ES2879557T3 - Matrices que comprenden un polisacárido modificado - Google Patents

Abstract

Uso de una matriz que comprende una agarosa modificada en donde al menos 11% de los grupos hidroxilo primario se oxidan a un grupo ácido carboxílico, como un componente de composiciones cosméticas.

Description

DESCRIPCIÓN

Matrices que comprenden un polisacárido modificado

Campo de la invención

La presente invención se refiere a matrices que comprenden un polisacárido modificado y a las aplicaciones de dichas matrices. Las matrices se pueden usar como implantes de cirugía plástica e implantes de liberación controlada de fármacos. Además, las matrices de la presente invención son adecuadas para usar como un aditivo alimentario, como un componente de composiciones cosméticas y para otros fines industriales.

Antecedentes de la presente invención

En el texto de la presente solicitud, la nomenclatura de aminoácidos y péptidos se usa de acuerdo con "Nomenclatura and symbolism for amino acids and peptides", Pure & Appl. Chem., Vol. 56, No. 5, págs. 595-624, 1984, si no se indica lo contrario.

Las siguientes abreviaturas tienen el significado que se da en la siguiente lista, si no se indica lo contrario:

AFM microscopía de fuerza atómica

CD dicroísmo circular

CSF factor de forma celular

CT tomografía computarizada

DIC imagen de contraste de interferencia diferencial

DLS dispersión de luz dinámica

DMEM Medio Eagle modificado por Dulbecco

ADN ácido desoxirribonucleico

ECM matriz extracelular

EDC hidrocloruro de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida

ESEM microscopía electrónica de barrido ambiental

FTIR espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier

HCI ácido clorhídrico

KBr bromuro de potasio

MAS-RMN RMN con giro en ángulo mágico

MD dinámica molecular

MES ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico

Mn peso molecular medio numérico

MRI imagen de resonancia magnética

MWCO corte de exclusión de peso molecular

NaOCI hipocloruro de sodio

NaOH hidróxido de sodio

RMN resonancia magnética nuclear

PCR reacción en cadena de la polimerasa

PDB base de datos de proteínas

ARN ácido ribonucleico

RMSD raíz de la desviación cuadrática media

SEM microscopía electrónica de barrido

ARNip ARN interferente pequeño

SLS dispersión de luz estática

TEMPO (2,2,6,6-tetrametil-piperidin-1 -il)oxilo.

Las células vivas de organismos superiores residen en un entorno que está mecánica y biológicamente bien definido por una matriz extracelular (en lo sucesivo ECM). Los aspectos estructurales y mecánicos de la ECM, tales como la rigidez y la topografía, pueden tener una influencia sustancial en diferentes funciones celulares tales como el crecimiento celular o la diferenciación de las células.

La presente invención proporciona matrices en las que se pueden ajustar propiedades mecánicas y químicas importantes de la matriz de acuerdo con la aplicación deseada. Por lo tanto, puede ser necesario, por ejemplo, reducir el módulo de cizalladura G' de la matriz o mejorar las propiedades ópticas hacia una mayor transparencia de la matriz.

El entorno celular en las últimas décadas se ha considerado que es una pieza importante del rompecabezas de la organogénesis. Se sabe que cada tipo de célula se desarrolla y evoluciona en un entorno específico que proporciona las propiedades mecánicas y las necesidades nutricionales de la célula. Este entorno se llama matriz extracelular (ECM). Los componentes estructurales y funcionales de la ECM pueden modular el comportamiento y la función celular y también determinar qué célula puede interaccionar con otra en el cuerpo humano. Sin embargo, la mayoría de estas interacciones intercelulares no se comprenden completamente. Se ha mostrado que las propiedades de la ECM que sustenta la célula en el cuerpo humano tienen muchos aspectos (físicos y químicos) que se ha mostrado que afectan el destino celular in vitro e in vivo. Se ha descubierto que, además de los restos de adhesión celular y los factores de crecimiento, los atributos físicos de un microambiente celular, en concreto, la rigidez y la topografía, son otro elemento importante para dictar y controlar el destino y la función de las células.

Proporcionar una ECM sintética sería una contribución significativa a la investigación de dicha interacción intercelular. Es importante que un modelo que empleara dicha ECM permitiría imitar tejidos humanos in vitro y sería susceptible de trasladarlo in vivo. Otro objetivo de este modelo es permitir la comunicación con el cuerpo y ayudar en la curación o regeneración de tejidos. Matrices inyectables, biológicamente bien definidas con propiedades físicas ajustables y hechas a medida serían el siguiente paso evolutivo en nichos sintéticos para células.

La presente invención proporciona una matriz adecuada para estas aplicaciones. Además, la matriz de la presente invención también se puede usar como aditivo alimentario, material para implantes quirúrgicos e implantes de liberación controlada de fármacos, como lubricante para fines industriales, así como para acondicionamiento de líquidos.

En la presente solicitud, la matriz se define como moléculas que componen el entorno celular. En general la matriz está formada por diferentes componentes que se pueden clasificar en:

(1) las moléculas solubles, p. ej. factor de crecimiento y otras moléculas de señalización y

(2) los polímeros estructurales, compuestos de proteínas y polisacáridos que determinan las propiedades mecánicas de los tejidos.

La expresión "factor de crecimiento" se refiere a un compuesto de origen natural que es capaz de estimular el crecimiento, proliferación y diferenciación celular. Preferiblemente, el factor de crecimiento es un polipéptido o una proteína, por ejemplo, una proteína soluble en agua.

El término "proteína" se refiere a una estructura polimérica que consiste en uno o varios polipéptidos. Los polipéptidos, a su vez, consisten en restos de aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos. Preferiblemente, los aminoácidos de las proteínas son L-a-aminoácidos, por lo que se prefieren particularmente los aminoácidos proteinogénicos. Se prefiere que las proteínas que actúan como componentes de una matriz extracelular no sean solubles en agua. La expresión "secuencia peptídica'' usada en la presente invención se refiere a un polipéptido. Preferiblemente, una secuencia peptídica tiene entre 2 y 50 restos de aminoácidos, particularmente preferido entre 5 y 20 restos de aminoácidos.

En la presente solicitud, el término "polisacárido" se refiere a una estructura de carbohidrato polimérico que está formada por unidades que se repiten unidas entre sí por enlaces glicosídicos. Preferiblemente, las unidades que se repiten son mono o disacáridos y la estructura polimérica del polisacárido no es ramificada. Se prefiere que el peso molecular medio numérico del polisacárido esté en el intervalo de 10.000 Da a 500.000 Da, particularmente preferido que el peso molecular medio numérico del polisacárido esté en el intervalo de 50.000 Da a 300.000 Da, de modo que el peso molecular medio numérico del polisacárido que está en el intervalo de 80.000 Da a 140.000 Da es incluso más preferido.

Ya se han comercializado algunas matrices sintéticas para usar como ECM. Hasta ahora se han explorado tres estrategias diferentes para producir ECM sintéticas:

(1) Uso de extractos de proteínas animales tales como Matrigel® que adolecen de una falta de reproducibilidad de lote a lote y una mala definición de los componentes. Esto conduce a dificultades en la interpretación de los resultados obtenidos con dichas ECM.

(2) Uso de polímeros sintéticos tales como el poliéster degradable que, aunque biocompatibles, no son fáciles de sintetizar y fabricar y, además, requieren conocimientos de química sintética para configurarlo y también son difíciles de trasladar a entornos clínicos in vivo.

(3) Uso de componentes naturales de la ECM tales como el colágeno o el ácido hialurónico, que reproducen solo un aspecto del entorno natural de la ECM.

Como se describe en la revisión de Tan et al (Materials 2010, 3, 1746-1767) se han sugerido varios polisacáridos como materiales adecuados para ECM en las últimas décadas. Entre ellos destacan el ácido hialurónico, ácido de alginato y quitosán. El ácido hialurónico cuando se modifica usando alcoholes de cadena larga puede producir geles que se forman debido a reticulaciones físicas establecidas por las agregaciones de las cadenas de alquilo hidrófobas en el agua. El ácido hialurónico también se puede gelificar usando reticulación covalente. En este caso, el ácido hialurónico se oxida para llevar grupos aldehído que después se hacen reaccionar con quitosán modificado con N-succinilo u otros biopolímeros. Posteriormente, la diamina induce la reticulación a través de la formación de base de Schiff. El ácido algínico también se puede procesar en geles que pueden servir como soportes celulares mediante su reticulación iónica con cationes divalentes Ca2+, Mg2+, Ba2+ o Sr2+.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere al uso de una matriz que comprende una agarosa modificada en donde al menos 11% de los grupos hidroxilo primario se oxidan a un grupo ácido carboxílico, como un componente de composiciones cosméticas, como un aditivo alimentario, como un lubricante para fines industriales, para el acondicionamiento de líquidos, como un implante de cirugía plástica o como un implante de liberación controlada de fármacos.

Otras realizaciones de la invención se refieren a implantes de cirugía plástica e implantes de liberación controlada de fármacos que comprenden una matriz que comprende una agarosa modificada en donde al menos 11 % de los grupos hidroxilo primario se oxidan a un grupo ácido carboxílico.

Es un componente esencial de la matriz de la presente invención contener una agarosa modificada. En otra realización preferida más, la agarosa modificada deriva de agarosa fragmentada.

El agar, la principal fuente de agarosa, es un polisacárido estructural de las paredes celulares de una variedad de algas rojas. Fuentes importantes de agar son Gelidiaceae tales como Gelidium amansii, Gelidium japonicum, Gelidium pacificum, Gelidium subcostatum, Pterocladia tenuis y Acanthopeltis japónica, algas rojas pertenecientes a Gracilariaceae tales como Gracilaria verrucosa y Gracilaria gigas, algas rojas pertenecientes a Ceramiaceae tales como Ceramium kondoiy Campylaephora hypnaeoides. El agar consiste en dos grupos de polisacáridos, en concreto agarosa y agaropectina. La agarosa es un polisacárido lineal neutro sin ramificación y tiene un esqueleto que consiste en unidades que se repiten de p-D-galactosa-(1-4)-a-L-3,6-anhidrogalactosa con uniones 1,3. Esta unidad dimérica que se repite, llamada agarobiosa se diferencia de una unidad dimérica que se repite similar llamada carrabiosa que deriva de la carragenina en que contiene 3,6-anhidrogalactosa en forma L y no contiene grupos sulfato.

Dichas unidades diméricas que se repiten derivadas de agarosa se modifican químicamente por oxidación regioselectiva del grupo alcohol primario a un grupo ácido carboxílico. Dicha oxidación se puede llevar a cabo convenientemente mediante hipocloruro de sodio en presencia de 2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-oxilo (TEMPO). El mecanismo de reacción se muestra en el Esquema 1 a continuación. No hace falta decir que la oxidación regioselectiva del grupo alcohol primario al grupo ácido carboxílico también se puede llevar a cabo mediante otras reacciones que son bien conocidas por un experto en la técnica siempre que estas reacciones sean suficientemente selectivas y no tenga lugar la oxidación no deseada del grupo alcohol secundario y de otros grupos funcionales de la agarosa. Además, la oxidación de los grupos alcohol primario del polisacárido también se puede llevar a cabo mediante un proceso enzimático o usando un sistema bacteriológico.

Dependiendo de las condiciones de reacción elegidas, se puede oxidar solo un cierto porcentaje de los grupos alcohol primario de la agarosa. Según la invención, al menos 11 % de las unidades de repetición de disacárido están oxidadas. En una realización preferida, en al menos 20 hasta 99% de las unidades de repetición de disacárido, el grupo alcohol primario se oxida al grupo ácido carboxílico. En una realización particularmente preferida, en 50-95% de las unidades de repetición de disacárido, el grupo alcohol primario se oxida al grupo ácido carboxílico. En otra realización más, en más de 75% de las unidades de repetición de disacárido, el grupo alcohol primario se oxida al grupo ácido carboxílico.

Por lo tanto, la reacción de oxidación se lleva a cabo de una forma controlada, de modo que sólo se produce una oxidación parcial de los grupos alcohol primario. Sin embargo, la agarosa también se puede oxidar de tal manera que se oxiden aproximadamente el 100% de los grupos alcohol primario.

La agarosa completa o parcialmente oxidada posteriormente se puede mezclar con un polisacárido no modificado que puede ser agarosa u otro polisacárido. Dado que la naturaleza y extensión de la modificación química de la agarosa se puede controlar con precisión y la relación de mezcla con otro polisacárido o el mismo polisacárido no modificado se puede ajustar, es posible controlar las propiedades químicas de la matriz resultante.

La relación en peso de la agarosa modificada en la matriz de la presente invención está en el intervalo de 1-99% en peso. En una realización preferida de la presente invención, la relación en peso de la agarosa modificada en la matriz es mayor que 1% en peso, preferiblemente es mayor que 10% en peso. Es incluso más preferido que la relación de la agarosa modificada en la matriz sea mayor que 20% en peso, en particular mayor que 50% en peso.

Un aspecto importante de la presente invención es el módulo de cizalladura G' de la matriz. De acuerdo con la presente invención, el módulo de cizalladura puede variar de aproximadamente 10 Pa, que refleja la estructura de un tejido nervioso, a aproximadamente 107 Pa, que se corresponde con el módulo de cizalladura de los tejidos del cartílago. Mediante la mezcla de geles con diferentes grados de modificación química, se puede afectar a la estructura a nanoescala del gel. Se ha demostrado que la topografía a nanoescala influye en la forma celular, el ensamblaje y la función del citoesqueleto. Es por esta razón que la matriz de la presente invención puede inducir cambios en la forma de las células de mamíferos o en la función de las células de mamíferos.

El módulo de cizalladura de la matriz varía preferiblemente de 1 Pa a 100 kPa, más preferido de 1 Pa a 50 kPa y en una realización más preferida en un intervalo de 10 Pa a 10 kPa, de modo que la medición del módulo de cizalladura se lleva a cabo a una temperatura de 37°C como se especifica a continuación.

En una realización especialmente preferida, la agarosa en la que el grupo alcohol primario se ha oxidado a un grupo ácido carboxílico se mezcla con agarosa no modificada.

La agarosa se usa habitualmente para técnicas de separación tales como la electroforesis, cromatografía de permeabilidad en geles, cromatografía líquida de alto rendimiento, pero también como aditivo alimentario. Recientemente, se ha mostrado que el uso de hidrogel de agarosa es útil para la ECM modificada. La agarosa se ha usado con éxito para la preparación de cartílago de novo, lo que sugiere que un mayor desarrollo ofrecerá la posibilidad de regenerar otros tejidos. Se ha mostrado que los geles de agarosa inducen la reconstrucción ósea in vivo. También se ha mostrado que se puede modificar la cadena principal de la agarosa oxidando el grupo alcohol primario del resto de D-galactosa de una manera altamente regioselectiva. Esta modificación permite el injerto de moléculas en el gel de agarosa a través de un grupo ácido carboxílico. Por lo tanto, la matriz de la presente invención es muy valiosa para aplicaciones bioquímicas y médicas.

Se ha observado que la oxidación del grupo alcohol primario C6 del resto de D-galactosa conduce a una disminución del módulo de cizalladura pero también a un gel más débil. El diseño de nuevo material usando agarosa se ha investigado creando copolímero de agarosa-colágeno o agarosa-celulosa, pero también mezclando agarosa con polímero natural de la ECM.

La agarosa modificada es el componente preferido de la matriz de la presente invención. Sin embargo, se prefiere igualmente usar la agarosa no modificada como un componente de la matriz. Además, se pueden usar otros polisacáridos de origen natural como componentes que se pueden mezclar con agarosa modificada si dicho componente no se puede oxidar como se ha descrito antes. Si la estructura del polisacárido contiene un grupo alcohol primario que se puede oxidar a un grupo ácido carboxílico, las unidades de disacárido que se repiten se pueden modificar como se ha descrito antes con más detalle para la agarosa. Otros polisacáridos que se pueden usar en la presente invención se dan en la Tabla 1 a continuación. Los polisacáridos en celdas con bordes en negrita comprenden unidades de disacáridos que tienen un grupo alcohol primario. Por lo tanto, estos polisacáridos se pueden modificar químicamente de la manera descrita antes para la agarosa. En particular, los polisacáridos usados para la matriz de la presente invención son ácido hialurónico, sulfato de heparina, dermatán sulfato, condroitín sulfato, alginato, quitosán, pululano, k-carragenina. En la realización más preferida se usa agarosa.

En otra realización de la presente invención, la matriz contiene carrageninas en forma modificada y/o sin modificar. Las carrageninas son polisacáridos que están contenidos en algas rojas pertenecientes a Gigartinaceae, Solieriaceae, Hypneaceae y similares. Se conocen la K-carragenina, A-carragenina y rpcarragenina.

Tabla 1

En realizaciones preferidas adicionales de la presente invención, el grupo carboxílico que deriva de la oxidación del grupo alcohol primario se acopla covalentemente con una secuencia peptídica. En realizaciones preferidas, la secuencia peptídica se selecciona del grupo que consiste en la secuencia de adhesión celular arginina-glicina-ácido aspártico, las secuencias peptídicas IKVAV y YIGSR o una proteína que se selecciona preferiblemente de colágeno, fragmentos de colágeno, fibronectina y mezclas de los mismos. En otra realización más, la secuencia de proteínas es vitronectina.

En otra realización preferida, la matriz puede contener una modificación del grupo ácido carboxílico derivado de la oxidación del grupo alcohol primario en tanto que este grupo ácido carboxílico esté unido covalentemente a una secuencia de ácido nucleico. La secuencia de ácido nucleico puede ser ADN monocatenario, ADN bicatenario, ARN monocatenario y ARNip. El enlace entre el grupo ácido carboxílico y el ácido nucleico se puede introducir mediante un método de química click como se conoce en la técnica anterior. En caso de que se unan ácidos nucleicos monocatenarios a la matriz, dichas moléculas monocatenarias pueden hibridar con moléculas monocatenarias complementarias que están unidas a otros componentes. Esto ofrece la oportunidad de unir fácilmente moléculas o incluso células completas a la matriz.

Dependiendo del propósito del uso de la matriz, puede ser particularmente útil incluir puntos específicos de fijación en la matriz que se pueden diseñar de acuerdo con el uso previsto de la matriz.

La presente descripción describe además la capacidad de cambiar la estructura terciaria de la agarosa de manera que la rugosidad, rigidez, comportamiento de gelificación térmica y característica óptica del material se puedan ajustar con precisión para dirigirse a un material específico, de modo que la modificación hecha en la cadena principal consiste en una oxidación del grupo alcohol primario de la cadena principal de agarosa al grupo ácido carboxílico. Se demostró que esta modificación induce un cambio de organización de la cadena principal del polímero y se ha repetido en la kcarragenina como otro polisacárido. El gel de interés se puede obtener controlando la cantidad de modificación química de la cadena principal, pero también mezclando el polisacárido nativo con el polisacárido modificado. Esto da como resultado un material uniforme con características tales como rigidez, gelificación térmica y rugosidad que se pueden ajustar incorporando diferentes cantidades de cada polisacárido.

La facilidad de control de las propiedades físicas permite el diseño de un entorno que es mecánicamente similar al tejido humano natural pero también biológicamente neutro, ya que la agarosa no interacciona con las células. En caso de que se desee que las células interaccionen con el material, se deben injertar ligandos biológicos que son reconocidos por las células en la cadena principal del polímero. Por lo tanto, se han seguido dos estrategias; primero la forma química usando el acoplamiento de hidrocloruro de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDC) que permite la unión química directa del grupo ácido carboxílico del polisacárido al grupo amina en el extremo N de un péptido. Este proceso se ilustra en el esquema 2.

La secuencia peptídica también se puede unir al polisacárido modificado mediante química click, de modo que la azida o el resto alquino se acopla al polisacárido modificado y el otro resto se acopla a la secuencia peptídica.

El segundo enfoque se ha hecho con acoplamiento de ADN que permite una manipulación más fácil para el usuario final. Se puede acoplar una cadena de oligo-ADN a la cadena principal de polímero con la cadena de oligo-ADN complementaria que previamente se ha unido químicamente al péptido de interés. Esta forma de unión es para el usuario final un paso adelante hacia un sistema totalmente ajustable, donde las propiedades mecánicas se pueden ajustar mezclando dos componentes (polisacárido nativo con modificado) y la señal biológica incorporada al polímero de la cadena principal añadiendo un componente al sistema (la cadena de oligo-ADN complementaria unida al péptido de interés). Este principio se muestra en la Figura 1.

En una realización preferida, la matriz se puede usar como un andamio de células vivas con el fin de hacer crecer células en una estructura tridimensional que se parece al entorno natural. Las células, preferiblemente células humanas, que se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en condrocitos, osteoblastos, osteoclastos, células epiteliales de la piel, células epiteliales intestinales, células epiteliales corneales, astrocitos, neuronas, oligodendrocitos, células del músculo liso, células endoteliales, cardiomiocitos, células de islote pancreático, células epiteliales de riñón, células madre embrionarias, células madre pluripotentes; o células naive obtenidas del cordón umbilical.

La matriz de la presente invención se puede usar adicionalmente para fines experimentales, puesto que la interacción de las células y su comprensión adquieren cada vez más importancia en muchos campos de investigación biológica. Alternativamente, la matriz se puede usar con el fin de producir tejidos artificiales. Por ejemplo, se pueden hacer crecer células como se ha descrito antes con el fin de producir tejidos artificiales unidos tridimensionalmente que se pueden usar como implantes para el curado de varios defectos. Por ejemplo, se pueden producir estructuras óseas homólogas cultivando osteoblastos y/u osteoclastos en la matriz como se describe en el presente documento. Alternativamente, se puede producir piel o cartílago artificial. Puesto que el material es muy compatible con el sistema inmunitario, no se pueden esperar reacciones alérgicas inesperadas. Esto es especialmente cierto cuando se usan células homólogas para la preparación de tejidos artificiales.

La matriz de la presente invención se puede implantar en cavidades corporales de mamíferos tanto en presencia como en ausencia de factores de crecimiento. Estas cavidades pueden ser con o sin células.

Se pueden formar estructuras tubulares que se ponen en contacto con este tipo de células que forman vasos sanguíneos. Alternativamente, la matriz puede tener la forma de un disco y la matriz se pondrá en contacto con células que forman tejidos del cartílago. Puesto que las propiedades mecánicas tales como rigidez, falta de flexibilidad y viscosidad de la matriz se pueden controlar seleccionando la relación adecuada de agarosa modificada:polisacárido no modificado, en particular agarosa modificada:agarosa no modificada, las propiedades se pueden regular con mucha precisión. Otra ventaja de la presente invención es que la estructura tridimensional del tejido viene dada por la matriz. Por lo tanto, el espesor, longitud o cualquier otra forma deseada de la matriz se puede preparar usando una forma o molde adecuado. Para fines médicos, se prefiere esterilizar la agarosa. Esto se puede hacer mediante productos químicos adecuados o, más preferiblemente, por tratamiento térmico o por radiación.

Los métodos usados para esterilizar la agarosa no están particularmente limitados. Como agente químico adecuado para la esterilización se usa ventajosamente óxido de etileno. La agarosa también se puede esterilizar por un tratamiento con radiación ionizante, tal como rayos X, radiación y o con haz electrónico. Sin embargo, se prefiere particularmente llevar a cabo la esterilización de agarosa mediante un tratamiento térmico. Dicho tratamiento térmico se lleva a cabo ventajosamente en un autoclave a una temperatura de aprox. 121°C y presión de 1,1 bar de modo que se requiere un tiempo de esterilización de al menos 15 min. Alternativamente, la esterilización se puede llevar a cabo mediante una filtración usando un filtro estéril con tamaño de poros de menos de 0,5 gm, preferiblemente menos de 0,3 gm.

En otra realización de la presente invención, la matriz se puede usar como un implante de cirugía plástica para cirugía reconstructiva y cosmética en diversas regiones del cuerpo: en la región facial tal como una nariz, una frente, una mandíbula, una mejilla pero también en mama, una cadera, una pantorrilla y similares. Por ejemplo, en el caso de la corrección de la nariz, puesto que el pequeño implante se inserta entre el hueso nasal y el periostio, el material del implante debe ser lo suficientemente rígido de modo que el implante no se desvíe de su posición original. Sin embargo, en el caso de la corrección mamaria, se emplea un implante relativamente grande y un implante blando.

Las propiedades mecánicas de la matriz, tales como la rigidez y la rugosidad, se pueden ajustar como se ha indicado antes. Por lo tanto, las propiedades del implante de cirugía plástica que comprende la matriz se pueden ajustar convenientemente dependiendo del propósito previsto y usar en una amplia variedad de regiones corporales.

En otra realización más de la presente invención, la matriz se puede usar para producir formulaciones de liberación controlada de fármacos de componentes farmacéuticamente activos. Variando las propiedades mecánicas de la matriz, la formulación de liberación controlada de fármaco se puede adaptar al propósito deseado. Si, por ejemplo, la matriz es muy rígida, los agentes farmacéuticos que se incluyen dentro de la matriz serán suministrados después de implante en el cuerpo muy lentamente. Por otro lado, si la viscosidad y la rigidez de la matriz son bastante bajas, un agente farmacéutico que está atrapado en la matriz se liberará con bastante rapidez.

En una realización adicional de la presente invención, la matriz se puede usar con agentes farmacéuticamente activos tales como factores de crecimiento, insulina, péptidos biológicamente activos, quimioquinas, citoquinas, esteroides, antibióticos, analgésicos y agentes antiinflamatorios o fármacos antineoplásicos.

En una realización adicional, la matriz también se puede usar con fines de diagnóstico incluyendo agentes de formación de imágenes como p. ej. agentes de contraste para imágenes por resonancia magnética (IRM), agentes de contraste para tomografía computarizada (TC), sondas de imágenes fluorescentes o radionucleidos. Al incluir esos agentes en la matriz y después aplicar la matriz al cuerpo humano, los agentes están atrapados en la matriz y pueden ser liberados de manera controlada ajustando las propiedades de la matriz tales como la viscosidad, rigidez y forma que dependen del uso previsto.

También se pueden incluir en la matriz células que forman un tejido y agentes farmacéuticamente activos.

Otra realización de la presente invención se refiere al uso de la matriz como un aditivo alimentario. Dicho aditivo alimentario es útil para la preparación de alimentos, bebidas o condimentos. Preferiblemente, los alimentos, bebidas o condimentos contienen de 0,1 a 30% en peso del polisacárido de matriz con respecto al peso total de dicho alimento, bebida o condimento, más preferiblemente contienen de 0,5 a 25% en peso del polisacárido de matriz, de modo que se prefiere particularmente el contenido de 1 a 20% en peso del polisacárido de matriz. Los alimentos, bebidas o condimentos que contienen la matriz de la presente invención no están específicamente limitados. Por ejemplo, los ejemplos de dichos alimentos incluyen los siguientes: productos de cereales procesados (p. ej., productos de harina de trigo, productos de almidón, pudines premezclados, mermelada, fideos de trigo sarraceno, pan de gluten de trigo, ositos de gelatina, fideos de gelatina y pastel de arroz envasado), productos de grasa y aceite procesados (p. ej., margarina, aceite para ensaladas, mayonesa y aderezos), productos de soja procesados (p. ej., tofu, miso y soja fermentada), productos de carne procesados (p. ej., embutidos y salchichas), productos marinos procesados (p. ej., pescado congelado, pasta de pescado y palitos de pescado), productos lácteos (p. ej., leche cruda, nata, yogur, mantequilla, queso, leche condensada, leche en polvo y helado), productos de verduras y frutas procesados (p. ej., pasta, mermelada, encurtidos), y similares.

Debido a que los componentes de la matriz tienen una estabilidad química suficiente, el procedimiento para producir el alimento, bebida o condimento que contiene la matriz de la presente invención no se limita a uno específico. Se puede usar cualquier procedimiento incluyendo cocinar, procesar y otros procedimientos generalmente empleados para producir un alimento, bebida o condimento y los componentes de la matriz se pueden añadir antes, durante o después de la cocción o procesamiento, ya sea por separado o en forma de una matriz previamente preparada.

Es importante destacar que la cantidad, así como las propiedades de la matriz empleada para producir el alimento, bebida o condimento se pueden adaptar de acuerdo con la consistencia deseada de los productos resultantes. Por ejemplo, la preparación de ositos de goma requiere típicamente un mayor contenido de polisacáridos de matriz que la preparación de un pudín.

La matriz de la presente invención también se puede usar como un excipiente farmacéutico, por ejemplo, para la preparación de formulaciones farmacéuticas orales.

En otra realización, la matriz de la presente invención se usa como un componente de composiciones cosméticas tales como maquillaje, colorete, barra de labios, sombra de ojos, antitranspirantes, desodorantes y correctores. Las composiciones cosméticas comprenden de 0,1 a 50% en peso de polisacárido de matriz, preferiblemente de 0,5 a 30% en peso de polisacárido de matriz, incluso más preferido de 1 a 25% en peso y particularmente preferido de 2 a 20% en peso. El contenido de polisacárido de matriz se elige de acuerdo con las propiedades mecánicas deseadas de las composiciones cosméticas. Preferiblemente, las composiciones cosméticas se caracterizan por ser de una sola fase.

Preferiblemente, las composiciones cosméticas son sólidas o semisólidas a una temperatura de 25°C y tienen una consistencia tal que se pueden moldear en forma de barra. Para este fin, las composiciones se pueden calentar hasta fundir y después verter en un molde y enfriar. Alternativamente, las composiciones se pueden conformar en barras, pero se vierten en cubetas u otros tipos de formas de tortas o cremas para proporcionar ciertos beneficios al consumidor. Por ejemplo, una composición de sombra de ojos se puede moldear en forma de barra, pero normalmente se desea verterla en una cubeta para un uso más conveniente desde el punto de vista del consumidor.

Las propiedades físicas de las composiciones cosméticas resultantes se pueden ajustar convenientemente mediante una elección adecuada de los componentes de la matriz y por su cantidad en la composición.

En otra realización, la matriz de la presente invención se usa como un lubricante. Debido a que las propiedades de la matriz, tales como rigidez y temperatura de gelificación, se pueden ajustar convenientemente adaptando el grado de modificación del polisacárido modificado, la matriz de la presente invención es adecuada para una amplia variedad de aplicaciones industriales.

La concentración de los componentes polisacáridos de la matriz en la solución acuosa típicamente varía de 1 a 4% en peso, particularmente preferido de 1 a 3% en peso. En una realización particularmente preferida, la concentración de los componentes polisacáridos de la matriz en la solución acuosa varía de 1 a 2% en peso. Es incluso más preferido que esta concentración sea de aproximadamente 2% en peso.

La solución acuosa puede contener además otros compuestos, tales como sales o proteínas, en particular proteínas solubles en agua.

Realizaciones preferidas de la invención

La agarosa modificada se prepara a partir de agarosa por un protocolo sintético conocido en la técnica anterior. Se añade solución de NaOH a la mezcla de reacción durante la reacción con el fin de mantener el pH óptimo de 10,8 de la mezcla de reacción y neutralizar los ácidos carboxílicos que se forman. Como oxidante se usa (2,2,6,6-tetrametilpiperidin-1 -il)oxilo (TEMPO), que a su vez, se reactiva con hipocloruro de sodio NaOCI y en presencia de bromuro de potasio KBr como catalizador (Esquema 1). La adición de NaOH permite además seguir el progreso de la reacción y proporciona una caracterización cuantitativa de la cantidad de ácido carboxílico formado, ya que compensa la formación del resto ácido.

Por lo tanto, una relación entre el volumen de la solución de NaOH añadida y la relación de las unidades de repetición del disacárido en las que el grupo alcohol primario se oxida al grupo ácido carboxílico (ÜPÍ^Agarosa) se describe por la Ecuación 1.

m-Ag arosa y

^{w A} u r i Agarosa = n NaOH

w n Agarosa

(1)

en donde

mAgarosa es la masa de la agarosa,

MnAgarosa es el peso molecular medio numérico de la agarosa usada como material de partida, y

nNaOH es la cantidad de solución de NaOH añadida.

Al final de la reacción de oxidación, se añade borohidruro de sodio NaBH4 a la mezcla de reacción. Por lo tanto, los grupos aldehído que resultan de una oxidación incompleta de los grupos alcohol primario se reducen de nuevo a los grupos alcohol primario.

Con el fin de tener un resultado preciso y fiable, a la reacción de oxidación le seguían varias técnicas diferentes. Como un primer análisis cualitativo, las muestras de la mezcla de reacción se liofilizaron y se analizaron por MAS-RMN 13C. Los espectros de MAS-RMN 13C obtenidos muestran la aparición de un pico a 180 ppm, característico del átomo de carbono carbonílico de los grupos de ácido carboxílico, y la desaparición del pico a 55 ppm que es característico del átomo de carbono del grupo alcohol primario (Figura 2A).

Se utilizó espectrometría infrarroja FTIR como método cuantitativo. Los espectros de FTIR de la mezcla de reacción muestran el aumento de la relación entre los picos a 1650 cm-1: banda de vibración del doble enlace carbono-oxígeno (C = O) del grupo ácido carboxílico y 1360 cm-1: la banda de vibración del enlace carbono-oxígeno (C-OH) del grupo alcohol primario (Figura 2B). Las cantidades relativas de los grupos de ácido carboxílico y de los grupos de alcohol primario se pueden calcular integrando los picos de interés y usando la Ecuación (2).

en donde

I Vc=o es el área bajo el pico de absorción de C=O,

I V^{c -o h} es el área bajo el pico de absorción de C-OH y

%Oxidación es el grado de conversión de la reacción de oxidación.

La formación de grupos ácido carboxílico a lo largo de la cadena principal del polisacárido también se vigiló midiendo la cantidad de solución de NaOH consumida durante la reacción de oxidación y luego por análisis cuantitativo usando espectrometría de FTIR. Con el fin de comparar ambos métodos analíticos, se representó gráficamente la cantidad de solución de NaOH añadida a la mezcla de reacción frente al grado de conversión calculado determinado por FTIR. Una relación lineal entre estos valores confirma la precisión de ambos métodos analíticos y verifica la reproducibilidad de la reacción de oxidación (Figura 2C).

Se supone que la incorporación de ligandos en los grupos alcohol primario de la posición C6 en la D-galactosa de la unidad que se repite de la agarosa conduce a un módulo de cizalladura (G') más bajo y una temperatura de gelificación más baja. Con el fin de investigar de qué manera la introducción de grupos de ácido carboxílico en la cadena principal del polisacárido induce el cambio de propiedades mecánicas y de gelificación, los autores de la presente invención llevaron a cabo un estudio reológico sistemático de los geles.

El punto de gelificación, también llamado temperatura de gelificación, se determina por la igualdad de los módulos de cizalladura de almacenamiento respecto al de pérdida a una frecuencia de cizalladura y deformación constantes con la disminución de la temperatura, como se muestra en la Figura 3A. En comparación con la técnica de la botella invertida, el barrido de temperatura es una medida objetiva que da un valor más preciso. Como se puede reconocer fácilmente en la Figura 3C, un aumento del grado de modificación de un polisacárido reduce su temperatura de gelificación de forma lineal. En particular, la temperatura de gelificación de la agarosa nativa es de 40°C (no se muestra en la Figura 3C), mientras que la temperatura de gelificación de la agarosa modificada que tiene 93% de modificación es de 5°C.

Este fenómeno se puede usar para ajustar la temperatura de gelificación del gel con el fin de adaptarlo a una aplicación particular. Por lo tanto, también la temperatura de gelificación de la matriz de la presente invención se puede ajustar eficazmente ajustando el grado de modificación del polisacárido modificado.

Además, la agarosa forma un hidrogel que tiene un comportamiento histerético, es decir, la formación de puntos físicos reticulados se producía a una temperatura más baja que la descomposición del gel. Esta característica del gel conduce a una estabilidad térmica mejorada de la matriz correspondiente y lo convierte en un material prometedor para aplicaciones biológicas.

La rigidez del gel se puede caracterizar haciendo un barrido de frecuencia, cizalladura del gel a una deformación y temperatura constante con un aumento de frecuencia. En reología, un estado de gel se puede definir como un estado en el que tanto el módulo de cizalladura como el de pérdida son independientes de la frecuencia de cizalladura, Figura 3C. La modificación de la cadena principal del polisacárido induce una cizalladura y módulos de pérdida menores, lo que da como resultado un gel más débil. Este debilitamiento de la red polimérica parece estar relacionado con la incorporación de grupos ácido carboxílico, ya que la pérdida de grupos alcohol primario da como resultado una pérdida lineal de rigidez (Figura 3D).

La rigidez versátil de estos geles se puede comparar con la rigidez del tejido humano. Además, los valores del módulo de cizalladura de la matriz de la presente invención también son comparables con los de tejidos humanos. Se ha descrito que el módulo de cizalladura de la célula circundante varía desde 105 Pa para los huesos hasta 101 Pa para los nervios. El orden de magnitud de la rigidez del gel cubierto por la diferente proporción de modificación varía de 104 Pa para un gel al 2% en p/v de agarosa nativa a 102 Pa para un gel 93%modificado de la misma concentración. Por lo tanto, la adaptación del grado de modificación del polisacárido modificado permite una adaptación eficaz de la ECM resultante para una amplia variedad de tejidos humanos.

Se sabe que la cadena principal de la agarosa se pliega en una hélice a y que el gel se forma por la agregación de estas hélices. La pérdida de rigidez de los diferentes geles para una concentración determinada podría atribuirse a una pérdida de agregación de la hélice a. Además, la pérdida de la turbidez del gel atribuida a las estructuras amorfas formadas por los agregados refuerza la hipótesis de una pérdida del punto de reticulación (Figura 4).

Se ha sugerido en la bibliografía que el punto reticulado físico formado en el hidrogel de agarosa se puede asimilar como nanopartículas esféricas y después caracterizar con dispersión de luz estática (SLS). Parece que el aumento del grado de modificación a lo largo de la cadena principal del polímero disminuye notablemente el tamaño de este punto reticulado y también su polidispersidad dando como resultado agregados más pequeños de una distribución de tamaños más pequeña, véase la Figura 5F. Estos resultados apoyan la hipótesis de menor agregación de hélice a, pero la pérdida de polidispersidad también es una cuantificación de la organización del agregado. La disminución de la polidispersidad pone de manifiesto que los agregados están organizados en una forma más regular.

Por otro lado, la medición del potencial zeta da información de las cargas móviles presentes en la superficie del polímero. Parece que el aumento de la modificación es linealmente proporcional al aumento del potencial zeta, véase la Figura 5E. El aumento del potencial zeta transcribe la incorporación de cargas de repulsión entre las cadenas de polímero que podrían afectar a la agregación de los dominios de hélice a.

En el pasado, la hélice a de la agarosa se ha caracterizado usando espectroscopía de dicroísmo circular (CD). El espectro de CD de la agarosa nativa está compuesto por un solo pico a 185 nm que es característico de una conformación de hélice a de la estructura secundaria. Con el fin de comprender el mecanismo de gelificación de la agarosa modificada, se ha medido el CD para varias preparaciones de agarosa modificada que tienen diferentes grados de modificación. Parece que el pico característico para una hélice a se desplaza a una longitud de onda más alta y aparece un nuevo pico a 203 nm, véase la Figura 5A. La hipótesis de un número menor de agregados de hélice a conducirá a una elipticidad reducida en la zona de hélice a del espectro, pero el desplazamiento del espectro a otra zona sugiere un cambio del plegamiento de la agarosa modificada.

La analogía de la conformación de polisacáridos con el plegamiento de proteínas da una indicación de la nueva estructura secundaria de la agarosa modificada. De hecho, el pico en la zona de 203 nm corresponde a la organización de proteínas en lámina p. El estudio consistente de diferentes geles modificados destaca que la aparición del nuevo pico es linealmente proporcional a la cantidad de grupos ácido carboxílico a lo largo de la cadena principal del polisacárido, véase la Figura 5C. La modificación del grupo alcohol primario al grupo ácido carboxílico induce claramente un cambio de la estructura secundaria en la agarosa que todavía es capaz de formar un gel a baja temperatura.

El espectro de CD de la agarosa modificada se ha medido a dos temperaturas diferentes, a 5°C donde la agarosa modificada está por debajo de su temperatura de transición de sol-gel y a 90°C por encima de su temperatura de transición de gel-sol. Parece que a alta temperatura el nuevo pico a 203 nm desaparece. La agarosa modificada forma un gel que depende de la temperatura, de modo que la dependencia de la temperatura del nuevo pico sugiere que la dependencia del gel ahora está dirigida por esta nueva organización y ya no por la agregación de la hélice a.

Es importante que la agarosa no es el único polisacárido que presenta una estructura de hélice a. De hecho, también se sabe que miembros de la familia de las carrageninas, por ejemplo, la K-carragenina, se organizan en hélices a y también forman geles físicos que dependen de la temperatura.

Los autores de la presente invención llevaron a cabo el mismo estudio espectroscópico para caracterizar la kcarragenina que se ha oxidado en la misma posición, según el mismo protocolo que la agarosa. El pico de la kcarragenina no modificada y la agarosa no modificada son de signo opuesto debido a la diferente rotación de la hélice, pero ambos están en la misma longitud de onda. Las curvas de CD obtenidas para la k-carragenina modificada presentan el mismo nuevo pico a la misma longitud de onda de 203 nm, véase la Figura 5D. La posibilidad de obtener el mismo comportamiento de CD para dos polisacáridos de la misma familia implica que la modificación de estos grupos alcohol primario en estos polímeros puede ser un método general para inducir una estructura similar a una lámina p en los polisacáridos.

Con el fin de validar estas hipótesis se realizó una simulación de dinámica molecular (MD) de dos cadenas principales de polisacáridos de más de 15 ns. Estudios anteriores sobre polisacáridos han demostrado la relevancia de la simulación de MD. Es de gran importancia validar el modelo de la nueva organización de la agarosa modificada. La raíz de la desviación cuadrática media (RDSD) de la geometría desde su posición inicial muestra que después de 2 ns se obtiene una conformación estable. Es importante el que esta conformación permanece estable hasta el final de la simulación, véase la Figura 6A. Con el fin de caracterizar la distancia entre las dos cadenas de polisacáridos, se ha calculado la formación de un enlace de hidrógeno (enlace H) entre estas dos cadenas. La formación de un enlace de H está dirigida por la distancia de un átomo electronegativo a un átomo de hidrógeno. Se ha sumado cada enlace H en cada ventana y esta suma se ha representado gráficamente en función del tiempo. Por lo tanto, una suma de enlaces de H estables transcribe que no hay presencia de ningún enlace de H, véase la Figura 6B.

Este cálculo muestra que la agarosa nativa es capaz de formar enlaces de H a lo largo de toda la simulación, pero las cadenas de agarosa totalmente modificadas no forman ningún enlace de H después de 5 ns, destacando que las dos cadenas de polímero están demasiado lejos una de otra con el fin de poder interaccionar juntas de esta manera. La no interacción de las dos cadenas de polímero confirma los datos obtenidos del potencial zeta que muestran fuerzas de repulsión entre las dos cadenas.

La pregunta principal que debe ser respondida por la simulación es la posibilidad física y geométrica de formar una estructura de lámina p. En estudios anteriores, la conformación de los ciclos de azúcar de la cadena del polímero se ha analizado usando un gráfico de Ramachandran. El ángulo diedro del enlace glicosídico se puede representar y comparar con la cartografía obtenida para el plegamiento de proteínas. La agarosa nativa tiene su ángulo diedro formado por la unión anhidrogalactopiranosa/galactosa de la cadena 1 y la unión galactosa/anhidrogalactopiranosa de la cadena 2 en el dominio de hélice a, véase la Figura 6C. Las mismas uniones en la agarosa modificada tienen sus ángulos diedros en la zona de la lámina p del gráfico, véase la Figura 6D. El cambio de zona de los ángulos diedros que cambian de la posición de la hélice a a la ubicación de la lámina p muestra que esta organización sugerida del otro análisis es posible.

Las animaciones creadas por el software dan una idea sobre la posición de las cadenas de polímeros a lo largo del tiempo de simulación. La conformación del polímero del primer marco se ha obtenido a partir de los datos de rayos X de la agarosa. Los dos polímeros se han modelado con la misma conformación inicial. Parece que las cadenas de la agarosa nativa permanecen juntas a lo largo del tiempo de simulación, pero las cadenas de la agarosa modificada se repelen entre sí y colocan sus grupos ácido carboxílico opuestos entre sí.

Por lo tanto, la simulación de MD confirma la posibilidad de esta conformación de lámina p. En cuanto a los datos de CD, la gráfica de los ángulos diedros se basa en la teoría desarrollada para las proteínas. El uso del área específica del gráfico de Ramachadran con el fin describir el plegamiento de proteínas solo se ha usado hasta ahora para proteínas. A medida que la organización de las cadenas de polímero cambia de una agregación de hélice a a una lámina p, el impacto en la macroestructura del material no debería ser despreciable.

Los autores llevaron a cabo una investigación de la macroestructura del gel usando microscopía electrónica de barrido ambiental (ESEM), véase la Figura 7, A1 a D1. La mayor dificultad en el estudio de geles es la dificultad para poner de manifiesto la estructura hidratada de la red polimérica. Por lo tanto, se han usado muestras liofilizadas para el ESEM. El cambio de estructura entre la agarosa nativa y la modificada muestra un cambio radical de su estructura. Las fibras no ordenadas de la agarosa nativa dejan el sitio a una estructura fibrilar muy ordenada a medida que aumenta el porcentaje de modificación de la cadena principal del polímero. Las fibras no ordenadas se acoplan con una zona pequeña ordenada en la muestra modificada en un 28%. El gel modificado en un 60% está más ordenado y pone de manifiesto todavía pequeños dominios de fibras no ordenadas, pero el gel modificado en un 93% está totalmente ordenado en láminas.

En resumen, los autores de la presente invención encontraron que la modificación de un polisacárido conduce a un cambio de su estructura terciaria.

Esta nueva organización de polisacáridos es sorprendente. Las imágenes obtenidas por los autores validan la hipótesis de una nueva estructura de plegamiento pero, además, confirman la organización en lámina p de las cadenas de polímero. La espectroscopia de CD mostraba que la modificación de los grupos alcohol primario de la D-galactosa de la unidad de repetición de la agarosa conduce al mismo cambio de plegamiento de la estructura secundaria.

Se obtuvieron imágenes de la estructura de los hidrogeles de k-carragenina siguiendo el mismo protocolo que para la agarosa. La imagen de ESEM pone de manifiesto que la modificación de los grupos alcohol primario de la kcarragenina conduce a las mismas estructuras altamente ordenadas que forman láminas delgadas del mismo tipo que para los geles de agarosa modificados en un 93%.

En resumen, los autores mostraron para dos polisacáridos diferentes de la misma familia que se produce el mismo cambio de organización cuando los grupos alcohol primario se oxidan a grupos ácido carboxílico. Estos resultados fomentan la posibilidad de un método general para modificar la organización de los polisacáridos y predecir su estructura secundaria basándose en los modelos de proteínas ya existentes, véase la Figura 7, A4, A5, D4 y D5.

Las células que se cultivan en un sustrato bidimensional muestran una dependencia de la rugosidad del sustrato. Por lo tanto, la superficie del gel se ha caracterizado en un estado semiseco usando microscopía de fuerza atómica (AFM). La AFM puede poner de manifiesto la rugosidad de la superficie. Las imágenes de altura resaltan una pérdida del relieve, a medida que aumenta la modificación, véase la Figura 7, de A2 a D2. La reconstrucción tridimensional permite visualizar claramente la pérdida de rugosidad, véase la Figura 7, de A2 a D2. El cálculo matemático de la rugosidad de la superficie del gel parece estar relacionado linealmente con la cantidad de ácido carboxílico en la cadena principal del polímero, véase la Figura 7E.

La pérdida de rugosidad se puede explicar por los puntos reticulados más pequeños, agregados calculados con el experimento de dispersión de luz, que se forman en los geles modificados. La superficie es más lisa y la organización en láminas mostradas por la ESEM se correlaciona con la explicación de un gel más liso que tiene fibras más ordenadas en una dirección unilateral.

Descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra un esquema que ilustra las estrategias para la preparación de polisacáridos modificados. En el cuadro del lado izquierdo se muestran las modificaciones realizadas por el proveedor. En el cuadro del lado derecho se representan dos mezclas hechas por el usuario final.

La Figura 2A muestra los espectros de MAS-RMN-13C de la agarosa modificada (negro) y la agarosa nativa (gris).

La Figura 2B muestra los espectros de FTIR de la agarosa modificada (negro) y la agarosa nativa (gris).

La Figura 2C es un gráfico del porcentaje de modificación determinado por FTIR frente a la cantidad de solución de NaOH añadida a la mezcla de reacción como una media de 12 reacciones. Las barras de error representan la desviación estándar.

La Figura 3A muestra un barrido de temperatura de agarosa nativa (negro) y agarosa 60% modificada (gris), los puntos grises representan G' y los triángulos grises representan G".

La Figura 3B muestra un barrido de frecuencia de agarosa nativa (negro) y agarosa 60% modificada (gris), los puntos grises representan G' y los triángulos grises representan G".

La Figura 3C representa un gráfico que muestra la relación entre la temperatura de gelificación de la agarosa modificada y el porcentaje de modificación. Las barras de error representan la desviación estándar.

La figura 3D es un diagrama que muestra el módulo de cizalladura G' de muestras de agarosa que tienen diferente porcentaje de modificación. Las barras de error representan la desviación estándar.

Figura 4 Fotografías de geles que contienen 2% en p/v respectivamente: A agarosa 93% modificada; B agarosa 60% modificada; C agarosa 28% modificada; D agarosa nativa.

La Figura 5A muestra un espectro de CD de agarosa nativa (negro) y agarosa 93% modificada (gris).

La Figura 5B muestra un espectro de CD de agarosa 93% modificada a 5°C (discontinuo) y agarosa 93% modificada a 90°C (continuo).

La Figura 5C muestra el CD de geles de agarosa que tienen un grado diferente de modificación a 203 nm. Las barras de error representan la desviación estándar.

La Figura 5D muestra los espectros de CD de agarosa nativa (negro discontinuo), agarosa 93% modificada (gris discontinuo), k-carragenina nativa (negro continuo), k-carragenina 93% modificada (gris continuo).

La Figura 5E muestra un gráfico del potencial zeta (mV) de agarosas modificadas frente a sus grados de modificación. Las barras de error representan la desviación estándar.

La Figura 5F muestra gráficos de polidispersidad (negro) y tamaño (gris) medidos por dispersión de luz de soluciones diluidas de diferentes agarosas modificadas frente a sus grados de modificación. Las barras de error representan la desviación estándar.

La Figura 6A muestra una RMSD del primer marco para agarosa nativa (negro) y agarosa 100% modificada (gris). La Figura 6B representa la suma de enlaces de H acumulados entre las dos cadenas de polisacárido durante la simulación de MD para agarosa nativa (negro) y agarosa 100% modificada (gris).

La Figura 6C muestra un gráfico de Ramachandran de la unión AG de agarosa nativa en la cadena 1 y la unión GA en la cadena 2.

La Figura 6D muestra un gráfico de Ramachandran de la unión AG de agarosa totalmente modificada de la cadena 1 y unión GA en la cadena 2.

Figura 7. Columna A : polisacárido nativo, B 28% de modificación, C 60% de modificación, D 93% de modificación; la fila 1 es la ESEM de gel de agarosa liofilizada al 2% en p/v; la fila 2 es la imagen de AFM de la altura de los geles de agarosa, la fila 3 es la reconstrucción 3D de las imágenes de AFM; la fila 4 es la ESEM de geles de k-carragenina liofilizados al 2% en p/v con aumento bajo; la fila 5 es la ESEM de k-carragenina liofilizada al 2% en p/v con aumento grande, E es un diagrama que muestra la rugosidad de la superficie de la muestra de AFM de geles de agarosa representada frente al porcentaje de modificación.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos no limitantes ilustrarán realizaciones representativas de la invención en detalle.

Descripción de los métodos

a) Espectroscopia infrarroja

Los espectros de FTIR se han registrado en un espectrómetro de FT-IR Vector 22 de Brucker en gránulos de KBr a 20°C. Los gránulos se prepararon con 2 mg de la sustancia en 200 mg de KBr, después se trituraron y se prensaron bajo una presión de 10 toneladas durante 10 min.

b) Resonancia magnética nuclear

Los espectros de RMN con giro en ángulo mágico se registraron a temperatura ambiente (20°C) en estado sólido usando un espectrómetro Avance DRX 500 de Brucker. Para este propósito, las muestras liofilizadas se pusieron en un soporte cerámico y se centrifugaron a 7500 U/s.

c) Reología

Los experimentos de reología se llevaron a cabo con un reómetro MCR Anton Paar Physica MCR 301 equipado con una celda de temperatura Peltier.

Las muestras se prepararon al 2% en p/v en agua desionizada, se calentaron a 90°C y se agitaron durante 10 min hasta que se obtuvo una solución transparente. Después, se vertió el líquido sobre la placa del reómetro, precalentada a 80°C, usando una pipeta. La solución se dejó estabilizar durante 10 minutos antes de que se iniciara el registro. Se usó una herramienta de placa de Anton Paar: PPR25 para todos los experimentos. La transición sol-gel y el barrido de frecuencia se hicieron usando la misma muestra en un solo ciclo: equilibrio de 10 min a 80°C, enfriamiento a 5°C en 30 min y registro de G' y G" cada 1,5°C a 1 rad/s con una deformación de 10%, estabilizado a 5°C durante 30 min, calentado a 37°C y estabilizado durante 30 min, después el barrido de frecuencia se registró a 37°C aumentando la frecuencia de rotación desde 0,01 rad/s a 10 rad/s a lo largo de 30 min con una deformación de 10%. La temperatura de transición sol-gel se calculó como la temperatura en donde tan 0 = 0.

d) Dicroísmo circular

Los espectros de dicroísmo circular se obtuvieron usando un espectropolarímetro J-810 de Jasco equipado con una celda de temperatura Peltier PFD-425S de Jasco. Se preparó una solución de agarosa al 0,15% en p/v en agua Milli-Q a 90°C durante 15 min y después la solución se enfrió a 5°C en la cámara de CD durante 30 min antes de la medición. Cada espectro se registró tres veces y los espectros obtenidos se sumaron. Cada espectro para una modificación dada es una media de tres lotes obtenidos por tres síntesis diferentes.

e) Dispersión de luz dinámica

Las mediciones de dispersión de luz dinámica (DLS) se llevaron a cabo en un analizador de partículas Delsa™ Nano C de Beckman Coulter con una cubeta de poliestireno de 1 cm. Se disolvió agarosa en agua Milli-Q a 90°C durante 15 min para obtener una solución al 0,15% en p/v que se enfrió a temperatura ambiente durante un día. La dispersión de luz se hizo a 15°C y las muestras se equilibraron durante 30 min antes de la medición. Para cada valor se realizaron tres mediciones y se calculó un promedio. Cada punto es una media de tres lotes obtenidos por tres síntesis diferentes.

f) Potencial Zeta

El potencial Zeta se midió en un analizador de partículas de Delsa™ Nano C de Beckman Coulter. Se usaron las mismas soluciones que para el experimento de dispersión de luz. Las mediciones se hicieron en una celda de flujo que se alineó con el láser antes de cada medición. Cada medición se hizo tres veces y se calculó un promedio. Cada espectro para una modificación dada es una media de tres lotes obtenidos por tres síntesis diferentes.

g) ESEM

Las imágenes de ESEM se obtuvieron con geles de agarosa ref. Se prepararon soluciones al 2% en p/v y se liofilizaron 2 ml de estas soluciones durante 24 horas con un vacío de 0,1 mbar en un vial de vidrio de 5 ml. Las muestras se cortaron verticalmente y se obtuvieron imágenes del interior de la muestra con diferentes aumentos. Las imágenes mostradas aquí son imágenes representativas de diferentes zonas de una muestra dada con diferentes aumentos, que se reprodujeron con tres geles diferentes preparados a partir de diferentes lotes.

h) AFM

Las imágenes AFM se obtuvieron con un microscopio de sonda de barrido Veeco Dimension 2100. Las muestras se prepararon en un soporte de vidrio de microscopio de 3 mm que se había pasivado previamente. El portaobjetos de vidrio se lavó con una solución de NaOH 0,1 M y se secó en el horno. A continuación, los portaobjetos secos se pasivaron con unas gotas de diclorometilsilano. Se emparejaron entres sí dos portaobjetos para tener una pasivación uniforme. Después de 10 minutos, los portaobjetos se lavaron con agua y se eliminó por lavado con jabón el exceso de diclorometilsilano después de lo cual los portaobjetos se secaron. El lado de los portaobjetos se preparó de forma hidrófoba. Se prepararon muestras de agarosa como geles al 2% en p/v y se vertieron 25 gl de la solución obtenida en un portaobjetos de vidrio sin modificar. Después, un portaobjetos pasivado con diclorometilsilano se ajustó encima de la solución. Se pusieron portaobjetos de 0,5 mm como espaciadores entre el portaobjetos de vidrio hidrófobo y el normal, después todo el montaje se dejó gelificar durante 30 min a 4°C. Después se retiró el portaobjetos superior (hidrófobo) y se obtuvo una fina capa de gel de agarosa. Después, este gel se dejó estabilizar a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de la medición con el fin de evitar cualquier encogimiento o dilatación del gel durante la medición.

i) Simulaciones de dinámica molecular

Las simulaciones de MD se hicieron usando el paquete Desmond del Maestro, Versión 8.5 de Schrodinger. La conformación inicial se obtuvo a partir de la estructura de rayos X de la agarosa que se descargó de la biblioteca de la base de datos de proteínas (PDB). La agarosa modificada se extrajo del archivo de PDB directamente dentro del software Maestro. Se construyó el modelo de agua implícito usando la herramienta Desmond, dando como resultado una construcción de caja cuadrada de 10 Á siguiendo el modelo de solución TIP3. Las simulaciones se realizaron en el modelo NPV a 300°K a presión atmosférica durante 15 ns. El análisis de los resultados se hizo usando el software VMD y las herramientas disponibles en el paquete estándar.

j) Análisis elemental

Las muestras se han analizado en un analizador de elementos Elementar Vario EL

Ejemplo 1. Modificación de agarosa

La agarosa tipo I se obtuvo de Calbiochem. El (2,2,6,6-tetrametilpiperidin-1-il)oxilo (TEMPO), NaOCI, NaBHU, NaBr, 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y ácido 2-(W-morfolino)etanosulfónico (MES) se obtuvieron de Sigma Aldrich y se usaron tal como se recibieron. La solución de NaOH 0,5 M así como la solución de HCl 5 M se prepararon de nuevo cada tres meses. Se usó etanol de calidad técnica sin ninguna purificación adicional. Se usó agua desionizada para síntesis no estéril.

La agarosa se modificó en condiciones estériles: todos los productos químicos se disolvieron en agua tratada en autoclave y se filtraron con un filtro de 0,2 gm. Todo el material de vidrio se trató en autoclave y la reacción se llevó a cabo bajo un flujo laminar. La agarosa (1 g) se trató en autoclave en agua MilliQ. La agarosa tratada en autoclave se vertió en un matraz de fondo redondo de 3 bocas, que se usó como reactor. Se ajustó un agitador mecánico a una de las bocas. Se ajustó un medidor de pH a otra boca del matraz de fondo redondo. Después, la mezcla de reacción se enfrió a 0-5°C y se agitó enérgicamente. Se añadió TEMPO (0,160 mmol, 20,6 mg), también se vertieron NaBr (0,9 mmol, 0,1 g) y NaOCI (2,5 ml, solución al 15%) dentro del reactor. La solución resultante se ajustó a pH = 10,8 con una solución de HCl y NaOH. El pH se mantuvo a 10,8 añadiendo una solución de NaOH. Al final de la reacción se añadió NaBH⁴ (0,1 g) y se alcanzó pH = 8. La solución se agitó durante 1 hora y se añadieron NaCl (0,2 mol, 12 g) y etanol (500 ml). La agarosa precipitó y se extrajo en un embudo. Después, las dos capas se filtraron sobre un vidrio sinterizado. Después, la agarosa se dializó en membranas Spectra Pore 4, MWCO = 12-14000 durante 2 días y el agua se cambió dos veces. Antes de la diálisis, las membranas se dejaron durante la noche en una solución de etanol al 70%, 2 horas antes de su uso se enjuagaron en agua tratada en autoclave. Finalmente, el producto se puso en un liofilizador Christ LD 2-8 LD plus a 0,1 mbar para el secado principal y a 0,001 mbar durante la fase de desorción. Las muestras se pusieron en un matraz de botella redonda y se congelaron en un baño de nitrógeno líquido en un rotavapor modificado para este fin. Se obtuvo una capa fina de solución congelada en la pared del matraz reduciendo el tiempo de liofilización.

Ejemplo 2. Modificación de k-carragenina para comparación

La K-carragenina se obtuvo de Sigma Aldrich y se usó como estaba. La K-carragenina se sometió a una oxidación mediada por TEMPO, de acuerdo con el protocolo sintético del Ejemplo 1.

La k-carragenina modificada resultante se dializó y liofilizó, como se especifica en el Ejemplo 1 anterior.

Ejemplo 3. Mezcla de agarosa modificada con agarosa no modificada

Se prepararon mezclas de agarosa modificada y agarosa nativa en diferentes proporciones. Las mezclas resultantes se estudiaron usando espectrometría de CD. Los resultados obtenidos indican que la mezcla de dos polisacáridos conduce al mismo cambio en la estructura terciaria que el polisacárido modificado. Esto sugiere que estos dos polisacáridos son miscibles y se pueden usar para diseñar nuevas matrices.

Los estudios de reología muestran un comportamiento específico del gel. De hecho, los geles mezclados tienen un módulo de cizalladura más alto que el gel de agarosa no modificado. Estos resultados sugieren que la organización de las cadenas modificadas con las cadenas no modificadas sigue un nuevo mecanismo, que es diferente de la agarosa modificada.

La imagen de ESEM ilustra la estructura de los geles y pone de manifiesto una organización diferente de las fibras que para la agarosa no modificada. También para la rugosidad de la superficie, la rugosidad de los geles mezclados no depende de la proporción lo que sugiere un nuevo mecanismo de organización.

Ejemplo 4. Unión covalente de péptido a agarosa modificada

El péptido GGGGRGDSP se obtuvo de Peptide International.

La funcionalización de agarosa con el péptido G⁴RGDSP se hizo por acoplamiento del péptido con EDC. Se disolvió agarosa (30 mg, 0,25 gmol) en agua tratada en autoclave; todos los productos químicos y el tampón se esterilizaron en un filtro de 0,2 pm, se añadió tampón MES y la solución alcanzó un pH = 4. Se le añadió el péptido (500 pg), seguido de EDC (200 mg) y la solución resultante se agitó durante dos horas a 40°C para evitar cualquier formación de gel. A continuación, la solución se dializó en Spectra Pore 4 MWCO = 12-14 kDa, de modo que el agua se cambió tres veces. Posteriormente, la muestra se liofilizó. Antes de la diálisis, las membranas se dejaron durante la noche en una solución de etanol al 70%, 2 horas antes de usar se enjuagaron en agua tratada en autoclave.

Ejemplo 5: Uso de matriz extracelular modificada para ensayos biológicos

Cultivo de células:

Se prepararon geles modificados en una concentración de 2% en p/v en medio DMEM y se calentaron a 60°C durante 30 minutos con el fin de evitar cualquier degradación del péptido RGD. La temperatura se ajustó a 37°C y el medio de cultivo se completó con los nutrientes y citoquinas habituales. Los condrocitos humanos se obtuvieron de ATCC y se usaron entre los pases 3 y 5. La solución de agarosa se mezcló con las células y después se sembró en una placa de 48 pocillos. La placa después se almacenó a 4°C durante hasta 30 min con el fin de permitir que se produjera la transición sol-gel. Después, las placas se cultivaron en una incubadora a 37°C, 4% de CO² durante dos semanas.

Factor de forma celular:

Todas las imágenes se tomaron en un Axio Observer A1, de Carl Zeiss, equipado con un filtro de contraste de interferencia diferencial (DIC). Las imágenes se tomaron después de 1, 5 y 14 días con diferentes aumentos en diferentes zonas de la muestra. Después, se midieron el perímetro de la célula y el área de la célula y se calculó el factor de forma celular (CSF). Los resultados son una media de tres lotes diferentes de agarosa modificada con péptidos que se repitieron dos veces, lo que representa un total de 6 pocillos. Por pocillo se midieron más de 100 células con el fin de tener un CSF significativo.

PCR en tiempo real:

A los 7 días, 14 días y 21 días de cultivo celular en el gel, se eliminó el medio y los geles se congelaron a -80°C durante la noche. Después, los sólidos obtenidos se trituraron y se digirieron con un tampón CT AB. Después se extrajeron usando los kits de Qiagen.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Uso de una matriz que comprende una agarosa modificada en donde al menos 11 % de los grupos hidroxilo primario se oxidan a un grupo ácido carboxílico, como un componente de composiciones cosméticas.

2. Uso de una matriz que comprende una agarosa modificada en donde al menos 11% de los grupos hidroxilo primario se oxidan a un grupo ácido carboxílico, como un aditivo alimentario.

3. Uso de una matriz que comprende un polisacárido modificado que consiste en unidades de disacárido que se repiten, de modo que en al menos 11% de las unidades de disacárido un grupo alcohol primario se oxida a un grupo ácido carboxílico, como lubricante para fines industriales.

4. Uso de una matriz que comprende un polisacárido modificado que consiste en unidades de disacárido que se repiten, de modo que en al menos 11% de las unidades de disacárido un grupo de alcohol primario se oxida a un grupo ácido carboxílico para el acondicionamiento de líquidos.

5. Uso de una matriz que comprende una agarosa modificada en donde al menos 11% de los grupos hidroxilo primario se oxidan a un grupo ácido carboxílico, como un implante de cirugía plástica.

6. Uso de una matriz que comprende una agarosa modificada en donde al menos 11% de los grupos hidroxilo primario se oxidan a un grupo ácido carboxílico, como un implante de liberación controlada de fármaco.

7. Implante de cirugía plástica que comprende una matriz que comprende una agarosa modificada en donde al menos 11% de los grupos hidroxilo primario se oxidan a un grupo ácido carboxílico.

8. Implante de liberación controlada de fármaco que comprende una matriz que comprende una agarosa modificada en donde al menos 11% de los grupos hidroxilo primarios se oxidan a un grupo ácido carboxílico.