ES2879023T3 - Niveles en ayunas de la hormona de crecimiento como marcador predictivo de riesgo cardiovascular - Google Patents

Abstract

Un método para predecir el riesgo cardiovascular en el plazo de 2,5 años en un sujeto, que comprende: - determinar el nivel en ayunas de la hormona de crecimiento (hGH), y/o sus isoformas en un fluido corporal obtenido de dicho sujeto; y - correlacionar dicho nivel en ayunas de la hormona de crecimiento (hGH), y/o sus isoformas con un riesgo cardiovascular, en donde un mayor nivel es predictivo de un mayor riesgo, en donde el riesgo cardiovascular se define como un evento adverso y en donde el riesgo de dicho evento adverso se predice en un plazo de 2,5 años y en donde el riesgo cardiovascular se define como un evento adverso seleccionado del grupo que comprende accidente cerebrovascular, ECV (enfermedad cardiovascular)-mortalidad y enfermedad arterial coronaria (EAC) en donde la última comprende infarto de miocardio mortal o no mortal, muerte por cardiopatía isquémica, intervención coronaria percutánea (ICP) o derivación de arteria coronaria por injerto (CABG).

Description

DESCRIPCIÓN

Niveles en ayunas de la hormona de crecimiento como marcador predictivo de riesgo cardiovascular

El objeto de la presente invención es un método para predecir el riesgo cardiovascular o el riesgo de mortalidad general en un sujeto, que comprende:

• determinar el nivel en ayunas de la hormona de crecimiento (hGH), y/o sus isoformas en un fluido corporal obtenido de dicho sujeto; y

• correlacionar dicho nivel en ayunas de la hormona de crecimiento (hGH), y/o sus isoformas con un riesgo cardiovascular o el riesgo de mortalidad general, en donde un mayor nivel es predictivo de un mayor riesgo. La hormona de crecimiento (hGH) se secreta por la glándula pituitaria anterior y muchas, pero no todas, de sus acciones metabólicas se ejercen a través de IGF-1, {1}. Además de regular el crecimiento óseo longitudinal durante la niñez y la adolescencia, la hGH ejerce efectos metabólicos durante toda la vida, tales como en un estado anabólico, actuando con la insulina para estimular el IGF-1 dando como resultado la síntesis y el anabolismo de proteínas. En el estado catabólico, la hGH estimula la lipólisis y, por lo tanto, previene la degradación de las proteínas y el agotamiento de las reservas de glucógeno {1}. En las últimas décadas el papel de la hGH en el sistema cardiovascular adulto ha atraído un interés creciente, principalmente en las situaciones de deficiencia y exceso de hGH.

Se reconoce que los adultos hipopituitarios tienen una mayor mortalidad en enfermedades cardiovasculares y cerebrovasculares y esto se ha atribuido a la deficiencia de la hormona de crecimiento (GHD) para muchas {2}, {3}, {4}, pero no todas {5} de dichas enfermedades. Al comparar pacientes con GHD con individuos sanos, se ha demostrado que los pacientes con GHD tienen un perfil de riesgo cardiovascular adverso con colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL-C) {6}, {7}, índice de masa corporal (IMC) {6} y la relación cintura-cadera altos {6}, {8} y disminución del colesterol unido a lipoproteínas de alta densidad (HDL-C) {4}. La terapia de sustitución de hGH en estos pacientes ha mostrado un efecto favorable en varios aspectos del perfil de riesgo cardiovascular, por ejemplo disminuye la PCR, la grasa corporal, la relación cintura-cadera, la grasa del tronco y aumenta HDL-C {9}, {6}, {10}, así como disminuye LDL-C y la presión arterial diastólica {11}. Aunque los efectos sobre la homeostasis de la glucosa pueden ser negativos {11}, {1}, con estos antecedentes es tentativo suponer que la sustitución de la hGH es beneficiosa; sin embargo, hasta la fecha, no existen grandes estudios prospectivos aleatorizados controlados con placebo para demostrar el efecto de la sustitución de hGH sobre la morbilidad o mortalidad cardiovascular.

En el otro extremo del espectro, los pacientes con acromegalia, que sufren de una secreción excesiva de hormona de crecimiento, también presentan tasas elevadas de mortalidad en enfermedades cardiovasculares y cerebrovasculares {12}. Los factores que contribuyen a esta mortalidad se encuentran en la mayor prevalencia de hipertensión, diabetes, arritmias y miocardiopatía con hipertrofia del corazón {13}, {14}. La inhibición de la secreción de hGH con análogos de somatostatina en estos pacientes ha mostrado efectos beneficiosos sobre la estructura y el rendimiento del corazón {15}. El estudio de Takala et al. en 1999 realiza otra demostración de los efectos perjudiciales del exceso de hGH, donde la administración de altas dosis de hGH a pacientes críticamente enfermos en una unidad de cuidados intensivos duplica las tasas de mortalidad en comparación con el placebo {16}.

La mayor parte de la bibliografía se refiere a pacientes con exceso o deficiencia de hGH. Sin embargo, el estudio prospectivo de policías franceses comenzó a finales de los 60 y principios de los 70 con un seguimiento de 18 años, examinó los valores de ayuno de hGH y el riesgo de mortalidad prematura. Sus hallazgos muestran que los niveles más altos de hGH después de una prueba de tolerancia a la glucosa oral de 2 h se asocian con un mayor riesgo de mortalidad prematura para todas las causas y trastornos cardiovasculares, la hGH en ayunas (medida con la prueba estándar de hGH no era significativa para la predicción de la mortalidad {17}. Empleando un valor umbral de 0,5 ng/ml, Maison et al. encontraron un aumento de la mortalidad cardíaca a los 18 años con un Riesgo de 1,79. La interpretación precisa de la concentración plasmática de hGH se ve obstaculizada por el hecho de que la hGH se libera en pulsos durante la mayor parte del día y en las horas de la mañana, cuando la concentración plasmática es relativamente estable {32}, {33}, {34}, las concentraciones de hGH son bajas y, a veces, indetectables empleando ensayos de hGH convencionales.

En la presente divulgación se describe un ensayo de ultrasensibilidad para mediciones de hGH en plasma (hGH), con mediciones precisas también a concentraciones plasmáticas bajas de hGH (por ejemplo, sensibilidad del ensayo 2 pg/ml). El objeto de la presente invención es la correlación del desarrollo de morbilidad y mortalidad cardiovascular con la hGH en plasma en ayunas en un sujeto. El objeto de la presente invención es la relación de la hGH en el plasma en ayunas de un sujeto y el riesgo de enfermedad arterial coronaria (EAC), accidente cerebrovascular, mortalidad por todas las causas (total), y mortalidad cardiovascular (ECV).

El objeto de la presente invención es un método para predecir el riesgo cardiovascular o el riesgo de mortalidad total en un sujeto, que comprende:

■ determinar el nivel en ayunas de la hormona de crecimiento (hGH), y/o sus isoformas en un fluido corporal obtenido de dicho sujeto; y

■ correlacionar dicho nivel en ayunas de la hormona de crecimiento (hGH), y/o sus isoformas con un riesgo cardiovascular o el riesgo de mortalidad total, en donde un mayor nivel es predictivo de un mayor riesgo.

Riesgo cardiovascular o riesgo de mortalidad total significa el riesgo de sufrir un evento por razones cardiovasculares o el riesgo de morir por todas las causas en un plazo de 2,5 años.

El objeto de la presente invención es un método para predecir en un sujeto el riesgo cardiovascular o el riesgo de mortalidad total en un plazo de 2,5 años, que comprende:

■ determinar el nivel en ayunas de la hormona de crecimiento (hGH), y/o sus isoformas en un fluido corporal obtenido de dicho sujeto; y

■ correlacionar dicho nivel en ayunas de la hormona de crecimiento (hGH), y/o sus isoformas con un riesgo cardiovascular o el riesgo de mortalidad total, en donde un mayor nivel es predictivo de un mayor riesgo, en donde el riesgo cardiovascular se define como un evento adverso o el riesgo de mortalidad total y en donde el riesgo de dicho evento adverso o el riesgo de mortalidad total se predice dentro de los 2,5 años después de tomar dicho fluido corporal de dicho sujeto.

En una realización, dicho sujeto es un sujeto sano en el momento de la medición o un sujeto que no tiene una enfermedad cardiovascular en el momento de la medición. En una realización, dicho sujeto nunca ha tenido un accidente cerebrovascular y/o infarto de miocardio y/o insuficiencia cardíaca aguda en el momento de la medición. En una realización, dicho sujeto nunca ha tenido enfermedad arterial coronaria (EAC) y/o cardiopatía isquémica y/o intervención coronaria percutánea (ICP) o derivación de arteria coronaria por injerto (CABG, de sus siglas en inglés) en el momento de la medición.

El riesgo de mortalidad total es el riesgo de morir por todas las causas, es el riesgo de muerte dentro de un determinado período de tiempo.

En una realización específica de la invención, el riesgo cardiovascular se define como un evento seleccionado del grupo que comprende accidente cerebrovascular, mortalidad por ECV (enfermedad cardiovascular) y enfermedad arterial coronaria (EAC) en donde esta última comprende infarto de miocardio mortal o no mortal, muerte debido a enfermedad cardiaca isquémica, intervención coronaria percutánea (ICP) o derivación de arteria coronaria por injerto (CABG). En una realización la mortalidad por ECV (enfermedad cardiovascular) es la mortalidad debida a infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca aguda o accidente cerebrovascular. Esto significa que la mortalidad por ECV (enfermedad cardiovascular) es la muerte debida a una enfermedad cardiovascular. En una realización específica la ECV (enfermedad cardiovascular) se selecciona del grupo que comprende infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca aguda y accidente cerebrovascular.

El riesgo cardiovascular o el riesgo de mortalidad total es una predicción a corto plazo de dicho riesgo.

Esto significa que se predice el riesgo de que un sujeto sufra un evento asociado a un riesgo cardiovascular o de morir por todas las causas (mortalidad total) en un corto plazo, en donde dicho corto plazo significa dentro de un plazo de 2,5 años.

El sorprendente hallazgo de la presente invención es que es posible un pronóstico a corto plazo del riesgo cardiovascular o del riesgo de mortalidad total determinando el nivel en ayunas de la hormona de crecimiento (hGH), y/o sus isoformas en un fluido corporal. Corto plazo significa dentro de los 2,5 años después de tomar dicho fluido corporal de dicho sujeto.

La predicción de la mortalidad por ECV es una predicción a corto plazo. Esto significa que se predice el riesgo de que un sujeto muera debido a un infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca aguda o accidente cerebrovascular en un corto plazo, en donde dicho corto plazo significa dentro de 2,5 años.

En una realización más específica, la predicción de la mortalidad por ECV es una predicción a corto plazo para un sujeto masculino. Esto significa en una realización más específica que se predice el riesgo de que un sujeto masculino muera debido a un infarto de miocardio, una insuficiencia cardíaca aguda o un accidente cerebrovascular en un corto plazo, en donde dicho corto plazo significa dentro de 2,5 años.

Las isoformas de la hormona de crecimiento (hGH) se pueden seleccionar del grupo que comprende la isoforma 1 de hGH (22KD), la isoforma 2 de hGH, la isoforma 3 de hGH, y la isoforma 4 de hGH.

Secuencias de las isoformas:

SEQ ID NO.1: hGH Isoforma 1 (22 KD) MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSAFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFE EA YIPKEQKY SFLQNPQT SLCF SESIPTP SNREETQQKSNLELLRISLLLIQ SWLEP V QFLR S VF AN SL VY GASD SNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRT GQIFKQT Y SKFDTN SH NDD ALLKNY GLL Y CFRKDMDKVETFLRIVQCRS VEGSCGF SEQ ID NO.2: hGH Isoforma 2 MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSAFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFN PQ TSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSN VYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQT Y SKFDTNSHNDD ALLKNY GLL Y CF RKD MDKVETFLRIVQCRS VEGSCGF SEQ ID NO.3: hGH Isoforma 3 MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSAFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFE EA YIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQTLMGRLEDGS PRTGQIFKQTY SKFDTN SHNDD ALLKNY GLL Y CFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSC GF SEQ ID NO.4: hGH Isoforma 4 MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSAFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFE EA YIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQIFK QTY SKFDTN SHNDD ALLKNY GLLY CFRKDMDKVETFLRIVQCRS VEGSCGF

Niveles en ayunas de hormona de crecimiento (hGH) significa el nivel de hormona de crecimiento (hGH) determinado en sangre, suero o plasma de sujetos en ayunas (12 horas sin ingesta de alimentos previa toma de la muestra). Sujeto en ayunas significa un sujeto que 12 horas antes de la toma de la muestra no tomó alimentos. El término "sujeto", como se emplea en la presente memoria, se refiere a un organismo vivo humano o no humano. Preferiblemente en la presente memoria, el sujeto es un sujeto humano. El sujeto puede estar sano o enfermo si no se indica lo contrario. El término "nivel elevado" significa un nivel por encima de un determinado nivel umbral.

Se puede seleccionar un fluido corporal del grupo que comprende sangre, plasma, suero, saliva, orina, y fluido cerebroespinal. En una realización específica, dicho fluido corporal se selecciona del grupo que comprende sangre, plasma, y suero.

La sensibilidad del ensayo se puede definir por la sensibilidad del ensayo "analítico" que se define como la concentración de hGH (lectura de la curva estándar) a una señal media de, por ejemplo, 20 determinaciones de muestra reducida de hGH 2 desviaciones estándar (SD, de sus siglas en inglés).

Alternativamente, la sensibilidad del ensayo se puede definir mediante la sensibilidad del ensayo "funcional", que refleja más el límite de detección en una rutina clínica. La sensibilidad del ensayo funcional se define como la determinación del coeficiente de variación (CV) entre ensayos del plasma (muestras de pacientes) en una variedad de muestras individuales con diferentes concentraciones de hGH. La sensibilidad del ensayo funcional es la concentración de hGH más baja con un CV entre ensayos de menos del 20%.

Las sensibilidades del ensayo pueden depender del método de calibración y del ensayo de hGH empleados. Diferentes ensayos de hGH pueden detectar diferentes conjuntos de isoformas de hGH, lo que conduce a diferentes resultados cuantitativos, lo que significa que conducen a diferentes umbrales y necesidades de sensibilidad dependiendo del ensayo y del método de calibración empleado.

Para superar esta posible heterogeneidad de diferentes ensayos de hGH, las calibraciones del ensayo se pueden corregir correlacionando los valores de hGH en plasma de sujetos individuales. Si la pendiente de la curva de correlación es diferente de 1, los valores de hGH (la calibración) se pueden corregir mediante el factor diferencial que conduce a una calibración comparable, un análisis de sensibilidad comparable y umbrales comparables.

La corrección anterior se puede realizar para comparar los resultados obtenidos mediante diferentes ensayos.

El ensayo descrito en el ejemplo 1 reconoce predominantemente la isoforma 1 de hGH y está calibrado por la hormona de crecimiento humana recombinante (código NIBSC 98/574, Instituto Nacional de Estándares y Control Biológicos, Herfordshire, Reino Unido).

En un método específico según la invención, dicho nivel en ayunas de la hormona de crecimiento (hGH), y/o sus isoformas en un fluido corporal se determina mediante un ensayo ultrasensible que tiene una sensibilidad de ensayo analítico (que se define como la concentración de hGH a una señal media de 20 determinaciones de muestra agotada de hGH 2 desviaciones estándar (SD)) de menos de 100 pg/ml, preferiblemente menos de 50 pg/ml, preferiblemente menos de 30 pg/ml, preferiblemente menos de 20 pg/ml, preferiblemente menos de 10 pg/ml, preferiblemente menos de 5 pg/ml, preferiblemente 2 pg/ml. La medición de hGH se expresa en ng/ml (1 ng/ml=2,6 mU/l).

Alternativamente, el ensayo ultrasensible tiene una sensibilidad de ensayo funcional (ver arriba) de menos de 400 pg/ml, preferiblemente menos de 200 pg/ml, preferiblemente menos de 120 pg/ml, preferiblemente menos de 80 pg/ml, preferiblemente menos de 40 pg/ml, preferiblemente menos de 20 pg/ml, preferiblemente 10 pg/ml, lo más preferiblemente menos de 8,5 pg/ml. La medición de hGH se expresa en ng/ml.

Para la inmunización y para la calibración empleamos hormona de crecimiento humana recombinante (código NIBSC 98/574, Instituto Nacional de Estándares y Control Biológicos, Herfordshire, Reino Unido).

En una realización de la invención dicho ensayo se realiza como se describe en el Ejemplo 1.

Dicho ensayo puede ser selectivo para una isoforma de hGH específica o puede ser específico y determinar más de uno o todos los isómeros secretados de hGH seleccionados del grupo que comprende la Isoforma 1, la Isoforma 2, la Isoforma 3, y la Isoforma 4 de hGH (véase SEQ ID NO.1-4) en dicho fluido corporal.

En una realización del método según la invención, dicho método se realiza más de una vez para controlar el riesgo cardiovascular en un sujeto o para controlar el curso del tratamiento.

En una realización del método según la invención dicha monitorización se realiza para evaluar la respuesta de dicho sujeto a las medidas preventivas y/o terapéuticas tomadas.

En una realización del método según la invención, dicho método se emplea para estratificar a dichos sujetos en grupos de riesgo y/o reclasificar dichos sujetos sobre los marcadores de riesgo clásicos.

En una realización de la invención dicho sujeto es varón y el umbral es de más de 400 pg/ml, preferiblemente 340 pg/ml, hasta 100 pg/ml, preferiblemente 60 pg/ml, en donde un nivel en ayunas de hormona de crecimiento (hGH), y/o sus isoformas por encima de un umbral de 400 pg/ml, preferiblemente 340 pg/ml, es predictivo de un alto riesgo y un nivel en ayunas por debajo de un umbral de 100 pg/ml, preferiblemente 60 pg/ml, es predictivo de un bajo riesgo.

En otra realización de la invención dicho sujeto es una mujer y el umbral es de 3150 pg/ml, preferiblemente hasta 400 pg/ml, en donde un nivel en ayunas de la hormona de crecimiento (hGH), y/o sus isoformas por encima de un umbral de 3150 pg/ml es predictivo de un alto riesgo y un nivel en ayunas por debajo de un umbral de preferiblemente 400 pg/ml es predictivo de un bajo riesgo.

En una realización de la invención dicho riesgo cardiovascular se selecciona de infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca aguda y accidente cerebrovascular.

En otra realización, se determina adicionalmente al menos un parámetro clínico en donde dicho parámetro clínico se selecciona del grupo que comprende: edad, presencia de diabetes mellitus, consumo de tabaco.

En una realización específica de los métodos de la presente invención, adicionalmente se determina al menos un biomarcador adicional en el fluido corporal de dicho sujeto y se correlaciona con dicho riesgo cardiovascular, en donde dicho biomarcador adicional se selecciona del grupo que comprende: pro-Neurotensina 1-117 (PNT 1-117), proteína C reactiva (PCR), pro-péptido natriurético cerebral 1 -108 (pro-BNP) 1-108, Pro-BNP, BNP, péptido natriurético proauricular 1-98 (fragmento terminal del proANP-N), Pro-ANP, Adrenomedulina, pro-adrenomedulina (proADM) 24-71, ProADM 127-164, pro-péptido natriurético auricular (pro-ANP) y fragmentos de los mismos que tienen al menos una longitud de cinco aminoácidos, ST-2, GDF15, galectina-3, copeptina.

El objeto según la presente invención es un método en donde el nivel en ayunas de la hormona de crecimiento (hGH), y/o sus isoformas se determina empleando un aglutinante de la hormona de crecimiento (hGH), y/o sus isoformas. Los biomarcadores adicionales mencionados anteriormente se pueden determinar empleando un aglutinante para dichos biomarcadores o sus fragmentos como se describe anteriormente.

En una realización de la invención, dicho aglutinante se selecciona del grupo que comprende un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un armazón que no es Ig que se une a la hormona de crecimiento (hGH), y/o a sus isoformas.

Según la invención, el aglutinante de diagnóstico se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos, por ejemplo, IgG, una inmunoglobulina de longitud completa típica, o fragmentos de anticuerpo que contienen al menos el dominio variable F de la cadena pesada y/o ligera como, por ejemplo, anticuerpos acoplados químicamente (fragmento de unión al antígeno) que incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab que incluyen minicuerpos Fab, anticuerpo Fab monocatenario, anticuerpo Fab monovalente con marcadores de epítopo, por ejemplo, Fab-V5Sx2; Fab bivalente (mini-anticuerpo) dimerizado con el dominio CH3; Fab bivalente o Fab multivalente, por ejemplo, formado mediante multimerización con la ayuda de un dominio heterólogo, por ejemplo, mediante dimerización de dominios dHLX, por ejemplo, Fab-dHLX-FSx2; fragmentos F(ab')2, fragmentos scFv, fragmentos scFv multivalentes y/o multiespecíficos multimerizados, diacuerpos bivalentes y/o biespecíficos, BITE® (acoplador de células T biespecíficas), anticuerpos trifuncionales, anticuerpos polivalentes, por ejemplo, de una clase diferente a la G; anticuerpos de dominio único, por ejemplo, nanocuerpos derivados de inmunoglobulinas de camélidos o peces. En una realización específica, el nivel del biomarcador anterior o fragmentos del mismo se mide con un ensayo que emplea aglutinantes seleccionados del grupo que comprende aptámeros, armazones que no son de Ig, como se describe con mayor detalle a continuación que se unen a hGH o fragmentos de la misma.

El aglutinante que se puede emplear para determinar el nivel de cualquiera de los anteriores biomarcadores o fragmentos de los mismos muestra una constante de afinidad a la región de unión de cualquiera de los biomarcadores anteriores de al menos 107 M-1, preferiblemente 108 M-1, preferiblemente una constante de afinidad superior a 109 M-1, lo más preferiblemente mayor de 1010 M-1. Una persona experta en la técnica sabe que se puede considerar compensar una menor afinidad aplicando una mayor dosis de compuestos y esta medida no saldría del alcance de la invención. La afinidad de unión se puede determinar empleando el método Biacore, ofrecido como análisis de servicio, por ejemplo, en Biaffin, Kassel, Alemania (http://www.biaffin.com/de/).

Constantes de afinidad.

Para determinar la afinidad de los anticuerpos, se determinó la cinética de unión de la hGH al anticuerpo inmovilizado mediante resonancia de plasmón superficial sin marcador empleando un sistema Biacore 2000 (GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Alemania). La inmovilización reversible de los anticuerpos se realizó empleando un anticuerpo Fc anti-ratón acoplado covalentemente en alta densidad a una superficie del sensor CM5 según las instrucciones del fabricante (kit de captura de anticuerpos de ratón; GE Healthcare) {59}.

Además de los anticuerpos, en la técnica se conocen bien otros armazones de biopolímeros para complejar una molécula diana y se han empleado para la generación de biopolímeros altamente específicos de diana. Algunos ejemplos son aptámeros, espiegelmeros, anticalinas y conotoxinas. Los armazones que no son de Ig pueden ser armazones de proteínas y se pueden emplear como imitadores de anticuerpos, ya que son capaces de unirse a ligandos o antígenos. Los armazones que no son de Ig se pueden seleccionar del grupo que comprende armazones que no son de Ig basados en tetranectina (por ejemplo, descritos en la Patente US 2010/0028995), armazones de fibronectina (por ejemplo, descritos en la Patente E^p 1266 025; armazones a base de lipocalina (por ejemplo, descritos en la Patente WO 2011/154420); armazones de ubiquitina, por ejemplo, descritos en la Patente W^o 2011/073214), traspaso de armazones (por ejemplo, descritos en la Patente US 2004/0023334), armazones de proteína A (por ejemplo, descritos en la Patente EP 2231860), armazones basados en repetición de anquirina (por ejemplo, descritos en la Patente WO 2010/060748), armazones de microproteínas, preferiblemente microproteínas que forman un nudo de cistinas) (por ejemplo descritos en la Patente EP 2314308), armazones basados en el dominio Fyn SH3 (por ejemplo, descritos en la Patente WO 2011/023685) armazones basados en el dominio EGFR-A (por ejemplo, descritos en la Patente WO 2005/040229) y armazones basados en el dominio Kunitz (por ejemplo, descritos en la Patente EP 1941867).

El objeto de la presente invención también es un método para predecir el riesgo cardiovascular, la mortalidad debido a eventos cardiovasculares o el riesgo de mortalidad total en un sujeto según cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde el nivel de hormona de crecimiento (hGH), y/o de sus isoformas en un fluido corporal obtenido de dicho sujeto, se emplea ya sea en solitario o en combinación con otros parámetros clínicos o de laboratorio útiles para el pronóstico, que se pueden seleccionar de las siguientes alternativas:

• Comparación con la media del nivel de hGH o fragmentos de la misma de al menos 5 aminoácidos en un fluido corporal obtenido de dicho sujeto en un conjunto de muestras predeterminadas en una población de sujetos "sanos" o "aparentemente sanos",

• Comparación con un cuantil del nivel de hGH o fragmentos de la misma de al menos 5 aminoácidos en un fluido corporal obtenido de dicho sujeto en un conjunto de muestras predeterminadas en una población de sujetos "sanos" o "aparentemente sanos",

• Cálculo basado en el análisis de riesgos proporcionales de Cox o mediante el empleo de cálculos de índice de riesgo, tales como el NRI (índice de mejoría neta de reclasificación) o el IDI (índice de discriminación integrado).

En una realización específica de los métodos según la presente invención dicho sujeto es una mujer y se determina un biomarcador adicional además de la hGH y sus isómeros en el fluido corporal de dicho sujeto femenino y se correlaciona con dicho riesgo cardiovascular, en donde dicho biomarcador adicional es pro-Neurotensina (PNT) y fragmentos de la misma que tienen al menos una longitud de cinco aminoácidos.

En una realización de la invención puede tratarse del denominado ensayo POCT (point-of-care, punto de atención), que es una tecnología de ensayo que permite realizar la prueba en menos de 1 hora cerca del paciente sin el requisito de un sistema de ensayo totalmente automatizado. Un ejemplo de esta tecnología es la tecnología de ensayo inmunocromatográfica.

En una realización de la invención, dicho ensayo es un inmunoensayo tipo sándwich que emplea cualquier tipo de tecnología de detección que incluye, pero no se limita a, marcaje enzimático, marcador de quimioluminiscencia, marcaje de electroquimioluminiscencia, preferiblemente un ensayo completamente automatizado. En una realización de la invención, dicho ensayo es un ensayo sándwich marcado con enzima. Ejemplos de ensayos automatizados o completamente automatizados comprenden ensayos que se pueden emplear para uno de los siguientes sistemas: Roche Elecsys®, Abbott Architect®, Siemens Centauer®, Brahms Kryptor®, Biomerieux Vidas®, Alere Triage®. Se conocen una variedad de inmunoensayos y se pueden emplear para los ensayos y métodos de la presente invención, éstos incluyen: radioinmunoensayos ("RIA"), inmunoensayos homogéneos de multiplicación de enzimas ("EMIT"), ensayos de inmunoadsorción ligados a enzimas ("ELISA"), inmunoensayo de reactivación de apoenzimas ("ARIS"), inmunoensayos con tira reactiva y ensayos de inmunocromatografía.

En una realización de la invención, al menos uno de dichos dos aglutinantes se marca para ser detectado.

Los métodos de detección preferidos comprenden inmunoensayos en varios formatos, tales como, por ejemplo, radioinmunoensayo (RIA), inmunoensayos de quimioluminiscencia y fluorescencia, inmunoensayos ligados a enzimas (ELISA), matrices de perlas basadas en Luminex, ensayos de micromatrices de proteínas, y formatos de ensayo rápido, tales como, por ejemplo, ensayos de tiras inmunocromatográficas.

En una realización preferida, dicho marcador se selecciona del grupo que comprende marcador quimioluminiscente, marcador enzimático, marcador de fluorescencia, marcador de yodo radiactivo.

Los ensayos pueden ser ensayos homogéneos o heterogéneos, ensayos competitivos y no competitivos. En una realización, el ensayo tiene la forma de un ensayo sándwich, que es un inmunoensayo no competitivo, en donde la molécula a detectar y/o cuantificar se une a un primer anticuerpo y a un segundo anticuerpo. El primer anticuerpo se puede unir a una fase sólida, por ejemplo,, una perla, una superficie de un pocillo u otro recipiente, un chip o una tira, y el segundo anticuerpo es un anticuerpo que está marcado, por ejemplo, con un colorante, con un radioisótopo o un reactivo o resto catalíticamente activo. A continuación, se mide mediante un método apropiado la cantidad de anticuerpo marcado unido al analito. La composición general y los procedimientos implicados en los "ensayos sándwich" están bien establecidos y son conocidos por el experto en la técnica {23}.

En otra realización, el ensayo comprende dos moléculas de captura, preferiblemente anticuerpos que están presentes como dispersiones en una mezcla de reacción líquida, en donde un primer componente de marcaje se une a la primera molécula de captura, en donde dicho primer componente de marcado es parte de un sistema de marcado basado en extinción o amplificación de fluorescencia o quimioluminiscencia, y un segundo componente de marcado de dicho sistema de marcado se une a la segunda molécula de captura, de modo que al unirse ambas moléculas de captura al analito se genera una señal medible que permite la detección de los complejos sándwich formados en la disolución que comprende la muestra.

En otra realización, dicho sistema de marcado comprende criptatos de tierras raras o quelatos de tierras raras en combinación con un tinte de fluorescencia o un tinte de quimioluminiscencia, en particular un tinte del tipo cianina.

En el contexto de la presente invención, los ensayos basados en fluorescencia comprenden el empleo de tintes, que se pueden seleccionar, por ejemplo, del grupo que comprende FAM (5-o 6-carboxifluoresceína), VIC, ⁿ E^d , Fluoresceína, Fluoresceinisotiocianato (FITC), iRD-700/800, tintes de cianina, tales como CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, Cy7, Xanteno, 6-Carboxi-2',4',7',4,7-hexaclorofluoresceína (HEX), TET, 6-Carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetodifluoresceína (JOE), N,N,N',N'-Tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA), 6-Carboxi-X-rodamina (ROX), 5-carboxirodamina-6G (R6G5), 6-carboxirodamina-6G (RG6), rodamina, verde rodamina, rojo rodamina, rodamina 110, tintes BODIPY, tales como BODIPY TMR, verde Oregon, cumarinas, tales como umbeliferona, benzimidas, tales como Hoechst 33258; Fenantridinas, tales como Rojo Texas, Amarillo Yakima, Alexa Fluor, PET, Bromuro de Etidio, tintes de acridinio, tintes de Carbazol, tintes de Fenoxazina, tintes de Porfirina, tintes de Polimetina, y similares.

En el contexto de la presente invención, los ensayos basados en quimioluminiscencia comprenden el empleo de tintes, basados en los principios físicos descritos para los materiales quimioluminiscentes en {24}. Los tintes quimioluminiscentes preferidos son los acridinumésteres.

Como se menciona en la presente memoria, un "ensayo" o "ensayo de diagnóstico" puede ser de cualquier tipo aplicado en el campo del diagnóstico. Tal ensayo se puede basar en la unión de un analito a detectar a una o más sondas de captura con cierta afinidad. Con respecto a la interacción entre las moléculas de captura y las moléculas diana o moléculas de interés, la constante de afinidad es preferiblemente superior a 108 M-1.

En el contexto de la presente invención, las "moléculas aglutinantes" son moléculas que se pueden emplear para unir moléculas diana o moléculas de interés, es decir, analitos (es decir, en el contexto de la presente invención PCT y fragmentos del mismo), a partir de una muestra. Por lo tanto, las moléculas aglutinantes se deben configurar adecuadamente, tanto espacialmente como en términos de características superficiales, tales como carga superficial, hidrofobicidad, hidrofilicidad, presencia o ausencia de donantes y/o aceptores de Lewis, para unir específicamente las moléculas diana o moléculas de interés. De este modo, la unión puede estar mediada, por ejemplo, por interacciones iónicas, van-der-Waals, pi-pi, sigma-pi, hidrófobas o de enlace de hidrógeno o una combinación de dos o más de las interacciones mencionadas anteriormente entre las moléculas de captura y las moléculas diana o moléculas de interés. En el contexto de la presente invención, las moléculas aglutinantes se pueden seleccionar, por ejemplo, del grupo que comprende una molécula de ácido nucleico, una molécula de carbohidrato, una molécula de PNA, una proteína, un anticuerpo, un péptido o una glicoproteína. Preferiblemente, las moléculas aglutinantes son anticuerpos, incluyendo fragmentos de los mismos con suficiente afinidad por una diana o molécula de interés, e incluyendo anticuerpos recombinantes o fragmentos de anticuerpos recombinantes, así como derivados modificados químicamente y/o bioquímicamente de dichos anticuerpos o fragmentos derivados de la cadena variante con una longitud de al menos 12 aminoácidos de la misma.

El marcador quimioluminiscente puede ser un marcador de éster de acridinio, marcadores de esteroides que implican marcadores de isoluminol, y similares.

Los marcadores enzimáticos pueden ser lactato deshidrogenasa (LDH), creatina quinasa (CPK), fosfatasa alcalina, aspartato aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ALT), fosfatasa ácida, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, etc.

En una realización de la invención, al menos uno de dichos dos aglutinantes está unido a una fase sólida como partículas magnéticas, y superficies de poliestireno.

En una realización de los ensayos para determinar el nivel de hormona de crecimiento (hGH), y/o sus isoformas en una muestra según la presente invención, dicho ensayo es un ensayo en sándwich, preferiblemente un ensayo completamente automatizado. Puede ser un ELISA totalmente automatizado o manual. Puede ser el denominado ensayo POCT (punto de atención). Ejemplos de ensayos automatizados o completamente automatizados comprenden ensayos que se pueden emplear para uno de los siguientes sistemas: Roche Elecsys®, Abbott Architect®, Siemens Centauer®, Brahms Kryptor®, Biomerieux Vidas®, Alere Triage®. Más arriba se proporcionan ejemplos de formatos de ensayo.

En una realización de los ensayos para determinar el nivel de hormona de crecimiento (hGH), y/o sus isoformas en una muestra según la presente invención, al menos uno de dichos dos aglutinantes se marca para ser detectado. Se proporcionan anteriormente ejemplos de marcadores.

En una realización de los ensayos para determinar el nivel de hormona de crecimiento (hGH), y/o sus isoformas en una muestra según la presente invención, al menos uno de dichos dos aglutinantes se une a una fase sólida. Se proporcionan anteriormente ejemplos de fases sólidas.

En una realización de los ensayos para determinar el nivel de hormona de crecimiento (hGH), y/o sus isoformas en una muestra según la presente invención, dicho marcador se selecciona del grupo que comprende marcador quimioluminiscente, marcador enzimático, marcador de fluorescencia, marcador de yodo radiactivo.

También se describe en la presente memoria un kit que comprende un ensayo como se describe en la presente divulgación, en donde los componentes de dicho ensayo se pueden comprender en uno o más recipientes.

Según la presente invención, dicho sujeto puede tener una comorbilidad, que puede ser una enfermedad o un evento seleccionado del grupo que comprende aterosclerosis, presión arterial alta, insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio.

En una realización preferida de la invención, dicho nivel en ayunas de la hormona de crecimiento (hGH), y/o sus isoformas, se mide con un inmunoensayo. En una realización aún más preferida, dicho inmunoensayo comprende al menos un anticuerpo, preferiblemente dos anticuerpos, que tienen una afinidad de unión de 10-8M o menos.

También se describe en la presente divulgación un ensayo ultrasensible (us-hGH) que comprende al menos un aglutinante monoespecífico, preferiblemente dos aglutinantes monoespecíficos, que tienen una afinidad de unión de 10-8M o menos para hGH y/o sus isoformas y en donde el ensayo ultrasensible tiene una sensibilidad del ensayo analítico de menos de 100 pg/ml, preferiblemente menos de 50 pg/ml, preferiblemente menos de 30 pg/ml, preferiblemente menos de 20 pg/ml, preferiblemente menos de 10 pg/ml, preferiblemente menos de 5 pg/ml, preferiblemente 2 pg/ml.

En un aspecto específico del ensayo de hGH ultrasensible, dicho aglutinante monoespecífico es un anticuerpo monoclonal.

El ensayo de hGH ultrasensible como se describe en la presente memoria se emplea en el método según la presente invención.

Ejemplos

Ejemplo 1, ensayo us-hGH

Productos químicos

Si no se indica lo contrario, se obtuvieron productos químicos de grado práctico (PA). de Merck (Darmstadt, Alemania).

Antígeno

Para la inmunización y para la calibración se empleó hormona de crecimiento humana recombinante (código NIBSC 98/574, Instituto Nacional de Estándares y Control Biológicos, Herfordshire, Reino Unido).

Desarrollo de anticuerpos

UNICUS (Karlsburg, Alemania) desarrolló anticuerpos monoclonales de ratón frente a la hGH.

Los anticuerpos se generaron según el siguiente método:

Se inmunizó un ratón BALB/c con 100 pg de hGH los días 0 y 14 (emulsionado en 100 pl de adyuvante completo de Freund) y 50 pg los días 21 y 28 (en 100 pl de adyuvante incompleto de Freund). Tres días antes de que se realizara el experimento de fusión, el animal recibió 50 pg del conjugado disuelto en 100 pl de disolución salina, administrado como una inyección intraperitoneal y una intravenosa.

Los esplenocitos del ratón inmunizado y las células de la línea celular de mieloma SP2/0 se fusionaron con 1 ml de polietilenglicol al 50% durante 30 segundos 37°C. Después del lavado, las células se sembraron en placas de cultivo celular de 96 pocillos. Los clones híbridos se seleccionaron cultivando en medio HAT [medio de cultivo RPMI 1640 enriquecido con suero de ternero fetal al 20% y suplemento HAT]. Después de dos semanas, el medio HAT se reemplaza con medio HT durante tres pases seguido del regreso al medio de cultivo celular normal.

Los sobrenadantes del cultivo celular se cribaron principalmente para el cribado de anticuerpos IgG específicos de antígeno tres semanas después de la fusión. Los microcultivos positivos ensayados se transfirieron a placas de 24 pocillos para su propagación. Tras someter a ensayo nuevamente, los cultivos seleccionados se clonaron y se volvieron a clonar empleando la técnica de dilución limitante y se determinaron los isotipos. {60}, {61}.

Producción de anticuerpos monoclonales

Seleccionamos 5 anticuerpos para posteriores investigaciones.

Los anticuerpos se produjeron mediante métodos estándar de producción de anticuerpos (Marx et al., Monoclonal Antibody Production (1997), ATLA 25, 121) y se purificaron mediante cromatografía de proteína A. Las purezas de los anticuerpos eran >95% en base al análisis de electroforesis en gel SDS.

Marcaje y recubrimiento de anticuerpos.

Todos los anticuerpos se marcaron con éster de acridinio según el siguiente procedimiento:

Compuesto marcado (trazador): se mezclaron 100 pg (100 pl) de anticuerpo (1 mg/ml en PBS, pH 7,4) con 10 pl de éster de acridinio NHS (1 mg/ml en acetonitrilo, InVent GmbH, Alemania) (EP 0353971) y se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente. El anticuerpo marcado se purificó mediante HPLC de filtración en gel en Bio-Sil SEC 400-5 (Bio-Rad Laboratories, Inc., EE.UU.) El anticuerpo marcado purificado se diluyó en (300 mmol/l de fosfato de potasio, 100 mmol/l de NaCl, 10 mmol/l de Na-EDTA, 5 g/l de albúmina de suero bovino, pH 7,0). La concentración final fue de aproximadamente 800.000 unidades relativas de luz (URL) de compuesto marcado (aproximadamente 20 ng de anticuerpo marcado) por 200 pl. La quimioluminiscencia del éster de acridinio se midió empleando un aparato AutoLumat LB 953 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG).

Anticuerpo en fase sólida (anticuerpo recubierto):

Fase sólida: Se recubrieron tubos de poliestireno (Greiner Bio-One International AG, Austria) (18 horas a temperatura ambiente) con anticuerpo (1,5 pg de anticuerpo/0,3 ml de NaCl, 100 mmoles/l 50 mmoles/l de Tris/HCl, pH 7,8). Después de bloquear con albúmina de suero bovino al 5%, los tubos se lavaron con PBS, pH 7,4 y se secaron al vacío.

Inmunoensayo de hGH:

Se pipetearon 50 pl de muestra (o calibrador) en tubos recubiertos, después de añadir anticuerpo marcado (200 ul), los tubos se incubaron durante 2 horas a 18-25°C. El trazador no unido se eliminó lavando 5 veces (1 ml cada vez) con disolución de lavado (PBS 20 mmol/l, pH 7,4, Triton X-100 al 0,1%). El anticuerpo marcado unido al tubo se midió empleando el LB 953. Se empleó una concentración fija de 1ng/ml de hGH. En la tabla 1 se proporciona la relación señal (URL en 1 ng hGH/ml) ruido (URL sin us-hGH) de diferentes combinaciones de anticuerpos.. Todos los anticuerpos fueron capaces de generar un complejo sándwich con cualquier otro anticuerpo. El par de anticuerpos con la relación señal/ruido más fuerte (mejor sensibilidad) se empleó posteriormente para realizar el inmunoensayo us-hGH: el anticuerpo hGH G12 se empleó como anticuerpo de tubo recubierto y el anticuerpo hGH H4 se empleó como anticuerpo marcado.

Tabla 1: Resultados de las determinaciones relacionadas con el ruido entre diferentes pares de anticuerpos de hGH.

Calibración:

El ensayo se calibró empleando diluciones de hGH recombinante (Estándar Internacional de la OMS, código NIBSC 98/574), diluido en K2PO4 20 mM, EDTA 6 mM, BSA al 0,5%, Amastatina 50 uM, Leupeptina 100 uM, pH 8,0. (Figura 1)

Especificaciones del ensayo

La sensibilidad del ensayo analítico (unidades relativas de luz media de 20 determinaciones de muestra libre de hGH más 2 SD) era de 2 pg/ml de hGH y la sensibilidad del ensayo funcional (véase más arriba) era de 8,5 pg/ml. La recuperación y la dilución fueron > 85% dentro del intervalo de medición de 5-10.000 pg/ml de hGH. El coeficiente de correlación de N=997 muestras entre el ensayo us-hGH y un ensayo de hGH específico para hGH recombinante (22KD) era r=0,98 y se encontró un r de 0,95 para un ensayo que reconoce preferentemente isoformas de hGH producidas por la pituitaria de manera natural {20}. Estos datos indican la idoneidad de todas las mediciones de isoformas de hGH dentro de la presente invención.

Ejemplo 2 Estudio de población

Sujetos y métodos

Población de estudio

El estudio de dieta y cáncer de Malmo (MDC) es un estudio epidemiológico de cohorte prospectiva basado en la población de 28449 individuos examinados entre 1991 y 1996 {18}. De este estudio de cohorte se incluyó una muestra aleatoria, examinada entre noviembre de 1991 y febrero de 1994 (n=6103) en el estudio de cohorte cardiovascular MDC (MDC-CC), con el objetivo principal de estudiar la epidemiología de la enfermedad de las arterias carótidas {19}. Al excluir a los individuos que carecen de valores de las muestras de plasma en ayunas y, por lo tanto, al faltar datos sobre la prevalencia de diabetes mellitus o los valores en ayunas de HDL-C, LDL-C o hGH, quedaron 4453 personas y constituyen la cohorte del estudio principal.

Todos los participantes dieron su consentimiento por escrito y el estudio se aprobó por el comité de ética de la Universidad de Lund, Lund, Suecia.

Ensayos y examen clínico

Los participantes se sometieron a una historia clínica, un examen físico y una evaluación de laboratorio. La presión arterial se midió con un esfigmomanómetro de columna de mercurio después de 10 minutos de reposo en posición decúbito supino. La circunferencia de la cintura se midió a nivel del ombligo. El consumo actual de cigarrillos se definió como cualquier consumo en el último año, y se encuestó a través de un cuestionario autoadministrado. Se empleó el mismo cuestionario en combinación con un diario para registrar la prevalencia de medicación antihipertensiva al inicio del estudio. La diabetes mellitus se definió como el autoinforme de un diagnóstico médico, el uso de medicación para la diabetes o la glucemia total en ayunas superior a 6,0 mmol/L (109 mg/dl).

Todas las muestras de plasma y sangre total se obtuvieron después de un ayuno nocturno y las muestras se extrajeron entre las 7.30 y las 9.00 horas después de 15 minutos de reposo en posición decúbito supino. Los niveles de HDL-C y colesterol total se midieron según procedimientos estándar en el Departamento de Química Clínica del Hospital Universitario de Malmo. Los niveles de LDL-C se calcularon según la fórmula de Friedewald.

Los niveles de hGH se midieron en muestras de plasma en ayunas almacenadas, que se habían congelado a -80°C inmediatamente en el examen de referencia de MDC-CC. La medición se realizó con un inmunoensayo de quimioluminiscencia de ultrasensibilidad (véase el ensayo de us-hGH del ejemplo 1). El límite de detección era de 2 pg/ml, la sensibilidad del ensayo funcional era de 8,5 pg/ml. La medición de hGH se expresa en ng/ml (1 ng/ml=2,6 mU/l).

Tabla 2. Características clínicas de la población de estudio

Hombre Mujer

Número (% de toda la cohorte) 1873 (42,1) 2580 (57,9) Edad, media (SD), años 57,9 (6,0) 57,6 (5,9) Presión arterial sistólica, media (SD), mmHg 144(19) 141 (19)

Índice de masa corporal, media (SD), kg/m2 26,2 (3,5) 25,5 (4,2) Terapia antihipertensiva, N° (%) 345 (18,4) 402(15,6) Diabetes Mellitus, N° (%) 216 (11,5) 166 (6,4)

LDL,-C media (SD), mmol/l 4,11 (0,90) 4,20 (1,04)

HDL-C, media (SD), mmol/l 1,22 (0,30) 1,51 (0,37) Fumadores actuales, N° (%) 512 (27,3) 661 (25,6) Hormona de crecimiento, mediana (IQR), ng/ml 0,11 (0,06-0,34) 1,22 (0,39-3,15)* *Diferencia significativa frente a los varones (p<0,001). P para la diferencia en otras variables no calculadas.

Abreviaturas: IMC, índice de masa corporal; LDL-C, colesterol unido a lipoproteínas de baja densidad; HDL-C, colesterol unido a lipoproteínas de alta densidad

Distribución de hGH en hombres y mujeres

Tabla 3: distribución de frecuencia de hGH en hombres y mujeres

Intervalo de valores de hGH en cuartiles para todas las causas y mortalidad por ECV.

Hombres Q1 Q2 Q3 Q4

hGH mínima 0,02 0,06 0,12 0,34

hGH máxima 0,05 0,11 0,33 23,94

Mínimo Ln hGH -3,91 -2,81 -2,12 -1,10

Máximo Ln hGH -3,00 -2,21 -1,11 3,18

Mujeres

hGH mínima 0,01 0,40 1,22 3,15

hGH máxima 0,39 1,21 3,14 40,60

Mínimo Ln hGH -4,61 -0,92 0,20 1,15

Máximo Ln hGH -0,94 0,19 1,14 3,70

Las concentraciones de hGH más bajas observadas fueron 0,02 ng/ml en hombres y 0,01 ng/ml en mujeres, lo que indica la idoneidad del ensayo us-hGH empleado (sensibilidad analítica: 0,002 ng/ml (2 pg/ml), sensibilidad del ensayo funcional 0,0085ng/ml (8,5 pg/ml)) para detectar hGH en ayunas en todos los sujetos. Los valores umbral para la mortalidad por ECV en los hombres pueden estar por encima de 0,34 ng/ml para los sujetos de alto riesgo y por debajo de 0,06 ng/ml para los de bajo riesgo.

Puntos finales clínicos

Examinamos 4 resultados primarios: enfermedad de las arterias coronarias (EAC), accidente cerebrovascular, mortalidad cardiovascular y mortalidad total. Los criterios de valoración se recuperaron mediante la vinculación de registros del número de identificación personal de cada individuo sueco y el registro sueco de altas hospitalarias (SHDR), el registro sueco de causas de muerte (SCDR), el registro de accidentes cerebrovasculares en Malmo y el sistema web sueco de mejora y desarrollo de la atención basada en la evidencia en las enfermedades cardíacas evaluadas según las terapias recomendadas (SWEDEHEART). El uso de estos registros para la clasificación de resultados se ha validado previamente y se ha demostrado que la sensibilidad para detectar eventos, tal como el infarto de miocardio, que supera el 90% {21}, {22}, {23}. La EAC se definió como infarto de miocardio mortal o no mortal, muerte por enfermedad cardíaca isquémica, intervención coronaria percutánea (ICP) o derivación de arteria coronaria por injerto (CABG), lo que ocurriera primero, sobre la base de International Classification of Diseases, 9a y 10a revisiones (ICD-9 e ICD-10) códigos 410 y I21 respectivamente en el SHDR o SCDR, códigos 412 y 414 (ICD-9) o I22,I23 y I25 (ICD-10) del SCDR. El accidente cerebrovascular se definió como un accidente cerebrovascular mortal o no mortal sobre la base de los códigos 430, 431, 434 y 436 (ICD-9) o I60, I61, I63 y I64 (ICD-10). La mortalidad cardiovascular se definió sobre la base de los códigos (ICD-9) 390-459 o (ICD-10) códigos I00-I99 en el SCDR. El seguimiento de los resultados se extendió hasta el 30 de junio de 2009.

Análisis estadístico

Los valores en ayunas de hGH muestran una distribución sesgada a la derecha y se transformaron en el logaritmo natural antes de cualquier análisis. Para determinar si la hGH mostraba alguna correlación con los factores de riesgo cardiovascular tradicionales {24}, se realizaron análisis transversales al inicio del estudio empleando modelos de regresión lineal con hGH como variable dependiente y la edad, sexo, tabaquismo actual, medicación antihipertensiva, diabetes mellitus y valores estandarizados para: presión arterial sistólica, IMC, HDL-C y LDL-C como variables independientes ingresadas por separado (en bruto) o simultáneamente (multivariado ajustado).

Se realizaron modelos multivariables de riesgo proporcional de Cox para examinar la asociación entre la hGH y la incidencia de eventos cardiovasculares y mortalidad. En los análisis de EAC y accidente cerebrovascular, excluimos a las personas que tenían antecedentes de EAC (n=94) o accidente cerebrovascular (n=35) antes del inicio en el análisis respectivo. Todos los modelos se ajustaron por edad, sexo, presión arterial sistólica, uso de medicación antihipertensiva, tabaquismo actual, diabetes mellitus, IMC y niveles de LDL-C y HDL-C. Confirmamos que se cumplía la suposición de proporcionalidad de los peligros empleando los residuos de Schoenfeld (es decir, una prueba de pendiente distinta de cero en una regresión lineal generalizada de los residuos de Schoenfeld escalados en el tiempo). Los cocientes de riesgo (HR) para la hGH se expresaron por incremento de 1 SD del logaritmo natural de la hGH. Para establecer si existía alguna diferencia de género significativa, se realizó un ensayo de interacción sexual.

Para obtener las curvas de Kaplan-Meier, la cohorte se dividió en cuartiles específicos de género.

La Tabla 3 muestra las concentraciones límite de los diferentes cuartiles en hombres y mujeres. Las concentraciones límite se pueden adaptar si se emplean ensayos de hGH que reconocen diferentes conjuntos de una o más isoformas de hGH.

Para evaluar posibles resultados diferentes mediante el empleo de diferentes ensayos, que reconocen diferentes conjuntos de isoformas de hGH, comparamos el ensayo (anticuerpos generados frente al hGH recombinante (isoforma 1) descrito en el ejemplo 1 con un ensayo que reconoce preferentemente las isoformas 2-4 (ensayo de pit para hGH, {29}. Se correlacionaron los resultados de hGH de 997 sujetos sanos, el coeficiente de correlación era 0,95 (r=0,95), lo que indica resultados casi idénticos empleando ensayos de unión para diferentes isoformas de hGH.

Para evaluar si la hGH se podría emplear para reclasificar el riesgo, seguimos los métodos descritos anteriormente para calcular una mejora neta de reclasificación (NRI) {25}. Empleamos puntuaciones de riesgo multivariable con los parámetros mencionados anteriormente para estimar el riesgo de desarrollar un evento cardiovascular a 10 años y clasificar a los participantes en los grupos: menos del 5%, de 5% a menos del 10%, de 10% a menos del 20%, de 20% o superior. Con la adición de valores de hGH, los participantes se podrían reclasificar en diferentes grupos. Evaluamos la reclasificación de sujetos y calculamos un NRI como una medida del éxito del modelo. La discriminación del modelo se evaluó calculando las estadísticas C (de Harrell), que representan el área bajo la curva de características operativas del receptor (ROC), para los diferentes modelos {25}.

Todos los análisis, excepto el NRI y el estadístico C, se realizaron empleando el programa informático estadístico SPSS (versión 20.0.0, SPSS inc, Chicago, Ill). Los análisis de estadísticas de C y NRI se realizaron con el programa informático Stata versión 11 (StataCorp, College Station, Texas). Un valor de P bilateral de menos de 0,05 se consideró significativo estadísticamente.

Resultados

Análisis transversal

Las características de referencia de la cohorte se muestran en la tabla 2. Las mujeres, como se esperaba, tenían valores de hGH en ayunas significativamente más altos que los hombres (Tabla 3). En los modelos de regresión en bruto, todas las variables fueron determinantes significativos de los niveles de hGH en ambos sexos con la excepción de la edad en las mujeres (Tabla 4). En los modelos ajustados, la edad, el tabaquismo actual y e1HDL-C tenían una correlación positiva significativa con la hGH, mientras que el LDL-C y el IMC mostraron una correlación negativa significativa en ambos sexos (Tabla 4). La presión arterial sistólica tenía una correlación negativa significativa en las mujeres, pero no en los hombres. En las mujeres, la diabetes mellitus tenía una fuerte correlación negativa con la hGH en el análisis simple, pero estaba en el límite de la no significancia en el análisis ajustado. Por el contrario, la correlación entre la hGH y la diabetes mellitus en los hombres era positiva y significativa en ambos modelos. Los modelos de regresión múltiple tenían un valor R2 del 9,5% para los hombres y del 11,8% para las mujeres. Al analizar toda la cohorte y ajustar por género, el valor R2 fue del 39%. La suma de las variables asociadas a la hGH de la cintura, insulina (logaritmo natural) y porcentaje de grasa corporal dio como resultado un valor R2 del 10,4% para los hombres y del 12,6% para las mujeres. Los modelos de regresión en bruto que incluyen estas variables adicionales muestran una correlación negativa significativa con los niveles de hGH en ayunas.

La hormona de crecimiento y el riesgo de EAC

De 4358 individuos (1799 hombres, 2559 mujeres) sin antecedentes de EAC previa, 401 (249 hombres, 152 mujeres) experimentaron un evento de EAC durante un tiempo medio de seguimiento de 16,1 años (IQR, 15,4-16,7). Cada aumento de la SD de la hGH de referencia se asoció con un HR ajustado multivariante de 1,14 (P=0,008) en la cohorte total (Tabla 5). La HR era similar en análisis separados de hombres (HR, 1,17; p=0,01) pero no significativamente elevada en las mujeres. No hubo interacción sexual significativa en el resultado de EAC (p=0,37). El cuartil superior frente al inferior de la hGH se asoció con un HR de 1,33 (IC del 95%, 0,99-1,78; p=0,05) en el análisis total, 1,46 (IC del 95%, 1,01-2,09; p= 0,04) en hombres y no significativo en mujeres (p=0,91), (Tabla 6). Hormona de crecimiento y riesgo de accidente cerebrovascular (véanse tablas 5 y 6)

4417 individuos (1849 hombres, 2568 mujeres) de la cohorte no tenían antecedentes de accidente cerebrovascular. Durante un tiempo medio de seguimiento de 16,2 años (IQR, 15,5-16,7), 265 personas (152 hombres, 123 mujeres) sufrieron un accidente cerebrovascular. Cada aumento de la SD de la hGH en ayunas al inicio del estudio se asoció con un HR ajustado multivariante de 1,19 en toda la cohorte, mientras que los análisis específicos de género generaron un HR de 1,18 en los hombres y no era significativo en las mujeres. No hubo interacción sexual significativa en el resultado (p=0,81). El cuartil superior frente al inferior de la hGH se asoció con un HR de 1,47 (IC del 95%, 1,02-2,11; p=0,04) en el análisis total, 1,48 (IC del 95%, 0,91-2,42; p=011) en hombres y 1,46 (IC 95%, 0,83-2,58; p=0,19) en mujeres.

Hormona de crecimiento y mortalidad total (véanse tablas 5 y 6)

De 4452 individuos (1872 hombres, 2580 mujeres) en la cohorte, 698 (383 hombres, 315 mujeres) fallecieron después de un tiempo medio de seguimiento de 16,2 años (IQR, 15,6-16,7). Cada aumento de la SD de la hGH en ayunas al inicio del estudio se relacionó con un HR ajustado multivariante de 1,21 en toda la cohorte, e1HR correspondiente para los hombres era de 1,26 y no era significativo para las mujeres. Un análisis de la interacción sexual mostró una diferencia significativa (p=0,01) entre los géneros en el resultado. El cuartil superior frente al inferior de la hGH se asoció con un HR de 1,46 (IC del 95%, 1,17-1,84; p<0,001) en el análisis total, 2,05 (IC del 95%, 1,47-2,86; p<0,001) en hombres y no significativo en mujeres (p=0,96).

Hormona de crecimiento y mortalidad cardiovascular (tablas 5 y 6)

En el estudio cohorte 4452 individuos estaban disponibles para el análisis al inicio del estudio y durante el tiempo de seguimiento que fue idéntico al de la mortalidad total, 215 (126 hombres, 89 mujeres) de estos individuos fallecieron por un evento cardiovascular como causa principal de la muerte. Cada aumento de la SD de la hGH en ayunas al inicio del estudio se asoció con un HR ajustado multivariante de 1,51 en la cohorte total. Los HRs específicos de género eran 1,41 para los hombres y 1,38 para las mujeres. No hubo interacción sexual significativa en el resultado (p=0,81). El cuartil superior frente al inferior de la hGH se asoció con un HR de 2,68 (IC del 95%, 1,70-4,23; p<0,001) en el análisis total, 3,41 (IC del 95%, 1,76-6,61; p<0,001) en hombres y 1,94 (IC del 95%, 0,98-3,81; p=0,06) en mujeres. La Figura 2 ilustra el desarrollo dependiente del tiempo de eventos de mortalidad por ECV en hombres.

La hormona de crecimiento es un predictor a corto plazo de mortalidad por ECV.

El desarrollo de la mortalidad por ECV dependiente del tiempo se ilustra en la Figura 2.

Sorprendentemente, la discriminación predictiva entre individuos de bajo riesgo y de alto riesgo fue más fuerte si se acortaba el período de observación (Tabla 7).

La hGH indica que es extraordinariamente fuerte en la predicción del riesgo a corto plazo de la mortalidad por ECV en los hombres. El riesgo relativo de eventos (cuartil 4 frente al cuartil 1 al inicio) es > 15 para una predicción de riesgo de 2,5 años, 9,1 para una predicción de riesgo de 5 años, 7,9 para una predicción de riesgo de 10 años y 4,2 para una predicción de riesgo de 15 años de mortalidad por ECV en hombres. Estos datos indican el fuerte poder de predicción a corto plazo de la hGH y la idoneidad de las mediciones en serie de la hGH.

Tabla 7: Cuartiles de hGH para la predicción de la mortalidad por ECV en hombres, variación del período de observación. La Tabla 7 ilustra el riesgo a corto plazo de mortalidad por ECV en los hombres. Cuanto más corto sea el período de observación, mayor será la diferencia del riesgo relativo entre los cuartiles más bajo y más alto de hGH:

Discriminación y reclasificación de riesgos

Los análisis NRI no eran significativos para la EAC y el accidente cerebrovascular, aunque se pudo observar una tendencia de mejora en el análisis total de EAC y de accidente cerebrovascular. En el resultado de la mortalidad total, el NRI era significativo para los hombres (4,5%; p=0,005), pero no era significativo en las mujeres. La mejora se debió principalmente a la clasificación descendente de los no eventos (8,6%). En la mortalidad cardiovascular, la NRI fue del 11,1% (p<0,001) en todos los sujetos y del 10,2% (p=0,05) en la cohorte de mujeres, la mejora se observó especialmente en la clasificación ascendente de los eventos incidentes (14,4% de los eventos mejorados en total muestra y 16,9% en mujeres).

La adición de hGH al modelo básico mejoró todo el estadístico C para EAC, accidente cerebrovascular, mortalidad por ECV y mortalidad total. Se observó una mejora del 70,5% al 71,4% en los hombres para la mortalidad total. La mayor mejora se observó en la mortalidad por ECV con el aumento de la estadística c del 78,7% al 79,8% en toda la cohorte, del 75,7% al 77,1% en los hombres y del 80,4% al 81,2% en las mujeres.

Tabla 4. Resultados de múltiples modelos de regresión lineal que examinan las correlaciones entre los valores en ayunas de la hormona de crecimiento y los marcadores tradicionales de riesgo cardiovascular.

Hombres Mujeres

^{Marcador de riesgo Coeficiente} IC del 95% P Coeficiente

_{B B} IC del 95% P Edad 0,02 0,01 a 0,03 <0,001 0,02 0,01 a 0,02 <0,001 Presión arterial sistólica 0,03 -0,02 a 0,08 0,19 -0,04 -0,08 a 0,00 0,05* Medicación antihipertensiva 0,12 0,00 a 0,24 0,05 0,07 -0,03 a 0,18 0,18

-0,12 a - -0,29 a -IMC -0,07 0,02 0,004 -0,25 0,21 <0,001 Tabaquismo actual 0,30 0,20 a 0,40 <0,001 0,19 0,10 a 0,27 <0,001

-0,12 a - -0,14 a -LDL-C -0,08 0,04 <0,001 -0,10 0,06 <0,001 HDL-C 0,20 0,15 a 0,25 <0,001 0,08 0,05 a 0,12 <0,001 Diabetes mellitus 0,22 0,08 a 0,36 0,002 -0,15 -0,30 a 0,01 0,06 Los coeficientes B se expresan como el incremento de valores estandarizados del logaritmo natural de hGH por 1 incremento de valores estandarizados (o presencia de marcador de riesgo dicotomizado) del marcador de riesgo en cuestión. NB la edad no está estandarizada. El IMC (peso en kilogramos dividido por la altura en metros al cuadrado), la presión arterial sistólica, y los valores de h Dl y LDL en ayunas están estandarizados. La prevalencia de diabetes mellitus, el tabaquismo actual y el uso de medicación antihipertensiva son variables dicotómicas.

Abreviaturas: IMC, índice de masa corporal; LDL-C, colesterol unido a lipoproteínas de baja densidad; HDL, colesterol unido a lipoproteínas de alta densidad

Tabla 5: Modelo de riesgos proporcionales de Cox ajustado multivariante para el valor basal en ayunas de la hGH frente a la incidencia de eAc , accidente cerebrovascular, mortalidad por todas las causas y mortalidad cardiovascular.

Evento Subgrupo n/eventos HR IC del 95% P EAC Todos 4358/401 1,14 1,01-1,29 0,04

Hombres 1799/249 1,17 1,04-1,33 0,01 Mujeres 2559/152 1,02 0,86-1,21 0,81 Accidente cerebrovascular Todos 4417/265 1,19 1,02-1,39 0,02

Hombres 1849/152 1,18 1,01-1,39 0,04 Mujeres 2568/123 1,14 0,94-1,39 0,18 Mortalidad total Todos 4452/698 1,21 1,11-1,33 <0,001 Hombres 1872/383 1,26 1,14-1,39 <0,001 Mujeres 2580/315 1,04 0,92-1,17 0,53 Mortalidad por ECV Todos 4452/215 1,51 1,28-1,78 <0,001 Hombres 1872/126 1,41 1,20-1,66 <0,001 Mujeres 2580/89 1,38 1,08-1,76 0,009 Los cocientes de riesgo (HR) (IC del 95%) se expresan por incremento de 1 SD del logaritmo natural de hGH. Variables ajustadas en el análisis: edad, presión arterial sistólica, uso de medicación antihipertensiva, IMC (peso en kilogramos dividido por altura en metros al cuadrado), prevalencia de diabetes mellitus, tabaquismo actual y valores en ayunas de HDL y LDL. Además, se ajustó por sexo en los análisis combinados de género.

Descripción de la figura

Figura 1: muestra una curva típica de señal/dosis de ensayo de us-hGH.

Figura 2: Análisis de Kaplan Meier de los cuartiles de hGH (véase Tabla 3) de predicción de mortalidad por ECV en hombres. Eje Y: Funciones de supervivencia (% evento/100) Eje X: Período de seguimiento (años) desde el inicio hasta la emigración o muerte o la última fecha de seguimiento (2009-06-30).

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Claims (21)

REIVINDICACIONES

1. Un método para predecir el riesgo cardiovascular en el plazo de 2,5 años en un sujeto, que comprende:

■ determinar el nivel en ayunas de la hormona de crecimiento (hGH), y/o sus isoformas en un fluido corporal obtenido de dicho sujeto; y

■ correlacionar dicho nivel en ayunas de la hormona de crecimiento (hGH), y/o sus isoformas con un riesgo cardiovascular, en donde un mayor nivel es predictivo de un mayor riesgo,

en donde el riesgo cardiovascular se define como un evento adverso y en donde el riesgo de dicho evento adverso se predice en un plazo de 2,5 años y en donde el riesgo cardiovascular se define como un evento adverso seleccionado del grupo que comprende accidente cerebrovascular, ECV (enfermedad cardiovascular)-mortalidad y enfermedad arterial coronaria (^eA^c ) en donde la última comprende infarto de miocardio mortal o no mortal, muerte por cardiopatía isquémica, intervención coronaria percutánea (ICP) o derivación de arteria coronaria por injerto (CABG).

2. Un método según la reivindicación 1 en donde se predice el riesgo de mortalidad por ECV, en donde la mortalidad por ECV es la muerte debido a un infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca o accidente cerebrovascular.

3. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 en donde dicho sujeto es un hombre.

4. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en donde dicho nivel en ayunas de la hormona de crecimiento (hGH), y/o sus isoformas en un fluido corporal se determina mediante un ensayo ultrasensible que tiene una sensibilidad del ensayo analítico de menos de 100 pg/ml, preferiblemente menos de 50 pg/ml, preferiblemente menos de 30 pg/ml, preferiblemente menos de 20 pg/ml preferiblemente menos de 10 pg/ml, preferiblemente menos de 5 pg/ml, preferiblemente 2 pg/ml.

5. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en donde dicho nivel en ayunas de la hormona de crecimiento (hGH), y/o sus isoformas en un fluido corporal se determina mediante un ensayo ultrasensible que tiene una sensibilidad de ensayo funcional de menos de 400 pg/ml, preferiblemente menos de 200 pg/ml, preferiblemente menos de 120 pg/ml, preferiblemente menos de 80 pg/ml, preferiblemente menos de 40 pg/ml, preferiblemente menos de 20 pg/ml, preferiblemente 10 pg/ml, lo más preferiblemente menos de 8,5 pg/ml.

6. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en donde dicho ensayo es específico para uno de los isómeros de hGH secretados, o para más de uno o es específico y determina todos los isómeros secretados de hGH seleccionados del grupo que comprende el isómero 1, el isómero 2, el isómero 3 y el isómero 4 (SEQ ID. NO: 1 a 4) en dicho fluido corporal.

7. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en donde dicho método se realiza más de una vez para controlar el riesgo cardiovascular o el riesgo de mortalidad total en un sujeto o para controlar el curso del tratamiento.

8. Un método según la reivindicación 7 en donde dicha monitorización se realiza para evaluar la respuesta de dicho sujeto a las medidas preventivas y/o terapéuticas tomadas.

9. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para estratificar dichos sujetos en grupos de riesgo y/o reclasificar dichos sujetos para el riesgo cardiovascular.

10. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1-9 en donde el fluido corporal es sangre o plasma o suero.

11. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en donde dicho sujeto es un hombre y en donde el umbral es de 340 pg/ml a 60 pg/ml, en donde un nivel de hormona de crecimiento (hGH) en ayunas, y/o sus isoformas por encima de un umbral de 340 pg/ml es predictivo de un alto riesgo y un nivel en ayunas por debajo de un umbral de 60 pg/ml es predictivo de un bajo riesgo.

12. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicho sujeto es una mujer y en donde el umbral es de 3150 pg/ml a 400 pg/ml, en donde un nivel en ayunas de hormona de crecimiento (hGH), y/o sus isoformas por encima de un umbral de 3150 pg/ml es predictivo de un alto riesgo y un nivel en ayunas por debajo de un umbral de 400 pg/ml es predictivo de un bajo riesgo.

13. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde dicha ECV (enfermedad cardiovascular) se selecciona de infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca y accidente cerebrovascular.

14. Un método según las reivindicaciones 1 a 13, en donde adicionalmente se determina al menos un parámetro clínico que se selecciona del grupo que comprende: edad, presencia de diabetes mellitus, tabaquismo actual.

15. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde adicionalmente se determina al menos un biomarcador adicional en el fluido corporal de dicho sujeto y se correlaciona con dicho riesgo cardiovascular, en donde dicho biomarcador adicional se selecciona del grupo que comprende: pro-Neurotensina (PNT) 1-117 y fragmentos de la misma que tienen al menos una longitud de cinco aminoácidos, proteína C reactiva (PCR), pro-péptido natriurético cerebral 1-108 (pro-BNP) 1-108, Pro-BNP, BNP, Pro-péptido natriurético Atrial 1-98 (fragmento proANP-N-terminal), Pro-ANP, Adrenomedulina, pro-Adrenomedulina (proADM) 24-71, ProADM 127-164, péptido natriurético proauricular (pro-ANP) y fragmentos de los mismos que tienen al menos una longitud de cinco aminoácidos, ST-2, GDF15, galectina-3 y copeptina.

16. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, 5 a 10 y 12 a 15, en donde dicho sujeto es una mujer y en donde adicionalmente se determina un biomarcador adicional en el fluido corporal de dicho sujeto femenino y se correlaciona con dicho riesgo cardiovascular o con dicho riesgo de mortalidad total, en donde dicho biomarcador adicional es pro-neurotensina (PNT) y fragmentos de la misma que tienen al menos una longitud de cinco aminoácidos.

17. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en donde dicho sujeto tiene una enfermedad o ha tenido un evento seleccionado del grupo que comprende aterosclerosis, presión arterial alta, insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio.

18. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en donde dicho nivel en ayunas de la hormona de crecimiento (hGH), y/o sus isoformas se mide con un inmunoensayo.

19. Un método según la reivindicación 18, en donde dicho inmunoensayo comprende al menos un anticuerpo, preferiblemente dos anticuerpos, que tienen una afinidad de unión de 10'8 M o menos.

20. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 18 o 19, en donde dicho inmunoensayo es un ensayo de hGH ultrasensible que comprende al menos un aglutinante monoespecífico, preferiblemente dos aglutinantes monoespecíficos, que tienen una afinidad de unión de 10'8M o menos para la hGH y sus isoformas y en donde dicho(s) aglutinante(s) es específico para uno de los isómeros de hGH secretados, o para más de uno o es específico y se une a todos los isómeros secretados de hGH seleccionados del grupo que comprende el isómero 1, isómero 2, isómero 3 e isómero 4 (SEQ ID. NO: 1 a 4) y en donde el ensayo ultrasensible tiene una sensibilidad del ensayo analítico de menos de 10 pg/ml, preferiblemente menos de 5 pg/ml, preferiblemente 2 pg/ml, o una sensibilidad de ensayo funcional de menos de 20 pg/ml, preferiblemente 10 pg/ml, lo más preferiblemente menos de 8,5 pg/ml.

21. Un método según la reivindicación 20, en donde dicho aglutinante monoespecífico es un anticuerpo monoclonal.