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ES2877367T3 - Elementos reguladores postranscripcionales de hepatitis modificados - Google Patents

Elementos reguladores postranscripcionales de hepatitis modificados Download PDF

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ES2877367T3
ES2877367T3 ES16703392T ES16703392T ES2877367T3 ES 2877367 T3 ES2877367 T3 ES 2877367T3 ES 16703392 T ES16703392 T ES 16703392T ES 16703392 T ES16703392 T ES 16703392T ES 2877367 T3 ES2877367 T3 ES 2877367T3
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Semih Tareen
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Abstract

Un polinucleótido, que comprende un elemento regulador postranscripcional (PRE) modificado, dicho PRE modificado comprendiendo una variante de un gen X del virus de la hepatitis de tipo salvaje, dicho gen X variante comprendiendo una pluralidad de codones de terminación no presentes en el gen X de tipo salvaje.

Description

DESCRIPCIÓN
Elementos reguladores postranscripcionales de hepatitis modificados
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional de Estados Unidos N° 62/102.569 presentada el 12 de enero de 2015, titulada "Modified Hepatitis Post-transcriptional Regulatory Elements".
Listado de secuencias
La presente solicitud se presenta con un Listado de Secuencias en formato electrónico. El Listado de Secuencias se proporciona como un archivo titulado 735042001840SeqList.txt, creado el 12 de enero de 2016, que tiene un tamaño de 152,051 bytes.
Campo
La presente divulgación se refiere a métodos para expresar moléculas recombinantes y polinucleótidos para su uso en tales métodos. En particular, la divulgación se refiere a polinucleótidos que contienen elementos reguladores postranscripcionales (PRE) que pueden potenciar la expresión de moléculas recombinantes enlazadas operativamente a los mismos, como elementos reguladores postranscripcionales que actúan en cis y variantes modificadas de los mismos. Los elementos reguladores postranscripcionales modificados incluyen los derivados de los virus de la hepatitis, como el virus de la hepatitis de la marmota (WHV), incluyendo las variantes modificadas de un elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE). Los PRE modificados incluyen típicamente una o más modificaciones que reducen el potencial de oncogénesis y/o inmunogenicidad tras la introducción en un sujeto para la expresión de la molécula recombinante, por ejemplo, evitando la expresión de ciertas proteínas. En algunas realizaciones, tales modificaciones incluyen uno o más codones de terminación incluidos dentro de una secuencia dentro del PRE que codifica una proteína X viral o una porción de la misma. En algunas realizaciones, el polinucleótido incluye una o más secuencias que codifican un sitio para promover la modificación postraduccional, como la degradación, por ejemplo, un sitio de ubiquitinación.
Antecedentes
Los vectores virales pueden proporcionar un sistema de administración eficaz para transferir material genético a una célula. Los ácidos nucleicos dentro de muchos vectores virales, como los vectores gammaretrovirales y lentivirales, pueden integrarse en el genoma de una célula huésped. Los elementos que actúan en cis, como los elementos reguladores postranscripcionales (PRE) víricos, incluyendo los PRE del virus de la hepatitis y variantes de los mismos, se han usado en vectores virales para potenciar la expresión génica. Hay disponibles ácidos nucleicos, casetes de expresión y vectores que contienen tales elementos. Hay una necesidad de ácidos nucleicos, casetes y vectores mejorados que contengan PRE. Se divulgan casos que abordan tales necesidades.
Zoulim et al. describen que se requiere la proteína X del virus de la hepatitis de marmota para la infección viral in vivo (J Virol, 68: 2026-2030, 1994).
Schambach et al. describen que el elemento regulador postranscripcional del virus de hepatitis de marmota eliminado de la proteína X y las secuencias promotoras potencial el título y la expresión del vector retroviral (gene Ther, 13: 641-645, 2006).
Chen et al., describen que el gen X del virus de la hepatitis de marmota es importante para el establecimiento de una infección vírica en marmotas (J Virol, 67: 1218-1226, 1993).
Sumario
La invención proporciona un polinucleótido que comprende un elemento regulador postranscripcional (PRE) modificado, dicho PRE modificado comprendiendo un gen X variante del virus de la hepatitis del tipo salvaje, dicho gen X variante comprendiendo una pluralidad de codones de terminación no presentes en el gen X de tipo salvaje. La invención proporciona además un casete de expresión que comprende el polinucleótido de la invención y un promotor enlazado operativamente al ácido nucleico que codifica la proteína recombinante. La invención también proporciona un vector que comprende el polinucleótido de la invención, opcionalmente en donde el vector es un vector viral, opcionalmente un vector retroviral y/o un vector lentiviral, opcionalmente en donde el vector lentiviral se deriva del VIH-1. La invención también proporciona una célula que comprende un polinucleótido de la invención o un casete de expresión que comprende el polinucleótido de la invención, opcionalmente en donde la célula es una célula T, una célula asesina natural (NK), una célula iPS, o una célula derivada de iPS. La invención también proporciona un método, que comprende introducir el casete de expresión de la invención o el vector de la invención en una célula, en condiciones mediante las cuales se produce la expresión de la proteína recombinante en la célula.
La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende la célula de la invención, y un portador farmacéuticamente aceptable.
Las realizaciones de la invención se describen en algunos de los casos a continuación.
Se divulgan polinucleótidos que contienen un elemento regulador postranscripcional (PRE) modificado que contiene un gen X variante que incluye un codón de terminación y/o una secuencia de degradación postraduccional no presente en un gen X del virus de la hepatitis de tipo salvaje o no modificado, como no presente en un gen X de un virus de la hepatitis de mamífero de tipo salvaje, como un WHV o HBV. Entre los polinucleótidos divulgados se encuentran aquellos que contienen un WPRE modificado que contiene un gen X variante que incluye un codón de terminación y/o una secuencia de degradación postraduccional no presente en un gen X de WHV de tipo salvaje o no modificado. Los polinucleótidos divulgados incluyen casetes de expresión y vectores virales que contienen tales PRE modificados. En casos particulares, el PRE modificado está enlazado operativamente a un ácido nucleico que codifica una proteína recombinante, por ejemplo, una proteína heteróloga.
Se divulgan polinucleótidos que contienen un PRE modificado que incluye una variante de un gen X del virus de la hepatitis de tipo salvaje en el que el gen X variante contiene un codón de terminación, como por lo menos un codón de terminación, no presente en el gen X de tipo salvaje. En algunos casos, por lo menos un codón de terminación, por ejemplo, el primer codón de terminación o cada uno de una pluralidad de codones de terminación presentes en el gen X variante, comienza en una posición dentro de 36 o 24 nucleótidos en la dirección 3' desde una posición en la gen X variante correspondiente a la posición 5' de un codón de inicio del marco de lectura abierto de la proteína X de tipo salvaje. En algunos casos, por lo menos un codón de terminación, por ejemplo, el primer codón de terminación o uno o más de una pluralidad de codones de terminación presentes en el gen X variante, comienza en una posición dentro de 36 o 24 nucleótidos en la dirección 3' desde una posición correspondiente al residuo 411 de la secuencia PRE de WHV expuesta en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125 y/o el residuo 1503 de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2. En algunos de tales casos, el gen X variante no contiene un marco de lectura abierto de más de o de aproximadamente 39 nucleótidos de longitud o de más de o de aproximadamente 27 nucleótidos de longitud.
Se divulgan polinucleótidos que contienen un PRE modificado que contiene una variante de un gen X del virus de la hepatitis de tipo salvaje en el que el gen X variante contiene un codón de terminación, como por lo menos un codón de terminación, no presente en el gen X de tipo salvaje y que comienza en una posición dentro de los 32 o 30 nucleótidos de un codón de inicio del gen X. En algunos casos, el por lo menos un codón de terminación, por ejemplo, el primer codón de terminación o uno o más de una pluralidad de codones de terminación presentes en el gen X variante, comienza en una posición dentro de 32 o 30 nucleótidos en la dirección 3' desde una posición en el gen X variante correspondiente a la posición 5' de un codón de inicio del marco de lectura abierto de la proteína X de tipo salvaje. En algunos casos, el por lo menos un codón de terminación, por ejemplo, el primer codón de terminación o uno o más de una pluralidad de codones de terminación presentes en el gen X variante, comienza en una posición dentro de 32 o 30 nucleótidos en la dirección 3' desde una posición correspondiente al residuo 411 de la secuencia PRE de WHV expuesta en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125 y/o el residuo 1503 de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2. En algunos de tales casos, el gen X variante tiene un marco de lectura abierto de menos de o igual a 33 nucleótidos de longitud.
En cualquiera de tales casos de un PRE modificado, el por lo menos un codón de terminación no presente en el gen X de tipo salvaje incluye una pluralidad de codones de terminación. Se divulgan polinucleótidos que comprenden un p Re modificado que contiene una variante de un gen X del virus de la hepatitis de tipo salvaje en el que el gen X variante contiene una pluralidad de codones de terminación que no están presentes en el gen X de tipo salvaje. En cualquiera de tales casos, el PRE modificado contiene 2, 3, 4, 5 o 6 codones de terminación. En algunos casos, la pluralidad de codones de terminación comprende por lo menos un codón de terminación en cada marco de lectura presente en el gen Xvariante. En algunos casos, la pluralidad de codones determinación comprende por lo menos dos codones de terminación en el mismo marco de lectura.
En cualquiera de tales casos de un PRE modificado que contiene una pluralidad de codones de terminación, el primer codón de terminación entre la pluralidad o uno o más de una pluralidad de codones de terminación comienza en una posición dentro de 36, 30 o 24 nucleótidos en la dirección 3' desde una posición en el gen X variante correspondiente a la posición 5' de un codón de inicio del marco de lectura abierto de la proteína X de tipo salvaje. En algunos casos de un PRE modificado que contiene una pluralidad de codones de terminación, el primer codón de terminación entre la pluralidad o uno o más de una pluralidad de codones de terminación comienza en una posición dentro de 36, 30 o 24 nucleótidos en la dirección 3' desde una posición en el gen X variante correspondiente al residuo 411 de la secuencia del elemento regulador postranscripcional (WPRE) de WHV expuesta en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125 y/o el residuo 1503 de la secuencia de WHV expuesta como la SEQ ID NO: 2. En algunos de tales casos, el gen X variante no comprende un marco de lectura abierto de más de o de aproximadamente 39 nucleótidos de longitud, de más de o de aproximadamente 30 nucleótidos de longitud o de más de o de aproximadamente 27 nucleótidos de longitud.
En cualquiera de tales casos, los polinucleótidos divulgados también pueden incluir un ácido nucleico que codifica una proteína recombinante. En casos particulares, el PRE modificado está enlazado operativamente al ácido nucleico que codifica la proteína recombinante.
En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el por lo menos un codón de terminación, por ejemplo, el primer codón de terminación o uno o más de una pluralidad de codones de terminación presentes en el gen X variante, comienza en una posición dentro o dentro de por lo menos o a 9, 12, 15, 18 o 21 nucleótidos en la dirección 3' desde una posición en el gen X variante correspondiente a la posición 5' de un codón de inicio del marco de lectura abierto de la proteína X de tipo salvaje. En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el por lo menos un codón de terminación, por ejemplo, el primer codón de terminación o uno o más de una pluralidad de codones de terminación presentes en el gen X variante, comienza en una posición dentro o dentro de por lo menos o a 9, 12, 15, 18, 21 nucleótidos en la dirección 3' desde una posición en el gen X variante correspondiente al residuo 411 de la secuencia del elemento regulador postranscripcional (WPRE) de WHV expuesta en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125 y/o el residuo 1503 de la secuencia de WHV expuesta como la s Eq ID NO: 2. En algunos casos, el PRE modificado contiene por lo menos un codón de terminación, como 1, 2, 3, 4 o 5 codones de terminación, en el que uno o más codones de terminación de la pluralidad comienza en una posición dentro de o dentro de por lo menos o en una posición de nucleótidos correspondiente a la posición 420, 423, 426, 429 o 432 de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1 o la 125. En algunos de tales casos, el gen X variante no comprende un marco de lectura abierto de más de o de o de aproximadamente 24 nucleótidos de longitud, más de o aproximadamente 21 nucleótidos de longitud, más de o aproximadamente 18 nucleótidos de longitud, más de o aproximadamente 15 nucleótidos de longitud, o más de o aproximadamente 12 nucleótidos de longitud.
En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el por lo menos un codón de terminación, por ejemplo, el primer codón de terminación o uno o más de una pluralidad de codones de terminación presentes en el gen X variante, comienza en una posición dentro o dentro de por lo menos o a 9, 13, 17 o 21 nucleótidos en la dirección 3' desde una posición en el gen X variante correspondiente a la posición 5' de un codón de inicio del marco de lectura abierto de la proteína X de tipo salvaje. En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el por lo menos un codón de terminación, por ejemplo, el primer codón de terminación o uno o más de una pluralidad de codones de terminación presentes en el gen X variante, comienza en una posición dentro o dentro de por lo menos o a 9, 13, 17 o 21 nucleótidos en la dirección 3' desde una posición en el gen X variante correspondiente al residuo 411 de la secuencia del elemento regulador postranscripcional (WPRE) de WHV expuesta en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125 y/o el residuo 1503 de la secuencia WHV expuesta como la SEQ ID NO: 2. En algunos casos, el PRE modificado contiene por lo menos un codón de terminación, como 1, 2, 3 o 4 codones de terminación, en los que uno o más de una pluralidad de los codones de terminación comienzan en una posición dentro o dentro de por lo menos o en una posición de nucleótidos correspondiente a la posición 420, 424, 428 o 432 de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125. En algunos de tales casos, el gen X variante no comprende un marco de lectura abierto de más de o aproximadamente 24 nucleótidos de longitud, más de o aproximadamente 21 nucleótidos de longitud, más de o aproximadamente 16 nucleótidos de longitud, o más de o aproximadamente 12 nucleótidos de longitud.
En algunos casos, el gen X no modificado o de tipo salvaje comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 221, y el gen X variante contiene por lo menos un codón de terminación, como 1, 2, 3, 4 o 5 codones de terminación introducidos en el mismo. En algunos casos, se introduce una pluralidad de codones de terminación, donde se introduce por lo menos un codón de terminación en cada marco de lectura del mismo. En algunos casos, se introduce una pluralidad de codones de terminación donde se introducen por lo menos dos codones de terminación en el mismo marco de lectura presente en ellos. En algunos casos, el PRE modificado contiene un gen X variante que contiene por lo menos un codón de terminación, como 1, 2, 3 o 4 codones de terminación, en el que uno o más comienzan en una posición dentro o dentro de por lo menos o en la posición 9, 13, 17 o 21 en la dirección 3' desde una posición en el gen X variante correspondiente a la posición 5' del codón de inicio ATG expuesto en la SEQ ID NO: 221. En algunos casos, el PRE modificado contiene un gen X variante que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 28.
En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el PRE modificado contiene una horquilla beta correspondiente a los residuos de nucleótidos 448-470 de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125. En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el PRE modificado no contiene un cambio de nucleótidos en una posición dentro de la horquilla beta correspondiente a los nucleótidos 448-470 de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125. En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el codón de terminación o los codones de terminación no comprenden un nucleótido en una posición dentro de la horquilla beta correspondiente a una o más de las posiciones de nucleótidos 448-470 de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125.
En cualquiera de tales casos, el PRE modificado contiene un codón de terminación seleccionado entre: un codón de terminación que comienza en la posición 9 en la dirección 3' desde una posición en el gen X variante correspondiente a la posición 5' de un codón de inicio del marco de lectura abierto de proteína X de tipo salvaje y/o en una posición de nucleótidos correspondiente a la posición 420 en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125; un codón de terminación que comienza en la posición 13 en la dirección 3' desde una posición en el gen X variante correspondiente a la posición 5' de un codón de inicio del marco de lectura abierto de la proteína X de tipo salvaje y/o en una posición de nucleótidos correspondiente a la posición 424 en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125; un codón de terminación que comienza en la posición 17 en la dirección 3' desde una posición en el gen X variante correspondiente a la posición 5' de un codón de inicio del marco de lectura abierto de la proteína X de tipo salvaje y/o en una posición de nucleótidos correspondiente a la posición 428 en la secuencia expuesta en la s Eq ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125; y/o un codón de terminación que comienza en la posición 21 en la dirección 3' desde una posición en el gen X variante correspondiente a la posición 5' de un codón de inicio del marco de lectura abierto de la proteína X de tipo salvaje y/o en una posición de nucleótidos correspondiente a la posición 432 en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125.
En cualquiera de tales casos, el codón de terminación puede ser un codón de terminación ámbar (TAG), ocre (TAA) u ópalo (TGA). En algunos casos, el codón de terminación puede ser un codón de terminación ámbar (TAG) u ópalo (TGA). En cualquiera de tales casos, el codón de terminación, como cada uno de una pluralidad de codones determinación, se introduce mediante sustitución, deleción o inserción de nucleótidos.
En algunos casos de cualquiera de tales polinucleótidos, el gen X variante en el PRE modificado no tiene más de 180 nucleótidos de longitud o no tiene más de o aproximadamente 210 nucleótidos de longitud. En algunos casos de cualquiera de tales polinucleótidos, el gen X variante tiene por lo menos o aproximadamente 90 nucleótidos 90 nucleótidos de longitud o por lo menos aproximadamente 120 nucleótidos de longitud o tiene por lo menos o aproximadamente 180 nucleótidos de longitud.
En algunos casos de cualquiera de tales polinucleótidos, el gen X variante puede ser una variante de un gen X de la hepatitis de mamífero de tipo salvaje o no modificado o una porción parcial o truncada del mismo. En algunos casos, el gen X de tipo salvaje o no modificado puede incluir un gen X parcial que codifica una proteína X truncada, como está presente en un PRE de tipo salvaje o no modificado. En algunos casos, el gen X de la hepatitis de mamífero de tipo salvaje o no modificado o el gen X parcial es o se deriva de un gen X del virus de la hepatitis de marmota (WHV) de tipo salvaje. En algunos casos, el gen X de WHV de tipo salvaje o no modificado contiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 9 o es un gen X parcial de la misma. En algunos casos, el gen X de WHV de tipo salvaje o no modificado contiene la secuencia de nucleótidos expuesta como los nucleótidos 411-592 de cualquiera de las SEQ ID NO: 1 y 12-20 o los nucleótidos 411-589 de la SeQ ID NO: 125.
En algunos casos de cualquiera de tales polinucleótidos, el PRE modificado puede contener por lo menos dos o por lo menos tres subelementos reguladores postranscripcionales que actúan en cis de un PRE del virus de la hepatitis de tipo salvaje o variantes funcionales del mismo. En algunos de tales casos, los por lo menos dos o por lo menos tres subelementos comprenden un subelemento alfa de PRE de tipo salvaje o una variante funcional del mismo, una variante funcional de un subelemento beta de PRE de tipo salvaje y/o un subelemento gamma de PRE de tipo salvaje o variante funcional del mismo. En algunos casos, el PRE modificado comprende un subelemento alfa de un PRE de virus de la hepatitis de tipo salvaje o una variante funcional del mismo y una variante funcional de un subelemento beta de PRE de tipo salvaje. En cualquiera de tales casos, el subelemento alfa puede comprender la secuencia de la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5 o una variante de la misma, el subelemento beta puede comprender una variante de la secuencia de la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 7, y/o la subunidad gamma puede comprender la secuencia de la SEQ ID NO: 8 o variante de la misma.
En algunos casos de cualquiera de tales polinucleótidos, el PRE del virus de la hepatitis de tipo salvaje o no modificado puede ser un PRE de hepatitis de mamífero de tipo salvaje. En algunos casos, el PRE del virus de la hepatitis de mamífero de tipo salvaje o no modificado contiene la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 1 y 12-27 o es una porción funcional de la misma que muestra actividad postranscripcional. En algunos casos, uno o más residuos de aminoácidos N- o C-terminales pueden eliminarse o quitarse sin un efecto sustancial sobre la actividad del PRE. En algunos casos, el PRE del virus de la hepatitis de tipo salvaje o no modificado tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 125. En algunos casos, el p Re de hepatitis de mamífero de tipo salvaje es un PRE de virus de la hepatitis de marmota de tipo salvaje (WPRE).
En cualquiera de tales casos de los polinucleótidos divulgados, el PRE modificado puede modificarse con respecto a un PRE de hepatitis de tipo salvaje o no modificado que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125, una secuencia de nucleótidos que muestra por lo menos un 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125, o una porción funcionalmente activa de la misma que muestre actividad postranscripcional, siempre que el gen X variante contenga al menos un codón de terminación no presente en el PRE de hepatitis de tipo salvaje correspondiente.
En cualquiera de tales casos de los polinucleótidos divulgados, el PRE de hepatitis de tipo salvaje o no modificado puede contener la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 12-20 o 125. En algunos casos, el PRE de la hepatitis de tipo salvaje o no modificado puede contener la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1. En algunos casos, el PRE de hepatitis de tipo salvaje o no modificado puede contener la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 125.
En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos, el gen X variante puede contener un codón de inicio que comienza en una posición correspondiente a la posición 411 de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125. En algunos casos, el codón de inicio es un codón de inicio ATG.
En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos, el gen X variante puede contener además un promotor enlazado operativamente al gen X variante. En algunos casos, el promotor es un promotor del gen X de tipo salvaje que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 11 o una secuencia promotora del gen X de WHV de tipo salvaje.
En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos, el PRE modificado puede seleccionarse de: a) un PRE modificado que comprende una secuencia de nucleótidos que muestra por lo menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125, en el que el PRE modificado contiene un gen X variante que tiene por lo menos un codón de terminación no presente en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125; o b) un PRE modificado que comprende una porción de la secuencia de nucleótidos de a) en el que la porción contiene un gen X variante que comprende por lo menos un codón de terminación y la parte muestra actividad postranscripcional. En algunos casos, el gen X variante contiene por lo menos 2 codones de terminación, por lo menos 3 codones de terminación o por lo menos 4 codones de terminación. En algunos casos, el gen X variante comprende un codón de terminación en cada marco de lectura presente en dicho gen X variante.
En algunos casos, el gen X variante comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 44-58 o 141-155. En algunos casos, el PRE modificado comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 29-43 o 126-140.
En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el PRE modificado no contiene ninguna modificación además del por lo menos un codón de terminación no presente en el PRE de tipo salvaje o no modificado, como no presente en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125. En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el PRE modificado contiene modificaciones adicionales además del por lo menos un codón de terminación en comparación con la secuencia del PRE de tipo salvaje o no modificado, como en comparación con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125.
En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el gen X variante contiene además un codón de inicio variante que comprende una o más diferencias de nucleótidos en comparación con un codón de inicio del gen X del virus de la hepatitis de tipo salvaje. En algunos casos, el codón de inicio variante contiene una o más diferencias de nucleótidos en comparación con el codón de inicio correspondiente a las posiciones de nucleótidos 411-413 de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125. En algunos de tales casos, la una o más diferencias dan como resultado un inicio de la traducción restringida o impedida a partir de dicho codón de inicio. En algunos de tales casos, el gen X variante comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 74­ 88 o 171-185 y/o el PRE modificado comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 59-73 o 156-170.
En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el gen X variante contiene un promotor variante enlazado operativamente al gen X variante en el que el promotor variante comprende una o más diferencias de nucleótidos en comparación con un promotor del gen X del virus de la hepatitis de tipo salvaje. En algunos casos, el promotor variante contiene una o más diferencias de nucleótidos en comparación con el promotor expuesto como la SEQ ID NO: 11. En algunos casos, la una o más diferencias dan como resultado una transcripción restringida o la prevención de la transcripción de dicho promotor. En algunos de tales casos, el PRE modificado comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 89-118 o 186-215.
En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, tras la introducción del polinucleótido en una célula eucariota, no se produce ningún polipéptido de longitud mayor de 12, 11, 10, 9 u 8 aminoácidos codificados por dicho gen X variante. En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el polinucleótido es incapaz de producir un polipéptido de una longitud mayor de 12, 11, 10, 9 u 8 aminoácidos de longitud codificados por dicho gen X variante.
En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el PRE modificado codifica un ARN que promueve la exportación de ARN nuclear y/o aumenta la estabilidad del ARNm. En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el PRE modificado codifica un polinucleótido de ARN que promueve la exportación de ARN nuclear y/o aumenta la estabilidad del ARNm, en donde dicha promoción de la exportación de ARN nuclear y/o la estabilidad del ARNm aumenta la expresión de la proteína recombinante. En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el PRE modificado retiene la actividad postranscripcional del PRE de hepatitis de tipo salvaje o no modificado correspondiente y/o el PRE expuesto en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120 y/o la s Eq ID NO: 216. En algunos de tales casos, el PRE modificado muestra por lo menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120% o 130% o más de la actividad postranscripcional del PRE de la hepatitis de tipo salvaje o no modificado correspondiente y/o el PRE expuesto en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120 y/o la SEQ ID NO: 216. En algunos casos, la actividad postranscripcional del PRE modificado puede evaluarse monitorizando la expresión génica de un ácido nucleico enlazado operativamente que codifica una proteína recombinante.
En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el gen X variante contiene además una secuencia que codifica una señal de modificación postraduccional no presente en el gen X del virus de la hepatitis de tipo salvaje.
También se divulgan polinucleótidos que contienen un PRE modificado que incluye una variante de un gen X del virus de la hepatitis de tipo salvaje o no modificado en el que el gen X variante contiene una secuencia que codifica una señal de modificación postraduccional no presente en el gen X del virus de la hepatitis de tipo salvaje o no modificado. En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, la señal de modificación postraduccional contiene un sitio de ubiquitinación.
En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, la señal de modificación postraduccional contiene un primer codón que comienza en una posición dentro o dentro de por lo menos 2, 3, 4, 5 o 6 nucleótidos en la dirección 3' desde una posición en el gen X variante correspondiente a la posición 5' de un codón de inicio del marco de lectura abierto de la proteína X, en donde el primer codón codifica un residuo de glicina, arginina, ácido glutámico, fenilalanina, aspartato, cisteína, lisina, asparagina, serina, tirosina, triptófano, histidina, o leucina de acuerdo con la regla del extremo N; y opcionalmente un segundo codón que comienza en una posición dentro o dentro de por lo menos 2, 3, 4, 5 o 6 nucleótidos en la dirección 3' desde una posición en gen X variante correspondiente a la posición 5' de un codón de inicio del marco de lectura abierto de proteína X, en donde el segundo codón codifica un residuo de ácido glutámico o asparagina de acuerdo con la regla del extremo N.
En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, la señal de modificación postraduccional contiene una o más secuencias PEST.
En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el polinucleótido contiene un ácido nucleico que codifica una proteína recombinante enlazada operativamente al PRE modificado y un gen X variante que contiene una secuencia que codifica una señal de modificación postraduccional no presente en el gen X del virus de la hepatitis del tipo salvaje o no modificado.
En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el gen X variante contiene una secuencia que codifica una señal de modificación postraduccional que contiene una horquilla beta correspondiente a los residuos de nucleótidos 448-470 de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125. En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el gen X variante contiene una secuencia que codifica una señal de modificación postraduccional que no contiene un cambio de nucleótidos en una posición dentro de la horquilla beta correspondiente a los nucleótidos 448-470 de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125.
En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el gen X variante no tiene más de 180 nucleótidos de longitud o no tiene más de o aproximadamente 210 nucleótidos de longitud. En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el gen X variante tiene por lo menos o aproximadamente 90 nucleótidos 90 nucleótidos de longitud o por lo menos aproximadamente 120 nucleótidos de longitud o tiene por lo menos o aproximadamente 180 nucleótidos de longitud.
En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el gen X variante es una variante de un gen X de la hepatitis de mamífero de tipo salvaje o no modificado o una porción parcial o truncada del mismo. En algunos casos, el gen X de tipo salvaje o no modificado puede incluir un gen X parcial que codifica una proteína X truncada, como está presente en un PRE de tipo salvaje o no modificado. En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el gen X de la hepatitis de mamífero de tipo salvaje o no modificado o el gen X parcial es o se deriva de un gen X del virus de la hepatitis de marmota (WHV) de tipo salvaje. En algunos casos, el gen X de WHV de tipo salvaje o no modificado contiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 9, la secuencia de nucleótidos expuesta como los nucleótidos 1503-1928 de la SEQ ID NO: 2 o es un gen X parcial de la misma. En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el gen X de WHV de tipo salvaje o no modificado contiene la secuencia de nucleótidos expuesta como los nucleótidos 411-592 de cualquiera de las SEQ ID NO: 1 y 12-20 o los nucleótidos 411-589 de la SEQ ID NO: 125.
En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el PRE modificado contiene por lo menos dos o por lo menos tres subelementos reguladores postranscripcionales que actúan en cis de un PRE del virus de la hepatitis de tipo salvaje o variante funcional del mismo. En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, los por lo menos dos o por lo menos tres subelementos contienen un subelemento alfa de PRE de tipo salvaje o una variante funcional del mismo, una variante funcional de un subelemento beta de PRE de tipo salvaje y/o un subelemento gamma de PRE de tipo salvaje o variante funcional del mismo. En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el PRE modificado contiene un subelemento alfa de un PRE de virus de la hepatitis de tipo salvaje o una variante funcional del mismo y una variante funcional de un subelemento beta de PRE de tipo salvaje. En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el subelemento alfa contiene la secuencia de la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5 o una variante de la misma, el subelemento beta contiene una variante de la secuencia de la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 7, y/o la subunidad gamma contiene la secuencia de la SEQ ID NO: 8 o variante de la misma.
En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el PRE del virus de la hepatitis de tipo salvaje o no modificado es un PRE de hepatitis de mamífero de tipo salvaje. En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el PRE del virus de la hepatitis de mamífero de tipo salvaje o no modificado contiene la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 12-27 o 125. En algunos casos de cualquiera de las polinucleótidos divulgados, el PRE de la hepatitis de mamífero de tipo salvaje es un PRE de virus de hepatitis de marmota (WPRE) de tipo salvaje.
En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el PRE modificado se selecciona entre: a) un PRE modificado que comprende un gen X variante de un PRE de hepatitis de tipo salvaje o no modificado, el PRE de hepatitis de tipo salvaje o no modificado conteniendo la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID n O : 125 o una secuencia de nucleótidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125, en donde el gen X variante contiene una secuencia que codifica una señal de modificación postraduccional no presente en el gen X del virus de la hepatitis de tipo salvaje o no modificado; y b) un PRE modificado que contiene una porción de la secuencia de nucleótidos de a), la porción que contiene un gen X variante que contiene la secuencia que codifica una señal de modificación postraduccional, en donde la porción muestra actividad postranscripcional.
En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el gen X variante contiene un codón de inicio que comienza en una posición correspondiente a la posición 411 de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125. En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el codón de inicio es un codón de inicio ATG. En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el gen X variante contiene un promotor enlazado operativamente a dicho gen X variante. En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el promotor es un promotor del gen X de tipo salvaje que contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 11 o una secuencia promotora del gen X del WHV de tipo salvaje.
En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el PRE modificado se selecciona entre: a) un PRE modificado que comprende una secuencia de nucleótidos que muestra por lo menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125, el PRE modificado que contiene un gen X variante que contiene una secuencia que codifica una señal de modificación postraduccional no presente en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125; y b) un PRE modificado que contiene una porción de la secuencia de nucleótidos de a), la porción que contiene un gen X variante que contiene la secuencia que codifica la modificación postraduccional, en donde la porción muestra actividad postranscripcional.
En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el gen X variante contiene hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 cambios de nucleótidos.
En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el PRE modificado no contiene ninguna modificación además de la secuencia que codifica una señal de modificación postraduccional. En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el PRE modificado contiene modificaciones adicionales además de la secuencia que codifica una señal de modificación postraduccional no presente en el gen X del virus de la hepatitis de tipo salvaje o no modificado. En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, la o las modificaciones adicionales están en el gen X variante. En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, la modificación o modificaciones adicionales dan como resultado un gen X variante que codifica una proteína X inactiva y/o una proteína X truncada.
En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el PRE modificado codifica un ARN que promueve la exportación de ARN nuclear y/o aumenta la estabilidad del ARNm. En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, la promoción de la exportación de ARN nuclear y/o la estabilidad del ARNm aumenta la expresión de la proteína recombinante.
En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el PRE modificado retiene la actividad postranscripcional del PRE de hepatitis de tipo salvaje o no modificado correspondiente y/o el PRE expuesto en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 125 o SEQ ID NO: 216. En algunos de tales casos, el PRE modificado muestra por lo menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120% o 130% o más de la actividad postranscripcional del PRE de hepatitis de tipo salvaje o no modificado correspondiente y/o el PRE expuesto en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120 y/o la SEQ ID NO: 216. En algunos casos, la actividad postranscripcional del PRE modificado puede evaluarse monitorizando la expresión génica de un ácido nucleico enlazado operativamente que codifica una proteína recombinante.
En algunos casos, cualquiera de los polinucleótidos divulgados puede contener además ácido nucleico viral que contiene un Flap variante, en donde el Flap variante contiene una deleción de todos o una porción de los nucleótidos correspondientes al tracto central de polipurina (cPPT) y/o las regiones de la secuencia terminación central (CTS) de una secuencia Flap de tipo salvaje o no modificada. En tales casos, los polinucleótidos contienen un PRE modificado y un Flap variante. En algunos casos, tales elementos están enlazados operativamente al ácido nucleico que codifica una proteína recombinante y/o dan como resultado un aumento en la eficiencia de la transferencia génica de un ácido nucleico heterólogo que codifica una proteína recombinante en comparación con la ausencia de tales elementos.
También se divulgan polinucleótidos que contienen un Flap variante, en donde el Flap variante contiene una deleción de todos o una parte de los nucleótidos correspondientes al tracto central de polipurina (cPPT) y/o las regiones de la secuencia de terminación central (CTS) de una secuencia Flap de tipo salvaje o no modificada. En algunos casos, el polinucleótido que contiene un Flap variante puede contener además ácido nucleico que codifica una proteína recombinante. En algunos casos, la presencia de un polinucleótido que contiene un Flap variante, aunque se elimina para todo o una parte del cPPT y el CTS que están implicados en la formación de la estructura de Flap, sin embargo, puede transducir o transferir con éxito a las células con el ácido nucleico que codifica la proteína recombinante.
En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados que contienen un Flap variante, el Flap variante contiene una deleción de todo o una parte del nucleótido correspondiente al cPPT y al CTS. En algunos casos, todos los residuos de nucleótidos correspondientes a cPPT y todos los residuos de nucleótidos correspondientes a CTS se eliminan y/o el Flap variante no contiene residuos de nucleótidos correspondientes a cPPT o residuos de nucleótidos correspondientes a CTS. En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el Flap variante contiene la deleción de todos o una parte contigua de los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos en la región de cPPT expuesta en la SEQ ID NO: 123. En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el Flap variante contiene la deleción de todos o una parte contigua de los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos en la región de CTS expuesta en la SEQ ID NO: 124. En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el Flap variante contiene la deleción de todos o una parte contigua de los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos en la región de cPPT expuesta en la SEQ ID NO: 123 y la deleción de todos o una parte contigua de los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos en la región de CTS expuesta en la SEQ ID nO: 124.
En cualquiera de tales casos de un polinucleótido que contiene un Flap variante, el Flap variante se modifica o comprende modificaciones en comparación con una secuencia que contiene un Flap de tipo salvaje o no modificado. En algunos casos, la secuencia Flap de tipo salvaje o no modificada contiene de o de aproximadamente 80 a 200 nucleótidos contiguos que incluyen las regiones cPPT o CTS de un retrovirus, que opcionalmente es un lentivirus. En algunos casos, el retrovirus es un lentivirus. En algunos casos, el lentivirus es VIH-1. En algunos casos, el Flap de tipo salvaje o no modificado contiene a) la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 121; b) una secuencia de nucleótidos que comprende por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 121 que contiene las regiones cPPT y CTS; o c) una parte contigua de a) o b) que incluye las regiones cPPT y CTS.
En algunos casos, el ácido nucleico viral que contiene el Flap variante es o comprende una secuencia de nucleótidos que muestra por lo menos un 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 121, dicha variante Flap careciendo de todas o una parte de las regiones cPPT y CTS. En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el ácido nucleico viral es o contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 122.
En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el polinucleótido contiene a) un Flap variante que es o comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 122 o una secuencia que tiene por lo menos un o aproximadamente un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 122, dicho Flap variante careciendo de todas o una parte de las regiones cPPT y CTS del Flap de tipo salvaje o no modificado correspondiente o de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 121; y b) un PRE modificado que es o comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 29 o 126 o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 29 o 126, dicho PRE modificado conteniendo por lo menos un codón de terminación en el gen X variante del PRE modificado no presente en un gen X de tipo salvaje o no modificado o no presente en un PREP de tipo salvaje o no modificado que contiene un gen X, como no presente en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125.
En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el WPRE modificado y/o el Flap variante está enlazado operativamente a nucleótidos que codifican una proteína recombinante que es o contiene un receptor recombinante. En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el receptor recombinante es un receptor de antígeno y/o un receptor quimérico. En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el receptor recombinante es un receptor de antígeno no TCR funcional o un TCR transgénico. En algunos casos de cualquiera de los polinucleótidos divulgados, el receptor recombinante es un receptor de antígeno quimérico (CAR).
En algunos casos, también se divulga un casete de expresión que contiene cualquiera de los polinucleótidos divulgados y un promotor enlazado operativamente a un ácido nucleico que codifica una proteína recombinante. En algunos casos, también se divulga un vector que contiene cualquiera de los polinucleótidos o casetes de expresión divulgados. En algunos casos de cualquiera de los vectores divulgados, el vector es un vector viral. En algunos casos de cualquiera de los vectores divulgados, el vector es un vector retroviral. En algunos casos de cualquiera de los vectores divulgados, el vector es un vector lentiviral. En algunos casos, el vector viral es un vector lentiviral que se deriva del VIH-1.
En algunos casos, también se divulga una célula que contiene cualquiera de los polinucleótidos divulgados, casetes de expresión o cualquiera de los vectores divulgados. En algunos casos de cualquiera de las células divulgadas, la célula es una célula T, una célula asesina natural (NK), una célula iPS o una célula derivada de iPS.
En algunos casos, también se divulga una partícula de virus que contiene cualquiera de los vectores divulgados.
En algunos casos, también se divulgan métodos que incluyen introducir cualquiera de los polinucleótidos, casetes de expresión, vectores o partículas de virus divulgados en una célula, en condiciones en las que se produce la expresión de la proteína recombinante en la célula. En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados, la introducción se efectúa transduciendo la célula con el vector o la partícula de virus. En algunos casos, la introducción se efectúa transfectando la célula con el vector; y/o la introducción se efectúa por electroporación de la célula con el vector. En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados, la proteína recombinante se expresa a un nivel que aumenta en comparación con el que se logra introduciendo el vector en ausencia del PRE modificado o un vector correspondiente que no contiene el PRE modificado o un PRE.
También se divulga una célula o células producidas por cualquiera de los métodos divulgados.
También se divulga una composición farmacéutica que contiene una célula de cualquiera de los casos divulgados y un portador farmacéuticamente eficaz.
También se divulgan métodos de tratamiento que incluyen administrar a un sujeto que tiene una enfermedad o afección cualquiera de los polinucleótidos, vectores, partículas de virus, células o composiciones farmacéuticas divulgados.
En algunos casos de cualquiera de los métodos de tratamiento divulgados, el método da como resultado la expresión de la proteína recombinante codificada por el polinucleótido. En algunos casos, la proteína recombinante comprende un receptor recombinante que se une específicamente a un ligando expresado por la enfermedad o afección o una célula o tejido de la misma. En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados, el receptor es un receptor de antígeno y el ligando es un antígeno específico para y/o está asociado con la enfermedad o afección. En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados, la enfermedad o afección es un cáncer y un trastorno autoinmune o una enfermedad infecciosa.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 representa la secuencia de ácidos nucleicos de un WPRE ejemplar expuesto en la SEQ ID NO: 1. Lo ácidos nucleicos correspondientes a subelementos de PRE informados (Donello et al. (1998) J. Virol., 72:5085; Smith et al. (1998) Nucleic Acids Research,26:4818) se indican de la siguiente manera: un subelemento gamma, un subelemento alfa y un subelemento beta se indican mediante líneas continuas con flechas que indican las posiciones iniciales y finales; los nucleótidos correspondientes a porciones ejemplares que forman una horquilla de los subelementos alfa y beta, respectivamente, se indican con una línea discontinua y en cursiva; los nucleótidos correspondientes a un promotor de proteína de WHX se indican con una línea de trazos y puntos y en cursiva; y los nucleótidos correspondientes al gen X truncado contenido en este WPRE ejemplar están subrayados. Se entiende que la descripción de elementos de la misma se deriva teórica o empíricamente. Por tanto, el locus exacto puede variar (por ejemplo, ser más largo o más corto), y un elemento correspondiente no es necesariamente el mismo para cada PRE, como para cada especie o subespecie de PRE.
Las Figuras 2A-2E representan alineaciones ejemplares de la secuencia de WPRE expuesta en la SEQ ID NO: 1 con otros PRE de hepatitis ejemplares, e identifica los residuos correspondientes. El símbolo "I" entre dos nucleótidos alineados indica que los nucleótidos alineados son idénticos. La ausencia de "I" entre dos nucleótidos alineados indica que los nucleótidos alineados no son idénticos. El símbolo “-” indica un espacio en la alineación. Las posiciones ejemplares no limitativas correspondientes a un codón de inicio del gen X se indican con texto en negrita y cursiva. Las posiciones ejemplares, no limitativas dentro de un gen X que corresponden a posiciones en las que puede introducirse un codón de terminación, están en recuadros. Tales posiciones corresponden a un residuo inicial ejemplar (por ejemplo, posición 3' de un codón de terminación) para el posicionamiento de un codón de terminación introducido. Por ejemplo, la Figura 2A representa la alineación de la secuencia de WPRE ejemplar expuesta en la SEQ ID NO: 1 con los ácidos nucleicos correspondientes a la secuencia de WPRE ejemplar expuesta en la SEQ ID NO: 12. la Figura 2B representa la alineación de la secuencia de WPRE ejemplar expuesta en la SEQ ID NO: 1 con los ácidos nucleicos correspondientes a la secuencia de WPRE ejemplar expuesta en la SEQ ID NO: 13. la Figura 2C representa la alineación de la secuencia de WPRE ejemplar expuesta en la SEQ ID NO: 1 con los ácidos nucleicos correspondientes a la secuencia de WPRE modificada ejemplar expuesta en la SEQ ID NO: 119. la Figura 2D representa la alineación de la secuencia de WPRE ejemplar expuesta en la SEQ ID NO: 1 con los ácidos nucleicos correspondientes a una secuencia de PRE del virus de la hepatitis B de ardilla de tierra ejemplar expuesta en la SEQ ID NO: 27. la Figura 2E representa la alineación de la secuencia de WPRE ejemplar expuesta en la SEQ ID NO: 1 con los ácidos nucleicos correspondientes a una secuencia de PRE del virus de la hepatitis B humana (HBV) ejemplar expuesta en la SEQ ID NO: 21.
Descripción detallada
I. Polinucleótidos y vectores virales que contienen un elemento regulador postranscripcional (PRE) modificado
Se divulgan polinucleótidos útiles para potenciar la expresión de moléculas recombinantes, como proteínas recombinantes. Los polinucleótidos contienen elementos reguladores postranscripcionales modificados (PRE modificados), como elementos reguladores postranscripcionales que actúan en cis, incluyendo versiones modificadas de elementos reguladores postranscripcionales virales, como versiones modificadas de PRE derivados de virus de la hepatitis, como el virus de la hepatitis de la marmota (WHV) y virus de la hepatitis B (VHB).
En algunos casoss, los PRE modificados incluyen versiones modificadas de elementos reguladores postranscripcionales de WHV (WPRE) de tipo salvaje o versiones modificadas de elementos reguladores postranscripcionales del VHB (HBVPRE), incluyendo aquellas con modificaciones que reducen el riesgo de que la o las proteínas o el o los polipéptidos, particularmente aquellos que tienen potencial oncogénico o inmunogénico para los sujetos hospedadores, se expresarán a partir de la secuencia codificante dentro del PRE y/o que, si se producen, se retendrán tales proteínas. En general, la secuencia de los PRE de tipo salvaje contiene un marco de lectura abierto (ORF) que codifica un gen X parcial que codifica una proteína X truncada que, en algunos casos, puede estar implicada en la tumorigénesis cuando se expresa. Además, como los PRE se usan generalmente para potenciar la expresión transgénica de un vector de expresión, la administración de un vector que contiene un p Re también puede dar como resultado la expresión exógena de la proteína X truncada que puede contribuir a la inmunogenicidad cuando se administra a un sujeto.
Los PRE modificados divulgados incluyen un gen X variante, el gen X variante incluyendo una o más modificaciones de nucleótidos en comparación con un gen X del virus de la hepatitis de tipo salvaje o no modificado. Tales modificaciones generalmente reducen el potencial de oncogénesis y/o inmunogenicidad tras la introducción en un sujeto de un polinucleótido (por ejemplo, vector viral) que contiene tal PRE modificado enlazado operativamente al ácido nucleico que codifica una molécula recombinante para la expresión de la molécula recombinante, por ejemplo, evitando la expresión de ciertas proteínas codificadas por el PRE. Por ejemplo, la o las modificaciones generalmente incluyen aquellas diseñadas para evitar o reducir la probabilidad de expresión de polipéptidos del gen X variante del PRE modificado. Las modificaciones son tales que el PRE modificado conserva por lo menos alguna actividad reguladora postranscripcional, como toda o una parte de la actividad reguladora postranscripcional de un PRE de tipo salvaje correspondiente. En algunos casos, se conserva por lo menos o por lo menos aproximadamente el 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más de la actividad reguladora postranscripcional.
Mientras que los vectores virales pueden proporcionar un sistema eficaz para la introducción de material genético en las células, es posible que el uso de ciertos vectores virales no siempre produzca los niveles de expresión deseados de dicho material genético. La inserción de intrones se usa para potenciar la expresión en algunos contextos, pero puede que no siempre sea apropiada en ciertos vectores virales. Se han empleado elementos reguladores postranscripcionales de la hepatitis (HPRE), como el elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE), para potenciar la expresión génica.
Los PRE derivados del virus de la hepatitis, incluyendo los WPRE y los HBVPRE, generalmente promueven, por ejemplo, potencian, la expresión de transgenes enlazados operativamente a los mismos, facilitando la exportación de ARN postranscripcional desde el núcleo. Las estructuras secundarias y terciarias formadas por secuencias que actúan en cis o elementos contenidos dentro de los PRE pueden promover tales funciones. Por ejemplo, los PRE derivados del virus de la hepatitis de tipo salvaje generalmente incluyen un subelemento alfa y un subelemento beta, cada uno de los cuales forma independientemente estructuras de horquilla, que afectan y/o están implicadas en la actividad postranscripcional completa del PRE (Smith et al. (1998) INucleic Acids Research, 26: 4818-4827). Algunos PRE de virus de la hepatitis no humanos de tipo salvaje, como WPRE, también incluyen un subelemento gamma que puede potenciar adicionalmente la actividad postranscripcional. Tales subelementos pueden tener o codificar ARN que tienen estructuras que promueven la exportación de ARN desde el núcleo, por ejemplo, mediante la interacción con maquinaria de exportación dependiente y/o independiente de CRM1, proporcionar sitios de unión para proteínas celulares, aumentar la cantidad total de ARN, por ejemplo, ARN recombinante y/o heterólogo, transcripciones, aumentar la estabilidad del ARN, aumentar el número de transcripciones poliadeniladas y/o aumentar el tamaño de las colas poliadeniladas en tales transcripciones.
Además de proporcionar una función potenciadora de la expresión a través de estas secuencias que actúan en cis, los PRE del virus de la hepatitis de tipo salvaje y no modificado, incluyendo los PRE derivados del virus de la hepatitis de mamíferos, como HBVPRE o WPRE, contienen una porción de un gen X viral, que incluye por lo menos un marco de lectura abierto parcial que codifica por lo menos una proteína X truncada. Esta región generalmente se solapa, por lo menos en parte, con los subelementos reguladores que actúan en cis. Las proteínas X, sin embargo, incluso ciertas proteínas X truncadas, pueden mostrar potencial oncogénico cuando se incluyen en vectores para la expresión génica en sujetos. Las mutaciones realizadas en la región del gen X de los PRE, por ejemplo, en el sitio de inicio y/o en la región promotora, no son necesariamente del todo satisfactorias para abordar estas preocupaciones. Por ejemplo, incluso un promotor mutante con actividad disminuida puede permitir cierto grado de expresión de la proteína X del PRE u otro polipéptido codificado por la región. La reversión o mutación adicional en una o más posiciones del gen X podría restaurar o aumentar los niveles de expresión de la proteína X, promoviendo la oncogenicidad. Incluso aparte del potencial oncogénico, el riesgo de expresión de cualquier polipéptido, particularmente de por lo menos una cierta longitud (por ejemplo, por lo menos 8, 9, 10, 11 o 12 aminoácidos de longitud o más), de la proteína X u otro marco de lectura dentro de esta región o enlazado operativamente con el promotor, puede promover la inmunogenicidad cuando se administra a un sujeto. Se divulgan ácidos nucleicos con PRE modificados que abordan estos problemas.
Típicamente, la región X de un PRE incluye un marco de lectura parcial que codifica una proteína X truncada que es menor que la proteína X de la hepatitis de longitud completa, por ejemplo, que tiene menos de 141 aminoácidos de longitud, como menos de 130 nucleótidos, menos de 120 nucleótidos, menos de 110 nucleótidos, menos de 100 nucleótidos, menos de 90 nucleótidos, menos de 80 nucleótidos, menos de 70 nucleótidos y generalmente menos de 60, 50, 40, 30, 20, 10 o menos nucleótidos de longitud. Como se ejemplifica en el WPRE ejemplar de tipo salvaje mostrado en la Figura 1, el promotor X y el marco de lectura parcial se superponen con las secuencias que actúan en cis alfa y beta. La traducción de tal marco de lectura abierto parcial puede dar como resultado una proteína X truncada codificada, que puede tener el potencial de promover la tumorigénesis y/o una reacción inmunogénica tras la introducción en un sujeto.
Por ejemplo, con referencia al WPRE ejemplar expuesto en la SEQ ID NO: 1 (correspondiente a los nucleótidos 1093-1684 de la SEQ ID NO: 2 o N° de registro GenBank J04514.1), los nucleótidos 411-592 corresponden a un marco de lectura abierto de proteína X parcial bajo el control operativo de un promotor X expueto como los nucleótidos 391-410. La traducción de las transcripciones iniciada a partir del promotor X codifica una proteína X truncada. Aunque generalmente no está completamente representado en un PRE, un marco de lectura abierto de proteína X de longitud completa ejemplar correspondiente es 425 pares de bases y corresponde a los nucleótidos 1503-1928 de la secuencia del virus de la hepatitis ejemplar expuesta en la SEQ ID NO: 2 bajo el control operativo del promotor X correspondiente a los nucleótidos 1483-1502. Otros PRE de virus de la hepatitis de mamíferos de tipo salvaje o no modificados también pueden contener un marco de lectura abierto de proteína X parcial. En la Tabla 1 se exponen PRE del virus de la hepatitis de mamíferos de tipo salvaje o no modificados ejemplares, y el marco de lectura abierto de la proteína X parcial correspondiente. Los residuos en cualquier PRE, como cualquier PRE de mamífero, que corresponden a residuos en el WPRE ejemplar expuesto en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125 (que contiene los nucleótidos 1-589 de la SEQ ID NO: 1), pueden identificarse mediante alineación de la secuencia de longitud completa del PRE de cada uno como se ejemplifica en la Figura 2A-2E para secuencias ejemplares. Los ejemplos no limitativos de residuos correspondientes que pueden identificarse incluyen, por ejemplo, residuos de cualquier elemento que actúa en cis o porción del mismo (por ejemplo, alfa, beta o gamma o porción de los mismos), residuos del marco de lectura abierto de la proteína X, residuos de un codón de inicio, residuos para la introducción de un codón de terminación.
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En casos de los PRE modificados divulgados, el gen X variante contenido en los mismos son variantes de un gen X no modificado o de tipo salvaje. El gen X no modificado puede ser cualquiera que incluya un marco de lectura del gen X parcial, como un marco de lectura abierto del gen X presente en un PRE no modificado o de tipo salvaje. Por ejemplo, las variantes del gen X del PRE modificado incluyen porciones de genes X del virus de la hepatitis de mamíferos, que pueden contener un marco de lectura abierto de la proteína X parcial y codificar una proteína X truncada, típicamente modificada adicionalmente para incluir uno o más codones de terminación u otra modificación para reducir el riesgo de oncogenicidad y/o inmunogenicidad. Por ejemplo, los genes X variantes incluyen variantes de una porción del gen X de tipo salvaje. En algunos casos, el gen X variante puede contener por lo menos 180 nucleótidos de longitud pero menos nucleótidos que los contenidos en un gen X del virus de la hepatitis de longitud completa, por ejemplo, menos de 425 nucleótidos de longitud. Generalmente, el PRE modificado en el que está contenido el gen X variante contiene una porción suficiente de las secuencias reguladoras en cis (por ejemplo, uno o más de un subelemento alfa, beta y/o gamma, porción o porciones de los mismos y/o variante o variantes funcionales de los mismos) para regular la actividad postranscripcional de una transcripción de ARN.
Las modificaciones de nucleótidos en una variante del gen X de un PRE modificado pueden incluir deleciones, inserciones y/o sustituciones de nucleótidos. Tales modificaciones pueden incluir cambios de nucleótidos en una región del PRE que codifica la proteína X viral o una porción de la misma que incluyen, pero no se limitan a, cambios de nucleótidos que dan como resultado un codón de terminación, una secuencia que se dirige a una proteína para su degradación y combinaciones de los mismos. Las modificaciones típicamente son tales que el PRE modificado conserva por lo menos alguna actividad reguladora postranscripcional, como toda o una parte de la actividad reguladora postranscripcional de un PRE de tipo salvaje correspondiente o un PRE no modificado (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 125), u otro p Re modificado conocido en la técnica por tener un grado suficiente de actividad para su uso en la transducción de vectores virales, como el PRE que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 119 o la SEQ ID NO: 120. En algunos casos, los PRE modificados se divulgan en un vector de expresión (por ejemplo, vector viral) enlazado operativamente al ácido nucleico que codifica una proteína recombinante, como una proteína heteróloga. Heterólogo en este contexto se refiere a una proteína que no se expresa normalmente a partir de un virus y/o no está codificada por un genoma viral. En algunos casos, la proteína heteróloga no es expresada por el virus de la hepatitis del que se deriva el PRE. En cualquiera de tales casos, los PRE modificados divulgados pueden potenciar la expresión del ácido nucleico que codifica una proteína recombinante, por ejemplo, en comparación con la expresión de la proteína recombinante de un vector de expresión que no contiene un PRE.
En algunos casos, los PRE modificados divulgados muestran actividad postranscripcional, por ejemplo para potenciar la expresión de un ácido nucleico enlazado operativamente, a la vez que se evita o reduce la probabilidad de oncogénesis tras la introducción y/o expresión en un sujeto. Por ejemplo, la expresión no deseada de proteínas X funcionales de longitud completa o truncadas codificadas por PRE puede promover la oncogénesis. En algunos casos, los PRE modificados contienen un gen X variante que incluye modificaciones que previenen o reducen la probabilidad de expresión de una proteína no deseada, como una proteína X viral o una porción funcional de la misma, reduciendo de este modo el riesgo de oncogénesis. Por ejemplo, tales modificaciones pueden incluir cambios de nucleótidos que introducen uno o más codones de terminación en el gen X variante, como codones de terminación no presentes en el gen X no modificado o de tipo salvaje, de tal manera que no se exprese una proteína no deseada, como una proteína X o una porción funcional de la misma suficiente para provocar oncogénesis, y/o cualquier péptido con potencial oncogénico. En otros ejemplos, tales modificaciones incluyen cambios de nucleótidos que introducen una señal de modificación postraduccional, como un sitio de ubiquitinación, en el gen X variante no presente en el gen X no modificado o de tipo salvaje, de tal manera que la proteína X codificada se dirige a degradación.
En algunos casos, los PRE modificados divulgados incluyen además modificaciones (por ejemplo, una inserción, sustitución o reemplazo o deleción de nucleótidos) en el promotor del gen X y/o el codón de inicio en comparación con un PRE no modificado o de tipo salvaje. En algunos casos, el PRE modificado divulgado no incluye una modificación en el promotor del gen X. En algunos casos, el PRE modificado divulgado no incluye una modificación en el codón de inicio del gen X. En algunos casos, el PRE modificado divulgado no incluye modificaciones en el promotor del gen X y el codón de inicio del gen X. En otros casos, el promotor del gen X y/o el codón de inicio es de tipo salvaje.
En algunos casos, hay más de una modificación que afecta a la expresión de la proteína X codificada por el gen X variante en el PRE modificado. Por ejemplo, en algunos casos, el PRE modificado contiene un gen X variante que contiene una pluralidad de codones de terminación que no están presentes en el PRE no modificado o de tipo salvaje correspondiente, como por lo menos 2, 3, 4, 5, 6 o más codones de terminación. Debido a la presencia de múltiples cambios de nucleótidos, como para efectuar la introducción de una pluralidad de codones de terminación, los PRE modificados divulgados pueden reducir la probabilidad de expresión de la proteína X resultante de la reversión a la secuencia no modificada, como una secuencia de tipo salvaje. En algunos casos, una pluralidad de codones de terminación puede incluir un codón de terminación en cada marco de lectura del gen X variante, y/o múltiples codones de terminación en un solo marco de lectura, reduciendo de este modo la probabilidad de expresión de proteínas no deseada. En algunos casos, se incluyen por lo menos 3 codones de terminación, por ejemplo, para cubrir los tres marcos de lectura, que, en algunos casos, pueden ser secuenciales.
Los PRE modificados divulgados contienen características que pueden reducir el riesgo de oncogenicidad debido a la reversión a la secuencia de tipo salvaje del gen X presente en el PRE o sitio de inicio o promotor del mismo y/o la expresión de otros polipéptidos oncogénicos debido a otras mutaciones. Tales características pueden proporcionar ventajas sobre las secuencias reguladoras postranscripcionales modificadas disponibles, como las que contienen modificaciones solo en el promotor de la proteína X y/o el codón de inicio (ver la Patente de Estados Unidos N° 7.419.829). Por ejemplo, incluso los promotores mutados pueden no necesariamente dar como resultado una ausencia completa de expresión de proteínas del promotor. Al incorporar múltiples modificaciones para producir múltiples codones de terminación en el gen X variante, los PRE modificados divulgados en algunos casos previenen o reducen la probabilidad de péptidos oncogénicos o inmunogénicos, incluso en el contexto de tale promotores permeables.
En algunos casos, los PRE modificados divulgados que contienen un gen X variante pueden reducir la probabilidad de inmunogenicidad de la proteína X tras la introducción en un sujeto. Por ejemplo, para reducir la posibilidad de crear un epítopo inmunogénico a partir de una proteína X variante expresada, el uno o una pluralidad de codones de terminación pueden comenzar lo suficientemente cerca del codón de inicio del marco de lectura abierto de la proteína X para evitar la expresión de un polipéptido que contiene un epítopo que podría inducir una respuesta inmune no deseada. En algunos casos, tales características aseguran o aumentan la probabilidad de que, tras la introducción en un sujeto, el gen X variante en el PRE modificado no dé como resultado la expresión de ningún polipéptido que tenga un epítopo potencialmente inmunogénico. En algunos casos, el polinucleótido que contiene un PRE modificado incluye por lo menos un codón de terminación, por ejemplo el primer codón de terminación o cada uno de una pluralidad de codones determinación introducidos presentes en el gen Xvariante del PRE modificado, comenzando en una posición dentro de por lo menos 18 o 21 o 24 o 27 o 30 o 33 o 36 nucleótidos de un codón de inicio del gen X variante (por ejemplo, de la primera posición de tal codón de inicio) o de un codón correspondiente a un codón de inicio en la secuencia de tipo salvaje o no modificada correspondiente. En algunos ejemplos de tales casos, tales características aseguran que no se produzca ningún polipéptido de más de 6 o 7 u 8 o 9 o 10 u 11 o 12 aminoácidos de longitud codificados por el PRE, por ejemplo, incluso en el caso de un codón de inicio o promotor de tipo salvaje o no modificado o reversión al mismo u otra mutación que dé como resultado un codón de inicio y/o promotor funcional. En algunos casos, el polinucleótido que contiene un PRE modificado incluye un codón de terminación, por ejemplo, el primer codón de terminación cada uno de una pluralidad de codones de terminación presentes en el gen X variante del PRE modificado, comenzando en una posición dentro de por lo menos 9, 12, o 15 nucleótidos de un codón de inicio del gen X variante (por ejemplo, de la primera posición de tal codón de inicio) o de un codón correspondiente a un codón de inicio en la secuencia de tipo salvaje o no modificada correspondiente.
Los polinucleótidos divulgados incluyen aquellos con PRE modificados diseñados para promover ventajas de seguridad, por ejemplo, reducción de la oncogénesis y/o inmunogenicidad, mientras se mantiene un grado suficiente de actividad postranscripcional, como la función potenciadora de la expresión. Por tanto, los PRE modificados de los polinucleótidos divulgados generalmente también están diseñados para conservar una cantidad suficiente de actividad postranscripcional, como la función potenciadora de la expresión, del PRE no modificado o de tipo salvaje correspondiente. Como se ha descrito anteriormente, la región de un virus de la hepatitis, como WHV, que codifica la proteína X generalmente se solapa con las características estructurales de un PRE de dicho virus que son importantes para su función potenciadora de la expresión. En algunos casos, los sitios y/o la naturaleza de las modificaciones en los PRE modificados, como los que introducen el codón o codones de terminación y/o la secuencia o secuencias codificadoras de señales postraduccionales como se describen están diseñadas para minimizar las alteraciones de cierta estructura secundaria o terciaria codificada por PRE. En algunos casos, tales modificaciones se introducen en regiones del PRE distintas de las que codifican una estructura de horquilla de un subelemento de PRE, como una estructura de horquilla de un subelemento alfa y/o beta de un PRE. En algunos casos, no se introduce ningún codón de terminación o se realiza una modificación dentro de un subelemento alfa mínimo que codifica la estructura de horquilla alfa o dentro de una parte del subelemento beta que codifica la estructura de horquilla beta. En algunos casos, si se introduce una modificación en una estructura de horquilla, las modificaciones se realizan seleccionando nucleobases que son diferentes de las nucleobases de tipo salvaje o no modificadas correspondientes y aún mantienen la o las estructuras secundarias o terciarias del PRE. Por ejemplo, en algunos casos, cuando se modifica una modificación de una cierta posición dentro de una estructura de formación de horquilla, por ejemplo, para introducir un codón de terminación, puede realizarse una modificación complementaria en otra posición para permitir la formación de una estructura secundaria o terciaria similar o igual a la de la secuencia de tipo salvaje o no modificada, por ejemplo, una estructura de horquilla.
También entre los polinucleótidos divulgados están los polinucleótidos que contienen una secuencia Flap variante (polinucleótidos “Flap variante”). Los polinucleótidos de Flap variante incluyen polinucleótidos, como los que contienen uno o más ácidos nucleicos virales, en los que se han eliminado una o más secuencias de Flap o porción de las mismas. Tales polinucleótidos Flap variantes incluyen casetes de expresión y vectores, como vectores virales, para la expresión de moléculas recombinantes, como proteínas recombinantes, por ejemplo, heterólogas. En algunos casos, los polinucleótidos que comprenden los PRE modificados comprenden además variaciones en las secuencias Flap y/o son polinucleótidos Flap variantes. En general, la o las variaciones en el Flap son tales que todavía permiten y/o no interrumpen sustancialmente la administración o la expresión viral de la molécula recombinante, por ejemplo, en una célula huésped.
También se divulgan casetes de expresión que contienen los polinucleótidos, que generalmente incluyen además un promotor operativamente enlazado a la secuencia que codifica la proteína recombinante, como la proteína heteróloga, y vectores que contienen tales polinucleótidos y casetes de expresión, incluyendo vectores retrovirales como vectores lentivirales y gamma-retrovirales. También se divulgan virus y células que contienen tales polinucleótidos, casetes y/o vectores, incluyendo células de empaquetamiento y células huésped, como células T y composiciones que las contienen. También se divulgan métodos y usos de tales casos, incluyendo métodos y usos terapéuticos, como los que implican la administración del virus, vector y/o células a un sujeto en una cantidad eficaz para tratar o prevenir una enfermedad o afección.
A. PRE modificados
Los PRE modificados en los polinucleótidos divulgados contienen genes X variantes. Los genes X variantes son variantes de genes X de hepatitis no modificados, típicamente de tipo salvaje. Los genes X variantes incluyen una y típicamente más de una modificación en comparación con el gen X de tipo salvaje u otro gen no modificado. En particular, el gen X variante generalmente incluye una o más modificaciones diseñadas para prevenir o reducir la probabilidad de que una proteína o péptido no deseado codificado por una secuencia dentro del gen X y/o PRE se exprese y/o se mantenga, por ejemplo, tras la introducción en un sujeto. Las modificaciones pueden incluir deleciones, sustituciones y/o inserciones de nucleótidos en comparación con la secuencia no modificada, por ejemplo, de tipo salvaje.
En algunos casos, las modificaciones incluyen mutaciones que dan como resultado la presencia de un codón de terminación en el gen X variante del PRE modificado no presente en el gen X de tipo salvaje o no modificado de otra manera correspondiente, como no presente en el PRE de tipo salvaje o no modificado de otra manera correspondiente que contiene un gen X parcial. En algunos casos, tales modificaciones acortan el marco de lectura abierto que codifica la proteína X en comparación con un gen X de tipo salvaje o un fragmento de gen X dentro de un PRE de tipo salvaje o no modificado. En algunos casos, las modificaciones dan como resultado un PRE modificado en el que el gen X variante contiene un marco de lectura abierto de la proteína X que no tiene más de 9, 12, 15, 18 o 21 nucleótidos de longitud. En algunos casos, las modificaciones en el gen X variante del PRE modificado evitan la expresión de cualquier proteína del marco de lectura de la proteína X contenida en el mismo que tenga más de 3, 4, 5, 6 o 7 aminoácidos de longitud o que pueda ser inmunogénica para un sujeto o tienen potencial o actividad oncogénica. En algunos casos, si el gen X variante también contiene un sitio de inicio o promotor mutado o modificado, las modificaciones del codón de terminación evitan tal expresión incluso en el caso de una mutación que dé como resultado la reversión a un promotor o sitio de inicio funcional.
En algunos casos, las modificaciones en el gen X variante del PRE modificado evitan la expresión de cualquier polipéptido no deseado, ya sea en el marco de lectura que codifica la proteína X o no. Por ejemplo, en algunos casos, las modificaciones en el gen X variante del PRE modificado evitan la expresión de cualquier péptido o péptido del gen X contenido en el mismo que sea más largo que una cierta longitud, como más largo de 3, 4, 5, 6 o 7 aminoácidos de longitud y/o que pueda ser inmunogénico tras la expresión en un sujeto.
En algunos casos, las modificaciones incluyen aquellas que introducen secuencias codificantes para introducir o dar como resultado secuencias de aminoácidos de degradación posterior a la traducción que se dirigen a proteínas expresadas codificadas por el gen X variante o porción del mismo del PRE modificado para degradación. Las secuencias de degradación ejemplares incluyen señales de ubiquitinación. Por tanto, las modificaciones en el gen X variante del PRE modificado pueden incluir además aquellas que dan como resultado una secuencia de degradación postraduccional, como una secuencia de ubiquitinación, no presente en la proteína correspondiente codificada por un gen X no modificado o de tipo salvaje, como no presente en el PRE de tipo salvaje o no modificado correspondiente que contiene un gen X parcial.
El gen X variante del PRE modificado contiene generalmente una porción de un gen X que incluye menos nucleobases de longitud que un gen X de longitud completa de tipo salvaje correspondiente presente en un virus de hepatitis de tipo salvaje correspondiente. En algún caso, la porción del gen X carece de nucleótidos del gen X que no se superponen y/o que no son importantes o esenciales para la función o funciones reguladoras postranscripcionales del PRE. En algunos casos, la porción del gen X carece de residuos del gen X de un virus de la hepatitis de tipo salvaje que no se encuentra dentro del subelemento o subelementos alfa, beta y/o gamma del PRE y/o regiones funcionales de los mismos. Por tanto, los PRE modificados en la presente generalmente no incluyen genes X de longitud completa o variantes de longitud completa de los mismos. En algunos de tales casos, el gen X variante dentro del PRE modificado generalmente incluye menos de 425, 400, 300, 200 o 180 nucleobases de longitud.
El PRE modificado generalmente contiene uno o más de un subelemento alfa, beta y/o gamma que, en algunos casos, puede ser una variante de dicho subelemento de un PRE de tipo salvaje o no modificado o una porción funcional del mismo, por ejemplo, uno que sea suficiente para la actividad postranscripcional y/o la formación de una horquilla u otra estructura secundaria o terciaria. En algunos casos, generalmente por lo menos algunas de dichas porciones se solapan con la porción del gen X variante del PRE modificado. Por tanto, en algunos casos, una porción del gen X variante puede estar contenida dentro de una porción del subelemento alfa y/o una porción del gen X variante puede estar contenida o solaparse con el subelemento beta. En algunos casos, las modificaciones en el gen X variante de los PRE modificados divulgados en comparación con un gen X de tipo salvaje o no modificado o PRE no ablacionan, reducen y/o interfieren con la actividad postranscripcional para controlar la expresión de un ácido nucleico operativamente enlazado (por ejemplo, molécula recombinante o transgén) mediado por el subelemento o subelementos alfa y/o beta y/o gamma del PRE modificado, y/o no lo hacen sustancialmente, en comparación con la actividad postranscripcional mediada por el subelemento o subelementos de un PRE de tipo salvaje o no modificado correspondiente que no tiene la o las modificaciones o en comparación con otro p Re modificado que se sabe que conserva suficiente actividad, como el que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 119, 120, o 216.
En un caso, los cambios de nucleótidos que introducen codones de terminación y/o secuencia de degradación posterior a la traducción son tales que, a nivel de ARN, no alteran la estructura secundaria y/o terciaria de las secuencias del elemento cis dentro de PRE y/o conservan un grado sustancial de la estructura secundaria y/o terciaria de las secuencias del elemento cis dentro del PRE, en comparación con un PRE de tipo salvaje o no modificado correspondiente y/o PRE que no contiene tales modificaciones. En otro caso, los cambios de nucleótidos que introducen codones de terminación y/o una secuencia de degradación posterior a la traducción, son tales que, a nivel de ARN, los cambios de nucleótidos no alteran la actividad del PRE, por ejemplo, su capacidad para promover la exportación de ARN desde el núcleo, por ejemplo, a través de la interacción con maquinaria de exportación dependiente y/o independiente de CRM1, proporcionar sitios de unión para proteínas celulares, aumentar la cantidad total de ARN, por ejemplo, ARN transgénico, transcripciones, aumentar la estabilidad del ARN, aumentar el número de transcripciones poliadeniladas y/o aumentar el tamaño de las colas poliadeniladas en dichas transcripciones, en comparación con un PRE de tipo salvaje correspondiente y/o PRE que no contenga tales modificaciones, y/o en comparación con otro PRE modificado conocido en la técnica por tener un grado suficiente de actividad para su uso en la transducción de vectores virales o aceptado para su uso en el mismo y/o aceptado para tales usos en el contexto de la terapia génica. En algunos casos, el otro PRE no modificado tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120 o la SEQ ID NO: 216.
En algunos casos, un subelemento beta dentro del PRE modificado incluye por lo menos una porción del gen X variante. En algunos de tales casos, el subelemento beta es una variante funcional o porción de la misma de un subelemento beta de un PRE de tipo salvaje o no modificado, de tal manera que el PRE modificado que contiene la variante funcional o porción del subelemento beta muestra actividad postranscripcional. En algunos casos, la variante funcional del subelemento beta es una variante de un subelemento beta expuesto en la SEQ ID NO: 6 o una porción funcional de la misma. En algunos casos, una variante funcional o porción de un subelemento beta contiene residuos de nucleótidos suficientes para formar una horquilla beta. Por ejemplo, en algunos casos, una variante funcional o porción de un subelemento beta contiene residuos de nucleótidos correspondientes a los residuos de nucleótidos 448-470 de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125, como la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 7. En aspectos del PRE modificado divulgado en la presente, el gen X variante no contiene un cambio de nucleótidos dentro de ningún nucleótido correspondiente a los nucleótidos 448-470 de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125 y/o en una región de nucleótidos correspondiente a nucleótidos expuestos en la SEQ ID NO: 7. En algunos casos, donde una modificación, por ejemplo para introducir un codón de terminación, está en una base de nucleótidos correspondiente a uno o más de los nucleótidos 448-470 de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125 y/o uno o más nucleótidos correspondientes a los nucleótidos expuestos en la SEQ ID NO: 7, puede realizarse una modificación complementaria en otra posición para permitir la formación de una estructura secundaria o terciaria similar o igual que la horquilla beta de la secuencia de tipo salvaje o no modificada.
En algunos casos de un PRE modificado que contiene un subelemento alfa, el subelemento alfa modificado puede ser de un PRE de hepatitis no modificado, como un PRE de hepatitis de tipo salvaje, o puede ser una variante funcional del mismo de tal manera que el PRE modificado que contiene la variante funcional del subelemento alfa muestra actividad postranscripcional. En algunos casos, el subelemento alfa se expone en la SEQ ID NO: 3 o se expone en la SEQ ID NO: 4, o es una variante funcional o porción de la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 4. En algunos casos, una variante funcional o porción de un subelemento alfa contiene residuos de nucleótidos suficientes para formar una horquilla alfa. Por ejemplo, en algunos casos, una variante funcional de un subelemento alfa contiene residuos de nucleótidos correspondientes a los residuos de nucleótidos 329-366 de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125, como la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 5. En aspectos del PRE modificado divulgado en la presente, el PRE modificado no contiene un cambio de nucleótidos dentro de ningún nucleótido correspondiente a los nucleótidos 329-366 de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125 y/o en una región de nucleótidos correspondiente a nucleótidos expuestos en la SEQ ID NO: 5. En algunos casos, donde una modificación es en una base de nucleótidos correspondiente a uno o más de los nucleótidos 329-366 de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125 y/o uno o más nucleótidos correspondientes a los nucleótidos expuestos en la SEQ ID NO: 5, puede realizarse una modificación complementaria en otra posición para permitir la formación de una estructura secundaria o terciaria similar o igual a una horquilla alfa de la secuencia de tipo salvaje o no modificada.
En un caso, el PRE modificado contiene por lo menos un subelemento alfa y beta, como una variante funcional de un subelemento alfa y beta, por lo menos una parte del cual generalmente se solapa con el gen X variante. En algunos casos, el PRE modificado contiene un subelemento gamma o una variante funcional del mismo. En casos de un PRE modificado que contiene un subelemento gamma, el subelemento gamma modificado puede ser de un PRE de hepatitis no modificado, como un PRE de hepatitis de tipo salvaje, o puede ser una variante funcional del mismo de tal manera que el PRE modificado que contiene la variante funcional del subelemento gamma conserva la actividad postranscripcional. En algunos casos, el subelemento gamma se expone en la SEQ ID NO: 8, o es una variante funcional o porción de la SEQ ID NO: 8.
Las modificaciones de nucleótidos, como las que se encuentran dentro del gen X variante, de un PRE modificado pueden incluir deleciones, inserciones y/o sustituciones de nucleótidos. El gen X variante puede contener por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 o 50 cambios de nucleótidos en comparación con el gen X del PRE no modificado, como un PRE de tipo salvaje. En algunos casos, el gen X variante contiene no más de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 cambios de nucleótidos. En algunos casos, el gen X variante tiene una secuencia de nucleótidos que muestra por lo menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con el gen X expuesto en la SEQ ID NO: 10, con la secuencia de nucleótidos 391-592 de cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 12-20, 119 o 120 o con la secuencia de nucleótidos 391-589 de la SEQ ID NO: 125 o 216, en la que el gen X variante contiene por lo menos un codón de terminación no presente y/o una secuencia que codifica una señal de modificación postraduccional o secuencia de degradación no presente en el mismo. Por ejemplo, en algunos casos, el gen X variante tiene una secuencia de nucleótidos que muestra por lo menos un 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con el gen X expuesto en la SEQ ID NO: 10, con la secuencia de los nucleótidos 391-592 de la SEQ ID NO: 1 o con la secuencia de los nucleótidos 391-589 de la SEQ ID NO: 125, en la que el gen X variante contiene por lo menos un codón de terminación no presente en el mismo y/o una secuencia que codifica una señal de modificación postraduccional o una secuencia de degradación no presente en el mismo. En algunos casos, el PRE modificado tiene una secuencia de nucleótidos que muestra por lo menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con el PRE expuesto en cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 12-20, 119, 120, 125 o 216, en la que el PRE contiene por lo menos un codón de terminación no presente en el mismo y/o una secuencia que codifica una señal de modificación postraduccional o una secuencia de degradación no presente en el mismo. Por ejemplo, en algunos casos, el PRE modificado tiene una secuencia de nucleótidos que muestra por lo menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con el PRE expuesto en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125, en la que el PRE modificado contiene por lo menos un codón de terminación no presente en el mismo y/o una secuencia que codifica una señal de modificación postraduccional o secuencia de degradación no presente en el mismo.
En algunos casos, el gen X variante es un gen X parcial, como una porción de genes X de tipo salvaje, que tiene una secuencia que es menor que la secuencia de longitud completa del gen X de un virus de la hepatitis, como un virus de hepatitis de tipo salvaje, como el virus de la hepatitis de mamíferos. Por ejemplo, en algunos casos, el PRE modificado contiene un gen X variante que tiene menos o no más de 250 nucleótidos de longitud o aproximadamente 250 nucleótidos, como menos de o no más de 240 nucleótidos, 230 nucleótidos, 220 nucleótidos, 210 nucleótidos, 200 nucleótidos, 190 nucleótidos, 180 nucleótidos, 170 nucleótidos, 160 nucleótidos, 150 nucleótidos, 140 nucleótidos, 130 nucleótidos, 120 nucleótidos, 110 nucleótidos, 100 nucleótidos, 90 nucleótidos, 80 nucleótidos o 70 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el PRE modificado contiene un gen X variante que tiene por lo menos 60 nucleótidos de longitud pero es menor que la secuencia de longitud completa del gen X de un virus de la hepatitis, como un virus de la hepatitis de tipo salvaje, como un virus de la hepatitis de mamíferos. Por ejemplo, en algunos casos, el PRE modificado contiene un gen X variante que tiene por lo menos 60 nucleótidos de longitud pero es menor o no mayor de o aproximadamente 250 nucleótidos de longitud, como menor o no mayor de o aproximadamente 240 nucleótidos, 230 nucleótidos, 220 nucleótidos, 210 nucleótidos, 200 nucleótidos, 190 nucleótidos, 180 nucleótidos, 170 nucleótidos, 160 nucleótidos, 150 nucleótidos, 140 nucleótidos, 130 nucleótidos, 120 nucleótidos, 110 nucleótidos, 100 nucleótidos, 90 nucleótidos, 80 nucleótidos o 70 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el PRE modificado contiene un gen X variante que tiene por lo menos o aproximadamente por lo menos 180 nucleótidos de longitud.
En algunos casos, el PRE modificado que contiene el gen X variante es una variante de un PRE no modificado, como un PRE de hepatitis de tipo salvaje, que contiene un gen X o una porción del mismo. Por ejemplo, el gen X variante puede ser una variante de un PRE de hepatitis de tipo salvaje que tiene un gen X que es menor que la secuencia completa del gen X correspondiente del virus de la hepatitis, como un virus de la hepatitis de tipo salvaje, como el virus de la hepatitis de mamíferos. El gen X no modificado o de tipo salvaje puede contener un gen X que tiene menos o no más de o aproximadamente 250 nucleótidos de longitud, como menos de o no más de o aproximadamente 240 nucleótidos, 230 nucleótidos, 220 nucleótidos, 210 nucleótidos, 200 nucleótidos, 190 nucleótidos, 180 nucleótidos, 170 nucleótidos, 160 nucleótidos, 150 nucleótidos, 140 nucleótidos, 130 nucleótidos, 120 nucleótidos, 110 nucleótidos, 100 nucleótidos, 90 nucleótidos, 80 nucleótidos o 70 nucleótidos de longitud.
En algunos casos, el PRE no modificado, como el PRE de hepatitis de tipo salvaje, es uno que contiene un gen X que tiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína X funcional, por ejemplo, una proteína X truncada. En tal caso, el gen X variante contiene un codón de inicio para iniciar la traducción de la proteína X. En algunos casos, el codón de inicio es un codón de inicio ATG. En algunos casos, el gen X variante contiene un codón de inicio correspondiente a un codón de inicio que comienza en una posición correspondiente a la posición 411 de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125. En algunos casos, el PRE no modificado, como un PRE de tipo salvaje, puede contener un marco de lectura abierto que codifica una proteína X que tiene por lo menos 30 aminoácidos de longitud, como por lo menos 40 aminoácidos, 50 aminoácidos, 60 aminoácidos, 70 aminoácidos u 80 aminoácidos.
El PRE modificado generalmente contiene un gen X variante que contiene una modificación, por ejemplo, una o más modificaciones de nucleótidos que introducen uno o más codones de terminación y/o secuencia de degradación postraduccional no presente en un gen X de hepatitis no modificado, como no presente en un gen X de la hepatitis de tipo salvaje o su correspondiente versión truncada (por ejemplo, como está presente en un PRE). En algunos casos, el gen X variante contiene una modificación no presente en un gen X de hepatitis de mamífero de tipo salvaje o su correspondiente versión truncada (por ejemplo, como está presente en un p Re ). En algunos casos, el gen X de la hepatitis no modificado o de tipo salvaje o la versión truncada del mismo es un gen X que muestra por lo menos o aproximadamente por lo menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o más identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10 o con los nucleótidos 411-592 de la SEQ ID NO: 1 o con los nucleótidos 411-589 de la SEQ ID NO: 125. En algunos casos, el gen X de la hepatitis de mamífero de tipo salvaje o no modificado o la correspondiente versión truncada del mismo tiene la secuencia de nucleótidos correspondiente a los nucleótidos 411-592 de cualquiera de las SEQ ID NO: 1 o 12-20, los nucleótidos 411-589 de la SEQ ID NO: 125, los nucleótidos 412-722 de cualquiera de las SEQ ID NO: 21-23, los nucleótidos 411-721 de la SEQ ID NO: 25, los nucleótidos 401-582 de la SEQ ID NO: 26 o los nucleótidos 411-592 de la SEQ ID NO: 27. En algunos casos, el gen X de la hepatitis no modificado o de tipo salvaje es un gen X de WHV o la correspondiente versión truncada del mismo que muestra por lo menos o aproximadamente por lo menos un 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9, los nucleótidos 411-592 de la SEQ ID NO: 1 o con los nucleótidos 411­ 589 de la SEQ ID NO: 125. En algunos casos, el gen X de WHV no modificado o de tipo salvaje o la correspondiente versión truncada del mismo tiene la secuencia de nucleótidos correspondiente a los nucleótidos 411-592 de cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 12-20, 119 o 120 o con los nucleótidos 411-589 de la SEQ ID NO: 125 o 216. En algunos casos, el gen X de la hepatitis es un gen X de WHV expuesto en la SEQ ID NO: 9 o una versión truncada correspondiente del mismo expuesta en la SEQ ID NO: 10.
En algunos casos, el gen X variante del PRE modificado contiene diferencias en comparación con un gen X 0 una porción del mismo contenido dentro de un PRE de hepatitis no modificado, como un PRE de hepatitis de tipo salvaje. En algunos casos, tal PRE de hepatitis de tipo salvaje es un PRE de hepatitis de mamífero. En algunos casos, el PRE de mamífero de tipo salvaje o no modificado tiene una secuencia de nucleótidos con por lo menos o aproximadamente por lo menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125. En algunos casos, el PRE de hepatitis de mamífero de tipo salvaje o no modificado tiene la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 1 o 12-27. En algunos casos, el PRE de hepatitis no modificado o de tipo salvaje es un WPRE que muestra por lo menos o aproximadamente por lo menos un 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ NO ID: 125. Por ejemplo, en algunos casos, el WPRE no modificado o de tipo salvaje tiene la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 12-20, 119, 120, 125 o 216.
En algunos casos, el gen X variante está acoplado operativamente a un promotor. En algunos casos, el promotor es un promotor del gen X no modificado o de tipo salvaje. Por ejemplo, el promotor puede tener la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 o una variante funcional o porción de la misma. El promotor puede tener la secuencia de nucleótidos 7-20 de la SEQ ID NO: 11. En algunos casos, el promotor es un promotor del gen X mutante o modificado, como se describe en la subsección I.A.3 a continuación.
En algunos casos, el PRE modificado muestra actividad postranscripcional para mediar, como para potenciar, la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína recombinante, como una proteína heteróloga, enlazada operativamente a la misma, por ejemplo, en comparación con la expresión de un ácido nucleico que no está enlazado operativamente al PRE y/o no está enlazado a ninguna secuencia reguladora cis. En algunos casos, el PRE modificado muestra actividad para promover la exportación de ARN desde el núcleo, proporcionar sitios de unión para proteínas celulares, aumentar la cantidad total de transcripciones de ARN, aumentar la estabilidad del ARN, aumentar el número de transcripciones poliadeniladas y/o aumentar el tamaño de las colas poliadeniladas en tales transcripciones. En algunos casos, el PRE modificado conserva la actividad o un grado sustancial y/o suficiente de actividad del PRE de hepatitis no modificado correspondiente, como el PRE de hepatitis de tipo salvaje, y/o de otro PRE modificado conocido en la técnica que tiene un grado suficiente de actividad para su uso en la transducción de vectores virales, como el PRE que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120 o la SEQ ID NO: 216. En algunos casos, el PRE modificado muestra por lo menos o aproximadamente por lo menos o aproximadamente un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200% o más de la actividad postranscripcional de un PRE no modificado o de tipo salvaje expuesto en cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 12 -27, 119, 120, 125 o 216. En algunos casos, el PRE modificado muestra por lo menos o aproximadamente por lo menos o aproximadamente un 80%, 85%, 90%, 95%, o100% de la actividad del WPRE expuesto en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125.
En algunos de tales casos, la actividad relevante (por ejemplo, del PRE modificado y/u otro PRE, como el PRE no modificado o de tipo salvaje con el que se está comparando), es la mejora o promoción de la expresión de una proteína recombinante codificada por un ácido nucleico enlazado operativamente al PRE modificado. En algunos casos, tal mejora o promoción se evalúa midiendo el nivel de expresión de una proteína recombinante enlazada operativamente al PRE modificado dentro de un vector después de la transducción u otra forma de transferencia del vector a una célula huésped. La mejora puede medirse determinando un grado relativo de dicha expresión en comparación con un vector que no contiene el PRE respectivo. La cuestión de si un PRE modificado tiene la actividad al mismo nivel o grado o un grado sustancial o aceptable del mismo en comparación con un PRE no modificado puede evaluarse usando vectores que contienen los PRE respectivos. Pueden usarse una serie de métodos bien conocidos para evaluar el nivel de expresión de moléculas recombinantes, como detección por métodos basados en afinidad, por ejemplo, métodos basados en inmunoafinidad, por ejemplo, en el contexto de proteínas de la superficie celular, como por citometría de flujo. En algunos ejemplos, la expresión se mide mediante la detección de un marcador de transducción y/o un constructo informador. En algunos casos, el ácido nucleico que codifica una proteína de superficie truncada se incluye dentro del vector y se usa como marcador de expresión y/o potenciación del mismo por el PRE modificado.
1. Codones de terminación
El codón de terminación en los PRE modificados, por ejemplo, dentro del gen X variante (por ejemplo, uno no presente en una posición correspondiente en un gen X o PRE de tipo salvaje o no modificado correspondiente) puede ser un codón de terminación ámbar (TAG), ocre (TAA), o ópalo (TGA). En un caso, el codón de terminación es un codón de terminación ámbar (TAG). En un caso, el codón de terminación es un codón de terminación ópalo (TGA).
El codón determinación puede introducirse mediante sustitución, deleción o inserción de nucleótidos. En un caso, el codón de terminación se introduce mediante sustitución de nucleótidos. La sustitución de nucleótidos minimiza los cambios de nucleótidos, como desplazamientos de marco, que pueden producirse por deleción o inserción de residuos de nucleótidos. Por tanto, las sustituciones de nucleótidos pueden minimizar los cambios estructurales en las secuencias reguladoras en cis implicadas en la actividad de PRE, como el elemento beta o una porción funcional del mismo. En algunos casos, el codón de terminación se forma mediante la sustitución de un solo nucleótido, de tal manera que dos posiciones dentro del codón de terminación representan nucleótidos no modificados presentes en las posiciones correspondientes en la secuencia de tipo salvaje o no modificada. En algunos casos, el codón de terminación se forma mediante la sustitución de dos nucleótidos, de tal manera que solo una posición dentro del codón de terminación represente nucleótidos no modificados presentes en la posición correspondiente en la secuencia de tipo salvaje o no modificada. En algunos casos, el codón de terminación se forma mediante la sustitución de tres nucleótidos, de tal manera que todas las posiciones dentro del codón de terminación difieren en comparación con el codón correspondiente de la secuencia de tipo salvaje o no modificada.
El gen X variante puede contener por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más codones de terminación que no están presentes en el gen X no modificado o de tipo salvaje o no están presentes en el PRE no modificado o de tipo salvaje. Generalmente, por lo menos un codón de terminación está en marco con el marco de lectura de la proteína X. En algunos casos, el gen X variante contiene una pluralidad de codones de terminación, como por lo menos 2, 3, 4, 5 o 6 codones de terminación.
En algunos casos, la pluralidad de codones de terminación incluye por lo menos dos codones de terminación en los que uno está en marco con el marco de lectura de la proteína X y el otro está en un marco de lectura diferente. En otros casos, la pluralidad de codones de terminación incluye por lo menos tres codones de terminación en cada marco de lectura presente en el gen X variante.
En algunos casos, la pluralidad de codones de terminación incluye por lo menos dos codones de terminación en el mismo marco de lectura. Típicamente, los por lo menos dos codones de terminación están en el mismo marco de lectura que el marco de lectura de la proteína X.
En algunos casos, cada uno del por lo menos un codón de terminación comienza en una posición dentro o no más de 36 nucleótidos en la dirección 3' desde una posición correspondiente a la posición 5' de un codón de inicio del marco de lectura abierto de la proteína X, por ejemplo, un codón correspondiente a un codón de inicio en un marco de lectura abierto de proteína X de tipo salvaje o no modificado correspondiente, como correspondiente a un codón de inicio en el marco de lectura abierto de proteína X expuesto en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125 que comienza en la posición 411. Típicamente, el primer codón de terminación y, en algunos casos, cada uno de la pluralidad de codones de terminación introducidos, presentes en el gen X variante después de la posición 5' de un codón de inicio del marco de lectura abierto de la proteína X comienza dentro de o no más de 36 nucleótidos en la dirección 3' desde una posición correspondiente a la posición 5' del codón de inicio. Por ejemplo, en algunos casos, cada uno del por lo menos un codón de terminación, por ejemplo, el primer codón de terminación o uno o más de una pluralidad de codones de terminación presentes en el gen X variante después de una posición correspondiente a la posición 5' de un codón de inicio del marco de lectura abierto de proteína X, comienza en una posición dentro o no más de 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 o 9 nucleótidos en la dirección 3' desde una posición correspondiente a la posición 5' de un codón de inicio del marco de lectura abierto de la proteína X. En algunos casos, cada uno del por lo menos un codón de terminación comienza en una posición dentro de no más de 9, 12, 15, 18 o 21 nucleótidos en la dirección 3' desde una posición correspondiente a la posición 5' de un codón de inicio del marco de lectura abierto de la proteína X, como a no más de 21 nucleótidos desde dicha posición.
Con referencia al WPRE ejemplar expuesto en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125, la posición correspondiente a la posición 5' de un codón de inicio del marco de lectura abierto de la proteína X corresponde al residuo 411 (correspondiente al residuo 1503 de la secuencia de WHV expuesta en la s Eq ID NO: 2). En algunos casos, el por lo menos un codón de terminación, por ejemplo, el primer codón de terminación o uno o más de una pluralidad de codones determinación presentes en el gen Xvariante después de una posición correspondiente a la posición 5' de un codón de inicio del marco de lectura abierto de la proteína X, comienza en una posición dentro o no más de 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 o 9 nucleótidos en la dirección 3' desde una posición correspondiente al residuo 411 en el WPRE expuesto en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125, por ejemplo, no más de 9, 12, 15, 18, o 21, por ejemplo, no más de 21, nucleótidos en la dirección 3' desde dicha posición. Está fácilmente dentro del nivel de un experto en la técnica identificar un residuo en otro PRE de hepatitis, como otro WPRE, que corresponde al residuo 411 para identificar una posición 5' de un codón que corresponde a un codón de inicio del PRE de tipo salvaje ejemplar expuesto en la s Eq ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125 (que es una porción de la SEQ ID NO: 1 que contiene los residuos 1-589 o la SEQ ID NO: 1). La Figura 2A-2E ejemplifica la identificación de los residuos correspondientes en PRE de hepatitis ejemplares.
En algunos casos de un PRE modificado que contiene un gen X variante con una pluralidad de codones de terminación, los codones de terminación pueden estar presentes secuencialmente en cada marco de lectura del gen X. En algunos casos de un PRE modificado que contiene un gen X variante con una pluralidad de codones de terminación, los codones de terminación pueden estar presentes secuencialmente en el mismo marco de lectura.
En algunos casos de un PRE modificado, el gen X variante no contiene un marco de lectura abierto de más de o aproximadamente 39 nucleótidos de longitud, como más de o aproximadamente 36 nucleótidos, 33 nucleótidos, 30 nucleótidos, 27 nucleótidos, 24 nucleótidos, 21 nucleótidos, 18 nucleótidos, 15 nucleótidos o 12 nucleótidos de longitud.
En algunos casos, el por lo menos un codón de terminación, por ejemplo, el primer codón de terminación o uno o más de una pluralidad de codones de terminación presentes en el gen X variante después de una posición correspondiente a la posición 5' de un codón de inicio del marco de lectura abierto de la proteína X, comienza en una posición que está en el marco con el marco de lectura de la proteína X. Por ejemplo, en algunos casos, el por lo menos un codón de terminación, por ejemplo, el primer codón de terminación o uno o más de una pluralidad de codones de terminación presentes en el gen X variante después de una posición correspondiente a la posición 5' de un codón de inicio del marco de lectura abierto de la proteína X, comienza en una posición dentro o no más de 36, 33, 30, 27, 24, 21, 18, 15, 12 o 9 nucleótidos en la dirección 3' desde una posición correspondiente a la posición 5' de un codón de inicio del marco de lectura abierto de la proteína X, por ejemplo, no más de 9, 12, 15, 18 o 21, por ejemplo, no más de 21 nucleótidos en la dirección 3' desde dicha posición. En algunos casos, el por lo menos un codón de terminación, por ejemplo, el primer codón de terminación o uno o más de una pluralidad de codones de terminación presentes en el gen X variante después de una posición correspondiente a la posición 5' de un codón de inicio marco de lectura abierto de la proteína X, comienza en una posición dentro o no más de 36, 33, 30, 27, 24, 21, 18, 15, 12 o 9 nucleótidos en la dirección 3' desde una posición correspondiente al residuo 411 en el WPRE expuesto en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125.
En algunos casos, el PRE modificado contiene un gen X variante que contiene un codón de terminación o una pluralidad de codones determinación que comienzan en las posiciones 9, 13, 17 y/o 21 en la dirección 3' desde una posición correspondiente a la posición 5' de un codón de inicio del marco de lectura abierto de la proteína X. Con referencia al WPRE ejemplar expuesto en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125, el PRE modificado contiene un gen Xvariante que contiene un codón determinación o una pluralidad de codones determinación que comienzan en una posición de nucleótidos correspondiente a la posición 420, 424, 428 y/o 432 en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125. En tales casos, una, dos, tres o las cuatro posiciones pueden ser el comienzo de un codón de terminación.
En algunos casos, el PRE modificado contiene un gen X variante que contiene cuatro codones de terminación comenzando en cada una de las posiciones 9, 13, 17 y 21 en la dirección 3' desde una posición correspondiente a la posición 5' de un codón de inicio del marco de lectura abierto de la proteína X. Con referencia al WPRE ejemplar expuesto en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125, el PRE modificado contiene un gen X variante que contiene un codón de terminación que comienza en una posición de nucleótidos correspondiente a la posición 420, 424, 428 y 432 en la secuencia expuesta en la SEQ ID n O : 1 o la SEQ ID NO: 125.
En algunos casos, el PRE modificado comprende una secuencia de nucleótidos que muestra por lo menos un 65% de identidad de secuencia, como por lo menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89 %, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia, con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125, siempre que el PRE modificado contenga un gen X variante que contenga por lo menos un codón de terminación que no esté presente en el gen X expuesto en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125. En algunos casos, el PRE modificado difiere de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125 solo por la sustitución de nucleótidos. En otros casos, el PRE modificado difiere de la SEQ ID NO: 1 o 125 por la inserción o deleción de nucleótidos. En algunos casos, el PRE modificado puede ser más largo o más corto que la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125.
En algunos casos, el PRE modificado no contiene ninguna modificación además del por lo menos un codón de terminación no presente en el PRE de tipo salvaje o no modificado.
Las Tablas 2A y 2B muestran posiciones ejemplares para la introducción de por lo menos un codón de terminación en un gen X variante o PRE modificado, respectivamente. También se exponen las SEQ ID NO correspondientes a las secuencias de polinucleótidos ejemplares. En algunos casos, se divulgan polinucleótidos que comprenden un PRE modificado que contiene un gen X variante que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 44-58 o 141-155. En algunos casos, se divulgan polinucleótidos que comprenden un PRE modificado que tiene la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 29-43 o 126-140. En algunos casos, se divulgan polinucleótidos que contienen tales PRE enlazados operativamente a ácidos nucleicos que codifican moléculas recombinantes, como receptores de antígenos recombinantes, CAR, TCR, receptores quiméricos, inmunomoduladores, moléculas inmunoestimuladoras, y/o marcadores de transducción o expresión, y casetes y vectores de expresión que contienen los mismos.
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2. Secuencias de degradación
En algunos casos, el gen X truncado comprende una señal de modificación postraduccional, que puede incluir secuencias de degradación que se sabe que aumentan la velocidad a la que el proteasoma degrada una proteína, disminuyendo de este modo la vida media de la proteína. Los ejemplos no limitativos de tales secuencias incluyen la incorporación de nucleótidos que codifican secuencias PEST, dominios de unión a ubiquitina o aminoácidos siguiendo la regla del extremo N.
Las secuencias PEST son regiones de aminoácidos ricas en prolina (P), ácido glutámico (E), serina (S) y treonina (T). (Rogers S, Wells R, Rechsteiner M (1986). "Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis". Science (revista) 234 (4774): 364-8. Doi:10.1126/science.2876518. La presencia de regiones PEST puede dar como resultado la degradación intracelular rápida de las proteínas que las contienen. Por tanto, en algunos casos, el gen X variante comprende ácidos nucleicos que codifican regiones PEST.
En algunos casos, el gen X variante comprende ácidos nucleicos que codifican dominios de unión a ubiquitina. Los dominios de unión a ubiquitina (UBD) son una colección de dominios proteicos modulares que se unen de manera no covalente a la ubiquitina. Estos motivos interpretan y transmiten información conferida por la ubiquitinación de proteínas para controlar varios eventos celulares, incluyendo la degradación proteasomal. Por tanto, en algunos casos, el gen X variante puede estar enlazado operativamente a ácidos nucleicos que codifican dominios de unión a ubiquitina de tal manera que las ligasas de ubiquitina se dirigen a la proteína X variante para el marcado de ubiquitina y, por tanto, la degradación por el proteasoma, más rápidamente. Los ejemplos no limitativos de dominios de unión a ubiquitina incluyen CUE, GAT, GLUE, NZF, PAZ, UBA, UEV, UiM y VHS. Ver Hicke, Ubiquitin-Binding Domains, doi:10.1038/nrm1701.
En algunos casos, el gen X variante comprende mutaciones correspondientes a sustituciones de aminoácidos que disminuyen la estabilidad de la proteína X de acuerdo con la regla del extremo N. En la regla del extremo N, la identidad del aminoácido que está expuesto en el extremo N terminal de un polipéptido después de la eliminación de la metionina de iniciación puede afectar la estabilidad metabólica y la vida media del polipéptido. (Varshaysky, A, 1996 The N-end rule: functions, mysteries, uses. Proc Natl Acad. Sci. USA 93(22):12142-12149. Este aminoácido puede denominarse un aminoácido desestabilizador. Por tanto, en algunos casos, el PRE modificado comprende mutaciones en el gen X variante en las que el codón de inicio es seguido inmediatamente por un codón que codifica un aminoácido desestabilizador. Ejemplos no limitativos de aminoácidos desestabilizadores incluyen glicina, arginina, ácido glutámico, fenilalanina, aspartato, cisteína, lisina, asparagina, serina, tirosina, triptófano, histidina y leucina. Ver Varshaysky 1996; ver también Gonda et al. (1989). “Universality and Structure of the N-end Rule”. Journal of Biological Chemistry 264 (28): 16700-16712. En algunos casos, el PRE modificado comprende mutaciones en el gen X variante en las que el codón de inicio está seguido inmediatamente por codones que codifican un aminoácido desestabilizador primario y un aminoácido desestabilizador secundario. Estas mutaciones pueden corresponder a parejas de aminoácidos, como arginina-ácido glutámico o arginina-asparagina. En algunos casos, la arginina es el aminoácido desestabilizador primario y el ácido glutámico o asparagina es el aminoácido desestabilizador secundario.
3. Otras modificaciones
Se proporcionan polinucleótidos que contienen un PRE modificado que contiene modificaciones adicionales además de cualquiera de las descritas anteriormente. En algunos casos, las modificaciones adicionales pueden ser cualquier modificación del gen X contenido en el PRE modificado que reduzca o evite una o más de la expresión, degradación, estabilidad, oncogenicidad y/o inmunogenicidad del gen X o la proteína X codificada. En algunos casos, las modificaciones adicionales alteran, como reducen, la transcripción del gen X variante y/o la traducción de la proteína X codificada por el gen X variante.
En un caso, el PRE modificado contiene adicionalmente una variante de un codón de inicio del gen X que, en algunos casos, se introduce para restringir o evitar el inicio de la traducción. En algunos casos, la variante del codón de inicio contiene una o más diferencias de nucleótidos en comparación con un codón de inicio del gen X no modificado, como un codón de inicio del gen X del virus de la hepatitis de tipo salvaje. Por ejemplo, con referencia a la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125, el PRE modificado puede contener adicionalmente un codón de inicio variante que contiene una o más diferencias de nucleótidos en comparación con el codón de inicio correspondiente a las posiciones de nucleótidos 411-413 de la SEQ ID NO: 1 o la S e Q ID NO: 125. Está fácilmente dentro del nivel de un experto en la técnica identificar un residuo en otro PRE de hepatitis, como otro WPRE, que corresponde a las posiciones de codón de inicio 411-413 de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125 (ver por ejemplo la Figura 2A-2E). Las diferencias de nucleótidos pueden resultar en un inicio de la traducción restringido o impedido.
En algunos casos, la variante del codón de inicio puede ser el codón variante que se encuentra en la posición correspondiente a un codón de inicio del gen X dentro del marco de lectura del gen X variante de la secuencia de WPRE modificada expuesta en la SEQ ID NO: 119 o la SEQ ID NO.: 216. Por ejemplo, la variante del codón de inicio puede ser un codón correspondiente a los residuos de nucleótidos 411-413 (TTG) de la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 119 o la SEQ ID NO: 216. En algunos casos, la variante de un codón de inicio puede ser un codón del marco de lectura del gen X en el WPRE modificado expuesto en la SEQ ID NO: 120. Por ejemplo, la variante de un codón de inicio puede ser un codón correspondiente a los residuos de nucleótidos 411-413 (GGG) de la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 120.
Las Tablas 3A y 3B muestran genes X variantes y polinucleótidos de PRE modificados ejemplares que contienen un gen X variante, respectivamente, en los que está contenido por lo menos un codón de terminación introducido y un codón de inicio variante no presente en un gen X o PRE de tipo salvaje o no modificado. La Tabla muestra posiciones ejemplares para la introducción del por lo menos un codón de terminación en el gen X variante o PRE modificado. También se muestran las SEQ ID NO correspondientes para las secuencias de los polinucleótidos ejemplares. En algunos casos, el gen X variante comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 74-88 o 171-185. En algunos casos, el PRE modificado comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 59-73 o 156-170. En algunos casos, se divulgan polinucleótidos que contienen tales PRE enlazados operativamente a ácidos nucleicos que codifican moléculas recombinantes, como receptores de antígenos recombinantes, CAR, TCR, receptores quiméricos, inmunomoduladores, moléculas inmunoestimuladoras, y/o marcadores de transducción o expresión, y casetes y vectores de expresión que contienen los mismos.
En otro caso, el PRE modificado puede contener adicionalmente un promotor variante enlazado operativamente al gen X variante en el mismo. El promotor variante puede contener una o más diferencias de nucleótidos en comparación con un promotor del gen X del virus de la hepatitis no modificado, como un promotor del gen X del virus de la hepatitis de tipo salvaje. Por ejemplo, con referencia a la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125, el gen X variante puede contener una o más diferencias de nucleótidos en comparación con el promotor del gen X de WPRE expuesto en la SEQ ID NO: 11 o expuesto como los nucleótidos 7-20 de la SEQ i D NO: 11. En algunos casos, las diferencias de nucleótidos pueden resultar en una o más diferencias que dan como resultado la restricción o la prevención de la transcripción del promotor.
En algunos casos, el PRE modificado puede contener un promotor variante que tiene la secuencia del promotor variante operativamente enlazada al gen X modificado dentro de la secuencia de PRE modificada expuesta como la SEQ ID NO: 119 o la SEQ ID NO: 216. Por ejemplo, el promotor variante puede ser un promotor variante que comprende los residuos de nucleótidos correspondientes a los residuos 391-411 (GGGGAAATCATCGTCCTTTCC; SEQ ID NO: 217) o los residuos de nucleótidos 397-410 (ATCATCGTCCTTTC; SEQ ID NO: 218), cada una de las secuencias de nucleótidos expuestas en la SEQ ID NO: 119 o la SEQ ID NO: 216. En algunos casos, el PRE modificado puede contener un promotor variante que tiene la secuencia del promotor variante enlazada operativamente al gen X modificado dentro del PRE modificado expuesto en la SEQ ID NO: 120. Por ejemplo, el promotor variante puede ser un promotor variante que comprende los residuos de nucleótidos correspondientes a los residuos 391-411 (GGGGAAGGTCTGCTGAGACTC; S e Q ID NO:219) o los residuos de nucleótidos 397-410 (GGTCTGCTGAGACT; SEQ ID NO:220), cada una de las secuencias de nucleótidos expuestas en la SEQ ID NO: 120.
En algunos casos, el promotor variante puede ser un promotor variante que es un promotor de la proteína X de la hepatitis conocido en la técnica, como cualquiera descrito en Sugata et al. (1994) Virology, 205: 314-320. En algunos casos, la variante del promotor X puede ser una variante de un promotor expuesto en la SEQ ID NO: 11 o un promotor que comprende los nucleótidos 6-22 de la SEQ ID NO: 10 que incluye una mutación de la treonina (T) en un posición correspondiente a la posición 9 de la SEQ ID NO: 10 o una mutación de la glicina (G) en una posición correspondiente a la posición 10 de la SEQ ID NO: 10.
Las Tablas 3A y 3B muestran genes X variantes y polinucleótidos de PRE modificados ejemplares que contienen un gen X variante, respectivamente, en el que está contenido por lo menos un codón de terminación introducido, un promotor variante y, opcionalmente, un codón de inicio variante no presente en un PRE de tipo salvaje o no modificado. La Tabla muestra posiciones ejemplares para la introducción del por lo menos un codón de terminación en un gen X variante o PRE modificado. También se indica la SEQ ID NO correspondiente para las secuencias de los polinucleótidos ejemplares. En algunos casos, el PRE modificado comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 89-118 o 186-215. En algunos casos, se divulgan polinucleótidos que contienen tales PRE enlazados operativamente a ácidos nucleicos que codifican moléculas recombinantes, como receptores de antígenos recombinantes, CAR, TCR, receptores quiméricos, inmunomoduladores, moléculas inmunoestimuladoras, y/o marcadores de transducción o expresión, y casetes y vectores de expresión que contienen los mismos.
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B. Ácidos nucleicos que codifican moléculas recombinantes
En algunos casos, los PRE modificados en los polinucleótidos divulgados están enlazados operativamente a uno o más ácidos nucleicos que codifican una o más moléculas de interés, como una o más moléculas recombinantes y/o heterólogas, por ejemplo, proteínas recombinantes, como proteínas heterólogas. Tales moléculas recombinantes y/o heterólogas pueden incluir proteínas solubles, por ejemplo, proteínas secretadas y/o proteínas de la superficie celular. En algunos casos, la molécula es o incluye un receptor recombinante. Tales receptores recombinantes pueden incluir receptores de antígenos, como receptores de antígenos funcionales que no son TCR, incluyendo receptores de antígenos quiméricos (CAR) y otros receptores de unión a antígenos, como receptores de células T transgénicos (TCR). Los receptores también pueden incluir otros receptores, como otros receptores quiméricos, como receptores que se unen a ligandos particulares y que tienen dominios de señalización transmembrana y/o intracelulares similares a los presentes en un CAR.
En algunas realizaciones, la molécula es una molécula soluble, como una molécula inmunomoduladora y/o inmunoestimuladora, como una citoquina, por ejemplo, IL-2, IL-12, IL-6, 41BBL, CD40L y/o ligando o receptor soluble como un ligando soluble para una molécula coestimuladora de células inmunes, por ejemplo, CD40L, 41BBL, o una molécula soluble de unión a antígeno como un scFv. También entre las moléculas se encuentran los marcadores de expresión o transducción y cualquier otra molécula conocida para su uso en vectores y/o casetes de expresión.
En algunos casos, el receptor de antígeno recombinante, por ejemplo, CAR, se une específicamente a uno o más ligandos en una célula o enfermedad a la que se dirigirá, como un cáncer, enfermedad infecciosa, enfermedad inflamatoria o autoinmune, u otra enfermedad o afección, incluyendo aquellas descritas en la presente para el direccionamiento con los métodos y composiciones divulgados. Los antígenos ejemplares son receptor de tirosina quinasa huérfano ROR1, tEGFR, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, mesotelina, CEA y antígeno de superficie de la hepatitis B, receptor antifolato, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44 EGFR, EGP-2, EGP-4, 0EPHa2, ErbB2, 3 o 4, FBP, receptor de acetilcolina fetal, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-alfa, IL-13R-alfa2, kdr, cadena ligera kappa, Lewis Y, molécula de adhesión de células L1, MAGE-A1, mesotelina, MUC1, MUC16, PSCA, ligandos NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, antígeno oncofetal, ROR1, TAG72, VEGF-R2, antígeno arcinoembrionario (CEA), antígeno específico de la próstata, PSMA, Her2/neu, receptor de estrógeno, receptor de progesterona, efrinaB2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2 y MAGE A3, CE7, tumor de Wilms 1 (WT- 1), una ciclina, como ciclina A1 (CCNA1), y/o moléculas biotiniladas, y/o moléculas expresadas por y/o características o específicas de VIH, VHC, VHB, VHP y/u otros patógenos y/o versiones oncogénicas de los mismos.
1. Receptores de antígenos quiméricos
En algunos casos, la molécula recombinante es o incluye un receptor de antígeno quimérico (CAR). El CAR es generalmente un receptor diseñado genéticamente con un dominio de unión de ligando extracelular enlazado a uno o más componentes de señalización intracelular. Tales moléculas típicamente imitan o se aproximan a una señal a través de un receptor de antígeno natural y/o señal a través de dicho receptor en combinación con un receptor coestimulador.
En algunos casos, los CAR se construyen con una especificidad para un marcador particular, como un marcador expresado en un tipo de célula particular para ser dirigido por terapia adoptiva, por ejemplo, un marcador de cáncer y/o cualquiera de los antígenos descritos. Por tanto, el CAR incluye típicamente uno o más fragmentos de unión a antígeno, dominio o porción de un anticuerpo, o uno o más dominios variables de anticuerpo, y/o moléculas de anticuerpo. En algunos casos, el CAR incluye una porción de unión a antígeno o porciones de una molécula de anticuerpo, como una cadena pesada variable (VH) o una porción de unión de antígeno de la misma, o un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla (scFv) derivado de las cadenas variable pesada (VH) y variable ligera (VL) de un anticuerpo monoclonal (mAb).
El componente de unión o reconocimiento específico de antígeno está generalmente enlazado a uno o más dominios de señalización transmembrana e intracelulares. En algunos casos, el CAR incluye un dominio transmembrana fusionado al dominio extracelular. En un caso, se usa un dominio transmembrana que se asocia de manera natural con uno de los dominios en el receptor, por ejemplo, CAR. En algunos casos, el dominio transmembrana se selecciona o modifica mediante sustitución de aminoácidos para evitar la unión de tales dominios a los dominios transmembrana de las mismas proteínas de la superficie de la membrana o de unas diferentes para minimizar las interacciones con otros miembros del complejo receptor.
El dominio transmembrana en algunos casos se deriva o de una fuente natural o de una sintética. Cuando la fuente es natural, el dominio en algunos aspectos se deriva de cualquier proteína unida a membrana o transmembrana. Las regiones transmembrana incluyen aquellas derivadas de (es decir, comprenden por lo menos la región o regiones transmembrana de) la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD154. El dominio transmembrana en algunos casos es sintético. En algunos aspectos, el dominio transmembrana sintético comprende predominantemente residuos hidrófobos como leucina y valina. En algunos aspectos, se encontrará un triplete de fenilalanina, triptófano y valina en cada extremo de un dominio transmembrana sintético. En algunos casos, el enlace se realiza mediante conectores, espaciadores, y/o dominios transmembrana.
En algunos casos, un conector oligo o polipéptido corto, por ejemplo, un conector de entre 2 y 10 aminoácidos de longitud, como uno que contiene glicinas y serinas, por ejemplo, doblete de glicina-serina, está presente y forma un enlace entre el dominio transmembrana y el dominio de señalización citoplásmica del CAR.
El receptor, por ejemplo, el CAR, incluye generalmente por lo menos un componente o componentes de señalización intracelular. En algunos casos, el receptor incluye un componente intracelular de un complejo de TCR, como una cadena de TCR de CD3 que media la activación y citotoxicidad de las células T, por ejemplo, la cadena zeta de CD3. Por tanto, en algunos aspectos, la porción de unión a antígeno se enlaza a uno o más módulos de señalización celular. En algunos casos, los módulos de señalización celular incluyen el dominio transmembrana de CD3, los dominios de señalización intracelular de CD3 y/u otros dominios transmembrana de CD. En algunos casos, el receptor, por ejemplo, CAR, incluye además una porción de una o más moléculas adicionales como el receptor y de Fc, CD8, CD4, CD25 o CD16. Por ejemplo, en algunos aspectos, el CAR u otro receptor quimérico incluye una molécula quimérica entre CD3-zeta (Cd3-Z) o receptor y de Fc y CD8, CD4, CD25 o CD16.
En algunos casos, tras la ligación del CAR u otro receptor quimérico, el dominio citoplásmico o el dominio de señalización intracelular del receptor activa por lo menos una de las funciones efectoras normales o respuestas de la célula inmune, por ejemplo, células T modificadas para expresar el CAR. Por ejemplo, en algunos contextos, el CAR induce una función de una célula T, como la actividad citolítica o la actividad auxiliar T, como la secreción de citoquinas u otros factores. En algunos casos, se usa una porción truncada de un dominio de señalización intracelular de un componente receptor de antígeno o molécula coestimuladora en lugar de una cadena inmunoestimuladora intacta, por ejemplo, si transduce la señal de la función efectora. En algunos casos, el dominio o dominios de señalización intracelular incluyen las secuencias citoplásmicas del receptor de células T (TCR), y en algunos aspectos también las de los coreceptores que en el contexto natural actúan en sintonía con tales receptores para iniciar la transducción de señales después del acoplamiento del receptor al antígeno, y/o cualquier derivado o variante de tales moléculas, y/o cualquier secuencia sintética que tenga la misma capacidad funcional.
En el contexto de un TCR natural, la activación completa generalmente requiere no solo la señalización a través del TCR, sino también una señal coestimuladora. Por tanto, en algunos casos, para promover la activación completa, también se incluye en el CAR un componente para generar una señal secundaria o coestimuladora. La activación de las células T se describe en algunos aspectos como mediada por dos clases de secuencias de señalización citoplásmica: las que inician la activación primaria dependiente de antígeno a través del TCR (secuencias de señalización citoplásmicas primarias) y las que actúan de manera independiente del antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimuladora (secuencias de señalización citoplásmicas secundarias). En algunos aspectos, el CAR incluye uno o ambos componentes de señalización.
Las secuencias de señalización citoplásmicas primarias pueden, en algunos aspectos, regular la activación primaria del complejo TCR o de manera estimulante o inhibidora. Las secuencias de señalización citoplásmicas primarias que actúan de manera estimulante pueden contener motivos de señalización que se conocen como motivos de activación basados en inmunoreceptores de tirosina o ITAM. Los ejemplos de ITAM que contienen secuencias de señalización citoplásmicas primarias incluyen las derivadas de TCR zeta, FcR gamma, FcR beta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CDS, CD22, CD79a, CD79b y CD66d. En algunos casos, la o las moléculas de señalización citoplásmica en el CAR contienen un dominio de señalización citoplásmico, una porción del mismo o una secuencia derivada de CD3 zeta.
En algunos casos, el CAR incluye un dominio de señalización y/o una porción transmembrana de un receptor coestimulador, como CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 e ICOS.
En ciertos casos, el dominio de señalización intracelular comprende una transmembrana de CD28 y un dominio de señalización enlazado a un dominio intracelular de CD3. En algunos casos, el dominio de señalización intracelular comprende dominios coestimuladores de CD28 y CD137 quiméricos, enlazados a un dominio intracelular de CD3. En algunos casos, un CAR también puede incluir un marcador de transducción (por ejemplo, tEGFR). En algunos casos, el dominio de señalización intracelular de las células T citotóxicas CD8+ es el mismo que el dominio de señalización intracelular de las células T auxiliares CD4+. En algunos casos, el dominio de señalización intracelular de las células T citotóxicas CD8+ es diferente al dominio de señalización intracelular de las células T auxiliares CD4+.
En algunos casos, el CAR abarca uno o más, por ejemplo, dos o más, dominios coestimuladores y un dominio de activación, por ejemplo, el dominio de activación primario, en la porción citoplásmica. Un ejemplo es un receptor que incluye componentes intracelulares de CD3-zeta, CD28 y 4-1BB.
En algunos casos, la molécula o moléculas recombinantes codificadas por ácidos nucleicos dentro de los polinucleótidos divulgados incluyen además uno o más marcadores, por ejemplo, con el propósito de confirmar la transducción o modificación de la célula para expresar el receptor y/o la selección y/o direccionamiento de células que expresan moléculas codificadas por el polinucleótido. En algunos aspectos, dicho marcador puede estar codificado por un ácido nucleico o polinucleótido diferente, que también puede introducirse durante el proceso de modificación genética, típicamente mediante el mismo método, por ejemplo, transducción por el mismo vector o tipo de vector.
En algunos aspectos, el marcador, por ejemplo, el marcador de transducción, es una proteína y/o es una molécula de la superficie celular. Los marcadores ejemplares son variantes truncadas de marcadores de origen natural, por ejemplo, marcadores endógenos, como moléculas de superficie celular de origen natural. En algunos aspectos, las variantes tienen inmunogenicidad reducida, función de tráfico reducida y/o función de señalización reducida en comparación con la molécula de superficie celular natural o endógena.
En algunos aspectos, el marcador incluye todo o parte (por ejemplo, forma truncada) de CD34, un NGFR o receptor del factor de crecimiento epidérmico (por ejemplo, tEGFR).
En algunos casos, el marcador es una molécula, por ejemplo, una proteína de la superficie celular, que no se encuentra de manera natural en las células T o no se encuentra de manera natural en la superficie de las células T, o una porción de las mismas.
En algunos casos, la molécula es una molécula no propia, por ejemplo, una proteína no propia, es decir, una que no es reconocida como "propia" por el sistema inmunológico del huésped al que se transferirán adoptivamente las células.
En algunos casos, el marcador no tiene ninguna función terapéutica y/o no produce ningún efecto que no sea el de ser usado como marcador para ingeniería genética, por ejemplo, para seleccionar células diseñadas con éxito. En otros casos, el marcador puede ser una molécula terapéutica o una molécula que de otro modo ejerza algún efecto deseado, como un ligando para una célula que se encontrará in vivo, como una molécula coestimuladora o de punto de control inmune para mejorar y/o amortiguar las respuestas de las células tras la transferencia adoptiva y el encuentro con el ligando.
Los receptores de antígenos, incluyendo los CAR y los TCR recombinantes, y la producción e introducción de los mismos, en algunos casos incluyen los descritos, por ejemplo, en los números de publicación de solicitud de patente internacional WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, números de publicación de solicitud de patente de Estados Unidos US2002131960, US2013287748, US20130149337, Patentes de Estados Unidos N° 6.451.995, 7.446.190, 8.252.592, 8.339.645, 8.398.282, 7.446.179, 6.410.319, 7.070.995, 7.265.209, 7.354.762, 7.446.191, 8.324.353 y 8.479.118, y la solicitud de patente europea número EP2537416, y los descritos por Sadelain et al., Cancer Discov. abril de 2013; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol.,cctubre de 2012; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, marzo de 2012 18(2): 160-75.
2. Receptores de células T (TCR)
En algunos casos, la molécula o moléculas recombinantes codificadas por los ácidos nucleicos son o incluyen un receptor de células T recombinantes (TCR). En algunos casos, el TCR recombinante es específico para un antígeno, generalmente un antígeno presente en una célula objetivo, como un antígeno específico de tumor, un antígeno expresado en un tipo celular particular asociado con una enfermedad autoinmune o inflamatoria, o un antígeno derivado de un patógeno viral o un patógeno bacteriano.
En algunos casos, el TCR es uno que se ha clonado a partir de células T de origen natural. En algunos casos, un clon de células T de alta afinidad para un antígeno objetivo (por ejemplo, un antígeno canceroso) se identifica y se aísla de un paciente. En algunos casos, el clon de t Cr para un antígeno objetivo se ha generado en ratones transgénicos modificados con genes del sistema inmunológico humano (por ejemplo, el sistema de antígeno leucocitario humano o HLA). Ver, por ejemplo, antígenos tumorales (ver, por ejemplo, Parkhurst et al. (2009) Clin Cancer Res. 15:169-180 y Cohen et al. (2005) J Immunol. 175:5799-5808. En algunos casos, se usa presentación de fagos para aislar TCR contra un antígeno objetivo (ver, por ejemplo, Varela-Rohena et al. (2008) Nat Med.
14:1390-1395 y Li (2005) Nat Biotechnol. 23: 349-354.
En algunos casos, una vez obtenido el clon de células T, las cadenas alfa y beta de TCR se aíslan y se clonan en un vector de expresión génica. En algunos casos, los genes alfa y beta de TCR se enlazan mediante un péptido de salto ribosómico de picornavirus 2A de tal manera que ambas cadenas se coexpresan. En algunos casos, el ácido nucleico que codifica un TCR incluye además un marcador para confirmar la transducción o modificación de la célula para expresar el receptor.
En algunos casos, la molécula o moléculas recombinantes o heterólogas codificadas por el ácido nucleico dentro del polinucleótido divulgado son o incluyen una molécula de ácido nucleico, como un ARN, ADN o una secuencia de ácido nucleico artificial, como una diseñada para interferir con la expresión o la actividad de un ARNm objetivo, como un ARN interferente corto (ARNip), ARN de horquilla corta (ARNhc) o microARN (miARN). Tales moléculas pueden incluir aquellas diseñadas para interferir con la expresión o la actividad de moléculas asociadas con, promover o inhibir la actividad de células inmunes, como inmunomoduladores, moléculas inmunoinhibidoras y moléculas de puntos de control inmunes. En algunos casos, puede producirse una secuencia de ARNip o miARN de nucleótidos (por ejemplo, 21-25 nucleótidos de longitud), por ejemplo, a partir de un vector de expresión mediante la transcripción de una secuencia de ARN en horquilla corta (ARNhc), una secuencia precursora más larga (por ejemplo, 60-80 nucleótidos), que posteriormente es procesada por la maquinaria de ARNi celular para producir o una secuencia de ARNip o de miARN. Alternativamente, una secuencia de ARNip o miARN de nucleótidos (por ejemplo, 21-25 nucleótidos de longitud) puede, por ejemplo, sintetizarse químicamente. La síntesis química de secuencias de ARNip o miARN está disponible comercialmente en empresas como Dharmacon, Inc. (Lafayette, CO), Qiagen (Valencia, CA) y Ambion (Austin, TX). El ARN puede tener de 10 a 30 nucleótidos de longitud, como 19-25 o 21-25 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, una secuencia de ARNip típicamente se une a una secuencia única dentro de un ARNm objetivo con complementariedad exacta y da como resultado la degradación de la molécula de ARNm objetivo. Una secuencia de ARNip puede unirse en cualquier lugar dentro de la molécula de ARNm; las secuencias dirigidas por el ARNip incluyen genes que expresan un polipéptido de interés, o un modulador cen sentido ascendente o en sentido descendente de dicho gen, por ejemplo, un modulador en sentido ascendente o en sentido descendente de un gen, como un factor de transcripción que se une a un promotor genético, una quinasa o fosfatasa que interactúa con un polipéptido de interés y polipéptidos implicados en vías reguladoras capaces de influir en el polipéptido de interés. Una secuencia de miARN típicamente se une a una secuencia única dentro un ARNm objetivo con complementariedad exacta o menos exacta y da como resultado la represión traslacional de la molécula de ARNm objetivo. Una secuencia de miARN puede unirse en cualquier lugar dentro de la secuencia de ARNm, pero generalmente se une dentro de la región no traducida 3' de la molécula de ARNm.
C. Casetes de expresión y vectores virales
En algunos casos, el polinucleótido se divulga como o dentro de un casete de expresión. El polinucleótido o casete de expresión puede estar contenido en un vector de expresión, como un vector viral, para la expresión de la molécula recombinante y/o heteróloga codificada por el ácido nucleico.
1. Casete de expresión
En algunos casos, el casete de expresión puede contener el ácido nucleico heterólogo y/o recombinante bajo el control de un promotor y enlazado operativamente al PRE modificado, como cualquiera de los descritos anteriormente. El casete de expresión también puede contener uno o más de otros elementos reguladores. Además del PRE modificado, el ácido nucleico puede enlazarse operativamente a otras secuencias de ácidos nucleicos, incluyendo pero no limitadas a, promotores, potenciadores, otros elementos reguladores postranscripcionales, señales de poliadenilación, sitios de enzimas de restricción, sitios de clonación múltiples o segmentos de codificación.
a. Promotores
En algunos casos, el casete de expresión incluye un promotor enlazado operativamente a la molécula de ácido nucleico que codifica la proteína recombinante o heteróloga. El promotor puede comprender cualquier promotor deseado por el usuario según sea apropiado para el contexto de expresión. En algunos casos, un promotor puede comprender un promotor de origen eucariota o procariota que puede proporcionar altos niveles de expresión constitutiva a través de una variedad de tipos de células y será suficiente para dirigir la transcripción del ácido nucleico que codifica la proteína recombinante o heteróloga en una célula. En algunos casos, el ácido nucleico que codifica la proteína recombinante o heteróloga es una secuencia localizada distalmente, que es una secuencia enlazada operativamente al extremo 5' de la secuencia promotora. La región promotora también puede incluir elementos de control para la potenciación o represión de la transcripción y puede modificarse como se desee por el usuario dependiendo del contexto.
En algunos casos, un promotor comprende una secuencia que funciona para posicionar el sitio de inicio para la síntesis de ARN. En algunos casos, el promotor comprende la caja TATA. En algunos casos, el promotor carece de una caja TATA como, por ejemplo, el promotor del gen de la desoxinucleotidil transferasa terminal de mamífero y el promotor para los genes tardíos de SV40. En tal caso, el promotor puede contener un elemento discreto que se superpone al propio sitio de inicio que ayuda a fijar el lugar de inicio. Los elementos promotores adicionales regulan la frecuencia de inicio de la transcripción. En algunos casos, estos se localizan en la región 30­ 110 pb en sentido ascendente del sitio de inicio, aunque se ha demostrado que una serie de promotores contienen elementos funcionales también en sentido descendente del sitio de inicio. Para poner una secuencia codificante "bajo el control de" un promotor, se coloca el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción del marco de lectura de la transcripción "en sentido descendente" de (es decir, 3' de) el promotor elegido. El promotor "en sentido ascendente" estimula la transcripción del ADN y promueve la expresión del ARN codificado.
En algunos casos, el espacio entre los elementos promotores es flexible, de tal manera que la función del promotor se conserva cuando los elementos se invierten o se mueven unos con respecto a los otros. En algunos casos en los que el promotor es el promotor tk, el espacio entre los elementos del promotor puede aumentarse a 50 pb antes de que la actividad comience a disminuir. Dependiendo del promotor, los elementos individuales pueden funcionar ya sea de manera cooperativa o independiente para activar la transcripción. En algunos casos, puede usarse un promotor junto con un "potenciador", que se refiere a una secuencia reguladora que actúa en cis implicada en la activación transcripcional de una secuencia de ácido nucleico.
En algunos casos, un promotor puede ser uno que está asociado de manera natural con una secuencia de ácido nucleico, como puede obtenerse aislando las secuencias no codificantes 5' localizadas en sentido ascendente del segmento codificante y/o exón. A dicho promotor puede hacerse referencia como "endógeno". En algunos casos, un potenciador puede ser uno asociado de manera natural con una secuencia de ácido nucleico, localizada o en sentido descendente o en sentido ascendente de esa secuencia.
Alternativamente, en algunos casos, el segmento de ácido nucleico codificante puede colocarse bajo el control de un promotor y/o potenciador recombinante y/o heterólogo, que normalmente no está asociado con la secuencia de ácido nucleico codificante en el entorno natural. Tales promotores o potenciadores pueden incluir promotores o potenciadores que en la naturaleza están enlazados operativamente a otros genes dentro de la especie de la que se deriva el ácido nucleico, y promotores o potenciadores aislados de otras especies, como de otras células procariotas o eucariotas, y promotores o potenciadores que no son "de origen natural", es decir, que contienen diferentes elementos de diferentes regiones reguladoras transcripcionales y/o mutaciones que alteran la expresión en comparación con las que se encuentran en cualquier promotor o potenciador en la naturaleza. Por ejemplo, los promotores ejemplares usados en la construcción de ADN recombinante incluyen, pero no se limitan a, los promotores de p-lactamasa (penicilinasa), lactosa, triptófano (trp), ARN polimerasa (pol) III, incluyendo los promotores U6 pol III humanos y murinos, así como los promotores pol III de ARN H1 humanos y murinos; promotores de ARN polimerasa (pol) II; el promotor temprano inmediato del citomegalovirus (pCMV), el factor de elongación-1 alfa (EF-1 alfa) y los sistemas promotores del promotor de repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous (pRSV). Además de producir secuencias de ácido nucleico de promotores y potenciadores sintéticamente, las secuencias pueden producirse usando clonación recombinante y/o tecnología de amplificación de ácidos nucleicos, incluyendo pCr ™, en relación con las composiciones y métodos divulgados en la presente (ver las Patentes de Estados Unidos N° 4.683.202 y 5.928.906). Además, en algunos casos, también pueden emplearse secuencias de control que dirigen la transcripción y/o expresión de secuencias dentro de orgánulos no nucleares como mitocondrias, cloroplastos y similares. A las secuencias de control que comprenden promotores, potenciadores y otros locus o elementos de control/modulación de la transcripción también puede hacerse referencia como "casetes transcripcionales".
En algunos casos, el promotor y/o potenciador está enlazado operativamente para dirigir eficazmente la expresión del segmento de ADN en el orgánulo, tipo celular, tejido, órgano u organismo elegido para la expresión. Los expertos en la técnica de la biología molecular generalmente conocen el uso de promotores, potenciadores y combinaciones de tipos de células para la expresión de proteínas (ver, por ejemplo, Sambrook et al., 1989). Los promotores empleados pueden ser constitutivos, específicos de tejido, inducibles y/o útiles en las condiciones apropiadas para dirigir la expresión de alto nivel del segmento de ADN introducido, como es ventajoso para la terapia génica o para aplicaciones como la producción a gran escala de proteínas y/o péptidos recombinantes. El promotor puede ser heterólogo o endógeno.
En algunos casos, puede emplearse un sistema de expresión citoplásmico T3, T7 o SP6. Las células eucariotas pueden soportar la transcripción citoplásmica de ciertos promotores bacterianos si se proporciona la polimerasa bacteriana apropiada, ya sea como parte del complejo de administración o como un constructo de expresión genética adicional.
En algunos casos, puede usarse un promotor inducible. Como se usa en la presente, un "promotor inducible" se refiere a un elemento de control de la transcripción que puede regularse en respuesta a señales específicas. Un promotor inducible es transcripcionalmente activo cuando se une a un activador transcripcional, que a su vez se activa bajo un conjunto específico de condiciones, por ejemplo, en presencia de una combinación particular de señales químicas que afectan a la unión del activador transcripcional al promotor inducible y/o afectan a la función del propio activador transcripcional. Por tanto, un promotor inducible es un promotor que, en ausencia de un inductor, no dirige la expresión, o dirige niveles bajos de expresión, de una secuencia de ácido nucleico a la que el promotor inducible está enlazado operativamente; o muestra un bajo nivel de expresión en presencia de un factor regulador que, cuando se elimina, permite un alto nivel de expresión del promotor, por ejemplo, el sistema tet. En presencia de un inductor, un promotor inducible dirige la transcripción a un nivel aumentado.
En algunos casos, el sistema regulable por tetraciclina (tet), que se basa en la acción inhibidora de la represión de tet (tetr) de Escherichia coli en la secuencia del operador de tet (TECO), puede modificarse para su uso en sistemas de mamíferos y usarse como un elemento regulable para casetes de expresión. Estos sistemas son bien conocidos por los expertos en la técnica. (Ver, Goshen y Badgered, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-51 (1992), Shockett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6522-26 (1996), Lindemann et al., Mol. Med. 3:466-76 (1997)).
B. Otros elementos reguladores
En algunos casos, el casete de expresión puede incluir adicionalmente un potenciador que está enlazado operativamente al ácido nucleico que codifica la proteína recombinante, por ejemplo, proteína heteróloga.
En algunos casos, los elementos de los sitios de unión a ribosomas internos (IRES) se enlazan operativamente a casetes de expresión para crear mensajes multigénicos o policistrónicos. Los elementos IRES son capaces de eludir el modelo de barrido de ribosomas de la traducción dependiente del casquete metilado en 5' y comenzar la traducción en sitios internos (Pelletier y Sonenberg, 1988). Los ejemplos no limitativos de elementos IRES incluyen, pero no se limitan a, elementos IRES de la familia de los picornavirus (polio y encefalomiocarditis) (Pelletier y Sonenberg, 1988) o un IRES de un mensaje de mamífero (Macejak y Sarnow, 1991). Los elementos IRES pueden vincularse a marcos de lectura abiertos heterólogos. pueden transcribirse juntos múltiples marcos de lectura abiertos, cada uno separado por un IRES, creando mensajes policistrónicos. En virtud del elemento IRES, cada marco de lectura abierto es accesible a los ribosomas para una traducción eficiente. Pueden expresarse de manera eficiente múltiples genes usando un único promotor/potenciador para transcribir un único mensaje.
En algunos casos, los vectores o constructos comprenderán por lo menos una señal de terminación enlazada operativamente al ácido nucleico que codifica una proteína recombinante, como una proteína heteróloga. Una "señal de terminación" o "terminador" está compuesta por las secuencias de ADN implicadas en la terminación específica de una transcripción de ARN por una ARN polimerasa. Por tanto, en ciertos casos se contempla una señal de terminación que finaliza la producción de una transcripción de ARN. En algunos casos, puede usarse un terminador in vivo para lograr niveles de mensaje deseables.
En algunos casos que comprenden sistemas eucariotas, la región de terminación también puede comprender secuencias de ADN específicas que permiten la escisión específica del sitio de la nueva transcripción para exponer un sitio de poliadenilación. Esto señala a una polimerasa endógena especializada que añada un tramo de aproximadamente 200 residuos A (poliA) al extremo 3' de la transcripción. Las moléculas de ARN modificadas con esta cola de poliA parecen más estables y se traducen de manera más eficiente. Por tanto, en algunos casos que implican eucariotas, el terminador comprende una señal para la escisión del ARN. En algunos casos, la señal de terminación promueve la poliadenilación del mensaje. Los elementos del sitio de terminación y/o poliadenilación pueden servir para mejorar los niveles de mensaje y minimizar la lectura a través del casete a otras secuencias.
Los terminadores incluyen cualquier terminador de transcripción conocido descrito en la presente o conocido por un experto en la técnica, que incluye pero no se limita a, las secuencias de terminación de genes, como por ejemplo el terminador de la hormona del crecimiento bovino o las secuencias de terminación viral, como por ejemplo el terminador SV40. En ciertos casos, la señal de terminación puede ser una falta de secuencia transcribible o traducible, como debido a un truncamiento de secuencia.
En algunos casos que implican la expresión génica eucariota, el casete de expresión puede enlazarse operativamente a una señal de poliadenilación para efectuar la poliadenilación adecuada de la transcripción. Puede emplearse cualquier secuencia de este tipo. Algunos ejemplos incluyen la señal de poliadenilación de SV40 o la señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovino, conveniente y conocida por funcionar bien en varias células objetivo. La poliadenilación puede aumentar la estabilidad de la transcripción o puede facilitar el transporte citoplásmico.
En algunos casos, el casete o vector de expresión contiene uno o más orígenes de sitios de replicación (a menudo denominados "ori") para propagarse en una célula huésped. Un origen de replicación es una secuencia de ácidos nucleicos específica en la que se inicia la replicación. Alternativamente, puede emplearse una secuencia de replicación autónoma (ARS) si la célula huésped es una levadura.
2. Vectores virales
En algunos casos, los PRE modificados, ácidos nucleicos y/o casetes se divulgan dentro de los vectores virales. El ácido nucleico dentro del vector puede divulgarse como un casete de expresión bajo el control de un promotor. Los vectores virales pueden usarse para transferir la molécula de ácido nucleico a las células para la expresión de la proteína heteróloga o recombinante a las mismas.
Los vectores virales ejemplares incluyen vectores retrovirales, como vectores lentivirales o gammaretrovirales, vectores derivados del virus de simio 40 (SV40), adenovirus y virus adenoasociado (AAV). En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a las células usando vectores retrovirales, como vectores lentivirales o vectores gamma-retrovirales (ver, por ejemplo, Koste et al. (2014) Gene Therapy 3 de abril 2014. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. noviembre de 2011 29(11): 550-557. Los retrovirus son útiles como vectores de administración debido a su capacidad para integrar sus genes en el genoma del huésped, transfiriendo una gran cantidad de material genético extraño, infectando un amplio espectro de especies y tipos celulares y de ser envasadas en líneas celulares especiales (Miller, 1992).
En algunos casos, la transferencia genética se realiza mediante vectores lentivirales. Los lentivirus, a diferencia de otros retrovirus, en algunos contextos pueden usarse para transducir ciertas células que no se dividen.
Los ejemplos no limitativos de vectores lentivirales incluyen los derivados de un lentivirus, como el virus de inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1), el VIH-2, un virus de inmunodeficiencia de simio (SIV), el virus linfotrópico T humano 1 (HTLV-1), HTLV-2 o virus de la anemia por infección equina (E1AV). Por ejemplo, se han generado vectores lentivirales atenuando de forma múltiple los genes de virulencia del VIH, por ejemplo, los genes env, vif, vpr, vpu y nef se eliminan, lo que hace que el vector sea más seguro para propósitos terapéuticos. Los vectores lentivirales son conocidos en la técnica, ver Naldini et al., (1996 y 1998); Zufferey et al., (1997); Dull et al., 1998, patente de Estados Unidos N° 6.013.516; y 5.994.136). En algunos casos, estos vectores virales se basan en plásmidos o se basan en virus, y están configurados para llevar las secuencias esenciales para incorporar ácidos nucleicos extraños, para la selección, y para la transferencia del ácido nucleico a una célula huésped. Los lentivirus conocidos pueden obtenerse fácilmente de depósitos o colecciones como American Type Culture Collection (“ATCC”; 10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110-2209), o aislarse de fuentes conocidas usando técnicas comúnmente disponibles.
En algunos casos, dos componentes están implicados en la elaboración de un sistema de administración de genes basado en virus: primero, plásmidos de empaquetamiento, que abarcan las proteínas estructurales así como las enzimas necesarias para generar una partícula de vector viral, y segundo, el propio vector viral, es decir, el material genético a transferir. Pueden introducir salvaguardias de bioseguridad en el diseño de uno o ambos de estos componentes. En algunos casos, el plásmido de empaquetamiento puede contener todas las proteínas del VIH-1 distintas de las proteínas de la envoltura (Naldini et al., 1998). En algunos casos, los vectores virales pueden carecer de genes virales adicionales, como los que están asociados con la virulencia, por ejemplo, vpr, vif, vpu y nef, y/o Tat, un transactivador primario del VIH. En algunos casos, los sistemas de empaquetamiento para vectores lentivirales, como los vectores lentivirales basados en VIH, incluyen plásmidos de empaquetamiento separado que juntos comprenden solo tres genes del virus original; gag, pol y rev, que reduce o elimina la posibilidad de reconstitución de un virus de tipo salvaje mediante recombinación.
En algunos aspectos de los vectores virales divulgados, el ácido nucleico heterólogo que codifica una proteína recombinante, como se proporciona como parte de un casete de expresión que contiene el transgén bajo el control de un promotor, está contenido y/o localizado entre las secuencias LTR 5' y LTR 3' del genoma del vector, incluyendo las LTR de tipo salvaje o porciones o porciones quiméricas de las mismas. En algunos casos, el vector viral, como un vector viral del VlH, carece de unidades transcripcionales adicionales. En algunos casos, el genoma del vector puede contener una deleción en la región U3 de la lTr 3' del ADN usado para producir el ARN del vector viral, que puede generar un vector autoactivante (SIN). Esta deleción puede luego transferirse a la LTR 5' del ADN proviral durante la transcripción inversa. En algunos casos, la LTR 3' se elimina para el promotor y el potenciador de U3. En algunos casos, puede eliminarse suficiente secuencia, incluyendo la eliminación de una caja TATA, para abolir la actividad transcripcional de la LTR. Esto puede prevenir la producción de ARN de vector de longitud completa en células transducidas. Por tanto, algunos casos incluyen una deleción en la región U3 de la LTR 3' del ADN. En algunos casos, esto no afecta a los títulos de los vectores ni a las propiedades in vitro o in vivo del vector.
En algunos casos, el genoma del vector viral también puede contener elementos genéticos adicionales. Los tipos de elementos que pueden incluirse en los constructos no están limitados de ninguna manera y pueden ser elegidos por un experto en la técnica. En algunos casos, el genoma del vector contiene secuencias derivadas de un genoma viral (por ejemplo, genoma lentiviral) que son regiones no codificantes del genoma que facilitan o divulgan señales de reconocimiento para la síntesis y procesamiento de ADN o ARN. En algunos casos, tales secuencias pueden incluir secuencias que actúan en cis que pueden estar implicadas en el empaquetamiento o encapsidación, transcripción inversa y transcripción y/o transferencia o integración de genes. En algunos casos, las secuencias de activación en cis divulgadas como parte del vector viral se derivan del mismo organismo similar a lentivirus o retrovirus.
En algunos casos, puede incluirse una señal que facilite la entrada nuclear del genoma viral en la célula objetivo. Un ejemplo de dicha señal es la secuencia Flap (también llamada secuencia de ADN Flap) formada a partir de los componentes cPPT y CTS que forman parte del gen pol de un genoma de vector viral, como un genoma de vector lentiviral. En algunos casos, una secuencia Flap incluye una porción de ácido nucleico viral que contiene una región cPPT y/o CTS, pero en la que se eliminan las porciones 5' y 3' del gen pol que no son necesarias para la función Flap. En algunos casos, el vector viral no contiene una región Flap funcional. Como se analiza a continuación, en algunos casos, un vector viral contiene ácido nucleico viral que contiene un Flap variante que carece de la totalidad o una parte de una o ambas regiones cPPT y CTS.
En algunos casos, el genoma del vector lentiviral puede contener elementos seleccionados entre un sitio donante de empalme (SD), un sitio aceptor de empalme (SA) y/o un elemento sensible a Rev (RRE). En algunos casos, se proporciona RRE para permitir la exportación de ARN mensajero viral desde el núcleo al citosol después de la unión de la proteína Rev proporcionada como parte de un plásmido auxiliar durante el empaquetamiento viral.
En algunos casos, el genoma del vector puede contener la señal de empaquetamiento psi (V), que, en algunos casos, puede derivarse del fragmento N-terminal del ORF de gag. En algunos casos, la secuencia de señal de empaquetamiento psi puede modificarse mediante mutación o mutaciones de desplazamiento de marco para evitar cualquier interferencia de una posible transcripción/traducción del péptido gag, con la del transgén.
En algunos casos, se divulga un vector viral, como un vector lentiviral, que contiene un genoma recombinante que contiene en orden entre las secuencias LTR 5' y 3' del genoma del vector: un RRE; un polinucleótido que contiene ácido nucleico viral que comprende un Flap de ADN funcional que contiene un cPPT y CTS que se inserta en sentido ascendente de un promotor que controla la expresión de un polinucleótido que codifica una proteína recombinante; un transgén que contiene un promotor que controla la expresión de un polinucleótido que codifica la proteína recombinante, como cualquiera de los descritos anteriormente, y el polinucleótido que codifica la proteína recombinante, como un receptor de antígeno (por ejemplo, un CAR); y un polinucleótido que contiene un PRE modificado, como cualquiera divulgado en la presente, enlazado operativamente al ácido nucleico que codifica la proteína recombinante como cualquiera divulgada en la presente. En algunos casos, el genoma recombinante comprende la secuencia 5' LTR-RRE-cPPT-CTS-transgén(es)-PRE modificado-3' LTR. En algunos casos, el PRE modificado en el vector viral, como el vector lentiviral, tiene la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 29-43, 59-73, 89-118, 126-140, 156-170 o 186-215. En algunos casos, el PRE modificado es o comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 29 o la SEQ ID NO: 126. En algunos casos, el cPPT y el CTS se insertan como un fragmento de una secuencia de ácido nucleico viral que contiene un Flap de ADN de tipo salvaje o no modificado, como el que es o comprende la secuencia ejemplar expuesta en la SEQ ID NO: 121 o un fragmento funcional del mismo que contiene las secuencias cPPT y CTS. En algunos casos, el vector lentiviral es un vector lentiviral derivado del VIH-1.
En algunos casos, entre los polinucleótidos divulgados, incluyendo los vectores virales, se encuentran los que contienen variaciones en las secuencias Flap virales (consideradas polinucleótidos o secuencias "Flap variantes"). Tales polinucleótidos incluyen aquellos que contienen una o más modificaciones, por ejemplo, deleciones, dentro de una secuencia Flap viral dentro del polinucleótido. Las variaciones pueden incluir la deleción completa de una secuencia Flap, o una subparte de la misma, dentro de una secuencia viral del polinucleótido. Tales polinucleótidos incluyen vectores virales, como un vector lentiviral, que contienen dichas secuencias Flap variantes.
En general, una secuencia Flap viral es una región reguladora viral que contiene una secuencia de polinucleótidos que incluye dos componentes: un tracto de polipurina central (cPPT) y una secuencia de terminación central (CTS). Ver, por ejemplo, Iglesias et al., Retrovirology 2011, 8:92. En la SEq ID NO: 123 se divulga una secuencia de cPPT ejemplar, no limitativa. En la SEQ ID NO: 124 se divulga una secuencia CTS ejemplar, no limitativa. En un VIH-1 de tipo salvaje ejemplar, el cPPT y el CTS pueden enlazarse operativamente por aproximadamente 70-100 nucleótidos. Se informa que el cPPT y CTS se colocan en o alrededor del centro del genoma del vector lentiviral, de tal manera que después de la transcripción inversa, el ADN codificado por las secuencias de cPPT y CTS forman una superposición de aproximadamente 100 nucleótidos, o " Flap de ADN", en el centro del genoma. Cuando se inserta en vectores virales, como los vectores derivados de lentivirales, el polinucleótido que permite que se produzca el flap de ADN durante la retro-transcripción, estimula la eficiencia de transferencia génica y complementa el nivel de importación nuclear a niveles de tipo salvaje.
En algunos casos, el polinucleótido de Flap variante contiene deleciones de todos o una parte de los nucleótidos en el CTS, el cPPT o tanto el CTS como el cPPT con referencia a una secuencia de una secuencia Flap de tipo salvaje o no modificada. En algunos casos, la secuencia de una secuencia Flap de tipo salvaje o no modificada es una secuencia de ácido nucleico viral que contiene cPPT y CTS que se deriva de un retrovirus, como un lentivirus, o de un organismo similar a un retrovirus, como un retrotransposón. En algunos casos, la secuencia de un Flap de tipo salvaje o no modificado es de un retrovirus o lentivirus humano, como un retrovirus del VIH (por ejemplo, VIH-1 o VIH-2). En algunos casos, la secuencia de un Flap de ADN de tipo salvaje o no modificado es de un virus CAEV (virus de la encefalitis de la artritis caprina), un virus EIAV (virus de la anemia infecciosa equina), un virus VI SNA, el virus SIV (virus de inmunodeficiencia de los simios) o un virus FIV (virus de inmunodeficiencia felina). En algunos casos, la secuencia de ácido nucleico viral que contiene el Flap de tipo salvaje o no modificado puede contener una secuencia flanqueante adicional presente en el genoma viral. En algunos casos, el polinucleótido que contiene un Flap de tipo salvaje o no modificado puede tener una secuencia de aproximadamente 80 a aproximadamente 200 nucleótidos, dependiendo de su origen y preparación. En algunos casos, la secuencia Flap de tipo salvaje o no modificada puede prepararse sintéticamente (síntesis química) o mediante amplificación de polinucleótidos que contienen el Flap de cualquier retrovirus, como de un ácido nucleico de lentivirus, por ejemplo, mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
En algunos casos, una secuencia Flap de tipo salvaje o no modificada puede derivarse de una secuencia de polinucleótidos presente en el VIH-1, como la correspondiente a un fragmento de 178 pares de bases desde las posiciones 4757 a 4935 o un fragmento de 179 pares de bases desde las posiciones 4746 a 4935 del vector del VIH-1 ejemplar pNL4-3 (GenBank N° AF324493), o una secuencia más corta o más larga presente en el mismo que contiene el cPPT y CTS que es capaz de producir el Flap tras la transcripción inversa. En algunos casos, una secuencia de polinucleótidos ejemplar que contiene un Flap de tipo salvaje o no modificado es o comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 121, una secuencia que muestra por lo menos un 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 121 o un fragmento funcional del mismo que contiene el cPPT y CTS para producir la estructura Flap tras la transcripción inversa. En algunos casos, el cPPT es o comprende una secuencia correspondiente a los nucleótidos 30-45 de la SEQ ID NO: 121 (expuesta en la SEQ ID NO: 123) y el CTS es o comprende una secuencia correspondiente a los nucleótidos 117-143 de la SEQ ID NO: 121 (expuesta en la SEQ ID NO: 124).
En algunos casos de los polinucleótidos o vectores virales divulgados que comprenden una secuencia Flap variante, por ejemplo, eliminada, la secuencia Flap variante puede ser una en la que toda o una porción de la región Flap del ácido o nucleico viral dentro del vector es eliminado y/o mutado, incluyendo todo o parte del cPPT y/o CTS. En algunos casos, la secuencia Flap variante incluye secuencias virales que carecen completamente o carecen sustancialmente de la secuencia Flap completa o parte de la misma. En algunos casos, el Flap variante contiene deleción o deleciones en el cPPT, el CTS o tanto en el cPPT como en el CTS. En algunos casos, el Flap variante puede contener un cPPT con por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 deleciones de nucleótidos, que pueden ser deleciones de nucleótidos contiguas, en comparación con una secuencia de cPPT de tipo salvaje o no modificada, como se compara con el cPPT no modificado ejemplar expuesto en la SEQ ID NO: 123. En algunos casos, el cPPT puede eliminarse por completo. En algunos casos, el Flap de ADN variante puede contener un CTS con por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 o 27 deleciones de nucleótidos, que pueden ser deleciones de nucleótidos contiguas, en comparación con una secuencia de CTS de tipo salvaje o no modificada, como en comparación con el CTS no modificado ejemplar expuesto en la SEQ ID NO: 124. En algunos casos, el CTS puede eliminarse por completo.
En algunos casos, el polinucleótido de Flap variante contiene la deleción de todo o una porción contigua del cPPT y contiene un CTS de tipo salvaje. En algunos casos, el polinucleótido de Flap variante contiene un cPPT de tipo salvaje y contiene la deleción de todo o una porción contigua del CTS.
En algunos casos, el Flap variante contiene una deleción de todo o una parte del cPPT y contiene una deleción de todo o una parte del CTS. En algunos casos, el Flap de ADN variante puede contener un cPPT con por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 deleciones de nucleótidos, que pueden ser deleciones de nucleótidos contiguas, en comparación con un cPPT de tipo salvaje o no modificado, como en comparación con el cPPT no modificado ejemplar expuesto en la SEQ ID NO: 123, o pueden tener el cPPT eliminado por completo y contener un CTS con por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, o 27 deleciones de nucleótidos, que pueden ser deleciones de nucleótidos contiguas, en comparación con un CTS de tipo salvaje o no modificado, como en comparación con el CTS no modificado ejemplar de la SEQ ID NO: 124, o tener el CTS eliminado por completo.
En algunos casos, el polinucleótido que contiene una secuencia Flap variante es o comprende una secuencia de nucleótidos que muestra por lo menos un 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 78%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 90% o 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 121, pero que carece de todo o una parte del cPPT y/o CTS presente en la SEQ ID NO: 121. En algunos casos, el polinucleótido que contiene una secuencia o polinucleótido de Flap variante es, comprende o contiene una porción que tiene una secuencia de nucleótidos con por lo menos o aproximadamente por lo menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 122 en la que se elimina todo o una parte de un cPPT y/o CTS. Se divulga una variante de polinucleótido de Flap ejemplar, no limitativo, como la SEQ ID NO: 122.
En algunos casos, la deleción de todos o una parte de los nucleótidos en el CTS y/o el cPPT en un Flap variante divulgado se introduce en una secuencia de polinucleótidos que contiene un Flap no modificado o de tipo salvaje mediante técnicas de ADN recombinante. En algunos casos, el polinucleótido de Flap variante se produce sintéticamente, como mediante síntesis química.
En algunos casos, el polinucleótido, por ejemplo, el vector viral, contiene una secuencia Flap variante y un PRE. En algunos casos, el PRE puede ser un PRE modificado, como cualquiera de los descritos anteriormente. Por tanto, en algunos casos, los polinucleótidos contienen secuencias de nucleótidos que contienen polinucleótidos Flap variantes y que contienen polinucleótidos PRE modificados. En algunos casos, tal polinucleótido y/o vector viral contiene la secuencia de la SEQ ID NO: 122 o una que tiene por lo menos o aproximadamente un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 122 en la que se eliminan todo o una parte del cPPT y CTS, y una secuencia para el PRE modificado se expone en la SEQ ID NO: 29 o la SEQ ID NO: 126 o una que tenga por lo menos o aproximadamente un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 29 o la SEQ ID NO: 126 que contiene las modificaciones de codones determinación introducidas.
En algunos casos, se divulga un vector viral, como un vector lentiviral, que contiene un genoma recombinante que contiene en orden entre las secuencias LTR 5' y 3' del genoma del vector: un RRE; un polinucleótido que contiene ácido nucleico viral que comprende un Flap de ADN variante que contiene una deleción de todo o una parte del cPPT y CTS, tal Flap de ADN variante se inserta en sentido ascendente un promotor que controla la expresión de un polinucleótido que codifica una proteína recombinante; un transgén que contiene un promotor que controla la expresión de un polinucleótido que codifica la proteína recombinante, como cualquiera de los descritos anteriormente, y el polinucleótido que codifica la proteína recombinante, como un receptor de antígeno (por ejemplo, un CAR); y un polinucleótido que contiene un PRE modificado, como cualquiera de los divulgados en la presente, enlazado operativamente al ácido nucleico que codifica la proteína recombinante como cualquiera de las divulgadas en la presente. En algunos casos, el genoma recombinante comprende la secuencia 5' LTR-RRE-Flap de ADN variante-transgén(es)-PRE modificado -3' LTR. En algunos casos, el PRE modificado en el vector viral, como el vector lentiviral, tiene la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 29-43, 59-73, 89-118, 126-140, 156-170 o 186-215. En algunos casos, el PRE modificado es o comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 29 o la SEQ ID NO: 126. En algunos casos, el polinucleótido que contiene ácido nucleico viral que contiene un Flap de ADN variante es o comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 122. En algunos casos, el vector lentiviral es un vector lentiviral derivado de VIH-1.
En algunos casos, puede usarse un polinucleótido, como un vector viral, que contiene un Flap de ADN variante como se divulga y/o un PRE modificado como se divulga para transferir una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína recombinante o heteróloga contenida en la misma a células para la transducción y expresión de dicha proteína. En algunos casos, aunque todavía da como resultado una transducción con éxito de células, dicha transducción por los vectores virales divulgados, en algunos casos, puede ser menor que, como hasta o hasta aproximadamente 1,1 veces, 1,2 veces, 1,5 veces, 2,0 veces, 3,0 veces, 4,0 veces o más menos que o disminución de, transducción en comparación con la transducción usando la misma cantidad o una sustancialmente similar y concentración de un vector viral correspondiente que contiene sustancialmente el mismo genoma pero que contiene una secuencia de Flap de ADN no modificada o de tipo salvaje en la que está presente el cPPT y CTS para la formación de la estructura Flap de ADN. En algunos casos, donde se desea una mayor eficiencia de transducción, puede aumentarse la eficiencia de transducción aumentando el volumen o la concentración del vector viral usado para transducir las células. En otros casos, el número de células transducidas puede enriquecerse o aumentarse mediante clasificación celular y expansión de las células transducidas.
En algunos casos, el vector también puede contener secuencias para la propagación en una célula huésped, como una célula huésped procariota. En algunos casos, el ácido nucleico del vector viral contiene uno o más orígenes de replicación para la propagación en una célula procariota, como una célula bacteriana. En algunos casos, los vectores que incluyen un origen de replicación procariota también pueden contener un gen cuya expresión confiere un marcador detectable o seleccionable como resistencia a fármacos.
3. Preparación de partículas de vectores virales
En algunos casos, el ácido nucleico, por ejemplo, uno que codifica la secuencia deseada, como el polinucleótido o el casete de expresión, se inserta en el genoma viral en lugar de ciertas secuencias virales para producir un virus que tiene una replicación defectuosa. Para producir viriones, puede construirse una línea celular de empaquetamiento que contenga los genes gag, pol y env pero sin los componentes de empaquetamiento y LTR. También puede emplearse un plásmido recombinante que contiene un polinucleótido, como un casete de expresión, que contiene ácido nucleico que codifica una proteína recombinante bajo el control operativo de un PRE modificado. Cuando se introduce un plásmido recombinante junto con el LTR retroviral y las secuencias de empaquetamiento en una línea celular especial (por ejemplo, mediante precipitación con fosfato de calcio, por ejemplo), la secuencia de empaquetamiento puede permitir que la transcripción de ARN del plásmido recombinante sea empaquetada en partículas virales, que luego pueden secretarse en el medio de cultivo. En algunos casos luego se recoge el medio que contiene los retrovirus recombinantes, opcionalmente se concentra y se usa para la transferencia de genes.
En algunos casos, una línea celular de empaquetamiento se transfecta con uno o más vectores plásmidos que contienen los componentes necesarios para generar las partículas. La línea celular de empaquetamiento puede expresar o hacerse que exprese genes lentivirales esenciales (por ejemplo, VIH-1) para permitir la generación de partículas lentivirales. Estos genes pueden expresarse mediante varios plásmidos. En algunos casos, se utilizan múltiples vectores para separar los varios componentes genéticos que generan las partículas del vector retroviral. En algunos de tales casos, proporcionar vectores separados a la célula de empaquetamiento reduce la posibilidad de eventos de recombinación que de otro modo podrían generar virus competentes de la replicación.
En algunos casos, una línea celular de empaquetamiento puede transfectarse con un plásmido de expresión lentiviral que contiene una secuencia de empaquetamiento psi (Y) que actúa en cis y el gen transgénico insertado entre las LTR lentivirales para permitir la integración de la célula objetivo; un plásmido o plásmidos de empaquetamiento que codifican los genes virales pol, gag, rev y/o tat y, en algunos casos, contienen el elemento de respuesta rev (RRE) y un plásmido de pseudotipificación, como un plásmido que codifica una proteína de la envoltura, como la proteína G del gen de la envoltura del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G).
En algunos casos, una línea celular de empaquetamiento se transfecta con un plásmido que contiene el genoma del vector viral, incluyendo las LTR, la secuencia de empaquetamiento que actúa en cis y la secuencia de interés, es decir, un ácido nucleico que codifica una proteína recombinante (por ejemplo, un receptor de antígeno, como un CAR) junto con varios plásmidos auxiliares que codifican los componentes enzimáticos y/o estructurales del virus, como Env, Gag, pol y/o rev. En algunos casos, un plásmido de empaquetamiento GagPol que contiene los genes gag y pol que codifican componentes estructurales y enzimáticos y un plásmido Rev que contiene el gen rev que codifica la proteína reguladora Rev se introducen por separado en una línea celular de empaquetamiento. En algunos casos, puede usarse un único vector plasmídico que tiene todos los componentes retrovirales. En algunos casos, también puede introducirse un plásmido de envoltura que codifica un gen env, que, en algunos casos, puede dar como resultado partículas virales pseudotipadas con proteínas Env alternativas. En algunos casos, la partícula de vector retroviral, como la partícula de vector lentiviral, se pseudotipifica para aumentar la eficacia de transducción de las células huésped. Por ejemplo, una partícula de vector retroviral, como una partícula de vector lentiviral, se pseudotipa con una glicoproteína VSV-G, que proporciona una amplia gama de huéspedes de células que amplían los tipos de células que pueden transducirse.
El gen env puede derivarse de cualquier virus apropiado, como un retrovirus. En algunos casos, el env es una proteína de envoltura anfotrópica que permite la transducción de células humanas y de otras especies. Algunos casos usan genes env derivados de retrovirus, que incluyen, pero no se limitan a: virus de la leucemia murina de Moloney (MoMuLV o MMLV), virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV o HSV), virus de tumor mamario murino (MuMTV o MMTV), virus de la leucemia del mono gibón (GaLV o GALV), virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y virus del sarcoma de Rous (RSV). En algunos casos, también pueden usarse otros genes env como la proteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV) (VSVG), el de los virus de la hepatitis y de la gripe.
En algunos casos, el plásmido de empaquetamiento que proporciona la secuencia de ácido nucleico env viral está asociado operativamente con secuencias reguladoras, por ejemplo, un promotor o potenciador. La secuencia reguladora en algunos casos puede ser cualquier promotor o potenciador eucariótico, incluyendo por ejemplo, EF1a, PGK, el elemento promotor-potenciador del virus de la leucemia murina de Moloney, el potenciador del citomegalovirus humano, el promotor de la vacuna P7.5 o similares. En algunos casos, como el elemento promotor-potenciador del virus de la leucemia murina de Moloney, los elementos promotor-potenciador se localizan dentro o adyacentes a las secuencias de LTR. En algunos casos, la secuencia reguladora es una que no es endógena al lentivirus a partir del cual se construye el vector. Por tanto, si el vector se hace a partir de SIV, la secuencia reguladora de SIV encontrada en la LTR de SIV puede reemplazarse por un elemento regulador que no se origina de SIV.
En algunos casos, los vectores virales y los plásmidos de empaquetamiento se introducen mediante transfección o infección en la línea celular de empaquetamiento. La línea celular de empaquetamiento produce partículas de vectores virales que contienen el genoma del vector viral. Los métodos de transfección o infección son bien conocidos. Los ejemplos no limitativos incluyen fosfato de calcio, DEAE-dextrano y métodos de lipofección, electroporación y microinyección. Después de la cotransfección de los plásmidos de empaquetamiento y el vector de transferencia a la línea celular de empaquetamiento, las partículas del vector viral se recuperan del medio de cultivo y se titulan mediante métodos estándar usados por los expertos en la técnica. Por tanto, los plásmidos de empaquetamiento en algunos casos se introducen en líneas celulares humanas mediante estos métodos, generalmente junto con un marcador seleccionable dominante, como neomicina, DHFR, glutamina sintetasa o ADA, seguido de selección en presencia del fármaco apropiado y aislamiento de clones. El gen marcador seleccionable puede enlazarse físicamente a los genes de empaquetamiento en el constructo.
En algunos casos, las partículas de vector viral pueden producirse mediante líneas celulares estables en las que están configuradas para expresarse las funciones de empaquetamiento. Se conocen células de empaquetamiento adecuadas que incluyen, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5.686.279; y Ory et al., (1996). Las células de empaquetamiento con un vector lentiviral incorporado en ellas forman células productoras. Por tanto, las células productoras son células o líneas celulares que pueden producir o liberar partículas de vectores virales que portan el gen de interés. En algunos casos, estas células pueden depender además del anclaje, lo que significa que estas células crecerán, sobrevivirán o mantendrán su función de manera óptima cuando se unen a una superficie como vidrio o plástico. En algunos casos, las células productoras pueden ser células transformadas neoplásicamente. En algunos casos, las células huésped para la transfección con el vector lentiviral y los plásmidos de empaquetamiento incluyen, por ejemplo, células primarias de mamíferos; líneas celulares de mamíferos expuestas, como células c Os , CHO, HeLa, NIH3T3, 293t y PC12; células anfibias, como embriones y ovocitos de Xenopus; otras células de vertebrados; células de insectos (por ejemplo, Drosophila), células de levadura (por ejemplo, S. cerevisiae, S. pombe o Pichia pastoris) y células procariotas (por ejemplo, E. coli).
En algunos casos, pueden producirse vectores lentivirales en una línea celular de empaquetamiento, como una línea celular HEK 293T ejemplar, mediante la introducción de plásmidos para permitir la generación de partículas lentivirales. Aproximadamente dos días después de la transfección de células, por ejemplo, células HEK 293T, el sobrenadante celular contiene vectores lentivirales recombinantes, que pueden usarse para transducir las células objetivo. Una vez en las células objetivo, el ARN viral se transcribe de manera inversa, se importa al núcleo y se integra de manera estable en el genoma del huésped. Uno o dos días después de la integración del ARN viral, puede detectarse la expresión de la proteína recombinante.
D. Métodos de producción y métodos de modificación de células.
También se divulgan métodos para producir los polinucleótidos que contienen los PRE modificados y/o casetes, vectores y/o células modificadas que contienen los mismos. En algunos casos, los métodos incluyen introducir la modificación o modificaciones en una secuencia de PRE de tipo salvaje o no modificada u otra secuencia de PRE modificada de inicio, como una que se sabe que tiene un grado particular de actividad. En algunos casos, tales modificaciones se efectúan mutando un vector existente.
Los métodos incluyen además aquellos para modificar células introduciendo en una célula de un polinucleótido que contiene un PRE modificado como se divulga en la presente, enlazado operativamente a un ácido nucleico que codifica la molécula recombinante, como la proteína recombinante, como la proteína heteróloga, por ejemplo, un receptor de antígeno, como un TCR o CAR, u otro receptor quimérico. El polinucleótido puede introducirse en las células en el contexto de una partícula de vector viral que contiene en su genoma el polinucleótido divulgado, incluyendo el ácido nucleico que codifica la molécula recombinante, como la proteína heteróloga. También se divulgan células que contienen polinucleótidos, casetes y/o vectores con los PRE modificados y ácidos nucleicos y composiciones que contienen los mismos y/o producidos mediante los métodos divulgados.
Las células generalmente son células eucariotas, como células de mamífero, y típicamente son células humanas. En algunos casos, las células se derivan de la sangre, la médula ósea, la linfa o los órganos linfoides, son células del sistema inmunológico, como células de la inmunidad innata o adaptativa, por ejemplo, células mieloides o linfoides, incluyendo linfocitos, típicamente células T y/o células NK. Otras células ejemplares incluyen células madre, como células madre multipotentes y pluripotentes, incluyendo células madre pluripotentes inducidas (iPSC). En algunos casos, las células son células primarias, como las aisladas directamente de un sujeto y/o aisladas de un sujeto y congeladas. En algunos casos, las células incluyen uno o más subconjuntos de células T u otros tipos de células, como poblaciones de células T completas, células CD4+, células CD8+ y subpoblaciones de las mismas, como las definidas por función, estado de activación, madurez, potencial de diferenciación, expansión, recirculación, localización y/o capacidades de persistencia, especificidad de antígeno, tipo de receptor de antígeno, presencia en un órgano o compartimento particular, perfil de secreción de marcador o citoquina y/o grado de diferenciación. Con referencia al sujeto a tratar, las células pueden ser alogénicas y/o autólogas. Entre los métodos se incluyen los métodos listos para el uso. En algunos aspectos, como las tecnologías listas para el uso, las células son pluripotentes y/o multipotentes, como células madre, como células madre pluripotentes inducidas (iPSC). En algunos casos, los métodos incluyen aislar células del sujeto, prepararlas, procesarlas, cultivarlas y/o modificarlas y reintroducirlas en el mismo sujeto, antes o después de la crioconservación.
Entre los subtipos y subpoblaciones de células T y/o de células T CD4+ y/o CD8+ se encuentran las células T vírgenes (Tn), las células T efectoras (Teff), las células T de memoria y subtipos de las mismas, como T de memoria de células madre (Tscm), T de memoria central (Tcm), T de memoria efectora (Tem) o células T de memoria efectora diferenciadas terminalmente, linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), células T inmaduras, células T maduras, células T auxiliares, células T citotóxicas, células T invariantes asociadas a la mucosa (MAIT), células T reguladoras adaptativas y de origen natural (Treg), células T auxiliares, como células TH1, células TH2, células TH3, células TH17, células TH9, células TH22, células T auxiliares foliculares, células T alfa/beta y células T delta/gamma.
En algunos casos, las células son células asesinas naturales (NK). En algunos casos, las células son monocitos o granulocitos, por ejemplo, células mieloides, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, mastocitos, eosinófilos y/o basófilos.
La ingeniería genética generalmente implica la introducción del polinucleótido o polinucleótidos en la célula, como mediante transducción, transfección o transformación retroviral, como se ha descrito anteriormente.
En algunos casos, la transferencia génica se logra estimulando primero la célula, por ejemplo combinándola con un estímulo que induzca una respuesta como proliferación, supervivencia y/o activación, por ejemplo, medida por la expresión de una citoquina o marcador de activación, seguido de la transducción de las células activadas y la expansión en cultivo hasta cantidades suficientes para aplicaciones clínicas.
En algunos contextos, la sobreexpresión de un factor estimulador (por ejemplo, una linfocina o una citoquina) puede ser tóxica para un sujeto. Por tanto, en algunos contextos, las células modificadas genéticamente incluyen segmentos de genes que hacen que las células sean susceptibles a la selección negativa in vivo, como tras la administración en inmunoterapia adoptiva. Por ejemplo, en algunos aspectos, las células están modificadas de tal manera que puedan eliminarse como resultado de un cambio en la condición in vivo del sujeto al que se administran. El fenotipo seleccionable negativo puede resultar de la inserción de un gen que confiere sensibilidad a un agente administrado, por ejemplo, un compuesto. Los genes seleccionables negativos incluyen el gen de la timidina quinasa de tipo I del virus del Herpes simple (HSV-I TK) (Wigler et al., Cell II: 223, 1977) que confiere sensibilidad al ganciclovir; el gen de la fosforibosiltransferasa de hipoxantina celular (HPRT), el gen de la fosforibosiltransferasa de adenina celular (APRT), deaminasa de citosina bacteriana (Mullen et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA. 89:33 (1992)). En algunos aspectos, las células se modifican además para promover la expresión de citoquinas u otros factores. Se conocen bien varios métodos para la introducción de componentes modificados genéticamente, por ejemplo, receptores de antígenos, por ejemplo, CAR, y pueden usarse con los métodos y composiciones divulgados.
En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a las células T mediante electroporación (ver, por ejemplo, Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298 y Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437). En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a las células T mediante transposición (ver, por ejemplo, Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucí Acids 2, e74; y Huang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126). Otros métodos de introducción y expresión de material genético en células inmunes incluyen transfección con fosfato de calcio (por ejemplo, como se describe en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York. N.Y.), fusión de protoplastos, transfección mediada por liposomas catiónicos; bombardeo de micropartículas facilitado por partículas de tungsteno (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); y coprecipitación de ADN con fosfato de estroncio (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)).
Otros enfoques y vectores para la transferencia de los ácidos nucleicos que codifican los productos recombinantes son los descritos, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional, N° de publicación: WO2014055668 y la Patente de Estados Unidos N° 7.446.190.
Entre los ácidos nucleicos adicionales, por ejemplo, los genes para la introducción están los que mejoran la eficacia de la terapia, por ejemplo, promoviendo la viabilidad y/o función de las células transferidas; genes para proporcionar un marcador genético para la selección y/o evaluación de las células, como para evaluar la supervivencia o localización in vivo; genes para mejorar la seguridad, por ejemplo, haciendo que la célula sea susceptible a la selección negativa in vivo como se describe por Lupton SD et al., Mol. y Cell Biol., 11:6 (1991); y Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992); ver también las publicaciones PCT/US91/08442 y PCT/US94/05601 de Lupton et al. que describen el uso de genes de fusión seleccionables bifuncionales derivados de la fusión de un marcador seleccionable positivo dominante con un marcador seleccionable negativo. Ver, por ejemplo, Riddell et al., Patente de Estados Unidos N° 6.040.177, en las columnas 14-17.
En algunos casos, la preparación de las células modificadas incluye uno o más pasos de cultivo y/o preparación. Las células para la introducción del ácido nucleico que codifica el PRE modificado pueden aislarse de una muestra, como una muestra biológica, por ejemplo, una obtenida o derivada de un sujeto. En algunos casos, el sujeto del que se aísla la célula es uno que tiene la enfermedad o afección o que necesita una terapia celular o al que se le administrará la terapia celular. En algunos casos, el sujeto es un humano que necesita una intervención terapéutica particular, como la terapia celular adoptiva para la que se están aislando, procesando y/o modificando células.
Por consiguiente, las células en algunos casos son células primarias, por ejemplo, células humanas primarias. Las muestras incluyen tejidos, fluidos y otras muestras tomadas directamente del sujeto, así como muestras resultantes de uno o más pasos de procesamiento, como separación, centrifugación, ingeniería genética (por ejemplo, transducción con vector viral), lavado y/o incubación. La muestra biológica puede ser una muestra obtenida directamente de una fuente biológica o una muestra que se procesa. Las muestras biológicas incluyen, pero no se limitan a, fluidos corporales como sangre, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, orina y sudor, muestras de tejidos y órganos, incluyendo muestras procesadas derivadas de las mismas.
En algunos aspectos, la muestra de la que se derivan o aíslan las células es sangre o una muestra derivada de sangre, o es o se deriva de un producto de aféresis o leucaféresis. Las muestras ejemplares incluyen sangre total, células mononucleares de sangre periférica (PBMC), leucocitos, médula ósea, timo, biopsia de tejido, tumor, leucemia, linfoma, ganglio linfático, tejido linfoide asociado al intestino, tejido linfoide asociado a mucosas, bazo, otros tejidos linfoides, hígado, pulmón, estómago, intestino, colon, riñón, páncreas, mama, hueso, próstata, cuello uterino, testículos, ovarios, amígdalas u otro órgano y/o células derivadas de los mismos. Las muestras incluyen, en el contexto de la terapia celular, por ejemplo, la terapia celular adoptiva, muestras de fuentes autólogas y alogénicas.
En algunos casos, las células se derivan de líneas celulares, por ejemplo, líneas de células T. Las células en algunos casos se obtienen de una fuente xenogénica, por ejemplo, de ratón, rata, primate no humano y cerdo.
En algunos casos, el aislamiento de las células incluye uno o más pasos de preparación y/o separación de células no basados en afinidad. En algunos ejemplos, las células se lavan, centrifugan y/o incuban en presencia de uno o más reactivos, por ejemplo, para eliminar componentes no deseados, enriquecer para obtener componentes deseados, lisar o eliminar células sensibles a reactivos particulares. En algunos ejemplos, las células se separan en base a una o más propiedades, como densidad, propiedades adherentes, tamaño, sensibilidad y/o resistencia a componentes particulares.
En algunos ejemplos, las células de la sangre circulante de un sujeto se obtienen, por ejemplo, mediante aféresis o leucoféresis. Las muestras, en algunos aspectos, contienen linfocitos, incluyendo células T, monocitos, granulocitos, células B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y/o plaquetas, y en algunos aspectos contienen células distintas de glóbulos rojos y plaquetas.
En algunos casos, las células sanguíneas recogidas del sujeto se lavan, por ejemplo, para eliminar la fracción de plasma y colocar las células en un tampón o medio apropiado para los pasos de procesamiento posteriores. En algunos casos, las células se lavan con solución salina tamponada con fosfato (PBS). En algunos casos, la solución de lavado carece de calcio y/o magnesio y/o muchos o todos los cationes divalentes. En algunos aspectos, un paso de lavado se realiza en una centrífuga de "flujo continuo" semiautomática (por ejemplo, el procesador celular Cobe 2991, Baxter) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En algunos aspectos, un paso de lavado se logra mediante filtración de flujo tangencial (TFF) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En algunos casos, las células se vuelven a suspender en una variedad de tampones biocompatibles después del lavado, como, por ejemplo, PBS libre de Ca++/Mg++. En ciertos casos, los componentes de una muestra de células sanguíneas se extraen y las células se vuelven a suspender directamente en el medio de cultivo.
En algunos casos, los métodos incluyen métodos de separación de células basados en densidad, como la preparación de glóbulos blancos a partir de sangre periférica mediante la lisis de los glóbulos rojos y la centrifugación a través de un gradiente de Percoll o Ficoll.
En algunos casos, los métodos de aislamiento incluyen la separación de diferentes tipos de células en base a la expresión o presencia en la célula de una o más moléculas específicas, como marcadores de superficie, por ejemplo, proteínas de superficie, marcadores intracelulares o ácido nucleico. En algunos casos, puede usarse cualquier método conocido para la separación en base a tales marcadores. En algunos casos, la separación es una separación basada en afinidad o inmunoafinidad. Por ejemplo, el aislamiento en algunos aspectos incluye la separación de células y poblaciones de células en base a la expresión de las células o el nivel de expresión de uno o más marcadores, típicamente marcadores de superficie celular, por ejemplo, mediante incubación con un anticuerpo o compañero de unión que se une específicamente a tales marcadores, seguidos generalmente por pasos de lavado y separación de las células que se han unido al anticuerpo o al compañero de unión, de las células que no se han unido al anticuerpo o compañero de unión.
Tales pasos de separación pueden basarse en selección positiva, en la que las células que se han unido a los reactivos se conservan para uso posterior, y/o en selección negativa, en la que se conservan las células que no se han unido al anticuerpo o al compañero de unión. En algunos ejemplos, ambas fracciones se conservan para su uso posterior. En algunos aspectos, la selección negativa puede ser particularmente útil cuando no hay ningún anticuerpo disponible que identifique específicamente un tipo de célula en una población heterogénea, de tal manera que la separación se lleva a cabo mejor en base a los marcadores expresados por células distintas de la población deseada.
No es necesario que la separación dé como resultado un enriquecimiento del 100% o la eliminación de una población celular particular o células que expresan un marcador particular. Por ejemplo, la selección positiva o el enriquecimiento de células de un tipo particular, como las que expresan un marcador, se refiere a aumentar el número o porcentaje de tales células, pero no tiene por qué dar como resultado una ausencia completa de células que no expresan el marcador. De igual manera, la selección negativa, eliminación o agotamiento de células de un tipo particular, como las que expresan un marcador, se refiere a disminuir el número o porcentaje de tales células, pero no tiene por qué dar como resultado la eliminación completa de todas esas células.
En algunos ejemplos, se llevan a cabo múltiples series de pasos de separación, en las que la fracción seleccionada positiva o negativamente de un paso se somete a otro paso de separación, como una selección positiva o negativa posterior. En algunos ejemplos, un solo paso de separación puede agotar las células que expresan múltiples marcadores simultáneamente, como incubando células con una pluralidad de anticuerpos o compañeros de unión, cada uno específico para un marcador dirigido para la selección negativa. De igual manera, pueden seleccionarse positivamente múltiples tipos de células simultáneamente incubando células con una pluralidad de anticuerpos o compañeros de unión expresados en los varios tipos de células.
Por ejemplo, en algunos aspectos, subpoblaciones específicas de células T, como células positivas o que expresan niveles altos de uno o más marcadores de superficie, por ejemplo, células T CD28+, CD62L+, CCR7+, c D27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ y/o CD45RO+, se aíslan mediante técnicas de selección positiva o negativa.
Por ejemplo, las células T CD3+, CD28+ pueden seleccionarse positivamente usando perlas magnéticas conjugadas CD3/CD28 (por ejemplo, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander).
En algunos casos, el aislamiento se lleva a cabo mediante el enriquecimiento de una población celular particular mediante selección positiva, o el agotamiento de una población celular particular, mediante selección negativa. En algunos casos, la selección positiva o negativa se logra incubando células con uno o más anticuerpos u otro agente de unión que se unen específicamente a uno o más marcadores de superficie expresados o expresados (marcador+) a un nivel relativamente más alto (marcadoralto) en las células seleccionadas positiva o negativamente, respectivamente.
En algunos casos, las células T se separan de una muestra de PBMC mediante la selección negativa de marcadores expresados en células que no son T, como células B, monocitos u otros glóbulos blancos, como CD14. En algunos aspectos, se usa un paso de selección de CD4+ o CD8+ para separar las células T auxiliares CD4+ y citotóxicas CD8+. Tales poblaciones de CD4+ y CD8+ pueden clasificarse adicionalmente en subpoblaciones mediante selección positiva o negativa de marcadores expresados o expresados en un grado relativamente más alto en una o más subpoblaciones de células T vírgenes, de memoria y/o efectoras.
En algunos casos, las células CD8+ se enriquecen adicionalmente o se agotan en células madre vírgenes, de memoria central, memoria efectora y/o memoria central, como mediante selección positiva o negativa basada en antígenos de superficie asociados con la subpoblación respectiva. En algunos casos, el enriquecimiento de las células T de memoria central (Tcm) se lleva a cabo para aumentar la eficacia, como para mejorar la supervivencia a largo plazo, la expansión y/o el injerto después de la administración, que en algunos aspectos es particularmente robusto en tales subpoblaciones. Ver Terakura et al. (2012) Blood.1: 72-82; Wang et al. (2012) J Immunother.
35(9):689-701. En algunos casos, la combinación de células T CD8+ y células T CD4+ enriquecidas con Tcm mejoran aún más la eficacia.
En casos, las células T de memoria están presentes en los subconjuntos CD62L+ y CD62L-de los linfocitos de sangre periférica CD8+. Los PBMC pueden enriquecerse o agotarse de las fracciones CD62L-CD8+ y/o CD62L+CD8+, como por ejemplo usando anticuerpos anti-CD8 y anti-CD62L.
En algunos casos, el enriquecimiento de las células T de memoria central (Tcm) se basa en una expresión de superficie alta o positiva de CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 y/o CD 127; en algunos aspectos, se basa en la selección negativa de células que expresan o expresan en gran medida CD45RA y/o granzima B. En algunos aspectos, el aislamiento de una población de CD8+ enriquecida para células Tcm se lleva a cabo mediante el agotamiento de las células que expresan CD4, CD14, CD45RA y selección positiva o enriquecimiento de células que expresan CD62L. En un aspecto, el enriquecimiento de células T de memoria central (Tcm) se lleva a cabo partiendo de una fracción negativa de células seleccionadas en base a la expresión de CD4, que se somete a una selección negativa en base a la expresión de CD14 y CD45RA, y a una selección positiva en base a CD62L. Tales selecciones en algunos aspectos se llevan a cabo simultáneamente y en otros aspectos se llevan a cabo secuencialmente, en cualquier orden. En algunos aspectos, el mismo paso de selección basado en la expresión de CD4 que se usa para preparar la población o subpoblación de células CD8+, también se usa para generar la población o subpoblación de células CD4+, de tal manera que se conservan tanto las fracciones positivas como las negativas de la separación basada en CD4- la base y usan en los pasos posteriores de los métodos, opcionalmente siguiendo uno o más pasos de selección positiva o negativa adicionales.
En un ejemplo particular, una muestra de PBMC u otra muestra de glóbulos blancos se somete a selección de células CD4+, donde se conservan tanto las fracciones negativas como las positivas. Luego la fracción negativa se somete a selección negativa en base a la expresión de CD14 y CD45RA o CD19, y a selección positiva en base a un marcador característico de las células T de memoria central, como CD62L o CCR7, donde las selecciones positiva y negativa se llevan a cabo en cualquier orden.
Las células auxiliares T CD4+ se clasifican en células vírgenes, de memoria central y efectoras identificando poblaciones de células que tienen antígenos de superficie celular. Los linfocitos CD4+ pueden obtenerse mediante métodos estándar. En algunos casos, los linfocitos T CD4+ vírgenes son células T CD45RO-, CD45RA+, CD62L+, CD4+. En algunos casos, las células CD4+ de memoria central son CD62L+ y CD45RO+. En algunos casos, las células CD4+ efectoras son CD62L-y CD45RO-.
En un ejemplo, para enriquecer las células CD4+ mediante selección negativa, un cóctel de anticuerpos monoclonales incluye típicamente anticuerpos contra CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR y CD8. En algunos casos, el anticuerpo o compañero de unión se une a un soporte sólido o matriz, como una perla magnética o una perla paramagnética, para permitir la separación de células para la selección positiva y/o negativa. Por ejemplo, en algunos casos, las células y las poblaciones de células se separan o aíslan usando técnicas de separación inmunomagnéticas (o de afinidad magnética) (revisadas en Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocol, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p. 17-25 Editado por: S.A. Brooks y U. Schumacher© Humana Press Inc., Totowa, NJ).
En algunos aspectos, la muestra o composición de células que se van a separar se incuba con material pequeño, magnetizable o magnéticamente sensible, como partículas o micropartículas magnéticamente sensibles, como perlas paramagnéticas (por ejemplo, perlas Dynabeads o MACS). El material magnéticamente sensible, por ejemplo, una partícula, generalmente se une directa o indirectamente a un compañero de unión, por ejemplo, un anticuerpo, que se une específicamente a una molécula, por ejemplo, un marcador de superficie, presente en la célula, células o población de células que se desea separar, por ejemplo, que se desea seleccionar negativa o positivamente.
En algunos casos, la partícula o perla magnética comprende un material magnéticamente sensible unido a un miembro de unión específico, como un anticuerpo u otro compañero de unión. Hay muchos materiales magnéticamente sensibles bien conocidos que se usan en los métodos de separación magnética. Las partículas magnéticas adecuadas incluyen las descritas en Molday, Patente de Estados Unidos N° 4.452.773 y en la Memoria descriptiva de la Patente Europea EP 452342 B. Las partículas de tamaño coloidal, como las descritas en la Patente de Estados Unidos N° 4.795.698 de Owen y Liberti et al., Patente de Estados Unidos N° 5.200.084 son otros ejemplos.
La incubación generalmente se lleva a cabo en condiciones en las que los anticuerpos o compañeros de unión, o moléculas, como anticuerpos secundarios u otros reactivos, que se unen específicamente a tales anticuerpos o compañeros de unión, que están unidos a la partícula o perla magnética, se unen específicamente a las moléculas de la superficie celular si están presentes en las células dentro de la muestra.
En algunos aspectos, la muestra se coloca en un campo magnético, y aquellas células que tienen partículas magnéticamente sensibles o magnetizables unidas a la misma serán atraídas por el imán y separadas de las células no marcadas. Para la selección positiva, se retienen las células que son atraídas por el imán; para la selección negativa, se retienen las células que no se atraen (células no marcadas). En algunos aspectos, se realiza una combinación de selección positiva y negativa durante el mismo paso de selección, donde las fracciones positivas y negativas se retienen y se procesan adicionalmente o se someten a pasos de separación adicionales.
En ciertos casos, las partículas magnéticamente sensibles se recubren en anticuerpos primarios u otros compañeros de unión, anticuerpos secundarios, lectinas, enzimas o estreptavidina. En ciertos casos, las partículas magnéticas se unen a las células mediante un recubrimiento de anticuerpos primarios específicos para uno o más marcadores. En ciertos casos, las células, en lugar de las perlas, se marcan con un anticuerpo primario o un compañero de unión, y luego se añaden partículas magnéticas recubiertas con un anticuerpo secundario específico de tipo celular u otro compañero de unión (por ejemplo, estreptavidina). En ciertos casos, las partículas magnéticas recubiertas de estreptavidina se usan junto con anticuerpos primarios o secundarios biotinilados.
En algunos casos, las partículas magnéticamente sensibles se dejan unidas a las células que posteriormente se incubarán, cultivarán y/o modificarán; en algunos aspectos, las partículas se dejan unidas a las células para su administración a un paciente. En algunos casos, se eliminan de las células las partículas magnetizables o magnéticamente sensibles. Los métodos para eliminar partículas magnetizables de las células son conocidos e incluyen, por ejemplo, el uso de anticuerpos competidores no marcados y partículas magnetizables o anticuerpos conjugados con conectores escindibles. En algunos casos, las partículas magnetizables son biodegradables.
En algunos casos, la selección basada en afinidad se realiza mediante clasificación celular activada magnéticamente (MACS) (Miltenyi Biotech, Auburn, CA). Los sistemas de clasificación celular activada magnéticamente (MACS) son capaces de realizar una selección de alta pureza de células que tienen partículas magnetizadas unidas a las mismas. En ciertos casos, MACS funciona en un modo en el que las especies objetivo y no objetivo se eluyen secuencialmente después de la aplicación del campo magnético externo. Es decir, las células unidas a las partículas magnetizadas se mantienen en su lugar mientras se eluyen las especies no unidas. Luego, una vez completado este primer paso de elución, las especies que quedaron atrapadas en el campo magnético y se impidió que fueran eluidas se liberan de alguna manera de tal manera que puedan eluirse y recuperarse. En ciertos casos, las células no objetivo se marcan y agotan de la población heterogénea de células.
En ciertos casos, el aislamiento o separación se lleva a cabo usando un sistema, dispositivo o aparato que lleva a cabo uno o más de los pasos de aislamiento, preparación celular, separación, procesamiento, incubación, cultivo y/o formulación de los métodos. En algunos aspectos, el sistema se usa para llevar a cabo cada uno de estos pasos en un entorno cerrado o estéril, por ejemplo, para minimizar el error, la manipulación por parte del usuario y/o la contaminación. En un ejemplo, el sistema es un sistema como se describe en la Solicitud de Patente Internacional, Número de Publicación WO2009/072003, o US 20110003380 A1.
En algunos casos, el sistema o aparato lleva a cabo uno o más, por ejemplo, todos los pasos de aislamiento, procesamiento, modificación y formulación en un sistema integrado o autocontenido y/o de una manera automatizada o programable. En algunos aspectos, el sistema o aparato incluye un ordenador y/o programa de ordenador en comunicación con el sistema o aparato, lo que permite al usuario programar, controlar, evaluar el resultado y/o ajustar varios aspectos de los pasos de procesamiento, aislamiento, modificación y formulación.
En algunos aspectos, la separación y/u otras pasos se llevan a cabo usando el sistema CliniMACS (Miltenyi Biotic), por ejemplo, para la separación automatizada de células a nivel de escala clínica en un sistema cerrado y estéril. Los componentes pueden incluir un microordenador integrado, una unidad de separación magnética, una bomba peristáltica y varias válvulas de pinzamiento. En algunos aspectos, el ordenador integrado controla todos los componentes del instrumento y dirige el sistema para que realice procedimientos repetidos en una secuencia estandarizada. En algunos aspectos la unidad de separación magnética incluye un imán permanente móvil y un soporte para la columna de selección. La bomba peristáltica controla el caudal en todo el conjunto de tubos y, junto con las válvulas de pinzamiento, asegura el flujo controlado de tampón a través del sistema y la suspensión continua de las células.
El sistema CliniMACS en algunos aspectos usa partículas magnetizables acopladas a anticuerpos que se suministran en una solución estéril no pirogénica. En algunos casos, después de marcar las células con partículas magnéticas, las células se lavan para eliminar el exceso de partículas. Luego, se conecta una bolsa de preparación de células al conjunto de tubos, que a su vez se conecta a una bolsa que contiene tampón y una bolsa de recogida de células. El conjunto de tubos consiste de tubos estériles preensamblados, que incluyen una precolumna y una columna de separación, y son para un solo uso. Una vez iniciado el programa de separación, el sistema aplica automáticamente la muestra de células en la columna de separación. Las células marcadas se retienen dentro de la columna, mientras que las células no marcadas se eliminan mediante una serie de pasos de lavado. En algunos casos, las poblaciones de células para su uso con los métodos descritos en la presente no están marcadas y no se retienen en la columna. En algunos casos, las poblaciones de células para su uso con los métodos descritos en la presente se marcan y se retienen en la columna. En algunos casos, las poblaciones de células para su uso con los métodos descritos en la presente se eluyen de la columna después de la eliminación del campo magnético y se recogen dentro de la bolsa de recogida de células.
En ciertos casos, la separación y/u otros pasos se llevan a cabo usando el sistema CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec). El sistema CliniMACS Prodigy en algunos aspectos está equipado con una unidad de procesamiento celular que permite el lavado y el fraccionamiento automátizados de las células por centrifugación. El sistema CliniMACS Prodigy también puede incluir una cámara integrada y un software de reconocimiento de imágenes que determina el criterio de valoración óptimo del fraccionamiento celular discerniendo las capas macroscópicas del producto de la célula de origen. Por ejemplo, la sangre periférica puede separarse automáticamente en eritrocitos, glóbulos blancos y capas de plasma. El sistema CliniMACS Prodigy también puede incluir una cámara de cultivo celular integrada que logra protocolos de cultivo celular como, por ejemplo, diferenciación y expansión celular, carga de antígeno y cultivo celular a largo plazo. Los puertos de entrada pueden permitir la extracción estéril y el reabastecimiento de medios y las células pueden monitorizarse usando un microscopio integrado. Ver, por ejemplo, Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Sangre. 1:72-82 y Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701.
En algunos casos, una población celular descrita en la presente se recoge y se enriquece (o se agota) mediante citometría de flujo, en la que las células teñidas para múltiples marcadores de superficie celular se transportan en una corriente fluídica. En algunos casos, una población celular descrita en la presente se recoge y se enriquece (o se agota) mediante clasificación a escala preparativa (FACS). En ciertos casos, una población celular descrita en la presente se recoge y enriquece (o agota) mediante el uso de chips de sistemas microelectromecánicos (MEMS) en combinación con un sistema de detección basado en FACS (ver, por ejemplo, WO 2010/033140, Cho et al. (2010) Lab Chip 10, 1567-1573; y Godin et al. (2008) J Biophoton. 1(5):355-376. En ambos casos, las células pueden marcarse con múltiples marcadores, lo que permite el aislamiento de subconjuntos de células T bien definidos de alta pureza.
En algunos casos, los anticuerpos o compañeros de unión se marcan con uno o más marcadores detectables, para facilitar la separación para la selección positiva y/o negativa. Por ejemplo, la separación puede basarse en la unión a anticuerpos marcados con fluorescencia. En algunos ejemplos, la separación de células en base a la unión de anticuerpos u otros compañeros de unión específicos para uno o más marcadores de superficie celular se lleva a cabo en una corriente fluídica, como mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), incluyendo la escala preparativa (FACS) y/o chips de sistemas microelectromecánicos (MEMS), por ejemplo, en combinación con un sistema de detección de citometría de flujo. Tales métodos permiten la selección positiva y negativa en base a múltiples marcadores simultáneamente.
En algunos casos, los métodos de preparación incluyen pasos para congelar, por ejemplo, crioconservar, las células, antes o después del aislamiento, incubación y/o modificación. En algunos casos, el paso de congelación y el de descongelación posterior elimina los granulocitos y, hasta cierto punto, los monocitos de la población celular. En algunos casos, las células se suspenden en una solución de congelación, por ejemplo, después de un paso de lavado para eliminar el plasma y las plaquetas. Puede usarse cualquiera de una variedad de soluciones y parámetros de congelación conocidos en algunos aspectos. Un ejemplo implica el uso de PBS que contiene un 20% de DMSO y un 8% de albúmina de suero humano (HSA), u otros medios de congelación de células adecuados. Luego, se diluye 1:1 con medio de tal manera que la concentración final de DMSO y HSA sea del 10% y el 4%, respectivamente. Luego, las células se congelan generalmente a -80° C a una velocidad de 1° por minuto y se almacenan en la fase de vapor de un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido.
En algunos casos, los métodos divulgados incluyen pasos de cultivo, incubación, cultivo y/o ingeniería genética. Por ejemplo, en algunos casos, se divulgan métodos para incubar y/o modificar las poblaciones de células agotadas y las composiciones de inicio del cultivo.
Por tanto, en algunos casos, las poblaciones de células se incuban en una composición de inicio del cultivo. La incubación y/o la modificación pueden llevarse a cabo en un recipiente de cultivo, como una unidad, cámara, pocillo, columna, tubo, conjunto de tubos, válvula, vial, placa de cultivo, bolsa u otro recipiente para cultivo o crecimiento de células.
En algunos casos, las células se incuban y/o cultivan antes o en conexión con la ingeniería genética. Los pasos de incubación pueden incluir cultivo, crecimiento, estimulación, activación y/o propagación. En algunos casos, las composiciones o células se incuban en presencia de condiciones estimuladoras o un agente estimulador. Tales condiciones incluyen aquellas diseñadas para inducir la proliferación, expansión, activación y/o supervivencia de células en la población, para imitar la exposición al antígeno y/o cebar las células para la ingeniería genética, como para la introducción de un receptor de antígeno recombinante.
Las condiciones pueden incluir uno o más medios particulares, temperatura, contenido de oxígeno, contenido de dióxido de carbono, tiempo, agentes, por ejemplo, nutrientes, aminoácidos, antibióticos, iones y/o factores estimuladores, como citoquinas, quimiocinas, antígenos, compañeros de unión, proteínas de fusión, receptores solubles recombinantes y cualquier otro agente diseñado para activar las células.
En algunos casos, las condiciones o agentes estimuladores incluyen uno o más agentes, por ejemplo, ligando, que es capaz de activar un dominio de señalización intracelular de un complejo TCR. En algunos aspectos, el agente enciende o inicia la cascada de señalización intracelular de TCR/CD3 en una célula T. Tales agentes pueden incluir anticuerpos, como los específicos para un componente de TCR y/o receptor coestimulador, por ejemplo, anti-CD3, anti-CD28, por ejemplo, unidos a un soporte sólido como una perla y/o una o más citoquinas. Opcionalmente, el método de expansión puede comprender además el paso de añadir anticuerpo anti-CD3 y/o anti CD28 al medio de cultivo (por ejemplo, a una concentración de por lo menos aproximadamente 0,5 ng/ml). En algunos casos, los agentes estimuladores incluyen IL-2 y/o IL-15, por ejemplo, una concentración de IL-2 de por lo menos aproximadamente 10 unidades/ml.
En algunos aspectos, la incubación se lleva a cabo de acuerdo con técnicas como las descritas en la Patente de Estados Unidos N° 6.040.177 de Riddell et al., Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood 1:72-82 y/o Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701.
En algunos casos, las células T se expanden añadiendo a la composición de inicio del cultivo células alimentadoras, como células mononucleares de sangre periférica que no se dividen (PBMC), (por ejemplo, de tal manera que la población de células resultante contenga por lo menos aproximadamente 5, 10, 20, o 40 o más células alimentadoras de PBMC por cada linfocito T en la población inicial a expandir); e incubar el cultivo (por ejemplo, durante un tiempo suficiente para expandir el número de células T). En algunos aspectos, las células alimentadoras que no se dividen pueden comprender células alimentadoras de PBMC irradiadas con rayos gamma. En algunos casos, las PBMC se irradian con rayos gamma en el intervalo de aproximadamente 3000 a 3600 rads para evitar la división celular. En algunos aspectos, las células alimentadoras se añaden al medio de cultivo antes de la adición de las poblaciones de células T.
En algunos casos, las condiciones estimuladoras incluyen temperatura adecuada para el crecimiento de linfocitos T humanos, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 25 grados Celsius, generalmente por lo menos aproximadamente 30 grados, y generalmente de o aproximadamente 37 grados Celsius. Opcionalmente, la incubación puede comprender además la adición de células linfoblastoides (LCL) transformadas con EBV que no se dividen como células alimentadoras. El LCL puede irradiarse con rayos gamma en el intervalo de aproximadamente 6000 a 10.000 rads. Las células alimentadoras de LCL en algunos aspectos se divulgan en cualquier cantidad adecuada, como una proporción de células alimentadoras de LCL a linfocitos T iniciales de por lo menos aproximadamente 10:1.
En casos, las células T específicas de antígeno, como las células T CD4+ y/o CD8+ específicas de antígeno, se obtienen estimulando linfocitos T vírgenes o específicos de antígeno con antígeno. Por ejemplo, pueden generarse líneas o clones de células T específicas de antígeno para antígenos de citomegalovirus aislando células T de sujetos infectados y estimulando las células in vitro con el mismo antígeno.
II. Composiciones, métodos y usos
A. Composiciones y formulaciones farmacéuticas
También se divulgan composiciones que incluyen polinucleótidos, casetes, vectores, partículas virales y/o células en las que se han introducido tales polinucleótidos o que los contienen de otra manera. En algunos casos, se divulgan composiciones farmacéuticas que contienen células que han sido modificadas para expresar una proteína recombinante mediante métodos de transducción que emplean cualquiera de los vectores divulgados o partículas virales que los contienen. Entre las composiciones se encuentran las composiciones para administración, que incluyen composiciones y formulaciones farmacéuticas, como composiciones en forma de dosis unitaria que incluyen el número de células para la administración en una dosis dada o fracción de la misma. Las composiciones y formulaciones farmacéuticas generalmente incluyen uno o más portadores o excipientes opcionales farmacéuticamente aceptables. En algunos casos, la composición incluye por lo menos un agente terapéutico adicional.
El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en una forma tal que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en el mismo sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se le administrará la formulación.
Un "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, que no es un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un portador farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizador o conservante.
En algunos aspectos, la elección del portador está determinada en parte por la célula y/o por el método de administración particulares. Por consiguiente, hay una variedad de formulaciones adecuadas. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede contener conservantes. Los conservantes adecuados pueden incluir, por ejemplo, metilparabeno, propilparabeno, benzoato de sodio y cloruro de benzalconio. En algunos aspectos, se usa una mezcla de dos o más conservantes. El conservante o mezclas de los mismos están típicamente presentes en una cantidad de aproximadamente el 0,0001% a aproximadamente el 2% en peso de la composición total. Los portadores se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980). Los portadores farmacéuticamente aceptables generalmente no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen, pero no se limitan a: tampones como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; alcohol fenólico, butílico o bencílico; alquil parabenos como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes como EDTA; azúcares como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o surfactantes no iónicos como polietilenglicol (PEG).
En algunos aspectos en las composiciones se incluyen agentes tamponadores. Los agentes tamponadores adecuados incluyen, por ejemplo, ácido cítrico, citrato de sodio, ácido fosfórico, fosfato de potasio y varios otros ácidos y sales. En algunos aspectos, se usa una mezcla de dos o más agentes tamponadores. El agente tamponador o mezclas de los mismos están típicamente presentes en una cantidad de aproximadamente el 0,001% a aproximadamente el 4% en peso de la composición total. Se conocen métodos para preparar composiciones farmacéuticas administrables. Los métodos ejemplares se describen con más detalle en, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21a ed. (1 de mayo de 2005).
Las formulaciones pueden incluir soluciones acuosas. La formulación o composición también puede contener más de un ingrediente activo útil para la indicación, enfermedad o afección particular que se está tratando con las células, preferiblemente aquellas con actividades complementarias a las células, donde las actividades respectivas no se afectan adversamente entre sí. Tales ingredientes activos están adecuadamente presentes en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito pretendido. Por tanto, en algunos casos, la composición farmacéutica incluye además otros agentes o fármacos farmacéuticamente activos, como agentes quimioterapéuticos, por ejemplo, asparaginasa, busulfán, carboplatino, cisplatino, daunorrubicina, doxorrubicina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato, paclitaxel, rituximab, vinblastina y/o vincristina.
En algunos casos la composición farmacéutica contiene las células en cantidades eficaces para tratar o prevenir la enfermedad o afección, como una cantidad terapéuticamente eficaz o profilácticamente eficaz. La eficacia terapéutica o profiláctica en algunos casos se monitoriza mediante la evaluación periódica de los sujetos tratados. La dosificación deseada puede administrarse mediante la administración de un solo bolo de las células, mediante múltiples administraciones de bolo de las células o mediante la administración de infusión continua de las células.
En algunos casos, la composición incluye las células en una cantidad eficaz para reducir la carga de la enfermedad o afección, y/o en una cantidad que no da como resultado CRS o CRS grave en el sujeto y/o para efectuar cualquiera de los otros resultados. de los métodos descritos en la presente.
Las células y composiciones pueden administrarse usando técnicas, formulaciones y/o dispositivos de administración estándar. La administración de las células puede ser autóloga o alogénica. Por ejemplo, las células o progenitores inmunorespondedores pueden obtenerse de un sujeto y administrarse al mismo sujeto o a un sujeto compatible diferente. Las células inmunorespondedoras derivadas de sangre periférica o su progenie (por ejemplo, derivadas in vivo, ex vivo o in vitro) pueden administrarse mediante inyección localizada, incluyendo la administración por catéter, inyección sistémica, inyección localizada, inyección intravenosa o administración parenteral. Cuando se administra una composición terapéutica (por ejemplo, una composición farmacéutica que contiene una célula inmunorespondedora modificada genéticamente), generalmente se formulará en una forma inyectable de dosificación unitaria (solución, suspensión, emulsión).
Las formulaciones incluyen aquellas para administración oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual o en supositorio. En algunos casos, las poblaciones de células se administran por vía parenteral. Las infusiones parenterales pueden incluir administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intratorácica, intracraneal y/o subcutánea. En algunos casos, una dosis dada se administra mediante la administración de un solo bolo de las células. En algunos casos, las células se administran al sujeto usando administración sistémica periférica mediante inyección intravenosa, intraperitoneal o subcutánea.
En algunos casos, se divulgan composiciones como preparaciones líquidas estériles, por ejemplo, soluciones acuosas isotónicas, suspensiones, emulsiones, dispersiones o composiciones viscosas, que en algunos aspectos pueden tamponarse a un pH seleccionado. Las preparaciones líquidas son normalmente más fáciles de preparar que los geles, otras composiciones viscosas y composiciones sólidas. Además, las composiciones líquidas son algo más cómodas de administrar, especialmente por inyección. Las composiciones viscosas, por otro lado, pueden formularse dentro del intervalo de viscosidad apropiado para proporcionar períodos de contacto más largos con tejidos específicos. Las composiciones líquidas o viscosas pueden comprender portadores, que pueden ser un medio solvente o dispersante que contenga, por ejemplo, agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido) y mezclas adecuadas de los mismos.
Pueden prepararse soluciones inyectables estériles incorporando las células en un solvente, como en una mezcla con un portador, diluyente o excipiente adecuado como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa, dextrosa o similares. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares como agentes humectantes, dispersantes o emulsionantes (por ejemplo, metilcelulosa), agentes tamponadores del pH, aditivos gelificantes o potenciadores de la viscosidad, conservantes, agentes aromatizantes y/o colores, dependiendo de la vía de administración y la preparación deseada. En algunos aspectos, pueden consultarse los textos estándar para preparar las preparaciones adecuadas.
Pueden añadirse varios aditivos que mejoran la estabilidad y esterilidad de las composiciones, incluyendo conservantes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y tampones. La prevención de la acción de los microorganismos puede garantizarse mediante varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol y ácido sórbico. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede conseguirse mediante el uso de agentes que retrasen la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las formulaciones que se usarán para la administración in vivo son generalmente estériles. La esterilidad puede lograrse fácilmente, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.
B. Métodos y usos terapéuticos y profilácticos
Se divulgan métodos para tratar una enfermedad o afección en un sujeto usando los polinucleótidos divulgados, casetes, vectores, células que los contienen, proteínas y otras moléculas codificadas por los mismos, y composiciones de las mismas, como aquellas en las que la molécula recombinante o heteróloga codificada por el ácido nucleico es un receptor recombinante, como un receptor de antígeno, por ejemplo, un CAR o un TCR. En algunos casos, los métodos divulgados incluyen administrar a un sujeto que tiene una enfermedad o afección las células o poblaciones de células proporcionadas, o composiciones farmacéuticas de las mismas, que han sido diseñadas para expresar una proteína recombinante mediante métodos de transducción que emplean cualquiera de los vectores divulgados o partículas virales que contienen los mismos. También se divulgan usos y composiciones para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección en un sujeto que emplea las células o poblaciones de células divulgadas, o composiciones de las mismas, modificadas para contener un receptor recombinante, como un receptor de antígeno, por ejemplo, un CAR o un TCR.
En algunos casos, la enfermedad o afección tratada o prevenida es un cáncer, un trastorno autoinmune y/o una enfermedad infecciosa, como una enfermedad viral, y/o es una o más de otras enfermedades, afecciones y/o trastornos.
En algunos casos, las células, composiciones y/o polinucleótidos, por ejemplo, vectores, se administran a un sujeto o paciente que tiene la enfermedad o afección particular que se va a tratar, por ejemplo, mediante terapia celular adoptiva, como terapia de células T adoptiva. En algunos casos, las células y composiciones preparadas mediante los métodos divulgados, como composiciones modificadas y composiciones de final de producción después de la incubación y/u otros pasos de procesamiento, se administran a un sujeto, como un sujeto que tiene o está en riesgo de padecer la enfermedad o afección. En algunos aspectos, los métodos de este modo tratan, por ejemplo, mejoran uno o más síntomas de la enfermedad o afección, como disminuyendo la carga tumoral en un cáncer que expresa un antígeno reconocido por una célula T modificada.
En los métodos o usos divulgados, la proteína recombinante o heteróloga puede comprender un receptor recombinante, como un receptor de antígeno, por ejemplo, un CAR o un TCR, que se une específicamente a un ligando expresado por la enfermedad o afección o una célula o tejido de la misma. Por ejemplo, en algunos casos, el receptor es un receptor de antígeno y el ligando es un antígeno específico para y/o asociado con la enfermedad o afección.
Los métodos para la administración de células para terapia celular adoptiva son conocidos y pueden usarse en relación con los métodos y composiciones divulgados. Por ejemplo, los métodos de terapia de células T adoptiva se describen, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 2003/0170238 de Gruenberg et al; la Patente de Estados Unidos N° 4.690.915 de Rosenberg; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol.
8(10):577-85). Ver, por ejemplo, Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10):928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338.
En algunos casos, la terapia celular, por ejemplo, la terapia celular adoptiva, por ejemplo, la terapia con células T adoptiva, se lleva a cabo mediante transferencia autóloga, en la que las células se aíslan y/o preparan de otro modo a partir del sujeto que va a recibir la terapia celular, o de una muestra derivada de dicho sujeto. Por tanto, en algunos aspectos, las células se derivan de un sujeto, por ejemplo, un paciente, con necesidad de un tratamiento y las células, después del aislamiento y el procesamiento, se administran al mismo sujeto.
En algunos casos, la terapia celular, por ejemplo, la terapia celular adoptiva, por ejemplo, la terapia con células T adoptiva, se lleva a cabo mediante transferencia alogénica, en la que las células se aíslan y/o preparan de otro modo de un sujeto que no es un sujeto que va a recibir o quién finalmente recibe la terapia celular, por ejemplo, un primer sujeto. En tales casos, las células se administran luego a un sujeto diferente, por ejemplo, un segundo sujeto, de la misma especie. En algunos casos, el primer y el segundo sujetos son genéticamente idénticos. En algunos casos, el primer y el segundo sujetos son genéticamente similares. En algunos casos, el segundo sujeto expresa la misma clase o supertipo de HLA que el primer sujeto.
El sujeto, por ejemplo, el paciente, al que se administran las células, poblaciones de células o composiciones es un mamífero, y típicamente es un primate, como un humano. En algunos casos, el primate es un mono o un simio. El sujeto puede ser masculino o femenino y puede tener cualquier edad adecuada, incluyendo sujetos lactantes, juveniles, adolescentes, adultos y geriátricos. En algunos casos, el sujeto es un mamífero que no es un primate, como un roedor. En algunos ejemplos, el paciente o sujeto es un modelo animal validado para enfermedad, terapia celular adoptiva y/o para evaluar resultados tóxicos como el síndrome de liberación de citoquinas (CRS).
Entre las enfermedades, afecciones y trastornos se encuentran los tumores, incluyendo los tumores sólidos, las enfermedades hematológicas y los melanomas, y las enfermedades infecciosas, como la infección por un virus u otro patógeno, por ejemplo, VIH, VHC, VHB, VPH, CMV y enfermedades parasitarias. En algunos casos, la enfermedad o afección es un tumor, cáncer, malignidad, neoplasia u otra enfermedad proliferativa. Dichas enfermedades incluyen, pero no se limitan a, leucemia, linfoma, por ejemplo, leucemia linfocítica crónica (CLL), ALL, linfoma no Hodgkin, leucemia mieloide aguda, mieloma múltiple, linfoma folicular refractario, linfoma de células del manto, linfoma de células B indolente, enfermedades malignas de células B, cánceres de colon, pulmón, hígado, mama, próstata, ovario, piel (incluyendo melanoma), cáncer de huesos y cerebro, cáncer de ovario, cánceres epiteliales, carcinoma de células renales, adenocarcinoma pancreático, linfoma de Hodgkin, carcinoma de cuello uterino, cáncer colorrectal, glioblastoma, neuroblastoma, sarcoma de Ewing, meduloblastoma, osteosarcoma, sarcoma sinovial, y/o mesotelioma.
En algunos casos, la enfermedad o afección es una enfermedad o afección infecciosa, como, pero no limitado a, infecciones víricas, retrovirales, bacterianas y protozoarias, inmunodeficiencia, citomegalovirus (CMV), virus de Epstein-Barr (EBV), adenovirus, poliomavirus Bk . En algunos casos, la enfermedad o afección es una enfermedad o afección autoinmune o inflamatoria, como artritis, por ejemplo, artritis reumatoide (AR), diabetes de tipo I, lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis, esclerodermia, enfermedad de tiroides autoinmune, enfermedad de Grave, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple, asma y/o una enfermedad o afección asociada con el trasplante.
En algunos casos, el antígeno asociado con la enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste de receptor de tirosina quinasa huérfano ROR1, tEGFR, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, mesotelina, CEA y antígeno de superficie de la hepatitis B, receptor de anti-folato, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, 0EPHa2, ErbB2, 3 o 4, FBP, receptor fetal de acetilcolina e, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-alfa, IL-13R-alfa2, kdr, cadena ligera kappa, Lewis Y, molécula de adhesión de células L1, MAGE-A1, mesotelina, MUC1, MUC16, PSCA, ligandos NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, antígeno oncofetal, ROR1, TAG72, VEGF-R2, antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno específico de la próstata, PSMA, Her2/neu, receptor de estrógeno, receptor de progesterona, efrinaB2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, y MAGE A3, CE7, tumor de Wilms 1 (WT-1), una ciclina, como ciclina A1 (CCNA1), y/o moléculas biotiniladas y/o moléculas expresadas por VIH, VHC, VHB u otros patógenos.
Como se usa en la presente, un "elemento regulador postranscripcional (PRE)", como un PRE de hepatitis, se refiere a una secuencia de ADN que, cuando se transcribe crea una estructura terciaria capaz de mostrar actividad postranscripcional para potenciar o promover la expresión de un gen asociado enlazado operativamente al mismo.
Como se usa en la presente, "actividad postranscripcional" se refiere a la actividad de un elemento regulador para controlar o regular la expresión génica a nivel de ARN. La actividad postranscripcional puede manifestarse por la actividad que promueve la exportación de ARN desde el núcleo, proporciona sitios de unión para proteínas celulares, aumenta la cantidad total de ARN, por ejemplo, ARN recombinante y/o heterólogo, transcripciones, aumenta la estabilidad del ARN, aumenta el número de transcripciones poli-adeniladas y/o aumenta el tamaño de las colas poli-adeniladas en dichas transcripciones.
Como se usa en la presente, "enlazado operativamente" se refiere a la asociación de componentes, como una secuencia de ADN, por ejemplo, un ácido nucleico heterólogo y una secuencia o secuencias reguladoras, de tal manera que permitan la expresión génica cuando las moléculas apropiadas (por ejemplo, proteínas activadoras transcripcionales) se unen a la secuencia reguladora. Por lo tanto, significa que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera prevista.
Como se usa en la presente, "no modificado" con referencia a un PRE, un gen X o una secuencia Flap se refiere a un polinucleótido de partida que se selecciona para la modificación como se divulga. El polinucleótido de partida puede ser una forma de tipo salvaje de origen natural de un polinucleótido. En algunos casos, el polinucleótido de partida puede alterarse o mutarse, de tal manera que difiera de una forma nativa de tipo salvaje pero, no obstante, se denomina polinucleótido de partida no modificado con respecto a los polinucleótidos modificados posteriormente como se divulga. Un polinucleótido no modificado no contiene una modificación divulgada (por ejemplo, codón de terminación, secuencia de degradación o deleción de todo o una parte de un cPPT o CTS según se divulga) en su secuencia. En algunos casos, el ácido nucleico no modificado, por ejemplo, PRE, es uno que se sabe que posee o muestra un grado deseado de funcionalidad o actividad, como un PRE con un grado conocido de actividad postranscripcional, por ejemplo, capacidad para potenciar la expresión génica. Ejemplos de secuencias PRE no modificadas son las que se exponen en las SEQ ID NO: 1, 12-27, 119, 120, 125 o 216. Un ejemplo de una secuencia Flap no modificada se expone en la SEQ ID NO: 121.
Como se usa en la presente, "tipo salvaje" con referencia a un PRE o un gen X se refiere a una secuencia derivada de una secuencia de ácidos nucleicos de origen natural de un PRE o un gen X que está presente como tal en un virus o genoma de virus, como un hepadnavirus, por ejemplo, un ortohepandanvirus, como un hepadnavirus aislado de un mamífero, en la naturaleza. La referencia a tipo salvaje sin referencia a una especie se pretende que abarque una secuencia de virus que incluye un gen X aislado de cualquier especie. Un ejemplo de un gen de PRE o X de tipo salvaje es cualquiera que tenga una secuencia de ácidos nucleicos obtenida de o que tenga una secuencia que sea la misma que una secuencia génica de PRE o X presente en un hepadnavirus, incluyendo cualquier hepadnavirus encontrado o aislado de una especie de mamífero, como un humano, un primate o una ardilla, por ejemplo una marmota. Los ejemplos de PRE de tipo salvaje son los expuestos en las SEQ Id NO: 1, 12-27 o 125.
Como se usa en la presente, "tipo salvaje" con referencia a una secuencia Flap se refiere a una secuencia derivada de una secuencia de ácidos nucleicos viral de origen natural que contiene regiones cPPT y CTS para formar un Flap de ADN presente como tal en un virus o genoma de virus, como un retrovirus, por ejemplo, un lentivirus, como el VIH-1. Un ejemplo de una secuencia Flap de tipo salvaje es cualquiera que tenga una secuencia de ácidos nucleicos obtenida de o que tenga una secuencia que sea la misma que una secuencia de ácidos nucleicos viral que contenga regiones cPPT y CTS presentes en un retrovirus, incluyendo un lentivirus (por ejemplo, VIH-1). En la SEQ ID NO: 121 se expone un ejemplo de ácido nucleico viral que contiene una secuencia Flap de ADN de tipo salvaje.
Como se usa en la presente, "porcentaje (%) de identidad de secuencia" y "porcentaje de identidad" cuando se usa con respecto a una secuencia de nucleótidos (secuencia de nucleótidos de referencia) se define como el porcentaje de residuos de nucleótidos en una secuencia candidata (por ejemplo, el PRE o gen X sujeto, como un PRE modificado o gen X variante) que son idénticos a los residuos de nucleótidos en la secuencia de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia. La alineación con el propósito de determinar el porcentaje de identidad de secuencia puede lograrse de varias maneras que están dentro de la experiencia en la técnica, por ejemplo, usando software de ordenador disponible públicamente como software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se están comparando. Como se usa en la presente, "en una posición correspondiente a" o enumeración de que nucleótidos, posiciones de aminoácidos o regiones "corresponden a" nucleótidos, posiciones de aminoácidos o regiones en una secuencia divulgada, como se establece en el listado de secuencias, se refiere a posiciones de nucleótidos o aminoácidos o una región o dominio que contiene nucleótidos o aminoácidos identificados tras la alineación con la secuencia divulgada para maximizar la identidad usando un algoritmo de alineación estándar, como el algoritmo GAP. Los residuos o regiones correspondientes descritos ejemplares pueden identificarse mediante la alineación de una secuencia con una secuencia de PRE ejemplar expuesta en la SEQ ID NO: 1 (o la SEQ ID NO: 125, que son los residuos 1-589 de la SEQ ID NO: 1). Al alinear las secuencias, un experto en la técnica puede identificar los residuos correspondientes, por ejemplo, usando residuos de aminoácidos conservados e idénticos como guías. En general, para identificar las posiciones correspondientes, las secuencias de aminoácidos se alinean de tal manera que se obtenga la coincidencia de orden más alto (ver, por ejemplo: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073). La Figura 2A a 2E ejemplifica alineaciones ejemplares e identificación de residuos correspondientes ejemplares.
El término "vector", como se usa en la presente, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de propagar otro ácido nucleico al que está enlazado. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. Ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de ácidos nucleicos a los que están enlazados operativamente. Atales vectores se hace referencia en la presente como "vectores de expresión". Entre los vectores se encuentran los vectores virales, como los vectores lentivirales.
Los términos "célula huésped", "línea células huésped" y "cultivo de células huésped" se usan indistintamente y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la progenie de tales células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas", que incluyen la célula transformada primaria y la progenie derivada de la misma sin tener en cuenta el número de pases. Es posible que la progenie no sea completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula original, pero puede contener mutaciones. En la presente se incluye la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada o seleccionada en la célula originalmente transformada.
Como se usa en la presente, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, "un" o "uno" significa "por lo menos uno" o "uno o más". Se entiende que los aspectos y variaciones descritos en la presente incluyen aspectos y variaciones "que consisten" y/o "que consisten esencialmente de".
A lo largo de esta divulgación, varios aspectos de la materia reivindicado se presentan en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es meramente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de la materia reivindicada. Por consiguiente, debe considerarse que la descripción de un intervalo ha divulgado específicamente todos los posibles subintervalos, así como valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, cuando se divulga un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor establecido o intermedio en ese intervalo establecido está incluido dentro de la materia reivindicada. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños, y también se incluyen dentro de la materia reivindicada, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen uno o ambos de los límites incluidos también se incluyen en la materia reivindicada. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.
El término "aproximadamente" como se usa en la presente se refiere al intervalo de error habitual para el valor respectivo fácilmente conocido por el experto en este campo técnico. La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en la presente incluye (y describe) casos que están dirigidos a ese valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción que hace referencia a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X".
Como se usa en la presente, una composición se refiere a cualquier mezcla de dos o más productos, sustancias o compuestos, incluyendo las células. Puede ser una solución, una suspensión, líquido, polvo, pasta, acuoso, no acuoso o cualquier combinación de los mismos.
Como se usa en la presente, un "sujeto" es un mamífero, como un humano u otro animal, y típicamente es un humano.
A menos que se defina de otro modo, se pretende que todos los términos de la técnica, notaciones y otros términos o terminología técnicos y científicos usados en la presente tengan el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece la materia reivindicada. En algunos casos, los términos con significados comúnmente entendidos se definen en la presente para mayor claridad y/o para una fácil referencia, y la inclusión de tales definiciones en la presente no debe interpretarse necesariamente como una diferencia sustancial sobre lo que se entiende generalmente en la técnica.
El título de la sección que se usa en la presente es solo con propósitos organizativos y no debe interpretarse como una limitación de la materia descrita.
MI. Casos ejemplares
Entre los casos divulgados en la presente se encuentran:
1. Un polinucleótido, que comprende:
un ácido nucleico que codifica una proteína recombinante;
un elemento regulador postranscripcional (PRE) modificado enlazado operativamente a dicho ácido nucleico, dicho PRE modificado comprendiendo una variante de un gen X del virus de la hepatitis de tipo salvaje o no modificado, dicho gen X variante comprendiendo un codón de terminación no presente en el gen X de tipo salvaje o no modificado.
2. El polinucleótido del caso 1, en el que el codón de terminación comprende por lo menos un codón de terminación seleccionado entre:
un codón de terminación que comienza en una posición dentro de 36 o 24 nucleótidos en la dirección 3' desde una posición en el gen X variante correspondiente a la posición 5' de un codón de inicio del marco de lectura abierto de la proteína X de tipo salvaje; y/o
un codón de terminación que comienza en una posición dentro de 36 o 24 nucleótidos en la dirección 3' desde una posición correspondiente al residuo 411 de la secuencia del elemento regulador postranscripcional de WHV (WPRE) expuesta en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125 y/o el residuo 1503 de la secuencia de WHV expuesta como la SEQ ID NO: 2.
3. El polinucleótido del caso 1 o del caso 2, en el que dicho gen X variante no comprende un marco de lectura abierto de más de o aproximadamente 39 nucleótidos de longitud o más de o aproximadamente 27 nucleótidos de longitud.
4. Un polinucleótido, que comprende un elemento regulador postranscripcional (PRE) modificado, dicho PRE modificado comprendiendo una variante de un gen X del virus de la hepatitis de tipo salvaje o no modificado, dicho gen X variante comprendiendo un codón de terminación no presente en el gen X de tipo salvaje o no modificado, en donde el codón de terminación comprende por lo menos un codón de terminación seleccionado entre:
un codón de terminación que comienza en una posición dentro de 32 o 30 nucleótidos en la dirección 3' desde una posición en el gen X variante correspondiente a la posición 5' de un codón de inicio del marco de lectura abierto de la proteína X de tipo salvaje; y/o
un codón de terminación que comienza en una posición dentro de 32 o 30 nucleótidos en la dirección 3' desde una posición en el gen X variante correspondiente al residuo 411 de la secuencia del elemento regulador postranscripcional de WHV (WPRE) expuesta en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125 y/o el residuo 1503 de la secuencia WHV expuesta como la SEQ ID NO: 2.
5. El polinucleótido del caso 4, en donde dicho gen X variante comprende un marco de lectura abierto de menos de o igual a 33 nucleótidos de longitud.
6. El polinucleótido de cualquiera de los casos 1-5, en el que dicho codón de terminación comprende una pluralidad de codones de terminación.
7. El polinucleótido del caso 6, en el que dicha pluralidad de codones de terminación comprende por lo menos un codón de terminación en cada marco de lectura presente en dicho gen X variante y/o comprende por lo menos dos codones de terminación en el mismo marco de lectura.
8. Un polinucleótido, que comprende un elemento regulador postranscripcional (PRE) modificado, dicho PRE modificado comprendiendo un gen X variante del virus de la hepatitis de tipo salvaje o no modificado, dicho gen X variante comprendiendo una pluralidad de codones de terminación no presentes en el gen X de tipo salvaje o no modificado.
9. El polinucleótido del caso 8, en el que la pluralidad de codones de terminación comprende por lo menos un codón de terminación seleccionado entre:
un codón de terminación que comienza en una posición dentro de 36, 30 o 24 nucleótidos en la dirección 3' desde una posición en el gen X variante correspondiente a la posición 5' de un codón de inicio del marco de lectura abierto de la proteína X de tipo salvaje; y/o
un codón de terminación que comienza en una posición dentro de 36, 30 o 24 nucleótidos en la dirección 3' desde una posición en el gen X variante correspondiente al residuo 411 de la secuencia del elemento regulador postranscripcional de WHV (WPRE) expuesta en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125 y/o residuo 1503 de la secuencia de WHV expuesta como la SeQ ID NO: 2.
10. El polinucleótido del caso 9, en el que dicho gen X variante no comprende un marco de lectura abierto de más de o aproximadamente 39 nucleótidos de longitud, más de o aproximadamente 33 nucleótidos de longitud o más de o aproximadamente 27 nucleótidos de longitud.
11. El polinucleótido de cualquiera de los casos 8-10, en el que el gen X variante comprende por lo menos 2 codones de terminación, por lo menos 3 codones de terminación o por lo menos 4 codones de terminación. 12. El polinucleótido de cualquiera de los casos 8-11, en el que el gen X variante comprende un codón de terminación en cada marco de lectura presente en dicho gen X variante.
13. El polinucleótido de cualquiera de los casos 4-12, que comprende además un ácido nucleico que codifica una proteína recombinante enlazada operativamente al PRE modificado.
14. El polinucleótido de cualquiera de los casos 1-13, en el que el codón de terminación comprende por lo menos un codón de terminación seleccionado entre:
un codón de terminación que comienza en una posición dentro o dentro de por lo menos 9, 12, 15 o 18 nucleótidos en la dirección 3' desde una posición en el gen X variante correspondiente a la posición 5' de un codón de inicio del marco de lectura abierto de proteína X de tipo salvaje o no modificada; y/o
un codón de terminación que comienza en una posición dentro o dentro de por lo menos 9, 12, 15 o 18 nucleótidos en la dirección 3' desde una posición en el gen X variante correspondiente al residuo 411 de la secuencia del elemento regulador postranscripcional de WHV (WPRE) expuesta en la SEQ ID NO: 1 y/o el residuo 1503 de la secuencia de WHV expuesta como la SEQ ID NO: 2.
15. El polinucleótido del caso 14, en el que dicho gen X variante no comprende un marco de lectura abierto de más de o aproximadamente 21 nucleótidos de longitud, de más de o aproximadamente 18 nucleótidos de longitud, de más de o aproximadamente 15 nucleótidos de longitud, o de más de o aproximadamente 12 nucleótidos de longitud.
16. El polinucleótido de cualquiera de los casos 1-15, en el que:
el PRE modificado contiene una horquilla beta correspondiente a los residuos de nucleótidos 448-470 de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125; y/o
el PRE modificado no contiene un cambio de nucleótidos en una posición dentro de la horquilla beta correspondiente a los nucleótidos 448-470 de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125; y/o
dicho codón de terminación o codones de terminación no comprenden un nucleótido en una posición dentro de la horquilla beta correspondiente a los nucleótidos 448-470 de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125. 17. El polinucleótido de cualquiera de los casos 1-16, en el que dicho codón de terminación se selecciona de un codón de terminación ámbar (TAG), ocre (TAA) u ópalo (TGA).
18. El polinucleótido de cualquiera de los casos 1-17, en el que dicho codón de terminación se introduce mediante sustitución, deleción o inserción de nucleótidos.
19. El polinucleótido de cualquiera de los casos 1-18, en el que dicho codón de terminación se selecciona entre: un codón de terminación que comienza en la posición 9 en la dirección 3' desde una posición en el gen X variante correspondiente a la posición 5' de un codón de inicio del marco de lectura abierto de la proteína X de tipo salvaje o no modificada y/o en una posición de nucleótidos correspondiente a la posición 420 en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125;
un codón de terminación que comienza en la posición 13 en la dirección 3' desde una posición en el gen X variante correspondiente a la posición 5' de un codón de inicio del marco de lectura abierto de la proteína X de tipo salvaje o no modificada y/o en una posición de nucleótidos correspondiente a la posición 424 en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125;
un codón de terminación que comienza en la posición 17 en la dirección 3' desde una posición en el gen X variante correspondiente a la posición 5' de un codón de inicio del marco de lectura abierto de la proteína X de tipo salvaje o no modificada y/o en una posición de nucleótidos correspondiente a la posición 428 en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125;
un codón de terminación que comienza en la posición 21 en la dirección 3' desde una posición en el gen X variante correspondiente a la posición 5' de un codón de inicio del marco de lectura abierto de la proteína X de tipo salvaje o no modificada y/o en una posición de nucleótidos correspondiente a la posición 432 en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125.
20. El polinucleótido de cualquiera de los casos 17-19, en el que dicho codón de terminación es un codón de terminación ámbar (TAG) u ópalo (TGA).
21. El polinucleótido de cualquiera de los casos 1-20, en el que:
dicho gen X variante no tiene más de 180 nucleótidos de longitud o no tiene más de o aproximadamente 210 nucleótidos de longitud; y/o
dicho gen X variante tiene una longitud de por lo menos o aproximadamente 90 nucleótidos o una longitud de por lo menos aproximadamente 120 nucleótidos o tiene una longitud de por lo menos o aproximadamente 180 nucleótidos.
22. El polinucleótido de cualquiera de los casos 1-21, en el que:
dicho gen X variante es una variante de un gen X de la hepatitis de mamífero de tipo salvaje o no modificado o una porción truncada del mismo, que es, opcionalmente, una porción truncada presente en un PRE; o el PRE modificado comprende un gen X variante que comprende la SEQ ID NO: 28.
23. El polinucleótido del caso 22, en el que dicho gen X de la hepatitis de mamífero de tipo salvaje o no modificado es un gen X del virus de la hepatitis de la marmota de tipo salvaje (WHV) o una porción truncada del mismo, que es opcionalmente, una porción truncada presente en un PRE de tipo salvaje o no modificado.
24. El polinucleótido del caso 23, en el que el gen X de WHV de tipo salvaje o no modificado o la porción truncada de un gen X de tipo salvaje presente en un PRE comprende la secuencia de nucleótidos expuesta como los nucleótidos 411-592 de cualquiera de las SEQ ID NO: 1 y 12-20 o expuesta como los nucleótidos 411­ 589 de la SEQ ID NO: 125.
25. El polinucleótido del caso 23 o el caso 24, en el que dicho gen X de WHV de tipo salvaje comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 9 o es una porción truncada de la misma, que se expone, opcionalmente, en la SEQ ID NO: 10 o es una porción truncada presente en un PRE de tipo salvaje o no modificado.
26. El polinucleótido de cualquiera de los casos 1-25, en el que dicho PRE modificado comprende por lo menos dos o por lo menos tres subelementos reguladores postranscripcionales que actúan en cis de un PRE del virus de la hepatitis de tipo salvaje o no modificado o variante funcional del mismo.
27. El polinucleótido del caso 26, en el que dichos por lo menos dos o por lo menos tres subelementos comprenden un subelemento alfa de PRE de tipo salvaje o no modificado o una variante funcional del mismo, una variante funcional de un subelemento beta de PRE de tipo salvaje o no modificado, y/o un subelemento gamma de PRE de tipo salvaje o no modificado o una variante funcional del mismo.
28. El polinucleótido de cualquiera de los casos 1-27, en el que dicho PRE modificado comprende un subelemento alfa de un PRE de virus de la hepatitis de tipo salvaje o no modificado o una variante funcional del mismo y una variante funcional de un subelemento beta de PRE de tipo salvaje o no modificado.
29. El polinucleótido del caso 27 o el caso 28, en el que dicho subelemento alfa comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 3 o una variante de la misma, dicho subelemento beta comprende una variante de la secuencia de la SEQ ID NO: 6, y/o dicha subunidad gamma comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 8 o una variante de la misma.
30. El polinucleótido de cualquiera de los casos 1-29, en el que el PRE modificado comprende modificaciones de nucleótidos en comparación con un PRE de virus de la hepatitis de tipo salvaje o no modificado que es un PRE de hepatitis de mamífero de tipo salvaje.
31. El polinucleótido del caso 30, en el que dicho PRE del virus de la hepatitis de mamífero de tipo salvaje o no modificado comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NOS: 1, 12-27 y 125.
32. El polinucleótido del caso 30 o el caso 31, en el que dicho PRE de hepatitis de mamífero de tipo salvaje o no modificado es un PRE de virus de hepatitis de marmota (WPRE) de tipo salvaje.
33. El polinucleótido de cualquiera de los casos 1-32, en el que el PRE de hepatitis de tipo salvaje o no modificado comprende:
a) la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125 o una secuencia de nucleótidos que muestra por lo menos un 94% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125, que muestra sustancialmente la misma, como por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de la actividad postranscripcional de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125; y
b) un PRE modificado que comprende una porción de la secuencia de nucleótidos de a), en el que la porción muestra o conserva la actividad postranscripcional.
34. El polinucleótido del caso 33, en el que el PRE de hepatitis de tipo salvaje o no modificado comprende una secuencia de nucleótidos que muestra por lo menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125.
35. El polinucleótido de cualquiera de los casos 1-34, en el que dicho PRE de hepatitis de tipo salvaje o no modificado comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 12-20 y 125.
36. El polinucleótido de cualquiera de los casos 1-35, en el que dicho PRE de hepatitis de tipo salvaje o no modificado comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125.
37. El polinucleótido de cualquiera de los casos 1-36, en el que dicho gen X variante comprende un codón de inicio que comienza en una posición correspondiente a la posición 411 de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125.
38. El polinucleótido del caso 37, en el que dicho codón de inicio es un codón de inicio ATG.
39. El polinucleótido de cualquiera de los casos 1-38, en el que el gen X variante comprende además un promotor enlazado operativamente a dicho gen X variante.
40. El polinucleótido del caso 39, en el que dicho promotor es un promotor del gen X de tipo salvaje o no modificado que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 11 o una secuencia promotora del gen X de WHV de tipo salvaje.
41. El polinucleótido de cualquiera de los casos 1-40, en el que el PRE modificado se selecciona entre:
a) un PRE modificado que comprende una secuencia de nucleótidos que muestra por lo menos un 65% de identidad de secuencia con la s Eq ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125, dicho PRE modificado conteniendo un gen X variante que comprende por lo menos un codón de terminación no presente en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125; y
b) un PRE modificado que comprende una porción de la secuencia de nucleótidos de a), dicha porción comprendiendo un gen X variante que comprende por lo menos un codón de terminación, en el que la porción muestra actividad postranscripcional.
42. El polinucleótido del caso 41, en el que el PRE modificado comprende una secuencia de nucleótidos que muestra por lo menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125.
43. El polinucleótido del caso 41 o el caso 42, en el que el gen X variante comprende por lo menos 2 codones de terminación, por lo menos 3 codones de terminación o por lo menos 4 codones de terminación.
44. El polinucleótido de cualquiera de los casos 41-43, en el que el gen X variante comprende un codón de terminación en cada marco de lectura presente en dicho gen X variante.
45. El polinucleótido de cualquiera de los casos 1-44, en el que el gen X variante comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 44-58 o las SEQ ID NO: 141-155 y/o el PRE modificado comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 29-43 o las SEQ ID NO: 126­ 140.
46. El polinucleótido de cualquiera de los casos 1-45, en el que el PRE modificado no contiene ninguna modificación además del por lo menos un codón de terminación no presente en el PRE de tipo salvaje o no modificado.
47. El polinucleótido de cualquiera de los casos 1-46, en el que el PRE modificado contiene modificaciones adicionales además del por lo menos un codón de terminación no presente en el PRE de tipo salvaje o no modificado.
48. El polinucleótido de cualquiera de los casos 1-47, en el que dicho gen X variante comprende además una variante de un codón de inicio que comprende una o más diferencias de nucleótidos en comparación con un codón de inicio del gen X del virus de la hepatitis de tipo salvaje o no modificado y/o en comparación con el codón de inicio correspondiente a las posiciones de nucleótidos 411-413 de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125.
49. El polinucleótido del caso 48, en el que dicha una o más diferencias dan como resultado el inicio de la traducción restringida o impedida a partir de dicho codón de inicio.
50. El polinucleótido de cualquiera de los casos 47-49, en el que dicho gen X variante comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 74-88 o 171-185 y/o el PRE modificado comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 59-73 o 156-170.
51. El polinucleótido de cualquiera de los casos 1-50, en el que dicho gen X variante comprende un promotor variante enlazado operativamente a dicho gen X variante, dicho promotor variante comprendiendo una o más diferencias de nucleótidos en comparación con un promotor del gen X del virus de la hepatitis de tipo salvaje o no modificado y/o comparado con un promotor de la SEQ ID NO: 11.
52. El polinucleótido del caso 51, en el que dicha una o más diferencias dan como resultado una transcripción restringida o una prevención de la transcripción de dicho promotor.
53. El polinucleótido del caso 51 o 52, en el que dicho PRE modificado comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 89-118 o 186-215.
54. El polinucleótido de cualquiera de los casos 1-53, en el que
tras la introducción en una célula eucariota, no se produce ningún polipéptido de una longitud mayor de 12, 11, 10, 9 u 8 aminoácidos codificados por dicho gen X variante; y/o
dicho polinucleótido es incapaz de producir un polipéptido de una longitud mayor de 12, 11, 10, 9 u 8 aminoácidos de longitud codificados por dicho gen X variante.
55. El polinucleótido de cualquiera de los casos 1-54, en el que dicho PRE modificado codifica un ARN que promueve la exportación de ARN nuclear y/o aumenta la estabilidad del ARNm.
56. El polinucleótido de cualquiera de los casos 1-55, en el que dicho PRE modificado codifica un polinucleótido de ARN que promueve la exportación de ARN nuclear y/o aumenta la estabilidad del ARN, en el que dicha promoción de la exportación de ARN nuclear y/o la estabilidad del ARNm aumenta la expresión de la proteína recombinante.
57. El polinucleótido de cualquiera de los casos 1-56, en el que el PRE modificado conserva la actividad postranscripcional del PRE de la hepatitis de tipo salvaje o no modificado correspondiente y/o el PRE expuesto en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 125 y/o SEQ ID NO: 216, que, en algunos casos, es por lo menos o aproximadamente por lo menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de la actividad postranscripcional del PRE de la hepatitis de tipo salvaje o no modificado y/o el PRE expuesto en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 125 o SEQ ID NO: 216.
58. El polinucleótido de cualquiera de los casos 1-57, en el que el gen X variante comprende además una secuencia que codifica una señal de modificación postraduccional no presente en el gen X del virus de la hepatitis de tipo salvaje o no modificado.
59. Un polinucleótido, que comprende un elemento regulador postranscripcional (PRE) modificado, dicho PRE modificado comprendiendo una variante de un gen X del virus de la hepatitis de tipo salvaje o no modificado, dicho gen X variante comprendiendo una secuencia que codifica una señal de modificación postraduccional no presente en el gen X del virus de la hepatitis de tipo salvaje o no modificado.
60. El polinucleótido del caso 58 o el caso 59, en el que dicha señal de modificación postraduccional comprende un sitio de ubiquitinación.
61. El polinucleótido del caso 58 o el caso 59, en el que dicha señal de modificación postraduccional comprende: un primer codón que comienza en una posición dentro o dentro de por lo menos 2, 3, 4, 5 o 6 nucleótidos en la dirección 3' desde una posición en el gen X variante correspondiente a la posición 5' de un codón de inicio del marco de lectura abierto de la proteína X, en donde el primer codón codifica un residuo de glicina, arginina, ácido glutámico, fenilalanina, aspartato, cisteína, lisina, asparagina, serina, tirosina, triptófano, histidina o leucina de acuerdo con la regla del extremo N; y opcionalmente
un segundo codón que comienza en una posición dentro o dentro de por lo menos 2, 3, 4, 5 o 6 nucleótidos en la dirección 3' desde una posición en el gen X variante correspondiente a la posición 5' de un codón de inicio del marco de lectura abierto de la proteína X, en donde el segundo codón codifica un residuo de ácido glutámico o asparagina de acuerdo con la regla del extremo N.
62. El polinucleótido del caso 58 o el caso 59, en el que dicha señal de modificación postraduccional comprende una o más secuencias PEST.
63. El polinucleótido de cualquiera de los casos 59-62, que comprende además un ácido nucleico que codifica una proteína recombinante enlazada operativamente al p Re modificado.
64. El polinucleótido de cualquiera de los casos 59-63, en el que:
dicho gen X variante que comprende una secuencia que codifica una señal de modificación postraduccional contiene una horquilla beta correspondiente a los residuos de nucleótidos 448-470 de la SEQ ID NO: 1; y/o dicho gen X variante que comprende una secuencia que codifica una señal de modificación postraduccional no contiene un cambio de nucleótidos en una posición dentro de la horquilla beta correspondiente a los nucleótidos 448-470 de la SEQ ID NO: 1.
65. El polinucleótido de cualquiera de los casos 59-64, en el que:
dicho gen X variante no tiene más de 180 nucleótidos de longitud o no tiene más de o aproximadamente 210 nucleótidos de longitud; y/o
dicho gen X variante tiene una longitud de por lo menos o aproximadamente 90 nucleótidos o una longitud de por lo menos 120 nucleótidos o tiene una longitud de por lo menos o aproximadamente 180 nucleótidos. 66. El polinucleótido de cualquiera de los casos 59-65, en el que dicho gen X variante es una variante de un gen X de la hepatitis de mamífero de tipo salvaje o no modificado o una porción truncada del mismo, que es, opcionalmente, una porción truncada presente en un PRE.
67. El polinucleótido del caso 66, en el que dicho gen X de la hepatitis de mamífero de tipo salvaje o no modificado es un gen X del virus de la hepatitis de la marmota (WHV) de tipo salvaje o una porción truncada del mismo, que es opcionalmente, una porción truncada presente en un PRE de tipo salvaje o no modificado.
68. El polinucleótido del caso 67, en el que el gen X de WHV de tipo salvaje o no modificado o la porción truncada de un gen X de tipo salvaje presente en un PRE comprende la secuencia de nucleótidos expuesta como los nucleótidos 1503-1928 de la SEQ ID NO: 2, la secuencia de nucleótidos expuesta como los nucleótidos 411-592 de cualquiera de las SEQ ID NO: 1 y 12-20 o la secuencia de nucleótidos expuesta como los nucleótidos 411-589 de la SEQ ID NO: 125.
69. El polinucleótido del caso 67 o el caso 68, en el que dicho gen X de WHV de tipo salvaje comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 9 o es una porción truncada de la misma, que se expone, opcionalmente, en la SEQ ID NO: 10 o es una porción truncada presente en un PRE de tipo salvaje o no modificado.
70. El polinucleótido de cualquiera de los casos 59-69, en el que dicho PRE modificado comprende por lo menos dos o por lo menos tres subelementos reguladores postranscripcionales que actúan en cis de un PRE del virus de la hepatitis de tipo salvaje o no modificado o variante funcional del mismo.
71. El polinucleótido del caso 70, en el que dichos por lo menos dos o por lo menos tres subelementos comprenden un subelemento alfa de PRE de tipo salvaje o no modificado o una variante funcional del mismo, una variante funcional de un subelemento beta de PRE de tipo salvaje o no modificado, y/o un subelemento gamma de PRE de tipo salvaje o no modificado o una variante funcional del mismo.
72. El polinucleótido de cualquiera de los casos 59-71, en el que dicho PRE modificado comprende un subelemento alfa de un PRE de virus de la hepatitis de tipo salvaje o no modificado o una variante funcional del mismo y una variante funcional de un subelemento beta de PRE de tipo salvaje o no modificado.
73. El polinucleótido del caso 71 o el caso 72, en el que dicho subelemento alfa comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 3 o una variante de la misma, dicho subelemento beta comprende una variante de la secuencia de la SEQ ID NO: 6, y/o dicha subunidad gamma comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 8 o una variante de la misma.
74. El polinucleótido de cualquiera de los casos 1-73, en el que el PRE modificado comprende modificaciones de nucleótidos en comparación con un PRE de virus de la hepatitis de tipo salvaje o no modificado que es un PRE de hepatitis de mamífero de tipo salvaje.
75. El polinucleótido del caso 74, en el que dicho PRE del virus de la hepatitis de mamífero de tipo salvaje o no modificado comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 12-27 y 125.
76. El polinucleótido del caso 74 o el caso 75, en el que dicho PRE de hepatitis de mamífero de tipo salvaje o no modificado es un PRE de virus de hepatitis de marmota (WPRE) de tipo salvaje.
77. El polinucleótido de cualquiera de los casos 1-76, en el que el PRE de hepatitis de tipo salvaje o no modificado comprende:
a) la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125 o una secuencia de nucleótidos que muestra por lo menos un 94% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125 que muestra sustancialmente la misma, como por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de la actividad postranscripcional de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125; y
b) un PRE modificado que comprende una porción de la secuencia de nucleótidos de a), en donde la porción muestra o conserva la actividad postranscripcional.
78. El polinucleótido del caso 77, en el que el PRE de hepatitis de tipo salvaje o no modificado comprende una secuencia de nucleótidos que muestra por lo menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125.
79. El polinucleótido de cualquiera de los casos 59-78, en el que dicho PRE de hepatitis de tipo salvaje o no modificado comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 12-20 y 125.
80. El polinucleótido de cualquiera de los casos 59-79, en el que dicho PRE de hepatitis de tipo salvaje o no modificado comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125.
81. El polinucleótido de cualquiera de los casos 59-80, en el que dicho gen X variante comprende un codón de inicio que comienza en una posición correspondiente a la posición 411 de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125.
82. El polinucleótido del caso 81, en el que dicho codón de inicio es un codón de inicio ATG.
83. El polinucleótido de cualquiera de los casos 59-82, en el que el gen X variante comprende además un promotor enlazado operativamente a dicho gen X variante.
84. El polinucleótido del caso 83, en el que dicho promotor es un promotor del gen X de tipo salvaje o no modificado que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 11 o una secuencia promotora del gen X de WHV de tipo salvaje.
85. El polinucleótido de cualquiera de los casos 59-84, en el que el PRE modificado se selecciona entre: a) un PRE modificado que comprende una secuencia de nucleótidos que muestra por lo menos un 65% de identidad de secuencia con la s Eq ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125, dicho PRE modificado conteniendo un gen X variante que comprende una secuencia que codifica una señal de modificación postraduccional no presente en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125; y
b) un PRE modificado que comprende una porción de la secuencia de nucleótidos de a), dicha porción comprendiendo un gen X variante que comprende la secuencia que codifica una modificación postraduccional, en donde la porción muestra actividad postranscripcional.
86. El polinucleótido del caso 85, en el que el PRE modificado comprende una secuencia de nucleótidos que muestra por lo menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 125.
87. El polinucleótido de cualquiera de los casos 1-86, en el que el gen X variante comprende hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 cambios de nucleótidos.
88. El polinucleótido de cualquiera de los casos 59-87, en el que el PRE modificado no contiene ninguna modificación además de la secuencia que codifica una señal de modificación postraduccional.
89. El polinucleótido de cualquiera de los casos 59-88, en el que el PRE modificado contiene modificaciones adicionales además de la secuencia que codifica una señal de modificación postraduccional no presente en el gen X del virus de la hepatitis de tipo salvaje o no modificado.
90. El polinucleótido del caso 89, en el que las modificaciones adicionales están en el gen X variante.
91. El polinucleótido del caso 90, en el que la modificación o modificaciones adicionales dan como resultado un gen X variante que codifica una proteína X inactiva y/o una proteína X truncada.
92. El polinucleótido de cualquiera de los casos 59-91, en el que dicho PRE modificado codifica un ARN que promueve la exportación de ARN nuclear y/o aumenta la estabilidad del ARNm.
93. El polinucleótido de cualquiera de los casos 59-92, en el que dicho PRE modificado codifica un polinucleótido de ARN que promueve la exportación de ARN nuclear y/o aumenta la estabilidad del ARNm, en donde dicha promoción de la exportación de ARN nuclear y/o estabilidad del ARNm aumenta la expresión de la proteína recombinante.
94. El polinucleótido de cualquiera de los casos 59-93, en el que el PRE modificado conserva la actividad postranscripcional del PRE de la hepatitis de tipo salvaje o no modificado correspondiente y/o el PRE expuesto en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 125 y/o la SEQ ID NO: 216, que, en algunos casos, es por lo menos o aproximadamente por lo menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de la actividad postranscripcional del PRE de la hepatitis de tipo salvaje o no modificado y/o el PRE expuesto en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 125 o SEQ ID NO: 216.
95. Un polinucleótido, que comprende un ácido nucleico viral que comprende un Flap variante, en donde el Flap variante contiene una deleción de todos o una parte de los nucleótidos correspondientes al tracto de polipurina central (cPPT) y/o las regiones de la secuencia de terminación central (CTS) de una secuencia Flap de tipo salvaje o no modificada.
96. El polinucleótido del caso 95, en el que el Flap variante comprende una deleción de todos o una parte, que puede ser una parte contigua, de los nucleótidos correspondientes al cPPT y al CTS.
97. El polinucleótido de Flap variante del caso 95 o 96, en el que:
la secuencia del Flap de tipo salvaje o no modificado comprende desde o desde aproximadamente 80 a 200 nucleótidos contiguos que comprenden las regiones cPPT o CTS de un retrovirus, que opcionalmente es un lentivirus, que opcionalmente es VIH-1; y/o
la secuencia del Flap de tipo salvaje o no modificado comprende a) la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 121; b) una secuencia de nucleótidos que comprende por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 121 que contiene las regiones de cPPT y/o CTS; o c) una parte contigua de a) o b) que comprende las regiones de cPPT y/o CTS.
98. El polinucleótido del Flap variante de cualquiera de los casos 95-97, en el que:
el Flap variante comprende la deleción de la totalidad o una porción, que puede ser una porción contigua, de los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos de la región cPPT expuesta en la SEQ ID NO: 123; y/o el Flap variante comprende la deleción de todo o una porción, que puede ser una porción contigua, de los nucleótidos correspondientes a la región CTS expuesta en la SEQ ID NO: 124.
99. El polinucleótido Flap variante de cualquiera de los casos 95-98, en el que el Flap variante comprende la deleción de todo o una porción, que puede ser una porción contigua, de la región cPPT expuesta en la SEQ ID NO: 123 y comprende la deleción de todos o una porción, que puede ser una porción contigua, de la región de CTS expuesta en la SEQ ID NO: 124.
100. El polinucleótido del Flap variante de cualquiera de los casos 95-99, en el que:
el ácido nucleico viral que comprende el Flap variante comprende una secuencia de nucleótidos que muestra por lo menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 85% o 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 121, dicha variante Flap carece de todo o una porción de las regiones cPPT y/o CTS; y/o
el ácido nucleico viral comprende el Flap variante que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 122.
101. El polinucleótido de cualquiera de los casos 1-94 comprende además un polinucleótido que comprende un ácido nucleico viral que comprende un Flap variante de cualquiera de los casos 95-100.
102. Un polinucleótido de cualquiera de los casos 95-101, que comprende:
un Flap variante que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 122 o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 122; y
la secuencia de la SEQ ID NO: 29 o la SEQ ID NO: 126 o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 29 o la SEQ ID NO: 126; y
opcionalmente, que comprende ácidos nucleicos que codifican una proteína recombinante.
103. El polinucleótido de cualquiera de los casos 1-94 y 101-102, en el que la proteína recombinante comprende un receptor recombinante.
104. El polinucleótido del caso 103, en el que el receptor recombinante es un receptor de antígeno y/o un receptor quimérico.
105. El polinucleótido del caso 104, en el que el receptor recombinante es un receptor de antígeno funcional no TCR o un TCR transgénico.
106. El polinucleótido de cualquiera de los casos 103-105, en el que el receptor recombinante es un receptor de antígeno quimérico (CAR).
107. Un casete de expresión que comprende el polinucleótido de cualquiera de los casos 1-106 y un promotor enlazado operativamente al ácido nucleico que codifica la proteína recombinante.
108. Un vector que comprende el polinucleótido de cualquiera de los casos 1-106 o el casete de expresión del caso 107.
109. El vector del caso 108, que es un vector viral.
110. El vector del caso 109, en el que el vector viral es un vector lentiviral, que, opcionalmente, se deriva del VIH-1.
111. El vector del caso 109, en el que el vector viral es un vector retroviral.
112. Una célula que comprende el casete de expresión del caso 107 o el vector de cualquiera de los casos 108­ 111.
113. La célula del caso 112, en la que la célula es una célula T, una célula asesina natural (NK), una célula iPS o una célula derivada de iPS.
114. Una partícula de virus, que comprende el vector de cualquiera de los casos 108-111.
115. Un método, que comprende introducir el casete de expresión del caso 107, el vector de cualquiera de los casos 108-111 o la partícula de virus del caso 114 en una célula, en condiciones en las que la expresión de la proteína recombinante se efectúa en la célula.
116. El método del caso 115, en el que:
dicha introducción se efectúa transduciendo dicha célula con dicho vector o partícula viral;
dicha introducción se efectúa transfectando dicha célula con dicho vector; y/o
dicha introducción se efectúa por electroporación de dicha célula con dicho vector.
117. El método del caso 116, en el que la proteína recombinante se expresa a un nivel que se incrementa en comparación con el logrado mediante la introducción de un vector que es igual pero que no contiene el PRE modificado o no contiene un PRE.
118. Una célula producida por el método de cualquiera de los casos 115-117.
119. Una composición farmacéutica que comprende la célula de los casos 112, 113 o 118, y un portador farmacéuticamente eficaz.
120. Un método de tratamiento, el método comprendiendo administrar a un sujeto que tiene una enfermedad o afección el vector de cualquiera de los casos 108-111, la partícula de virus del caso 114, la célula del caso 112, 113 o 118, o la composición del caso 119.
121. El método del caso 120, en el que la proteína recombinante comprende un receptor recombinante que se une específicamente a un ligando expresado por la enfermedad o afección o una célula o tejido de la misma. 122. El método del caso 121, en el que el receptor es un receptor de antígeno y el ligando es un antígeno específico para y/o asociado con la enfermedad o afección.
123. El método del caso 122, en el que la enfermedad o afección es un cáncer, y un trastorno autoinmune, o una enfermedad infecciosa.
124. El uso de una composición farmacéutica del caso 119 para tratar una enfermedad o afección.
125. Una composición farmacéutica del caso 119 para su uso en la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad o afección.
IV. EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos se incluyen sólo con propósitos ilustrativos y no se pretende que limiten el alcance de la invención.
Ejemplo 1: Elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota modificado Se generó un polinucleótido del elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE) modificado ejemplar, que contenía modificaciones en los residuos correspondientes a posiciones en una secuencia de WPRE de tipo salvaje ejemplar (SEQ ID NO: 1). Se introdujeron codones de terminación en cada marco de lectura correspondiente a una región de la SEQ ID NO: 1 que codifica una porción truncada de la proteína X de WHV (fragmento del gen X). Específicamente, dentro de esta región, se introdujeron dos codones de terminación en el marco de lectura abierto que codifica la proteína X truncada (comenzando a 9 y 21 nucleótidos desde el sitio correspondiente a la posición 5' del codón de inicio del gen X), y uno en cada uno de los otros dos marcos de lectura (comenzando 13 y 17 nucleótidos desde el sitio correspondiente a la posición 5' del codón de inicio). El WRPE modificado contenía la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 126. En la siguiente porción de esta secuencia, los codones de terminación se indican en negrita, y las mutaciones introducidas con referencia a la SEQ ID NO:1 están subrayados. ATGGCTGCTTAGCTGAGTAGcTg A (SEQ ID NO: 28). También se generó un WPRE funcional de control modificado, que contenía la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 216. Este WPRE modificado funcional de control contiene mutaciones en la región promotora del gen X de WHV y el codón de inicio en comparación con la secuencia de WPRE de tipo salvaje de la s Eq ID NO: 1. Se ha usado en una pluralidad de vectores virales para transducción, demostrando actividad suficiente para promover expresión de moléculas recombinantes codificadas por tales vectores (ver, por ejemplo, "Cloning vector pLV.MCS.WHVPRE, complete sequence", GenBank: JN622008.1; Patente de Estados Unidos N° 7.384.738).
El polinucleótido de WPRE modificado que contiene la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 126 y el WPRE modificado de control que contiene la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 216 se incorporaron cada uno por separado en un vector lentiviral derivado de VIH-1 ejemplar que contenía mutaciones dentro la región Flap viral. Específicamente, el vector lentiviral contenía una región de Flap variante en la que se eliminaron las regiones correspondientes a la SEQ ID NO: 123 y la SEQ ID NO: 124, dando como resultado un vector variante de Flap, que tiene una porción que contiene la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 122 (designado Flap -/-).
También se generó un vector lentiviral en el que se incorporó el WPRE modificado de control de la SEQ ID NO: 119 en un vector lentiviral derivado de VIH-1 ejemplar que contenía una región Flap completa. El vector lentiviral que contiene la región Flap completa (un polinucleótido de Flap de tipo salvaje) que contiene la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 121 (designado Flap /+).
Las secuencias contenidas en los vectores lentivirales generados se resumen en la Tabla 4 a continuación:
Tabla 4:
Figure imgf000059_0001
El vector contenía polinucleótidos que codificaban el receptor de antígeno quimérico y el marcador de transducción del factor de crecimiento epidérmico truncado (EGFRt) separados por un conector T2A (ver la Patente de Estados Unidos N° 8.802.374). Se produjeron partículas de vectores lentivirales pseudotipadas mediante procedimientos estándar transfectando transitoriamente células HEK-293T con los vectores resultantes, plásmidos auxiliares (que contienen plásmidos gagpol y plásmido rev) y un plásmido de pseudotipificación y se usaron para transducir células.
Ejemplo 2: Transducción de células con vectores virales que contienen WPRE modificado
Las partículas de vectores lentivirales descritas en el Ejemplo 1 se usaron para transducir células de una línea celular de fibrosarcoma humano (HT1080 ATCC® No. CCL-121™) y células T humanas primarias. La eficacia de la transducción se evaluó midiendo la expresión superficial del marcador EGFRt recombinante codificado por el vector.
2A. Células HT1080
En estudios duplicados (A y B), las células HT1080 se transdujeron en placas de 24 pocillos con 250 pl o 125 pl de volumen de virus en presencia de 8 pg/ml de Polybrene con espinoculación (1200 * g durante 30 minutos). Se usó una muestra de células no transducidas como control negativo.
Después del cultivo de las células durante 48-72 horas, se detectó la expresión de superficie del marcador EGFRt mediante citometría de flujo con un conjunto de activación basado en la muestra de control no transducida. Se detectó EGFRt usando un anticuerpo anti-EGFR conjugado con biotina (cetuximab) seguido de detección con una estreptavidina secundaria conjugada con V450. La Tabla 5 enumera el porcentaje de células vivas que muestran expresión de EGFRt de superficie para cada una de las varias condiciones en los duplicados A y B.
Como se muestra, la transducción de células HT1080 usando un vector lentiviral que tiene una región Flap variante y un WPRE modificado con codones de terminación en el fragmento del gen X dio como resultado una expresión de EGFRt comparable a la que usa un vector con una región Flap variante y un WPRE modificado de control. Por tanto, en comparación con las modificaciones en el codón de inicio y la región promotora del gen X, la presencia de codones de terminación en el fragmento del gen X no interfirió con la capacidad de un WPRE para promover la expresión de la proteína recombinante codificada por el vector.
Además, como se muestra, un vector lentiviral que tiene una región Flap variante transdujo con éxito las células HT1080 detectadas por la expresión de EGFRt.
Tabla 5:
Figure imgf000060_0001
2B. Células T humanas
Se enriquecieron células T humanas primarias mediante selección positiva a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas de muestras de aféresis humana. Las células se activaron usando perlas anti-CD3/anti-CD28 en presencia de IL-2 (100 Ul/ml). Las células T activadas se transdujeron con un volumen de virus en presencia de Polybrene (8 pg/ml) y espinoculación (1200 x g durante 30 min) en placas de 24 pocillos para cada uno de los vectores descritos en el Ejemplo 1. Una muestra de las células sirvió como control negativo.
La expresión superficial de EGFRt se detectó como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 2A. Los resultados se muestran en la Tabla 6, incluyendo los resultados de estudios duplicados (Ay B). Como se muestra, la transducción de células T humanas primarias usando un vector lentiviral que tiene una región Flap variante y un WPRE modificado con codones de terminación en el fragmento del gen X dio como resultado una expresión de EGFRt comparable a la que usa un vector con una región Flap variante y un WPRE modificado de control. Por tanto, en comparación con las modificaciones en el codón de inicio y la región promotora del gen X, la presencia de codones de terminación en el fragmento del gen X no interfirió con la capacidad de un WPRE para promover la expresión de la proteína recombinante codificada por el vector. Estos resultados fueron consistentes en múltiples reactivos de activación, con resultados similares obtenidos cuando se activaron células T primarias humanas con varios tipos de perlas anti-CD3/anti-CD28.
Además, como se muestra, un vector lentiviral que tiene una región Flap variante transdujo con éxito células T como se observa mediante la expresión de EGFRt.
Tabla 6:
Figure imgf000061_0002
Ejemplo 3: Transducción de células con vectores virales que contienen un Fiat completo o una región Flap variante
Se generaron partículas de vectores lentivirales sustancialmente como se describe en el Ejemplo 1, en el que cada una codificaba un receptor de antígeno quimérico (CAR) que contenía un dominio de unión al antígeno scFv anti-CD19 diferente. Cada vector lentiviral también contenía polinucleótidos de WPRE de un WPRE modificado funcional de control que era nulo para el ORF del gen X enlazado operativamente a los polinucleótidos que codifican el CAR, y un polinucleótido de Flap de tipo salvaje (Flap /+) (SEQ ID NO: 121) o un polinucleótido de Flap variante (Flap -/-) (SEQ ID NO: 122). Para la detección de la expresión del CAR, los vectores lentivirales también codificaron un marcador de transducción de EGFR truncado (EGFRt) separado del CAR por un conector T2A autoescindible.
Se enriquecieron células T CD8 humanas primarias mediante selección positiva de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas de muestras de aféresis humana. Las partículas de vectores lentivirales se usaron para transducir células T CD8 (esencialmente como se describe por Yam et al. (2002) Mol. Ther. 5: 479; WO2015/095895). Una muestra de células no transducidas sirvió como control negativo.
Después de la transducción y expansión, se usó la tinción con anticuerpo anti-EGFR para verificar la expresión del marcador de transducción de EGFRt en la superficie de las células T mediante citometría de flujo como se describe en el Ejemplo 2A. La activación se estableció en base a la muestra de control no transducida. La Tabla 7 enumera el porcentaje de células vivas que muestran expresión de EGFRt de superficie para cada una de las varias condiciones. Como se muestra, los resultados confirmaron que los vectores lentivirales con un polinucleótido Flap -/- podían transducir con éxito las células T CD8+.
Tabla 7:
Figure imgf000061_0001
Después de la transducción, las células T transducidas con cada constructo de CAR, incluyendo las que contienen el polinucleótido Flap -/- variante, se enriquecieron y expandieron selectivamente con éxito (en o cerca del 100% de EGFRt+ según se confirmó por citometría de flujo) mediante estimulación en presencia de líneas celulares

Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. Un polinucleótido, que comprende un elemento regulador postranscripcional (PRE) modificado, dicho PRE modificado comprendiendo una variante de un gen X del virus de la hepatitis de tipo salvaje, dicho gen X variante comprendiendo una pluralidad de codones de terminación no presentes en el gen X de tipo salvaje.
2. El polinucleótido de la reivindicación 1, en el que la pluralidad de codones de terminación comprende por lo menos un codón de terminación seleccionado entre:
un codón de terminación que comienza en una posición dentro de 36, 30 o 24 nucleótidos en la dirección 3' desde una posición en el gen X variante correspondiente a la posición 5' de un codón de inicio del marco de lectura abierto de la proteína X de tipo salvaje; y/o
un codón de terminación que comienza en una posición dentro de 36, 30 o 24 nucleótidos en la dirección 3' desde una posición en el gen X variante correspondiente al residuo 411 de la secuencia del elemento regulador postranscripcional de WHV (WPRE) expuesta en la SEQ ID NO: 1 y/o el residuo 1503 de la secuencia de WHV expuesta como la SEQ ID NO: 2.
3. El polinucleótido de la reivindicación 2, en el que dicho gen X variante no comprende un marco de lectura abierto de más de o aproximadamente 39 nucleótidos de longitud, más de o aproximadamente 33 nucleótidos de longitud, más de o aproximadamente 27 nucleótidos de longitud.
4. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el gen X variante comprende por lo menos 2 codones de terminación, por lo menos 3 codones de terminación o por lo menos 4 codones de terminación y/o en el que el gen X variante comprende un codón de terminación en cada marco de lectura presente en dicho gen X variante.
5. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende además un ácido nucleico que codifica una proteína recombinante enlazada operativamente al PRE modificado, opcionalmente en donde la proteína recombinante comprende un receptor recombinante, opcionalmente un receptor de antígeno o un receptor quimérico.
6. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la pluralidad de codones de terminación comprende por lo menos un codón de terminación seleccionado entre:
un codón de terminación que comienza en una posición dentro o dentro de por lo menos 9, 12, 15 o 18 nucleótidos en la dirección 3' desde una posición en el gen X variante correspondiente a la posición 5' de un codón de inicio del marco de lectura abierto de proteína X; y/o
un codón de terminación que comienza en una posición dentro o dentro de por lo menos 9, 12, 15 o 18 nucleótidos en la dirección 3' desde una posición en el gen X variante correspondiente al residuo 411 de la secuencia del elemento regulador postranscripcional de WHV (WPRE) expuesta en la SEQ ID NO: 1 y/o el residuo 1503 de la secuencia de WHV expuesta como la SEQ ID NO: 2.
7. El polinucleótido de la reivindicación 6, en el que dicho gen X variante no comprende un marco de lectura abierto de más de o aproximadamente 21 nucleótidos de longitud, más de o aproximadamente 18 nucleótidos de longitud, más de o aproximadamente 15 nucleótidos de longitud, o más de o aproximadamente 12 nucleótidos de longitud.
8. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la pluralidad de codones comprende por lo menos un codón de terminación seleccionado entre:
un codón de terminación que comienza en una posición de nucleótidos correspondiente a la posición 420 en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1;
un codón de terminación que comienza en una posición de nucleótidos correspondiente a la posición 424 en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1;
un codón de terminación que comienza en una posición de nucleótidos correspondiente a la posición 428 en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1; y
un codón de terminación que comienza en una posición de nucleótidos correspondiente a la posición 432 en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1.
9. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el PRE modificado se selecciona entre: a) un PRE modificado que comprende una secuencia de nucleótidos que muestra por lo menos un 85% de identidad de secuencia con la s Eq ID NO: 1 o 125, dicho PRE modificado conteniendo un gen X variante que comprende por lo menos un codón de terminación no presente en la SEQ ID NO: 1 o 125; y
b) un PRE modificado que comprende una porción de la secuencia de nucleótidos de a), dicha porción comprendiendo un gen X variante que comprende por lo menos un codón de terminación, en el que la porción muestra actividad postranscripcional.
10. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el gen X variante comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 28, 44-54 o 141-151 y/o el PRE modificado comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 29-39 o 126-136.
11. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que dicho gen X variante comprende además una variante de un codón de inicio que comprende una o más diferencias de nucleótidos en comparación con un codón de inicio del gen X del virus de la hepatitis de tipo salvaje y/o en comparación con el codón de inicio correspondiente a las posiciones de nucleótidos 411-413 de la SEQ ID NO: 1, opcionalmente
en donde dicho gen X variante comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 74-84 o 171-181 y/o el PRE modificado comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 59-69 o 156-166.
12. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde dicho gen X variante comprende un promotor variante enlazado operativamente a dicho gen X variante, dicho promotor variante comprendiendo una o más diferencias de nucleótidos en comparación con promotor del gen X del virus de la hepatitis de tipo salvaje y/o en comparación con un promotor de la SEQ ID NO: 11, opcionalmente en donde dicha una o más diferencias dan como resultado en la transcripción restringida o la prevención de la transcripción de dicho promotor y/u opcionalmente en donde dicho PRE modificado comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 89­ 99, 104-114, 186-196 o 201-211.
13. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, que comprende además un ácido nucleico viral que comprende un Flap variante, en donde el Flap variante contiene una deleción de todo o una porción de los nucleótidos correspondientes a las regiones del tracto de polipurina central (cPPT) y/o la secuencia de terminación central (CTS) de una secuencia de Flap de tipo salvaje o no modificado, opcionalmente en donde la secuencia de Flap de tipo salvaje o no modificada comprende de 80 a 200 nucleótidos contiguos que comprenden las regiones de cPPT o CTS de un retrovirus, que opcionalmente es un lentivirus o VIH-1.
14. El polinucleótido de la reivindicación 13, en donde:
(i) el Flap variante comprende la deleción de toda o una porción contigua de nucleótidos correspondientes a los nucleótidos en la región de cPPT expuesta en la SEQ ID NO: 123 y comprende la deleción de toda o una porción contigua de los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos en la región de CTS expuesta en la sEQ ID NO: 124, y/o
(ii) el ácido nucleido viral que comprende el Flap variante comprende una secuencia de nucleótidos que muestra por lo menos un 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 121. dicho Flap variante careciendo de toda una porción de las regiones de cPPT y CTS.
15. El polinucleótido de la reivindicación 13 o la reivindicación 14, que comprende:
un Flap variante que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 122 o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 122; y un PRE modificado que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 29 o 126 o una secuencia que tiene por lo menos o aproximadamente un 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia con la SEQ iD NO: 29 o 126.
16. Un casete de expresión que comprende el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-15 y un promotor enlazado operativamente al ácido nucleico que codifica la proteína recombinante.
17. Un vector que comprende el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-15 o el casete de expresión de la reivindicación 16, opcionalmente en donde el vector es un vector viral, opcionalmente un vector retroviral y/o vector lentiviral, opcionalmente en donde el vector lentiviral se deriva de VIH-1.
18. Una célula que comprende un polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-15 o un casete de expresión que comprende el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, opcionalmente en donde la célula es una célula T, un célula asesina natural (NK), una célula iPS, o una célula derivada de iPS.
19. Un método in-vitro, que comprende introducir el casete de expresión de la reivindicación 16 o el vector de la reivindicación 17 en una célula, en condiciones por la que se efectúa la expresión de la proteína recombinante en la célula.
20. Una composición farmacéutica que comprende la célula de la reivindicación 18, y un portador farmacéuticamente eficaz.
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