ES2873879T3 - MIR-18B para su uso como marcador de la progresión del cáncer y diana para terapias para tratar el cáncer - Google Patents

Abstract

Método de detección de una expresión disminuida de miR-18b y de una metilación aumentada de la región de 2,5 kilobases (kB) en el sentido de 5' de miR-18b en una muestra biológica de tejido de un sujeto, que comprende: (i) medir el nivel de expresión de miR-18b en la muestra biológica de tejido y determinar el estado de metilación de la región de 2,5 kB en el sentido de 5' del gen miR-18b en la muestra usando cebadores específicos de metilación tras el tratamiento con bisulfito, en el que los cebadores específicos de metilación consisten en la secuencia de SEQ ID NO: 4 y 5; (ii) comparar el nivel de expresión de miR-18b en la muestra del sujeto con el nivel medio de expresión de miR- 18b de una o más muestras biológicas de control; (iii) identificar si el nivel de expresión para miR-18b en la muestra está disminuido en comparación con el nivel medio de expresión para miR-18b en una o más muestras de control, y determinar si la muestra tiene metilación aumentada para la región de 2,5 kB en comparación con el estado de metilación para la región de 2,5 kB en la una o más muestras de control.

Description

DESCRIPCIÓN

MIR-18B para su uso como marcador de la progresión del cáncer y diana para terapias para tratar el cáncer Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica prioridad según 35 U.S.C. §119 de la solicitud provisional con n.° de serie 61/703.057, presentada el 19 de septiembre 2012.

Campo técnico

La divulgación proporciona métodos para el diagnóstico del cáncer, la tasa de supervivencia del sujeto, y/o la progresión del cáncer basándose en medir los niveles de expresión de microARN, miR-18b. La divulgación proporciona además un método para tratar a un sujeto con cáncer potenciando la expresión de miR-18b.

Antecedentes

El melanoma, una neoplasia maligna potencialmente mortal con mal pronóstico en sus estadios avanzados, representa el 80% de las muertes por cáncer de piel. Es el sexto cáncer más común en los EE.UU. representando más de 60.000 casos nuevos cada año. Los melanomas son únicos entre los tumores sólidos porque rara vez albergan mutaciones en el gen p53. El mecanismo por el que se suprime la ruta de p53 en muchos melanomas no está claro, más allá de las mutaciones en el gen CKDN2A, que pueden dar como resultado la pérdida de p14ARF. Más allá de la extirpación quirúrgica del tumor primario, actualmente no existe una terapia curativa convencional disponible, especialmente para estadios más avanzados. Por consiguiente, ha existido la necesidad desde hace mucho tiempo en la industria de desarrollar marcadores moleculares que puedan usarse no sólo para rastrear la progresión del melanoma, sino que también podrían usarse como dianas para regular y suprimir la progresión del melanoma.

Sumario

La divulgación proporciona un papel funcional para miR-18b en cáncer, el mecanismo molecular que regula su expresión, e identifica el proto-oncogén MDM2 como diana de la acción de miR-18b en el cáncer.

La divulgación proporciona un método para pronosticar si sujeto tiene un cáncer, tal como melanoma, que comprende: (i) obtener una muestra biológica, tal como una biopsia de tejido, de un sujeto; (ii) medir el nivel de expresión de pre-miR-18b (UGUGUUAAGGUGCAUCUAGUGCAGUUAGUGAAGCAGCUUAGAAUCUACUGCCCUAAAUGCCCCUUC UGGCA; SEQ ID NO:2), o miR-18b-5p procesado/maduro (UAAGGUGCAUCUAGUGCAGUUAG; SEQ ID NO:1 (6-28 de SEQ ID NO:2); o-miR-18b-3p UGCCCUAAAUGCCCCUUCUGGC; SEQ ID NO:3 (49-70 de SEQ ID NO:2)) en la muestra biológica del sujeto; (iii) comparar el nivel de expresión de miR-18b en la muestra biológica del sujeto con el nivel de expresión de miR-18b de una o más muestras biológicas de control, tales como de biopsias de tejido de nevos benignos; y (iv) pronosticar si el sujeto tiene cáncer basándose en que tiene un nivel de expresión menor para miR-18b en comparación con el nivel medio de expresión de miR-18b en las muestras de control. En otra realización, las muestras biológicas de control o nevos benignos son del mismo sujeto o alternativamente no son del mismo sujeto.

La divulgación proporciona un método para determinar si un sujeto tiene un cáncer, que comprende: (i) obtener una muestra biológica, tal como una biopsia de tejido, de un sujeto; (ii) medir el nivel de expresión de miR-18b en la muestra biológica del sujeto; (iii) comparar el nivel de expresión de miR-18b en la muestra biológica del sujeto con el nivel medio de expresión de miR-18b de una o más muestras biológicas de control, tales como de biopsias de tejido de nevos benignos; y (iv) determinar si el sujeto tiene cáncer basándose en que tiene un nivel de expresión significativamente menor para miR-18b en comparación con los niveles de expresión para miR-18b en las muestras de control. En otro aspecto, las muestras biológicas de control son del mismo sujeto o alternativamente de un sujeto diferente.

La divulgación proporciona un método para determinar si un cáncer, tal como un melanoma, en un sujeto está progresando o en recuperación, que comprende: (i) obtener una muestra biológica, tal como una biopsia de tejido, de un sujeto en un primer punto de tiempo; (ii) medir el nivel de expresión de miR-18b en la muestra biológica del sujeto del primer punto de tiempo; (iii) obtener una muestra biológica, tal como una biopsia de tejido, de un sujeto en un segundo punto de tiempo; (iv) medir el nivel de expresión de miR-18b en la muestra biológica del sujeto del segundo punto de tiempo;(v) comparar los niveles de expresión de miR-18b del primer punto de tiempo con los niveles de expresión del segundo punto de tiempo; y (vi) determinar si un cáncer está progresando o está en recuperación basándose en el cambio en los niveles de expresión de miR-18b de los dos puntos de tiempo, en el que un aumento en los niveles de expresión de miR-18b entre el primer punto de tiempo y el segundo punto de tiempo indica que el cáncer está en recuperación, y en el que una disminución en los niveles de expresión de miR-18b entre el primer punto de tiempo y el segundo punto de tiempo indica que el cáncer está progresando.

La divulgación proporciona un método para pronosticar la tasa de supervivencia de un sujeto que tiene un cáncer, tal como un melanoma, que comprende: (i) obtener una muestra biológica de un sujeto en un primer punto de tiempo; (ii) medir el nivel de expresión de miR-18b en la muestra biológica del sujeto del primer punto de tiempo; (iii) obtener una muestra biológica de un sujeto en un segundo punto de tiempo; (iv) medir el nivel de expresión de miR-18b en la muestra biológica del sujeto, tal como biopsia de tejido, del segundo punto de tiempo; (v) comparar los niveles de expresión de miR-18b del primer punto de tiempo con los niveles de expresión del segundo punto de tiempo; y (vi) pronosticar una tasa de supervivencia del sujeto basándose en el cambio en los niveles de expresión de miR-18b de los dos puntos de tiempo, en el que un aumento en los niveles de expresión de miR-18b entre el primer punto de tiempo y el segundo punto de tiempo indica una mejor tasa de supervivencia para el sujeto, y en el que una disminución en los niveles de expresión de miR-18b entre el primer punto de tiempo y el segundo punto de tiempo indica una peor tasa de supervivencia para el sujeto.

La divulgación proporciona un método para tratar un cáncer, tal como un melanoma, en un sujeto, comprendiendo el método: administrar una cantidad eficaz de un agente que potencia la expresión de miR-18b. En un aspecto, la divulgación proporciona métodos en los que el agente que potencia la expresión de miR-18b es un vector que expresa miR-18b que comprende SEQ ID NO:1 o una secuencia que es al menos el 98% idéntica a SEQ ID ⁿO:1. En un aspecto, el vector es un vector retroviral competente para la replicación tal como un MLV (véase, por ejemplo, la publicación internacional n.° WO 2010/036986) o un vector adenoviral. En otro aspecto, el vector puede ser un vector defectuoso para la replicación. En aún otro aspecto, puede usarse un sistema de administración que comprende dominios de unión de ARN bicatenario y dominios de transducción de proteínas (véase, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense n.° 20090093026-A1) o una nanopartícula que puede neutralizar la carga aniónica del miR-18b. En aún un aspecto adicional, la potencia de la expresión de miR-18b da como resultado la inhibición o prevención de la proliferación de células cancerosas. En otro aspecto, el potenciamiento de la expresión de miR-18b da como resultado una disminución en la expresión de MDM2 en células cancerosas. En aún otro aspecto, un agente terapéutico adicional se administra junto con un polinucleótido que comprende miR-18b y/o un agente que potencia la expresión de miR-18b. Los ejemplos de agentes terapéuticos adicionales incluyen, pero no se limitan a, análogos de platino, agentes alquilantes, sulfonatos de alquilo, andrógenos, anticuerpos antiadrenales, antiandrógenos, antibióticos, antiestrógenos, 4(5)-imidazoles que inhiben la aromatasa, antimetabolitos, análogos de ácido fólico, etileniminas y metilamelaminas, reforzadores del ácido fólico, mostazas de nitrógeno, nitrosureas, análogos de purina, análogos de pirimidina, inhibidores de la topoisomerasa, inhibidores de la timidilato sintasa, anticuerpos anticancerígenos, quimioterápicos, terapias dirigidas tales como vemurafenib, dabrafenib, trametinib, erlotinib y Gleevec y agentes de desmetilación. En un aspecto particular, el agente terapéutico adicional es cisplatino.

La divulgación proporciona uno o más aspectos expuestos en los dibujos adjuntos y la descripción a continuación. Otras características, objetos y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción y los dibujos, y de las reivindicaciones.

Descripción de los dibujos

La figura 1A-C muestra que la expresión de miR-18b se suprime en el melanoma. (A) Análisis cuantitativo de miARN que muestra una supresión significativa en la expresión de miR-18b en una cohorte de muestras de melanoma en comparación con muestras de nevos. (B) La supresión en miR-18b en muestras de melanoma predice la supervivencia global. Se definieron los sujetos que tienen baja expresión de miR-18b como muestras con expresión de miR-18b por debajo de la media, y se definieron los sujetos que tienen alta expresión de miR-18b como muestras con expresión de miR-18b por encima de la media. (C) La expresión de miR-18b se suprime en líneas de células de melanoma en comparación con los melanocitos humanos normales. En las que, * es p<0,05.

La figura 2A-D muestra que la expresión de miR-18b se suprime mediante hipermetilación. (A) Representación esquemática de la región (2500 pb) en el sentido de 5' de miR-18b analizada para la metilación, con sitios CpG representados mediante líneas verticales. (B) La expresión de miR-18b, tal como se determina mediante qRT-PCR, se reguló por incremento en cinco líneas de células de melanoma (C8161,9, LOX, 1205-Lu, DO4 y WM278) tras el tratamiento con 5AZA. (C) Situación de la metilación del promotor de miR-18b en líneas de células de melanoma y treinta muestras de tumor; M, producto amplificado con cebadores que reconocen una secuencia metilada; U, producto amplificado con cebadores que reconocen una secuencia no metilada. (D) Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina realizadas en células después de la sobreexpresión de miR-18b. La sobreexpresión de miR-18b dio como resultado el enriquecimiento de las modificaciones de cromatina activas (acetil histona H3, H4 y metil-2H3K4) y la reducción de modificaciones represoras (2H3K9 y 3H3K9).

La figura 3A-F muestra MDM2 como una diana directa de miR-18b, y una correlación inversa de miR-18b y MDM2 en células de melanoma. (A) La secuencia semilla de miR-18b (SEQ ID NO:1) es complementaria a la 3'UTR de MDM2 (SEQ ID NO:10 y 11). (B) Expresión de MDM2 en el ARNm y niveles de proteínas en diferentes líneas de células de melanoma humano y melanocitos normales. (C) y (D) Ensayos con luciferasa por duplicado, que muestran la disminución en la actividad indicadora después de la transfección conjunta de MDM2-3'UTR con miR-18b en células 1205-Lu y respectivamente LOX células. La 3UTR mutante no tuvo ningún efecto sobre la actividad indicadora.(E) Nivel de expresión de miR-18b relativo en células 1205-Lu después de la transfección con miR-18b tal como se determina mediante qRT-PCR de miR. (F) Análisis de inmunotransferencia de tipo Western que muestra la supresión en MDM2 y la regulación por incremento en p53, p21 y PUMA a niveles de proteínas. En las que, * es p<0,05.

La figura 4A-F miR-18b inhibe la proliferación de células de melanoma 1205-Lu, la formación de colonias e induce la apoptosis. (A) La capacidad proliferativa de células 1205-Lu después de la transfección de miR-18b se reduce significativamente cuando se compara con cont.miR. (B) La sobreexpresión de miR-18b inhibe significativamente la capacidad de formación de colonias de células de melanoma 1205-Lu. (C) Análisis del ciclo celular que muestra una disminución significativa en la fase S de células 1205-Lu que sobreexpresan miR-18b. (D) Sobreexpresión de miR-18b apoptópica significativamente inducida en células 1205-Lu en comparación con células que expresan cont.miR. (E-F) Transfección conjunta de MDM2 junto con la supresión invertida de miR-18b en la proliferación celular, nivel de expresión de p53, p21 y PUMA. *p<0,05.

La figura 5A-E muestra en células LOX transfectadas, que miR-18b suprime la proliferación de células de melanoma e induce la apoptosis en células de melanoma. (A) La capacidad proliferativa de células LOX después de la transfección de miR-18b se reduce significativamente en comparación con cont.miR. (B) La sobreexpresión de miR-18b inhibe significativamente la capacidad de formación de colonias de células de melanoma. (C) Inmunotransferencia de tipo Western que muestra que la expresión de MDM2, BCL2 y BCL-XL se regula por disminución en células LOX transfectadas con miR-18b frente a Cont.miR, mientras que la expresión de p53, p21 y PUMA se regula por incremento en células LOX transfectadas con miR-18b frente a cont.miR. Se proporciona GAPDH como control. (D) Análisis del ciclo celular que muestra una disminución significativa en la fase S de células LoX que sobreexpresan miR-18b. (E) Ensayos de apoptosis que muestran un aumento en el número de células apoptóticas en las células LOX transfectadas con miR-18b frente a células LOX transfectadas con cont.miR.

La figura 6A-G muestra que la sobreexpresión estable de miR-18b inhibe la proliferación celular in vitro e in vivo. (A) Niveles de expresión relativos de miR-18b en células 1205-Lu que expresan de manera estable miR-18b tal como se determina mediante qRT-PCR de miR. (B) La sobreexpresión estable de miR-18b en líneas de células de melanoma suprimió significativamente la proliferación celular. (C) La capacidad de formación de colonias se reduce significativamente mediante miR-18b. (D) la expresión estable de miR-18b suprime la fase S del ciclo celular. (E) La sobreexpresión estable de miR-18b induce la apoptosis en células 1205-Lu. (F) Análisis de inmunotransferencia de tipo Western que muestra la supresión de MDM2 y la regulación por incremento de p53, p21 y PUMA. (G) El volumen del tumor tras la inyección subcutánea de células 1205-Lu que expresan miR-18b se redujo significativamente en comparación con las células que expresan cont.miR (N=10 ratones por grupo). Inmunotransferencia de tipo Western que muestra la expresión de MDM2 de tumores subcutáneos que expresan cont.miR y miR-18b. En las que, * es p<0,05.

La figura 7A-B muestra que el cisplatino induce miR-18b. (A) El cisplatino induce la expresión de miR-18b tal como se determina mediante qRT-PCR después de 48 h de tratamiento. (B) La sobreexpresión de miR-18b y el tratamiento con cisplatino dio como resultado una mayor supresión de la capacidad proliferativa de células de melanoma que el tratamiento con cisplatino solo.

La figura 8A-E muestra que miR-18b suprime la migración de células de melanoma y invasividad, e invierte la transición epitelial a mesenquimatosa (EMT). (A) y (B) Experimentos por duplicado, que muestran que la sobreexpresión de miR-18b suprime significativamente la capacidad migratoria y la invasividad de líneas de células de melanoma 1205-Lu en comparación con células que expresan cont.mir. (C) y (D) Ensayos de inmunofluorescencia que demuestran que la sobreexpresión de miR-18b en células de melanoma 1205-Lu regula por disminución la expresión de vimentina y N-cadherina. DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) indica la ubicación del ADN en la célula. (E) Inmunotransferencia de tipo Western que muestra que la expresión de N-cadherina, vimentina y Slug se regula por disminución en células de melanoma 1205-Lu transfectadas con miR-18b frente a cont.miR, mientras que la expresión de E-cadherina se regula por incremento en células de melanoma 1205-Lu transfectadas con miR-18b frente a cont.miR. Se proporciona GAPDH como control para la transfección.

La figura 9 muestra el efecto de miR-18b con inhibidor de BRAF sobre la proliferación celular de líneas de células de melanoma.

Descripción detallada

Tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un/uno”, “y” y “el/la” incluyen los referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a “una sonda” incluye una pluralidad de tales células y la referencia a “la célula” incluye la referencia a una o más células y equivalentes de la misma conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto habitual en la técnica a la que pertenece esta divulgación. Aunque cualquier método y reactivo similar o equivalente a los descritos en el presente documento puede usarse en la práctica de los métodos y composiciones dados a conocer, ahora se describen los métodos y materiales a modo de ejemplo.

Todas las publicaciones mencionadas en el presente documento se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en el presente documento debe interpretarse como una admisión de que los inventores no tienen derecho a preceder dicha divulgación en virtud de una divulgación previa. Además, con respecto a cualquier término que se presente en una o más publicaciones que sea similar o idéntico a un término que se ha definido expresamente en esta divulgación, la definición del término tal como se proporciona expresamente en esta divulgación prevalecerá en todos los aspectos.

Las células de melanoma son muy resistentes a la quimioterapia, dando como resultado bajas tasas de respuesta a la administración de quimioterápicos (La Porta CA., Curr Cancer Drug Targets 9:391-7 (2009)). Además, las células de melanoma son comunes y representan la causa principal de enfermedad y cirugía de la piel.

Los microARN (miARN) han emergido como una clase novedosa de posibles biomarcadores del cáncer o dianas para la terapia. Los miARN son secuencias no codificantes de proteínas pensadas para regular >90% de los genes humanos (Miranda et al., Cell 126:1203-17 (2006)). La desregulación de la expresión de miARN se ha identificado en varios cánceres y los datos acumulados indican que algunos miARN pueden funcionar como oncogenes o genes supresores de tumores (Volinia et al. Proc Natl Acad Sci U S A 103:2257-61 (2006); Porkka et al., Cancer Res 67:6130-5 (2007)). Los miARN se expresan de una manera específica de tejido y pueden desempeñar un papel importante en la proliferación celular, apoptosis, y diferenciación (Sempere et al., Genome Biol 5:R13 (2004); y Bartel DP. Cell 116:281-97 (2004)). La inactivación de miARN oncogénicos o la restitución de miARN supresores de tumores puede tener un gran potencial para el tratamiento del cáncer (Medina et al., Nature 467:86-90; Obad et al. Nat Genet 43: 371-8; Saito et al., Cancer Cell 9: 435-43 (2006); Lujambio et al. Cancer Res 67:1424-9 (2007); y Lujambio et al. Proc Natl Acad Sci U S A 105:13556-61 (2008)). Además, los miARN se están evaluando como posibles biomarcadores para ayudar en el diagnóstico y pronóstico de diferentes cánceres, incluyendo melanoma (Yi et al., Cell Death Differ 17:229-35 (2010); y Bartels et al., Clin Chem 55:623-31 (2009)). Hasta la fecha, se han realizado pocos análisis del perfilado de la expresión de miARN en muestras de melanoma humano, y algunos miARN candidatos han emergido con supuestos papeles en la progresión del melanoma (Mueller et al., Br J Cancer 101:551-6 (2009); Bemis et al. Cancer Res 68: 1362-8 (2008) ; Felicetti et al. Cancer Res 68: 2745-54 (2008); Segura et al., Proc Natl Acad Sci U S A 106:1814-9 (2009) ; y Dar et al., J Biol Chem 286: 16606-14 (2011)).

Recientemente, los miARN supresores de tumores han mostrado que se inactivan por la hipermetilación del ADN de los sitios CpG (Chuang et al., Pediatr Res 61:24R-9R (2007)). El perfil de metilación del ADN de los tumores se ha usado para definir el tipo de tumor, el pronóstico clínico y la respuesta a la terapia (Esteller M., N Engl J Med 358:1148-59 (2008); Rodriguez-Paredes et al., Nat Med 17:330-9). El silenciamiento epigenético de los miARN puede estar implicado en la adquisición del fenotipo invasivo y metastásico (Lujambio et al., Cell Cycle 8:377-82 (2009)). Pese a la evidencia acumulada en cuanto al papel de diversos miARN en el cáncer, está disponible una información muy limitada sobre el repertorio y función de los miARN en el melanoma, y se han identificado pocas dianas de los miARN en el melanoma. Varios estudios han evaluado los niveles de diversos miARN a través de perfilado de expresión de microalineamientos o han estudiado los mecanismos de acción de miARN seleccionados en este tipo de tumor (Gaur et al., Cancer Res 67: 2456-68 (2007); Philippidou et al., Cancer Res (2010); y Segura et al., Proc Natl Acad Sci U S A 106: 1814-9 (2009)). Por ejemplo, miR-221 y miR-222 se han implicado en la progresión del melanoma a través de la regulación de la expresión de p27 (Felicetti et al., Cancer Res 68:2745-54 (2008)). La expresión atípica de miR-182 promueve la metástasis del melanoma reprimiendo FOXO3 y el factor de transcripción asociado con microftalmía Segura et al., Proc Natl Acad Sci U S A 106: 1814-9 (2009)). Se ha demostrado que miR-532-3p regula RUNX3 en el melanoma cutáneo (Kitago et al., Clin Cancer Res 15:2988-94 (2009)); miR-193 regula Mcl-1 (Chen et al., Am J Pathol 179: 2162-8 (2011)); y miARN-137 selecciona como diana MITF (Bemis et al., Cancer Res 68: 1362-8 (2008)) en melanoma. Se ha informado sobre un papel para miR-205 en la supresión del crecimiento del melanoma y en la inducción de senescencia (Dar et al., J Biol Chem 286: 16606-14 (2011)).

Se ha informado que miR-18b se expresa de manera diferencial en determinado cánceres usando selecciones de microalineamientos, pero falta un papel funcional en la tumorigénesis y sus objetivos de acción aún no se han determinado (Kim et al., Histopathology 57:734-43 (2010)). Dar et al. (Cancer Research 72 (8) :Abstract LB-470(2012)) y el documento WO2012/005572 (Interna Technologies BV) describen un vínculo entre la metilación de miR-18b y el melanoma. Pavicic et al.(Molecular Medicine 17(7-8)726-735 (2011)) describen el análisis de metilación de una región en el sentido de 5' de miR-18b. La divulgación proporciona la caracterización de miR-18b, incluyendo la identificación de un mecanismo por el cual se silencia su expresión y la demostración de su papel funcional como supresor de tumores en el melanoma. En los estudios presentados en el presente documento, se encontró que miR-18b estaba regulado por disminución en melanomas en comparación con nevos, y en líneas de células de melanoma en comparación con melanocitos normales. En una realización particular, midiendo el nivel de expresión de miR-18b en células cancerosas de un sujeto, se podría predecir la tasa de supervivencia del sujeto, de modo que un nivel de expresión de miR-18b menor sea correlativo a una tasa de supervivencia menor del sujeto.

La divulgación proporciona que la metilación del ADN es un mecanismo molecular importante que es responsable de la supresión de la expresión de miR-18b en el melanoma. Esta divulgación se suma al creciente conjunto de datos que demuestra el papel de la regulación por disminución mediada por metilación del ADN de los miARN por islas CpG proximales (Saito et al., Cancer Cell 9:435-43 (2006); Kozaki et al., Cancer Res 68:2094-105 (2008); Iorio et al., Biochim Biophys Acta 1799:694-701; y Toyota et al., Cancer Res 68:4123-32 (2008)). La metilación atípica del ADN y las modificaciones de histonas funcionan en conjunto para silenciar muchos genes supresores de tumores en cánceres humanos (Nakagawa et al., J Urol 173: 1767-71 (2005); y Kristeleit et al., Expert Opin Emerg Drugs 9: 135-54 (2004)). Además, la hiperacetilación de los residuos de histona lisina facilita la activación transcripcional y la inducción de la expresión génica (Kristeleit et al., Expert Opin Emerg Drugs 9: 135-54 (2004); y Archer et al., Curr Opin Genet Dev 9: 171-4 (1999)). Los estudios proporcionados en el presente documento indican que la sobreexpresión de miR-18b en líneas de células de melanoma da como resultado un aumento del enriquecimiento de acetil H3, aceti1H4, 2H3K4, que es indicativo de expresión génica activa, mientras que se suprimieron las modificaciones represivas de la cromatina (2H3K9 y 3H3K4). Los estudios adicionales proporcionados en el presente documento establecen que miR-18b tiene islas CpG distintas en su región en el sentido de 5' que están hipermetiladas, lo que conduce a su silenciamiento a través de la hipermetilación del ADN específico del tumor.

Un obstáculo significativo para comprender la función de miARN ha sido la relativa escasez de objetivos validados experimentalmente. Para determinar los efectores de miR-18b, algoritmos y análisis funcionales insilico identificaron a MDM2 como una diana. Los resultados presentados en el presente documento indican una correlación inversa entre la expresión de miR-18b y la de MDM2 en un panel de líneas de células de melanoma. Se encontró que miR-18b selecciona como diana directamente a la 3'UTR de MDM2. Además, se observó una regulación por disminución significativa de los niveles de proteína MDM2 después de la sobreexpresión de miR-18b, lo que indica la regulación postranscripcional de MDM2 mediante la selección como diana de su 3'UTR. Se ha demostrado que MDM2 se sobreexpresa en la progresión del melanoma (Polsky et al., J Natl Cancer Inst 94: 1803-6 (2002)), y probablemente induce la transformación celular a través de su asociación con p53 (para promover la degradación de p53) y a través de su capacidad para estimular el complejo de transcripción E2F1/DP1. Además, los estudios presentados en el presente documento demuestran que la regulación por disminución de MDM2 después de la sobreexpresión de miR-18b estuvo acompañada por la activación de p53.

p53 tiene una potente actividad supresora de tumores y se inactiva en la mayoría de los tumores a través de mutaciones puntuales. El melanoma es relativamente único en los tumores sólidos humanos en el sentido de que raras veces se han descrito mutaciones de p53 (Sparrow et al., Melanoma Res 5: 93-100 (1995)). p53 también puede inactivarse mediante la sobreexpresión de MDM2 o la pérdida o inactivación de p14ARF y p16INK4a (Toledo et al., Nat Rev Cancer 6:909-23 (2006)). La expresión de p14ARF no cambió después de la sobreexpresión de miR-18b, lo que enfatiza el papel directo desempeñado por miR-18b para suprimir MDM2 y activar p53. Los resultados proporcionados en el presente documento, indican en el primer caso de su tipo que la pérdida de miR-18b (a través de hipermetilación) es un mecanismo alternativo importante para efectuar la supresión de p53 y la ruta de p53 en células de melanoma. La reactivación de la función de p53 se ha buscado activamente como enfoque terapéutico en el cáncer (Martins et al., Cell 127: 1323-34 (2006)). Por tanto, en un aspecto, la divulgación proporciona métodos y composiciones para expresar o aumentar la expresión de p53 en células cancerosas sobreexpresando miR-18b. Por ejemplo, en una realización, tal como se describió anteriormente, la hipermetilación reduce el miR-18b, por consiguiente los agentes que inhiben la metilación pueden usarse para aumentar la expresión de miR-18b y, por tanto, la expresión de p53. En un determinado aspecto, un sujeto con melanoma puede tratarse administrando un agente desmetilante para contrarrestar, impedir, inhibir o suprimir la hipermetilación del ADN específico de tumor de miR-18b en células de melanoma. Los ejemplos de agentes desmetilantes incluyen, pero no se limitan a, derivados de citidina, que incluyen 5-azacitidina y 5-azadesoxicitidina; y procainamida y derivados, tales como procaína.

Además, la divulgación demuestra que la sobreexpresión de miR-18b da como resultado la regulación por incremento de PUMA, una proteína proapoptótica, así como el regulador del ciclo celular p21, y suprime la expresión de las proteínas antiapoptóticas BCL-2 y BCL-XL. Estos cambios en la expresión génica se acompañaron de una inhibición significativa de la proliferación celular, formación de colonias e inducción de apoptosis en células de melanoma, observación que se confirmó en dos líneas de células de melanoma humano diferentes. Estos efectos se confirmaron además tras la sobreexpresión estable de miR-18b en células 1205-Lu. Además, los estudios in vivo proporcionados en el presente documento demuestran una notable reducción en el crecimiento de células tumorales subcutáneas en ratones después de la sobreexpresión de miR-18b. Estos hallazgos identifican al miR-18b como un novedoso supresor de tumores en el melanoma. En una determinada realización, p53 y la cascada apoptótica pueden activarse sobreexpresando miR-18b. Los estudios dados a conocer en el presente documento demuestran que la sobreexpresión de miR-18b suprime significativamente la capacidad migratoria e invasiva de las líneas de células de melanoma.

En un aspecto descrito en el presente documento, los sujetos con melanoma pueden tratarse potenciando la expresión de miR-18b. En una realización adicional, los sujetos con cáncer, tal como melanoma, pueden tratarse potenciando la expresión de miR-18b en conjugación con la administración de uno o más agentes terapéuticos adicionales. Los ejemplos de agentes terapéuticos incluyen, entre otros, agentes anticancerígenos, agentes desmetilantes, agentes alquilantes, agentes antimetabolitos, inhibidores mitóticos, inhibidores de la tirosina cinasa, inhibidores de la topoisomerasa, anticuerpos monoclonales de inmunoterapia contra el cáncer, agentes antibióticos antitumorales y agentes anticancerígenos dirigidos. En una realización particular, los sujetos con cáncer, tal como melanoma, pueden tratarse potenciando la expresión de miR-18b en combinación con la administración de cisplatino. En otro aspecto, los sujetos con cáncer, tal como melanoma, pueden tratarse potenciando la expresión de miR-18b en combinación con la administración de un inhibidor de BRAF tal como, por ejemplo, dabrafenib. Tal como se usa en el presente documento, “inhibidores de BRAF” se refiere a fármacos que seleccionan como diana una mutación adquirida de B-RAF que está asociada con cáncer, tal como .sup.V600EB-RAF. Los ejemplos representativos de un inhibidor de B-RAF de este tipo incluyen PLX4032/vemurafenib u otros agentes similares, tales como GSK2118436/dabrafenib.

Se ha demostrado que la transición epitelial a mesenquimatosa (EMT) desempeña un papel importante en la invasión y metástasis de tumores epiteliales así como de melanoma (Alonso et al., Cancer Res 67:3450-60 (2007)). Los reguladores epiteliales a mesenquimatosos (EMTR) tales como Snail, Slug y Twist son cruciales para este proceso, que está coordinado principalmente por la desaparición o pérdida de marcadores tales como E-cadherina y la activación concomitante de marcadores tales como vimentina, fibronectina y N-cadherina. Los estudios presentados en el presente documento demuestran que la sobreexpresión de miR-18b da como resultado la supresión de vimentina, slug y W-cadherina mientras restaura los niveles de E-cadherina en las células de melanoma. Estos resultados indican que miR-18b puede mediar la EMT, lo que representa un posible mecanismo a través del cual afecta la migración y la invasión del melanoma. Los estudios dados a conocer en el presente documento demuestran que la sobreexpresión de miR-18b suprime significativamente la capacidad migratoria e invasiva de las líneas de células de melanoma.

En otro aspecto descrito en el presente documento, la divulgación proporciona un método de tratamiento de un cáncer, comprendiendo el método administrar una cantidad eficaz de un agente que potencia la expresión de miR-18b.

Los términos “tratar”, “que trata” y “tratamiento”, tal como se usan en el presente documento, se refieren a mejorar los síntomas asociados con una enfermedad o un estado, por ejemplo, un melanoma, incluyendo prevenir o retrasar la aparición de los síntomas de la enfermedad, y/o atenuar la gravedad o la frecuencia de los síntomas de la enfermedad o el estado. Los términos “sujeto” e “individuo” se definen en el presente documento para incluir animales, tales como mamíferos, incluyendo pero sin limitarse a, primates, vacas, ovejas, cabras, caballos, perros, gatos, conejos, cobayas, ratas, ratones u otras especies bovinas, ovinas, equinas, caninas, felinas, de roedores o murinas. En un aspecto preferido, el mamífero es un ser humano.

Tal como se usa en el presente documento, una “cantidad eficaz” de miR-18b es una cantidad suficiente para inhibir la proliferación o invasividad de una célula cancerosa en un sujeto que padece cáncer. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente una cantidad eficaz de producto de gen miR-18b que va a administrarse a un sujeto dado, teniendo en cuenta factores, tales como el tamaño y el peso del sujeto; el grado de la penetración de la enfermedad; la edad, salud y sexo del sujeto; la vía de administración; y si la administración es regional o sistémica.

Los cáncer que pueden tratarse mediante las composiciones que comprenden polinucleótidos que comprenden miR-18b y/o agentes que aumentan la expresión de miR-18b, incluyen, tumores que no están vascularizados, o aún no sustancialmente vascularizados, así como tumores vascularizados. Los cánceres pueden estar compuestos de tumores no sólidos (tal como leucemias y linfomas) o pueden ser tumores sólidos.

Los tipos de cánceres tratados con el agente o la composición de la divulgación incluyen carcinoma, blastoma y sarcoma, y determinadas leucemias o neoplasias malignas linfocíticas, tumores benignos y malignos y neoplasias malignas, por ejemplo, sarcomas, carcinomas, y melanomas. Los tumores/cánceres en adultos y tumores/cánceres pediátricos por igual pueden tratarse según los métodos dados a conocer en el presente documento.

Los ejemplos de tumores/cánceres que pueden tratarse incluyen, tumores de ovario, mama (incluyendo HER2+ y metastásico), colorrectales, de colon, renales, rectales, de páncreas, próstata, estómago, gastrointestinales, gástrico, de estómago, esófago, vías biliares, pulmón (incluyendo tumores de pulmón de células pequeñas y células no pequeñas; adenocarcinoma del pulmón y carcinoma de células escamosas del pulmón), tumores de hígado, epidermoides, tumores de células escamosas tales como tumores de cabeza y cuello, cáncer de células escamosas epiteliales, tumores de tiroides, cuello uterino, neuroendocrinos del aparato digestivo, tumores neuroendocrinos, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, hepatoblastoma, HPCR, glioblastoma, cáncer de vejiga, hepatoma, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de las glándulas salivales, cáncer de riñón o renal, cáncer de hueso, sarcoma de partes blandas (incluyendo rabdomiosarcoma embrionario y alveolar, GIST, de sarcoma de partes blandas alveolar y sarcoma de células claras), colangiocarcinoma, cáncer de vías biliares, carcinoma de vesícula biliar, mieloma, cáncer vulvar, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pene, cáncer retiniano, hematopoyético, tumores dependientes de andrógenos, tumores independientes de andrógenos. Otros ejemplos incluyen sarcoma de Kaposi, sarcoma sinovial, tumor que secreta péptidos intestinales vasoactivos, neoplasmas del SNC, neuroblastomas, hemangioblastomas capilares, meningiomas y metástasis cerebrales, melanoma, rabdomiosarcoma, glioblastoma, incluyendo glioblastoma multiforme, EMB, RMS, ALV, meduloblastoma, ependimoma, cáncer de Wilm, cáncer de Ewing, osteosarcoma, PNT, cáncer rabdoide, rabdomiosarcoma, retinoblastoma, cáncer corticosuprarrenal, cáncer suprarrenal y liomiosarcoma. En un determinado aspecto, el cáncer que va a tratarse es melanoma.

En un aspecto particular descrito en el presente documento, la divulgación proporciona un método de tratamiento de cáncer, tal como melanoma, en un sujeto, comprendiendo el método administrar una cantidad eficaz de un agente que potencia la expresión de miR-18b. En otro aspecto, el agente es un ARNhc de un promotor de polimerasa II o III. En otro aspecto, el agente es un mimético de miARN bicatenario. La tecnología de miméticos de miARN es bien conocida en la técnica. Véase, por ejemplo, Wang, Z., 2009, miRNA mimic technology, En MicroRNA Interference Technologies, páginas 93-100, Springer-Link Publications. En otra realización, el agente es un fármaco pre-miR-18b basado en oligonucleótidos.

La terapia con polinucleótidos que presenta un polinucleótido que codifica para miARN, tal como miR-18b, es otro enfoque terapéutico para mejor un número de transcritos o nivel de expresión del miARN en un sujeto. Los vectores de expresión que codifican para miR-18b pueden administrarse a células de un sujeto para el tratamiento o la prevención de un cáncer. Las moléculas de ácido nucleico se administran a las células de un sujeto de una forma en la que se pueden absorber y se expresan de manera ventajosa de modo que pueden lograrse niveles terapéuticamente eficaces. Los vectores de expresión que pueden expresar miR-18b están disponibles comercialmente de diversos vendedores.

Los métodos para administrar polinucleótidos que comprenden miR-18b y/o agentes que aumentan la expresión de miR-18b a la célula incluyen el uso de un sistema de administración, tal como liposomas, polímeros, microesferas, vectores de terapia génica y vectores de ADN desnudos.

La transducción de vectores virales (por ejemplo, retrovirales, adenovirales, lentivirales y virales adenoasociados) pueden usarse para la terapia génica de células somáticas, especialmente debido a su alta eficiencia de infección e integración y expresión estables (véase, por ejemplo, Cayouette et al., Human Gene Therapy 8:423-430 (1997); Kido et al., Current Eye Research 15:833-844 (1996); Bloomer et al., Journal of Virology 71:6641-6649 (1997); Naldini et al., Science 272:263-267 (1996); y Miyoshi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:10319 (1997)). Por ejemplo, un polinucleótido que codifica para miR-18b puede clonarse en un vector retroviral y su expresión puede dirigirse desde un promotor endógeno, desde la repetición terminal larga retroviral o desde un promotor específico para un tipo de célula diana de interés. Otros vectores virales que pueden usarse incluyen, por ejemplo, un virus vaccinia, un virus del papiloma bovino o un virus del herpes, tal como virus de Epstein-Barr (también véanse, por ejemplo, los vectores de Miller, Human Gene Therapy 15-14, (1990); Friedman, Science 244:1275-1281 (1989); Eglitis et al., BioTechniques 6:608-614 (1988); Tolstoshev et al., Current Opinion in Biotechnology 1:55-61 (1990); Sharp, The Lancet 337:1277-1278 (1991); Cornetta et al., Nucleic Acid Research y Molecular Biology 36(31) :1-322 (1987); Anderson, Science 226:401-409 (1984); Moen, Blood Cells 17:407-416 (1991); Miller et al., Biotechnology 7:980-990 (1989); Le Gal La Salle et al., Science 259:988-990 (1993); y Johnson, Chest 107:77S-83S (1995)). Los vectores retrovirales están particularmente bien desarrollados y se han usado en entornos clínicos (Rosenberg et al., N. Engl. J. Med 323:370 (1990); Anderson et al., patente estadounidense n.° 5.399.346). También pueden emplearse enfoques no virales para la introducción de un agente terapéutico basado en miR-18b en una célula de un paciente diagnosticado como que tiene una neoplasia. Por ejemplo, un polinucleótido que comprende miR-18b puede introducirse en una célula administrando el ácido nucleico en presencia de un lípido catiónico (Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

84:7413 (1987); Ono et al., Neuroscience Letters 17:259 (1990); Brigham et al., Am. J. Med. Sci. 298:278 (1989); y Staubinger et al., Methods in Enzymology 101:512 (1983)); conjugación asialo-orosoinucoide-polilisina (Wu et al. Journal of Biological Chemistry 263:14621 (1988); Wu et al., Journal of Biological Chemistry 264:16985 (1989); o mediante microinyección en condiciones quirúrgicas (Wolff et al., Science 247:1465 (1990). Pueden administrarse un polinucleótido que comprende miR-18b y/o un agente que potencia la expresión de miR-18b en combinación con un liposoma y protamina.

También puede lograrse la transferencia génica usando medios no virales que implican la transfección in vitro. Tales métodos incluyen el uso de fosfato de calcio, DEAE dextrano, electroporación y fusión de protoplastos. Los liposomas también pueden ser potencialmente beneficiosos para la administración de ADN en una célula. La expresión de miR-18b para su uso en métodos de terapia con polinucleótidos puede dirigirse desde cualquier promotor adecuado (por ejemplo, el citomegalovirus humano (CMV), virus de simio 40 (SV40), o promotores de metalotioneína), y regularse mediante cualquier elemento regulador de mamífero apropiado. Por ejemplo, si se desea, pueden usarse potenciadores conocidos para dirigir de manera preferencial la expresión génica en tipos de células específicos para dirigir la expresión de un ácido nucleico. Los potenciadores usados pueden incluir, sin limitación, los que se caracteriza como potenciadores específicos de tejidos o células. Para cualquier sujeto particular, las pautas posológicas específicas deben ajustarse a lo largo del tiempo según la necesidad individual y la opinión profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones.

En otro aspecto, la divulgación proporciona composiciones terapéuticas que comprenden polinucleótidos que comprenden miR-18b que aumentan la expresión de miR-18b para el tratamiento de un cáncer, tal como melanoma. En otro aspecto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende un agente que potencia la expresión de miR-18b. Los ejemplos de tales agentes incluyen, pero no se limitan a, compuestos que impiden o suprimen la metilación de miR-18b.

Los polinucleótidos que comprenden miR-18b y/o agentes que aumentan la expresión de miR-18b pueden administrarse como parte de una composición farmacéutica. La composición farmacéutica es preferiblemente estéril y contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula de polinucleótido que comprende miR-18b y/o un agente que potencia la expresión de miR-18b en una unidad de peso o volumen adecuada para la administración a un sujeto.

La molécula de polinucleótido terapéutica que comprende miR-18b y/o agentes que aumentan la expresión de miR-18b puede administrarse con un portador farmacéuticamente aceptable, en forma de dosificación unitaria. Puede emplearse la práctica farmacéutica convencional para proporcionar formulaciones o composiciones adecuadas para administrar los compuestos a pacientes que padecen cáncer.

El portador, tal como se usa en el presente documento, incluye portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables que no son tóxicos para la célula o el mamífero que se expone a los mismos en las dosis y concentraciones empleadas. A menudo, el portador fisiológicamente aceptable es una disolución acuosa tamponada de pH. Los ejemplos de portadores fisiológicamente aceptables incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico; polipéptido de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, polietilenglicol (PEG) y PLURONICS™.

Los polinucleótidos que comprenden miR-18b y/o agentes que aumentan la expresión de miR-18b también pueden estar atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Las formulaciones que van a usarse para la administración in vivo debe ser estéril. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que comprenden un polinucleótido que comprende miR-18b y/o un agente que potencia la expresión de miR-18b, matrices que están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (patente estadounidense n.° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de y-etilo, copolímeros de etileno-acetato de vinilo no degradables, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros tales como el etileno-acetato de vinilo y el ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, determinados hidrogeles liberan moléculas durante períodos de tiempo más cortos.

En otro aspecto, las composiciones farmacéuticas que comprenden polinucleótidos que comprenden miR-18b y/o agentes que aumentan la expresión de miR-18b se administran junto con otros agentes terapéuticos. “Junto con” con respecto a la administración de otros agentes terapéuticos, se refiere a agentes que pueden administrarse antes de, simultáneamente con o después de composiciones farmacéuticas que comprenden polinucleótidos que comprenden miR-18b y/o agentes que aumentan la expresión de miR-18b.

En un aspecto particular, las composiciones farmacéuticas que comprenden polinucleótidos que comprenden miR-18b y/o agentes que aumentan la expresión de miR-18b se administrar junto con radioterapia, quimioterapia, terapia fotodinámica, cirugía u otra inmunoterapia, a un paciente que tiene un trastorno hiperproliferativo, tal como cáncer o un tumor. En un ejemplo, las composiciones farmacéuticas de la divulgación se administran a un sujeto junto con quimioterapia, radioterapia, o tanto quimioterapia como radioterapia. Las composiciones farmacéuticas de la divulgación pueden administrarse en conjugación con uno o más otros agentes profilácticos o terapéuticos, incluyendo, pero sin limitarse a agentes citotóxicos, quimioterápicos, citocinas, agentes inhibidores del crecimiento, agentes antihormonales, inhibidores de cinasas, agentes antiangiogénicos, cardioprotectores, agentes inmunoestimuladores, agentes inmunosupresores, agentes que promueven la proliferación de células hematológicas, inhibidores de angiogénesis, inhibidores de proteína tirosina cinasa (PTK), anticuerpos anticancerígenos u otros agentes terapéuticos.

Los ejemplos de quimioterápicos incluyen, pero no se limitan a, análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; proteínas tales como arginina desiminasa y asparaginasa; agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclosfosfamida (CYTOXAN™); sulfonatos de alquilo tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anticuerpos antiadrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; antibióticos tales como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antiestrógenos incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles que inhiben la aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, queoxifeno, LY 117018, onapristona y toremifeno (Fareston); antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenemelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosfaoramida y trimetilolomelamina; reforzador de ácido fólico tal como ácido frolínico; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; taxanos, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL™, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) y docetaxel (TAXOTERE™, Rhne-Poulenc Rorer, Antony, Francia); inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; inhibidor de timidilato sintasa (tal como Tomudex); quimioterápicos adicionales incluyendo aceglatona; glicósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; difluorometilornitina (DMFO); elformitina; acetato de eliptinio; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK™; razoxano; sizofurano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2, 2', 2” '-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido (“Ara-C”); ciclofosfamida; tiotepa; clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorrelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; ácido retinoico; esperamicinas; y capecitabina.

La administración de las composiciones farmacéuticas dadas a conocer en el presente documento puede comenzar después de que se determine que el sujeto tiene cáncer o se sospecha que tiene cáncer. Puede emplearse cualquier vía de administración apropiada, por ejemplo, la administración puede ser parenteral, intravenosa, intraarterial, subcutánea, intratumoral, intramuscular, intracraneal, intraorbital, oftálmica, intraventricular, intrahepática, intracapsular, intratecal, intracisternal, intraperitoneal, intranasal, aerosol, supositorio o administración oral. Por ejemplo, las formulaciones terapéuticas pueden estar en forma de disoluciones o suspensiones líquidas; para la administración oral, las formulaciones pueden estar en forma de comprimidos o cápsulas; y para formulaciones intranasales, en forma de polvos, gotas nasales o aerosoles.

Los métodos bien conocidos en la técnica para preparar formulaciones se encuentran, por ejemplo, en “Remington: The Science and Practice of Pharmacy” Ed. A. R. Gennaro, Lippincourt Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa., 2000. Las formulaciones para administración parenteral pueden contener, por ejemplo, excipientes, agua estéril o solución salina, polialquilenglicoles tales como polietilenglicol, aceites de origen vegetal o naftalenos hidrogenados. Para controlar la liberación de los compuestos pueden usarse polímero de lactida, copolímero de lactida/glicólido o copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno biocompatibles y biodegradables. Otros sistemas de administración parenteral potencialmente útiles para moléculas inhibidoras de ácido nucleico incluyen partículas de copolímero de etileno-acetato de vinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusión implantables y liposomas. Las formulaciones para inhalación pueden contener excipientes, por ejemplo, lactosa, o pueden ser disoluciones acuosas que contienen, por ejemplo, polioxietilen-9-lauril éter, glicocolato y desoxicolato, o pueden ser disoluciones oleosas para administración en forma de gotas nasales o como un gel.

Además de los aspectos terapéuticos de la expresión y sobreexpresión de miR-18b, el miR-18b también puede usarse como marcador de diagnóstico y pronóstico del tratamiento del cáncer, tal como melanoma. En una determinada realización, el nivel de expresión de miR-18b se determina a partir de una o más muestras biológicas de uno o más sujetos. La muestra biológica puede ser un tejido, sangre u otra muestra biológica conocida por un experto en la técnica. En un ejemplo, una muestra de tejido, tal como una biopsia de tejido, puede extraerse de un sujeto según un método conocido por un experto en la técnica. En otro ejemplo, puede extraerse una muestra de sangre de un sujeto y pueden aislarse componentes individuales de la muestra de sangre para la extracción de ácidos nucleicos o proteínas mediante técnicas convencionales.

En una realización particular, se obtienen una o más muestras de control de uno o más nevos benignos de uno o más sujetos. Los ejemplos de nevos incluyen, pero no se limitan a, nevo compuesto, nevo de Spitz, nevo halo, nevo de unión, pseudomelanoma, nevo azul, nevo melanocítico congénito, nevo de células en globo, nevo displásico/síndrome de nevo displásico, nevo acral, nevo de Becker, nevo melanocítico benigno y lentigo. Se mide el nivel de expresión de miR-18b en las muestras de control y, en una realización, el nivel de expresión medio para miR-18b sirve como nivel de expresión de control para miR-18b. En una realización particular, la una o más muestras de control y la muestra de prueba se obtienen del mismo sujeto. En una realización alternativa, la una o más muestras de control son de múltiples sujetos, que pueden incluir o no al sujeto de prueba.

El nivel de expresión de miARN puede cuantificarse y el nivel puede compararse con los valores de control. Por ejemplo, puede medirse el nivel de expresión de un miARN en una muestra de prueba y determinar el nivel. Por tanto, puede determinarse si el nivel de miARN es menor que el nivel de expresión del miARN en una muestra de control (es decir, la expresión del gen miARN está “subexpresada”). Tal como se usa en el presente documento, la expresión de un miARN está “subexpresada” cuando la cantidad de expresión de miARN en una muestra de prueba de un sujeto es menor que la cantidad del nivel de expresión del miARN en una muestra de control. En otra realización, el nivel de expresión de un miARN en una muestra de prueba puede ser mayor que el nivel de expresión del miARN en una muestra de control (es decir, la expresión del producto génico de miR está “sobreexpresada”). Tal como se usa en el presente documento, la expresión de un miARN está “sobreexpresada” cuando la cantidad de expresión de miARN en una muestra de prueba de un sujeto es mayor que la cantidad del nivel de expresión del miARN en una muestra de control. En aún otra realización, el nivel de expresión de un miARN en una muestra de prueba es igual al nivel de expresión de la expresión de miARN en una muestra de control.

El nivel de un miARN en una muestra puede medirse usando cualquier técnica que sea adecuada para detectar niveles de expresión de ARN en una muestra biológica. Las técnicas adecuadas para determinar los niveles de expresión de ARN en células a partir de una muestra biológica son bien conocidas por los expertos en la técnica. Los ejemplos de tales técnicas incluyen, pero no se limitan a, análisis de transferencia de tipo Northern, RT-PCR, microalineamientos, hibridación in situ. En una realización particular, se usa un sistema de alto rendimiento, por ejemplo, un microalineamiento, para medir el nivel de expresión de una pluralidad de genes.

En una determinada realización, el nivel de un miARN se detecta usando análisis de transferencia de tipo Northern. Por ejemplo, el ARN celular total puede purificarse a partir de células mediante homogeneización en presencia de tampón de extracción de ácido nucleico, seguido por centrifugación. Los ácidos nucleicos se precipitan y el ADN se retira mediante tratamiento con ADNasa y precipitación. Luego las moléculas de ARN se separan mediante electroforesis en gel sobre geles de agarosa según técnicas convencionales y se transfieren a filtros de nitrocelulosa. Luego, el ARN se inmoviliza en los filtros mediante calentamiento. La detección y cuantificación de ARN específico se logra usando sondas de ADN o ARN debidamente marcadas complementarias al ARN en cuestión.

Pueden producirse sondas adecuadas para la hibridación por transferencia de tipo Northern de un miARN dado a partir de las secuencias de ácido nucleico del miARN. Los métodos para la preparación de sondas de ADN y ARN marcadas, y las condiciones para la hibridación de las mismas con secuencias de nucleótidos diana, se describen en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., eds., 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, capítulos 10 y 11.

En un ejemplo, la sonda de ácido nucleico puede marcarse con, por ejemplo, un radionucleótido, tal como 3H, 32P, 33P, 14C o 35S; un metal pesado; o un ligando que puede funcionar como un miembro de un par de unión específico para un ligando marcado (por ejemplo, biotina, avidina o un anticuerpo), una molécula fluorescente, una molécula quimioluminiscente o una enzima. Las sondas pueden marcarse para una alta actividad específica mediante traducción de mellas, cebado aleatorio u otros métodos conocidos por un experto en la técnica. Por ejemplo, al reemplazar los nucleótidos preexistentes con nucleótidos altamente radiactivos de acuerdo con el método de traducción de mellas, sabe prepararse sondas de ácido nucleico marcadas con 32P con una actividad específica muy superior a 108 cpm/microgramo.

La detección autorradiográfica de la hibridación puede realizarse exponiendo filtros hibridados a una película fotográfica. El barrido densitométrico de las películas fotográficas expuestas por los filtros hibridados proporciona una medición precisa de los niveles de transcripción de miARN. En otra realización, los niveles de transcritos de genes miARN pueden cuantificarse mediante sistemas de obtención de imágenes computarizados, como el Molecular Dynamics 400-B 2D Phosphorimager disponible en Amersham Biosciences, Piscataway, N.J.

En otra realización, el método de cebador aleatorio puede usarse para incorporar un análogo, por ejemplo, el análogo de dTTP 5-(N-(N-biotinil-épsilon-aminocaproil)-3-aminoalil)desoxiuridina trifosfato, en la molécula de sonda. El oligonucleótido de sonda biotinilado puede detectarse por reacción con proteínas de unión a biotina, tales como avidina, estreptavidina y anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos anti-biotina) acoplados a colorantes fluorescentes o enzimas que producen reacciones de color.

En una realización adicional, la determinación de los niveles de expresión de un miARN puede lograrse usando la técnica de hibridación “in situ". Esta técnica requiere menos células que la técnica de transferencia de tipo Northern e implica depositar células completas en un cubreobjetos de microscopio y sondear el contenido de ácido nucleico de la célula con una disolución que contenga sondas de ácido nucleico radiactivo o marcado de otro modo (por ejemplo, ADNc o ARN). Esta técnica es particularmente adecuada para analizar muestras de biopsia de tejido de sujetos. La práctica de la técnica de hibridación in situ se describe con más detalle en la patente estadounidense n.° 5.427.916.

El número relativo de transcritos de genes miARN en las células también puede determinarse mediante la transcripción inversa de los transcritos de genes miARN, seguido por la amplificación de los transcritos de transcripción inversa mediante la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR). Los niveles de transcritos de genes miARN pueden cuantificarse en comparación con un patrón interno, por ejemplo, el nivel de ARNm de un gen “de mantenimiento” presente en la misma muestra. Un gen “de mantenimiento” adecuado para su uso como patrón interno incluye, por ejemplo, miosina o gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH). Los métodos para RT-PCR cuantitativa y variaciones de los mismos están dentro del conocimiento de la técnica. En otra realización, se usa una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real de bucle en tallo de alto rendimiento (RT-qPCR) para detectar la expresión de miARN. Véase Mestdagh et al., Nucleic Acid Research 36 (21) (2008)).

En algunos casos, puede ser deseable determinar simultáneamente el nivel de expresión de una pluralidad de productos génicos de miARN diferentes en una muestra. En otros casos, puede ser deseable determinar el nivel de expresión de los transcritos de todos los miARN conocidos correlacionados con un cáncer. En un aspecto, la evaluación de niveles de expresión específicos de cáncer para cientos de miARN requiere una gran cantidad de ARN total (por ejemplo, 20 pg para cada transferencia de tipo Northern) y técnicas autorradiográficas que requieren isótopos radiactivos. En otro aspecto, una biblioteca de oligopéptidos, en formato de microchip (es decir, un microalineamiento), puede construirse conteniendo un conjunto de oligodesoxinucleótidos sonda que son específicos para un conjunto de genes de miARN. Usando un microalineamiento de este tipo, el nivel de expresión de miARN múltiples en una muestra biológica puede determinarse mediante transcripción inversa de los ARN para generar un conjunto de oligodesoxinucleótidos diana, e hibridándolos para dar oligodesoxinucleótidos sonda en el microalineamiento para generar un perfil de hibridización o expresión. El perfil de hibridización de la muestra puede compararse luego con el nivel de expresión predeterminado de una muestra de control para determinar que miARN tienen un nivel de expresión alterado en células cancerosas. Tal como se usa en el presente documento, “oligonucleótido sonda” o “oligodesoxinucleótido sonda” se refiere a un oligonucleótido que puede hibridar a un oligonucleótido diana. “Oligonucleótido diana” o “oligodesoxinucleótido diana” se refiere a una molécula que va a detectarse (por ejemplo, a través de hibridización). Se entiende por “oligonucleótido sonda específico de miARN” o “oligonucleótido sonda específico para un miARN” un oligonucleótido sonda que tiene una secuencia seleccionada para hibridar un producto génico de miARN específico, o para transcribir de manera inversa el producto génico de miARN específico.

Un “perfil de expresión” o “perfil de hibridización” de una muestra particular es esencialmente un huella del estado de la muestra; aunque dos estados pueden tener un gen particular expresado de manera similar, la evaluación de varios genes simultáneamente permite la generación de un perfil de expresión génica que es único para el estado de la célula. Es decir, el tejido normal puede distinguirse de un tejido canceroso, y dentro de un tejido canceroso, pueden determinarse diferentes estados de pronóstico (buenas o malas perspectivas de supervivencia a largo plazo, por ejemplo). Comparando los perfiles de expresión de un tejido canceroso en diferente estados, se obtiene información en cuanto a que genes son importantes (incluyendo regulación tanto por incremento como por disminución de genes) en cada uno de estos estados. La identificación de secuencias que se expresan de manera diferencial en un tejido canceroso o tejido normal, así como la expresión diferencial que da como resultado diferentes resultados de pronóstico, permite el uso de esta información de varias maneras. Por ejemplo, puede evaluarse un régimen de tratamiento particular (por ejemplo, para determinar si un quimioterápico actúan para mejorar el pronóstico a largo plazo en un paciente particular). De manera similar, el diagnóstico puede realizarse o confirmarse comparando muestras de paciente con los perfiles de expresión conocidos. Además, estos perfiles de expresión génica (o genes individuales) permiten la selección de candidatos farmacológicos que suprimen el perfil de expresión de cáncer o convertir un mal perfil de pronóstico en un mejor perfil de pronóstico.

El microalineamiento puede prepararse a partir de sondas de oligonucleótidos específicas de genes a partir de secuencias de miARN conocidas, incluyendo miR-18b. En un aspecto, el alineamiento contiene dos sondas de oligonucleótidos diferentes para cada miARN, una que contiene la secuencia madura activa y la otra que es específica para el precursor del miARN. El alineamiento también puede contener controles, tales como una o más secuencias de ratón que difieren de ortólogos humanos en sólo unas pocas bases, que pueden servir como controles para las condiciones de rigurosidad de hibridización. Los ARNt de ambas especies también pueden imprimirse en el microchip, proporcionando un control positivo, relativamente estable, interno para la hibridización específica. Uno o más controles apropiados para la hibridación no específica también pueden incluirse en el microchip. Para este fin, se seleccionan secuencias basándose en la ausencia de cualquier homología con cualquiera de los miARN conocidos.

El microalineamiento puede fabricarse usando técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, oligonucleótidos sonda de una longitud apropiada se modifica con 5'-amina en la posición C6 y se imprimen usando sistemas de microalineamiento disponibles comercialmente, por ejemplo, los portaobjetos activados GENEMACHINE, OMNIGRID 100 MICROARRAYER y AMERSHAM CODELINK. El oligómero de ADNc marcado correspondiente a los ARN diana se prepara mediante transcripción inversa del ARN diana con un cebador marcado. Después de la síntesis de la primera cadena, los híbridos de ARN/ARN se desnaturalizan para degradar los moldes de ARN. Los ADNc diana marcados así preparados se hibridan luego para dar el chip de microalineamiento en condiciones de hibridación, por ejemplo, 6 x SSPE/formamida al 30% a 25°C durante 18 horas, seguido por lavado en 0,75 x TNT a 37°C durante 40 minutos. En las posiciones en el alineamiento en las que el ADN de sonda inmovilizado reconoce un ADNc diana complementario en la muestra, se produce la hibridización. El ADNc diana marcado marca la posición exacta en el alineamiento en la que se produce la unión, permitiendo la detección y cuantificación automática. La salida consiste en una lista de eventos de hibridización, que indica la abundancia relativa de las secuencias de ADNc específicas y, por tanto, la abundancia relativa del miARN complementario correspondiente, en la muestra del paciente. Según un aspecto, el oligómero de ADNc marcado es un ADNc marcado con biotina, preparado a partir de un cebador marcado con biotina. Luego se procesa el microalineamiento mediante detección directa de los transcritos que contienen biotina usando, por ejemplo, conjugado ESTREPTAVIDINA-ALEXA647, y realizando un barrido utilizando métodos de barrido convencionales. Las intensidades de imagen de cada punto en el alineamiento son proporcionales a la abundancia del miARN correspondiente en la muestra del paciente.

Además de su uso para ensayos de nivel de expresión cuantitativa de un miARN específico, puede emplearse un microchip que contenga oligonucleótidos sonda específicos de miARN correspondientes a una porción sustancial del miRNoma, preferiblemente el miRNoma completo, para llevar a cabo el perfilado de expresión génica de miARN, para el análisis de patrones de expresión de miARN. Las distintas firmas de miARN pueden asociarse con marcadores de enfermedad establecidos o directamente con un estado patológico.

Según los métodos de perfilado de la expresión descritos en el presente documento, el ARN total de una muestra de un sujeto sospechoso de tener cáncer (por ejemplo, melanoma) se transcribe cuantitativamente de manera inversa para proporcionar un conjunto de oligodesoxinucleótidos diana marcados complementarios al ARN de la muestra. A continuación, los oligodesoxinucleótidos diana se hibridan con un microalineamiento que comprende oligonucleótidos sonda específicos de miARN para proporcionar un perfil de hibridación para la muestra. El resultado es un perfil de hibridación para la muestra que representa el patrón de expresión de miARN en la muestra. El perfil de hibridación comprende la señal de la unión de los oligodesoxinucleótidos diana de la muestra a los oligonucleótidos sonda específicos de miARN en el microalineamiento. El perfil puede registrarse como la presencia o ausencia de unión (señal frente a señal cero). Más preferiblemente, el perfil registrado incluye la intensidad de la señal de cada hibridación. El perfil se compara con el perfil de hibridación generado a partir de una muestra de control. Una alteración en la señal es indicativa de una respuesta a la quimioterapia en el sujeto.

Otras técnicas para medir la expresión génica de miARN también se encuentran dentro de la experiencia en la técnica, e incluyen diversas técnicas para medir las tasas de transcripción y degradación del ARN, que incluyen ensayos de protección de ARNasa, ensayos de run-on nuclear, inmunotransferencia por ranuras, etc.

En otra realización, la divulgación proporciona un método para pronosticar la presencia de un cáncer en un sujeto. El método comprende la etapa de determinar si un miR-18b se sobreexpresa o subexpresa o no en una muestra biológica del sujeto, en relación con la expresión de miR-18b de una o más muestras de control. En una realización particular, el nivel de subexpresión de miR-18b de una muestra biológica del sujeto en comparación con una muestra de control biológica indica si la muestra del sujeto es maligna. En una realización adicional, dicha neoplasia maligna es melanoma.

En aún otro aspecto descrito en el presente documento, la divulgación proporciona un método de determinación de la progresión de cáncer en un sujeto. El método comprende la etapa de medir el nivel de expresión de miR-18b de muestras biológicas tomadas del paciente que tiene un cáncer en diversos puntos de tiempo, de manera que el cambio en el nivel de expresión de miR-18b entre muestras de los diferentes puntos de tiempo indica la progresión o recuperación del cáncer en el sujeto. En un aspecto particular, si el nivel de subexpresión de miR-18b se aumenta entre puntos de tiempo anteriores y posteriores (es decir, el nivel de miR-18b está disminuyendo adicionalmente o permanece igual) indica que el cáncer del sujeto está progresando a estadios posteriores. En una realización alternativa, si el nivel de subexpresión de miR-18b está disminuyendo (es decir, el nivel de miR-18b está aumentando) entre puntos de tiempo anteriores y posteriores indica que el cáncer del sujeto está en el proceso de recuperación. En una realización adicional, dicho cáncer es melanoma.

En aún otro aspecto, la divulgación proporciona un método de determinación de la tasa de supervivencia de un sujeto con cáncer. El método comprende la etapa de medir el nivel de expresión de miR-18b de muestras biológicas tomadas del paciente que tiene un cáncer en diversos puntos de tiempo, de manera que el cambio en el nivel de expresión de miR-18b entre muestras de los diferentes puntos de tiempo indica una disminución o un aumento de la tasa de supervivencia del sujeto. En un aspecto particular, si el nivel de subexpresión de miR-18b está aumentando entre puntos de tiempo anteriores y posteriores indicaría que la tasa de supervivencia del sujeto está disminuyendo. En un aspecto alternativo, si el nivel de subexpresión de miR-18b está disminuyendo entre puntos de tiempo anteriores y posteriores indicaría que la tasa de supervivencia del sujeto está mejorando. En un aspecto adicional, dicho cáncer es melanoma.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un kit para determinar la probabilidad de que un sujeto tenga cáncer y/o la progresión del cáncer, comprendiendo dicho kit: a) un oligonucleótido complementario a miR-18b; y b) opcionalmente, reactivos para la formación de la hibridización entre dicho oligonucleótido y miR-18b. En otro aspecto, el kit incluye opcionalmente instrucciones para monitorizar los niveles de moléculas de ácido nucleico de un marcador en una muestra biológica derivada de un sujeto. En otro aspecto, el kit comprende un recipiente estéril que contiene el cebador, la sonda u otros reactivos de detección; tales recipientes pueden ser cajas, ampollas, frascos, viales, tubos, bolsas, bolsitas, envases alveolados, u otra forma de recipiente adecuada conocida en la técnica. Tales recipientes pueden fabricarse de plástico, vidrio, papel laminado, lámina metálico, u otros materiales adecuados para contener ácidos nucleicos. Las instrucciones incluirán generalmente información sobre el uso de los cebadores o sondas descritos en el presente documento y su uso en el diagnóstico de un cáncer. Preferiblemente, el kit comprende además uno cualquiera o más de los reactivos descritos en los ensayos de diagnóstico descritos en el presente documento. En otros aspectos, las instrucciones incluyen al menos uno de los siguientes: descripción del cebador o la sonda; métodos para el uso de los materiales adjuntos para el diagnóstico de un cáncer; precauciones; advertencias; indicaciones; estudios clínicos o de investigación; y/o referencias. Las instrucciones pueden imprimirse directamente en el recipiente (cuando esté presente), o como una etiqueta aplicada al recipiente, o como una hoja, folleto, tarjeta o carpeta independiente suministrada en o con el recipiente.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un aparato para determinar los niveles de expresión de miR-18b, comprendiendo dicho aparato un soporte sólido, en el que una superficie de dicho soporte sólido se une a un oligonucleótido complementario a miR-18b. En un aspecto, el aparato es un microalineamiento. Los ejemplos de soporte sólido incluyen, pero no se limitan a, un portaobjetos de vidrio o nitrocelulosa que se usa para unir ácidos nucleicos.

Los siguientes ejemplos están destinados a ilustrar pero no limitar la divulgación. Si bien son típicos de los que podrían usarse, pueden usarse alternativamente otros procedimientos conocidos por los expertos en la técnica.

Ejemplos

Cultivo celular, plásmidos y transfección. Se obtuvieron y se propagaron las líneas de células de melanoma DO4, WM3211, 1205-Lu, C8161,9, WM278 y Lox tal como se describe en Dar et al., J Biol Chem 286:16606-14 (2011). Se adquirieron melanocitos humanos normales (HEM) de Lifeline cell technology y se hicieron crecer en medio LL-0027 (Lifeline cell technology, Walquersville MD). Se adquirieron vector de control nulo pEP-miR (pEP Null) miRNASelect™ de plásmidos, vector de expresión pEP-hsa-miR-18b miRNASelect™ (pEP miR-18b) (Cell Biolabs Inc, San Diego CA). Se adquirieron sondas TaqMan para hsa-miR-18b y pre-miR de control negativo (cont. miR) de Applied Biosystems (Foster City, CA). Se trataron las células subconfluentes (confluentes al 60-70%) con 5-AZA-2'-desoxicitidina (5AZA) (Sigma Aldrich, St. Louis MO) disuelta en dimetilsulfóxido. Las células tratadas con vehículo sirvieron como control. Se llevaron a cabo transfecciones transitorias mediante Lipofectamine-2000 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) siguiendo el protocolo del fabricante.

Extracción de ARN, ARN y miARN de muestras de tejido y líneas celulares. Se obtuvieron muestras de pacientes con melanoma (n=92) y nevos benignos (n=48) según un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional. Se extrajeron ARN y miARN tal como se describió previamente en Dar et al., J Biol Chem 286:16606-14 (2011).

PCR en tiempo real cuantitativa. Se evaluaron los miARN maduros y otros ARNm usando el ensayo de microARN y el ensayo de expresión génica TaqMan (Applied Biosystems), respectivamente, tal como se describió previamente en Dar et al., J Biol Chem 286:16606-14 (2011).

Modificación con bisulfito de sodio y secuenciación. Se analizó el estado de metilación dentro de la región de 2,5 kB en el sentido de 5' del gen miR-18b. Se realizó modificación con bisulfito del ADN usando el kit de bisulfito Epi-Tect (Qiagen, Valencia CA) siguiendo el protocolo del fabricante y tal como se describió previamente en Majid et al., Carcinogenesis 30:662-70 (2009). Se diseñaron los cebadores usando el programa en línea Meth Primer (Li et al., Bioinformatics 18: 1427-31 (2002)). Los cebadores específicos metilados y no metilados usados en el presente documento se presentan en la tabla 1:

Tabla 1.

Viabilidad celular, formación de colonias y citometría de flujo. Se realizó el análisis de la viabilidad celular, formación de colonias y citometría de flujo tal como se describió previamente en Dar et al., J Biol Chem 286:16606-14 (2011); y Dar et al., J Invest Dermatol 130:2071-9 (2010)).

Análisis de inmunotransferencia de tipo Western. Se prepararon lisados celulares en PBS que contenían 1 x cóctel de inhibidores de proteasas Halt y 1 x cóctel de inhibidores de fosfatasas Halt (Pierce, Rockford, IL), se centrifugaron 3500 r.p.m. durante 10 min a 4°C. Se sometieron las proteínas (10-15 ug) de cada muestra a electroforesis en gel de SDS/poliacrilamida (PAGE) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Se detectaron las proteínas diana usando anticuerpos específicos contra MDM2, p53, p21, BCL-2 y GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), y PUMA, BCL-XL (Cell Signaling Technology, Danvers, mA).

Ensayos de luciferasa. Se clonó la región 3'-UTR de MDM2 que contiene secuencias de sitios diana complementarias la secuencia semilla de miR-18b en el sentido de 3' del gen de luciferasa en el vector de luciferasa pMIR-REPORT (Ambion, Cambridge MA), y se denominaron los vectores resultantes MDM2-3'UTR. Se clonaron secuencias mutadas de 3'UTR de MDM2 complementarias a miR-18b en el mismo vector y los vectores resultantes se denominaron MDM2-Mut 3'UTR. Para los ensayos indicadores, se transfirieron de manera transitoria células con plásmido indicador de tipo natural o mutante y miR-18b. Se midieron las actividades de luciferasa de luciérnaga usando el ensayo dual de luciferasa (Promega, Madison, WI) 48 h después de la transfección y se normalizaron los resultados con luciferasa de Renilla. Se transfectó cada plásmido indicador al menos tres veces (en días diferentes) y se sometió a ensayo cada muestra por triplicado. Ensayo de invasión y migración. Para células 1205-Lu, se recubrieron los insertos de la cámara de Boyden con 15 |il de Matrigel en proteína 6 mg/ml. Para el ensayo de migración, no se recubrieron los insertos de la cámara de Boyden y se añadieron directamente las células a los mismos.

Generación de células estable y estudio in vivo. Se transfectaron células 1205-Lu con vectores pEP Null o pEP miR-18b (Cellbiolabs, San Diego CA) y se seleccionaron con puromicina (1 |ig/ml). Para los estudios in vivo tal como se describieron previamente en Dar et al., J Invest Dermatol 130:2071-9 (2010), se inyectaron 1 x 106 células en ratones desnudos por vía subcutánea y se siguió el crecimiento tumoral durante 24 días. Todo el cuidado de los animales se realizó de acuerdo con las pautas institucionales.

Ensayo de inmunofluorescencia. Se sembraron células 1205-Lu en una cámara de placas de 8 pocillos. Se realizó el ensayo de inmunofluorescencia tal como se describió anteriormente en Dar et al., Oncogene 28: 866­ 75 (2009). Se usaron anticuerpos contra W-cadherina, vimentina, slug y E-cadherina (Cell signaling) en el ensayo.

Análisis de inmunoprecipitación con cromatina. Se realizó el análisis de inmunoprecipitación con cromatina usando el kit EZ-ChIP (Upstate Biotechnology, Charlottesville, VA) según las instrucciones del fabricante y tal como se describió en Majid et al., Carcinogenesis 30: 662-70 (2009). Los anticuerpos usados en las inmunoprecipitaciones se adquirieron de Upstate Biotechnology y Ambion (Austin, TX) y eran específicos para acetil-histona H3 (06-599), acetil-histona H4 (06-866), dimetil-histona H3 lisina 4 (07-030), trimetil-histona H3 lisina 4(07-473), dimetil-histona H3 lisina 9 (07-441) y trimetil-histona H3 lisina 9 (ab8898). Se eluyó el ADN inmunoprecipitado en un volumen total de 50 |il y se usaron 2 |il para PCR. La secuencia de cebadores usada para la PCR se presenta en la tabla 2:

Tabla 2

Análisis estadístico. Todos los datos cuantificados representan un promedio de al menos muestras por triplicado o tal como se indica. Las barras de error representan un error estándar de la media. La significación estadística se determinó mediante la prueba de la t de Student y valores de p bilaterales <0,05 se consideraron significativos. El análisis de Kaplan-Meier (prueba del rango logarítmico) se realizó usando el software Prism 5 (Graphpad Software Inc., CA).

Expresión de miR-18b en melanocitos y células de melanoma. Se determinó el patrón de expresión de los miARN en el melanoma realizando un microalineamiento de miARN en un pequeño número de muestras de nevos (n=5) y de tumor de melanoma (n=10) usando la plataforma Agilent. Se encontró que miR-18b se regulaba por disminución significativamente en muestras de melanoma en comparación con los nevos. Para validar los resultados del microalineamiento, se realizó un análisis de RT-PCR cuantitativa de miARN (qRT-PCR de miR) en una cohorte independiente de tejidos de nevos y melanoma. La qRT-PCR de miR de muestras de nevos (n=48) y de melanoma (n=92) indicaron que la expresión de miR-18b se regula por disminución significativamente en melanomas cuando se compara con los nevos (véase la figura 1A).

Mediante la realización del análisis de Kaplan-Meier, se encontraron niveles bajos de miR-18b en muestras cutáneas de melanoma primario que se asociaron con una tasa de supervivencia global significativamente reducida (véase la figura 1B, p<0,04). Luego se determinaron los niveles de expresión de miR-18b en un panel de líneas de células de melanoma humano y melanocitos normales. Los resultados indican que había una regulación por disminución significativa en la expresión de miR-18b en células de melanoma en comparación con melanocitos normales (véase la figura 1C). Por consiguiente, los datos sugieren que miR-18b se regula por disminución en muestras y líneas celulares que contienen células de melanoma, y que midiendo los niveles de expresión de miR-18b de un sujeto un médico podría evaluar la progresión o estadio del melanoma en el sujeto.

El miR-18b se silencia en melanoma a través de la hipermetilación de CpG. Para entender el mecanismo que subyace en la supresión de la expresión de miR-18b en melanoma, se realizaron análisis de metilación de la secuencia de 2,5 kb en el sentido de 5' de miR-18b. Empleando el software Methprimer, se observaron varias regiones ricas en CpG (véase la figura 2A). Además, el tratamiento de cinco líneas de células de melanoma con el agente de desmetilación 5-aza-desoxicitidina (5AZA, 5 pM) dio como resultado una regulación por incremento significativa de la expresión de miR-18b, lo que sugiere un posible papel para la metilación en su supresión (la figura 2B). Para investigar el estado de metilación de líneas de células de melanoma y muestras de tumores, se diseñaron cebadores que seleccionan como diana miR-18b metilado y no metilado. Tal como se muestra en la figura 2C, se observó una banda metilada distinta en cinco líneas de células de melanoma y treinta muestras de tumores. Por el contrario, la banda no metilada en líneas de células de melanoma y muestras de tumor estuvo o bien ausente o era débil. Para determinar si había modificaciones con cromatina covalentes tras la sobreexpresión de miR-18b, se realizó un análisis de inmunoprecipitación con cromatina. La sobreexpresión de miR-18b dio como resultado un enriquecimiento de histonas acetiladas H3, H4 y H3 dimetilada lisina 4 (véase la figura 2C-D), indicativo de la activación génica. En cambio, se observó supresión de modificaciones con cromatina represoras (2H3K9 y 3H3K9) tras la sobreexpresión de miR-18b (véase la figura 2C-D). Estos hallazgos demuestran que miR-18b se silencia por hipermetilación en líneas de células de melanoma y muestras de tumores, y que su sobreexpresión se asocia con el enriquecimiento de modificaciones de histona activas. Por consiguiente, los datos sugieren que impidiendo, inhibiendo o invirtiendo la hipermetilación de miR-18b en células de melanoma podría proporcionarse un efecto beneficioso terapéutico en sujetos con melanoma.

MDM2 como diana de miR-18b. Para identificar células efectoras de miR-18b, se usaron diversos algoritmos que predicen dianas de ARNm, e identificaron MDM2 como una supuesta diana, ya que la secuencia semilla de miR-18b era complementaria a la 3'UTR de MDM2 (véase la figura 3A). Para investigar la correlación entre expresión de miR-18b y la de MDM2, se determinó la expresión de MDM2 en el ARNm y los niveles de proteínas en el mismo panel de líneas celulares. Los niveles de expresión de MDM2 eran mayores en células de melanoma cuando se compararon con la línea de melanocitos normales (véase la figura 3B), aunque el nivel absoluto de expresión varió entre las diferentes líneas de células de melanoma. Estos datos demuestran una correlación inversa entre la expresión de miR-18b y la de MDM2, lo que sugiere MDM2 como diana de miR-18b.

A continuación, se clonó la 3'UTR de MDM2 que alberga la secuencia complementaria a la secuencia semilla de miR-18b en un vector plasmídico indicador. En paralelo, se clonó una secuencia de 3'UTR mutada en el mismo plásmido indicador. La transfección conjunta transitoria del constructo MDM2-3'UTR junto con miR-18b en células de melanoma humano 1205-Lu y LOX condujeron a una disminución significativa en la expresión indicadora cuando se compara con el vector de control (véase la figura 3C-D). Estos resultados indican que los nucleótidos conservados en la 3'UTR de MDM2 eran responsables de la selección como diana in vitro de miR-18b. La sobreexpresión transitoria de miR-18b (véase la figura 3E) suprimió significativamente MDM2 al nivel de proteínas, con una regulación por incremento concomitante de los genes proapoptóticos genes p53 y PUMA, y la regulación por disminución de los genes antiapoptóticos BCL2 y BCL-XL) (véase la figura 3F). Curiosamente, la sobreexpresión de miR-18b no tuvo ningún efecto sobre la supervivencia celular, los niveles de expresión de MDM2 y p53 en líneas de células de melanoma C8161.9 que albergan p53 mutante al contrario que 1205-Lu y LOX, que tiene p53 de tipo natural. El cisplatino indujo la expresión de miR-18b, y las células de melanoma tratadas con miR-18b mostraron un aumento de la sensibilidad a la citotoxicidad del cisplatino. Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que MDM2 (y la ruta de p53) es una diana de la acción de miR-18b en el melanoma.

miR-18b regula la proliferación celular, formación de colonias y apoptosis del melanoma. A continuación, se sometieron a ensayo los efectos funcionales de la regulación por disminución dirigida por miR-18b de MDM2 y la posterior inducción de genes proapoptóticos. La transfección transitoria de células 1205-Lu con miR-18b dio como resultado una proliferación celular significativamente disminuida a lo largo del tiempo (véase la figura 4A) en comparación con las células que expresan una secuencia de miR de control (cont.miR). Los efectos de miR-18b sobre la viabilidad de las células de melanoma célula se examinaron luego usando un ensayo de formación de colonias. Las células 1205-Lu transfectadas con miR-18b mostraron baja capacidad de formación de colonias, ya que tanto el tamaño como el número de focos en células que expresan miR-18b se suprimieron cuando se compara con células que expresan cont.miR (véase la figura 4B). El análisis del ciclo celular reveló una disminución significativa en la fase S (del 15,5% al 8,05%, p<0,02) de células1205-Lu que sobreexpresan miR-18b en comparación con células que expresan cont. miR (véase la figura 4C). La sobreexpresión de miR-18b indujo apoptosis en células 1205-Lu en comparación cont.miR (del 2,87% al 11,30%, p<0,01) (véase la figura 4D). Para confirmar el efecto de miR-18b sobre la proliferación celular y apoptosis del melanoma, se transfectó miR-18b en células de melanoma humano LOX. Tal como se muestra en la figura 5A-D, no hubo una disminución en la proliferación celular, formación de colonias y fase S, junto con un aumento en la apoptosis, en células LOX transfectadas con miR-18b. Estos resultados confirman los efectos fenotípicos de la sobreexpresión de miR-18b en células de melanoma humano.

Los efectos de la sobreexpresión de miR-18b sobre células de melanoma está mediada por la regulación de la expresión MDM2. Para explorar además el papel de MDM2 como diana de miR-18b, se transfectaron conjuntamente con células 1205-Lu con miR-18b así como MDM2, y se examinaron sus efectos sobre la expresión génica y la supervivencia de las células de melanoma. La transfección conjunta de miR-18b y un control de vector vacío dio como resultado la supresión de MDM2, la activación de la ruta p53, y suprimió la supervivencia de células de melanoma, cuando se compara con la transfección conjunta del cont. miR y los vectores vacíos. Estos efectos se invirtieron en gran medida tras la transfección conjunta del miR-18b y los vectores que expresan MDM2. Estos resultados indican que los efectos de miR-18b en la expresión génica en el sentido de 3' y la proliferación celular del melanoma están mediadas en gran medida por su inhibición de la expresión de MDM2.

La sobreexpresión estable de miR-18b inhibe la supervivencia celular, formación de colonias, y crecimiento de células tumorales in vivo. Luego se estudiaron los efectos de la expresión estable de miR-18b en el melanoma. Se generaron células 1205-Lu que expresan de manera estable miR-18b, y se confirmó la sobreexpresión de miR-18b mediante análisis de qRT-PCR de miR (véase la figura 6A). La proliferación celular de células 1205-Lu que expresan miR-18b se suprimió significativamente en comparación con las células que expresan el vector de control (véase la figura 6B). Las células que sobreexpresan miR-18b tuvieron una disminución significativa en la formación de colonias (véase la figura 6C) y las células en fase S (véase la figura 6D) en comparación con las células que expresan el vector de control. La sobreexpresión de miR-18b dio como resultado un aumento significativo en el índice apoptótico de las células 1205-Lu (véase la figura 6E). Además, se reguló por disminución significativamente MDM2 en células que sobreexpresan miR-18b, con un aumento concomitante en la expresión de p53 y PUMA (véase la figura 6F). La sobreexpresión estable de miR-18b suprimió significativamente el crecimiento tumoral in vivo tras la inoculación subcutánea en ratones desnudos en comparación con células que expresan vector de control (véase la figura 6G). Se suprimió MDM2 al nivel de proteínas en tumores que sobreexpresan miR-18b en comparación con tumores de control (véase la figura 6H). Estos resultados confirman que miR-18b es un supresor de tumores y tiene efectos beneficiosos sobre el eje MDM2-p53. Además, los resultados demuestran que las terapias que comprenden polinucleótidos que comprenden miR-18b y/o agentes que potencian la expresión de miR-18b pueden ser eficaces en el tratamiento del cáncer.

El cisplatino induce la expresión de miR-18b. Las células de melanoma son muy resistentes a los quimioterápicos convencionales. Dado que miR-18b reguló por incremento la expresión de p53 a través de MDM2, y dados los efectos conocidos de p53 en la mediación de la apoptosis inducida por quimioterapia (Li et al., Melanoma Res 8:17-23 (1998)), se investigó la posible interacción entre quimioterápicos y la expresión de miR-18b. El tratamiento de células 1205-Lu con cisplatino 2 nM durante 48 h dio como resultado una expresión significativamente regulada por incremento de miR-18b en comparación con las células tratadas con vehículo (véase la figura 7A). Además, la sobreexpresión de miR-18b y el tratamiento con cisplatino dio como resultado la supresión de la proliferación de células de melanoma en un grado significativo (véase la figura 7B). Además, los resultados demuestran que un efecto sinérgico en el tratamiento del cáncer puede alcanzarse combinando terapias basadas en la elevación de los niveles de miR-18b en un sujeto con otros agentes anticangerígenos conocidos.

miR-18b suprime la migración celular e invasividad del melanoma, e invierte la transición epitelial a mesenquimatosa (EMT). Se estudiaron los efectos de miR-18b sobre la migración y el comportamiento invasivo de células de melanoma 1205-Lu, un tipo de célula muy invasiva. La sobreexpresión de miR-18b suprimió significativamente la capacidad migratoria e invasividad de células de melanoma 1205-Lu (véase la figura 8A-B). Luego se analizaron los posibles efectos de miR-18b sobre la EMT, dado su rol en el comportamiento invasivo y

Claims (4)

REIVINDICACIONES

1. Método de detección de una expresión disminuida de miR-18b y de una metilación aumentada de la región de 2,5 kilobases (kB) en el sentido de 5' de miR-18b en una muestra biológica de tejido de un sujeto, que comprende:

(i) medir el nivel de expresión de miR-18b en la muestra biológica de tejido y determinar el estado de metilación de la región de 2,5 kB en el sentido de 5' del gen miR-18b en la muestra usando cebadores específicos de metilación tras el tratamiento con bisulfito, en el que los cebadores específicos de metilación consisten en la secuencia de SEQ ID NO: 4 y 5;

(ii) comparar el nivel de expresión de miR-18b en la muestra del sujeto con el nivel medio de expresión de miR-18b de una o más muestras biológicas de control;

(iii) identificar si el nivel de expresión para miR-18b en la muestra está disminuido en comparación con el nivel medio de expresión para miR-18b en una o más muestras de control, y determinar si la muestra tiene metilación aumentada para la región de 2,5 kB en comparación con el estado de metilación para la región de 2,5 kB en la una o más muestras de control.

2. Método según la reivindicación 1, mediante el cual la muestra biológica del sujeto es de una biopsia de tejido.

3. Método según la reivindicación 1, mediante el cual la una o más muestras biológicas de control son de biopsias de tejido de nevos benignos, preferiblemente en el que las muestras biológicas de control comprenden muestras del sujeto; o en el que las muestras biológicas de control comprenden muestras que son de un sujeto diferente.

4. Método según la reivindicación 1, que comprende además:

proporcionar un pronóstico de que el sujeto puede tener un melanoma basándose en identificar que el nivel de expresión para miR-18b en la muestra del sujeto está disminuido en comparación con el de una o más muestras de control, e identificar que la muestra del sujeto tiene metilación aumentada para la región de 2,5 kB en comparación con la una o más muestras de control.