ES2876430T3

ES2876430T3 - Inhibición dirigida de TGFß

Info

Publication number: ES2876430T3
Application number: ES15717097T
Authority: ES
Inventors: Kin-Ming Lo
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2014-02-10
Filing date: 2015-02-10
Publication date: 2021-11-12
Anticipated expiration: 2035-02-10
Also published as: IL246968B; WO2015118175A2; US20150225483A1; SG10202108879SA; JP6731346B2; MX2021003685A; RU2016135062A3; RU2016135062A; US20180002436A1; HUE054873T2; US20230056881A1; US11370819B2; EP3105246B1; RU2752424C2; AU2022200365A1; CY1124408T1; CA2934979A1; PE20161096A1; PT3105246T; PL3105246T3

Abstract

Una proteína que comprende: un primer polipéptido que comprende a) TGFβRII humano, o un fragmento del mismo, capaz de unirse a TGFβ; y b) al menos una región variable de la cadena pesada de un anticuerpo o de un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen a la proteína humana de ligando de muerte programada 1 (PD-L1); y un segundo polipéptido que comprende al menos una región variable de la cadena ligera de un anticuerpo o de un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen a la proteína humana PD-L1, en donde el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:3, en donde el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 1, y en donde la cadena pesada del primer polipéptido y la cadena ligera del segundo polipéptido, cuando se combinan, forman un sitio de unión al antígeno que se une a PD-L1.

Description

DESCRIPCIÓN

Inhibición dirigida de TGFp

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a moléculas bifuncionales que incluyen (a) un TGFpRII o un fragmento del mismo capaz de unirse al TGFp y (b) un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a una proteína de punto de control inmunitario, tal como el ligando 1 de muerte programada (PD-L1), a los usos de dichas moléculas (por ejemplo, para tratar el cáncer) y a los métodos para fabricar dichas moléculas.

Antecedentes

En el tratamiento del cáncer, se ha reconocido desde hace mucho tiempo que la quimioterapia se asocia con una alta toxicidad y puede conducir a la aparición de variantes de células cancerosas resistentes. Incluso con la terapia dirigida contra oncoproteínas sobreexpresadas o activadas importantes para la supervivencia y el crecimiento del tumor, las células cancerosas invariablemente mutan y se adaptan para reducir la dependencia de la vía dirigida, tal como mediante la utilización de una vía redundante. La inmunoterapia contra el cáncer es un nuevo paradigma en el tratamiento del cáncer que, en lugar de dirigirse a las células cancerosas, se centra en la activación del sistema inmunitario. Su principio es rearmar la respuesta inmunitaria del hospedador, especialmente la respuesta adaptativa de los linfocitos T, para proporcionar vigilancia inmunitaria para destruir a las células cancerosas, en particular, la enfermedad mínima residual que ha escapado a otras formas de tratamiento, logrando así una inmunidad protectora duradera.

La aprobación de la FDA del anticuerpo anti-CTLA-4 ipilimumab para el tratamiento del melanoma en 2011 marcó el comienzo de una nueva era de inmunoterapia contra el cáncer. La demostración de que la terapia anti-PD-1 o anti-PD-L1 indujo respuestas duraderas en el melanoma, el riñón y el cáncer de pulmón en ensayos clínicos significa aún más su mayoría de edad (Pardoll, D.M., Nat Immunol. 2012; 13:1129-32). Sin embargo, la terapia con ipilimumab está limitada por su perfil de toxicidad, presumiblemente porque el tratamiento anti-CTLA-4, interfiriendo con el punto de control inhibidor de linfocitos T primarios, puede conducir a la generación de nuevos linfocitos T autorreactivos. Si bien la inhibición de la interacción PD-L1/PD-1 da como resultado la desinhibición de las respuestas inmunitarias crónicas existentes en los linfocitos T agotados que son en su mayoría de naturaleza antivírica o anticancerígena (Wherry, E. J., Nat Immunol. 2011; 12:492-9), la terapia anti-PD-1, no obstante, a veces puede dar como resultado eventos adversos autoinmunes relacionados con los pulmones potencialmente letales. A pesar de las prometedoras actividades clínicas de anti-PD1 y anti-PD-L1 hasta ahora, aumentar el índice terapéutico, ya sea aumentando la actividad terapéutica o disminuyendo la toxicidad, o ambos, sigue siendo un objetivo central en el desarrollo de agentes inmunoterapéuticos. El documento WO2011/109789 documenta proteínas de fusión que comprenden un resto de direccionamiento fusionado con un resto inmunomodulador. El resto de direccionamiento puede ser un anticuerpo anti-PD-L1. El resto inmunomodulador puede ser un dominio de unión a ligando extracelular de TGFpR. El documento WO2013/164694 documenta proteínas de fusión quiméricas que comprenden al menos un resto de direccionamiento y al menos un resto inmunomodulador que contrarresta la tolerancia inmunitaria de las células cancerosas. El resto de direccionamiento puede unirse a PD-L1. El resto inmunomodulador puede ser un dominio de unión a ligando extracelular de TGFpR.

Sumario de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento de que una proteína bifuncional que contiene al menos una porción del Receptor II del TGFp (TGFpRIl) que es capaz de unir TGFp y un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une a una proteína de punto de control inmunitario como la proteína humana de ligando de muerte programada 1 (PD-L1) puede ser un agente terapéutico eficaz contra el tumor y el cáncer. La proteína puede presentar un efecto sinérgico en el tratamiento del cáncer, en comparación con el efecto de administrar los dos agentes por separado. Cualquier materia o enseñanza desvelada no es parte de la invención. La invención se define solo mediante las reivindicaciones.

Por consiguiente, la divulgación presenta una proteína que incluye (a) TGFpRII humano, o un fragmento del mismo capaz de unirse a TGFp (por ejemplo, un fragmento soluble); y (b) un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une al PD-L1 humano (por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento). Un aspecto de la invención proporciona una proteína tal como se establece en la reivindicación 1.

La divulgación también presenta un polipéptido que incluye (a) al menos un dominio variable de una cadena pesada de un anticuerpo que se une a PD-L1 (por ejemplo, los aminoácidos 1-120 del SEQ ID NO:2); y (b) TGFpRII humano, o un fragmento soluble del mismo capaz de unirse a TGFp (por ejemplo, un dominio extracelular (DEC) de TGFpRII humano, los aminoácidos 24-159 del SEQ ID NO: 9, o cualquiera de los descritos en el presente documento). El polipéptido puede incluir además un enlazador de aminoácidos que conecta el extremo C-terminal del dominio variable al extremo N-terminal del TGFpRII humano o un fragmento soluble del mismo capaz de unirse al TGFp. El polipéptido puede incluir la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica al SEQ ID NO: 3. El fragmento de inmunoglobulina puede ser un fragmento scFv, Fab, F(ab')2 o Fv.

En ciertas divulgaciones del presente documento, la proteína o el polipéptido incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye el SEQ ID NO: 2 y TGFpRII humano. El anticuerpo puede incluir opcionalmente una región constante modificada (por ejemplo, cualquiera de las descritas en el presente documento, una sustitución de Lys ^ Ala en C-terminal, una mutación de la secuencia Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) a Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ ID NO: 20), o una región constante híbrida que incluye una región de bisagra de IgG1 y un dominio CH2 de IgG2).

En cierta divulgación en el presente documento, la proteína o polipéptido incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye el SEQ ID NO: 2 y un fragmento de TGFpRII humano capaz de unirse a TGFp (por ejemplo, un fragmento soluble). El anticuerpo puede incluir opcionalmente una región constante modificada (por ejemplo, cualquiera de las descritas en el presente documento, incluyendo una sustitución Lys ^ Ala en C-terminal, una mutación de la secuencia Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) a Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ iD NO: 20), o una región constante híbrida que incluye una región de bisagra de IgG1 y un dominio CH2 de IgG2).

En cierta divulgación en el presente documento, la proteína o el polipéptido incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye el SEQ ID NO: 2 y un DEC de TGFpRII humano. El anticuerpo puede incluir una región constante modificada (por ejemplo, cualquiera de las descritas en el presente documento, incluyendo una sustitución Lys ^ Ala en C-terminal, una mutación de la secuencia Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) a Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ ID NO: 20), o una región constante híbrida que incluye una región de bisagra de IgG1 y un dominio CH2 de IgG2).

En cierta divulgación en el presente documento, la proteína o el polipéptido incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye los aminoácidos 1-120 del SEQ ID NO: 2 y TGFpRII humano. El anticuerpo puede incluir una región constante modificada (por ejemplo, cualquiera de las descritas en el presente documento, incluyendo una sustitución Lys ^ Ala en C-terminal, una mutación de la secuencia Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) a Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ ID NO: 20), o una región constante híbrida que incluye una región de bisagra de IgG1 y un dominio CH2 de IgG2).

En cierta divulgación en el presente documento, la proteína o polipéptido incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye los aminoácidos 1-120 del s Eq ID NO: 2 y un fragmento de TGFpRII humano capaz de unirse a TGFp (por ejemplo, un fragmento soluble). El anticuerpo puede incluir una región constante modificada (por ejemplo, cualquiera de las descritas en el presente documento, incluyendo una sustitución Lys ^ Ala en C-terminal, una mutación de la secuencia Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) a Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ iD NO: 20), o una región constante híbrida que incluye una región de bisagra de IgG1 y un dominio CH2 de IgG2).

En cierta divulgación en el presente documento, la proteína o el polipéptido incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye los aminoácidos 1-120 del s Eq ID NO: 2 y un DEC de TGFpRII humano. El anticuerpo puede incluir una región constante modificada (por ejemplo, cualquiera de las descritas en el presente documento, incluyendo una sustitución Lys ^ Ala en C-terminal, una mutación de la secuencia Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) a Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ ID NO: 20), o una región constante híbrida que incluye una región de bisagra de IgG1 y un dominio CH2 de IgG2).

En cierta divulgación en el presente documento, la proteína o el polipéptido incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye las regiones hipervariables presentes en el SEQ ID NO: 2 y TGFpRII humano. El anticuerpo puede incluir una región constante modificada (por ejemplo, cualquiera de las descritas en el presente documento, incluyendo una sustitución Lys ^ Ala en C-terminal, una mutación de la secuencia Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) a Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ ID NO: 20), o una región constante híbrida que incluye una región de bisagra de IgG1 y un dominio CH2 de IgG2).

En cierta divulgación en el presente documento, la proteína o polipéptido incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye las regiones hipervariables presentes en el SEQ ID NO: 2 y un fragmento de TGFpRII humano capaz de unirse a TGFp (por ejemplo, un fragmento soluble). El anticuerpo puede incluir una región constante modificada (por ejemplo, cualquiera de las descritas en el presente documento, incluyendo una sustitución Lys ^ Ala en C-terminal, una mutación de la secuencia Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) a Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ ID NO: 20), o una región constante híbrida que incluye una región de bisagra de IgG1 y un dominio CH2 de IgG2).

En cierta divulgación en el presente documento, la proteína o el polipéptido incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye las regiones hipervariables presentes en el SEQ ID NO: 2 y un DEC de TGFpRII humano. El anticuerpo puede incluir una región constante modificada (por ejemplo, cualquiera de las descritas en el presente documento, incluyendo una sustitución Lys ^ Ala en C-terminal, una mutación de la secuencia Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) a Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ ID NO: 20), o una región constante híbrida que incluye una región de bisagra de IgG1 y un dominio CH2 de IgG2).

En cierta divulgación en el presente documento, la proteína o el polipéptido incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye el SEQ ID NO: 12 y TGFpRII humano. El anticuerpo puede incluir una región constante modificada (por ejemplo, cualquiera de las descritas en el presente documento, incluyendo una sustitución Lys ^ Ala en C-terminal, una mutación de la secuencia Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) a Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ ID NO: 20), o una región constante híbrida que incluye una región de bisagra de IgG1 y un dominio CH2 de IgG2).

En cierta divulgación en el presente documento, la proteína o polipéptido incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye el SEQ ID NO: 12 y un fragmento de TGFpRII humano capaz de unirse a TGFp (por ejemplo, un fragmento soluble). El anticuerpo puede incluir una región constante modificada (por ejemplo, cualquiera de las descritas en el presente documento, incluyendo una sustitución Lys ^ Ala en C-terminal, una mutación de la secuencia Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) a Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ ID NO: 20), o una región constante híbrida que incluye una región de bisagra de IgG1 y un dominio CH2 de IgG2).

En cierta divulgación en el presente documento, la proteína o el polipéptido incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye el SEQ ID NO: 12 y un DEC de TGFpRII humano. El anticuerpo puede incluir una región constante modificada (por ejemplo, cualquiera de las descritas en el presente documento, incluyendo una sustitución Lys ^ Ala en C-terminal, una mutación de la secuencia Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) a Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ ID NO: 20), o una región constante híbrida que incluye una región de bisagra de IgG1 y un dominio CH2 de IgG2).

En cierta divulgación en el presente documento, la proteína o el polipéptido incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye las regiones hipervariables presentes en el SEQ ID NO: 12 y TGFpRII humano. El anticuerpo puede incluir una región constante modificada (por ejemplo, cualquiera de las descritas en el presente documento, incluyendo una sustitución Lys ^ Ala en C-terminal, una mutación de la secuencia Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) a Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ ID NO: 20), o una región constante híbrida que incluye una región de bisagra de IgG1 y un dominio CH2 de IgG2).

En cierta divulgación en el presente documento, la proteína o polipéptido incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye las regiones hipervariables presentes en el SEQ ID NO: 12 y un fragmento de TGFpRII humano capaz de unirse a TGFp (por ejemplo, un fragmento soluble). El anticuerpo puede incluir una región constante modificada (por ejemplo, cualquiera de las descritas en el presente documento, incluyendo una sustitución Lys ^ Ala en C-terminal, una mutación de la secuencia Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) a Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ ID NO: 20), o una región constante híbrida que incluye una región de bisagra de IgG1 y un dominio CH2 de IgG2).

En cierta divulgación en el presente documento, la proteína o el polipéptido incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye las regiones hipervariables presentes en el SEQ ID NO: 12 y un DEC de TGFpRII humano. El anticuerpo puede incluir una región constante modificada (por ejemplo, cualquiera de las descritas en el presente documento, incluyendo una sustitución Lys ^ Ala en C-terminal, una mutación de la secuencia Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) a Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ ID NO: 20), o una región constante híbrida que incluye una región de bisagra de IgG1 y un dominio CH2 de IgG2).

En cierta divulgación en el presente documento, la proteína o el polipéptido incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye el SEQ ID NO: 14 y TGFpRII humano. El anticuerpo puede incluir una región constante modificada (por ejemplo, cualquiera de las descritas en el presente documento, incluyendo una sustitución Lys ^ Ala en C-terminal, una mutación de la secuencia Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) a Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ ID NO: 20), o una región constante híbrida que incluye una región de bisagra de IgG1 y un dominio CH2 de IgG2).

En cierta divulgación en el presente documento, la proteína o polipéptido incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye el SEQ ID NO: 14 y un fragmento de TGFpRII humano capaz de unirse a TGFp (por ejemplo, un fragmento soluble). El anticuerpo puede incluir una región constante modificada (por ejemplo, cualquiera de las descritas en el presente documento, incluyendo una sustitución Lys ^ Ala en C-terminal, una mutación de la secuencia Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) a Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ ID NO: 20), o una región constante híbrida que incluye una región de bisagra de IgG1 y un dominio CH2 de IgG2).

En cierta divulgación en el presente documento, la proteína o el polipéptido incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye el SEQ ID NO: 14 y un DEC de TGFpRII humano. El anticuerpo puede incluir una región constante modificada (por ejemplo, cualquiera de las descritas en el presente documento, incluyendo una sustitución Lys ^ Ala en C-terminal, una mutación de la secuencia Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) a Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ ID NO: 20), o una región constante híbrida que incluye una región de bisagra de IgG1 y un dominio CH2 de IgG2).

La divulgación también presenta un ácido nucleico que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido descrito anteriormente. En cierta divulgación en el presente documento, el ácido nucleico incluye además una segunda secuencia de nucleótidos que codifica al menos un dominio variable de una cadena ligera de un anticuerpo que, cuando se combina con el polipéptido, forma un sitio de unión a antígeno que se une a PD-L1 (por ejemplo, que incluye los aminoácidos 1-110 del s Eq ID NO: 1). La segunda secuencia de nucleótidos puede codificar la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 1 (cadena ligera lambda anti-PD-L1 secretada) o una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica al SEQ ID NO: 1. La divulgación también presenta una célula que incluye cualquiera de los ácidos nucleicos descritos anteriormente.

La divulgación también presenta un método para producir una proteína que incluye (a) el dominio extracelular del TGFpRII humano, o un fragmento del mismo capaz de unirse al TGFp (por ejemplo, un fragmento soluble), y (b) un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a PD-L1 humano. El método incluye mantener una célula descrita anteriormente en condiciones que permitan la expresión de la proteína. El método puede incluir además recolectar la proteína.

La divulgación también presenta una proteína que incluye el polipéptido descrito anteriormente y al menos un dominio variable de una cadena ligera de un anticuerpo que, cuando se combina con el polipéptido, forma un sitio de unión a antígeno que se une a PD-L1. La proteína puede incluir (a) dos polipéptidos, cada uno con una secuencia de aminoácidos que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ iD NO: 3, y (b) dos polipéptidos adicionales, cada uno con una secuencia de aminoácidos que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 1.

La divulgación también presenta una proteína descrita anteriormente para su uso en terapia. La terapia puede incluir la administración de radiación o la administración de un agente quimioterapéutico, biológico o una vacuna.

La divulgación también presenta una proteína descrita anteriormente para su uso en la promoción del agotamiento local de TGFp en un tumor.

La divulgación también presenta una proteína descrita anteriormente para su uso en la inhibición de la fosforilación de SMAD3 en una célula (por ejemplo, una célula tumoral o una célula inmunitaria).

La divulgación también presenta una proteína descrita anteriormente para su uso en el tratamiento del cáncer o para su uso en la inhibición del crecimiento tumoral. El cáncer o el tumor se pueden seleccionar del grupo que consiste en colorrectal, de mama, de ovario, de páncreas, gástrico, de próstata, riñón, de cuello del útero, mieloma, linfoma, leucemia, de tiroides, endometrial, de útero, de vejiga, neuroendocrino, de cabeza y cuello, de hígado, nasofaríngeo, testicular, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, melanoma, cáncer de piel de células basales, cáncer de piel de células escamosas, dermatofibrosarcoma protuberans, carcinoma de células de Merkel, glioblastoma, glioma, sarcoma, mesotelioma y síndromes mielodisplásicos. El uso puede incluir además la administración de radiación o la administración de un agente quimioterapéutico, biológico o una vacuna.

La divulgación también presenta un método para promover el agotamiento local de TGFp. El método incluye administrar una proteína descrita anteriormente, en donde la proteína se une al TGFp en solución, se une a PD-L1 en la superficie celular y transporta el TGFp unido al interior de la célula (por ejemplo, una célula cancerosa).

La divulgación también presenta un método para inhibir la fosforilación de SMAD3 en una célula (por ejemplo, una célula cancerosa o una célula inmunitaria), el método incluye exponer la célula en el microambiente del tumor a una proteína descrita anteriormente.

La divulgación también presenta un método para inhibir el crecimiento de tumores o tratar el cáncer. El método incluye exponer el tumor a una proteína descrita anteriormente. El método puede incluir además exponer el tumor a radiación o a un agente quimioterapéutico, biológico o una vacuna. En cierta divulgación en el presente documento, el tumor o cáncer se selecciona del grupo que consiste en colorrectal, de mama, de ovario, de páncreas, gástrico, de próstata, riñón, de cuello del útero, mieloma, linfoma, leucemia, de tiroides, endometrial, de útero, de vejiga, neuroendocrino, de cabeza y cuello, de hígado, nasofaríngeo, testicular, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, melanoma, cáncer de piel de células basales, cáncer de piel de células escamosas, dermatofibrosarcoma protuberans, carcinoma de células de Merkel, glioblastoma, glioma, sarcoma, mesotelioma y síndromes mielodisplásicos.

Por "TGFpRN" o "receptor de TGFp II" se entiende un polipéptido que tiene la secuencia de la isoforma A de tipo 2 del receptor de TGFp humano de tipo silvestre (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la secuencia de referencia del NCBI (RefSeq) de n.° de registro NP_o0lO20oi8 (SEQ ID NO: 8)), o un polipéptido que tiene la secuencia de isoforma B del receptor de TGFp de tipo 2 humano de tipo silvestre (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de NCBI RefSeq n.° de registro NP_003233 (SEQ ID NO: 9)) o que tiene una secuencia sustancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 8 o del SEQ ID NO: 9. El TGFpRII puede conservar al menos un 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 5 %, 10 %, 25 %, 35 %, 50 %, 75 %, 90 %, 95 % o 99 % de la actividad de unión a TGFp de la secuencia de tipo silvestre. El polipéptido del TGFpRII expresado carece de la secuencia señal.

Por un "fragmento de TGFpRII capaz de unirse a TGFp" se entiende cualquier porción de la RefSeq del NCBI de N.° de registro NP_001020018 (SEQ ID NO: 8) o de la RefSeq del NCBI de N.° de registro NP_003233 (SEQ ID NO: 9), o una secuencia sustancialmente idéntica al SEQ ID NO: 8 o el SEQ ID NO: 9 que es de al menos 20 (por ejemplo, al menos 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 175 o 200) aminoácidos de longitud que conserva al menos parte de la actividad de unión de TGFp (por ejemplo, al menos el 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 5 %, 10 %, 25 %, 35 %, 50 %, 75 %, 90 %, 95 % o el 99 %) del receptor de tipo silvestre o del fragmento de tipo silvestre correspondiente. Normalmente, tal fragmento es un fragmento soluble. Un ejemplo de tal fragmento es un dominio extracelular de TGFpRIl que tiene la secuencia del SEQ ID NO: 10.

Por "sustancialmente idéntico" se entiende un polipéptido que presenta al menos un 50%, deseablemente el 60%, 70 %, 75 % o el 80 %, más deseablemente el 85 %, 90 % o 95 %, y lo más deseablemente el 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de referencia. La longitud de las secuencias de comparación será generalmente de al menos 10 aminoácidos, deseablemente al menos 15 aminoácidos contiguos, más deseablemente al menos 20, 25, 50, 75, 90, 100, 150, 200, 250, 300 o 350 aminoácidos contiguos, y más deseablemente la secuencia de aminoácidos de longitud completa.

Por "paciente" se entiende un animal humano o no humano (por ejemplo, un mamífero).

Por "tratar" una enfermedad, trastorno o afección (por ejemplo, un cáncer) en un paciente se entiende reducir al menos un síntoma de la enfermedad, trastorno o afección mediante la administración de un agente terapéutico al paciente. Por "cáncer" se entiende una colección de células que se multiplican de manera anómala.

Otras realizaciones y detalles de la invención se presentan a continuación en el presente documento.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1A es un dibujo esquemático de una molécula de anti-PD-L1/trampa de TGFp que comprende un anticuerpo anti-PD-L1 fusionado a dos dominios extracelulares (DEC) del receptor II de TGFp a través de un enlazador (Gly4Ser)4Gly. La FIG. 1B es una fotografía de un análisis de electroforesis en gel de poliacrilamidadodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) de la anti-PD-L1/trampa de TGFp en condiciones reductoras y no reductoras. La FIG. 2 es una fotografía de un gel SDS-PAGE que muestra el análisis del grado de recorte de la anti-PD-L1/trampa de TGFp expresada por el clon 02B15 a varios niveles de duplicación de la población. La anti-PD-L1/trampa de TGFp del clon 02B15 después de una única etapa de cromatografía de proteína A se analizó mediante SDS-PAGe en condiciones reductoras. Carriles 1 y 10, véase el PM estándar Blue Plus 2; carril 2, referencia de anti-PD-L1/trampa de TGFp purificada; carril 3, clon 02B15 a PDL0; carril 4, clon 02B15 a PDL30; carril 5, clon 02B15 a PDL60; y carril 6, clon 02B15 a PDL90. (PDL, nivel de duplicación de la población).

La FIG. 3 es un gráfico que muestra el análisis FACS de la unión de la anti-PD-L1/trampa de TGFp a células HEK transfectadas para expresar PD-L1 humano.

La FIG. 4 es un gráfico que muestra la capacidad de la anti-PD-L1/trampa de TGFp para inhibir la fosforilación inducida por TGFp de SMAD3 utilizando una línea celular indicadora de pSMAD3-luciferasa (círculo relleno: anti-PD-L1; X: anti-PD-L1(mut); cuadrado relleno: anti-PD-L1/trampa de TGFp; triángulo relleno: anti-PD-L1 (mut)/trampa de TGFp; : anticuerpo anti-TGFp 1D11; estrella: TGFp RII-Fc).

Las FIG. 5A y 5B son gráficos que muestran la farmacocinética de la anti-PD-L1/trampa de TGFp administrada por vía intravenosa y proteínas relacionadas en ratones.

La FIG. 6A es un gráfico que muestra la endocitosis mediada por diana de PD-L1 de la anti-PD-L1/trampa de TGFp. La FIG. 6B es un gráfico que muestra la endocitosis de anti-PD-L1 mediada por diana de PD-L1. La FIG.

6C es un gráfico que muestra el porcentaje de internalización de anti-PD-L1/trampa de TGFp y anti-PD-L1 unido en células HEK/PD-L1.

Las FIG. 7A-7C son gráficos que muestran la eficacia antitumoral de la anti-PD-L1/trampa de TGFp y proteínas relacionadas en el modelo subcutáneo de carcinoma de mama EMT-6 (Ejemplo 7). La FIG. 7A muestra las curvas de crecimiento tumoral de los volúmenes tumorales promedio de los ratones supervivientes en diferentes grupos de tratamiento (estrella: Grupo 1: círculo relleno: Grupo 2; triángulo relleno: Grupo 3; cuadrado relleno: Grupo 4; cuadrado blanco: Grupo 5; cuadrado relleno/línea discontinua: Grupo 6; cuadrado relleno/línea punteada: Grupo 7). La FIG. 7B muestra las curvas de crecimiento tumoral de los volúmenes tumorales individuales en diferentes grupos de tratamiento. La FIG. 7C es un gráfico de Kaplan-Meier del porcentaje de supervivencia en diferentes grupos de tratamiento (símbolos como en 7A).

La FIG. 8 es un gráfico que muestra la eficacia antitumoral de la anti-PD-L1/trampa de TGFp y proteínas relacionadas en el modelo de tumor subcutáneo de carcinoma colorrectal MC38 (Ejemplo 8; estrella: Grupo 1; círculo relleno: Grupo 2; círculo relleno/línea discontinua: Grupo 3; triángulo relleno: Grupo 4; triángulo relleno/línea discontinua: Grupo 5; cuadrado relleno: Grupo 6; cuadrado relleno/línea discontinua: Grupo 7).

La FIG. 9 es un gráfico que muestra la eficacia antitumoral de la anti-PDL1/trampa de TGFp y proteínas relacionadas en un modelo de cáncer de mama EMT-6 ortotópico (Ejemplo 9; estrella: Grupo 1; círculo relleno/línea discontinua: Grupo 2; triángulo relleno: Grupo 3; triángulo relleno/línea discontinua: Grupo 4; diamante relleno: Grupo 5).

La FIG. 10 es un gráfico que muestra la eficacia antitumoral de la anti-PDLI/trampa de TGFp y proteínas relacionadas en un modelo de carcinoma colorrectal MC38 intramuscular (Ejemplo 10; estrella: Grupo 1; círculo relleno: Grupo 2; círculo relleno/línea discontinua: Grupo 3: diamante relleno/línea discontinua: Grupo 4; cuadrado relleno: Grupo 5; cuadrado relleno/línea discontinua: Grupo 6; diamante relleno: Grupo 7).

La Figura 11 es un gráfico que muestra la eficacia antitumoral de la anti-PD-LI/trampa de TGFp y la combinación de control de anti-PD-LI y trampa de TGFp de control administrada para dar una exposición in vivo en un modelo de tumor de mama EMT-6 ortotópico (Ejemplo 11; estrella: Grupo 1; cuadrado relleno: Grupo 2; cuadrado blanco: Grupo 3; diamante relleno: Grupo 4; diamante blanco: Grupo 5).

Las FIG. 12A-12C son gráficos que muestran la eficacia antitumoral de la anti-PD-L1/trampa de TGF-p y la combinación de anti-PD-L1 y trampa de TGFp de control administrada para dar una exposición equivalente in vivo en un modelo de carcinoma colorrectal MC38 intramuscular (Ejemplo 12). La FIG. 12A muestra las curvas de crecimiento tumoral de ratones tratados con dosis intermedias y bajas de las proteínas (estrella: Grupo 1; cuadrados rellenos: Grupo 2; cuadrados blancos: Grupo 3; diamantes rellenos: Grupo 4; diamantes blancos Grupo 5). FIG. 12B (estrella: Grupo 1; cuadrado relleno: Grupo 2; diamante relleno: Grupo 4; *: p <0,0001 en comparación con el Grupo 1; **: p <0,0001 en comparación con el Grupo 2) y 12C (estrella: Grupo 1; cuadrado relleno: Grupo 3; diamante relleno: Grupo 5; *: p <0,0001 en comparación con el Grupo 1; **: p <0,0001 en comparación con el Grupo 3) muestran un análisis estadístico de las curvas de crecimiento tumoral de ratones tratados con dosis intermedias y bajas de las proteínas, respectivamente

Las FIG. 13A-13B son gráficos que muestran la eficacia antitumoral de la anti-PD-L1 (YW)/trampa de TGF-p y proteínas relacionadas en un modelo de tumor de mama EMT-6 ortotópico (Ejemplo 13; estrella: Grupo 1; círculo relleno: Grupo 2; triángulo relleno: Grupo 3; cuadrado relleno: Grupo 4; diamante relleno: Grupo 5). La FIG. 13A muestra curvas de crecimiento tumoral de ratones en diferentes grupos de tratamiento. La FIG. 13B es un gráfico de Kaplan-Meier del porcentaje de supervivencia en diferentes grupos de tratamiento.

Las FIG. 14A-14B son gráficos que muestran la eficacia antitumoral de la anti-PD-L1 (YW)/trampa de TGF-p y proteínas relacionadas basadas en (A) los volúmenes tumorales y (B) los pesos tumorales, en un modelo de carcinoma colorrectal MC38 intramuscular (Ejemplo 14; estrella: Grupo 1; círculo relleno: Grupo 2; triángulo relleno: Grupo 3; cuadrado relleno: Grupo 4; diamante relleno: Grupo 5).

La FIG. 15 es un gráfico que compara la eficacia antitumoral de un tratamiento con anticuerpo anti-PD-1 con y sin trampa de TGFp de control en un modelo de tumor de mama EMT-6 ortotópico (Ejemplo 15; estrella: Grupo 1; cuadrado relleno: Grupo 2; triángulo invertido relleno: Grupo 3; triángulo invertido blanco: Grupo 4).

La FIG. 16 es un gráfico que compara la eficacia antitumoral de un tratamiento con anticuerpo anti-PD-1 con y sin trampa de TGFp de control en un modelo de tumor colorrectal MC38 intramuscular (Ejemplo 16; estrella: Grupo 1; cuadrado relleno: Grupo 2; triángulo invertido relleno: Grupo 3; triángulo invertido blanco: Grupo 4).

La FIG. 17 es un gráfico que compara la eficacia antitumoral de un tratamiento con anticuerpos anti-LAG3 o anti-TIM3 con y sin trampa de TGFp de control en un modelo de tumor de mama EMT-6 ortotópico (Ejemplo 17; estrella: Grupo 1; cuadrado relleno: Grupo 2; triángulo relleno: Grupo 3; triángulo invertido relleno: Grupo 4; triángulos blancos: Grupo 5; triángulo invertido blanco: Grupo 6).

La FIG. 18 es un gráfico que compara la eficacia antitumoral de un tratamiento con anticuerpos anti-LAG3 o anti-TIM3 con y sin trampa de TGFp de control en un modelo de tumor colorrectal MC38 intramuscular (Ejemplo 18; estrella: Grupo 1; cuadrado relleno: Grupo 2; triángulo relleno: Grupo 3; triángulo invertido relleno: Grupo 4; triángulos blancos: Grupo 5; triángulo invertido blanco: Grupo 6).

Descripción detallada

La divulgación actual permite la reducción localizada de TGFp en un microambiente tumoral capturando el TGFp usando un receptor de citocina soluble (TGFpRIl) anclado a un resto de anticuerpo dirigido a un receptor de punto de control inmunitario celular que se encuentra en la superficie exterior de ciertas células tumorales o células inmunitarias. Un ejemplo de un resto de anticuerpo de la divulgación para una proteína de punto de control inmunitario es anti-PD-L1. Esta molécula bifuncional, a veces citada en el presente documento como una "trampa de anticuerpos-citocinas", es eficaz precisamente porque el anticuerpo anti-receptor y la trampa de citocinas están físicamente unidos. La ventaja resultante (sobre, por ejemplo, administración del anticuerpo y el receptor como moléculas separadas) se debe en parte a que las citocinas funcionan predominantemente en el entorno local a través de funciones autocrinas y paracrinas. El resto del anticuerpo dirige la trampa de citocinas al microambiente del tumor donde puede ser más eficaz, neutralizando los efectos inmunosupresores locales autocrinos o paracrinos. Además, en los casos en los que la diana del anticuerpo se internaliza tras la unión del anticuerpo, se proporciona un mecanismo eficaz para la eliminación del complejo citocina/receptor de citocina. Se ha demostrado la internalización de la diana mediada por anticuerpos para PD-L1. Esta es una clara ventaja sobre el uso de un anticuerpo anti-TGFp porque primero, un anticuerpo anti-TGFp podría no ser completamente neutralizante; y en segundo lugar, el anticuerpo puede actuar como un vehículo prolongando la vida media de la citocina, y los complejos de anticuerpo/citocina a menudo actúan como un sumidero en circulación que se acumula y finalmente se disocia para liberar la citocina de regreso a la circulación (Montero-Julian et al., Blood. 1995; 85:917-24). El uso de una trampa de citocinas para neutralizar el ligando también puede ser una mejor estrategia que bloquear el receptor con un anticuerpo, como en el caso de CSF-1. Debido a que el CSF-1 se elimina de la circulación por endocitosis mediada por receptores, un bloqueo de anticuerpos anti receptor de CSF-1 provocó un aumento significativo en la concentración de CSF-1 en circulación (Hume et al, Blood.

2012;119:1810-20)

De hecho, tal como se describe a continuación, el tratamiento con anti-PD-L1/ trampa de TGFp provoca un efecto antitumoral sinérgico debido al bloqueo simultáneo de la interacción entre PD-L1 en las células tumorales y PD-1 en las células inmunes, y la neutralización de TGFp en el microambiente tumoral. Tal como se demuestra en los siguientes ejemplos, el anti-PDL1/trampa de TGFp tiene una eficacia superior a la del control de la anti-PD-L1 o trampa de TGFp como agente único. Sin quedar limitados por la teoría, esto presumiblemente se debe a un efecto sinérgico obtenido del bloqueo simultáneo de los dos principales mecanismos de escape inmunitario y, además, el agotamiento dirigido del TGFp en el microambiente tumoral por una sola entidad molecular. Este agotamiento se logra mediante (1) el direccionamiento anti-PD-L1 de las células tumorales; (2) la unión del TGFp autocrino/paracrino en el microambiente tumoral por la Trampa de TGFp; y (3) destrucción del TGFp unido a través de la endocitosis mediada por el receptor PD-L1. Los mecanismos de acción mencionados anteriormente no se pueden lograr mediante la terapia de combinación de los dos agentes únicos anti-PD-L1 y trampa de TGFp. Además, el TGFpRIl fusionado al extremo C-terminal de Fc (fragmento de cristalización de IgG) fue varias veces más potente que el TGFpRII-Fc que coloca al TGFpRIl en el extremo N-terminal de Fc (véase el Ejemplo 3). La excelente eficacia obtenida con anti-pDL1/trampa de TGFp también disipa algunas preocupaciones de que el TGFpRIl no atrapa al TGFp2. Como señalaron Yang et al, Trends Immunol. 2010; 31:220-227, aunque algunos tipos de tumores secretan TGFp2 inicialmente, a medida que avanza el tumor, el TGFp en el microambiente tumoral es secretado predominantemente por células supresoras derivadas del mieloide, que secretan TGFp1. Además de ser muy prometedor como agente terapéutico inmunooncológico eficaz, el tratamiento con TGFpRIl soluble puede reducir potencialmente los problemas de cardiotoxicidad de las terapias dirigidas al TGFp, especialmente los inhibidores de la cinasa TGFpRI. Esto se debe al importante papel que juega el TGFp2 en el desarrollo embrionario del corazón, así como en la reparación del daño miocárdico después de una lesión por isquemia y reperfusión (Roberts et al, J Clin Invest. 1992; 90:2056-62).

TGFp como diana del cáncer

El TGFp había sido una diana algo cuestionable en la inmunoterapia contra el cáncer debido a sus papeles paradójicos como Jekyll y Hyde moleculares del cáncer (Bierie et al., Nat Rev Cancer. 2006; 6:506-20). Como algunas otras citocinas, la actividad de TGFp depende de la etapa de desarrollo y del contexto. De hecho, el TGFp puede actuar como promotor de tumores o supresor de tumores, afectando a la iniciación del tumor, a la progresión y a la metástasis. Los mecanismos que subyacen a esta función doble del TGFp siguen sin estar claros (Yang et al., Trends Immunol.

2010; 31:220-227). Aunque se ha postulado que la señalización dependiente de Smad media la inhibición del crecimiento de la señalización de TGFp, mientras que las vías independientes de Smad contribuyen a su efecto promotor de tumores, también hay datos que muestran que las vías dependientes de Smad están implicadas en la progresión tumoral (Yang et al, Cancer Res. 2008; 68:9107-11).

Tanto el ligando de TGFp como el receptor se han estudiado intensamente como dianas terapéuticas. Hay tres isoformas de ligando, TGFp1, 2 y 3, todas las cuales existen como homodímeros. También hay tres receptores de TGFp (TGFpR), que se denominan TGFpR tipo I, II y III (López-Casillas et al, J Cell Biol. 1994; 124:557-68). TGFpRI es la cadena de señalización y no puede unirse al ligando. TGFpRII se une al ligando TGFp1 y 3, pero no a TGFp2, con alta afinidad. El complejo TGFpRII/TGFp recluta TGFpRI para formar el complejo de señalización (Won et al., Cancer Res. 1999; 59:1273-7). TGFpRIII es un regulador positivo de la unión de TGFp a sus receptores de señalización y une las 3 isoformas de TGFp con alta afinidad. En la superficie celular, el complejo TGFp/TGFpRIII se une a TGFpRII y luego recluta TGFpRI, que desplaza a TGFpRIII para formar el complejo de señalización.

Aunque las tres isoformas de TGFp diferentes envían señales a través del mismo receptor, se sabe que tienen patrones de expresión diferencial y funciones que no se superponen in vivo. Los tres ratones con inactivación de la isoforma de TGF-p diferentes tienen fenotipos distintos, lo que indica numerosas funciones no compensadas (Bujak et al., Cardiovasc Res. 2007; 74:184-95). Mientras que los ratones sin TGFp1 tienen defectos de hematopoyesis y vasculogénesis y los ratones sin TGFp3 muestran desarrollo pulmonar y palatogénesis defectuosa, los ratones sin TGFp2 muestran diversas anomalías del desarrollo, siendo las más prominentes, las deformidades cardíacas múltiples (Bartram et al., Circulation. 2001; 103:2745-52; Yamagishi et al, Anat Rec. 2012; 295:257-67). Además, El TGFp está implicado para desempeñar un papel importante en la reparación del daño miocárdico después de la lesión por isquemia y reperfusión. En un corazón adulto, los cardiomiocitos secretan TGFp, que actúa como un autocrino para mantener la frecuencia de latidos espontáneos. Notablemente, el 70-85 % del TGFp secretado por cardiomiocitos es TGFp2 (Roberts et al., J Clin Invest. 1992; 90:2056-62). En resumen, dados los roles predominantes de TGFp1 y TGFp2 en el microambiente tumoral y la fisiología cardíaca, respectivamente, un agente terapéutico que neutraliza TGFp1 pero no TGFp2 podría proporcionar un índice terapéutico óptimo minimizando la cardiotoxicidad sin comprometer la actividad antitumoral. Esto es consistente con los hallazgos de los presentes inventores, que observaron una falta de toxicidad, incluyendo cardiotoxicidad, para anti-PD-LI/trampa de TGFp en monos.

Los enfoques terapéuticos para neutralizar TGFp incluyen el uso de los dominios extracelulares de los receptores de TGFp como trampas de receptores solubles y anticuerpos neutralizantes. Del enfoque de la trampa del receptor, el TGFpRIII soluble puede parecer la opción obvia ya que se une a los tres ligandos de TGFp. Sin embargo, TGFpRIII, que se produce naturalmente como glucosaminoglicano (GAG)-glucoproteína de 280-330 kD, con dominio extracelular de 762 restos de aminoácidos, es una proteína muy compleja para el desarrollo bioterapéutico. El TGFpRIII soluble desprovisto de GAG podría producirse en células de insectos y se demostró que es un potente agente neutralizante de TGFp (Vilchis-Landeros et al, Biochem J 355:215, 2001). Los dos dominios de unión separados (el relacionado con la endoglina y el relacionado con la uromodulina) de TGFpRIII podrían expresarse de forma independiente, pero se demostró que tenían afinidades de 20 a 100 veces menores que las del TGFpRIII soluble y una actividad neutralizante muy disminuida (Mendoza et al., Biochemistry. 2009; 48:11755-65). Por otra parte, el dominio extracelular de TGFpRII tiene solo 136 restos de aminoácidos de longitud y se puede producir como una proteína glucosilada de 25-35 kD. Se demostró además que el TGFpRII soluble recombinante se une al TGFp1 con una Kd de 200 pM, que es bastante similar a la Kd de 50 pM para el TGFpRII de longitud completa en las células (Lin et al., J Biol Chem. 1995; 270:2747-54). Se probó el TGFpRII-Fc soluble como agente anticanceroso y se demostró que inhibe el crecimiento de mesotelioma maligna murina establecido en un modelo tumoral (Suzuki et al., Clin Cancer Res. 2004; 10:5907-18). Dado que TGFpRII no se une a TGFp2, y TGFpRIII se une a TGFp1 y 3 con menor afinidad que TGFpRII, se produjo una proteína de fusión del dominio de endoglina de TGFpRIII y el dominio extracelular de TGFpRII en bacterias y se demostró que inhibe la señalización de TGFp1 y 2 en ensayos basados en células de manera más eficaz que TGFpRII o RIII (Verona et al., Protein Eng Des Sel. 2008; 21:463-73). A pesar de algunas actividades antitumorales alentadoras en modelos tumorales, hasta donde saben los presentes inventores, no se ha probado en la clínica ninguna proteína recombinante de trampa de receptor de TGFp.

Otro enfoque más para neutralizar las tres isoformas de los ligandos de TGFp es seleccionar un anticuerpo anti-TGFp panneutralizante, o un anticuerpo anti-receptor que bloquea la unión del receptor a TGFp1, 2 y 3. GC1008, un anticuerpo humano específico para todas las isoformas de TGFp, estaba en un estudio de fase I/II en pacientes con melanoma maligno avanzado o carcinoma de células renales (Morris et al., J Clin Oncol 2008; 26:9028 (Resumen de reunión)). Aunque se descubrió que el tratamiento era seguro y bien tolerado, solo se observó una eficacia clínica limitada y, por lo tanto, fue difícil interpretar la importancia de la terapia anti-TGFp sin una caracterización adicional de los efectos inmunológicos (Flavell et al., Nat Rev Immunol. 2010; 10:554-67). También se probaron en la clínica anticuerpos específicos de isoforma de TGFp. Metelimumab, un anticuerpo específico para TGFp1, se probó en un ensayo clínico de fase 2 como tratamiento para prevenir la cicatrización posoperatoria excesiva de la cirugía de glaucoma; y Lerdelimumab, un anticuerpo específico para TGFp2, se descubrió que era seguro pero ineficaz para mejorar las cicatrices después de la cirugía ocular en un estudio de fase 3 (Khaw et al., Ophthalmology 2007; 114:1822-1830). Los anticuerpos anti-TGFpRII que bloquean la unión del receptor a las tres isoformas de TGFp, tales como el anticuerpo anti-TGFpRII humano TR1 y el anticuerpo anti-TGFpRII de ratón MT1, también han demostrado cierta eficacia terapéutica contra el crecimiento de tumores primarios y la metástasis en modelos de ratón (Zhong et al., Clin Cancer Res. 2010; 16:1191-205). Hasta la fecha, la gran mayoría de los estudios sobre el tratamiento contra el cáncer dirigido a TGFp, incluidos los inhibidores de moléculas pequeñas de la señalización de TGFp que a menudo son bastante tóxicos, se encuentran mayoritariamente en fase preclínica y la eficacia antitumoral obtenida ha sido limitada (Calone et al., Exp Oncol. 2012; 34:9-16; Connolly et al, Int J Biol Sci. 2012; 8:964-78).

El anticuerpo-trampa de TGFp de la divulgación es una proteína bifuncional que contiene al menos una porción de un Receptor II de TGFp humano (TGFpRII) que es capaz de unirse a TGFp. En alguna divulgación, el polipéptido de trampa de TGFp es una porción soluble de la isoforma A del receptor de TGFp de tipo 2 humano (SEQ ID NO: 8) que es capaz de unirse a TGFp. En mayor divulgación, el polipéptido de trampa de TGFp contiene al menos los aminoácidos 73-184 del SEQ ID NO: 8. En una divulgación adicional, el polipéptido de trampa de TGFp contiene los aminoácidos 24-184 del SEQ ID NO: 8. En otra divulgación, el polipéptido de trampa de TGFp es una porción soluble de la isoforma B del receptor de TGFp de tipo 2 humano (SEQ ID NO: 9) que es capaz de unirse a TGFp. En mayor divulgación, el polipéptido de trampa de TGFp contiene al menos los aminoácidos 48-159 del SEQ ID NO: 9. En una divulgación adicional, el polipéptido de trampa de TGFp contiene los aminoácidos 24-159 del SEQ ID NO: 9. En una divulgación adicional, el polipéptido de trampa de TGFp contiene los aminoácidos 24-105 del SEQ ID NO: 9.

Desinhibición del punto de control inmunitario

El enfoque del direccionamiento de los puntos de control de inhibición de linfocitos T para la desinhibición con anticuerpos terapéuticos es un área de intensa investigación (para una revisión, véase Pardoll, Nat Rev Cancer. 2012; 12:253-264). En un enfoque, el resto de anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno se dirige a las proteínas receptoras del punto de control de inhibición de linfocitos T en el linfocito T, tal como, por ejemplo: CTLA-4, PD-1, BTLA, LAG-3, T iM-3 y LAIR1. En otro enfoque, el resto del anticuerpo se dirige a los contrarreceptores de las células presentadoras de antígenos y las células tumorales (que cooptan algunos de estos contrarreceptores para su propia evasión inmunitaria), tal como, por ejemplo: PD-L1 (B7-H1), B7-DC, HVEM, TIM-4, B7-H3 o B7-H4.

La divulgación contempla anticuerpo - trampa de TGFp que se dirige a, a través de su resto de anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, puntos de control de inhibición de linfocitos T para la desinhibición. Con ese fin, los presentes inventores han probado la eficacia antitumoral de combinar una trampa de TGFp con anticuerpos dirigidos a diversas proteínas receptoras del punto de control de inhibición de linfocitos T, tal como anti-PD-1, anti-PD-LI, anti-TIM-3 y anti-LAG3. Los resultados experimentales se detallan más en los Ejemplos 7-18. Los presentes inventores descubrieron que la combinación de una trampa de TGFp con un anticuerpo anti-PD-LI presentaba una actividad antitumoral notable más allá de lo observado con las monoterapias. En cambio, ninguna de las otras combinaciones con anticuerpos contra las dianas enumeradas anteriormente mostró una eficacia superior. En particular, uno podría haber esperado que un tratamiento combinado de una trampa de TGFp con un anticuerpo anti-PD-1 demostraría una actividad similar a la observada con anti-PD-LI, ya que PD-1/PD-L1 son receptores afines que se unen entre sí para efectuar la inhibición del punto de control inmunitario. Sin embargo, esto no es lo que han descubierto los presentes inventores.

Anticuerpos anti-PD-L1

La divulgación puede incluir cualquier anticuerpo anti-PD-LI, o fragmento de unión a antígeno del mismo, descrito en la materia. Los anticuerpos anti-PD-LI están disponibles comercialmente, por ejemplo, el anticuerpo 29E2A3 (Biolegend, N.° de Cat. 329701). Los anticuerpos pueden ser monoclonales, quiméricos, humanizado o humano. Los fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, F(ab')2, fragmentos scFv y Fv, que se describen con más detalle a continuación.

Anticuerpos ilustrativos se describen en la publicación PCT WO 2013/079174. Estos anticuerpos pueden incluir un polipéptido de región variable de cadena pesada que incluye una secuencia HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, en donde: (a) la secuencia HVR-H1 es X1YX2MX3;

(b) la secuencia HVR-H2 es SIYPSGGX4TFYADX5VKG;

(c) la secuencia HVR-H3 es IKLGTVTTVXgY;

donde además: X1 es K, R, T, Q, G, A, W, M, I o S; X2 es V, R, K, L, M o I; X3 es H, T, N, Q, A, V, Y, W, F o M; X4 es F o I; X5 es S o T; X6 es E o D.

En alguna divulgación, X1 es M, I o S; X2 es R, K, L, M o I; X3 es F o M; X4 es F o I; X5 es S o T; X6 es E o D.

En otra divulgación X1 es M, I o S; X2 es L, M o I; X3 es F o M; X4 es I; X5 es S o T; X6 es D.

En otra divulgación más, X1 es S; X2 es I; X3 es M; X4 es I; X5 es T; X6 es D.

En otra divulgación, el polipéptido incluye además secuencias marco de cadena pesada de región variable yuxtapuestas entre los HVR de acuerdo con la fórmula: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4).

En otra divulgación más, las secuencias marco derivan de secuencias marco consenso humanas o secuencias marco de la línea germinal humana.

En aún otra divulgación más, al menos una de las secuencias marco es la siguiente:

HC-FR1 es EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS;

HC-FR2 es WVRQAPGKGLEWVS;

HC-FR3 es RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR;

HC-FR4 es WGQGTLVTVSS.

En aún otra divulgación más, el polipéptido de cadena pesada se combina además con una cadena ligera de región variable que incluye una HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3, en donde:

(a) la secuencia de HVR-L1 es TGTXyXaDVGXgYNYVS;

(b) la secuencia de HVR-L2 es X10VX11X12RPS;

(c) la secuencia de HVR-L3 es SSX13TX14X15X16X17RV;

donde además: X7 es N o S; Xa es T, R o S; Xg es A o G; X10 es E o D; X11 es I, N o S; X12 es D, H o N; X13 es F o Y; X14 es N o S; X15 es R, T o S; X16 es G o S; X17 es I o T.

En otra divulgación, X7 es N o S; X⁸es T, R o S; Xg es A o G; X10 es E o D; X11 es N o S; X12 es N; X13 es F o Y; X14 es S; X15 es S; X16 es G o S; X17 es T.

En otra divulgación más, X7 es S; X⁸es S; Xg es G; X10 es D; X11 es S; X12 es N; X13 es Y; X14 es S; X15 es S; X16 es S; X17 es T.

En aún otra divulgación más, la cadena ligera incluye además secuencias marco de cadena ligera de región variable yuxtapuestas entre los HVR de acuerdo con la fórmula: (LC-FR1MHVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4).

En aún otra divulgación más, las secuencias marco de cadena ligera derivan de secuencias marco consenso humanas o secuencias marco de la línea germinal humana.

En aún otra divulgación más, las secuencias marco de cadena ligera son secuencias de cadena ligera lambda. En aún otra divulgación más, al menos una de las secuencias marco es la siguiente:

LC-FR1 es QSALTQPASVSGSPGQSITISC;

LC-FR2 es WYQQHPGKAPKLMIY;

LC-FR3 es GVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC;

LC-FR4 es FGTGTKVTVL.

Otra divulgación proporciona un anticuerpo anti-PD-L1 o un fragmento de unión a antígeno que incluye una secuencia de región variable de cadena pesada y cadena ligera, en donde:

(a) la cadena pesada incluye una HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, donde, además: (i) la secuencia de HVR-H1 es X1YX2MX3; (ii) la secuencia de HVR-H2 es SIYPSGGX4TFYADX5VKG; (iii) la secuencia de HVR-H3 es IKLGTVTTVXgY, y;

(b) la cadena ligera incluye una HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3, donde, además: (iv) la secuencia de HVR-L1 es TGTX7X8DVGX9YNYVS; (v) la secuencia de HVR-L2 es X10VX11X12RPS; (vi) la secuencia de HVR-L3 es SSX13TX14X15X16X17RV; en donde: X1 es K, R, T, Q, G, A, W, M, I o S; X2 es V, R, K, L, M o I; X3 es H, T, N, Q, A, V, Y, W, F o M; X4 es F o I; X5 es S o T; X⁶es E o D; X7 es N o S; Xa es T, R o S; Xg es A o G; X10 es E o D; X11 es I, N o S; X12 es D, H o N; X13 es F o Y; X14 es N o S; X15 es R, T o S; X16 es G o S; X17 es I o T.

En alguna divulgación, X1 es M, I o S; X2 es R, K, L, M o I; X3 es F o M; X4 es F o I; X5 es S o T; X⁶es E o D; X7 es N o S; Xa es T, R o S; Xg es A o G; X10 es E o D; X11 es N o S; X12 es N; X13 es F o Y; X14 es S; X15 es S; X16 es G o S; X17 es T.

En otra divulgación, X1 es M, I o S; X2 es L, M o I; X3 es F o M; X4 es I; X5 es S o T; X⁶es D; X7 es N o S; Xa es T, R o S; Xg es A o G; X10 es E o D; X11 es N o S; X12 es N; X13 es F o Y; X14 es S; X15 es S; X16 es G o S; X17 es T.

En otra divulgación más, X1 es S; X2 es I; X3 es M; X4 es I; X5 es T; X⁶es D; X7 es S; Xa es S; Xg es G; X10 es D; X11 es S; X12 es N; X13 es Y; X14 es S; X15 es S; X16 es S; X17 es T.

En mayor divulgación, la región variable de cadena pesada incluye una o más secuencias marco yuxtapuestas entre las HVR como: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4) y las regiones variables de cadena ligera incluyen una o más secuencias marco yuxtapuestas entre las HVR como: (LC-FR1 MHVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4).

En aún otra divulgación más, las secuencias marco derivan de secuencias marco consenso humanas o secuencias de la línea germinal humana.

En aún otra divulgación más, una o más de las secuencias del marco de la cadena pesada es la siguiente:

HC-FR1 es EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS;

HC-FR2 es WVRQAPGKGLEWVS;

HC-FR3 es RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR;

HC-FR4 es WGQGTLVTVSS.

En aún otra divulgación más, las secuencias marco de cadena ligera son secuencias de cadena ligera lambda. En aún otra divulgación más, una o más de las secuencias del marco de la cadena ligera es la siguiente:

LC-FR1 es QSALTQPASVSGSPGQSITISC;

LC-FR2 es WYQQHPGKAPKLMIY;

LC-FR3 es GVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC;

LC-FR4 es FGTGTKVTVL.

En aún otra divulgación más, el polipéptido de la región variable de la cadena pesada, el anticuerpo, o el fragmento de anticuerpo incluye además al menos un dominio Ch1.

En una divulgación más específica, el polipéptido de la región variable de la cadena pesada, el anticuerpo, o el fragmento de anticuerpo además incluye un dominio Ch1, un Ch2 y un Ch3.

En aún otra divulgación más, la cadena ligera de la región variable, el anticuerpo, o el fragmento de anticuerpo además incluye un dominio Cl.

En aún otra divulgación más, el anticuerpo además incluye un dominio Ch1, un Ch2, un Ch3 y un Cl.

En una divulgación aún más específica, el anticuerpo incluye además una región constante humana o murina.

En aún otra divulgación más, la región constante humana se selecciona del grupo que consiste en IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4.

En una divulgación aún más específica, la región constante humana o murina es IgG1.

Otra divulgación presenta un anticuerpo anti-PD-L1 que incluye una secuencia de región variable de cadena pesada y cadena ligera, en donde:

(a) la cadena pesada incluye una HVR-H1, un HVR-H2 y un HVR-H3, que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia total con SYIMM, SIYPSGGITFYADTVKG, e IKLGTVTTVDY, respectivamente, y

(b) la cadena ligera incluye una HVR-L1, un HVR-L2 y un HVR-L3, que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia total con TGTSSDVGGYNYVS, DVSNRPS y SSYTSSSTRV, respectivamente.

La identidad de secuencia puede ser del 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %.

(a) la cadena pesada incluye una HVR-H1, un HVR-H2 y un HVR-H3, que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia total con MYMMM, SIYPSGGITFYADSVKG e IKLGTVTTVDY, respectivamente, y

(b) la cadena ligera incluye una HVR-L1, un HVR-L2 y un HVR-L3, que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia total con TGTSSDVGAYNYVS, DVSNRPS y SSYTSSSTRV, respectivamente.

En aún otra divulgación más, en el anticuerpo o fragmento de anticuerpo según la invención, en comparación con las secuencias de HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, al menos los aminoácidos permanecen sin cambios que se destacan subrayando lo siguiente:

(a) en HVR-H1 SYIMM,

(b) en HVR-H2 SIYPSGGITFYAPTVKG,

(c) en HVR-H3 IKLGTVTTVDY;

y además, donde, en comparación con las secuencias de HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3, al menos los aminoácidos permanecen sin cambios que se destacan subrayando lo siguiente:

(a) HVR-L1 TGTSSDVGGYNYVS

(b) HVR-L2 DVSNRPS

(c) HVR-L3 SSYTSSSTRV.

En otra divulgación, la región variable de cadena pesada incluye una o más secuencias marco yuxtapuestas entre las HVR como: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4) y las regiones variables de cadena ligera incluyen una o más secuencias marco yuxtapuestas entre las HVR como: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4).

En otra divulgación más, las secuencias marco provienen de secuencias de la línea germinal humana.

HC-FR1 es EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS;

HC-FR2 es WVRQAPGKGLEWVS;

HC-FR3 es RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR;

HC-FR4 es WGQGTLVTVSS.

En aún otra divulgación más, las secuencias marco de cadena ligera provienen de una secuencia de cadena ligera lambda.

En aún otra divulgación más, una o más de las secuencias del marco de la cadena ligera es la siguiente:

LC-FR1 es QSALTQPASVSGSPGQSITISC;

LC-FR2 es WYQQHPGKAPKLMIY;

LC-FR3 es GVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC;

LC-FR4 es FGTGTKVTVL.

En aún otra divulgación más, el anticuerpo incluye además una región constante humana o murina.

Aún otra divulgación más presenta un anticuerpo anti-PD-L1 que incluye una secuencia de región variable de cadena pesada y cadena ligera, en donde:

(a) la secuencia de cadena pesada tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la secuencia de cadena pesada:

EV QLLESGGGL V QPGGSLRLS C AASGFTF S S YIMMVWR Q APGKGLE WV S SI YP SGGITF

YADWKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVT

VSS.

y

(b) la secuencia de cadena ligera tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la secuencia de cadena ligera:

Q S A L T Q P A S V S G S P G Q S IT IS C T G T S S D V G G Y N Y V S W Y Q Q H P G K A P K L M IY D V S N

RP S G V SNRF S G S K S GN T A S L T IS G LQ A E D E A D Y Y C S S Y T S S ST R V F G T G T K V T V L .

divulgación La identidad de secuencia puede ser del 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %.

Aún otra divulgación más proporciona un anticuerpo anti-PD-L1 que incluye una secuencia de región variable de cadena pesada y cadena ligera, en donde:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSMYMMMWVRQAPGKGLEVWSSIYPSGGIT

FYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARIKLGTVTTVDYWG

QGTLVTVSS,

QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGAYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNR

PSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVL.

La identidad de secuencia puede ser del 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %.

En otra divulgación, el anticuerpo se une al PD-L1 humano, de ratón o de mono cinomolgo. En una divulgación específica, el anticuerpo es capaz de bloquear la interacción entre PD-L1 humano, de ratón o de mono cinomolgo y los respectivos receptores de PD-1 de humano, ratón o mono cinomolgo.

En otra divulgación, el anticuerpo se une a PD-L1 humano con una KD de 5x10-9 M o menos, preferentemente con una Kd de 2x10-9 M o menos, y aún más preferentemente con una Kd de 1x10-9 M o menos.

Aún otra divulgación se refiere a un anticuerpo anti-PD-L1 o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un epítopo funcional que incluye los restos Y56 y D61 de PD-L1 humano.

En una divulgación específica, el epítopo funcional incluye además E58, E60, Q66, R113 y M115 de PD-L1 humano. En una divulgación más específica, el anticuerpo se une a un epítopo conformacional, incluidos los restos 54-66 y 112 122 de PD-L1 humano.

La divulgación adicional está relacionada con un anticuerpo anti-PD-L1, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que compite de forma cruzada por unirse a PD-L1 con un anticuerpo de acuerdo con la divulgación.

La divulgación adicional presenta proteínas y polipéptidos que incluyen cualquiera de los anticuerpos anti-PD-L1 descritos anteriormente en combinación con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La divulgación adicional presenta un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido, o una secuencia de región variable de cadena ligera o cadena pesada de un anticuerpo anti-PD-L1, o fragmento de unión a antígeno del mismo, tal como se describe en el presente documento. Aún en otra divulgación más se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica una secuencia de región variable de cadena ligera o de cadena pesada de un anticuerpo anti-PD-L1, en donde:

(a) la cadena pesada incluye una HVR-H1, una secuencia HVR-H2 y HVR-H3 que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con SYIMM, SIYPSGGITFYADTVKG, e IKLGTVTTVDY, respectivamente, o

(b) la cadena ligera incluye una HVR-L1, una secuencia HVR-L2 y HVR-L3 que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con TGTSSDVGGYNYVS, DVSNRPS y SSYTSSSTRV, respectivamente.

En mayor divulgación, la secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada es:

atggagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgctag ctccagcgag 60 gtgcagctgc tggaatccgg cggaggactg gtgcagcctg gcggctccct gagactgtct 120 tgcgccgcct ccggcttcac cttctccagc tacatcatga tgtgggtgcg acaggcccct 180 ggcaagggcc tggaatgggt gtcctccatc tacccctccg gcggcatcac cttctacgcc 240 gacaccgtga agggccggtt caccatctcc cgggacaact ccaagaacac cctgtacctg 300 cagatgaact ccctgcgggc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gatcaagctg 360 ggcaccgtga ceaccgtgga ctactggggc cagggcaccc tggtgacagt gtcctccgcc 420

tccdtxaayg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480 acagcggtct tyggcigcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 720 tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccageac ctgaactcct ggggggaccg 780 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 840 gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 900 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 960 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1020 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcacg ggatgagctg 1140 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1200 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260 gactccgacg gctccttctt cctctatagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320 caggggaacg tcttctcatg etccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1380 aagagcctct ccctgtcccc gggtaaa 1407

y la secuencia de ácido nucleico de la cadena ligera es:

atggagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cttaagccag 60 tccgccctga cccagcctgc ctccgtgtct ggctcccctg gccagtccat caccatcagc 120 tgcaccggca cctccagcga cgtgggcggc tacaactacg tgtcctggta tcagcagcac 180 cccggcaagg cccccaagct gatgatctac gacgtgtcca accggccctc cggcgtgtcc 240 aacagattct ccggctccaa gtccggcaac accgcctccc tgaccatcag cggactgcag 300 gcagaggacg aggccgacta ctactgctcc tcctacacct cctccagcac cagagtgttc 360 ggcaccggca caaaagtgac cgtgctgggc cagcccaagg ccaacccaac cgtgacactg 420 ttccccecat cctccgagga actgcaggcc aacaaggcca ccctggtctg cctgatctca 480 gatttctatc caggcgccgt gaccgtggcc tggaaggctg atggctcccc agtgaaggcc 540 ggcgtggaaa ccaccaagcc ctccaagcag tccaacaaca aatacgccgc ctcctcctac 600 ctgtccctga cccccgagca gtggaagtcc caccggtcct acagctgcca ggtcacacac 660 gagggctcca ccgtggaaaa gaccgtcgcc cccaccgagt gctca 705 En la publicación de solicitud de patente de EE.UU. US 2010/0203056 se describen anticuerpos anti-PD-LI ilustrativos adicionales que se pueden usar en un anti-PD-L1/trampa de TGFp. En alguna divulgación del presente documento, el resto de anticuerpo es YW243.55S70. En otra divulgación, el resto de anticuerpo es MPDL3280A.

La divulgación adicional presenta un resto de anticuerpo anti-PD-LI que incluye una secuencia de región variable de cadena pesada y cadena ligera, en donde:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYY

ADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS

(SEQ ID NO: 12), y

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSG

SGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR

(SEQ ID NO: 13).

La identidad de secuencia puede ser del 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %.

La divulgación adicional presenta un resto de anticuerpo anti-PD-L1 que incluye una secuencia de región variable de cadena pesada y cadena ligera, en donde:

(a) la secuencia de la región variable de la cadena pesada es:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYY

ADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS

(SEQ ID NO: 12), y

(b) la secuencia de la región variable de la cadena ligera es:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSG

SGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR

(SEQ ID NO: 13).

La divulgación adicional presenta un resto de anticuerpo anti-PD-L1 que incluye una secuencia de región variable de cadena pesada y de cadena ligera, en donde:

(a) la secuencia de la región variable de la cadena pesada es:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSV

KGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSA

(SEQ ID NO: 14), y

(b) la secuencia de la región variable de la cadena ligera es:

(SEQ ID NO: 13).

Aún otros anticuerpos anti-PD-LI ilustrativos que se pueden usar en un anti-PD-LI/trampa de TGFp se describen en la publicación de patente de EE.UU. US 7.943.743.

En alguna divulgación, el anticuerpo anti-PD-L1 es MDX-1105.

En una divulgación adicional, el anticuerpo anti-PD-L1 es MEDI-4736.

Región constante

Las proteínas y péptidos de la divulgación pueden incluir una región constante de una inmunoglobulina o un fragmento, un análogo, una variante, un mutante o un derivado de la región constante. En la divulgación preferida del presente documento, la región constante se obtiene de una cadena pesada de inmunoglobulina humana, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 u otras clases. En alguna divulgación, la región constante incluye un dominio CH2. En otra divulgación, la región constante incluye dominios CH2 y CH3 o incluye bisagra-CH2-CH3. Como alternativa, la región constante puede incluir la totalidad o una parte de la región bisagra, del dominio CH2 y/o del dominio CH3.

En alguna divulgación, la región constante contiene una mutación que reduce la afinidad por un receptor Fc o reduce la función efectora de Fc. Por ejemplo, la región constante puede contener una mutación que elimina el sitio de glucosilación dentro de la región constante de una cadena pesada de IgG. En alguna divulgación del presente documento, la región constante contiene mutaciones, deleciones o inserciones en una posición de aminoácido correspondiente a Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Asn297 o Pro331 de IgG1 (los aminoácidos están numerados según la nomenclatura de la UE). En una divulgación particular, la región constante contiene una mutación en una posición de aminoácido correspondiente a Asn297 de IgG1. En la divulgación alternativa en el presente documento, la región constante contiene mutaciones, deleciones o inserciones en una posición de aminoácido correspondiente a Leu281, Leu282, Gly283, Gly284, Asn344, o Pro378 de IgG1.

En alguna divulgación del presente documento, la región constante contiene un dominio CH2 que proviene de una cadena pesada de IgG2 o IgG4 humana. Preferentemente, el dominio CH2 contiene una mutación que elimina el sitio de glucosilación de dentro del dominio CH2. En alguna divulgación, la mutación altera la asparagina dentro de la secuencia de aminoácidos Gln-Phe-Asn-Ser (SEQ ID NO: 15) dentro del dominio CH2 de la cadena pesada de IgG2 o IgG4. Preferentemente, la mutación cambia la asparagina a glutamina. Como alternativa, la mutación altera tanto la fenilalanina como la asparagina dentro de la secuencia de aminoácidos Gln-Phe-Asn-Ser (SEQ ID NO: 15). En alguna divulgación, la secuencia de aminoácidos Gln-Phe-Asn-Ser (SEQ ID NO: 15) se reemplaza por una secuencia de aminoácidos Gln-Ala-Gln-Ser (SEQ ID NO: 16). La asparagina dentro de la secuencia de aminoácidos Gln-Phe-Asn-Ser (SEQ ID NO: 15) se corresponde con Asn297 de IgG1.

En otra divulgación, la región constante incluye un dominio CH2 y al menos una parte de una región bisagra. La región bisagra puede derivarse de una cadena pesada de inmunoglobulina, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 u otras clases. Preferentemente, la región de la bisagra se obtiene de la IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 humana u otras clases adecuadas. Más preferentemente, la región bisagra se obtiene de una cadena pesada de IgG1 humana. En alguna divulgación, la cisteína en la secuencia de aminoácidos de Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys (SEQ ID NO: 17) de la región bisagra de IgG1 está alterada. En la descripción preferida, la secuencia de aminoácidos de Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys (SEQ ID NO: 17) se reemplaza con una secuencia de aminoácidos de Pro-Lys-Ser-Ser-Asp-Lys (SEQ ID NO: 18). En alguna divulgación, la región constante incluye un dominio CH2 derivado de un primer isotipo de anticuerpo y una región bisagra derivada de un segundo isotipo de anticuerpo. En una divulgación específica, el dominio CH2 se deriva de una cadena pesada de IgG2 o IgG4 humana, mientras que la región bisagra se deriva de una cadena pesada de IgG1 humana alterada.

La alteración de los aminoácidos cerca de la unión de la parte Fc y la parte no Fc puede aumentar espectacularmente la semivida en suero de la proteína de fusión Fc (publicación PCT WO 01/58957). Por consiguiente, la región de unión de una proteína o de un polipéptido de la presente divulgación puede contener alteraciones que, en relación con las secuencias naturales de una cadena pesada de inmunoglobulina y eritropoyetina, preferentemente, se encuentran dentro de aproximadamente 10 aminoácidos del punto de unión. Estos cambios de aminoácidos pueden causar un aumento en la hidrofobicidad. En alguna divulgación, la región constante se deriva de una secuencia de IgG en la que se reemplaza el resto de lisina C-terminal. Preferentemente, la lisina C-terminal de una secuencia de IgG se reemplaza por un aminoácido distinto de la lisina, tal como alanina o leucina, para aumentar aún más la semivida en suero. En otra divulgación, la región constante se obtiene de una secuencia de IgG en la que la secuencia de aminoácidos Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) cerca del extremo C-terminal de la región constante está alterada para eliminar posibles epítopos de linfocitos T de unión. Por ejemplo, en alguna divulgación, la secuencia de aminoácidos Leu-Ser-Leu-Ser se reemplaza con una secuencia de aminoácidos Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ ID NO: 20). En otra divulgación en el presente documento, los aminoácidos dentro del segmento Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) se reemplazan con otros aminoácidos tales como glicina o prolina. Los métodos detallados para generar sustituciones de aminoácidos del segmento Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) cerca del extremo C-terminal de una IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 u otra molécula de la clase de inmunoglobulinas, se han descrito en la publicación de patente de EE.UU. n.° 2003/0166877.

Las regiones de bisagra adecuadas para la presente divulgación se pueden obtener de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 y otras clases de inmunoglobulinas. La región bisagra de IgG1 tiene tres cisteínas, dos de los cuales participan en enlaces disulfuro entre las dos cadenas pesadas de la inmunoglobulina. Estas mismas cisteínas permiten la formación eficaz y consistente de enlaces disulfuro entre las partes Fc. Por lo tanto, una región de bisagra preferida de la presente invención se obtiene de IgG1, más preferentemente, de IgG1 humana. En alguna divulgación del presente documento, la primera cisteína de dentro de la región bisagra de IgG1 humana está mutada a otro aminoácido, preferentemente, a serina. La región bisagra del isotipo IgG2 tiene cuatro enlaces disulfuro que tienden a potenciar la oligomerización y posiblemente un enlace disulfuro incorrecto durante la secreción en sistemas recombinantes. Una región bisagra adecuada se puede derivar de una bisagra de IgG2; las dos primeras cisteínas están cada una preferentemente mutadas a otro aminoácido. Se sabe que la región bisagra de IgG4 forma enlaces disulfuro entre cadenas de manera ineficaz. Sin embargo, una región bisagra adecuada para la presente divulgación se puede obtener de la región de bisagra de IgG4, que contiene preferentemente una mutación que potencia la formación correcta de enlaces disulfuro entre restos derivados de la cadena pesada (Angal S., et al. (1993) Mol. Immunol., 30:105-8).

De conformidad con la presente divulgación, la región constante puede contener dominios CH2 y/o CH3 y una región bisagra que se derive de diferentes isotipos de anticuerpos, es decir, una región constante híbrida. Por ejemplo, en alguna divulgación, la región constante contiene dominios CH2 y/o CH3 derivados de IgG2 o IgG4 y una región bisagra mutante derivada de IgG1. Como alternativa, se usa una región bisagra mutante de otra subclase de IgG en una región constante híbrida. Por ejemplo, se puede usar una forma mutante de la bisagra de IgG4 que permita una unión disulfuro eficaz entre las dos cadenas pesadas. Una bisagra mutante también puede derivarse de una bisagra de IgG2 en la que las dos primeras cisteínas estén mutadas a otro aminoácido. El ensamblaje de dichas regiones constantes híbridas se ha descrito en la publicación de patente de EE.UU. n.° 2003/0044423.

De acuerdo con la divulgación, la región constante puede contener una o más mutaciones descritas en el presente documento. Las combinaciones de mutaciones en la porción Fc pueden tener efectos aditivos o sinérgicos sobre la semivida sérica prolongada y el aumento in vivo de la potencia de la molécula bifuncional. Por lo tanto, en una divulgación ilustrativa, la región constante puede contener (i) una región que proviene de una secuencia de IgG en la que la secuencia de aminoácidos Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) se reemplaza con una secuencia de aminoácidos Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ ID NO: 20); (ii) un resto de alanina en C-terminal en lugar de lisina; (iii) un dominio CH2 y una región de bisagra que se obtienen de diferentes isotipos de anticuerpos, por ejemplo, un dominio CH2 de IgG2 y una región de bisagra de IgG1 alterada; y (iv) una mutación que elimina el sitio de glucosilación dentro del dominio CH2 que proviene de IgG2, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos Gln-Ala-Gln-Ser (SEQ ID NO: 16) en lugar de la secuencia de aminoácidos Gln-Phe-Asn-Ser (SEQ ID NO: 15) dentro del dominio CH2 que proviene de IgG2.

Fragmentos de anticuerpo

Las proteínas y polipéptidos también pueden incluir fragmentos de anticuerpos de unión a antígenos. Los fragmentos de anticuerpos ilustrativos incluyen scFv, Fv, Fab, F(ab')2 y fragmentos VHH de dominio único, tal como los de origen camélido.

Los fragmentos de anticuerpos monocatenarios, también conocidos como anticuerpos monocatenarios (scFv), son polipéptidos recombinantes que normalmente se unen a antígenos o receptores; estos fragmentos contienen al menos un fragmento de una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable de anticuerpo (Vh) unido al menos a un fragmento de una secuencia de cadena ligera variable de anticuerpo (Vl) con o sin uno o más enlazadores de interconexión. Tal enlazador puede ser un péptido flexible y corto seleccionado para asegurar que el plegado tridimensional adecuado de los dominios Vl y Vh se produce una vez que se unen para mantener la especificidad de unión a la molécula diana del anticuerpo completo del que se obtiene el fragmento de anticuerpo monocatenario. Generalmente, el extremo carboxilo terminal de la secuencia de Vl o Vh está unida covalentemente por tal enlazador peptídico al extremo aminoacídico de una secuencia de Vl y Vh complementaria. Los fragmentos de anticuerpos monocatenarios se pueden generar mediante clonación molecular, biblioteca de presentación de anticuerpos en fagos o técnicas similares. Estas proteínas pueden producirse tanto en células eucariotas como en células procariotas, incluyendo bacterias.

Los fragmentos de anticuerpos de cadena sencilla contienen secuencias de aminoácidos que tienen al menos una de las regiones variables o CDR de los anticuerpos completos descritos en la presente memoria descriptiva, pero carecen de algunos o todos los dominios constantes de esos anticuerpos. Estos dominios constantes no son necesarios para la unión del antígeno, pero constituyen una parte importante de la estructura de los anticuerpos completos. Por lo tanto, los fragmentos de anticuerpos monocatenarios pueden superar algunos de los problemas asociados con el uso de anticuerpos que contienen parte o la totalidad de un dominio constante. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos monocatenarios tienden a estar libres de interacciones no deseadas entre moléculas biológicas y la región constante de cadena pesada, u otra actividad biológica no deseada. De manera adicional, los fragmentos de anticuerpos monocatenarios son considerablemente más pequeños que los anticuerpos completos y, por lo tanto, pueden tener una mayor permeabilidad capilar que los anticuerpos completos, permitiendo que los fragmentos de anticuerpos monocatenarios se localicen y se unan a los sitios de unión al antígeno diana de manera más eficaz. También, los fragmentos de anticuerpos se pueden producir a una escala relativamente grande en células procariotas, facilitando así su producción. Además, el tamaño relativamente pequeño de los fragmentos de anticuerpos monocatenarios los hace menos propensos que los anticuerpos completos a provocar una respuesta inmune en un receptor.

También pueden estar presentes fragmentos de anticuerpos que tienen características de unión iguales o comparables a las del anticuerpo completo. Dichos fragmentos pueden contener uno o ambos fragmentos Fab o el fragmento F(ab')2. Los fragmentos de anticuerpos pueden contener las seis CDR del anticuerpo completo, aunque los fragmentos que contienen menos de todas esas regiones, tal como tres, cuatro o cinco CDR, también son funcionales.

Producción de proteína

Las proteínas de anticuerpo-trampa de citocina se producen generalmente de forma recombinante, utilizando células de mamífero que contienen un ácido nucleico diseñado genéticamente para expresar la proteína. Aunque en los Ejemplos 1 y 2 se describe un ejemplo de una línea celular y un método de producción de proteínas adecuados, se han utilizado una amplia variedad de vectores adecuados, líneas celulares y métodos de producción de proteínas para producir productos biofarmacéuticos basados en anticuerpos y podrían utilizarse en la síntesis de estas proteínas de anticuerpos y trampa de citocinas.

Indicaciones terapéuticas

Las proteínas trampa anti-PD-L1/TGFp descritas en la solicitud se pueden usar para tratar el cáncer o reducir el crecimiento tumoral en un paciente. Los cánceres ilustrativos incluyen colorrectal, de mama, de ovario, de páncreas, gástrico, de próstata, riñón, de cuello del útero, mieloma, linfoma, leucemia, de tiroides, endometrial, de útero, de vejiga, neuroendocrino, de cabeza y cuello, de hígado, nasofaríngeo, testicular, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, melanoma, cáncer de piel de células basales, cáncer de piel de células escamosas, dermatofibrosarcoma protuberans, carcinoma de células de Merkel, glioblastoma, glioma, sarcoma, mesotelioma y síndromes mielodisplásicos.

El cáncer o tumor que se va a tratar con un anti-PD-LI/trampa de TGFp puede seleccionarse basándose en la expresión o expresión elevada de PD-L1 y TGFp en el tumor, la correlación de sus niveles de expresión con el pronóstico o la progresión de la enfermedad, y la experiencia clínica y preclínica sobre la sensibilidad del tumor a los tratamientos dirigidos a PD-L1 y TGFp. Dichos cánceres o tumores incluyen, entre otros, colorrectal, de mama, de ovario, de páncreas, gástrico, de próstata, riñón, de cuello del útero, de vejiga, de cabeza y cuello, de hígado, cáncer de pulmón no microcítico, melanoma, carcinoma de células de Merkel y mesotelioma.

Composiciones farmacéuticas

La presente divulgación también presenta composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína descrita en el presente documento. La composición se puede formular para su uso en varios sistemas de administración de fármacos. También se pueden incluir en la composición uno o más excipientes o vehículos fisiológicamente aceptables para una formulación adecuada. Las formulaciones adecuadas para su uso en la presente divulgación se encuentran en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17a ed., 1985. Para una breve revisión de los métodos para suministro de fármacos, véanse, por ejemplo, Langer (Science 249:1527-1533, 1990).

Las composiciones farmacéuticas están pensadas para administración parenteral, intranasal, tópica, oral o local, tal como por un medio transdérmico, para el tratamiento terapéutico. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar por vía parenteral (por ejemplo, mediante inyección intravenosa, intramuscular o subcutánea), o por ingestión oral, o por aplicación tópica o inyección intraarticular en áreas afectadas por la enfermedad vascular o cancerosa. Las vías de administración adicionales incluyen la administración intravascular, intraarterial, intratumoral, intraperitoneal, intraventricular, intraepidural, así como nasal, oftálmica, intraescleral, intraorbital, rectal, tópica o por inhalación de aerosol. Por lo tanto, la divulgación proporciona composiciones para administración parenteral que comprenden los agentes mencionados anteriormente disueltos o suspendidos en un vehículo aceptable, preferentemente un vehículo acuoso, por ejemplo, agua, agua tamponada, solución salina, PBS y similares. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según sea necesario, para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste del pH y tamponantes, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes, detergentes y similares. La divulgación también proporciona composiciones para administración oral, que pueden contener ingredientes inertes tales como aglutinantes o cargas para la formulación de un comprimido, una cápsula y similares. Además, la presente divulgación proporciona composiciones para la administración local, que pueden contener ingredientes inertes como disolventes o emulsionantes para la formulación de una crema, un ungüento y similares.

Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales o pueden esterilizarse por filtración. Las soluciones acuosas resultantes se pueden envasar para su uso tal cual, o liofilizarse, combinándose la preparación liofilizada con un vehículo acuoso estéril antes de la administración. El pH de las preparaciones estará normalmente entre 3 y 11, más preferentemente entre 5 y 9 o entre 6 y 8, y lo más preferentemente entre 7 y 8, tal como del 7 al 7,5. Las composiciones resultantes en forma sólida se pueden empaquetar en múltiples unidades de dosis única, conteniendo, cada uno, una cantidad fija del agente o agentes mencionados anteriormente, tal como en un paquete sellado de comprimidos o cápsulas. La composición en forma sólida también se puede envasar en un recipiente para una cantidad flexible, tal como en un tubo comprimible diseñado para una crema o ungüento de aplicación tópica.

La dosis óptima de anticuerpo-trampa de TGFp se basa en el porcentaje de ocupación del receptor por parte de la fracción de anticuerpo para lograr el efecto terapéutico máximo porque la trampa de citocina se usa en un gran exceso. Por ejemplo, la dosis terapéutica para un anticuerpo monoclonal dirigido a un receptor celular se determina de manera que el nivel mínimo sea de alrededor de 10 a 100 |jg/ml, es decir, 60 a 600 nM (para anticuerpos con una constante de disociación (Kd) de 6 nM, este nivel mínimo aseguraría que entre el 90 y el 99 % de los receptores diana en las células estén ocupados por el anticuerpo). Esto es un gran exceso de citocinas, que normalmente están presentes en pg a ng/ml en circulación.

La dosis óptima de polipéptido de anticuerpo-trampa de TGFp de la divulgación dependerá de la enfermedad que se esté tratando, de la gravedad de la enfermedad y de la existencia de efectos secundarios. La dosis óptima se puede determinar mediante experimentación de rutina. Para administración parenteral una dosis entre 0,1 mg/kg y 100 mg/kg, alternativamente entre 0,5 mg/kg y 50 mg/kg, alternativamente, entre 1 mg/kg y 25 mg/kg, alternativamente entre 2 mg/kg y 10 mg/kg, alternativamente se administran y pueden administrarse entre 5 mg/kg y 10 mg/kg, por ejemplo, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez al mes por ciclo de tratamiento.

Ejemplos

La invención, que se está describiendo ahora en líneas generales, se entenderá más completamente por referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen simplemente con fines de ilustración de determinados aspectos y realizaciones de la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de la invención de ningún modo.

EJEMPLO 1 - Construcción de ADN y expresión de proteínas

El anti-PD-L1/Trampa de TGFp es una proteína de fusión anticuerpo anti-PD-L1-Receptor de TGFp II. La cadena ligera de la molécula es idéntica a la cadena ligera del anticuerpo anti-PD-L1 (SEQ ID NO: 1). La cadena pesada de la molécula (SEQ ID NO: 3) es una proteína de fusión que comprende la cadena pesada del anticuerpo anti-PD-L1 (SEQ ID NO: 2) fusionado genéticamente a través de un enlazador flexible (Gly4Ser)4Gly (SEQ ID NO: 11) al extremo N-terminal del Receptor de TGFp II soluble (SEQ ID NO: 10). En la unión de fusión, el resto de lisina C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo se mutó a alanina para reducir la escisión proteolítica. Para la expresión de anti-PD-L1/trampa de TGFp, el ADN que codifica la cadena ligera anti-PD-L1 (SEQ ID NO: 4) y el ADN que codifica el anti-PD-L1/Receptor de TGFp II (SEQ ID NO: 5) en el mismo vector de expresión o en vectores de expresión separados se usaron para transfectar células de mamífero usando protocolos estándar para transfección transitoria o estable. Los medios de cultivo acondicionados se recogieron y la proteína de fusión anti-PD-L1/trampa de TGFp se purificó mediante cromatografía de proteína A en sefarosa estándar. La proteína purificada que comprende un anticuerpo anti-PD-L1 y dos moléculas del Receptor II de TGFp soluble (Figura 1A) tiene un peso molecular estimado (PM) de aproximadamente 190 kilodaltons en cromatografía de exclusión por tamaño y electroforesis de poliacrilamida-SDS en condiciones no reductoras. En condiciones reductoras, las cadenas ligeras y pesadas tienen PM aparentes de 28 y 75 kilodaltons, respectivamente (FIG. 1B).

La proteína de fusión anti-PD-L1 (mut)/trampa de TGFp, que contiene un polipéptido de fusión de cadena pesada análogo (SEQ ID NO: 7) y una cadena ligera con las mutaciones A31G, D52E, R99Y se preparó de forma similar en la región variable que anula la unión a PD-L1 (SEQ ID NO: 6). Se utilizó en experimentos posteriores como control de trampa de TGFp.

EJEMPLO 2 - Producción de anti-PD-L1/trampa de TGFp como agente bioterapéutico

Se descubrió que la anti-PD-L1/trampa de TGFp producida por la transfección transitoria de células 293 de riñón embrionario humano (HEK) contenía diversos grados de una especie recortada, que apareció como una banda tenue con un PM aparente de aproximadamente 60 kD en SDS-PAGE en condiciones reductoras (Figura 1B). Se confirmó que esta banda era la cadena pesada de la anti-PD-L1/trampa de TGFp escindida en un sitio en la porción N-terminal de TGFpRII cerca de la unión de fusión.

Se generaron clones estables que expresan la anti-PD-L1/trampa de TGFp en la línea de células hospedadoras CHO-S, que fue preadaptada para el crecimiento en medio sin suero en cultivo en suspensión. Las células se transfectaron con un vector de expresión que contenía un gen que codifica la proteína anti-PD-L1-TGFpRII y un marcador de selección de glutamina sintetasa. La selección posterior de integrantes estables se realizó con L-metionina sulfoximina (MSX). Se generaron líneas celulares que expresan la anti-PD-LI/trampa de TGFp usando un enfoque de miniagrupación, seguido de la deposición de células individuales en placas de 384 pocillos, utilizando un clasificador de células activado por fluorescencia de Beckton-Dickinson (FACS Aria II). El crecimiento, la productividad y la calidad de las proteínas se evaluaron en un ensayo de lote alimentado con plataforma genérica. Basándose en estos análisis, se seleccionaron 14 clones como candidatos principales para estudios adicionales. Se llevó a cabo un estudio de estabilidad con los clones a ~ 90 PDL (nivel de duplicación de la población) de los bancos de células de investigación establecidos durante la ampliación de los clones. Al concluir el desarrollo del minigrupo, se descubrió que la subunidad de cadena pesada-enlazador-TGFpRII sufrió un recorte, tal como se vio en la expresión transitoria. Todos los clones del estudio de estabilidad produjeron la especie recortada, aunque se demostró en el material purificado con proteína A que el porcentaje de especies recortadas en relación con la subunidad intacta variaba con cada clon. Además, se desarrolló un proceso de purificación mejorado que consiste en una cromatografía de proteína A seguida de un fuerte intercambio catiónico para reducir la copurificación de las especies recortadas. Incluso con el proceso mejorado, el material purificado con los niveles finales requeridos de especies recortadas de < 5 % solo se puede lograr utilizando clones que produzcan niveles bajos de recorte. Basándose en estos análisis combinados, el clon 02B15 se seleccionó como el clon candidato final. El análisis de la anti-PD-LI/trampa de TGFp expresada por este clon a cero PDL, treinta PDL, sesenta PDL y noventa PDL muestra que el porcentaje de recorte no aumentó con los niveles de duplicación de la población (FIG. 2).

EJEMPLO 3 - Análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) de la unión de anti-PD-LI/tram pa de TGFp y controles al PD-L1 humano en las células

Se estudió la unión del anticuerpo anti-PD-LI y las proteínas de fusión en células HEK transfectadas de forma estable para expresar PD-L1 humano usando el siguiente procedimiento.

Se utilizó el siguiente procedimiento de ejemplo para determinar la unión de PD-L1 mediante FACS:

a. Se prepararon 50 pl de diluciones en serie de las muestras de prueba en tampón FACS.

b. Se dispensaron 50 pl de células HEK transfectadas de forma estable para expresar PD-L1 humana a 5 x 106 células/ml a los pocillos con muestras de prueba y se mezclaron.

c. Las placas se incubaron en la oscuridad sobre hielo durante 1 hora.

d. Las células se sedimentaron a 300 x g durante 5 minutos.

e. El sobrenadante se decantó y las células se resuspendieron en 300 pl de tampón FACS y se volvieron a sedimentar a 300 x g durante 5.

f. Se repitió el enjuague de la muestra.

g. Las células se resuspendieron en 100 pl de tampón FACS que contenía anti-IgG humana en cabra de IgG completa conjugada con DyLight 488, Fcy (diluida a 1:300).

h. La placa o las placas se incubaron en la oscuridad sobre hielo durante 45 minutos.

i. Las células se sedimentaron a 300 x g durante 5.

j. El sobrenadante se decantó y las células se resuspendieron en 300 pl de tampón FACS y se volvieron a sedimentar a 300 x g durante 5 minutos

k. Se repitió el enjuague de la muestra y finalmente se resuspendieron las células en 200 pl de tampón FACS. l. Los datos se adquirieron en FACS Caliber y se analizaron con Microsoft Excel. La CE50 se calculó mediante regresión no lineal (dosis-respuesta sigmoidea) con Graphpad Prism5.

Tal como se muestra en la Fig. 3, el análisis FACS mostró que la proteína de fusión anti-PD-L1/trampa de TGFp conserva una afinidad de unión similar a la del anticuerpo anti-PD-L1 de control positivo en células HEK transfectadas de forma estable para expresar PD-L1 humana (células HEK/PD-L1). Las CE50 para anti-PD-L1/trampa de TGFp y anti-PD-L1 son 0,116 pg/ml (0,64 nM) y 0,061 pg/ml (0,41 nM), respectivamente. La IFM (intensidad de fluorescencia media) observada fue específica para la unión a PD-L1 humana ya que no se observó IFM en las células HEK parentales que no se transfectaron. El control negativo anti-PD-L1(mut)/trampa de TGFp no mostró ninguna unión a las células HEK transfectadas de manera estable para expresar PD-L1 humana.

EJEMPLO 4 - Determinación de la capacidad de anti-PD-L1/trampa de TGFp para inh ib ir la fosforilación inducida por TGFp de SMAD3

La capacidad de la anti-PD-L1/trampa de TGFp para neutralizar TGFp se determinó usando células 4T1 que llevaban un indicador de luciferasa SMAD3. En el ensayo que se detalla a continuación, la inhibición de la fosforilación de SMAD3 inducida por TGFp se midió usando un indicador de luciferasa bajo el control del promotor de SMAD3.

Se realizó un ensayo ilustrativo para evaluar la potencia para inhibir la actividad informadora inducida por TGFp como sigue.

1. Un día antes del estudio, se alimentaron células 4T1 que portaban el indicador de SMAD3-luciferasa.

2. El día 0, las células se sembraron en una placa Biocoat de 96 pocillos a una concentración de 5x104 células/pocillo en 100 pl de medio fresco y se incubaron durante la noche a 37 °C y 5 % de CO2.

3. El día 1:

i. Se añadieron a los pocilios 50 |jl de medio completo reciente que contenía la concentración indicada de muestras de anti-PD-L1/trampa de TGFp a ensayar o sus controles y se incubaron durante una hora. Todas las muestras se analizaron por triplicado.

ii. Se añadieron a cada pocillo 50 j l de medio completo reciente que contenía 20 ng/ml de TGFp humano y las muestras se incubaron durante la noche (la concentración final en el pocillo es de 5 ng/ml).

4. El día 2:

i. Se eliminaron 100 j l de sobrenadante de cultivo y se añadieron 100 j l de medio completo fresco, que contenía 150 jg/m l de D-luciferina, y las muestras se incubaron durante al menos cinco minutos.

ii. La luminiscencia se midió usando un lector de placas Envision 2104 registrando CPM.

5. Los datos se analizaron utilizando MS Excel o Graphpad prism 5. La actividad de luciferasa se registró como CPM. La actividad inhibidora de (%) se calculó utilizando la siguiente ecuación:

Inhibición (%) = (1- CPM de la muestra/CPM máx de la muestra tratada con anti-PD-L1) X 100

6. El ajuste de regresión no lineal se llevó a cabo utilizando dosis-respuesta sigmoidea (pendiente variable) de Graphpad prism 5. Se calcularon los valores de CI50.

La FIG. 4 muestra que la anti-PD-L1/trampa de TGFp inhibe la actividad indicadora de pSMAD3 inducida por TGFp de una manera dependiente de la dosis. El hecho de que el control de la anti-PD-L1 (mut)/trampa de TGFp tuviera una potencia y CI50 (concentración requerida para inhibir el 50 % de la actividad máxima) más el hecho de que el anticuerpo anti-PD-L1 no tuviera ningún efecto mostró que esta inhibición de la señalización es independiente de la actividad anti-PD-L1. Sorprendentemente, la anti-PD-L1/trampa de TGFp fue varias veces más potente que TGFpRII-Fc (R&D Systems), que coloca el TGFpRIl en el extremo N-terminal en lugar del extremo C-terminal de la proteína de fusión. También es digno de mención que la anti-PD-L1/trampa de TGFp es significativamente más potente que 1D11 (GC1008), el anticuerpo anti-TGFp que se probó en pacientes con melanoma maligno avanzado o carcinoma de células renales (Morris et al., J Clin Oncol 2008; 26:9028 (Resumen de reunión)). En este ensayo, 1D11 y TGFpRIl-Fc mostraron una actividad similar.

EJEMPLO 5 - Análisis farmacocinético (PK) en ratones

Dieciocho ratones macho C57BL/6, de 5-6 semanas de vida, fueron asignados aleatoriamente a 3 grupos (N = 6/grupo), y cada grupo recibió una de las tres proteínas (anti-PD-L1/trampa de TGFp, anti-PD-L1(mut)/trampa de TGFp y anti-PD-L1). Se registró el peso corporal del ratón antes de la dosificación. Después de un breve calentamiento bajo una lámpara calefactora, cada ratón recibió 120 jg de proteína en 200 j l por vía intravenosa (IV) a través de la vena de la cola independientemente de su peso corporal. Cada grupo al que se le administró la misma proteína se dividió en 2 subgrupos (n=3). Se tomaron alternativamente muestras de sangre de cada uno de los dos subgrupos, es decir, se retiró un subgrupo para las muestras de sangre a 1 h, 24 h, 72 h y 168 h, mientras que otro subgrupo fue para muestras de sangre a 7 h, 48 h, 120 h y 240 h. En cada momento, se recogieron aproximadamente 50 j l de muestras de sangre de cada ratón a través de la vena de la cola usando un capilar de microvidrio heparinizado (100 j l de capacidad). La muestra de sangre se transfirió luego a un tubo prerrevestido con Li-Heparina y se mantuvo a 4 °C. Dentro de los 10 minutos posteriores a la recolección, las muestras de sangre se centrifugaron a 14.000 rpm durante 10 min. Se transfirieron al menos 20 j l de muestra de plasma a un nuevo conjunto de tubos preetiquetados y se almacenaron a -20 °C hasta el día del análisis.

El ELISA para medir la IgG humana total utilizó anti-IgG humana (H+L) de cabra (cadenas pesadas y ligeras) (Jackson ImmunoResearch Laboratories) recubiertos de pocillos para captura y anti-IgG humana de ratón AffiniPure con peroxidasa, F(ab')2 (Jackson ImmunoResearch Laboratories) para la detección. El ELISA para medir el anticuerpo anti-PD-L1 completamente funcional y/o la proteína de fusión utilizó pocillos recubiertos con PD-L1-Fc (dominio extracelular de PD-L1 humano fusionado a Fc) (recubiertos a 1,25 jg/m l) para captura y peroxidasa-anti-IgG humana en ratón AffiniPure, F(ab')2 para la detección. El ELISA para medir anti-pD-L1 completamente funcional y TGFpRII intacto utilizó pocillos recubiertos con PD-L1-Fc para la captura y anti-TGFpRII humano biotinilado (R&D Systems) para la detección.

La FIG. 5A muestra que la proteína de fusión anti-PD-L1/trampa de TGFp tenía un perfil de PK muy similar al del anticuerpo anti-PD-L1. Por ejemplo, tal como se mide por el ELISA de IgG humana total, las concentraciones séricas en el momento de 168 horas de anti-PD-L1/trampa de TGFp y anti-PD-L1 fueron de 16,8 y 16,2 jg/ml, respectivamente, y el área bajo la curva (ABC) respectiva de 0 a 168 h fueron 4102 y 3841 h-jg/ml. De manera similar, cuando las concentraciones séricas se midieron mediante el ELISA anti-PD-L1 funcional total, las concentraciones séricas en el momento de 168 horas de anti-PD-L1/trampa de TGFp y anti-PD-L1 fueron 9,5 y 11,1 jg/ml, respectivamente, y las respectivas ABC de 0 a 168 h fueron 3562 y 3086 h-jg/ml. La concentración sérica de la proteína de fusión anti-PD-L1/trampa de TGFp intacta se determinó mediante ELISA, que detecta anti-PD-L1 completamente funcional y el TGFpRII fusionado. En este caso, la concentración sérica de la anti-PD-L1/trampa de TGFp fue de 5,9 |jg/ml en el momento de las 168 horas y el ABC (0 a 168 horas) fue de 2656 horas-|jg/ml, que fueron algo más bajos que los del ELISA anti-PD-LI completamente funcional, presumiblemente debido a la degradación del resto TGFpRII después de la endocitosis mediada por receptor. Se ha demostrado que la unión del anticuerpo a PD-L1 da como resultado una endocitosis mediada por PD-L1, y se sabe que una proteína de fusión anticuerpo-X sufre degradación del resto X después de la endocitosis mediada por receptor (Gillies et al, Clin Cancer Res. 2002; 8:210-6). Esto está respaldado por el descubrimiento en la FIG. 5 que cuando el resto del anticuerpo no se une a PD-L1, tal como en el control de anti-PD-L1(mut)/trampa de TGFp, la exposición es aproximadamente 3 veces mayor, con una concentración sérica de 53 jg/m l en el momento de las 168 horas y una ABC (0 a 168 horas) de 9585 h-jg/ml, lo que sugiere que al menos parte de la eliminación está mediada por receptores.

Para confirmar la diferencia de ~ 3 veces en la exposición entre la anti-PD-L1/trampa de TGFp y la anti-PD-L1(mut)/trampa de TGFp, se repitió el experimento de farmacocinética y se determinaron las concentraciones de las proteínas de fusión intactas en las muestras de suero. Los ratones (ratones hembra B6.129S2, 8 semanas de vida, Jackson Lab) fueron inyectados con anti-PD-L1/trampa de TGFp o anti-PD-L1 (mut)/trampa de TGFp (164 jg/ratón). Las concentraciones séricas de las dos proteínas de fusión se midieron mediante un ELISA utilizando Fab anti-IgG humana (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) para la captura y el anti-TGFpRII humano biotinilado (R&D Systems, Minneapolis, MN) y estreptavidina conjugada con peroxidasa (Zymed/ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY) para detectar proteínas anti-PD-L1/trampa de TGFp intactas. Las concentraciones séricas de las proteínas de fusión intactas en varios puntos de tiempo se muestran en la Tabla siguiente y se representan en la FIG. 5B. El área total bajo la curva (ABC) hasta 336 h es 11781 h-jg/ml para la anti-PD-L1/trampa de TGFp y 35575 h-jg/ml para la anti-PD-L1(mut)/trampa de TGFp (Tabla 1), lo que confirma la exposición tres veces mayor de la molécula de control de trampa.

Tabla 1. Las exposiciones de la anti-PD-L1/trampa de TGFp y el control de la anti-PD-L1(mut)/trampa de TGFp n l rmin r l r l r AB n l r fi f rm in i l Fi r B

EJEMPLO 6 - Endocitosis mediada por diana PD-L1 de anti-PD-LI/trampa de TGFp

La endocitosis mediada por receptores se estudió utilizando las técnicas de extinción de Alexa Fluor 488 de acuerdo con el protocolo del fabricante (Life Technologies, Carlsbad, CA). Brevemente, las células HEK que expresan PD-L1 (células HEK/PD-L1) se incubaron con 10 jg/m l de anti-PD-L1/trampa de TGFp conjugada con Alexa Fluor 488 en hielo durante aproximadamente 1 hora y se lavaron 4 veces con medio frío. A continuación, se pulsaron las células lavadas a 37 °C durante 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 3 y 4 h para permitir la internalización. Las muestras de células en cada momento se dividieron luego en dos porciones. Una porción se incubó en hielo y se midió la fluorescencia total de la anti-PD-L1/trampa de TGFp conjugada con Alexa Fluor 488 unida a la superficie celular e internalizada; la otra porción se incubó con anti-Alexa Fluor 488 a 4 °C durante aproximadamente una hora y se midió la fluorescencia no extinguible de la anti-PD-L1/trampa de TGFp internalizada y conjugada con Alexa Fluor 488. En la Figura 6A se muestra un gráfico que muestra una evolución temporal de la intensidad de fluorescencia media total (IFM) no inactivable de la anti-PD-L1/trampa de TGFp a 37 °C. La cinética de internalización mediada por receptor es muy similar a la del anticuerpo anti-PD-L1, que se muestra en la FIG. 6B. El porcentaje de internalización mediada por receptor de anti-PD-L1/trampa de TGFp y anti-PD-L1 en células HEK/PD-L1 en varios puntos de tiempo a 37 °C se muestra en la FIG. 6C, utilizando la siguiente fórmula para tener en cuenta el hecho de que el enfriamiento por el anti-Alexa Fluor 488 no es del 100 %:

Fluorescencia internalizada = IFM total -(IFM total - IFM no inactivable)/Eficacia de extinción

EJEMPLO 7 - Anti-PD-L1/trampa de TGFp demostró un efecto antitumoral superior que es sinérgico de las actividades del anti-PD-LI y de la trampa de TGFp en el modelo subcutáneo EMT-6 (carcinoma de mama)

Los ratones hembra de 8-12 semanas Jh (Igh-Jtm1Dhu) Balb/C (Taconic Farms, Hudson, NY) se inocularon con 0,5 x 106 células EMT6 viables en 0,1 ml de PBS en los flancos derechos por vía subcutánea. Aproximadamente cinco días después, cuando los tumores alcanzaron un tamaño promedio de 20-30 mm3, los ratones se clasificaron en grupos (N=10) de modo que los tamaños medios de los tumores de todos los grupos fueran similares y se inició el tratamiento mediante inyecciones intravenosas (día 0). El grupo 1 recibió 400 |jg de control de anticuerpo de isotipo tres veces a la semana (o "eod" (en días alternos); El grupo 2 recibió 400 jg de anticuerpo anti-PD-LI tres veces por semana; El grupo 3 recibió 164 jg de anti-PD-LI (mut)/trampa de TGFp tres veces por semana; El grupo 4 recibió 492 jg de anti-PD-LI/trampa de TGFp tres veces a la semana; El grupo 5 recibió 492 jg de anti-PD-L1/trampa de TGFp dos veces por semana (equimolar a 400 jg de anticuerpo anti-PD-L1); El grupo 6 recibió 164 jg de anti-pD-L1/trampa de TGFp tres veces a la semana; y el Grupo 7 recibió 55 jg de anti-PD-L1/trampa de TGFp tres veces por semana. Los pesos corporales se midieron dos veces por semana para controlar la toxicidad. Los volúmenes tumorales se determinaron en diferentes momentos usando la fórmula: volumen tumoral (mm3) = largo x ancho x alto x 0,5236. Cualquier ratón con tumores de más de 2500 mm3 fue sacrificado siguiendo el protocolo de sanidad animal del instituto. La eficacia antitumoral se documentó como una relación T/C, en donde T y C son los volúmenes tumorales promedio del grupo tratado con anticuerpo o proteína de fusión, y el grupo tratado con el control de isotipo, respectivamente.

Todos los tratamientos fueron bien tolerados. La inhibición del crecimiento tumoral por los diversos tratamientos se muestra en la FIG. 7A, que mostraba los volúmenes tumorales medios de los ratones supervivientes, y la FIG. 7B, que mostró el volumen del tumor individual de los ratones supervivientes, teniendo en cuenta que los ratones con tumores de más de 2500 mm3 tuvieron que ser sacrificados. La anti-PD-L1/trampa de TGFp demostró una potente eficacia antitumoral, logrando proporciones T/C de 0,30, 0,40 y 0,44 para los grupos de dosis alta (492 jg , Grupo 4), media (164 jg , Grupo 6) y baja (55 jg , Grupo 7), respectivamente el día 28). Mientras que el anticuerpo anti-PD-L1 (Grupo 2, T/C = 0,87, p>0,05, en el Día 16, el último día para el que se dispuso del volumen tumoral medio de todos los ratones, es decir, antes de que los ratones con tumores de más de 2500 mm3 fueran sacrificados) o el control de trampa de TGFp (Grupo 2, T/C = 0,97 el día 16, p> 0,05) solo tuvo una eficacia marginal en este modelo, que combina los dos agentes en una sola molécula dio como resultado un efecto antitumoral sinérgico profundo. Esto es evidente en la mediana de los tiempos de supervivencia observados para la dosis de 492 jg (58 y más de 80 días, respectivamente, para la dosificación de tres veces por semana y dos veces por semana) y una dosis de 164 jg (35 días) de la proteína de fusión (prueba de rango logarítmico: p<0,0001) (FIG. 7C). Notablemente, la anti-PD-L1/trampa de TGFp a la dosis media de 164 jg (Grupo 6), con una mediana de supervivencia de 35 días, fue mucho más eficaz que la misma dosis de anti-PD-L1 (mut)/trampa de TGFp (Grupo 3) o tres veces la dosis equivalente de anti-PD-L1 (Grupo 2), los cuales arrojaron una mediana de supervivencia de 22 días, respectivamente (prueba de rango logarítmico: p<0,0001). Esta actividad antitumoral sinérgica es especialmente sorprendente porque la exposición de la fracción de trampa de TGFp de la dosis de 164 jg de PD-L1 (mut)/trampa de TGFp debería ser aproximadamente 3 veces mayor que la de la dosis de 164 jg de PD-L1/Trampa de TGFp debido a la eliminación de este último mediada por receptor (véanse los Ejemplos 5 y 6). Es notable que los tumores en ratones que recibieron la dosis alta de anti-PD-L1/trampa de TGFp continuaron retrocediendo después de que se detuvo la dosificación el día 18 (3 de 10 del Grupo 4 y 6 de 10 del Grupo 5 con regresiones completas el día 78), lo que demuestra el efecto inmunitario antitumoral de larga duración que se dirige a los dos mecanismos inmunosupresores simultáneamente (FIG. 7C). También es de destacar que la eficacia del Grupo 4 no es mejor que la del Grupo 5, lo que sugiere que la dosis de 492 jg administrada dos veces por semana estaba cerca de la dosis de saturación, o era un régimen de dosificación más óptimo que los 492 jg administrados tres veces por semana.

El efecto protector de la inmunidad antitumoral provocada por el tratamiento con anti-PD-L1/trampa de TGFp fue evidente cuando los ratones con tumores en regresión completa fueron expuestos a 25.000 células EMT6 viables inyectadas por vía subcutánea. Mientras que los diez ratones sin exposición previa en un grupo de control desarrollaron tumores hasta un volumen tumoral promedio de 726 mm3 para el día 18 después de la exposición, ninguno de los once ratones tratados previamente con PD-L1/trampa de TGFp (tres del Grupo 4, seis del Grupo 5 y uno de cada uno de los Grupos 6 y 7) mostró ningún signo de crecimiento tumoral.

EJEMPLO 8 - Anti-PD-L1/trampa de TGF-p mostró una profunda actividad antitumoral sinérgica en el modelo de tum or subcutáneo MC38 (carcinoma colorrectal).

Los ratones hembra B6.129S2-Ighmtm1Cgn/ J de 8-12 semanas de vida (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) fueron inyectados con 0,5x106 células tumorales MC38 viables en 0,1 ml de PBS por vía subcutánea en el flanco derecho. Aproximadamente ocho días después, cuando el tamaño promedio del tumor alcanzó aproximadamente 80-100 mm3, los ratones se clasificaron en grupos (N=10) de modo que los tamaños medios de los tumores de todos los grupos fueran similares y se inició el tratamiento mediante inyecciones intravenosas (día 0). El grupo 1 recibió 400 jg de control de anticuerpo de isotipo; El grupo 2 recibió 400 jg de anticuerpo anti-PD-L1; El grupo 3 recibió 133 jg de anticuerpo anti-PD-L1; El grupo 4 recibió 492 jg de anti-PD-L1 (mut)/trampa de TGFp; El grupo 5 recibió 164 jg de anti-PD-L1 (mut)/trampa de TGFp; El grupo 6 recibió 492 jg de anti-PD-L1/trampa de TGFp; y el Grupo 7 recibió 164 jg de anti-PD-L1/trampa de TGFp. El tratamiento se administró tres veces por semana durante dos semanas. Los pesos corporales se midieron dos veces por semana para controlar la toxicidad. Los volúmenes tumorales se determinaron en diferentes momentos usando la fórmula: volumen tumoral (mm3) = largo x ancho x alto x 0,5236.

Cualquier ratón con tumores de más de 2500 mm3 fue sacrificado siguiendo el protocolo de sanidad animal del instituto. La eficacia antitumoral se documentó como una relación T/C, en donde T y C son los volúmenes tumorales promedio del grupo tratado con anticuerpo o proteína de fusión, y el grupo tratado con el control de isotipo, respectivamente.

Todos los tratamientos fueron bien tolerados. La inhibición del crecimiento tumoral por los diversos tratamientos se muestra en la FIG. 8. En el día 19 del estudio, la anti-PD-LI/trampa de TGFp demostró una potente eficacia antitumoral dependiente de la dosis, logrando proporciones T/C de 0,18 (p<0,001) y 0,38 (p<0,001) para los grupos de dosis alta (492 |jg, Grupo 6) y baja (164 |jg, Grupo 7), respectivamente. Por otra parte, ni anti-PD-Ll ni anti-PD-LI (mut)/Trampa de TGFp mostraron actividad antitumoral en absoluto. Por lo tanto, se obtuvo una profunda actividad antitumoral sinérgica cuando el anticuerpo anti-PD-LI y el resto de trampa de TGFp se combinaron en una molécula para dirigir a estos dos mecanismos inmunosupresores de manera simultánea.

EJEMPLO 9 - Anti-PDLI/tram pa de TGFp fue eficaz en el modelo ortotópico EMT-6 de cáncer de mama metastásico.

Los ratones hembra de 8-12 semanas Jh (Igh-Jtm1Dhu) Balb/C (Taconic Farms, Hudson, NY) se inocularon con 0,25x106 células EMT6 viables en 0,1 ml de PBS en la almohadilla mamaria derecha. Aproximadamente una semana después, cuando el tamaño medio del tumor alcanzó unos 50 mm3, los ratones se clasificaron en grupos (N=10) de modo que los tamaños medios de los tumores de todos los grupos fueran similares y se inició el tratamiento mediante inyecciones intravenosas (día 0). El grupo 1 recibió 133 jg de control de anticuerpo de isotipo; El grupo 2 recibió 133 jg de anticuerpo anti-PD-L1; El grupo 3 recibió 164 jg de anti-PD-L1 (mut)/trampa de TGFp; El grupo 4 recibió 164 jg de anti-PD-L1/trampa de TGFp; y el Grupo 5 recibió una combinación de 133 jg de anti-PD-L1 y 164 jg de anti-PD-L1 (mut)/trampa de TGFp. El tratamiento se repitió los días 0, 2, 4, 7, 9, 11 (es decir, 3 veces por semana durante dos semanas). Los pesos corporales se midieron dos veces por semana para controlar la toxicidad. Los volúmenes tumorales se determinaron en diferentes momentos usando la fórmula: volumen tumoral (mm3) = largo x ancho x alto x 0,5236. Cualquier ratón con tumores de más de 2500 mm3 fue sacrificado siguiendo el protocolo de sanidad animal del instituto. La eficacia antitumoral se documentó como una relación T/C, en donde T y C son los volúmenes tumorales promedio del grupo tratado con anticuerpo o proteína de fusión, y el grupo tratado con el control de isotipo, respectivamente.

Todos los tratamientos fueron bien tolerados. La inhibición del crecimiento tumoral por los diversos tratamientos se muestra en la FIG. 9. La anti-PD-L1/trampa de TGFp demostró una potente eficacia antitumoral, logrando una proporción T/C de 0,03 (p<0,001) el día 21. Por otra parte, las dosis equimolares de anti-PD-L1 o anti-PD-L1 (mut)/trampa de TGFp fueron menos eficaces, dando proporciones T/C de 0,31 (p<0,001 frente al Grupo 1; p <0,001 frente al Grupo 4) y 0,68 (p<0,001 frente al Grupo 1; p<0,001 frente al Grupo 4), respectivamente. La terapia de combinación de dosis equimolares de anti-PD-L1 y anti-PD-L1 (mut)/trampa de TGFp logró una eficacia antitumoral casi idéntica a la de la proteína de fusión, aunque se estimó que la exposición de la trampa de TGFp de la proteína de fusión (Grupo 4) era aproximadamente 3 veces menor que la de la anti-PD-L1 (mut)/trampa de TGFp en la combinación (Grupo 5) según el análisis farmacocinético (véase el Ejemplo 5). También es notable que los tumores de los grupos 4 y 5 continuaron retrocediendo después del último día de administración, por ejemplo, el tamaño medio del tumor disminuyó de 212 mm3 el día 11, el último día de dosificación, hasta 26 mm3 el día 24 para el tratamiento con anti-PD-L1/trampa de TGFp, lo que demuestra el efecto inmunitario antitumoral de larga duración de dirigirse a los dos mecanismos inmunosupresores simultáneamente.

EJEMPLO 10 - Anti-PD-L1/trampa de TGFp tiene una mejor eficacia antitumoral que la combinación de anti-PD-L1 y trampa de TGFp en un modelo de carcinoma colorrectal MC38 intramuscular.

Los ratones hembra B6.129S2-Ighmtm1Cgn/ J de 8-12 semanas de vida (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) fueron inyectados con 0,5x106 células tumorales MC38 viables en 0,1 ml de PBS por vía intramuscular en el muslo derecho. Aproximadamente una semana después, cuando el tamaño medio del tumor alcanza unos 50 mm3, los ratones se clasificaron en grupos (N = 8) de modo que los tamaños medios de los tumores de todos los grupos fueran similares, y se inició el tratamiento mediante inyecciones intravenosas (día 0) y se repitió de nuevo dos días después (día 2). El grupo 1 recibió 400 jg de control de anticuerpo de isotipo; El grupo 2 recibió 400 jg de anticuerpo anti-PD-L1; El grupo 3 recibió 133 jg de anticuerpo anti-PD-L1; El grupo 4 recibió 164 jg de anti-PD-L1 (mut)/trampa de TGFp; El grupo 5 recibió 492 jg de anti-PD-L1/trampa de TGFp; El grupo 6 recibió 164 jg de anti-PD-L1/trampa de TGFp; y el grupo 7 recibió una combinación de 133 jg de anti-PD-L1 y 164 jg de anti-PD-L1 (mut)/trampa de TGFp. Los pesos corporales se midieron dos veces por semana para controlar la toxicidad. Los volúmenes tumorales se determinaron en diferentes momentos usando la fórmula: volumen tumoral (mm3) = largo x ancho x alto x 0,5236. Cualquier ratón con tumores de más de 2500 mm3 fue sacrificado siguiendo el protocolo de sanidad animal del instituto. La eficacia antitumoral se documentó como una relación T/C, en donde T y C son los volúmenes tumorales promedio del grupo tratado con anticuerpo o proteína de fusión, y el grupo tratado con el control de isotipo, respectivamente.

Todos los tratamientos fueron bien tolerados. La inhibición del crecimiento tumoral por los diversos tratamientos se muestra en la FIG. 10. La anti-PD-L1/trampa de TGFp demostró una eficacia antitumoral muy potente, logrando proporciones T/C de 0,024 (p<0,001) y 0,052 (p<0,001) para los grupos de dosis alta (492 jg , Grupo 5) y baja (164 jg , Grupo 6), respectivamente, en el día 15. Por otra parte, las dosis equimolares de anti-PD-L1 fueron menos eficaces, dando proporciones T/C de 0,59 (p<0,001) y 0,45 (p<0,001) para los grupos de dosis alta (400 |jg, Grupo 2) y baja (133 jg , Grupo 3), respectivamente. La anti-PD-LI (mut)/trampa de TGFp a 164 jg (Grupo 4) fue completamente ineficaz, y cabe señalar que aunque esta dosis es equimolar con el grupo de dosis baja de anti-PD-LI/trampa de TGFp (Grupo 6), la exposición de la trampa de TGFp debería ser bastante similar a la del grupo de anti-PD-Ll/trampa de TGFp de dosis alta (Grupo 5) debido a las diferencias en la farmacocinética (véase el Ejemplo 5). Por lo tanto, los datos demostraron que la anti-PD-LI/trampa de TGFp tenía una potente actividad antitumoral sinérgica en este modelo. Es especialmente digno de mención que, la anti-PD-LI/trampa de TGFp fue más eficaz que la terapia de combinación de dosis equimolares de anti-PD-LI y anti-PD-LI (mut)/trampa de TGFp, que tenía una proporción de T/C de 0,16 (p<0,001 frente al Grupo 1 y p> 0,05 frente al Grupo 6) a pesar de una mayor exposición a la trampa de TGFp de aproximadamente tres veces (véase el Ejemplo 5). Además, el tratamiento anti-PD-L1/trampa de TGFp dio como resultado 4 de cada 10 ratones con regresión tumoral completa, mientras que la combinación de anti-PD-L1 y la trampa de control indujo una regresión completa en solo 2 de cada 10 ratones (datos no mostrados). También es notable que los tumores en los ratones tratados con anti-PD-L1/trampa de TGFp continuaron retrocediendo después del último día de dosificación el día 2, y permanecieron completamente retrocedidos a partir de entonces (hasta al menos el día 102), lo que demuestra el efecto inmunitario antitumoral profundo y de larga duración de esta proteína de fusión. Sin quedar limitados por la teoría, los datos apoyan un mecanismo en el que la proteína de fusión anti-PD-L1/trampa de TGFp no solo aprovecha el efecto sinérgico de bloquear las dos principales vías de escape inmunitario, sino que es superior a la terapia combinada debido a que una sola entidad molecular se dirige al microambiente del tumor. Muchas citocinas inmunosupresoras secretadas por células tumorales o células inmunitarias subvertidas (por ejemplo, macrófagos asociados a tumores, células supresoras derivadas de mieloides) tienen funciones autocrinas o paracrinas. Por lo tanto, la anti-PD-L1/trampa de TGFp tiene la capacidad de administrar la trampa de TGFp al microambiente tumoral mediante la unión a PD-L1 células tumorales, en donde la trampa neutraliza el TGFp secretado localmente. Además, en lugar de actuar como un sumidero de TGFp ligado que se acumula en la circulación, el TGFp unido a anti-PD-L1/trampa de TGFp podría destruirse eficazmente a través de la endocitosis mediada por el receptor de PD-L1 (Ejemplos 5 y 6).

EJEMPLO 11 - Tratamiento con anti-PDL1/Trampa de TGFp o combinación de anti-PD-LI y control de trampa de TGFp a una exposición equivalente en el modelo ortotópico EMT-6 de cáncer de mama metastásico.

En dosis equimolares, la anti-PDL1/trampa de TGFp tuvo una eficacia similar a la combinación de control de anti-PD-L1 y la trampa de TGFp en el modelo de cáncer de mama EMT-6 ortotópico (Ejemplo 9). En el siguiente estudio, se evaluó la eficacia de la anti-PDL1/trampa de TGFp o la combinación de control de la trampa anti-PD-L1 y TGFp administrada para una exposición equivalente.

Los ratones hembra de 8-12 semanas Jh (Igh-Jtm1Dhu) Balb/C (Taconic Farms, Hudson, NY) se inocularon con 0,25x106 células EMT6 viables en 0,1 ml de PBS en la almohadilla mamaria derecha. Aproximadamente una semana después, cuando el tamaño medio del tumor alcanzó unos 80 mm3, los ratones se clasificaron en grupos (N=12) de modo que los tamaños medios de los tumores de todos los grupos fueran similares, y se inició el tratamiento mediante inyecciones intravenosas el día 0 y se repitió de nuevo 7 días después. El grupo 1 recibió 133 jg de control de anticuerpo de isotipo; El grupo 2 recibió 164 jg de anti-PD-L1/trampa de TGFp; El grupo 3 recibió 55 jg de anti-PD-L1/trampa de TGFp; El Grupo 4 recibió una combinación de 133 jg de anti-PD-L1 y 55 jg de anti-PD-L1 (mut)/trampa TGFp; y el Grupo 5 recibió una combinación de 44,3 jg de anti-PD-L1 y 18,3 jg de anti-PD-L1 (mut)/trampa de TGFp. Los pesos corporales se midieron dos veces por semana para controlar la toxicidad. Los volúmenes tumorales se determinaron en diferentes momentos usando la fórmula: volumen tumoral (mm3) = largo x ancho x alto x 0,5236. Cualquier ratón con tumores de más de 2500 mm3 fue sacrificado siguiendo el protocolo de sanidad animal del instituto. La eficacia antitumoral se documenta como una proporción de T/C, en donde T y C son los volúmenes tumorales promedio del grupo tratado con anticuerpo o proteína de fusión, y el grupo tratado con el control de isotipo, respectivamente.

Todos los tratamientos fueron bien tolerados. La anti-PD-L1/trampa de TGFp y la terapia de combinación demostraron una potente eficacia antitumoral a ambos niveles de dosis ensayados.

EJEMPLO 12 - Anti-PD-L1/trampa de TGF-p tiene mejor eficacia antitumoral que la combinación de anti-PD-L1 y trampa de TGFp administrada para dar una exposición equivalente en un modelo de carcinoma colorrectal MC38 intramuscular.

Los resultados del Ejemplo 10 sugirieron que, a dosis equimolares, la anti-PD-L1/trampa TGF-p tiene una mejor eficacia antitumoral que la combinación de control de anti-PD-L1 y trampa de TGFp incluso aunque la exposición in vivo del control de la anti-PD-L1 (mut)/trampa de TGFp es aproximadamente 3 veces la de la anti-PD-L1/trampa de TGFp (Ejemplo 5). En un estudio de seguimiento se comparó la eficacia antitumoral de la anti-PD-L1/trampa de TGFp y la combinación de anti-PD-L1 y anti-PD-L1 (mut)/trampa de TGFp basada en la misma exposición. Se administraron dosis más bajas que en el Ejemplo 10 para evitar una dosificación cercana a los niveles de saturación.

Los ratones hembra B6.129S2-Ighmtm1Cgn/ J de 8-12 semanas de vida (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) fueron inyectados con 0,5x106 células tumorales MC38 viables en 0,1 ml de PBS por vía intramuscular en el muslo derecho. Una semana después, cuando el tamaño medio del tumor alcanzó unos 200 mm3, los ratones se clasificaron en grupos (N=12) de modo que los tamaños medios de los tumores de todos los grupos fueran similares. Se inició el tratamiento mediante inyecciones intravenosas (día 0) y se repitió de nuevo el día 4. El grupo 1 recibió 133 |jg de control de anticuerpo de isotipo; El grupo 2 recibió 164 jg de anti-PD-LI/trampa de TGFp; El grupo 3 recibió 55 jg de anti-PD-L1/trampa de TGFp; El Grupo 4 recibió una combinación de 133 jg de anti-PD-LI y 55 jg de anti-PD-LI (mut)/trampa TGFp; y el Grupo 5 recibió una combinación de 44,3 jg de anti-PD-L1 y 18,3 jg de anti-PD-L1 (mut)/trampa de TGFp. Los pesos corporales se midieron dos veces por semana para controlar la toxicidad. Los volúmenes tumorales se determinaron en diferentes momentos usando la fórmula: volumen tumoral (mm3) = largo x ancho x alto x 0,5236. Cualquier ratón con tumores de más de 2500 mm3 fue sacrificado siguiendo el protocolo de sanidad animal del instituto. La eficacia antitumoral se documenta como una proporción de T/C, en donde T y C son los volúmenes tumorales promedio del grupo tratado con anticuerpo o proteína de fusión, y el grupo tratado con el control de isotipo, respectivamente.

Todos los tratamientos fueron bien tolerados. La anti-PD-L1/trampa de TGFp demostró una eficacia antitumoral muy potente, lograr proporciones de T/C de 0,13 (p<0,001) y 0,19 (p<0,001) para los grupos de dosis intermedia (164 jg , Grupo 2, llamado dosis intermedia en relación con la dosis alta de 492 jg que parecía estar saturando en el Ejemplo 10) y baja (55 jg , Grupo 3), respectivamente, en el día 9. Por otra parte, la combinación de anti-PD-L1 y anti-PD-L1 (mut)/trampa de TGFp fue menos eficaz, dando proporciones de T/C de 0,34 (p<0,001) y 0,37 (p<0,001) para los grupos de dosis intermedia (Grupo 4) y baja (Grupo 5), respectivamente (Fig. 12A o Tabla). Es especialmente digno de mención que cuando se administra para dar una exposición equivalente in vivo del anticuerpo anti-PD-L1 y del componente de trampa de TGFp, la anti-PD-L1/trampa de TGFp fue significativamente más eficaz que la terapia combinada de anti-PD-L1 y anti-PD-L1 (mut)/trampa de TGFp en ambos niveles de dosis (en la dosis intermedia, T/C de 0,13 para anti-PD-L1/trampa de TGFp frente a 0,34 para la combinación p <0,0001 (Fig. 12B); a la dosis baja, T/C de 0,19 para la anti-PD-L1/trampa de TGFp frente a 0,37 para la combinación p<0,0001 (Fig. 12C)).

EJEMPLO 13 - Anti-PD-LI (YW)/trampa de TGFp tiene un efecto antitumoral superior que es sinérgico de las actividades del anti-PD-L1 y de la trampa de TGFp en el modelo ortotópico EMT-6 (carcinoma de mama).

YW243.55S70 es un anticuerpo humano que reconoce PD-L1 tanto humano como murino (publicación de solicitud de patente de EE.UU. N.° US2010/0203056 A1). Su secuencia de región variable de la cadena pesada (VH) y la secuencia de región variable de la cadena ligera (VL) (proporcionada como el SEQ ID NO: 14 y el SEQ ID NO: 13, respectivamente) se utilizaron para reemplazar las correspondientes secuencias de región variable de la anti-PD-L1/trampa de TGFp descrita en el Ejemplo 1 para dar anti-PD-L1 (YW)/trampa de TGFp mediante técnicas estándar de biología molecular. Después de la construcción del ADN que codifica la anti-PD-L1 (YW)/trampa de TGFp, la proteína de fusión del anticuerpo se expresó tal como se describe en el Ejemplo 1. El anticuerpo anti-PD-L1 YW243.55S70 se expresa de forma similar para comparar la eficacia en modelos de tumores murinos.

Los ratones hembra de 8-12 semanas Jh (Igh-Jtm1Dhu) Balb/C (Taconic Farms, Hudson, NY) se inocularon con 0,25x106 células EMT6 viables en 0,1 ml de PBS en la almohadilla mamaria derecha. Aproximadamente una semana después, cuando el tamaño promedio del tumor alcanzó aproximadamente 50-100 mm3, los ratones se clasificaron en grupos (N=10) de modo que los tamaños medios de los tumores de todos los grupos fueran similares y se inició el tratamiento mediante inyecciones intravenosas (día 0). El grupo 1 recibió 133 jg de control de anticuerpo de isotipo; El grupo 2 recibió 133 jg de anticuerpo anti-PD-L1 (YW); El grupo 3 recibió 164 jg de anti-PD-L1 (mut)/trampa de TGFp; El grupo 4 recibió 164 jg de anti-PD-L1 (YW)/trampa de TGFp; y el grupo 5 recibió una combinación de 133 jg de anti-PD-L1 (YW) y 164 jg de anti-PD-L1 (mut)/trampa de TGFp. El tratamiento se repitió los días 4 y 7. Los pesos corporales se midieron dos veces por semana para controlar la toxicidad. Los volúmenes tumorales se determinaron en diferentes puntos de tiempo usando la fórmula volumen tumoral (mm3) = largo x ancho x alto x 0,5236. Cualquier ratón con tumores de más de 2500 mm3 fue sacrificado siguiendo el protocolo de sanidad animal del instituto. La eficacia antitumoral se documenta como una proporción de T/C, en donde T y C son los volúmenes tumorales promedio del grupo tratado con anticuerpo o proteína de fusión, y el grupo tratado con el control de isotipo, respectivamente.

Todos los tratamientos fueron bien tolerados. La inhibición del crecimiento tumoral por los diversos tratamientos se muestra en la FIG. 13A, que mostró los volúmenes tumorales promedio de los ratones el día 17, el último día para el que se dispuso del volumen tumoral medio de todos los ratones, es decir, antes que los ratones con tumores de más de 2500 mm3 fueran sacrificados. La anti-PD-L1 (YW)/trampa de TGFp demostró una potente eficacia antitumoral, logrando una proporción T/C de 0,25 (p <0,0001) que es ligeramente mejor que la del tratamiento combinado en el Grupo 5 (T/C = 0,31, p <0,0001), pero superior a la del anticuerpo anti-PD-L1(YW) en el Grupo 2 (T/C=0,57, p<0,0001) y el control de la trampa TGFp en el Grupo 3 (T/C=0,66, p<0,0001). El efecto antitumoral sinérgico de la proteína de fusión del anticuerpo también resultó en una supervivencia prolongada de los ratones tratados, tal como se muestra en la FIG. 13B. El grupo tratado con anti-PD-L1/trampa de TGFp tuvo una mediana de tiempo de supervivencia de 65 días, que fue significativamente mejor que el del grupo tratado con anticuerpo anti-PD-L1 (YW) (24 días) o el grupo tratado con el control de trampa de TGFp (21 días). También se compara favorablemente con la mediana del tiempo de supervivencia de 53,5 días para el grupo de tratamiento combinado. A pesar de que la dosificación se detuvo después del día 7, la inhibición continua del crecimiento tumoral y la supervivencia prolongada de los ratones tratados con anti-PD-L1 (YW)/trampa de TGFp demuestran el efecto antitumoral inmunitario de larga duración resultante del bloqueo doble de las dos vías inmunosupresoras principales.

EJEMPLO 14 - Anti-PD-LI (YW)/trampa de TGF-p tiene un efecto antitumoral superior que es sinérgico de las actividades del anti-PD-L1 y de la trampa de TGFp en el modelo de tum or intramuscular MC38 (carcinoma colorrectal)

Los ratones hembra B6.129S2-Ighmtm1Cgn/ J de 8-12 semanas de vida (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) fueron inyectados con 0,5x106 células tumorales MC38 viables en 0,1 ml de PBS por vía intramuscular en el muslo derecho. Aproximadamente una semana después, cuando el tamaño medio del tumor alcanza unos 150-200 mm3, los ratones se clasificaron en grupos (N = 10) de modo que los tamaños medios de los tumores de todos los grupos fueran similares, y se inició el tratamiento mediante inyecciones intravenosas (día 0) y se repitió de nuevo cuatro días después (día 4). El grupo 1 recibió 133 |jg de control de anticuerpo de isotipo; El grupo 2 recibió 133 |jg de anticuerpo anti-PD-L1(y W); El grupo 3 recibió 164 jg de anti-PD-L1 (mut)/trampa de TGFp; El grupo 4 recibió 164 jg de anti-PD-L1 (YW)/trampa de TGFp; y el grupo 5 recibió una combinación de 133 jg de anti-PD-L1 (YW) y 164 jg de anti-PD-L1 (mut)/trampa de TGFp. Los pesos corporales se midieron dos veces por semana para controlar la toxicidad. Los volúmenes tumorales se determinaron en diferentes puntos de tiempo usando la fórmula volumen tumoral (mm3) = largo x ancho x alto x 0,5236. Cualquier ratón con tumores de más de 2500 mm3 fue sacrificado siguiendo el protocolo de sanidad animal del instituto. La eficacia antitumoral se documentó como una relación T/C, en donde T y C son los volúmenes tumorales promedio del grupo tratado con anticuerpo o proteína de fusión, y el grupo tratado con el control de isotipo, respectivamente.

Todos los tratamientos fueron bien tolerados. La inhibición del crecimiento tumoral por los diversos tratamientos se muestra en la FIG. 14A, que mostró los volúmenes tumorales promedio de los ratones el día 10, el último día para el que se dispuso del volumen tumoral medio de todos los ratones. La anti-PD-L1(YW)/trampa de TGFp demostró una eficacia antitumoral muy potente, logrando una proporción T/C de 0,14 (p <0,0001) que es ligeramente mejor que la del tratamiento combinado en el Grupo 5 (T/C = 0,19, p <0,0001), pero superior a la del anticuerpo anti-PD-L1(YW) en el Grupo 2 (T/C=0,34, p<0,0001) y el control de la trampa TGFp en el Grupo 3 (T/C=0,99, p<0,0001), que no tuvo actividad en este modelo. La eficacia antitumoral de la anti-PD-L1 (YW)/trampa de TGFp se confirmó adicionalmente mediante mediciones del peso tumoral tomadas el día 11. En este momento, el grupo de control de isotipo tuvo que ser sacrificado porque los tumores habían crecido más de 2500 mm3. Por lo tanto, el experimento se terminó y todos los grupos se sacrificaron y se determinaron los pesos tumorales. Los pesos tumorales individuales se muestran en la FIG. 14B. El análisis de los pesos tumorales confirmó que la terapia anti-PD-L1 (YW)/trampa de TGFp inhibió significativamente el crecimiento del tumor MC38 (T/C = 0,13; p<0,0001). La eficacia de la anti-PD-L1 (YW)/trampa de TGFp fue significativamente mejor que la observada con anti-PD-L1 (T/C = 0,37; p = 0,003) o el control de la trampa de TGFp (T/C = 1,0, p<0,0001). La eficacia antitumoral de la anti-PD-L1 (YW)/trampa de TGFp, basado en el análisis del peso tumoral, no fue estadísticamente mejor que los ratones tratados con la combinación de anti-PD-L1 y el control de trampa de TGFp (T/C = 0,17; p=0,96).

EJEMPLO 15 - El tratamiento combinado de Anti-PD-1 y trampa de TGFp no proporciona ningún efecto antitumoral aditivo en un modelo ortotópico EMT-6 (carcinoma de mama)

En este estudio, los presentes inventores probaron si el tratamiento combinado de anti-PD-1 y trampa de TGFp proporciona algún efecto antitumoral aditivo en el modelo ortotópico EMT-6. CT-011, también conocido como pidiluzumab, es un anticuerpo anti-PD1 humano humanizado que se probó en la clínica para el tratamiento de neoplasias hematológicas (Berger et al, Clin Cancer Res. 2008; 14:3044-3051). También reconoce la PD-1 murina y ha demostrado una actividad antitumoral que sinergiza con la ciclofosfamida y el tratamiento con vacunas en modelos de tumores singénicos (Mkrtichyan et al., Eur J Immunol. 2011; 41:2977-86). Las secuencias VH y VL de CT-011 se utilizaron para producir un anticuerpo recombinante con regiones constantes de IgG1/kappa humanas mediante técnicas convencionales de biología molecular.

Los ratones hembra de 8-12 semanas Jh (Igh-Jtm1Dhu) Balb/C (Taconic Farms, Hudson, NY) se inocularon con 0,25x106 células EMT6 viables en 0,1 ml de PBS en la almohadilla mamaria derecha. Aproximadamente una semana después, cuando el tamaño medio del tumor alcanzó unos 100 mm3, los ratones se clasificaron en grupos (N=10) de modo que los tamaños medios de los tumores de todos los grupos fueran similares y se inició el tratamiento mediante inyecciones intravenosas (día 0). El grupo 1 recibió 364 jg de control de anticuerpo de isotipo; El grupo 2 recibió 164 jg de anti-PD-L1 (mut)/trampa de TGFp, que sirvió como control de la trampa de TGFp; El grupo 3 recibió 200 jg de anti-PD-1 (CT-011); y el grupo 4 recibió una combinación de 200 jg de anti-PD-1 (CT-011) y 164 jg de anti-pD-L1 (mut)/trampa de TGFp de control. El tratamiento se repitió los días 2, 4, 7, 9 y 11, es decir, 3 veces por semana durante dos semanas. Los pesos corporales se midieron dos veces por semana para controlar la toxicidad. Los volúmenes tumorales se determinaron en diferentes puntos de tiempo usando la fórmula volumen tumoral (mm3) = largo x ancho x alto x 0,5236. Cualquier ratón con tumores de más de 2500 mm3 fue sacrificado siguiendo el protocolo de sanidad animal del instituto. La eficacia antitumoral se documentó como una relación T/C, en donde T y C son los volúmenes tumorales promedio del grupo tratado con anticuerpo o proteína de fusión, y el grupo tratado con el control de isotipo, respectivamente.

Todos los tratamientos fueron bien tolerados. El anti-PD-1 (CT-011) mostró una eficacia antitumoral muy modesta (T/C = 0,87, p> 0,05) en este modelo, mientras que su combinación con el control de trampa de TGFp tuvo la misma eficacia que el control de trampa de TGFp solo (Figura 15).

EJEMPLO 16 - El tratamiento combinado de Anti-PD-1 y trampa de TGFp no proporciona ningún efecto antitumoral aditivo en un modelo de tum or intramuscular MC38 (carcinoma colorrectal).

En este estudio, los presentes inventores probaron si el tratamiento combinado de anti-PD-1 y trampa de TGFp proporciona algún efecto antitumoral aditivo en el modelo de tumor colorrectal intramuscular MC38. Los ratones hembra B6.129S2-Ighmtm1Cgn/ J de 8-12 semanas de vida (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) fueron inyectados con 0,5x106 células tumorales MC38 viables en 0,1 ml de PBS por vía intramuscular en el muslo derecho. Aproximadamente una semana después, cuando el tamaño medio del tumor alcanza unos 190 mm3, los ratones se clasifican en grupos (N = 10) de modo que los tamaños medios de los tumores de todos los grupos sean similares, y se inicia el tratamiento mediante inyecciones intravenosas (día 0). El grupo 1 recibió 364 |jg de control de anticuerpo de isotipo los días 0, 2, 4 y 7; El grupo 2 recibió 164 jg del control de anti-PD-L1 (mut)/trampa de TGFp los días 0 y 2; El grupo 3 recibió 200 jg de anti-PD-1 (CT-011) los días 0, 2, 4 y 7; y el grupo 4 recibió una combinación de 200 jg de anti-PD-1 (CT-011) los días 0, 2, 4 y 7, y 164 jg de control de anti-PD-L1 (mut)/trampa de TGFp los días 0 y 2. Los pesos corporales se midieron dos veces por semana para controlar la toxicidad. Los volúmenes tumorales se determinaron en diferentes puntos de tiempo usando la fórmula volumen tumoral (mm3) = largo x ancho x alto x 0,5236. Cualquier ratón con tumores de más de 2500 mm3 fue sacrificado siguiendo el protocolo de sanidad animal del instituto. La eficacia antitumoral se documentó como una relación T/C, en donde T y C son los volúmenes tumorales promedio del grupo tratado con anticuerpo o proteína de fusión, y el grupo tratado con el control de isotipo, respectivamente.

Todos los tratamientos fueron bien tolerados. El anti-PD-1 (CT-011) mostró una eficacia antitumoral muy modesta (T/C = 0,87, p>0,05), mientras que el control de anti-PD-L1 (mut)/trampa de TGFp no tuvo eficacia en este modelo, tal como se ve en ejemplos anteriores. La combinación de anti-PD-1 (CT-011) con la trampa de TGFp de control no tuvo ninguna eficacia (FIG. 15).

EJEMPLO 17 - El tratamiento combinado de la trampa de TGFp con anti-LAG3 o anti-TIM-3 no proporciona ningún efecto antitumoral aditivo en un modelo ortotópico EMT-6 (carcinoma de mama)

En este estudio, los presentes inventores probaron si el tratamiento de combinación de la trampa de TGFp con anti-LAG3 o anti-TIM3 proporciona algún efecto antitumoral aditivo en el modelo ortotópico de tumor de mama EMT-6. El anticuerpo anti-LAG3 utilizado es un anticuerpo anti-LAG3 murino monoclonal IgG1 de rata C9B7W (BioXcell, Beverly, MA), que demostró tener sinergia con el tratamiento anti-PD-1 murino en modelos de tumores singénicos (Woo et al, Cancer Res, 2011; 72:917-27). El anticuerpo anti-TIM-3 utilizado es un anticuerpo anti-TIM3 murino monoclonal IgG2a de rata RMT3-23 (BioXcell, Beverly, MA), que también demostró tener sinergia con el tratamiento anti-PD-1 murino en modelos de tumores singénicos, aunque su eficacia como agente único fue relativamente modesta (Ngiow et al, Cancer Res, 2011; 71:3540-51).

Los ratones hembra de 8-12 semanas Jh (Igh-Jtm1Dhu) Balb/C (Taconic Farms, Hudson, NY) se inocularon con 0,25x106 células EMT6 viables en 0,1 ml de PBS en la almohadilla mamaria derecha. Aproximadamente una semana después, cuando el tamaño medio del tumor alcanzó unos 110 mm3, los ratones se clasificaron en grupos (N=9) de modo que los tamaños medios de los tumores de todos los grupos fueran similares y se inició el tratamiento mediante inyecciones intravenosas (día 0). El grupo 1 recibió 133 jg de control de anticuerpo de isotipo; El grupo 2 recibió 164 jg del control de anti-PD-L1 (mut)/trampa de TGFp; El grupo 3 recibió 200 jg de anti-LAG3; El grupo 4 recibió 250 jg de anti-TIM3; El grupo 5 recibió una combinación de 200 jg de anti-LAG3 y 164 jg de control de anti-PD-L1 (mut)/trampa de TGFp; y el Grupo 6 recibió una combinación de 250 jg de anti-TlM3 y 164 jg de control de anti-PD-L1 (mut)/trampa de TGFp. El tratamiento se repitió los días 2, 4, 7, 9 y 11, es decir, 3 veces por semana durante dos semanas. Los pesos corporales se midieron dos veces por semana para controlar la toxicidad. Los volúmenes tumorales se determinaron en diferentes puntos de tiempo usando la fórmula volumen tumoral (mm3) = largo x ancho x alto x 0,5236. Cualquier ratón con tumores de más de 2500 mm3 fue sacrificado siguiendo el protocolo de sanidad animal del instituto. La eficacia antitumoral se documentó como una relación T/C, en donde T y C son los volúmenes tumorales promedio del grupo tratado con anticuerpo o proteína de fusión, y el grupo tratado con el control de isotipo, respectivamente.

Como se ha observado anteriormente, el control de anti-PD-L1 (mut)/trampa de TGFp (Grupo 2) mostró una eficacia muy modesta en este modelo EMT-6. Anti-TIM3 (Grupo 4) como agente único mostró una eficacia igualmente modesta que la trampa de control, y en la terapia de combinación con la trampa de control (Grupo 6) no mostró ningún efecto aditivo. Anti-LAG3 como agente único (Grupo 3) o en terapia combinada con la trampa de control (Grupo 5) no mostró ninguna eficacia.

EJEMPLO 18 - El tratamiento combinado de la trampa de TGFp con anti-LAG3 o anti-TIM-3 no proporciona ningún efecto antitumoral aditivo en un modelo intramuscular MC38 (carcinoma colorrectal)

En este estudio, los presentes inventores probaron si el tratamiento combinado de la trampa de TGFp con anti-LAG3 (C9B7W) o anti-TIM3 (RMT3-23) proporciona algún efecto antitumoral aditivo en el modelo de tumor colorrectal MC38 intramuscular.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteína que comprende:

un primer polipéptido que comprende

a) TGFpRII humano, o un fragmento del mismo, capaz de unirse a TGFp; y

b) al menos una región variable de la cadena pesada de un anticuerpo o de un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen a la proteína humana de ligando de muerte programada 1 (PD-L1); y

un segundo polipéptido que comprende al menos una región variable de la cadena ligera de un anticuerpo o de un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen a la proteína humana PD-L1,

en donde el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:3,

en donde el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 1, y

en donde la cadena pesada del primer polipéptido y la cadena ligera del segundo polipéptido, cuando se combinan, forman un sitio de unión al antígeno que se une a PD-L1.

2. La proteína de la reivindicación 1 que comprende dos polipéptidos que tienen, cada uno, una secuencia de aminoácidos que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 3, y dos polipéptidos que tienen, cada uno, una secuencia de aminoácidos que consiste en la secuencia de aminoácidos del s Eq ID NO: 1.

3. Ácido nucleico que comprende una primera secuencia de nucleótidos que codifica el primer polipéptido según la reivindicación 1 y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica el segundo polipéptido según la reivindicación 1.

4. Una célula que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 3.

5. Un método para producir una proteína según la reivindicación 1 que comprende a) TGFpRII, o un fragmento del mismo capaz de unirse a TGFp, y b) un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a la proteína humana de ligando de muerte programada 1 (PD-L1), comprendiendo el método mantener una célula según la reivindicación 4 en condiciones que permitan la expresión de la proteína.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende además recolectar la proteína.

7. Una proteína según la reivindicación 1 para su uso en terapia.

8. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína según la reivindicación 1.

9. Una proteína según la reivindicación 1 para su uso en;

(i) un método para inhibir el crecimiento tumoral en un paciente, comprendiendo el método exponer el tumor a la proteína; o

(ii) un método para tratar el cáncer en un paciente, comprendiendo el método administrar la proteína al paciente con cáncer.

10. Una proteína para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el método comprende además exponer al paciente con cáncer a radiación y/o administrar un agente quimioterapéutico.

11. Una proteína para su uso de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en donde el tumor o cáncer se selecciona del grupo que consiste en colorrectal, de mama, de ovario, de páncreas, gástrico, de próstata, riñón, de cuello del útero, mieloma, linfoma, leucemia, de tiroides, endometrial, de útero, de vejiga, neuroendocrino, de cabeza y cuello, de hígado, nasofaríngeo, testicular, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, melanoma, cáncer de piel de células basales, cáncer de piel de células escamosas, dermatofibrosarcoma protuberans, carcinoma de células de Merkel, glioblastoma, glioma, sarcoma, mesotelioma y síndromes mielodisplásicos.

12. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proteína bloquea la interacción entre el PD-L1 humano y el receptor PD-1 humano.