ES2872377T3 - Nanopartículas de protamina/ARN para inmunoestimulación - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que contiene nanopartículas de un tamaño medio de 450 a 990 nm que comprende protamina y ARN para usar en inmunoestimulación.

Description

DESCRIPCIÓN

Nanopartículas de protamina/ARN para inmunoestimulación

La presente invención se refiere a nanopartículas de protamina/ARN inmunoestimulantes de un tamaño medio definido, a una composición farmacéutica que contiene dichas nanopartículas y a un método de producción de las mismas. Las nanopartículas de la presente invención son particularmente útiles como medicamento inmunoestimulante con un patrón preciso de inmunoestimulación diferente del de la técnica anterior.

Antecedentes de la invención

Además de su papel principal como portadores de la información genética, recientemente, se ha reconocido que determinadas moléculas de ácido nucleico son patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP, Pathogen-Associated Molecular Patterns), y se han utilizado como agentes para la estimulación de respuestas inmunitarias innatas del hospedador. Entre estas moléculas de ácido nucleico inmunoestimulantes se incluyen desoxinucleótidos (ADN) que comprenden el motivo CpG no metilado (OligoDesoxiNucleótido CpG: ODN CpG) y ribonucleótidos (ARN) en forma de ARN bicatenarios (ARNbc) y moléculas de ARN monocatenario (ARNmc) protegidas o modificadas químicamente de otra manera. Se sabe que las diferentes familias de PAMP de ácidos nucleicos (es decir, ODN CpG, ARNbc y ARNmc estabilizados) producen diferentes receptores de tipo Toll (TLR, Toll-Like Receptors) expresados por poblaciones celulares no solapantes (Jarrossay et al., 2001, "Specialization and complementarity in microbial molecule recognition by human myeloid and plasmacytoid dendritic cells". Eur. J Immunol. 31: 3388-3393) y dan lugar a diferentes tipos de respuestas inmunitarias innatas caracterizadas por la secreción de un grupo específico de citocinas. Sin embargo, el ADN como adyuvante o como vehículo de administración de vacunas puede provocar problemas de seguridad, por ejemplo, debido al riesgo de integración del ADN dentro del genoma celular, lo que provoca mutaciones que desregulan la expresión génica (inducen o impiden una expresión génica). Dichas mutaciones también pueden ser transformantes, lo que conlleva un grave riesgo de provocar cáncer en el paciente.

Asimismo, el ODN CpG, la versión sintética del ADN bacteriano para la inmunoestimulación, o el ADN bacteriano pueden generar efectos secundarios graves debido a la sobrestimulación del sistema inmunitario (véase p. ej., Heikenwalder et al., (2004) Nat. Med. 10:187-192) lo que se sabe que produce esplenomegalia en ratones (Montheith et al., Anticancer Drug Res. 1997, 12 (5): 421-432). Además, las moléculas de ADN se degradan de forma relativamente lenta en el torrente sanguíneo y, como tales, pueden provocar la formación de autoanticuerpos (Gilkeson et al., J. Clin. Invest. 1995, 95: 1398-1402).

Recientemente, se ha demostrado que el ARN estabilizado en forma de ARN mensajero (ARNm) condensado sobre el péptido catiónico natural protamina o los OligoRriboNucleótidos (ORN) sintéticos con una estructura principal de fosforotioato son señales de peligro para las células presentadoras de antígeno (APC, Antigen-Presenting Cells) de ratón (véase Scheel et al., "Immunostimulating capacities of stabilized RNA molecules". Eur. J. Immunol. 2004. 34: 537-547, documento EP1806139 B1 para los oligonucleótidos de ARN modificados químicamente y el documento EP1818409 B1 para el ARNm protegido con protamina).

El documento WO2005/016376 desvela una composición farmacéutica que contiene células sanguíneas transfectadas con al menos un ARNm que codifica al menos un antígeno. Los documentos WO03/051401 y WO2007/121347 desvelan composiciones a base de ARNm. Weyermann et al. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 2005. 59, 431-438, describen nanopartículas de albúmina-protamina-oligonucleótido como un nuevo sistema de administración no codificante. Hoerr et al. European Journal of Immunology. 2000. 30, 1-7, desvelan un estudio sobre la eficacia de las vacunas a base de ARN. Li y Huang. Molecular Pharmaceutics. 2006. 3 (5), 579­ 588, aportan un informe sobre la administración dirigida de oligonucleótidos no codificantes y de ARNip en células de cáncer de pulmón.

En otros informes, en lugar de protamina, se utilizan lípidos catiónicos o PoliEtilenImina (PEI) para proteger y ^{transfectar el ARN. En Heil et al., "Species-specific recognition of single-stranded RNA via Toll-like receptor 7 and} 8^{". Science, 2004. 303: 1526-1529, y en el documento WO 03/086280 A2, se identificaron el TLR-7 de ratón y el TLR}-8 humano como receptores de ORN fosforotioato administrados a través de liposomas. Específicamente, se publicó que los oligonucleótidos de ARNmc ricos en guanosina (G) y en uridina (U) derivados de VIH-1 estimularon la secreción de interferón-a en células dendríticas y macrófagos, por lo que se reconoce que los oligonucleótidos de ARNmc (ORN) ^{ricos en GU son una clase de ligandos fisiológicos para TLR-7 y TLR-}8^{. Diebold et al. (2004, "Innate antiviral responses} by means of TLR7-mediated recognition of single-stranded RNA". Science 303:1529-1531) informaron que los ARNmc protegidos con PEI también inducen la producción dependiente de TLR7 de citocinas inflamatorias, y postularon que las células del sistema inmunitario innato son sensibles a los ARNmc endosómicos para detectar la infección por virus de ARN. Los mismos autores demostraron además que los oligonucleótidos de ARN administrados con PEI realizan la estimulación preliminarmente a través de sus restos U. Al mismo tiempo, Hornung et al., (Nat Med. marzo de 2005; 11(3):263-70 y documento EP 1764 107 A1) probaron muchos oligonucleótidos de ARN administrados mediante liposomas catiónicos, y pudieron desarrollar, a partir de estos resultados, un algoritmo que puede predecir la capacidad inmunoestimulante de las secuencias de ARN. Lund et al., "Recognition of single-stranded RNA viruses by Toll-like receptor 7". Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., 2004. 101: 5598-5603, mostraron que los genomas de ARN monocatenario de virus (virus de la gripe, virus de la estomatitis vesicular) son reconocidos por el TLR-7 en ratones. Finalmente, Kariko et al., "mRNA is an endogenous ligand for Toll-like receptor 3". J. Biol. Chem. 2004. 279: 12542-12550, demostraron que el ARNm estabilizado mediante encapsulación en liposomas o mediante modificaciones con fluoro en 2' activa las células dendríticas (CD) a través del TLR-3. Debido a que el ARNmc estabilizado activa la inmunidad innata, se puede utilizar como adyuvante de vacunas como se describe en Scheel et al., para oligonucleótidos de ARN fosforotioato desnudo (Scheel, European Journal of Immunology, 2004) y Bourquin (Bourquin, Blood, 1 de abril de 2007, Vol. 109, n.° 7, pág. 2953-2960) para los oligonucleótidos de ARN encapsulados en liposomas.

Diebold et al., ("Innate antiviral responses by means of TLR7-mediated recognition of single stranded RNA". Science, 2004. 303: 1529-1531) mostraron que las moléculas de ARN protegidas por PEI estimulan las CD plasmocitoides (CDp) de ratón a través del TLR-7.

Más recientemente, Diebold et al. (2006) (Eur. J. Immunol. 36:3256-3267) publicaron que tanto la uridina como la ribosa son necesarias y suficientes para la estimulación del TLR7, y que los ARNmc actúan como agonistas de TLR7 de forma independiente de la secuencia siempre que contengan varias uridinas próximas. Dielbold et al. (2006) mostraron además que, cuando se administró en endosomas, el ARN vírico y autorreplicativo generó la respuesta inmunitaria innata mediada por TLR7 de eficacia similar, apoyando adicionalmente la noción de que la diferenciación entre los ligandos de ARN autorreplicativo y vírico se basa en la accesibilidad endosómica en lugar de una secuencia de ARN. También se ha desvelado recientemente que los ARNm transcritos a partir de los genes de la p-galactosidasa de E. coli o pp65 del CMV, cuando forman complejos con la protamina, pueden inducir inmunidad antitumoral terapéutica en los ratones portadores de tumores (Scheel et al., 2006, Eur. J. Immunol. 36:2807-2816).

Sin embargo, ninguna de las composiciones inmunoestimulantes a base de ARN anteriores es óptima para aplicaciones clínicas debido a que requieren formulaciones con liposomas catiónicos que son inestables in vitro y tóxicos o con PEI que es tóxico (revisado por Hunter A. C. "Molecular hurdles in polyfectin design and mechanistic background to polycation induced cytotoxicity". Adv Drug Deliv Rev. 1 de diciembre de 2006; 58(14):1523-31) o con protamina que aporta grandes agregados heterogéneos (Scheel et al. (2005), Eur. J. Immunol. 35: 1557-1566, véase la Fig. 1 del mismo) que precipitan rápidamente y no son fáciles de coger con una jeringa ni de inyectar (se aglomeran en el tubo y quedan atrapados en la jeringa o en la aguja). Además, la mayoría de estas formulaciones se prepara con oligonucleótidos de ARN modificados que son extraños para el organismo y que pueden generar una respuesta inmunitaria contra la vacuna, es decir, una respuesta de anticuerpos específica de las modificaciones químicas del oligonucleótido. Por tanto, sigue habiendo la necesidad de una formulación inmunoestimulante clínicamente aceptable a base de ARN sin modificar como principio farmacéutico activo. Es objeto de la presente invención proporcionar métodos y composiciones para superar las anteriores deficiencias de la técnica anterior. Dado que se basa en nanopartículas homogéneas bien definidas, la presente "composición de nanopartículas de protamina-ARN inmunoestimulantes" es adecuada para la formulación farmacéutica y para cualquier tipo de inyección, incluyendo la vía intravenosa.

Por otro lado, se sabe que los inmunoestimulantes a base de ácidos nucleicos aumentan, además del nivel de IFN alfa deseable, que es una de las escasas citocinas utilizadas como fármaco (tratamiento de la infección por el virus de la hepatitis C), el nivel de citocinas inflamatorias, tales como el TNF alfa (Tumor Necrosis Factor alfa, factor de necrosis tumoral alfa) (véase, p. ej., la patente de EE. UU. n.° 6.429.199), que se sabe que es tóxico y limitante de la dosis. El TNF alfa es una citocina liberada principalmente por células del sistema inmunitario en respuesta a determinados inmunoestimulantes. Cuando se administra a animales o a seres humanos, provoca inflamación, fiebre, efectos cardiovasculares, hemorragia, coagulación, caquexia y respuestas de fase aguda similares a las observadas durante infecciones agudas, enfermedades inflamatorias y estados de shock. La producción de TNF alfa excesiva o no regulada se ha implicado en una serie de enfermedades. Estas incluyen la endotoxemia y/o el síndrome de choque tóxico [(Tracey, et al., (1990) Nature 330, 662-664 (1987) y Hinshaw, et al., Circ. Shock 30, 279-292)], artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, caquexia [(Dezube, et al., (1990) Lancet, 335 (8690), 662] y lupus. La infusión sistémica de TNFa recombinante dio lugar a cambios observados normalmente en el síndrome de dificultad respiratoria del adulto [(Ferrai-Baliviera, et al., (1989) Arch. Surg. 124(12), 1400-1405)]. El TNF alfa tiene actividades proinflamatorias que, junto con su producción inicial (durante la fase inicial de un episodio inflamatorio), lo convierten en un posible mediador de las lesiones tisulares en varios trastornos importantes que incluyen, aunque no de forma limitativa, infarto de miocardio, ictus y choque circulatorio.

También se ha notificado que el TNF alfa es un potente activador de la replicación de retrovirus incluyendo la activación ^{del VIH-1. [(Duh, et al., Proc. Nat. Acad. Sci.} 86^{, 5974-5978 (1989); Poll, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 87, 782-785} (1990); Monto, et al., Blood 79, 2670 (1990); Clouse, et al., J. Immunol. 142, 431-438 (1989); Poll, et al., AIDS Res. Hum. Retrovirus, 191-197 (1992)].

Scheel et al. (2005; véase la Fig. 3A) publicaron que los agregados de gran tamaño preparados mezclando protamina y ARN en las condiciones de la técnica anterior (es decir, en presencia de sales) inducen una fuerte producción de TNF alfa por células inmunitarias humanas.

A la vista de las deficiencias de las estrategias de la técnica anterior, sería muy deseable tener una composición inmunoestimulante que se pudiera adaptar para la inducción de la producción de IFN alfa/TNF alfa de forma controlada, en particular, para inducir la producción de IFN alfa incluso sin un fuerte aumento del nivel de TNF alfa.

La solución del problema técnico anterior se proporciona mediante las realizaciones de la presente invención como se define en las reivindicaciones.

Sumario de la invención

En particular, de acuerdo con un primer aspecto, la presente invención proporciona nanopartículas de un tamaño medio de 450 a 990 nm que comprenden protamina y ARN. Las nanopartículas de la presente invención son particularmente para usar como un medicamento inmunomodulador, preferentemente, inmunoestimulante.

Por lo tanto, de acuerdo con un segundo aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende dichas nanopartículas de protamina y ARN junto con un excipiente, vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con un tercer aspecto, la presente invención se dirige a un método para la producción de las nanopartículas ^{según lo definido en la reivindicación} 1^{, método que comprende las etapas de:}

(a) proporcionar una solución acuosa de ARN

(1) a 1 mg/ml o más utilizando una solución de electrolitos de 0 a 75 mM; o

(2) a menos de 1 mg/ml utilizando una solución de electrolitos de 0 a 225 mM;

(b) proporcionar una solución acuosa de protamina

(1) a 1 mg/ml o más utilizando una solución de electrolitos de 0 a 75 mM; o

(2) a menos de 1 mg/ml utilizando una solución de electrolitos de 0 a 225 mM; y

^{(c) combinar las soluciones obtenidas en las etapas (a}1^{) y (b}1^{) o mezclar las soluciones obtenidas en (a}2^{) y (b}2^). Preferentemente, las etapas anteriores (a1 y/o a2) se realizan volviendo a suspender una cantidad apropiada de ARN desecado bien (a1) en una solución acuosa que contiene electrolitos de 0 a 75 mM o (a2) en una solución acuosa que contiene electrolitos de 0 a 225 mM.

Preferentemente, las etapas (b1) y/o (b2) anteriores se llevan a cabo diluyendo una solución madre isotónica acuosa de protamina, que preferentemente contiene de 1000 ("protamina 1000") a 5000 ("protamina 5000") unidades neutralizantes de heparina por ml con una solución que contiene bien (1) sales de 0 a 75 mM o (2) sales de 0 a 225 mM. Por ejemplo, las soluciones madre de protamina 1000 y 5000 se comercializan por Valeant Pharmaceuticals International, Aliso Viejo, CA, EE.UU., con las marcas registradas Valeant® 1000 y 5000, respectivamente.

Lo más preferentemente, el método de acuerdo con la presente invención comprende las siguientes etapas:

(a) proporcionar una solución acuosa de ARN a menos de 2 mg/ml en agua pura;

^{(b) proporcionar una solución acuosa de protamina a menos de} 2 ^{mg/ml diluyendo una solución madre isotónica} acuosa que contiene 5000 unidades neutralizantes de heparina de protamina por ml con agua pura; y

(c) combinar las soluciones obtenidas en las etapas (a) y (b).

En este contexto, cabe destacar que, una vez que se forman las nanopartículas de la presente invención, no es necesario seguir manteniendo las condiciones específicas de sal (o electrolito)/concentración para el ARN y la protamina de acuerdo con el método de la presente invención. Por lo tanto, las nanopartículas pueden se pueden procesar adicionalmente, p. ej., recuperándolas finalmente mediante centrifugación y diluyéndolas, disolviéndolas o dispersándolas en un medio, preferentemente un excipiente, vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable, en particular, en un medio isotónico tal como una solución de Ringer o solución de lactato de Ringer.

Las nanopartículas de acuerdo con la invención son particularmente útiles como un medicamento inmunomodulador, preferentemente, inmunoestimulante. Por tanto, la presente invención también se refiere a un método para estimular el sistema inmunitario de un paciente mamífero que comprende la administración de una cantidad eficaz de una composición farmacéutica de la presente invención.

La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que se pueden proporcionar composiciones de protamina y ARN como nanopartículas de tamaño definido diluyendo el ARN (preferentemente, oligonucleótidos o ARNm) y la protamina en agua o soluciones acuosas que tengan baja fuerza iónica (preferentemente sales a menos de aproximadamente 75 mM, más preferentemente sales a menos de 25 mM) y mezclando las dos soluciones (véanse ^{las Fig.} 1 ^{a 3 y la Tabla} 1^{). Este sorprendente hallazgo es contrario a la técnica anterior, en donde la presencia de} concentraciones superiores de electrolitos en el ARN y/o la protamina daba lugar a la producción de partículas y agregados de gran tamaño.

De acuerdo con la presente invención, la expresión "mM de sales" significa la concentración en 10^-3 moles por litro de la suma de todos los electrolitos (incluyendo sales inorgánicas tales como NaCl, KCI, NaH²PO⁴, Na²HPO⁴ , KH²PO⁴, K²HPO⁴, MgCl², MnCl², Na²SO⁴ , K²SO⁴, MgSO⁴ y sales tales como Tris-HCl, EDTA, Hepes, etc.) en las soluciones utilizadas para volver a suspender o diluir una solución madre de ARN y en las soluciones utilizadas para diluir una solución madre de protamina (tal como Protamina 1000 o 5000) antes de mezclar los componentes (es decir, (a1) y ^(b1^{) o (a}2^{) y (b}2^{) como se ha definido anteriormente).}

En el contexto de la presente invención, los términos "sal/es" y "electrolito/s" se utilizan indistintamente y significan un compuesto que está al menos parcialmente disociado en sus respectivos contraiones en agua.

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, las nanopartículas de protamina y ARN se pueden preparar diluyendo tanto el ARN como la protamina (preferentemente a partir de una solución madre tal como ^{protamina 5000) hasta menos de} 2 ^{mg/ml, preferentemente} 1 ^{mg/ml en agua pura, para tener un tamaño medio inferior} a 500 nm, en particular, de 50 a 450 nm. Dichas nanopartículas se pueden utilizar para la inmunoestimulación (o para la preparación de un medicamento para la inmunoestimulación) mediante la inducción fuerte de IFN alfa, pero en menor grado, de TNF alfa (véanse las Fig. 4 y 5). Asimismo, dichas partículas de pequeño tamaño tienen el beneficio ^{adicional de que se pueden inyectar, p. ej., mediante inyección venosa (véase la Fig.} 6^).

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, una proporción en masa de la protamina con respecto al ARN de 1 a 1 o mayor (es decir, más protamina que ARN) da lugar a una inmunoestimulación óptima (Fig. 7), mientras que una proporción de 1 a 4 (es decir, cuatro veces menos protamina que ARN) o inferior da lugar a la ^{expresión del ARNm (Fig.} 8^).

De acuerdo con la presente invención, no se requiere la presencia de una U doble o del doblete UG en el ARN para que los complejos de protamina-ARN estimulen la producción de IFN alfa por las PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cells, células mononucleares de sangre periférica); véase la Fig. 9. Sin embargo, normalmente se prefiere un oligonucleótido que contenga al menos un resto U (véase la Fig. 10). Los oligorribonucleótidos preferidos de la ^{presente invención contienen de} 6 ^{a 100 nucleótidos. Por ejemplo, los oligonucleótidos de 10 restos que forman} complejos con protamina han mostrado estimular las células inmunitarias. La estimulación de las PBMC humanas ha mostrado ser optima con oligonucleótidos de ARN de 16 o más restos (véase la Fig. 11).

Por consiguiente, en una realización, (i) la protamina formulada como una solución a 1 mg/ml gracias a la dilución con agua pura de una solución farmacéutica isotónica de al menos 10 mg/ml (protamina 5000) y (ii) el ARN formulado como una solución a 1 mg/ml mediante la dilución de un sedimento de ARN desecado en agua pura, cuando se mezclan entre sí, forman nanopartículas homogéneas de aproximadamente 250 nm de diámetro como media.

Los beneficios de la presente invención son independientes de la longitud del ARN (esto funciona igualmente bien con ^{oligorribonucleótidos de un mínimo de aproximadamente} 6 ^{bases y con ARNm largo transcrito in vitro). Cuando los} electrolitos están presentes en las soluciones utilizadas para diluir el ARN o la protamina antes de la mezcla (p. ej., dilución de protamina y ARN a 1 mg/ml utilizando soluciones isotónicas tales como la solución de lactato de Ringer), las partículas obtenidas son de tamaño mayor (de aproximadamente 25 pm) y heterogéneo, como se ha mostrado anteriormente (Scheel et al., 2005, Fig. 1).

Se encontró que, sorprendentemente, las partículas más pequeñas obtenidas de acuerdo con el método de la invención (preferentemente mediante la mezcla de protamina 5000 diluida 14 veces en agua pura y ARN a 1 mg/ml en agua pura) indujeron una fuerte producción de IFN alfa, pero comparativamente solo indujeron débilmente la ^{producción de TNF alfa, mientras que las partículas más grandes inducen ambas citocinas con fuerza (Fig.} 6^{B). En} realizaciones preferidas adicionales, el ARN comprende más de 10 nucleótidos y contiene uno o más restos U. Sin embargo, no se requieren restos U dobles. Los restos G también pueden inducir un cierto nivel de inmunoestimulación. Sin embargo, al contrario que los informes anteriores (véanse los documentos WO-A-2007/031322, WO-A-2008/014979) no se requieren los pares UG o los pares GU. No es necesario que el ARN de la presente invención ^{tenga las características de un ARN mensajero (más de} 100 ^{restos, codón de inicio, codón de terminación, cola poli} A) como se ha sugerido previamente en la técnica anterior (Scheel, 2004, Scheel 2005 y Scheel 2006).

Breve descripción de los dibujos

Otros objetos, ventajas y rasgos distintivos novedosos de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada cuando se considere en conjunto con los dibujos adjuntos.

^{En la Fig.} 1 ^{se muestran ejemplos de los datos en bruto obtenidos a partir de los experimentos de medición del tamaño} para diferentes composiciones de protamina/ARN. El oligonucleótido de ARN 18-mero rico en U (ARN18RU: 5' AGUGUUAUUCUUGUAUGG 3', (SEQ ID NO: 1); solución madre a 5 mg/ml en agua) o ARN mensajero (ARNm, aproximadamente 900 bases, solución madre a 5 mg/ml en agua) y protamina VALEANT® 5000 (solución madre a 14 mg/ml en una solución de inyección isotónica) se formularon a 2 mg/ml, 1 mg/ml, 0,5 mg/ml o 0,25 mg/ml en agua pura o en agua más NaCl 25 mM o en agua más NaCl 75 mM o en agua más NaCl 225 mM o en lactato de Ringer. Se mezclaron cantidades iguales de ARN y protamina (5 microlitros de cada solución). 1 minuto después (tras la formación de las partículas), se añadió 1 ml de lactato de Ringer y se transfirió toda la solución a una cubeta transparente. Se colocó la cubeta en un Malvern Zetasizer y se midió el tamaño de las partículas. Se demuestra que el ARN diluido hasta 1 mg/ml en agua mezclado con protamina 5000 diluida hasta 1 mg/ml en agua, cuando se mezclan entre sí, generan nanopartículas con un tamaño medio (diámetro) de menos de 500 nm (ARN18RU más protamina (dilución en agua): 267 nm; y ARNm más protamina (dilución en agua): 254 nm). Por el contrario, cuando tanto el ARN como la protamina se diluyen hasta 1 mg/ml en una solución de NaCl 225 mM, los complejos que se forman son más grandes y heterogéneos (ARN18RU más protamina, ambos diluidos con una solución acuosa de NaCl 225 mM: 1288 nm). En el caso de las moléculas largas de ARN (p. ej., ARNm), la presencia de concentraciones superiores de electrolitos (p. ej., dilución de ARN y protamina hasta 1 mg/ml con lactato de Ringer) induce a la formación de agregados grandes que no se pueden detectar mediante el Zetasizer (el tamaño de las partículas está fuera del intervalo detectable), pero que se pueden visualizar con un microscopio convencional (véase Scheel et al.

2005; Fig. 1).

En la siguiente Tabla 1, se resumen los resultados del tamaño medio de partícula (diámetro) utilizando ARN18RU y protamina 5000 ambos diluidos hasta 2 mg/ml o 1 mg/ml o 0,5 mg/ml o 0,25 mg/ml o 0,125 mg/ml) en agua pura o NaCl 25 mM o NaCl 75 mM o NaCl 225 mM o lactato de Ringer (Ringer). Se muestra que los electrolitos contenidos en las soluciones de dilución o procedentes de una dilución baja de protamina 5000 (cuando se utiliza a 2 mg/ml, por tanto, diluida solo 7 veces en agua) dictan la formación de partículas de mayor tamaño (de más de 450 nm de diámetro como media) que cuando tanto el ARN como la protamina 5000 se diluyen en agua hasta 1 mg/ml. La dilución adicional tanto del ARN como de la protamina hasta menos de 1 mg/ml es una forma de reducir los tamaños de partícula incluso cuando se utiliza, p. ej., una solución de NaCl o de lactato de Ringer 25 mM o 75 mM o 225 mM.

Tabla 1:

La Fig. 2 muestra los datos en bruto de un experimento de medición del tamaño de partícula donde el ARN18RU y la protamina se diluyen hasta 1 mg/ml utilizando agua (dilución en agua: 268 nm) o en NaCl 25 mM (dilución en NaCl 25 mM: 320 nm) o en lactato de Ringer (dilución en Ringer: 1808 nm). De forma similar a los resultados mostrados en la Fig. 1 y en la Tabla 1, la presencia de concentraciones de sales crecientes dio lugar a la producción de partículas de protamina-ARN de tamaños medios crecientes.

En la Fig. 3, se resumen los resultados de un experimento de medición del tamaño de partícula adicional en el que el ARN18RU y la protamina 5000 se diluyen hasta 1 mg/ml con agua o con NaCl 10 mM o NaCl 20 mM o NaCl 25 mM o NaCl 30 mM o NaCl 40 mM o NaCl 50 mM o lactato de Ringer. Se llevaron a cabo al menos dos formulaciones y mediciones para cada condición.

La Fig. 4 muestra la capacidad de inmunoestimulación de las partículas formadas utilizando las condiciones de la Tabla 1. Se prepararon PBMC procedentes de seres humanos sanos utilizando un gradiente de separación de Ficoll®. A continuación, se lavaron con PBS y se volvieron a suspender a 5 millones por ml en RPMI con suero de ternera fetal al 10% más penicilina y estreptomicina. Se añadieron doscientos microlitos (1 millón de células) a las partículas formadas en el pocillo de una placa de 96 pocillos mezclando 2 microgramos de ARN18RU con 2 microgramos de protamina 5000 ambos a la concentración indicada en la solución indicada. Los controles positivos son PBMC incubadas de forma similar con el oligonucleótido de ADN de clase A CpG fosforotioato, ARN bicatenario (ARNbc) ambos a una concentración final de 10 microgramos/ml o el agonista de TLR7/8 R848 a 2 microgramos/ml final. Estas ^{preparaciones se incubaron durante 24 horas a 37 °C con CO}2 ^{al 5 %. A continuación, se recogieron los sobrenadantes} del cultivo y se congelaron a -20 °C. Se evaluaron los contenidos de IFN alfa y TNF alfa en estos sobrenadantes utilizando 20 microlitos de los sobrenadantes descongelados y los kits de ELISA de Bender (IFN alfa) y Abazyme (TNF alfa). Los resultados se presentan en pg/ml en el sobrenadante de cultivo celular. Estos demuestran que solo las partículas generadas con ARN18RU y protamina 5000 ambos diluidos en agua hasta 1 mg/ml o menos (por debajo de 0,25 mg/ml) estimulan una fuerte producción de IFN alfa y una producción relativamente débil de TNF alfa. Cuanto mayor es la dilución, más IFN alfa se produce (en comparación con los resultados utilizando 1 mg/ml y 0,25 mg/ml). Se obtienen los mismos resultados cuando, en lugar de ARN18RU a 1 mg/ml, se utiliza otro ARN, incluyendo el ARNm en agua a 1 mg/ml (Fig. 5C y 5D). Cuando hay sales presentes en las soluciones de dilución de ARN o protamina, aumenta la producción de ^t N^f alfa: se obtienen solo menos de 600 pg/ml cuando se utiliza agua para la dilución de la protamina y el ARN, mientras que se obtienen más de 40.000 pg/ml cuando se utiliza NaCl 25 mM para la dilución. Se sabe que los oligonucleótidos de clase A CpG inducen la producción de IFN alfa, pero no de TNF alfa. El agonista de TLR7/8 R848 induce una alta producción de IFN alfa y TNF alfa. El ARN bicatenario que estimula las células inmunitarias a través de TLR3 induce una producción débil de IFN alfa y TNF alfa por las PBMC humanas.

Fig. 5A y B: se realizó un experimento independiente similar al mostrado en la Fig. 4 utilizando PBMC nuevas de tres donantes sanos. Se diluyeron el ARN18RU y la protamina 5000 hasta 1 mg/ml con agua o con agua que contenía NaCl 25 mM o con lactato de Ringer. Como en la Fig. 4, se cultivaron conjuntamente 200 microlitos de PBMC nuevas a 5 millones de células/ml con 4 microgramos de partículas (2 microgramos de ARN mezclados con 2 microgramos de protamina) durante 24 horas a 37 °C. A continuación, se midieron el IFN alfa y el TNF alfa en el sobrenadante del cultivo utilizando kits de ELISA. Independientemente del donante, cuando se diluyen la protamina 5000 y el ARN con agua pura hasta 1 mg/ml, forman partículas que inducen altos niveles de IFN alfa (Fig. 5A), pero bajos niveles de TNF alfa (Fig. 5B). Cuando la protamina y el ARN se diluyen con NaCl 25 mM, en este experimento, se inducen altos niveles de IFN alfa y TNF alfa. Este es el caso en la mayoría de los experimentos. Con las partículas de mayor tamaño producidas mediante la dilución de protamina 5000 y ARN en lactato de Ringer, se detecta la producción de altos niveles de TNF alfa, pero bajos niveles de IFN alfa.

Fig. 5C y D: se realizó un experimento adicional para evaluar si las nanopartículas de ARNm/protamina de acuerdo con la presente invención ejercían inmunoestimulación. Se cultivaron aproximadamente un millón de PBMC humanas a 5 millones de células por ml (200 microlitros) durante 24 horas "solas" o con 2 microgramos (2 microlitros) de "protamina sola" (protamina 5000 diluida hasta 1 mg/ml utilizando agua) o 2 microgramos de "ARNm con NY-ESO-1" (ARN mensajero que tenía la secuencia codificante de la proteína NY-ESO-1 y diluido hasta 1 mg/ml con agua) o 2 microgramos del oligonucleótido CpG inmunoestimulante "CpG A" o con 0,5 microgramos de "R848" o con ARNm con NY-ESO-1 mezclado con protamina después de que ambos reactivos se hubieran diluido hasta 1 mg/ml con agua (ARNm con NY-ESO-1 prot en agua) o con ARNm con NY-ESO-1 mezclado con protamina después de que ambos reactivos se hubieran diluido hasta 1 mg/ml con lactato de Ringer (ARNm con NY-ESO-1 prot en Ringer). A continuación, se comprobó en el sobrenadante del cultivo celular la presencia de interferón alfa utilizando un kit de ELISA de Binder. Los resultados muestran que, al igual que los oligonucleótidos de ARN, el ARNm mezclado con protamina induce una fuerte producción de interferón alfa, si se diluyen tanto la protamina como el ARNm hasta 1 mg/ml utilizando agua pura (Fig. 5C). La presencia de una concentración de sal isotónica en la protamina y el ARNm antes de la mezcla (cuando ambos reactivos se diluyen hasta 1 mg/ml en lactato de Ringer) genera partículas grandes que estimulan una baja producción de interferón alfa por las PBMC humanas (Fig. 5C). Los resultados también muestran que, al igual que los oligonucleótidos de ARN, el ARN mezclado con protamina induce una producción relativamente baja de t Nf alfa, si se diluyen tanto la protamina como el ARNm hasta 1 mg/ml utilizando agua pura (Fig. 5D). La presencia de una concentración de sal isotónica en la protamina y el ARNm antes de la mezcla (cuando ambos reactivos se diluyen hasta 1 mg/ml en lactato de Ringer) genera partículas grandes que estimulan una fuerte producción de TNF alfa por las PBMC humanas (Fig. 5D).

^Fig.6^{A: se recogió medula ósea de ratones BALB/C y se cultivaron las células durante una semana en presencia de} GM-CSF (Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor, factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos) para obtener Células Dendríticas derivadas de Médula Ósea (CD-MO) de ratón. Se recogieron las células y se distribuyeron en una placa de 96 pocillos a una concentración de aproximadamente 1 millón de células por pocillo (en 200 microlitros de medio). Se diluyeron el ARN18RU, el ARNm que codifica NY-ESO-1 y la protamina 1000 hasta 1 mg/ml. Se añadieron solos a los cultivos celulares (como controles) o se mezclaron en diferentes proporciones (como se indica) antes de añadirse a los cultivos. Tras 24 horas de incubación a 37 °C, se recogieron los sobrenadantes y ^{se evaluó el contenido de interleucina} 6 ^{utilizando un ELISA (eBioscience). Los resultados muestran que las CD-MO} de ratón son activadas por nanopartículas de ARN-protamina que tienen una proporción de protamina/ARN de 2:1 a 1:4. Este resultado es independiente de si el ARN es un oligonucleótido o un ARNm largo. Como controles positivos, se utilizaron el agonista de TLR9 de ratón CpG 1826 (concentración final de 10 microgramos por ml) y el agonista de TLR7 R848 (concentración final de 2,5 microgramos por ml).

^Fig.6^{B: se recogió medula ósea de ratones nulogénicos para TLR7 y se cultivaron las células durante una semana en} presencia de GM-CSF, obteniéndose células dendríticas derivadas de médula ósea (CD-MO) de ratón. Se recogieron las células y se distribuyeron en una placa de 96 pocillos a una concentración de aproximadamente 1 millón de células por pocillo (en 200 microlitros de medio). Se diluyeron el ARN18RU, el ARNm que codifica NY-ESO-1 y la protamina 1000 hasta 1 mg/ml. Se añadieron solos a los cultivos celulares (como controles) o se mezclaron en diferentes proporciones (como se indica) antes de añadirse a los cultivos. Tras 24 horas de incubación a 37 °C, se recogieron ^{los sobrenadantes y se evaluó el contenido de interleucina} 6 ^{utilizando un ELISA (eBioscience). Los resultados} muestran que las ^c D-MO de ratón nulogénico para TLR7 no son activadas por protamina-ARN, lo que demuestra que TLR7 participa en el reconocimiento de las partículas de protamina-ARN por las células inmunitarias (independientemente de si el ARN es un oligonucleótido o una molécula de ARNm larga). Como control positivo, se utilizó el agonista de TLR9 de ratón CpG 1832 (concentración final de 10 microgramos por ml).

^Fig.6^{C: los ratones BALB/c recibieron mediante inyección por vía intravenosa 100 microgramos (50 microgramos de} protamina mezclados con 50 microgramos de ARN) de partículas. Se inyectaron bien nanopartículas pequeñas(protARN en agua: protamina 5000 y ARN diluido hasta 1 mg/ml en agua pura antes de la mezcla) o partículas más grandes ^{(prot-ARN en Ringer: protamina 5000 y ARN diluido hasta 1 mg/ml con lactato de Ringer) y 1 hora, 3 horas o} 6 ^horas después, se recogió una gota de sangre de los ratones (tres ratones para partículas pequeñas y tres ratones para las partículas grandes, así como para los controles negativos de ARN solo y protamina sola y, para el control positivo, ^{10 microgramos de R848). El contenido de interleucina} 6 ^{en el suero se cuantificó mediante ELISA. Se muestra que} solo la inyección de nanopartículas pequeñas induce una potente estimulación del sistema inmunitario del ratón. Fig. 7: se probaron las proporciones óptimas de protamina y ARN utilizando protamina 1000 diluida en agua y ARN diluido hasta 1 mg/ml en agua. Este protocolo da lugar a nanopartículas (de aproximadamente 500 nm) que pueden inducir la producción tanto de IFN alfa como de TNF alfa. Por lo tanto, esto permite a los presentes inventores, en un experimento, probar el efecto de las proporciones de protamina-ARN sobre la producción tanto de IFN alfa como de TNF alfa. Como en el caso anterior, se cultivaron 200 microlitos de PMBC humanas nuevas a 5 millones de células por ml junto con 4 microgramos de partículas (2 microgramos de protamina y 2 microgramos de ARN) durante 24 horas. Si se utiliza un ARNm largo y un oligonucleótido de 21 restos (oligo 21: 5' GUUGCAUGGGCCUCAUAUACA 3' (SEQ ID NO: 2) la mejor inmunoestimulación se observa cuando la protamina está en una cantidad igual a la del ARN o cuando hay más gramos de protamina que de ARN.

^Fig. 8^{: se probó la proporción óptima entre la protamina y el ARN en cuanto a la expresión de ARNm (traducción tras} la inyección). Cada ratón BALB/c recibió mediante inyección en la oreja izquierda 10 microgramos de ARNm desnudo codificante de la luciferasa. En la oreja derecha, los ratones recibieron una mezcla de protamina y ARNm codificante de la luciferasa donde las proporciones entre los dos productos eran como se indica. 18 horas después, los ratones ^{recibieron luciferina por vía intraperitoneal} (200 ^{pl de solución de luciferina a} 20 ^{mg/ml) y se controló la emisión de luz} durante 1 minuto utilizando un dispositivo Xenogen IVIS. El resultado muestra que, al contrario de lo que se ve para la inmunoestimulación, para la expresión del ARNm, debe haber al menos 4 veces menos protamina que ARN para permitir la expresión del ARN que es necesaria, por ejemplo, para la vacunación a base de ARNm.

Fig. 9: los datos de la bibliografía, así como los resultados de los presentes inventores (Fig. 10), indican que, en el ARN, los restos U y G son inmunoestimulantes. Además, se ha sugerido en la técnica anterior que son importantes la U doble, o los pares UG o GU. Se probó la capacidad inmunoestimulante de un oligonucleótido de ARN carente de restos U dobles y de dobletes de UG o GU (ARN18 PU por pobre en U). Se diluyó este oligonucleótido de 18 restos ARN18PU (5' AUCGCUAUCGAUCUCUAG 3' [SEQ ID NO: 3) hasta 1 mg/ml en agua y se mezcló con protamina 5000 diluida hasta 1 mg/ml en agua para generar nanopartículas pequeñas. Se añadieron las partículas a PBMC humanas nuevas a 5 millones de células por ml y, tras 24 horas de cultivo, se midió el contenido de IFN alfa en el sobrenadante mediante ELISA. Como se muestra en la Fig. 9, el ARN18PU mezclado con protamina pudo inducir la producción de IFN alfa de forma similar al oligonucleótido rico en U ARN18RU. Cuando se diluyen el ARN y la protamina hasta 1 mg/ml en lactato de Ringer, de forma habitual, es generada una baja producción de IFN alfa por las nanopartículas/micropartículas grandes.

Fig. 10: se probó el efecto de la secuencia del ARN sobre la inmunoestimulación utilizando protamina 1000 diluida en agua y ARN diluido hasta 1 mg/ml en agua. Este protocolo da lugar a nanopartículas de aproximadamente 500 nm como media que pueden inducir la producción tanto de IFN alfa como de TNF alfa. Por lo tanto, esto permite a los presentes inventores, en un experimento, probar el efecto de las proporciones de protamina-ARN sobre la producción tanto de IFN alfa como de TNF alfa. Como en el caso anterior, se cultivaron 200 microlitos de PMBC humanas nuevas a 5 millones por ml junto con 4 microgramos de partículas (2 microgramos de protamina y 2 microgramos de ARN) durante 24 horas. Se utilizaron oligonucleótidos de ARN dodecámeros de diferentes secuencias (12-mero rico en A: GAAAAACAAGAA (SEQ ID NO: 4); 12-mero rico en U: GUUAUUCUUGUA (SEQ ID NO: 5); 12-mero rico en C: ^{GCCACCCCCGCA (SEQ ID NO:} 6^{), 12-mero rico en G: GGGAGGCGGAGA (SEQ ID NO: 7); 12-mero de purina: AGAGAGAGAGAG (SEQ ID NO:} 8^{); 12-mero de pirimidina: CUCUCUCUCUCU (SEQ ID NO: 9)). Solo el} oligonucleótido 12-mero rico en U combinado con la protamina es un fuerte inmunoestimulante para la producción tanto de IFN alfa como de TNF alfa. El oligonucleótido rico en G, desprovisto de restos U, genera una actividad inmunoestimulante detectable cuando se mezcla con protamina. Los oligonucleótidos de pirimidina y purina también muestran una actividad inmunoestimulante detectable cuando se mezclan con protamina. Estos datos confirmaron trabajos previamente publicados en los que se demostraba que principalmente los restos U y, en menor grado, los restos G son entidades inmunoestimulantes dentro del ARN.

Fig. 11: se probó el efecto de la longitud del ARN sobre la inmunoestimulación utilizando protamina 1000 diluida en agua y ARN diluido hasta 1 mg/ml en agua. Este protocolo da lugar a nanopartículas de aproximadamente 500 nm como media que pueden inducir la producción tanto de IFN alfa como de t Nf alfa. Por lo tanto, esto permitió a los inventores probar, en un experimento, el efecto de las proporciones de protamina-ARN sobre la producción tanto de IFN alfa como de TNF alfa. Como en el caso anterior, se cultivaron 200 microlitos de PMBC humanas nuevas a 5 millones de células por ml junto con 4 microgramos de partículas (2 microgramos de protamina y 2 microgramos de ARN) durante 24 horas. Se probaron oligonucleótidos de diferente longitud, pero que siempre contenían restos U (21-mero con U: AGUGUUAUUCUUGUAUGGUUG (SEQ ID NO: 10); 18-mero con U: AGUGUUAUUCUUGUAUGG (SEQ ID NO: 1); 16-mero con U: GUGUUAUUCUUGUAUG (SEQ ID NO: 11); 14-mero con U: GUUAUUCUUGUAUG (SEQ ID NO: 12); 12-mero con U: GUUAUUCUUGUA (SEQ ID NO: 5); 10-mero con U: GUUAUUCUUG (SEQ ID NO: 13)). Los resultados muestran que, aunque los oligonucleótidos de 10 restos son capaces de proporcionar inmunoestimulación cuando se mezclan con la protamina, la estimulación aumenta mediante el uso de oligonucleótidos de 18 restos o más.

Descripción detallada de la invención

En oposición a lo descrito en la técnica anterior (véase Scheel 2006, Fig. 1), los presentes inventores descubrieron que, sorprendentemente, se pueden producir nanopartículas de un tamaño medio definido mezclando protamina y ARN. Un método preferido para la preparación de dichas nanopartículas es diluir la protamina y el ARN a concentraciones de menos de aproximadamente 2 mg/ml, en el mejor de los casos, a 1 mg/ml o menos utilizando agua pura o solución salina a baja concentración (preferentemente electrolitos a menos de 75 mM, más preferentemente electrolitos a menos de 25 mM) y, a continuación, mezclando las dos soluciones. Adicionalmente, se descubrió que, dependiendo de la concentración de sales en las soluciones de protamina y/o ARN antes de la mezcla, no solo se modifica el tamaño medio de las partículas resultantes, sino también su capacidad inmunoestimulante: Por ejemplo, cuando se diluyen la protamina 5000 y el ARN en agua pura (o soluciones que contiene electrolitos a menos de 25 mM) hasta 1 mg/ml o menos (por debajo de 0,25 mg/ml) y se mezclan entre sí, las partículas resultantes de menos de 450 nm de diámetro como media, como se ha descrito anteriormente, estimulan la producción más alta de interferón alfa por las PBMC mientras que la producción de TNF alfa es baja.

También se descubrió que se obtienen preferentemente nanopartículas homogéneas de tamaños ligeramente mayores (de 450 nm a 990 nm como media) diluyendo la protamina 5000 y el ARN hasta 1 mg/ml o menos utilizando soluciones de electrolitos de 30 a 75 mM. Dichas partículas también se pueden obtener en presencia de concentraciones mayores de sales (diluyendo con solución de NaCl 225 mM o soluciones isotónicas tales como lactato de Ringer), si la concentración de protamina y ARN está por debajo de 1 mg/ml antes de la mezcla.

Dichas nanopartículas de mayor tamaño inducen una fuerte producción tanto de IFN alfa como de TNF alfa por las PBMC humanas.

Como se muestra en el presente documento con la protamina 5000 y el ARN diluidos hasta 1 mg/ml en lactato de Ringer y en el estado de la técnica (Scheel 2005), las partículas y los agregados de mayor tamaño obtenidos mezclado protamina y/o ARN en presencia de electrolitos induce una producción máxima de TNF alfa y una baja producción de IFN alfa.

Para generar nanopartículas altamente inmunoestimulantes, las moléculas de ARN tienen preferentemente al menos 10 restos de longitud y la proporción en masa de la protamina con respecto al ARN es preferentemente de al menos 0,5 (preferentemente no más del doble más de ARN que de protamina). De acuerdo con una realización ^{particularmente preferida, esta proporción es de} 1 ^{o superior (más preferentemente la misma cantidad en masa de} protamina y ARN o se utiliza más protamina que ARN).

La restricción con respecto a la proporción entre la protamina y el ARN es la opuesta a la del estado de la técnica: para la vacunación con ARNm, la proporción entre la protamina y el ARNm debe ser menor de 0,25 (al menos cuatro veces más ARN que protamina) para garantizar la expresión del ARNm (traducción). La ocupación de la protamina en el ARN a las proporciones en masa necesarias para producir nanopartículas inmunoestimulantes (protamina/ARN >0,5) probablemente previenen la traducción del ARN por los ribosomas.

En la molécula de ARN, contenida en las nanopartículas para la presente invención, no se requieren dobletes de U o pares GU o UG, dado que, por ejemplo, el oligonucleótido pobre en U AUCGCUAUCGAUCUCUAG (SEQ ID NO: 3) cuando se diluye hasta 1 mg/ml en agua pura y se mezcla con protamina 5000 diluida hasta 1 mg/ml en agua pura genera nanopartículas que inducen una fuerte producción de IFN alfa.

El carácter distintivo de la materia objeto de la presente invención se muestra por el hecho de que se proporcionan nanopartículas de tamaño medio definido (diámetro), es decir, de aproximadamente 50 a aproximadamente 990 nm, preferentemente: menos de 450 nm, en particular, de 50 a 450 nm para las partículas más pequeñas y, de acuerdo con otras realizaciones preferidas, de 450 a 990 nm para nanopartículas más grandes, que son particularmente adecuadas para la producción de composiciones farmacéuticas que se pueden administrar i.v. y mediante otros métodos de administración.

Un beneficio adicional de la presente invención es que, a través del método específico de producción de las nanopartículas, es posible controlar de forma precisa la respuesta inmunitaria: producción preferida de IFN alfa y baja producción de TNF alfa utilizando partículas pequeñas (tamaño medio de aproximadamente 50 a aproximadamente 450 nm) y producción tanto de IFN alfa como de TNF alfa mediante nanopartículas más grandes (tamaño medio de aproximadamente 450 a aproximadamente 990 nm). Esto se opone a las metodologías de la técnica anterior en las que se obtuvo una fuerte producción de TNF alfa y una producción relativamente baja de IFN alfa utilizando partículas/agregados grandes.

En función de la inmunoestimulación inespecífica por nanopartículas de protamina-ARN de tamaño definido de acuerdo con la presente invención, se pueden utilizar para activar o reforzar la inmunidad frente a enfermedades crónicas tales como el cáncer o infecciones víricas persistentes.

Los ejemplos de cánceres que se pueden tratar con las nanopartículas y la composición inmunoestimulante, respectivamente, de acuerdo con la invención incluyen melanoma maligno, todos los tipos de carcinoma (carcinoma de colon, de células renales, de vejiga, de próstata, pulmonar no microcítico y microcítico, etc.), linfomas, sarcomas, blastemas, gliomas, etc.

Los ejemplos de enfermedades infecciosas que se pueden tratar con las nanopartículas y la composición inmunoestimulante, respectivamente, de acuerdo con la invención incluyen enfermedades infecciosas víricas, tales como el SIDA (VIH), hepatitis A, B o C, herpes, herpes zóster (varicela), sarampión alemán (virus de la rubéola), fiebre amarilla, dengue etc. flavivirus, virus de la gripe, enfermedades infecciosas hemorrágicas (virus de Marburg o Ébola), enfermedades infecciosas bacterianas, tales como la enfermedad del legionario (Legionella), úlcera gástrica (Helicobacter), cólera (Vibrio), infecciones por E. coli, Staphylococcus, Salmonella o Streptococcus (tétanos); infecciones por patógenos protozoos tales como malaria, enfermedad del sueño, leishmaniosis; toxoplasmosis, es decir, infecciones por Plasmodium, Trypanosoma, Leishmania y Toxoplasma; o infecciones fúngicas que están provocadas, por ejemplo, por Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis o Candida albicans).

Con el cambio de la inmunidad, las nanopartículas inmunoestimulantes y la composición farmacéutica, respectivamente, de la presente invención pueden probarse útiles para tratar también las alergias.

En una realización, la presente invención proporciona nanopartículas, preferentemente en forma de una composición ^{inmunoestimulante, que comprende/n un Ar N monocatenario, no homopolimérico y no modificado.}

^{El ARN es preferentemente un oligonucleótido de aproximadamente} 6 ^{a 100 ribonucleótidos o un ARN mensajero} (ARNm) de aproximadamente 100 a 10.000 nucleótidos.

Debido a que la fabricación de oligonucleótidos mediante síntesis química es más fácil a escalas muy grandes (kilogramos) que la síntesis enzimática del ARNm, los oligonucleótidos son las moléculas de ARN preferidas para los fines de la presente invención.

Los oligonucleótidos también se pueden obtener a partir de fuentes de ácido nucleico utilizando métodos de aislamiento bien conocidos por los expertos en la materia, aunque se sintetizan preferentemente mediante síntesis química (p. ej., se producen mediante síntesis de oligonucleótidos). Se prefieren los oligonucleótidos sintetizados debido a que están químicamente bien definidos y debido a su pureza y homogeneidad de secuencia.

Como se utiliza en el presente documento, el término "oligonucleótido" debería significar ribonucleótidos múltiples (es decir, una molécula que comprende una ribosa) unidos a un grupo fosfato y a una base orgánica seleccionada del grupo que consiste en citosina (C), uracilo (U), adenina (A) y guanina (G). Un oligómero generalmente se define como aquel que consiste en un número finito de unidades de monómeros, cuyo número varía de unos cuantos a un centenar. ^{En el contexto de la presente invención, un oligorribonucleótido consiste en de aproximadamente} 6 ^{a 100} ribonucleótidos. Preferentemente, de 12 a 40, y aún más preferentemente, de 16 a 21.

El ARN de la presente invención es preferentemente monocatenario y normalmente no contiene ninguna modificación química en sus subunidades (p. ej., en la base, o en el fosfato o en el resto de ribosa). Sin embargo, también son objeto de la presente invención las modificaciones que podrían ayudar a la fabricación o formulación de las actividades biológicas de las nanopartículas de protamina-ARN descritas en el presente documento. El extremo 5' del ARN puede ser OH, monofosfato o trifosfato, permitiendo este último la estimulación del RIG-1 citosólico y potenciando la inmunoestimulación.

No existe un requisito específico en cuanto a la secuencia de ribonucleótidos para que una molécula de oligorribonucleótido sea adecuada para preparar una composición de nanopartículas inmunoestimulantes de acuerdo con la presente invención. Preferentemente, sin embargo, el ARN contiene al menos el 25 % de restos de uridina. Lo más preferentemente, el ARN es un oligonucleótido que tiene las siguientes secuencias (escritas en sentido de 5' a 3'): ARN18PU: AUCGCUAUCGAUCUCUAG (SEQ ID NO: 3), 21-mero con U: AGUGUUAUUCUUGUAUGGUUG (SEQ ID NO: 10); 18-mero con U: AGUGUUAUUCUUGUAUGG (SEQ ID NO: 1); 16-mero con U: GUGUUAUUCUUGUAUG (SEQ ID NO: 11); 14-mero con U: GUUAUUCUUGUAUG (SEQ ID NO: 12); 12-mero con U: GUUAUUCUUGUA (SEQ ID NO: 5); 10-mero con U: GUUAUUCUUG (SEQ ID NO: 13); Oligo 21: GUUGCAUGGGCCUCAUAUACA (SEQ ID NO: 2).

La protamina de la presente invención puede ser protamina sulfatada o clorhidrato de protamina. En una realización preferida, la fuente de protamina utilizada para la producción de las nanopartículas y la "composición de nanopartículas de protamina-ARN inmunoestimulante", respectivamente, es protamina 5000 que contiene protamina a más de 10 mg/ml (5000 unidades neutralizantes de heparina por ml) en una solución salina isotónica y que se diluye como se ha establecido anteriormente.

La protamina no es tóxica y ya se está utilizando a nivel clínico, por ejemplo, como tratamiento anti-heparina en cirugía y como estabilizante de la insulina en nuevas formulaciones de insulina. La protamina se ha utilizado previamente para estabilizar el ARNm en una preparación de vacuna de ARNm (documento EP 1818409); sin embargo, se ha encontrado que en la proporción en masa de protamina:ARN utilizada en la presente invención (más de 1:2, en el mejor de los casos, 1:1, 2:1 o 4:1), se inhibe la expresión del ARNm. Por lo tanto, el método para utilizar protamina con el fin de estabilizar el ARNm de acuerdo con la técnica anterior es diferente al utilizado para generar nanopartículas homogéneas inmunoestimulantes de acuerdo con la presente invención.

Preferentemente, la composición inmunoestimulante tiene una proporción en peso protamina:ARN de 8:1 a 1:2, más preferentemente de 4:1 a 1:2.

En una realización preferida, en las nanopartículas de la presente invención, la proporción en peso entre la protamina ^{y el oligorribonucleótido es de aproximadamente} 1^.

Para aumentar adicionalmente la eficacia, las composiciones inmunoestimulantes de acuerdo con la invención pueden comprender uno o más adyuvantes, preferentemente para conseguir un efecto sinérgico de inmunoestimulación. "Adyuvante", en este contexto, abarca cualquier compuesto que potencie una respuesta inmunitaria. En este sentido, son posibles diferentes mecanismos, dependiendo de los diferentes tipos de adyuvantes. Por ejemplo, los compuestos que permiten la maduración de las CD, por ejemplo, lipopolisacáridos o ligando de CD40, forman una primera clase de adyuvantes adecuados. Generalmente, se puede utilizar cualquier agente que influya sobre el sistema inmunitario del tipo "señal peligrosa" (LPS, GP96, ARNbc, etc.) o citocinas, tales como GM-CFS, como adyuvante que permita que una respuesta inmunitaria se intensifique y/o se vea influenciada de forma controlada. Los oligodesoxinucleótidos CpG también se pueden utilizar opcionalmente en este contexto, aunque se han de considerar los efectos adversos que se produzcan en determinadas circunstancias, como se ha explicado anteriormente. Sin embargo, debido a la presencia del agente inmunoestimulante de acuerdo con la invención que comprende ARN como el principal inmunoestimulante, solo es necesaria una cantidad relativamente pequeña de ADN CpG (en comparación con la inmunoestimulación con solo ADN CpG). Los adyuvantes particularmente preferidos son citocinas, tales como ^{monocinas, linfocinas, interleucinas o quimiocinas, p. ej., IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-}6^{, IL-7, IL-}8^{, IL-9, IL-10, IL-12,} INFa, INF-y, GM-CFS, LT-a o factores de crecimiento, p. ej., hGH (human Growth Hormone, hormona del crecimiento humana). Otros adyuvantes conocidos son hidróxido de aluminio, adyuvante de Freund o aceite tal como Montanide®, lo más preferentemente Montanide® ISA51. Los lipopéptidos, tales como Pam3Cys, también son particularmente adecuados para usar como adyuvantes en la composición inmunoestimulante de la presente invención.

En una realización preferida, la composición inmunoestimulante de acuerdo con la invención también se puede utilizar junto con otro reactivo terapéutico. La composición inmunoestimulante de protamina/ARN de la presente invención puede por sí misma actuar de forma sinérgica con otros tratamientos tales como fármacos quimioterapéuticos para pacientes con cáncer, triterapia para pacientes con VIH o cloroquina, un fármaco utilizado frente a la infección de la malaria y conocido porque mejora la sensibilización cruzada. De hecho, la composición inmunoestimulante sola es capaz de inducir una activación general inespecífica del sistema inmunitario que, a su vez, ayuda al control de los patógenos.

Muchas de las pautas quimioterapéuticas (gemcitabina, etopofós, cisplatino, carboplatino, etc.) o protocolos de radioterapia no afectan gravemente al sistema inmunitario. Por lo tanto, durante la radio/quimioterapia en pacientes con cáncer, se puede utilizar la inmunomodulación de modo que la muerte de las células tumorales pueda ir acompañada de la inducción de una respuesta inmunitaria mediante composiciones inmunoestimulantes de acuerdo con la presente invención. Las inyecciones sistémicas (intravenosas o subcutáneas, por ejemplo), así como las inyecciones locales (intratumorales o intradérmicas, por ejemplo) de una composición de nanopartículas de protaminaa Rn inmunoestimulantes de acuerdo con la presente invención en pacientes sometidos a radio/quimioterapia pueden ayudar al sistema inmunitario a aumentar la respuesta frente al tumor. Esta respuesta inmunitaria también podría controlar el crecimiento tumoral.

En otra realización, la composición farmacéutica de la presente invención adopta la forma de una preparación vacunal que comprende las nanopartículas de protamina-ARN inmunoestimulantes definidas anteriormente y al menos un antígeno. Se entiende por "antígeno" cualquier estructura que puede inducir la formación de anticuerpos y/o la activación de una respuesta inmunitaria celular. Son ejemplos de antígenos los polipéptidos, las proteínas, las células, los extractos celulares, los hidratos de carbono/polisacáridos, los conjugados de polisacáridos, los lípidos y los glicolípidos. Estos antígenos pueden ser antígenos tumorales, o antígenos o alérgenos víricos, bacterianos, fúngicos y de protozoos. El antígeno puede estar presente en la vacuna de acuerdo con la invención en forma de un hapteno acoplado a un vehículo adecuado. Los vehículos adecuados son conocidos por los expertos en la materia e incluyen, por ejemplo, albúmina sérica humana (HSA, Human Serum Albumin), polietilenglicoles (PEG). El hapteno se puede acoplar al portador mediante procesos bien conocidos en la técnica anterior, p. ej., en el caso de un portador polipeptídico a través de un enlace de amida a un resto Lys.

La formulación de antígeno más nanopartículas de protamina-ARN se puede formular como una emulsión utilizando la mezcla con un aceite tal como Montanide®.

En una realización alternativa, la composición inmunoestimulante de la presente invención se puede utilizar en vacunación genética, en donde se estimula una respuesta inmunitaria mediante la introducción en el organismo o en la célula (electroporación in vitro seguida de transferencia adoptiva o inyección directa mediante dispositivos con o sin aguja) de una molécula de ácido nucleico adecuada codificante de este antígeno. Esta molécula de ácido nucleico puede ser un ADN o un ARNm. La "composición de nanopartículas de protamina-ARN inmunoestimulantes" se puede inyectar de modo sistémico (intravenoso o subcutáneo), así como a nivel local, en el sitio de administración del ADN o ARNm, proporcionando de este modo un entorno inmunitario (inducción de citocinas y maduración de CPA) beneficioso para la inducción de una respuesta inmunitaria.

Las vacunas de acuerdo con la invención son adecuadas para el tratamiento de cánceres. En este contexto, se pueden utilizar un Antígeno Específico del Tumor (AET) o un ácido nucleico codificante de dicho antígeno, así como una o varias partes de antígenos tumorales o ácidos nucleicos codificantes de dichas partes. Los ejemplos específicos de antígenos tumorales que se pueden utilizar de acuerdo con la invención incluyen 707-AP, AFP, a RT-4, bAg E, .beta.-^{catenina/m, Bcr-abl, CAMEL, CAP-1, CASP-}8^{, CDC27/m, CDK4/m, CEA, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1,} G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/neu, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HAST-2, hTERT (o ^{hTRT), iCE, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/Melan-A, MC1R, miosina/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA}88-A, NY-ESO-1, p190 menor bcr-abl, Pml/RAR.alfa, PRAME, PSA, PSM, RAGE, RU1 o RU2, SAGE, SART-1 o SART-3, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2 y WT1.

La vacuna de acuerdo con la invención se puede emplear además frente a enfermedades infecciosas.

La vacuna de acuerdo con la invención se puede utilizar junto con cloroquina, un compuesto farmacéutico que aumenta la presentación cruzada y, por lo tanto, la inducción de linfocitos T efectores específicos del antígeno.

Un ejemplo de la formulación vacunal que se utilizará podría ser la proteína NY-ESO-1 de longitud completa mezclada con nanopartículas de protamina-ARN y homogeneizada en Montanide®. La emulsión se puede administrar por vía subcutánea, opcionalmente junto con una captación concomitante de cloroquina por parte del individuo tratado. La presente invención es particularmente adecuada para usar en la inducción de la producción, o el aumento del nivel, de IFN alfa. Cuando se añade a células PBMC humanas in vitro, la composición inmunoestimulante es capaz de inducir la producción de al menos 500 pg/ml de interferón IFN alfa por 1 millón de PBMC humanas cultivadas 24 horas en 200 |jl de medio de cultivo (RPMI más suero de ternera fetal al 10 %).

Preferentemente, una forma de las nanopartículas de la presente invención (nanopartículas pequeñas), en particular en forma de una composición inmunoestimulante, cuando se incuba junto con las células Pb Mc humanas in vitro, durante 24 horas, es capaz de inducir una fuerte producción de INF alfa por 1 millón de PBMC humanas (más de 500 pg/ml), pero una producción de TNF alfa menor de 10.000 pg/ml.

Otra forma de las nanopartículas de la presente invención, preferentemente proporcionada en forma de una composición inmunoestimulante, cuando se incuba junto con las células PBMC humanas in vitro, durante 24 horas, es capaz de inducir una producción de INF alfa por 1 millón de PBMC humanas (más de 100 pg/ml) y una producción de TNF alfa de más de 10.000 pg/ml.

En una realización preferida más, las nanopartículas de la presente invención tienen un tamaño medio de no más de aproximadamente 450 nm de diámetro, preferentemente de 50 a 450 nm de diámetro (nanopartículas pequeñas). En otra realización preferida, la presente invención proporciona nanopartículas más grandes de protamina y ARN que tienen un tamaño medio de aproximadamente 450 nm a aproximadamente 990 nm de diámetro.

En "tamaño" medio de las nanopartículas generalmente es el "tamaño diseñado" o tamaño pretendido de las partículas preparadas de acuerdo con un proceso establecido. El tamaño puede ser una dimensión medida directamente, tal como el diámetro medio o máximo, o se puede determinar mediante un ensayo indirecto, tal como un ensayo de detección por filtración. La medición directa del tamaño de las partículas normalmente se realiza mediante dispersión dinámica de luz. Puesto que surgen variaciones menores del tamaño durante el proceso de fabricación, se acepta una variación de hasta el 40 % en la medición establecida y se considera que está dentro del tamaño establecido. Como alternativa, el tamaño del microportador se puede determinar mediante ensayos de detección por filtración. Por ejemplo, una preparación de partículas tiene un tamaño menor al establecido, si al menos el 97 % de las partículas pasan a través de un filtro "de tipo tamiz" del tamaño establecido.

Las composiciones de la presente invención se pueden procesar adicionalmente y pueden contener principios activos adicionales. Por ejemplo, en la patente de EE. Uu . n.° 7.018.657, se desvela un método para preparar formulaciones de nanopartículas de composiciones farmacéuticas que comprenden polinucleótidos precondensados con un péptido policatiónico, tales como sulfato de protamina.

Una realización adicional es una formulación inyectable que comprende las nanopartículas inmunoestimulantes de la invención junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable tal como lactato de Ringer.

La presente invención proporciona además un método de inmunoestimulación, en particular, para estimular una respuesta inmunitaria del hospedador en un sujeto, preferentemente un mamífero, especialmente un ser humano. Se administra una cantidad eficaz de una composición farmacéutica de acuerdo con la invención, opcionalmente junto con otro tratamiento (por ejemplo, radioterapia) o agente terapéutico, tal como una vacuna proteica, un agente quimioterapéutico contra el cáncer, un agente inmunomodulador adicional, un fármaco que potencie la sensibilización cruzada tal como cloroquina, un agente antivírico, un agente antiparasitario o un agente antibacteriano. Por lo tanto, la presente invención también comprende el uso de nanopartículas como se define en el presente documento para la ^{preparación de una composición farmacéutica o un medicamento para la inmunomodulación, en particular, para} estimular la respuesta inmunitaria del hospedador en un sujeto, preferentemente un mamífero, especialmente un ser humano.

Preferentemente, el agente inmunomodulador adicional es un agente anti-CTL-A4 o reactivos anti-linfocitos T reguladores tales como un anticuerpo anti-CD25 o ciclofosfamida.

El al menos un agente terapéutico adicional se puede administrar de forma simultánea con la composición farmacéutica, o el al menos un agente terapéutico adicional se administra de forma secuencial con la composición farmacéutica.

De acuerdo con el método de la presente invención, el nivel de IFN alfa aumenta mediante la administración de la composición inmunoestimulante de la invención.

En otra realización, la presente invención proporciona un método ex vivo para estimular la respuesta inmunitaria del hospedador en un mamífero. En una realización, se aíslan células inmunitarias adecuadas procedentes del mamífero y se tratan in vitro mediante la administración a las células inmunitarias aisladas de una cantidad eficaz de la composición farmacéutica de la presente invención, y se vuelven a introducir las células inmunitarias estimuladas en el organismo. Las células inmunitarias adecuadas para dicho tratamiento ex vivo incluyen, pero sin limitación, células dendríticas.

El método y la composición de la presente invención se pueden utilizar como tratamiento con interferón-a suplementario o para aumentar el interferón-a en un sujeto.

La composición inmunoestimulante de la invención comprende, además de ARN y protamina, y otros agentes terapéuticos o inmunogénicos, un portador farmacéuticamente aceptable y/o un vehículo farmacéuticamente aceptable y/o un diluyente farmacéuticamente aceptable. Las vías apropiadas para la formulación y preparación adecuadas del agente inmunoestimulante de acuerdo con la invención y la vacuna se desvelan en Remington: "The Science and Practice of Pharmacy", 20a Ed., A. R. Gennaro, Editor, Mack Publishing Co., Easton, PA (2003). Las posibles sustancias portadoras para la administración parenteral son, por ejemplo, agua estéril, Ringer, lactato de Ringer, solución de cloruro sódico estéril, polialquilenglicoles, naftalenos hidrogenados y, en particular, polímeros de lactida biocompatibles, copolímeros lactida/glicólico o copolímero de polioxietilen/polioxipropileno. Los agentes inmunoestimulantes y las vacunas de acuerdo con la invención pueden comprender sustancias de carga o sustancias tales como lactosa, manitol, sustancias para la unión covalente de polímeros, tales como, por ejemplo, de polietilenglicol, sobre haptenos, péptidos o polipéptidos antigénicos de acuerdo con la invención, formando complejos con iones metálicos o inclusión de materiales dentro o sobre determinadas preparaciones de compuestos poliméricos, tales como, p. ej., polilactato, ácido poliglicólico, hidrogel o en liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilamelares o multilamelares, fragmentos de eritrocitos o esferoblastos. Las realizaciones particulares del agente inmunoestimulante y la vacuna se seleccionan de acuerdo con las propiedades físicas, por ejemplo, con respecto a la solubilidad, estabilidad, biodisponibilidad o degradabilidad. La liberación controlada o constante de los componentes (de tipo) fármacos activos de acuerdo con la invención en la vacuna o en el agente inmunoestimulante incluye formaciones a base de depósitos lipófilos (p. ej., ácidos grasos, ceras o aceites). En el contexto de la presente invención, también se desvelan recubrimientos de sustancias inmunoestimulantes y sustancias vacunales o composiciones vacunales (todas ellas de acuerdo con la invención) que comprenden dichas sustancias, en concreto recubrimientos con polímeros (p. ej., polioxámeros o polioxaminas). Las sustancias o composiciones vacunales o inmunoestimulantes de acuerdo con la invención pueden tener además recubrimientos protectores, p. ej., inhibidores de proteasas o intensificadores de la permeabilidad. Los portadores preferidos normalmente son materiales portadores acuosos, utilizándose Agua Para Inyección (API) o agua tamponada con fosfato, citrato, HEPES o acetato, o Ringer o lactato de Ringer, etc., y normalmente el pH se ajusta de 5,0 a 8,0, preferentemente de 6,5 a 7,5. Preferentemente, el portador o vehículo comprenderá adicionalmente constituyentes salinos, p. ej., cloruro de sodio, cloruro potásico y otros componentes que conviertan la solución en, p. ej., isotónica. Asimismo, el portador o vehículo puede contener, además de los constituyentes mencionados anteriormente, componentes adicionales, tales como albúmina sérica humana (HSA), polisorbato 80, azúcares o aminoácidos.

El modo y el método de administración y la dosis del agente inmunoestimulante de acuerdo con la invención y la vacuna de acuerdo con la invención dependen de la naturaleza de la enfermedad que se vaya a tratar, cuando se

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que contiene nanopartículas de un tamaño medio de 450 a 990 nm que comprende protamina y ARN para usar en inmunoestimulación.

2. La composición para el uso de la reivindicación 1, en donde la proporción en peso de protamina con respecto al ARN es de 8:1 a 1:2, preferentemente de 4:1 a 1:2.

3. La composición para el uso de la reivindicación 1 o 2, en donde el ARN contiene al menos un nucleótido U y/o al menos un nucleótido G.

4. La composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el ARN es un ^{oligonucleótido de} 6 ^a 100 ^{nucleótidos.}

5. La composición para el uso de la reivindicación 3 o 4, en donde el ARN es un oligonucleótido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1,2, 3, 5, 10, 11, 12 y 13.

6^{. La composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el ARN es un ARNm de} 100 ^a 10.000 ^{nucleótidos.}

^{7. La composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a} 6^{, en donde la composición} farmacéutica además contiene al menos un antígeno.

8^{. La composición para el uso de la reivindicación 7, en donde el antígeno se selecciona del grupo que consiste en 707-AP, AFP, ART-4, BAGE, beta.-catenina/m, Bcr-abl, CAMEL, CAP-1, CASP-}8^{, CDC27/m, CDK4/m, CEA, CT, Cyp-}B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/neu, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HAST-2, hTERT (o hTRT), iCE, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/Melan-A, MC1R, ^{miosina/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA}88^{-A, NY-ESO-1, p190 menor bcr-abl, Pml/RAR.alfa, PRAME, PSA, PSM, RAGE,} RU1 o RU2, SAGE, SART-1 o SART-3, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2 y WT1.

^{9. La composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a} 8^{, en donde la composición} farmacéutica además contiene al menos un adyuvante.

10. La composición para el uso de la reivindicación 9, en donde el adyuvante es un aceite.

11. La composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la composición farmacéutica se administra junto con un agente inmunomodulador adicional seleccionado del grupo que consiste en fármacos quimioterapéuticos, cloroquina, agente anti-CTLA-4 o reactivos anti-linfocitos T reguladores.

12. Un método para la preparación de nanopartículas de un tamaño medio de 450 a 990 nm que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una solución acuosa de ARN

(1) a 0,25 mg/ml o más utilizando una solución que contiene electrolitos de 225 a 0 mM; o

(2) a 0,5 mg/ml o menos utilizando lactato de Ringer;

(b) proporcionar una solución acuosa de protamina

(1) a 0,25 mg/ml o más utilizando una solución que contiene electrolitos de 225 a 0 mM; o

(2) a 0,5 mg/ml o menos utilizando lactato de Ringer; y

^{(c) combinar las soluciones obtenidas en las etapas (a}1^{) y (b}1^{) o mezclar las soluciones obtenidas en (a}2^{) y (b}2^).