí. Por ejemplo, en el concatámero 120 de la Figura 1K, la primera copia de la primera cadena del molde de ácido nucleico bicatenario se separa de la segunda copia de la primera cadena del molde de ácido nucleico bicatenario por la secuencia, en orden 5'-3': CCAT. CCAT es también la secuencia, en orden 5'-3', de la región de cola del segundo cebador 106. De manera similar, en el concatámero 120 de la Figura 1K, la primera copia de la segunda cadena del molde de ácido nucleico bicatenario se separa de la segunda copia de la segunda cadena del molde de ácido nucleico bicatenario por la secuencia, en orden 5'-3': ATGG. ATGG es también la secuencia, en orden 5'-3', de la región de cola del primer cebador 105. Dentro del concatámero, el CCAT de la primera cadena concatámero se hibrida con el ATGG de la segunda cadena concatámero.

En algunas modalidades, las condiciones para que se formen una estructura cruzada 118 o productos de extensión de las cadenas de una estructura cruzada pueden incluir cualquier condición suficiente para sustentar la síntesis de ácidos nucleicos basada en polimerasa, que incluye cualquier condición discutida en otra parte de la presente descripción. Las condiciones pueden ser las mismas que se usan para generar un producto de extensión de la primera copia del primer cebador 111, un producto de extensión del segundo cebador 112 o un producto de extensión de la segunda copia del primer cebador 111, o pueden ser diferentes.

En algunas modalidades, los concatámeros proporcionados en la presente descripción pueden aumentar adicionalmente en longitud de acuerdo con el proceso descrito generalmente en las Figuras 1I-1K. Por ejemplo, dos de las moléculas concatámero 120 como se muestra en la Figura 1K pueden tratarse de manera que formen una estructura cruzada similar a la que se muestra en la Figura 1J (excepto con cadenas más largas), seguida de la generación de una molécula concatámero más grande que contiene cuatro copias del molde de ácido nucleico 102. En otro ejemplo, un ácido nucleico secundario 115 y un concatámero 120 pueden formar una estructura cruzada, seguida de la generación de una molécula concatámero más grande que contiene tres copias del molde de ácido nucleico 102. En algunas modalidades, en los métodos proporcionados en la presente descripción, pueden generarse simultáneamente múltiples concatámeros diferentes de múltiples longitudes diferentes.

En las modalidades, los métodos y composiciones proporcionados en la presente descripción pueden describirse con referencia a la Figura 8. Un molde polinucleotídico 800 (Figura 8A) puede ser una diana para la amplificación. El molde polinucleotídico 800 es una única cadena de ácido nucleico. La cadena molde polinucleotídica puede existir como una molécula monocatenaria libre, o puede existir como parte de una molécula bicatenaria, en la que la cadena molde polinucleotídica se hibrida con una cadena complementaria de esta. El molde polinucleotídico 800 puede ser ADN o ARN.

El molde polinucleotídico 800 puede contener al menos una primera porción 801 (también indicada con un "(i)") y una segunda porción 802 (también indicada con un "(ii)"). La primera porción 801 y la segunda porción 802 pueden contener cada una cualquier número de nucleótidos, tal como menos de 1000, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 o 3 nucleótidos cada una o al menos 1000, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 o 3 nucleótidos cada una. Típicamente, la primera porción 801 y la segunda porción 802 pueden contener cada una entre 10 y 30 nucleótidos, aunque la primera porción 801 y la segunda porción 802 pueden tener otras longitudes como también se describe en otra parte de la presente descripción. La primera porción 801 y la segunda porción 802 pueden contener el mismo o diferente número de nucleótidos. En algunas modalidades, el molde polinucleotídico 800 puede contener otras porciones además de la primera porción 801 y la segunda porción 802. En otras modalidades, la primera porción 801 y la segunda porción 802 pueden constituir la totalidad del molde polinucleotídico 800. El molde polinucleotídico 800 puede tener la longitud de un molde de ácido nucleico descrito en otra parte de la presente descripción. El molde polinucleotídico 800 puede ser una porción de un ácido nucleico primario. El molde polinucleotídico puede estar presente en una muestra que se obtiene de un sujeto.

El molde polinucleotídico 800 puede incubarse en una mezcla de reacción que contiene un primer cebador 810 y un segundo cebador 820 (Figura 8B). Típicamente, la mezcla de reacción contiene múltiples copias de cada cebador, tal como, por ejemplo, al menos 4, 5, 6, 10 , 15, 20, 50, 100, 1000, 10000, 100000 o 1 millón de copias o más de cada uno de los cebadores. El primer cebador 810 puede tener una primera región 811 (también indicada con un "(i)") y una segunda región 812 (también indicada con un "(ii)"). La primera región del primer cebador 811 puede tener un extremo 5' y la segunda región del primer cebador 812 puede tener un extremo 3'. La primera región del primer cebador puede tener una secuencia de nucleótidos que es diferente de la secuencia de nucleótidos de la segunda región del primer cebador. El segundo cebador 820 puede tener una primera región 821 (también indicada con "(i)") y una segunda región 822 (también indicada con "(ii)"). La primera región del segundo cebador 821 puede tener un extremo 5' y la segunda región del segundo cebador 822 puede tener un extremo 3'. La primera región del segundo cebador puede tener una secuencia de nucleótidos que es diferente de la secuencia de nucleótidos de la segunda región del segundo cebador.

La segunda región del primer cebador 812 puede tener una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de la primera porción del molde polinucleotídico 801. En la Figura 8, la secuencia de nucleótidos de la primera porción del molde polinucleotídico 801 está representada por la letra A, y la secuencia de nucleótidos de la segunda región del primer cebador 812 está representada por la letra A', donde A y A' son complementarias entre sí. La segunda región del segundo cebador 822 puede tener una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos asociada 830, en donde la secuencia de nucleótidos asociada 830 es complementaria a la secuencia de nucleótidos de la segunda porción del molde polinucleotídico 802. En la Figura 8, la secuencia de nucleótidos de la segunda porción del molde polinucleotídico 802 está representada por la letra B, la secuencia de nucleótidos de la secuencia de nucleótidos asociada 830 está representada por la letra B', y la secuencia de nucleótidos de la segunda región del segundo cebador 822 está representada por la letra B, donde B y B' son complementarias entre sí. En otras palabras, como se indica en la Figura 8, la secuencia de nucleótidos de la segunda porción del molde polinucleotídico 802 (B) puede ser la misma que la secuencia de nucleótidos de la segunda región del segundo cebador 822 (B). Con las composiciones y métodos proporcionados en la presente descripción, puede generarse una secuencia de nucleótidos asociada 830, por ejemplo, como parte de un producto de extensión a partir del extremo 3' del primer cebador. En las modalidades, la primera región del primer cebador 811 puede ser complementaria a la primera región del segundo cebador 821. En la Figura 8, la secuencia de nucleótidos de la primera región del primer cebador está representada por la letra C, y la secuencia de nucleótidos de la primera región del segundo cebador está representada por la letra C', donde C y C' son complementarias entre sí.

En las modalidades, el primer cebador y el segundo cebador de la Figura 8 pueden tener cualquiera de las características del primer cebador y el segundo cebador descritos en otra parte de la presente descripción (por ejemplo, como en la Figura 1), respectivamente. Además, en las modalidades, la primera región del primer cebador de la Figura 8 puede tener cualquiera de las características de la región de cola de un primer cebador descrito en otra parte de la presente descripción. En las modalidades, la segunda región del primer cebador de la Figura 8 puede tener cualquiera de las características de la región de unión al molde de un primer cebador descrito en otra parte de la presente descripción. En las modalidades, la primera región del segundo cebador de la Figura 8 puede tener cualquiera de las características de la región de cola de un segundo cebador descritas en otra parte de la presente descripción. En las modalidades, la segunda región del segundo cebador de la Figura 8 puede tener cualquiera de las características de la región de unión al molde de un segundo cebador descrito en otra parte de la presente descripción.

En las modalidades, una mezcla de reacción que contiene un molde polinucleotídico 800 y al menos dos copias de un primer cebador 810 y al menos dos copias de un segundo cebador 820 puede contener uno o más de otros componentes que pueden sustentar la síntesis de ácidos nucleicos basada en polimerasa como se describe en otra parte de la presente descripción (por ejemplo, polimerasas, nucleótidos, tampones, agua, etcétera). De manera similar, una mezcla de reacción que contiene un molde polinucleotídico 800 y al menos dos copias de un primer cebador 810 y al menos dos copias de un segundo cebador 820 puede incubarse en cualquiera de las condiciones de reacción descritas en otra parte de la presente descripción para sustentar la amplificación de un molde de ácido nucleico o la generación de concatámeros.

En las modalidades, después de la incubación de un molde polinucleotídico 800 y al menos dos copias de un primer cebador 810 y al menos dos copias de un segundo cebador 820 en una mezcla de reacción como se describe en la presente descripción, pueden formarse una o más cadenas concatámero (Figura 8C). En las modalidades, una cadena concatámero 840 formada puede tener un extremo 5' y un extremo 3', y puede tener una secuencia que contiene la estructura general en la dirección 5' a 3' de: C'-T-C'-T -X-C', donde C' es la secuencia de nucleótidos de la primera región del segundo cebador, T es la secuencia del molde polinucleotídico o una secuencia análoga de este, y X es cualquier número y secuencia de nucleótidos. Por lo tanto, como lo indica la estructura general de la cadena concatámero, una cadena concatámero puede contener al menos dos copias de la secuencia del molde polinucleotídico o una secuencia análoga de este donde las copias de la secuencia del molde polinucleotídico están separadas por al menos la secuencia de la primera región del segundo cebador. En las modalidades, T puede ser una secuencia análoga del molde polinucleotídico. Como se usa en la presente descripción, una "secuencia análoga" de un molde polinucleotídico se refiere a una secuencia que contiene una secuencia similar al molde polinucleotídico, pero que contiene uno o más nucleótidos análogos a un nucleótido en el molde polinucleotídico. Por lo tanto, por ejemplo, si el molde polinucleotídico contiene una secuencia de ARN, una secuencia análoga de esta puede ser una versión de ADN de la misma secuencia (es decir, los uracilos en la secuencia de ARN son timinas en la secuencia de ADN análoga) o viceversa. Continuando con el ejemplo, si el molde polinucleotídico contiene una secuencia de ARN de 5' UACCUG 3', una secuencia análoga es la secuencia de ADN de 5' TACCTG 3'.

En las modalidades, en una secuencia que contiene la estructura general en la dirección 5' a 3' de: C'-T-C'-T -X-C', X es cero nucleótidos (es decir, la secuencia T y C a cada lado de la X están vinculadas directamente). En otras modalidades, X es menor que 10000, 5000, 4000, 3000, 2000, 1000, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 o 3 nucleótidos. Los nucleótidos (si los hay) en X pueden tener cualquier secuencia. En las modalidades, X contiene una secuencia que tiene la estructura general en la dirección 5' a 3' de [(C'-T)ⁿ] en donde C' es la secuencia de nucleótidos de la primera región del segundo cebador, T es la secuencia del molde polinucleotídico o secuencia análoga de este, y N es cualquier número entero menor que 1000, 500, 200, 100, 50 o 10, tal como un número entero entre 1 y 500, 1 y 200, 1 y 100, 1 y 50, o 1 y 10. Por ejemplo, si "N" es 3 cuando X contiene una secuencia que tiene la estructura general en la dirección 5' a 3' de [(C'-T)ⁿ], hay 3 repeticiones secuenciales de (C'-T) en la posición X de la estructura C'-T-C'-T -X-C', de manera que la estructura correspondiente podría escribirse como: C'-T-C'-T-C'-T-C'-T -C'-T-C', donde las C' y las T subrayadas son las repeticiones C'-T de la fórmula [(C'-T)3]. Por lo tanto, por ejemplo, de acuerdo con las composiciones y métodos proporcionados en la presente descripción, pueden formarse cadenas concatámeros que contienen decenas o cientos de copias del molde polinucleotídico. En las modalidades, una cadena concatámero como se proporciona en la Figura 8 puede tener cualquiera de las características de una cadena concatámero descritas en otra parte de la presente descripción. Además, en algunas modalidades, durante la generación de una cadena concatámero, en una o más posiciones de una C' o T en una secuencia que tiene la estructura general C'-T-C'-T -X-C', un pequeño número de nucleótidos (por ejemplo, 15 o menos, 10 o menos, 5 o menos, o 3 o menos) pueden insertarse entre una C' y T. Además, en algunas modalidades, durante la generación de una cadena concatámero, en una o más posiciones de una C' o T en una secuencia que tiene la estructura general C'-T-C'-T -X-C' o un pequeño número de nucleótidos (por ejemplo, 15 o menos, 10 o menos, 5 o menos, o 3 o menos) pueden eliminarse de una secuencia C' o T. Por lo tanto, las cadenas concatámero generadas de acuerdo con los métodos proporcionados en la presente descripción pueden incluir cadenas que tienen una estructura general como se proporciona en la presente descripción, pero que pueden tener una pequeña cantidad de nucleótidos añadidos o eliminados en uno o más puntos de unión entre los diferentes componentes de la secuencia de la cadena concatámero (es decir, uniones entre la secuencia molde y la secuencia del cebador / T y C'). Además, en las modalidades, una cadena concatámero como se proporciona en la presente descripción puede contener nucleótidos adicionales (por ejemplo, hasta 3, 5, 10 , 20, 50, 100, 500, 1000 o más nucleótidos adicionales) en el extremo 5' o 3' de una molécula que contiene un concatámero que tiene una secuencia con la estructura general C'-T-C'-T -X-C'. En las modalidades, una C' de la estructura general C'-T-C'-T -X-C' puede tener cualquiera de las características (por ejemplo, longitud, secuencia) de la región de cola de un segundo cebador descrito en otra parte de la presente descripción. En las modalidades, una T de estructura general C'-T-C'-T -X-C' puede tener cualquiera de las características (por ejemplo, longitud, secuencia) de una cadena molde polinucleotídica descrita en otra parte de la presente descripción.

En las modalidades, una cadena concatámero 840 generada de acuerdo con el método proporcionado en la presente descripción puede ser parte de una molécula monocatenaria. En otras modalidades, una cadena concatámero 840 generada de acuerdo con el método proporcionado en la presente descripción puede ser parte de un concatámero bicatenario, en el que la cadena concatámero 840 se hibrida con una cadena que es complementaria de la cadena concatámero 850. Mientras que la Figura 8C representa cadenas concatámero que tienen una secuencia que tiene la estructura general en la dirección 5' a 3' de: C'-T-C'-T -X-C' (cadena 840) o C-T'-C-T'-X'-C (cadena 850), en donde X

es 0 nucleótidos, una cadena concatámero generada de acuerdo con el esquema de la Figura 8 puede tener cualquiera de las características de una cadena concatámero descritas anteriormente o en otra parte de la presente descripción.

Además, en relación con la Figura 8C, las secuencias A y B son parte de la cadena molde y, por lo tanto, no se anotan por separado en la estructura general C'-T-C'-T -X-C' o C-T'-C-T'-X'-C.

Para indicar además la relación de elementos en las modalidades de la Figura 8, los bloques 860, 862, 864, 866 y 868 se proporcionan en la Figura 8. El bloque 860 (con un relleno similar a una barra invertida) indica la posición relativa de la secuencia del molde polinucleotídico total (es decir, el elemento 800), o su secuencia complementaria. El bloque

862 (con relleno de línea vertical) indica la posición relativa de la secuencia de la primera porción del molde polinucleotídico (es decir, la posición relativa de la secuencia del elemento 801), o su secuencia complementaria. Por lo tanto, el bloque 862 también representa la secuencia de la segunda región del primer cebador (es decir, el elemento

812), que es complementaria al elemento 801. El bloque 864 (con relleno de línea vertical y horizontal) indica la posición relativa de la secuencia de la segunda porción del molde polinucleotídico (es decir, la posición relativa de la secuencia del elemento 802), o su secuencia complementaria. Por lo tanto, el bloque 864 también representa la secuencia de la secuencia de nucleótidos asociada (es decir, el elemento 830), que es complementaria al elemento

802. El bloque 864 también indica la posición relativa de la secuencia de la segunda región del segundo cebador 822, que puede ser la misma secuencia que la secuencia de la segunda porción del molde polinucleotídico (elemento 802), o una secuencia similar. En otras palabras, en las modalidades, la secuencia de nucleótidos de 822 puede ser igual o similar a la secuencia de nucleótidos de 802. Como se muestra, por ejemplo, en la Figura 8A, en las modalidades, hay nucleótidos en el molde polinucleotídico que no forman parte de la primera porción o de la segunda porción del molde polinucleotídico. Por ejemplo, en un ejemplo, la primera porción del molde polinucleotídico puede contener 15 nucleótidos, la segunda porción del molde polinucleotídico puede contener 15 nucleótidos y entre la primera porción y la segunda porción del molde polinucleotídico hay 25 nucleótidos. Típicamente, la primera porción del molde polinucleotídico y la segunda porción del molde polinucleotídico tienen cada una entre 10 y 30 nucleótidos de longitud, aunque también se contemplan otros números. Por ejemplo, cada una de la primera y segunda porción del molde polinucleotídico puede ser al menos de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o

100 nucleótidos, no más de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o 100 nucleótidos, o al menos de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 nucleótidos y no más de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o 100 nucleótidos (con el límite superior por encima del límite inferior). En las modalidades, en el molde polinucleotídico entre la primera porción y la segunda porción, puede haber, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,

25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200, o 500 nucleótidos, no más de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,

19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200, o 500 nucleótidos, o al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, o 200 nucleótidos y no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200, o 500 nucleótidos (con el límite superior por encima del límit inferior). El bloque 866 (con relleno de línea ondulada) indica la posición relativa de la secuencia de la primera región del primer cebador (es decir, la posición relativa de la secuencia del elemento 811 / región "C"), o su secuencia complementaria. Por lo tanto, el bloque 866 también representa la secuencia de la primera región del segundo cebador (elemento 821 / región "C"), que es complementaria al elemento 811. El bloque 868 (con relleno de diamante) indica la posición relativa de la secuencia de la cadena concatámero (elemento 840), o su secuencia complementaria. Por lo tanto, el bloque 868 también representa la secuencia de una cadena que es complementaria a la cadena concatámero (elemento 850). Como se muestra en la Figura 8C, dentro de la cadena concatámero o su complemento (868), están presentes dos copias de la secuencia del molde polinucleotídico o su complemento (860), separadas por la secuencia de nucleótidos de la primera región del primer cebador o su complemento (866). Además, dentro de la cadena concatámero o su complemento (868), la secuencia de nucleótidos de la primera región del primer cebador o su complemento (866) flanquea la secuencia del molde polinucleotídico o su complemento (860) en ambos extremos.

Además, dentro de la cadena concatámero o su complemento (868), hay dos copias de la secuencia de la segunda región del primer cebador o su complemento (862) y dos copias de la secuencia de la segunda región del segundo cebador o su complemento (864), que están presentes en dos copias como parte de las dos copias de la secuencia del molde polinucleotídico o su complemento. No debe interpretase que los bloques 860, 862, 864, 866 y 868 dictan ninguna relación de tamaño requerida particular entre los elementos de la Figura 8; más bien, los bloques 860, 862,

864, 866 y 868 son simplemente para ayudar a indicar la posición general de los elementos de la Figura 8 entre sí en determinadas modalidades proporcionadas en la presente descripción.

Los concatámeros generados de acuerdo con los métodos y composiciones proporcionados en la presente descripción pueden tener cualquier longitud de nucleótidos. En algunas modalidades, las moléculas concatámeros generadas en la presente descripción pueden ser de al menos 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600,

700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10 000, 15 000, 20 000, o 25 000 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, las moléculas concatámeros generadas en la presente descripción pueden ser de no más de 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 15000, 20000, o 25000 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, las moléculas concatámeros generadas en la presente descripción pueden tener una longitud seleccionada de un intervalo que tiene un valor mínimo de 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10 000, 15 000, o 20 000 nucleótidos de longitud, y un valor máximo de 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 15000, 20000, o 25000 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, al menos algunos concatámeros generados de acuerdo con un método o composición proporcionados en la presente descripción tienen las características descritas anteriormente. En algunas modalidades, al menos el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de los concatámeros generados de acuerdo con un método o composición proporcionados en la presente descripción tienen las características descritas anteriormente.

Los concatámeros generados de acuerdo con métodos y composiciones proporcionados en la presente descripción pueden contener cualquier número de copias de un molde de ácido nucleico o ácido nucleico particular. En algunas modalidades, las moléculas concatámeros generadas en la presente descripción pueden contener al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 copias de un molde de ácido nucleico o ácido nucleico particular. En algunas modalidades, las moléculas concatámeros generadas en la presente descripción pueden contener no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 copias de un molde de ácido nucleico o ácido nucleico particular. En algunas modalidades, las moléculas concatámeros generadas en la presente descripción pueden tener varias copias de un molde de ácido nucleico o un ácido nucleico particular seleccionado de un intervalo que tiene un valor mínimo de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80 o 90 copias, y un valor máximo de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 copias. En algunas modalidades, al menos algunos concatámeros generados de acuerdo con un método o composición proporcionados en la presente descripción tienen las características descritas anteriormente. En algunas modalidades, al menos el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de los concatámeros generados de acuerdo con un método o composición proporcionados en la presente descripción tienen las características descritas anteriormente.

El progreso de un método proporcionado en la presente descripción puede controlarse de múltiples formas diferentes. En las modalidades, puede evaluarse una reacción para determinar un producto de amplificación de ácido nucleico (por ejemplo, la cantidad de producto o la velocidad de su generación). En otras modalidades, puede evaluarse una reacción para determinar la actividad de una polimerasa a lo largo de un molde de ácido nucleico (por ejemplo, por el movimiento de una polimerasa a lo largo de una cadena molde). Por lo tanto, en algunas modalidades, los eventos de un método proporcionado en la presente descripción pueden observarse debido a la acumulación de producto de un método (que puede ser durante o después de la terminación de las etapas del método), o debido a eventos detectables que ocurren durante las etapas de un método.

La presencia de ácidos nucleicos amplificados puede evaluarse, por ejemplo, mediante la detección de productos de reacción (ácidos nucleicos amplificados o subproductos de reacción) o mediante la detección de sondas asociadas con el progreso de la reacción.

En algunas modalidades, los productos de reacción pueden identificarse mediante la tinción de los productos con un colorante. En algunas modalidades, un colorante puede tener mayor fluorescencia cuando se une a un ácido nucleico que cuando no se une a un ácido nucleico. En las modalidades, un colorante puede intercalarse con un ácido nucleico bicatenario o puede unirse a una región externa de un ácido nucleico. Los colorantes de ácido nucleico que pueden usarse con los métodos y composiciones proporcionados en la presente descripción incluyen, por ejemplo, colorantes de cianina, PicoGreen ®, OliGreen ®, RiboGreen ®, SYBR® dyes, SYBR ® Gold, SYBR ® Green I, SYBR ® Green II, bromuro de etidio, dihidroetidio, BlueView™, colorantes TOTO ®, colorantes TO-PRO ®, colorantes POPO ®, colorantes YOYO ®, colorantes BOBO ®, colorantes JOJO ®, colorantes LOLO ®, colorantes SYTOX ®, colorantes SYTO ®, yoduro de propidio, yoduro de hexidio, azul de metileno, DAPI, naranja de acridina, quinacrina, dímeros de acridina, 9-amino-6-cloro-2-metoxiacridina, colorantes bisbencimida, colorantes Hoechst, 7-aminoactinomicina D, actinomicina D, hidroxiestilbamidina, pironina Y, colorante Diamond™, GelRed™, GelGreen™ y LDS 751.

En algunas modalidades, los productos de reacción pueden identificarse mediante el análisis de la turbidez de las reacciones de amplificación. Por ejemplo, en las modalidades, el aumento de la turbidez puede correlacionarse con la formación de productos de reacción y subproductos de reacción (por ejemplo, pirofosfato en complejo con magnesio).

En algunas modalidades, los productos de reacción pueden identificarse mediante la separación de una reacción que se realiza de acuerdo con un método de la presente descripción mediante electroforesis en gel, seguido de tinción del gel con un colorante para ácidos nucleicos. El colorante puede ser cualquier colorante de ácido nucleico descrito en la presente descripción o conocido de cualquier otra manera en la técnica.

En algunas modalidades, cualquier método o composición conocida en la técnica para la detección de ácidos nucleicos o para la generación de ácidos nucleicos puede usarse con los métodos y composiciones proporcionados en la presente descripción.

En algunas modalidades, una sonda de ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótidos complementaria a una porción de una cadena molde de ácido nucleico (o una cadena que tiene una secuencia similar o idéntica) y que contiene uno o ambos de un indicador fluorescente (fluoróforo) y un inactivador se incluyen en una reacción proporcionada en la presente descripción.

En un ejemplo, una sonda de ácido nucleico puede contener un indicador fluorescente en su extremo 5' o 3' y un inactivador en el otro extremo. La sonda puede tener, además, una secuencia de nucleótidos que contiene, en orden, al menos una primera, segunda y tercera región, donde la primera y tercera regiones son complementarias entre sí, y donde al menos una porción de la segunda región es complementaria a una porción de una cadena del molde de ácido nucleico (la sonda "secuencia de detección"). En algunas modalidades, la longitud de la segunda región puede ser mayor que la longitud de la primera o tercera región. En algunas modalidades, la longitud de la segunda región puede estar entre 10 y 40 nucleótidos, y la longitud de la primera y tercera región puede estar entre 4 y 10 nucleótidos. La sonda puede tener al menos dos conformaciones diferentes: (A) una conformación donde la sonda no se hibrida con su secuencia de detección y donde la primera y la tercera regiones se hibridan entre sí; esta conformación puede ser una estructura de "tallo-lazo", donde la primera y tercera regiones forman el tallo y la segunda región forma el lazo, y (B) una conformación donde la sonda se hibrida con su secuencia de detección; en esta conformación, la segunda región o una porción de esta se hibrida con su secuencia de detección y la primera y tercera regiones no se hibridan entre sí. En la conformación (A) de la sonda, el indicador fluorescente y el inactivador (que se encuentran en los extremos opuestos de la sonda / en los extremos exteriores de la primera y tercera regiones) pueden estar muy próximos entre sí (ambos en el extremo de la estructura del tallo formada por el híbrido de la primera y tercera regiones), de manera que se inactiva el indicador fluorescente. En la conformación (B) de la sonda, el indicador fluorescente y el inactivador pueden no estar muy próximos entre sí, de manera que el indicador fluorescente no se inactiva. La sonda puede usarse para controlar la acumulación de un producto de reacción seleccionado, por ejemplo, en condiciones de reacción donde la sonda puede formar una estructura de tallo-lazo o hibridarse con su secuencia de detección. En algunas modalidades, si la secuencia de detección está presente, la sonda puede hibridarse con la secuencia de detección y la sonda puede emitir fluorescencia en respuesta a la luz de una longitud de onda del espectro de excitación del fluoróforo. Por el contrario, si la secuencia de detección no está presente, la sonda puede formar una estructura de tallo-lazo y no emitir fluorescencia en respuesta a la luz de una longitud de onda del espectro de excitación del fluoróforo.

En otro ejemplo, una sonda de ácido nucleico puede contener un indicador fluorescente en su extremo 5' o 3', y puede hibridar con un cebador de ácido nucleico que contiene un inactivador. El cebador de ácido nucleico que contiene un inactivador puede contener el inactivador en una posición en el cebador de manera que cuando la sonda de ácido nucleico hibrida con el cebador, el indicador fluorescente se inactiva. La sonda puede usarse para controlar la acumulación de un producto de reacción seleccionado, por ejemplo, en condiciones de reacción donde la sonda puede hibridar con el cebador o hibridar con su secuencia de detección en el producto de reacción. En algunas modalidades, si la secuencia de detección está presente, la sonda puede hibridarse con la secuencia de detección y la sonda puede emitir fluorescencia en respuesta a la luz de una longitud de onda del espectro de excitación del fluoróforo (de esta manera indica la presencia del producto de reacción). Por el contrario, si la secuencia de detección no está presente, la sonda puede permanecer apareada con el cebador y no emitir fluorescencia en respuesta a la luz de una longitud de onda del espectro de excitación del fluoróforo.

En sondas que contienen un par de indicador fluorescente e inactivador, el indicador fluorescente e inactivador pueden seleccionarse de manera que el inactivador pueda inactivar eficazmente al indicador. En algunas modalidades, un indicador fluorescente se aparea con un inactivador donde el máximo de emisión del indicador fluorescente es similar al máximo de absorción del inactivador. Los fluoróforos que pueden usarse como indicadores fluorescentes incluyen, por ejemplo, CAL Fluor Gold, CAL Fluor Orange, Quasar 570, CAL Fluor Red 590, CAL Fluor Red 610, CAL Fluor Red 610, Ca L Fluor Red 635, Quasar 670 (Biosearch Technologies), VIC, NED (Life Technologies), Cy3, Cy5, Cy5.5 (GE Healthcare Life Sciences), Oyster 556, Oyster 645 (Integrated DNA Technologies), LC red 610, Lc red 610, LC red 640, LC red 670, LC red 705 (Roche Applies Science), Texas red, FAM, TeT, HEX, JOE, TMR, y ROX. Los inactivadores que pueden usarse incluyen, por ejemplo, DDQ-I, DDQ-II (Eurogentec), Eclipse (Epoch Biosciences), Iowa Black FQ, Iowa Black RQ (Integrated DNA Technologies), BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3 (Biosearch Technologies), QSY-7, QSY-21 (Molecular Probes), y Dabcyl.

En algunas modalidades, una sonda que se usa con una composición o método proporcionados en la presente descripción puede ser una sonda de ácido nucleico peptídico (PNA). Los ácidos nucleicos peptídicos son análogos de los ADN sintéticos en los que, por ejemplo, el esqueleto del fosfodiéster se sustituye por unidades repetitivas de N-(2-aminoetil) glicina y a los que se unen las bases de purina y pirimidina mediante un enlazador metilcarbonilo. Opcionalmente, puede proporcionarse una sonda de PNA en una reacción proporcionada en la presente descripción que además contiene un colorante que se une a los dúplex de PNA-ADN y que cambia de color al unirse a los dúplex de PNA-ADN. Un ejemplo de tal colorante es el yoduro de 3,3'-dietiltiadicarbocianina [DiSc2(5)]. El DiSc2(5) cambia de color de azul a violeta al unirse a los dúplex de PNA-ADN, y este cambio de color puede observarse, por ejemplo, en un espectrofotómetro, mediante análisis de imágenes o por el ojo humano sin necesidad de equipamiento. El uso de sondas PNA y DiSc2(5) para la detección de dúplex ^pNA-ADN se describe, por ejemplo, en Wilhelmsson y otros, Nucleic Acids Research, 2002, Vol. 30, No.2 e3.

En las modalidades que usan una sonda de PNA, típicamente,

la sonda de PNA se diseñará para que sea complementaria a una secuencia que se amplificará en la reacción de amplificación relevante. Por lo tanto, si la secuencia se amplifica con éxito, la sonda de PNA se hibridará con las cadenas de ADN que contienen la secuencia amplificada, y esta hibridación puede detectarse (por ejemplo, mediante la observación del cambio de color en DiSc2(5) cuando se une a los dúplex de PNA-ADN). Por lo tanto, el uso de una sonda de PNA con las modalidades proporcionadas en la presente descripción puede ayudar a determinar con precisión las reacciones en las que una secuencia se amplifica con éxito y a diferenciar estas reacciones de las reacciones que tienen una amplificación no específica de ácidos nucleicos. Para usar una sonda de PNA con las modalidades proporcionadas en la presente descripción, opcionalmente, la sonda de PNA puede incluirse en una mezcla de reacción proporcionada en la presente descripción al inicio de la reacción. En otros ejemplos, la sonda de PNA puede añadirse a la mezcla de reacción en un momento después del inicio de la reacción o después de finalizar la reacción. Puede añadirse un colorante a una mezcla de reacción al mismo tiempo que se añade una sonda de PNA, o en un momento diferente. Por ejemplo, en las modalidades, puede añadirse un colorante a la mezcla de reacción al inicio de la reacción, y el PNA puede añadirse en el punto posterior al inicio de la reacción. En las modalidades, un kit proporcionado en la presente descripción puede contener, además, una sonda de PNA que es complementaria a una secuencia de nucleótidos a amplificar mediante reactivos del kit, y un colorante que se une a los dúplex de PNA-ADN.

En algunas modalidades, una reacción realizada de acuerdo con un método proporcionado en la presente descripción puede controlarse en un aparato que contiene una fuente de luz y un sensor óptico. En algunas situaciones, la reacción puede colocarse en la trayectoria de la luz de la fuente de luz y puede medirse la luz absorbida por la muestra (por ejemplo, en el caso de una reacción turbia), dispersada por la muestra (por ejemplo, en el caso de una reacción turbia) o emitida por la muestra (por ejemplo, en el caso de una reacción que contiene una molécula fluorescente). En algunas modalidades, un método proporcionado en la presente descripción puede realizarse o controlarse en un dispositivo o módulo en el mismo como se describe en la solicitud de patente de Estados Unidos Núm. de Serie 13/769,779, presentada el 18 de febrero de 2013, que se incorpora en la presente descripción como referencia en su totalidad.

Mediante el uso de los métodos proporcionados en la presente descripción, los productos de amplificación específicos de un molde de ácido nucleico de interés pueden identificarse en, por ejemplo, 30 segundos, 1 minuto, 3 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 60 minutos, 90 minutos, 120 minutos, 180 minutos o 240 minutos del inicio de una reacción de amplificación. En otros ejemplos, mediante el uso de los métodos proporcionados en la presente descripción, las reacciones de amplificación que son positivas para un molde de ácido nucleico de interés pueden identificarse cuando se generan tan solo 10, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10 000, 50 000, 100 000, 500000 o 1000000 copias del molde. En otros ejemplos, mediante el uso de los métodos proporcionados en la presente descripción, puede identificarse la presencia de un molde de ácido nucleico de interés en una muestra que contiene tan solo 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000, 5000 o 10000 copias del molde de interés al comienzo del método

En las modalidades, los métodos proporcionados en la presente descripción pueden usarse para analizar una muestra en busca de un ácido nucleico diana de interés. En determinadas modalidades, la presencia o cantidad de un ácido nucleico diana de interés en una muestra puede determinarse mediante un método que implica determinar un tiempo de inflexión para la amplificación del ácido nucleico en una reacción. Un tiempo de inflexión / punto de inflexión es un tiempo o un punto donde se determina que una reacción de amplificación es positiva para un molde de ácido nucleico. Un tiempo / punto de inflexión puede identificarse mediante uno o más indicadores, tales como por ejemplo, el tiempo posterior al inicio de una reacción cuando se ha generado una cantidad seleccionada de ácido nucleico en la reacción, el momento en el que la velocidad de amplificación en una reacción cambia de una fase de línea base a una fase exponencial, o el momento en que la velocidad de amplificación en una reacción cambia de una fase exponencial a una fase de meseta, etcétera. En las modalidades, puede identificarse un tiempo / punto de inflexión basado en un cambio en la fluorescencia o absorbancia de una reacción, o cuando la fluorescencia o absorbancia de una reacción alcanza un valor seleccionado. En determinadas modalidades, la presencia o cantidad de un ácido nucleico diana de interés en una muestra puede determinarse mediante un método que implica la comparación de un tiempo de inflexión para la amplificación del ácido nucleico de una reacción cuya reacción tiene una cantidad desconocida de ácido nucleico diana de interés versus uno o ambos de: i) una reacción que se conoce que carece del ácido nucleico diana de interés (es decir, un control negativo) o ii) una reacción que se conoce que contiene el ácido nucleico diana de interés (es decir, un control positivo). En las modalidades, tanto una reacción que contiene el ácido nucleico diana de interés como una reacción que no contiene el ácido nucleico diana pueden medirse durante un tiempo de inflexión seleccionado. En las modalidades, la presencia de un ácido nucleico diana de interés en una muestra puede determinarse basado en un método que implica la evaluación de la diferencia de tiempo entre la inflexión de una reacción que contiene una muestra que puede contener o no un ácido nucleico diana de interés y un tiempo de inflexión de una o más reacciones con un estado conocido de ácido nucleico diana interés (por ejemplo, que se conoce que contienen o no contienen el ácido nucleico diana de interés). Por ejemplo, puede identificarse que una muestra contiene un ácido nucleico diana de interés si el tiempo de inflexión de la reacción de acuerdo con un método proporcionado en la presente descripción es al menos 3, 5, 10 , 15, 20, 30, 40, 50, 60, 90, 120 o 180 minutos más temprano que una reacción correspondiente que se conoce que no contiene el ácido nucleico diana de interés. En otro ejemplo, puede identificarse que una muestra contiene un ácido nucleico diana de interés si el tiempo de inflexión de la reacción de acuerdo con un método proporcionado en la presente descripción no es más de 3, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 90, 120 o 180 minutos más tarde que una reacción correspondiente que se conoce que contiene el ácido nucleico diana de interés.

Los métodos proporcionados en la presente descripción pueden realizarse durante cualquier período de tiempo. Típicamente, el método se realizará durante un período de tiempo suficiente para controlar, por ejemplo, la velocidad de replicación del ácido nucleico, la aparición de actividad polimerasa o la acumulación del producto de amplificación. En algunas modalidades, un método proporcionado en la presente descripción puede realizarse durante un total de menos de 10 segundos, 30 segundos, 1 minuto, 5 minutos, 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas o 24 horas, momento en el que se mide la velocidad de replicación del ácido nucleico, la aparición de actividad polimerasa o la acumulación del producto de amplificación.

Los métodos proporcionados en la presente descripción pueden terminarse de varias formas. En una modalidad, las etapas de un método pueden terminar con la reducción de la concentración o el consumo completo de uno o más reactivos involucrados en una o más etapas del método (por ejemplo, los dNTP). En otra modalidad, las etapas de un método pueden terminar con la inactivación de una o más enzimas implicadas en una o más etapas del método (por ejemplo, las polimerasas). Las enzimas pueden inactivarse de diversas formas. Por ejemplo, las enzimas pueden perder gradualmente la actividad enzimática con el tiempo debido a eventos aleatorios que afectan la estructura de la enzima, o las enzimas pueden exponerse a una condición que acelere la inactivación de la actividad de la enzima (por ejemplo, altas temperaturas, pH extremo, etcétera).

En algunas modalidades, un ácido nucleico primario puede ser monocatenario o bicatenario. Un ácido nucleico primario monocatenario también puede denominarse en la presente descripción "polinucleótido primario". Un ácido nucleico primario puede ser lineal o circular. Un ácido nucleico primario puede comprender un molde de ácido nucleico. En algunas modalidades, la totalidad de un ácido nucleico primario puede ser un molde de ácido nucleico. En otras modalidades, un ácido nucleico primario puede contener uno o más nucleótidos que no son parte de un molde de ácido nucleico (por ejemplo, el ácido nucleico primario puede tener una longitud mayor que un molde de ácido nucleico contenido dentro del ácido nucleico primario). En algunas modalidades, un ácido nucleico primario puede contener dos o más copias de un molde de ácido nucleico. Un ácido nucleico primario puede contener ADN, ARN o una mezcla de estos. Un ácido nucleico primario bicatenario lineal puede tener extremos romos o pegajosos (los "extremos pegajosos" se refieren a extremos que tienen una cadena sobresaliente que tiene uno o más nucleótidos no apareados).

Un ácido nucleico primario puede tener cualquier longitud de nucleótidos. Por ejemplo, un ácido nucleico primario puede ser al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 750, 1000 o 1500 nucleótidos de longitud. En otro ejemplo, un ácido nucleico primario puede estar entre 2 y 100000, entre 5 y 100000, entre 10 y 100000, entre 15 y 100000, entre 20 y 100000, entre 25 y 100 000, entre 30 y 100000, entre 50 y 100000, entre 70 y 100000, entre 100 y 100000, entre 200 y 100000, entre 2 y 10 000, entre 5 y 10000, entre 10 y 10000, entre 15 y 10000, entre 20 y 10 000, entre 25 y 10000, entre 30 y 10 000, entre 50 y 10 000, entre 70 y 10000, entre 100 y 10000, entre 200 y 10 000, entre 2 y 5000, entre 5 y 5000, entre 10 y 5000, entre 15 y 5000, entre 20 y 5000, entre 25 y 5000, entre 30 y 5000, entre 50 y 5000, entre 70 y 5000, entre 100 y 5000, entre 200 y 5000, entre 2 y 3000, entre 5 y 3000, entre 10 y 3000, entre 15 y 3000, entre 20 y 3000, entre 25 y 3000, entre 30 y 3000, entre 50 y 3000, entre 70 y 3000, entre 100 y 3000, entre 200 y 3000, entre 2 y 1000, entre 5 y 1000, entre 10 y 1000, entre 15 y 1000, entre 20 y 1000, entre 25 y 1000, entre 30 y 1000, entre 50 y 1000, entre 70 y 1000, entre 100 y 1000, entre 200 y 1000, entre 2 y 500, entre 5 y 500, entre 10 y 500, entre 15 y 500, entre 20 y 500, entre 25 y 500, entre 30 y 500, entre 50 y 500, entre 70 y 500, entre 100 y 500, o entre 200 y 500 bases nucleotídicas de longitud.

En algunas modalidades, un molde de ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario. Una sola cadena de un molde de ácido nucleico puede denominarse en la presente descripción "molde polinucleotídico". No se excluye que un "molde polinucleotídico " como se menciona en la presente descripción se una a una secuencia complementaria de este. En otras palabras, un "molde polinucleotídico" puede ser, por ejemplo, la totalidad de un molde de ácido nucleico monocatenario, o puede ser una cadena de un molde de ácido nucleico bicatenario. Un molde de ácido nucleico puede estar contenido en una molécula de ácido nucleico primaria. En algunas modalidades, un molde de ácido nucleico puede constituir la totalidad de una molécula de ácido nucleico primaria. En otras modalidades, un molde de ácido nucleico puede estar contenido en un ácido nucleico primario que contiene uno o más nucleótidos que no son parte del molde de ácido nucleico (por ejemplo, el molde de ácido nucleico puede ser de una longitud más corta que el ácido nucleico primario que contiene el molde de ácido nucleico).

Un molde de ácido nucleico puede tener cualquier longitud de nucleótidos. Por ejemplo, un molde de ácido nucleico puede ser al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 750, 1000 o 1500 nucleótidos de longitud. En otro ejemplo, un molde de ácido nucleico puede estar entre 2 y 100,000, entre 5 y 100000, entre 10 y 100000, entre 15 y 100000, entre 20 y 100000, entre 25 y 100 000, entre 30 y 100000, entre 50 y 100000, entre 70 y 100000, entre 100 y 100000, entre 200 y 100000, entre 2 y 10 000, entre 5 y 10000, entre 10 y 10000, entre 15 y 10000, entre 20 y 10 000, entre 25 y 10000, entre 30 y 10 000, entre 50 y 10 000, entre 70 y 10000, entre 100 y 10000, entre 200 y 10 000, entre 2 y 5000, entre 5 y 5000, entre 10 y 5000, entre 15 y 5000, entre 20 y 5000, entre 25 y 5000, entre 30 y 5000, entre 50 y 5000, entre 70 y 5000, entre 100 y 5000, entre 200 y 5000, entre 2 y 3000, entre 5 y 3000, entre 10 y 3000, entre 15 y 3000, entre 20 y 3000, entre 25 y 3000, entre 30 y 3000, entre 50 y 3000, entre 70 y 3000, entre 100 y 3000, entre 200 y 3000, entre 2 y 1000, entre 5 y 1000, entre 10 y 1000, entre 15 y 1000, entre 20 y 1000, entre 25 y 1000, entre 30 y 1000, entre 50 y 1000, entre 70 y 1000, entre 100 y 1000, entre 200 y 1000, entre 2 y 500, entre 5 y 500, entre 10 y 500, entre 15 y 500, entre 20 y 500, entre 25 y 500, entre 30 y 500, entre 50 y 500, entre 70 y 500, entre 100 y 500, o entre 200 y 500 bases de nucleótidos de longitud.

Un "cebador" como se usa en la presente descripción puede referirse a un polinucleótido que es i) capaz de hibridar con una cadena de ácido nucleico original y ii) actuar como un punto de inicio para la síntesis de una nueva cadena de ácido nucleico, en donde la nueva cadena de ácido nucleico es un producto de extensión del cebador y es complementaria a la cadena original. Un cebador puede tener un grupo -OH libre en su extremo 3', que puede servir como origen de la síntesis para el producto de extensión

Un cebador puede contener nucleótidos estándar [por ejemplo, desoxirribonucleótidos de ADN estándar (monofosfato de desoxiadenosina, monofosfato de desoxiguanosina, monofosfato de timidina, monofosfato de desoxicitidina) o ribonucleótidos de ARN estándar (monofosfato de adenosina, monofosfato de guanosina, monofosfato de uridina, monofosfato de citidina)], nucleótidos alternativos (por ejemplo, inosina) nucleótidos modificados, análogos de nucleótidos o una combinación de estos. Por ejemplo, un cebador oligonucleotídico puede incluir ácidos nucleicos peptídicos, morfolinos (por ejemplo, oligos de fosforodiamidato morfolino), ácidos nucleicos bloqueados [ver, por ejemplo, Kaur, H, y otros, Biochemistry 45 (23), 7347-55 (2006)], ácidos nucleicos de glicol o ácidos nucleicos de treosa. Un cebador puede tener un esqueleto, que incluye, por ejemplo, enlaces fosfodiéster, enlaces fosforotioato (un O que no forma un puente se sustituye con azufre) o enlaces peptídicos (como parte de un ácido nucleico peptídico). Los nucleótidos alternativos, nucleótidos modificados y análogos de nucleótidos pueden denominarse conjuntamente en la presente descripción "nucleótidos no estándar."

La presencia de un nucleótido no estándar en un cebador puede afectar varias propiedades del cebador. En algunas modalidades, la inclusión de un nucleótido no estándar en un cebador puede aumentar o disminuir la estabilidad termodinámica de un cebador con respecto a una secuencia complementaria de este. Por ejemplo, un cebador que tiene una mayor estabilidad termodinámica puede contener un ácido nucleico bloqueado. Un cebador que tiene una estabilidad termodinámica disminuida puede contener, por ejemplo, inosina (descrita por Auer y otros, Nucl. Acids Res. 24; 5021-5025 (1996)) o un grupo químico cargado negativamente, tal como un ácido carboxílico.

Un primer cebador o un segundo cebador proporcionados en la presente descripción pueden tener cualquier longitud. El primer cebador y el segundo cebador pueden contener el mismo número de nucleótidos o un número diferente de nucleótidos. En algunas modalidades, un primer o segundo cebador puede ser al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 750, 1000, o 1500 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, un primer o segundo cebador no pueden tener más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 750, 1000, o 1500 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, un primer o segundo cebador pueden tener una longitud seleccionada de un intervalo que tiene un valor mínimo de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 750, o 1000 nucleótidos de longitud y un valor máximo de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 750, 1000, o 1500 nucleótidos de longitud.

La región de cola de un primer cebador o un segundo cebador proporcionados en la presente descripción puede tener cualquier longitud. Típicamente, las regiones de cola de un primer cebador y un segundo cebador dirigidos al mismo molde contienen el mismo número de nucleótidos. En algunas modalidades, la región de cola de un primer o segundo cebador puede ser al menos de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 750, 1000, o 1500 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, la región de cola de un primer o segundo cebador puede ser no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 750, 1000, o 1500 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, la región de cola de un primer o segundo cebador puede tener una longitud seleccionada de un intervalo que tiene un valor mínimo de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 750, o 1000 nucleótidos de longitud y un valor máximo de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 750, 1000, o 1500 nucleótidos de longitud.

La región de unión al molde de un primer cebador o un segundo cebador proporcionados en la presente descripción puede tener cualquier longitud. Las regiones de unión al molde de un primer cebador y un segundo cebador dirigidos al mismo molde pueden contener el mismo número de nucleótidos o un número diferente de nucleótidos. En algunas modalidades, la región de unión al molde de un primer o segundo cebador puede ser al menos de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 750, 1000, o 1500 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, la región de unión al molde de un primer o segundo cebador puede ser no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,

19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500,

750, 1000, o 1500 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, la región de unión al molde de un primer o segundo cebador puede tener una longitud seleccionada de un intervalo que tiene un valor mínimo de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100,

150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 750, o 1000 nucleótidos de longitud y un valor máximo de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,

12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200,

250, 300, 350, 400, 500, 750, 1000, o 1500 nucleótidos de longitud.

En algunas modalidades, un cebador puede ser de cualquier longitud y contener cualquier secuencia de nucleótidos que permita la hibridación suficientemente estable y específica del cebador con su complemento a la temperatura que se usa para un método o etapa de este que involucra al cebador. La longitud exacta conveniente de un cebador puede depender de una variedad de factores, que incluye la temperatura de una reacción, la composición química del cebador y la reacción que involucra al cebador. En algunas modalidades, la región de unión al molde de un cebador puede tener cualquier longitud y contener cualquier secuencia de nucleótidos que permita la hibridación suficientemente estable y específica de la región de unión al molde del cebador con su complemento a la temperatura que se usa para un método o etapa de este que involucra el cebador. La longitud exacta conveniente de la región de unión al molde de un cebador puede depender de una variedad de factores, que incluye la temperatura de una reacción, la composición química de la región de unión al molde del cebador y la reacción que involucra al cebador. La inclusión de uno o más nucleótidos no estándar en el cebador puede cambiar la longitud conveniente del cebador para usar en un método proporcionado en la presente descripción, en comparación con la longitud de un cebador correspondiente que carece de un nucleótido no estándar. Por ejemplo, si con un método proporcionado en la presente descripción es conveniente tener un cebador con una determinada temperatura de fusión ("Tm"), en algunas modalidades, un cebador con la Tm seleccionada puede ser de una longitud más corta si el cebador contiene al menos algunos nucleótidos no estándar, en comparación a si el cebador solo contiene nucleótidos estándar. Generalmente, la "temperatura de fusión" de una secuencia de nucleótidos se refiere a la temperatura a la que el 50 % de los ácidos nucleicos que tienen la secuencia de nucleótidos están apareados con una secuencia complementaria de esta (es decir, están en una molécula bicatenaria) y el 50 % de los ácidos nucleicos que tienen la secuencia de nucleótidos están en forma monocatenaria.

En algunas modalidades, uno o ambos de un primer cebador o un segundo cebador proporcionados en la presente descripción pueden diseñarse para contener una secuencia de nucleótidos en la región de cola del cebador que es complementaria a un motivo interno (es decir, una secuencia de nucleótidos) dentro de una secuencia del ácido nucleico diana. Por ejemplo, con referencia nuevamente a la Figura 1, la región de cola de un primer cebador 105 puede contener una secuencia de nucleótidos que es complementaria a un motivo interno en una segunda cadena de un molde de ácido nucleico bicatenario 104, un producto de extensión de una primera copia del primer cebador 111, o un producto de extensión de una segunda copia del primer cebador 113. De manera similar, aun con referencia a la Figura 1, la región de cola de un segundo cebador 106 puede contener una secuencia de nucleótidos que es complementaria a un motivo interno en una primera cadena de un molde de ácido nucleico bicatenario 103 o un producto de extensión del segundo cebador 112. En al menos algunas circunstancias, tener una secuencia de nucleótidos en la región de cola de un cebador que es complementaria a un motivo interno dentro de una secuencia de ácido nucleico diana puede aumentar la velocidad o la especificidad de una reacción como se describe en la presente descripción.

Sin estar ligado a ninguna teoría, se cree que tener una secuencia de nucleótidos en la región de cola de un cebador que es complementaria a un motivo interno dentro de una secuencia de ácido nucleico diana puede aumentar la velocidad o la especificidad de una reacción de acuerdo con el mecanismo descrito en la Figura 9. En aras de la brevedad, la Figura 9 y este mecanismo se describen solo con referencia a una primera copia de un primer cebador, pero igualmente pueden aplicarse a una segunda copia de un primer cebador, un segundo cebador o similar, según corresponda. Además, la Figura 9 y este mecanismo se describen solo con referencia a un producto de extensión de una primera copia del primer cebador 111 que se hibrida con un producto de extensión del segundo cebador 112 , pero igualmente pueden aplicarse a otras moléculas que contienen un producto de extensión de un cebador descrito en la presente descripción. Pasando ahora a la Figura 9, al menos una porción de la región de cola de un primer cebador puede contener una secuencia de nucleótidos 901 (relleno de tablero de ajedrez) que es complementaria a un motivo interno 902 (relleno similar a una barra invertida) en un producto de extensión de una primera copia del primer cebador

111 y ese primer cebador puede integrarse en el producto de extensión de la primera copia del primer cebador 111 (como se describe en otra parte de la presente descripción). El producto de extensión de la primera copia del primer cebador 111 puede hibridarse con un producto de extensión del segundo cebador 112. Durante la "respiración" de un ácido nucleico dúplex que contiene el producto de extensión de la primera copia del primer cebador 111 y el producto de extensión del segundo cebador 112, la región de cola del cebador 901 puede moverse hacia adelante y puede aparearse temporalmente con el motivo interno 902 presente en el producto de extensión de una primera copia del primer cebador. Después de hibridar temporalmente el motivo interno 902 en el producto de extensión de la primera copia del primer cebador, la región de cola del cebador 901 puede volver a su posición original hibridada con el producto de extensión del segundo cebador 112 y, opcionalmente, puede moverse repetidamente hacia adelante y

hacia atrás entre estas configuraciones (representadas por las flechas en la Figura 9). Durante el tiempo que la secuencia de nucleótidos de la región de cola 901 se híbrida con el motivo interno 902, uno o más nucleótidos en el extremo 3' del producto de extensión del segundo cebador 112 pueden estar sin hibridar y disponibles para unirse a un nueva copia de un primer cebador o de una secuencia complementaria en otro ácido nucleico dúplex (por ejemplo, un ácido nucleico secundario). En el caso de que uno o más nucleótidos en el extremo 3' del producto de extensión del segundo cebador 112 se una a una nueva copia de un primer cebador o a una secuencia complementaria en otro ácido nucleico dúplex (por ejemplo, un ácido nucleico secundario), ambos eventos pueden aumentar la velocidad de una reacción como se describe en otra parte de la presente descripción, por ejemplo, mediante la generación de un nuevo producto de extensión del primer cebador (que desplaza el primer producto de extensión del primer cebador original durante su generación). Además, incluso sin que exista una secuencia de nucleótidos 901 en el primer cebador que sea complementaria a un motivo interno 902, todavía puede haber "respiración" entre secuencias complementarias en un ácido nucleico dúplex en los métodos proporcionados en la presente descripción. Sin embargo, la cantidad de tiempo durante el cual un ácido nucleico dúplex puede "respirar" puede aumentar cuando hay una secuencia de nucleótidos 901 en el primer cebador que es complementaria a un motivo interno 902, y esto a su vez puede aumentar la velocidad de una reacción de acuerdo con un método proporcionado en la presente descripción.

En las modalidades, un motivo interno puede contener al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, o 100 nucleótidos. En las modalidades, un motivo interno no puede contener más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, o 100 nucleótidos. En las modalidades, un motivo interno puede contener al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o 75 y no más de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, o 100 nucleótidos (en los que el valor superior está por encima del valor inferior). Típicamente, la secuencia de nucleótidos en el cebador que es complementaria al motivo interno contiene el mismo número de nucleótidos que el motivo interno. Además, la secuencia de nucleótidos en el cebador que es complementaria al motivo interno puede ser perfectamente complementaria al motivo interno, o puede haber uno o más nucleótidos con errores de apareamiento entre la secuencia de nucleótidos en el cebador y el motivo interno. El comienzo del motivo interno puede estar separado por cualquier distancia del nucleótido terminal 3' del cebador que se extiende para formar el producto de extensión del cebador que contiene el motivo interno, pero normalmente puede estar separado del nucleótido terminal 3' del cebador, por ejemplo, por al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, o 100 nucleótidos. En las modalidades, el comienzo del motivo interno puede estar separado del nucleótido terminal 3' del cebador que se extiende para formar el producto de extensión del cebador que contiene el motivo interno en no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, o 100 nucleótidos. En modalidades, el comienzo del motivo interno puede estar separado del nucleótido terminal 3' del cebador que se extiende para formar el producto de extensión del cebador que contiene el motivo interno por al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o 75 y no más que 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, o 100 nucleótidos (donde el número superior es mayor que el número inferior).

Como se usa en la presente descripción, en el contexto de una única cadena de ácido nucleico diana / molde polinucleotídico, un "motivo interno" es una porción de la cadena de ácido nucleico diana a la que la región de cola de un cebador de un par de cebadores para amplificar el ácido nucleico diana proporcionado en la presente descripción es complementario y que tiene la misma secuencia de nucleótidos o una similar que la región de cola del otro cebador del par de cebadores. Por lo tanto, por ejemplo, si el motivo interno en un ácido nucleico diana tiene la secuencia de nucleótidos, en la dirección 5' a 3' de GGGATGGA, la cola / primera región de un cebador de un par de cebadores usado para amplificar el ácido nucleico diana de acuerdo con un método proporcionado en la presente descripción tendrá la secuencia de nucleótidos, en la dirección 5' a 3' de TCCATCCC (o una secuencia similar), y la cola / primera región del otro cebador del par de cebadores tendrá la secuencia de nucleótidos, en la dirección 5' a 3' de GGGATGGA (o una secuencia similar). En el contexto de un ácido nucleico diana bicatenario, el término "motivo interno" se refiere a la región relevante de cualquiera de las dos cadenas, como se describió anteriormente para una cadena sencilla. En el contexto de un producto de extensión del cebador descrito en la presente descripción, un "motivo interno" se refiere a la porción del producto de extensión que es complementaria a la porción del producto de extensión del cebador que corresponde a la región de cola del cebador que se extendió para formar ese producto de extensión del cebador particular. Además, si va a hacerse referencia a una secuencia de nucleótidos en una cadena diferente que es complementaria al "motivo interno" en una cadena particular, esa secuencia complementaria puede denominarse en la presente descripción como "complemento del motivo interno". Es de destacar que, en situaciones en las que están presentes dos cadenas de ácido nucleico complementarias (por ejemplo, como en una molécula bicatenaria que contiene dos productos de extensión de cebadores complementarios), cada cadena tendrá un "motivo interno" diferente (los "motivos internos de las diferentes cadenas serán complementarios entre sí), por lo que la descripción de un "motivo interno" proporcionada en la presente descripción puede calificarse con referencia a la cadena o cebador relevante, cuando sea apropiado. Por ejemplo, puede describirse un ácido nucleico bicatenario, en donde la primera cadena del ácido nucleico tiene, en orden 5'-3', las porciones C'-B-C-A-C', y la segunda cadena del ácido nucleico tiene, en orden 5' -3', las porciones C-A'-C'-B'-C, donde la porción C' de la primera cadena hibrida con la porción C de la segunda cadena, la porción A de la primera cadena hibrida con la porción A' de la segunda cadena, etcétera. Si la porción C' de la primera cadena corresponde a la región de cola de un cebador proporcionado en la presente descripción, y la porción C' es complementaria a la porción C, entonces la porción C de la primera cadena puede denominarse el "motivo interno" de la primera cadena, y la porción C' de la segunda cadena puede denominarse "complemento del motivo interno" en relación con la primera cadena. Al mismo tiempo, si la porción C de la segunda cadena también corresponde a la región de cola de un cebador proporcionado en la presente descripción, y es complementaria a la porción C', entonces la porción C' de la segunda cadena puede denominarse "motivo interno' de la segunda cadena, y la porción C de la primera cadena puede denominarse "complemento del motivo interno" en relación con la segunda cadena.

En las modalidades, los métodos y composiciones proporcionados en la presente descripción pueden describirse con referencia a la Figura 10. Las características de la Figura 10 pueden describirse generalmente de la misma manera que la Figura 8, excepto que el molde de la Figura 10 incluye, además, un motivo interno.

Un molde polinucleotídico 1000 (Figura 10A) puede ser una diana para la amplificación. El molde polinucleotídico 1000 es una cadena de ácido nucleico única. La cadena del molde polinucleotídico puede existir como una molécula de cadena única libre, o puede existir como parte de una molécula bicatenaria, en la que la cadena del molde polinucleotídico hibrida con una cadena complementaria de este. El molde polinucleotídico 1000 puede ser ADN o ARN.

El molde polinucleotídico 1000 puede contener al menos una primera porción 1001 (también indicada con un "(i)" y la letra "A") y una segunda porción 1002 (también indicada con un "(ii)" y la letra "B"). La primera porción 1001 y la segunda porción 1002 pueden contener cada una cualquier número de nucleótidos, tal como se describe para la primera porción y la segunda porción del molde en la Figura 8. La primera porción 1001 y la segunda porción 1002 pueden contener el mismo o diferente número de nucleótidos. Además, el molde polinucleotídico 1000 puede contener una tercera porción 1003 (también indicada con un "(iii)" y una letra "C"), que también puede denominarse "motivo interno". El motivo interno, típicamente, contiene entre 6 y 10 nucleótidos, aunque opcionalmente puede contener otros números de nucleótidos, tal como al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 nucleótidos, no más de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleótidos, o al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 nucleótidos y no más de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleótidos (siendo el valor superior mayor que el valor inferior). El motivo interno 1003, típicamente, está separado de la primera porción 1001 y la segunda porción 1002 en cada lado entre 2 y 25 nucleótidos, aunque puede estar separado por otros números de nucleótidos tal como al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o 50 nucleótidos, no más de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o 60 nucleótidos, o entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o 50 nucleótidos y 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o 60 nucleótidos (siendo el valor superior mayor que el valor inferior). En las modalidades, puede haber el mismo número de nucleótidos entre la primera porción 1001 y el motivo interno 1003, en comparación con entre la segunda porción 1002 y el motivo interno 1003 (por ejemplo, puede haber 6 nucleótidos entre la primera porción y el motivo interno y 6 nucleótidos entre la segunda porción y el motivo interno). En otras modalidades, puede haber un número diferente de nucleótidos entre la primera porción 1001 y el motivo interno 1003 que entre la segunda porción 1002 y el motivo interno 1003 (por ejemplo, puede haber 6 nucleótidos entre la primera porción y el motivo interno y 8 nucleótidos entre la segunda porción y el motivo interno). En las modalidades, no hay nucleótidos entre el motivo interno y la primera porción 1001 o la segunda porción 1002 (por ejemplo, en las modalidades, el motivo interno puede estar directamente al lado de una o ambas de la primera porción 1001 o la segunda porción 1002).

El molde polinucleotídico 1000 puede incubarse en una mezcla de reacción que contiene un primer cebador 1010 y un segundo cebador 1020 (Figura 10B). Típicamente, la mezcla de reacción contiene múltiples copias de cada cebador, tal como, por ejemplo, al menos 4, 5, 6, 10, 15, 20, 50, 100, 1000, 10 000, 100 000 o 1 millón de copias o más de cada uno de los cebadores. El primer cebador 1010 puede tener una primera región 1011 (también indicada con un "(i)") y una segunda región 1012 (también indicada con un "(ii)"). La primera región del primer cebador 1011 puede tener un extremo 5' y la segunda región del primer cebador 1012 puede tener un extremo 3'. La primera región del primer cebador puede tener una secuencia de nucleótidos que es diferente de la secuencia de nucleótidos de la segunda región del primer cebador. El segundo cebador 1020 puede tener una primera región 1021 (también indicada con "(i)") y una segunda región 1022 (también indicada con "(ii)"). La primera región del segundo cebador 1021 puede tener un extremo 5' y la segunda región del segundo cebador 1022 puede tener un extremo 3'. La primera región del segundo cebador puede tener una secuencia de nucleótidos que es diferente de la secuencia de nucleótidos de la segunda región del segundo cebador.

La segunda región del primer cebador 1012 puede tener una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de la primera porción del molde polinucleotídico 1001. En la Figura 10, la secuencia de nucleótidos de la primera porción del molde polinucleotídico 1001 está representada por la letra A, y la secuencia de nucleótidos de la segunda región del primer cebador 1012 está representada por la letra A', donde A y A' son complementarias entre sí. La segunda región del segundo cebador 1022 puede tener una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos asociada 1030, en donde la secuencia de nucleótidos asociada 1030 es complementaria a la secuencia de nucleótidos de la segunda porción del molde polinucleotídico 1002. En la Figura 10, la secuencia de nucleótidos de la segunda porción del molde polinucleotídico 1002 está representada por la letra B, la secuencia de nucleótidos de la secuencia de nucleótidos asociada 1030 está representada por la letra B', y la secuencia de nucleótidos de la segunda región del segundo cebador 1022 está representada por la letra B, donde B y B 'son complementarias entre sí. En otras palabras, como se indica en la Figura 10, la secuencia de nucleótidos de la segunda porción del molde polinucleotídico 1002 (B) puede ser la misma que la secuencia de nucleótidos de la segunda región del segundo cebador 1022 (B). Con las composiciones y métodos proporcionados en la presente descripción, puede generarse una secuencia de nucleótidos asociada 1030, por ejemplo, como parte de un producto de extensión desde el extremo 3' del primer cebador. En las modalidades, la primera región del primer cebador 1011 puede ser complementaria a la primera región del segundo cebador 1021. En la Figura10, la secuencia de nucleótidos de la primera región del primer cebador está representada por la letra C, y la secuencia de nucleótidos de la primera región del segundo cebador está representada por la letra C', donde C y C' son complementarias entre sí.

Además, la primera región del segundo cebador 1021 puede ser complementaria al motivo interno 1003 en el molde polinucleotídico. En la Figura 10, la secuencia de nucleótidos del motivo interno 1003 del molde polinucleotídico está representada por la letra C, donde C y C 'son complementarias entre sí. Por lo tanto, como se indica en la Figura 10, en las modalidades, la primera región del primer cebador 1011 puede tener la misma secuencia de nucleótidos que el motivo interno 1003 del molde polinucleotídico, mientras que la primera región del segundo cebador 1021 tiene una secuencia que es complementaria al motivo interno 1003. Además, la primera región del segundo cebador 1021 es complementaria tanto de la primera región del primer cebador 1011 como del motivo interno, mientras que la primera región del primer cebador 1011 es complementaria de la primera región del segundo cebador 1011 y del complemento del motivo interno.

En las modalidades, el primer cebador y el segundo cebador de la Figura 10 pueden tener cualquiera de las características del primer cebador y el segundo cebador descritos en otra parte de la presente descripción (por ejemplo, como en la Figura 1 u 8), respectivamente. Además, en las modalidades, la primera región del primer cebador de la Figura 10 puede tener cualquiera de las características de la región de cola de un primer cebador descrito en otra parte de la presente descripción. En las modalidades, la segunda región del primer cebador de la Figura 10 puede tener cualquiera de las características de la región de unión al molde de un primer cebador descrito en otra parte de la presente descripción. En las modalidades, la primera región del segundo cebador de la Figura 10 puede tener cualquiera de las características de la región de cola de un segundo cebador descritas en otra parte de la presente descripción. En las modalidades, la segunda región del segundo cebador de la Figura 10 puede tener cualquiera de las características de la región de unión al molde de un segundo cebador descrito en otra parte de la presente descripción.

En las modalidades, una mezcla de reacción que contiene un molde polinucleotídico 1000 y al menos dos copias de un primer cebador 1010 y al menos dos copias de un segundo cebador 1020 puede contener uno o más de otros componentes que pueden sustentar la síntesis de ácidos nucleicos basada en polimerasa como se describe en otra parte en la presente descripción (por ejemplo, polimerasas, nucleótidos, tampones, agua, etcétera). De manera similar, una mezcla de reacción que contiene un molde polinucleotídico 1000 y al menos dos copias de un primer cebador 1010 y al menos dos copias de un segundo cebador 1020 puede incubarse en cualquiera de las condiciones de reacción descritas en otra parte de la presente descripción para sustentar la amplificación de un ácido nucleico molde o la generación de concatámeros.

En las modalidades, después de la incubación de un molde polinucleotídico 1000 y al menos dos copias de un primer cebador 1010 y al menos dos copias de un segundo cebador 1020 en una mezcla de reacción como se describe en la presente descripción, pueden formarse una o más cadenas concatámero (Figura 10C). En las modalidades, una cadena concatámero 1040 formada puede tener un extremo 5' y un extremo 3', y puede tener una secuencia que contiene la estructura general en la dirección 5' a 3' de: C'-T-C'-T -X-C', en donde C' es la secuencia de nucleótidos de la primera región del segundo cebador, T es la secuencia del molde polinucleotídico o una secuencia análoga de este, y X es cualquier número y secuencia de nucleótidos. Como se indica además en la Figura 10C, dentro de la secuencia del molde polinucleotídico de la cadena 1040, en la dirección 5' a 3', están presentes las secuencias de las siguientes porciones del molde: B (la segunda porción del molde polinucleotídico), C (el motivo interno) y A (la primera porción del molde polinucleotídico). Por lo tanto, como se muestra en la Figura 10C, la secuencia del motivo interno / complemento del motivo interno se produce en múltiples posiciones en una cadena concatámero en las modalidades proporcionadas en la presente descripción. Específicamente, en la cadena 1040, la secuencia del complemento del motivo interno (C') aparece en la cadena concatámero entre las dos copias de la secuencia del molde polinucleotídico y en los extremos de la cadena, y la secuencia del motivo interno (C) ocurre en la misma cadena dentro de la secuencia del molde polinucleotídico. Por lo tanto, como lo indica la estructura general de la cadena concatámero 1040, una cadena concatámero puede contener al menos dos copias de la secuencia del molde polinucleotídico o una secuencia análoga de esta, donde las copias de la secuencia del molde polinucleotídico están separadas por al menos la secuencia de la primera región del segundo cebador. En las modalidades, T en la estructura general C'-T-C'-T -X-C' proporcionada anteriormente puede ser una secuencia análoga del molde polinucleotídico.

En las modalidades, una cadena concatámero 1040 generada de acuerdo con el método proporcionado en la presente descripción puede ser parte de una molécula monocatenaria. En otras modalidades, una cadena concatámero 1040 generada de acuerdo con el método proporcionado en la presente descripción puede ser parte de un concatámero bicatenario, en el que la cadena concatámero 1040 se hibrida con una cadena que es complementaria a la cadena concatámero 1050. Mientras que la Figura 10C representa cadenas concatámeros que tienen una secuencia que tiene la estructura general en la dirección 5' a 3' de: C'-T-C'-T -X-C' (cadena 1040) o C-T'-C-T'-X'-C (cadena 1050), en donde X es 0 nucleótidos, una cadena concatámero generada de acuerdo con el esquema de la Figura 10 puede tener cualquiera de las características de una cadena concatámero descritas anteriormente o en otra parte de la presente descripción. Además, como se muestra en la Figura 10C, las secuencias A y B y C son parte de la cadena molde y, por lo tanto, no se anotan por separado en la estructura general C'-T-C'-T -X-C' o C-T'-C-T'-X'-C.

Para indicar además la relación de los elementos en las modalidades de la Figura 10, los bloques 1060, 1062, 1064, 1066 y 1068 se proporcionan en la Figura 10. El bloque 1060 (con un relleno similar a una barra invertida) indica la posición relativa de la secuencia del molde polinucleotídico total (es decir, el elemento 1000), o su secuencia complementaria. El bloque 1062 (con relleno de línea vertical) indica la posición relativa de la secuencia de la primera porción del molde polinucleotídico (es decir, la posición relativa de la secuencia del elemento 1001), o su secuencia complementaria. Por lo tanto, el bloque 1062 también representa la secuencia de la segunda región del primer cebador (es decir, el elemento 1012), que es complementaria al elemento 1001. El bloque 1064 (con relleno de línea vertical y horizontal) indica la posición relativa de la secuencia de la segunda porción del molde polinucleotídico (es decir, la posición relativa de la secuencia del elemento 1002), o su secuencia complementaria. Por lo tanto, el bloque 1064 también representa la secuencia de nucleótidos asociada (es decir, el elemento 1030), que es complementaria al elemento 1002. El bloque 1064 también indica la posición relativa de la secuencia de la segunda región del segundo cebador 1022, que puede ser la misma secuencia que la secuencia de la segunda porción del molde polinucleotídico (elemento 1002), o una secuencia similar. En otras palabras, en las modalidades, la secuencia de nucleótidos de 1022 puede ser igual o similar a la secuencia de nucleótidos de 1002. Como se representa, por ejemplo, en la Figura 10A, en las modalidades, hay nucleótidos en el molde polinucleotídico que no forman parte de la primera porción, segunda porción o tercera porción (motivo interno) del molde polinucleotídico. El bloque 1066 (con relleno de línea ondulada) indica la posición relativa de la secuencia de la primera región del primer cebador (es decir, la posición relativa de la secuencia del elemento 1011 / región "C"), o su secuencia complementaria. Por lo tanto, el bloque 1066 también representa la secuencia de la primera región del segundo cebador (elemento 1021 / región "C"), que es complementaria al elemento 1011. Además, el bloque 1066 también representa la secuencia del motivo interno o su secuencia complementaria. Es de destacar que, la secuencia del motivo interno o su secuencia complementaria está tanto en la secuencia molde como en las colas del primer y segundo cebadores. Como se describe en otra parte de la presente descripción, el motivo interno puede estar directamente adyacente a una o a ambas de la primera porción o la segunda porción del molde polinucleotídico, o puede haber nucleótidos adicionales entre el motivo interno y la primera porción o la segunda porción. El bloque 1068 (con relleno de diamante) indica la posición relativa de la secuencia de la cadena concatámero (elemento 1040), o su secuencia complementaria. Por lo tanto, el bloque 1068 también representa la secuencia de una cadena que es complementaria a la cadena concatámero (elemento 1050). Como se muestra en la Figura 10C, dentro de la cadena concatámero o su complemento (1068), están presentes dos copias de la secuencia del molde polinucleotídico o su complemento (1060), separadas por la secuencia de nucleótidos de la primera región del primer cebador o su complemento (1066). Esta secuencia que separa las copias del molde polinucleotídico es también la secuencia del motivo interno o su complemento (1066). Además, dentro de la cadena concatámero o su complemento (1068), la secuencia de nucleótidos de la primera región del primer cebador o su complemento (1066) flanquea la secuencia del molde polinucleotídico o su complemento (1060) en ambos extremos. Además, dentro de la cadena concatámero o su complemento (1068), hay dos copias de la secuencia de la segunda región del primer cebador o su complemento (1062) y dos copias de la secuencia de la secuencia de la segunda región del segundo cebador o su complemento (1064), que ambas están presentes en dos copias como parte de las dos copias de la secuencia del molde polinucleotídico o su complemento. Los bloques 1060, 1062, 1064, 1066 y 1068 no deben interpretarse como que dictan ninguna relación de tamaño particular requerida entre los elementos de la Figura 10; más bien, los bloques 1060, 1062, 1064, 1066 y 1068 son simplemente para ayudar a indicar la posición general de los elementos de la Figura 10 entre sí en determinadas modalidades proporcionadas en la presente descripción.

Un cebador proporcionado en la presente descripción puede prepararse mediante cualquier método adecuado. Por ejemplo, un cebador puede sintetizarse químicamente. En otro ejemplo, un ácido nucleico de origen natural puede aislarse, escindirse (por ejemplo, con enzimas de restricción) y/o modificarse para generar o convertirse en parte de un cebador descrito en la presente descripción.

En algunas modalidades, puede unirse un marcador a un cebador. Los marcadores incluyen, por ejemplo, ligandos de unión (por ejemplo, digoxina o biotina), enzimas, moléculas fluorescentes / fluoróforos, moléculas luminiscentes, moléculas inactivadoras o radioisótopos. En otras modalidades, una base de un oligonucleótido puede sustituirse con un análogo fluorescente, tal como 2-aminopurina (ver, por ejemplo, Proc.Acad. Sci. USA, 91, 6644-6648 (1994)).

En algunas modalidades, las condiciones de manera que: i) una región de unión al molde de una primera copia de un primer cebador se hibrida con una cadena de un molde de ácido nucleico, ii) una región de unión al molde de un segundo cebador se hibrida con un producto de extensión de una primera copia de un primer cebador, iii) una región de unión al molde de una segunda copia de un primer cebador se hibrida con un producto de extensión de un segundo cebador, o iv) una región terminal 3' de un producto de extensión de una segunda copia de un primer cebador de una primera copia de un ácido nucleico secundario se hibrida con una región terminal 3' de un producto de extensión de un segundo cebador de una segunda copia de un ácido nucleico secundario, para producir una estructura cruzada que comprende estas cadenas, cada una puede incluir (es decir, cualquiera de i), ii), iii) o iv) puede incluir) incubar los ácidos nucleicos a una temperatura tal que las cadenas de moléculas de ácido nucleico bicatenario "respiren" (es decir, experimenten breves períodos de ruptura localizada de los enlaces de hidrógeno que conectan los pares de bases) en un grado suficiente para facilitar la entrada de un cebador o una cadena de ácido nucleico diferente entre las cadenas de una molécula bicatenaria y suficiente para permitir la hibridación del cebador o de una cadena de ácido nucleico diferente a una de las cadenas de la molécula de ácido nucleico bicatenaria abierta. En algunas modalidades, los métodos o etapas de estos pueden realizarse o incubarse a una temperatura de al menos 10, 15, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 90 o 95 C. En algunas modalidades, los métodos o etapas de estos pueden realizarse o incubarse a una temperatura no mayor que 10, 15, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 90 o 95 C. En algunas modalidades, los métodos o etapas de estos pueden realizarse o incubarse a una temperatura entre 10, 15, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, o 90 C y 15, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48,49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 90 o 95 C.

En algunas modalidades, para un método o etapas de este proporcionados en la presente descripción, la etapa o método se realiza a una temperatura por debajo de la temperatura de fusión (Tm) de las cadenas de nucleótidos apareadas potencialmente relevantes, o regiones de estas (por ejemplo, la región de unión a molde del primer cebador a la primera cadena de un molde de ácido nucleico, la región de unión al molde del segundo cebador al producto de extensión de la primera copia del primer cebador, el primer cebador al producto de extensión del segundo cebador, la región terminal 3' del producto de extensión del segundo cebador a su complemento, la región terminal 3' del producto de extensión de la primera copia del primer cebador a su complemento, etcétera). En algunas modalidades, para un método o etapas de este proporcionados en la presente descripción, la etapa o método se realiza a una temperatura por encima de la Tm de las cadenas de nucleótidos apareadas potencialmente relevantes, o regiones de estas (por ejemplo, la región de unión al molde del primer cebador a la primera cadena de un molde de ácido nucleico, la región de unión al molde del segundo cebador al producto de extensión de la primera copia del primer cebador, el primer cebador al producto de extensión del segundo cebador, la región terminal 3' del producto de extensión del segundo cebador a su complemento, la región terminal 3' del producto de extensión de la primera copia del primer cebador a su complemento, etcétera). En algunas modalidades, para un método o etapas de este proporcionados en la presente descripción, la etapa o método se realiza a una temperatura de /-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, o 25 C de la Tm de las cadenas de nucleótidos apareadas potencialmente relevantes, o regiones de estas (por ejemplo, la región de unión al molde del primer cebador a la primera cadena de un molde de ácido nucleico, la región de unión al molde del segundo cebador al producto de extensión de la primera copia del primer cebador, el primer cebador al producto de extensión del segundo cebador, la región terminal 3' del producto de extensión del segundo cebador a su complemento, la región terminal 3' del producto de extensión de la primera copia del primer cebador a su complemento, etcétera).

En algunas modalidades, se incluye una polimerasa de ácido nucleico con un método o composición proporcionados en la presente descripción. Una polimerasa puede generar un producto de extensión de un cebador. El cebador y el producto de extensión de este pueden ser complementarios a una cadena de ácido nucleico molde. Generalmente, una polimerasa de ácido nucleico iniciará la síntesis de un producto de extensión de un cebador en el extremo 3' del cebador. En algunas modalidades, se incluye una ADN polimerasa con un método o composición proporcionados en la presente descripción. Como se usa en la presente descripción, una "ADN polimerasa" se refiere a una polimerasa de ácido nucleico que tiene actividad de polimerasa primaria o exclusiva en moldes de ADN. En algunas modalidades, se incluye una transcriptasa inversa con un método o composición proporcionados en la presente descripción. Como se usa en la presente descripción, una "transcriptasa inversa" se refiere a una polimerasa de ácido nucleico que puede sintetizar una cadena de ADN a partir de un molde de ARN. En algunas modalidades, puede incluirse una ARN polimerasa con un método o composición proporcionados en la presente descripción. Como se usa en la presente descripción, una "ARN polimerasa" se refiere a una polimerasa de ácido nucleico que puede sintetizar una cadena de ARN a partir de un molde de ADN o ARN.

En algunas modalidades, una polimerasa proporcionada en la presente descripción puede tener actividad de desplazamiento de cadena. Las polimerasas que tienen actividad de desplazamiento de cadena incluyen, por ejemplo, ADN polimerasa exo-Bca, ADN polimerasa phi29, fragmento Klenow de ADN polimerasa 1 de E. coli, ADN polimerasa VentR, ADN polimerasa Deep VentR, ADN polimerasa 9°Nm, ADN polimerasa Bst 2.0 y fragmento grande de ADN polimerasa Bst. Pueden usarse, además, otras polimerasas que tienen actividad de desplazamiento de cadena.

También pueden usarse versiones modificadas de polimerasas con los métodos y composiciones proporcionados en la presente descripción, siempre que la polimerasa modificada tenga actividad de síntesis de ácido nucleico dependiente de la secuencia. Una versión modificada de una polimerasa ("polimerasa modificada") puede tener, por ejemplo, 100 o menos, 70 o menos, 50 o menos, 40 o menos, 30 o menos, 20 o menos, 10 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, 2 o menos, o 1 aminoácido diferente de la secuencia de la versión original de la polimerasa. En algunas modalidades, una polimerasa modificada puede contener no más de 1000, 700, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 40, 30, 20, 10 o 5 más o menos aminoácidos que la polimerasa original. En algunas modalidades, una polimerasa modificada puede comprender un fragmento de una polimerasa original. En algunas modalidades, una polimerasa modificada puede comprender un polipéptido quimérico con una porción derivada de una polimerasa y una porción derivada de una proteína no polimerasa. En algunas modalidades, una polimerasa modificada puede tener, por ejemplo, mayor actividad catalítica, mayor estabilidad o mayor estabilidad térmica en comparación con la polimerasa original.

En algunas modalidades, una polimerasa proporcionada en la presente descripción es termoestable. Una polimerasa termoestable puede tener, por ejemplo, una vida media de al menos 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 90, 120 o 180 minutos a una temperatura de hasta 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o 95 C. En algunas modalidades, una polimerasa modificada puede ser termoestable.

En algunas modalidades, los métodos y etapas de estos proporcionados en la presente descripción incluyen o se realizan en condiciones suficientes para sustentar la síntesis de ácidos nucleicos basada en polimerasa. Las condiciones ilustrativas para la síntesis de ácidos nucleicos basada en polimerasa se conocen en la técnica y se proporcionan, por ejemplo, en Green y Sambrook, supra. Los componentes no limitantes para una reacción de síntesis de ácidos nucleicos basada en polimerasa pueden incluir uno o más de: enzima polimerasa (a una concentración entre, por ejemplo, 0,01 y 10 unidades de enzima por 50 microlitros de volumen de reacción, o cualquier intervalo que incluye, por ejemplo, entre 0,01-1, 0,1-10, 0,1-5, 0,5-10, 0,5-5, 0,5-2, 1-10, o 1-5 unidades de enzima por 50 microlitros de volumen de reacción, donde 1 unidad de enzima incorporará 15 nmol de dNTP en el producto de polimerización en 30 minutos a 75 °C); molde (a una concentración de al menos, por ejemplo, 1, 10, 100, 1000, 10000, o 100000 copias por reacción); cebador (a una concentración entre, por ejemplo, 0,01 y 10 micromolar, o cualquier intervalo que incluye, por ejemplo, entre 0,01-1, 0,1-10, 0,1-5, 0,5-5, o 0,5-2 micromolar); dNTP (por ejemplo, dATP, dTTP, dGTP y dCTP, a una concentración entre, por ejemplo, 50 y 500 micromolar de cada uno de dATP, dTTP, dGTP y dCTP, o cualquier intervalo que incluye, por ejemplo, entre 50-350, 100-500, 100-300, 200-500 o 300-400 micromolar de cada uno de dATP, dTTP, dGTP y dCTP); sales (por ejemplo, KCl o acetato de potasio, a una concentración entre, por ejemplo, 1 y 200 milimolar, o cualquier intervalo en el mismo que incluye, por ejemplo, entre 1-100, 1-50, 1-20, 1-10, 10-20, 10 50 o 10-200 milimolar); tampón (por ejemplo, Tris-HCl o Tris-acetato, pH 7,8 - 8,5, a una concentración entre, por ejemplo, 1 y 100 milimolar, o cualquier intervalo que incluye, por ejemplo, entre 1-50, 1-20, 1-10, 1-5, 10-100, 20-100 o 50-100 milimolar); e iones magnesio (a una concentración entre, por ejemplo, 0,1 y 10 milimolar, o cualquier intervalo, que incluye, por ejemplo, entre 0,1-5, 0,1-1, 0,5-10, 0,5-5 o 0,5-2,5 milimolar). Los componentes no limitantes adicionales para una reacción de síntesis de ácido nucleico basada en polimerasa pueden aumentar la velocidad de la reacción, aumentar la fidelidad de la reacción o aumentar la estabilidad de las enzimas o del ADN en la reacción, y pueden incluir uno o más de: gelatina (a una concentración entre, por ejemplo, 0,0001 % y 0,1 % p/v), BSA (a una concentración entre, por ejemplo, 0,01 y 1 microgramo por microlitro), sacarosa (a una concentración entre, por ejemplo, 0,01 molar y 0,8 molar), trehalosa (a una concentración entre, por ejemplo, 0,01 molar y 0,8 molar), DMSO (a una concentración entre, por ejemplo, 0,01 y 10 % v/v), betaína (a una concentración entre, por ejemplo, 0,1 y 10 molar), formamida (a una concentración entre, por ejemplo, 0,1 y 10 % v/v), glicerol (a una concentración entre, por ejemplo, 0,1 y 20 % v/v), polietilenglicol (a una concentración entre, por ejemplo, 0,1 y 20 % v/v), detergentes no iónicos [por ejemplo, NP-40 (a una concentración entre, por ejemplo, 0,01 y 1 % v/v), Tween-20 (a una concentración entre, por ejemplo, 0,01 y 1 % v/v), o Triton X-100 (a una concentración entre, por ejemplo, 0,01 y 1 % v/v)], iones de amonio [por ejemplo, sulfato de amonio (a una concentración entre, por ejemplo, 1 y 100 milimolar)] y EDTA (a una concentración entre, por ejemplo, 0,001 y 0,1 milimolar). También pueden estar presentes otros reactivos en una reacción de síntesis de ácido nucleico basada en polimerasa proporcionada en la presente descripción. Por ejemplo, pueden usarse reactivos suficientes para sintetizar productos de reacción de ARN o productos de reacción que contienen nucleótidos no estándar. Las condiciones suficientes para sustentar la síntesis de ácidos nucleicos basada en polimerasa pueden incluir una variedad de temperaturas y valores de pH. Por ejemplo, el pH de una reacción de síntesis de ácido nucleico basada en polimerasa puede estar entre, por ejemplo, pH 6,0 y pH 10,0, tal como 6,5, 7, 7,5, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,5, 9, o 9,5. La temperatura de una reacción de síntesis de ácido nucleico basada en polimerasa puede ser constante o variada. Una temperatura constante puede estar entre, por ejemplo, 10 C y 95 C, tal como 20, 25, 30, 35, 37, 40, 42, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 u 85 C. Una temperatura variada puede ser dos o más temperaturas diferentes entre, por ejemplo, 10 C y 95 C, tal como dos o más temperaturas seleccionadas entre 20, 25, 30, 35, 37, 40, 42, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 u 85 C.

Los métodos proporcionados en la presente descripción pueden realizarse a una variedad de temperaturas. En algunas modalidades, todas las etapas de un método se realizan a la misma temperatura. Por lo tanto, los ciclos de temperatura tales como en la PCR no son necesarios con los métodos descritos en la presente descripción. En algunas modalidades, los métodos proporcionados en la presente descripción pueden realizarse a dos o más temperaturas diferentes. En algunas modalidades, una mezcla de reacción que contiene reactivos para un método proporcionado en la presente descripción se incuba a dos o más temperaturas diferentes. En algunos ejemplos, pueden seleccionarse diferentes temperaturas para optimizar la velocidad, la precisión u otra característica de las diferentes etapas de un método proporcionado en la presente descripción. Por ejemplo, puede seleccionarse una temperatura para aumentar la actividad enzimática de una polimerasa. En algunos ejemplos, pueden seleccionarse diferentes temperaturas para aumentar la especificidad de unión de un cebador a un molde o para aumentar la accesibilidad de un molde a un cebador (por ejemplo, temperaturas más altas pueden promover la separación de ácidos nucleicos del molde dúplex). En algunas modalidades, todas las etapas de un método proporcionado en la presente descripción se realizan a una temperatura no superior a 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o 10 °C. En algunas modalidades, un método proporcionado en la presente descripción se realiza a una temperatura entre 20-60, 30-70, 40-80, 20-40, 30-50, 40-60, 50-70, 60-80, 30 40, 35-45, 40-50, 45-55, 50-60, 55-65 °C. En determinadas modalidades, una muestra que contiene un ácido nucleico diana puede calentarse a una temperatura superior a 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 95 C antes del inicio de un método proporcionado en la presente descripción. En determinadas modalidades, una mezcla de reacción proporcionada en la presente descripción puede calentarse una vez a una temperatura elevada superior a 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90 o 95 C antes o después del inicio de un método proporcionado en la presente descripción. Después de calentar la mezcla de reacción a la temperatura elevada, puede mantenerse a una temperatura más baja como se proporciona en otra parte de la presente descripción (por ejemplo, a una temperatura entre 40-70 C) durante el resto de la ejecución del método. En las modalidades, si una mezcla de reacción o muestra se calienta a una temperatura elevada antes del inicio de un método proporcionado en la presente descripción, puede añadirse una polimerasa de ácido nucleico a la mezcla de reacción o muestra después de que la mezcla de reacción o muestra se haya calentado a la temperatura elevada y la mezcla de reacción o muestra se ha llevado a una temperatura más baja como se proporciona en la presente descripción. Los métodos descritos en la presente descripción pueden realizarse con o sin un termociclador.

Como una consideración, la temperatura que se usa para un método o etapa de este proporcionado en la presente descripción puede seleccionarse para que sea apropiada para la enzima o enzimas que se usan en la etapa del método. En algunas modalidades, para los métodos en los que se usa una polimerasa, la temperatura o temperaturas de la reacción se seleccionan de manera que no afecten significativamente la actividad de la polimerasa (por ejemplo, la temperatura de la reacción puede seleccionarse de manera que la polimerasa tenga una vida media de al menos 24, 12, 6, 4, 3, 2, 1, 0,75, 0,5, 0,25 o 0,1 horas). Alternativamente, los métodos pueden realizarse a una temperatura que perjudique la actividad de las enzimas que se usan en el método (por ejemplo, la temperatura de la reacción puede seleccionarse de manera que una enzima en la reacción tenga una vida media de no más de 24, 12, 6, 4, 3, 2, 1, 0,75, 0,5, 0,25 o 0,1 horas). En algunas modalidades, si un método se realiza a una temperatura u otra condición (por ejemplo, pH) que deteriora la actividad de una o más enzimas, puede añadirse enzima adicional a la reacción en uno o más intervalos después del inicio del método para complementar la actividad de las enzimas deterioradas.

En algunas modalidades, una o más etapas de un método proporcionado en la presente descripción ocurren en el mismo recipiente de reacción (por ejemplo, tubo, punta, recipiente, etcétera). En algunas modalidades, todas las etapas de un método ocurren en el mismo recipiente de reacción.

Los reactivos para los métodos proporcionados en la presente descripción pueden proporcionarse todos juntos al comienzo de una reacción, o pueden añadirse secuencialmente, donde después de una, dos o más etapas se añaden nuevos reactivos a una reacción. En algunas circunstancias, pueden añadirse nuevos reactivos (por ejemplo, enzimas, cebadores) a un recipiente de reacción durante el curso de la reacción, para aumentar la cantidad de reactivos disponibles para actuar sobre los sustratos o para sustituir la función de los reactivos que se han inactivado (por ejemplo, las enzimas). Pueden añadirse nuevos reactivos a una reacción en uno o más intervalos de tiempo seleccionados después del inicio de una reacción de un método proporcionado en la presente descripción (por ejemplo, en 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 30, 45 o 60 minutos después del inicio de una reacción).

En algunas modalidades, una o más etapas de un método proporcionado en la presente descripción pueden ocurrir simultáneamente. Por ejemplo, después de la generación de una única copia de un producto de extensión de una primera copia del primer cebador, pueden generarse múltiples copias de un producto de extensión de un segundo cebador secuencialmente a partir de esa única copia de un producto de extensión de una primera copia del primer cebador. Como las copias del producto de extensión de un segundo cebador se generan secuencialmente a partir de la copia única del producto de extensión de una primera copia del primer cebador, las copias individuales del producto de extensión de un segundo cebador pueden, por ejemplo, servir como molde para la formación de un producto de extensión de una segunda copia del primer cebador, ser un componente de un ácido nucleico secundario, ser un componente de una estructura cruzada o puede ser un punto de inicio para la formación de un producto de extensión de un producto de extensión de un segundo cebador / primera cadena concatámero. En otro ejemplo, dos copias de un ácido nucleico secundario pueden formar una estructura cruzada al mismo tiempo que se genera un producto de extensión de una primera copia de un primer cebador a partir de una primera cadena de un molde de ácido nucleico. En otro ejemplo, una copia de un producto de extensión de una primera copia de un primer cebador se genera a partir de una primera cadena de un molde de ácido nucleico al mismo tiempo que se genera un producto de extensión del segundo cebador a partir de una copia diferente del producto de extensión de una primera copia de un primer cebador. Otras etapas proporcionadas en la presente descripción también pueden ocurrir simultáneamente. Además, en los métodos y composiciones proporcionados en la presente descripción que implican un molde de ácido nucleico bicatenario, cualquier cadena del molde de ácido nucleico puede considerarse una "primera cadena", y cualquier cebador de un par de cebadores proporcionado en la presente descripción puede considerarse un "primer cebador". Por consiguiente, en algunos ejemplos, ambas cadenas de un ácido nucleico bicatenario pueden usarse simultáneamente como "primera cadena" de un ácido nucleico de acuerdo con un método proporcionado en la presente descripción, con cebadores opuestos del par de cebadores que sirven como el "primer cebador" para las diferentes "primeras cadenas". Además, varias estructuras generadas de acuerdo con los métodos proporcionados en la presente descripción pueden entrar opcionalmente en diferentes rutas de los métodos proporcionados en la presente descripción. Por ejemplo, en las modalidades, un primer ácido nucleico secundario puede aparearse con un segundo ácido nucleico secundario para formar una estructura cruzada como se describe en otra parte de la presente descripción. En otras modalidades, un primer ácido nucleico secundario puede ser invadido por un primer cebador, y el producto de extensión del segundo cebador puede servir como molde para la generación de un nuevo producto de extensión del primer cebador. Para generar el nuevo producto de extensión del primer cebador, se desplaza el producto de extensión del primer cebador que forma parte del ácido nucleico secundario. En otro ejemplo, en las modalidades, un primer concatámero puede aparearse con otro concatámero para formar una estructura cruzada. En otras modalidades, un primer concatámero puede ser invadido por un primer cebador, y la primera cadena concatámero puede servir como molde para la generación de una nueva segunda cadena concatámero. Para generar la nueva primera cadena concatámero, se desplaza la primera cadena concatámero que es parte del concatámero. También pueden ocurrir otros eventos similares durante los métodos proporcionados en la presente descripción.

Las reacciones y composiciones proporcionadas en la presente descripción pueden contener múltiples copias de primeros cebadores, segundos cebadores, ácidos nucleicos primarios, ácidos nucleicos secundarios, productos de extensión de una primera copia del primer cebador, productos de extensión de una segunda copia del primer cebador, productos de extensión del segundo cebador, estructuras cruzadas, concatámeros y similares. Por consiguiente, los métodos proporcionados en la presente descripción pueden incluir procesos en donde se producen simultáneamente múltiples etapas proporcionadas en la presente descripción, y tales etapas pueden ocurrir con múltiples copias de las moléculas relevantes.

En algunas modalidades, se proporcionan dos o más conjuntos del primer y segundo cebadores en un método o composición proporcionados en la presente descripción, donde cada conjunto contiene un primer cebador y un segundo cebador, y donde diferentes conjuntos de cebadores son complementarios a diferentes moldes de ácido nucleico. La región de unión al molde del primer y segundo cebadores de un conjunto puede ser complementaria a diferentes cadenas del mismo molde de ácido nucleico bicatenario. Por lo general, las regiones de cola del primer y segundo cebadores en un conjunto dado tienen secuencias diferentes, no complementarias de las regiones de cola del primer y segundo cebador de otros conjuntos de cebadores que se usarán en el mismo método o composición, de manera que las colas de los cebadores de los diferentes conjuntos de cebadores no son complementarias. Esto puede ser conveniente para prevenir la formación de estructuras cruzadas híbridas que contienen cadenas derivadas de diferentes moldes de ácido nucleico. Alternativamente, las regiones de cola del primer y segundo cebadores en dos o más conjuntos de cebadores diferentes pueden tener secuencias complementarias, con el fin de crear estructuras cruzadas híbridas y concatámeros que contienen cadenas derivadas de diferentes moldes de ácido nucleico. La inclusión de dos o más conjuntos de cebadores en un método o composición proporcionados en la presente descripción puede sustentar la amplificación simultánea de múltiples moldes de ácido nucleico diferentes en el mismo recipiente de reacción. Esto puede ser útil, por ejemplo, para amplificar múltiples moldes de interés en una muestra, o para analizar la presencia de múltiples moldes diferentes en una muestra. En algunas modalidades, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 100, 200, 500 o más conjuntos de primer y segundo cebadores se proporcionan en un método proporcionado en la presente descripción, con el fin de amplificar o analizar la presencia de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 100, 200, 500 o más moldes de ácido nucleico diferentes.

En algunas modalidades, en un método proporcionado en la presente descripción, un molde de ácido nucleico puede amplificarse rápidamente. Por ejemplo, en algunas modalidades, un molde de ácido nucleico puede amplificarse al menos 500 veces dentro de 0,1, 0,5, 1, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 90, 120 o 180 minutos de iniciar el método. En otro ejemplo, en algunas modalidades, un molde de ácido nucleico puede amplificarse al menos 10000 veces dentro de 0,1, 0,5, 1, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 90, 120 o 180 minutos de iniciar el método. En otro ejemplo, en algunas modalidades, un molde de ácido nucleico puede amplificarse al menos 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 5000, 10 000, 50000, 100000, 500000 o 1000000 veces más que la cantidad original del molde de ácido nucleico presente en una mezcla de reacción al inicio del método dentro de 0,1 minutos, 0,5 minutos, 1 minuto, 3 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 40 minutos, 50 minutos, 60 minutos, 90 minutos, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas o 24 horas desde el inicio del método. En algunas modalidades, cuando se inicia un método, todos los reactivos para la primera etapa del método están en un recipiente que contiene la mezcla de reacción para el método. En algunas modalidades, cuando se inicia un método, todos los reactivos para todas las etapas del método están en un recipiente que contiene la mezcla de reacción para el método.

En algunas modalidades, en un método proporcionado en la presente descripción, un molde de ácido nucleico puede amplificarse a una velocidad superior a la lineal. En algunas modalidades, en un método proporcionado en la presente descripción, un molde de ácido nucleico puede amplificarse exponencialmente. En algunas modalidades, en un método proporcionado en la presente descripción, un molde de ácido nucleico puede al menos duplicar su número cada 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 90, 120, 180 o 240 minutos después del inicio del método. En algunas modalidades, un molde de ácido nucleico puede amplificarse al menos 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 5000, 10 000, 50000, 100000, 500000, 1000000 o 10000000 veces por encima de la cantidad original del molde de ácido nucleico presente en la reacción al comienzo del método.

La presencia de múltiples copias de un molde de ácido nucleico en un concatámero generado de acuerdo con un método proporcionado en la presente descripción puede contribuir a la amplificación rápida de los moldes de ácido nucleico de acuerdo con los métodos proporcionados en la presente descripción. En particular, dado que pueden estar presentes múltiples copias de una cadena de un molde de ácido nucleico en una única cadena concatámero, la carga de una sola polimerasa en una única cadena concatámero puede resultar en la generación de múltiples copias de una cadena del molde de ácido nucleico a medida que la polimerasa se mueve a lo largo de la cadena concatámero. En algunas situaciones, el tiempo necesario para que las polimerasas de ácido nucleico se encuentren y se carguen en las cadenas de ácido nucleico puede afectar significativamente la velocidad general de una reacción de amplificación. Por ejemplo, si cada cadena de ácido nucleico que encuentra una polimerasa durante una reacción de replicación solo contiene una única copia de una cadena de un molde de ácido nucleico, una polimerasa puede necesitar encontrar y cargar en una nueva cadena después de que se genera cada copia de la cadena del molde. Por el contrario, con un concatámero, después de que la polimerasa se encuentra y carga en una cadena concatámero, puede sintetizar múltiples copias de una cadena del molde sin necesidad de dejar la cadena concatámero o encontrar y cargar otra cadena.

En algunas modalidades, en la presente descripción se proporcionan métodos y composiciones para la generación de un concatámero de ADN bicatenario a partir de un molde de ARN monocatenario o bicatenario. El método puede realizarse como se describe en la presente descripción, excepto que una enzima transcriptasa inversa (por ejemplo, transcriptasa inversa AMV, transcriptasa inversa M-MLV, transcriptasa inversa Superscript II™, transcriptasa inversa Superscript III™ o transcriptasa inversa ThermoScript™) también se incluye con los métodos proporcionados en la presente descripción. La primera copia del primer cebador puede hibridarse con el molde de ARN y la enzima transcriptasa inversa puede generar el producto de extensión de la primera copia del primer cebador, que se forma como una cadena de ADN mediante el proceso de transcripción inversa. Los métodos y condiciones para la transcripción inversa de ARN se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en RNA: A Laboratory Manual, D. Rio y otros, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2011). Después de la generación (a partir de una cadena de ARN) del producto de extensión de la primera copia del primer cebador (que es una cadena de ADN) mediante una enzima transcriptasa inversa, el resto de las etapas para la generación de un concatámero pueden ser las mismas como las que se describen en otra parte de la presente descripción.

En algunas modalidades, los métodos y composiciones proporcionados en la presente descripción pueden incluir uno o más "cebadores de choque". Los cebadores de choque pueden usarse con los métodos y las composiciones proporcionados en la presente descripción para, por ejemplo, aumentar la velocidad o especificidad de generación de productos de reacción, por ejemplo, aumentando la velocidad a la que una segunda cadena del molde de ácido nucleico se desplaza de una primera cadena del molde de ácido nucleico, aumentando la velocidad a la que una primera cadena de un molde de ácido nucleico se desplaza de un primer producto de extensión del cebador, o aumentando la velocidad a la que un primer producto de extensión del cebador se desplaza de un segundo producto de extensión del cebador. Como se usa en la presente descripción, un "cebador de choque" se refiere a un cebador que es complementario a una secuencia en una primera cadena o segunda cadena de un molde de ácido nucleico que está aguas abajo de una secuencia en la misma cadena a la que se une la región de unión al molde de un primer cebador o segundo cebador. Por lo tanto, cuando un cebador de choque se hibrida con la misma cadena de ácido nucleico con la que se hibrida un primer cebador o un segundo cebador, el extremo 3' del cebador de choque se orienta hacia el extremo 5' del primer cebador o segundo cebador (es decir, el nucleótido terminal 5' y la región de cola del primer cebador o segundo cebador). Cuando se incuba con una polimerasa de ácido nucleico y en condiciones para sustentar la generación de productos de extensión del cebador, la polimerasa puede formar un producto de extensión de un cebador de choque, desde el extremo 3' del cebador de choque. Dado que el extremo 3' del cebador de choque está orientado hacia el extremo 5' del primer cebador o segundo cebador, a medida que el producto de extensión del cebador de choque aumenta en longitud, eventualmente puede encontrar el extremo 5' del primer cebador o segundo cebador como el producto de extensión. La polimerasa puede entonces desplazar el primer cebador o el segundo cebador de la cadena, así como también cualquier producto de extensión del primer cebador o segundo cebador. Por consiguiente, los cebadores de choque pueden acelerar las reacciones proporcionadas en la presente descripción.

En algunas modalidades, en la presente descripción se proporciona un recipiente que contiene una o más enzimas, cebadores u otros reactivos proporcionados en la presente descripción. Los recipientes pueden incluir cualquier estructura capaz de soportar o contener un material líquido o sólido y pueden incluir tubos, recipientes, puntas, etcétera. En algunas modalidades, una pared de un recipiente puede permitir la transmisión de luz a través de la pared. Un recipiente puede ser ópticamente transparente. Un recipiente puede contener, por ejemplo, uno o más de una polimerasa de ácido nucleico aislada, una polimerasa de ADN aislada, una transcriptasa inversa aislada, un primer cebador, un segundo cebador, un colorante de ácido nucleico o una sonda de ácido nucleico, como se describe en otra parte de la presente descripción. Puede proporcionarse cualquier número de copias de cualquiera de los contenidos de un recipiente (por ejemplo, una primera copia, una segunda copia, una tercera copia, etcétera). El contenido de un recipiente puede estar en comunicación fluida. En algunas modalidades, un recipiente puede contener, además, un molde de ácido nucleico. En algunas modalidades, un recipiente puede contener, además, nucleótidos, tampones, sales, agua u otros reactivos proporcionados en la presente descripción para la amplificación de ácidos nucleicos. En algunas modalidades, un recipiente puede contener dos o más conjuntos de cebadores, en donde cada conjunto de cebadores comprende un primer y un segundo cebador, y los diferentes conjuntos de cebadores son complementarios a diferentes moldes de ácido nucleico.

Dos o más reactivos útiles para un método proporcionado en la presente descripción pueden empaquetarse y proporcionarse como un kit. Por ejemplo, un kit puede incluir dos o más de: un molde de ácido nucleico, un primer cebador, un segundo cebador, una polimerasa de ácido nucleico, una ADN polimerasa, una transcriptasa inversa, tampones, colorantes de ácido nucleico, una sonda de ácido nucleico o dNTP, como se describe en otra parte de la presente descripción. Dentro del kit, los dos o más reactivos pueden empaquetarse en recipientes separados o en el mismo recipiente. En algunas modalidades, un kit puede contener, además, nucleótidos, tampones, sales, agua u otros reactivos proporcionados en la presente descripción para la amplificación de ácidos nucleicos.

En las modalidades, un primer cebador y un segundo cebador como se proporcionan en la presente descripción pueden proporcionarse juntos como un conjunto de cebadores. El conjunto de cebadores puede proporcionarse como un kit o composición independiente, o el conjunto de cebadores puede proporcionarse en un kit con uno o más de otros reactivos para realizar un método proporcionado en la presente descripción.

En algunas modalidades, puede incluirse una ligasa de ácido nucleico con un método o composición proporcionados en la presente descripción. Las ligasas catalizan la formación de enlaces fosfodiéster entre nucleótidos, típicamente, entre el fosfato 5' de un nucleótido y el grupo hidroxilo 3' de otro nucleótido. Una reacción proporcionada en la presente descripción puede amplificar un ácido nucleico diana a una velocidad mayor con la inclusión de una ligasa en la reacción, en comparación con la reacción sin la inclusión de una ligasa. Una ligasa puede, por ejemplo, aumentar el tamaño o el número de concatámeros presentes en una reacción proporcionada en la presente descripción.

Las ligasas de ácido nucleico incluyen ADN ligasa de E. coli, ADN ligasa Taq, ADN ligasa T3, ADN ligasa T4, ADN ligasa T7, Ampligase™, ARN ligasa 1 T4 y ARN ligasa 2 T4.

Para catalizar la reacción de ligación, determinadas ligasas requieren ATP (por ejemplo, ADN ligasa T4) o NAD+ (ADN ligasa de E. coli). En algunas modalidades, una ligasa puede ligar ácidos nucleicos que tienen extremos romos. En algunas modalidades, una ligasa puede ligar ácidos nucleicos que tienen extremos pegajosos. En algunas modalidades, una ligasa puede ligar ácidos nucleicos que tienen extremos romos y pegajosos.

Las versiones modificadas de ligasas también pueden usarse con los métodos y composiciones proporcionados en la presente descripción, siempre que la ligasa modificada tenga la capacidad de catalizar la formación de enlaces fosfodiéster entre los nucleótidos. Una versión modificada de una ligasa ("ligasa modificada") puede tener, por ejemplo, 100 o menos, 70 o menos, 50 o menos, 40 o menos, 30 o menos, 20 o menos, 10 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, 2 o menos, o 1 aminoácido diferente de la secuencia de la versión original de la ligasa de origen natural. En algunas modalidades, una ligasa modificada puede contener no más de 1000, 700, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 40, 30, 20, 10 o 5 más o menos aminoácidos que la ligasa original. En algunas modalidades, una ligasa modificada puede comprender un fragmento de una ligasa original. En algunas modalidades, una ligasa modificada puede comprender un polipéptido quimérico con una porción derivada de una ligasa y una porción derivada de una proteína no ligasa. En algunas modalidades, una ligasa modificada puede tener, por ejemplo, mayor actividad catalítica, mayor estabilidad o mayor estabilidad térmica en comparación con la ligasa original.

En algunas modalidades, una ligasa proporcionada en la presente descripción es termoestable. Una ligasa termoestable puede tener, por ejemplo, una vida media de al menos 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 90, 120 o 180 minutos a una temperatura de hasta 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o 95 C. En algunas modalidades, una ligasa modificada puede ser termoestable.

En algunas modalidades, una ligasa que se incluye con los métodos y composiciones proporcionados en la presente descripción puede ser una ligasa modificada denominada en la presente descripción "p50-Tth", que tiene la secuencia de aminoácidos:

M G H H H H H H H H H H S S G H IE G R A S A D G P Y L Q IL E Q P K Q R G F R F R Y V C E G P S H G G L P G A S S E K N K K S Y P Q V K IC N Y V G P A K V IV Q L V T N G K N IH L H A H S L V G K H C E D G IC T V T A G P K D M V V G F A N L G IL H V T K K K V F E T L E A R M T E A C IR G Y N P G L L V H P D L A Y L Q A E G G G D R Q L G D R E K E L IR Q A A L Q Q T K E M D L S V V R L M F T A F L P D S T G S F T R R L E P V V S D A IY D S K A P N A S N L K IV R M D R T A G C V T G G E E IY L L C D K V Q K D D IQ IR F Y E E E E N G G V W E G F G D F S P T D V H R Q F A IV F K T P K Y K D IN IT K P A S V F V Q L R R K S D L E T S E P K P F L Y Y P E IK D K E E V Q R K R Q K G S S G T S G G G S G GGMTLEEARKRVNELRDLIRYHNYRYYVLADPEISDAEYDRLLRELKELEERFPELK SPDSPTLQVGARPLEATFRPVRHPTRMYSLDNAFNLDELKAFEEREERALGRKGPFAY TVEHKVDGLSVNLYYEEGVLVYGATRGDGEVGEEVTQNLLTIPTIPRRLKGVPERLE VRGEVYMPIEAFLRLNEELEERGERIFKNPRNAAAGSLROKDPRITAKRGLRATFYAL GLGLEEVEREGVATOFALLHWLKEKGFPVEHGYARAVGAEGVEAVYODWLKKRR ALPFEADGVVVKLDELALWRELGYTARAPRFAIAYKFPAEEKETRLLDVVFOVGRT GRVTPVGILEPVFLEGSEVSRVTLHNESYIEELDIRIGDWVLVHKAGGVIPEVLRVLKE RRTGEERPIRWPETCPECGHRLLKEGKVHRCPNPLCPAKRFEAIRHFASRKAMDIOGL GEKLIERLLEKGLVKDVADLYRLRKEDLVGLERMGEKSAONLLROIEESKKRGLERL LYALGLPGVGEVLARNLAARFGNMDRLLEASLEELLEVEEVGELTARAILETLKDPA FRDLVRRLKEAGVEMEAKEKGGEALKGLTFVITGELSRPREEVKALLRRLGAKVTDS VSRKTSYLWGENPGSKLEKARALGVPTLTEEELYRLLEARTGKKAEELV (SEQ ID NO: 79). La ligasa p50-Tth tiene actividad de ligación de extremos romos termoestable a temperaturas de al menos 60 C. La ligasa p50-Tth es una proteína quimérica que comprende una secuencia líder que contiene His 10, una secuencia p50 de la proteína NF-kappa-B humana número de acceso NP_003989 aminoácidos 40-366 (indicados en cursiva), una secuencia flexible rica en glicina y una secuencia de ADN ligasa Tth, de Therm us T he rm o ph ilu s HB8, número de acceso YP_144363 (indicado con subrayado). En algunas modalidades, puede usarse una versión modificada de la ligasa p50-Tth con los métodos y composiciones proporcionados en la presente descripción (por ejemplo, con 100 o menos, 70 o menos, 50 o menos, 40 o menos, 30 o menos, 20 o menos, 10 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, 2 o menos, o 1 aminoácido diferente de la ligasa p50-Tth). En las modalidades, una ligasa que se usa con una composición o método proporcionado en la presente descripción puede ser una ligasa descrita en la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos Núm. 61/802,124, presentada el 15 de marzo de 2013 o Solicitud PCT Núm. PCT/US14/30003, presentada el 15 de marzo de 2014.

Los diversos métodos y composiciones proporcionados en la presente descripción para la amplificación de un molde de ácido nucleico / la generación de un concatámero que contiene al menos dos copias del molde pueden cumplir muchas de las funciones que se han realizado previamente mediante otros métodos y composiciones para la amplificación de ácido nucleico isoterma y dependiente de termocicladores. Un molde de ácido nucleico para amplificación de acuerdo con los métodos proporcionados en la presente descripción también puede denominarse en la presente descripción "ácido nucleico diana" o similar. Los métodos y composiciones proporcionados en la presente descripción pueden usarse, por ejemplo, para el aislamiento y clonación de ácidos nucleicos de interés, análisis de expresión génica, identificación diagnóstica de ácidos nucleicos, síntesis de ácidos nucleicos nuevos, síntesis y marcaje de sondas de ácidos nucleicos, identificación forense de un sujeto, identificación de alelos de un sujeto, cribado genético, secuenciación de ácidos nucleicos y aplicaciones relacionadas. Una molécula de ácido nucleico diana puede ser de cualquier tipo, que incluye ADN o ARN monocatenario o bicatenario y (por ejemplo, ARNm). Un ácido nucleico diana puede ser de cualquier tipo o función (por ejemplo, una secuencia codificadora de proteínas, una secuencia reguladora, un intrón, etcétera). Un ácido nucleico diana puede ser la totalidad de un gen o una porción de este.

En algunas modalidades, un método o composición proporcionados en la presente descripción pueden usarse para detectar la cantidad de un ácido nucleico diana en una muestra (que incluye la presencia o ausencia de la diana), para medir la cantidad de un producto de amplificación de una diana formada a partir de una muestra en un período de tiempo seleccionado, o para determinar la cantidad de tiempo necesaria para generar un determinado número de copias de un molde a partir de una muestra. Las muestras que pueden usarse con los métodos y las composiciones proporcionados en la presente descripción se describen en otra parte de la presente descripción y pueden incluir, por ejemplo, un fluido corporal, una secreción o un tejido de un sujeto. En las modalidades, una muestra puede procesarse antes del uso de la muestra en un ensayo para amplificar un ácido nucleico diana en la muestra de acuerdo con un método proporcionado en la presente descripción. El procesamiento de la muestra puede incluir cualquier etapa de procesamiento como se describe en otra parte de la presente descripción, y puede incluir, por ejemplo, etapas de sonicación o lisis química.

En algunas modalidades, puede realizarse un método proporcionado en la presente descripción para analizar simultáneamente al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, o más ácidos nucleicos diana diferentes en el mismo recipiente de reacción. Típicamente, para cada ácido nucleico diana de interés, se proporcionan un primer cebador y un segundo cebador, cada uno de los cuales es complementario a una cadena del ácido nucleico diana, o un complemento de este. La amplificación de los diferentes ácidos nucleicos diana en el mismo recipiente puede controlarse, por ejemplo, mediante el uso de sondas de ácido nucleico que tienen especificidad de secuencia para detección de secuencias en los diferentes ácidos nucleicos diana y diferentes fluoróforos.

En algunas modalidades, puede usarse un método o composición proporcionados en la presente descripción para detectar la presencia o ausencia de un nucleótido particular de interés en un ácido nucleico diana (por ejemplo, en el caso de una mutación o SNP). Por ejemplo, puede seleccionarse un primer o segundo cebador que se una selectivamente a una región en un ácido nucleico diana que incluye o es adyacente al nucleótido de interés. El cebador puede diseñarse de manera que selectivamente: i) se una a la región cuando la región contiene el nucleótido de interés, o ii) no se une a la región cuando la región contiene el nucleótido de interés. Puede realizarse un método como se describe en la presente descripción con el cebador seleccionado, y el resultado de la reacción de amplificación puede proporcionar información sobre la presencia o ausencia del nucleótido de interés en el ácido nucleico diana. Por ejemplo, si la región de unión al molde de un primer cebador está diseñada para tener una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en el ácido nucleico diana que incluye un nucleótido particular de interés (por ejemplo, una mutación), la amplificación exitosa del ácido nucleico diana con el cebador seleccionado a partir de una muestra puede indicar que la muestra contiene un ácido nucleico diana que tiene el nucleótido particular de interés. En algunas modalidades, un cebador que se usa para el análisis de un nucleótido de interés en un ácido nucleico diana puede contener un nucleótido crítico (es decir, un nucleótido que corresponde a la misma posición de un nucleótido de interés en el ácido nucleico diana) en el extremo 3' del cebador. En tal caso, la hibridación del nucleótido terminal 3' del cebador puede depender de la presencia del nucleótido de interés en el ácido nucleico diana. Si el nucleótido terminal 3' del cebador no hibrida con un nucleótido en el ácido nucleico diana (por ejemplo, debido a un error de apareamiento entre los nucleótidos), el error de apareamiento puede afectar significativamente a una polimerasa de ácido nucleico de sintetizar un producto de extensión a partir del cebador. Por consiguiente, en algunas modalidades, un cebador que tiene un nucleótido terminal 3' que corresponde a un nucleótido de interés puede ser útil para determinar la presencia o ausencia de un nucleótido particular en un ácido nucleico diana. En tales modalidades, en algunas situaciones, el nucleótido crítico en el extremo 3' del cebador puede seleccionarse para que sea complementario del nucleótido de interés en el ácido nucleico diana, y en algunas otras situaciones el nucleótido crítico en el extremo 3' del cebador puede seleccionarse para que no sea complementario del nucleótido de interés en el ácido nucleico diana. El nucleótido de interés puede representar, por ejemplo, una forma de tipo silvestre, una forma mutante o un polimorfismo de un ácido nucleico diana.

En otras modalidades, puede detectarse un nucleótido particular de interés en un ácido nucleico diana (por ejemplo, una mutación o SNP) mediante la selección de cebadores de manera que el nucleótido de interés esté presente en el ácido nucleico diana en una región que no es complementaria a una región de unión al molde de un primer o segundo cebador. Por ejemplo, el nucleótido de interés puede estar aproximadamente en el medio de una secuencia de ácido nucleico diana. En las modalidades, el nucleótido de interés puede estar en un "motivo interno" descrito en otra parte de la presente descripción. Cuando un nucleótido de interés está en un motivo interno, en las modalidades, puede prepararse un par de cebadores para que contengan una secuencia de nucleótidos en la región de cola de los cebadores que es complementaria a un motivo interno o al complemento de este, y que puede usarse para evaluar la presencia o ausencia del nucleótido de interés en el motivo interno en la secuencia diana. Como se explica en otra parte de la presente descripción, la hibridación temporal de una secuencia de nucleótidos en la región de cola de un cebador con un motivo interno en un producto de extensión de ese cebador puede aumentar la velocidad de una reacción proporcionada en la presente descripción. En algunas circunstancias, cuanto mayor sea la afinidad de una secuencia de nucleótidos en la región de cola de un cebador por el motivo interno en un producto de extensión de ese cebador, más rápida puede ocurrir la reacción. Además, típicamente, cuanto mayor sea el número de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos en la región de cola del cebador que puede unirse a los nucleótidos en el motivo interno en el producto de extensión del cebador, mayor será la afinidad de la secuencia de nucleótidos en la región de cola del producto de extensión para el motivo interno en el producto de extensión. Por lo tanto, con las composiciones y los métodos proporcionados en la presente descripción, en las modalidades, la presencia o ausencia de un nucleótido de interés en una secuencia diana puede determinarse mediante el uso de cebadores que tienen una secuencia de nucleótidos en la región de cola del cebador que puede unirse al motivo interno en la secuencia diana o un complemento de esta, y que, dentro de la región de cola, tienen o no un nucleótido que se une específicamente con el nucleótido particular de interés en el motivo interno o su complemento. Típicamente, la reacción ocurrirá más rápido cuando la secuencia de nucleótidos en la región de cola de un cebador contiene un nucleótido que es complementario al nucleótido en el producto de extensión de ese cebador que corresponde al nucleótido de interés en la diana, que cuando el nucleótido relevante en la región de cola del cebador no es complementario al nucleótido en el producto de extensión de ese cebador que corresponde al nucleótido de interés en la diana. Por ejemplo, el motivo interno de una versión de tipo silvestre de una cadena de ácido nucleico diana puede tener la secuencia de nucleótidos: 5' TATTGCAT 3'. Sin embargo, la "G" en la secuencia puede mutar con frecuencia a una "A" en muchos individuos de la población. Para determinar si un ácido nucleico diana particular contiene una "G" u otro nucleótido en la secuencia, puede prepararse un cebador que contiene una secuencia de nucleótidos en su región de cola que tenga la secuencia: 5'ATGCAATA 3'. Si este cebador (y un segundo cebador apropiado) se usa para amplificar el ácido nucleico diana de acuerdo con un método proporcionado en la presente descripción, la reacción de amplificación puede tener una determinada velocidad de reacción si la "G" está presente en el motivo interno, en comparación a si un nucleótido diferente está presente en la posición de la "G" en el motivo interno. Esto se debe a que la secuencia de nucleótidos en la región de cola del cebador será perfectamente complementaria al motivo interno si la "G" está presente en el motivo interno, pero no lo será si un nucleótido distinto de la "G" está presente en la posición normal de la G. Generalmente, en este ejemplo, si una "G" está presente en el motivo interno, la región de cola del cebador hibridará con el motivo interno con más frecuencia que si la "G" no está presente, y esto a su vez puede conducir a una velocidad de reacción más rápida si la "G" está presente que si no está presente. Con los sistemas y métodos proporcionados en la presente descripción, pueden prepararse cebadores para evaluar la presencia o ausencia de un nucleótido de interés (por ejemplo, pueden prepararse cebadores de manera que la reacción ocurra más rápidamente si está presente una versión mutada de un nucleótido que si está presente una versión de tipo silvestre del nucleótido, o viceversa). Además, en las modalidades, pueden prepararse cebadores para determinar la identidad de un nucleótido desconocido en una posición de interés en un motivo interno en una diana. Por ejemplo, pueden prepararse cuatro pares de cebadores diferentes, cada uno de los cuales contiene una A, T, G o C, según corresponda, correspondiente a un nucleótido de interés en un ácido nucleico diana. En las modalidades, el par de cebadores que produce los resultados de reacción más rápidos puede indicar qué nucleótido está presente en la posición de interés en el motivo interno en el ácido nucleico diana. Por ejemplo, un ácido nucleico diana puede tener un motivo interno que comúnmente tiene la secuencia, en la dirección 5' a 3' de: GTAACGAG. Sin embargo, diferentes variantes del ácido nucleico diana pueden tener diferentes nucleótidos en la 5ta posición en el motivo interno (es decir, en la posición de la "C"). Continuando con el ejemplo, si se proporciona una muestra que contiene el ácido nucleico diana, en donde se desconoce qué nucleótido está en la 5ta posición en el motivo interno, la muestra puede dividirse en al menos 4 porciones, y las cuatro porciones pueden usarse para una primera mezcla de reacción, una segunda mezcla de reacción, una tercera mezcla de reacción y una cuarta mezcla de reacción. Para la primera mezcla de reacción, se proporciona un primer par de cebadores, donde los cebadores tienen regiones de cola con las secuencias, en la dirección 5' a 3': CTCGTTAC y GTAACGAG, respectivamente. Estas regiones de cola serán perfectamente complementarias al motivo interno o complemento de este, si una "C" está presente en la 5ta posición en el motivo interno. Por lo tanto, si la diana se amplifica más rápidamente en esta mezcla de reacción, indica que una "C" está presente en la posición del nucleótido de interés en el motivo interno en la diana. Para la segunda mezcla de reacción, se proporciona un segundo par de cebadores, donde los cebadores tienen regiones de cola con las secuencias, en la dirección 5' a 3': CTCATTAC y GTAATGAG, respectivamente. Estas regiones de cola serán perfectamente complementarias al motivo interno o complemento de este, si una "T" está presente en la 5ta posición en el motivo interno. Por lo tanto, si la diana se amplifica más rápidamente en esta mezcla de reacción, indica que una "T" está presente en la posición del nucleótido de interés en el motivo interno en la diana. Para la tercera mezcla de reacción, se proporciona un tercer par de cebadores, donde los cebadores tienen regiones de cola con las secuencias, en la dirección 5' a 3': CTCCTTAC y GTAAGGAG, respectivamente. Estas regiones de cola serán perfectamente complementarias al motivo interno o complemento de este, si una "G" está presente en la 5ta posición en el motivo interno. Por lo tanto, si la diana se amplifica más rápidamente en esta mezcla de reacción, indica que una "G" está presente en la posición del nucleótido de interés en el motivo interno en la diana. Para la cuarta mezcla de reacción, se proporciona un cuarto par de cebadores, donde los cebadores tienen regiones de cola con las secuencias, en la dirección 5' a 3': CTCTTTAC y GTAAAGAG, respectivamente. Estas regiones de cola serán perfectamente complementarias al motivo interno o complemento de este, si una "A" está presente en la 5ta posición en el motivo interno. Por lo tanto, si la diana se amplifica más rápidamente en esta mezcla de reacción, indica que una "A" está presente en la posición del nucleótido de interés en el motivo interno en la diana. En las modalidades, los métodos o composiciones como se describen generalmente anteriormente pueden prepararse, opcionalmente, con solo 2 o 3 mezclas de reacción con pares de cebadores correspondientes a solo 2 o 3 opciones para un nucleótido en una posición de interés, si por ejemplo, no es conveniente seleccionar todas las variantes de nucleótidos posibles (por ejemplo, si solo 2 nucleótidos diferentes típicamente se encuentran en una posición de interés).

En las modalidades, una muestra que contiene un ácido nucleico diana puede dividirse en al menos una primera y una segunda porción, donde la primera porción se incuba en una primera mezcla de reacción con un primer par de cebadores, y la segunda porción se incuba en una segunda mezcla de reacción con un segundo par de cebadores, de acuerdo con los métodos proporcionados en la presente descripción. En las modalidades, el primer par de cebadores y el segundo par de cebadores se diferencian entre sí por un único nucleótido en las respectivas cola / primeras regiones del cebador (por ejemplo, la secuencia de la primera región del primer cebador del primer par difiere de la secuencia de la primera región del primer cebador del segundo par por un único nucleótido). El único nucleótido que es diferente en la región de cola de los cebadores puede corresponder a la posición de un nucleótido de interés en el ácido nucleico diana. Mediante la comparación de la velocidad o cantidad de amplificación del ácido nucleico diana en la primera mezcla de reacción con la de la segunda mezcla de reacción, puede determinarse la identidad de un nucleótido de interés en el ácido nucleico diana. En las modalidades, el método descrito anteriormente puede realizarse con una primera, segunda, tercera y cuarta porción de la muestra, y con un primer par de cebadores, un segundo par de cebadores, un tercer par de cebadores y un cuarto par de cebadores, en donde el primer par de cebadores, el segundo par de cebadores, el tercer par de cebadores y el cuarto par de cebadores se diferencian entre sí por un único nucleótido en la respectiva cola / primera región de los cebadores, como se describió anteriormente.

En las modalidades, puede proporcionarse al menos un primer ácido nucleico diana y un segundo ácido nucleico diana, en donde el primer ácido nucleico diana y el segundo ácido nucleico diana difieren en un único nucleótido en una posición de interés en un motivo interno como se describe en otra parte de la presente descripción. En las modalidades, el primer ácido nucleico diana puede incubarse en una primera mezcla de reacción que contiene un par de cebadores descrito en la presente descripción y el segundo ácido nucleico diana puede incubarse en una segunda mezcla de reacción que contiene el mismo par de cebadores, de acuerdo con los métodos proporcionados en la presente descripción. Mediante la comparación de la velocidad o cantidad de amplificación del primer ácido nucleico diana en la primera mezcla de reacción con la del segundo ácido nucleico diana en la segunda mezcla de reacción o con un valor absoluto, la identidad del nucleótido en la posición de interés en uno o ambos del primer ácido nucleico diana o el segundo ácido nucleico diana puede determinarse, de acuerdo con los principios descritos en otra parte de la presente descripción.

Además, en las modalidades, las composiciones y métodos descritos en la presente descripción para detectar un único nucleótido de interés pueden usarse, además, para detectar mutaciones o polimorfismos de múltiples nucleótidos.

Los métodos y composiciones proporcionados en la presente descripción pueden usarse para amplificar un ácido nucleico de cualquier muestra que pueda contener ácidos nucleicos. Los ejemplos de muestras pueden incluir varias muestras de fluidos. En algunos casos, la muestra puede ser una muestra de un fluido corporal de un sujeto. La muestra puede incluir uno o más componentes fluidos. En algunos casos, pueden proporcionarse muestras sólidas o semisólidas. La muestra puede incluir tejido recolectado del sujeto. La muestra puede incluir un fluido corporal, secreción o tejido de un sujeto. La muestra puede ser una muestra biológica. La muestra biológica puede ser un fluido corporal, una secreción o una muestra de tejido. Los ejemplos de muestras biológicas pueden incluir, pero no se limitan a, sangre, suero, saliva, orina, fluido gástrico y digestivo, lágrimas, heces, semen, fluido vaginal, fluidos intersticiales derivados de tejido tumoral, fluidos oculares, sudor, moco, cerumen, aceite, secreciones glandulares, aliento, líquido cefalorraquídeo, cabello, uñas, células de la piel, plasma, frotis nasal o lavado nasofaríngeo, líquido cefalorraquídeo, líquido cerebroespinal, tejido, frotis de garganta, biopsia, líquido placentario, líquido amniótico, sangre del cordón umbilical, líquidos enfáticos, fluidos de la cavidad, esputo, pus, microbiota, meconio, leche materna u otras excreciones. La muestra puede provenir de un ser humano o un animal. Las muestras pueden ser de una planta, microorganismo (por ejemplo, virus, bacterias) u otro material biológico.

En algunas modalidades, los métodos y composiciones proporcionados en la presente descripción pueden realizarse o usarse en puntos de ubicaciones de servicio (por ejemplo, el hogar o el trabajo de un sujeto, tiendas de comestibles, farmacias, clínicas, escuelas, etcétera). Los métodos y composiciones proporcionados en la presente descripción pueden permitir la rápida amplificación de ácidos nucleicos en una muestra de un sujeto, para ayudar en el diagnóstico o tratamiento de un sujeto. Por ejemplo, los métodos y composiciones proporcionados en la presente descripción pueden usarse para evaluar una muestra de un sujeto para detectar la presencia de ácido nucleico de un patógeno, tal como un virus (por ejemplo, influenza) o bacterias (por ejemplo, estreptococos).

En las modalidades, los métodos y composiciones proporcionados en la presente descripción pueden usarse para detectar un patógeno o una característica de un patógeno (por ejemplo, un gen o una variante de gen dentro del patógeno). Los patógenos o características de estos que pueden detectarse con un método o composición proporcionados en la presente descripción pueden incluir, por ejemplo, A c in e to b a c te r baum a nn ii, gen de resistencia blaROB, gen de resistencia blaTEM, B o rd e ta lla ho lm es ii, B u rkh o ld e ria cepac ia , C a n d id a a lb icans, C los tr id ium d iffic ile , C lo s tr id iu m sorde llii, E n te ro b a c te r ae rog ene s , E n te ro b a c te r c loacae , E n te ro c o c c u s fae cae lis , E n te ro c o c c u s faec ium , E sch e rich ia coli, K le b s ie lla pn e u m o n ia e , gen de resistencia a KPC, L e g io n e lla pn e u m o p h ila , gen de resistencia a mecA, gen de resistencia a mecC, M ora xe lla ca ta rrh a lis , M yco b a c te riu m ab scessu s , P se u d o m o n a s ae rug inosa , S e rra tia m a rce scen s , S ta p h y lo co ccu s au reus, S ta p h y lo co ccu s a u reu s (V a n co m yc in -re s is ta n t) VRSA, S tre p to co ccu s a g a la c tia e (S trep B), S tre p to co ccu s p n e u m o n ia , S tre p to co ccu s p n e u m o n ia (p e n ic illin -se n s itive ), S trep to coccus p yo g e n e s , gen de resistencia vanA, gen de resistencia vanB. A d e n o v iru s B, A d e n o v iru s C, A d e n o v iru s E, B oca v iru s 1+3, B o ca v iru s 2+4, B o rd e te lla p a ra p e rtu ss is , B o rd e te lla p e rtu ss is , C h lam yd ia p n e u m o n ia , C lo s tr id iu m so rde llii, C o ro n a v iru s 229E , C o ro n a v iru s H K U 1, C o ro n a v iru s M E R S , C o ro n a v iru s N L63 , C o ro n a v iru s O C 43, m e ta p n e u m o v iru s A H um ano , m e ta p n e u m o v iru s B H um ano , In flu e n za A - MP, In flu e n za B - MP, In flu e n za H 1N 1 (2009), In flu e n za H 1N 1 (es tac iona l), In flu e n za H 3N 2, In flu e n za H 5N 1, In flu e n za H 7 N 9 (H A gene), In flu e n za H 7 N 9 (N A gene), v irus saram pión , v irus de la s pa pe ras , M yco b a c te riu m tub e rcu los is , M yco p la sm a pn e u m o n ia , P a ra in flu e n za 1, P a ra in flu e n za 2, P a ra in flu e n z a 3, P a ra in flu e n z a 4a, P a ra in flu e n z a 4b, v iru s s in c it ia l R e s p ira to r io A (R S V A ), v irus s in c it ia l R e sp ira to r io B (R S V B ), R h in o v iru s A, R h in o v iru s B, R h in o v iru s C, v irus de la rubeo la , S tre p to co ccu s p yo g e n e s , C a n d id a a lb icans, C h la m yd ia tracho m a tis , v irus de l p a p ilo m a hum ano , H P V 16, H P V 18, H S V -1 /2 , m y co p la sm a ge n ita liu m , N e isse ria go n o rrh o e a e , T repo ne m a p a llid u m (sífilis ), T richo m on as vag ina lis , v irus de la V arice lla -zos te r, V irus E ps te in -B a rr, H e p a titis A, H e p a titis B, H e p a titis C, H e p a titis D, H IV , H IV -1 g ru p o M, H IV -1 g ru p o O1, H IV -1 g ru p o O3, Hi V-2 g ru p o A, H IV -2 g ru p o B, M yco p la sm a hom in is , P ro te us m irab ilis , P ro te us pe nn e ri, P ro te us vu lga ris , S. sap rop hy ticus , U re a p la sm a u re a ly ticum , B ac illu s an th rac is , Y ers ina pe s tis , v irus de l dengue , P la sm od ium , T rypan oso m a cruz i (chagas), v irus de l N ilo o cc id e n ta l 1, v irus de l N ilo occ id e n ta l 2, lin a je N o rov iru s 1, lin a je de N o rov iru s 2, v irus d e l Ébola. En las modalidades, pueden analizarse 1,2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 o más de tales patógenos o características de estos a partir de una única muestra de un sujeto mediante el uso de un método proporcionado en la presente descripción. En las modalidades, cualquiera de los ensayos basados en amplificación de ácidos nucleicos o paneles de ensayo como se describe en la Solicitud Internacional Núm. PCT/US2014/54424, presentado el 5 de septiembre de 2014 o en la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos Núm. 62/001,050, presentada el 20 de mayo de 2014 puede realizarse mediante el uso de un método para la amplificación de ácidos nucleicos descrito en la presente descripción. De manera similar, cualquiera de los patógenos o características de estos descritos en la Solicitud Internacional Núm. PCT/US2014/54424 o en la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos Núm. 62/001,050 puede evaluarse con un método de amplificación de ácido nucleico proporcionado en la presente descripción.

En las modalidades, puede realizarse un panel de influenza mediante el uso de los métodos proporcionados en la presente descripción para la amplificación de ácidos nucleicos de una o más cepas de influenza. Por ejemplo, mediante el uso de los métodos proporcionados en la presente descripción, pueden amplificarse uno o más ácidos nucleicos de uno o más de Influenza A, Influenza A H3n 2, Influenza A H5N1, Influenza A H7N9 - gen HA, Influenza A H7N9 - gen NA o Influenza B. Otros paneles que pueden realizarse mediante el uso de los métodos proporcionados en la presente descripción incluyen, por ejemplo, un panel respiratorio, un panel de enfermedades de transmisión sexual, un panel de patógenos transmitidos por la sangre o un panel de infecciones adquiridas en un hospital. Cualquiera de estos paneles puede incluir ensayos para al menos 2, 3, 4, 5, 10, 15 o 20 patógenos o genes diferentes.

En las modalidades, los métodos y composiciones proporcionados en la presente descripción pueden usarse para la detección y la clasificación del subtipo del virus de la influenza A. Los subtipos de influenza A se definen por el tipo de dos genes virales, hemaglutinina (Ha ) y neuraminidasa (NA). Actualmente, hay 18 genes HA conocidos (H1-H18) y 11 genes NA conocidos (N1-N11). Estos genes están codificados en diferentes moléculas del virus de la influenza A y, por lo tanto, es posible que un subtipo de influenza A lleve cualquier combinación de diferentes genes HA y NA. Para detectar y determinar con precisión el tipo de un virus de la influenza A, puede ser conveniente analizar una muestra que puede contener o se sabe que contiene el virus de la influenza A para al menos dos y hasta todos los 18 genes HA conocidos y al menos dos y hasta todos los 11 genes NA conocidos. En las modalidades, una única muestra de un sujeto puede dividirse en dos o más porciones, y las porciones pueden incubarse en las condiciones de reacción proporcionadas en la presente descripción con pares de cebadores que tienen regiones de unión al molde específicas para cada uno de los 18 genes HA conocidos y 11 genes NA conocidos (es decir, 29 pares de cebadores diferentes). En las modalidades, una única muestra de un sujeto puede dividirse en al menos 29 porciones diferentes, en donde la primera porción se incuba en las condiciones de reacción proporcionadas en la presente descripción con un par de cebadores que tiene regiones de unión al molde específicas para H1, en donde la segunda porción se incuba bajo condiciones de reacción proporcionadas en la presente descripción con un par de cebadores que tiene regiones de unión al molde específicas para H2, en donde la tercera porción se incuba en las condiciones de reacción proporcionadas en la presente descripción con un par de cebadores que tiene regiones de unión al molde específicas para H3, en donde la cuarta porción se incuba en condiciones de reacción proporcionadas en la presente descripción con un par de cebadores que tiene regiones de unión al molde específicas para H4, en donde la quinta porción se incuba en las condiciones de reacción proporcionadas en la presente descripción con un par de cebadores que tiene regiones de unión al molde específicas para H5, en donde la sexta porción se incuba en las condiciones de reacción proporcionadas en la presente descripción con un par de cebadores que tiene regiones de unión al molde específicas para H6, en donde la séptima porción se incuba en las condiciones de reacción proporcionadas en la presente descripción con un par de cebadores que tiene regiones de unión al molde específicas para H7, en donde la octava porción se incuba en las condiciones de reacción proporcionadas en la presente descripción con un par de cebadores que tiene regiones de unión al molde específicas para H8, en donde la novena porción se incuba en las condiciones de reacción proporcionadas en la presente descripción con un par de cebadores que tienen regiones de unión al molde específicas para H9, en donde la décima porción se incuba en las condiciones de reacción proporcionadas en la presente descripción con un par de cebadores que tienen regiones de unión al molde específicas para H10, en donde la undécima porción se incuba en las condiciones de reacción proporcionadas en la presente descripción con un par de cebadores que tienen regiones de unión al molde específicas para H11, en donde la duodécima porción se incuba en las condiciones de reacción proporcionadas en la presente descripción con un par de cebadores que tienen regiones de unión al molde específicas para H12, en donde la decimotercera poción se incuba en las condiciones de reacción proporcionadas en la presente descripción con un par de cebadores que tiene regiones de unión al molde específicas para H13, en donde la decimocuarta porción se incuba en las condiciones de reacción proporcionadas en la presente descripción con un par de cebadores que tiene regiones de unión al molde específicas para H14, en donde la decimoquinta porción se incuba en las condiciones de reacción proporcionadas en la presente descripción con un par de cebadores que tiene regiones de unión al molde específicas para H15, en donde la decimosexta porción se incuba en las condiciones de reacción proporcionadas en la presente descripción con un par de cebadores que tienen regiones de unión al molde específicas para H16, en donde la decimoséptima porción se incuba en las condiciones de reacción proporcionadas en la presente descripción con un par de cebadores que tiene regiones de unión al molde específicas para H17, en donde la decimoctava porción se incuba en las condiciones de reacción proporcionadas en la presente descripción con un par de cebadores que tienen regiones de unión al molde específicas para H18, en donde la decimonovena porción se incuba en las condiciones de reacción proporcionadas en la presente descripción con un par de cebadores que tiene regiones de unión al molde específico para N1, en donde la vigésima porción se incuba en las condiciones de reacción proporcionadas en la presente descripción con un par de cebadores que tiene regiones de unión al molde específicas para N2, en donde la vigésimo primera porción se incuba en las condiciones de reacción proporcionadas en la presente descripción con un par de cebadores que tiene regiones de unión al molde específicas para N3, en donde la vigésima segunda porción se incuba en las condiciones de reacción proporcionadas en la presente descripción con un par de cebadores que tiene regiones de unión al molde específicas para N4, en donde la vigésimo tercera porción se incuba en las condiciones de reacción proporcionadas en la presente descripción con un par de cebadores que tienen regiones de unión al molde específicas para N5, en donde la vigésimo cuarta porción se incuba en las condiciones de reacción proporcionadas en la presente descripción con un par de cebadores que tiene regiones de unión al molde específicas para N6, en donde la vigésimo quinta porción se incuba en las condiciones de reacción proporcionadas en la presente descripción con un par de cebadores que tiene regiones de unión al molde específicas para N7, en donde la vigésima sexta porción se incuba en condiciones de reacción proporcionadas en la presente descripción con un par de cebadores que tiene regiones de unión al molde específicas para N8, en donde la vigésima séptima porción se incuba en las condiciones de reacción proporcionadas en la presente descripción con un par de cebadores que tiene regiones de unión al molde específicas para N9, en donde la vigésimo octava porción se incuba en condiciones de reacción proporcionadas en la presente descripción con un par de cebadores que tiene regiones de unión al molde específicas para N10, y en donde la vigésima novena porción se incuba en las condiciones de reacción proporcionadas en la presente descripción con un par de cebadores que tiene regiones de unión al molde específicas para N11. En algunas modalidades, los pares de cebadores para 2, 3, 4, 5 o más subtipos diferentes de HA o NA pueden incubarse con una sola porción de una muestra de un sujeto (por ejemplo, en un recipiente común), y los productos de la reacción de amplificación pueden identificarse mediante el uso de una sonda específica de secuencia (por ejemplo, sonda de ADN o sonda de PNA), como se describe en otra parte de la presente descripción. En las modalidades, puede realizarse un panel en donde se usa una sola muestra para reacciones de amplificación con pares de cebadores para al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25 o los 29 subtipos HA y NA descritos anteriormente. En las modalidades, un panel puede incluir reacciones para amplificar uno o más de H1, H2, H3, H5, H7 o N9. En las modalidades, un panel o método descrito en la presente descripción para la detección de Influenza A o subtipos de este puede incluir, además, reactivos o reacciones para detectar, por ejemplo, el gen de la proteína de matriz de Influenza A (este está presente en todos los subtipos de Influenza A, y por lo tanto puede usarse para identificar la influenza A en una muestra), RNasaP humana (para asegurar la recolección adecuada de muestras de un sujeto humano; para sujetos no humanos, se pueden usar otros genes de control apropiados específicos de la especie), o un control de ácido nucleico de aumento, que pueden añadirse en uno o más puntos durante la recolección de muestras o en la etapa de procesamiento, para asegurar una recolección o procesamiento de muestras adecuados. En las modalidades, pueden proporcionarse kits para realizar cualquiera de los métodos o para cualquiera de los paneles proporcionados anteriormente.

En las modalidades, mediante el uso de los métodos proporcionados en la presente descripción, puede usarse un único par de cebadores para amplificar una mayor variedad de secuencias de ácido nucleico diana que las que pueden amplificarse con un único par de cebadores mediante el uso de otros métodos de amplificación de ácido nucleico (por ejemplo, PCR o LAMP). Por ejemplo, en las modalidades, las regiones de unión al molde de los cebadores proporcionados en la presente descripción pueden hibridar suficientemente con los moldes para amplificar las moldes de acuerdo con los métodos proporcionados en la presente descripción, incluso cuando hay 1,2, 3, 4, 5 o más errores de apareamiento de nucleótidos entre la región de unión al molde del cebador y el molde. En las modalidades, los métodos proporcionados en la presente descripción pueden realizarse cuando al menos el 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 o 24 % de los nucleótidos en la región de unión al molde de al menos un primer cebador y opcionalmente también el segundo cebador que se usan en un método proporcionado no es complementario a los nucleótidos correspondientes en la secuencia molde. El uso de cebadores y métodos proporcionados en la presente descripción, por lo tanto, puede facilitar la amplificación de múltiples secuencias similares pero diferentes por el mismo par de cebadores. Por ejemplo, los cebadores y métodos proporcionados en la presente descripción pueden ser útiles para la detección de múltiples cepas diferentes de influenza A, donde las cepas tienen secuencias de nucleótidos similares pero diferentes. Por ejemplo, puede haber dos cepas diferentes de Influenza A, donde ambas cepas se definen como subtipo H1N1, pero las cepas tienen secuencias de nucleótidos H1 o N1 ligeramente diferentes. Mediante el uso de composiciones y métodos proporcionados en la presente descripción, en las modalidades, tanto la primera cepa como la segunda cepa pueden amplificarse mediante el uso del mismo par de cebadores.

Además, los cebadores que se usan para la amplificación de ácidos nucleicos de patógenos pueden seleccionarse basándose en regiones altamente conservadas en ácidos nucleicos de patógenos, para ayudar más en la detección de múltiples cepas diferentes de un patógeno con el mismo par de cebadores de acuerdo con los métodos proporcionados en la presente descripción. Tales regiones altamente conservadas pueden identificarse, por ejemplo, mediante la alineación de secuencia de un gen de interés a través de múltiples cepas de un patógeno. Por ejemplo, las secuencias de HA3 con números de identificación de Genbank: AEK98400, ABG47862, AEO00689, ABF17954, AFG99237, AFG99027, ABO33069, ABE12623, AFG72790, AAA87553, AAZ38605, AFN19700, ABB04371, ABC39805 son aislados del virus de influenza A3N2. Cada uno de estos genes HA3 tiene secuencias de nucleótidos ligeramente diferentes. No obstante, mediante una selección cuidadosa de cebadores, todos estos genes HA3 pueden amplificarse con el mismo conjunto de cebadores de acuerdo con un método proporcionado en la presente descripción. Por ejemplo, una porción del gen HA3 que tiene la secuencia, en orden 5'-3': AACCTCACTACGTAAGTCTTGACGTAAACGGTTACCCACGTAGACTAGAGTAATA ACTCGAAAAGGGT (SEQ ID NO: 91) puede seleccionarse como diana para amplificación de acuerdo con un método proporcionado en la presente descripción (la secuencia se proporciona en ADN, en lugar de en forma de ARN). Al describir esta secuencia, en la dirección 5' a 3', la primera secuencia subrayada es la segunda porción del molde, la segunda secuencia subrayada es el motivo interno y la tercera secuencia subrayada es la primera porción del molde, como estos términos se usan, por ejemplo, en la Figura 10. En este y otros ejemplos similares, tanto la secuencia diana total para la amplificación, así como también las secuencias particulares para funcionar como la primera porción del molde, la segunda porción del molde y el motivo interno pueden seleccionarse de manera que los cebadores como se describen en la presente descripción puedan usarse para amplificar con éxito una amplia gama de secuencias relacionadas de acuerdo con los métodos proporcionados en la presente descripción. En las modalidades, puede proporcionarse un primer cebador como se describe en la presente descripción en donde la región de unión al molde del cebador es complementaria a la primera porción del molde anterior, y puede proporcionarse un segundo cebador como se describe en la presente descripción en donde la región de unión al molde del cebador es complementaria a una secuencia asociada que es complementaria a la segunda porción del molde. Opcionalmente, los cebadores pueden tener además regiones de cola que son complementarias al motivo interno o una secuencia complementaria de este. Tales cebadores pueden proporcionarse, por ejemplo, en composiciones o métodos proporcionados en la presente descripción.

Con los métodos proporcionados en la presente descripción, los patógenos o genes pueden identificarse positivamente a concentraciones tan bajas como, por ejemplo, menos de 1000, 500, 100, 50, 10, 5, 2 o 1 copia por microlitro en una muestra o una mezcla de reacción. En las modalidades, los métodos proporcionados en la presente descripción pueden amplificar específicamente el ácido nucleico de un tipo de patógeno o gen y no amplificar el ácido nucleico de un patógeno o gen relacionado. Por ejemplo, los ensayos proporcionados en la presente descripción para amplificar el gen de la proteína de la matriz de la influenza A pueden amplificar este gen de múltiples cepas diferentes de influenza A, pero no amplifican el material genético de la influenza B.

En las modalidades, los métodos proporcionados en la presente descripción pueden realizarse con éxito en presencia de una o más sustancias potencialmente interferentes. Los ejemplos de sustancias potencialmente interferentes incluyen BSA, glucosa, bilirrubina, nitritos, beta-hCG, acetona, condiciones de pH bajo, condiciones de pH alto, acetaminofén, aspirina, progestina, etinilestradiol, conservantes de orina, líquido seminal, lubricantes personales, jaleas anticonceptivas, espermicidas, polvos femeninos, cremas para hemorroides, miconazol, ADN genómico humano, lociones, medios de transporte universal (virales), medios de transporte de amies (bacterias), sangre, mucina, aciclovir, tratamientos para el herpes labial, orina, heces, hemoglobina, triglicéridos, EDTA, heparina, colesterol, gammaglobulina, ampicilina, nicotina, cotinina, aerosoles nasales, gotas nasales o cualquier combinación de estos. En las modalidades, los métodos proporcionados en la presente descripción pueden realizarse en presencia de una sustancia potencialmente interferente que se encuentra en una concentración de al menos tan grande como la proporcionada en la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos Núm. 62/001,050, presentada el 20 de mayo de 2014. En las modalidades, los métodos proporcionados en la presente descripción pueden realizarse en presencia de una sustancia potencialmente interferente que se encuentra en una concentración de hasta al menos un 10 %, 25 %, 50 % o 100 % mayor que la proporcionada en la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos Núm. 62/001,050.

Los ensayos y métodos descritos en la presente descripción pueden realizarse en un dispositivo o en un sistema para procesar una muestra. Los ensayos y métodos descritos en la presente descripción pueden incorporarse y usarse fácilmente en un dispositivo para procesar una muestra, o un sistema para procesar una muestra, que puede ser un dispositivo de ensayo automatizado o puede ser un sistema de ensayo automatizado. Tal dispositivo, y tal sistema, pueden ser útiles para la práctica de los métodos descritos en la presente descripción. Por ejemplo, un dispositivo puede ser útil para recibir una muestra. Un dispositivo puede ser útil para preparar o procesar una muestra. Un dispositivo puede ser útil para realizar un ensayo en una muestra. Un dispositivo puede ser útil para obtener datos de una muestra. Un dispositivo puede ser útil para transmitir datos que se obtienen de una muestra. Un dispositivo puede ser útil para desechar una muestra después del procesamiento o análisis de una muestra.

Un dispositivo puede ser parte de un sistema, un componente del cual puede ser un dispositivo de procesamiento de muestras. Un dispositivo puede ser un dispositivo de procesamiento de muestras. Puede configurarse un dispositivo de procesamiento de muestras para facilitar la recolección de una muestra, preparar una muestra para una prueba clínica o realizar un método con uno o más reactivos, como se describe en la presente descripción. Puede configurarse un dispositivo de procesamiento de muestras para obtener datos de una muestra. Puede configurarse un dispositivo de procesamiento de muestras para transmitir datos que se obtienen de una muestra. Puede configurarse un dispositivo de procesamiento de muestras para analizar datos de una muestra. Puede configurarse un dispositivo de procesamiento de muestras para comunicarse con otro dispositivo, o un laboratorio, o una persona afiliada a un laboratorio, para analizar los datos que se obtienen de una muestra.

Puede configurarse un dispositivo de procesamiento de muestras para colocarse en o sobre un sujeto. Puede configurarse un dispositivo de procesamiento de muestras para aceptar una muestra de un sujeto, ya sea directa o indirectamente. Una muestra puede ser, por ejemplo, una muestra de sangre (por ejemplo, una muestra que se obtiene de una punción en el dedo, o de una punción en vena, o una muestra de sangre arterial), una muestra de orina, una muestra de biopsia, un fragmento de tejido, una muestra de heces u otra muestra biológica; una muestra de agua, una muestra de suelo, una muestra de comida, una muestra de aire; u otra muestra. Una muestra de sangre puede comprender, por ejemplo, sangre completa, plasma o suero. Un dispositivo de procesamiento de muestras puede recibir una muestra del sujeto a través de una carcasa del dispositivo. La recolección de muestras puede ocurrir en un sitio de recolección de muestras o en otro lugar. La muestra puede proporcionarse al dispositivo en un sitio de recolección de muestras.

En algunas modalidades, un dispositivo de procesamiento de muestras puede configurarse para aceptar o contener un cartucho. En algunas modalidades, un dispositivo de procesamiento de muestras puede comprender un cartucho. El cartucho puede extraerse del dispositivo de procesamiento de muestras. En algunas modalidades, puede proporcionarse una muestra al cartucho del dispositivo de procesamiento de muestras. Alternativamente, puede proporcionarse una muestra a otra porción de un dispositivo de procesamiento de muestras. El cartucho y/o dispositivo puede comprender una unidad de recolección de muestras que puede configurarse para aceptar una muestra.

Un cartucho puede incluir una muestra y puede incluir reactivos para usar en el procesamiento o análisis de una muestra, desechables para usar en el procesamiento o análisis de una muestra u otros materiales. Un cartucho puede contener reactivos descritos en la presente descripción para realizar un método descrito en la presente descripción. Después de colocar un cartucho en, o insertar un cartucho en, un dispositivo de procesamiento de muestras, uno o más componentes del cartucho pueden ponerse en comunicación fluida con otros componentes del dispositivo de procesamiento de muestras. Por ejemplo, si se recolecta una muestra en un cartucho, la muestra puede transferirse a otras porciones del dispositivo de procesamiento de muestras. De manera similar, si se proporcionan uno o más reactivos en un cartucho, los reactivos pueden transferirse a otras porciones del dispositivo de procesamiento de muestras, o pueden llevarse otros componentes del dispositivo de procesamiento de muestras a los reactivos. En algunas modalidades, los reactivos o componentes de un cartucho pueden permanecer a bordo del cartucho. En algunas modalidades, no se incluyen fluidos que requieran sistemas de tubos o que requieran mantenimiento (por ejemplo, mantenimiento manual o automatizado).

Puede transferirse una muestra o reactivo a un dispositivo, tal como un dispositivo de procesamiento de muestras. Puede transferirse una muestra o reactivo dentro de un dispositivo. Tal transferencia de muestra o reactivo puede lograrse sin proporcionar una vía de fluido continua desde el cartucho al dispositivo. Tal transferencia de muestra o reactivo puede realizarse sin proporcionar una vía de fluido continua dentro de un dispositivo. En las modalidades, tal transferencia de muestra o reactivo puede realizarse mediante un sistema de manipulación de muestras (por ejemplo, una pipeta); por ejemplo, una muestra, reactivo o alícuota de esta puede aspirarse a un componente de transferencia de punta abierta, tal como una punta de pipeta, que puede conectarse operativamente a un sistema de manipulación de muestras que transfiere la punta, con la muestra, reactivo o una alícuota de esta contenida dentro de la punta, en una ubicación sobre o dentro del dispositivo de procesamiento de muestras. La muestra, reactivo o alícuota de esta puede depositarse en un lugar sobre o dentro del dispositivo de procesamiento de muestras. La muestra y el reactivo, o los reactivos múltiples, pueden mezclarse mediante el uso de un sistema de manipulación de muestras de manera similar. Uno o más componentes del cartucho pueden transferirse de forma automatizada a otras porciones del dispositivo de procesamiento de muestras y viceversa.

Un dispositivo, tal como un dispositivo de procesamiento de muestras, puede tener un sistema de manejo de fluidos. Un sistema de manejo de fluidos puede realizar, o puede ayudar a realizar, transportar, diluir, extraer, formar alícuotas, mezclar y otras acciones con un fluido, tal como una muestra. En algunas modalidades, un sistema de manipulación de fluidos puede estar contenido dentro de la carcasa del dispositivo. Un sistema de manejo de fluidos puede permitir la recolección, suministro, procesamiento y/o transporte de un fluido, disolución de reactivos secos, mezcla de líquido y/o reactivos secos con un líquido, así como también la recolección, suministro, procesamiento y/o transporte de componentes, muestras o materiales no fluídicos. El fluido puede ser una muestra, un reactivo, diluyente, lavado, colorante o cualquier otro fluido que pueda usarse por el dispositivo y puede incluir, pero no se limita a, fluidos homogéneos, líquidos diferentes, emulsiones, suspensiones y otros fluidos. Además, puede usarse un sistema de manipulación de fluidos, que incluye, sin limitación, una pipeta, para transportar recipientes (con o sin líquido contenido en ellos) alrededor del dispositivo. El sistema de manejo de fluidos puede dispensar o aspirar un fluido. La muestra puede incluir una o más partículas o materia sólida flotando dentro de un fluido.

En las modalidades, un sistema de manejo de fluidos puede comprender una pipeta, punta de pipeta, jeringa, capilar u otro componente. El sistema de manipulación de fluidos puede tener una porción con una superficie interior y una superficie exterior y un extremo abierto. El sistema de manipulación de fluidos puede comprender una pipeta, que puede incluir un cuerpo de pipeta y una boquilla de pipeta, y puede comprender una punta de pipeta. La punta de una pipeta puede o no ser extraíble de una boquilla de pipeta. En las modalidades, un sistema de manipulación de fluidos puede usar una pipeta acoplada con una punta de pipeta; una punta de pipeta puede ser desechable. Una punta puede formar un sello hermético a los fluidos cuando se acopla con una pipeta. Una punta de pipeta puede usarse una, dos o más veces. En las modalidades, un sistema de manipulación de fluidos puede usar una pipeta o dispositivo similar, con o sin punta de pipeta, para aspirar, dispensar, mezclar, transportar o manipular el fluido de cualquier otra manera. El fluido puede dispensarse desde el sistema de manipulación de fluidos cuando sea conveniente. El fluido puede estar contenido dentro de la punta de una pipeta antes de dispensarse, por ejemplo, desde un orificio en la punta de la pipeta. En las modalidades, o casos durante el uso, puede dispensarse todo el fluido; en otras modalidades, o casos durante el uso, puede dispensarse una porción del fluido dentro de una punta. Una pipeta puede aspirar selectivamente un fluido. La pipeta puede aspirar una cantidad determinada de fluido. La pipeta puede ser capaz de accionar mecanismos de agitación para mezclar el fluido dentro de la punta o dentro de un recipiente. La pipeta puede incorporar puntas o recipientes que creen lazos de flujo continuo para mezclar, que incluye materiales o reactivos que no están en forma líquida. Además, la punta de una pipeta puede facilitar la mezcla mediante el suministro medido de múltiples fluidos simultáneamente o en secuencia, tal como en reacciones de sustrato de 2 partes.

El sistema de manipulación de fluidos puede incluir una o más unidades independientes hidráulicamente o aisladas de manera fluida. Por ejemplo, el sistema de manipulación de fluidos puede incluir una, dos o más puntas de pipeta. Las puntas de las pipetas pueden configurarse para aceptar y confinar un fluido. Las puntas pueden estar aisladas de forma fluida o independientes hidráulicamente entre sí. El fluido contenido dentro de cada punta puede estar aislado de forma fluida o independiente hidráulicamente de los fluidos en otras puntas y de otros fluidos dentro del dispositivo. Las unidades independientes hidráulicamente o aisladas de forma fluida pueden ser móviles con respecto a otras porciones del dispositivo y/o entre sí. Las unidades independientes hidráulicamente o aisladas de forma fluida pueden moverse individualmente. Un sistema de manipulación de fluidos puede comprender una o más bases o soportes. Una base o soporte puede soportar una o más pipetas o unidades de pipetas. Una base o soporte puede conectar una o más pipetas del sistema de manejo de fluidos entre sí.

Puede configurarse un dispositivo de procesamiento de muestras para realizar etapas o acciones de procesamiento en una muestra que se obtiene de un sujeto. El procesamiento de la muestra puede incluir la preparación de la muestra, que incluye, por ejemplo, dilución de la muestra, división de una muestra en alícuotas, extracción, contacto con un reactivo, filtración, separación, centrifugación u otra acción o etapa de preparación o procesamiento. Puede configurarse un dispositivo de procesamiento de muestras para realizar una o más acciones o etapas de preparación de muestras en la muestra. Opcionalmente, puede prepararse una muestra para una reacción química y/o una etapa de procesamiento físico. Una acción o etapa de preparación de la muestra puede incluir uno o más de los siguientes: centrifugación, separación, filtración, dilución, enriquecimiento, purificación, precipitación, incubación, pipeteo, transporte, cromatografía, lisis celular, citometría, pulverización, trituración, activación, ultrasonidos, procesamiento de microcolumnas, procesamiento con perlas magnéticas, procesamiento con nanopartículas u otras acciones o etapas de preparación de muestras. Por ejemplo, la preparación de la muestra puede incluir una o más etapas para separar la sangre en suero y/o fracciones particuladas, o para separar cualquier otra muestra en varios componentes. La preparación de la muestra puede incluir una o más etapas para diluir y/o concentrar una muestra, tal como una muestra de sangre u otras muestras biológicas. La preparación de la muestra puede incluir la adición de un anticoagulante u otros ingredientes a una muestra. La preparación de la muestra también puede incluir la purificación de una muestra. En las modalidades, todas las acciones o etapas de procesamiento, preparación o análisis de muestras se realizan mediante un dispositivo único. En las modalidades, todas las acciones o etapas de procesamiento, preparación o análisis de muestras se realizan dentro de una carcasa de un dispositivo único. En las modalidades, la mayoría de las acciones o etapas de procesamiento, preparación o análisis de muestras se realizan mediante un dispositivo único, y pueden realizarse dentro de una carcasa de un dispositivo único. En las modalidades, muchas acciones o etapas de procesamiento, preparación o análisis de muestras se realizan mediante un dispositivo único, y pueden realizarse dentro de una carcasa de un dispositivo único. En las modalidades, las acciones o etapas de procesamiento, preparación o análisis de la muestra pueden realizarse mediante más de un dispositivo.

Puede configurarse un dispositivo de procesamiento de muestras para ejecutar uno o más análisis en una muestra y para obtener datos de la muestra. Un dispositivo de procesamiento de muestras puede realizar los métodos proporcionados en la presente descripción, así como también análisis adicionales. Una evaluación puede incluir uno o más tratamientos físicos o químicos y puede incluir ejecutar una o más reacciones químicas o físicas. Puede configurarse un dispositivo de procesamiento de muestras para realizar uno, dos o más análisis en una pequeña muestra de fluido corporal. Una o más reacciones químicas pueden tener lugar en una muestra que tiene un volumen, como se describe en otra parte de la presente descripción. Por ejemplo, una o más reacciones químicas pueden tener lugar en una píldora que tiene volúmenes inferiores a femtolitros. En un caso, la unidad de recolección de muestras se configura para recibir un volumen de la muestra de fluido corporal equivalente a una sola gota o menos de sangre o fluido intersticial. En las modalidades, el volumen de una muestra puede ser un volumen pequeño, donde un volumen pequeño puede ser un volumen que es menor que aproximadamente 1000 j L, o menor que aproximadamente 500 |jL, o menor que aproximadamente 250 j L, o menor que aproximadamente 150 j L, o menor que aproximadamente 100 j L, o menor que aproximadamente 75 j L, o menor que aproximadamente 50 j L, o menor que aproximadamente 40 j L, o menor que aproximadamente 20 j L, o menor que aproximadamente 10 j L, menor que aproximadamente 5 j L, menor que aproximadamente 1 jl, menor que aproximadamente 0,5 j l, menor que aproximadamente 0,1 j l u otro volumen pequeño. En las modalidades, todas las acciones o etapas de análisis de muestras se realizan en una sola muestra. En las modalidades, todas las acciones o etapas del análisis de muestras se realizan mediante un dispositivo único. En las modalidades, todas las acciones o etapas de análisis de muestras se realizan dentro de una carcasa de un dispositivo único. En las modalidades, la mayoría de las acciones o etapas de análisis de muestras se realizan mediante un dispositivo único y pueden realizarse dentro de una carcasa de un dispositivo único. En las modalidades, muchas acciones o etapas de análisis de muestras se realizan mediante un dispositivo único, y pueden realizarse dentro de una carcasa de un dispositivo único. En las modalidades, las acciones o etapas de procesamiento, preparación o análisis de la muestra pueden realizarse mediante más de un dispositivo.

Puede configurarse un dispositivo de procesamiento de muestras para realizar una pluralidad de análisis en una muestra. En algunas modalidades, un dispositivo de procesamiento de muestras puede configurarse para realizar un método proporcionado en la presente descripción y uno, dos o más análisis adicionales. En las modalidades, un dispositivo de procesamiento de muestras puede configurarse para realizar una pluralidad de análisis en una única muestra. En las modalidades, un dispositivo de procesamiento de muestras puede configurarse para realizar una pluralidad de análisis en una sola muestra, donde la muestra es una muestra pequeña. Por ejemplo, una muestra pequeña puede tener un volumen de muestra que es un volumen pequeño menor que aproximadamente 1000 j L, o menor que aproximadamente 500 j L, o menor que aproximadamente 250 j L, o menor que aproximadamente 150 j L, o menor que aproximadamente 100 j L, o menor que aproximadamente 75 j L, o menor que aproximadamente 50 j L, o menor que aproximadamente 40 j L, o menor que aproximadamente 20 j L, o menor que aproximadamente 10 j L, menor que aproximadamente 5 j L, menor que aproximadamente 1 j L, menor que aproximadamente 0,5 jl, menor que aproximadamente 0,1 j l u otro volumen pequeño. Un dispositivo de procesamiento de muestras puede ser capaz de realizar análisis multiplexados en una única muestra. Pueden realizarse una pluralidad de análisis simultáneamente; puede ejecutarse secuencialmente; o algunos análisis pueden realizarse simultáneamente mientras que otros se realizan secuencialmente. Además, pueden incorporarse al dispositivo uno o más análisis de control y/o calibradores (por ejemplo, que incluyen una configuración con un control de un calibrador para el análisis/pruebas); los análisis de control y los análisis sobre calibradores pueden realizarse simultáneamente con análisis realizados sobre una muestra, o pueden realizarse antes o después de los análisis realizados sobre una muestra, o cualquier combinación de estos. En las modalidades, todas las acciones o etapas del análisis de muestras se realizan mediante un dispositivo único. En las modalidades, la totalidad de una pluralidad de acciones o etapas de análisis se realizan dentro de una carcasa de un dispositivo único. En las modalidades, la mayoría de las acciones o etapas de análisis de muestras, de una pluralidad de análisis, se realizan mediante un dispositivo único, y pueden realizarse dentro de una carcasa de un dispositivo único. En las modalidades, muchas acciones o etapas de análisis de muestras, de una pluralidad de análisis, se realizan mediante un dispositivo único, y pueden realizarse dentro de una carcasa de un dispositivo único. En las modalidades, las acciones o etapas de procesamiento, preparación o análisis de la muestra pueden realizarse mediante más de un dispositivo.

En las modalidades, todos los análisis de una pluralidad de análisis pueden realizarse en un período de tiempo corto. En las modalidades, un período de tiempo tan corto comprende menos de aproximadamente tres horas, o menos de aproximadamente dos horas, o menos de aproximadamente una hora, o menos de aproximadamente 40 minutos, o menos de aproximadamente 30 minutos, o menos de aproximadamente 25 minutos, o menos de aproximadamente 20 minutos, o menos de aproximadamente 15 minutos, o menos de aproximadamente 10 minutos, o menos de aproximadamente 5 minutos, o menos de aproximadamente 4 minutos, o menos de aproximadamente 3 minutos, o menos de aproximadamente 2 minutos, o menos de aproximadamente 1 minuto, u otro período de tiempo corto.

Puede configurarse un dispositivo de procesamiento de muestras para detectar una o más señales relacionadas con la muestra. Puede configurarse un dispositivo de procesamiento de muestras para identificar una o más propiedades de la muestra. Por ejemplo, el dispositivo de procesamiento de muestras puede configurarse para detectar la presencia o concentración de un analito (por ejemplo, un ácido nucleico diana) o una pluralidad de analitos o una enfermedad en la muestra (por ejemplo, en o a través de un fluido corporal, secreción, tejido u otra muestra). Alternativamente, el dispositivo de procesamiento de muestras puede configurarse para detectar una señal o señales que pueden analizarse para detectar la presencia o concentración de uno o más analitos (que pueden ser indicativos de una afección de enfermedad) o una enfermedad en la muestra. Las señales pueden analizarse a bordo del dispositivo o en otro lugar. La ejecución de una prueba clínica puede incluir o no análisis o comparación de los datos recolectados.

Puede realizarse una reacción química u otras etapas de procesamiento, con o sin la muestra. Los ejemplos de etapas, pruebas o análisis que pueden prepararse o ejecutarse con el dispositivo pueden incluir, entre otros, inmunoensayo, análisis de ácido nucleico (por ejemplo, los métodos proporcionados en la presente descripción), análisis basados en receptores, análisis citométrico, análisis colorimétrica, análisis enzimática, análisis electroforético, análisis electroquímico, análisis espectroscópico, análisis cromatográfico, análisis microscópico, análisis topográfico, análisis calorimétrico, análisis turbidimétrico, análisis de aglutinación, análisis de radioisótopos, análisis viscosimétrico, prueba de coagulación, prueba de tiempo de coagulación, análisis de síntesis de proteínas, análisis histológico, análisis de cultivo, análisis de osmolaridad y/u otros tipos de análisis, centrifugación, separación, filtración, dilución, enriquecimiento, purificación, precipitación, pulverización, incubación, pipeteo, transporte, lisis celular u otra acción o etapas de preparación de muestras, o combinaciones de estos. Las etapas, pruebas o análisis que pueden prepararse o ejecutarse por el dispositivo pueden incluir imágenes, que incluye microscopía, citometría y otras técnicas que preparan o usan imágenes. Las etapas, pruebas o análisis que pueden prepararse o ejecutarse por el dispositivo pueden incluir, además, una evaluación de histología, morfología, cinemática, dinámica y/o estado de una muestra, que puede incluir tal evaluación para las células.

Un dispositivo puede ser capaz de realizar todas las etapas a bordo (por ejemplo, etapas o acciones realizadas por un solo dispositivo) en un corto período de tiempo. Un dispositivo puede ser capaz de realizar todas las etapas a bordo en una única muestra en un corto período de tiempo. Por ejemplo, desde la recolección de la muestra de un sujeto hasta la transmisión de datos y/o el análisis puede tomar aproximadamente 3 horas o menos, 2 horas o menos, 1 hora o menos, 50 minutos o menos, 45 minutos o menos, 40 minutos o menos, 30 minutos o menos, 20 minutos o menos, 15 minutos o menos, 10 minutos o menos, 5 minutos o menos, 4 minutos o menos, 3 minutos o menos, 2 minutos o menos, o 1 minuto o menos. La cantidad de tiempo desde la aceptación de una muestra dentro del dispositivo hasta la transmisión de datos y/o el análisis desde el dispositivo con respecto a tal muestra puede depender del tipo o número de etapas, pruebas o análisis realizados en la muestra. La cantidad de tiempo desde la aceptación de una muestra dentro del dispositivo hasta la transmisión de datos y/o el análisis desde el dispositivo con respecto a tal muestra puede tomar aproximadamente 3 horas o menos, 2 horas o menos, 1 hora o menos, 50 minutos o menos, 45 minutos o menos, 40 minutos o menos, 30 minutos o menos, 20 minutos o menos, 15 minutos o menos, 10 minutos o menos, 5 minutos o menos, 4 minutos o menos, 3 minutos o menos, 2 minutos o menos, o 1 minuto o menos.

Puede configurarse un dispositivo para preparar una muestra para su eliminación, o para eliminar una muestra, tal como una muestra biológica, después del procesamiento o análisis de una muestra.

En las modalidades, un dispositivo de procesamiento de muestras puede configurarse para transmitir datos que se obtienen de una muestra. En las modalidades, un dispositivo de procesamiento de muestras puede configurarse para comunicarse a través de una red. Un dispositivo de procesamiento de muestras puede incluir un módulo de comunicación que puede interactuar con la red. Un dispositivo de procesamiento de muestras puede conectarse a la red a través de una conexión por cable o de forma inalámbrica. La red puede ser una red de área local (LAN) o una red de área amplia (WAN) tal como Internet. En algunas modalidades, la red puede ser una red de área personal. La red puede incluir la nube. El dispositivo de procesamiento de muestras puede conectarse a la red sin requerir un dispositivo intermediario, o puede requerirse un dispositivo intermediario para conectar un dispositivo de procesamiento de muestras a una red. Un dispositivo de procesamiento de muestras puede comunicarse a través de una red con otro dispositivo, que puede ser cualquier tipo de dispositivo en red, que incluye, pero no se limita a, una computadora personal, una computadora servidor o una computadora portátil; asistentes digitales personales (PDA) tal como un dispositivo Windows CE; teléfonos tales como teléfonos móviles, teléfonos inteligentes (por ejemplo, iPhone, Android, Blackberry, etcétera) o teléfonos portátiles con reconocimiento de ubicación (tal como g Ps ); un dispositivo de itinerancia, tal como un dispositivo de itinerancia conectado a la red; un dispositivo inalámbrico, tal como un dispositivo de correo electrónico inalámbrico u otro dispositivo capaz de comunicarse de forma inalámbrica con una red informática; o cualquier otro tipo de dispositivo de red que pueda comunicarse posiblemente a través de una red y manejar transacciones electrónicas. Tal comunicación puede incluir proporcionar datos a una infraestructura de computación en la nube o cualquier otro tipo de infraestructura de almacenamiento de datos a la que puedan acceder otros dispositivos.

Un dispositivo de procesamiento de muestras puede proporcionar datos relacionados con una muestra a, por ejemplo, un profesional de la salud, una ubicación de un profesional de la salud, tal como un laboratorio, o una filial de este. Uno o más de un laboratorio, un profesional de la salud o un sujeto pueden tener un dispositivo de red capaz de recibir o acceder a los datos proporcionados por el dispositivo de procesamiento de muestras. Puede configurarse un dispositivo de procesamiento de muestras para proporcionar datos relacionados con una muestra a una base de datos. Un dispositivo de procesamiento de muestras puede configurarse para proporcionar datos relacionados con una muestra a un sistema de registros médicos electrónicos, a un sistema de información de laboratorio, a un sistema de automatización de laboratorio u otro sistema o programa informático. Un dispositivo de procesamiento de muestras puede proporcionar datos en forma de informe.

Un laboratorio, dispositivo u otra entidad o programa informático puede realizar análisis de datos relacionados con una muestra en tiempo real. Un sistema de programa informático puede realizar análisis químicos y/o análisis patológicos, o estos pueden distribuirse entre combinaciones de personal de laboratorio, clínico y especializado o experto. El análisis puede incluir la evaluación cualitativa y/o cuantitativa de una muestra. El análisis de datos puede incluir una evaluación cualitativa y/o cuantitativa posterior de una muestra. Opcionalmente, puede generarse un informe basado en datos sin procesar, datos procesados preliminarmente o datos analizados. Tal informe puede prepararse para mantener la confidencialidad de los datos que se obtienen de la muestra, la identidad y otra información sobre el sujeto del que se obtuvo la muestra, el análisis de los datos y otra información confidencial. El informe y/o los datos pueden transmitirse a un profesional de la salud. Los datos que se obtienen mediante un dispositivo de procesamiento de muestras, o el análisis de tales datos o informes, pueden proporcionarse a una base de datos, un sistema de registros médicos electrónicos, un sistema de información de laboratorio, un sistema de automatización de laboratorio u otro sistema o programa informático.

La descripción y divulgación de ejemplos de reactivos, análisis, métodos, kits, dispositivos y sistemas que pueden usarse, o ser usados con, métodos, composiciones u otros reactivos descritos en la presente descripción pueden encontrarse, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos 8,088,593; Patente de Estados Unidos 8,380,541; Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. de Serie 13/769,798, presentada el 18 de febrero de 2013; Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. de Serie 13/769,779, presentada el 18 de febrero de 2013; Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. de Serie 13/244,947 presentada el 26 de septiembre de 2011; Solicitud internacional Núm. PCT/US2012/57155, presentada el 25 de septiembre de 2012; Solicitud de Estados Unidos Núm. de Serie 13/244,946, presentada el 26 de septiembre de 2011; Solicitud de patente de Estados Unidos 13/244,949, presentada el 26 de septiembre de 2011; Solicitud internacional Núm. PCT/US14/30034, presentada el 15 de marzo de 2014, y Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 14/214,850, presentada el 15 de marzo de 2014.

Esta solicitud reclama el beneficio y la prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos Núm.

61/908,027, presentada el 22 de noviembre de 2013; Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos Núm.

62/001,050, presentada el 20 de mayo de 2014; Solicitud de patente no provisional de Estados Unidos Núm. 14 / 214,850, presentada el 15 de marzo de 2014; y Solicitud de Patente Internacional Núm. PCT/US 14/30034, presentada el 15 de marzo de 2014,

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se ofrecen únicamente con fines ilustrativos y no pretenden limitar la presente descripción de ninguna manera.

Ejemplo 1: Amplificación de un molde de ácido nucleico con cebadores de longitud variable en la región de cola

Se usó un método como se proporciona en la presente descripción para amplificar un ácido nucleico diana. Se prepararon reacciones para analizar aproximadamente una porción de 102 nucleótidos del ácido nucleico diana T124A1, que es una porción de 464 nucleótidos de un gen de hemaglutinina (HA3) del virus de la influenza A (una molécula de ARN). La secuencia de nucleótidos de T124A1 se proporciona en la SEQ ID NO: 89. Se prepararon 12 variantes de un primer cebador ("P1") y 12 variantes de un segundo cebador ("P2"). Las secuencias de todas las variantes de cebadores se proporcionan en la Figura 2A. Todos los cebadores contenían una región de unión al molde de 15 nucleótidos de longitud. La secuencia de la región de unión al molde de todas las variantes del primer cebador fue: CAAACCGTACCAACC (SEQ ID NO: 80) (en la dirección 5'-3'). La secuencia de la región de unión al molde de todas las variantes del segundo cebador fue: ATGCGGAATGTa Cc (SEQ ID NO: 81) (en la dirección 5'-3'). Las diferentes variantes de cebadores contenían regiones de cola que variaban de 8 a 22 nucleótidos de longitud, específicamente 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20 o 22 nucleótidos de longitud. La región de cola del primer cebador tenía una secuencia de bases de:

CGCCGGATGGCTCTTGGGAAAC (SEQ ID NO: 82) (en la dirección 5'-3'). La secuencia de bases tiene 22 nucleótidos de longitud; las regiones de cola más cortas del primer cebador tienen la misma secuencia, menos el número apropiado de nucleótidos del extremo 5' de la región de cola (por ejemplo, el cebador con la región de cola de 18 nucleótidos de longitud tiene una región de cola con la misma secuencia que la secuencia de bases, menos los primeros 4 nucleótidos (CGCC) de la secuencia de bases). La región de cola del segundo cebador tenía una secuencia de bases de: GTTTCCCAAGAGCCATCCGGCG (SEQ ID NO: 83) (en la dirección 5'-3'). La secuencia de bases tiene 22 nucleótidos de longitud; las regiones de cola más cortas del primer cebador tienen la misma secuencia, menos el número apropiado de nucleótidos del extremo 3' de la región de cola (por ejemplo, el cebador con la región de cola de 18 nucleótidos de longitud tiene una región de cola con la misma secuencia que la secuencia de bases, menos los últimos 4 nucleótidos (GGCG) de la secuencia de bases).

Se prepararon mezclas de reacción de 150 microlitros, cada una contienen: acetato de potasio 50 mM, Tris-acetato 20 mM, pH 7,9, acetato de magnesio 10 mM, DTT 1 mM, albúmina de suero bovino (BSA) 30 |jg, betaína 0,8 M, cada uno de dATP, dTTP, dGTP y dCTP 1,4 mM, SYTO ® 59 (Life Technologies) 2 uM, ADN polimerasa Bst (New England BioLabs) 0,8 unidades / j l, enzima transcriptasa inversa AMV (New England Biolabs) 0,016 unidades / j l, inhibidor de la ARNasa murina 1 unidad / j l (New England Biolabs), una primera variante de cebador 0,8 jM , una segunda variante de cebador 0,8 jM y 100000 copias de molde T124A1 por microlitro, y se incubaron a 59 C durante 100 minutos en un instrumento CFX 96 Touch (Bio-Rad). Los puntos de inflexión de los ensayos se determinaron mediante el uso de un método de umbral único con el programa informático CFX Manager (Bio-Rad) y se muestran en la Figura 2B. El eje X proporciona la longitud en nucleótidos de la región de cola del primer y segundo cebador usados en la reacción, y el eje Y proporciona el tiempo de inflexión (en minutos) del ensayo. Para cada longitud de nucleótido de la región de cola, se muestran dos barras adyacentes: la barra de la izquierda es el tiempo de inflexión para la reacción que contiene el molde y la barra de la derecha es el tiempo de inflexión para la reacción que carece del molde ["sin control del molde" ("NTC")]. Para tiempos de inflexión superiores a 90 minutos, no se muestra ninguna barra. Como se muestra en la Figura 2B, en estas condiciones de reacción, los cebadores con regiones de cola de 8-15 nucleótidos y, más particularmente, 8-11 nucleótidos sustentaron los tiempos de inflexión más rápidos. Las reacciones de control sin molde eventualmente muestran un tiempo de inflexión; esto se debe a productos no específicos de fondo que se forman con el tiempo.

Ejemplo 2: Amplificación de un ácido nucleico molde con cebadores de longitud variable de la región de cola y longitud variable de la región de unión al molde

Se usó un método como se proporciona en la presente descripción para amplificar un ácido nucleico diana. Se prepararon reacciones para analizar el ácido nucleico diana T124A1, que se describe anteriormente en el Ejemplo 1. Se prepararon dos grupos diferentes de conjuntos de primer y segundo par de cebadores. En el primer grupo de pares de cebadores, cada uno de los cebadores tenía una región de unión al molde de 20 nucleótidos de longitud (el grupo de la "región de unión al molde de 20 nucleótidos"). En el segundo grupo de pares de cebadores, cada uno de los cebadores tenía una región de unión al molde de 16 nucleótidos de longitud (el grupo "región de unión al molde de 16 nucleótidos"). Dentro de cada grupo, se prepararon conjuntos de pares de cebadores primero y segundo con 8 longitudes de región de cola diferentes: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14 y 16 nucleótidos. La Figura 3 proporciona las secuencias de nucleótidos de los diferentes conjuntos de pares de cebadores para el grupo de la región de unión al molde de 16 nucleótidos (Figura 3A) y el grupo de la región de unión al molde de 20 nucleótidos (Figura 3B). En las Figuras 3A y 3B, la secuencia de la "cola" se refiere a la región de cola, y la región del "cebador' se refiere a la región de unión al molde del cebador. Las secuencias de los cebadores se muestran en la dirección 5'-3'.

Se prepararon mezclas de reacción de 110 microlitros, cada una contiene: acetato de potasio 50 mM, Tris-acetato 20 mM, pH 7,9, acetato de magnesio 10 mM, DTT 1 mM, albúmina de suero bovino (BsA) 30 |jg, betaína 0,8 M, dATP, dTTP, dGTP y dCTP 1,4 mM cada uno, SYTO ® 59 (Life Technologies) 2 uM, A d N polimerasa Bst (New England BioLabs) 0,8 unidades / j l, enzima transcriptasa inversa AMV (New England Biolabs) 0,016 unidades / j l, inhibidor de ARNasa murina (New England Biolabs) 1 unidad / jl, una primera variante de cebador 0,8 jM , una segunda variante de cebador 0,8 jM y 100000 copias del molde T124A1 por microlitro, y se incubaron a 56 C durante 100 minutos en un instrumento CFX 96 Touch (Bio-Rad). Los puntos de inflexión de los ensayos se muestran en las Figuras 3C (grupo de la región de unión al molde de 20 nucleótidos) y 3D (grupo de la región de unión al molde de 16 nucleótidos). Tanto en las Figuras 3C como en 3D, el eje X proporciona la longitud en nucleótidos de la región de cola del primer y segundo cebador usados en la reacción, y el eje Y proporciona el tiempo de inflexión (en minutos) del ensayo. Para cada longitud de nucleótido de la región de cola, se muestran dos barras adyacentes: la barra izquierda es el tiempo de inflexión para la reacción que contiene el molde, y la barra derecha es el tiempo de inflexión para la reacción que carece del molde. Como se muestra en la Figura 3, en estas condiciones de reacción, las reacciones que contienen cebadores que tienen regiones de cola relativamente más cortas mostraron tiempos de inflexión más rápidos y una mayor separación entre el tiempo de inflexión de las reacciones que contienen el molde versus las reacciones sin el molde. Por ejemplo, para los cebadores de 16 pb y 20 pb, las reacciones que contienen cebadores que tienen una longitud de la región de cola de 7, 8 o 9 nucleótidos mostraron tiempos de inflexión más rápidos que las reacciones que contienen cebadores que tienen una longitud de la región de cola de 12, 14 o 16 nucleótidos.

Ejemplo 3: Amplificación de un ácido nucleico molde a temperaturas variables

Se usó un método como se proporciona en la presente descripción para amplificar un ácido nucleico diana. Se prepararon reacciones para analizar el ácido nucleico diana T124A1, descrito anteriormente en el Ejemplo 1. El primer cebador "RLX0892" (secuencia: 5' TTGGGAAACCAAACCGTACCAACC 3')(SEQ ID NO: 20) y el segundo cebador "RLX0893" (secuencia: 5' GTTTCCCAAATGCGGAATGTACC 3')(SEQ ID n O: 32) se usaron para amplificar T124A1. Ambos cebadores tienen una región de cola de 9 nucleótidos, RLX0892 tiene una región de unión al molde de 15 nucleótidos y RLX0893 tiene una región de unión al molde de 14 nucleótidos. La región de cola de RLX0892 es: 5' TTGGGAAAC 3' (SEQ ID NO: 84) y la región de cola de RLX0893 es: 5' GTTTCCCAA 3' (SEQ ID NO: 85).

Se prepararon mezclas de reacción de 80 microlitros, cada una contiene: acetato de potasio 50 mM, Tris-acetato 20 mM, pH 7,9, acetato de magnesio 10 mM, DTT 1 mM, albúmina de suero bovino (BSA) 20 jg , betaína 0,8 M, dATP, dTTP, dGTP y dCTP 1,4 mM cada uno, SYTO ® 59 (Life Technologies) 2 uM, A d N polimerasa Bst (New England BioLabs) 0,8 unidades / j l, enzima transcriptasa inversa AMV (New England Biolabs) 0,016 unidades / j l, inhibidor de la ARNasa murina (New England Biolabs) 1 unidad / j l, 0,8 jM del primer cebador RLX0892, 0,8 jM del segundo cebador RLX0893 y 10000, 1000, 100 o 0 copias del molde T124A1 por microlitro, y se incubaron por triplicado a 52, 52,7, 54, 55,9, 58,4, 60,3, 61,4 o 62 C durante 100 minutos en un instrumento CfX 96 Touch (Bio-Rad). Los puntos de inflexión de los ensayos se muestran en la Figura 4. El eje X proporciona la temperatura de incubación de la reacción y el eje Y proporciona el tiempo de inflexión (en minutos) del ensayo. Para cada temperatura, se muestran 4 barras adyacentes, de izquierda a derecha: 10000 copias del molde / microlitro, 1000 copias del molde / microlitro, 100 copias del molde / microlitro o sin control del molde. Como se muestra en la Figura 4, en estas condiciones de reacción, los ensayos amplificaron eficazmente el molde a 1000 copias del molde / microlitro en todo el intervalo de temperaturas de 52 a 62 C, y a algunas temperaturas, a concentraciones del molde de al menos 100 copia del molde / microlitro.

Ejemplo 4: Amplificación de un ácido nucleico molde en presencia de ADN genómico humano

Se usó un método como se proporciona en la presente descripción para amplificar un ácido nucleico diana. Se prepararon reacciones para analizar el ácido nucleico diana T124A1 (descrito anteriormente) en presencia de ADN humano. El primer cebador "RLX0892" (descrito anteriormente) y el segundo cebador "RLX0893" (descrito anteriormente) se usaron para amplificar T124A1.

Se prepararon mezclas de reacción de 160 microlitros, cada una contiene: acetato de potasio 50 mM, Tris-acetato 20 mM, pH 7,9, acetato de magnesio 10 mM, DTT 1 mM, albúmina de suero bovino (Bs A) 20 |jg, betaína 0,8 M, dATP, dTTP, dGTP y dCTP 1,4 mM cada uno, 0,4 x SYTO ® 59 (Life Technologies), A d N polimerasa Bst (New England BioLabs) 0,8 unidades / j l, enzima transcriptasa inversa AMV (New England Biolabs) 0,016 unidades / j l, inhibidor de la ARNasa murina (New England Biolabs) 1 unidad / j l, 0,8 jM del primer cebador RLX0892, 0,8 jM del segundo cebador RLX0893 y 1000, 100 o 0 copias del molde T124A1 por microlitro, y 0, 1, 2,5, 5 o 10 nanogramos de ADN genómico humano y se incubó a 56 C durante 100 minutos en un instrumento CFX 96 Touch (Bio-Rad). Los puntos de inflexión de los ensayos se muestran en la Figura 5. El eje X proporciona la cantidad de ADN genómico humano ("ADNh") en la reacción, y el eje Y proporciona el tiempo de inflexión (en minutos) del ensayo. Para cada cantidad de ADNh, se muestran 3 barras adyacentes, de izquierda a derecha: 1000 copias del molde / microlitro, 100 copias del molde / microlitro o sin el molde. Como se muestra en la Figura 5, en estas condiciones de reacción, los ensayos amplificaron eficazmente el molde a 1000 copias del molde / microlitro en presencia de al menos 10 ng de ADNh. Además, la adición de ADNh a las reacciones provocó sólo una disminución relativamente pequeña en los tiempos de inflexión de NTC, incluso a concentraciones de 5 o 10 ng ADNh.

Ejemplo 5: Amplificación de un ácido nucleico molde de un eluato de lisado viral

Se usó un método como el que se proporciona en la presente descripción para amplificar un ácido nucleico diana de dos muestras diferentes que contienen la diana. El ácido nucleico diana T124A1 se preparó en dos muestras: 1) una muestra que contiene una molécula de ARN de T124A1 aislada (como en el Ejemplo 1), y 2) una muestra que contiene ácidos nucleicos aislados de una muestra viral de influenza A H3N2. T124A1 es una porción del gen HA3 y, por lo tanto, se espera que esté presente en una muestra de ácidos nucleicos aislados del virus de la influenza A H3N2. El lisado viral de la influenza A se preparó con un kit de ADN/ARN viral Chemagic (PerkinElmer), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La concentración de T124A1 en las dos muestras diferentes se cuantificó mediante qPCR y las muestras se diluyeron para normalizar la concentración de T124A1 en las muestras. Se usaron el primer cebador "RLX0892" y el segundo cebador "RLX0893" para amplificar T124A1.

Se prepararon mezclas de reacción de 25 microlitros, cada una contiene: acetato de potasio 50 mM, Tris-acetato 20 mM, pH 7,9, acetato de magnesio 10 mM, DTT 1 mM, albúmina de suero bovino (BsA) 20 jg , betaína 0,8 M, dATP, dTTP, dGTP y dCTP 1,4 mM cada uno, SYTO ® 59 (Life Technologies) 2 uM, A d N polimerasa Bst (New England BioLabs) 0,8 unidades / j l, enzima transcriptasa inversa AMV (New England Biolabs) 0,016 unidades / j l, inhibidor de la ARNasa murina (New England Biolabs) 1 unidad / j l, 0,8 jM del primer cebador RLX0892, 0,8 jM del segundo cebador RLX0893 y 10 000, 1000 o 0 copias del molde T124A1 por microlitro, y se incubaron a 56 C durante 100 minutos en un instrumento CFX 96 Touch (Bio-Rad). Los puntos de inflexión de los ensayos se muestran en la Figura 6. El eje X proporciona las copias del molde / microlitro en la reacción y el eje Y proporciona el tiempo de inflexión (en minutos) del ensayo. Para cada cantidad de copias de molde / microlitro, se muestran 2 barras adyacentes, de izquierda a derecha: T124A1 aislado y lisado viral de influenza A. También se muestra el punto de inflexión del NTC. Como se muestra en la Figura 6, en estas condiciones de reacción, los ensayos amplificaron eficazmente tanto el molde de T124A1 aislado como el molde de T124A1 en un lisado viral de influenza A.

Ejemplo 6: Amplificación de un ácido nucleico molde

Se usó un método como se proporciona en la presente descripción para amplificar un ácido nucleico diana. Se prepararon reacciones para analizar una porción de 54 nucleótidos de T129D1, que es una porción de 298 nucleótidos de un gen de hemaglutinina (HA) del virus de la influenza B (una molécula de ARN). La secuencia de nucleótidos de T129D1 se proporciona en la SEQ ID NO: 90. El primer cebador "A8" (secuencia de nucleótidos: 5' TCTTGAGAGAACCCACTAAC 3') (SEQ ID NO: 86) y el segundo cebador "B8" (secuencia de nucleótidos: 5' TCTCAAGAATTTGGTCTTCC 3') (Se Q ID NO: 87) se usaron para amplificar T129D1. En ambos cebadores, los primeros 8 nucleótidos (del extremo 5') son la región de cola y los últimos 12 nucleótidos son la región de unión al molde. Juntos, estos cebadores se dirigen a una porción de 54 nucleótidos de T129D1.

Se preparó una mezcla de reacción de 100 microlitros, cada una contiene: acetato de potasio 50 mM, Tris-acetato 20 mM, pH 7,9, acetato de magnesio 10 mM, DTT 1 mM, albúmina de suero bovino (BsA) 20 jg , betaína 0,8 M, dATP, dTTP, dGTP y dCTP 1,4 mM cada uno, 0,4 x SYTO ® 59 (Life Technologies), A d N polimerasa Bst (New England BioLabs) 0,8 unidades / j l, enzima transcriptasa inversa AMV (New England Biolabs) 0,016 unidades / j l, inhibidor de la ARNasa murina (New England Biolabs) 1 unidad / jl, 0,8 jM del primer cebador A8, 0,8 jM del segundo cebador B8 y 100000 moldes de T129D1 por microlitro, y se incubaron a 58 C durante 100 minutos en un instrumento CFX 96 Touch (Bio-Rad). Después de los 100 minutos, se tomó una muestra de la reacción y se ligó en vectores de clonación. Los vectores que contienen productos de reacción se secuenciaron mediante el uso de cebadores específicos de vector, dirigidos hacia el sitio de clonación. En la Figura 7 se muestra una parte de los resultados de múltiples reacciones de secuenciación ilustrativas. Los resultados de la secuenciación muestran que se forman concatámeros que tienen la estructura esperada. Específicamente, en estos ejemplos, en una sola cadena del producto de reacción, están presentes múltiples copias de la secuencia de 54 nucleótidos dirigida del gen T129D1, separadas por la secuencia de la región de cola del cebador A8 (5' TCTTGAGA 3') (SEQ ID NO: 88). En la Figura 7, solo se muestra una porción de la segunda aparición (de izquierda a derecha) del T129D1; las secuencias continúan más allá de los nucleótidos que se muestran en la figura.

Ejemplo 7: Cebadores con Colas Complementarias a un Motivo Interno

Para describir adicionalmente las modalidades proporcionadas en la presente descripción en las que una cola de cebador contiene una secuencia que es complementaria a un motivo interno dentro de un ácido nucleico diana, ahora se proporcionará un ejemplo con secuencias de ácido nucleico ilustrativas. Puede proporcionarse un molde polinucleotídico de 54 nucleótidos de longitud total ("Molde del Ejemplo 7"). El Molde del Ejemplo 7 corresponde al elemento 1000 de la Figura 10. La secuencia del Molde del Ejemplo 7 es la siguiente: 5' TCGCTTGAACTGAGGACTTAGCGCCTAGAAACTTGGCTCAGGTAACCAACTGGT 3' (SEQ ID NO: 92). Al describir el Molde del Ejemplo 7, en la dirección 5' a 3', la primera secuencia subrayada es la segunda porción del molde polinucleotídico (por ejemplo, similar al elemento 1002 como se indica en la Figura 10), la segunda secuencia subrayada es el motivo interno (por ejemplo, correspondiente al elemento 1003 proporcionado en la Figura 10), y la tercera secuencia subrayada es la primera porción del molde polinucleotídico (por ejemplo, correspondiente al elemento 1001 proporcionado en la Figura 10). Los nucleótidos específicos del Molde del Ejemplo 7 y otras secuencias proporcionadas en la presente descripción pueden mencionarse con respecto a su posición en la secuencia respectiva leída en la dirección 5' a 3'. Así, por ejemplo, la "T" en el extremo 5' del Molde del Ejemplo 7 está en la 1ra posición, la "C" adyacente a la "T" en el extremo 5' está en la 2da posición, y así sucesivamente. Puede proporcionarse un primer cebador de 24 nucleótidos de longitud total ("Primer Cebador del Ejemplo 7 "). El Primer Cebador del Ejemplo 7 corresponde al elemento 1010 de la Figura 10. La secuencia del Primer Cebador del Ejemplo 7 es la siguiente: 5' CTAGAAACACCAGTTGGTTACCTG 3' (SEQ ID NO: 93). La secuencia subrayada es la primera / región de cola del Primer Cebador del Ejemplo 7 (correspondiente al elemento 1011 de la Figura 10), y la secuencia no subrayada es la segunda / región de unión al molde del Primer Cebador del Ejemplo 7 (correspondiente al elemento 1012) de la Figura 10). También es de destacar el hecho de que la primera región del Primer Cebador del Ejemplo 7 tiene la misma secuencia de nucleótidos que el motivo interno del Molde del Ejemplo 7. El Primer Cebador del Ejemplo 7 puede hibridar con el Molde del Ejemplo 7 de la siguiente manera: Cuando el Molde del Ejemplo 7 y el Primer Cebador del Ejemplo 7 están orientados de manera que el extremo 3' del Molde del Ejemplo 7 y el extremo 5' del Primer Cebador del Ejemplo 7 estén orientados hacia la misma dirección, la secuencia no subrayada del Primer Cebador del Ejemplo 7 (leída en la dirección de 5' a 3', como en ACCAG...) se hibrida con la primera porción del Molde del Ejemplo 7 (leída en la dirección 3' a 5', como en TGGTC..). Más específicamente, la "A" en la 9na posición del Primer Cebador del Ejemplo 7 se aparea con la "T" en la posición 54 del Molde del Ejemplo 7, la "C" en la 10m' posición del Primer Cebador del Ejemplo 7 se aparea con la "G" en la posición 53 del Molde del Ejemplo 7, la "C" en la 11na posición del Primer Cebador del Ejemplo 7 se aparea con la "G" en la posición 52 del Molde del Ejemplo 7, etcétera. Cuando el Primer Cebador del Ejemplo 7 se hibrida con el Molde del Ejemplo 7, una polimerasa que tiene actividad de desplazamiento de cadena puede extender el Primer Cebador del Ejemplo 7, como se describe en otra parte de la presente descripción, para generar un Producto de Extensión del Primer Cebador del Ejemplo 7. El Producto de Extensión del Primer Cebador del Ejemplo 7 tendrá la secuencia de nucleótidos en la dirección 5' a 3' de: 5' CTAGAAACACCAGTTGGTTACCTGAGCCAAGTTTCTAGGCGCTAAGTCCTCAGTT CAAGCGA 3' (SEQ ID NO: 94). Al describir el Producto de Extensión del Primer Cebador del Ejemplo 7, en la dirección 5' a 3', la primera secuencia no subrayada es la secuencia de la primera región del Primer Cebador del Ejemplo 7, la primera secuencia subrayada es una secuencia que es complementaria a la primera porción del Molde del Ejemplo 7, la segunda secuencia subrayada es la secuencia del motivo interno del Producto de Extensión del Primer Cebador del Ejemplo 7 y la tercera secuencia subrayada es una secuencia que es complementaria a la segunda porción del Molde del Ejemplo 7. En las modalidades, cuando el Producto de Extensión del Primer Cebador del Ejemplo 7 se hibrida con el Molde del Ejemplo 7, en algunas circunstancias, la porción del Producto de Extensión del Primer Cebador del Ejemplo 7 que es la secuencia de la primera región del Primer Cebador del Ejemplo 7 puede hibridarse temporalmente al motivo interno del Producto de Extensión del Primer Cebador del Ejemplo 7, de manera que la "C" en la 1ra posición se hibrida con la "G" en la posición 38 del Producto de Extensión del Primer Cebador del Ejemplo 7, la "T" en la 2da posición hibrida con la "A" en la posición 37, la "A" en la 3ra posición se hibrida con la "T" en la posición 36, etcétera, hasta la "C" en la 8va posición se hibrida con la "G" en la posición 31. Cuando la porción del Producto de Extensión del Primer Cebador del Ejemplo 7 que es la secuencia de la primera región del Primer Cebador del Ejemplo 7 se hibrida temporalmente con la porción del motivo interno del Producto de Extensión del Primer Cebador del Ejemplo 7, la porción del Producto de Extensión del Primer Cebador del Ejemplo 7 entre estas porciones (que incluye, por ejemplo, la secuencia que es complementaria a la primera porción del Molde del Ejemplo 7) puede volverse no hibridada al Molde del Ejemplo 7, de esta manera se facilita, por ejemplo, la unión de otra copia del Primer Cebador del Ejemplo 7 al Molde del Ejemplo 7, y la generación posterior de Productos de Extensión del Primer Cebador del Ejemplo 7 adicionales.

Puede proporcionarse, además, un segundo cebador de 24 nucleótidos de longitud total ("Segundo Cebador del Ejemplo 7"). El Segundo Cebador del Ejemplo 7 corresponde al elemento 1020 de la Figura 10. La secuencia del Segundo Cebador del Ejemplo 7 es la siguiente: 5' GTTTCTAGTCGCTTGAACTGAGGA 3' (SEQ ID NO: 95). La secuencia subrayada es la primera región del Segundo Cebador del Ejemplo 7 (correspondiente al elemento 1021 de la Figura 10), y la secuencia no subrayada es la segunda región del Segundo Cebador del Ejemplo 7 (correspondiente al elemento 1022 de la Figura 10). El Segundo Cebador del Ejemplo 7 puede hibridar con el Producto de Extensión del Primer Cebador del Ejemplo 7 como sigue: La "T" en la 9na posición del Segundo Cebador del Ejemplo 7 se aparea con la "A" en la posición 62 del Producto de Extensión del Primer Cebador del Ejemplo 7, la "C" en la 10ma posición del Segundo Cebador del Ejemplo 7 se aparea con la "G" en la posición 61 del Producto de Extensión del Primer Cebador del Ejemplo 7, la "G" en la 11na posición del Segundo Cebador del Ejemplo 7 se aparea con la "C" en la posición 60 del Producto de Extensión del Primer Cebador del Ejemplo 7, etcétera. El Segundo Cebador del Ejemplo 7 puede extenderse por una polimerasa que tiene actividad de desplazamiento de cadena como se describe en otra parte en la presente descripción, para producir un Producto de Extensión del Segundo Cebador del Ejemplo 7. El Producto de Extensión del Segundo Cebador del Ejemplo 7 tendrá la secuencia de nucleótidos en la dirección 5' a 3' de: 5' GTTTCTAGTCGCTTGAACTGAGGACTTAGCGCCTAGAAACTTGGCTCAGGTAACC AACTGGTGTTTCTAG 3' (SEQ ID NO: 96). Al describir el Producto de Extensión del Segundo Cebador del Ejemplo 7, en la dirección 5' a 3', la primera secuencia no subrayada es la secuencia de la primera región del Segundo Cebador del Ejemplo 7, la primera secuencia subrayada es la secuencia de la segunda porción del Molde del Ejemplo 7, la segunda secuencia subrayada es la secuencia del motivo interno del Producto de Extensión del Segundo Cebador del Ejemplo 7, la tercera secuencia subrayada es la secuencia de la primera porción del Molde del Ejemplo 7 y la cuarta secuencia no subrayada es la secuencia de la primera región del Segundo Cebador del Ejemplo 7 y la secuencia de una secuencia que es complementaria a la primera región del Primer Cebador del Ejemplo 7. En las modalidades, cuando el Producto de Extensión del Segundo Cebador del Ejemplo 7 se hibrida con el Producto de Extensión del Primer Cebador del Ejemplo 7, en algunas circunstancias, la porción del Producto de Extensión del Segundo Cebador del Ejemplo 7 que es la secuencia de la primera región del Segundo Cebador del Ejemplo 7 puede temporalmente hibridarse al motivo interno del Producto de Extensión del Segundo Cebador del Ejemplo 7, de manera que la "G" en la 1ra posición se hibrida con la "C" en la posición 40 del Producto de Extensión del Segundo Cebador del Ejemplo 7, la "T "en la 2da posición hibrida con la "A" en la posición 39, la "T" en 3ra posición se hibrida con la "A" en la posición 38, etcétera, hasta la "G" en la 8va posición se hibrida con la "C" en la posición 33. Cuando la porción del Producto de Extensión del Segundo Cebador del Ejemplo 7 que es la secuencia de la primera región del Segundo Cebador del Ejemplo 7 se hibrida temporalmente con el motivo interno del Producto de Extensión del Segundo Cebador del Ejemplo 7, la porción del Producto de Extensión del Segundo Cebador del Ejemplo 7 entre estas porciones (que incluye, por ejemplo, la secuencia de la segunda porción del Molde del Ejemplo 7) puede quedar sin hibridar con el Producto de Extensión del Primer Cebador del Ejemplo 7, de esta manera se facilita, por ejemplo, la unión de otra copia del Segundo Cebador del Ejemplo 7 al Producto de Extensión del Primer Cebador del Ejemplo 7, y la generación posterior de Productos de Extensión del Segundo Cebador del Ejemplo 7 adicionales.

En las modalidades, los métodos proporcionados en otras partes de la presente descripción pueden proceder de acuerdo con los mecanismos generales descritos anteriormente. Cualquiera de las descripciones y detalles proporcionados en otras partes de la presente descripción para cebadores, ácidos nucleicos diana, condiciones de reacción, productos de reacción, etcétera, pueden aplicarse a reacciones que implican el mecanismo general descrito anteriormente en el Ejemplo 7.

Ejemplo 8: Detección de SNP

Se usó un método proporcionado en la presente descripción para identificar un SNP / mutación en un ácido nucleico diana. Se proporcionaron dos versiones del ácido nucleico diana, que se diferenciaban por un único nucleótido. La primera cadena de la Versión 1 del molde de ácido nucleico ("Molde de la Versión 1"; también denominada secuencia de "tipo silvestre") tiene la secuencia, en la dirección 5' a 3':

GCATTCATCACGTTTTTGCGAGTCCTTTCC^TCCCACCAACAGCAGGGATTCTGA AGAGATGGGGACAGTT (SEQ ID NO: 97). Al describir el Molde de la Versión 1, en la dirección de 5' a 3', la primera secuencia subrayada es la segunda porción del Molde de la Versión 1, la segunda secuencia subrayada es el motivo interno del Molde de la Versión 1 y la tercera secuencia subrayada es la primera porción del Molde de la Versión 1. La primera cadena de la Versión 2 del molde de ácido nucleico ("Molde de la Versión 2"; también denominada secuencia "SNP") tiene la secuencia, en la dirección 5' a 3':

GCATTCATCACGTTTTTGCGAGTCCTTTCCTTCCCACCAACAGCAGGGATTCTGAA GAGATGGGGACAGTT

(SEQ ID NO: 98). Al describir el Molde de la Versión 2, en la dirección de 5' a 3', la primera secuencia subrayada es la segunda porción del Molde de la Versión 2, la segunda secuencia subrayada es el motivo interno del Molde de la Versión 2 y la tercera secuencia subrayada es la primera porción del Molde de la Versión 2. Las secuencias del Molde de la Versión 1 y del Molde de la Versión 2 difieren sólo en un único nucleótido en la secuencia de motivos internos de los respectivos Moldes. Específicamente, el Molde de la Versión 1 tiene una "A" en la posición 31 de la secuencia (subrayado en negrita y en cursiva), mientras que el Molde de la Versión 2 tiene una "T" en la posición 31 de la secuencia (subrayado con negrita y en cursiva). También se proporcionaron un primer cebador y un segundo cebador para amplificar las secuencias del Molde. El primer cebador ("Cebador 1 del Ejemplo 8 ") tiene una secuencia de: 5' TCCATCCCAACTGTCCCCATCT 3' (SEQ iD NO: 99). La secuencia subrayada es la primera / región de cola del Cebador 1 del Ejemplo 8, y la secuencia no subrayada es la segunda / región de unión al molde del Cebador 1 del Ejemplo 8. El segundo cebador ("Cebador 2 del Ejemplo 8 ") tiene una secuencia de: 5' GGGATGGAGCATTCATCACGTTT 3' (SEQ ID NO: 100). La secuencia subrayada es la primera / región de cola del Cebador 2 del Ejemplo 8, y la secuencia no subrayada es la segunda / región de unión al molde del Cebador 2 del Ejemplo 8.

Se realizaron reacciones de amplificación separadas como se describe en otra parte de la presente descripción para el Molde de la Versión 1 o el Molde de la Versión 2, con las reacciones para el Molde de la Versión 1 y el Molde de la Versión 2 mediante el uso del Cebador 1 del Ejemplo 8 y el Cebador 2 del Ejemplo 8 como los cebadores. Se realizaron múltiples reacciones en las mismas condiciones para cada Molde.

En las reacciones del Molde de la Versión 1, después de la hibridación del Cebador 1 del Ejemplo 8 con el Molde de la Versión 1 y la generación por una polimerasa de un producto de extensión del Cebador 1 del Ejemplo 8 ("Producto de Extensión del Cebador 1 del Molde de la Versión 1"), el producto de extensión del Cebador 1 del Molde de la Versión 1 tendrá la siguiente secuencia: 5' TCCATCCCAACTGTCCCCATCTCTTCAGAATCCCTGCTGTTGGTGGGA7GGAAAG GACTCGCAAAAACGTGATGAATGC (SEQ ID NO: 101). Al describir el Producto de Extensión del Cebador 1 del Molde de la Versión 1, en la dirección 5' a 3', la primera secuencia no subrayada es la secuencia de la primera / región de cola del Cebador 1 del Ejemplo 8, la primera secuencia subrayada es una secuencia que es complementaria a la primera porción del Molde de la Versión 1, la segunda secuencia subrayada es la secuencia del motivo interno del Producto de Extensión del Cebador 1 del Molde de la Versión 1 (donde la "T" en negrita y cursiva es el nucleótido de interés), y la tercera secuencia subrayada es una secuencia que es complementaria a la segunda porción del Molde de la Versión 1. De acuerdo con los métodos descritos en la presente descripción, en las modalidades, la porción del Producto de Extensión del Cebador 1 del Molde de la Versión 1 correspondiente a la secuencia de la primera / región de cola de la secuencia del Cebador 1 del Ejemplo 8 puede hibridarse temporalmente con el motivo interno del Producto de Extensión del Cebador 1 del Molde de la Versión 1, de manera que la "T" en la 1ra posición se hibrida con la "A" en la posición 52, la "C" en la 2da posición se hibrida con la "G" en la posición 51, la " C" en la 3ra posición se hibrida con la "G" en la posición 50, etcétera, hasta la "C" en la 8va posición se hibrida con la "G" en la posición 45. Es de destacar que la porción del Producto de Extensión del Cebador 1 del Molde de la Versión 1 correspondiente a la secuencia de la primera / región de cola de la secuencia del Cebador 1 del Ejemplo 8 es perfectamente complementaria a la secuencia del motivo interno del Producto de Extensión del Cebador 1 del Molde de la Versión 1 (es decir, no hay errores de apareamientos entre ninguno de los 8 conjuntos de nucleótidos apareados).

En las reacciones del Molde de la Versión 2, después de la hibridación del Cebador 1 del Ejemplo 8 con el Molde de la Versión 2 y la generación por una polimerasa de un producto de extensión del Cebador 1 del Ejemplo 8 ("Producto de Extensión del Cebador 1 del Molde de la Versión 2"), el Producto de Extensión del Cebador 1 del Molde de la Versión 2 tendrá la siguiente secuencia: 5'

TCCATCCCAACTGTCCCCATCT CTTCAGAATCCCTGCTGTTGGTGGGA^GGAAAG GACTCGCAAAAACGTGATGAATGC (SEQ ID NO: 102). Al describir el Producto de Extensión del Molde de la Versión 2, en la dirección 5' a 3', la primera secuencia no subrayada es la secuencia de la primera / región de cola del Cebador 1 del Ejemplo 8, la primera secuencia subrayada es una secuencia que es complementaria a la primera porción del Molde de la Versión 2, la segunda secuencia subrayada es la secuencia del motivo interno del Producto de Extensión del Cebador 1 del Molde de la Versión 2 (donde la "A" en negrita y cursiva es el nucleótido de interés) y la tercera secuencia subrayada es una secuencia complementaria a la segunda porción del Molde de la Versión 2. De acuerdo con los métodos descritos en la presente descripción, en las modalidades, la porción del Producto de Extensión del Cebador 1 del Molde de la Versión 2 correspondiente a la secuencia de la primera / región de cola de la secuencia del Cebador 1 del Ejemplo 8 puede hibridarse temporalmente con el motivo interno del Producto de Extensión del Cebador 1 del Molde de la Versión 2, de manera que la "T" en la 1ra posición hibrida con la "A" en la posición 52, la "C" en la 2da posición hibrida con la "G" en la posición 51, la "C" en la 3ra posición hibrida con la "G" en la posición 50, etcétera, hasta la "C" en la 8va posición hibrida con la "G" en la posición 45. Es de destacar que la porción del Producto de Extensión del Cebador 1 del Molde de la Versión 2 correspondiente a la secuencia de la primera / región de cola de la secuencia del Cebador 1 del Ejemplo 8 no es perfectamente complementaria a la secuencia del motivo interno del Producto de Extensión del Cebador 1 del Molde de la Versión 2, ya que hay un error de apareamiento entre la "A" en la 4ta posición y la "A" en la posición 49. Por lo tanto, al comparar el Producto de Extensión del Cebador 1 del Molde de la Versión 1 con el Producto de Extensión del Cebador 1 del Molde de la Versión 2, la porción del Producto de Extensión respectivo correspondiente a la primera / región de cola del Cebador 1 del Ejemplo 8 tendrá una mayor complementación y será más estable la hibridación con el motivo interno en el Producto de Extensión del Cebador 1 del Molde de la Versión 1 que en el Producto de Extensión del Cebador 1 del Molde de la Versión 2. En particular, la secuencia "TCCATCCC" en el Producto de Extensión del Cebador 1 del Molde de la Versión 1 es perfectamente complementaria al motivo interno en el Producto de Extensión del Cebador 1 del Molde de la Versión 1 (8 de 8 nucleótidos pueden aparearse correctamente), mientras que la secuencia "TCCATCCC" en el Producto de Extensión del Cebador 1 del Molde de la Versión 2 no es perfectamente complementaria al motivo interno en el Producto de Extensión del Cebador 1 del Molde de la Versión 2 (solo 7 de los 8 nucleótidos pueden aparearse correctamente). Típicamente, una mayor complementariedad entre la porción de un Producto de Extensión correspondiente a una cola de cebador y un motivo interno en el Producto de Extensión resulta en una hibridación más estable entre estas dos porciones. Cuando un Producto de Extensión se configura de manera que estas dos porciones se hibridan, puede acelerar la velocidad de una reacción proporcionada en la presente descripción, por ejemplo, al permitir la unión de un nuevo cebador a nucleótidos no hibridados en una cadena complementaria expuesta mediante la hibridación interna de regiones de un Producto de Extensión o mediante el aumento de la velocidad en la formación del concatámero de acuerdo con los métodos proporcionados en la presente descripción.

Un mecanismo similar como el que se describe anteriormente también ocurre para los Productos de Extensión del Cebador 2 del Molde de la Versión 1 y del Molde de la Versión 2, donde la porción de la región de cola de los Productos de Extensión es perfectamente complementaria para el Producto de Extensión del Cebador 2 del Molde de la Versión 1, pero no es perfectamente complementaria para el Producto de Extensión del Cebador 2 del Molde de la Versión 2.

La Figura 11 muestra los resultados de las reacciones de amplificación con estos moldes y cebadores, donde el eje X muestra el tiempo y el eje Y muestra las unidades de fluorescencia relativa (RFU) (que indica ADN amplificado). Como se muestra en la Figura 11, las reacciones de amplificación con el Molde de la Versión 1 (secuencia "de tipo silvestre") ocurrieron más rápidamente que las reacciones con el Molde de la Versión 2 (secuencia "SNP"). Por lo tanto, estos resultados muestran que los métodos proporcionados en la presente descripción pueden usarse, por ejemplo, para distinguir entre secuencias que tienen variaciones de un único nucleótido.

Ejemplo 9: detección de SNP

Se usó un método proporcionado en la presente descripción para identificar un SNP / mutación en un ácido nucleico diana humano. La variante Q356R de la proteína BRCA1 puede estar asociada con un mayor riesgo de cáncer. La variante Q356R puede ocurrir, por ejemplo, cuando el codón (secuencia de nucleótidos CAG) que codifica la glutamina en el aminoácido de la posición de 356 de la proteína BRCA1 de tipo silvestre tiene en su lugar la secuencia de nucleótidos CGG, de manera que el codón codifica una arginina en lugar de glutamina.

Se obtuvieron cuatro versiones diferentes de una porción de la secuencia genómica de BRCA1 que contiene, entre otros nucleótidos, el codón para el aminoácido de la posición de 356. La primera versión ("Diana de tipo Silvestre") contiene el codón de tipo silvestre que codifica la glutamina en el aminoácido de la posición 356 (secuencia CAG), y tiene la secuencia de nucleótidos, en la dirección 5' a 3': AAGATGTTCCTTGGA

TA A C A C T A A A T A G C A G C A T T C A G A A A G T T A A T GAGTGGTT TTCCAGA (SEQ ID NO: 103). La segunda versión ("Diana Q356R ") contiene un codón que codifica una arginina en el aminoácido de la posición de 356 (secuencia CGG), y tiene la secuencia de nucleótidos, en la dirección 5' a 3':

AAGATGTTCCTTGGATAACACTAAATAGCAGCATTCGGAAAGTTAATGAGTGGTT TTCCAGA (SEQ ID NO: 104). La tercera versión ("Diana Q356P ") contiene un codón que codifica una prolina en el aminoácido de la posición 356 (secuencia CCG), y tiene la secuencia de nucleótidos, en la dirección 5' a 3':

AAGATGTTCCTTGGATAACACTAAATAGCAGCATTCCGAAAGTTAATGAGTGGTT TTCCAGA (SEQ ID NO: 105). La cuarta versión ("Diana Q356L ") contiene un codón que codifica una leucina en el aminoácido de la posición 356 (secuencia CTG), y tiene la secuencia de nucleótidos, en la dirección 5' a 3':

AAGATGTTCCTTGGATAACACTAAATAGCAGCATTCTGAAAGTTAATGAGTGGTT TTCCAGA (SEQ ID NO: 106). En cada uno de las cuatro dianas anteriores, en la dirección 5' a 3', la primera secuencia subrayada es la segunda porción de la Diana, la segunda secuencia subrayada es el motivo interno de la Diana y la tercera secuencia subrayada es la primera porción de la Diana.

Las cuatro secuencias Diana anteriores difieren en un único nucleótido en la secuencia de motivos internos de las respectivas Dianas. Específicamente, la Diana de Tipo Silvestre tiene una "A" en la posición 37 en la secuencia (subrayado en negrita y en cursiva), mientras que la Diana Q356R tiene una "G" en la posición 37 en la secuencia, la Diana Q356P tiene una "C" en la posición 37 en la secuencia, y la Diana Q356L tiene una "T" en la posición 37 en la secuencia. También se proporcionaron un primer cebador y un segundo cebador para amplificar las secuencias Diana. El primer cebador ("Cebador 1 del Ejemplo 9") tiene una secuencia de: 5' ATTCAGAATCTGGAAAACCACTC 3' (SEQ ID NO: 107). La secuencia subrayada es la primera / región de cola del Cebador 1 del Ejemplo 9, y la secuencia no subrayada es la segunda región de unión al molde del Cebador 1 del Ejemplo 9. El segundo cebador ("Cebador 2 del Ejemplo 9") tiene una secuencia de: 5' TTCTGAATAAGATGTTCCTTGGAT 3' (SEQ ID NO: 108). La secuencia subrayada es la primera / región de cola del Cebador 2 del Ejemplo 9, y la secuencia no subrayada es la segunda / región de unión al molde del Cebador 2 del Ejemplo 9.

Se realizaron reacciones de amplificación separadas como se describe en la presente descripción para cada una de las cuatro Dianas anteriores, con las reacciones para las cuatro Diana mediante el uso del Cebador 1 del Ejemplo 9 y el Cebador 2 del Ejemplo 9 como los cebadores. Las condiciones para las reacciones fueron las siguientes: acetato de potasio 50 mM, Tris-acetato 20 mM, pH 7,9, acetato de magnesio 10 mM, DTT 1 mM, betaína 0,8 M, SYTO® 592 uM (Life Technologies), Bst ADN polimerasa (New England BioLabs) 0,8 unidades / j l, Cebador 1 del Ejemplo 90,8 |jM, Cebador 2 del Ejemplo 90,8 jM y 10 copias de la molécula Diana / j l. Las reacciones se mantuvieron a 56 C durante 90 minutos y el punto de inflexión de cada reacción se determinó mediante el uso de un método de umbral único con el programa informático CFX Manager (Bio-Rad). Se realizaron múltiples reacciones en las mismas condiciones para cada Diana.

Las reacciones de amplificación ocurrieron por mecanismos descritos en otra parte de la presente descripción, por ejemplo, como en el Ejemplo 8. Por ejemplo, los productos de extensión del Cebador 1 del Ejemplo 9 y del Cebador 2 del Ejemplo 9 se formaron a partir de cada uno de los ácidos nucleicos Diana anteriores, en cada reacción respectiva, para formar, por ejemplo, un Producto de Extensión del Cebador 1 del Ejemplo 9 Diana de Tipo Silvestre, un Producto de Extensión del Cebador 1 del Ejemplo 9 Diana Q356R, un Producto de Extensión del Cebador 1 del Ejemplo 9 Diana Q356P, un Producto de Extensión del Cebador 1 del Ejemplo 9 Diana Q356L y los productos de extensión correspondientes de cada diana del Cebador 2 del Ejemplo 9.

Es de destacar que, mientras que la porción de, por ejemplo, el Producto de Extensión del Cebador 1 del Ejemplo 9 Diana de Tipo Silvestre correspondiente a la primera / región de cola del Cebador 1 del Ejemplo 9 es perfectamente complementaria al motivo interno en el Producto de Extensión del Cebador 1 del Ejemplo 9 Diana de Tipo Silvestre, la porción del Producto de Extensión correspondiente a la primera / región de cola del Cebador 1 del Ejemplo 9 para cada uno de los Productos de Extensión 1 Diana Q356r , Diana Q356P y Diana Q356L no es perfectamente complementaria al motivo interno en el Producto de Extensión respectivo. Específicamente, hay un error de apareamiento de un único nucleótido en la posición que involucra al nucleótido en la posición 37 de la secuencia diana, como se describió anteriormente. Este error de apareamiento puede afectar la velocidad de una reacción proporcionada en la presente descripción.

El tiempo medio de inflexión de los ensayos con cada una de las diferentes Dianas fue el siguiente: Diana de tipo silvestre: 24,5 minutos; Diana Q356R: 49,5 minutos, Diana Q356P: 55,7 minutos y Diana Q356L: 59,8 minutos. Por lo tanto, como indican los tiempos de inflexión de los ensayos, las reacciones pueden diferenciarse fácilmente entre dianas que varían en un único nucleótido en un motivo interno. El tiempo de inflexión significativamente más rápido del ensayo con la Diana de Tipo Silvestre en comparación con las otras Dianas puede ser el resultado de, por ejemplo, la complementación perfecta entre la porción del Producto de Extensión del Cebador 1 del Ejemplo 9 de la Diana de tipo silvestre correspondiente a la primera / región de cola del Cebador 1 del Ejemplo 9 y el motivo interno en el Producto de Extensión del Cebador 1 del Ejemplo 9 de la Diana de tipo silvestre, en contraste con la complementación imperfecta entre la porción del Producto de Extensión del Cebador 1 del Ejemplo 9 de la Diana Q356R, Diana Q356P, Diana Q356L que corresponde a la primera / región de cola del Cebador 1 del Ejemplo 9 y el motivo interno en el Producto de Extensión del Cebador 1 del Ejemplo 9 respectivo. Un razonamiento similar también se aplica a los productos de extensión de los Productos de Extensión del Cebador 2.

Ejemplo 10: amplificación del gen de la influenza N9

Se usó un método proporcionado en la presente descripción para amplificar una porción del gen de la neuraminidasa (N9) de una muestra que contenía el virus de la influenza A, subtipo H7N9. La secuencia diana de N9 fue, en la dirección 5' a 3' (en forma de ADN):

AACTTTAAGGACGAACAAGAGAGAAGGTAAACCTACAACCACTACAAACAAAGT AATATTATCAACAAATAATAACAAACCGAACACAACCAACAAAGT (SEQ ID NO: 109). El primer cebador utilizado para amplificar el molde tenía la secuencia, en la dirección 5' a 3': CTTCCATTTGAAACAACCAACAC (SEQ ID NO: 110). Al describir el primer cebador, la región subrayada es la cola / primera región del cebador y la región no subrayada es la segunda / región de unión al molde. El segundo cebador usado para amplificar el molde tenía la secuencia, en la dirección 5' a 3': AATGGAAGTTGAAATTCCTGCTTG (SEQ ID NO: 111). Al describir el primer cebador, la región subrayada es la cola / primera región del cebador y la región no subrayada es la segunda / región de unión al molde. Se realizaron múltiples reacciones como se describe en la presente descripción mediante el uso del primer cebador y el segundo cebador, donde las reacciones contenían una secuencia molde o no contenían una secuencia molde. Las reacciones que contenían el molde tenían 250000 copias de la secuencia del molde por reacción. Los resultados de las reacciones se proporcionan en la Figura 12. Los números del eje X son minutos y los valores del eje Y son unidades de fluorescencia relativa (RFU). Como se muestra en el gráfico, en las reacciones del molde, la RFU aumenta rápidamente a los 20 minutos, lo que indica la amplificación de la secuencia del molde. El aumento de RFU en las reacciones sin el molde aproximadamente a los 60 minutos y más tarde es el resultado de productos de fondo no específicos.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos proporcionadas en la presente descripción son secuencias artificiales, a menos que se indique lo contrario.

Si bien las modalidades preferidas de la presente invención se han mostrado y descrito en la presente descripción, será evidente para los expertos en la técnica que tales modalidades se proporcionan solamente a modo de ejemplo. La descripción anterior no pretende ser exhaustiva ni limitar la invención a las modalidades precisas descritas, y pueden ser posibles otras modificaciones y variaciones a la luz de las enseñanzas anteriores sin apartarse de la invención. Cualquier característica, ya sea preferida o no, puede combinarse con cualquier otra característica, ya sea preferida o no. Debe entenderse, además, que si bien la invención proporcionada en la presente descripción se ha descrito en la presente descripción mediante el uso de un número limitado de términos y frases para fines de conveniencia, la invención también podría describirse mediante el uso de otros términos y frases no proporcionados en la presente descripción que también describen con precisión la invención. Las reivindicaciones adjuntas no deben interpretarse en el sentido de que incluyen limitaciones de medios más función, a menos que dicha limitación se enumere explícitamente en una reivindicación dada mediante el uso de la frase "medios para". Debe entenderse que, como se usa en la presente descripción y en todas las reivindicaciones que siguen, el significado de "un", "una" y "el" incluye la referencia en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, una referencia a

Claims

REIVINDICACIONES

Un método para copiar un molde polinucleotídico, el método comprende:

incubar una mezcla de reacción que comprende el molde polinucleotídico, un primer cebador y un segundo cebador en condiciones sin termociclado, en donde al inicio de la incubación:

el molde polinucleotídico comprende una primera porción y una segunda porción;

el primer cebador comprende una primera región y una segunda región, en donde la primera región comprende un extremo 5' del cebador, la segunda región comprende un extremo 3' del cebador y la segunda región es complementaria a la primera porción del molde polinucleotídico;

el segundo cebador comprende una primera región y una segunda región, en donde la primera región comprende un extremo 5' del cebador, la segunda región comprende un extremo 3' del cebador y la segunda región es complementaria a una secuencia que es complementaria a la segunda porción del molde polinucleotídico;

la primera región del primer cebador es complementaria a la primera región del segundo cebador; y en donde el molde polinucleotídico comprende, además, una tercera porción, en donde la tercera porción está situada en el molde polinucleotídico entre la primera porción y la segunda porción, y en donde la primera región del segundo cebador es complementaria a la tercera porción del molde polinucleotídico.

y

se generan múltiples copias del molde polinucleotídico.

Un método para evaluar la identidad de un nucleótido en una posición de interés en una secuencia de nucleótidos en un molde polinucleotídico, el método comprende:

A) proporcionar copias del molde polinucleotídico en cada una de al menos una primera mezcla de reacción y una segunda mezcla de reacción, en donde al inicio de la incubación:

el molde polinucleotídico comprende una primera porción, una segunda porción y una tercera porción, en donde la tercera porción está situada en el molde polinucleotídico entre la primera porción y la segunda porción y en donde la posición de interés está en la tercera porción;

la primera mezcla de reacción comprende copias del molde polinucleotídico, un primer cebador y un segundo cebador, en donde:

el primer cebador comprende una primera región y una segunda región, en donde la primera región comprende un extremo 5' del cebador, la segunda región comprende un extremo 3' del cebador y la segunda región es complementaria a una primera porción del molde polinucleotídico; el segundo cebador comprende una primera región y una segunda región, en donde la primera región comprende un extremo 5' del cebador, la segunda región comprende un extremo 3' del cebador y la segunda región es complementaria a una secuencia que es complementaria a una segunda porción del molde polinucleotídico;

la primera región del primer cebador es complementaria a la primera región del segundo cebador; y

la primera región del segundo cebador es complementaria a la tercera porción del molde polinucleotídico;

la segunda mezcla de reacción comprende copias del molde polinucleotídico, un tercer cebador y un cuarto cebador, en donde

el tercer cebador comprende una primera región y una segunda región, en donde la primera región comprende un extremo 5' del cebador, la segunda región comprende un extremo 3' del cebador y la segunda región es complementaria a una primera porción del molde polinucleotídico; el cuarto cebador comprende una primera región y una segunda región, en donde la primera región comprende un extremo 5' del cebador, la segunda región comprende

un extremo 3' del cebador, y la segunda región es complementaria a una secuencia que es complementaria a una segunda porción del molde polinucleotídico;

la primera región del tercer cebador es complementaria a la primera región del cuarto cebador; y

la primera región del cuarto cebador es complementaria a la tercera porción del molde polinucleotídico; y

la secuencia de nucleótidos de la primera región del segundo cebador difiere de la secuencia de nucleótidos de la primera región del cuarto cebador por un único nucleótido, en donde la posición del nucleótido diferente en el segundo y cuarto cebadores corresponde a la posición del nucleótido de interés en el molde polinucleotídico si la secuencia de nucleótidos de la primera región del segundo cebador o cuarto cebador está orientada con la secuencia de nucleótidos de la tercera porción del molde polinucleotídico para la máxima complementación de las secuencias;

B) incubar la primera mezcla de reacción y la segunda mezcla de reacción en condiciones sin termociclado;

y

C) comparar la velocidad o cantidad de amplificación del molde polinucleotídico en la primera mezcla de reacción con la velocidad o cantidad de amplificación del molde polinucleotídico en la segunda mezcla de reacción, en donde la velocidad o cantidad de amplificación del molde polinucleotídico es indicativa del grado de complementación entre la primera región del segundo o cuarto cebador y la secuencia de nucleótidos de la tercera porción del molde polinucleotídico.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde el molde polinucleotídico es una cadena de ADN.

4. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde el molde polinucleotídico es una cadena de ARN.

5. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde el molde polinucleotídico es una cadena de una molécula de ADN dúplex.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la primera porción y la segunda porción del molde polinucleotídico tienen cada una entre 6 y 30 nucleótidos de longitud.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la tercera porción del molde polinucleotídico tiene una longitud entre 4 y 14 nucleótidos.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el número de copias del molde polinucleotídico en la mezcla de reacción se incrementa al menos 10 veces en los 60 minutos siguientes al inicio del método.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde se genera una cadena concatámero que comprende al menos tres copias del molde polinucleotídico durante la incubación de la mezcla de reacción.

10. Un método para amplificar una molécula de ácido nucleico bicatenario, el método comprende incubar la molécula de ácido nucleico bicatenario en una mezcla de reacción que comprende un primer cebador y un segundo cebador, en donde al inicio de la incubación:

la molécula de ácido nucleico bicatenario comprende una primera cadena y una segunda cadena, en donde la primera cadena comprende una primera porción y una tercera porción y la segunda cadena comprende una segunda porción;

el primer cebador comprende una primera región y una segunda región, en donde la segunda región del primer cebador es complementaria a la primera porción de la primera cadena; y

el segundo cebador comprende una primera región y una segunda región, en donde la segunda región del segundo cebador es complementaria a la segunda porción de la segunda cadena, la primera región del segundo cebador es complementaria a la tercera porción de la primera cadena, y la primera región del segundo cebador es complementaria a la primera región del primer cebador.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde la mezcla de reacción comprende, además, un colorante de ácido nucleico.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde la mezcla de reacción comprende, además, una transcriptasa inversa.