ES2874233T3

ES2874233T3 - Composiciones y métodos para el tratamiento de citomegalovirus

Info

Publication number: ES2874233T3
Application number: ES12847559T
Authority: ES
Inventors: David Anderson; Anne-Catherine Fluckiger
Original assignee: Variation Biotechnologies Inc
Current assignee: Variation Biotechnologies Inc
Priority date: 2011-11-11
Filing date: 2012-11-09
Publication date: 2021-11-04
Anticipated expiration: 2032-11-09
Also published as: CN107875382A; BR112014011229B1; AU2020264275B2; US20230272013A1; AU2018203538A1; CN107875382B; CN104271745A; JP2015505299A; US11248026B2; CN111995664B; US20170349634A1; BR112014011229A2; CN111995664A; AU2020264275A1; CA3166278A1; RU2019139064A; AU2012335277B2; KR102301463B1; US20140308308A1; RU2737530C1

Abstract

Partícula similar a virus (VLP) bivalente que comprende: una proteína de fusión que comprende una porción N-terminal de una proteína gag encontrada en virus de la leucemia murina (MLV) fusionada en el sentido de 5' de una proteína pp65 de longitud completa encontrada en citomegalovirus humano (HCMV); en la que la porción N-terminal de la proteína gag no comprende una secuencia de polimerasa C-terminal encontrada en MLV, y en la que la porción N-terminal de la proteína gag comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; y un polipéptido que comprende una proteína gB de longitud completa encontrada en HCMV

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos para el tratamiento de citomegalovirus

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional estadounidense n.° 61/558.800, presentada el 11 de noviembre de 2011, y de la solicitud provisional estadounidense n.° 61/654.157, presentada el 1 de junio de 2012.

Antecedentes

El citomegalovirus humano (HCMV), un p-herpesvirus, es un patógeno que se produce de manera ubicua. En una persona inmunocompetente, la infección por HCMV pasa desapercibida normalmente, teniendo como mucho síntomas leves e inespecíficos. Por el contrario, determinados grupos de riesgo, por ejemplo, en pacientes inmunodeprimidos como pacientes con sida o receptores de trasplantes, y después de la infección prenatal, la infección por HCMV tiene manifestaciones graves (Staras SA et al., 2006 Clin Infect Dis 43 (9): 1143-51; Hebart H y col., 2004 Hum Immunol 65(5):432-6; Rowshani AT et al., 2005 Transplantation 79(4):381-6). Las terapias existentes incluyen el uso de inmunoglobulinas y agentes antivirales tales como ganciclovir y sus derivados, que son más eficaces cuando se usan de manera profiláctica o muy temprano durante la infección en poblaciones de riesgo. Sin embargo, las terapias existentes se caracterizan por una toxicidad significativa y una eficacia limitada, especialmente para la enfermedad de inicio tardío (Boeckh M., 2004 Pediatr Transplant 8 (supl. 5): 19-27; Limaye AP., 2004 Trasplantation 78(9):1390-6), y no han tenido impacto en la enfermedad congénita por HCMV. El desarrollo de una vacuna eficaz para proteger contra la enfermedad por HCMV se reconoce como una importante prioridad de salud pública (Arvin AM et al., 2004 Clin Infect Dis 39(2):233-9). Gonczol E et al (Expert Opinion on Biological Therapy, Informa Healthcare, vol. 1, n.° 3, 1 de mayo de 2001) describe combinaciones de proteínas conocidas de HCMv para su uso como vacuna. Berensci et al (Journal of Infectious Diseases, vol. 183, n.° 8, 1171-1179) describe ALVAC que expresa pp65. Bernstein et al (Journal of Infectious Diseases, vol. 185, n.° 5, 686-690) describe ALVAC que expresa gB de HCMV.

Sumario

Entre otras cosas, la presente invención proporciona una partícula similar a virus (VLP) bivalente que comprende una proteína de fusión que comprende una porción N-terminal de una proteína gag encontrada en virus de la leucemia murina (MLV) fusionada en el sentido de 5' de una proteína pp65 de longitud completa encontrada en citomegalovirus humano (HCMV); en la que la porción N-terminal de la proteína gag no comprende una secuencia de polimerasa C-terminal encontrada en MLV, y en la que la porción N-terminal de la proteína gag comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; y un polipéptido que comprende una proteína gB de longitud completa encontrada en HCMV. También se proporciona un método para la producción de una VLP bivalente, comprendiendo el método: transfectar conjuntamente una célula huésped con un primer vector que comprende un primer polinucleótido que codifica para una proteína de fusión que comprende una porción N-terminal de una proteína gag encontrada en virus de la leucemia murina (MLV) fusionada en el sentido de 5' de una proteína pp65 de longitud completa encontrada en citomegalovirus humano (HCMV), en la que la porción N-terminal de la proteína gag no comprende una secuencia de polimerasa C-terminal encontrada en MLV, y en la que la porción N-terminal de la proteína gag comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y en el que el primer polinucleótido que codifica para la proteína de fusión está bajo el control de un único promotor, y un segundo vector que comprende un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido gB de longitud completa encontrado en HCMV en el que el segundo vector comprende una secuencia señal en el sentido de 5' del segundo polinucleótido y una señal de poliadenilación en el sentido de 3' del segundo polinucleótido; y cultivar la célula huésped en un medio adecuado en condiciones que permitan la expresión de las proteínas codificadas por los vectores primero y segundo; y recuperar opcionalmente las VLP del medio y/o la células huésped. También se proporciona una composición farmacéutica que comprende una VLP bivalente tal como se define en el presente documento. En el presente documento se describen métodos y composiciones útiles para la profilaxis, tratamiento, y/o estudio de infección por citomegalovirus humano (HCMV). En algunas realizaciones, la presente invención proporciona partículas similares a virus (VLP) que comprenden una o más proteínas del núcleo del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV) e incluye uno o más epítopos de HCMV, tales como, por ejemplo, de las glicoproteínas de la envuelta de HCMV gB y/o gH y/o la proteína pp65 del tegumento. Entre otras cosas, la presente invención abarca el reconocimiento de que una combinación de antígenos (por ejemplo, glicoproteínas de la envuelta y proteínas estructurales) pueden conducir a una inducción mejorada de respuestas inmunitarias beneficiosas, por ejemplo que incluyen tanto una respuesta humoral (por ejemplo, producción de anticuerpos neutralizantes) y una respuesta celular (por ejemplo, activación de células T). Las VLP proporcionadas puede caracterizarse porque no contienen ADN viral y no son infecciosas. En algunas realizaciones, las VLP proporcionadas están rodeadas por una membrana lipídica, que contiene opcionalmente uno o más epítopos de glicoproteínas de la envuelta viral (por ejemplo, gB y/o gH) que son antígenos que desempeñan un papel en la inducción de anticuerpos neutralizantes de virus.

En algunas realizaciones, las VLP proporcionadas contienen uno o más epítopos de proteínas estructurales virales (por ejemplo, pp65) que son antígenos que desempeñan un papel en la inducción de respuestas inmunitarias celulares (por ejemplo, respuesta de células T). En algunas realizaciones, las proteínas estructurales virales utilizadas (por ejemplo, pp65) estimulan tanto la formación de células T auxiliares como inducen linfocitos T citotóxicos (LTC) contra HCMV.

En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona variantes de glicoproteínas de la envuelta viral (por ejemplo, gB y/o gH). En algunas realizaciones, una glicoproteína de la envuelta viral variante es o comprende una proteína de fusión. En algunas realizaciones, una variante de una glicoproteína viral comprende un dominio de proteína heterólogo (por ejemplo, un dominio transmembrana y/o citoplásmico de una proteína diferente). En algunas realizaciones, una variante de una proteína estructural viral comprende un antígeno o epítopo heterólogo. En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona VLP que comprenden variantes de proteínas estructurales virales. En algunas realizaciones, una variante de una proteína estructural viral es o comprende una proteína de fusión.

Tal como se usa en esta solicitud, los términos “alrededor de” y “aproximadamente” se usan como equivalentes. Cualquier número usado en esta solicitud con o sin alrededor de/aproximadamente se entiende que cubre cualquier fluctuación normal apreciada por un experto habitual en la técnica relevante.

Otras características, objetos y ventajas de la presente invención resultan evidentes en la descripción detallada que sigue. Sin embargo, debe entenderse que la descripción detallada, aunque indica las realizaciones de la presente invención, se proporciona únicamente a modo de ilustración, no de limitación.

Breve descripción de los dibujos

Los dibujos son sólo con fines de ilustración, no de limitación.

La figura 1 muestra el mapa de plásmidos de expresión de ADN (A) y la construcción de plásmidos de expresión recombinantes a modo de ejemplo (B).

La figura 2 muestra el análisis de FACS de antígenos de superficie heterólogos a modo de ejemplo en células de empaquetamiento HEK 293 (A) y análisis de inmunotransferencia de tipo Western de expresión de antígenos heteróloga en composiciones de VLP a modo de ejemplo (B).

Las figuras 3(A) y (B) muestran la determinación del tamaño de partícula y el índice de polidispersidad para dos composiciones de VLP a modo de ejemplo.

La figura 4 muestra los títulos de ELISA en ratones tratados con composiciones de gB/pp65 (A), gH-G/pp65 (B), o gB/gH-G/pp65 (C) VLP a modo de ejemplo.

La figura 5 muestra la actividad de anticuerpos neutralizantes en ratones tratados con composiciones de VLP a modo de ejemplo (evaluada en células fibroblásticas humanas).

La figura 6 muestra la actividad de anticuerpos neutralizantes en ratones tratados con composiciones de VLP a modo de ejemplo (evaluada en células epiteliales humanas).

La figura 7 muestra la actividad de anticuerpos neutralizantes en ratones tratados con composiciones de VLP a modo de ejemplo frente a una proteína gB recombinante (evaluada en células fibroblásticas humanas).

La figura 8 muestra respuestas de LTC específicos de antígeno en ratones tratados con composiciones de VLP a modo de ejemplo expresadas en células HEK 293, representadas como frecuencia de LTC basándose en la disminución de CFSE, control en células T CD3+ CD8+ (A) o la frecuencia de proliferación de LTC específicos de pp65 (B).

La figura 9 muestra títulos anti-gB y de anticuerpos neutralizantes en conejos tratados con composiciones de VLP a modo de ejemplo expresados en células HEK 293 (evaluados en células fibroblásticas humanas).

La figura 10 muestra títulos de anticuerpos neutralizantes en conejos tratados con composiciones de VLP a modo de ejemplo expresados en células HEK 293 (evaluados en células epiteliales humanas).

La figura 11 muestra imágenes de microscopía electrónica (ME) de tinción negativa de composiciones de VLP a modo de ejemplo expresadas en células CHO purificadas mediante (A) filtración de flujo tangencial (TFF) o (B) cromatografía de intercambio aniónico (AEX).

La figura 12 muestra títulos de anticuerpos neutralizantes en conejos tratados con composiciones de VLP a modo de ejemplo expresadas en células CHO y purificadas mediante filtración de flujo tangencial (TFF) y cromatografía de intercambio aniónico (AEX) (evaluados en células fibroblásticas humanas).

La figura 13 muestra títulos de anticuerpos neutralizantes en conejos tratados con composiciones de VLP a modo de ejemplo expresadas en células CHO purificadas mediante filtración de flujo tangencial (TFF) y cromatografía de intercambio aniónico (AEX) (evaluados en células epiteliales humanas).

La figura 14 muestra el índice de avidez de anticuerpos producidos en conejos tratados con composiciones de VLP a modo de ejemplo expresadas en células CHO y purificadas mediante filtración de flujo tangencial (TFF) y cromatografía de intercambio aniónico (AEX).

Definiciones

Para que la presente invención se entienda más fácilmente, en primer lugar se definen determinados términos a continuación. Se establecen definiciones adicionales para los siguientes términos y otros términos en toda la memoria descriptiva.

Aminoácido: tal como se usa en el presente documento, el término “aminoácido”, en su sentido más amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que pueda incorporarse en una cadena polipeptídica. En algunas realizaciones, un aminoácido tiene la estructura general H²N-C(H)(R)-COOH. En algunas realizaciones, un aminoácido es un aminoácido que se produce de manera natural. En algunas realizaciones, un aminoácido es un aminoácido sintético; en algunas realizaciones, un aminoácido es un d-aminoácido; en algunas realizaciones, un aminoácido es un l-aminoácido. “Aminoácido convencional” se refiere a cualquiera de los veinte l-aminoácidos convencionales que se encuentran comúnmente en péptidos que se producen de manera natural. “Aminoácido no convencional” se refiere a cualquier aminoácido, distinto de los aminoácidos convencionales, independientemente de si se prepara de manera sintética o se obtiene de una fuente natural. Tal como se usa en el presente documento, “aminoácido sintético” abarca aminoácidos químicamente modificados, que incluyen, pero no se limitan a, sales, derivados de aminoácidos (tales como amidas) y/o sustituciones. Los aminoácidos, incluyendo los aminoácidos carboxi-terminales y/o amino-terminales en los péptidos, pueden modificarse mediante metilación, amidación, acetilación, grupos protectores y/o sustitución con otros grupos químicos que pueden cambiar la semivida circulante del péptido sin afectar adversamente su actividad. Los aminoácidos pueden participar en un enlace disulfuro. Los aminoácidos pueden comprender una o modificaciones postraduccionales, tal como la asociación con una o más entidades químicas (por ejemplo, grupos metilo, grupos acetato, grupos acetilo, grupos fosfato, restos de formilo, grupos isoprenoides, grupos sulfato, restos de polietilenglicol, restos lipídicos, restos de hidratos de carbono, restos de biotina, etc.). El término “aminoácido” se usa de manera intercambiable con “residuo de aminoácido” y puede referirse a un aminoácido libre y/o a un residuo de aminoácido de un péptido. Resultará evidente a partir del contexto en el que se usa el término si se refiere a un aminoácido libre o a un residuo de un péptido.

Antígeno: tal como se usa en el presente documento, el término “antígeno” se refiere a una sustancia que contiene uno o más epítopos (lineales, conformacionales o ambos) que son reconocidos por anticuerpos. En determinadas realizaciones, un antígeno es o comprende un virus o un polipéptido viral. En algunas realizaciones, el término “antígeno” se refiere a un antígeno de subunidad (es decir, un antígeno que es independiente y distinto de un virus completo con el que el antígeno está asociado en la naturaleza; por ejemplo, un antígeno que está asociado con una partícula similar a virus). Alternativa o adicionalmente, en algunas realizaciones, el término “antígeno” se refiere a virus muertos, atenuados o inactivados. En determinadas realizaciones, un antígeno es un “inmunógeno”.

Aproximadamente o alrededor de: tal como se usa en el presente documento, el término “aproximadamente” o “alrededor de”, según se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia mencionado. En determinadas realizaciones, el término “aproximadamente” o “alrededor de” se refiere a un intervalo de valores que están dentro del 25%, el 20%, el 19%, el 18%, el 17%, el 16%, el 15%, el 14%, el 13%, el 12%, el 11%, el 10%, el 9%, el 8%, el 7%, el 6%, el 5%, el 4%, el 3%, el 2%, el 1%, o menos en cualquier dirección (mayor que o menor que) del valor de referencia mencionado a menos que se mencione lo contrario o resulte evidente de otra manera a partir del contexto (excepto cuanto tal número exceda el 100% de un posible valor).

Mejora: tal como se usa en el presente documento, el término “mejora” significa la prevención, reducción o atenuación de un estado, o la mejora del estado de un sujeto. Mejora incluye, pero no requiere la recuperación completa o la prevención completa de una enfermedad, trastorno o estado (por ejemplo, infección por HCMV). El término “prevención” se refiere a un retraso de la aparición de una enfermedad, trastorno o estado. La prevención puede considerarse completa cuando la aparición de una enfermedad, trastorno o estado se ha retrasado durante un periodo de tiempo definido previamente.

Porción característica: tal como se usa en el presente documento, el término una “porción característica” de una sustancia, en el sentido más amplio, es aquella que comparte un grado designado de identidad estructural con la sustancia intacta. En determinadas realizaciones, una porción característica comparte al menos una característica funcional con la sustancia intacta. Por ejemplo, una “porción característica” de una proteína o polipéptido es una que contiene un tramo continuo de aminoácidos, o una colección de tramos continuos de aminoácidos, que juntos son característicos de una proteína o polipéptido. En algunas realizaciones, cada tramo continuo de este tipo contiene generalmente al menos 2, 5, 10, 15, 20, 50 o más aminoácidos. En general, una porción característica de una sustancia (por ejemplo, de una proteína, anticuerpo, etc.) es uno que, además de la secuencia y/o identidad estructural especificadas anteriormente, comparte al menos una característica funcional con la sustancia intacta relevante. En algunas realizaciones, una porción característica puede ser biológicamente activa.

Secuencia característica: una “secuencia característica” es una secuencia que se encuentra en todos los miembros de una familia de polipéptidos o ácidos nucleicos y, por tanto, puede usarse por los expertos habituales en la técnica para definir miembros de la familia.

Dominio citoplásmico: tal como se conoce en la técnica, los polipéptidos tienen algunas veces dominios transmembrana, citoplásmicos y/o extracelulares. En general, un “dominio citoplásmico”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un dominio que tiene un atributo que está presente en el citoplasma. Tal como se apreciará, no se requiere que cada aminoácido en un dominio citoplásmico esté presente en el citoplasma. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un dominio citoplásmico se caracteriza porque un tramo o porción designados de una proteína se ubica sustancialmente en el citoplasma. Tal como se conoce bien en la técnica, las secuencias de aminoácido o ácido nucleico pueden analizarse usando una variedad de algoritmos para predecir la ubicación subcelular de proteínas (por ejemplo, ubicación citoplásmica). Tales programas a modo de ejemplo incluyen Psort (PSORT.org), Prosite (prosite.expasy.org), entre otros.

Forma de dosificación: tal como se usan en el presente documento, los términos “forma de dosificación” y “forma de dosificación unitaria” se refiere a una unidad físicamente discreta de un agente terapéutico para el paciente que va a tratarse. Cada unidad contiene una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado. Sin embargo, se entenderá que la dosificación total de la composición la decidirá el médico responsable dentro del alcance de la opinión médica razonable.

Pauta posológica: una “pauta posológica” (o “régimen terapéutico”), como se usa ese término en el presente documento, es un conjunto de dosis unitarias (normalmente más de una) que se administran de manera individual a un sujeto, normalmente separadas por periodos de tiempo. En algunas realizaciones, un agente terapéutico dado tiene una pauta posológica recomendada, que puede implicar una o más dosis. En algunas realizaciones, una pauta posológica comprende una pluralidad de dosis cada una de las cuales se separan entre sí por un periodo de tiempo de la misma duración; en algunas realizaciones, una pauta posológica comprende una pluralidad de dosis y al menos dos periodos de tiempo diferentes que separan las dosis individuales.

Expresión: tal como se usa en el presente documento, “expresión” de una secuencia de ácido nucleico se refiere a uno o más de los siguientes eventos: (1) producción de un molde de ARN a partir de una secuencia de ADN (por ejemplo, mediante transcripción); (2) procesamiento de un transcrito de ARN (por ejemplo, mediante corte y empalme, edición, formación de caperuza 5', y/o formación de extremo 3'); (3) traducción de un ARN para dar un polipéptido o proteína; y/o (4) modificación postraduccional de un polipéptido o proteína.

Dominio extracelular: tal como se conoce en la técnica, los polipéptidos tienen algunas veces dominios transmembrana, citoplásmicos y/o extracelulares. En general, un “dominio extracelular”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un dominio que tiene un atributo de estar presente fuera de una célula. Tal como se apreciará, no se requiere que cada aminoácido en un dominio extracelular esté presente fuera de la célula. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un dominio extracelular se caracteriza porque un tramo o porción designados de una proteína se ubica sustancialmente fuera de la célula. Tal como se conoce bien en la técnica, las secuencias de aminoácido o ácido nucleico pueden analizarse usando una variedad de algoritmos para predecir la ubicación subcelular de proteínas (por ejemplo, ubicación extracelular). Tales programas a modo de ejemplo incluyen Psort (PSORT.org), Prosite (prosite.expasy.org), entre otros.

Proteína de fusión: tal como se usa en el presente documento, el término “proteína de fusión” generalmente se refiere a un polipéptido que incluye al menos dos segmentos, cada uno de los cuales muestra un alto grado de identidad de aminoácidos con un resto peptídico que (1) se produce en la naturaleza, y/o (2) representa un dominio funcional de un polipéptido. Normalmente, un polipéptido que contiene al menos dos de tales segmentos se considera que es una proteína de fusión si los dos segmentos son restos que (1) no están incluidos en la naturaleza en el mismo péptido, y/o (2) no se han unido entre sí en un único polipéptido, y/o (3) se han unido entre sí a través de la acción de la mano del hombre.

Gen: tal como se usa en el presente documento, el término “gen” tiene su significado tal como se entiende en la técnica. Los expertos habituales en la técnica apreciarán que el término “gen” puede incluir secuencias reguladoras de genes (por ejemplo, promotores, potenciadores, etc.) y/o secuencias de intrones. Se apreciará además que las definiciones de gen incluyen referencias a ácidos nucleicos que no codifican proteínas sino que codifican moléculas de ARN funcionales tales como ARNt, agentes inductores de iARN, etc. Para mayor claridad, se indica que, tal como se usa en la presente solicitud, el término “gen” se refiere generalmente a una porción de un ácido nucleico que codifica para una proteína; el término puede abarcar opcionalmente secuencias reguladoras, tal como resultará evidente a partir del contexto para los expertos habituales en la técnica. Esta definición no pretende excluir la aplicación del término “gen” a unidades de expresión que no codifican para proteínas, sino aclarar que, en la mayoría de los casos, el término tal como se usa en este documento se refiere a un ácido nucleico que codifica para proteínas.

Producto génico o producto de expresión: tal como se usa en el presente documento, el término “producto génico” o “producto de expresión” se refiere generalmente a un ARN transcrito del gen (pre y/o posprocesamiento) o un polipéptido (pre y/o posmodificación) codificado por un ARN transcrito del gen.

Heterólogo: tal como se usa en el presente documento, el término “heterólogo” con respecto a una proteína o un polipéptido se refiere a una proteína o polipéptido que no se produce de manera natural en un organismo particular, tal como un retrovirus o VLP. En algunas realizaciones, una proteína o polipéptido heterólogo no se produce de manera natural en un virión de retrovirus particular. Tal como se usa en el presente documento, el término “heterólogo” con respecto a un dominio de proteína se refiere generalmente a un dominio de proteína que no se produce de manera natural en una proteína particular.

Inmunogénico: tal como se usa en el presente documento, el término “inmunogénico” significa que puede producir una respuesta inmunitaria en un animal huésped contra una entidad no huésped (por ejemplo, un antígeno de HCMV). En determinadas realizaciones, esta respuesta inmunitaria forma la base de la inmunidad protectora provocada por una vacuna contra un organismo infeccioso específico (por ejemplo, un HCMV).

Respuesta inmunitaria: tal como se usa en el presente documento, el término “respuesta inmunitaria” se refiere a una respuesta provocada en un animal. Una respuesta inmunitaria puede referirse a inmunidad celular, inmunidad humoral o puede implicar a ambas. Una respuesta inmunitaria también puede limitarse a una parte del sistema inmunitario. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, una composición inmunogénica puede inducir un aumento de la respuesta de IFNy. En determinadas realizaciones, una composición inmunogénica puede inducir una respuesta de IgA mucosa (por ejemplo, medida en lavados nasales y/o rectales). En determinadas realizaciones, una composición inmunogénica puede inducir una respuesta de IgG sistémica (por ejemplo, medida en suero). En determinadas realizaciones, una composición inmunogénica puede inducir anticuerpos neutralizantes de virus o una respuesta de anticuerpos neutralizantes.

Mejorar, aumentar o reducir: tal como se usa en el presente documento, los términos “mejorar”, “aumentar” o “reducir”, o equivalentes gramaticales, indican valores que son relativos a una medición de referencia, tal como una medición en el mismo individuo antes del inicio del tratamiento descrito en el presente documento, o una medición en un individuo de control (o múltiples individuos de control) en ausencia del tratamiento descrito en el presente documento.

Individuo, sujeto, paciente: tal como se usa en el presente documento, los términos “sujeto”, “individuo” o “paciente” se refieren a un sujeto mamífero humano o no humano. En algunas realizaciones, el individuo (también denominado “paciente” o “sujeto”) que está siendo tratado es un individuo (feto, lactante, niño, adolescente o adulto) que padece una enfermedad, por ejemplo, infección por HCMV. En algunas realizaciones, el sujeto tiene riesgo de infección por HCMV. En algunas realizaciones, el sujeto es un sujeto inmunodeprimido. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el sujeto inmunodeprimido se selecciona del grupo que consiste en un sujeto infectado por VIH, un paciente con sida, un receptor de trasplante, un sujeto pediátrico y un sujeto gestante. En algunas realizaciones, el sujeto ha estado expuesto a una infección por HCMV. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano.

Aislado: tal como se usa en el presente documento, el término “aislado” se refiere a una sustancia y/o entidad que (1) se ha separado de al menos algunos de los componentes con los que se asoció cuando se produjo inicialmente (ya sea en la naturaleza y/o en un entorno experimental), y/o (2) se ha producido, preparado y/o fabricado por la mano del hombre. Las sustancias y/o entidades aisladas pueden separarse desde aproximadamente el 10%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 91%, aproximadamente el 92%, aproximadamente el 93%, aproximadamente el 94%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99%, o más de aproximadamente el 99% de los otros componentes con los que se asociaron inicialmente. En algunas realizaciones, los agentes aislados son aproximadamente el 80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 91%, aproximadamente el 92%, aproximadamente el 93%, aproximadamente el 94%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99%, o más de aproximadamente el 99% puros. Tal como se usa en el presente documento, una sustancia es “pura” si está sustancialmente libre de otros componentes. Tal como se usa en el presente documento, el cálculo del porcentaje de pureza de sustancias y/o entidades aisladas no debe incluir excipientes (por ejemplo, tampón, disolvente, agua, etc.).

Ligador: tal como se usa en el presente documento, el término “ligador” se refiere a, por ejemplo, en una proteína de fusión, una secuencia de aminoácidos de una longitud apropiada distinta de la que aparece en una posición particular en la proteína natural y se diseña generalmente para que sea flexible y/o para interponer una estructura, tal como una hélice a , entre dos restos de proteínas. En general, un ligador permite a dos o más dominios de una proteína de fusión retener el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o más de la actividad biológica de cada uno de los dominios. Un ligador también puede denominarse espaciador.

Ácido nucleico: tal como se usa en el presente documento, el término “ácido nucleico,” en su sentido más amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que se incorpora o puede incorporarse en una cadena de oligonucleótidos. En algunas realizaciones, un ácido nucleico es un compuesto y/o sustancia que se incorpora o puede incorporarse en una cadena de oligonucleótidos a través de un enlace fosfodiéster. En algunas realizaciones, “ácido nucleico” se refiere a residuos de ácido nucleico individuales (por ejemplo, nucleótidos y/o nucleósidos). En algunas realizaciones, “ácido nucleico” se refiere a una cadena de oligonucleótidos que comprende residuos de ácido nucleico individuales. Tal como se usa en el presente documento, los términos “oligonudeótido” y “polinudeótido” pueden usarse de manera intercambiable. En algunas realizaciones, “ácido nucleico” abarca ARN así como ADN y/o ADNc monocatenario y/o bicatenario. Además, los términos “ácido nucleico,” “ADN,” ARN” y/o términos similares incluyen análogos de ácido nucleico, es decir, análogos que tienen una estructura principal distinta de fosfodiéster. Por ejemplo, los denominados “ácidos nucleicos peptídicos,” que se conocen en la técnica y tienen enlaces peptídicos en vez de enlaces fosfodiéster en la estructura principal, se consideran dentro del alcance de la presente invención. El término “secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos” incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas entre sí y/o codifican para la misma secuencia de aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos que codifican para proteínas y/o ARN pueden incluir intrones. Los ácidos nucleicos pueden purificarse a partir de fuentes naturales, producidas usando sistemas de expresión recombinantes y opcionalmente purificadas, sintetizadas químicamente, etc. Cuando sea apropiado, por ejemplo, en el caso de moléculas sintetizadas químicamente, los ácidos nucleicos pueden comprender análogos de nucleósidos tales como análogos que tienen bases o azúcares modificados químicamente, modificaciones de la estructura principal, etc. Una secuencia de ácido nucleico se presenta en la dirección de 5' a 3' a menos que se indique lo contrario. El término “segmento de ácido nucleico” se usa en el presente documento para referirse a una secuencia de ácido nucleico que es una porción de una secuencia de ácido nucleico más larga. En muchas realizaciones, un segmento de ácido nucleico comprende al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más residuos. En algunas realizaciones, un ácido nucleico tiene o comprende nucleósidos naturales (por ejemplo, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina y desoxicitidina); análogos de nucleósidos (por ejemplo, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metiladenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinil-citidina, C-5 propinil-uridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-propinil-uridina, C5-propinil-citidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina, 7-deazaadenosina, 7-deazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina y 2-tiocitidina); bases modificadas químicamente; bases modificadas biológicamente (por ejemplo, bases metiladas); bases intercaladas; azúcares modificados (por ejemplo, 2'-fluororibosa, ribosa, 2'-desoxiribosa, arabinosa y hexosa); y/o grupos fosfato modificados (por ejemplo, enlaces fosforotioatos y 5’-A/-fosforamidita). En algunas realizaciones, la presente invención se refiere específicamente a “ácidos nucleicos no modificados”, que significa ácidos nucleicos (por ejemplo, polinucleótidos y residuos, incluyendo nucleótidos y/o nucleósidos) que no se han modificado químicamente para facilitar o lograr la administración.

Farmacéuticamente aceptable: el término “farmacéuticamente aceptable” tal como se usa en el presente documento, se refiere a sustancias que, dentro del alcance de la opinión médica razonable, son adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica excesivas u otro problema o complicación, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable.

Polipéptido: tal como se usa en el presente documento, un “polipéptido”, en términos generales, es una cadena de al menos dos aminoácidos unidos entre sí mediante un enlace peptídico. En algunas realizaciones, un polipéptido puede incluir al menos 3-5 aminoácidos, cada uno de los cuales está unido a otros por medio de al menos un enlace peptídico. Los expertos habituales en la técnica apreciarán que los polipéptidos incluyen algunas veces aminoácidos “no naturales” u otras entidades que, no obstante, pueden integrarse en una cadena polipeptídica, opcionalmente.

Poliproteína: tal como se usa en el presente documento, el término “poliproteína”, se refiere generalmente a una proteína que, después de la síntesis, puede escindirse para producir varios polipéptidos funcionalmente distintos. Una poliproteína está codificada normalmente por una única secuencia de aminoácidos. En algunas realizaciones, una poliproteína no escindida retiene la actividad biológica de sus partes componentes. Algunos virus producen tales poliproteínas, por ejemplo, una poliproteína Gag, que puede retenerse como una poliproteína funcional o puede procesarse en varios polipéptidos funcionalmente distintos. Funcionalmente, la poliproteína Gag se divide en tres dominios: el dominio de unión a la membrana, que dirige la poliproteína Gag a la membrana celular; el dominio de interacción que promueve la polimerización de Gag; y el dominio tardío que facilita la liberación de viriones nacientes de la célula huésped. En general, la forma de la proteína Gag que media el ensamblaje de partículas virales es la poliproteína.

Porción de autoensamblaje: en general, una “porción de autoensamblaje”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un tramo relevante de una entidad que adopta una disposición definida sin la guía o gestión de una fuente externa. En algunas realizaciones, la entidad es una proteína. En algunas realizaciones, la entidad es una poliproteína. En alguna de tales realizaciones, el tramo relevante tiene al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 o más residuos. Puede presentarse autoensamblaje, por ejemplo, dentro del contexto de una célula (por ejemplo, in vivo). Alternativa o adicionalmente, puede presentarse autoensamblaje fuera del contexto de una célula (por ejemplo, in vitro). El autoensamblaje puede ser intramolecular (por ejemplo, plegamiento) y/o intermolecular. En algunas realizaciones, el autoensamblaje puede ser macromolecular mediante lo cual las entidades se autoensamblan para dar una estructura macromolecular compleja y/o extendida. Las entidades autoensambladas pueden presentar una amplia gama de motivos estructurales, incluyendo, pero sin limitarse a partículas, fibras, láminas y cintas. En algunas realizaciones, el autoensamblaje de una entidad es importante para una función biológica de la entidad. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el autoensamblaje de un lípido conduce a la formación de una estructura de membrana celular. En algunas realizaciones, el autoensamblaje de una proteína (por ejemplo, una proteína estructural viral) en un contexto celular conduce a la formación de una estructura de partícula (por ejemplo, una estructura de partícula viral). Por ejemplo, una poliproteína estructural viral puede contener una secuencia de direccionamiento que puede dirigir su ubicación a una membrana celular de su célula huésped (por ejemplo, membrana plasmática, endosoma, etc.) de la cual la poliproteína estructural viral puede brotar para formar una VLP que contiene material membranoso celular del huésped que rodea la poliproteína estructural viral.

Homología sustancial: la expresión “homología sustancial” se usa en el presente documento para hacer referencia a una comparación entre secuencias de aminoácido o ácido nucleico. Tal como apreciarán los expertos habituales en la técnica, se considera generalmente que dos secuencias son “sustancialmente homólogas” si contienen residuos homólogos en las posiciones correspondientes. Los residuos homólogos pueden ser residuos idénticos. Alternativamente, los residuos homólogos pueden ser residuos no idénticos con características estructurales y/o funcionales apropiadamente similares. Por ejemplo, como es bien conocido por los expertos habituales en la técnica, determinados aminoácidos se clasifican normalmente como aminoácidos “hidrófobos” o “hidrófilos” y/o tienen cadenas laterales “polares” o “no polares”. La sustitución de un aminoácido por otro del mismo tipo a menudo puede considerarse una sustitución “homóloga”.

Tal como se conoce bien en esta técnica, pueden compararse secuencias de aminoácido o ácido nucleico usando cualquiera de una variedad de algoritmos, incluyendo los disponibles en programas informáticos comerciales tales como BLASTN para secuencias de nucleótidos y BLASTP, Gapped BLAST y PSI-BLAST para secuencias de aminoácidos. Tales programas a modo de ejemplo se describen en Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996); Altschul, et al., “Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generación of protein database search programs”, Nucleic Acids Res.

25:3389-3402, 1997; Baxevanis, et al., Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; y Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, vol. 132), Humana Press, 1999. Además, para identificar secuencias homólogas, los programas mencionados anteriormente proporcionan normalmente una indicación del grado de homología. En algunas realizaciones, se considera que dos secuencias son sustancialmente homólogas si al menos el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o más de sus residuos correspondientes son homólogos a lo largo de un tramo relevante de residuos. En algunas realizaciones, el tramo relevante es una secuencia completa. En algunas realizaciones, el tramo relevante tiene al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 o más residuos.

Identidad sustancial: la expresión “identidad sustancial” se usa en el presente documento para hacer referencia a una comparación entre secuencias de aminoácido o ácido nucleico. Tal como apreciarán los expertos habituales en la técnica, se considera generalmente que dos secuencias son “sustancialmente idénticas” si contienen residuos idénticos en las posiciones correspondientes. Tal como se conoce bien en esta técnica, pueden compararse secuencias de aminoácido o ácido nucleico usando cualquiera de una variedad de algoritmos, incluyendo los disponibles en programas informáticos comerciales tales como BLASTN para secuencias de nucleótidos y BLASTP, Gapped BLAST y PSI-BLAST para secuencias de aminoácidos. Tales programas a modo de ejemplo se describen en Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996); Altschul et al., Nucleic Acid Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis et al., Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; y Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, vol. 132), Humana Press, 1999. Además, para identificar secuencias idénticas, los programas mencionados anteriormente proporcionan normalmente una indicación del grado de identidad. En algunas realizaciones, se considera que dos secuencias son sustancialmente idénticas si al menos el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o más de sus residuos correspondientes son idénticos a lo largo de un tramo relevante de residuos. En algunas realizaciones, el tramo relevante es una secuencia completa. En algunas realizaciones, el tramo relevante tiene al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 o más residuos.

Que padece: un individuo que “padece” una enfermedad, trastorno o estado (por ejemplo, infección por HCMV) ha sido diagnosticado y/o presenta uno o más síntomas de la enfermedad, trastorno o estado.

Susceptible a: un individuo que es “susceptible a” una enfermedad, trastorno o estado (por ejemplo, infección por HCMV) tiene riesgo de desarrollar la enfermedad, trastorno o estado. En algunas realizaciones, un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno o estado no muestra ningún síntoma de la enfermedad, trastorno o estado. En algunas realizaciones, a un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno o estado no se le ha diagnosticado la enfermedad, trastorno y/o estado. En algunas realizaciones, un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno o estado es un individuo que ha estado expuesto a condiciones asociadas con el desarrollo de la enfermedad, trastorno o estado (por ejemplo, el individuo ha estado expuesto a1HCMV).

Los síntomas se reducen: según la presente invención, los “síntomas se reducen” cuando uno o más síntomas de una enfermedad, trastorno o estado particular se reducen en magnitud (por ejemplo, intensidad, gravedad, etc.) o frecuencia. Para mayor claridad, un retraso en la aparición de un síntoma en particular se considera una forma de reducir la frecuencia de ese síntoma. No se pretende que la presente invención se limite únicamente a los casos en los que se eliminen los síntomas. La presente invención contempla específicamente un tratamiento tal que uno o más síntomas se reduce(n) (y de ese modo se “mejora” estado del sujeto), aunque no se eliminan por completo.

Cantidad terapéuticamente eficaz: tal como se usa en el presente documento, el término “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad suficiente para conferir un efecto terapéutico en el sujeto tratado, en una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico. El efecto terapéutico puede ser objetivo (es decir, medible mediante alguna prueba o marcador) o subjetivo (es decir, el sujeto da una indicación de o siente un efecto). En particular, la “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de una proteína o composición terapéutica para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o estado deseado, o para presentar un efecto detectable terapéutico o preventivo, tal como mejorando los síntomas asociados con la enfermedad, previniendo o retrasando la aparición de la enfermedad, y/o también disminuyendo la gravedad o frecuencia de síntomas de la enfermedad. Una cantidad terapéuticamente eficaz se administra comúnmente en una pauta posológica que puede comprender múltiples dosis unitarias. Para cualquier composición inmunogénica particular, una cantidad terapéuticamente eficaz (y/o una dosis unitaria apropiada dentro de una pauta posológica eficaz) puede variar, por ejemplo, dependiendo de la vía de administración, en combinación con otros agentes farmacéuticos. Además, la cantidad terapéuticamente eficaz específica (y/o dosis unitaria) para cualquier paciente particular puede depender de una variedad de factores incluyendo el trastorno que va a tratarse y la gravedad del trastorno; la actividad del agente farmacéutico específico empleado; la composición específica empleada; la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente; el momento de la administración, la vía de administración, y/o tasa de excreción o metabolismo de la composición inmunogénica específica empleada; la duración del tratamiento; y factores similares que se conocen bien en las técnicas médicas.

Dominio transmembrana: tal como se conoce en la técnica, los polipéptidos tienen algunas veces dominios transmembrana, citoplásmicos y/o extracelulares. En general, un “dominio transmembrana”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un dominio que tiene el atributo de estar presente en la membrana (por ejemplo, que abarca una parte o toda la membrana celular). Tal como se apreciará, no es necesario que todos los aminoácidos de un dominio transmembrana estén presentes en la membrana. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un dominio transmembrana se caracteriza porque un tramo o una porción designados de una proteína se ubica sustancialmente en la membrana. Tal como se conoce bien en la técnica, las secuencias de aminoácido o ácido nucleico pueden analizarse usando una variedad de algoritmos para predecir la ubicación subcelular de proteínas (por ejemplo, ubicación transmembrana). Tales programas a modo de ejemplo incluyen Psort (PSORT.org), Prosite (prosite.expasy.org), entre otros.

Tratamiento: tal como se usa en el presente documento, el término “tratamiento” (también “tratar” o “que trata”) se refiere a cualquier administración de una composición inmunogénica que alivia, mejora, mitiga, inhibe, retrasa el inicio, reduce la gravedad y/o reduce parcial o completamente la incidencia de uno o más síntomas o características de una enfermedad, trastorno y/o estado particular (por ejemplo, infección por HCMV) o la predisposición a la enfermedad. Tal tratamiento puede ser de un sujeto que no presenta signos de la enfermedad, trastorno y/o estado relevante y/o de un sujeto que presenta solo signos tempranos de la enfermedad, trastorno y/o estado. Alternativa o adicionalmente, tal tratamiento puede ser de un sujeto que presenta uno o más signos establecidos de la enfermedad, trastorno y/o estado relevante. En determinadas realizaciones, el término “tratar” se refiere a la vacunación de un paciente.

Vacunación: tal como se usa en el presente documento, el término “vacunación” se refiere a la administración de una composición destinada a generar una respuesta inmunitaria, por ejemplo a un agente causante de enfermedad (por ejemplo, HCMV). Para los fines de la presente invención, la vacunación puede administrarse antes, durante y/o después de la exposición a un agente causante de enfermedad y, en determinadas realizaciones, antes, durante y/o poco después de la exposición al agente. En algunas realizaciones, la vacunación incluye múltiples administraciones, apropiadamente espaciadas en el tiempo, de una composición de vacunación.

Vector: tal como se usa en el presente documento, “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al que está asociado. En algunas realizaciones, los vectores son capaces de replicación extracromosómica y/o expresión de ácidos nucleicos a los que están unidos en una célula huésped, tal como una célula eucariota y/o procariota. Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes unidos operativamente se denominan en el presente documento “vectores de expresión”.

Descripción detallada de determinadas realizaciones

Entre otras cosas, la presente invención proporciona métodos y composiciones útiles para la profilaxis, tratamiento, y/o estudio de la infección por citomegalovirus humano (HCMV). En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona partículas similares a virus (VLP) bivalentes que comprenden una o más proteínas del núcleo del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV) e incluyen uno o más epítopos de HCMV, tales como, por ejemplo, de glicoproteínas de la envuelta de HCMV gB y/o gH y/o proteína pp65 del tegumento. Entre otras cosas, la presente invención abarca el reconocimiento de que una combinación de antígenos (por ejemplo, glicoproteínas de la envuelta y proteínas estructurales) pueden conducir a inducción mejorada de respuestas inmunitarias beneficiosas, por ejemplo, que incluyen tanto una respuesta humoral (por ejemplo, producción de anticuerpos neutralizantes) como una respuesta celular (por ejemplo, activación de células T). Las VLP proporcionadas pueden caracterizarse porque contienen ARN o ADN no viral y no son infecciosas. En algunas realizaciones, las VLP proporcionadas contienen ARN o ADN viral y son infecciosas. En alguna de tales realizaciones, las VLP proporcionadas son útiles como vacuna de ADN.

En algunas realizaciones, la respuesta humoral inmunitaria en un sujeto se mantiene durante al menos aproximadamente 1 mes, al menos aproximadamente 2 meses, al menos aproximadamente 3 meses, al menos aproximadamente 4 meses, al menos aproximadamente 5 meses, al menos aproximadamente 6 meses, al menos aproximadamente 7 meses, al menos aproximadamente 8 meses, al menos aproximadamente 9 meses, al menos aproximadamente 10 meses, al menos aproximadamente 11 meses, al menos aproximadamente 12 meses, al menos aproximadamente 13 meses, al menos aproximadamente 14 meses, al menos aproximadamente 15 meses, al menos aproximadamente 16 meses, al menos aproximadamente 17 meses, al menos aproximadamente 18 meses, al menos aproximadamente 19 meses, al menos aproximadamente 20 meses, al menos aproximadamente 21 meses, al menos aproximadamente 22 meses, al menos aproximadamente 23 meses, al menos aproximadamente 24 meses, al menos aproximadamente 28 meses, al menos aproximadamente 32 meses, al menos aproximadamente 36 meses, al menos aproximadamente 40 meses, al menos aproximadamente 44 meses, al menos aproximadamente 48 meses, o más. En algunas realizaciones, la respuesta celular inmunitaria en un sujeto se mantiene durante al menos aproximadamente 1 mes, al menos aproximadamente 2 meses, al menos aproximadamente 3 meses, al menos aproximadamente 4 meses, al menos aproximadamente 5 meses, al menos aproximadamente 6 meses, al menos aproximadamente 7 meses, al menos aproximadamente 8 meses, al menos aproximadamente 9 meses, al menos aproximadamente 10 meses, al menos aproximadamente 11 meses, o al menos 12 meses.

En algunas realizaciones, las VLP proporcionadas están rodeadas por una membrana lipídica, que contiene opcionalmente uno o más epítopos de glicoproteínas de la envuelta viral (por ejemplo, gB y/o gH) que son antígenos que desempeñan un papel en la inducción de anticuerpos neutralizantes de virus.

En algunas realizaciones, las VLP proporcionadas contienen uno o más epítopos de proteínas estructurales virales (por ejemplo, pp65) que son antígenos que desempeñan un papel en la inducción de respuestas inmunitarias celulares (por ejemplo, respuesta de células T). En algunas realizaciones, las proteínas estructurales virales utilizadas (por ejemplo, pp65) tanto estimulan la formación de células T auxiliares (T^h) como también inducen los linfocitos T citotóxicos (LTC) contra HCMV

En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona variantes de glicoproteínas de la envuelta viral (por ejemplo, gB y/o gH). En algunas realizaciones, una glicoproteína de la envuelta viral variante es o comprende una proteína de fusión. En algunas realizaciones, una variante de una glicoproteína viral comprende un dominio de proteína heterólogo (por ejemplo, un dominio transmembrana y/o citoplásmico de una proteína diferente). En algunas realizaciones, una variante de una proteína estructural viral comprende un antígeno o epítopo heterólogo. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona VLP que comprenden variantes de proteínas estructurales virales. En algunas realizaciones, una variante de una proteína estructural viral es o comprende una proteína de fusión.

I. Partículas similares a virus (VLP)

Los retrovirus son virus de ARN con envuelta que pertenecen a la familia Retroviridae. Después de la infección de una célula huésped por un retrovirus, se transcribe el ADN para dar ADN a través de la enzima transcriptasa inversa. Luego se incorpora el ADN en el genoma de la célula huésped por una enzima integrasa y después de esto se replica como parte del ADN de la célula huésped. La familia Retroviridae incluye los siguientes géneros Alpharetrovirus, Betaretrovirus, Gammearetrovirus, Deltaretrovirus, Epsilonretrovirus, Lentivirus y Spumavirus. Los huéspedes para esta familia de retrovirus son generalmente vertebrados. Los retrovirus producen un virión infeccioso que contiene una nucleocápside esférica (el genoma viral en un complejo con proteínas estructurales virales) rodeada por una bicapa lipídica derivada de la membrana de la célula huésped.

Los vectores retrovirales pueden usarse para generar viriones con envuelta que son infecciosos y o bien competentes para la replicación o defectuosos para la replicación. Los vectores retrovirales infecciosos competentes para la replicación contienen todos los genes necesarios para la síntesis de viriones y continúan propagándose una vez que se produce la infección de la célula huésped. Los vectores retrovirales infecciosos defectuosos para la replicación no se propagan después de la infección inicial. Esto se logra mediante el reemplazo de la mayoría de las regiones codificantes de los retrovirus con genes o secuencias de nucleótidos que van a transferirse; de manera que vector no puede elaborar las proteínas requeridas para rondas adicionales de replicación.

Alternativa o adicionalmente, pueden usarse vectores retrovirales para generar partículas similares a virus (VLP) que carecen de un genoma derivado de retrovirus y son tanto no infecciosos como no replicantes. Debido a las propiedades ventajosas de las VLP, pueden utilizarse VLP como sistema de administración de antígenos. Además, debido a que las VLP no son infecciosas, pueden administrarse de manera segura como composición inmunogénica (por ejemplo, una vacuna). Generalmente, las VLP son estructuralmente similares a los viriones con envuelta descritos anteriormente, pero carecen de un genoma derivado de retrovirus, por lo que es poco probable que se produzca la replicación viral. La expresión de proteínas de la cápside (por ejemplo, Gag) de algunos virus (por ejemplo, virus de la leucemia murina, tales como virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV)) conduce al autoensamblaje en partículas similares al virus nativo correspondiente, partículas que están libres de material genético viral.

Se ha preparado una amplia variedad de VLP. Por ejemplo, se han preparado VLP que incluyen proteínas de la cápside únicas o múltiples o bien con o bien sin proteínas de la envuelta y/o glicoproteínas de superficie. En algunos casos, las VLP no tienen envuelta y se ensamblan mediante la expresión de sólo una proteína de la cápside principal, tal como se muestra para las VLP preparadas a partir de hepadnavirus (por ejemplo, Engerix™, GSK y Recombivax HB™, Merck), virus del papiloma (por ejemplo, Cervarix™, GSK y Gardasil™, Merck), parovirus, o poliomavirus. En algunas realizaciones, las VLP tienen envuelta y pueden comprender múltiples proteínas antigénicas encontradas en el virus nativo correspondiente. Las VLP se parecen normalmente a su virus nativo correspondiente y pueden ser estructuras particuladas multivalentes. En algunas realizaciones, pueden presentarse proteínas antigénicas de manera interna dentro de la VLP, como un componente de la estructura de la v Lp , y/o en la superficie de la VLP. La presente invención abarca el reconocimiento de que la presentación de un antígeno en el contexto de una VLP es ventajosa para la inducción de anticuerpos neutralizantes contra el antígeno en comparación con otras formas de presentación de antígeno, por ejemplo, antígenos solubles no asociados con una VLP. Los anticuerpos neutralizantes reconocen más a menudo estructuras terciarias o cuaternarias; esto requiere a menudo la presentación de proteínas antigénicas, como las glicoproteínas de la envuelta, en su conformación viral nativa. Alternativa o adicionalmente, las VLP pueden ser útiles para presentar antígenos en un contexto que induce la inmunidad celular (por ejemplo, respuesta de células T). La presente invención abarca además la idea de que el uso de combinaciones de antígenos en sistemas de VLP pueden generar una respuesta inmunitaria mejorada.

A. Proteínas estructurales

En algunas realizaciones, la presente descripción utiliza VLP que se componen de una o más proteínas estructurales retrovirales (por ejemplo, Gag). En algunas realizaciones, una proteína estructural para su uso según la presente invención es una proteína estructural de alfaretrovirus (por ejemplo, virus de la leucosis aviar), betaretrovirus (Virus del tumor mamario de ratón), gammaretrovirus (virus de la leucemia murina), deltaretrovirus (virus de la leucemia bovina), épsilonretrovirus (virus del sarcoma dérmico de Walley), lentivirus (virus de inmunodeficiencia humana 1) o espumavirus (espumavirus de chimpancé). En determinadas realizaciones, una poliproteína estructural es una proteína estructural del virus de la leucemia murina (MLV). Los genomas de estos retrovirus están fácilmente disponibles en las bases de datos. Los genes Gag de todos estos retrovirus tienen una similitud estructural global y dentro de cada grupo de retrovirus se conservan en el nivel de aminoácido. Las proteínas Gag retrovirales funcionan principalmente en el ensamblaje viral. El gen Gag en forma de una poliproteína da lugar a las proteínas estructurales del núcleo de la VLP. El gen Gag de MLV codifica para un precursor de poliproteína de 65 kDa que se escinde de manera proteolítica en 4 proteínas estructurales (Matrix (MA); p12; cápside (CA); y nucleocápside (NC)), por la proteasa de MLV, en el virión maduro. Los retrovirus ensamblan una cápside inmadura que se compone de la poliproteína Gag formada a partir del polipéptido Gag pero desprovista de otros elementos virales como proteasa viral con Gag como proteína estructural de la partícula de virus inmadura. De manera funcional, la poliproteína Gag se divide en tres dominios: el dominio de unión a membrana, que dirige la poliproteína Gag a la membrana celular; el dominio de interacción que promueve la polimerización de Gag; y el dominio tardío que facilita la liberación de viriones nacientes de la célula huésped. La forma de la proteína Gag que media el ensamblaje de partículas virales es la poliproteína.

En algunas realizaciones, una proteína estructural retroviral para su uso según la presente invención es una parte N-terminal de MLV de un polipéptido Gag. Tal como se usa en el presente documento, el término “polipéptido Gag” es el polipéptido estructural derivado de retrovirus que es responsable de la formación de las VLP descritas en el presente documento y se refiere a una secuencia de polipéptido cuya secuencia de aminoácidos incluye al menos una secuencia característica de Gag. En la técnica se conocen una amplia variedad de secuencias de Gag de diversos retrovirus y los expertos habituales en la técnica, refiriéndose a tales secuencias, pueden identificar fácilmente secuencias que son generalmente características de proteínas Gag, y/o de polipéptidos Gag particulares.

Un polipéptido Gag a modo de ejemplo para su uso según la presente invención se muestra como SEQ ID NO:1 a continuación.

Secuencia de aminoácidos de Gag de MMLV (SEQ ID NO:1) MGQTVTTPLSLTLGHWKDVERIAHNQSVDVk KRRWVTFCSAEWPTFNVGWPRDGTFN RDLITQVKIKWSPGPHGHPDQVPYIVTWEALAFDPPPWVKPFVHPKPPPPLPPSAPSLPL EPPRSTPPRSSLYPALTPSLGAKPKPQVLSDSGGPLIDLLTEDPPPYRDPRPPPSDRDGNGG EATP AGE APDP SPMASRLRGRREPP V AD S TTS Q AFPLRAGGN GQLQ YWPF S S SDL YNW

k n n n p s f s e d p g k l t a l ie s v l it h q p t w d d c q q l l g t l l t g e e k q r v l l e a r k a v r g d DGRPTQLPNEVDAAFPLERPDWDYTTQAGRNHLVHYRQLLLAGLQNAGRSPTNLAKV

k g it q g p n e s p s a f l e r l k e a y r r y t p y d p e d p g q e t n v s m s f iw q s a p d ig r k l e r l e d LKNKTLGDLVREAEKIFNKRETPEEREERIRRETEEKEERRRTEDEQKEKERDRRRHREM SKLLATWSGQKQDRQGGERRRSQLDRDQCAYCKEKGHWAKDCPKKPRGPRGPRPQT SLLTLDD (SEQ ID NO:l)

Secuencia de nucleótidos de Gag de MMLV (SEQ ID NO:2)

A TCtCtCtCCAGA ^{c t g t t a c c a c t c c c t t a a g t t t g a c c t t a g g t c a c t g g a a a g a t g t c}GAGCGGATCGCTC AC A ACC AGTCGGT AGATGTC A AGA AGAGACGTTGGGTT A CCTT CTGCTCTGCAGA A TGGCC A A CCTTTA A CGTCGGA TGGCCGCGA GA CGGC A CCTTTA A

^{c c g a g a c c t c} a ^{t c a} eee a ^{g g t t a a g a t c a a g g t c t t t t c a rrT G G T :r.r.G r a t g g a} e a eee a ^{g a c c a g g t c c c c t a c a t c g t g a c c t g g g a a g c c t t g g c t t t t g a c c c c c c t c c}CTGGGTCAAGCCCTTTGTACACCCTAAGCCTCCGCCTCCTCTTCCTCCATCCGCCCCG TCTCTCCCCCTTGA A CCTCCTCGTTCGA CCCCGCCTCG A TCCTCCCTTT ATCC A GCCC TC ACTCCTTCTCT AGGCGCC A A ACCTA A ACCTC A AGTTCTTTCTGAC AGTGGGGGGC CGCTC A TCGA CCT A CTT ACA GA A GA CCCCCCGCCTT A T A GGGA CCC A A GA CC A CCCC CTTCCGA C A GGGA CGGA A A TGGTGGA GA A GCGA CCCCTGCGGGA GA GGC A CCGGA CCCCTCCCC A A TGGC A TCTCGCCT A CGTGGGA GA CGGGA GCCCCCTGTGGCCGA CTC

CACTACCTCGCAGGCATTCCCCCTCCGCGCAGGAGGAAACGGACAGCTTCAATACT GGCCGTTCTCCTCTTCTGACCTTTACAACTGGAAAAATAATAACCCTTCTTTTTCTGA AGATCCAGGTAAACTGACAGCTCTGATCGAGTCTGTTCTCATCACCCATCAGCCCAC CTGGGACGACTGTCAGCAGCTGTTGGGGACTCTGCTGACCGGAGAAGAAAAACAAC GGGTGCTCTTAGAGGCTAGAAAGGCGGTGCGGGGCGATGATGGGCGCCCCACTCAA CTGCCCAATGAAGTCGATGCCGCTTTTCCCCTCGAGCGCCCAGACTGGGATTACACC ACCCAGGCAGGTAGGAACCACCTAGTCCACTATCGCCAGTTGCTCCTAGCGGGTCTC CAAAACGCGGGCAGAAGCCCCACCAATTTGGCCAAGGTAAAAGGAATAACACAAG GGCCCAATGAGTCTCCCTCGGCCTTCCTAGAGAGACTTAAGGAAGCCTATCGCAGGT ACACTCCTTATGACCCTGAGGACCCAGGGCAAGAAACTAATGTGTCTATGTCTTTCA TTTGGCAGTCTGCCCCAGACATTGGGAGAAAGTTAGAGAGGTTAGAAGATTTAAAA AACAAGACGCTTGGAGATTTGGTTAGAGAGGCAGAAAAGATCTTTAATAAACGAGA AACCCCGGAAGAAAGAGAGGAACGTATCAGGAGAGAAACAGAGGAAAAAGAAGA ACGCCGT AGGAC AGAGGAT GAGC AGAAAGAGA AAGAAAGAGAT CGT AGGAGAC AT AGAGAGATGAGCAAGCTATTGGCCACTGTCGTTAGTGGACAGAAACAGGATAGACA GGGAGGAGAACGAAGGAGGTCCCAACTCGATCGCGACCAGTGTGCCTACTGCAAAG AAAAGGGGCACTGGGCTAAAGATTGTCCCAAGAAACCACGAGGACCTCGGGGACC AAGACCCCAGACCTCCCTCCTGACCCTAGATGAC (SEQ ID N0:2)

Secuencia de nucleótidos de Gag de MMLV con codones optimizados (SEQ ID NO:3)

ATGGGAC AGAC AGT C ACT AC ACCCCT GAGCCTGAC ACT GGGAC ATT GGA AAGACGT GGAGAGGATTGCACATAACCAGAGCGTGGACGTGAAGAAACGGAGATGGGTCACCT TTTGCTCCGCCGAGTGGCCAACATTCAATGTGGGATGGCCCCGAGATGGCACCTTCA ACCGGGACCTGATCACTCAGGTGAAGATCAAGGTCTTCTCTCCAGGACCCCACGGCC ATCCAGATCAGGTGCCCTACATCGTCACCTGGGAGGCTCTGGCATTTGACCCCCCTC CATGGGTGAAGCCTTTCGTCCACCCAAAACCACCTCCACCACTGCCTCCATCTGCCC CTAGTCTGCCACTGGAACCCCCTCGGTCAACCCCACCCAGAAGCTCCCTGTATCCCG CACTGACACCTAGCCTGGGGGCCAAGCCTAAACCACAGGTGCTGTCTGATAGTGGC GGGCCTCTGATCGATCTGCTGACCGAGGACCCTCCACCATACCGCGACCCACGACCT CCACCAAGCGACCGGGACGGAAACGGAGGAGAGGCTACACCCGCAGGCGAAGCCC CCGATCCTAGTCCAATGGCATCAAGGCTGCGCGGGAGGCGCGAACCTCCAGTGGCC GACT C A ACC AC A AGCC AGGC ATTT CC ACTGAGGGCCGGGGGAAAT GGAC AGCT CC A GTATTGGCCCTT CTCT AGTTC AGAT CT GT AC AACT GGAAGA AC AAT AACCCT AGCTT CAGCGAGGACCCAGGCAAACTGACCGCCCTGATCGAATCCGTGCTGATTACCCACC AGCCCACATGGGACGATTGTCAGCAGCTCCTGGGCACCCTGCTGACCGGAGAGGAA AAGC AGAGAGT GCT GCT GGAGGCT AGGAAAGC AGT CCGCGGGGACGAT GGA AGGC CAACACAGCTCCCCAATGAGGTGGATGCCGCTTTCCCTCTGGAACGGCCAGATTGGG ACTATACTACCCAGGCTGGACGCAACCACCTGGTGCATTACCGGCAGCTCCTGCTGG CTGGACTGCAGAATGCAGGGCGCAGCCCCACTAACCTGGCCAAGGTGAAAGGAATC ACCCAGGGCCCCAATGAGTCCCCTTCTGCATTCCTGGAGCGGCTGAAGGAAGCCTAC CGACGGTATACTCCCTACGATCCTGAGGACCCAGGCCAGGAAACCAACGTGAGTAT GAGCTTCATCTGGCAGTCCGCTCCTGACATTGGCCGAAAACTGGAGCGGCTGGAAG ATCTGAAGAACAAGACCCTGGGCGACCTGGTGCGGGAGGCAGAAAAGATCTTCAAC AAAAGGGAGACTCCAGAGGAACGGGAGGAAAGAATTAGAAGGGAAACAGAGGAA AAGGAGGAACGCCGACGGACTGAGGATGAACAGAAGGAGAAAGAAAGAGACCGGC GGCGGCACCGGGAGATGTCTAAGCTGCTGGCCACCGTGGTCAGTGGCCAGAAACAG GATCGACAGGGAGGAGAGCGACGGAGAAGCCAGCTCGATCGGGACCAGTGCGCCT

ATTGTAAGGAAAAAGGGCATTGGGCTAAGGACTGCCCCAAGAAACCCAGAGGCCCA CGCGGGCCCCGACCTCAGACTTCCCTGCTGACCCTGGACGAT (SEQ ID N 0:3)

Secuencia de nucleótidos de Gag de MMLV con codones optimizados (SEQ ID NO:21)

ATGGGACAGACCGTCACAACACCCCTGAGCCTGACCCTGGGACATTGGAAAGACGT GGAGAGGATCGCACATAACCAGAGCGTGGACGTGAAGAAACGGAGATGGGTCACA TTCTGCAGTGCTGAGTGGCCAACTTTTAATGTGGGATGGCCCCGAGACGGCACTTTC AACAGGGATCTGATCACCCAGGTGAAGATCAAGGTCTTTAGCCCAGGACCTCACGG ACATCCAGACCAGGTGCCTTATATCGTCACCTGGGAGGCACTGGCCTTCGATCCCCC TCCATGGGTGAAGCCATTTGTCCACCCAAAACCACCTCCACCACTGCCTCCAAGTGC CCCTTCACTGCCACTGGAACCACCCCGGAGCACACCACCCCGCAGCTCCCTGTATCC TGCTCTGACTCCATCTCTGGGCGCAAAGCCAAAACCACAGGTGCTGAGCGACTCCG GAGGACCACTGATTGACCTGCTGACAGAGGACCCCCCACCATACCGAGATCCTCGG CCTCCACCAAGCGACCGCGATGGAAATGGAGGAGAGGCTACTCCTGCCGGCGAAGC CCCTGACCCATCTCCAATGGCTAGTAGGCTGCGCGGCAGGCGCGAGCCTCCAGTGG C AGAT AGC ACC AC AT CCC AGGCCTT CCCTCT GAGGGCTGGGGGAAAT GGGC AGCT C CAGTATTGGCCATTTTCTAGTTCAGACCTGTACAACTGGAAGAACAATAACCCCTCT TTCAGTGAGGACCCCGGCAAACTGACCGCCCTGATCGAATCCGTGCTGATTACCCAT CAGCCCACATGGGACGATTGTCAGCAGCTCCTGGGCACCCTGCTGACCGGAGAGGA AAAGCAGCGCGTGCTGCTGGAGGCTCGCAAAGCAGTCCGAGGGGACGATGGACGG CCCACACAGCTCCCTAATGAGGTGGACGCCGCTTTTCCACTGGAAAGACCCGACTGG GATTATACTACCCAGGCAGGGAGAAACCACCTGGTCCATTACAGGCAGCTCCTGCT GGC AGGCCT GC AGAAT GCCGGGAGAT CCCCC ACC AACCTGGCC AAGGT GA AAGGC A TC AC AC AGGGGCCT AAT GAGT C ACC AAGCGCCTTT CT GGAGAGGCTGAAGGAAGCT TACCGACGGTATACCCCATACGACCCTGAGGACCCCGGACAGGAAACAAACGTCTC CATGTCTTTCATCTGGCAGTCTGCCCCAGACATTGGGCGGAAGCTGGAGAGACTGGA AGACCTGAAGAACAAGACCCTGGGCGACCTGGTGCGGGAGGCTGAAAAGATCTTCA ACAAACGGGAGACCCCCGAGGAAAGAGAGGAAAGGATTAGAAGGGAAACTGAGGA AAAGGAGGAACGCCGACGGACCGAGGACGAACAGAAGGAGAAAGAACGAGATCG GCGGCGGCACCGGGAGATGTCAAAGCTGCTGGCCACCGTGGTCAGCGGACAGAAAC AGGACAGACAGGGAGGAGAGCGACGGAGAAGCCAGCTCGACAGGGATCAGTGCGC ATACTGTAAGGAAAAAGGCCATTGGGCCAAGGATTGCCCCAAAAAGCCAAGAGGAC CAAGAGGACCAAGACCACAGACATCACTGCTGACCCTGGACGAC (SEQ ID NO:21)

Normalmente, en la naturaleza, una proteína Gag incluye una gran extensión C-terminal que puede contener actividad enzimática de proteasa retroviral, transcriptasa inversa e integrasa. Sin embargo, el ensamblaje de las VLP no requiere generalmente la presencia de tales componentes. En algunos casos, una proteína Gag retroviral sola (por ejemplo, que carece de una extensión C-terminal, que carece de uno o más de ARN genómico, transcriptasa inversa, proteasa viral o proteína de la envuelta) puede autoensamblarse para formar las VLP tanto in vitrn como in vivo (Sharma S et al., 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 10803-8). La poliproteína retroviral Gag sola puede oligomerizarse y ensamblarse para dar las VLP.

En algunas realizaciones, un polipéptido Gag para su uso según la presente invención carece de una extensión C-terminal y/o contiene una extensión C-terminal modificada. Un polipéptido Gag puede incluir opcionalmente uno o más polipéptidos adicionales (por ejemplo, un antígeno heterólogo). En algunas realizaciones, un polipéptido Gag se expresa conjuntamente con un antígeno heterólogo (por ejemplo, bajo promotores independientes y/o como proteínas independientes). En algunas realizaciones, un polipéptido Gag se expresa como una proteína de fusión con un antígeno heterólogo. El polipéptido Gag puede unirse a un antígeno heterólogo para crear una proteína de fusión sin alterar la función de Gag. Por ejemplo, una secuencia codificante para un antígeno heterólogo puede someterse a corte y empalme en la secuencia codificante del polipéptido Gag, por ejemplo, en el extremo 3’ de la secuencia codificante del polipéptido Gag. En algunas realizaciones, una secuencia codificante para un antígeno heterólogo puede someterse a corte y empalme en marco en la secuencia codificante del polipéptido Gag. En algunas realizaciones, una secuencia codificante del polipéptido Gag y un antígeno heterólogo pueden expresarse mediante un único promotor. En algunas realizaciones, un antígeno heterólogo se inserta en (por ejemplo, se fusiona a) el extremo C-terminal de un polipéptido Gag. Sin querer limitarse a ninguna teoría, se cree que la fusión de un polipéptido Gag autoensamblante a un antígeno heterólogo crea una proteína de fusión que actúa como Gag sin modificar y como resultado permitirá que al antígeno incorporarse en los componentes estructurales de una VLP resultante. En algunas realizaciones, los componentes estructurales de VLP sirve como inmunógenos eficaces (por ejemplo, para la inducción de la respuesta celular inmunitaria). Por ejemplo, las VLP proporcionadas pueden comprender un polipéptido Gag retroviral (por ejemplo, MMLV Gag) y un componente estructural de Hc Mv (por ejemplo, pp65). En alguna de tales realizaciones, pp65 se incorpora en la VLP y sirve como antígeno para provocar una respuesta inmunitaria contra HCMV.

Un polipéptido de fusión Gag-pp65 a modo de ejemplo para su uso según la presente invención se muestra como SEQ ID NO:4

Secuencia de aminoácidos de Gag de MMLV - pp65 de CMV (SEQ ID NO:4)

m g q t v t t p l s l t l g h w k d v e r i a h n q s v d v k k r r w v t f c s a e w p t f n v g w p r d g TFNRDLITQVKIKVFSPGPHGHPDQVPYIVTWEALAFDPPPWVKPFVHPKPPPPLPP SAPSLPLEPPRSTPPRSSLYPALTPSLGAKPKPQVLSDSGGPLIDLLTEDPPPYRDPRP PPSDRDGNGGEATPAGEAPDPSPMASRLRGRREPPVADSTTSQAFPLRAGGNGQLQ YWPFSSSDLYNWKNNNPSFSEDPGKLTALIESVL1THQPTYVDDCQQLLGTLLTGEE KQRVLLEARKAVRGDDGRPTQLPNEVDAAFPLERPDWDYTTQAGRNHLVHYRQL

l l a g l q n a g r s p t n l a k v k g i t q g p n e s p s a f l e r l k e a y r r y t p y d p e d p g q e t n VSMSFIWQSAPDIGRKLERLEDLKNKTLGDLVREAEKIFNKRETPEEREERIRRETE

e k e e r r r t e d e q k e k e r d r r r h r e m s k l l a t w s g q k q d r q g g e r r r s q l d r d q CAYCKEKGHWAKDCPKKPRGPRGPRPQTSLLTLDDCESRGRRCPEMISVLGPISGHV LKAVFSRGDTPVLPHETRLLQTGIHVRVSQPSLILVSQYTPDSTPCHRGDNQLQVQHTYF TGSEVENVSVNVHNPTGRSICPSOEPMSIYVYALPLKMLNIPSINVHHYPSAAERKHRHL PVADAVIHASGKOMWOARLTVSGLAWTROONOWKEPDVYYTSAFVFPTKDVALRHV VCAHELVCSMENTRATKMQVIGDQYVKVYLESFCEDVPSGKLFMHVTLGSDVEEDLT MTRNPOPFMRPHERNGFTVLCPKNMIIKPGKISHIMLDVAFTSHEHFGLLCPKSIPGLSIS

g n l l m n g q q if l e v q a ir e t v e l r q y d p v a a l f f f d id l l l q r g p q y s e h p t f t s q y r iq GKLEYRHTWDRHDEGAAQGDDDVWTSGSDSDEELVTTERKTPRVTGGGAMAGASTSA GRKRKSASSATACTAGVMTRGRLKAESTVAPEEDTDEDSDNEIHNPAVFTWPPWQAGI LARNLVPMVATVQGQNLKYQEFFWDANDIYRIFAELEGVWQPAAQPKRRRHRQDALP GPCIASTPKKHRG* (SEQ ID NO:4) (secuencia de aminoácidos de Gag de MMLV en negrita)

Secuencia de nucleótidos de Gag de MMLV - pp65 de CMV (SEQ ID NO:5)

ATGGGGGAGAGTGTTAGGAGTGGGTTAAGTTTGAGGTTAGGTGAGTGGAAAGAT GTGGAGGGGATGGGTGAGAAGGAGTGGGTAGATGTGAAGAAGAGAGGTTGGGT TACCTTCTGCTCTGCAGAATGGCCAACCTTTAACGTCGGATGGCCGCGAGACG GCACCTTTAACCGAGACCTCATCACCCAGGTTAAGATCAAGGTCTTTTCACCTG GCCCGCATGGACACCCAGACCAGGTCCCCTACATCGTGACCTGGGAAGCCTTG GGTTTTGAGGGGGGTGGGTGGGTGAAGGGGTTTGTAGAGGGTAAGGGTGGGGGT CCTCTTCCTCCATCCGCCCCGTCTCTCCCCCTTGAACCTCCTCGTTCGACCCCG GGTGGATGGTGGGTTTATGGAGGGGTGAGTGGTTGTGTAGGGGGGAAAGGTAAA GGTGAAGTTGTTTGTGAGAGTGGGGGGGGGGTGATGGAGGTAGTTAGAGAAGA CCCCCCGCCTTATAGGGACCCAAGACCACCCCCTTCCGACAGGGACGGAAATG GTGGAGA AGCGACCCCTGCGGGAGAGGCACCGGACCCCTCCCCAATGGCATCT GGGGTAGGTGGGAGAGGGGAGGGGGGTGTGGGGGAGTGGAGTAGGTGGGAGGG ATTCCCCCTCCGCGCAGGAGGAAACGGACAGCTTCAATACTGGCCGTTCTCCT CTTCTGACCTTTACAACTGGAAAAATAATAACCCTTCTTTTTCTGAAGATCCAG GTAAACTGACAGCTCTGATCGAGTCTGTTCTCATCACCCATCAGCCCACCTGGG ACGACTGTCAGCAGCTGTTGGGGACTCTGCTGACCGGAGAAGAAAAACAACGG GTGCTCTTAGAGGCTAGAAAGGCGGTGCGGGGCGATGATGGGCGCCCCACTCA ACTGCCCAATGAAGTCGATGCCGCTTTTCCCCTCGAGCGCCCAGACTGGGATT ACACCACCCAGGCAGGTAGGAACCACCTAGTCCACTATCGCCAGTTGCTCCTA GCGGGTCTCCAAAACGCGGGCAGAAGCCCCACCAATTTGGCCAAGGTAAAAGG AATAACACAAGGGCCCAATGAGTCTCCCTCGGCCTTCCTAGAGAGACTTAAGG AAGCCTATCGCAGGTACACTCCTTATGACCCTGAGGACCCAGGGCAAGAAACT AATGTGTCTATGTCTTTCATTTGGCAGTCTGCCCCAGACATTGGGAGAAAGTTA GAGAGGTTAGAAGATTTAAAAAACAAGACGCTTGGAGATTTGGTTAGAGAGGC AGAAAAGATCTTTAATAAACGAGAAACCCCGGAAGAAAGAGAGGAACGTATCA GGAGAGAAACAGAGGAAAAAGAAGAACGCCGTAGGACAGAGGATGAGCAGAA AGAGAAAGAAAGAGATCGTAGGAGACATAGAGAGATGAGCAAGCTATTGGCCA CTGTCGTTAGTGGACAGAAACAGGATAGACAGGGAGGAGAACGAAGGAGGTC CCAACTCGATCGCGACCAGTGTGCCTACTGCAAAGAAAAGGGGCACTGGGCTA AAGATTGTCCCAAGAAACCACGAGGACCTCGGGGACCAAGACCCCAGACCTCC CTCCTGACCCTAGATGACTGTGAGTCGCGCGGTCGCCGTTGTCCCGAAATGATATC CGTACTGGGTCCCATTTCGGGGCACGTGCTGAAAGCCGTGTTTAGTCGCGGCGACAC GCCGGTGCTGCCGCACGAGACGCGACTCCTGCAGACGGGTATCCACGTGCGCGTGA GCCAGCCCTCGCTGATCCTGGTGTCGCAGTACACGCCCGACTCGACGCCATGCCACC GCGGCGACAATCAGCTGCAGGTGCAGCACACGTACTTTACGGGCAGCGAGGTGGAG AACGTGTCGGTCAACGTGCACAACCCCACGGGCCGGAGCATCTGCCCCAGCCAAGA GCCCATGTCGATCTATGTGTACGCGCTGCCGCTCAAGATGCTGAACATCCCCAGCAT CAACGTGCACCACTACCCGTCGGCGGCCGAGCGCAAACACCGACACCTGCCCGTAG CTGACGCTGTGATTCACGCGTCGGGCAAGCAGATGTGGCAGGCGCGTCTCACGGTCT CGGGACTGGCCTGGACGCGTCAGCAGAACCAGTGGAAAGAGCCCGACGTCTACTAC ACGTCAGCGTTCGTGTTTCCCACCAAGGACGTGGCACTGCGGCACGTGGTGTGCGCG CACGAGCTGGTTTGCTCCATGGAGAACACGCGCGCAACCAAGATGCAGGTGATAGG TGACCAGTACGTCAAGGTGTACCTGGAGTCCTTCTGCGAGGACGTGCCCTCCGGCAA GCTCTTTATGCACGTCACGCTGGGCTCTGACGTGGAAGAGGACCTGACGATGACCCG CAACCCGCAACCCTTCATGCGCCCCCACGAGCGCAACGGCTTTACGGTGTTGTGTCC CAAAAATATGATAATCAAACCGGGCAAGATCTCGCACATCATGCTGGATGTGGCTTT TACCTCACACGAGCATTTTGGGCTGCTGTGTCCCAAGAGCATCCCGGGCCTGAGCAT CTCAGGTAACCTATTGATGAACGGGCAGCAGATCTTCCTGGAGGTGCAAGCGATAC GCGAGACCGTGGAACTGCGTCAGTACGATCCCGTGGCTGCGCTCTTCTTTTTCGATA TCGACTTGCTGCTGCAGCGCGGGCCTCAGTACAGCGAACACCCCACCTTCACCAGCC AGTATCGCATCCAGGGCAAGCTTGAGTACCGACACACCTGGGACCGGCACGACGAG GGTGCCGCCCAGGGCGACGACGACGTCTGGACCAGCGGATCGGACTCCGACGAGGA ACTCGTAACCACCGAGCGCAAGACGCCCCGCGTTACCGGCGGCGGCGCCATGGCGG GCGCCTCCACTTCCGCGGGCCGCAAACGCAAATCAGCATCCTCGGCGACGGCGTGC ACGGCGGGCGTTATGACACGCGGCCGCCTTAAGGCCGAGTCCACCGTCGCGCCCGA AGAGGACACCGACGAGGATTCCGACAACGAAATCCACAATCCGGCCGTGTTCACCT GGCCGCCCTGGCAGGCCGGCATCCTGGCCCGCAACCTGGTGCCCATGGTGGCTACG GTTCAGGGTCAGAATCTGAAGTACCAGGAGTTCTTCTGGGACGCCAACGACATCTAC CGCATCTTCGCCGAATTGGAAGGCGTATGGCAGCCCGCTGCGCAACCCAAACGTCG

CCGCCACCGGCAAGACGCCTTGCCCGGGCCATGCATCGCCTCGACGCCCAAAAAGC ACCGAGGTTAG (SEQ ID N0:5) (secuencia de nucleótidos de Gag de MMLV en negrita)

Secuencia de nucleótidos de Gag de MMLV - pp65 de CMV con codones optimizados (SEQ ID NO:6) ATGGGACAGACAGTCACTACACCCCTGAGCCTGACACTGGGACATTGGAAAGA CGTGGAGAGGATTGCACATAACCAGAGCGTGGACGTGAAGAAACGGAGATGG GTCACCTTTTGCTCCGCCGAGTGGCCAACATTCAATGTGGGATGGCCCCGAGA TGGCACCTTCAACCGGGACCTGATCACTCAGGTGAAGATCAAGGTCTTCTCTCC AGGACCCCACGGCCATCCAGATCAGGTGCCCTACATCGTCACCTGGGAGGCTC TGGCATTTGACCCCCCTCCATGGGTGAAGCCTTTCGTCCACCCAAAACCACCTC CACCACTGCCTCCATCTGCCCCTAGTCTGCCACTGGAACCCCCTCGGTCAACCC CACCCAGAAGCTCCCTGTATCCCGCACTGACACCTAGCCTGGGGGCCAAGCCT AAACCACAGGTGCTGTCTGATAGTGGCGGGCCTCTGATCGATCTGCTGACCGA GGACCCTCCACCATACCGCGACCCACGACCTCCACCAAGCGACCGGGACGGAA ACGGAGGAGAGGCTACACCCGCAGGCGAAGCCCCCGATCCTAGTCCAATGGCA TCAAGGCTGCGCGGGAGGCGCGAACCTCCAGTGGCCGACTCAACCACAAGCCA GGCATTTCCACTGAGGGCCGGGGGAAATGGACAGCTCCAGTATTGGCCCTTCT CTAGTTCAGATCTGTACAACTGGAAGAACAATAACCCTAGCTTCAGCGAGGAC CCAGGCAAACTGACCGCCCTGATCGAATCCGTGCTGATTACCCACCAGCCCAC ATGGGACGATTGTCAGCAGCTCCTGGGCACCCTGCTGACCGGAGAGGAAAAGC AGAGAGTGCTGCTGGAGGCTAGGAAAGCAGTCCGCGGGGACGATGGAAGGCC AACACAGCTCCCCAATGAGGTGGATGCCGCTTTCCCTCTGGAACGGCCAGATT GGGACTATACTACCCAGGCTGGACGCAACCACCTGGTGCATTACCGGCAGCTC CTGCTGGCTGGACTGCAGAATGCAGGGCGCAGCCCCACTAACCTGGCCAAGGT GAAAGGAATCACCCAGGGCCCCAATGAGTCCCCTTCTGCATTCCTGGAGCGGC TGAAGGAAGCCTACCGACGGTATACTCCCTACGATCCTGAGGACCCAGGCCAG GAAACCAACGTGAGTATGAGCTTCATCTGGCAGTCCGCTCCTGACATTGGCCG AAAACTGGAGCGGCTGGAAGATCTGAAGAACAAGACCCTGGGCGACCTGGTGC GGGAGGCAGAAAAGATCTTCAACAAAAGGGAGACTCCAGAGGAACGGGAGGA AAGAATTAGAAGGGAAACAGAGGAAAAGGAGGAACGCCGACGGACTGAGGAT GAACAGAAGGAGAAAGAAAGAGACCGGCGGCGGCACCGGGAGATGTCTAAGC TGCTGGCCACCGTGGTCAGTGGCCAGAAACAGGATCGACAGGGAGGAGAGCG ACGGAGAAGCCAGCTCGATCGGGACCAGTGCGCCTATTGTAAGGAAAAAGGGC ATTGGGCTAAGGACTGCCCCAAGAAACCCAGAGGCCCACGCGGGCCCCGACCT CAGACTTCCCTGCTGACCCTGGACGATTGCGAGAGCCGGGGCCGGCGGTGCCCA GAAATGATCTCTGTGCTGGGGCCCATTAGTGGACATGTGCTGAAGGCCGTCTTCTCC AGGGGAGACACCCCCGTGCTGCCTCACGAGACTCGACTGCTGCAGACCGGCATCCA TGTGCGGGTCTCCCAGCCCTCTCTGATTCTGGTGTCACAGTATACACCAGATAGCAC TCCCTGCCACAGAGGAGACAATCAGCTCCAGGTGCAGCATACCTACTTTACAGGCTC CGAGGTCGAAAACGTGTCTGTCAATGTGCACAACCCTACCGGCAGGAGCATCTGTC CTAGCCAGGAGCCAATGAGCATCTACGTGTACGCCCTGCCTCTGAAGATGCTGAATA TCCCATCAATTAACGTCCACCATTACCCTAGCGCAGCCGAACGGAAGCACAGACAT CTGCCAGTGGCCGACGCTGTCATCCATGCCAGCGGCAAACAGATGTGGCAGGCAAG ACTGACCGTGTCCGGGCTGGCCTGGACAAGGCAGCAGAATCAGTGGAAGGAGCCCG ACGTGTACTATACCAGCGCCTTCGTGTTCCCTACCAAAGACGTGGCCCTGAGACATG TGGT GT GCGC AC AT GAGCT GGTGT GC AGC AT GGA AA AC ACT AGGGCC ACC A AGAT G CAGGTCATCGGCGATCAGTATGTCAAAGTGTACCTGGAGAGTTTTTGCGAAGACGTG CCATCAGGGAAGCTGTTCATGCATGTGACCCTGGGCAGCGATGTCGAGGAAGACCT GACCATGACAAGAAATCCACAGCCCTTTATGAGACCCCACGAGAGGAATGGGTTCA CTGTGCTGTGCCCCAAGAACATGATCATTAAGCCTGGAAAAATCAGTCATATTATGC TGGATGTGGCCTTTACATCACACGAGCATTTCGGACTGCTGTGCCCCAAATCCATCC CTGGACTGAGCATTTCCGGCAATCTGCTGATGAACGGCCAGCAGATCTTCCTGGAAG TGCAGGCCATCCGGGAGACCGTCGAACTGCGACAGTATGACCCAGTGGCTGCACTG TTCTTTTTCGACATCGACCTGCTGCTGCAGCGAGGACCACAGTACAGCGAGCACCCT ACTTTTACCTCCCAGTATCGGATTCAGGGGAAGCTGGAGTACAGGCACACCTGGGAT CGCCATGACGAAGGAGCCGCTCAGGGGGACGATGACGTGTGGACATCTGGCAGTGA TTCAGACGAGGAACTGGTGACAACTGAGCGAAAAACCCCCCGGGTGACAGGAGGA GGGGCAATGGCAGGGGCCAGCACCAGCGCAGGGCGGAAGCGAAAAAGCGCCAGCA GCGCCACAGCATGTACCGCCGGCGTGATGACTAGAGGAAGGCTGAAGGCCGAGTCT ACAGTCGCTCCCGAGGAAGATACTGACGAGGATAGTGACAATGAAATCCACAACCC CGCCGTGTTCACCTGGCCACCTTGGCAGGCAGGGATTCTGGCTCGCAACCTGGTCCC CATGGTGGCAACCGTCCAGGGACAGAATCTGAAGTATCAGGAGTTTTTCTGGGATGC TAACGACATCTACCGGATTTTTGCAGAGCTGGAAGGCGTGTGGCAGCCAGCAGCCC AGCCCAAACGACGGAGACATCGACAGGACGCTCTGCCAGGACCTTGTATCGCCAGC ACACCAAAGAAGCACAGGGGCTAA (SEQ ID N0:6) (secuencia de nucleótidos de Gag de MMLV en negrita)

Secuencia de nucleótidos de Gag - pp65 de CMV de MMLV con codones optimizados (SEQ ID NO:22)

ATGGGACAGACCGTCACAACACCCCTGAGCCTGACCCTGGGACATTGGAAAGA CGTGGAGAGGATCGCACATAACCAGAGCGTGGACGTGAAGAAACGGAGATGG GTCACATTCTGCAGTGCTGAGTGGCCAACTTTTAATGTGGGATGGCCCCGAGA CGGCACTTTCAACAGGGATCTGATCACCCAGGTGAAGATCAAGGTCTTTAGCC CAGGACCTCACGGACATCCAGACCAGGTGCCTTATATCGTCACCTGGGAGGCA CTGGCCTTCGATCCCCCTCCATGGGTGAAGCCATTTGTCCACCCAAAACCACCT CCACCACTGCCTCCAAGTGCCCCTTCACTGCCACTGGAACCACCCCGGAGCAC ACCACCCCGCAGCTCCCTGTATCCTGCTCTGACTCCATCTCTGGGCGCAAAGCC AAAACCACAGGTGCTGAGCGACTCCGGAGGACCACTGATTGACCTGCTGACAG AGGACCCCCCACCATACCGAGATCCTCGGCCTCCACCAAGCGACCGCGATGGA AATGGAGGAGAGGCTACTCCTGCCGGCGAAGCCCCTGACCCATCTCCAATGGC TAGTAGGCTGCGCGGCAGGCGCGAGCCTCCAGTGGCAGATAGCACCACATCCC AGGCCTTCCCTCTGAGGGCTGGGGGAAATGGGCAGCTCCAGTATTGGCCATTT TCTAGTTCAGACCTGTACAACTGGAAGAACAATAACCCCTCTTTCAGTGAGGAC CCCGGCAAACTGACCGCCCTGATCGAATCCGTGCTGATTACCCATCAGCCCAC ATGGGACGATTGTCAGCAGCTCCTGGGCACCCTGCTGACCGGAGAGGAAAAGC AGCGCGTGCTGCTGGAGGCTCGCAAAGCAGTCCGAGGGGACGATGGACGGCC CACACAGCTCCCTAATGAGGTGGACGCCGCTTTTCCACTGGAAAGACCCGACT GGGATTATACTACCCAGGCAGGGAGAAACCACCTGGTCCATTACAGGCAGCTC CTGCTGGCAGGCCTGCAGAATGCCGGGAGATCCCCCACCAACCTGGCCAAGGT GAAAGGCATCACACAGGGGCCTAATGAGTCACCAAGCGCCTTTCTGGAGAGGC TGAAGGAAGCTTACCGACGGTATACCCCATACGACCCTGAGGACCCCGGACAG GAAACAAACGTCTCCATGTCTTTCATCTGGCAGTCTGCCCCAGACATTGGGCG GAAGCTGGAGAGACTGGAAGACCTGAAGAACAAGACCCTGGGCGACCTGGTG

CGGGAGGCTGAAAAGATCTTCAACAAACGGGAGACCCCCGAGGAAAGAGAGG AAAGGATTAGAAGGGAAACTGAGGAAAAGGAGGAACGCCGACGGACCGAGGA CGAACAGAAGGAGAAAGAACGAGATCGGCGGCGGCACCGGGAGATGTCAAAG CTGCTGGCCACCGTGGTCAGCGGACAGAAACAGGACAGACAGGGAGGAGAGC GACGGAGAAGCCAGCTCGACAGGGATCAGTGCGCATACTGTAAGGAAAAAGGC CATTGGGCCAAGGATTGCCCCAAAAAGCCAAGAGGACCAAGAGGACCAAGACC ACAGACATCACTGCTGACCCTGGACGACTGCGAGAGCCGGGGCCGGCGGTGCCC AGA A ATG ATCTCTGTGCTGGGGCCC ATTAGTGGACATGT GCTGA AGGCCGTCTT CTC CAGGGGAGACACCCCCGTGCTGCCTCACGAGACTCGACTGCTGCAGACCGGCATCC ATGTGCGGGTCTCCCAGCCCTCTCTGATTCTGGTGTCACAGTATACACCAGATAGCA CTCCCTGCCACAGAGGAGACAATCAGCTCCAGGTGCAGCATACCTACTTTACAGGCT CCGAGGTCGAAAACGTGTCTGTCAATGTGCACAACCCTACCGGCAGGAGCATCTGT CCTAGCCAGGAGCCAATGAGCATCTACGTGTACGCCCTGCCTCTGAAGATGCTGAAT ATCCCATCAATTAACGTCCACCATTACCCTAGCGCAGCCGAACGGAAGCACAGACA TCTGCCAGTGGCCGACGCTGTCATCCATGCCAGCGGCAAACAGATGTGGCAGGCAA GACTGACCGTGTCCGGGCTGGC CTGG AC A AGGC AGC AGA ATC AGTGGA AGGAGCCC GACGTGTACTATACCAGCGCCTTCGTGTTCCCTACCAAAGACGTGGCCCTGAGACAT GTGGTGTGCGCACATGAGCTGGTGTGCAGCATGGAAAACACTAGGGCCACCAAGAT GC AGGTC ATCGGCG ATC AGTATGTC A A AGTGTACCTGGAG AGTTTTTGCG A AG ACGT GCCATCAGGGAAGCTGTTCATGCATGTGACCCTGGGCAGCGATGTCGAGGAAGACC TGACCATGACAAGAAATCCACAGCCCTTTATGAGACCCCACGAGAGGAATGGGTTC ACTGTGCTGTGCCCCAAGAACATGATCATTAAGCCTGGAAAAATCAGTCATATTATG CTGG ATGTGGCCTTTAC ATC AC ACGAGC ATTTCGGACTGCTGTGCCCC A A ATCC ATC CCTGGACTGAGCATTTCCGGCAATCTGCTGATGAACGGCCAGCAGATCTTCCTGGAA GTGCAGGCCATCCGGGAGACCGTCGAACTGCGACAGTATGACCCAGTGGCTGCACT GTTCTTTTTCGACATCGACCTGCTGCTGCAGCGAGGACCACAGTACAGCGAGCACCC T ACTTTTACCT CCC AGT ATCGGATTC AGGGGA A GCTGGAGT AC AGGC AC ACCTGGGA TCGCCATGACGAAGGAGCCGCTCAGGGGGACGATGACGTGTGGACATCTGGCAGTG ATTCAGACGAGGAACTGGTGACAACTGAGCGAAAAACCCCCCGGGTGACAGGAGG AGGGGC A ATGGC A GGGGCC AGCACC AGCGC AGGGCGG A AGCG A A A A AGCGCC AGC AGCGCCACAGCATGTACCGCCGGCGTGATGACTAGAGGAAGGCTGAAGGCCGAGTC TACAGTCGCTCCCGAGGAAGATACTGACGAGGATAGTGACAATGAAATCCACAACC CCGCCGTGTTCACCTGGCCACCTTGGCAGGCAGGGATTCTGGCTCGCAACCTGGTCC CCATGGTGGCAACCGTCCAGGGACAGAATCTGAAGTATCAGGAGTTTTTCTGGGATG CTAACGACATCTACCGGATTTTTGCAGAGCTGGAAGGCGTGTGGCAGCCAGCAGCC CAGCCCAAACGACGGAGACATCGACAGGACGCTCTGCCAGGACCTTGTATCGCCAG CACACCAAAGAAGCACAGGGGCTAA (SEQ ID NO:22) (secuencia de nucleótidos de Gag

de MMLV en negrita)

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido Gag o una porción característica de un polipéptido Gag. En determinadas realizaciones, los ácidos nucleicos pueden ser ADN o ARN, y pueden ser monocatenarios o bicatenarios. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de la invención pueden incluir uno o más nucleótidos no naturales; en otras realizaciones, los ácidos nucleicos de la invención incluyen sólo nucleótidos naturales.

B. Proteínas de la envuelta

En algunas realizaciones, la presente invención utiliza VLP que se componen de uno o más polipéptidos de la envuelta de HCMV (por ejemplo, gB y/o gH). Tal como se usa en el presente documento, el término “polipéptido de la envuelta” se refiere a una secuencia de polipéptido cuya secuencia de aminoácidos incluye al menos una secuencia característica de una glicoproteína de la envuelta. Una amplia variedad de secuencias de glicoproteínas de la envuelta de diversos virus, incluyendo, pero sin limitarse a HCMV, se conocen en la técnica y los expertos habituales en la técnica, refiriéndose a tales secuencias, pueden identificar fácilmente secuencias que son características de glicoproteínas de la envuelta generalmente, y/o de glicoproteínas de la envuelta particulares. En algunas realizaciones, un polipéptido de la envuelta comprende una porción o un dominio citoplásmicos, transmembrana y/o extracelulares.

En algunas realizaciones, un polipéptido de la envuelta de HCMV incluye un dominio transmembrana y citoplásmico que no se encuentra en la naturaleza en la proteína de HCMV. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un polipéptido de la envuelta de HCMV incluye un dominio transmembrana y citoplásmico de otra proteína de HCMV (por ejemplo, gB o gH). En algunas realizaciones, un polipéptido de la envuelta de HCMV incluye un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico encontrados en la naturaleza en el virus de la estomatitis vesicular (VEV). Tal como se conoce en la técnica, los polipéptidos tienen algunas veces dominios transmembrana, citoplásmicos y/o extracelulares. En general, un “dominio transmembrana”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un dominio que tiene un atributo de estar presente en la membrana (por ejemplo, que abarca una porción o toda la membrana celular). Tal como se apreciará, no se requiere que cada aminoácido en un dominio transmembrana esté presente en la membrana. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un dominio transmembrana se caracteriza porque un tramo o porción designados de una proteína se ubica sustancialmente en la membrana. Tal como se conoce bien en la técnica, pueden analizarse secuencias de aminoácido o ácido nucleico usando una variedad de algoritmos para predecir la ubicación subcelular de proteínas (por ejemplo, ubicación transmembrana). Tales programas a modo de ejemplo incluyen Psort (PSORT.org), Prosite (prosite.expasy.org), entre otros. En general, un “dominio citoplásmico”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un dominio que tiene un atributo de estar presente en el citoplasma. Tal como se apreciará, no se requiere que cada aminoácido en un dominio citoplásmico esté presente en el citoplasma. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un dominio citoplásmico se caracteriza porque un tramo o una porción designados de una proteína se ubica sustancialmente en el citoplasma. Tal como se conoce bien en la técnica, pueden analizarse secuencias de aminoácido o ácido nucleico usando una variedad de algoritmos para predecir la ubicación subcelular de proteínas (por ejemplo, ubicación citoplásmica). Tales programas a modo de ejemplo incluyen Psort (PSORT.org), Prosite (prosite.expasy.org), entre otros.

El dominio transmembrana de VEV-G funciona para dirigir la glicoproteína viral a la membrana celular (Compton T et al., 1989 Proc Natl Acad Sci USA 86:4112-4116). El intercambio de los dominios transmembrana y citoplásmicos de VEV-G por los dominios transmembrana y citoplásmicos de otra proteína se ha usado para dirigir una proteína a la membrana celular cuando la proteína nativa no hace esto de manera natural o requiere proteínas accesorias expresadas conjuntamente para lograr esto (Garrone P et al., 2011 Sci Transl Med 94:).

Entre otras cosas, la presente invención abarca el reconocimiento de que las VLP que contienen un componente estructural de un virus (por ejemplo, MLV) y uno o más antígenos de superficie heterólogos (por ejemplo, proteína de la envuelta) son especialmente eficaces para la administración de antígenos y la inducción de una respuesta inmunitaria contra el antígeno heterólogo.

C. Antígenos heterólogos

Las proteínas de la envuelta de HCMV, tal como glicoproteínas gB y gH, son importantes dianas para la producción de anticuerpos neutralizantes contra HCMV, como anticuerpos neutralizantes pueden prevenir generalmente la infección. Las terapias contra infección por HCMV, tal como una vacuna de subunidades de gB, se han desarrollado y sometido a prueba en animales de experimentación y estudios clínicos. Sin embargo, los resultados de tales estudios han demostrado que en seres humanos, la respuesta de los anticuerpos no fue de larga duración ni suficientemente eficaz para el tratamiento de HCMV en todos los casos. Los motivos que se han sugerido para la eficacia limitada de vacunas de subunidades basadas de manera exclusiva en gB de HCMV son, a su vez, variaciones específicas de cepas en las respuestas inmunitarias, inducción inadecuada de una respuesta celular inmunitaria y restricciones estructurales en el antígeno usado, cuyos epítopos se cree que son dependientes de la conformación. Los presentes inventores reconocieron que el desarrollo de una vacuna contra e1HCMV que comprende uno o más antígenos de polipéptidos de la envuelta presentados en su conformación nativa en la superficie de una VLP conduce a la inducción de anticuerpos neutralizantes (por ejemplo, a través de una respuesta humoral inmunitaria) y una vacuna contra el HCMV que comprende uno o más antígenos de proteínas estructurales (por ejemplo, proteína pp65 del tegumento) conduce a la inducción de células T auxiliares (linfocitos T^h) y células T citotóxicas (LTC) (por ejemplo, a través de una respuesta inmunitaria mediada por células). Los anticuerpos neutralizantes se forman generalmente contra proteínas de la envuelta viral, y especialmente contra las glicoproteínas gB y gH de HCMV. Las células T^hse estimulan mediante las proteínas estructurales del tegumento de un virus, tales como, por ejemplo, pp65 de HCMV (ppUL83). Además, pp65 desempeña un papel en la inducción de una respuesta de LTC contra HCMV.

Se apreciará que las VLP proporcionadas pueden comprender cualquier antígeno heterólogo, incluyendo antígenos heterólogos de HCMV. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una VLP según la presente invención comprende uno o más polipéptidos de la envuelta de HCMV. En algunas realizaciones, una VLP según la presente invención comprende uno o más polipéptidos estructurales de HCMV. En algunas realizaciones, una VLP según la presente invención comprende uno o más polipéptidos de la envuelta de HCMV y uno o más polipéptidos estructurales de HCMV. A continuación se proporciona una lista de antígenos de HCMV a modo de ejemplo, pero no limitativos. Complejo de glicoproteína gB (gC) I

El complejo de glicoproteínas de HCMV más completamente caracterizado es el complejo gB (gB; UL55). Se ha demostrado que los sueros de individuos seropositivos para CMV contienen anticuerpos contra gB, y hasta el 70% de la respuesta de anticuerpos neutralizantes en sueros convalecientes es específica de gB (Marshall GS et al., 1994 J Med Virol 43:77-83).

Una secuencia a modo de ejemplo de aminoácidos y ácidos nucleicos de polipéptido gB de HCMV se muestra a continuación como SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8, respectivamente. En algunas realizaciones, un polipéptido gB adecuado es sustancialmente homólogo a un polipéptido gB de HCMV. Por ejemplo, un polipéptido gB puede ser un polipéptido gB de HCMV modificado que contiene una o más sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácido en comparación con un polipéptido gB salvaje o que se produce de manera natural (por ejemplo, SEQ ID NO:7). Por tanto, en algunas realizaciones, un polipéptido gB adecuado para la presente invención es sustancialmente homólogo a un polipéptido gB de HCMV (SEQ ID NO:7). En algunas realizaciones, un polipéptido de HCMV adecuado para la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o más homóloga a SEQ ID NO:7. En algunas realizaciones, un polipéptido gB adecuado para la presente invención es sustancialmente idéntico a un polipéptido gB de HCMV (SEQ ID NO:7). En algunas realizaciones, un polipéptido gB adecuado para la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o más idéntica a SEQ ID NO:7.

Secuencia de aminoácidos de gB de HCMV (SEQ ID NO:7)

MESRIWCLVVCVNLCIVCLGAAVSSSSTRGTSATHSHHSSHTTSAAHSRSGSVSQRVTSS QTVSHGVNETIYNTTLKYGDVVGVNTTKYPYRVCSMAQGTDLIRFERNIVCTSMKPINE DLDEGIMVVYKRNIVAHTFKVRVYQKVLTFRRSYAYIHTTYLLGSNTEYVAPPMWEIH HINSHSQCYSSYSRVIAGTVFVAYHRDSYENKTMQLMPDDYSNTHSTRYVTVKDQWHS RGSTWLYRETCNLNCMVTITTARSKYPYHFFATSTGDVVDISPFYNGTNRNASYFGENA DKFFIFPNYTIVSDFGRPNSALETHRLVAFLERADSV1SWDIQDEKNVTCQLTFWEASERT

IRSEAEDSYHFSSAKMTATFLSKKQEVNMSDSALDCVRDEAINKLQQIFNTSYNQTYEK YGNVSVFETTGGLVVFWQGIKQKSLVELERLANRSSLNLTHNRTKRSTDGNNATHLSN MESVHNLVYAQLQFTYDTLRGYINRALAQIAEAWCVDQRRTLEVFKELSKINPSAILSAI YNKPIAARFMGDVLGLASCVTINQTSVKVLRDMNVKESPGRCYSRPVVIFNFANSSYVQ YGQLGEDNE1LLGNHRTEECQLPSLKIFIAGNSAYEYVDYLFKRMIDLSSISTVDSMIALD

1DPLENTDFRVLELYSQKELRSINVFDLEEIMREFNSYKQRVKYVEDKVVDPLPPYLKGL

DDLMSGLGAAGKAVGVAIGAVGGAVASVVEGVATFLKNPFGAFTIILVAIAVVIIIYLIY TRORRLCMOPLONLFPYLVSADGTTVTSGNTKDTSLOAPPSYEESVYNSGRKGPGPPSS DASTAAPPYTNEOAYOMLLALVRLDAEORAOONGTDSLDGOTGTODKGOKPNLLDRL RHRKNGYRHLKDSDEEENV* (SEQ ID NO:7) (TM y CD subrayados)

Secuencia de nucleótidos de gB de HCMV (SEQ ID NO:8)

ATGGAATCCAGGATCTGGTGCCTGGTAGTCTGCGTTAACTTGTGTATCGTCTGTCTG GGTGCTGCGGTTTCCTCATCTTCTACTCGTGGAACTTCTGCTACTCACAGTCACCATT CCTCTCATACGACGTCTGCTGCTCATTCTCGATCCGGTTCAGTCTCTCAACGCGTAAC TTCTTCCCAAACGGTCAGCCATGGTGTTAACGAGACCATCTACAACACTACCCTCAA GTACGGAGATGTGGTGGGGGTCAACACCACCAAGTACCCCTATCGCGTGTGTTCTAT GGCACAGGGTACGGATCTTATTCGCTTTGAACGTAATATCGTCTGCACCTCGATGAA GCCCATCAATGAAGACCTGGACGAGGGCATCATGGTGGTCTACAAACGCAACATCG TCGCGCACACCTTTAAGGTACGAGTCTACCAGAAGGTTTTGACGTTTCGTCGTAGCT ACGCTTACATCCACACCACTTATCTGCTGGGCAGCAACACGGAATACGTGGCGCCTC CTATGTGGGAGATTCATCATATCAACAGTCACAGTCAGTGCTACAGTTCCTACAGCC GCGTTATAGCAGGCACGGTTTTCGTGGCTTATCATAGGGACAGCTATGAAAACAAA ACCATGCAATTAATGCCCGACGATTATTCCAACACCCACAGTACCCGTTACGTGACG GTCAAGGATCAATGGCACAGCCGCGGCAGCACCTGGCTCTATCGTGAGACCTGTAA TCTGAATTGTATGGTGACCATCACTACTGCGCGCTCCAAGTATCCCTATCATTTTTTC GCAACTTCCACGGGTGATGTGGTTGACATTTCTCCTTTCTACAACGGAACTAATCGC AATGCCAGCTATTTTGGAGAAAACGCCGACAAGTTTTTCATTTTTCCGAACTACACT ATCGTCTCCGACTTTGGAAGACCGAATTCTGCGTTAGAGACCCACAGGTTGGTGGCT TTTCTTG A ACGTGC GGACTC AGTGA TC TCCTGGGATAT AC AGG ACG AGAAG A A TGTT ACTTGTCAACTCACTTTCTGGGAAGCCTCGGAACGCACCATTCGTTCCGAAGCCGAG GACTCGTATC ACTTTTCTTCTGCCA A AATGACCGCC ACTTTCTT ATCTA AGA AGCA AG AGGTGAACATGTCCGACTCTGCGCTGGACTGTGTACGTGATGAGGCCATAAATAAGT TACAGCAGATTTTCAATACTTCATACAATCAAACATATGAAAAATATGGAAACGTGT CCGTCTTTGAAACCACTGGTGGTTTGGTGGTGTTCTGGCAAGGTATCAAGCAAAAAT CTCTGGTGGAACTCGAACGTTTGGCCAACCGCTCCAGTCTGAATCTTACTCATAATA GAACCAAAAGAAGTACAGATGGCAACAATGCAACTCATTTATCCAACATGGAGTCG GTGCACAATCTGGTCTACGCCCAGCTGCAGTTCACCTATGACACGTTGCGCGGTTAC ATCAACCGGGCGCTGGCGCAAATCGCAGAAGCCTGGTGTGTGGATCAACGGCGCAC CCTAGAGGTCTTCAAGGAACTTAGCAAGATCAACCCGTCAGCTATTCTCTCGGCCAT CTACAACAAACCGATTGCCGCGCGTTTCATGGGTGATGTCCTGGGTCTGGCCAGCTG CGTGACCATTAACCAAACCAGCGTCAAGGTGCTGCGTGATATGAATGTGAAGGAAT CGCCAGGACGCTGCTACTCACGACCAGTGGTCATCTTTAATTTCGCCAACAGCTCGT ACGTGC AGTACGGTCAACTGGGCGAGGATAACGAAATCCTGTTGGGCAACCACCGC ACTGAGGAATGTCAGCTTCCCAGCCTCAAGATCTTCATCGCCGGCAACTCGGCCTAC GAGTACGTGGACTACCTCTTCAAACGCATGATTGACCTCAGCAGCATCTCCACCGTC GACAGCATGATCGCCCT AGAC ATCGACCCGCTGGAAA ACACCGACTTCAGGGT ACT GGAACTTTACTCGCAGAAAGAATTGCGTTCCATCAACGTTTTTGATCTCGAGGAGAT C ATGCGCGAGTTCAATTCGT AT AAGCAGCGGGT A AAGTACGTGGAGGAC AAGGTAG TC GACC CGCTGCCGCCCT ACCTC A AGGGTCTGGACGACCTCATGAGCGGCCTGGGC G CCGCGGGAAAGGCCGTTGGCGTAGCCATTGGGGCCGTGGGTGGCGCGGTGGCCTCC GTGGTCGAAGGCGTTGCCACCTTCCTCAAAAACCCCTTCGGAGCCTTCACCATCATC CTCGTGGCCATAGCCGTCGTCATTATCATTTATTTGATCTATACTCGACAGCGGCGTC TCTGCATGCAGCCGCTGCAGAACCTCTTTCCCTATCTGGTGTCCGCCGACGGGACCA CCGTGACGTCGGGCAACACCAAAGACACGTCGTTACAGGCTCCGCCTTCCTACGAG GAAAGTGTTTATAATTCTGGTCGCAAAGGACCGGGACCACCGTCGTCTGATGCATCC ACGGCGGCTCCGCCTTACACCAACGAGCAGGCTTACCAGATGCTTCTGGCCCTGGTC CGTCTGGACGCAGAGCAGCGAGCGCAGCAGAACGGTACAGATTCTTTGGACGGACA GACTGGCACGCAGGACAAGGGACAGAAGCCCAACCTGCTAGACCGACTGCGACACC GCAAAAACGGCTACCGACACTTGAAAGACTCCGACGAAGAAGAGAACGTCTGA

(SEQ ID NOS) (TM y CD subrayados)

Secuencia de nucleótidos de gB de HCMV con codones optimizados (SEQ ID NO:9)

ATGGAGTCAAGGATTTGGTGCCTGGTCGTGTGCGTCAATCTGTGCATCGTCTGTCTG GGGGCTGCCGTGTCATCAAGTTCTACAAGAGGCACCAGCGCCACCCACTCACACCA TAGCTCCCATACCACATCCGCCGCTCACTCCCGGTCTGGCAGCGTGAGCCAGAGAGT CACATCTAGTCAGACCGTGAGCCACGGGGTCAACGAGACCATCTACAATACTACCC TGAAGTATGGCGACGTGGTCGGGGTGAACACAACTAAATACCCATATAGGGTCTGC AGTATGGCCCAGGGCACTGATCTGATTAGATTCGAAAGGAACATCGTGTGCACCAG CATGAAGCCCATTAATGAGGACCTGGATGAAGGGATCATGGTGGTCTACAAACGCA ATATTGTGGCCCATACCTTCAAGGTGCGAGTCTATCAGAAAGTGCTGACATTTCGGA GATCTTACGCATATATCCACACCACATACCTGCTGGGGAGTAACACCGAGTATGTGG CTCCCCCT ATGTGGGA AATTC ACC ATATC A ATAGCC ATTCCC AGTGCTACTC A AGCT

ACAGCAGAGTGATCGCTGGAACAGTGTTCGTCGCATACCACAGAGACTCTTATGAG AACAAGACTATGCAGCTCATGCCCGACGATTACAGCAATACACATTCCACTAGATAT GTGACAGTCAAAGATCAGTGGCACTCAAGGGGCAGCACCTGGCTGTACCGCGAGAC ATGCAACCTGAATTGTATGGTGACTATCACTACCGCTAGATCCAAGTACCCCTATCA CTTCTTTGC A ACTTCC ACCGGGG ACGTGGTCGAT ATTTCTCCTTTCT AC A ACGGC AC A AACCGGAATGCATCTTATTTTGGGGAGAACGCCGACAAGTTCTTTATTTTCCCAAAT TACACCATCGTGTCTGATTTTGGCAGACCCAACAGTGCCCTGGAGACACATCGACTG GTGGCATTCCTGGAACGGGCCGACTCCGTCATTTCTTGGGACATCCAGGATGAGAAG AATGTGACCTGCCAGCTCACCTTCTGGGAGGCCAGCGAACGCACCATCCGATCCGA GGCTGAAGATTCTTACCACTTCTCCTCTGCCAAAATGACAGCTACTTTTCTGAGCAA GAAACAGGAGGTGAACATGTCTGACAGTGCTCTGGATTGCGTGCGGGACGAAGCAA TTAATAAGCTGCAGCAGATCTTCAACACATCATACAACCAGACTTACGAGAAGTAC GGA A ACGTGAGCGTCTTCG A A AC A ACTGGCGGGCTGGTGGTCTTTTGGC AGGGC AT CAAGCAGAAATCCCTGGTGGAGCTGGAAAGGCTGGCCAATCGCAGTTCACTGAACC TGACTCATAATCGGACCAAGAGATCTACAGACGGAAACAATGCCACACATCTGTCT AACATGGAGAGTGTGCACAATCTGGTCTACGCTCAGCTCCAGTTTACCTACGACACA CTGAGAGGCTATATTAACAGGGCACTGGCCCAGATCGCTGAAGCATGGTGCGTGGA TCAGAGGCGCACCCTGGAGGTCTTCAAGGAACTGTCCAAAATCAACCCTTCAGCAA TTCTGAGCGCCATCTACAATAAGCCAATTGCAGCCAGGTTTATGGGAGACGTGCTGG GCCTGGCCAGTTGCGTCACTATCAACCAGACCTCAGTGAAGGTCCTGCGCGATATGA ATGTGAAAGAGAGTCCCGGCAGATGCTATTCACGGCCTGTGGTCATCTTCAACTTTG CTAATAGCTCCTACGTGCAGTATGGACAGCTCGGCGAGGACAACGAAATTCTGCTG GGGAATCACAGGACCGAGGAATGTCAGCTCCCTAGCCTGAAGATTTTCATCGCTGG AAACTCCGCATACGAGTATGTGGATTACCTGTTCAAGCGGATGATTGACCTGTCTAG TATCTCCACTGTGGATTCTATGATTGCCCTGGACATCGATCCACTGGAAAATACCGA CTTCAGGGTGCTGGAGCTGTATAGCCAGAAGGAACTGCGCTCCATCAACGTGTTCGA TCTGGAGGAAATTATGAGAGAGTTTAATAGCTACAAGCAGAGGGTGAAATATGTCG AAGATAAGGTGGTCGACCCCCTGCCACCCTACCTGAAAGGCCTGGACGATCTGATG AGCGGGCTGGGAGCTGCAGGGAAGGCAGTGGGAGTCGCTATCGGCGCAGTGGGAG GAGCCGTGGCCAGCGTGGTCGAGGGAGTGGCAACATTCCTGAAAAACCCCTTCGGG GCCTTC ACC ATC ATTCTGGTGGC A ATCGCCGTGGTC A TC ATT ATCTACCTGATCTAC A CAAGGCAGCGGCGGCTGTOCATGCAGCCTCTGCAGAACCTGTTTOCATACCTGGTGA GCGCCGACGGGACCACAGTCACCTCAGGAAATACTAAGGATACCTCTCTGCAGGCC CCCCCAAGTTACGAGGAATCAGTGTATAACAGCGGCAGAAAAGGACCAGGACCACC TTCAAGCGACGCCAGCACTGCCGCTCCACCCTACACCAATGAGCAGGCCTATCAGAT GCTGCTGGCTCTGGTGCGCCTGGATGCCGAACAGCGAGCTCAGCAGAACGGGACCG ACTCCCTGGATGGACAGACCGGAAC'ACAGGACAAGGGACAGAAACCTAATCTGCTG

GATCGGCTGCGGCACAGAAAAAACGGGTATAGGCACCTGAAGGACTCCGACGAAG AAGAAAATGTCTAA (SEQ ID NO:9) (TM y CD subrayados)

En algunas realizaciones, un polipéptido gB para su uso según la presente invención carece de un dominio transmembrana y/o un dominio citoplásmico y/o contiene un dominio transmembrana y/o un dominio citoplásmico modificados. Un polipéptido gB puede incluir opcionalmente uno o más polipéptidos adicionales (por ejemplo, un polipéptido heterólogo de dominio transmembrana y/o dominio citoplásmico). En algunas realizaciones, un polipéptido gB se expresa como una proteína de fusión con un polipéptido heterólogo. El polipéptido gB puede unirse a un polipéptido heterólogo para crear una proteína de fusión sin alterar la función y/o antigenicidad de gB. Por ejemplo, una secuencia codificante para un polipéptido heterólogo puede someterse a corte y empalme en la secuencia codificante del polipéptido gB, por ejemplo, en el extremo 3' de la secuencia codificante del polipéptido gB. En algunas realizaciones, una secuencia codificante para un polipéptido heterólogo puede someterse a corte y empalme en marco en la secuencia codificante del polipéptido gB. En algunas realizaciones, una secuencia codificante del polipéptido gB y el polipéptido heterólogo pueden expresarse mediante un único promotor. En algunas realizaciones, un polipéptido heterólogo se inserta en (por ejemplo, se fusiona con) el extremo C-terminal de un polipéptido gB.

En algunas realizaciones, un polipéptido heterólogo es o comprende un dominio transmembrana y/o dominio citoplásmico encontrado en el virus de la estomatitis vesicular (VEV). En algunas realizaciones, un gB que carece de un dominio transmembrana y/o dominio citoplásmico se fusiona con un dominio transmembrana y/o dominio citoplásmico de VEV. Un polipéptido de fusión de gB-VEV a modo de ejemplo para su uso según la presente invención se muestra a continuación como SEQ ID NO:10. En algunas realizaciones, una proteína de fusión de polipéptido gB-VEV adecuada incluye todo o una porción de un polipéptido gB que es sustancialmente homólogo a un polipéptido gB conocido y todo o una porción de un polipéptido de VEV que es sustancialmente homólogo a un polipéptido de VEV conocido. Por ejemplo, una proteína de fusión de polipéptido gB - VEV puede contener una o más sustituciones, deleciones y/o inserciones aminoácidos en comparación con un polipéptido gB y/o de VEV salvaje o que se produce de manera natural. Por tanto, en algunas realizaciones, una proteína de fusión de polipéptido gB-VEV adecuada para la presente invención es sustancialmente homóloga a SEQ ID NO: 10. En algunas realizaciones, una proteína de fusión de polipéptido gB-VEV adecuada para la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o más homóloga a SEQ ID NO:10. En algunas realizaciones, una proteína de fusión de polipéptido gB-VEV adecuada para la presente invención es sustancialmente idéntica a SEQ ID NO:10. En algunas realizaciones, una proteína de fusión de polipéptido gB-VEV adecuada para la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o más idéntica a SEQ ID NO:10. Tal como se usa en el presente documento, “gB-G” se refiere a proteína de fusión de TM/CTD de gB - VEV de HMCV.

Secuencia de aminoácidos de gB-G de HCMV (SEQ ID NO:10)

MESRIWCLWCVNLCIVCLGAAVSSSSTRGTSATHSHHSSHTTSAAHSRSGSVSQRVTSS QTVSHGVNETIYNTTLKYGDVVGVNTTKYPYRVCSMAQGTDLIRFERNIVCTSMKPINE DLDEGIMVVYKRNIVAHTFKVRVYQKVLTFRRSYAYIHTTYLLGSNTEYVAPPMWEIH HINSHSQCYSSYSRVIAGTVFVAYHRDSYENKTMQLMPDDYSNTHSTRYVTVKDQWHS RGSTWLYRETCNLNCMVTITTARSKYPYHFFATSTGDVVDISPFYNGTNRNASYFGENA DKFFIFPNYTIVSDFGRPNSALETHRLVAFLERADSVISWDIQDEKNVTCQLTFWEASERT IRSEAEDSYHFSSAKMTATFLSKKQEVNMSDSALDCVRDEAINKLQQIFNTSYNQTYEK YGNVSVFETTGGLVVFWQGIKQKSLVELERLANRSSLNLTHNRTKRSTDGNNATHLSN MESVHNLVYAQLQFTYDTLRGYINRALAQIAEAWCVDQRRTLEVFKELSKINPSAILSAI YNKPIAARFMGDVLGLASCVTINQTSVKVLRDMNVKESPGRCYSRPVVIFNFANSSYVQ YGQLGEDNEILLGNHRTEECQLPSLKIFIAGNSAYEYVDYLFKRMIDLSSISTVDSMIALD IDPLENTDFRVLELYSQKELRSINVFDLEEIMREFNSYKQRVKYVEDKWDPLPPYLKGL DDLMSGLGAAGKAVGVAIGAVGGAVASVVEGVATFLKNPFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHL

( ^{i ki}M I m k - m n m u \ I \ K I ( , k m o ^{i d}\ ^di ¡ ' ^{m v}m m.m . -

Secuencia de nucleótidos de gB-G de HCMV (SEQ ID NO:11)

ATGGAATCCAGGATCTGGTGCCTGGTAGTCTGCGTTAACTTGTGTATCGTCTGTCTG GGTGCTGCGGTTTCCTCATCTTCTACTCGTGGAACTTCTGCTACTCACAGTCACCATT CCTCTCATACGACGTCTGCTGCTCATTCTCGATCCGGTTCAGTCTCTCAACGCGTAAC TTCTTCCCAAACGGTCAGCCATGGTGTTAACGAGACCATCTACAACACTACCCTCAA GTACGGAGATGTGGTGGGGGTCAACACCACCAAGTACCCCTATCGCGTGTGTTCTAT GGCACAGGGTACGGATCTTATTCGCTTTGAACGTAATATCGTCTGCACCTCGATGAA GCCCATCAATGAAGACCTGGACGAGGGCATCATGGTGGTCTACAAACGCAACATCG TCGCGCACACCTTTAAGGTACGAGTCTACCAGAAGGTTTTGACGTTTCGTCGTAGCT ACGCTTACATCCACACCACTTATCTGCTGGGCAGCAACACGGAATACGTGGCGCCTC CTATGTGGGAGATTCATCATATCAACAGTCACAGTCAGTGCTACAGTTCCTACAGCC GCGTTATAGCAGGCACGGTTTTCGTGGCTTATCATAGGGACAGCTATGAAAACAAA ACCATGCAATTAATGCCCGACGATTATTCCAACACCCACAGTACCCGTTACGTGACG GTCAAGGATCAATGGCACAGCCGCGGCAGCACCTGGCTCTATCGTGAGACCTGTAA TCTGAATTGTATGGTGACCATCACTACTGCGCGCTCCAAGTATCCCTATCATTTTTTC GCAACTTCCACGGGTGATGTGGTTGACATTTCTCCTTTCTACAACGGAACTAATCGC AATGCCAGCTATTTTGGAGAAAACGCCGACAAGTTTTTCATTTTTCCGAACTACACT ATCGTCTCCGACTTTGGAAGACCGAATTCTGCGTTAGAGACCCACAGGTTGGTGGCT TTTCTTGAACGTGCGGACTCAGTGATCTCCTGGGATATACAGGACGAGAAGAATGTT ACTTGTCAACTCACTTTCTGGGAAGCCTCGGAACGCACCATTCGTTCCGAAGCCGAG GACTCGTATCACTTTTCTTCTGCCAAAATGACCGCCACTTTCTTATCTAAGAAGCAAG AGGTGAACATGTCCGACTCTGCGCTGGACTGTGTACGTGATGAGGCCATAAATAAGT TACAGCAGATTTTCAATACTTCATACAATCAAACATATGAAAAATATGGAAACGTGT CCGTCTTTGAAACCACTGGTGGTTTGGTGGTGTTCTGGCAAGGTATCAAGCAAAAAT CTCTGGTGGAACTCGAACGTTTGGCCAACCGCTCCAGTCTGAATCTTACTCATAATA GAACCAAAAGAAGTACAGATGGCAACAATGCAACTCATTTATCCAACATGGAGTCG GTGCACAATCTGGTCTACGCCCAGCTGCAGTTCACCTATGACACGTTGCGCGGTTAC ATCAACCGGGCGCTGGCGCAAATCGCAGAAGCCTGGTGTGTGGATCAACGGCGCAC CCTAGAGGTCTTCAAGGAACTTAGCAAGATCAACCCGTCAGCTATTCTCTCGGCCAT CTACAACAAACCGATTGCCGCGCGTTTCATGGGTGATGTCCTGGGTCTGGCCAGCTG CGTGACCATTAACCAAACCAGCGTCAAGGTGCTGCGTGATATGAATGTGAAGGAAT CGCCAGGACGCTGCTACTCACGACCAGTGGTCATCTTTAATTTCGCCAACAGCTCGT ACGTGCAGTACGGTCAACTGGGCGAGGATAACGAAATCCTGTTGGGCAACCACCGC ACTGAGGAATGTCAGCTTCCCAGCCTCAAGATCTTCATCGCCGGCAACTCGGCCTAC GAGTACGTGGACTACCTCTTCAAACGCATGATTGACCTCAGGAGCATCTCCACCGTC GACAGCATGATCGCCCTAGACATCGACCCGCTGGAAAACACCGACTTCAGGGTACT GGAACTTTACTCGCAGAAAGAATTGCGTTCCATCAACGTTTTTGATCTCGAGGAGAT CATGCGCGAGTTCAATTCGTATAAGCAGCGGGTAAAGTACGTGGAGGACAAGGTAG TCGACCCGCTGCCGCCCTACCTCAAGGGTCTGGACGACCTCATGAGCGGCCTGGGCG CCGCGGGAAAGGCCGTTGGCGTAGCCATTGGGGCCGTGGGTGGCGCGGTGGCCTCC GTGGTCGAAGGCGTTGCCACCTTCCTCAAAAACCCCTTTTTCTTTATCATAGGGTTAA TCATTGGACTATTCTTGGTTCTCCGAGTTGGTATCCATCTTTGCATTAAATTAAAGCA CACCAAGAAAAGACAGATTTATACAGACATAGAGATGAACCGACTTGGAAAGTAA

(SEQ ID NO: 11) TM y CD subrayados)

Secuencia de nucleótidos de gB - G de HCMV con codones optimizados (SEQ ID NO:12)

ATGGAGTCAAGGATTTGGTGTCTGGTCGTCTGCGTCAACCTGTGCATTGTCTGCCTG GGAGCCGCCGTCTCATCATCATCTACCCGAGGCACATCCGCCACTCACTCTCACCAT AGCTCCCATACCACATCCGCCGCTCACTCAAGAAGCGGGTCCGTGTCTCAGAGGGTC ACATCTAGTCAGACCGTGAGCCATGGAGTCAACGAGACAATCTACAATACTACCCT GAAGTATGGAGACGTGGTCGGCGTGAACACAACTAAATACCCCTATAGGGTCTGCT CTATGGCCCAGGGGACAGATCTGATCCGATTTGAACGGAACATCGTGTGCACTAGC ATGAAGCCTATCAATGAGGACCTGGATGAAGGAATTATGGTGGTCTACAAACGAAA TATCGTGGCCCATACTTTTAAGGTGAGAGTCTATCAGAAAGTGCTGACCTTCCGGAG AAGCTACGCTTATATTCACACCACATACCTGCTGGGGTCCAACACCGAGTATGTGGC ACCCCCTATGTGGGAAATCCACCATATTAATAGTCATTCACAGTGCTACTCAAGCTA CAGCAGAGTGATCGCTGGAACCGTGTTCGTCGCATACCACAGAGACAGTTATGAGA ACAAGACAATGCAGCTCATGCCCGACGATTACAGTAATACCCATTCAACAAGATAT GTGACCGTCAAAGATCAGTGGCACTCTCGCGGCAGTACCTGGCTGTACCGAGAGAC ATGCAACCTGAATTGTATGGTGACAATTACTACCGCCAGAAGCAAGTACCCTTATCA CTTCTTTGCTACCTCAACAGGGGACGTGGTCGACATCAGCCCCTTCTACAACGGAAC AAACCGGAATGCCTCCTATTTCGGCGAGAACGCTGACAAATTCTTTATCTTCCCCAA CTACACTATCGTGAGCGATTTCGGCAGACCTAACAGTGCCCTGGAGACCCATCGGCT GGTGGCATTTCTGGAAAGAGCCGACAGCGTGATCTCCTGGGACATTCAGGATGAGA AGAATGTGACCTGCCAGCTCACCTTCTGGGAGGCCAGCGAAAGAACCATCAGGTCC GAGGCAGAAGATTCTTACCACTTTTCCTCTGCAAAAATGACTGCCACCTTCCTGTCC AAGAAACAGGAGGTGAACATGAGCGACTCCGCACTGGATTGCGTGCGGGACGAAGC CATCAATAAGCTGCAGCAGATCTTCAACACATCTTACAACCAGACTTACGAGAAGTA CGGCAACGTGAGTGTCTTTGAAACAACTGGCGGGCTGGTGGTCTTCTGGCAGGGGAT CAAGCAGAAATCTCTGGTGGAGCTGGAACGGCTGGCCAATAGAAGTTCACTGAACC TGACTCATAATCGCACCAAGCGATCCACAGACGGAAACAATGCAACTCATCTGAGC AACATGGAGTCCGTGCACAATCTGGTCTACGCCCAGCTCCAGTTCACTTACGACACC CTGCGAGGCTATATCAACCGGGCCCTGGCTCAGATTGCAGAAGCCTGGTGCGTGGAT CAGAGGCGCACCCTGGAGGTCTTTAAGGAACTGAGCAAAATTAACCCATCTGCTATC

CTGAGTGCAATCTACAATAAGCCCATCGCAGCCAGGTTCATGGGGGACGTGCTGGG ACTGGCCTCCTGCGTCACTATCAACCAGACCTCTGTGAAGGTCCTGCGCGATATGAA TGTGAA AGAGA GTCCTGGCAGGTGTTATTCACGCCCAGTGGTCATCTTCAACTTCGC TAATAGCTCCTACGTGCAGTATGGCCAGCTCGGGGAGGACAACGAAATCCTGCTGG GAAATCACAGGACCGAGGAATGTCAGCTCCCAAGTCTGAAGATCTTTATTGCCGGC AACTCAGCTTACGAGTATGTGGATTACCTGTTCAAACGCATGATCGACCTGTCTAGT ATTTCAACAGTGGATAGCATGATCGCCCTGGACATTGATCCCCTGGAAAATACTGAC TTCAGGGTGCTGGAGCTGTATAGCCAGAAGGAACTGCGCTCCATTAACGTGTTTGAT CTGGAGGAAATCATGAGGGAGTTCAATTCCTACAAGCAGCGCGTGAAATATGTCGA AGATAAGGTGGTCGACCCTCTGCCACCCTACCTGAAAGGCCTGGACGATCTGATGA GCGGGCTGGGAGCTGCAGGCAAGGCAGTGGGAGTCGCCATCGGAGCTGTGGGAGGC GCTGTCGCATCCGTGGTCGAGGGAGTGGCTACCTTTCTGAAGAACCCATTCTTTTTC ATCATCGGCCTGATCATTGGGCTGTTCCTGGTGCTGAGAGTCGGCATCCACCTGTGC ATTAAGCTGAAGCACACCAAGAAGAGGCAGATCTACACCGATATTGAAATGAACAG ACTGGGCAAGTGA (SEQ ID NO: 12) (TM y CTD subrayados)

Complejo de glicoproteína gH (gC) III

El complejo gc III contiene glicoproteínas gH (UL75), gL (UL115) y gO (UL74) (Urban M et al., 1996 J Gen Virol 77:1537 - 47). Al igual que gB, gH se conserva entre los virus del herpes patógenos humanos y desempeña un importante papel en varias etapas durante la replicación de HCMV. HCMV codifica para dos complejos gH/gL: gH/gL/gO y un complejo gH/gL/UL128/UL130/UL131 (Wang D y Shenk T 2005 Proc Natl Acad USA 102:18153-8). El complejo que contiene gO es generalmente suficiente para la infección de fibroblastos con HCMV, mientras que el complejo que contiene UL128/UL130/UL131 es necesario para HCMV para infectar células endoteliales y epiteliales (Wang D y Shenk T 2005 J Virol 79 10330-8). La infección natural con HCMV provoca normalmente anticuerpos neutralizantes de alto título específicos para la entrada en células epiteliales y se ha demostrado que los anticuerpos contra epítopos de gH/gL/UL128/UL130/UL131 pueden comprender un componente significativo de esta actividad (Macagno A et al., 2010 J Virol 84:1005-13). Los estudios inmunológicos sobre gH han demostrado que células de mamífero la proteína requiere polipéptidos adicionales (como gL) para el procesamiento y transporte correctos a la membrana celular (Urban M et al., 1996 J Gen Virol 77:1537-1547). Si se expresa sola, gH se encuentra de manera exclusiva en el citoplasma y/o la membrana nuclear (Cranage MP et al., 1988 J Virol 62: 1416-1422).

Una secuencia de aminoácidos y ácidos nucleicos a modo de ejemplo del polipéptido gH de HCMV se muestra a continuación como SEQ ID NO:13 y SEQ ID NO:14, respectivamente. En algunas realizaciones, un polipéptido gH adecuado es sustancialmente homólogo a un polipéptido gH de HCMV conocido. Por ejemplo, un polipéptido gH puede ser un polipéptido gH de HCMV modificado que contiene una o más sustituciones, deleciones, y/o inserciones de aminoácidos en comparación con polipéptido gH salvaje o que se produce de manera natural (por ejemplo, SEQ ID NO:13). Por tanto, en algunas realizaciones, un polipéptido gH adecuado para la presente invención es sustancialmente homólogo a un polipéptido gH de HCMV (SEQ ID NO:13). En algunas realizaciones, un polipéptido gH de HCMV adecuado para la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o más homóloga a SEQ ID NO:13. En algunas realizaciones, un polipéptido gH adecuado para la presente invención es sustancialmente idéntico a un polipéptido gH de HCMV (SEQ ID NO:13). En algunas realizaciones, un polipéptido gH adecuado para la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o más idéntica a SEQ ID NO:13.

Secuencia de aminoácidos de gH de HCMV (SEQ ID NO:13)

MRPGLPS YLIVL AV CLLSHLLSSRY G AE AI SEPLD K AFHLLLNT Y GRPIRFLRENTTQ CT YNSSLRNSTVVRENAISFNFFQSYNQYYVFHMPRCLFAGPLAEQFLNQVDLTETLERYQ QRLNTYALVSKDLASYRSFSQQLKAQDSLGEQPTTVPPPIDLSIPHVWMPPQTTPHGWT ESHTTSGLHRPHFNQTCILFDGHDLLFSTVTPCLHQGFYLIDELRYVKITLTEDFFWTVSI DDDTPMLLIFGHLPRVLFKAPYQRDNFILRQTEKHELLVLVKKDQLNRHSYLKDPDFLD AALDFNYLDLSALLRNSFHRYAVDVLKSGRCQMLDRRTVEMAFAYALALFAAARQEE AGAQVSVPRALDRQAALLQIQEFMITCLSQTPPRTTLLLYPTAVDLAKRALWTPNQITDI TSLVRLVYILSKQNQQHLIPQWALRQIADFALKLHKTHLASFLSAFARQELYLMGSLVH SMLVHTTERRE1FIVETGLCSLAELSHFTQLLAHPPLHEYLSDLYTPCSSSGRRDHSLERLT

RLFPDATVPTTVPAALSILSTMQPSTLETFPDLFCLPLGESFSALTVSEHVSYVVTNQYLI KGISYPVSTTVVGQSLnTQTDSQTKCELTRNMHTTHSITAALNISLENCAFCQSALLEYD

DTQGVINIMYMHDSDDVLFALDPYNEVVVSSPRTHYLMLLKNGTVLEVTDVVVDATDS RLLMMSVYALSAHGIYLLYRMLKTC* (SEQ ID NO: I3) (TM y CTD subrayados)

Secuencia de nucleótidos de gH de HCMV (SEQ ID NO:14)

ATGCGGCCAGGCCTCCCCTCCTACCTCATCGTCCTCGCCGTCTGTCTCCTCAGCCACC TACTTTCGTCACGATATGGCGCAGAAGCCATATCCGAACCGCTGGACAAAGCGTTTC ACCTACTGCTCAACACCTACGGGAGACCCATCCGCTTCCTGCGTGAAAACACCACCC AGTGTACCTACAATAGCAGCCTCCGTAACAGCACGGTCGTCAGGGAAAACGCCATC AGTTTCAACTTTTTCCAAAGCTATAATCAATACTATGTATTCCATATGCCTCGATGTC TTTTTGCGGGTCCTCTGGCGGAGCAGTTTCTGAACCAGGTAGATCTGACCGAAACCC TGGAAAGATACCAACAGAGACTTAACACTTACGCGCTGGTATCCAAAGACCTGGCC AGCTACCGATCTTTTTCGCAGCAGCTAAAGGCACAGGACAGCCTAGGTGAACAGCC

CACCACTGTGCCACCACCCATTGACCTGTCAATACCTCACGTTTGGATGCCACCGCA AACCACTCCACACGGCTGGACAGAATCACATACCACCTCAGGACTACACCGACCAC ACTTTAACCAGACCTGTATCCTCTTTGATGGACACGATCTACTATTCAGCACCGTCAC ACCTTGTTTGCACCAAGGCTTTTACCTCATCGACGAACTACGTTACGTTAAAATAAC ACTGACCGAGGACTTCTTCGTAGTTACGGTGTCCATAGACGACGACACACCCATGCT GCTT ATCTTCGGCCATCTTCCACGCGT ACTCTTT AA AGCGCCCTATCA ACGCGACAA CTTTATACTACGACAAACTGAAAAACACGAGCTCCTGGTGCTAGTTAAGAAAGATC AACTGAACCGTCACTCTTATCTCAAAGACCCGGACTTTCTTGACGCCGCACTTGACT TC A ACT ACCTGGACCTC AGCGCACT ACT ACGTA AC AGCTTTC ACCGTT ACGCCGTGG ATGTACTCAAAAGCGGTCGATGTCAGATGCTGGACCGCCGCACGGTAGAAATGGCC TTCGCCTACGCATTAGCACTGTTCGCAGCAGCCCGACAAGAAGAGGCCGGCGCCCA AGTCTCCGTCCCACGGGCCCTAGACCGCCAGGCCGCACTCTTACAAATACAAGAATT TATGATCACCTGCCTCTCACAAACACCACCACGCACCACGTTGCTGCTGTATCCCAC GGCCGTGGACCTGGCCAAACGAGCCCTTTGGACACCGAATCAGATCACCGACATCA CCAGCCTCGTACGCCTGGTCTACATACTCTCTAAACAGAATCAGCAACATCTCATCC CCCAGTGGGCACTACGACAGATCGCCGACTTTGCCCTAAAACTACACAAAACGCAC CTGGCCTCTTTTCTTTCAGCCTTCGCGCGTCAAGAACTCTACCTCATGGGCAGCCTCG TCCACTCCATGCTAGTACATACGACGGAGAGACGCGAAATCTTCATCGTAGAAACG GGCCTCTGTTCATTAGCCGAGCTATCACACTTTACGCAGTTGCTAGCTCATCCGCAC CACGAATACCTCAGCGACCTGTACACACCCTGTTCCAGTAGCGGGCGACGCGATCA CTCGCTCGAACGCCTCACACGTCTCTTCCCCGATGCCACCGTCCCCACTACCGTTCCC GCCGCCCTCTCCATCCTATCTACCATGCAACCAAGCACGCTAGAAACCTTCCCCGAC CTGTTTTGTCTGCCGCTCGGCGAATCCTTCTCCGCGCTGACCGTCTCCGAACACGTCA GTTATGTCGTAACAAACCAGTACCTGATCAAAGGTATCTCCTACCCTGTCTCCACCA CCGTCGTAGGCCAGAGCCTCATCATCACCCAGACGGACAGTCAAACTAAATGCGAA CTGACGCGCAACATGCATACCACACACAGCATCACAGCGGCGCTCAACATTTCCCTA GAAAACTGCGCCTTTTGCCAAAGCGCCCTACTAGAATACGACGACACGCAAGGCGT CATCAACATCATGTACATGCACGACTCGGACGACGTCCTTTTCGCCCTGGATCCCTA CAACGAAGTGGTGGTCTCATCTCCGCGAACTCACTACCTCATGCTTTTGAAAAACGG TACGGTCCTAGAAGTAACTGACGTCGTCGTGGACGCTACCGACAGTCGTCTCCTCAT GATGTCCGTCTACGCGCTATCGGCCATCATCGGCATCTATCTGCTCTACCGCATGCTC AAGACATGCTGA (SEQ ID NO: 14) (TM y CTD subrayados)

Secuencia de nucleótidos de gH de HCMV con codones optimizados (SEQ ID NO:15)

ATGAGACCTGGACTGCCTTCTTATCTGATTGTGCTGGCCGTCTGCCTGCTGTCACATC TGCTGAGTTCACGCTATGGGGCTGAGGCTATCTCCGAGCCACTGGACAAGGCTTTTC ACCTGCTGCTGAACACCTACGGGAGACCCATTAGGTTCCTGCGCGAGAATACCACA CAGTGCACATATAACAGCTCCCTGCGGAACAGCACTGTGGTCCGCGAAAACGCCAT CTCTTTTAATTTCTTTCAGAGTTACAACCAGTACTACGTGTTCCATATGCCACGCTGT CTGTTTGCAGGACCCCTGGCCGAGCAGTTCCTGAACCAGGTGGACCTGACCGAGAC ACTGGAAAGATACCAGCAGAGGCTGAATACCTATGCCCTGGTGAGTAAGGATCTGG CTTCATATCGGTCTTTCAGTCAGCAGCTCAAGGCCCAGGACTCACTGGGCGAGCAGC CTACTACCGTGCCCCCTCCAATCGATCTGAGCATTCCACACGTCTGGATGCCCCCTC AGACAACTCCCCACGGCTGGACCGAAAGCCATACCACATCCGGGCTGCACAGACCC CATTTCAACCAGACATGCATCCTGTTTGATGGGCACGACCTGCTGTTCAGCACTGTG ACCCCTTGTCTGCATCAGGGATTCTACCTGATCGATGAGCTGAGATATGTGAAAATT ACACTGACTGAAGACTTCTTTGTGGTCACCGTGAGCATCGACGATGACACACCAATG

CTGCTGATTTTTGGACACCTGCCCCGGGTGCTGTTCAAGGCCCCCTACCAGCGAGAC AACTTTATTCTGCGGCAGACCGAGAAACACGAACTGCTGGTGCTGGTCAAGAAAGA TCAGCTCAACAGGCATAGCTATCTGAAGGACCCCGACTTTCTGGATGCCGCTCTGGA CTTCAACTACCTGGACCTGTCAGCACTGCTGCGGAATAGCTTCCACAGATATGCCGT GGATGTCCTGAAATCCGGAAGATGCCAGATGCTGGACCGGAGAACCGTGGAGATG GCATTTGCCTACGCTCTGGCACTGTTCGCAGCCGCTAGGCAGGAGGAAGCAGGCGC TCAGGTGTCCGTCCCTCGCGCACTGGATCGACAGGCAGCCCTGCTGCAGATCCAGGA GTTCATGATTACCTGTCTGTCTCAGACACCACCCAGAACTACCCTGCTGCTGTACCC CACTGCCGTGGACCTGGCTAAGAGGGCACTGTGGACCCCTAACCAGATCACTGATA TTACCTCTCTGGTGCGCCTGGTCTATATCCTGAGTAAACAGAATCAGCAGCACCTGA TCCCACAGTGGGCCCTGCGACAGATTGCCGACTTCGCTCTGAAGCTGCACAAAACCC ATCTGGCTTCCTTCCTGTCTGCATTTGCCCGCCAGGAGCTGTACCTGATGGGCTCTCT GGTGC AC AGT ATGCT GGTCC AT ACA ACTGAG AGGC GCGA A AT CTTT ATT GTGG AGAC AGGGCTGTGCAGCCTGGCTGAACTGTCCCACTTCACTCAGCTCCTGGCCCATCCTCA CCATGAGTACCTGTCCGATCTGTATACCCCATGTTCTAGTTCAGGCCGACGGGACCA CTCTCTGGAACGACTGACTCGGCTGTTTCCTGATGCAACCGTGCCTACCACCGTGCC CGCCGCCCTGAGTATCCTGTCAACAATGCAGCCAAGCACACTGGAGACTTTCCCCGA CCTGTTTTGCCT GCCTCTGGGGGAGTC ATT C AGCGCCCT GACCGTGTC AGAAC ATGT CAGCTACGTGGTCACAAACCAGTATCTGATCAAGGGAATTTCCTACCCCGTGTCTAC TACCGTGGTCGGCCAGAGTCTGATCATTACCCAGACAGATTCACAGACTAAATGTGA GCTGACCCGGAATATGCACACAACTCATAGCATCACCGCCGCTCTGAACATTTCCCT GGAGAATTGCGCTTTTTGTCAGAGTGCACTGCTGGAATACGATGACACACAGGGCGT GATO AAC ATTATGTATATGCACGATAGCGATGACGTGCTGTTCGCTCTGGACCCCTA CAACGAGGTGGTCGTGAGCTCCCCTCGCACTCATTATCTGATGCTGCTGAAGAATGG AAGAGTGCTGGAAGTCACTGATGTCGTGGTCGATGCCACAGACTCCCGGCTGCTGAT GATGTCTGTGTACGCACTGTCCGCCATCATCGGCATCTATCTGCTGTATCGAATGCTG AAAACCTGTTGA (SEQ ID NO: 15) (TM y CTD subrayados)

En algunas realizaciones, un polipéptido gH para su uso según la presente invención carece de un dominio transmembrana y/o dominio citoplásmico y/o contiene un dominio transmembrana y/o dominio citoplásmico modificados. Un polipéptido gH puede incluir opcionalmente uno o más polipéptidos adicionales (por ejemplo, un polipéptido heterólogo de dominio transmembrana y/o dominio citoplásmico). En algunas realizaciones, un polipéptido gH se expresa como una proteína de fusión con un polipéptido heterólogo. El polipéptido gH puede unirse a un polipéptido heterólogo para crear una proteína de fusión sin alterar la función y/o antigenicidad de gH. Por ejemplo, una secuencia codificante para un polipéptido heterólogo puede someterse a corte y empalme en la secuencia codificante del polipéptido gH, por ejemplo, en el extremo 3' de la secuencia codificante del polipéptido gH. En algunas realizaciones, una secuencia codificante para un polipéptido heterólogo puede someterse a corte y empalme en marco en la secuencia codificante del polipéptido gH. En algunas realizaciones, una secuencia codificante del polipéptido gH y el polipéptido heterólogo puede expresarse mediante un único promotor. En algunas realizaciones, un polipéptido heterólogo se inserta en (por ejemplo, se fusiona con) el extremo C-terminal de un polipéptido gH.

En algunas realizaciones, un polipéptido heterólogo es o comprende un dominio transmembrana y/o dominio citoplásmico encontrado en el virus de la estomatitis vesicular (VEV). En algunas realizaciones, un gH que carece de un dominio transmembrana y/o dominio citoplásmico se fusiona con un dominio transmembrana y/o dominio citoplásmico de VEV. Un polipéptido de fusión gH-VEV a modo de ejemplo para su uso según la presente invención se muestra a continuación como SEQ ID NO: 16. En algunas realizaciones, una proteína de fusión de polipéptido gH-VEV adecuada incluye todo o una porción de un polipéptido gH que es sustancialmente homólogo a un polipéptido gH de HCMV conocido y todo o una porción de un polipéptido de VEV que es sustancialmente homólogo a un polipéptido de VEV conocido. Por ejemplo, una proteína de fusión de polipéptido gH - VEV puede contener una o más sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos en comparación con un polipéptido gH y/o de VEV salvaje o que se produce de manera natural. Por tanto, en algunas realizaciones, una proteína de fusión de polipéptido gH-VEV adecuada para la presente invención es sustancialmente homóloga a SEQ ID NO:16. En algunas realizaciones, una proteína de fusión de polipéptido gH-VEV adecuada para la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o más homóloga a SEQ ID NO: 16. En algunas realizaciones, una proteína de fusión de polipéptido gH-VEV adecuada para la presente invención es sustancialmente idéntica a SEQ ID NO:16. En algunas realizaciones, una proteína de fusión de polipéptido gH-VEV adecuada para la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o más idéntica a SEQ ID NO:16. Tal como se usa en el presente documento, “gH-G” se refiere a una proteína de fusión de TM/CTD de gH - VEV de HMCV incluida como ejemplo únicamente con fines ilustrativos.

Secuencia de aminoácidos de gH - G de HCMV (SEQ ID NO:16)

MRPGLPS YLIVLAV CLLSHLLS SRY GAE AISEPLDKAFHLLLNT Y GRPIRFLRENTTQCT YN S SLRN S TWRENAISFNFF Q S YNQ Y YWHMPRCLF AGPL AEQFLN Q VDLTETLERY Q QRLNT Y AL Y SKDLAS YRSF S Q QLKAQD SLGEQPTTVPPPIDL SIPHVWMPPQTTPHGWT ESHTTSGLHRPHFNQTCILFDGHDLLFSTVTPCLHQGFYLIDELRYVKITLTEDFFWTYSI DDDTPMLLIFGHLPRVLFKAPYQRDNFILRQTEKHELLVLVKKDQLNRHSYLKDPDFLD AALDFNYLDLS ALLRN SFHRY A VD VLKS GRCQMLDRRTVEMAF AY AL ALF AAARQEE AGAQVSVPRALDRQAALLQIQEFMITCLSQTPPRTTLLLYPTAVDLAKRALWTPNQITDI TSLVRLV YILSKQNQQHLIPQ W ALRQIADF ALKLHKTHL ASFLS AF ARQEL YLMGSLVH

SMLVHTTERREIFIVETGLCSLAELSHFTQLLAHPHHEYLSDLYTPCSSSGRRDHSLERLT RLFPDATVPTTVPAALSILSTMQPSTLETFPDLFCLPLGESFSALTVSEHVSYVVTNQYLI KGISYPVSTTVVGQSLIITQTDSQTKCELTRNMHTTHSITAALNISLENCAFCQSALLEYD DTQGVINTMYMFTDSDDVLFALDPYNEVVVSSPRTHYEMLLKNGTVLEVTDVYVDATDS RFFFIIÜLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKROIYTDIEMNKLÜK* (SEQ ID NO: 16) (TM y CTD subrayados)

Secuencia de nucleótidos de gH - G de HCMV (SEQ ID NO:17)

ATGCGGCCAGGCCTCCCCTCCTACCTCATCGTCCTCGCCGTCTGTCTCCTCAGCCACC TACTTTCGTCACGATATGGCGCAGAAGCCATATCCGAACCGCTGGACAAAGCGTTTC ACCTACTGCTCAACACCTACGGGAGACCCATCCGCTTCCTGCGTGAAAACACCACCC AGTGTACCTACAATAGCAGCCTCCGTAACAGCACGGTCGTCAGGGAAAACGCCATC AGTTTCAACTTTTTCCAAAGCTATAATCAATACTATGTATTCCATATGCCTCGATGTC TTTTTGCGGGTCCTCTGGCGGAGCAGTTTCTGAACCAGGTAGATCTGACCGAAACCC TGGAAAGATACCAACAGAGACTTAACACTTACGCGCTGGTATCCAAAGACCTGGCC AGCTACCGATCTTTTTCGCAGCAGCTAAAGGCACAGGACAGCCTAGGTGAACAGCC CACCACTGTGCCACCACCCATTGACCTGTCAATACCTCACGTTTGGATGCCACCGCA AACCACTCCACACGGCTGGACAGAATCACATACCACCTCAGGACTACACCGACCAC ACTTTAACCAGACCTGTATCCTCTTTGATGGACACGATCTACTATTCAGCACCGTCAC ACCTTGTTTGCACCAAGGCTTTTACCTCATCGACGAACTACGTTACGTTAAAATAAC ACTGACCGAGGACTTCTTCGTAGTTACGGTGTCCATAGACGACGACACACCCATGCT GCTTATCTTCGGCCATCTTCCACGCGTACTCTTTAAAGCGCCCTATCAACGCGACAA CTTTATACTACGACAAACTGAAAAACACGAGCTCCTGGTGCTAGTTAAGAAAGATC AACTGAACCGTCACTCTTATCTCAAAGACCCGGACTTTCTTGACGCCGCACTTGACT TCAACTACCTGGACCTCAGCGCACTACTACGTAACAGCTTTCACCGTTACGCCGTGG ATGTACTCAAAAGCGGTCGATGTCAGATGCTGGACCGCCGCACGGTAGAAATGGCC TTCGCCTACGCATTAGCACTGTTCGCAGCAGCCCGACAAGAAGAGGCCGGCGCCCA AGTCTCCGTCCCACGGGCCCTAGACCGCCAGGCCGCACTCTTACAAATACAAGAATT TATGATCACCTGCCTCTCACAAACACCACCACGCACCACGTTGCTGCTGTATCCCAC GGCCGTGGACCTGGCCAAACGAGCCCTTTGGACACCGAATCAGATCACCGACATCA CCAGCCTCGTACGCCTGGTCTACATACTCTCTAAACAGAATCAGCAACATCTCATCC CCCAGTGGGCACTACGACAGATCGCCGACTTTGCCCTAAAACTACACAAAACGCAC CTGGCCTCTTTTCTTTCAGCCTTCGCGCGTCAAGAACTCTACCTCATGGGCAGCCTCG TCCACTCCATGCTAGTACATACGACGGAGAGACGCGAAATCTTCATCGTAGAAACG GGCCTCTGTTCATTAGCCGAGCTATCACACTTTACGCAGTTGCTAGCTCATCCGCAC CACGAATACCTCAGCGACCTGTACACACCCTGTTCCAGTAGCGGGCGACGCGATCA CTCGCTCGAACGCCTCACACGTCTCTTCCCCGATGCCACCGTCCCCACTACCGTTCCC GCCGCCCTCTCCATCCTATCTACCATGCAACCAAGCACGCTAGAAACCTTCCCCGAC CTGTTTTGTCTGCCGCTCGGCGAATCCTTCTCCGCGCTGACCGTCTCCGAACACGTCA GTTATGTCGTAACAAACCAGTACCTGATCAAAGGTATCTCCTACCCTGTCTCCACCA CCGTCGTAGGCCAGAGCCTCATCATCACCCAGACGGACAGTCAAACTAAATGCGAA CTGACGCGCAACATGCATACCACACACAGCATCACAGCGGCGCTCAACATTTCCCTA GAAAACTGCGCCTTTTGCCAAAGCGCCCTACTAGAATACGACGACACGCAAGGCGT CATCAACATCATGTACATGCACGACTCGGACGACGTCCTTTTCGCCCTGGATCCCTA CAACGAAGTGGTGGTCTCATCTCCGCGAACTCACTACCTCATGCTTTTGAAAAACGG TACGGTCCTAGAAGTAACTGACGTCGTCGTGGACGCTACCGACAGTCGTTTTTTCTTT ATCATAGGGTTAATCATTGGACTATTCTTGGTTCTCCGAGTTGGTATCCATCTTTGCA

TTAAATTAAAGCACACCAAGAAAAGACAGATTTATACAGACATAGAGATGAACCGA CTTGGAAAGTAA (SEO ID NO: 17) (TM y CTD subrayados)

Secuencia de nucleótidos de gH - G de HCMV con codones optimizados (SEQ ID NO:18)

ATGCGACCCGGACTGCCAAGCTACCTGATTGTCCTGGCTGTCTGTCTGCTGTCACAC CTGCTGAGTTCAAGATATGGGGCCGAAGCCATCAGCGAGCCACTGGACAAGGCTTT CCACCTGCTGCTGAACACCTACGGCAGACCCATTAGGTTTCTGCGCGAGAATACCAC ACAGTGCACATATAACAGCTCCCTGAGGAATAGCACTGTGGTCCGCGAAAACGCCA TCTCTTTCAATTTCTTTCAGAGTTACAACCAGTACTACGTGTTCCATATGCCACGCTG TCTGTTCGCAGGACCCCTGGCCGAGCAGTTTCTGAACCAGGTGGACCTGACCGAGAC ACTGGAAAGATACCAGCAGAGGCTGAATACCTATGCCCTGGTGAGTAAGGATCTGG CTTCATATCGGTCTTTCAGTCAGCAGCTCAAGGCCCAGGACTCTCTGGGAGAGCAGC CTACTACCGTGCCCCCTCCAATCGATCTGAGTATTCCACACGTCTGGATGCCCCCTC AGACAACTCCCCACGGATGGACCGAAAGCCATACCACATCCGGCCTGCACAGACCC CACTTCAACCAGACATGCATCCTGTTCGATGGCCACGACCTGCTGTTTTCCACTGTG ACCCCTTGTCTGCATCAGGGGTTCTACCTGATCGATGAGCTGAGATATGTGAAGATT ACACTGACTGAAGACTTCTTTGTGGTCACCGTGTCTATCGACGATGACACACCAATG CTGCTGATTTTCGGACACCTGCCCCGGGTGCTGTTCAAGGCCCCCTACCAGCGAGAC AACTTCATCCTGCGGCAGACCGAGAAACACGAACTGCTGGTGCTGGTCAAGAAAGA TCAGCTCAACCGGCATTCCTATCTGAAGGACCCCGACTTCCTGGATGCCGCTCTGGA CTTTAACTACCTGGACCTGTCAGCACTGCTGCGGAATAGCTTTCACAGATATGCCGT GGATGTCCTGAAATCTGGGCGCTGCCAGATGCTGGACCGGAGAACCGTGGAGATGG CATTCGCCTACGCTCTGGCACTGTTTGCAGCCGCTCGGCAGGAGGAAGCAGGAGCTC AGGTGAGTGTCCCTCGCGCACTGGATCGACAGGCAGCCCTGCTGCAGATCCAGGAG TTCATGATTACCTGTCTGAGCCAGACACCACCCAGAACTACCCTGCTGCTGTACCCC ACTGCCGTGGACCTGGCTAAGAGGGCACTGTGGACCCCTAACCAGATCACTGATATT ACCAGCCTGGTGAGACTGGTCTATATCCTGTCCAAACAGAATCAGCAGCACCTGATC CCACAGTGGGCCCTGAGGCAGATTGCCGACTTTGCTCTGAAGCTGCACAAAACCCAT CTGGCTTCCTTTCTGTCTGCATTCGCCAGACAGGAGCTGTACCTGATGGGATCTCTGG TGCACAGTATGCTGGTCCATACAACTGAGAGGCGCGAAATCTTCATTGTGGAGACA GGCCTGTGCAGCCTGGCTGAACTGTCCCACTTTACTCAGCTCCTGGCCCATCCTCAC CATGAGTACCTGTCAGATCTGTATACCCCATGTTCTAGTTCAGGACGACGGGACCAC AGCCTGGAACGACTGACTCGGCTGTTCCCTGATGCAACCGTGCCTACCACCGTGCCC GCCGCCCTGAGTATCCTGTCAACAATGCAGCCAAGCACACTGGAGACTTTTCCCGAC CTGTTCTGCCTGCCTCTGGGCGAGAGCTTCAGCGCCCTGACCGTGAGCGAACATGTC AGCTACGTGGTCACAAACCAGTATCTGATCAAGGGGATTTCCTACCCCGTGTCTACT ACCGTGGTCGGACAGTCCCTGATCATTACCCAGACAGATTCTCAGACTAAATGTGAG CTGACCAGAAATATGCACACAACTCATAGTATCACCGCCGCTCTGAACATTTCACTG GAGAATTGCGCTTTCTGTCAGTCCGCACTGCTGGAATACGATGACACACAGGGCGTG ATCAACATTATGTATATGCACGATTCTGATGACGTGCTGTTTGCTCTGGACCCCTACA ACGAGGTGGTCGTGAGCTCCCCCAGAACTCATTATCTGATGCTGCTGAAGAATGGCA CAGTGCTGGAAGTCACTGATGTCGTGGTCGATGCCACAGACTCCCGCTTCTTTTTCAT CATTGGCCTGATCATTGGGCTGTTCCTGGTGCTGCGAGTCGGCATCCACCTGTGCAT CAAGCTGAAGCATACAAAGAAGAGACAGATCTACACCGATATTGAAATGAACAGGC TGGGCAAATGA (SEQ ID NO: 18) (TM y CTD subrayados)

En algunas realizaciones, un polipéptido gH incluye un dominio transmembrana y/o un dominio citoplásmico encontrado en gB. Un nucleótido a modo de ejemplo que codifica para un polipéptido de fusión de TM/CTD de gH de HCMV - gB de HCMV para su uso según la presente invención se muestra a continuación como SEQ ID NO:20. En algunas realizaciones, un polipéptido de TM/CTD de gH de HCMV - gB de HCMV adecuado para la presente invención es sustancialmente homólogo para el polipéptido codificado por SEQ ID NO:20. En algunas realizaciones, un polipéptido de TM/CTD de gH de HCMv - gB de HCMV adecuado para la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o más homóloga al polipéptido codificado por SEQ ID NO:20. En algunas realizaciones, un polipéptido de TM/CTD de gH de HCMV - gB de HCMV adecuado para la presente invención es sustancialmente idéntico al polipéptido codificado por SEQ ID NO:20. En algunas realizaciones, un polipéptido de TM/CTD de gH de HCMV - gB de HCMV adecuado para la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o más idéntica al polipéptido codificado por SEQ ID NO:20.

Secuencia de nucleótidos de TM/CTD de gH de HCMV - gB de HCMV (SEQ ID NO:20)

ATGCGGCCAGGCCTCCCCTCCTACCTCATCGTCCTCGCCGTCTGTCTCCTCAGCCACC TACTTTCGTCACGATATGGCGCAGAAGCCATATCCGAACCGCTGGACAAAGCGTTTC ACCTACTGCTCAACACCTACGGGAGACCCATCCGCTTCCTGCGTGAAAACACCACCC AGTGTACCTACAATAGCAGCCTCCGTAACAGCACGGTCGTCAGGGAAAACGCCATC AGTTTCAACTTTTTCCAAAGCTATAATCAATACTATGTATTCCATATGCCTCGATGTC TTTTTGCGGGTCCTCTGGCGGAGCAGTTTCTGAACCAGGTAGATCTGACCGAAACCC TGGAAAGATACCAACAGAGACTTAACACTTACGCGCTGGTATCCAAAGACCTGGCC AGCTACCGATCTTTTTCGCAGCAGCTAAAGGCACAGGACAGCCTAGGTGAACAGCC CACCACTGTGCCACCACCCATTGACCTGTCAATACCTCACGTTTGGATGCCACCGCA AACCACTCCACACGGCTGGACAGAATCACATACCACCTCAGGACTACACCGACCAC ACTTTAACCAGACCTGTATCCTCTTTGATGGACACGATCTACTATTCAGCACCGTCAC ACCTTGTTTGCACCAAGGCTTTTACCTCATCGACGAACTACGTTACGTTAAAATAAC ACTGACCGAGGACTTCTTCGTAGTTACGGTGTCCATAGACGACGACACACCCATGCT GCTTATCTTCGGCCATCTTCCACGCGTACTCTTTAAAGCGCCCTATCAACGCGACAA CTTTATACTACGACAAACTGAAAAACACGAGCTCCTGGTGCTAGTTAAGAAAGATC AACTGAACCGTCACTCTTATCTCAAAGACCCGGACTTTCTTGACGCCGCACTTGACT TCAACTACCTGGACCTCAGCGCACTACTACGTAACAGCTTTCACCGTTACGCCGTGG ATGTACTCAAAAGCGGTCGATGTCAGATGCTGGACCGCCGCACGGTAGAAATGGCC TTCGCCTACGCATTAGCACTGTTCGCAGCAGCCCGACAAGAAGAGGCCGGCGCCCA AGTCTCCGTCCCACGGGCCCTAGACCGCCAGGCCGCACTCTTACAAATACAAGAATT

TATGATCACCTGCCTCTCACAAACACCACCACGCACCACGTTGCTGCTGTATCCCAC GGCCGTGGACCTGGCCAAACGAGCCCTTTGGACACCGAATCAGATCACCGACATCA CCAGCCTCGTACGCCTGGTCTACATACTCTCTAAACAGAATCAGCAACATCTCATCC CCCAGTGGGCACTACGACAGATCGCCGACTTTGCCCTAAAACTACACAAAACGCAC CTGGCCTCTTTTCTTTCAGCCTTCGCGCGTCAAGAACTCTACCTCATGGGCAGCCTCG TCCACTCCATGCTAGTACATACGACGGAGAGACGCGAAATCTTCATCGTAGAAACG GGCCTCTGTTCATTAGCCGAGCTATCACACTTTACGCAGTTGCTAGCTCATCCGCAC CACGAATACCTCAGCGACCTGTACACACCCTGTTCCAGTAGCGGGCGACGCGATCA CTCGCTCGAACGCCTCACACGTCTCTTCCCCGATGCCACCGTCCCCACTACCGTTCCC GCCGCCCTCTCCATCCTATCTACCATGCAACCAAGCACGCTAGAAACCTTCCCCGAC CTGTTTTGTCTGCCGCTCGGCGAATCCTTCTCCGCGCTGACCGTCTCCGAACACGTCA GTTATGTCGTAACAAACCAGTACCTGATCAAAGGTATCTCCTACCCTGTCTCCACCA CCGTCGTAGGCCAGAGCCTCATCATCACCCAGACGGACAGTCAAACTAAATGCGAA CTGACGCGCAACATGCATACCACACACAGCATCACAGCGGCGCTCAACATTTCCCTA GAAAACTGCGCCTTTTGCCAAAGCGCCCTACTAGAATACGACGACACGCAAGGCGT CATCAACATCATGTACATGCACGACTCGGACGACGTCCTTTTCGCCCTGGATCCCTA CAACGAAGTGGTGGTCTCATCTCCGCGAACTCACTACCTCATGCTTTTGAAAAACGG TACGGTCCTAGAAGTAACTGACGTCGTCGTGGACGCTACCGACAGTCGTTTCGGAG CCTTCACCATCATCCTCGTGGCCATAGCCGTCGTCATTATCATTTATTTGATCT ATACTCGACAGCGGCGTCTCTGCATGCAGCCGCTGCAGAACCTCTTTCCCTATC TGGTGTCCGCCGACGGGACCACCGTGACGTCGGGCAACACCAAAGACACGTCG TTACAGGCTCCGCCTTCCT ACGAGGAAAGTGTTTAT AATTCTGGTCGCAAAGGA CCGGGACCACCGTCGTCTGATGCATCCACGGCGGCTCCGCCTTACACCAACGA GCAGGCTTACCAGATGCTTCTGGCCCTGGTCCGTCTGGACGCAGAGCAGCGAG CGCAGCAGAACGGTACAGATTCTTTGGACGGACAGACTGGCACGCAGGACAAG GGACAGAAGCCCAACCTGCTAGACCGACTGCGACACCGCAAAAACGGCTACCG ACACTTGAAAGACTCCGACGAAGAAGAGAACGTCTGA (SEQ ID NO 20) (péptido

señal gH subrayado; TM-CTD de gB en negrita)

Otras (incluyendo complejo de glicoproteína gN y gM (gC) II)

Además de gB y gH, otras glicoproteínas de la envuelta pueden ser útiles en el desarrollo de vacunas. Por ejemplo, el complejo gcII, que contiene gN (UL73) y gM (UL100), es de particular interés. El análisis proteómico de viriones de HCMV ha demostrado que gcII es la glicoproteína más abundantemente expresada en partículas de virus, enfatizando su posible importancia en la inmunidad protectora (Varnum SM etal., 2005 Human Gene Ther 16:114350). La infección por HCMV provoca una respuesta de los anticuerpos específica de gcII en la mayoría de individuos seropositivos (Shimamura M et al., 2006 J Virol 80:4591-600), y las vacunas de ADN que contienen antígenos gM y gN de gcII han mostrado provocar las respuestas de los anticuerpos neutralizantes en conejos y ratones (Shen S et al., 2007 Vaccine 25:3319-27).

pp65

La respuesta celular inmunitaria al HCMV incluye respuestas a linfocitos T citotóxicos CD4+ restringidos por CMH de clase II y CD8+ restringidos por CMH de clase I a varios antígenos virales, muchos de los cuales se encuentran en el tegumento viral, la región de la partícula viral que se encuentra entre la envuelta y la nucleocápside. Por ejemplo, se ha demostrado que la proteína pp65 de HCMV (UL83) provoca una respuesta significativa de linfocitos T CD8+ después de la infección por HCMV (McLaughlin-Taylor E 1994 J Med Virol 43: 103-10). Esta proteína viral de 65 kDa es una de las proteínas estructurales de HCMV expresadas con mayor abundancia. En el presente documento se describen secuencias de pp65 a modo de ejemplo.

Otras (incluyendo IE1, pp150)

Otras proteínas que provocan las respuestas de linfocitos T incluyen la proteína inmediata temprana 1 (IE1) (UL123) y pp150 (UL32) (Gibson L et al., 2004 J Immunol 172:2256-64; La Rosa C et al., 2005 Human Immunol 66:116-26). Tal como se describió anteriormente, un polipéptido Gag puede incluir opcionalmente uno o más polipéptidos adicionales (por ejemplo, un antígeno heterólogo). En algunas realizaciones, un polipéptido Gag se expresa conjuntamente con un antígeno heterólogo (por ejemplo, bajo promotores independientes y/o como proteínas independientes). El polipéptido Gag puede expresarse conjuntamente con un antígeno heterólogo sin alterar la función de Gag. Sin querer limitarse a ninguna teoría, se cree que la coexpresión de un polipéptido Gag autoensamblante con un antígeno de la envuelta heterólogo permitirá al antígeno incorporarse en la envuelta o la bicapa lipídica de una VLP resultante. En algunas realizaciones, los componentes de la envuelta de VLP sirven como inmunógenos eficaces (por ejemplo, para la inducción de la respuesta humoral inmunitaria). En algunas realizaciones, un polipéptido Gag se expresa como una proteína de fusión con un antígeno heterólogo. Por ejemplo, una secuencia codificante para un antígeno heterólogo puede someterse a corte y empalme en la secuencia codificante del polipéptido Gag, por ejemplo, en el extremo 3' de la secuencia codificante del polipéptido Gag. En algunas realizaciones, una secuencia codificante para un antígeno heterólogo puede someterse a corte y empalme en marco en la secuencia codificante del polipéptido Gag. En algunas realizaciones, una secuencia codificante del polipéptido Gag y un antígeno heterólogo pueden expresarse mediante un único promotor. En algunas realizaciones, un antígeno heterólogo se inserta en (por ejemplo, se fusiona con) el extremo C-terminal de un polipéptido Gag. Sin querer limitarse a ninguna teoría, se cree que la fusión de un polipéptido Gag autoensamblante con un antígeno heterólogo permitirá al antígeno incorporarse en los componentes estructurales de una VLP resultante. En algunas realizaciones, los componentes estructurales de VLP sirven como inmunógenos eficaces (por ejemplo, para la inducción de la respuesta celular inmunitaria). Por ejemplo, las VLP proporcionadas pueden comprender un polipéptido gag retroviral (por ejemplo, gag de MLV) y un componente estructural de HCMV (por ejemplo, pp65). En alguna de tales realizaciones, pp65 se incorpora en la VLP y sirve como antígeno para provocar una respuesta inmunitaria contra HCMV.

Las VLP proporcionadas pueden contener una proteína retroviral estructural (por ejemplo, polipéptido Gag) que se dispone y construye de manera que se autoensambla para formar la VLP y se coloca en el interior de la VLP. En algunas realizaciones, las VLP proporcionadas contienen una proteína de la envuelta (por ejemplo, gB y/o gH) que se dispone y construye de manera que uno o más epítopos de la proteína de la envuelta (por ejemplo, gB y/o gH) se coloca en la superficie de la VLP. En algunas realizaciones, las VLP proporcionadas contienen una proteína de fusión estructural (por ejemplo, Gag/pp65) que se dispone y construye de manera que uno o más epítopos de la proteína estructural (por ejemplo, pp65) se coloca en el interior de la VLP.

II. Producción de las VLP

Se apreciará que una composición que comprende VLP incluirá normalmente una mezcla de VLP con una gama de tamaños. Debe entenderse que los valores de diámetro enumerados a continuación corresponden al diámetro más frecuente dentro de la mezcla. En algunas realizaciones,> 90% de las vesículas en una composición tendrá un diámetro que se encuentra dentro del 50% del valor más frecuente (por ejemplo, 1000 ± 500 nm). En algunas realizaciones, la distribución puede ser más estrecha, por ejemplo,> 90% de las vesículas en una composición puede tener un diámetro que se encuentra dentro del 40, el 30, el 20, el 10 o el 5% del valor más frecuente. En algunas realizaciones, la sonicación o la ultrasonicación pueden usarse para facilitar la formación de VLP y/o para alterar el tamaño de las VLP. En algunas realizaciones, puede usarse filtración, diálisis y/o centrifugación para ajustar la distribución de tamaño de las VLP.

En general, las VLP producidas según los métodos de la presente divulgación pueden ser de cualquier tamaño. En determinadas realizaciones, la composición puede incluir VLP con un diámetro en el intervalo de aproximadamente 20 nm a aproximadamente 300 nm. En algunas realizaciones, una VLP se caracteriza porque tiene un diámetro dentro de un intervalo delimitado por un límite inferior de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 nm y limitado por un límite superior de 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180 o 170 nm. En algunas realizaciones, las VLP dentro de una población muestran un diámetro promedio dentro de un intervalo delimitado por un límite inferior de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 nm y delimitado por un límite superior de 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180 o 170 nm. En algunas realizaciones, las VLP en una población tienen un índice de polidispersidad menor de 0,5 (por ejemplo, menor de 0,45, menor de 0,4 o menor de 0,3). En algunas formas de realización, el diámetro de las VLP se determina mediante nanodimensionamiento. En algunas realizaciones, el diámetro de las VLP se determina mediante microscopía electrónica.

A. Producción de VLP in vitro / ex vivo

Las VLP proporcionadas según la presente invención pueden prepararse según metodologías generales conocidas por los expertos. Por ejemplo, pueden prepararse diversas moléculas de ácido nucleico, genomas o vectores o plásmidos reconstituidos usando secuencias de virus conocidos. Tales secuencias están disponibles en bancos y el material puede obtenerse de diversas colecciones, plásmidos publicados, etc. Estos elementos pueden aislarse y manipularse usando técnicas bien conocidas por el experto en la técnica, o aislarse de plásmidos disponibles en la técnica. También pueden producirse diversas secuencias sintéticas o artificiales a partir de análisis informáticos o mediante el cribado (alto rendimiento) de bibliotecas. La expresión recombinante de los polipéptidos para las VLP requiere la construcción de un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica para uno o más polipéptidos. Una vez que se ha obtenido un polinucleótido que codifica para uno o más polipéptidos, el vector para la producción del polipéptido puede producirse mediante tecnología de ADN recombinante usando técnicas conocidas en la técnica. Los vectores de expresión que pueden utilizarse según la presente invención incluyen, pero no se limitan a, vectores de expresión de mamíferos, vectores de expresión de baculovirus, vectores de expresión de plantas (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor (CaMV), virus del mosaico del tabaco (TMV)), vectores de expresión de plásmidos (por ejemplo, plásmido Ti), entre otros.

Un plásmido de expresión de VLP a modo de ejemplo que puede usarse según la presente invención se muestra a continuación como SEQ ID NO: 19:

Plásmido de expresión Propol II (SEQ ID NO:19)

CTAGAGAGCTTGGCCCATTGCATACGTTGTATCCATATCATAATATGTACATTTATAT TGGCTCATGTCCAACATTACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAG TAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAA CTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCA ATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGG GTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCA AGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAG TACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTA TTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACT CACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACC AAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATG GGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCG TCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGA CCGATCCAGCCTCCGGTCGACCGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAGTTTGGGGACCCT TGATT GTT CTTTCTTTTT CGCT ATT GT AAAATT C AT GTT AT AT GGAGGGGGC AAAGTT TTCAGGGTGTTGTTTAGAATGGGAAGATGTCCCTTGTATCACCATGGACCCTCATGA TAATTTTGTTTCTTTCACTTTCTACTCTGTTGACAACCATTGTCTCCTCTTATTTTCTTT TCATTTTCTTGTAACTTTTTCGTTAAACTTTAGCTTGCATTTGTAACGAATTTTTAAAT TCACTTTTGTTTATTTGTCAGATTGTAAGTACTTTCTCTAATCACTTTTTTTTCAAGGC AAT C AGGGT AT ATT AT ATT GT ACTT C AGC AC AGTTTTAGAGAAC A ATT GTTAT AATT AAATGATAAGGTAGAATATTTCTGCATATAAATTCTGGCTGGCGTGGAAATATTCTT ATTGGTAGAAACAACTACATCCTGGTCATCATCCTGCCTTTCTCTTTATGGTTACAAT GATATACACTGTTTGAGATGAGGATAAAATACTCTGAGTCCAAACCGGGCCCCTCTG CTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTAT TGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCCTCGAGCGTACGCCTAGGGGATCCAG CGCTATTTAAATGCTAGCATGCATGTTAACCCTGCAGGGGTACCGCGGCCGCAAGCT TAGATCCGTCGAGGAATTCACTCCTCAGGTGCAGGCTGCCTATCAGAAGGTGGTGGC TGGTGTGGCCAATGCCCTGGCTCACAAATACCACTGAGATCTTTTTCCCTCTGCCAA AAATT AT GGGGAC AT C AT GAAGCCCCTT GAGC AT CT GACTT CTGGCTAAT AAAGGAA ATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACA TAT GGGAGGGC A AAT C ATTT AAAAC AT C AGAATGAGT ATTT GGTTT AGAGTTTGGC A ACATATGCCCATATGCTGGCTGCCATGAACAAAGGTTGGCTATAAAGAGGTCATCA GTATATGAAACAGCCCCCTGCTGTCCATTCCTTATTCCATAGAAAAGCCTTGACTTG AGGTTAGATTTTTTTTATATTTTGTTTTGTGTTATTTTTTTCTTTAACATCCCTAAAAT TTTCCTTACATGTTTTACTAGCCAGATTTTTCCTCCTCTCCTGACTACTCCCAGTCATA GCTGTCCCTCTTCTCTTATGGAGATCCCTCGACGGATCGGCCGCAATTCGTAATCATG TCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGA GCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATT AATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCA TTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGC TTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGC TCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGA ACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCT GGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAG TCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAA GCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTT TCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCG GTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGAC CGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTA TCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGG TGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATT TGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTG ATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGAT TACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGA CGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAA GGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTA TATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCT CAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAAC TACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACC CACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAG CGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGG GAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCT AC AGGC AT CGT GGT GT C ACGCT CGTCGTTT GGT AT GGCTT C ATT C AGCTCCGGTT CCC AACGAT C AAGGCGAGTTAC AT GAT CCCCC AT GTT GT GC A A AAAAGCGGGTT AGCT C CTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTT ATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGA CTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCT CTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTG CTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTG AGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTT TC ACC AGCGTTTCTGGGT GAGC AA A AAC AGGAAGGC A AA AT GCC GC AA AA AAGGG AATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTG AAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAA AAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTAAATTGT AAGCGTT AAT ATTTT GTTA AA ATT CGCGTTA A ATTTTT GTT AAAT C AGCTC ATTTTTT AACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGAT AGGGTT GAGTGTT GTT CC AGTTT GGAAC AAGAGT CC ACT ATT AA AGA ACGT GGACT C CAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCAT CACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTA AAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAA GGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTC ACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTC CCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTC GCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAA CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAGCGCGCGTAA TACGACTCACTATAGGGCGAATTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCT (SEQ ID

NO: 19)

Las VLP proporcionadas pueden prepararse según técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las VLP pueden producirse en cualquier sistema de expresión de proteínas disponible. Normalmente, el vector de expresión se transfiere a una célula huésped mediante técnicas convencionales y luego las células transfectadas se cultivan mediante técnicas convencionales para producir VLP. En algunas realizaciones, las VLP se producen usando transfección transitoria de células. En algunas realizaciones, las VLP se producen usando células transfectadas de manera estable. Las líneas celulares típicas que pueden utilizarse para la producción de VLP incluyen, pero no se limitan a, líneas celulares de mamíferos tales como riñón embrionario humano (HEK) 293, WI 38, ovario de hámster chino (CHO), riñón de mono (COS), HT1080, C10, HeLa, células de riñón de crías de hámster (BHK), células 3T3, C127, CV-1, HaK, NS/O y L-929. Los ejemplos específicos no limitativos incluyen, pero no se limitan a, la línea de mieloma de ratón BAlB/c (NSO/1, eCaCC n°: 85110503); retinoblastos humanos (PER.C6 (CruCell, Leiden, Países Bajos)); línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); células de riñón de crías de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino /- DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1 587); células de carcinoma de cuello uterino humano (HeLa, ATCC CCL 2); células renales caninas (MDCK, ATCC Cc L 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, At CC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci.

383:44-68 (1982).)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2). En algunas realizaciones, las líneas celulares que pueden utilizarse para la producción de VLP incluyen insectos (por ejemplo, Sf-9, Sf-21, Tn-368, Hi5) o células de plantas (por ejemplo, Leguminosa, cereales o tabaco). Se apreciará en algunas realizaciones, particularmente cuando la glicosilación es importante para la función de las proteínas, que son preferibles células de mamíferos para la expresión de proteínas y/o la producción de VLP (véase, por ejemplo, Roldao A et al., 2010 Expt Rev Vaccines 9:1149-76).

Se apreciará que puede elegirse una cepa celular que module la expresión de las secuencias insertadas o modifique y procese el producto génico de una manera específica. Tales modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión o transporte a la membrana) de productos proteicos pueden ser importantes para la generación de una VLP o la función de un polipéptido de VLP o polipéptido adicional (por ejemplo, un adyuvante o antígeno adicional). Las diferentes células tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento postraduccional y la modificación de proteínas y productos génicos. Pueden elegirse líneas celulares o sistemas huésped apropiados para asegurar la modificación y el procesamiento correctos de la proteína foránea expresada. Generalmente, las células huésped eucariotas (también denominadas células de empaquetamiento (por ejemplo, células de riñón embrionario humano 293T) que poseen la maquinaria celular apropiada para el procesamiento adecuado del transcrito primario, glicosilación y fosforilación del producto génico pueden usarse según la presente invención.

Las VLP pueden purificarse según técnicas conocidas, tales como centrifugación, gradientes, ultracentrifugación en gradiente de sacarosa, filtración de flujo tangencial y cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico (aniónico y catiónico), cromatografía en columna de afinidad y tamaño) o solubilidad diferencial, entre otras. Alternativa o adicionalmente, el sobrenadante celular puede usarse directamente, sin etapa de purificación. Pueden añadirse entidades adicionales, tales como antígenos o adyuvantes adicionales a las VLP purificadas.

En algunas realizaciones, las secuencias de polinucleótido proporcionadas son con codones optimizados. La optimización de codones se conoce bien en la técnica e implica la modificación del uso de codones de manera que se producen mayores niveles de proteína.

B. Producción de VLP in vivo

Las VLP proporcionadas según la presente invención puede prepararse como vacunas de ADN según métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, en algunas realizaciones, uno o más vectores o plásmidos, por ejemplo, tal como los descritos anteriormente, se administran a un sujeto de manera que las células receptoras expresan polipéptidos codificados por el vector o plásmido. En algunas realizaciones, las células receptoras que expresan tales polipéptidos producen VLP que comprenden los polipéptidos.

C. eVLPmono, di, trivalentes

Según la presente invención, las células pueden transfectarse con un único vector de expresión tal como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, un único vector de expresión codifica para más de un elemento de una VLP (por ejemplo, más de uno de poliproteína estructural, polipéptido del tegumento del CMV, glicoproteína del CMV, etc.). Por ejemplo, en algunas realizaciones, un único vector de expresión codifica para dos o más elementos de una VLP. En algunas realizaciones, un único vector de expresión codifica para tres o más elementos de una VLP.

En algunas realizaciones, las células se transfectan con dos o más vectores de expresión. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las células se transfectan con un primer vector que codifica para un polipéptido Gag y un segundo vector que codifica para una glicoproteína de la envuelta de HCMv (por ejemplo, gB o gB-G o). En algunas de tales realizaciones, se producen VLP “monovalentes” que comprenden una glicoproteína de la envuelta de HCMV (por ejemplo, gB o gB-G). En algunas realizaciones, las células se transfectan con un primer vector que codifica para un polipéptido Gag, un segundo vector que codifica para una glicoproteína de la envuelta de HCMV (por ejemplo, GB o gB-G) y un tercer vector que codifica para otra glicoproteína de la envuelta de HCMV (por ejemplo, GB o gB-G). En algunas de tales realizaciones, se producen VLP “bivalentes” que comprenden 2 glicoproteínas de la envuelta de HCMV (por ejemplo, gB y gH-G o gB-G). En algunas realizaciones, las células se transfectan con un primer vector que codifica para un polipéptido de fusión Gag-pp65 y un segundo vector que codifica para una glicoproteína de la envuelta de HCMV (por ejemplo, gB o gB-G). En algunas de tales realizaciones, se producen VLP “bivalentes” que comprenden una proteína estructural de HCMV y una glicoproteína de la envuelta de HCMV (por ejemplo, gB o gB-G). En algunas realizaciones, las células se transfectan con un primer vector que codifica para un polipéptido de fusión Gag-pp65, un segundo vector que codifica para una glicoproteína de la envuelta de HCMV (por ejemplo, GB o gB-G) y un tercer vector que codifica para otra glicoproteína de la envuelta de HCMV (por ejemplo, GB o gB-G). En algunas de tales realizaciones, se producen VLP “trivalentes” que comprenden una proteína estructural de HCMV y 2 glicoproteínas de la envuelta de HCMV (por ejemplo, gB y gH-G o gB-G).

En algunas realizaciones, se mezclan VLP monovalentes, bivalentes o trivalentes. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se mezclan VLP monovalentes y bivalentes para formar una mezcla de VLP trivalentes. En algunas realizaciones dos VLP bivalentes se mezclan para formar una mezcla de VLP trivalentes.

III. Infección por HCMV y tratamiento

El citomegalovirus humano (HCMV), un p-herpesvirus, es un patógeno que se produce de manera ubicua. En general, la entrada de virus del herpes en las células es un proceso complejo iniciado por adsorción y unión al receptor y seguido por la fusión de la envuelta del virus con una membrana celular. La fusión se produce generalmente en la membrana plasmática o en una membrana endosomal. El HCMV infecta múltiples tipos de células in vivo, incluyendo células epiteliales, células endoteliales y fibroblastos (Plachter B et al., 1996 Adv Virus Res 46:195-261). Se fusiona con las membranas plasmáticas de los fibroblastos (Compton T et al., 1992 Virology 191:387-395), pero entra en las células epiteliales pigmentadas de la retina y en las células endoteliales de la vena umbilical a través de la endocitosis (Bodaghi B et al., 1999 J Immunol 162:957-964; Ryckman BJ et al., 2006 J Virol 80:710-722). El mecanismo por el cual los herpesvirus eligen su ruta de entrada sigue sin estar claro. Generalmente, se asume que las rutas de entrada están determinadas principalmente por la célula huésped, pero hay pruebas de que las glicoproteínas del virión desempeñan funciones trópicas (Wang X et al., 1998 J Virol 72:5552-5558). Como se mencionó anteriormente, HCMV codifica para dos complejos gH/gL: gH/gL/gO y gH/gL/UL128/UL130/UL131. El complejo que contiene gO es suficiente para la infección por fibroblastos, mientras que el complejo que contiene pUL128/UL130/UL131 es importante para la infección por HCMV de células endoteliales y epiteliales.

El HCMV infecta al 50-85% de los adultos Gershon AA et al., 1997 en Viral Infections of Humans, 4a edición, Nueva York; Plenum Press:229-251). La mayoría de los individuos sanos que adquieren HCMV después del nacimiento desarrollan pocos síntomas, si es que presentan alguno. Sin embargo, la enfermedad por HCMV es la causa de una morbimortalidad significativa en individuos inmunodeprimidos, tales como los receptores de trasplantes de células hematopoyéticas (HCT) y trasplantes de visceras macizas (SOT) (Pass RF 2001 Cytomegalovirus. In Fields Virology. 4a edición, Filadelfia; Lippincott Williams & Wilkens:2675-2705). En poblaciones SOT o HCT, la enfermedad por HCMV puede producirse por una nueva infección transmitida desde el órgano donante o HCT, o puede reaparecer como resultado de la reactivación del virus latente en el receptor. En las personas infectadas por el VIH, la infección por HCMV acelera la progresión al sida y la muerte, a pesar de la disponibilidad de terapia antirretroviral (Deayton j R et al., 2004 Lancet 363:2116-2121). Además, en los EE. UU., Hc Mv es la infección intrauterina más común y provoca anomalías congénitas que dan como resultado la muerte o defectos congénitos graves, incluyendo sordera y el retraso mental, en aproximadamente 8000 bebés cada año (Stagon S et al., 1986 JAMA 256:1904-1908).

Las respuestas inmunitarias que controlan el HCMV no se comprenden completamente. Por analogía con otros herpesvirus humanos, puede suponerse que las respuestas inmunitarias tanto celulares como humorales desempeñan un papel importante (Kohl S 1992 Current topics in Microbiology and Immunology 179:75-88). Para el CMV murino, se demostró que una respuesta de células T citotóxicas o la transferencia pasiva de anticuerpos neutralizantes es suficiente para proteger contra un peligro letal (Rapp M et al., 1993 Multidisciplinary Approach to Understanding Cytomegalovirus Disease:327-332; Reddehase MJ et al., 198 J Virology 61:3102-3108).

El control del CMV en personas inmunodeprimidas se asocia principalmente con respuestas inmunitarias celulares; tanto los linfocitos T c D8+ como los CD4+ parecen ser importantes para la protección contra la enfermedad por CMV (Gamadia LE et al., 2003 Blood 101:2686-2692; Cobbold M et al., 2005 J Exp Med 202:379-386). La respuesta celular inmunitaria al CMV incluye respuestas de los linfocitos T auxiliares CD4+ y los linfocitos T citotóxicos CD8+ a varios antígenos, encontrados en el tegumento viral, la región de la partícula viral entre la envuelta y la cápside. Un estudio reciente de células T CD4+ y CD8+ específicas de CMV de donantes sanos usaron péptidos superpuestos de una serie de marcos de lectura abiertos de CMV para identificar antígenos reconocidos después de la infección por CMV (Silwester AW et al., 2005 J Exp Med 202:673-685). La fosfoproteína 65 (pp65) del tegumento del CMV y la glicoproteína de superficie gB fueron los antígenos más frecuentemente reconocidos por células T CD4+, y pp65 fue también uno de los antígenos más frecuentemente reconocidos por células T CD8+.

Al contrario que el entorno del trasplante, la respuesta humoral inmunitaria materna contra el virus parece ser importante para prevenir la enfermedad por HCMV en el recién nacido. Los anticuerpos contra las glicoproteínas de superficie, especialmente gB, parecen ser críticos para la protección contra la transferencia materno-fetal de CMV (Fowler KB et al., 2003 JAMA 289:1008-1011). Además, en un estudio de vacunación anterior se demostró que la protección contra la reinfección se correlaciona con los anticuerpos neutralizantes (Adler SP et al., 1995 J Infectious Diseases 171:26-32). La respuesta humoral inmunitaria al CMV está dominada por las respuestas a las glicoproteínas de la envuelta viral presentes en la envuelta externa de la partícula del virus (por ejemplo, gB y gH).

En el caso del HCMV, la evaluación directa de las funciones efectoras inmunológicas es difícil ya que el virus es estrictamente específico de la especie y no se dispone de un sistema de modelo animal. Sin embargo, se han usado CMV murino y CMV de cobaya para evaluar estrategias de vacunación en estas especies huésped.

Una vacuna contra el CMV que induce respuestas tanto de células T protectoras como de anticuerpos neutralizantes tiene el potencial de prevenir la infección o mejorar la enfermedad por CMV debido a una infección congénita o un trasplante.

La primera vacuna candidata contra el HCMV viva atenuada que se sometió a prueba en seres humanos se basó en la cepa AD169 adaptada al laboratorio. Los ensayos posteriores con otro aislado clínico adaptado al laboratorio, la cepa Towne, confirmaron que las vacunas vivas atenuadas podrían provocar anticuerpos neutralizantes, así como respuestas de los linfocitos T CD4+ y CD8+. La eficacia de la vacuna Towne se evaluó en una serie de estudios en receptores de trasplante renal. Aunque la vacuna Towne proporcionó un impacto protector sobre la enfermedad por HCMV, no pudo prevenir la infección por HCMV después del trasplante (Plotkin Sa et al., 1984 Lancet 1:528-530). La vacuna Towne también se evaluó en un estudio controlado con placebo de madres seronegativas que tenían hijos que asistían a guarderías infantiles grupales donde no pudo evitar que estas mujeres adquirieran la infección de sus hijos infectados por HCMV (Adler s P et al., 1995 J Infectious Diseases 171:26-32). Una interpretación de estos estudios fue que la vacuna Towne estaba sobreatenuada. Para explorar esta posibilidad se realizó una serie de recombinantes genéticos en los que las regiones de la cepa “Toledo” no atenuada del CMV se sustituyeron por las regiones correspondientes del genoma de Towne, dando como resultado la construcción de “quimeras” de Towne/Toledo que contienen algunas, pero no todas, de las mutaciones que contribuyen a la atenuación de la vacuna de Towne (Heineman TC et al. 2006 J Infect Disease 193:1350-1360). La seguridad y la tolerabilidad de cuatro “quimeras” de Towne/Toledo se están sometiendo a prueba en un ensayo de fase I. Las preocupaciones de seguridad a largo plazo sobre el riesgo potencial de establecer una infección latente por HCMV han obstaculizado el desarrollo posterior de vacunas vivas atenuadas.

La subunidad principal candidata a vacuna de CMV se basa en la glicoproteína de la envuelta, gB, (la vacuna gB recombinante purificada es fabricada por Sanofi-Pasteur Vaccines) debido a la capacidad de esta proteína para provocar respuestas de anticuerpos neutralizantes de virus de alto título durante la infección natural. La vacuna gB recombinante provoca respuestas de anticuerpos neutralizantes y tiene un perfil de seguridad excelente, sin embargo, excluye otras glicoproteínas dianas de la respuesta de anticuerpos neutralizantes y, lo que es más importante, las dianas de linfocitos T. La vacuna requiere adyuvante MF59 para optimizar la inmunogenicidad. En el ensayo más reciente, esta vacuna proporcionó una eficacia general del 50% para la prevención de la infección por CMV en un ensayo clínico de fase 2 en mujeres jóvenes (Pass RF et al., 2009 N Engl J Med 360:1191-1199). Otras proteínas virales que se están evaluando como subunidades candidatas a vacuna incluyen pp65 e IE1, las cuales provocan respuestas de células T.

Las vacunas de ADN provocan respuestas inmunitarias celulares y humorales robustas en animales y son muy adecuadas para la especificidad y precisión en el diseño de vacunas. Se han desarrollado vacunas de ADN contra CMV y se han centrado en las proteínas gB, IE1 y pp65 como inmunógenos diana candidatos. Un candidato a vacuna de ADN contra CMV bivalente (Wloch MK 2008 J Infectious Diseases 297:1634-1642), usando ADN plasmídico que codifica para pp65 y gB y un candidato a vacuna trivalente (Jacobson MA 2009 Vaccine 27:1540-1548) que también incluye un tercer plásmido que codifica para el producto del gen IE1 han sido desarrollados por Vical Vaccines (patente estadounidense 7.410.795). La vacuna de ADN trivalente sola tenía una inmunogenicidad mínima independientemente de la vía de administración. Sin embargo, la vacuna de ADN contra CMV pareció cebarse de manera segura para una respuesta de memoria a los antígenos del CMV observada después de la administración de un CMV vivo atenuado (Towne).

En un enfoque de vacuna vectorizada, el producto génico de interés se expresa en el contexto de un portador no replicante (habitualmente viral). Un ejemplo de esto es un vector de la viruela del canario llamado ALVAC desarrollado por Virogenetics y Sanofi-Pasteur Vaccines, que es un poxvirus atenuado que se replica de manera abortiva en células de mamíferos. ALVAC que expresa gB de CMV y ALVAC que expresa pp65 (documento US 6.267.965) se han probado en ensayos clínicos. ALVAC-CMV(gB) no indujo anticuerpos neutralizantes pero se preparó para títulos de anticuerpos neutralizantes más altos después de la infección posterior con el CMV de cepa Towne (Adler SP et al. 1999 J Infectious Diseases 180:843-846), aunque no pareció potenciar los títulos de anticuerpos neutralizantes después de la inmunización posterior con la vacuna de subunidad gB/MF59 (Bernstein DI et al. 2002 J Infectious Diseases 185: 686-690). Un vector de la viruela del canario que expresa pp65, ALVAC-CMV(pp64), indujo respuestas de LTC de larga duración en todos los voluntarios originalmente seronegativos, en frecuencias comparables a las de los individuos naturalmente seropositivos (Berencsi K et al. 2001 J Infectious Diseases 183:1171-1179). Otro enfoque usado para expresar gB como vacuna vectorizada es el uso de un sistema de replicón de alfavirus por AlphaVax Inc (documento US 7.4190674). Este enfoque implica un sistema de vector de replicón de ARN de ciclo único con propagación defectuosa derivado de una cepa atenuada de un alfavirus, el virus de la encefalitis equina venezolana (VEE), para producir partículas de replicón similares a virus (VRP) que expresan la proteína pp65, IE1 o gB (Berstein et al., 2010 Vaccine 28:484-493). Se usó una vacuna de replicón de alfavirus de dos componentes para expresar las tres proteínas de CMV como una forma soluble de gB de CMV (cepa Towne) y una proteína de fusión pp65/IE1 (Reap EA et al. 2007 Vaccine 25: 7441-7449) resultó segura e indujo altos niveles de anticuerpos neutralizantes y respuestas polifuncionales de células T CD4+ y CD8+ específicas de antígeno. El título medio geométrico (GMT) para el grupo de dosis alta fue aproximadamente la mitad del GMT en 12 individuos seropositivos para CMV infectados de manera natural sometidos a prueba en el ensayo.

Un candidato novedoso para la vacunación contra el HCMV actualmente en desarrollo preclínico es la vacuna de “cuerpo denso”. Los cuerpos densos (DB) son partículas con envuelta defectuosas para la replicación formadas durante la replicación de los CMV en cultivo celular. Contienen tanto glicoproteínas de la envuelta como grandes cantidades de proteína pp65. Los DB no son infecciosos ni inmunogénicos, pero no pueden establecer una infección latente por HCMV en el receptor de la vacuna. Se ha demostrado que los DB pueden inducir anticuerpos neutralizantes de virus y respuestas de células T en ratones en ausencia de expresión génica viral (Pepperl S et al., 2000 J Virol 74: 6132-6146 - documentos WO 00/53729 y US 6.713.070).

IV. Composiciones farmacéuticas

La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden VLP proporcionadas y/o variantes de glicoproteínas proporcionadas. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una VLP y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones farmacéuticas pueden comprender opcionalmente y/o administrarse en combinación con uno o más principios terapéuticamente activos adicionales. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas proporcionadas son útiles en medicina. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas proporcionadas son útiles como agentes profilácticos (es decir, vacunas) en el tratamiento o prevención de hCmV o de ramificaciones negativas asociadas o correlacionadas con la infección por HCMV. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas proporcionadas son útiles en aplicaciones terapéuticas, por ejemplo, en individuos que padecen o son susceptibles a la infección por HCMV. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se formulan para su administración a seres humanos.

Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en este caso pueden proporcionarse en una forma inyectable estéril (por ejemplo, una forma que sea adecuada para inyección subcutánea o infusión intravenosa). Por ejemplo, en algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se proporcionan en una forma de dosificación líquida que es adecuada para inyección. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se proporcionan como polvos (por ejemplo, liofilizados y/o esterilizados), opcionalmente a vacío, que se reconstituyen con un diluyente acuoso (por ejemplo, agua, tampón, solución salina, etc.) antes de la inyección. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se diluyen y/o reconstituyen en agua, disolución de cloruro de sodio, disolución de acetato de sodio, disolución de alcohol bencílico, solución salina tamponada con fosfato, etc. En algunas realizaciones, el polvo debe mezclarse suavemente con el diluyente acuoso (por ejemplo, sin agitar).

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas proporcionadas comprenden uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, conservante, diluyente inerte, agente dispersante, agente tensioactivo y/o emulsionante, agente de tamponamiento, etc.). Los excipientes adecuados incluyen, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, sacarosa, trehalosa, glicerol, etanol o similares, y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la vacuna puede contener sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes de tamponamiento del pH o adyuvantes que mejoran la eficacia de las vacunas. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden uno o más conservantes. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas no comprenden conservantes.

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se proporcionan en una forma que puede refrigerarse y/o congelarse. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se proporcionan en una forma que no puede refrigerarse y/o congelarse. En algunas realizaciones, las disoluciones reconstituidas y/o las formas de dosificación líquidas pueden almacenarse durante un determinado periodo de tiempo después de la reconstitución (por ejemplo, 2 horas, 12 horas, 24 horas, 2 días, 5 días, 7 días, 10 días, 2 semanas, un mes, dos meses o más). En algunas realizaciones, el almacenamiento de formulaciones de VLP durante más tiempo que el tiempo especificado da como resultado la degradación de VLP.

Las formas de dosificación líquidas y/o las disoluciones reconstituidas pueden comprender material particulado y/o alteración del color antes de la administración. En algunas realizaciones, no debe usarse una disolución si su color está alterado o está turbia y/o si queda materia particulada después de la filtración.

Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden prepararse mediante cualquier método conocido o desarrollado más adelante en el presente documento en la técnica de la farmacología. En algunas realizaciones, tales métodos preparatorios incluyen la etapa de asociar el principio activo con uno o más excipientes y/o uno o más de otros componentes accesorios, y luego, si es necesario y/o deseable, dar forma y/o envasar el producto en un unidad deseada de dosis única o múltiple.

Una composición farmacéutica según la invención puede prepararse, envasarse y/o venderse a granel, como una dosis unitaria única y/o como una pluralidad de dosis unitarias únicas. Tal como se usa en el presente documento, una “dosis unitaria” es una cantidad discreta de la composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada del principio activo. La cantidad de principio activo es generalmente igual a una dosis que se administraría a un sujeto y/o una fracción conveniente de una dosis de este tipo tal como, por ejemplo, la mitad o un tercio de una dosis de este tipo.

Las cantidades relativas de principio activo, excipiente farmacéuticamente aceptable y/o cualquier componente adicional en una composición farmacéutica según la invención pueden variar, dependiendo de la identidad, tamaño y/o estado del sujeto tratado y/o dependiendo de la vía mediante la que va a administrarse la composición. A modo de ejemplo, la composición puede comprender entre el 0,1% y el 100% (p/p) de principio activo.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable que, tal como se usa en el presente documento, puede ser o comprender disolventes, medios de dispersión, diluyentes u otros vehículos líquidos, adyuvantes de dispersión o suspensión, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, aglutinantes sólidos, lubricantes y similares, según convenga a la forma de dosificación particular deseada. Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21a edición, A. R. Gennaro, (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006) describe diversos excipientes usados en la formulación de composiciones farmacéuticas y técnicas conocidas para la preparación de las mismas. Excepto en la medida en que cualquier medio de excipiente convencional sea incompatible con una sustancia o sus derivados, tales como producir algún efecto biológico indeseable o interactuando de otra manera de una manera perjudicial con cualquier otro componente(s) de la composición farmacéutica, se contempla que su uso esté dentro del alcance de esta invención.

En algunas realizaciones, una composición farmacéutica es suficientemente inmunogénica como vacuna (por ejemplo, en ausencia de un adyuvante). En algunas realizaciones, la inmunogenicidad de una composición farmacéutica se mejora al incluir un adyuvante. Puede usarse cualquier adyuvante según la presente invención. Se conoce un gran número de adyuvantes; Los Institutos Nacionales de Salud preparan un compendio útil de muchos de tales compuestos, que puede encontrarse (www.niaid.nih.gov/daids/vaccine/pdf/compendium.pdf). Véase también Allison (1998, Dev. Biol. Stand., 92:3-11), Unkeless et al. (1998, Annu. Rev. Immunol., 6:251-281), y Phillips et al. (1992, Vaccine, 10:151-158). Se conocen en la técnica cientos de adyuvantes diferentes y pueden emplearse en la práctica de la presente invención. Los adyuvantes a modo de ejemplo que pueden usarse según la invención incluyen, pero no se limitan a, citocinas, adyuvantes de tipo gel (por ejemplo, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, fosfato de calcio, etc.); adyuvantes microbianos (por ejemplo, secuencias de ADN inmunomoduladoras que incluyen motivos CpG; endotoxinas tales como monofosforil lípido A; exotoxinas tales como toxina del cólera, toxina termolábil de E. co liy toxina de la tosferina; dipéptido de muramilo, etc.); adyuvantes basados en emulsión de aceite y emulsionantes (por ejemplo, adyuvante de Freund, MF59 [Novartis], SAF, etc.); adyuvantes particulados (por ejemplo, liposomas, microesferas biodegradables, saponinas, etc.); adyuvantes sintéticos (por ejemplo, copolímeros de bloque no iónicos, análogos de péptidos de muramilo, polifosfaceno, polinucleótidos sintéticos, etc.); y/o combinaciones de los mismos. Otros adyuvantes a modo de ejemplo incluyen algunos polímeros (por ejemplo, polifosfacenos; descritos en la patente estadounidense 5.500.161), Q57, QS21, escualeno, tetraclorodecaóxido, etc. Se han descrito previamente excipientes farmacéuticamente aceptables con más detalle en la sección anterior titulada “Composiciones farmacéuticas”.

V. Administración

Las composiciones y los métodos proporcionados de la presente divulgación son útiles para la profilaxis y/o el tratamiento de la infección por HCMV en un sujeto, incluyendo adultos y niños humanos. Sin embargo, en general pueden usarse con cualquier animal. En determinadas realizaciones, los métodos en el presente documento pueden usarse para aplicaciones veterinarias, por ejemplo, aplicaciones caninas y felinas. Si se desea, los métodos en el presente documento también pueden usarse con animales de granja, tales como especies ovina, aviar, bovina, porcina y equina.

Tal como se usa en el presente documento, los términos “sujeto”, “individuo” o “paciente” se refieren a un sujeto mamífero humano o no humano. El individuo (también denominado “paciente” o “sujeto”) que va a tratarse es un individuo (feto, lactante, niño, adolescente o adulto) que padece una enfermedad, por ejemplo, infección por HCMV. En algunas realizaciones, el sujeto tiene riesgo de infección por HCMV. En algunas realizaciones, el sujeto es un sujeto inmunodeprimido. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el sujeto inmunodeprimido se selecciona del grupo que consiste en un sujeto infectado por VIH, un paciente con sida, un receptor de trasplante, un sujeto pediátrico y un sujeto gestante. En algunas realizaciones, el sujeto se ha expuesto a una infección por HCMV. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano.

Las composiciones descritas en el presente documento se administrarán generalmente en las cantidades y durante el tiempo que sea necesario o suficiente para inducir una respuesta inmunitaria. Las pautas posológicas pueden consistir en una única dosis o una pluralidad de dosis a lo largo de un periodo de tiempo. La cantidad exacta de una composición inmunogénica (por ejemplo, VLP) que va a administrarse puede variar de un sujeto a otro y puede depender de varios factores. Por tanto, se apreciará que, en general, la dosis precisa usada será la que determine el médico prescriptor y dependerá no solo del peso del sujeto y de la vía de administración, sino también de la edad del sujeto y la gravedad de los síntomas y/o el riesgo de infección. En determinadas realizaciones, se administra una cantidad particular de una composición de VLP como dosis única. En determinadas realizaciones, se administra una cantidad particular de una composición de VLP como más de una dosis (por ejemplo, 1-3 dosis que están separadas por 1-12 meses). En determinadas realizaciones, se administra una cantidad particular de una composición de VLP como una dosis única en varias ocasiones (por ejemplo, 1-3 dosis que están separadas por 1-12 meses).

En algunas realizaciones, se administra una composición proporcionada en una dosis inicial y en al menos una dosis de refuerzo. En algunas realizaciones, se administra una composición proporcionada en una dosis inicial y dos dosis de refuerzo. En algunas realizaciones, se administra una composición proporcionada en una dosis inicial y tres dosis de refuerzo. En algunas realizaciones, se administra una composición proporcionada en una dosis inicial y cuatro dosis de refuerzo. En algunas realizaciones, se administra una composición proporcionada en una dosis inicial y en al menos una dosis de refuerzo aproximadamente un mes, aproximadamente dos meses, aproximadamente tres meses, aproximadamente cuatro meses, aproximadamente cinco meses, o aproximadamente seis meses tras la dosis inicial. En algunas realizaciones, se administra una composición proporcionada en una segunda dosis de refuerzo aproximadamente seis meses, aproximadamente siete meses, aproximadamente ocho meses, aproximadamente nueve meses, aproximadamente diez meses, aproximadamente once meses, o aproximadamente un año tras la dosis inicial. En algunas realizaciones, se administra una composición proporcionada en una dosis de refuerzo cada 1 año, 2 años, 3 años, 4 años, 5 años, 6 años, 7 años, 8 años, 9 años o 10 años.

En determinadas realizaciones, las composiciones proporcionadas pueden formularse para su administración por vía parenteral, por ejemplo, mediante inyección. En tales realizaciones, la administración puede ser, por ejemplo, intravenosa, intramuscular, intradérmica o subcutánea, o mediante técnicas de infusión o inyección sin aguja. En determinadas realizaciones, las composiciones pueden formularse para administración peroral, administración oral, administración intranasal, administración bucal, administración sublingual, administración transdérmica, administración transcutánea, administración intraperitoneal, administración intravaginal, administración rectal o administración intracraneal.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos describen algunos modos ejemplares de preparar y poner en práctica determinadas composiciones que se describen en el presente documento. La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas. Los ejemplos que dan a conocer un contenido que no es parte de la invención se consideran sólo con fines ilustrativos.

Ejemplo 1: Construcción de plásmidos de expresión de ADN

Este ejemplo describe el desarrollo de constructos y plásmidos de expresión para la expresión de secuencias de genes de HCMV recombinantes (por ejemplo, secuencias de genes de fusión gB, gB-G, gH-G y Gag/pp65). Generalmente, un plásmido de expresión convencional consiste en una secuencia promotora de origen mamífero, una secuencia de intrón, una secuencia señal de poliadenilación (PoliA), una secuencia de origen de replicación pUC (pUC - pBR322 es un origen/sitio de inicio de replicación de colE1 y se usa para replicar un plásmido en bacterias tales como E. Coli (DH5a)) y un gen de resistencia a antibióticos como marcador seleccionable para la selección de placas de plásmido. Dentro del plásmido que sigue al intrón hay una variedad de sitios de enzimas de restricción que pueden usarse para el corte y empalme en un gen o secuencia de gen parcial de interés.

El plásmido de expresión Propol II contiene el pHCMV (promotor temprano para HCMV), un intrón beta-globina (intrón BGL), una secuencia señal de poliadenilación (PoliA) de globina de conejo, un origen de secuencia de replicación pUC (pUC - pBR322 es un origen/sitio de inicio de la replicación de colE1 y se usa para replicar un plásmido en bacterias como E. coli (DH5 a)), y un gen de resistencia a la ampicilina p-lactamasa (Amp R - marcador seleccionable para plásmido confiere resistencia a ampicilina) (100 |ig/ml) (figura 1A).

La figura 1B representa plásmidos de expresión recombinantes a modo de ejemplo. Por ejemplo, para desarrollar un constructo de expresión de MMLV pHCMV-Gag (“MLV-Gag”), se clonó una secuencia de ADN complementario (ADNc) que codifica para una poliproteína Gag de MMLV (Gag sin su secuencia Pol C-terminal) en un vector de expresión Propol II (pHCMV). Para desarrollar un constructo de expresión de gB (“gB”), se optimizó el codón de la secuencia de longitud completa de gB para la expresión humana (GenScript) y se clonó en un vector de expresión Propol II que incluye la porción extracelular, el dominio transmembrana (TM) y la porción citoplásmica (Cito) de gB. Para desarrollar un constructo de expresión de gH-G (“gH-G”), como ejemplo ilustrativo, la secuencia truncada de gH que codifica sólo para la porción extracelular se fusionó con las porciones de TM y Cito de VSV-G y se optimizaron los codones para la expresión humana. (GenScript) y clonado en un vector de expresión Propol II. De manera similar, para desarrollar un constructo de expresión de gB-G (“gB-G”), la secuencia truncada de gB que codifica sólo para la porción extracelular se fusionó con las porciones de TM y Cito de VSV-G y se optimizaron los codones para la expresión humana (GenScript) y se clonó en un vector de expresión Propol II. Para desarrollar un constructo de expresión de Gag/pp65 (“Gag/pp65”), se fusionó una secuencia que codifica para la poliproteína Gag de MMLV (Gag sin su secuencia Pol C-terminal) con la secuencia de longitud completa de pp65 y se optimizaron los codones para la expresión humana (GenScript) y se clonó en un vector de expresión Propol II.

Se amplificaron los plásmidos de ADN en E. coli (DH5 a) competente y se purificaron con kits de preparación sin de endotoxinas según los protocolos convencionales.

Ejemplo 2: Producción de partículas similares a virus (VLP)

Este ejemplo describe métodos para producción de partículas similares a virus (VLP) que contienen diversos antígenos de HCMV recombinantes descritos en el ejemplo 1.

Se transfectaron transitoriamente células HEK 293T (ATCC, CRL-11268) usando métodos de fosfato de calcio con un plásmido de expresión de ADN de MMLV-Gag y se cotransfectaron con un gB o un gB-G (datos no mostrados) o un plásmido de expresión de ADN de gH-G (como ejemplo ilustrativo). Alternativamente, se transfectaron las células con un plásmido de expresión de ADN de Gag/pp65 y se cotransfectaron con un gB o un gB-G (datos no mostrados) o un plásmido de expresión de ADN de gH-G. Se apreciará que las células pueden transfectarse con un plásmido de expresión de ADN de MMLV-Gag y cotransfectarse tanto con gB como con gH-G o gB-G y un plásmido de expresión de ADN de gH-G. La expresión de diversos antígenos de HCMV por las células HEK 293 se confirmó mediante citometría de flujo (figura 2A). Después de 48 a 72 horas de transfección, se recogieron los sobrenadantes que contenían las VLP y se filtraron a través de membranas con un tamaño de poro de 0,45 |im y se concentraron y purificaron adicionalmente mediante ultracentrifugación a través de un colchón de sacarosa al 20% en un rotor SW32 Beckman (25.000 rpm, 2 horas, 4°C). Se resuspendieron los sedimentos en PBS estéril sin endotoxinas (GIBCO) para obtener reservas de VLP concentradas 500 veces. Se determinó la proteína total en una alícuota mediante un kit de cuantificación de ensayo de Bradford (BioRad). Se almacenaron las VLP purificadas a -80°C hasta su uso. Cada lote de VLP purificadas se analizó para determinar la expresión de la proteína de fusión MMLV-Gag, gB, gH-G y/o MMLV-Gag/pp65 mediante SDS-Page e inmunotransferencia de tipo Western con anticuerpos específicos contra gB (anticuerpo monoclonal de ratón CH 28 contra gB, Virusys Corporation; Pereira, L et al. 1984 Virology 139:73-86), gH-G (anticuerpo monoclonal de ratón contra el anticuerpo anti-etiqueta de VSV-G P5D4; Abcam plc) y pp65 (anticuerpo monoclonal de ratón CH12 contra UL83/pp65; Virusys Corporation; Pereira, L. et al.

1982 Infect Immun 36:924-932) (figura 2B). Los anticuerpos se detectaron usando quimioluminiscencia mejorada (ECL).

Ejemplo 3: Caracterización fisicoquímica de partículas similares a virus (VLP)

El análisis fisicoquímico de las VLP incluyó la determinación del tamaño de partícula y la evaluación del índice de polidispersidad usando un instrumento Malvern serie Zeta-Sizer Nano (ZEN3600). En las figuras 3A y 3B se muestran resultados a modo de ejemplo obtenidos a partir del análisis de nanodimensionamiento. Se produjo una composición de VLP a modo de ejemplo (composición de VLP bivalente de gH-G/pp65) en dos laboratorios diferentes usando los mismos vectores de expresión recombinantes y ambas preparaciones de VLP dieron un tamaño de partícula promedio de 150-180 nm de diámetro. Esto concuerda con el tamaño de un virión de CMV que, según se notifica, tiene un tamaño de 150-200 nm (1997 J Pathol 182: 273-281). El índice de polidispersidad (PdI) bajo de 0,214-0,240 indica homogeneidad del producto o una distribución de tamaño estrecha.

Ejemplo 4: Inmunogenicidad y actividad de neutralización de las VLP en ratones

Se sometieron a prueba las composiciones de VLP preparadas tal como se describe en el ejemplo 2 en ratones hembra BALB/C de 6-8 semanas de edad (mínimo 6 animales por grupo de prueba). Se inmunizaron los ratones por vía intraperitoneal con 200 |il de composiciones de VLP dos veces, una vez el día 0 (primovacunación) y una vez el día 56 (refuerzo a las 8 semanas). Se trataron los ratones con 10 |ig, 25 |ig o 50 |ig (proteína total) de una composición de VLP bivalente de gB/Gag/pp65, bivalente de gH-G/Gag/pp65 o trivalente de gB/gH-G/Gag/pp65. Para evaluar las respuestas humorales inmunitarias en ratones, se extrajo sangre de todos los ratones de los grupos de estudio antes y después de la inmunización las inmunizaciones 1a y 2' a las 0, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10, 12 y 14 semanas. El diseño del estudio se resume en la tabla 1.

Tabla 1

Se realizó el ensayo de inmunoadsorción ligado a enzima (ELISA) usando placas ELISA disponibles comercialmente (IBL International) recubiertas con lisados derivados de células MRC-5 infectadas con la cepa AD169 de HCMV. El lisado de HCMV comercial en bruto, que contiene todos los antígenos relacionados con el CMV y es útil para detectar respuestas inmunitarias de IgG, se usó como control positivo para determinar el contenido de IgG de HCMV en suero de ratón mediante ELISA. Se incubaron diluciones en serie de sueros de ratón (dilución en TBS-T/BSA/DMEM FCS al 10%) con las placas recubiertas durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de lavar las placas, se añadió anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) anti-IgG de ratón a una dilución de 1/10.000 y se incubó durante 1 hora, seguido por la adición de disolución de sustrato de tetrametilbencidina (TMB). Se detuvo la reacción mediante la adición de HCl 1N y se leyó la absorbancia a 450 nm en un lector de placas de micropocillos de ELISA. La figura 4 muestra evidencia de anticuerpos persistentes y un fuerte refuerzo de los ratones después de la 2a inmunización a las 8 semanas para cada una de las composiciones de VLP bivalentes y trivalentes.

Se determinaron las respuestas de anticuerpos neutralizantes al HCMV usando un ensayo de microneutralización. Se diluyó una cantidad convencional de la cepa VR1814 de HCMV (una cepa de CMV trópica de células endoteliales - Revello MG et al. J Gen Virol 82:1429-1438) con medio de infección (DME que contiene FBS inactivado por calor al 1%, mezcla de aminoácidos al 1%, penicilina-estreptomicina al 1% y PBS sin Ca+2 y Mg+2) y se añadió a un volumen igual de diluciones en serie de suero de prueba inactivado por calor y se incubó durante 1 hora a 37°C en un rotador. Se añadieron las mezclas de suero/HCMV a fibroblastos de prepucio humano (HFF) o células epiteliales pigmentadas de la retina (células ARPE-19) hechas crecer en cubreobjetos en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos y se incubaron durante 2 horas a 37°C, el 5% de CO2. Se lavaron las placas con PBS dos veces y luego se cultivaron durante 48 horas a 37°C, el 5% de CO2. Se fijaron las células con paraformaldehído al 4%, se hicieron reaccionar con un anticuerpo monoclonal anti-IE1 (anticuerpo monoclonal de ratón CH160 contra IE1/2 o anticuerpo monoclonal CH443 contra IE1; Virusys Corporation) durante 1 hora a temperatura ambiente seguido por anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón marcado con FlTC durante 45 minutos a temperatura ambiente. Se determinó el número de células que expresan IE1 mediante microscopía fluorescente. Se sometió a prueba la actividad neutralizante de sueros de ratón combinados (dilución 1:6) en cada punto de tiempo de sangrado (0, 3, 6, 8 y 9 semanas) por duplicado. La figura 5 muestra la inducción de anticuerpos neutralizantes en ratones (sometidos a ensayo en células de fibroblastos) después de la 2' inmunización a las 8 semanas para cada una de las composiciones de VLP bivalentes y trivalentes. La figura 6 muestra la inducción de anticuerpos neutralizantes en ratones (sometidos a ensayo en células epiteliales) después de la 2' inmunización a las 8 semanas para cada una de las composiciones de VLP bivalentes.

En otro estudio, se sometieron a prueba las composiciones de VLP monovalentes de gB-G preparadas tal como se describe en el ejemplo 2 en ratones BALB/C hembras de 6-8 semanas de edad (mínimo 8 animales por grupo de prueba). Se inmunizaron los ratones por vía intraperitoneal con 200 |il de composiciones de VLP dos veces, una vez el día 0 (primovacunación) y una vez el día 56 (refuerzo a las 8 semanas). Se trataron los ratones con cantidades equivalentes de 20 |ig de contenido de gB (determinado mediante ELISA) por inyección. Para evaluar las respuestas humorales inmunitarias en ratones, se extrajo sangre de todos los ratones de los grupos de estudio anteriores a la 1' inmunización y luego tras la 1' inmunización a las 3 y 6 semanas y antes de las 2' inmunización a las 8 semanas y luego después de la 2a inmunización a las 9 semanas desde el inicio del estudio. El diseño del estudio se resume en la tabla 2.

Tabla 2

Se determinaron las respuestas de anticuerpos neutralizantes al HCMV usando un ensayo de microneutralización en células de fibroblastos basado en una proteína verde fluorescente (GFP) que expresa el virus HCMV (TB40) y análisis de citometría de flujo de células HFF infectadas (GFP+). Para evaluar la presencia de anticuerpos neutralizantes en muestras de suero, se preincubó el suero con HCMV que expresa GFP durante un periodo de tiempo suficiente para que los anticuerpos neutralizantes redujeran r la infectividad de1HCMV. Se usaron diluciones en serie de la mezcla preincubada de suero y HCMV para poner en contacto una célula huésped (fibroblasto o epitelial) susceptible de infección por HCMV. Se determinó el número de células que expresan el constructo del gen indicador (GFP) mediante citometría de flujo para calcular el título infeccioso de la preparación de virus. La figura 7 representa los títulos de anticuerpos neutralizantes para ratones inmunizados dos veces a las 0 y 8 semanas con VLP monovalentes de gB-G frente a gB recombinante. Se combinaron los sueros recogidos antes y después de las inmunizaciones tal como se describe y se sometieron a prueba en relación con una hiperglobulina de CMV de control positivo, Cytogam™, en presencia de un complemento de cobaya al 10%. Tal como se muestra en la figura 7, la composición de VLP monovalente de gB-G provocó una neutralización más rápida y potente de la infección de células de fibroblastos que la provocada por una proteína gB recombinante.

Tal como puede verse (o como apreciarán los expertos en la técnica que hayan leído la presente memoria descriptiva), los datos demuestran, entre otras cosas, una actividad sorprendentemente buena de las VLP, tales como las VLP que incluyen gB-G en comparación con las gB recombinantes.

En otro estudio, se sometieron a prueba composiciones de VLP bivalentes de gB/Gag/pp65 preparadas tal como se describe en el ejemplo 2 en ratones BALB/C hembras de 6-8 semanas de edad (mínimo 4 animales por grupo de prueba). Se inmunizaron los ratones por vía intraperitoneal con 200 |il de composiciones de VLP dos veces, una vez el día 0 (primovacunación) y una vez el día 56 (refuerzo a las 8 semana). Se trataron los ratones con VLP bivalentes de gB/Gag/pp65 y se recogieron los esplenocitos 14 días después. Se estimularon células T CD8+ enriquecidas (razón 1:5) con esplenocitos transfectados durante 24 horas con plásmido que codifica para Gag/pp65 o Gag para determinar las frecuencias de LTC dirigidos contra pp65 o Gag. Se determinaron las frecuencias de LTC basándose en la disminución de CFSE, control en célula T CD3+ CD8+ (figura 8A). El gráfico de dispersión muestra la frecuencia de la proliferación de LTC específicos de pp65 después de restar las respuestas dirigidas contra Gag (figura 8B). Tal como se muestra en la figura 8, las VLP bivalentes de gB/Gag/pp65 provocaron LTC específicos de pp65 en ratones inmunizados.

Ejemplo 5: Inmunogenicidad y actividad de neutralización de las VLP en conejos

Se sometieron a prueba las composiciones de VLP bivalentes de gB/Gag/pp65 y gH-G/Gag/pp65 preparadas tal como se describe en el ejemplo 2 en conejos blancos de Nueva Zelanda de 6-8 semanas de edad (mínimo 6 animales por grupo de ensayo). Se inmunizaron los conejos por vía intramuscular con 0,5 ml de composiciones de VLP tres veces, una vez el día 0 (primovacunación) y una vez el día 56 (refuerzo a las 8 semanas) y una vez el día 168 (refuerzo a las 24 semanas). Se trataron los conejos con 25 pg o 50 pg o 100 pg (proteína total) de una composición de VLP bivalente de gB/Gag/pp65, bivalente de gH-G/Gag/pp65 o trivalente de gB/gH-G/Gag/pp65 (bivalente de gB/Gag/pp65 y gH-G/Gag/pp65 mezcladas en una proporción 1:1). Para evaluar la respuesta humoral inmunitaria en conejos, se extrajo sangre de todos los conejos de los grupos de estudio antes de la 1a inmunización y luego después de la 1a inmunización a las 2, 4, 6 y 8 semanas y después de la 2a inmunización a las 10, 13, 16, 20 y 24 semanas desde el inicio del estudio y luego después de la 3a inmunización a las 26 y 28 semanas desde el inicio del estudio. El diseño del estudio se resume en la tabla 3.

Tabla 3

Se sometió a prueba la reactividad de los sueros de conejos individuales contra el antígeno gB recombinante mediante ELISA (representado en el eje izquierdo de la figura 9A). Se determinaron las respuestas de anticuerpos neutralizantes al HCMV usando un ensayo de microneutralización en células de fibroblastos basado en un virus CMV que expresa GFP (TB40) y análisis de citometría de flujo de células HFF infectadas (GFP+) tal como se describe en el ejemplo 4 (representado en el eje derecho de la figura 9B). Se combinaron los sueros de conejo recogidos antes y después de las inmunizaciones tal como se describe y sometieron a prueba para determinar la actividad neutralizante en presencia de complemento contra HCMV que expresa GFP en fibroblastos HFF en relación con una hiperglobulina de CMV de control positivo, Cytogam™. Se representan gráficamente los títulos de punto final y representan una reducción del 50% en las células infectadas por CMV con respecto a los sueros de preinmunización emparejados (representados en el eje izquierdo de la figura 9A). Se recogieron 50.000 células durante el análisis de citometría de flujo de células infectadas (GFP+) (representadas en el eje derecho de la figura 9B). Tal como se muestra en la figura 9, la composición de VLP bivalente de gB/Gag/pp65 provocó un alto título de unión (A) y respuestas de alto título de anticuerpos neutralizantes (B) en conejos contra la infección de células de fibroblastos.

También se sometieron a prueba los sueros de conejo combinados para determinar la respuesta de los anticuerpos neutralizantes al HCMV usando un ensayo de microneutralización en células epiteliales basado en un virus HCMV que expresa GFP (Towne TS15-rR) y análisis de citometría de flujo de células ARPE-19 infectadas (GFP+). Se combinaron los sueros de conejo recogidos antes y después de las inmunizaciones tal como se describe y se sometieron a prueba para determinar la actividad neutralizante en presencia de complemento contra HCMV que expresa GFP en células epiteliales ARPE-19 en relación con una hiperglobulina de CMV de control positivo, Cytogam™. Tal como se muestra en la figura 10, sorprendentemente, la combinación de composición de VLP bivalente de gB/Gag/pp65 y bivalente de gH-G/Gag/pp65 provocó una respuesta de anticuerpos neutralizantes sinérgica y más rápida en conejos contra la infección de células epiteliales, en relación con gB/Gag/pp65 o gH/Gag/pp65.

Tal como puede observarse (o como apreciarán los expertos en la técnica que hayan leído la presente memoria descriptiva), los datos demuestran, entre otras cosas, una actividad sorprendentemente buena de las VLP, tales como mediante una combinación de VLP que incluyen gB/Gag/pp65 y VLP que incluyen gH-G/Gag/pp65, incluso en comparación con VLP que incluyen gB/Gag/pp65 o VLP que incluyen gH-G/Gag/pp65.

Ejemplo 6: Producción con aumento de escala y purificación de partículas similares a virus (VLP)

Se produjeron y purificaron las VLP de la siguiente manera. Se transfectaron células CHO a una densidad celular entre 1,5E06 y 2,0E06 células/ml con plásmidos de elección (preparados tal como se describe en el ejemplo 1) a concentraciones y razones predeterminadas. Se añadió ADN de relleno para lograr una concentración total de ADN de hasta 1 |ig/ml de cultivo celular. En primer lugar, se purificaron los plásmidos usados para la transfección mediante kits de purificación de plásmidos MaxiPrep o GigaPrep (Qiagen). Se proporcionó el PEIMAX usado para la transfección para suministrar a Dn a las células en una proporción de 6:1 (PEI:ADN peso/peso). Se cultivaron las células durante 72 horas y luego se centrifugaron los cultivos a 4000 rpm durante 20 minutos, usando el rotor JS-4.2A de Beckman Coulter, en botellas de 1 litro. Se filtró el sobrenadante a través de un filtro de 0,8/0,45 |im (AcroPak 500 Capsule, Pall). Luego se concentró el sobrenadante filtrado mediante filtración de flujo tangencial (TFF) y se sometió a diafiltración contra tampón que contenía histidina. Se cargó el material diafiltrado en una columna de cromatografía de intercambio aniónico (AEX) donde se recogió la fracción no retenida. Luego se filtró de forma estéril la fracción no retenida a través de 0,45 |im para dividirse en alícuotas en diferentes volúmenes.

El procedimiento de TFF implicó la desinfección durante la noche de dos membranas de TFF (corte Pellicon 2 Mini 500 kDa, 0,1 m2 de superficie) en NaOH 0,5 M fijándolos en paralelo en una carcasa de acero inoxidable. Después de hacer pasar agua a pH neutro en el retenido así como en el lado del permeado, se usó el tampón de fosfato (PBS) para equilibrar la membrana. Luego se cargó el sobrenadante filtrado en el circuito de recirculación del retenido de TFF. La presión de entrada inicial fue de 10,5 psi a una velocidad de flujo de permeado de 400 ml/min que se redujo a aproximadamente 200 ml/min al final de la concentración. Después de la concentración hasta aproximadamente 10 a 20 veces, se realizó la diafiltración con 5 volúmenes de histidina 20 mM NaCl 150 mM, pH 5,5. Se recogió el material diafiltrado y se aclaró con un volumen igual de tampón his después de recircular durante otros 5 minutos con el flujo de permeado cerrado. Luego se recogió el retenido y se combinó con el retenido previamente recogido. Para mantener la funcionalidad de las membranas, se aclararon las membranas con PBS durante 10 minutos; con NaOH 0,5 M durante 40 minutos (después de lavar 200 ml para que se desperdicien a través del permeado y el retenido); y finalmente con agua a pH neutro en retenido y permeado. Luego se almacenaron las membranas en una disolución de NaOH 0,1 M en un frigorífico.

Se usó cromatografía en columna AEX para reducir el contenido de ADN, usando una columna HiLoad 16/10 Sepharose HP de 20 ml a una velocidad de flujo de 1,6 ml/min para el equilibrio con tampón de equilibrio (histidina 20 mM NaCl 150 mM, pH 5,5), y una velocidad de flujo de 3,2 ml/min para las etapas de carga, lavado y separación. Se realizaron los procedimientos de limpieza a 0,8 ml/min. Se usó un registrador de gráficos para controlar la absorbancia de UV a 280 nm. Se usó un sistema de cromatografía Gradifrac (GE Healthcare), que se desinfectó antes de su uso. En primer lugar, se eliminó el etanol (20% v/v presente en la columna como tampón de almacenamiento) de la columna usando 5 volúmenes de columna de agua Super Q (bajo contenido de endotoxinas). Se hizo pasar el tampón de equilibrio por 5 volúmenes de columna, seguido por 5 volúmenes de columna de tampón de separación (histidina 20 mM NaCl 1000 mM, pH 5,5) para acondicionar la columna. Se hizo pasar de nuevo el tampón de equilibrio por 5 volúmenes de columna para preparar la columna para la carga. Se realizó la carga a 3,2 ml/min, después de lo cual se lavó la columna con 5 volúmenes de columna de tampón de equilibrio, o hasta que se observó la línea base. Se recogió la fracción no retenida desde el inicio del pico de UV hasta la caída del pico de UV hasta aproximadamente el 10% de la altura máxima del pico de la absorbancia de UV durante la carga del material. Luego, se sometió a separación la columna mediante 5 volúmenes de columna de tampón de separación (histidina 20 mM NaCl 1000 mM, pH 5,5) y se recogió el pico. A esto le siguieron 5 volúmenes de columna de otro tampón de separación (histidina 20 mM NaCl 2000 mM, pH 5,5) para eliminar cualquier proteína y ácido nucleico fuertemente unidos y se recogió el pico. Después, se limpió la columna con NaOH 1 M para eliminar cualquier proteína precipitada a 0,8 ml/min para 4 volúmenes de columna. Luego se aclaró la columna con agua a 0,8 ml/min hasta pH neutro (normalmente 4-5 volúmenes de columna). Luego se hizo pasar etanol al 20% por la columna (4 volúmenes de columna a 0,8 ml/min) para eliminar cualquier lipoproteína o lípido (2 volúmenes de columna). En esta fase, se almacenó la columna o se aclaró con agua (4 volúmenes de columna) para reiniciar el ciclo para un segundo lote.

La figura 11 representa imágenes de una VLP monovalente de gB-G purificada producida a partir de células CHO y luego sometida a métodos de purificación de TFF (figura 11A) y AEX (figura 11B) seguido por métodos analíticos de microscopía electrónica de tinción negativa. Tal como se muestra en la figura 11, las VLP monovalentes de gB-G intactas están presentes después de la purificación de TFF (figura 11A) y AEX (figura 11B).

Ejemplo 7: Inmunogenicidad y actividad de neutralización de VLP purificadas en conejos

Se sometieron a prueba las composiciones de VLP monovalentes de gB-G preparadas tal como se describe en el ejemplo 6 en conejos blancos de Nueva Zelanda de 6-8 semanas de edad (mínimo 6 animales por grupo de prueba). Se inmunizaron los conejos por vía intramuscular con 0,5 ml (50 |ig de contenido de gB) de composiciones de VLP tres veces, una vez el día 0 (primovacunación) y una vez el día 56 (refuerzo a las 8 semanas) y una vez el día 168 (refuerzo a las 24 semanas). Para evaluar la respuesta humoral inmunitaria en conejos, se extrajo sangre de todos los conejos de los grupos de estudio antes de la 1a inmunización y luego tras la 1' inmunización a las 2, 4, 6 y 8 semanas y tras la 2' inmunización a las 10, 13, 16, 20 y 24 semanas desde el inicio del estudio. El diseño del estudio se resume en la tabla 4.

Tabla 4

La figura 12 representa la potente neutralización de la infección de células de fibroblastos que fue provocada por suero de conejos inmunizados con VLP monovalentes de gB-G producidas con células CHO purificadas con TFF/AEX (“eVLP de gB” en la figura 12). Esta neutralización fue superior a la lograda con una hiperglobulina de CMV de control positivo, Cytogam™. La figura 12 también incluye datos de títulos de neutralización publicados para la vacuna Towne y la vacuna de subunidades de gB con adyuvante (gB MF59™) (Cui X et al. 2008 Vaccine 26: 5760-5766).

La figura 13 ilustra la potente neutralización de la infección de células epiteliales que fue provocada por suero de conejos inmunizados con VLP monovalentes de gB-G producidas con células CHO purificadas con TFF/AEX (“eVLP de gB” en la figura 13). Esta neutralización fue comparable a la lograda con una hiperglobulina de CMV de control positivo, Cytogam™. La figura 13 también incluye datos de títulos de neutralización publicados para la vacuna Towne y la vacuna de subunidades gB con adyuvante (gB MF59™) (Cui X et al. 2008 Vaccine 26: 5760-5766). La figura 14 representa el índice de avidez de los anticuerpos provocados en conejos inmunizados con composiciones de VLP monovalentes de gB-G producidas con células CHO purificadas con TFF/AEX. Los sueros combinados de conejo y una hiperglobulina de CMV de control positivo, Cytogam™, se diluyeron 1:600.000 y se sometieron a prueba contra el antígeno gB recombinante de longitud completa mediante ELISA en presencia o ausencia de urea 5 M. Se determinó la avidez del anticuerpo tal como se describió anteriormente (Marshall BC y Adler S 2003 Viral Immunol 16:491-500). Tal como se muestra en la figura 14, se provocó una rápida inducción de anticuerpos neutralizantes de alta avidez en conejos mediante inmunización con VLP monovalentes de gB-G producidas con células CHO purificadas con TFF/a Ex . La avidez máxima de anticuerpos se logró después de dos inmunizaciones con VLP gB-G.

Otras realizaciones

Se pretende que la memoria descriptiva y los ejemplos se consideren únicamente a modo de ejemplo, con el verdadero alcance de la divulgación indicado por las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de la lista de secuencias

SEQ ID NO: 1 representa una secuencia de aminoácidos de Gag de MMLV.

SEQ ID NO:2 representa una secuencia de nucleótidos de Gag de MMLV.

SEQ ID NO:3 representa una secuencia de nucleótidos de Gag de MMLV con codones optimizados.

SEQ ID NO:4 representa una secuencia de aminoácidos de Gag de MMLV - pp65 de CMV.

SEQ ID NO: 5 representa una Secuencia de nucleótidos de Gag de MMLV - pp65 de CMV.

SEQ ID NO:6 representa una Secuencia de nucleótidos de Gag de MMLV - pp65 de CMV con codones optimizados. SEQ ID NO:7 representa una secuencia de aminoácidos de gB de HCMV.

SEQ ID NO:8 representa una secuencia de nucleótidos de gB de HCMV.

SEQ ID NO:9 representa una secuencia de nucleótidos de gB de HCMV con codones optimizados.

SEQ ID NO: 10 representa una secuencia de aminoácidos de gB-G de HCMV.

SEQ ID NO:11 representa una secuencia de nucleótidos

gB-G de HCMV.

SEQ ID NO:12 representa una secuencia de nucleótidos de gB-G de HCMV con codones optimizados.

SEQ ID NO:13 representa una secuencia de aminoácidos de gH de HCMV.

SEQ ID NO:14 representa una secuencia de nucleótidos de gH de HCMV.

SEQ ID NO:15 representa una secuencia de nucleótidos de gH de HCMV con codones optimizados.

SEQ ID NO: 16 representa una secuencia de aminoácidos de gH - G de HCMV.

SEQ ID NO: 17 representa una secuencia de nucleótidos de gH - G de HCMV.

SEQ ID NO:18 representa una secuencia de nucleótidos de gH - G de HCMV con codones optimizados.

SEQ ID NO:19 representa una secuencia de nucleótidos del plásmido de expresión Propol II.

SEQ ID NO:20 representa una secuencia de nucleótidos de TM/CTD de gH de HCMV - gB de HCMV.

SEQ ID NO:21 representa una secuencia de nucleótidos de Gag de MMLV con codones optimizados.

SEQ ID NO:22 representa una secuencia de nucleótidos de Gag de MMLV - pp65 de CMV con codones optimizados.

Claims

REIVINDICACIONES

i . Partícula similar a virus (VLP) bivalente que comprende:

una proteína de fusión que comprende una porción N-terminal de una proteína gag encontrada en virus de la leucemia murina (MLV) fusionada en el sentido de 5' de una proteína pp65 de longitud completa encontrada en citomegalovirus humano (HCMV);

en la que la porción N-terminal de la proteína gag no comprende una secuencia de polimerasa C-terminal encontrada en MLV, y en la que la porción N-terminal de la proteína gag comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; y

un polipéptido que comprende una proteína gB de longitud completa encontrada en HCMV
2. VLP bivalente según la reivindicación 1, en la que el polipéptido que comprende una proteína gB tiene una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO:7.
3. VLP bivalente según la reivindicación 1, en la que la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4, y el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7.
4. Método para la producción de una VLP bivalente, comprendiendo el método:

transfectar conjuntamente una célula huésped con un primer vector que comprende un primer polinucleótido que codifica para una proteína de fusión que comprende una porción N-terminal de una proteína gag encontrada en virus de la leucemia murina (MLV) fusionada en el sentido de 5' de una proteína pp65 de longitud completa encontrada en citomegalovirus humano (HCMV), en la que la porción N-terminal de la proteína gag no comprende una secuencia de polimerasa C-terminal encontrada en MLV, y en la que la porción N-terminal de la proteína gag comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y en la que el primer polinucleótido que codifica para la proteína de fusión está bajo el control de un único promotor, y un segundo vector que comprende un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido gB de longitud completa encontrado en HCMV en el que el segundo vector comprende una secuencia señal en el sentido de 5' del segundo polinucleótido y una señal de poliadenilación en el sentido de 3' del segundo polinucleótido; y

cultivar la célula huésped en un medio adecuado en condiciones que permitan la expresión de las proteínas codificadas por los vectores primero y segundo;

y opcionalmente recuperar las VLP bivalentes del medio y/o las células huésped.
5. Composición farmacéutica que comprende la VLP bivalente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 3, y un portador farmacéuticamente aceptable; y opcionalmente un adyuvante que se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en citocinas, adyuvantes de tipo gel, adyuvantes microbianos, adyuvantes de emulsión en aceite y a base de emulsionantes, adyuvantes particulados, adyuvantes sintéticos, adyuvantes poliméricos, y combinaciones de los mismos.
6. Composición farmacéutica según la reivindicación 5, para su uso en reducir la frecuencia o gravedad o retrasar la aparición de síntomas de infección por HCMV en un sujeto, preferiblemente un sujeto humano y preferiblemente un sujeto que se ha expuesto a infección por HCMV, tal como un sujeto en riesgo por infección por HCMV, por ejemplo, un sujeto inmunodeprimido preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en un sujeto infectado por VIH, un paciente con sida, un receptor de trasplante, un sujeto pediátrico y un sujeto gestante.
7. Composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 6, en la que la frecuencia, gravedad o aparición de síntomas de infección por HCMV en un sujeto se reducen en aproximadamente el 50% o más, tales como en aproximadamente el 60% o más, aproximadamente el 70% o más, o aproximadamente el 75% o más, en comparación con la frecuencia, gravedad o aparición de síntomas de infección por HCMV en el sujeto antes del uso de la composición farmacéutica.
8. Composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 6 ó 7, en la que la composición farmacéutica es para la administración en una dosis inicial y en al menos una dosis de refuerzo, por ejemplo dos, tres o cuatro dosis de refuerzo.
9. Composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 8, en la que la composición farmacéutica es para la administración en una dosis inicial y en al menos una dosis de refuerzo aproximadamente un mes, aproximadamente dos meses, aproximadamente tres meses, aproximadamente cuatro meses, aproximadamente cinco meses, o aproximadamente seis meses tras la dosis inicial; y preferiblemente en una segundo dosis de refuerzo aproximadamente seis meses, aproximadamente siete meses, aproximadamente ocho meses, aproximadamente nueve meses, aproximadamente diez meses, aproximadamente once meses, o aproximadamente un año tras la dosis inicial.
10. Composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en la que la composición farmacéutica es para la administración en una dosis de refuerzo cada 1 año, 2 años, 3 años, 4 años, 5 años, 6 años, 7 años, 8 años, 9 años o 10 años.