ES2864850T3 - Proteínas de fusión del receptor de brazo único tipo I y tipo II y uso de las mismas - Google Patents

Abstract

Un complejo proteico que comprende un primer polipéptido asociado covalentemente o no covalentemente con un segundo polipéptido, donde: a. el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de un primer miembro de un par de interacción y la secuencia de aminoácidos de un polipéptido receptor de tipo II de la superfamilia de TGFβ, donde el polipéptido receptor de tipo II de la superfamilia de TGFβ es un polipéptido de ActRIIB, donde el polipéptido de ActRIIB comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 85 % idéntica a los aminoácidos 29-109 de SEQ ID NO: 1, y donde el primer polipéptido comprende una leucina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición 79 de SEQ ID NO: 1; y b. el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de un segundo miembro del par de interacción, y donde el segundo polipéptido no comprende un polipéptido receptor de tipo II de la superfamilia de TGFβ; donde el primer miembro del par de interacción es un Fc que comprende un dominio de multimerización, y donde el segundo miembro del par de interacción es un Fc que comprende un dominio de multimerización y donde el polipéptido ActRIIB es capaz de unirse a GDF8 y/o GDF11.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas de fusión del receptor de brazo único tipo I y tipo II y uso de las mismas

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La superfamilia del factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta) contiene un abanico de factores de crecimiento que comparten elementos de secuencia y motivos estructurales comunes. Estas proteínas se conocen por ejercer efectos biológicos sobre una gran variedad de tipos celulares tanto en vertebrados como invertebrados. Los miembros de la superfamilia realizan funciones importantes durante el desarrollo embrionario en la formación de patrones y la especificación tisular y pueden influir en un abanico de procedimientos de diferenciación, que incluyen adipogénesis, miogénesis, condrogénesis, cardiogénesis, hematopoyesis, neurogénesis y diferenciación de las células epiteliales. La superfamilia se divide en dos clados filogenéticos generales: los miembros de la superfamilia que han evolucionado más recientemente, que incluye TGF-beta, activinas y el clado nodal y de proteínas de la superfamilia relacionadas más lejanamente, que incluye varias BMP y GDF. Hinck (2012) FEBs Letters 586:1860-1870. Los miembros de la superfamilia de TGF-beta tienen diversos efectos biológicos, a menudo complementarios. Manipulando la actividad de un miembro de la familia TGF-beta, a menudo es posible provocar cambios fisiológicos significativos en un organismo. Por ejemplo, las razas de ganado vacuno piamontesa y azul belga llevan una mutación con pérdida de función en el gen de GDF8 (también denominado miostatina) que provoca un aumento marcado en la masa muscular. Grobet y col. (1997) Nat Genet., 17(1):71-4. Además, en los seres humanos, los alelos inactivos de GDF8 se asocian con un aumento de la masa muscular y, según se informa, una fuerza excepcional. Schuelke y col. (2004) N Engl J Med, 350:2682-8.

Los cambios en músculos, huesos, grasa, glóbulos rojos y otros tejidos se pueden lograr mejorando o inhibiendo la señalización (p. ej., SMAD 1, 2, 3, 5, y/o 8) que está mediado por ligandos de la superfamilia TGF-beta. Por tanto, existe la necesidad de agentes que regulen la actividad de varios ligandos de la superfamilia TGF-beta.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

En parte, la divulgación proporciona complejos heteromultiméricos que comprenden un polipéptido receptor de quinasa de serina/treonina tipo I o tipo II de una única superfamilia de TGF-beta (por ejemplo, un polipéptido ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6, ALK7, ActRIIA, ActRIIB, TGFBRII, BMPRII o MISRII), que incluye fragmentos y variantes de los mismos. Estas construcciones pueden denominarse en esta invención complejos polipeptídicos de "brazo único". Opcionalmente, los complejos polipeptídicos de brazo único descritos en esta invención (por ejemplo, un complejo polipeptídico ActRIIB de brazo único, como un heterodímero ActRIIB-Fc:Fc) tienen diferentes especificidades/perfiles de enlaces de ligandos en comparación con un complejo homodimérico correspondiente (por ejemplo, un homodímero ActRIIB, como un ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc). Las propiedades novedosas son exhibidas por complejos polipeptídicos heteromultiméricos que comprenden un solo dominio de polipéptido receptor de quinasa de serina/treonina tipo I o tipo II de una superfamilia de TGF-beta, como se muestra en los Ejemplos en esta invención. Las estructuras heteromultiméricas incluyen, por ejemplo, heterodímeros, heterotrímeros y complejos de orden superior. Preferiblemente, los polipéptidos receptores de tipo I y tipo II de la superfamilia de TGF-beta como se describen en esta invención comprenden un dominio de unión a ligando del receptor, por ejemplo, un dominio extracelular de un receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta. En consecuencia, en ciertos aspectos, los complejos de proteínas descritos en esta invención comprenden un dominio extracelular de un receptor de la superfamilia de TGF-beta tipo II seleccionado de entre: ActRIIA, ActRIIB, TGFBRII, BMPRII y MISRII, así como truncamientos y variantes de los mismos, o un dominio extracelular de un receptor de la superfamilia de TGF-beta de tipo I seleccionado de: ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6 y ALK7, así como truncamientos y variantes de los mismos. Preferiblemente, los polipéptidos de tipo I y tipo II de la superfamilia de TGF-beta como se describen en esta invención, así como los complejos de proteínas que los comprenden, son solubles. En ciertos aspectos, los complejos heteromultiméricos de la divulgación se unen a uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-beta (por ejemplo, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-p1, TGF-p2, TGF-p3, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina AE, activina BC, activina BE, factor neurotrófico derivado de células gliales nodal (GDNF), neurturina, artemina, persefina, sustancia inhibidora de Muller (MIS) y Lefty). Opcionalmente, los complejos de proteínas de la divulgación se unen a uno o más de estos ligandos con una K^d de menos de o igual a 10'8, 10'9, 10- r , 10-11, o 10'12. En general, los complejos heteromultiméricos de la divulgación antagonizan (inhiben) una o más actividades de al menos un ligando de la superfamilia de TGF-beta, y tales alteraciones en la actividad pueden medirse usando varios ensayos conocidos en la técnica, que incluyen, por ejemplo, un ensayo basado en células de acuerdo a lo descrito en esta invención. Preferiblemente, los complejos de proteínas de la divulgación exhiben una vida media en suero de al menos 4, 6, 12, 24, 36, 48 o 72 horas en un mamífero (por ejemplo, un ratón o un ser humano). Opcionalmente, los complejos proteicos de la divulgación pueden exhibir una vida media en suero de al menos 6, 8, 10, 12, 14, 20, 25 o 30 días en un mamífero (por ejemplo, un ratón o un ser humano).

En ciertos aspectos, los complejos de proteínas descritos en esta invención comprenden un primer polipéptido asociado covalentemente o no covalentemente con un segundo polipéptido donde el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de un polipéptido receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta y la secuencia de aminoácidos de un primer miembro de un par de interacción y el segundo polipéptido comprende un segundo miembro del par de interacción y no contiene una secuencia de aminoácidos de un polipéptido receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta. Opcionalmente, el segundo polipéptido comprende, además del segundo miembro del par de interacción, una secuencia polipeptídica adicional que no es un polipéptido receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta y puede comprender opcionalmente no más de 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 aminoácidos. Opcionalmente, el polipéptido receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta se conecta directamente al primer miembro del par de interacción, o se puede colocar una secuencia intermedia, como un enlazador, entre la secuencia de aminoácidos del polipéptido receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta y la secuencia de aminoácidos del primer miembro del par de interacción. Ejemplos de enlazadores incluyen, pero no se limitan a, las secuencias TGGG, TGGGG, SGGGG, GGGGS y GGG.

Los pares de interacción descritos en esta invención están diseñados para promover la dimerización o formar multímeros de orden superior. En algunas realizaciones, el par de interacción puede ser dos secuencias polipeptídicas cualesquiera que interaccionen para formar un complejo, particularmente un complejo heterodimérico, aunque las realizaciones operativas también pueden emplear un par de interacción que forma un complejo homodimérico. El primer y segundo miembros del par de interacción pueden ser un par asimétrico, lo que significa que los miembros del par se asocian preferentemente entre sí en lugar de autoasociarse. Por consiguiente, el primer y segundo miembros de un par de interacción asimétrica pueden asociarse para formar un complejo heterodimérico. Alternativamente, el par de interacción puede ser no guiado, lo que significa que los miembros del par pueden asociarse entre sí o autoasociarse sin una preferencia sustancial y, por tanto, pueden tener la misma secuencia de aminoácidos o diferentes. Por consiguiente, el primer y segundo miembros de un par de interacción no guiada pueden asociarse para formar un complejo homodímero o un complejo heterodimérico. Opcionalmente, el primer miembro del par de interacción (por ejemplo, un par asimétrico o un par de interacción no guiada) se asocia covalentemente con el segundo miembro del par de interacción. Opcionalmente, el primer miembro del par de interacción (por ejemplo, un par asimétrico o un par de interacción no guiada) se asocia no covalentemente con el segundo miembro del par de interacción.

Las proteínas de fusión y los anticuerpos tradicionales de Fc son ejemplos de pares de interacción no guiados, mientras que se han diseñado una variedad de dominios Fc diseñados como pares de interacción asimétricos. Por tanto, un primer miembro y/o un segundo miembro de un par de interacción descrito en esta invención puede comprender un dominio constante de una inmunoglobulina, que incluye, por ejemplo, la porción Fc de una inmunoglobulina. Opcionalmente, un primer miembro de un par de interacción puede comprender una secuencia de aminoácidos que se deriva de un dominio Fc de una inmunoglobulina IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. Por ejemplo, el primer miembro de un par de interacción puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a cualquiera de SEQ ID NO: 200-214. Opcionalmente, un segundo miembro de un par de interacción puede comprender una secuencia de aminoácidos que se deriva de un dominio Fc de una IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. Por ejemplo, el segundo miembro de un par de interacción puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a cualquiera de SEQ ID NO: 200-214. En algunas realizaciones, un primer miembro y un segundo miembro de un par de interacción comprenden dominios Fc derivados de la misma clase y subtipo de inmunoglobulina. En otras realizaciones, un primer miembro y un segundo miembro de un par de interacción comprenden dominios Fc derivados de diferentes clases o subtipos de inmunoglobulinas. Opcionalmente, un primer miembro y/o un segundo miembro de un par de interacción (por ejemplo, un par asimétrico o un par de interacción no guiada) comprende un dominio constante modificado de una inmunoglobulina, que incluye, por ejemplo, una porción Fc modificada de una inmunoglobulina. Por ejemplo, los complejos de proteínas de la divulgación pueden comprender una primera porción Fc de una IgG que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo: SEQ ID NOs: 200-214 y una segunda porción Fc de una IgG, que puede ser la misma o diferente de la secuencia de aminoácidos de la primera porción Fc modificada de la IgG, que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo: SEQ ID NOs: 200-214.

En algunas realizaciones, la divulgación proporciona complejos polipeptídicos heteroméricos que comprenden un único polipéptido receptor de la superfamilia de TGF-beta tipo I o tipo II, donde el polipéptido receptor de la superfamilia de TGF-beta se deriva de un receptor de ActRIIA. Por ejemplo, el polipéptido de ActRIIA puede comprender, consistir esencialmente en, o consistir en una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia de ActRIIA descrita en esta invención (p.ej., SEQ ID NOs: 9, 10, 11, 101, 103, 401, y 402). Opcionalmente, los polipéptidos de ActRIIA pueden comprender, consistir esencialmente en o consistir en una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a un polipéptido que a) comienza en cualquiera de los aminoácidos 21-30 (p. ej., residuos de aminoácidos 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30) SEQ ID NO: 9, y b) termina en cualquiera de los aminoácidos 110-135 (por ejemplo, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 o 135) de SEQ ID NO: 9. Opcionalmente, los polipéptidos de ActRIIA de la divulgación pueden ser proteínas de fusión que comprenden además una o más porciones (dominios) que son heterólogos de ActRIIA. Por ejemplo, un polipéptido de ActRIIA se puede fusionar con un polipéptido heterólogo que comprende un dominio de multimerización, opcionalmente con un dominio enlazador posicionado entre el polipéptido de ActRIIA y el polipéptido heterólogo (por ejemplo, SEQ ID NO: 101, 103, 401 y 402). En algunas realizaciones, los dominios de multimerización descritos en esta invención comprenden un componente de un par de interacción. Los complejos heteroméricos que comprenden un polipéptido de ActRIIA no comprenden otro polipéptido receptor de la superfamilia de TGF-beta de tipo I o tipo II pero pueden contener polipéptidos adicionales que no son polipéptidos de receptores de la superfamilia de TGF-beta de tipo I o tipo II.

En algunas realizaciones, la divulgación proporciona complejos polipeptídicos heteroméricos que comprenden un polipéptido receptor de la superfamilia de TGF-beta tipo I o tipo II, donde el polipéptido receptor de la superfamilia de TGF-beta se deriva de un receptor de ActRIIB. Por ejemplo, polipéptidos de ActRIIB pueden comprender, consistir esencialmente en, o consistir en una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia de ActRIIB descrita en esta invención (p.ej., SEQ ID NOs: 1,2, 3, 4, 5, 6, 104, 106, 403, y 404). Opcionalmente, los polipéptidos de ActRIIB pueden comprender, consistir esencialmente en o consistir en una secuencia de aminoácidos que sea al menos 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a un polipéptido que a) comienza en cualquiera de los aminoácidos de 20 a 29 (p. ej., residuos de aminoácidos 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29) SEQ ID No : 1, y b) termina en cualquiera de los aminoácidos 109­ 134 (p.ej., residuos de aminoácidos 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, o 134 de SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, los polipéptidos de ActRIIB de la divulgación pueden ser proteínas de fusión que comprenden además una o más porciones (dominios) que son heterólogos de ActRIIB. Por ejemplo, un polipéptido de ActRIIB se puede fusionar con un polipéptido heterólogo que comprende un dominio de multimerización, opcionalmente con un dominio enlazador posicionado entre el polipéptido de ActRIIB y el polipéptido heterólogo (por ejemplo, SEQ ID NOs:. 104, 106, 403, y 404).

En algunas realizaciones, los dominios de multimerización descritos en esta invención comprenden un componente de un par de interacción. Los complejos heteroméricos que comprenden un polipéptido de ActRIIB no comprenden otro polipéptido receptor de la superfamilia de TGF-beta de tipo I o tipo II pero pueden contener polipéptidos adicionales que no son polipéptidos de receptores de la superfamilia de TGF-beta de tipo I o tipo II.

En algunas realizaciones, la divulgación proporciona complejos polipeptídicos heteroméricos que comprenden un polipéptido receptor de la superfamilia de TGF-beta tipo I o tipo II, donde el polipéptido receptor de la superfamilia de TGF-beta se deriva de un receptor de TGFBRII. Por ejemplo, polipéptidos de TGFBRII pueden comprender, consistir esencialmente en, o consistir en una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia de TGFBRII descrita en esta invención (p.ej., SEQ ID NOs: 42, 43, 67, 68, 113, 115, 409 y 410). Opcionalmente, polipéptidos de TGFBRII pueden comprender, consistir esencialmente en o consistir en una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a un polipéptido que a) comienza en cualquiera de los aminoácidos 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 o 51 de SEQ ID NO: 42, y b) termina en cualquiera de los aminoácidos 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165 o 166 de SEQ ID NO: 42. Opcionalmente, polipéptidos de TGFBRII pueden comprender, consistir esencialmente en o consistir en una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a un polipéptido que a) comienza en cualquiera de los aminoácidos 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 o 44 de SEQ ID NO: 67, y b) termina en cualquiera de los aminoácidos 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190 o 191 de SEQ ID NO: 67. Opcionalmente, polipéptidos de TGFBRII de la divulgación pueden ser proteínas de fusión que comprenden además una o más porciones (dominios) que son heterólogos de TGFBRII. Por ejemplo, un polipéptido de TGFBRII se puede fusionar con un polipéptido heterólogo que comprende un dominio de multimerización, opcionalmente con un dominio enlazador posicionado entre el polipéptido de TGFBRII y el polipéptido heterólogo (por ejemplo, SEQ ID NOs:, 113, 115, 409, y 410). En algunas realizaciones, los dominios de multimerización descritos en esta invención comprenden un componente de un par de interacción. Los complejos heteroméricos que comprenden un polipéptido de TGFBRII no comprenden otro polipéptido receptor de la superfamilia de TGF-beta de tipo I o tipo II pero pueden contener polipéptidos adicionales que no son polipéptidos de receptores de la superfamilia de TGF-beta de tipo I o tipo II.

En algunas realizaciones, la divulgación proporciona complejos polipeptídicos heteroméricos que comprenden un polipéptido receptor de la superfamilia de TGF-beta tipo I o tipo II, donde el polipéptido receptor de la superfamilia de TGF-beta se deriva de un receptor de BMPRII. Por ejemplo, polipéptidos de BMPRII pueden comprender, consistir esencialmente en, o consistir en una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia de BMPRII descrita en esta invención (p.ej., SEQ ID NOs: 46, 47, 71, 72, 107, 109, 405 y 406). Opcionalmente, los polipéptidos BMPRII pueden comprender, consistir esencialmente en o consistir en una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a un polipéptido que a) comienza en cualquiera de los aminoácidos 27-34 (p. ej., residuos de aminoácidos 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 y 34) SEQ ID NO: 46 o 71, y b) termina en cualquiera de los aminoácidos 123­ 150 (por ejemplo, residuos de aminoácidos 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 y 150) de SEQ ID NO: 46 o 71. Opcionalmente, polipéptidos de BMPRII de la divulgación pueden ser proteínas de fusión que comprenden además una o más porciones (dominios) que son heterólogos de BMPRII. Por ejemplo, un polipéptido de BMPRII se puede fusionar con un polipéptido heterólogo que comprende un dominio de multimerización, opcionalmente con un dominio enlazador posicionado entre el polipéptido de ^bM^p RII y el polipéptido heterólogo (por ejemplo, SEQ ID NOs:, 107, 109, 405, y 406). Complejos heteroméricos que comprenden un polipéptido de BMPRII no comprenden otro polipéptido receptor de la superfamilia de TGF-beta de tipo I o tipo II pero pueden contener polipéptidos adicionales que no son polipéptidos de receptores de la superfamilia de TGF-beta de tipo I o tipo II.

En algunas realizaciones, la divulgación proporciona complejos polipeptídicos heteroméricos que comprenden un polipéptido receptor de la superfamilia de TGF-beta tipo I o tipo II, donde el polipéptido receptor de la superfamilia de TGF-beta se deriva de un receptor de MISRII. Por ejemplo, polipéptidos de MISRII pueden comprender, consistir esencialmente en, o consistir en una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia de MISRII descrita en esta invención (p.ej., SEQ ID NOs: 50, 51, 75, 76, 79, 80, 110, 112, 407, y 408). Opcionalmente, los polipéptidos de MISRII pueden comprender, consistir esencialmente en o consistir en una secuencia de aminoácidos que sea al menos 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a un polipéptido que a) comienza en cualquiera de los aminoácidos de 17-24 (p. ej., residuos de aminoácidos 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24) SEQ ID NO: 50, 75, o 79, y b) termina en uno cualquiera de los aminoácidos 116-149 (p.ej., residuos de aminoácidos 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, y 149) de SEQ ID NO: 50, 75 o 79. Opcionalmente, polipéptidos de MISRII de la divulgación pueden ser proteínas de fusión que comprenden además una o más porciones (dominios) que son heterólogos de MISRII. Por ejemplo, un polipéptido de MISRII se puede fusionar con un polipéptido heterólogo que comprende un dominio de multimerización, opcionalmente con un dominio enlazador posicionado entre el polipéptido de MISRII y el polipéptido heterólogo (por ejemplo, SEQ ID NOs:. 110, 112, 407, y 408). En algunas realizaciones, los dominios de multimerización descritos en esta invención comprenden un componente de un par de interacción. Complejos heteroméricos que comprenden un polipéptido de MISRII no comprenden otro polipéptido receptor de la superfamilia de TGF-beta de tipo I o tipo II pero pueden contener polipéptidos adicionales que no son polipéptidos de receptores de la superfamilia de TGF-beta de tipo I o tipo II.

En algunas realizaciones, la divulgación proporciona complejos polipeptídicos heteroméricos que comprenden un polipéptido receptor de la superfamilia de TGF-beta tipo I o tipo II, donde el polipéptido receptor de la superfamilia de TGF-beta se deriva de un receptor de ALK1. Por ejemplo, polipéptidos de a LK1 pueden comprender, consistir esencialmente en, o consistir en una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia de ALK1 descrita en esta invención (p.ej., SEQ ID NOs: 14, 15, 116, 118, 411, y 412). Opcionalmente, los polipéptidos ALK1 pueden comprender, consistir esencialmente en o consistir en una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a un polipéptido que a) comienza en cualquiera de los aminoácidos 22-34 (p. ej., residuos de aminoácidos 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 y 34) SEQ ID NO: 14, y b) termina en cualquiera de los aminoácidos 95-118 (p. ej., residuos de aminoácidos 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117 y 118) de SEQ ID NO: 14. Opcionalmente, polipéptidos de ALK1 de la divulgación pueden ser proteínas de fusión que comprenden además una o más porciones (dominios) que son heterólogos de ALK1. Por ejemplo, un polipéptido de ALK1 se puede fusionar con un polipéptido heterólogo que comprende un dominio de multimerización, opcionalmente con un dominio enlazador posicionado entre el polipéptido de ALK1 y el polipéptido heterólogo (por ejemplo, SEQ ID NOs:, 116, 118, 411, y 412). Complejos heteroméricos que comprenden un polipéptido de ALK1 no comprenden otro polipéptido receptor de la superfamilia de TGF-beta de tipo I o tipo II pero pueden contener polipéptidos adicionales que no son polipéptidos de receptores de la superfamilia de TGF-beta de tipo I o tipo II.

En algunas realizaciones, la divulgación proporciona complejos polipeptídicos heteroméricos que comprenden un polipéptido receptor de la superfamilia de TGF-beta tipo I o tipo II, donde el polipéptido receptor de la superfamilia de TGF-beta se deriva de un receptor de ALK2. Por ejemplo, polipéptidos de a LK2 pueden comprender, consistir esencialmente en, o consistir en una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia de ALK2 descrita en esta invención (p.ej., SEQ ID NOs: 18, 19, 119, 121,413, y 414). Opcionalmente, los polipéptidos de ALK2 pueden comprender, consistir esencialmente en o consistir en una secuencia de aminoácidos que sea al menos 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a un polipéptido que a) comienza en cualquiera de los aminoácidos de 21-35 (p. ej., residuos de aminoácidos 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34 o 35) SEQ ID NO: 18 y b) termina en cualquiera de los aminoácidos 99-123 (p. ej., residuos de aminoácidos 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122 y 123) de SEQ ID NO: 18. Opcionalmente, polipéptidos de ALK2 de la divulgación pueden ser proteínas de fusión que comprenden además una o más porciones (dominios) que son heterólogos de ALK2. Por ejemplo, un polipéptido de ALK2 se puede fusionar con un polipéptido heterólogo que comprende un dominio de multimerización, opcionalmente con un dominio enlazador posicionado entre el polipéptido de ALK2 y el polipéptido heterólogo (por ejemplo, SEQ ID NOs:, 119, 121, 413, y 414). Complejos heteroméricos que comprenden un polipéptido de ALK2 no comprenden otro polipéptido receptor de la superfamilia de TGF-beta de tipo I o tipo II pero pueden contener polipéptidos adicionales que no son polipéptidos de receptores de la superfamilia de TGF-beta de tipo I o tipo II.

En algunas realizaciones, la divulgación proporciona complejos polipeptídicos heteroméricos que comprenden un polipéptido receptor de la superfamilia de TGF-beta tipo I o tipo II, donde el polipéptido receptor de la superfamilia de TGF-beta se deriva de un receptor de ALK3. Por ejemplo, polipéptidos de a LK3 pueden comprender, consistir esencialmente en, o consistir en una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia de ALK3 descrita en esta invención (p.ej., SEQ ID NOs: 22, 23, 122, 124, 415, y 416). Opcionalmente, los polipéptidos ALK3 pueden comprender, consistir esencialmente en o consistir en una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a un polipéptido que a) comienza en cualquiera de los aminoácidos 24-61 (p. ej., residuos de aminoácidos 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 y 61) SEQ ID NO: 22, y b) termina en cualquiera de los aminoácidos 130-152 (p. ej., residuos de aminoácidos 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151 y 152) de SEQ ID NO: 22. Opcionalmente, polipéptidos de ALK3 de la divulgación pueden ser proteínas de fusión que comprenden además una o más porciones (dominios) que son heterólogos de ALK3. Por ejemplo, un polipéptido de ALK3 se puede fusionar con un polipéptido heterólogo que comprende un dominio de multimerización, opcionalmente con un dominio enlazador posicionado entre el polipéptido de ALK3 y el polipéptido heterólogo (por ejemplo, SEQ ID NOs:, 122, 124, 415, y 416). Complejos heteroméricos que comprenden un polipéptido de ALK3 no comprenden otro polipéptido receptor de la superfamilia de TGF-beta de tipo I o tipo II pero pueden contener polipéptidos adicionales que no son polipéptidos de receptores de la superfamilia de TGF-beta de tipo I o tipo II.

En algunas realizaciones, la divulgación proporciona complejos polipeptídicos heteroméricos que comprenden un polipéptido receptor de la superfamilia de TGF-beta tipo I o tipo II, donde el polipéptido receptor de la superfamilia de TGF-beta se deriva de un receptor de ALK4. Por ejemplo, polipéptidos de a LK4 pueden comprender, consistir esencialmente en, o consistir en una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia de ALK4 descrita en esta invención (p.ej., SEQ ID NOs: 26, 27, 83, 84, 125, 127, 417 y 418). Opcionalmente, los polipéptidos de ALK4 pueden comprender, consistir esencialmente en o consistir en una secuencia de aminoácidos que sea al menos 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a un polipéptido que a) comienza en cualquiera de los aminoácidos de 23-34 (p. ej., residuos de aminoácidos 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34) SEQ ID NO: 26 u 83 y b) que termina en uno cualquiera de los aminoácidos 101-126 (p. ej., residuos de aminoácidos 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 o 126) de SEQ ID NO: 26 u 83. Opcionalmente, polipéptidos de ALK4 de la divulgación pueden ser proteínas de fusión que comprenden además una o más porciones (dominios) que son heterólogos de ALK4. Por ejemplo, un polipéptido de ALK4 se puede fusionar con un polipéptido heterólogo que comprende un dominio de multimerización, opcionalmente con un dominio enlazador posicionado entre el polipéptido de a Lk4 y el polipéptido heterólogo (por ejemplo, SEQ ID NOs:, 125, 127, 417, y 418). Complejos heteroméricos que comprenden un polipéptido de ALK4 no comprenden otro polipéptido receptor de la superfamilia de TGF-beta de tipo I o tipo II pero pueden contener polipéptidos adicionales que no son polipéptidos de receptores de la superfamilia de TGF-beta de tipo I o tipo II.

En algunas realizaciones, la divulgación proporciona complejos polipeptídicos heteroméricos que comprenden un polipéptido receptor de la superfamilia de TGF-beta tipo I o tipo II, donde el polipéptido receptor de la superfamilia de TGF-beta se deriva de un receptor de ALK5. Por ejemplo, polipéptidos de ^a LK5 pueden comprender, consistir esencialmente en, o consistir en una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia de ALK5 descrita en esta invención (p.ej., SEQ ID NOs: 30, 31, 87, 88, 128, 130, 419 y 420). Opcionalmente, los polipéptidos de ALK5 pueden comprender, consistir esencialmente en o consistir en una secuencia de aminoácidos que sea al menos 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a un polipéptido que a) comienza en cualquiera de los aminoácidos de 25-36 (p. ej., residuos de aminoácidos 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36) SEQ ID NO: 30 u 87 y b) que termina en uno cualquiera de los aminoácidos 106-126 (p. ej., 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 y 126) de SeQ ID NO: 30 u 87. Opcionalmente, polipéptidos de ALK5 de la divulgación pueden ser proteínas de fusión que comprenden además una o más porciones (dominios) que son heterólogos de ALK5. Por ejemplo, un polipéptido de ALK5 se puede fusionar con un polipéptido heterólogo que comprende un dominio de multimerización, opcionalmente con un dominio enlazador posicionado entre el polipéptido de ALK5 y el polipéptido heterólogo (por ejemplo, SEQ ID NOs:, 128, 130, 419, y 420). Complejos heteroméricos que comprenden un polipéptido de ALK5 no comprenden otro polipéptido receptor de la superfamilia de TGF-beta de tipo I o tipo II pero pueden contener polipéptidos adicionales que no son polipéptidos de receptores de la superfamilia de TGF-beta de tipo I o tipo II.

En algunas realizaciones, la divulgación proporciona complejos polipeptídicos heteroméricos que comprenden un polipéptido receptor de la superfamilia de TGF-beta tipo I o tipo II, donde el polipéptido receptor de la superfamilia de TGF-beta se deriva de un receptor de ALK6. Por ejemplo, polipéptidos de ^a LK6 pueden comprender, consistir esencialmente en, o consistir en una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia de ALK6 descrita en esta invención (p.ej., SEQ ID NOs: 34, 35, 91, 92, 131, 133, 421 y 422). Opcionalmente, los polipéptidos de ALK6 pueden comprender, consistir esencialmente en o consistir en una secuencia de aminoácidos que sea al menos 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a un polipéptido que a) comienza en cualquiera de los aminoácidos de 14-32 (p. ej., residuos de aminoácidos 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 o 32) SEQ ID NO: 34 y b) termina en cualquiera de los aminoácidos 102-126 (p. ej., residuos de aminoácidos 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 y 126) de SEQ ID NO: 34. Opcionalmente, los polipéptidos de ALK6 pueden comprender, consistir esencialmente en o consistir en una secuencia de aminoácidos que sea al menos 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a un polipéptido que a) comienza en cualquiera de los aminoácidos de 26-62 (p. ej., residuos de aminoácidos 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58,59, 60, 61, y 62) SEQ ID NO: 91 y b) termina en cualquiera de los aminoácidos 132-156 (p. ej., residuos de aminoácidos 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155 y 156) de SEQ ID NO: 91. Opcionalmente, polipéptidos de ALK6 de la divulgación pueden ser proteínas de fusión que comprenden además una o más porciones (dominios) que son heterólogos de a LK6. Por ejemplo, un polipéptido de ALK6 se puede fusionar con un polipéptido heterólogo que comprende un dominio de multimerización, opcionalmente con un dominio enlazador posicionado entre el polipéptido de AlK6 y el polipéptido heterólogo (por ejemplo, SEQ ID NOs:, 131, 133, 421, y 422). Complejos heteroméricos que comprenden un polipéptido de ALK6 no comprenden otro polipéptido receptor de la superfamilia de TGF-beta de tipo I o tipo II pero pueden contener polipéptidos adicionales que no son polipéptidos de receptores de la superfamilia de TGF-beta de tipo I o tipo II.

En algunas realizaciones, la divulgación proporciona complejos polipeptídicos heteroméricos que comprenden un polipéptido receptor de la superfamilia de TGF-beta tipo I o tipo II, donde el polipéptido receptor de la superfamilia de TGF-beta se deriva de un receptor de ALK7. Por ejemplo, polipéptidos de a LK7 pueden comprender, consistir esencialmente en, o consistir en una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia de ALK7 descrita en esta invención (p.ej., SEQ ID NOs: 38, 39, 134, 136, 301, 302, 305, 306, 309, 310, 313, 423, y 424). Opcionalmente, los polipéptidos de ALK7 pueden comprender, consistir esencialmente en o consistir en una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a un polipéptido que comienza en cualquiera de los aminoácidos 21-28 de SEQ ID NO: 38 (p. ej., aminoácidos 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28) y termina en cualquiera de los aminoácidos 92­ 113 de SEQ ID NO: 38 (por ejemplo, los aminoácidos 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 o 113 de SEQ ID NO: 38). Opcionalmente, polipéptidos de ALK7 de la divulgación pueden ser proteínas de fusión que comprenden además una o más porciones (dominios) que son heterólogos de ALK7. Por ejemplo, un polipéptido de ALK7 se puede fusionar con un polipéptido heterólogo que comprende un dominio de multimerización, opcionalmente con un dominio enlazador posicionado entre el polipéptido de ALK7 y el polipéptido heterólogo (por ejemplo, SEQ ID NOs:, 134, 136, 423, y 424). Complejos heteroméricos que comprenden un polipéptido de ALK7 no comprenden otro polipéptido receptor de la superfamilia de TGF-beta de tipo I o tipo II pero pueden contener polipéptidos adicionales que no son polipéptidos de receptores de la superfamilia de TGF-beta de tipo I o tipo II.

En algunas realizaciones, los polipéptidos receptores de tipo I y/o tipo II de la superfamilia TGF-beta descritos en esta invención comprenden uno o más residuos de aminoácidos modificados seleccionados de entre: un aminoácido glucosilado, un aminoácido PEGilado, un aminoácido farnesilado, un aminoácido acetilado, un aminoácido biotinilado, un aminoácido conjugado con un resto lipídico y un aminoácido conjugado con un agente de derivatización orgánico. En algunas realizaciones, los polipéptidos de tipo I y/o tipo II de la superfamilia TGF-beta descritos en esta invención están glicosilados y tienen un patrón de glicosilación que se puede obtener a partir de la expresión de los polipéptidos en una célula de mamífero, que incluye, por ejemplo, una célula CHO.

En ciertos aspectos, la divulgación proporciona ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los polipéptidos de tipo I y/o tipo II de la superfamilia TGF-beta descritos en esta invención, que incluyen cualquier proteína de fusión que comprenda miembros de un par de interacción. Los ácidos nucleicos descritos en esta solicitud se pueden enlazar operativamente a un promotor para expresión, y la descripción proporciona células transformadas con tales polinucleótidos recombinantes. Preferiblemente, la célula es una célula de mamífero tal como una célula COS o una célula CHO.

En ciertos aspectos, la divulgación proporciona procedimientos para hacer cualquiera de los polipéptidos de tipo I y/o tipo II de la superfamilia TGF-beta descritos en esta invención así como complejos de proteínas que comprenden dicho polipéptido. Dicho procedimiento puede incluir expresar cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en esta invención en una célula adecuada (p.ej., célula CHO o una célula COS). Tal procedimiento puede comprender: a) cultivar una célula en condiciones adecuadas para la expresión de polipéptidos de tipo I o tipo II de la superfamilia TGF-beta descritos en esta invención, donde dicha célula se transforma con una construcción de expresión del polipéptido de tipo I o tipo II; y b) recuperar el polipéptido de tipo I o tipo II así expresado. Los polipéptidos de tipo I o tipo II de la superfamilia TGF-beta descritos en esta invención, así como complejos proteínicos de los mismos, se pueden recuperar como fracciones en bruto, parcialmente purificadas o altamente purificadas usando cualquiera de las técnicas conocidas para la obtención de proteínas a partir de cultivos celulares

Cualquiera de los complejos de proteínas descritos en esta invención se puede incorporar a una preparación farmacéutica. Opcionalmente, tales preparaciones farmacéuticas son al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % puras con respecto a otros componentes polipeptídicos. Opcionalmente, las preparaciones farmacéuticas descritas en esta invención pueden comprender uno o más agentes activos adicionales.

La divulgación proporciona además procedimientos para el uso de los complejos de proteínas y preparaciones farmacéuticas descritos en esta invención para el tratamiento o la prevención de diversas afecciones asociadas a TGF-beta, que incluyen, sin limitación, enfermedades y trastornos asociados con, por ejemplo, cáncer, músculo, hueso, grasa, glóbulos rojos, metabolismo, fibrosis y otros tejidos afectados por uno o más ligandos de la superfamilia TGF-beta.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 muestra ejemplos esquemáticos de complejos proteicos heteroméricos de brazo único que comprenden un polipéptido receptor de tipo I o un polipéptido receptor de tipo II. Dichos complejos pueden ensamblarse de forma covalente o no covalente a través de un dominio de multimerización contenido dentro de cada cadena polipeptídica. Dos dominios de multimerización ensamblados constituyen un par de interacción, que puede ser guiado o no guiado. La Figura 2 muestra un ejemplo esquemático de un complejo proteico heteromérico de brazo único que comprende un polipéptido receptor de tipo I (indicado como "I") (por ejemplo, un polipéptido que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a un dominio extracelular de una proteína ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6 o ALK7 de seres humanos u otras especies) o un polipéptido receptor de tipo II (indicado como "II") (por ejemplo, un polipéptido que es por lo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a un dominio extracelular de una proteína ActRIIA, ActRIIB, MISRII, BMPRII o TGFBRII de seres humanos u otras especies). En la realización ilustrada, el polipéptido receptor de tipo I o tipo II es parte de un polipéptido de fusión que comprende un primer miembro de un par de interacción ("B"), que se asocia con un segundo miembro de un par de interacción ("C"). En el polipéptido de fusión, se puede colocar un enlazador entre el polipéptido receptor de tipo I o tipo II y el miembro correspondiente del par de interacción. El primer y segundo miembros del par de interacción (B, C) pueden ser un par guiado (asimétrico), lo que significa que los miembros del par se asocian preferentemente entre sí en lugar de autoasociarse, o el par de interacción puede no ser guiado, lo que significa que los miembros del par pueden asociarse entre sí o autoasociarse sin preferencia sustancial y pueden tener la misma o diferentes secuencias de aminoácidos. Las proteínas de fusión y los anticuerpos de Fc tradicionales son ejemplos de pares de interacción no guiados, mientras que se han diseñado una variedad de dominios Fc diseñados como pares de interacción guiados (asimétricos).

La Figura 3 muestra un alineamiento de dominios extracelulares de ActRIIA humano (SEQ ID NO: 500) y ActRIIB humano (SEQ ID NO: 2) con los residuos que se deducen en esta solicitud, basado en el análisis de material compuesto de múltiples estructuras cristalinas de ActRIIB y ActRIIA, para entrar directamente en contacto con ligando indicado con recuadros.

La Figura 4 muestra una alineación de secuencia múltiple de varias proteínas precursoras de ActRIIB de vertebrados sin sus dominios intracelulares (SEQ ID NO: 501, 502, 503, 504, 505 y 506, respectivamente) proteína precursora de ActRIIA humana sin su dominio intracelular (SEQ ID NO: 507) y una proteína precursora de ActRII de consenso (SEQ ID NO: 508).

La Figura 5 muestra la alineación de múltiples secuencias de dominios Fc de isotipos de IgG humana usando Clustal 2.1. Las regiones de bisagra se indican mediante un subrayado punteado. El subrayado doble indica ejemplos de posiciones diseñadas en IgG1 Fc para promover el emparejamiento de cadenas asimétricas y las posiciones correspondientes con respecto a otros isotipos IgG2, IgG3 e IgG4.

La Figura 6 muestra los datos de unión del ligando para un complejo proteico heterodimérico ActRIIB-Fc:Fc de brazo único comparado con el homodímero ActRIIB-Fc. Para cada complejo de proteínas, los ligandos se clasifican según la tasa de desviación (k^off o k^d), una constante cinética que se correlaciona bien con la inhibición de la señalización del ligando, y se enumeran en orden descendente de afinidad de unión (los ligandos unidos más estrechamente se enumeran en la parte superior). A la izquierda, las líneas amarillas, rojas, verdes y azules indican la magnitud de la constante de desviación. Los ligandos de particular interés están resaltados en negrita mientras que otros están representados en gris, y las líneas negras continuas indican ligandos cuya unión al heterodímero está mejorada o sin cambios en comparación con el homodímero, mientras que las líneas discontinuas indican una unión sustancialmente reducida en comparación con el homodímero. Como se muestra, el homodímero de ActRIIB-Fc se une a cada uno de los cinco ligandos de alta afinidad con una afinidad igualmente alta, mientras que ActRIIB-Fc de brazo único discrimina más fácilmente entre estos ligandos. Por lo tanto, ActRIIB-Fc de brazo único se une fuertemente a la activina B y GDF11 y con una fuerza intermedia a GDF8 y activina A. En contraste con el homodímero de ActRIIB-Fc, ActRIIB-Fc de brazo único muestra solo una unión débil a BMP10 y ninguna unión a BMP9. Estos datos indican que ActRIIB-Fc de brazo único tiene una mayor selectividad de ligando que ActRIIB-Fc homodimérico.

La Figura 7 muestra los datos de unión del ligando para un complejo proteico heterodimérico ALK3-Fc:Fc de brazo único comparado con el homodímero de ALK3-Fc. El formato es el mismo que para la Figura 6. Como se muestra, el heterodímero ALK3-Fc de brazo único retiene la unión excepcionalmente estrecha a BMP4 observada con el homodímero ALK3-Fc, mientras que exhibe una fuerza de unión reducida a BMP2 y, por lo tanto, discrimina mejor entre BMP4 y BMP2 que el homodímero de ALK3-Fc. ALK3-Fc de brazo único también discrimina mejor entre BMP5 (unión intermedia), ^g DF7 (unión débil) y GDF6 (sin unión) en comparación con el homodímero de ALK3-Fc, que se une a estos tres ligandos con una fuerza muy similar (todos intermedios). Estos datos indican que ALK3-Fc de brazo único tiene una mayor selectividad de ligando que ALK3-Fc homodimérico.

La Figura 8 muestra los datos de unión del ligando para un complejo proteico heterodimérico ActRIIA-Fc:Fc de brazo único comparado con el homodímero de ActRIIA-Fc. El formato es el mismo que para la Figura 6. Como se muestra, el homodímero de ActRIIA-Fc exhibe una unión preferencial a la activina B combinada con una unión fuerte a la activina A y GDF11, mientras que ActRIIA-Fc de brazo único tiene una preferencia inversa por la activina A sobre la activina B combinada con selectividad muy mejorada para activina A sobre GDF11 (aglutinante débil). Estos datos indican que el ActRIIA-Fc de brazo único tiene una selectividad de ligando sustancialmente diferente a la del ActRIIA-Fc homodimérico.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

1. Análisis general

En parte, la presente divulgación se refiere a complejos heteromultímeros de brazo único que comprenden un dominio extracelular de un polipéptido receptor de tipo I de la superfamilia de TGFp o un dominio extracelular de un polipéptido receptor de tipo II de la superfamilia de TGFp, procedimientos para fabricar tales complejos heteromultiméricoss de brazo único y usos de los mismos. Como se describe en esta invención, los complejos heteromultímeros de brazo único pueden comprender un dominio extracelular de un polipéptido receptor de tipo I de la superfamilia de TGFp seleccionado entre: ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6 y ALK7, o un dominio extracelular de una superfamilia de TGFp tipo II polipéptido receptor seleccionado de: ActRIIA, ActRIIB, TGFBRII, BMPRII y MISRII. En ciertas realizaciones preferidas de la invención, los complejos heteromultiméricos de la divulgación tienen un perfil alterado de unión a ligandos de la superfamilia de TGFp en relación con un complejo homomultimérico correspondiente (por ejemplo, un heterodímero ActRIIB-Fc:Fc en comparación con un complejo homodímero ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc).

La superfamilia de TGF-p está comprendida por más de treinta factores secretados que incluyen TGF-beta, activinas, nódulos, proteínas morfogenéticas óseas (BMP), factores de crecimiento y diferenciación (GDF) y hormona anti-Mulleriana (AMH). Ver, p.ej., Weiss y col. (2013) Developmental Biology, 2(1): 47-63. Los miembros de la superfamilia, que se encuentran tanto en vertebrados como en invertebrados, se expresan de manera ubicua en diversos tejidos y funcionan durante las primeras etapas de desarrollo a lo largo de la vida de un animal. De hecho, las proteínas de la superfamilia TGF-p son mediadores clave de la autorrenovación, gastrulación, diferenciación, morfogénesis de órganos y homeostasis del tejido adulto de células madre. De acuerdo con esta actividad ubicua, la señalización aberrante de la superfamilia de TGF-beta se asocia con una amplia gama de patologías humanas que incluyen, por ejemplo, enfermedades autoinmunes, enfermedades cardiovasculares, enfermedades fibróticas y cáncer.

Los ligandos de la superfamilia TGF-beta comparten la misma estructura dimérica en la que la hélice central de giro 3-1/2 de un monómero se empaqueta contra la superficie cóncava formada por las cadenas beta del otro monómero. La mayoría de los miembros de la familia TGF-beta se estabilizan aún más mediante un enlace disulfuro intermolecular. Estos enlaces disulfuro atraviesan un anillo formado por otros dos enlaces disulfuro que generan lo que se ha denominado un motivo de "nudo de cisterna". Ver, p.ej., Lin y col., (2006) Reproduction 132: 179-190 y Hinck (2012) FEBS Letters 586: 1860-1870.

Las señales de la superfamilia TGF-p están mediadas por complejos heteroméricos de receptores de serina/treonina quinasa de tipo I y tipo II, que fosforilan y activan aguas abajo las proteínas SMAD (p.ej., las proteínas SMAD 1, 2, 3, 5 y 8) tras la estimulación del ligando. Ver, p.ej., Massagué (2000) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1:169-178. Estos receptores de tipo I y tipo II son proteínas transmembranarias, compuestas por un dominio extracelular de unión a ligando con una región rica en cisteína, un dominio transmembranario y un dominio citoplásmico con especificidad por la serina/treonina quinasa prevista. En general, los receptores de tipo I median la señalización intracelular, mientras que los receptores de tipo II son necesarios para unirse a ligandos de la superfamilia de TGF-beta. Los receptores de tipo I y II forman un complejo estable después de la unión a ligando, lo que da como resultado la fosforilación de los receptores de tipo I por los receptores de tipo II.

La familia de TGF-beta se puede dividir en dos ramas filogenéticas según los receptores de tipo I a los que se unen y las proteínas Smad que activan. Una es la rama de evolución más reciente, que incluye, por ejemplo, TGF-beta, activinas, GDF8, GDF9, GDF11, BMP3 y nodal. La otra rama comprende las proteínas más distantes de la superfamilia e incluye, por ejemplo, BMP2, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF1, GDF5, GDF6 y GDF7. Ver, por ejemplo Hinck (2012) FEBS Letters 586:1860-1870.

Las isoformas de TGF-beta son los miembros fundadores de la superfamilia TGF-beta, de las cuales hay 3 isoformas conocidas en mamíferos designadas como TGF-beta1, TGF-beta2 y TGF-beta3. Los ligandos de TGF-beta bioactivos maduros funcionan como homodímeros y señalizan predominantemente a través del receptor de tipo I ALK5, pero también se ha encontrado que señalizan a través de ALK1 en las células endoteliales. Ver, p.ej., Goumans y col. (2003) Mol Cell 12(4): 817-828. TGF-beta1 es la isoforma más abundante y de expresión ubicua. Se sabe que TGF-beta1 tiene un papel importante en la cicatrización de heridas, y los ratones que expresan un transgén de TGF-beta1 constitutivamente activo desarrollan fibrosis. Ver p.ej., Clouthier y col., (1997) J Clin. Invest. 100(11): 2697-2713. TGF-beta1 también participa en la activación de las células T y el mantenimiento de las células reguladoras T. Ver, p.ej., Li y col., (2006) Immunity 25(3): 455-471. La expresión de TGF-beta2 se describió por primera vez en células de glioblastoma humano y se produce en neuronas y células astrogliales del sistema nervioso embrionario. También se sabe que TGF-beta2 suprime el crecimiento de linfocitos T dependiente de interleucina-2. El TGF-beta3 se aisló inicialmente de una línea celular de rabdomiosarcoma humano y desde entonces se ha encontrado en líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón y carcinoma de riñón. Se sabe que TGF-beta3 es importante para la morfogénesis del paladar y el pulmón. Ver, p.ej., Kubiczkova y col., (2012) Journal of Translational Medicine 10:183.

Las activinas son miembros de la superfamilia TGF-beta que se descubrieron inicialmente como reguladores de la secreción de la hormona estimulante del folículo, pero posteriormente se han caracterizado varias funciones reproductivas y no reproductivas. Las formas principales de activina (A, B y AB) son homo/heterodímeros de dos subunidades p relacionadas estrechamente (p^Ap^A, p^Bp^B,y p^Ap^B, respectivamente). El genoma humano codifica también una activina C y una activina E, que se expresan principalmente en el hígado, y también se conocen formas heterodiméricas que contienen p^e o p^E. En la superfamilia de TGF-beta, las activinas son factores únicos y multifuncionales que pueden estimular la producción de hormonas en células ováricas y placentarias, respaldar la supervivencia de las células neuronales, influir en el desarrollo del ciclo celular de forma positiva o negativa dependiendo en el tipo celular e inducir la diferenciación mesodérmica al menos en embriones de anfibios. Ver, p.ej., DePaolo y col. (1991) Proc Soc Ep Biol Med. 198:500-512; Dyson y col. (1997) Curr Biol. 7:81-84; y Woodruff (1998) Biochem Pharmacol. 55:953-963. En varios tejidos, la transducción de señales de la activina es antagonizada por su heterodímero relacionado, la inhibina. Por ejemplo, en la regulación de la secreción de la hormona estimulante del folículo (FSH) de la pituitaria, la activina promueve la síntesis y secreción de FSH, mientras que la inhibina reduce la síntesis y secreción de FSH. Otras proteínas que pueden regular la bioactividad de la activina y/o unirse a la activina incluyen la folistatina (FS), la proteína relacionada con la folistatina (FSRP, también conocida como FLRG o FSTL3) y la a²-macroglobulina.

Como se describe en esta solicitud, los agentes que se unen a “activina A” son agentes que se unen específicamente a la subunidad p^A, ya sea en el contexto de una subunidad p^A aislada o como un complejo dimérico (p. ej., un homodímero p^Ap^A o un heterodímero p^Ap^B). En el caso de un complejo de heterodímero (p.el., un heterodímero a p^Ap^B), los agentes que se unen a “activina A” son específicos para epítopos presentes dentro de la subunidad p^A , pero no se unen a epítopos presentes dentro de la subunidad que no es p^A del complejo (p. ej., la subunidad p^B del complejo). Similarmente, los agentes descritos en esta solicitud que antagonizan (inhiben) la “activina A” son agentes que inhiben una o más actividades mediadas por una subunidad p^A , ya sea en el contexto de una subunidad p^A aislada o como un complejo dimérico (p.ej., un homodímero p^Ap^A o un heterodímero p^Ap^B). En el caso de los heterodímeros p^Ap^B los agentes que inhiben la “activina A” son agentes que inhiben específicamente una o más actividades de la subunidad p^A pero no inhiben la actividad de la subunidad que no es p^A del complejo (por ejemplo la subunidad pe del complejo). Este principio se aplica también a los agentes que se unen a y/o inhiben la “activina B”, “activina C” y “activina E”. Los agentes descritos en esta solicitud que antagonizan la “activina AB” son agentes que inhiben una o más actividades mediadas por la subunidad p^A y una o más actividades mediadas por la subunidad p^B.

Las BMP y los GDF juntos forman una familia de citocinas de nudos de cisteína que comparten el pliegue característico de la superfamilia TGF-beta. Ver, p.ej., Rider y col. (2010) Biochem J., 429(1):1-12. Esta familia incluye, por ejemplo, BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, BMP2a, BMP3, BMP3b (también conocido como GDF10), BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8, BMP8a, BMP8b, BMP9 (también conocido como GDF2), BMP10, BMP11 (también conocido como GDF11), BMP12 (también conocido como GDF7), BMP13 (también conocido como GDF6), BMP14 (también conocido como GDF5), BMP15, GDF1, GDF3 (también conocido como VGR2), GDF8 (también conocido como miostatina), GDF9, GDF15 y decapentapléjico. Además de la capacidad de inducir la formación ósea, que dio a las BMP su nombre, la BMP/^g DF^s despliegan actividades morfogenéticas en el desarrollo de una amplia gama de tejidos. Homo y heterodímeros BMP/GDF interactúan con combinaciones de dímeros receptores de tipo I y tipo II para producir múltiples complejos de señalización posibles, lo que lleva a la activación de uno de los dos conjuntos de factores de transcripción SMAD en competencia. BMP/GDFs tienen funciones muy específicas y localizadas. Estos están regulados de varias formas, incluida la restricción del desarrollo de expresión de BMP/GDF y a través de la secreción de varias proteínas que se unen a ciertos ligandos de la superfamilia de TGF-beta con alta afinidad y por lo tanto inhiben la actividad del ligando. Curiosamente, algunos de estos antagonistas endógenos se parecen a los propios ligandos de la superfamilia de TGF-beta.

El factor 8 de crecimiento y diferenciación (GDF8) también se conoce como miostatina. GDF8 es un regulador negativo de la masa del músculo esquelético y está altamente expresado en el músculo esquelético adulto y en desarrollo. La mutación anuladora del GDF8 en ratones transgénicos está caracterizada por una hipertrofia e hiperplasia notables del músculo esquelético. Ver, p.ej., McPherron y col., Nature (1997) 387:83-90. Son evidentes aumentos similares en la masa de músculo esquelético en mutaciones naturales de GDF8 en ganado y, sorprendentemente, en seres humanos. Ver, p.ej., Ashmore y col. (1974) Growth, 38:501-507; Swatland y Kieffer, J. Anim. Sci. (1994) 38:752-757; McPherron and Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94:12457-12461; Kambadur y col., Genome Res. (1997) 7:910-915; and Schuelke y col. (2004) N Engl J Med, 350:2682-8. Estudios también han demostrado que la atrofia muscular asociada con infección por VIH en seres humanos está acompañada de aumentos en la expresión de proteínas GDF8. Ver, p.ej., Gonzalez-Cadavid y col., PNAS (1998) 95:14938-43. Además, el GDF8 puede modular la producción de enzimas específicas del músculo (p.ej., la creatina cinasa) y modular la proliferación celular de mioblastos Ver, p.ej., Publicación de Solicitud de patente Internacional No. WO 00/43781). El propéptido GDF8 puede unirse de forma no covalente al dímero del dominio GDF8 maduro, inactivando su actividad biológica. Ver, p.ej., Miyazono y col. (1988) J. Biol. Chem., 263: 6407-6415; Wakefield y col. (1988) J. Biol. Chem., 263; 7646-7654; y Brown y col. (1990) Growth Factors, 3: 35-43. Otras proteínas que se unen a GDF8 o relacionadas estructuralmente con las proteínas y que inhiben su actividad biológica incluyen folistatina y, potencialmente, proteínas relacionadas con folistatina. Ver, p.ej., Gamer y col. (1999) Dev. Biol., 208: 222-232.

GDF11, también conocida como BMP11, es una proteína secretada que se expresa en el brote de la cola, brote de las extremidades, los arcos maxilar y mandibular y los ganglios de la raíz dorsal durante el desarrollo del ratón. Ver, p.ej., McPherron y col. (1999) Nat. Genet., 22: 260-264; and Nakashima y col. (1999) Mech. Dev., 80: 185-189. GDF11 juega un papel único en el modelado de tejidos tanto mesodérmicos como neurales. Ver, p.ej., Gamer y col. (1999) Dev Biol., 208:222-32. GDF11 demostró ser un regulador negativo de la condrogénesis y la miogénesis en el desarrollo de las extremidades de polluelos. Ver, p.ej., Gamer y col. (2001) Dev Biol., 229:407-20. La expresión de GDF11 en el músculo también sugiere su papel en la regulación del crecimiento muscular de una manera similar al GDF8. Además, la expresión de GDF11 en el cerebro sugiere que el GDF11 también puede poseer actividades que se relacionan con la función del sistema nervioso. Curiosamente, se encontró que el GDF11 inhibe la neurogénesis en el epitelio olfativo. Ver, p.ej., Wu y col. (2003) Neuron., 37:197-207. Por lo tanto, GDF11 puede tener aplicaciones in vitro e in vivo en el tratamiento de enfermedades tales como enfermedades musculares y enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo, esclerosis lateral amiotrófica).

BMP7, también denominada proteína osteogénica 1 (OP-1), se sabe que induce la formación de cartílagos y huesos. Además, la BMP7 regula un amplio abanico de procedimientos fisiológicos. Por ejemplo, la BMP-7 puede ser el factor osteoinductor responsable del fenómeno de la osteogénesis epitelial. También se encontró que la BMP7 desempeña una función en la regulación del calcio y la homeostasis ósea. Al igual que la activina, la BMP7 se une a receptores de tipo II, ActRIIA y ActRIIB. Sin embargo, la BMP7 y la activina reclutan distintos receptores de tipo I en los complejos de receptores heteroméricos. El receptor de tipo I principal de la BMP7 observado fue ALK2, mientras que la activina se unía exclusivamente a ALK4 (ActRIIB). La BMP7 y la activina provocaron respuestas biológicas distintas y activaron diferentes vías de SMAD. Ver, p.ej., Macias-Silva y col. (1998) J Biol Chem. 273:25628-36.

La hormona anti-Mulleriana (AMH), también conocida como sustancia inhibidora de Muller (MIS), es una glicoproteína de la familia TGF-beta. Se ha identificado un receptor de tipo II asociado a AMH y se designa como ^a M^h RII o, alternativamente, MISRII. La AMH induce la regresión de los conductos de Muller en el embrión masculino humano. La AMH se expresa en mujeres en edad reproductiva y no fluctúa con el ciclo o el embarazo, pero se encontró que disminuye gradualmente a medida que disminuyen tanto la cantidad como la calidad de los ovocitos, lo que sugiere que la AMH podría servir como un biomarcador de la fisiología ovárica. Véase p.ej. Zec y col., (2011) Biochemia Medica 21(3): 219-30.

La quinasa similar al receptor de activina-1 (ALK1), el producto del gen ACVRL1 conocido alternativamente como ACVRLK1, es un receptor de tipo I cuya expresión está predominantemente restringida a las células endoteliales. Ver, p.ej., entrada OMIM 601284. ALK1 se activa mediante la unión de ligandos de la familia TGF-beta, como BMP9 y BMP10, y la señalización de ALK1 es fundamental en la regulación de la formación de vasos sanguíneos tanto en el desarrollo como patológicos. La expresión de ALK1 se superpone con los sitios de vasculogénesis y angiogénesis en el desarrollo temprano del ratón, y los ratones con inactivación de ALK1 mueren alrededor del día embrionario 11,5 debido a anomalías vasculares graves (ver p.ej., Cunha y Pietras (2011) Blood 117(26):6999-7006.) La expresión de ALK1 también se ha descrito en otros tipos de células como las células estrelladas hepáticas y condrocitos. Además, se ha descubierto que ALK1 junto con la quinasa 2 similar al receptor de activina (ALK2) son importantes para la señalización osteogénica inducida por BMP9 en células madre mesenquimales. Véase p.ej., Cunha y Pietras (2011) Blood 117(26):6999-7006.

ALK2, el producto del gen ACVR1 conocido alternativamente como ActRIA o ACVRLK2, es un receptor de tipo I que se ha demostrado que se une a las las activinas y BMPs. ALK2 es fundamental para la embriogénesis, ya que los ratones con inactivación de ALK2 mueren poco después de la gastrulación. Ver, p.ej., Mishina y col. (1999) Dev Biol.

213: 314-326 y entrada OMIM 102576. Las mutaciones constitutivamente activas en ALK2 se asocian con la fibrodisplasia osificante progresiva (FOP), un trastorno genético poco común que hace que el tejido fibroso, incluidos músculos, tendones y ligamentos, se osifique de forma espontánea o cuando se dañe. Una mutación de arginina a histidina en la posición 206 de ALK2 es una mutación natural asociada con FOP en seres humanos. Esta mutación induce la señalización específica de BMP a través de ALK2 sin la unión del ligando. Ver, p.ej., Fukuda y col., (2009) J Biol Chem. 284(11):7149-7156 and Kaplan y col., (2011) Ann N.Y. Acad Sci. 1237: 5-10.

La quinasa 3 similar al receptor de activina (ALK3), el producto del gen BMPR1A conocido alternativamente como ACVRLK3, es un receptor de tipo I que media los efectos de múltiples ligandos en la familia BMP. A diferencia de varios receptores de tipo I con expresión tisular ubicua, ALK3 muestra un patrón de expresión restringido consistente con una funcionalidad más especializada. Ver, p.ej., ten Dijke (1993) Oncogene, 8: 2879-2887 y entrada OMIM 601299. ALK3 se reconoce generalmente como un receptor de alta afinidad para BMP2, BMP4, BMP7 y otros miembros de la familia BMP. BMP2 y BMP7 son potentes estimuladores de la diferenciación osteoblástica y ahora se utilizan clínicamente para inducir la formación de hueso en fusiones de la columna y ciertas fracturas sin consolidación.

ALK3 se considera un receptor clave en la mediación de la señalización de BMP2 y BMP4 en osteoblastos. Ver, p.ej., Lavery y col. (2008) J. Biol. Chem. 283: 20948-20958. Un ratón homocigoto con inactivación de ALK3 muere temprano en la embriogénesis (~día 9.5), sin embargo, se ha informado recientemente que los ratones adultos que portan una alteración condicional de ALK3 en los osteoblastos exhiben un aumento de la masa ósea, aunque el hueso recién formado mostró evidencia de desorganización. Ver, p.ej., Kamiya (2008) J. Bone Miner. Res., 23:2007-2017; and Kamiya (2008) Development 135: 3801-3811. Este resultado contrasta asombrosamente con la eficacia de BMP2 y BMP7 (ligandos para ALK3) como agentes de formación de huesos en uso clínico.

La quinasa 4 similar al receptor de activina (ALK4), el producto del gen ACVR1B conocido alternativamente como ACVRLK4, es un receptor de tipo I que transduce la señalización de una serie de ligandos de la familia TGF-beta que incluyen activinas, nodales y GDF Las mutaciones de ALK4 están asociadas con el cáncer de páncreas, y la expresión de isoformas de ALK4 truncadas negativas dominantes se expresa en gran medida en los tumores pituitarios humanos. Ver, p.ej., Tsuchida y col., (2008) Endocrine Journal 55(1): 11-21 y entrada OMIM 601300.

La quinasa 5 similar al receptor de activina (ALK5), el producto del gen TGFBR1, se expresa ampliamente en la mayoría de los tipos celulares. Varios ligandos de la superfamilia de TGF-beta, incluidos TGF-beta, activina y GDF-8, emiten señales a través de ALK5 y activan Smad 2 y Smad 3 aguas abajo. Los ratones deficientes en ALK5 exhiben defectos graves en el desarrollo vascular del saco vitelino y la placenta, falta de glóbulos rojos circulantes y mueren a mitad de la gestación. Se encontró que estos embriones tenían un potencial hematopoyético normal, pero una mayor proliferación y migración inadecuada de células endoteliales. Por tanto, la señalización dependiente de ALK5 es importante para la angiogénesis, pero no para el desarrollo de células progenitoras hematopoyéticas y la hematopoyesis funcional. Ver, p.ej. Larsson y col., (2001) The EMBO Journal, 20(7): 1663-1673 y entrada OMIM 190181. En las células endoteliales, ALK5 actúa de manera cooperativa y opuesta a la señalización de ALK1. ALK5 inhibe la migración y proliferación celular, en particular el efecto opuesto de ALK1. Ver, p.ej., Goumans y col. (2003) Mol Cell 12(4): 817-828. Además, se cree que ALK5 regula negativamente el crecimiento muscular. Se descubrió que la eliminación de ALK5 en el músculo, un modelo de distrofia muscular en ratón, disminuye la fibrosis y aumenta la expresión de genes asociados con el crecimiento muscular. Ver, p.ej. Kemaladewi y col., (2014) Mol Ther Nucleic Acids 3, e156.

La quinasa 6 similar al receptor de activina (ALK6) es el producto del gen BMPR1B, cuya deficiencia se asocia con crondodisplasia y defectos en las extremidades tanto en seres humanos como en ratones. Ver, p.ej., Demirhan y col., (2005) J Med Genet. 42:314-317. ALK6 se expresa ampliamente en todo el esqueleto en desarrollo y es necesaria para la condrogénesis en ratones. Ver, p.ej., Yi y col., (2000) Development 127:621-630 y entrada OMIM 603248.

La quinasa 7 similar al receptor de activina (ALK7) es el producto del gen ACVR1C. Los ratones nulos ALK7 son viables, fértiles y no muestran malformaciones esqueléticas o de extremidades. La señalización de GDF3 a través de ALK7 parece desempeñar un papel en la sensibilidad a la insulina y la obesidad. Esto está respaldado por los resultados de que los ratones sin ALK7 muestran una acumulación de grasa reducida y resistencia a la obesidad inducida por la dieta. Ver, p.ej., Andersson y col., (2008) PNAS 105(20): 7252-7256. Se ha implicado que la señalización nodal mediada por ALK7 tiene efectos tanto de promoción como de supresión de tumores en una variedad de diferentes líneas de células cancerosas. Ver, p.ej., De Silva y col., (2012) Frontiers in Endocrinology 3:59 y entrada OMIM 608981.

Como se emplea en esta invención, el término “ActRII” se refiere a la familia de receptores de activina de tipo II. Esta familia incluye tanto el receptor de activina tipo IIA (ActRIIA), codificado por el gen ACVR2A como el receptor de activina tipo IIB (ActRIIB), codificado por el gen ACVR2B. Los receptores ActRII son receptores de tipo II de la superfamilia de TGF-beta que se unen a una variedad de ligandos de la superfamilia de TGF-beta que incluyen activinas, GDF8 (miostatina), GDF11 y un subconjunto de BMP, en particular BMP6 y BMP7. Los receptores ActRII están implicados en una variedad de trastornos biológicos que incluyen trastornos musculares y neuromusculares (p. ej., distrofia muscular, esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y atrofia muscular), crecimiento óseo/de los cartílagos no deseados, trastornos del tejido adiposo (por ejemplo, obesidad), trastornos metabólicos (por ejemplo, diabetes tipo 2) y trastornos neurodegenerativos. Ver, p.ej., Tsuchida y col., (2008) Endocrine Journal 55(1): 11-21, Knopf y col., U.S.8,252,900, y entradas OMIM 102581 y 602730.

El receptor II del factor de crecimiento transformante beta (TGFBRII), codificado por el gen TGFBR2, es un receptor de tipo II que se sabe que se une a ligandos de TGF-beta y activa los efectores Smad 2 y Smad 3 aguas abajo Ver, p.ej., Hinck (2012) FEBS Letters 586: 1860-1870 y entrada OMIM 190182. La señalización de TGF-beta a través de TGFBRII es fundamental en la proliferación de células T, el mantenimiento de las células T reguladoras y la proliferación de células madre precartilaginosas. Ver, p.ej., Li y col., (2006) Immunity 25(3): 455-471 and Cheng y col., Int. J. Mol. Sci. 2014, 15, 12665-12676.

El receptor de proteína morfogenética ósea II (BMPRII), codificado por el gen BMPR2, es un receptor de tipo II que se sabe que se une a ligandos de BMP, incluidos BMP7 y BMP4. La unión eficaz del ligando a BMPRII depende de la presencia de los receptores TGFBR de tipo I apropiados. Ver, p.ej., Rosenzweig y col., (1995) PNAS 92:7632-7636. Las mutaciones en BMPRII están asociadas con la hipertensión pulmonar en seres humanos. Ver entrada OMIM 600799.

El receptor II de sustancia inhibidora de Müller (MISRII), el producto del gen AMHR2 conocido alternativamente como receptor de hormona anti-Mülleriana de tipo II, es un receptor de la superfamilia de TGF-beta de tipo II. MISRII se une al ligando MIS, pero requiere la presencia de un receptor de tipo I apropiado, como ALK3 o ALK6, para la transducción de señales. Ver, p.ej., Hinck (2012) FEBS Letters 586:1860-1870 y entrada OMIM 600956. MISRII está involucrada en la diferenciación sexual en seres humanos y es necesaria para la regresión mülleriana en el macho humano. La AMH se expresa en mujeres en edad reproductiva y no fluctúa con el ciclo o el embarazo, pero se encontró que disminuye gradualmente a medida que disminuyen tanto la cantidad como la calidad de los ovocitos, lo que sugiere que la AMH podría servir como un biomarcador de la fisiología ovárica. Ver, p.ej., Zec y col., (2011) Biochemia Medica 21(3): 219-30 y entrada OMIM 600956.

En ciertos aspectos, la presente divulgación se refiere al uso de complejos heteromultiméricos de brazo único que comprenden un dominio extracelular de un polipéptido receptor de tipo I de la superfamilia de TGFp (por ejemplo, ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6 y ALK7) o un extracelular dominio de un polipéptido receptor de tipo II de la superfamilia de TGFp (p.ej., ActRIIA, ActRlIB, TGFBRII, BMPRII y MiSr II), preferiblemente complejos heteromultímeros solubles, para antagonizar la transducción de señalización intracelular (p. ej., señalización Smad 2/3 y/o Smad 1/5/8) iniciada por uno o más ligandos de la superfamilia de TGFp (p. ej., activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina AE, activina BC, activina BE, Nodal, GDF8, GDF11, BMP6 y/o BMP7). Como se describe en esta invención, tales complejos antagonistas de heteromultímeros de brazo único pueden ser útiles para el tratamiento o la prevención de diversas afecciones asociadas a TGF-beta, que incluyen, sin limitación, enfermedades y trastornos asociados con, por ejemplo, cáncer, músculo, hueso, grasa, glóbulos rojos, metabolismo, fibrosis y otros tejidos afectados por uno o más ligandos de la superfamilia TGF-beta.

En particular, los datos de la presente divulgación demuestran que los complejos heteromultímeros de brazo único que comprenden un dominio extracelular de un polipéptido receptor tipo I de la superfamilia TGFp o un dominio extracelular de un polipéptido receptor tipo II de la superfamilia TGFp tienen diferentes perfiles de selectividad de ligando en comparación con sus correspondientes complejos homomultiméricos.

Los términos usados en esta memoria descriptiva generalmente tienen sus significados habituales en la técnica, dentro del contexto de esta descripción y en el contexto específico en el que se usa cada término. Ciertos términos se describen a continuación o en otra parte de la memoria descriptiva para proporcionar una orientación adicional al facultativo a la hora de describir las composiciones y los procedimientos de la descripción y cómo prepararlos y usarlos. El alcance o significado de cualquier uso de un término resultará evidente a partir del contexto específico en el que se usa.

Los términos "heterómero" o "heteromultímero" son un complejo que comprende al menos un primer polipéptido y un segundo polipéptido, donde el segundo polipéptido difiere en la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido en al menos un residuo de aminoácido. El heterómero puede comprender un "heterodímero" formado por el primer y segundo polipéptido o puede formar estructuras de orden superior donde están presentes polipéptidos además del primer y segundo polipéptido. Estructuras ejemplares para el heteromultímero incluyen heterodímeros, heterotrímeros, heterotetrámeros y otras estructuras oligoméricas. Los heterodímeros se designan en esta invención como X:Y o de forma equivalente como X-Y, donde X representa una primera cadena polipeptídica e Y representa una segunda cadena polipeptídica. Los heterómeros de orden superior y las estructuras oligoméricas se designan en esta invención de la manera correspondiente. En determinadas realizaciones, un heteromultímero es recombinante (por ejemplo, uno o más componentes polipeptídicos pueden ser una proteína recombinante), aislada y/o purificada.

“Homóloga”, en todas sus formas gramaticales y variaciones ortográficas, se refiere a la relación entre dos proteínas que poseen un “origen evolutivo común”, lo que incluye proteínas de superfamilias de la misma especie de organismo, así como proteínas homólogas de diferentes especies de organismos. Tales proteínas (y sus ácidos nucleicos codificantes) tienen homología de secuencia, como refleja su similitud de secuencia, ya sea en términos de porcentaje de identidad o por la presencia de residuos o motivos específicos y posiciones conservadas. Sin embargo, en el uso habitual y en la presente solicitud, el término “homólogo”, cuando está modificado con un adverbio tal como “altamente”, se puede referir a similitud de secuencia y puede o no estar relacionado con un origen evolutivo común.

El término “similitud de secuencia”, en todas sus formas gramaticales, se refiere al grado de identidad o correspondencia entre las secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos que pueden compartir o no un origen evolutivo común.

“Porcentaje (%) de identidad de secuencia” con respecto a una secuencia de polipéptido (o nucleótidos) de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácido (o ácidos nucleicos) de una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácido (o ácidos nucleicos) de la secuencia de polipéptido (o nucleótidos) de referencia, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para conseguir el porcentaje de identidad de secuencia máximo y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación a efectos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se puede conseguir de diversas maneras que se encuentran dentro de los conocimientos de los expertos en la técnica, por ejemplo, usando software informático disponible públicamente tal como el software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para alinear secuencias, lo que incluye cualquier algoritmo necesario para conseguir el alineamiento máximo a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se están comparando. Sin embargo, a efectos de esta solicitud, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos (ácidos nucleicos) se generan usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 fue creado por Genentech, Inc. y el código fuente se ha depositado con la documentación del usuario en la Oficina de Derechos de Autor de los EE. UU., Washington D.C., 20559, en la que está registrado con el n.° de registro de derechos de autor de los EE. UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente en Genentech, Inc., South San Francisco, Calif., o se puede compilar a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 se debe compilar para uso en un sistema operativo UNIX, lo que incluye UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias son establecidos por el programa ALIGN-2 y no varían.

Como se emplea en esta solicitud, la expresión “no se une sustancialmente a X ” está destinada a significar que un agente tiene una K^d que es superior a aproximadamente 10^{' 7} , 10^{' 6} , 10^{' 5} , 10^{' 4} o superior (^p.ej.,, ausencia de unión detectable mediante el ensayo usado para determinar la K^d para “X”.

2. Complejos heteromultiméricos que comprenden polipéptidos receptores de la superfamilia TGFp de brazo único

En ciertos aspectos, la divulgación se refiere a complejos de proteínas heteromultiméricas que comprenden uno o más polipéptidos receptores de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta de brazo único. En determinadas realizaciones, los polipéptidos descritos en esta invención pueden formar complejos de proteínas que comprenden un primer polipéptido asociado covalente o no covalentemente con un segundo polipéptido, donde el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de un polipéptido receptor de tipo I o tipo II y la secuencia de aminoácidos. de un primer miembro de un par de interacción; y el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de un segundo miembro del par de interacción, y donde el segundo polipéptido no comprende un polipéptido receptor de tipo I o tipo II. El par de interacción puede ser dos secuencias polipeptídicas cualesquiera que interaccionen para formar un complejo, particularmente un complejo heterodimérico, aunque las realizaciones operativas también pueden emplear un par de interacción que forma una secuencia homodimérica. Como se describe en esta invención, un miembro del par de interacción puede fusionarse con un polipéptido receptor de tipo I o tipo II, tal como un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o l00 % idéntica a la secuencia de cualquiera de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11, 14, 15, 18, 19, 22, 23, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 38, 39, 42, 43, 46, 47, 50, 51, 67, 68, 71, 72, 75, 76, 79, 80, 83, 84, 87, 88, 91, 92, 301, 302, 305, 306, 309, 310 y 313. Preferiblemente, el par de interacción se selecciona para conferir una vida media en suero mejorada, o para actuar como un adaptador al que se une otro resto, como un resto de polietilenglicol, para proporcionar una vida media en suero mejorada en relación con la forma monomérica. del polipéptido receptor de tipo I o tipo II.

Como se muestra en esta invención, las formas monoméricas (de brazo único) de los receptores de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta pueden exhibir una selectividad de unión al ligando sustancialmente alterada en comparación con sus formas homodiméricas correspondientes, pero las formas monoméricas tienden a tener un tiempo de residencia en suero corto (vida media), que no es deseable en el marco terapéutico. Un mecanismo común para mejorar la vida media en suero es expresar un polipéptido como una proteína de fusión homodimérica con una porción de dominio constante (por ejemplo, una porción Fc) de una IgG. Sin embargo, los polipéptidos receptores de la superfamilia de TGF-beta expresados como proteínas homodiméricas (por ejemplo, en una construcción de fusión Fc) pueden no exhibir el mismo perfil de actividad que la forma monomérica. Como se demuestra en esta invención, el problema se puede resolver fusionando la forma monomérica con un resto que prolonga la vida media y, sorprendentemente, esto se puede lograr fácilmente expresando proteínas como una proteína de fusión heterodimérica asimétrica en la que se fusiona un miembro de un par de interacción. a un polipéptido receptor de la superfamilia de TGF-beta y otro miembro del par de interacción se fusiona con ningún resto o con un resto heterólogo, lo que da como resultado un nuevo perfil de unión a ligando junto con una mejora en la vida media en suero conferida por el par de interacción.

En ciertos aspectos, la presente divulgación se refiere a complejos heteromultiméricos de brazo único que comprenden al menos un polipéptido receptor de tipo I de la superfamilia de TGF-beta (por ejemplo, ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6 y ALK7, así como las SEQ ID NO: 14, 15, 18, 19, 22, 23, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 38, 39, 83, 84, 87, 88, 91, 92, 301, 302, 305, 306, 309, 310, 313) o al menos un polipéptido receptor de tipo II de la superfamilia de TGF-beta (p. ej., ActRIIA, ActRIIB, TGFBRII, BMPRII y MISRII, así como SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11, 42, 43, 46, 47, 50, 51,67, 68, 71, 72, 75, 76, 79 y 80), que generalmente se denominan en esta invención "complejos heteromultiméricos de brazo único de la divulgación". o "complejos heteromultímeros de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta". Preferiblemente, los complejos heteromultiméricos de brazo único de la divulgación son solubles, por ejemplo, un complejo de heteromultímero de brazo único comprende una porción soluble de al menos un polipéptido receptor de tipo I de la superfamilia de TGFp o una porción soluble de al menos un polipéptido receptor de tipo II de la superfamilia de TGFp. En general, los dominios extracelulares de los receptores de tipo I y tipo II de la superfamilia de TGFp corresponden a una porción soluble del receptor de tipo I o tipo II. Por lo tanto, en algunas realizaciones, los complejos heteromultiméricos de brazo único de la divulgación comprenden un dominio extracelular de un polipéptido receptor de tipo I de la superfamilia de TGFp (por ejemplo, uno o más dominios extracelulares del receptor ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6, y/o ALK7) o un dominio extracelular de un polipéptido receptor de tipo II de la superfamilia de TGFp (p. ej., uno o más ActRIIA, ActRIIB, TGFBRII, BMPRII, y/o dominios extracelulares del receptor MISRII). Los dominios extracelulares ejemplares de ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6, ALK7, ActRIIA, ActRIIB, TGFBRII, BMPRII y MISRII se describen en esta invención y tales secuencias, así como fragmentos, variantes funcionales y formas modificadas de los mismos, pueden ser usados de acuerdo con las invenciones de la presente divulgación (por ejemplo, composiciones de complejos heteromultiméricos de brazo único y usos de los mismos).

Un motivo estructural definitorio conocido como pliegue de toxina de tres dedos es importante para la unión del ligando por los receptores de tipo I y tipo II y está formado por 10, 12 o 14 residuos de cisteína conservados ubicados en posiciones variables dentro del dominio extracelular de cada receptor monomérico. Ver, p.ej., Greenwald y col. (1999) Nat Struct Biol 6:18-22; Hinck (2012) FEBS Lett 586:1860-1870. Cualquiera de los complejos heteroméricos descritos en esta invención puede comprender dicho dominio de un receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta. Los dominios de unión al ligando central de los receptores de la superfamilia de TGFp, según lo demarcado por la más externa de estas cisteínas conservadas, corresponden a las posiciones 29-109 de SEQ ID NO: 1 (precursor de ActRIIB); posiciones 30-110 de SEQ ID NO: 9 (precursor de ActRIIA); posiciones 34-95 de SEQ ID NO: 14 (precursor de ALk 1); posiciones 35-99 de SEQ ID NO: 18 (precursor de ALK2); posiciones 61-130 de SEQ ID NO: 22 (precursor de ALK3); posiciones 34-101 de SEQ ID NO: 26 y 83 (precursores de ALK4); posiciones 36-106 de SEQ ID NO: 30 y 87 (precursores de ALK 5); posiciones 32-102 de SEQ ID NO: 34 (precursor de la isoforma B de ALK6); posiciones 28-92 de SEQ ID NO: 38, 305 y 309 (precursores de ALK7); posiciones 51-143 de SEQ ID NO: 42 (precursor de la isoforma B de TGFBRII); posiciones 34-123 de SEQ ID NO: 46 y 71 (precursores de BMPRII); posiciones 24-116 de SEQ ID NO: 50, 75 y 79 (precursores de MISRII); posiciones 44-168 de SEQ ID NO: 67 (precursor de la isoforma A de TGFBRII); y posiciones 62-132 de SEQ ID NO: 91 (precursor de la isoforma A de ALK6). Los aminoácidos estructuralmente menos ordenados que flanquean estas secuencias centrales demarcadas por cisteína se pueden truncar por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 o 37 residuos en cualquiera de los extremos sin alterar necesariamente el ligando vinculante. Dominios extracelulares ejemplares para truncamiento de extremo N y/o extremo C incluyen SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6, 10, 1115, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 51, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 302, 306, 310 y 313.

En otras realizaciones preferidas de la invención, los complejos heteromultímeros de brazo único de la divulgación se unen e inhiben (antagonizan) la actividad de uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-beta que incluyen, pero no se limitan a, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-P1, TGF-P2, TGF-P3, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina AE, activina BC, activina BE, nodal, factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF), neurturina, artemina, persefina, MIS y Lefty. En particular, los complejos heteromultiméricos de brazo único de la divulgación pueden usarse para antagonizar la transducción de señalización intracelular (por ejemplo, señalización Smad 2/3 y/o Smad 1/5/8) iniciada por uno o más ligandos de la superfamilia de TGFp. Como se describe en esta invención, tales complejos antagonistas de heteromultímeros pueden ser útiles para el tratamiento o la prevención de diversas afecciones asociadas a TGF-beta, que incluyen, sin limitación, enfermedades y trastornos asociados con, por ejemplo, cáncer, músculo, hueso, grasa, glóbulos rojos, metabolismo, fibrosis y otros tejidos afectados por uno o más ligandos de la superfamilia TGF-beta. En algunas realizaciones, los complejos heteromultiméricos de brazo único de la divulgación tienen diferentes perfiles de unión a ligando en comparación con su correspondiente complejo homomultimérico (por ejemplo, un heterodímero ActRIIB-Fc:Fc vs un homodímerocorrespondiente ActRNB-Fc:ActRNB-Fc o Fc:Fc). Como se describe en esta invención, los complejos heteromultiméricos de brazo único de la divulgación incluyen, por ejemplo, heterodímeros, heterotrímeros, heterotetrámeros y estructuras oligoméricas adicionales basadas en un complejo unitario de brazo único. En ciertas realizaciones preferidas de la invención, los complejos heteromultiméricos de brazo único de la divulgación son heterodímeros.

Como se emplea en esta solicitud, el término “ActRIIB” se refiere a una familia de proteínas de receptor de activina de tipo IIB (ActRIIB) de cualquier especie y a variantes derivadas de tales proteínas ActRIIB mediante mutagénesis u otra modificación. La referencia a ActRIIB en esta solicitud se entiende que es una referencia a una cualquiera de las formas identificadas actualmente. Los miembros de la familia ActRIIB generalmente son proteínas transmembranarias, compuestas por un dominio extracelular de unión a ligando que comprende una región rica en cisteína, un dominio transmembranario y un dominio citoplásmico con actividad serina/treonina cinasa prevista.

El término “polipéptido de ActRIIB” incluye polipéptidos que comprenden cualquier polipéptido de origen natural de un miembro de la familia ActRIIB, así como cualquier variante de los mismos (lo que incluye mutantes, fragmentos, fusiones y formas peptidomiméticas), que conserva una actividad útil. Ejemplos de tales variantes de polipéptidos de ActRIIB se proporcionan a lo largo de la presente descripción, así como en la solicitud de patente internacional con n.° de publicación WO 2006/012627. La numeración de los aminoácidos para todos lo polipéptidos relacionados con ActRIIB descritos en esta solicitud se basa en la numeración de la secuencia de proteína precursora de ActRIIB humano proporcionada más adelante (SEQ ID NO:1), a menos que se designe específicamente de otro modo. La secuencia de la proteína precursora ActRIIB humana es la siguiente:

1 MTAPWVALAL LWGSLCAGSGRGEAETRECI YYNANWELER TNQSGLERCE

51 GEQDKRLHCY ASWRNSSGTI ELVKKGCWLD DFNCYDRQEC VATEENPQVY

101 FCCCEGNFCN ERFTHLPEAG GPEVTYEPPP TAPTLLTVLAYSLLPIGGLS

151 LIVLLAFWMY RHRKPPYGHV DIHEDPGPPP PSPLVGLKPL QLLEIKARGR

201 FGCVWKAQLMNDFVAVKIFP LQDKQSWQSE REIFSTPGMK HENLLQFIAA

251 EKRGSNLEVE LWLITAFHDKGSLTDYLKGN IITWNELCHVAETMSRGLSY

301 LHEDVPWCRG EGHKPSIAHR DFKSKNVLLK SDLTAVLADF GLAVRFEPGK

351 PPGDTHGQVG TRRYMAPEVL EGAINFQRDA FLRIDMYAMG LVLWELVSRC

401 KAADGPVDEY MLPFEEEIGQ HPSLEELQEVVVHKKMRPTI KDHWLKHPGL

451 AQLCVTIEEC WDHDAEARLS AGCVEERVSL IRRSVNGTTS DCLVSLVTSV

501 TNVDLPPKES SI (SEQ IDNO: 1)

El péptido señal está indicado con subrayado único; el dominio extracelular está indicado en negrita y los puntos de N-glucosilación endógenos potenciales están indicados con subrayado doble.

La secuencia del polipéptido de ActRIIB humano (extracelular) soluble procesado es la siguiente:

GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDD

FNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID

NO: 2).

En algunas realizaciones, la proteína se puede producir con una secuencia “SGR...” en el extremo N. La “cola” del extremo C del dominio extracelular está indicada mediante subrayado único. La secuencia con la "cola" eliminada (una secuencia A15) es la siguiente:

GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDD

FNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEA (SEQ ID NO: 3).

También se describe en la bibliografía una forma de ActRIIB con una alanina en la posición 64 de SEQ ID NO: 1 (A64). Ver, p.ej., Hilden y col. (1994) Blood, 83(8): 2163-2170. Los solicitantes han determinado que una proteína de fusión ActRIIB-Fc que comprende un dominio extracelular de ActRIIB con la sustitución A64 tiene una afinidad relativamente baja por la activina y el GDF11. Por el contrario, la misma proteína de fusión ActRIIB-Fc con una arginina en la posición 64 (R64) tiene una afinidad para la activina y el GDF11 en el intervalo de nanomolar bajo a picomolar alto. Por lo tanto, las secuencias con una R64 se usan como la secuencia de referencia de “tipo natural” para ActRIIB humano en esta descripción.

La forma de ActRIIB con una alanina en la posición 64 es la siguiente:

1 MTAPWVALAL LWGSLCAGSG RGEAETRECI YYNANWELER TNQSGLERCE

51 GEQDKRLHCY ASWANSSGTI ELVKKGCWLD DFNCYDRQEC VATEENPQVY

101 FCCCEGNFCN ERFTHLPEAG GPEVTYEPPP TAPTLLTVLA YSLLPIGGLS

151 LIVLLAFWMY RHRKPPYGHV DIHEDPGPPP PSPLVGLKPL QLLEIKARGR

201 FGCVWKAQLM NDFVAVKIFP LQDKQSWQSE REIFSTPGMK HENLLQFIAA

251 EKRGSNLEVE LWLITAFHDK GSLTDYLKGN IITWNELCHV AETMSRGLSY

301 LHEDVPWCRG EGHKPSIAHR DFKSKNVLLK SDLTAVLADF GLAVRFEPGK

351 PPGDTHGQVG TRRYMAPEVL EGAINFQRDA FLRIDMYAMG LVLWELVSRC

401 KAADGPVDEY MLPFEEEIGQ HPSLEELQEV WHKKMRPTI KDHWLKHPGL

451 AQLCVTIEEC WDHDAEARLS AGCVEERVSL IRRSVNGTTS DCLVSLVTSV

501 TNVDLPPKES SI (SEQ ID NO: 4)

El péptido señal está indicado mediante subrayado único y el dominio extracelular está indicado en negrita.

La secuencia del polipéptido de ActRIIB extracelular procesado de la forma A64 alternativa es la siguiente:

GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSSGTIELVKKGCWLDD

FNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID

NO: 5)

En algunas realizaciones, la proteína se puede producir con una secuencia “SGR...” en el extremo N. La “cola” del extremo C del dominio extracelular está indicada mediante subrayado único. La secuencia con la "cola" eliminada (una secuencia A15) es la siguiente:

GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSSGTIELVKKGCWLDD

FNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEA (SEQ ID NO: 6)

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína precursora de ActRIIB humano se muestra a continuación (SEQ ID NO: 7), que consiste en nucleótidos 25-1560 de la secuencia de referencia de Genbank NM_001106.3, que codifica los aminoácidos 1-513 del precursor de ActRIIB. La secuencia mostrada proporciona una arginina en la posición 64 y se puede modificar para proporcionar una alanina en su lugar. La secuencia señal está subrayada.

1 ATGACGGCGC CCTGGGTGGC CCTCGCCCTC CTCTGGGGAT CGCTGTGCGC

51 CGGCTCTGGG CGTGGGGAGG CTGAGACACG GGAGTGCATC TACTACAACG

101 CCAACTGGGA GCTGGAGCGC ACCAACCAGA GCGGCCTGGA GCGCTGCGAA

151 GGCGAGCAGG ACAAGCGGCT GCACTGCTAC GCCTCCTGGC GCAACAGCTC

201 TGGCACCATC GAGCTCGTGA AGAAGGGCTG CTGGCTAGAT GACTTCAACT

251 GCTACGATAG GCAGGAGTGT GTGGCCACTG AGGAGAACCC CCAGGTGTAC

301 TTCTGCTGCT GTGAAGGCAA CTTCTGCAAC GAACGCTTCA CTCATTTGCC

351 AGAGGCTGGG GGCCCGGAAG TCACGTACGA GCCACCCCCG ACAGCCCCCA

401 CCCTGCTCAC GGTGCTGGCC TACTCACTGC TGCCCATCGG GGGCCTTTCC

451 CTCATCGTCC TGCTGGCCTT TTGGATGTAC CGGCATCGCA AGCCCCCCTA

501 CGGTCATGTG GACATCCATG AGGACCCTGG GCCTCCACCA CCATCCCCTC

551 TGGTGGGCCT GAAGCCACTG CAGCTGCTGG AGATCAAGGC TCGGGGGCGC

601 TTTGGCTGTG TCTGGAAGGC CCAGCTCATG AATGACTTTG TAGCTGTCAA

651 GATCTTCCCA CTCCAGGACA AGCAGTCGTG GCAGAGTGAA CGGGAGATCT

701 TCAGCACACC TGGCATGAAG CACGAGAACC TGCTACAGTT CATTGCTGCC

751 GAGAAGCGAG GCTCCAACCT CGAAGTAGAG CTGTGGCTCA TCACGGCCTT

801 CCATGACAAG GGCTCCCTCA CGGATTACCT CAAGGGGAAC ATCATCACAT

851 GGAACGAACT GTGTCATGTA GCAGAGACGA TGTCACGAGG CCTCTCATAC

901 CTGCATGAGG ATGTGCCCTG GTGCCGTGGC GAGGGCCACA AGCCGTCTAT

951 TGCCCACAGG GACTTTAAAA GTAAGAATGT ATTGCTGAAG AGCGACCTCA

1001 CAGCCGTGCT GGCTGACTTT GGCTTGGCTG TTCGATTTGA GCCAGGGAAA

1051 CCTCCAGGGG ACACCCACGG ACAGGTAGGC ACGAGACGGT ACATGGCTCC

1101 TGAGGTGCTC GAGGGAGCCA TCAACTTCCA GAGAGATGCC TTCCTGCGCA

1151 TTGACATGTA TGCCATGGGG TTGGTGCTGT GGGAGCTTGT GTCTCGCTGC

1201 AAGGCTGCAG ACGGACCCGT GGATGAGTAC ATGCTGCCCT TTGAGGAAGA

1251 GATTGGCCAG CACCCTTCGT TGGAGGAGCT GCAGGAGGTG GTGGTGCACA

1301 AGAAGATGAG GCCCACCATT AAAGATCACT GGTTGAAACA CCCGGGCCTG

1351 GCCCAGCTTT GTGTGACCAT CGAGGAGTGC TGGGACCATG ATGCAGAGGC

1401 TCGCTTGTCC GCGGGCTGTG TGGAGGAGCG GGTGTCCCTG ATTCGGAGGT

1451 CGGTCAACGG CACTACCTCG GACTGTCTCG TTTCCCTGGT GACCTCTGTC

1501 ACCAATGTGG ACCTGCCCCC TAAAGAGTCA AGCATC (SEQ ID NO: 7)

Una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de ActRIIB humano (extracelular) soluble procesado es la siguiente (SEQ ID NO: 8). La secuencia mostrada proporciona una arginina en la posición 64 y se puede modificar para proporcionar una alanina en su lugar.

1 GGGCGTGGGG AGGCTGAGAC ACGGGAGTGC ATCTACTACA ACGCCAACTG

51 GGAGCTGGAG CGCACCAACC AGAGCGGCCT GGAGCGCTGC GAAGGCGAGC

101 AGGACAAGCG GCTGCACTGC TACGCCTCCT GGCGCAACAG CTCTGGCACC

151 ATCGAGCTCG TGAAGAAGGG CTGCTGGCTA GATGACTTCA ACTGCTACGA

201 TAGGCAGGAG TGTGTGGCCA CTGAGGAGAA CCCCCAGGTG TACTTCTGCT

251 GCTGTGAAGG CAACTTCTGC AACGAACGCT TCACTCATTT GCCAGAGGCT

301 GGGGGCCCGG AAGTCACGTA CGAGCCACCC CCGACAGCCC CCACC

SEQ ID NO: 8)

Una alineación de las secuencias de aminoácidos del dominio extracelular soluble de ActRIIB humano y el dominio extracelular soluble de ActRIIA humano se ilustra en la Figura 3. Esta alineación indica residuos de aminoácidos dentro de ambos receptores que se cree que entran en contacto directamente con ligandos de ActRII. La Figura 4 representa una alineación de múltiples secuencias de diversas proteínas de ActRIIB de vertebrados y ActRIIA humano. A partir de estas alineaciones, es posible predecir las posiciones de aminoácidos clave dentro del dominio de unión a ligando que son importantes para las actividades de unión ActRII-ligando normales, así como predecir las posiciones de los aminoácidos que es probable que sean tolerantes a sufrir sustitución sin alterar significativamente las actividades de unión ActRII-ligando normales. Las proteínas ActRII se han caracterizado en la técnica en términos de características estructurales y funcionales, particularmente con respecto a la unión de ligandos. Ver, p.ej., Attisano y col. (1992) Cell 68(1):97-108; Greenwald y col. (1999) Nature Structural Biology 6(1): 18-22; Allendorph y col. (2006) PⁿA^s 103(20: 7643-7648; Thompson y col. (2003) The EMBO Journal 22(7): 1555-1566; así como Patentes EE. UU. Nos: 7,709,605, 7,612,041, y 7,842,663.

Por ejemplo, Attisano y col. demostraron que una eliminación del nudo de prolina en el extremo carboxiterminal del dominio extracelular de ActRIIB reducía la afinidad del receptor por la activina. Una proteína de fusión ActRIIB-Fc que contiene los aminoácidos 20-119 de la presente SEQ ID ⁿO: 1, “ActRIIB(20119)-Fc” tiene unión reducida a GDF11 y activina con respecto a una ActRIIB(20134)-Fc, que incluye la región de nudo de prolina y el dominio yuxtamembranario completo (ver, p.ej., U^s . Patente No. 7,842,663). Sin embargo, una proteína ActRIIB(20-129)-Fc conserva una actividad similar, aunque algo reducida, con respecto al tipo natural, incluso aunque la región de nudo de prolina esté alterada. Por tanto, los dominios extracelulares de ActRIIB que terminan en el aminoácido 134, 133, 132, 131, 130 y 129 (con respecto a SEQ ID NO:1) se espera que sean todos activos, pero las construcciones que terminan en el 134 o 133 pueden ser más activas. Similarmente, las mutaciones en cualquiera de los residuos 129­ 134 (con respecto a SEQ ID NO: 1) no se espera que alteren la afinidad de unión a ligando por márgenes grandes. Para respaldar esto, las mutaciones de P129 y P130 (con respecto a SEQ ID NO: 1) no reducen sustancialmente la unión a ligando. Por lo tanto, un polipéptido de ActRIIB de la presente descripción puede terminar tan pronto como en el aminoácido 109 (la cisteína final), sin embargo, las formas que terminan en, o entre, 109 y 119, (p. ej., 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118 o 119) se espera que tengan unión a ligando reducida. El aminoácido 119 (con respecto a la presente SEQ ID NO: 1) está mal conservado y, por tanto, se altera o trunca fácilmente. Los polipéptidos de ActRIIB y las trampas de GDF a base de ActRIIB que terminan en 128 (con respecto a SEQ ID NO: 1) o posterior deberían conservar actividad de unión a ligando. Los polipéptidos de ActRIIB y las trampas de GDF a base de ActRIIB que terminan en, o entre, el 119 y 127 (p. ej., 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126 o 127), con respecto a SEQ ID NO: 1, tendrán una capacidad de unión intermedia. Puede ser deseable usar cualquiera de estas formas, en función del entorno clínico o experimental.

En el extremo N de ActRIIB, se espera que una proteína que comienza en el aminoácido 29 o antes (con respecto a SEQ ID NO: 1) conservará actividad de unión a ligando. El aminoácido 29 representa la cisteína inicial. Una mutación de alanina a asparagina en la posición 24 (con respecto a SEQ ID NO: 1) introduce una secuencia de N-glicosilación sin afectar sustancialmente a la unión al ligando. Ver, p.ej., Patente EE. UU. No. 7,842,663. Esto confirma que las mutaciones en la región situada entre el péptido señal de escisión y la región reticulada de cisteína, que corresponde a los aminoácidos 2029, se toleran bien. En particular, los polipéptidos de ActRIIB y las trampas de GDF a base de ActRIIB que comienzan en la posición 20, 21,22, 23 y 24 (con respecto a SEQ ID NO: 1) deberían conservar actividad general de unión a ligando, y los polipéptidos de ActRIIB y las trampas de GDF a base de ActRIIB que comienzan en las posiciones 25, 26, 27, 28 y 29 (con respecto a SEQ ID NO: 1) también se espera que conserven actividad de unión a ligando. Los datos mostrados en, p.ej., Patente EE. UU. No. 7,842,663 demuestran que, sorprendentemente, una construcción de ActRIIB que comienza en 22, 23, 24 o 25 tendrá la actividad máxima.

Tomados en conjunto, una porción activa (por ejemplo, porción de unión a ligando) de ActRIIB comprende los aminoácidos 29-109 de SEQ ID NO: 1. Por lo tanto, los polipéptidos de ActRIIB de la presente divulgación pueden comprender, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una porción de ActRIIB que comienza en un residuo correspondiente a los aminoácidos 20­ 29 (p. ej., comienza en el aminoácido 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29) de SeQ ID NO: 1 y termina en una posición correspondiente a los aminoácidos 109-134 (p.ej., termina en el aminoácido 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, o 134) de SEQ ID NO: 1. Otros ejemplos incluyen polipéptidos que comienzan en una posición de 20-29 (p.ej., posición 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, o 29) o 21-29 (p.ej., posición 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, o 29) y termina en una posición de 119-134 (p.ej., 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, o 134), 119-133 (p.ej., 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, o 133), 129-134 (p.ej., 129, 130, 131, 132, 133, o 134), o 129­ 133 (p.ej., 129, 130, 131, 132, o 133) de SEQ ID NO: 1. Otros ejemplos incluyen construcciones que comienzan en una posición de 20-24 (p.ej., 20, 21, 22, 23, o 24), 21-24 (p.ej., 21, 22, 23, o 24), o 22-25 (p.ej., 22, 22, 23, o 25) y termina en una posición de 109-134 (p.ej., 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, o 134), 119-134 (p.ej., 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, o 134) o 129-134 (p.ej., 129, 130, 131, 132, 133, o 134) de SEQ ID NO: 1. También se contemplan variantes dentro de estos intervalos, particularmente aquellas que tienen al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la porción correspondiente de SEQ ID NO: 1.

La descripción incluye los resultados de un análisis de estructuras de ActRIIB compuestas, mostradas en la Figura 3, que demuestra que la bolsa de unión a ligando está definida, en parte, por los residuos Y31, N33, N35, L38 a T41, E47, E50, Q53 a K55, L57, H58, Y60, S62, K74, W78 a N83, Y85, R87, A92 y E94 a F101. En estas posiciones, se espera que se toleren mutaciones conservativas. R40 es una K en Xenopus, lo que indica que se tolerarán aminoácidos básicos en esta posición. Q53 es R en ActRIIB bovino y K en ActRIIB de Xenopus y, por lo tanto, se tolerarán aminoácidos que incluyen R, K, Q, N y H en esta posición. Por tanto, una fórmula general para un polipéptido de ActRIIB de la divulgación es una que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticos a los aminoácidos 29-109 de SEQ ID NO: 1, comenzando opcionalmente en una posición que varía de 20-24 (p.ej., 20, 21, 22, 23, o 24) o 22-25(p.ej., 22, 23, 24, o 25) y termina en una posición que va de 129-134 (p.ej., 129, 130, 131, 132, 133, o 134), y que comprende no más de 1, 2, 5, 10 o 15 cambios conservativos de aminoácidos en la bolsa de unión al ligando, y cero, una o más alteraciones no conservativas en las posiciones 40, 53, 55, 74, 79 y / o 82 en la bolsa de unión al ligando. Los puntos fuera de la bolsa de unión en los que la variabilidad se puede tolerar particularmente bien, incluyen los extremos amino y carboxi del dominio extracelular (como se señaló anteriormente) y las posiciones 42-46 y 65-73 (con respecto a la SEQ ID NO: 1). Una alteración de asparagina a alanina en la posición 65 (N65A) mejora en realidad la unión al ligando en el fondo de A64 y, por tanto, se espera que no tenga un efecto perjudicial sobre la unión al ligando en el fondo de R64. Ver, p.ej., Patente EE. UU. No. 7,842,663. Este cambio probablemente elimina la glucosilación en N65 del fondo de A64, lo que demuestra, por tanto, que es probable que se tolere un cambio significativo en esta región. Mientras que un cambio R64A se tolera mal, R64K se tolera bien y, por tanto, otro residuo básico, tal como H, se puede tolerar bien en la posición 64. Ver, p.ej., Patente EE. UU. No. 7,842,663.

ActRIIB se conserva bien en prácticamente todos los vertebrados, con grandes tramos del dominio extracelular conservados completamente. Muchos de los ligandos que se unen a ActRIIB también están muy conservados. Por consiguiente, las comparaciones de secuencias de ActRIIB de diversos organismos vertebrados proporcionan una idea de los residuos que se pueden alterar. Por lo tanto, una variante de polipéptido de ActRIIB humano útil según los procedimientos descritos actualmente pueden incluir uno o más aminoácidos en las posiciones correspondientes de la secuencia de otro ActRIIB de vertebrado, o pueden incluir un residuo que es similar al de la secuencia humana o de otro vertebrado. Los ejemplos siguientes ilustran esta estrategia para definir una variante de ActRIIB activa. L46 es una valina en ActRIIB de Xenopus y, por tanto, esta posición se puede alterar y, opcionalmente se puede alterar a otro residuo hidrófobo, tal como V, I o F, o un residuo apolar tal como A. E52 es una K en Xenopus, lo que indica que este punto puede tolerar un amplio abanico de cambios, que incluyen residuos polares, tales como E, D, K, R, H, S, T, P, G, Y y probablemente A. T93 es una K en Xenopus, lo que indica que se tolera una amplia variación estructural en esta posición, con los residuos polares favorecidos, tales como S, K, R, E, D, H, G, P, G e y. F108 es una Y en Xenopus y, por lo tanto, se debería tolerar Y u otro grupo hidrófobo, tal como I, V o L. E111 es K en Xenopus, lo que indica que se tolerarán residuos cargados en esta posición, lo que incluye D, R, K y H, así como Q y N. R112 es K en Xenopus, lo que indica que se toleran residuos básicos en esta posición, lo que incluye R y H. A en la posición 119 está relativamente mal conservada y se presenta como P en roedores y V en Xenopus, por tanto, se debería tolerar esencialmente cualquier aminoácido en esta posición.

Las variaciones descritas en esta solicitud se pueden combinar de diversas maneras. Adicionalmente, los resultados del programa de mutagénesis descrito en la técnica indican que hay posiciones de aminoácidos en ActRIIB que a menudo es beneficioso conservar. Con respecto a SEQ ID NO: 1, estas incluyen la posición 64 (aminoácido básico), posición 80 (aminoácido ácido o hidrófobo), posición 78 (hidrófobo, y particularmente triptófano), posición 37 (ácido, y particularmente ácido aspártico o glutámico), posición 56 (aminoácido básico), posición 60 (aminoácido hidrófobo, particularmente fenilalanina o tirosina). Así, en los polipéptidos de ActRIIB descritos en esta invención, la descripción proporciona una estructura de aminoácidos que se puede conservar. Otras posiciones que puede ser deseable conservar son las siguientes: la posición 52 (aminoácido ácido), posición 55 (aminoácido básico), posición 81 (ácido), 98 (polar o cargado, particularmente E, D, R o K), todas con respecto a SEQ ID NO: 1.

En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a complejos heteromultiméricos de brazo único que comprenden al menos un polipéptido de ActRIIB, que incluye fragmentos, variantes funcionales y formas modificadas de los mismos. Preferiblemente, los polipéptidos de ActRIIB para usar de acuerdo con las invenciones de la divulgación (por ejemplo, complejos heteromultímeros de brazo único que comprenden un polipéptido de ActRIIB y usos del mismo) son solubles (por ejemplo, un dominio extracelular de ActRIIB). En otras realizaciones preferidas de la invención, los polipéptidos de ActRIIB para su uso de acuerdo con las invenciones de la divulgación se unen a y/o inhibir (antagonizar) la actividad (p. ej., inducción de Smad 2/3 y/o señalización de Smad 1/5/8) de uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-beta. En algunas realizaciones, los complejos heteromultiméricos de brazo único de la divulgación comprenden al menos un polipéptido de ActRIIB que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % idéntico a una porción de ActRIIB que comienza en un residuo correspondiente a los aminoácidos 20-29 (por ejemplo, que comienza en el aminoácido 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29) de SEQ ID NO: 1 y termina en una posición correspondiente a los aminoácidos 109-134 (por ejemplo, termina en el aminoácido 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134) de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, los complejos heteromultiméricos de brazo único de la divulgación comprenden al menos un polipéptido ActRIIB que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % idéntico a una porción de ActRIIB que comienza en un residuo correspondiente a los aminoácidos 20-29 (por ejemplo, que comienza en el aminoácido 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29) de SEQ ID NO: 1 y termina en una posición correspondiente a los aminoácidos 109-134 (por ejemplo, termina en el aminoácido 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134) de SEQ ID NO: 1, donde la posición correspondiente a L79 de SEQ ID NO: 1 es un aminoácido ácido (es decir, un residuo de aminoácido D o E). En ciertas realizaciones preferidas de la invención, los complejos heteromultiméricos de brazo único de la divulgación comprenden al menos un polipéptido de ActRIIB que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % de aminoácidos idénticos 29-109 de SEQ ID NO: 1. En otras realizaciones preferidas de la invención, los complejos heteromultiméricos de brazo único de la divulgación comprenden al menos un polipéptido de ActRIIB que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o aminoácidos 100 % idénticos 29-109 de SeQ ID NO: 1, en donde la posición correspondiente a L79 de SEQ ID NO: 1 es un aminoácido ácido (es decir, un residuo de aminoácido D o E). En algunas realizaciones, los complejos heteromultímeros de brazo único de la divulgación comprenden al menos un polipéptido de ActRIIB que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 104, 106, 403 o 404. En algunas realizaciones, los complejos heteromultímeros de brazo único de la divulgación comprenden al menos un polipéptido de ActRIIB que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 104, 106, 403 o 404, donde la posición correspondiente a L79 de SEQ ID NO: 1 es un aminoácido ácido (es decir, un residuo de aminoácido D o E). En algunas realizaciones, los complejos heteromultímeros de brazo único de la divulgación comprenden, consisten en o consisten esencialmente en al menos un polipéptido de ActRIIB que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 104, 106, 403, o 404. En algunas realizaciones, los complejos heteromultímeros de brazo único de la divulgación comprenden, consisten en o consisten esencialmente en al menos un polipéptido de ActRIIB que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 104, 106, 403, o 404, donde la posición correspondiente a L79 de SEQ ID NO: 1 es un aminoácido ácido (es decir, un residuo de aminoácido D o E).

En determinadas realizaciones, la presente divulgación se refiere a un complejo proteico que comprende un polipéptido de ActRIIA. Como se emplea en esta solicitud, el término “ActRIIA” se refiere a una familia de proteínas de receptores de activina de tipo IIA (ActRIIA) de cualquier especie y a variantes derivadas de tales proteínas ActRIIA mediante mutagénesis u otra modificación. La referencia a ActRIIA, en esta solicitud, se entiende que es una referencia a una cualquiera de las formas identificadas actualmente. Los miembros de la familia ActRIIA generalmente son proteínas transmembranarias, compuestas por un dominio extracelular de unión a ligando que comprende una región rica en cisteína, un dominio transmembranario y un dominio citoplásmico con actividad de serina/treonina cinasa prevista. El término “polipéptido de ActRIIA” incluye polipéptidos que comprenden cualquier polipéptido de origen natural de un miembro de la familia ActRIIA, así como cualquier variante de los mismos (lo que incluye mutantes, fragmentos, fusiones y formas peptidomiméticas) que conserva una actividad útil. Los ejemplos de tales variantes de polipéptidos de ActRIIA se proporcionan a lo largo de la presente descripción, así como en la solicitud de patente internacional con n.° de publicación WO 2006/012627. La numeración de los aminoácidos para todos lo polipéptidos relacionados con ActRIIA descritos en esta solicitud se basa en la numeración de la secuencia de proteína precursora de ActRIIA humano proporcionada a continuación (SEQ ID NO:9), a menos que se designe específicamente de otro modo. La secuencia de la proteína precursora de ActRIIB humano es la siguiente:

1 MGAAAKLAFAVFLISCSSGA ILGRSETQEC LFFNANWEKD RTNQTGVEPC

51 YGDKDKRRHC FATWKNISGS IEIVKQGCWL DDINCYDRTD CVEKKDSPEV

101 YFCCCEGNMC NEKFSYFPEM EVTQPTSNPVTPKPPYYNIL LYSLVPLMLI

151 AGIVICAFWV YRHHKMAYPP VLVPTQDPGP PPPSPLLGLK PLQLLEVKAR

201 GRFGCVWKAQ LLNEYVAVKI FPIQDKQSWQ NEYEVYSLPGMKHENILQFI

O v Mj _L 'On 7\.J UJ1j17DG r 1p J C VT7T DD T V7T J_A' JT_I T va7T v u T x rp i 7 n\ i T U 11 P DTU /GV OJi TJU OiJ nJJ Fl T J_l TlS\ n 7\iN T\TT V 7T V 7 O T V^a7VT1\NT1T_|J T_I^ r _ */ U 11 T _L A.fA. rl_ml ±iv l/TvJ_ATA D.l\'O nJ_l

301 AYLHEDIPGL KDGHKPAISH RDIKSKNVLL KNNLTACIAD FGLALKFEAG

351 KSAGDTHGQV GTRRYMAPEV LEGAINFQRDAFLRIDMYAM GLVLWELASR

401 CTAADGPVDE YMLPFEEEIG QHPSLEDMQE VVVHKKKRPV LRDYWQKHAG

451 MAMLCETIEE CWDHDAEARL SAGCVGERIT QMQRLTNIIT TEDIVTVVTM

501 VTNVDFPPKE SSL (SEQ IDNO: 9)

El péptido señal está indicado mediante subrayado único; el dominio extracelular está indicado en negrita y los puntos de N-glucosilación endógenos potenciales están indicados mediante subrayado doble.

La secuencia del polipéptido de ActRIIA humano extracelular procesado es la siguiente:

ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDD

INCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID

NO: 10)

La “cola” del extremo C del dominio extracelular está indicada mediante subrayado único. La secuencia con la "cola" eliminada (una secuencia A15) es la siguiente:

ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDD

INCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEM (SEQ ID NO: 11)

La secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína precursora de ActRIIA humano se muestra a continuación (SEQ ID NO: 12), correspondiente a los nucleótidos 159-1700 de la secuencia de referencia de Genbank N^m_001616.4. La secuencia señal está subrayada.

1 ATGGGAGCTG CTGCAAAGTT GGCGTTTGCC GTCTTTCTTA TCTCCTGTTC

51 TTCAGGTGCT ATACTTGGTA GATCAGAAAC TCAGGAGTGT CTTTTCTTTA

101 ATGCTAATTG GGAAAAAGAC AGAACCAATC AAACTGGTGT TGAACCGTGT

151 TATGGTGACA AAGATAAACG GCGGCATTGT TTTGCTACCT GGAAGAATAT

201 TTCTGGTTCC ATTGAAATAG TGAAACAAGG TTGTTGGCTG GATGATATCA

251 ACTGCTATGA CAGGACTGAT TGTGTAGAAA AAAAAGACAG CCCTGAAGTA

301 TATTTTTGTT GCTGTGAGGG CAATATGTGT AATGAAAAGT TTTCTTATTT

351 TCCGGAGATG GAAGTCACAC AGCCCACTTC AAATCCAGTT ACACCTAAGC

401 CACCCTATTA CAACATCCTG CTCTATTCCT TGGTGCCACT TATGTTAATT

451 GCGGGGATTG TCATTTGTGC ATTTTGGGTG TACAGGCATC ACAAGATGGC

501 CTACCCTCCT GTACTTGTTC CAACTCAAGA CCCAGGACCA CCCCCACCTT

601 GGAAGATTTG GTTGTGTCTG GAAAGCCCAG TTGCTTAACG AATATGTGGC

651 TGTCAAAATA TTTCCAATAC AGGACAAACA GTCATGGCAA AATGAATACG

701 AAGTCTACAG TTTGCCTGGA ATGAAGCATG AGAACATATT ACAGTTCATT

751 GGTGCAGAAA AACGAGGCAC CAGTGTTGAT GTGGATCTTT GGCTGATCAC

801 AGCATTTCAT GAAAAGGGTT CACTATCAGA CTTTCTTAAG GCTAATGTGG

851 TCTCTTGGAA TGAACTGTGT CATATTGCAG AAACCATGGC TAGAGGATTG

901 GCATATTTAC ATGAGGATAT ACCTGGCCTA AAAGATGGCC ACAAACCTGC

951 CATATCTCAC AGGGACATCA AAAGTAAAAA TGTGCTGTTG AAAAACAACC

1001 TGACAGCTTG CATTGCTGAC TTTGGGTTGG CCTTAAAATT TGAGGCTGGC

1051 AAGTCTGCAG GCGATACCCA TGGACAGGTT GGTACCCGGA GGTACATGGC

1101 TCCAGAGGTA TTAGAGGGTG CTATAAACTT CCAAAGGGAT GCATTTTTGA

1151 GGATAGATAT GTATGCCATG GGATTAGTCC TATGGGAACT GGCTTCTCGC

1201 TGTACTGCTG CAGATGGACC TGTAGATGAA TACATGTTGC CATTTGAGGA

1251 GGAAATTGGC CAGCATCCAT CTCTTGAAGA CATGCAGGAA GTTGTTGTGC

1301 ATAAAAAAAA GAGGCCTGTT TTAAGAGATT ATTGGCAGAA ACATGCTGGA

1351 ATGGCAATGC TCTGTGAAAC CATTGAAGAA TGTTGGGATC ACGACGCAGA

14 01 AGCCAGGTTA TCAGCTGGAT GTGTAGGTGA AAGAATTACC CAGATGCAGA

1451 GACTAACAAA TATTATTACC ACAGAGGACA TTGTAACAGT GGTCACAATG

1501 GTGACAAATG TTGACTTTCC TCCCAAAGAA TCTAGTCTA

(SEQ ID NO: 12)

La secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de ActRIIA humano extracelular procesado es la siguiente:

1 ATACTTGGTA GATCAGAAAC TCAGGAGTGT CTTTTCTTTA ATGCTAATTG

51 GGAAAAAGAC AGAACCAATC AAACTGGTGT TGAACCGTGT TATGGTGACA

101 AAGATAAACG GCGGCATTGT TTTGCTACCT GGAAGAATAT TTCTGGTTCC

151 ATTGAAATAG TGAAACAAGG TTGTTGGCTG GATGATATCA ACTGCTATGA

201 CAGGACTGAT TGTGTAGAAA AAAAAGACAG CCCTGAAGTA TATTTTTGTT

251 GCTGTGAGGG CAATATGTGT AATGAAAAGT TTTCTTATTT TCCGGAGATG

301 GAAGTCACAC AGCCCACTTC AAATCCAGTT ACACCTAAGC CACCC

(SEQ ID NO: 13)

Una fórmula general para un polipéptido de ActRIIA activo (p. ej., de unión a ligando) es una que comprende un polipéptido que comienza en el aminoácido 30 y termina en el aminoácido 110 de SEQ ID NO: 9. Por consiguiente, los polipéptidos de ActRIIA de la presente divulgación pueden comprender un polipéptido que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a los aminoácidos 30-110 de S^eQ ID NO: 9. Opcionalmente, polipéptidos de ActRIIA de la presente divulgación comprenden un polipéptido que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a los aminoácidos ácidos 12-82 de SEQ ID NO: 9 opcionalmente comenzando en una posición que va de 1 a 5 (p.ej., 1,2, 3, 4, o 5) o 3-5 (p.ej., 3, 4, o 5) y termina en una posición que va de 110-116 (p.ej., 110, 111, 112, 113, 114, 115, o 116) o 110-115 (p.ej., 110, 111, 112, 113, 114, o 115), respectivamente, y que comprenden no más de 1,2, 5, 10 o 15 cambios conservativos de aminoácidos en la bolsa de unión del ligando, y cero, una o más alteraciones no conservativas en las posiciones 40, 53, 55, 74, 79 y/o 82 en la bolsa de unión al ligando con respecto a SEQ ID NO: 9.

En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a complejos heteromultiméricos de brazo único que comprenden al menos un polipéptido de ActRIIA, que incluye fragmentos, variantes funcionales y formas modificadas de los mismos. Preferiblemente, los polipéptidos de ActRIIA para usar de acuerdo con las invenciones de la divulgación (por ejemplo, complejos heteromultímeros de brazo único que comprenden un polipéptido de ActRIIA y usos del mismo) son solubles (por ejemplo, un dominio extracelular de ActRIIA). En otras realizaciones preferidas de la invención, los polipéptidos de ActRIIA para su uso de acuerdo con las invenciones de la divulgación se unen a y/o inhiben (antagonizan) la actividad (p. ej., inducción de Smad 2/3 y/o señalización de Smad 1/5/8) de uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-beta. En algunas realizaciones, los complejos heteromultímeros de brazo único de la divulgación comprenden al menos un polipéptido de ActRIIA que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 9, 10, 11, 101, 103, 401 o 402. En algunas realizaciones, los complejos heteromultímeros de brazo único de la divulgación comprenden, consisten en o consisten esencialmente en al menos un polipéptido de ActRIIA que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 9, 10, 11, 101, 103, 401 o 402.

En ciertos aspectos, la presente descripción se refiere a polipéptidos de TGFBRII. Como se usa en esta invención, el término "TGFBRII" se refiere a una familia de proteínas del receptor II del factor de crecimiento transformante-beta (TGFBRII) de cualquier especie y variantes derivadas de tales proteínas por mutagénesis u otra modificación. Se entiende que la referencia a TGFBRII en esta invención es una referencia a cualquiera de las formas identificadas actualmente. Los miembros de la familia TGFBRII son generalmente proteínas transmembrana, compuestas por un dominio extracelular de unión a ligando con una región rica en cisteína, un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico con actividad de serina / treonina quinasa predicha.

El término "polipéptido TGFBRII" incluye polipéptidos que comprenden cualquier polipéptido natural de un miembro de la familia TGFBRII así como cualquier variante del mismo (incluidos mutantes, fragmentos, fusiones y formas peptidomiméticas) que retienen una actividad útil. La numeración de aminoácidos para todos los polipéptidos relacionados con TGFBRII descritos en esta invención se basa en la numeración de la secuencia de la proteína precursora de TGFBRII humana a continuación (SEQ ID NO: 42), a menos que se indique específicamente lo contrario.

La secuencia de la proteína precursora del TGFBRII humano canónico (NCBI Ref Seq NP_003233.4) es la siguiente:

1 MGRGLLRGLW PLHIVLWTRI ASTIPPHVQK SVNNDMIVTD NNGAVKFPQL

51 CKFCDVRFST CDNQKSCMSN CSITSICEKP QEVCVAVWRK NDENITLETV

101 CHDPKLPYHD FILEDAASPK CIMKEKKKPG ETFFMCSCSS DECNDNIIFS

151 EEYNTSNPDL LLVIFQVTGI SLLPPLGVAI SVIIIFYCYR VNRQQKLSST

201 WETGKTRKLM EFSEHCAIIL EDDRSDISST CANNINHNTE LLPIELDTLV

251 GKGRFAEVYK AKLKQNTSEQ FETVAVKIFP YEEYASWKTE KDIFSDINLK

oym j _l Ui i i T i i ? i N T \ T_ Tl T u v r \ ^ T P i T j_ i r ±p J 7 r\ \ T l iP l T i lP í T I ) \ T I S \ T 1 i l T lP i T J _ m I 0 J S 1 \ ^ ViT iY / T v T u T i r mp 7\ T i7V iL i J n 7 \ . T i S \ ^ QTJ V1N T T U O ^ l F l i V 1 T U 1 r p 1 D \ 1 U 1 U V T _1 O ^a O T VT VC lli T J J \ T U J T ) A T AJ'T U

351 GSSLARGIAH LHSDHTPCGR PKMPIVHRDL KSSNILVKND LTCCLCDFGL

401 SLRLDPTLSV DDLANSGQVG TARYMAPEVL ESRMNLENVE SFKQTDVYSM

451 ALVLWEMTSR CNAVGEVKDY EPPFGSKVRE HPCVESMKDN VLRDRGRPEI

501 PSFWLNHQGI QMVCETLTEC WDHDPEARLT AQCVAERFSE LEHLDRLSGR

551 SCSEEKIPED GSLNTTK (SEQ ID NO:^: 42)

El péptido señal está indicado mediante subrayado único y el dominio extracelular está indicado en negrita.

La secuencia del polipéptido TGFBRII extracelular procesada es la siguiente:

TIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVC

VAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDN

IIFSEEYNTSNPDLLLVIFQ (SEQ ID NO: 43)

La secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína precursora de TGFBRII se muestra a continuación (SEQ ID NO: 44), correspondiente a los nucleótidos 383-2083 de la secuencia de referencia de Genbank NM_003242.5. La secuencia señal está subrayada.

ATGGGTCGGGGGCTGCTCAGGGGCCTGTGGCCGCTGCACATCGTCCTGTGGACGCGTATCGC

CAGCACGATCCCACCGCACGTTCAGAAGTCGGTTAATAACGACATGATAGTCACTGACAACA

ACGGTGCAGTCAAGTTTCCACAACTGTGTAAATTTTGTGATGTGAGATTTTCCACCTGTGAC

AACCAGAAATCC TGCATGAGCAAC TGCAGCATCACC TCCATC TGTGAGAAGCCACAGGAAGT

C TGTGTGGC TGTATGGAGAAAGAATGACGAGAACATAACAC TAGAGACAGT TTGCCATGACC

CCAAGC TCCCC TACCATGAC T T TAT TC TGGAAGATGC TGC T TC TCCAAAGTGCAT TATGAAG

GAAAAAAAAAAGCC TGGTGAGAC T T TC T TCATGTGT TCC TGTAGC TC TGATGAGTGCAATGA

CAACATCATC T TC TCAGAAGAATATAACACCAGCAATCC TGAC T TGT TGC TAGTCATAT T TC

AAGTGACAGGCATCAGCCTCCTGCCACCACTGGGAGTTGCCATATCTGTCATCATCATCTTC

TACTGCTACCGCGTTAACCGGCAGCAGAAGCTGAGTTCAACCTGGGAAACCGGCAAGACGCG

GAAGCTCATGGAGTTCAGCGAGCACTGTGCCATCATCCTGGAAGATGACCGCTCTGACATCA

GCTCCAC GTG TGCCAACAACAT CAAC CACAACACAGAG CTGCTGCC CAT TGAGC TGGACAC C

CTGGTGGGGAAAGGTCGCTTTGCTGAGGTCTATAAGGCCAAGCTGAAGCAGAACACTTCAGA

GCAGT TTGAGACAG TGGCAG TCAAGAT CTTTCCCTAT GAGGAG TATGCCTCTTG GAAGACAG

AGAAGGACAT C TTCTCAGACATCAATC TGAAGCAT GAGAACATAC TCCAGT TCC TGACGGC T

GAGGAGCGGAAGACGGAGTTGGGGAAACAATACTGGCTGATCACCGCCTTCCACGCCAAGGG

CAACCTACAGGAGTACCTGACGCGGCATGTCATCAGCTGGGAGGACCTGCGCAAGCTGGGCA

GCTCCCTCGCCCGGGGGATTGCTCACCTCCACAGTGATCACACTCCATGTGGGAGGCCCAAG

ATGCCCATCGTGCACAGGGACCTCAAGAGCTCCAATATCCTCGTGAAGAACGACCTAACCTG

CTGCCTGTGTGACTTTGGGCTTTCCCTGCGTCTGGACCCTACTCTGTCTGTGGATGACCTGG

CTAACAG TGGG CAGGTGG GAACTG CAAGATACAT GG CTCCAGAAG TCC TAGAAT CCAGGAT G

AATTTGGAGAATGTTGAGTCCTTCAAGCAGACCGATGTCTACTCCATGGCTCTGGTGCTCTG

GGAAATGACATCTCGCTGTAATGCAGTGGGAGAAGTAAAAGATTATGAGCCTCCATTTGGTT

CCAAGGTGCGGGAGCACCCCTGTGTCGAAAGCATGAAGGACAACGTGTTGAGAGATCGAGGG

CGACCAGAAATTCCCAGCTTCTGGCTCAACCACCAGGGCATCCAGATGGTGTGTGAGACGTT

GACTGAGTGCTGGGACCACGACCCAGAGGCCCGTCTCACAGCCCAGTGTGTGGCAGAACGCT

TCAGTGAGCTGGAGCATCTGGACAGGCTCTCGGGGAGGAGCTGCTCGGAGGAGAAGATTCCT

GAAGAC GGCTC CCTAAACAC TACCAAA (SEQ ID NO: 44)

La secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido TGFBRII extracelular procesado es la siguiente:

ACGAT CCCACC GCACGT TCAGAAGT CGGT TAATAACGACAT GATAGT CAC TGACAACAACGG

TGCAGTCAAGTTTCCACAACTGTGTAAATTTTGTGATGTGAGATTTTCCACCTGTGACAACC

AGAAATCCTGCATGAGCAACTGCAGCATCACCTCCATCTGTGAGAAGCCACAGGAAGTCTGT

GTGGCTGTATGGAGAAAGAATGACGAGAACATAACAC TAGAGACAGT T TGCCAT GACCCCAA

GCTCCCCTACCATGACTTTATTCTGGAAGATGCTGCTTCTCCAAAGTGCATTATGAAGGAAA

AAAAAAAGCCTGGTGAGACTTTCTTCATGTGTTCCTGTAGCTCTGATGAGTGCAATGACAAC

ATCATCTTCTCAGAAGAATATAACACCAGCAAT CC TGACTTGTTGCTAGTCATATTTCAA

(SEQ ID NO: 45)

Una isoforma alternativa de TGFBRII, isoforma A (NP_001020018.1), es la siguiente:

1 MGRGLLRGLW PLHIVLWTRI ASTIPPHVQK SDVEMEAQKD EIICPSCNRT

51 AHPLRHINND MIVTDNNGAV KFPQLCKFCD VRFS TCDNQK SCMSNCSITS

101 ICEKPQEVCV AVWRKNDENI TLETVCHDPK LPYHDFILED AASPKCIMKE

151 KKKPGE TFFM CSCSSDECND NIIFSEEYNT SNPDLLLVIF QVTGISLLPP

201 LGVAISVIII FYCYRVNRQQ KLSSTWETGK TRKLMEFSEH CAIILEDDRS

251 DISSTCANNI NHNTELLPIE LDTLVGKGRF AEVYKAKLKQ NTSEQFETVA

301 VKIFPYEEYA SWKTEKDIFS DINLKHENIL QFLTAEERKT ELGKQYWLIT

351 AFHAKGNLQE YLTRHVISWE DLRKLGSSLA RGIAHLHSDH TPCGRPKMPI

401 VHRDLKSSNI LVKNDLTCCL CDFGLSLRLD PTLSVDDLAN SGQVGTARYM

451 APEVLESRMN LENVESFKQT DVY SMALVLW EMTSRCNAVG EVKDYEPPFG

501 SKVREHPCVE SMKDNVLRDR GRPEIPSFWL NHQGIQMVCE TLTECWDHDP

551 EARLTAQCVA ERFSELEHLD RLSGRSCSEE KIPEDGSLNT TK

(SEQ ID NO:: 67)

El péptido señal está indicado mediante subrayado único y el dominio extracelular está indicado en negrita.

La secuencia del polipéptido TGFBRII extracelular procesada (isoforma A) es la siguiente:

TIPPHVQKSDVEMEAQKDEIICPSCNRTAHPLRHINNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFS

TCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKC

IMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQ (SEQ ID NO: 68)

A continuación se muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína precursora de TGFBRII (isoforma A) (SEQ ID NO: 69), correspondiente a los nucleótidos 383-2158 de la secuencia de referencia de Genbank NM_001024847.2. La secuencia señal está subrayada.

ATGGGTCGGGGGCTGCTCAGGGGCCTGTGGCCGCTGCACATCGTCCTGTGGACGCGTATCGC

CAGCACGATCCCACCGCACGTTCAGAAGTCGGATGTGGAAATGGAGGCCCAGAAAGATGAAA

TCATC TGCCCCAGC TGTAATAGGAC TGCCCATCCAC TGAGACATAT TAATAACGACATGATA

GTCAC TGACAACAACGGTGCAGTCAAGT T TCCACAAC TGTGTAAAT T T TGTGATGTGAGAT T

T TCCACC TGTGACAACCAGAAATCC TGCATGAGCAAC TGCAGCATCACC TCCATC TGTGAGA

AGCCACAGGAAGTC TGTGTGGC TGTATGGAGAAAGAATGACGAGAACATAACAC TAGAGACA

GT T TGCCATGACCCCAAGC TCCCC TACCATGAC T T TATTC TGGAAGATGC TGC T TC TCCAAA

GTGCAT TATGAAGGAAAAAAAAAAGCC TGGTGAGAC T TTC T TCATGTGT TCC TGTAGC TC TG

ATGAGTGCAATGACAACATCATC T TC TCAGAAGAATATAACACCAGCAATCC TGAC T TGT TG

C T A G T C A T A T T T C A A G T G A C A G G C A T C A G C C T C C T G C C A C C A C T G G G A G T T G C C A T A T C T G T

CATCATCATCTTCTACTGCTACCGCGTTAACCGGCAGCAGAAGCTGAGTTCAACCTGGGAAA

CCGGCAAGACGCGGAAGCTCATGGAGTTCAGCGAGCACTGTGCCATCATCCTGGAAGATGAC

CGCT CTGACAT CAGCT CCACGT GTGCCAACAACAT CAACCACAACACAGAG CTGCTGCC CAT

TGAGCTGGACACCCTGGTGGGGAAAGGTCGCTTTGCTGAGGTCTATAAGGCCAAGCTGAAGC

AGAACAC TTCAGAG CAG TTTGAGACAG TG GCAGTCAAGAT CTTTCCCTAT GAGGAG TATG CC

TCTTGGAAGACAGAGAAGGACATCTTCTCAGACATCAATCTGAAGCATGAGAACATACTCCA

GTTCCTGACGGCTGAGGAGCGGAAGACGGAGTTGGGGAAACAATACTGGCTGATCACCGCCT

TCCACGCCAAGGGCAACCTACAGGAGTACCTGACGCGGCATGTCATCAGCTGGGAGGACCTG

CGCAAGCTGGGCAGCTCCCTCGCCCGGGGGATTGCTCACCTCCACAGTGATCACACTCCATG

TGGGAGGCCCAAGATGCCCATCGTGCACAGGGACCTCAAGAGCTCCAATATCCTCGTGAAGA

ACGACCTAACCTGCTGCCTGTGTGACTTTGGGCTTTCCCTGCGTCTGGACCCTACTCTGTCT

GTGGATGACCTGGCTAACAGTGGGCAGGTGGGAACTGCAAGATACATGGCTCCAGAAGTCCT

AGAATCCAGGATGAATTTGGAGAATGTTGAGTCCTTCAAGCAGACCGATGTCTACTCCATGG

CTCTGGTGCTCTGGGAAATGACATCTCGCTGTAATGCAGTGGGAGAAGTAAAAGATTATGAG

CCTCCATTTGGTTCCAAGGTGCGGGAGCACCCCTGTGTCGAAAGCATGAAGGACAACGTGTT

GAGAGATCGAGGGCGACCAGAAATTCCCAGCTTCTGGCTCAACCACCAGGGCATCCAGATGG

TGTGTGAGACGTTGACTGAGTGCTGGGACCACGACCCAGAGGCCCGTCTCACAGCCCAGTGT

GTGGCAGAACGCTTCAGTGAGCTGGAGCATCTGGACAGGCTCTCGGGGAGGAGCTGCTCGGA

GGAGAAGATTCCTGAAGACGGCTCCCTAAACACTACCAAA (SEQ ID NO: 69)

Una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido TGFBRII extracelular procesado (isoforma A) es la siguiente:

ACGATCCCACCGCACGTTCAGAAGTCGGATGTGGAAATGGAGGCCCAGAAAGATGAAATCAT

CTGCCCCAGCTGTAATAGGACTGCCCATCCACTGAGACATATTAATAACGACATGATAGTCA

CTGACAACAACGGTGCAGTCAAGTTTCCACAACTGTGTAAATTTTGTGATGTGAGATTTTCC

ACCTGTGACAACCAGAAATCCTGCATGAGCAACTGCAGCATCACCTCCATCTGTGAGAAGCC

ACAGGAAGTCTGTGTGGCTGTATGGAGAAAGAATGACGAGAACATAACACTAGAGACAGTTT

GCCATGACCCCAAGCTCCCCTACCATGACTTTATTCTGGAAGATGCTGCTTCTCCAAAGTGC

ATTATGAAGGAAAAAAAAAAGCCTGGTGAGACTTTCTTCATGTGTTCCTGTAGCTCTGATGA

GTGCAATGACAACATCATCTTCTCAGAAGAATATAACACCAGCAATCCTGACTTGTTGCTAG

TCATATTTCAA (SEQ ID NO: 70) .

Cualquiera de las isoformas de TGFpRII anteriores (SEQ ID NO: 42, 43, 67 y 68) podría incorporar una inserción de 36 aminoácidos (SEQ ID NO: 95) entre el par de residuos de glutamato (posiciones 151 y 152 de SEQ ID NO : 42; posiciones 129 y 130 de SEQ ID NO: 43; posiciones 176 y 177 de SEQ ID NO: 67; o posiciones 154 y 155 de SEQ ID NO: 68) ubicadas cerca del extremo C del TGFpRII ECD, como se produce naturalmente en la isoforma C de TGFpRII (Konrad y col., BMC Genomics 8:318, 2007).

GRCKIRHIGS NNRLQRSTCQ NTGWESAHVM KTPGFR (SEQ ID NO: 95)

En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a complejos heteromultiméricos de brazo único que comprenden al menos un polipéptido de TGFBRII, que incluye fragmentos, variantes funcionales y formas modificadas de los mismos. Preferiblemente, los polipéptidos de TGFBRII para uso de acuerdo con las invenciones de la divulgación (p.ej., complejos heteromultímeros de brazo único que comprenden un polipéptido de TGFBRII y usos del mismo) son solubles (por ejemplo, un dominio extracelular de TGFBRII). En otras realizaciones preferidas de la invención, los polipéptidos de TGFBRII para su uso de acuerdo con las invenciones de la divulgación se unen a y/o inhiben (antagonizan) la actividad (p. ej., inducción de Smad 2/3 y/o señalización de Smad 1/5/8) de uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-beta. En algunas realizaciones, los complejos heteromultímeros de brazo único de la divulgación comprenden al menos un polipéptido de TGFBRII que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 42, 43, 67, 68, 113, 115, 409, o 410. En algunas realizaciones, los complejos heteromultiméricos de brazo único de la divulgación comprenden al menos un polipéptido TGFBRII que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, 43, 67, 68, 113, 115, 409 o 410, en las que se inserta SEQ ID NO: 95 entre los residuos de glutamato emparejados como se describe anteriormente. En algunas realizaciones, los complejos heteromultímeros de brazo único de la divulgación comprenden al menos un polipéptido de TGFBRII que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, 43, 67, 68, 113, 115, 409, o 410.

En ciertos aspectos, la presente descripción se refiere a complejos proteínicos que comprenden un polipéptido de BMPRII. Como se usa en esta invención, el término "BMPRII" se refiere a una familia de proteínas del receptor de proteína morfogenética ósea tipo II (BMPRII) de cualquier especie y variantes derivadas de tales proteínas BMPRII por mutagénesis u otra modificación. La referencia a BMPRII en esta solicitud se entiende que es una referencia a una cualquiera de las formas identificadas actualmente. Los miembros de la familia BMPRII son en general proteínas transmembrana, compuestas por un dominio extracelular de unión a ligando con una región rica en cisteína, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático con actividad serina/treonina quiinasa prevista.

El término “polipéptido de BMPRII” incluye polipéptidos que comprenden cualquier polipéptido de origen natural de un miembro de la familia BMPRII, así como cualquier variante de los mismos (lo que incluye mutantes, fragmentos, fusiones y formas peptidomiméticas), que conserva una actividad útil. La numeración de aminoácidos para todos los polipéptidos relacionados con BMPRII descritos en esta invención se basa en la numeración de la secuencia de la proteína precursora de BMPRII humana a continuación (SEQ ID NO: 46), a menos que se indique específicamente lo contrario.

La secuencia canónica de la proteína precursora de BMPRII humana (NCBI Ref Seq NP_001195.2) es la siguiente:

1 MTSSLQRPWR VPWLPWTILL VSTAAASQNQ ERLCAFKD PY QQDLGIGESR

51 ISHENGTILC SKGSTCYGLW EKSKGDINLV KQGCWSHIGD PQECHYEECV

101 VTTTPPSIQN GTYRFCCCST DLCNVNFTEN FPPPDTTPLS PPHSFNRDET

151 IIIALASVSV LAVLIVALCF GYRMLTGDRK QGLHSMNMME AAASEPSLDL

201 DNLKLLELIG RGRYGAVYKG SLDERPVAVK VFSFANRQNF INEKNIYRVP

251 LMEHDNIARF IVGDERVTAD GRMEYLLVME YYPNGSLCKY LSLHTSDWVS

301 SCRLAHSVTR GLAYLHTELP RGDHYKPAIS HRDLNSRNVL VKNDGTCVIS

351 DFGLSMRLTG NRLVRPGEED NAAISEVGTI RYMAPEVLEG AVNLRDCESA

401 LKQVDMYALG LIYWEIFMRC TDLFPGESVP EYQMAFQTEV GNHPTFEDMQ

451 VLVSREKQRP KFPEAWKENS LAVRSLKETI EDCWDQDAEA RLTAQCAEER

501 MAELMMIWER NKSVSPTVNP MSTAMQNERN LSHNRRVPKI GPYPDYSSSS

551 YIEDSIHHTD SIVKNISSEH SMSSTPLTIG EKNRNSINYE RQQAQARIPS

601 PETSVTSLST NTTTTNTTGL TPSTGMTTIS EMPYPDETNL HTTNVAQSIG

651 PTPVCLQLTE EDLETNKLDP KEVDKNLKES SDENLMEHSL KQFSGPDPLS

701 STSSSLLYPL IKLAVEATGQ QDFTQTANGQ ACLIPDVLPT QIYPLPKQQN

751 LPKRPTSLPL NTKNSTKEPR LKFGSKHKSN LKQVETGVAK MNTINAAEPH

801 WTVTMNGVA GRNHSVNSHA ATTQYANGTV LSGQTTNIVT HRAQEMLQNQ

851 FIGEDTRLNI NSSPDEHEPL LRREQQAGHD EGVLDRLVDR RERPLEGGRT

901 NSNNNNSNPC SEQDVLAQGV PSTAADPGPS KPRRAQRPNS LDLSATNVLD

951 GSSIQIGEST QDGKSGSGEK IKKRVKTPYS LKRWRPSTWV ISTESLDCEV

1001 NNNGSNRAVH SKSSTAVYLA EGGTATTMVS KDIGMNCL

(SEQ ID NO:: 46)

El péptido señal está indicado mediante subrayado único y el dominio extracelular está indicado en negrita.

La secuencia del polipéptido BMPRII extracelular procesada es la siguiente:

SQNQERLCAFKDPYQQDLGIGESRISHENGTILCSKGSTCYGLWEKSKGDINLVKQGCWSHI

GDPQECHYEECWTTTPPSIQNGTYRFCCCSTDLCNVNFTENFPPPDTTPLSPPHSFNRDET

(SEQ ID NO: 47)

A continuación se muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína precursora de BMPRII (SEQ ID NO: 48), como sigue los nucleótidos 1149-4262 de la secuencia de referencia de Genbank NM_001204.6. La secuencia de la señal está subrayada.

ATGACTTCCTCGCTGCAGCGGCCCTGGCGGGTGCCCTGGCTACCATGGACCATCCTGCTGGT CAGCACTGCGGCTGCTTCGCAGAATCAAGAACGGCTATGTGCGTTTAAAGATCCGTATCAGC AAGAC C TTGGGATAG GTGAGAG TAGAAT CT CTCATGAAAAT GG GACAATAT TATG CTCGAAA GGTAGCACCTGCTATGGCCTTTGGGAGAAATCAAAAGGGGACATAAATCTTGTAAAACAAGG ATGTTGGTCTCACAT TGGAGATCCCCAAGAGT GTCAC TATGAAGAATGT GTAGTAACTACCA CTCCTCCCTCAATTCAGAATGGAACATACCGTTTCTGCTGTTGTAGCACAGATTTATGTAAT GTCAACT TTACT GAGAATT TTCCACC TCCT GACACAACACCAC TCAGT CCACCTCAT TCAT T TAACCGAGAT GAGACAATAAT CAT TGCTTTGG CATCAG TCTCTGTAT TAG CTGTT TTGATAG TTGCCTTATGCTTTG GATACAGAAT GTTGACAG GAGAC CGTAAACAAG GTCTTCACAG TAT G AACATGATGGAGGCAGCAGCATCCGAACCCTCTCTTGATCTAGATAATCTGAAACTGTTGGA GCTGATTGGCCGAGGTCGATATGGAGCAGTATATAAAGGCTCCTTGGATGAGCGTCCAGTTG CTGTAAAAGTGTTTTCCTTTGCAAACCGTCAGAATTTTATCAACGAAAAGAACATTTACAGA

AGAT GGAC GCAT GGAATAT TTGCTTGT GAT GGAGTAC TATCCCAAT GGAT CTTTAT GCAAG T ATTTAAGTCTCCACACAAGTGACTGGGTAAGCTCTTGCCGTCTTGCTCATTCTGTTACTAGA GGACTGGCTTATCTT CACACAGAAT TACCAC GAGGAGAT CAT TATAAAC CTGCAAT TTCCCA TCGAGAT TTAAACAG CAGAAATGT CCTAGT GAAAAATGAT GGAACCTGTGTTATTAGTGAC T TTGGACTGTCCATGAGGCTGACTGGAAATAGACTGGTGCGCCCAGGGGAGGAAGATAATGCA GCCATAAG CGAG GTTGGCAC TATCAGATATAT GGCAC CAGAAG TGCTAGAAG GAG CTGTGAA CTTGAGGGACT GT GAATCAGCTT T GAAACAAGTAGACAT GTATGC TCTTGGACTAATC TAT T GGGAGATAT TTAT GAGAT GTACAGAC CTCT TCCCAGG GGAATC CGTACCAGAG TAC CAGAT G GCTTTTCAGACAGAGGTTGGAAACCATCCCACTTTTGAGGATATGCAGGTTCTCGTGTCTAG GGAAAAACAGAGAC CCAAG TTCCCAGAAG C CTGGAAAGAAAATAG CCT GGCAGTGAG GTCAC TCAAGGAGACAAT CGAAGAC TGTT GGGACCAG GATG CAGAGGCTCGGCT TACTGCACAG TG T GCTGAGGAAAGGATGGCTGAACTTATGATGATTTGGGAAAGAAACAAATCTGTGAGCCCAAC AGTCAATCCAATGTCTACTGCTATGCAGAATGAACGCAACCTGTCACATAATAGGCGTGTGC CAAAAATTGGTCCTTATCCAGAT TATTCTTCCTCCTCATACAT TGAAGAC TCTAT CCATCAT AC TGACAGCAT CGT GAAGAATAT T TCCTCT GAGCATTCTATGTCCAGCACACC T TTGACTAT AG GGGAAAAAAAC CGAAAT TCAAT TAACTAT GAACGACAG CAAG CACAAG CTCGAAT CCCCA GCCCTGAAACAAG TGTCAC CAGCC TCTCCAC CAACACAACAAC CACAAACAC CACAG GACT C AC GCCAAG TACT GGCATGAC TACTAT ATCT GAGATG CCATACC CAGAT GAAACAAAT CTGCA

TACCACAAAT GTTGCACAG TCAAT TGGGCCAACCCCTGTCTGCT TACAG CTGACAGAAGAAG

AC TTGGAAACCAACAAGC TAGACCCAAAAGAAGT TGATAAGAACC TCAAGGAAAGC TCTGAT

GAGAAT CTCAT GGAGCAC TCTCT TAAACAG TTCAG TGGCCCAGAC CCAC TGAGCAG TACTAG

TTCTAG CTTGC TTTACCCAC TCATAAAAC TTGCAG TAGAAGCAAC TGGACAG CAG GACTT CA

CACAGACTGCAAATGGCCAAGCATGTTTGATTCCTGATGTTCTGCCTACTCAGATCTATCCT

CTCCC CAAGCAG CAGAACC TTCCCAAGAGACCTACTAGTTTGCCTTTGAACACCAAAAATT C

AACAAAAGAG C CCCGGC TAAAAT TTGGCAGCAAGCACAAAT CAAAC TTGAAACAAG TCGAAA

CTGGAG TTGCCAAGAT GAATACAAT CAATGCAGCAGAAC CTCAT GTGG TGACAG TCACCAT G

AATGGTGTGGCAGGTAGAAACCACAGTGTTAACTCCCATGCTGCCACAACCCAATATGCCAA

TGGGACAG TAC TATCTGGC CAAACAACCAACATAG TGACACATAG GGC CCAAGAAAT GTT GC

AGAAT CAGTTTATTGGTGAG GACAC CCGGC TGAATAT TAAT TCCAGTCCTGATGAG CATGAG

CCTTTACTGAGACGAGAGCAACAAGCTGGCCATGATGAAGGTGTTCTGGATCGTCTTGTGGA

CAGGAG GGAAC GGCCAC TAGAAGG TGGCCGAAC TAAT TCCAATAACAACAACAG CAATCCAT

GTTCAGAACAAGAT GTTCTTGCACAGGGTGTTC CAAG CACAGCAG CAGAT CCTGGGCCATCA

AAGCCCAGAAGAGCACAGAGGCCTAATTCTCTGGATCTTTCAGCCACAAATGTCCTGGATGG

CAGCAG TATACAGATAG G TGAGTCAACACAAGAT GG CAAATCAG GATCAG GTGAAAAGAT CA

AGAAACGTGTGAAAACTCCCTATTCTCTTAAGCGGTGGCGCCCCTCCACCTGGGTCATCTCC

AC TGAATCGCT GGACTG TGAAGTCAACAATAAT GGCAG TAACAG GGCAG TTCAT TCCAAAT C

CAGCAC TGCTG TTTACC TTGCAGAAG GAGG CACTGC TACAAC CATGGT GTCTAAAGATATAG

GAATGAACTGTCTG (SEQ ID NO: 48)

La secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de BMPRII extracelular es la siguiente:

TCGCAGAAT CAAGAAC GGCTATGTGCGTT TAAAGAT CCGTAT CAGCAAGAC CTT GGGATAG G

TGAGAG TAGAAT CTCTCAT GAAAAT GGGACAATAT TATGCTCGAAAGG TAGCAC CTGCTATG

GCCTTTGGGAGAAATCAAAAGGGGACATAAATCTTGTAAAACAAGGATGTTGGTCTCACATT

GGAGATCCCCAAGAGTGTCACTATGAAGAATGTGTAGTAACTACCACTCCTCCCTCAATTCA

GAATG GAACATAC CGTTTCTGCTGTTGTAGCACAGAT TTATGTAATGTCAAC TT TACTGAGA

AT TTTCCACCT CCTGACACAACAC CACTCAG TCCAC CTCATT CAT TTAACCGAGAT GAGACA

(SEQ ID NO: 49)

Una isoforma alternativa de BMPRII, isoforma 2 (GenBank: AAA86519.1) es la siguiente:

1 MTSSLQRPWR VPWLPWTILL VSTAAASQNQ ERLCAFKDPY QQDLGIGESR

51 ISHENGTILC SKGSTCYGLW EKSKGDINLV KQGCWSHIGD PQECHYEECV

101 VTTTPPSIQN GTYRFCCCST DLCNVNFTEN FPPPDTTPLS PPHSFNRDET

151 IIIALASVSV LAVLIVALCF GYRMLTGDRK QGLHSMNMME AAASEPSLDL

201 DNLKLLELIG RGRYGAVYKG SLDERPVAVK VFSFANRQNF INEKNIYRVP

251 LMEHDNIARF IVGDERVTAD GRMEYLLVME YYPNGSLCKY LSLHTSDWVS

301 SCRLAHSVTR GLAYLHTELP RGDHYKPAIS HRDLNSRNVL VKNDGTCVIS

351 DFGLSMRLTG NRLVRPGEED NAAISEVGTI RYMAPEVLEG AVNLRDCESA

401 LKQVDMYALG LIYWEIFMRC TDLFPGESVP EYQMAFQTEV GNHPTFEDMQ

451 VLVSREKQRP KFPEAWKENS LAVRSLKETI EDCWDQDAEA RLTAQCAEER

501 MAELMMIWER NKSVSPTVNP MSTAMQNERR (SEQ ID NO:: 71)

El péptido señal está indicado mediante subrayado único y el dominio extracelular está indicado en negrita.

La secuencia del polipéptido BMPRII extracelular procesada (isoforma 2) es la siguiente:

SQNQERLCAFKDPYQQDLGIGESRISHENGTILCSKGSTCYGLWEKSKGDINLVKQGCWSHI

GDPQECHYEECWTTTPPSIQNGTYRFCCCSTDLCNVNFTENFPPPDTTPLSPPHSFNRDET

(SEQ ID NO: 72)

A continuación se muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína precursora de BMPRII humana (isoforma 2) (SEQ ID NO: 73), correspondiente a los nucleótidos 163-1752 de la secuencia de referencia Genbank U25110.1. La secuencia señal está subrayada.

ATGACTTCCTCGCTGCAGCGGCCCTGGCGGGTGCCCTGGCTACCATGGACCATCCTGCTGGT

CAGCACTGCGGCTGCTTCGCAGAATCAAGAACGGCTATGTGCGTTTAAAGATCCGTATCAGC

AAGAC CTTGG GATAGG TGAGAG TAGAATC TCTCAT GAAAAT GGGACAATAT TAT GCTCGAAA

GGTAGCACCTGCTATGGCCTTTGGGAGAAATCAAAAGGGGACATAAATCTTGTAAAACAAGG

ATGTTGGTCTCACAT TGGAGATCCCCAAGAGT GTCAC TATGAAGAATGT GTAGTAACTACCA

CTCCTCCCTCAATTCAGAATGGAACATACCGTTTCTGCTGTTGTAGCACAGATTTATGTAAT

GTCAACT TTAC TGAGAATT TTCCACC TCC TGACACAACACCAC TCAGT CCACC TCATTCAT T

TAACC GAGAT GAGACAATAAT CAT TGCTTTGG CAT CAGTCTCTGTAT TAGCTG TTTTGATAG

TTGCCTTATGCTTTG GATACAGAAT GTTGACAG GAGAC CGTAAACAAG GTCTT CACAGTAT G

AACATGATGGAGGCAGCAGCATCCGAACCCTCTCTTGATCTAGATAATCTGAAACTGTTGGA

GCTGATTGGCCGAGGTCGATATGGAGCAGTATATAAAGGCTCCTTGGATGAGCGTCCAGTTG

CTGTAAAAGTGTTTTCCTTTGCAAACCGTCAGAATTTTATCAACGAAAAGAACATTTACAGA

GTGCCTTT GAT GGAACAT GACAAC ATTGCCCGCTT TATAGT TGGAGAT GAGAGAG TCAC TGC

AGATGGACGCATGGAATATTTGCTTGTGATGGAGTACTATCCCAATGGATCTTTATGCAAGT

ATTTAAGTCTCCACACAAGTGACTGGGTAAGCTCTTGCCGTCTTGCTCATTCTGTTACTAGA

GGACTGGCTTATCTTCACACAGAATTACCACGAGGAGATCATTATAAACCTGCAATTTCCCA

TCGAGATTTAAACAGCAGAAATGTCCTAGTGAAAAATGATGGAACCTGTGTTATTAGTGACT

TTGGACTGTCCATGAGGCTGACTGGAAATAGACTGGTGCGCCCAGGGGAGGAAGATAATGCA

GCCATAAGCGAGGTTGGCACTATCAGATATATGGCACCAGAAGTGCTAGAAGGAGCTGTGAA

CTTGAGGGACTGTGAATCAGCTTTGAAACAAGTAGACATGTATGCTCTTGGACTAATCTATT

GGGAGATATTTATGAGATGTACAGACCTCTTCCCAGGGGAATCCGTACCAGAGTACCAGATG

GCTTTTCAGACAGAGGTTGGAAACCATCCCACTTTTGAGGATATGCAGGTTCTCGTGTCTAG

GGAAAAACAGAGACCCAAGTTCCCAGAAGCCTGGAAAGAAAATAGCCTGGCAGTGAGGTCAC

TCAAGGAGACAATCGAAGACTGTTGGGACCAGGATGCAGAGGCTCGGCTTACTGCACAGTGT

GCTGAGGAAAGGATGGCTGAACTTATGATGATTTGGGAAAGAAACAAATCTGTGAGCCCAAC

AGTCAATCCAATGTCTACTGCTATGCAGAATGAACGTAGG (SEQ ID NO: 73)

Una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de BMPRII extracelular (isoforma 2) es la siguiente:

TCGCAGAATCAAGAACGGCTATGTGCGTTTAAAGATCCGTATCAGCAAGACCTTGGGATAGG

TGAGAGTAGAATCTCTCATGAAAATGGGACAATATTATGCTCGAAAGGTAGCACCTGCTATG

GCCTTTGGGAGAAATCAAAAGGGGACATAAATCTTGTAAAACAAGGATGTTGGTCTCACATT

GGAGATCCCCAAGAGTGTCACTATGAAGAATGTGTAGTAACTACCACTCCTCCCTCAATTCA

GAATGGAACATACCGTTTCTGCTGTTGTAGCACAGATTTATGTAATGTCAACTTTACTGAGA

ATTTTCCACCTCCTGACACAACACCACTCAGTCCACCTCATTCATTTAACCGAGATGAGACA

(SEQ ID NO: 74)

En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a complejos heteromultiméricos de brazo único que comprenden al menos un polipéptido de BMPRII, que incluye fragmentos, variantes funcionales y formas modificadas de los mismos. Preferiblemente, los polipéptidos de BMPRII para uso de acuerdo con las invenciones de la divulgación (p.ej., complejos heteromultímeros de brazo único que comprenden un polipéptido de BMPRII y usos del mismo) son solubles (por ejemplo, un dominio extracelular de BMPRII). En otras realizaciones preferidas de la invención. los polipéptidos de BMPRII para su uso de acuerdo con las invenciones de la divulgación se unen a y/o inhiben (antagonizan) la actividad (p.ej., inducción de Smad 2/3 y/o señalización de Smad 1/5/8) de uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-beta. En algunas realizaciones, los complejos heteromultímeros de brazo único de la divulgación comprenden al menos un polipéptido de BMPRII que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 46, 47, 71, 72, 107, 109, 405, o 406. En algunas realizaciones, los complejos heteromultímeros de brazo único de la divulgación consiste o consiste esencialmente de al menos un polipéptido de BMPRII que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, 47, 71,72, 107, 109, 405, o 406.

En ciertos aspectos, la presente descripción se refiere a complejos proteínicos que comprenden un polipéptido de MISRII. Como se usa en esta invención, el término "MISRII" se refiere a una familia de proteínas del receptor de sustancia inhibidora de Muller de tipo II (MISRII) de cualquier especie y variantes derivadas de tales proteínas MISRII por mutagénesis u otra modificación. La referencia a MISRII en esta solicitud se entiende que es una referencia a una cualquiera de las formas identificadas actualmente. Los miembros de la familia MISRII son en general proteínas transmembrana, compuestas por un dominio extracelular de unión a ligando con una región rica en cisteína, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático con actividad serina/treonina quiinasa prevista.

El término "polipéptido de MISRII" incluye polipéptidos que comprenden cualquier polipéptido natural de un miembro de la familia MISRII así como cualquier variante del mismo (incluidos mutantes, fragmentos, fusiones y formas peptidomiméticas) que retienen una actividad útil. La numeración de aminoácidos para todos los polipéptidos relacionados con MISRII descritos en esta invención se basa en la numeración de la secuencia de la proteína precursora de MISRII humana a continuación (SEQ ID NO: 50), a menos que se indique específicamente lo contrario. La secuencia de la proteína precursora canónica humana MISRII (NCBI Ref Seq NP_065434.1) es el siguiente:

1 MLGSLGLWAL LPTAVEAPPN RRTCVFFEAP GVRGSTKTLG ELLDTGTELP

51 RAIRCLYSRC CFGIWNLTQD RAQVEMQGCR DSDEPGCESL HCDPSPRAHP

101 SPGSTLFTCS CGTDFCNANY SHLPPPGSPG TPGSQGPQAA PGESIWMALV

151 LLGLFLLLLL LLGSIILALL QRKNYRVRGE PVPEPRPDSG RDWSVELQEL

201 PELCFSQVIR EGGHAWWAG QLQGKLVAIK AFPPRSVAQF QAERALYELP

251 GLQHDHIVRF ITASRGGPGR LLSGPLLVLE LHPKGSLCHY LTQYTSDWGS

301 SLRMALSLAQ GLAFLHEERW QNGQYKPGIA HRDLSSQNVL IREDGSCAIG

351 DLGLALVLPG LTQPPAWTPT QPQGPAAIME AGTQRYMAPE LLDKTLDLQD

401 WGMALRRADI YSLALLLWEI LSRCPDLRPD SSPPPFQLAY EAELGNTPTS

451 DELWALAVQE RRRPYIPSTW RCFATDPDGL RELLEDCWDA DPEARLTAEC

501 VQQRLAALAH PQESHPFPES CPRGCPPLCP EDCTSIPAPT ILPCRPQRSA

551 CHFSVQQGPC SRNPQPACTL SPV (SEQ ID NO: 50)

El péptido señal está indicado mediante subrayado único y el dominio extracelular está indicado en negrita.

La secuencia del polipéptido extracelular MISRII procesada es la siguiente:

PPNRRTCVFFEAPGVRGSTKTLGELLDTGTELPRAIRCLYSRCCFGIWNLTQDRAQVEMQGC

RDSDEPGCESLHCDPSPRAHPSPGSTLFTCSCGTDFCNANYSHLPPPGSPGTPGSQGPQAAP

GESIWMAL (SEQ ID NO: 51)

A continuación se muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína precursora de MISRII (SEQ ID NO: 52), correspondiente a los nucleótidos 81-1799 de la secuencia de referencia de Genbank NM_020547.2. La secuencia señal está subrayada.

ATGCTAGGGTCTTTGGGGCTTTGGGCATTACTTCCCACAGCTGTGGAAGCACCCCCAAACAG

GCGAACCTGTGTGTTCTTTGAGGCCCCTGGAGTGCGGGGAAGCACAAAGACACTGGGAGAGC

TGCTAGATACAGGCACAGAGC TCCCCAGAGC TATCCGCTGCC TCTACAGCCGC TGC TGCT TT

GGGATCTGGAACCTGACCCAAGACCGGGCACAGGTGGAAATGCAAGGATGCCGAGACAGTGA

TGAGCCAGGCTGTGAGTCCCTCCACTGTGACCCAAGTCCCCGAGCCCACCCCAGCCCTGGCT

CCACTCTCTTCACCTGCTCCTGTGGCACTGACTTCTGCAATGCCAATTACAGCCATCTGCCT

CCTCCAGGGAGCCCTGGGACTCCTGGCTCCCAGGGTCCCCAGGCTGCCCCAGGTGAGTCCAT

CTGGATGGCACTGGTGCTGCTGGGGCTGTTCCTCCTCCTCCTGCTGCTGCTGGGCAGCATCA

TCTTGGCCCTGCTACAGCGAAAGAACTACAGAGTGCGAGGTGAGCCAGTGCCAGAGCCAAGG

CCAGACTCAGGCAGGGACTGGAGTGTGGAGCTGCAGGAGCTGCCTGAGCTGTGTTTCTCCCA

GGTAATCCGGGAAGGAGGTCATGCAGTGGTTTGGGCCGGGCAGCTGCAAGGAAAACTGGTTG

CCATCAAGGCCTTCCCACCGAGGTCTGTGGCTCAGTTCCAAGCTGAGAGAGCATTGTACGAA

CTTCCAGGCCTACAGCACGACCACATTGTCCGATTTATCACTGCCAGCCGGGGGGGTCCTGG

CCGCCTGCTCTCTGGGCCCCTGCTGGTACTGGAACTGCATCCCAAGGGCTCCCTGTGCCACT

ACTTGACCCAGTACACCAGTGACTGGGGAAGTTCCCTGCGGATGGCACTGTCCCTGGCCCAG

GGCCTGGCATTTCTCCATGAGGAGCGCTGGCAGAATGGCCAATATAAACCAGGTATTGCCCA

CCGAGATCTGAGCAGCCAGAATGTGCTCATTCGGGAAGATGGATCGTGTGCCATTGGAGACC

TGGGCCTTGCCTTGGTGCTCCCTGGCCTCACTCAGCCCCCTGCCTGGACCCCTACTCAACCA

CAAGGCCCAGCTGCCATCATGGAAGCTGGCACCCAGAGGTACATGGCACCAGAGCTCTTGGA

CAAGACTCTGGACCTACAGGATTGGGGCATGGCCCTCCGACGAGCTGATATTTACTCTTTGG

CTCTGCTCCTGTGGGAGATACTGAGCCGCTGCCCAGATTTGAGGCCTGACAGCAGTCCACCA

CCCTTCCAACTGGCCTATGAGGCAGAACTGGGCAATACCCCTACCTCTGATGAGCTATGGGC

CTTGGCAGTGCAGGAGAGGAGGCGTCCCTACATCCCATCCACCTGGCGCTGCTTTGCCACAG

ACCCTGATGGGCTGAGGGAGCTCCTAGAAGACTGTTGGGATGCAGACCCAGAAGCACGGCTG

ACAGCTGAGTGTGTACAGCAGCGCCTGGCTGCCTTGGCCCATCCTCAAGAGAGCCACCCCTT

TCCAGAGAGCTGTCCACGTGGCTGCCCACCTCTCTGCCCAGAAGACTGTACTTCAATTCCTG

CCCCTACCATCCTCCCCTGTAGGCCTCAGCGGAGTGCCTGCCACTTCAGCGTTCAGCAAGGC

CCTTGTTCCAGGAATCCTCAGCCTGCCTGTACCCTTTCTCCTGTG (SEQ ID NO: 52)

Una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido MISRII humano extracelular es la siguiente:

CCCCCAAACAGGCGAACCTGTGTGTTCTTTGAGGCCCCTGGAGTGCGGGGAAGCACAAAGAC

ACTGGGAGAGCTGCTAGATACAGGCACAGAGCTCCCCAGAGCTATCCGCTGCCTCTACAGCC

GCTGCTGCTTTGGGATCTGGAACCTGACCCAAGACCGGGCACAGGTGGAAATGCAAGGATGC

rtri7\ri7\rt7\ri^ xr v^uri-y\ x^r Gi J7r\i.rUir Gt Grt n7G\r TiGri irGtr xpr gi xrpr oi n7\ orir xprtrtr xtrp u-rot^rr-tv7u\-r xtrp gr xirv vurr-iy7u\-r utr- ^tr nt n7\ . e7\ rr xirn Gr Gtr Gtr Gtr Utr ni .7v\ jGri Grt Grt -rrt i.iG\r Gtr Gtrt

CAGCCCTGGCTCCACTCTCTTCACCTGCTCCTGTGGCACTGACTTCTGCAATGCCAATTACA

GCCATCTGCCTCCTCCAGGGAGCCCTGGGACTCCTGGCTCCCAGGGTCCCCAGGCTGCCCCA

GGTGAGTCCATCTGGATGGCACTG (SEQ ID NO: 53)

Una isoforma alternativa de la secuencia de la proteína precursora de MISRII humana, la isoforma 2 (NCBI Ref Seq NP_001158162.1), es la siguiente:

1 MLGSLGLWAL LPTAVEAPPN RRTCVFFEAP GVRGSTKTLG ELLDTGTELP

051 RAIRCLYSRC CFGIWNLTQD RAQVEMQGCR DSDEPGCESL HCDPSPRAHP

101 SPGSTLFTCS CGTDFCNANY SHLPPPGSPG TPGSQGPQAA PGESIWMALV

151 LLGLFLLLLL LLGSIILALL QRKNYRVRGE PVPEPRPDSG RDWSVELQEL

201 PELCFSQVIR EGGHAWWAG QLQGKLVAIK AFPPRSVAQF QAERALYELP

251 GLQHDHIVRF ITASRGGPGR LLSGPLLVLE LHPKGSLCHY LTQYTSDWGS

301 SLRMALSLAQ GLAFLHEERW QNGQYKPGIA HRDLSSQNVL IREDGSCAIG

351 DLGLALVLPG LTQPPAWTPT QPQGPAAIME AGTQRYMAPE LLDKTLDLQD

401 WGMALRRADI YSLALLLWEI LSRCPDLRPA VHHPSNWPMR QNWAIPLPLM

451 SYGPWQCRRG GVPTSHPPGA ALPQTLMG (SEQ ID NO: 75)

El péptido señal está indicado mediante subrayado único y el dominio extracelular está indicado en negrita.

La secuencia del polipéptido MISRII extracelular procesada (isoforma 2) es la siguiente:

PPNRRTCVFFEAPGVRGSTKTLGELLDTGTELPRAIRCLYSRCCFGIWNLTQDRAQVEMQGC

RDSDEPGCESLHCDPSPRAHPSPGSTLFTCSCGTDFCNANYSHLPPPGSPGTPGSQGPQAAP

GESIWMAL (SEQ ID NO: 76)

A continuación se muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína precursora MISRII (isoforma 2) (SEQ ID NO: 77), correspondiente a los nucleótidos 81-1514 de la secuencia de referencia de Genbank Nm_001164690.1. La secuencia señal está subrayada.

ATGCTAGGGTCTTTGGGGCTTTGGGCATTACTTCCCACAGCTGTGGAAGCACCCCCAAACAG

GCGAACCTGTGTGTTCTTTGAGGCCCCTGGAGTGCGGGGAAGCACAAAGACACTGGGAGAGC

TGCTAGATACAGGCACAGAGCTCCCCAGAGCTATCCGCTGCCTCTACAGCCGCTGCTGCTTT

GGGATCTGGAACCTGACCCAAGACCGGGCACAGGTGGAAATGCAAGGATGCCGAGACAGTGA

TGAGCCAGGCTGTGAGTCCCTCCACTGTGACCCAAGTCCCCGAGCCCACCCCAGCCCTGGCT

CCACTCTCTTCACCTGCTCCTGTGGCACTGACTTCTGCAATGCCAATTACAGCCATCTGCCT

CCTCCAGGGAGCCCTGGGACTCCTGGCTCCCAGGGTCCCCAGGCTGCCCCAGGTGAGTCCAT

CTGGATGGCACTGGTGCTGCTGGGGCTGTTCCTCCTCCTCCTGCTGCTGCTGGGCAGCATCA

TCTTGGCCCTGCTACAGCGAAAGAACTACAGAGTGCGAGGTGAGCCAGTGCCAGAGCCAAGG

CCAGACTCAGGCAGGGACTGGAGTGTGGAGCTGCAGGAGCTGCCTGAGCTGTGTTTCTCCCA

GGTAATCCGGGAAGGAGGTCATGCAGTGGTTTGGGCCGGGCAGCTGCAAGGAAAACTGGTTG

CCATCAAGGCCTTCCCACCGAGGTCTGTGGCTCAGTTCCAAGCTGAGAGAGCATTGTACGAA

CTTCCAGGCCTACAGCACGACCACATTGTCCGATTTATCACTGCCAGCCGGGGGGGTCCTGG

CCGCCTGCTCTCTGGGCCCCTGCTGGTACTGGAACTGCATCCCAAGGGCTCCCTGTGCCACT

ACTTGACCCAGTACACCAGTGACTGGGGAAGTTCCCTGCGGATGGCACTGTCCCTGGCCCAG

GGCCTGGCATTTCTCCATGAGGAGCGCTGGCAGAATGGCCAATATAAACCAGGTATTGCCCA

CCGAGATCTGAGCAGCCAGAATGTGCTCATTCGGGAAGATGGATCGTGTGCCATTGGAGACC

TGGGCCTTGCCTTGGTGCTCCCTGGCCTCACTCAGCCCCCTGCCTGGACCCCTACTCAACCA

CAAGGCCCAGCTGCCATCATGGAAGCTGGCACCCAGAGGTACATGGCACCAGAGCTCTTGGA

CAAGACTCTGGACCTACAGGATTGGGGCATGGCCCTCCGACGAGCTGATATTTACTCTTTGG

CTCTGCTCCTGTGGGAGATACTGAGCCGCTGCCCAGATTTGAGGCCTGCAGTCCACCACCCT

TCCAACTGGCCTATGAGGCAGAACTGGGCAATACCCCTACCTCTGATGAGCTATGGGCCTTG

GCAGTGCAGGAGAGGAGGCGTCCCTACATCCCATCCACCTGGCGCTGCTTTGCCACAGACCC

TGATGGGC (SEQ ID NO: 77)

La secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido MISRII humano soluble (extracelular) procesado (isoforma 2) es la siguiente:

CCCCCAAACAGGCGAACCTGTGTGTTCTTTGAGGCCCCTGGAGTGCGGGGAAGCACAAAGAC

ACTGGGAGAGCTGCTAGATACAGGCACAGAGCTCCCCAGAGCTATCCGCTGCCTCTACAGCC

GCTGCTGCTTTGGGATCTGGAACCTGACCCAAGACCGGGCACAGGTGGAAATGCAAGGATGC

CGAGACAGTGATGAGCCAGGCTGTGAGTCCCTCCACTGTGACCCAAGTCCCCGAGCCCACCC

CAGCCCTGGCTCCACTCTCTTCACCTGCTCCTGTGGCACTGACTTCTGCAATGCCAATTACA

GCCATCTGCCTCCTCCAGGGAGCCCTGGGACTCCTGGCTCCCAGGGTCCCCAGGCTGCCCCA

GGTGAGTCCATCTGGATGGCACTG (SEQ ID NO: 78)

Una isoforma alternativa de la secuencia de la proteína precursora de MISRII humana, la isoforma 3 (NCBI Ref Seq NP_001158163.1), es la siguiente:

1 MLGSLGLWAL LPTAVEAPPN RRTCVFFEAP GVRGSTKTLG ELLDTGTELP

51 RAIRCLYSRC CFGIWNLTQD RAQVEMQGCR DSDEPGCESL HCDPSPRAHP

101 SPGSTLFTCS CGTDFCNANY SHLPPPGSPG TPGSQGPQAA PGESIWMALV

151 LLGLFLLLLL LLGSIILALL QRKNYRVRGE PVPEPRPDSG RDWSVELQEL

201 PELCFSQVIR EGGHAWWAG QLQGKLVAIK AFPPRSVAQF QAERALYELP

251 GLQHDHIVRF ITASRGGPGR LLSGPLLVLE LHPKGSLCHY LTQYTSDWGS

301 SLRMALSLAQ GLAFLHEERW QNGQYKPGIA HRDLSSQNVL IREDGSCAIG

351 DLGLALVLPG LTQPPAWTPT QPQGPAAIME DPDGLRELLE DCWDADPEAR

401 LTAECVQQRL AALAHPQESH PFPESCPRGC PPLCPEDCTS IPAPTILPCR

451 PQRSACHFSV QQGPCSRNPQ PACTLSPV(SEQ ID NO: 79)

El péptido señal está indicado mediante subrayado único y el dominio extracelular está indicado en negrita.

La secuencia del polipéptido MISRII extracelular procesada (isoforma 3) es la siguiente:

PPNRRTCVFFEAPGVRGSTKTLGELLDTGTELPRAIRCLYSRCCFGIWNLTQDRAQVEMQGC

RDSDEPGCESLHCDPSPRAHPSPGSTLFTCSCGTDFCNANYSHLPPPGSPGTPGSQGPQAAP

GESIWMAL (SEQ ID NO: 80)

A continuación se muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína precursora de MISRII humana (isoforma 3) (SEQ ID NO: 81), correspondiente a los nucleótidos 81-1514 de la secuencia de referencia de Genbank N^m_001164691.1. La secuencia señal está subrayada.

ATGCTAGGGTCTTTGGGGCTTTGGGCATTACTTCCCACAGCTGTGGAAGCACCCCCAAACAG

GCGAACCTGTGTGTTCTTTGAGGCCCCTGGAGTGCGGGGAAGCACAAAGACACTGGGAGAGC

TGCTAGATACAGGCACAGAGCTCCCCAGAGCTATCCGCTGCCTCTACAGCCGCTGCTGCTTT

GGGATCTGGAACCTGACCCAAGACCGGGCACAGGTGGAAATGCAAGGATGCCGAGACAGTGA

TGAGCCAGGCTGTGAGTCCCTCCACTGTGACCCAAGTCCCCGAGCCCACCCCAGCCCTGGCT

CCACTCTCTTCACCTGCTCCTGTGGCACTGACTTCTGCAATGCCAATTACAGCCATCTGCCT

CCTCCAGGGAGCCCTGGGACTCCTGGCTCCCAGGGTCCCCAGGCTGCCCCAGGTGAGTCCAT

CTGGATGGCACTGGTGCTGCTGGGGCTGTTCCTCCTCCTCCTGCTGCTGCTGGGCAGCATCA

TCTTGGCCCTGCTACAGCGAAAGAACTACAGAGTGCGAGGTGAGCCAGTGCCAGAGCCAAGG

CCAGACTCAGGCAGGGACTGGAGTGTGGAGCTGCAGGAGCTGCCTGAGCTGTGTTTCTCCCA

GGTAATCCGGGAAGGAGGTCATGCAGTGGTTTGGGCCGGGCAGCTGCAAGGAAAACTGGTTG

CCATCAAGGCCTTCCCACCGAGGTCTGTGGCTCAGTTCCAAGCTGAGAGAGCATTGTACGAA

CTTCCAGGCCTACAGCACGACCACATTGTCCGATTTATCACTGCCAGCCGGGGGGGTCCTGG

CCGCCTGCTCTCTGGGCCCCTGCTGGTACTGGAACTGCATCCCAAGGGCTCCCTGTGCCACT

ACTTGACCCAGTACACCAGTGACTGGGGAAGTTCCCTGCGGATGGCACTGTCCCTGGCCCAG

GGCCTGGCATTTCTCCATGAGGAGCGCTGGCAGAATGGCCAATATAAACCAGGTATTGCCCA

CCGAGATCTGAGCAGCCAGAATGTGCTCATTCGGGAAGATGGATCGTGTGCCATTGGAGACC

TGGGCCTTGCCTTGGTGCTCCCTGGCCTCACTCAGCCCCCTGCCTGGACCCCTACTCAACCA

CAAGGCCCAGCTGCCATCATGGAAGACCCTGATGGGCTGAGGGAGCTCCTAGAAGACTGTTG

GGATGCAGACCCAGAAGCACGGCTGACAGCTGAGTGTGTACAGCAGCGCCTGGCTGCCTTGG

CCCATCCTCAAGAGAGCCACCCCTTTCCAGAGAGCTGTCCACGTGGCTGCCCACCTCTCTGC

CCAGAAGACTGTACTTCAATTCCTGCCCCTACCATCCTCCCCTGTAGGCCTCAGCGGAGTGC

CTGCCACTTCAGCGTTCAGCAAGGCCCTTGTTCCAGGAATCCTCAGCCTGCCTGTACCCTTT

CTCCTGTG (SEQ ID NO: 81)

Una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido MISRII humano soluble (extracelular) procesado (isoforma 3) es la siguiente:

CCCCCAAACAGGCGAACCTGTGTGTTCTTTGAGGCCCCTGGAGTGCGGGGAAGCACAAAGAC

ACTGGGAGAGCTGCTAGATACAGGCACAGAGCTCCCCAGAGCTATCCGCTGCCTCTACAGCC

GCTGCTGCTTTGGGATCTGGAACCTGACCCAAGACCGGGCACAGGTGGAAATGCAAGGATGC

CGAGACAGTGATGAGCCAGGCTGTGAGTCCCTCCACTGTGACCCAAGTCCCCGAGCCCACCC

CAGCCCTGGCTCCACTCTCTTCACCTGCTCCTGTGGCACTGACTTCTGCAATGCCAATTACA

GCCATCTGCCTCCTCCAGGGAGCCCTGGGACTCCTGGCTCCCAGGGTCCCCAGGCTGCCCCA

GGTGAGTCCATCTGGATGGCACTG (SEQ ID NO: 82)

En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a complejos heteromultiméricos de brazo único que comprenden al menos un polipéptido de MISRII, que incluye fragmentos, variantes funcionales y formas modificadas de los mismos. Preferiblemente, los polipéptidos de MISRII para uso de acuerdo con las invenciones de la divulgación (p.ej., complejos heteromultímeros de brazo único que comprenden un polipéptido de MISRII y usos del mismo) son solubles (por ejemplo, un dominio extracelular de MISRII). En otras realizaciones preferidas de la invención, los polipéptidos de MISRII para su uso de acuerdo con las invenciones de la divulgación se unen a y/o inhiben (antagonizan) la actividad (p.ej., inducción de Smad 2/3 y/o señalización de Smad 1/5/8) de uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-beta. En algunas realizaciones, los complejos heteromultímeros de brazo único de la divulgación comprenden al menos un polipéptido de MISRII que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 50, 51, 75, 76, 79, 80, 110, 112, 407, o 408. En algunas realizaciones, los complejos heteromultímeros de brazo único de la divulgación consiste o consiste esencialmente en al menos un polipéptido de MISRII que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, 51,75, 76, 79, 80, 110, 112, 407, o 408. En ciertos aspectos, la presente descripción se refiere a complejos proteínicos que comprenden un polipéptido de ALK1. Como se usa en esta invención, el término "ALK1" se refiere a una familia de proteínas quinasa-1 de tipo receptor de activina de cualquier especie y variantes derivadas de tales proteínas ALK1 por mutagénesis u otra modificación. La referencia a ALK1 en esta solicitud se entiende que es una referencia a una cualquiera de las formas identificadas actualmente. Los miembros de la familia de proteínas ALK1 son en general proteínas transmembrana, compuestas por un dominio extracelular de unión a ligando con una región rica en cisteína, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático con actividad serina/treonina quinasa prevista.

El término “polipéptido de ALK1” incluye polipéptidos que comprenden cualquier polipéptido de origen natural de un miembro de la familia ALK1, así como cualquier variante de los mismos (lo que incluye mutantes, fragmentos, fusiones y formas peptidomiméticas), que conserva una actividad útil. La numeración de los aminoácidos para todos lo polipéptidos relacionados con ALK1 descritos en esta solicitud se basa en la numeración de la secuencia de proteína precursora de ALK1 humano proporcionada más adelante (SEQ ID NO:14), a menos que se designe específicamente de otro modo.

La secuencia de la proteína precursora de ALK1 humana (NCBI Ref Seq NP_000011.2) es la siguiente:

1 MTLGSPRKGL LMLLMALVTQ GDPVKPSRGP LVTCTCESPH CKGPTCRGAW

51 CTWLVREEG RHPQEHRGCG NLHRELCRGR PTEFVNHYCC DSHLCNHNVS

101 LVLEATQPPS EQPGTDGQLA LILGPVLALL ALVALGVLGL WHVRRRQEKQ

151 RGLHSELGES SLILKASEQG DSMLGDLLDS DCTTGSGSGL PFLVQRTVAR

201 QVALVECVGK GRYGEVWRGL WHGESVAVKI FSSRDEQSWF RETEIYNTVL

301 RLAVSAACGL AHLHVEIFGT QGKPAIAHRD FKSRNVLVKS NLQCCIADLG

351 LAVMHSQGSD YLDIGNNPRV GTKRYMAPEV LDEQIRTDCF ESYKWTDIWA

401 FGLVLWEIAR RTIVNGIVED YRPPFYDWP NDPSFEDMKK WCVDQQTPT

451 IPNRLAADPV LSGLAQMMRE CWYPNPSARL TALRIKKTLQ KISNSPEKPK

501 VIQ (SEQ ID NO: 14)

El péptido señal está indicado mediante subrayado único y el dominio extracelular está indicado en negrita.

La secuencia del polipéptido de ALK1 extracelular procesado es la siguiente:

DPVKPSRGPLVTCTCESPHCKGPTCRGAWCTWLVREEGRHPQEHRGCGNLHRELCRGRPTE

FVNHYCCDSHLCNHNVSLVLEATQPPSEQPGTDGQ (SEQ ID NO: 15)

A continuación se muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína precursora de ALK1 humana (SEQ ID NO: 16), correspondiente a los nucleótidos 284-1792 de la secuencia de referencia de Genbank N^m_000020.2. La secuencia señal está subrayada.

ATGACCTTGGGCTCCCCCAGGAAAGGCCTTCTGATGCTGCTGATGGCCTTGGTGACCCAGGG

AGACCCTGTGAAGCCGTCTCGGGGCCCGCTGGTGACCTGCACGTGTGAGAGCCCACATTGCA

AGGGGCCTACCTGCCGGGGGGCCTGGTGCACAGTAGTGCTGGTGCGGGAGGAGGGGAGGCAC

CCCCAGGAACATCGGGGC TGCGGGAAC TTGCACAGGGAGC TC TGCAGGGGGCGCCCCACCGA

GTTCGTCAACCACTACTGCTGCGACAGCCACCTCTGCAACCACAACGTGTCCCTGGTGCTGG

AGGCCACCCAACCTCCTTCGGAGCAGCCGGGAACAGATGGCCAGCTGGCCCTGATCCTGGGC

CCCGTGCTGGCCTTGCTGGCCCTGGTGGCCCTGGGTGTCCTGGGCCTGTGGCATGTCCGACG

GAGGCAGGAGAAGCAGCGTGGCCTGCACAGCGAGCTGGGAGAGTCCAGTCTCATCCTGAAAG

CATCTGAGCAGGGCGACAGCATGTTGGGGGACCTCCTGGACAGTGACTGCACCACAGGGAGT

GGCTCAGGGCTCCCCTTCCTGGTGCAGAGGACAGTGGCACGGCAGGTTGCCTTGGTGGAGTG

TGTGGGAAAAGGCCGCTATGGCGAAGTGTGGCGGGGCTTGTGGCACGGTGAGAGTGTGGCCG

TCAAGATCTTCTCCTCGAGGGATGAACAGTCCTGGTTCCGGGAGACTGAGATCTATAACACA

GTGTTGCTCAGACACGACAACATCCTAGGCTTCATCGCCTCAGACATGACCTCCCGCAACTC

GAGCACGCAGCTGTGGCTCATCACGCACTACCACGAGCACGGCTCCCTCTACGACTTTCTGC

AGAGACAGACGCTGGAGCCCCATCTGGCTCTGAGGCTAGCTGTGTCCGCGGCATGCGGCCTG

GCGCACCTGCACGTGGAGATCTTCGGTACACAGGGCAAACCAGCCATTGCCCACCGCGACTT

CAAGAGCCGCAATGTGCTGGTCAAGAGCAACCTGCAGTGTTGCATCGCCGACCTGGGCCTGG

CTGTGATGCACTCACAGGGCAGCGATTACCTGGACATCGGCAACAACCCGAGAGTGGGCACC

AAGCG GTACAT GGCACC CGAGGT GCTGGAC GAGCAGAT CCG CACGGAC TGCTTT GAGTCC TA

CAAGTGGACTGACATCTGGGCCTTTGGCCTGGTGCTGTGGGAGATTGCCCGCCGGACCATCG

TGAATGGCATCGTGGAGGACTATAGACCACCCTTCTATGATGTGGTGCCCAATGACCCCAGC

TTTGAGGACATGAAGAAGGTGGTGTGTGTGGATCAGCAGACCCCCACCATCCCTAACCGGCT

GGCTGCAGACCCGGTCCTCTCAGGCCTAGCTCAGATGATGCGGGAGTGCTGGTACCCAAACC

CCTCTGCCCGACTCACCGCGCTGCGGATCAAGAAGACACTACAAAAAATTAGCAACAGTCCA

GAGAAGCCTAAAGTGATTCAA (SEQ ID NO: 16)

Una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido ALK1 extracelular procesado es la siguiente:

GACCCTGTGAAGCCGTCTCGGGGCCCGCTGGTGACCTGCACGTGTGAGAGCCCACATTGCAA

GGGGCCTACCTGCCGGGGGGCCTGGTGCACAGTAGTGCTGGTGCGGGAGGAGGGGAGGCACC

CCCAGGAACATCGGGGCTGCGGGAACTTGCACAGGGAGCTCTGCAGGGGGCGCCCCACCGAG

TTCGTCAACCACTACTGCTGCGACAGCCACCTCTGCAACCACAACGTGTCCCTGGTGCTGGA

GGCCACCCAACCTCCTTCGGAGCAGCCGGGAACAGATGGCCAG (SEQ ID NO: 17)

En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a complejos heteromultiméricos de brazo único que comprenden al menos un polipéptido de ALK1, que incluye fragmentos, variantes funcionales y formas modificadas de los mismos. Preferiblemente, los polipéptidos de ALK1 para uso de acuerdo con las invenciones de la divulgación (p.ej., complejos heteromultímeros de brazo único que comprenden un polipéptido de ALK1 y usos del mismo) son solubles (por ejemplo, un dominio extracelular de ALK1). En otras realizaciones preferidas de la invención, los polipéptidos de ALK1 para su uso de acuerdo con las invenciones de la divulgación se unen a y/o inhiben (antagonizan) la actividad (p.ej., inducción de Smad 2/3 y/o señalización de Smad 1/5/8) de uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-beta. En algunas realizaciones, los complejos heteromultímeros de brazo único de la divulgación comprenden al menos un polipéptido de ALK1 que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 14, 15, 116, 118, 411, o 412. En algunas realizaciones, los complejos heteromultímeros de brazo único de la divulgación consiste o consiste esencialmente de al menos un polipéptido de ALK1 que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, 15, 116, 118, 411, o 412.

En ciertos aspectos, la presente descripción se refiere a complejos proteínicos que comprenden un polipéptido de ALK2. Como se usa en esta invención, el término "ALK2" se refiere a una familia de proteínas quinasa-2 de tipo receptor de activina de cualquier especie y variantes derivadas de tales proteínas ALK2 por mutagénesis u otra modificación. La referencia a ALK2 en esta solicitud se entiende que es una referencia a una cualquiera de las formas identificadas actualmente. Los miembros de la familia de proteínas ALK2 son en general proteínas transmembrana, compuestas por un dominio extracelular de unión a ligando con una región rica en cisteína, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático con actividad serina/treonina quinasa prevista.

El término “polipéptido de ALK2” incluye polipéptidos que comprenden cualquier polipéptido de origen natural de un miembro de la familia ALK2, así como cualquier variante de los mismos (lo que incluye mutantes, fragmentos, fusiones y formas peptidomiméticas), que conserva una actividad útil. La numeración de los aminoácidos para todos lo polipéptidos relacionados con ALK2 descritos en esta solicitud se basa en la numeración de la secuencia de proteína precursora de ALK2 humano proporcionada más adelante (SEQ ID NO:18), a menos que se designe específicamente de otro modo.

La secuencia de la proteína precursora de ALK2 humana (NCBI Ref Seq NP_001096.1) es el siguiente:

1 MVDGVMILPV LIMIALPSPS MEDEKPKVNP KLYMCVCEGL SCGNEDHCEG

51 QQCFSSLSIN DGFHVYQKGC FQVYEQGKMT CKTPPSPGQA VECCQGDWCN

101 RNITAQLPTK GKSFPGTQNF HLEVGLIILS WFAVCLLAC LLGVALRKFK

151 RRNQERLNPR DVEYGTIEGL ITTNVGDSTL ADLLDHSCTS GSGSGLPFLV

201 QRTVARQITL LECVGKGRYG EVWRGSWQGE NVAVKIFSSR DEKSWFRETE

Z O- CU 1 _L T XJ \ X7 T 1 \NT r X P T V 7T l \ v/lT XT j T r ) \ T l - lT lT l7 i1 T I M V T X T X T l r Q T J l ? ' T X 7 X \ A C O T XY911\v/lT r X p Ü O I D \ 1 U 1 Ü O O k j r X p V ^^ TQXJV TaV7 T X J X T r X P ' 1L 1 J \7 X 'L l l JX T 7 L , i 'N lvl y QT ^ J k O J T V n V T r \ T T 1 T X T XJ

301 DTVSCLRIVL SIASGLAHLH IEIFGTQGKP AIAHRDLKSK NILVKKNGQC

351 CIADLGLAVM HSQSTNQLDV GNNPRVGTKR YMAPEVLDET IQVDCFDSYK

401 RVDIWAFGLV LWEVARRMVS NGIVEDYKPP FYDWPNDPS FEDMRKWCV

451 DQQRPNIPNR WFSDPTLTSL AKLMKECWYQ NPSARLTALR IKKTLTKIDN

501 SLDKLKTDC (SEQ ID NO: 18)

El péptido señal está indicado mediante subrayado único y el dominio extracelular está indicado en negrita.

La secuencia del polipéptido de ALK2 humano (extracelular) soluble procesado es la siguiente:

MEDEKPKVNPKLYMCVCEGLSCGNEDHCEGQQCFSSLSINDGFHVYQKGCFQVYEQGKMTCK

TPPSPGQAVECCQGDWCNRNITAQLPTKGKSFPGTQNFHLE (SEQ ID NO: 19)

A continuación se muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína precursora de ALK2 humana (SEQ ID NO: 20), correspondiente a los nucleótidos 431-1957 de la secuencia de referencia de Genbank NM_001105.4. La secuencia señal está subrayada.

ATGGTAGATGGAGTGATGATTCTTCCTGTGCTTATCATGATTGCTCTCCCCTCCCCTAGTAT

GGAAGATGAGAAGCCCAAGGTCAACCCCAAAC TC TACATGTGTGTGTGTGAAGGTC TC TCC T

GCGGTAATGAGGACCAC TGTGAAGGCCAGCAGTGC T T TTCC TCAC TGAGCATCAACGATGGC

CCCGCCGTCCCCTGGCCAAGCCGTGGAGTGCTGCCAAGGGGACTGGTGTAACAGGAACATCA

CGGCCCAGC TGCCCAC TAAAGGAAAATCC T TCCC TGGAACACAGAAT TTCCAC TTGGAGGTT

GGCCTCATTATTCTCTCTGTAGTGTTCGCAGTATGTCTTTTAGCCTGCCTGCTGGGAGTTGC

TCTCCGAAAATTTAAAAGGCGCAACCAAGAACGCCTCAATCCCCGAGACGTGGAGTATGGCA

CTATC GAAGGG CTCATCAC CACCAAT GTT GGAGACAG CACT TTAGCAGAT TTAT TGGATCAT

TCGTGTACATCAGGAAGTGGCTCTGGTCTTCCTTTTCTGGTACAAAGAACAGTGGCTCGCCA

GATTACACTGTTGGAGTGTGTCGGGAAAGGCAGGTATGGTGAGGTGTGGAGGGGCAGCTGGC

AAGGGGAGAATGTTGCCGTGAAGATCTTCTCCTCCCGTGATGAGAAGTCATGGTTCAGGGAA

ACGGAAT TGTACAACAC TGTGAT GCTGAG GCATGAAAATAT CTTAGG TTTCATT GCTTCAGA

CATGACAT CAAGACACT CCAGTACCCAGC TGTGGT TAATTACACAT TAT CATGAAATGGGAT

CGTTGTACGACTATCTTCAGCTTACTACTCTGGATACAGTTAGCTGCCTTCGAATAGTGCTG

TCCATAG CTAG TGGTCTTG CACAT TTGCACATAGAGATAT T TGGGACC CAAGGGAAAC CAG C

CATTG CCCATC GAGATT TAAAGAG CAAAAATAT TC TGGTTAAGAAGAAT GGACAG TGTTG CA

TAGCAGATTTGGGCCTGGCAGTCATGCATTCCCAGAGCACCAATCAGCTTGATGTGGGGAAC

AATCCCCGTGTGGGCACCAAGCGCTACATGGCCCCCGAAGTTCTAGATGAAACCATCCAGGT

GGATTGTTTCGATTCTTATAAAAGGGTCGATATTTGGGCCTTTGGACTTGTTTTGTGGGAAG

TGGCCAGGCGGATGGTGAGCAATGGTATAGTGGAGGATTACAAGCCACCGTTCTACGATGTG

GTTCCCAATGACCCAAGTTTTGAAGATATGAGGAAGGTAGTCTGTGTGGATCAACAAAGGCC

AAACATAC CCAACAGAT GGTTCT CAGACCCGACAT TAACCTCTCTGGCCAAGC TAATGAAAG

AATGCTGGTAT CAAAAT CCATCC GCAAGAC TCACAG CACTGC GTATCAAAAAGAC TTTGAC C

AAAATTGATAATTCCCTCGACAAATTGAAAACTGACTGT (SEQ ID NO: 20)

Una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido ALK2 extracelular es la siguiente:

ATGGAAGATGAGAAGCCCAAGGTCAACCCCAAACTCTACATGTGTGTGTGTGAAGGTCTCTC

CTGCGGTAATGAGGACCACTGTGAAGGCCAGCAGTGCTTTTCCTCACTGAGCATCAACGATG

GCTTCCACGTCTACCAGAAAGGCTGCTTCCAGGTTTATGAGCAGGGAAAGATGACCTGTAAG

ACCCCGCCGTCCCCTGGCCAAGCCGTGGAGTGCTGCCAAGGGGACTGGTGTAACAGGAACAT

CACGGCCCAGCTGCCCACTAAAGGAAAATCCTTCCCTGGAACACAGAATTTCCACTTGGAG

(SEQ ID NO: 21)

En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a complejos heteromultiméricos de brazo único que comprenden al menos un polipéptido de ALK2, que incluye fragmentos, variantes funcionales y formas modificadas de los mismos. Preferiblemente, los polipéptidos de ALK2 para uso de acuerdo con las invenciones de la divulgación (p.ej., complejos heteromultímeros de brazo único que comprenden un polipéptido de ALK2 y usos del mismo) son solubles (por ejemplo, un dominio extracelular de ALK2). En otras realizaciones preferidas de la invención, los polipéptidos de ALK2 para su uso de acuerdo con las invenciones de la divulgación se unen a y/o inhiben (antagonizan) la actividad (p.ej., inducción de Smad 2/3 y/o señalización de Smad 1/5/8) de uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-beta. En algunas realizaciones, los complejos heteromultímeros de brazo único de la divulgación comprenden al menos un polipéptido de ALK2 que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 18,19, 119, 121,413, o 414. En algunas realizaciones, los complejos heteromultímeros de brazo único de la divulgación consiste o consiste esencialmente de al menos un polipéptido de ALK2 que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, 19, 119, 121,413, o 414.

En ciertos aspectos, la presente descripción se refiere a complejos proteínicos que comprenden un polipéptido de ALK3. Como se usa en esta invención, el término "ALK3" se refiere a una familia de proteínas quinasa-3 de tipo receptor de activina de cualquier especie y variantes derivadas de tales proteínas ALK3 por mutagénesis u otra modificación. La referencia a ALK3 en esta solicitud se entiende que es una referencia a una cualquiera de las formas identificadas actualmente. Los miembros de la familia de proteínas ALK3 son en general proteínas transmembrana, compuestas por un dominio extracelular de unión a ligando con una región rica en cisteína, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático con actividad serina/treonina quinasa prevista.

El término “polipéptido de ALK3” incluye polipéptidos que comprenden cualquier polipéptido de origen natural de un miembro de la familia ALK3, así como cualquier variante de los mismos (lo que incluye mutantes, fragmentos, fusiones y formas peptidomiméticas), que conserva una actividad útil. La numeración de los aminoácidos para todos lo polipéptidos relacionados con ALK3 descritos en esta solicitud se basa en la numeración de la secuencia de proteína precursora de ALK3 humano proporcionada más adelante (SEQ ID NO:22), a menos que se designe específicamente de otro modo.

La secuencia de la proteína precursora de ALK3 humana (NCBI Ref Seq NP_004320.2) es el siguiente:

1 MPQLYIYIRLLGAYLFIISRVQGQNLDSML HGTGMKSDSD QKKSENGVTLAPEDTLPFLK

61 CYCSGHCPDDAINNTCITNGHCFAIIEEDD QGETTLASGC MKYEGSDFQCKDSPKAQLRR

121 TIECCRTNLCNQYLQPTLPPWIGPFFDGS IRWLVLLISM AVCIIAMIIFSSCFCYKHYC

181 KSISSRRRYN RDLEQDEAFIPVGESLKDLI DQSQSSGSGS GLPLLVQRTIAKQIQMVRQV

241 GKGRYGEVWMGKWRGEKVAVKVFFTTEEAS WFRETEIYQT VLMRHENILGFIAADIKGTG

301 SWTQLYLITD YHENGSLYDFLKCATLDTRA LLKLAYSAAC GLCHLHTEIYGTQGKPAIAH

361 RDLKSKNILI KKNGSCCIADLGLAVKFNSD TNEVDVPLNT RVGTKRYMAPEVLDESLNKN

421 HFQPYIMADIYSFGLIIWEMARRCITGGIV EEYQLPYYNM VPSDPSYEDMREVVCVKRLR

481 PIVSNRWNSD ECLRAVLKLMSECWAHNPAS RLTALRIKKT LAKMVESQDVKI

(SEQ IDNO: 22)

El péptido señal está indicado mediante subrayado único y el dominio extracelular está indicado en negrita.

La secuencia del polipéptido de ALK3 humano (extracelular) soluble procesado es la siguiente:

1 QNLDSMLHGT GMKSDSDQKKSENGVTLAPE DTLPFLKCYC SGHCPDDAINNTCITNGHCF

61 AIIEEDDQGE TTLASGCMKY EGSDFQCKDS PKAQLRRTIE CCRTNLCNQY LQPTLPPVVI

121 GPFFDGSIR (SEQ IDNO: 23)

A continuación se muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína precursora de ALK3 humana (SEQ ID NO: 24), correspondiente a los nucleótidos 549-2144 de la secuencia de referencia de Genbank Nm_004329.2. La secuencia señal está subrayada y el dominio extracelular está indicado en negrita.

1 ATGCCTCAGC TATACATTTA CATCAGATTA TTGGGAGCCT ATTTGTTCAT

CATTTCTCGT

61 GTTCAAGGAC AGAATCTGGA TAGTATGCTT CATGGCACTG GGATGAAATC AGACTCCGAC

121 CAGAAAAAGT CAGAAAATGG AGTAACCTTA GCACCAGAGG ATACCTTGCC TTTTTTAAAG

181 TGCTATTGCT CAGGGCACTG TCCAGATGAT GCTATTAATA ACACATGCAT AACTAATGGA

241 CATTGCTTTG CCATCATAGA AGAAGATGAC CAGGGAGAAA CCACATTAGC TTCAGGGTGT

301 ATGAAATATG AAGGATCTGA TTTTCAGTGC AAAGATTCTC CAAAAGCCCA GCTACGCCGG

361 ACAATAGAAT GTTGTCGGAC CAATTTATGT AACCAGTATT TGCAACCCAC ACTGCCCCCT

421 GTTGTCATAG GTCCGTTTTT TGATGGCAGC ATTCGATGGC TGGTTTTGCT CATTTCTATG

481 GCTGTCTGCA TAATTGCTAT GATCATCTTC TCCAGCTGCT TTTGTTACAA ACATTATTGC

541 AAGAGCATCT CAAGCAGACG TCGTTACAAT CGTGATTTGG AACAGGATGA AGCATTTATT

601 CCAGTTGGAG AATCACTAAA AGACCTTATT GACCAGTCAC AAAGTTCTGG TAGTGGGTCT

661 GGACTACCTT TATTGGTTCA GCGAACTATT GCCAAACAGA TTCAGATGGT CCGGCAAGTT

721 GGTAAAGGCC GATATGGAGA AGTATGGATG GGCAAATGGC GTGGCGAAAA

AGTGGCGGTG

781 AAAGTATTCT TTACCACTGA AGAAGCCAGC TGGTTTCGAG AAACAGAAAT

CTACCAAACT

841 GTGCTAATGC GCCATGAAAA CATACTTGGT TTCATAGCGG CAGACATTAA

AGGTACAGGT

901 TCCTGGACTC AGCTCTATTT GATTACTGAT TACCATGAAA ATGGATCTCT

CTATGACTTC

961 CTGAAATGTG CTACACTGGA CACCAGAGCC CTGCTTAAAT TGGCTTATTC

AGCTGCCTGT

1021 GGTCTGTGCC ACCTGCACAC AGAAATTTAT GGCACCCAAG GAAAGCCCGC

AATTGCTCAT

1081 CGAGACCTAA AGAGCAAAAA CATCCTCATC AAGAAAAATG GGAGTTGCTG

CATTGCTGAC

1141 CTGGGCCTTG CTGTTAAATT CAACAGTGAC ACAAATGAAG TTGATGTGCC

CTTGAATACC

1201 AGGGTGGGCA CCAAACGCTA CATGGCTCCC GAAGTGCTGG ACGAAAGCCT

GAACAAAAAC

1261 CACTTCCAGC CCTACATCAT GGCTGACATC TACAGCTTCG GCCTAATCAT

TTGGGAGATG

1321 GCTCGTCGTT GTATCACAGG AGGGATCGTG GAAGAATACC AATTGCCATA

TTACAACATG

1381 GTACCGAGTG ATCCGTCATA CGAAGATATG CGTGAGGTTG TGTGTGTCAA

ACGTTTGCGG

1441 CCAATTGTGT CTAATCGGTG GAACAGTGAT GAATGTCTAC GAGCAGTTTT

GAAGCTAATG

1501 TCAGAATGCT GGGCCCACAA TCCAGCCTCC AGACTCACAG CATTGAGAAT

TAAGAAGACG

1561 CTTGCCAAGA TGGTTGAATC CCAAGATGTA AAAATC (SEQ ID NO: 24)

La secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de ALK3 humano extracelular es la siguiente:

1 CAGAATCTGG ATAGTATGCT TCATGGCACT GGGATGAAAT CAGACTCCGA

CCAGAAAAAG

61 TCAGAAAATG GAGTAACCTT AGCACCAGAG GATACCTTGC CTTTTTTAAA

GTGCTATTGC

121 TCAGGGCACT GTCCAGATGATGCTATTAAT AACACATGCATAACTAATGG

ACATTGCTTT

181 GCCATCATAG AAGAAGATGACCAGGGAGAAACCACATTAG CTTCAGGGTG

TATGAAATAT

241 GAAGGATCTG ATTTTCAGTG CAAAGATTCT CCAAAAGCCCAGCTACGCCG

GACAATAGAA

301 TGTTGTCGGA CCAATTTATG TAACCAGTAT TTGCAACCCACACTGCCCCC

TGTTGTCATA

361 GGTCCGTTTT TTGATGGCAG CATTCGA (SEQ IDNO: 25)

Una fórmula general para un polipéptido ALK3 activo (p. ej., que se une al ligando) es una que comprende un polipéptido que comienza en cualquier posición de aminoácido 25-31 (es decir, posición 25, 26, 27, 28, 29, 30 o 31) de SEQ ID NO: 22 y termina en cualquier posición de aminoácidos 140-152 de SEQ ID ⁿO: 22 (es decir, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151 o 152). Ver Patente EE. UU. 8,338,377.

En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a complejos de heteromultímero de brazo único que comprenden al menos un polipéptido de ALK3, que incluye fragmentos, variantes funcionales y formas modificadas de los mismos. Preferiblemente, los polipéptidos de ALK3 para uso de acuerdo con las invenciones de la divulgación (p.ej., complejos heteromultímeros de brazo único que comprenden un polipéptido de ALK3 y usos del mismo) son solubles (por ejemplo, un dominio extracelular de ALK3). En otras realizaciones preferidas de la invención, los polipéptidos de ALK3 para su uso de acuerdo con las invenciones de la divulgación se unen a y/o inhiben (antagonizan) la actividad (p.ej., inducción de Smad 2/3 y/o señalización de Smad 1/5/8) de uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-beta. En algunas realizaciones, los complejos heteromultímeros de brazo único de la divulgación comprenden al menos un polipéptido ALK3 que comprende, consiste o consiste esencialmente en un aminoácido que comienza en cualquier posición de aminoácido 25-31 (es decir, posición 25, 26, 27, 28)., 29, 30 o 31) de SEQ ID NO: 22 y terminando en cualquier posición de aminoácidos 140-153 de SEQ ID NO: 22 (es decir, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151 o 152) de SEQ ID NO: 22. En algunas realizaciones, los complejos heteromultímeros de brazo único de la divulgación comprenden al menos un polipéptido de ALK3 que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID N^o : 22, 23, 122, 124, 415, o 416. En algunas realizaciones, los complejos heteromultímeros de brazo único de la divulgación consiste o consiste esencialmente de al menos un polipéptido de ALK3 que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, 23, 122, 124, 415, o 416.

En ciertos aspectos, la presente descripción se refiere a complejos proteínicos que comprenden un polipéptido de ALK4. Como se usa en esta invención, el término "ALK4" se refiere a una familia de proteínas quinasa-4 de tipo receptor de activina de cualquier especie y variantes derivadas de tales proteínas ALK4 por mutagénesis u otra modificación. La referencia a ALK4 en esta solicitud se entiende que es una referencia a una cualquiera de las formas identificadas actualmente. Los miembros de la familia de proteínas ALK4 son en general proteínas transmembrana, compuestas por un dominio extracelular de unión a ligando con una región rica en cisteína, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático con actividad serina/treonina quinasa prevista.

El término “polipéptido de ALK4” incluye polipéptidos que comprenden cualquier polipéptido de origen natural de un miembro de la familia ALK4, así como cualquier variante de los mismos (lo que incluye mutantes, fragmentos, fusiones y formas peptidomiméticas), que conserva una actividad útil. La numeración de los aminoácidos para todos lo polipéptidos relacionados con ALK4 descritos en esta solicitud se basa en la numeración de la secuencia de proteína precursora de ALK4 humano proporcionada más adelante (SEQ ID NO:26), a menos que se designe específicamente de otro modo.

La secuencia de proteínas del precursor de ALK4 humano canónico (isoforma A, NCBI Ref Seq NP_004293) es la siguiente:

1 MAESAGASSF FPLVVLLLAG SGGSGPRGVQ ALLCACTSCL QANYTCETDG

ACMVSIFNLD

61 GMEHHVRTCI PKVELVPAGK PFYCLSSEDL RNTHCCYTDY CNRIDLRVPS

GHLKEPEHPS

121 MWGPVELVGI IAGPVFLLFL IIIIVFLVIN YHQRVYHNRQ RLDMEDPSCE

MCLSKDKTLQ

181 DLVYDLSTSG SGSGLPLFVQ RTVARTIVLQ EIIGKGRFGE VWRGRWRGGD

VAVKIFSSRE

241 ERSWFREAEI YQTVMLRHEN ILGFIAADNK DNGTWTQLWL VSDYHEHGSL

FDYLNRYTVT

301 IEGMIKLALS AASGLAHLHM EIVGTQGKPG IAHRDLKSKN ILVKKNGMCA

IADLGLAVRH

361 DAVTDTIDIA PNQRVGTKRY MAPEVLDETI NMKHFDSFKC ADIYALGLVY

WEIARRCNSG

421 GVHEEYQLPY YDLVPSDPSI EEMRKVVCDQ KLRPNIPNWW QSYEALRVMG

KMMRECWYAN

481 GAARLTALRI KKTLSQLSVQ EDVKI (SEQ ID NO: 26)

El péptido señal está indicado mediante subrayado único y el dominio extracelular está indicado en negrita.

La secuencia del polipéptido de ALK4 humano extracelular procesado es la siguiente:

SGPRGVQALLCACTSCLQANYTCETDGACMVSIFNLDGMEHHVRTCIPKVELVPAGKPFYCL

SSEDLRNTHCCYTDYCNRIDLRVPSGHLKEPEHPSMWGPVE (SEQ ID NO: 27)

A continuación se muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína precursora de ALK4. (SEQ ID NO: 28), correspondiente a los nucleótidos 78-1592 de la secuencia de referencia de Genbank NM_004302.4. La frecuencia señal está subrayada y el dominio extracelular se indica en negrita.

A T G G C G G A G T C G G C C G G A G C C T C C T C C T T C T T C C C C C T T G T T G T C C T C C T G C T C G C C G G C A G

C G G C G G G T C C G G G C C C C G G G G G G T C C A G G C T C T G C T G T G T G C G T G C A C C A G C T G C C T C C A G G

C C A A C T A C A C G T G T G A G A C A G A T G G G G C C T G C A T G G T T T C C A T T T T C A A T C T G G A T G G G A T G

G A G C A C C A T G T G C G C A C C T G C A T C C C C A A A G T G G A G C T G G T C C C T G C C G G G A A G C C C T T C T A

C T G C C T G A G C T C G G A G G A C C T G C G C A A C A C C C A C T G C T G C T A C A C T G A C T A C T G C A A C A G G A

T C G A C T T G A G G G T G C C C A G T G G T C A C C T C A A G G A G C C T G A G C A C C C G T C C A T G T G G G G C C C G

G T G G A G C T G G T A G G C A T C A T C G C C G G C C C G G T G T T C C T C C T G T T C C T C A T C A T C A T C A T T G T

T T T C C T T G T C A T T A A C T A T C A T C A G C G T G T C T A T C A C A A C C G C C A G A G A C T G G A C A T G G A A G

A T C C C T C A T G T G A G A T G T G T C T C T C C A A A G A C A A G A C G C T C C A G G A T C T T G T C T A C G A T C T C

T C C A C C T C A G G G T C T G G C T C A G G G T T A C C C C T C T T T G T C C A G C G C A C A G T G G C C C G A A C C A T

C G T T T T A C A A G A G A T T A T T G G C A A G G G T C G G T T T G G G G A A G T A T G G C G G G G C C G C T G G A G G G

GAGATATAC CAGAC GGTCAT GCTG CGCCAT GAAAACAT CCTT GGATTTATTGCTGCT GACAA

TAAAGATAATGGCACCTGGACACAGCTGTGGCTTGTTTCTGACTATCATGAGCACGGGTCCC

TGTTTGATTATCTGAACCGGTACACAGTGACAATTGAGGGGATGATTAAGCTGGCCTTGTCT

GCTGCTAGTGGGCTGGCACACCTGCACATGGAGATCGTGGGCACCCAAGGGAAGCCTGGAAT

TGCTCAT CGAGAC TTAAAG TCAAAGAACAT TCTGGT GAAGAAAAAT GG CATGTG TGCCATAG

CAGACCTGGGCCTGGCTGTCCGTCATGATGCAGTCACTGACACCATTGACATTGCCCCGAAT

CAGAG GGTGGG GACCAAAC GATACAT GGCC CCTGAAG TACTT GATGAAAC CATTAATAT GAA

ACACTTTGACTCCTTTAAATGTGCTGATATTTATGCCCTCGGGCTTGTATATTGGGAGATTG

CTCGAAGATGCAAT TCTGGAGGAGT CCATGAAGAATAT CAGCTGCCATATTACGAC TTAGT G

CCCTCTGACCCTTCCATTGAGGAAATGCGAAAGGTTGTATGTGATCAGAAGCTGCGTCCCAA

CATCCCCAACTGGTGGCAGAGTTATGAGGCACTGCGGGTGATGGGGAAGATGATGCGAGAGT

GTTGGTATGCCAACGGCGCAGCCCGCCTGACGGCCCTGCGCATCAAGAAGACCCTCTCCCAG

CTCAGCGTGCAGGAAGACGTGAAGATC (SEQ ID NO: 28)

Una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido ALK4 extracelular es la siguiente:

TCCGGGCCCCGGGGGGTCCAGGCTCTGCTGTGTGCGTGCACCAGCTGCCTCCAGGCCAACTA

CACGTGTGAGACAGATGGGGCCTGCATGGTTTCCATTTTCAATCTGGATGGGATGGAGCACC

ATGTGCGCACCTGCATCCCCAAAGTGGAGCTGGTCCCTGCCGGGAAGCCCTTCTACTGCCTG

AGCTCGGAGGACCTGCGCAACACCCACTGCTGCTACACTGACTACTGCAACAGGATCGACTT

GAGGGTGCCCAGTGGTCACCTCAAGGAGCCTGAGCACCCGTCCATGTGGGGCCCGGTGGAG

(SEQ ID NO: 29)

Una isoforma alternativa del precursor de ALK4 humano, la isoforma B (NCBI Ref Seq NP_064732.3), es la siguiente:

1 MVSIFNLDGM EHHVRTCIPK VELVPAGKPF YCLSSEDLRN THCCYTDYCN

RIDLRVPSGH

61 LKEPEHPSMW GPVELVGIIA GPVFLLFLII IIVFLVINYH QRVYHNRQRL

DMEDPSCEMC

121 LSKDKTLQDL VYDLSTSGSG SGLPLFVQRT VARTIVLQEI IGKGRFGEVW

RGRWRGGDVA

181 VKIFSSREER SWFREAEIYQ TVMLRHENIL GFIAADNKDN GTWTQLWLVS

DYHEHGSLFD

241 YLNRYTVTIE GMIKLALSAA SGLAHLHMEI VGTQGKPGIA HRDLKSKNIL

VKKNGMCAIA

301 DLGLAVRHDA VTDTIDIAPN QRVGTKRYMA PEVLDETINM KHFDSFKCAD

IYALGLVYWE

361 IARRCNSGGV HEEYQLPYYD LVPSDPSIEE MRKWCDQKL RPNIPNWWQS

YEALRVMGKM

421 MRECWYANGA ARLTALRIKK TLSQLSVQED VKI (SEQ ID NO:83)

El dominio extracelular se indica en negrita.

La secuencia extracelular del polipéptido ALK4 (isoforma B) es la siguiente:

MVSIFNLDGMEHHVRTCIPKVELVPAGKPFYCLSSEDLRNTHCCYTDYCNRIDLRVPSGHLK

EPEHPSMWGPVE (SEQ ID NO: 84)

A continuación se muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica la isoforma B de la proteína precursora de ALK4 (SEQ ID NO: 85), correspondiente a los nucleótidos 186-1547 de la secuencia de referencia Genbank. NM_020327.3. El dominio extracelular se indica en negrita.

ATGGTTTCCATTTTCAATCTGGATGGGATGGAGCACCATGTGCGCACCTGCATCCCCAAAGT

GGAGCTGGTCCCTGCCGGGAAGCCCTTCTACTGCCTGAGCTCGGAGGACCTGCGCAACACCC

ACTGCTGC TACACTGAC TAC TGCAACAGGATCGAC T TGAGGGTGCCCAGTGGTCACC TCAAG

GAGCCTGAGCACCCGTCCATGTGGGGCCCGGTGGAGCTGGTAGGCATCATCGCCGGCCCGGT

GTTCCTCCTGTTCCTCATCATCATCATTGTTTTCCTTGTCATTAACTATCATCAGCGTGTCT

AT CACAAC CGCCAGAGACT GGACAT GGAAGATCCC TCAT GTGAGATGTGTCTCTCCAAAGAC

AAGACGCTCCAGGATCTTGTCTACGATCTCTCCACCTCAGGGTCTGGCTCAGGGTTACCCCT

CTTTGTCCAGCGCACAGTGGCCCGAACCATCGTTTTACAAGAGATTATTGGCAAGGGTCGGT

TTGGGGAAGTATGGCGGGGCCGCTGGAGGGGTGGTGATGTGGCTGTGAAAATATTCTCTTCT

CGTGAAGAACGGTCTTGGTTCAGGGAAGCAGAGATATACCAGACGGTCATGCTGCGCCATGA

AAACATCCTTGGATTTATTGCTGCTGACAATAAAGATAATGGCACCTGGACACAGCTGTGGC

TTGTTTCTGACTATCATGAGCACGGGTCCCTGTTTGATTATCTGAACCGGTACACAGTGACA

ATTGAGGGGATGATTAAGCTGGCCTTGTCTGCTGCTAGTGGGCTGGCACACCTGCACATGGA

GATCGTGGGCACCCAAGGGAAGCCTGGAATTGCTCATCGAGACTTAAAGTCAAAGAACATTC

TGGTGAAGAAAAATGGCATGTGTGCCATAGCAGACCTGGGCCTGGCTGTCCGTCATGATGCA

GTCACT GACACCAT TGACAT TGCCC CGAATCAGAG GG TGGGGAC CAAACGATACAT G GCCCC

TGAAGTAC TTGAT GAAACCAT TAATAT GAAACACT TT GACTCCT TTAAATGTGCTGATATTT

ATGCCCTCGGGCTTGTATATTGGGAGATTGCTCGAAGATGCAATTCTGGAGGAGTCCATGAA

GAATATCAGCTGCCATATTACGACTTAGTGCCCTCTGACCCTTCCATTGAGGAAATGCGAAA

GGTTGTATGTGATCAGAAGCTGCGTCCCAACATCCCCAACTGGTGGCAGAGTTATGAGGCAC

TGCGGGTGATGGGGAAGATGATGCGAGAGTGTTGGTATGCCAACGGCGCAGCCCGCCTGACG

GCCCTGCGCATCAAGAAGACCCTCTCCCAGCTCAGCGTGCAGGAAGACGTGAAGATC (SEQ

ID NO: 85)

Una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio extracelular del polipéptido de ALK4 (isoforma B) es la siguiente:

ATGGTTTCCATTTTCAATCTGGATGGGATGGAGCACCATGTGCGCACCTGCATCCCCAAAGT

GGAGCTGGTCCCTGCCGGGAAGCCCTTCTACTGCCTGAGCTCGGAGGACCTGCGCAACACCC

ACTGCTGCTACACTGACTACTGCAACAGGATCGACTTGAGGGTGCCCAGTGGTCACCTCAAG

GAGCCTGAGCACCCGTCCATGTGGGGCCCGGTGGAG (SEQ ID NO: 86)

En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a complejos heteromultiméricos de brazo único que comprenden al menos un polipéptido de ALK4, que incluye fragmentos, variantes funcionales y formas modificadas de los mismos. Preferiblemente, los polipéptidos de ALK4 para uso de acuerdo con las invenciones de la divulgación (p.ej., complejos heteromultímeros de brazo único que comprenden un polipéptido de ALK4 y usos del mismo) son solubles (por ejemplo, un dominio extracelular de ALK4). En otras realizaciones preferidas de la invención, los polipéptidos de ALK4 para su uso de acuerdo con las invenciones de la divulgación se unen a y/o inhiben (antagonizan) la actividad (p.ej., inducción de Smad 2/3 y/o señalización de Smad 1/5/8) de uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-beta. En algunas realizaciones, los complejos heteromultímeros de brazo único de la divulgación comprenden al menos un polipéptido de ALK4 que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 26, 27, 83, 84, 125, 127, 417, o 418. En algunas realizaciones, los complejos heteromultímeros de brazo único de la divulgación consiste o consiste esencialmente de al menos un polipéptido de ALK4 que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, 27, 83, 84, 125, 127, 417, o 418.

En ciertos aspectos, la presente descripción se refiere a complejos proteínicos que comprenden un polipéptido de ALK5. Como se usa en esta invención, el término "ALK5" se refiere a una familia de proteínas quinasa-5 similares al receptor de activina de cualquier especie y variantes derivadas de tales proteínas ALK4 por mutagénesis u otra modificación. La referencia a ALK5 en esta solicitud se entiende que es una referencia a una cualquiera de las formas identificadas actualmente. Los miembros de la familia de proteínas ALK5 son en general proteínas transmembrana, compuestas por un dominio extracelular de unión a ligando con una región rica en cisteína, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático con actividad serina/treonina quinasa prevista.

El término “polipéptido de ALK5” incluye polipéptidos que comprenden cualquier polipéptido de origen natural de un miembro de la familia ALK5, así como cualquier variante de los mismos (lo que incluye mutantes, fragmentos, fusiones y formas peptidomiméticas), que conserva una actividad útil. La numeración de los aminoácidos para todos lo polipéptidos relacionados con ALK5 descritos en esta solicitud se basa en la numeración de la secuencia de proteína precursora de ALK5 humano proporcionada más adelante (SEQ ID NO:30), a menos que se designe específicamente de otro modo.

La secuencia de la proteína precursora de ALK5 humana canónica (NCBI Ref Seq NP_004603.1) es la siguiente:

1 MEAAVAAPRP RLLLLVLAAAAAAAAALLPGATALQCFCHL CTKDNFTCVT

DGLCFVSVTE

61 TTDKVIHNSM CIAEIDLIPR DRPFVCAPSS KTGSVTTTYC CNQDHCNKIE

LPTTVKSSPG

121 LGPVELAAVI AGPVCFVCIS LMLMVYICHN RTVIHHRVPN EEDPSLDRPF

ISEGTTLKDL

181 IYDMTTSGSG SGLPLLVQRT IARTIVLQES IGKGRFGEVW RGKWRGEEVA

VKIFSSREER

241 SWFREAEIYQ TVMLRHENIL GFIAADNKDN GTWTQLWLVS DYHEHGSLFD

YLNRYTVTVE

301 GMIKLALSTA SGLAHLHMEI VGTQGKPAIA HRDLKSKNIL VKKNGTCCIA

361 ATDTIDIAPN HRVGTKRYMA PEVLDDSINM KHFESFKRAD IYAMGLVFWE

IARRCSIGGI

421 HEDYQLPYYD LVPSDPSVEE MRKVVCEQKL RPNIPNRWQS CEALRVMAKI

MRECWYANGA

481 ARLTALRIKK TLSQLSQQEG IKM (SEQ IDNO: 30)

El péptido señal está indicado mediante subrayado único y el dominio extracelular está indicado en negrita.

La secuencia del polipéptido de ALK5 extracelular procesado es la siguiente:

AALLPGATALQCFCHLCTKDNFTCVTDGLCFVSVTETTDKVIHNSMCIAEIDLIPRDRPFVC

APSSKTGSVTTTYCCNQDHCNKIELPTTVKSSPGLGPVEL (SEQ ID NO: 31)

A continuación se muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína precursora de ALK5. (SEQ ID NO: 32), correspondiente a los nucleótidos 77-1585 de la secuencia de referencia de Genbank NM_004612.2. La frecuencia señal está subrayada y el dominio extracelular se indica en negrita.

ATGGAGGCGGCGGTCGCTGCTCCGCGTCCCCGGCTGCTCCTCCTCGTGCTGGCGGCGGCGGC

GGCGGCGGCGGCGGCGCTGCTCCCGGGGGCGACGGCGTTACAGTGTTTCTGCCACCTCTGTA

CAAAAGACAAT TTTAC TTGTGTGACAGATGGGCTCTGCTTTGTCTCTGTCACAGAGACCACA

GACAAAGT TATACACAACAGCATGTGTATAGC TGAAATTGAC TTAAT TCCTCGAGATAGGCC

GTTTGTATGTGCACCC TCTTCAAAAAC TGGGTC TGTGAC TACAACATAT TGCTGCAATCAGG

ACCAT TGCAATAAAATAGAAC T TCCAACTAC TGTAAAGTCATCACC TGGCC TTGGTCC TGTG

GAACTGGCAGCTGTCATTGCTGGACCAGTGTGCTTCGTCTGCATCTCACTCATGTTGATGGT

CTATATCTGC CACAAC CGCACTG TCATTCAC CATC GAGTGC CAAATGAAGAG GAC CCTTCAT

TAGATCGCCCTTTTATTTCAGAGGGTACTACGTTGAAAGACT TAATT TATGATATGACAACG

TCAGGTTCTGGCTCAGGTTTACCATTGCTTGTTCAGAGAACAATTGCGAGAACTATTGTGTT

ACAAGAAAG CAT TGGCAAAG GTC GATTTG GAGAAG TTTGGAGAG GAAAG TGGCG GGGAGAAG

AAGTTGCTGTTAAGATATTCTCCTCTAGAGAAGAACGTTCGTGGTTCCGTGAGGCAGAGATT

TATCAAACTGTAATGTTACGTCATGAAAACAT CCTGGGATTTATAGCAGCAGACAATAAAGA

CAATGGTACTTGGACTCAGCTCTGGTTGGTGTCAGATTATCATGAGCATGGATCCCTTTTTG

ATTAC TTAAACAGATACACAG T TACTGTG GAAGGAAT GATAAAAC TTGCTCTGTC CACG GCG

AGCGGTCTTGCCCATCTTCACATGGAGATTGTTGGTACCCAAGGAAAGCCAGCCATTGCTCA

TAGAGATT TGAAATCAAAGAATATC TTGGTAAAGAAGAAT GGAAC TT GCTGTAT TGCAGACT

TAGGAC TGGCAG TAAGAC ATGAT TCAGCCAC AGATAC CATT GATATT GCTCCAAAC CACAGA

GTGGGAAC AAAAAG GTAC ATGGC CCCTGAAG TTCT CGATGAT TCCATAAAT AT GAAACAT TT

TGAATCCTTCAAACGTGCTGACATCTATGCAATGGGCTTAGTATTCTGGGAAATTGCTCGAC

GATGTTCCATTGGTGGAATTCATGAAGATTACCAACTGCCTTATTATGATCTTGTACCTTCT

GACCCAT CAG TTGAAGAAATGAGAAAAGTTGTTTGTGAACAGAAGT TAAGGCCAAATAT CCC

AAACAGAT GG CAGAGC TGTGAAG CCTTGAGAG TAAT GGCTAAAAT TAT GAGAGAAT GTTG GT

ATGCCAAT GGAG CAGC TAGGCT TACAGCAT TGCGGAT TAAGAAAACAT TATCG CAACTCAG T

CAACAG GAAG GCATCAAAAT G (SEQ ID NO: 32)

Una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido ALK5 humano extracelular es la siguiente:

GCGGCGCTGCTCCCGGGGGCGACGGCGTTACAGTGTTTCTGCCACCTCTGTACAAAAGACAA

TTTTACTTGTGTGACAGATGGGCTCTGCTTTGTCTCTGTCACAGAGACCACAGACAAAGTTA

TACACAACAG CATGTGTATAGCTGAAAT TGAC TTAATTCCTCGAGATAGGCCGTTTGTATGT

GCACCCTCTTCAAAAACTGGGTCTGTGACTACAACATATTGCTGCAATCAGGACCATTGCAA

TAAAATAGAACTTCCAACTACTGTAAAGTCATCACCTGGCCTTGGTCCTGTGGAACTG

(SEQ ID NO: 33)

Una isoforma alternativa de la secuencia de la proteína precursora de ALK5 humana, la isoforma 2 (NCBI Ref Seq XP_005252207.1), es la siguiente:

1 MEAAVAAPRP RLLLLVLAAA AAAAAALLPG ATALQCFCHL CTKDNFTCVT

DGLCFVSVTE

61 TTDKVIHNSM CIAEIDLIPR DRPFVCAPSS KTGSVTTTYC CNQDHCNKIE

LPTTGPFSVK

121 SSPGLGPVEL AAVIAGPVCF VCISLMLMVY ICHNRTVIHH RVPNEEDPSL

DRPFISEGTT

181 LKDLIYDMTT SGSGSGLPLL VQRTIARTIV LQESIGKGRF GEVWRGKWRG

EEVAVKIFSS

241 REERSWFREA EIYQTVMLRH ENILGFIAAD NKDNGTWTQL WLVSDYHEHG

SLFDYLNRYT

301 VTVEGMIKLA LSTASGLAHL HMEIVGTQGK PAIAHRDLKS KNILVKKNGT

CCIADLGLAV

361 RHDSATDTID IAPNHRVGTK RYMAPEVLDD SINMKHFESF KRADIYAMGL

VFWEIARRCS

421 IGGIHEDYQL PYYDLVPSDP SVEEMRKVVC EQKLRPNIPN RWQSCEALRV

MAKIMRECWY

481 ANGAARLTAL RIKKTLSQLS QQEGIKM (SEQ ID NO: 87)

El péptido señal está indicado mediante subrayado único y el dominio extracelular está indicado en negrita.

La secuencia del polipéptido de ALK5 extracelular procesado (isoforma 2) es la siguiente:

AALLPGATALQCFCHLCTKDNFTCVTDGLCFVSVTETTDKVIHNSMCIAEIDLIPRDRPFVC

APSSKTGSVTTTYCCNQDHCNKIELPTTGPFSVKSSPGLGPVEL (SEQ ID NO: 88)

A continuación se muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína precursora de ALK5 humano (isoforma 2) (SEQ ID NO: 89), correspondiente a los nucleótidos 77-1597 de la secuencia de referencia de Genbank XM_005252150.1. La frecuencia señal está subrayada y el dominio extracelular se indica en negrita.

ATGGAGGCGGCGGTCGCTGCTCCGCGTCCCCGGCTGCTCCTCCTCGTGCTGGCGGCGGCGGC

GGCGGCGGCGGCGGCGCTGCTCCCGGGGGCGACGGCGTTACAGTGTTTCTGCCACCTCTGTA

CAAAAGACAAT T T TAC T TGTGTGACAGATGGGC TC TGCT T TGTC TC TGTCACAGAGACCACA

GACAAAGT TATACACAACAGCATGTGTATAGC TGAAATTGAC T TAAT TCC TCGAGATAGGCC

G^{t t} TGTATGTGCACCC TC T TCAAAAAC TGGGTC TGTGAC TACAACATAT TGC TGCAATCAGG

ACCAT TGCAATAAAATAGAAC TTCCAAC TAC TGGCCC TT T T TCAGTAAAGTCATCACC TGGC

UI'njbTUU'nj'i'übftAU'i'übL.AbL.ibi L.ñiTUUTbrUAUU/ibiTUTbiUTTbblbTbbArb rbñbT

CATGTTGATGGTCTATATCTGCCACAACCGCACTGTCATTCACCATCGAGTGCCAAATGAAG

AGGAC CCTTCAT TAGATCGCCCTTTTATTTCAGAGGGTACTACGTTGAAAGACTTAATTTAT

GATATGACAACGTCAGGTTCTGGCTCAGGTTTACCATTGCTTGTTCAGAGAACAATTGCGAG

AACTATTGTGT TACAAGAAAG CAT TGGCAAAG GTC GATTTG GAGAAG TTTGGAGAG GAAAG T

GGCGGGGAGAAGAAGTTGCTGTTAAGATATTCTCCTCTAGAGAAGAACGTTCGTGGTTCCGT

GAGGCAGAGAT TTATCAAAC TGTAAT GTTAC GTCAT GAAAACAT CCTG GGATTTATAG CAG C

AGACAAT AAAGAC AATG GTACTT GGACTCAG CTCTGGTTGGTGT CAGAT TATCAT GAGCAT G

GATCCCTTTTTGATTACTTAAACAGATACACAGT TAC TGTGGAAGGAATGATAAAAC TTGC T

CTGTCCACGGCGAGCGGTCTTGCCCATCTTCACATGGAGATTGTTGGTACCCAAGGAAAGCC

AGCCATTGCT CATAGAGATT TGAAATCAAAGAATATC TTGGTAAAGAAGAATGGAACT TGC T

GTATTGCAGACT TAGGACT GGCAGTAAGACAT GAT TCAGCCACAGATACCAT TGATAT TGCT

CCAAAC CACAGAG TGGGAACAAAAAG GTACAT GGC CCCTGAAG TTCTC GATGAT TCCATAAA

TATGAAACATTTTGAATCCTTCAAACGTGCTGACATCTATGCAATGGGCTTAGTATTCTGGG

AAATTGCTCGACGATGTTCCATTGGTGGAATTCATGAAGATTACCAACTGCCTTATTATGAT

CTTGTACCTTCTGACCCATCAGTTGAAGAAATGAGAAAAGTTGTTTGTGAACAGAAGTTAAG

GCCAAATAT CC CAAACAGAT GGCAGAG CT GTGAAG CCTTGAGAG TAAT GGCTAAAAT TAT GA

GAGAAT GTTGGTATGC CAAT GGAG CAGCTAG GCTTACAG CAT TGCGGAT TAAGAAAACAT TA

TCGCAAC TCAG TCAACAG GAAGG CATCAAAAT G (SEQ ID NO: 89)

Una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de ALK5 extracelular procesado es la siguiente:

GCGGCGCTGCTCCCGGGGGCGACGGCGTTACAGTGTTTCTGCCACCTCTGTACAAAAGACAA

TTTTACTTGTGTGACAGATGGGCTCTGCTTTGTCTCTGTCACAGAGACCACAGACAAAGTTA

TACACAACAG CATGTGTATAGCTGAAAT TGAC TTAATTCCTCGAGATAGGCCGTTTGTATGT

GCACCCTCTTCAAAAACTGGGTCTGTGACTACAACATATTGCTGCAATCAGGACCATTGCAA

TAAAATAGAACTTCCAACTACTGGCCCTTTTTCAGTAAAGTCATCACCTGGCCTTGGTCCTG

TGGAACTG (SEQ ID NO: 90)

En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a complejos heteromultiméricos de brazo único que comprenden al menos un polipéptido de ALK5, que incluye fragmentos, variantes funcionales y formas modificadas de los mismos. Preferiblemente, los polipéptidos de ALK5 para uso de acuerdo con las invenciones de la divulgación (p.ej., complejos heteromultímeros de brazo único que comprenden un polipéptido de ALK5 y usos del mismo) son solubles (por ejemplo, un dominio extracelular de ALK5). En otras realizaciones preferidas de la invención, los polipéptidos de ALK5 para su uso de acuerdo con las invenciones de la divulgación se unen a y/o inhiben (antagonizan) la actividad (p.ej., inducción de Smad 2/3 y/o señalización de Smad 1/5/8) de uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-beta. En algunas realizaciones, los complejos heteromultímeros de brazo único de la divulgación comprenden al menos un polipéptido de ALK5 que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 30, 31, 87, 88, 128, 130, 419, o 420. En algunas realizaciones, los complejos heteromultímeros de brazo único de la divulgación consiste o consiste esencialmente de al menos un polipéptido de ALK5 que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, 31,87, 88, 128, 130, 419, o 420.

En ciertos aspectos, la presente descripción se refiere a complejos proteínicos que comprenden un polipéptido de ALK6. Como se usa en esta invención, el término "ALK6" se refiere a una familia de proteínas quinasa-6 similares al receptor de activina de cualquier especie y variantes derivadas de tales proteínas ALK6 por mutagénesis u otra modificación. La referencia a ALK6 en esta solicitud se entiende que es una referencia a una cualquiera de las formas identificadas actualmente. Los miembros de la familia de proteínas ALK6 son en general proteínas transmembrana, compuestas por un dominio extracelular de unión a ligando con una región rica en cisteína, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático con actividad serina/treonina quinasa prevista.

El término “polipéptido de ALK6” incluye polipéptidos que comprenden cualquier polipéptido de origen natural de un miembro de la familia ALK6, así como cualquier variante de los mismos (lo que incluye mutantes, fragmentos, fusiones y formas peptidomiméticas), que conserva una actividad útil. La numeración de los aminoácidos para todos lo polipéptidos relacionados con ALK6 descritos en esta solicitud se basa en la numeración de la secuencia de proteína precursora de ALK6 humano proporcionada más adelante (SEQ ID NO:34), a menos que se designe específicamente de otro modo.

La secuencia de la proteína precursora de ALK6 humana canónica (NCBI Ref Seq NP_001194.1) es la siguiente:

1 MLLRSAGKLN VGTKKEDGES TAPTPRPKVL RCKCHHHCPE DSVNNICSTD

GYCFTMIEED

61 DSGLPWTSG CLGLEGSDFQ CRDTPIPHQR RSIECCTERN ECNKDLHPTL

PPLKNRDFVD

121 GPIHHRALLI SVTVCSLLLV LIILFCYFRY KRQETRPRYS IGLEQDETYI

PPGESLRDLI

181 EQSQSSGSGS GLPLLVQRTI AKQIQMVKQI GKGRYGEVWMGKWRGEKVAV

KVFFTTEEAS

241 WFRETEIYQT VLMRHENILG FIAADIKGTG SWTQLYLITD YHENGSLYDY

LKSTTLDAKS

301 MLKLAYSSVS GLCHLHTEIF STQGKPAIAH RDLKSKNILV KKNGTCCIAD

LGLAVKFISD

361 TNEVDIPPNT RVGTKRYMPP EVLDESLNRN HFQSYIMADM YSFGLILWEV

ARRCVSGGIV

421 EEYQLPYHDL VPSDPSYEDM REIVCIKKLR PSFPNRWSSD ECLRQMGKLM

TECWAHNPAS

481 RLTALRVKKT LAKMSESQDI KL (SEQ IDNO: 34)

El péptido señal está indicado mediante subrayado único y el dominio extracelular está indicado en negrita.

La secuencia del polipéptido de ALK6 humano (extracelular) soluble procesado es la siguiente:

KKEDGESTAPTPRPKVLRCKCHHHCPEDSVNNICSTDGYCFTMIEEDDSGLPWTSGCLGLE

GSDFQCRDTPIPHQRRSIECCTERNECNKDLHPTLPPLKNRDFVDGPIHHR (SEQ ID

NO: 35)

A continuación se muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína precursora de ALK6. (SEQ ID NO: 36), correspondiente a los nucleótidos 275-1780 de la secuencia de referencia de Genbank NM_001203.2. La frecuencia señal está subrayada y el dominio extracelular se indica en negrita.

ATGCTTTTGC GAAGTGC AGGAAAAT TAAAT GTGGG CAC CAAGAAAGAGGAT GGTGAGAGTAC

AGCCCCCACCCCCCGTCCAAAGGTCTTGCGTTGTAAATGCCACCACCATTGTCCAGAAGACT

CAGTCAACAATAT T TGCAGCACAGACGGATAT TGT T TCACGATGATAGAAGAGGATGAC TC T

GGGTTGCCTGTGGTCACTTCTGGTTGCCTAGGACTAGAAGGCTCAGATTTTCAGTGTCGGGA

CAC TCCCAT TCC TCATCAAAGAAGATCAAT TGAATGC TGCACAGAAAGGAACGAATGTAATA

AAGACC TACACCC TACAC TGCC TCCAT TGAAAAACAGAGAT T T TGT TGATGGACC TATACAC

CACAGGGCTTTACTTATATCTGTGACTGTCTGTAGTTTGCTCTTGGTCCTTATCATATTATT

TTGTTACTTCCGGTATAAAAGACAAGAAACCAGACC TCGATACAGCAT TGGGT TAGAACAGG

ATGAAACT TACAT TCCTCCTGGAGAATCCC TGAGAGACT TAAT TGAGCAGT CTCAGAGC T CA

GGAAGTGGATCAGGCCTCCCTCTGCTGGTCCAAAGGACTATAGCTAAGCAGATTCAGATGGT

GAAACAGATTGGAAAAGGTCGCTATGGGGAAGTTTGGATGGGAAAGTGGCGTGGCGAAAAGG

TAGC TGTGAAAG TGTTC TTCACCACAGAG GAAGCCAG CTGG TTCAGAGAGACAGAAATATAT

CAGACAG TGT TGATGAG GCATGAAAACAT TTTGGGTTT CAT TGCTGCAGATAT CAAAG GGAC

AGGGTCCTGGACCCAGTTGTACCTAATCACAGACTATCATGAAAATGGTTCCCTTTATGATT

ATCTGAAGTCCACCACCCTAGACGCTAAATCAATGCTGAAGTTAGCCTACTCTTCTGTCAGT

GGCTTATGT CAT TTACACACAGAAAT CTT TAGTAC TCAAGG CAAACCAG CAAT TGCCCAT CG

AGATCTGAAAAGTAAAAACATTCTGGTGAAGAAAAATGGAACTTGCTGTATTGCTGACCTGG

GCCTGGCTGTTAAAT T TATTAGT GATACAAAT GAAGT TGACATACCACC TAACAC TCGAGT T

GGCAC CAAAC GCTATATGCCTC CAGAAG T GTTGGAC GAGAG CTTGAACAGAAAT CACTTC CA

GTCTTACATCATGGCTGACATGTATAGTTTTGGCCTCATCCTTTGGGAGGTTGCTAGGAGAT

GTGTAT CAGGAG GTATAG TGGAAGAATAC CAGCTTCCTTAT CATGAC CTAGTGCC CAGTGAC

CCCTCTTATGAGGACATGAGGGAGATTGTGTGCATCAAGAAGTTACGCCCCTCATTCCCAAA

CCGGTGGAGCAGTGATGAGTGTCTAAGGCAGATGGGAAAACTCATGACAGAATGCTGGGCTC

ACAATCCTGCATCAAGGCTGACAGCCCTGCGGGTTAAGAAAACACTTGCCAAAATGTCAGAG

TCCCAG GACAT TAAAC TC (SEQ ID NO: 36)

Una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de ALK6 extracelular procesado es la siguiente:

AAGAAAGAGGATGGTGAGAGTACAGCCCCCACCCCCCGTCCAAAGGTCTTGCGTTGTAAATG

CCACCAC CAT TGTCCAGAAGACT CAGTCAACAATATT TGCAGCACAGACGGATATTGTTTCA

CGATGATAGAAGAGGATGACTCTGGGTTGCCTGTGGTCACTTCTGGTTGCCTAGGACTAGAA

GGCTCAGATTTTCAGTGTCGGGACACTCCCATTCCTCATCAAAGAAGATCAATTGAATGCTG

CACAGAAAG GAACGAATGTAATAAAGACC TACACCC TACAC TGCCTCCATTGAAAAACAGAG

ATTTTGTTGATGGACCTATACACCACAGG (SEQ ID NO: 37)

Una isoforma alternativa de la secuencia de la proteína precursora de ALK6 humana, la isoforma 2 (NCBI Ref Seq NP_001243722.1) es la siguiente:

1 MGWLEELNWQ LHIFLLILLS MHTRANFLDN MLLRSAGKLN VGTKKEDGES

TAPTPRPKVL

61 RCKCHHHCPE DSVNNICSTD GYCFTMIEED DSGLPWTSG CLGLEGSDFQ

CRDTPIPHQR

121 RSIECCTERN ECNKDLHPTL PPLKNRDFVD GPIHHRALLI SVTVCSLLLV

LIILFCYFRY

181 KRQETRPRYS IGLEQDETYI PPGESLRDLI EQSQSSGSGS GLPLLVQRTI

AKQIQMVKQI

241 GKGRYGEVWM GKWRGEKVAV KVFFTTEEAS WFRETEIYQT VLMRHENILG

FIAADIKGTG

301 SWTQLYLITD YHENGSLYDY LKSTTLDAKS MLKLAYSSVS GLCHLHTEIF

STQGKPAIAH

361 RDLKSKNILV KKNGTCCIAD LGLAVKFISD TNEVDIPPNT RVGTKRYMPP

EVLDESLNRN

421 HFQSYIMADM YSFGLILWEV ARRCVSGGIV EEYQLPYHDL VPSDPSYEDM

REIVCIKKLR

481 PSFPNRWSSD ECLRQMGKLM TECWAHNPAS RLTALRVKKT LAKMSESQDI KL (SEQ

ID NO: 91)

El péptido señal está indicado mediante subrayado único y el dominio extracelular está indicado en negrita.

La secuencia del polipéptido de ALK6 extracelular procesado (isoforma 2) es la siguiente:

NFLDNMLLRSAGKLNVGTKKEDGESTAPTPRPKVLRCKCHHHCPEDSVNNICSTDGYCFTMI

EEDDSGLPWTSGCLGLEGSDFQCRDTPIPHQRRSIECCTERNECNKDLHPTLPPLKNRDFV

DGPIHHR (SEQ ID NO: 92)

A continuación se muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína precursora de ALK6 humana (isoforma 2), correspondiente a los nucleótidos 22-1617 de la secuencia de referencia de Genbank NM_001256793.1. La frecuencia señal está subrayada y el dominio extracelular se indica en negrita.

ATGGGTTGGCTGGAAGAACTAAACTGGCAGCTTCACATTTTCTTGCTCATTCTTCTCTCTAT

GCACACAAGGGCAAACTTCCTTGATAACATGCTTTTGCGAAGTGCAGGAAAATTAAATGTGG

GCACCAAGAAAGAGGATGGTGAGAGTACAGCCCCCACCCCCCGTCCAAAGGTC T TGCGTTGT

AAATGCCACCACCAT TGTCCAGAAGAC TCAGTCAACAATAT TTGCAGCACAGACGGATAT TG

TTTCACGATGATAGAAGAGGATGAC TCTGGGT TGCC TGTGGTCAC TTC TGGTTGCC TAGGAC

TAGAAGGC TCAGAT TTTCAGTGTCGGGACAC TCCCAT TCCTCATCAAAGAAGATCAAT TGAA

TGCTGCACAGAAAGGAACGAATGTAATAAAGACC TACACCC TACACTGCC TCCAT TGAAAAA

CAGAGAT TTTGT TGATGGACC TATACACCACAGGGC TTTAC TTATATC TGTGAC TGTCTG TA

GTTTGCTCTTGGTCCTTATCATATTATTTTGTTACTTCCGGTATAAAAGACAAGAAACCAGA

CCTCGAT ACAG CATTGG GTTAGAAC AGGAT GAAAC TTACAT TCCTCCTG GAGAAT CCCTGAG

AGACTTAATTGAGCAGTCTCAGAGCTCAGGAAGTGGATCAGGCCTCCCTCTGCTGGTCCAAA

GGAC TATAGC TAAGCAGAT TCAGAT GGTGAAACAGAT TGGAAAAG GTCGCTATGGG GAAG TT

TGGATGGGAAAGTGGCGTGGCGAAAAGGTAGCTGTGAAAGTGTTCTTCACCACAGAGGAAGC

CAGCTGGTTCAGAGAGACAGAAATATATCAGACAGT GTTGAT GAGGCATGAAAACATT TT GG

GTTTCAT TGC TGCAGATAT CAAAG GGACAG GGTCC TGGACC CAGTTG TACCTAAT CACAGAC

TATCAT GAAAATGGTTCCCTTTATGATTATCTGAAGT CCACCACCC TAGAC GCTAAATCAAT

GCTGAAGTTAGCCTACTCTTCTGTCAGTGGCTTATGTCATTTACACACAGAAATCTTTAGTA

CTCAAG GCAAAC CAGCAAT TGCC CATCGAGAT CTGAAAAG TAAAAACAT TCTGG TGAAGAAA

AATGGAACTTGCTGTATTGCTGACCTGGGCCTGGCTGTTAAATTTATTAGTGATACAAATGA

AGTTGACATAC CACCTAACAC TC GAGTTG GCACCAAAC GCTATATGCCTC CAGAAG TGTT GG

ACGAGAG CTTGAACAGAAAT CAC TTCCAG TCTTACAT CATG GCTGACAT GTATAG TTTTG GC

CTCAT CCTTTG GGAGGT TGCTAG GAGATG TGTATCAG GAGG TATAGTG GAAGAATAC CAG CT

TCCTTATCATGACCTAGTGCCCAGTGACCCCTCTTATGAGGACATGAGGGAGATTGTGTGCA

TCAAGAAGTTACGCCCCTCATTCCCAAACCGGTGGAGCAGTGATGAGTGTCTAAGGCAGATG

GGAAAACTCATGACAGAATGCTGGGCTCACAATCCTGCATCAAGGCTGACAGCCCTGCGGGT

TAAGAAAACAC TTGCCAAAAT GT CAGAGTCC CAGGACAT TAAAC TC (SEQ ID NO: 93;

La secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de ALK6 humano (extracelular) soluble procesado es la siguiente:

AACTTCCTTGATAACATGCTTTTGCGAAGTGCAGGAAAATTAAATGTGGGCACCAAGAAAGA

GGATGGTGAGAGTACAGCCCCCACCCCCCGTCCAAAGGTCTTGCGTTGTAAATGCCACCACC

ATTGT CCAGAAGACT CAGT CAACAATAT T TGCAGCACAGACGGATATTGTTTCACGAT GATA

GAAGAGGATGACTCTGGGTTGCCTGTGGTCACTTCTGGTTGCCTAGGACTAGAAGGCTCAGA

TTTTCAG TGTC GGGACAC TCCCATTCCTCATCAAAGAAGATCAAT TGAATGC TGCACAGAAA

GGAAC GAATG TAATAAAGACC TACACCC TACAC TGCCTCCATTGAAAAACAGAGAT TTTGT T

GATGGACCTATACACCACAGG (SEQ ID NO: 94)

En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a complejos heteromultiméricos de brazo único que comprenden al menos un polipéptido de ALK6, que incluye fragmentos, variantes funcionales y formas modificadas de los mismos. Preferiblemente, los polipéptidos de ALK6 para uso de acuerdo con las invenciones de la divulgación (p.ej., complejos heteromultímeros de brazo único que comprenden un polipéptido de ALK6 y usos del mismo) son solubles (por ejemplo, un dominio extracelular de ALK6). En otras realizaciones preferidas de la invención, los polipéptidos de ALK6 para su uso de acuerdo con las invenciones de la divulgación se unen a y/o inhiben (antagonizan) la actividad (p.ej., inducción de Smad 2/3 y/o señalización de Smad 1/5/8) de uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-beta. En algunas realizaciones, los complejos heteromultímeros de brazo único de la divulgación comprenden al menos un polipéptido de ALK6 que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 34, 35, 91, 92, 131, 133, 421, o 422. En algunas realizaciones, los complejos heteromultímeros de brazo único de la divulgación consiste o consiste esencialmente de al menos un polipéptido de ALK6 que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, 35, 91,92, 131, 133, 421, o 422.

En ciertos aspectos, la presente descripción se refiere a complejos proteínicos que comprenden un polipéptido de ALK7. Como se usa en esta invención, el término "ALK7" se refiere a una familia de proteínas quinasa-7 similares al receptor de activina de cualquier especie y variantes derivadas de tales proteínas ALK7 por mutagénesis u otra modificación. La referencia a ALK7 en esta solicitud se entiende que es una referencia a una cualquiera de las formas identificadas actualmente. Los miembros de la familia de proteínas ALK7 son en general proteínas transmembrana, compuestas por un dominio extracelular de unión a ligando con una región rica en cisteína, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático con actividad serina/treonina quinasa prevista.

El término “polipéptido de ALK7” incluye polipéptidos que comprenden cualquier polipéptido de origen natural de un miembro de la familia ALK7, así como cualquier variante de los mismos (lo que incluye mutantes, fragmentos, fusiones y formas peptidomiméticas), que conserva una actividad útil. La numeración de los aminoácidos para todos lo polipéptidos relacionados con ALK7 descritos en esta solicitud se basa en la numeración de la secuencia de proteína precursora de ALK7 humano proporcionada más adelante (SEQ ID NO:38), a menos que se designe específicamente de otro modo.

Se han descrito varias isoformas naturales de ALK7 humanas. La secuencia de la proteína precursora de la isoforma 1 humana canónica ALK7 (NCBI Ref Seq NP_660302.2) es la siguiente:

1 MTRALCSALR QALLLLAAAAELSPGLKCVC LLCDSSNFTC QTEGACWASV

MLTNGKEQVI

61 KSCVSLPELN AQVFCHSSNNVTKTECCFTD FCNNITLHLP TASPNAPKLG

PMELAIIITV

121 PVCLLSIAAM LTVWACQGRQ CSYRKKKRPN VEEPLSECNL VNAGKTLKDL

IYDVTASGSG

181 SGLPLLVQRT IARTIVLQEI VGKGRFGEVW HGRWCGEDVAVKIFSSRDER

SWFREAEIYQ

241 TVMLRHENIL GFIAADNKDN GTWTQLWLVS EYHEQGSLYD YLNRNIVTVA

GMIKLALSIA

301 SGLAHLHMEI VGTQGKPAIA HRDIKSKNIL VKKCETCAIA DLGLAVKHDS

ILNTIDIPQN

361 PKVGTKRYMA PEMLDDTMNVNIFESERRAD IYSVGLVYWE IARRCSVGGI

VEEYQLPYYD

421 MVPSDPSIEE MRKVVCDQKF RPSIPNQWQS CEALRVMGRI MRECWYANGA

ARLTALRIKK

481 TISQLCVKED CKA (SEQ IDNO: 38)

El péptido señal está indicado mediante subrayado único y el dominio extracelular está indicado en negrita.

La secuencia polipeptídica extracelular procesada de la isoforma 1 de ALK7 es la siguiente:

ELSPGLKCVCLLCDSSNFTCQTEGACWASVMLTNGKEQVIKSCVSLPELNAQVFCHSSNNVT

KTECCFTDFCNNITLHLPTASPNAPKLGPME (SEQ ID NO: 39)

A continuación se muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína precursora de la isoforma 1 de ALK7 humana. (SEQ ID NO: 40), correspondiente a los nucleótidos 244-1722 de la secuencia de referencia de Genbank NM_145259.2. La frecuencia señal está subrayada y el dominio extracelular se indica en negrita.

ATGACCCGGGCGCTCTGCTCAGCGCTCCGCCAGGCTCTCCTGCTGCTCGCAGCGGCCGCCGA

GCTCTCGCCAGGACTGAAGTGTGTATGTCTTTTGTGTGATTCTTCAAACTTTACCTGCCAAA

CAGAAGGAGCATGT TGGGCATCAGTCATGC TAACCAATGGAAAAGAGCAGGTGATCAAATCC

TGTGTCTCCCTTCCAGAACTGAATGCTCAAGTCTTCTGTCATAGTTCCAACAATGTTACCAA

AACCGAATGCTGC TTCACAGAT T T T TGCAACAACATAACAC TGCACC T TCCAACAGCATCAC

CAAATGCCCCAAAACTTGGACCCATGGAGCTGGCCATCATTATTACTGTGCCTGTTTGCCTC

CTGTCCATAGCTGCGATGCTGACAGTATGGGCATGCCAGGGTCGACAGTGCTCCTACAGGAA

GAAAAAGAGACCAAATGTGGAGGAACCACTCTCTGAGTGCAATCTGGTAAATGCTGGAAAAA

CTCTGAAAGATCTGATTTATGATGTGACCGCCTCTGGATCTGGCTCTGGTCTACCTCTGTTG

GTTCAAAG GACAAT TGCAAG GAC GATTGT GCTTCAG GAAATAG TAGGAAAAG G TAGATTT GG

TGAGGTGTGGCATGGAAGATGGTGTGGGGAAGATGTGGCTGTGAAAATATTCTCCTCCAGAG

ATGAAAGAT CTTGGTTTCGT GAG GCAGAAAT TTAC CAGACG GTCATG CTGCGACAT GAAAAC

ATCCTTGGTTTCATTGCTGCTGACAACAAAGATAATGGAACTTGGACTCAACTTTGGCTGGT

ATCT GAATAT CATGAACAGGGCTCCTTATATGAC TAT TTGAATAGAAATATAGT GACCGT GG

CTGGAATGATCAAGCTGGCGCTCTCAATTGCTAGTGGTCTGGCACACCTTCATATGGAGATT

GTTG GTACACAAG GTAAACCTGCTATTGCTCATCGAGACATAAAAT CAAAGAATAT CTTAGT

GAAAAAGTGTGAAACTTGTGCCATAGCGGACTTAGGGTTGGCTGTGAAGCATGATTCAATAC

TGAACAC TAT CGACATAC CTCAGAAT CCTAAAG TG GGAACCAAGAG GTATATGGCTCCT GAA

ATGCTTGATGATACAAT GAATGT GAATAT CTTTGAGT CCTT CAAACGAGC TGACAT CTAT TC

TGTTGGTCTGGTTTACTGGGAAATAGCCCGGAGGTGTTCAGTCGGAGGAATTGTTGAGGAGT

ACCAAT TGCCTTATTAT GACATGGTGCCTT CAGAT CCCTCGATAGAG GAAATGAGAAAG G TT

GTTTGTGACCAGAAGTTTCGACCAAGTATCCCAAACCAGTGGCAAAGTTGTGAAGCACTCCG

AGTCATGGGGAGAATAATGCGTGAGTGTTGGTATGCCAACGGAGCGGCCCGCCTAACTGCTC

TTCGTATTAAGAAGACTATATCTCAACTTTGTGTCAAAGAAGACTGCAAAGCC (SEQ ID

NO: 40)

Una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido ALK7 extracelular procesado (isoforma 1) es la siguiente:

GAGCTCTCGCCAGGACTGAAGTGTGTATGTCTTTTGTGTGATTCTTCAAACTTTACCTGCCA

AACAGAAGGAGCATGTTGGGCATCAGTCATGCTAACCAATGGAAAAGAGCAGGTGATCAAAT

CCTGTGTCTCCCTTCCAGAACTGAATGCTCAAGTCTTCTGTCATAGTTCCAACAATGTTACC

AAAACCGAAT GCTGCT TCACAGATT TTTGCAACAACATAACAC TGCACCTT CCAACAGCAT C

ACCAAATGCCCCAAAACTTGGACCCATGGAG (SEQ ID NO: 41)

La secuencia de aminoácidos de una isoforma alternativa de ALK7 humana, isoforma 2 (NCBI Ref Seq NP_001 104501.1), se muestra en su forma procesada como sigue (SEQ ID NO: 301), donde el dominio extracelular se indica en negrita.

1 MLTNGKEQVI KSCVSLPELN AQVFCHSSNN VTKTECCFTD FCNNITLHLP TASPNAPKLG

61 PMELAIIITV PVCLLSIAAM LTVWACQGRQ CSYRKKKRPN VEEPLSECNL

VNAGKTLKDL

121 IYDVTASGSG SGLPLLVQRT IARTIVLQEI VGKGRFGEVW HGRWCGEDVA

VKIFSSRDER

181 SWFREAEIYQ TVMLRHENIL GFIAADNKDN GTWTQLWLVS EYHEQGSLYD

YLNRNIVTVA

241 GMIKLALSIA SGLAHLHMEI VGTQGKPAIA HRDIKSKNIL VKKCETCAIA

DLGLAVKHDS

301 ILNTIDIPQN PKVGTKRYMA PEMLDDTMNV NIFESFKRAD IYSVGLVYWE

IARRCSVGGI

361 VEEYQLPYYD MVPSDPSIEE MRKVVCDQKF RPSIPNQWQS CEALRVMGRI

MRECWYANGA

421 ARLTALRIKK TISQLCVKED CKA (SEQ ID NO: 301)

La secuencia de aminoácidos del polipéptido extracelular ALK7 (isoforma 2) es la siguiente:

MLTNGKEQVIKSCVSLPELNAQVFCHSSNNVTKTECCFTDFCNNITLHLPTASPNAPKLGPME (SEQ ID NO: 302). A continuación se muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido ALK7 procesado (isoforma 2) (SEQ ID NO: 303), correspondiente a los nucleótidos 279-1607 de la secuencia de referencia NCBI NM_001111031.1. El dominio extracelular se indica en negrita.

ATGCTAACCAATGGAAAAGAGCAGGTGATCAAATCCTGTGTCTCCCTTCCAGAACTGAATGCTCAAGT

CTTCTGTCATAGTTCCAACAATGTTACCAAAACCGAATGCTGCTTCACAGATTTTTGCAACAACATAA

CACTGCACCTTCCAACAGCATCACCAAATGCCCCAAAACTTGGACCCATGGAGCTGGCCATCATTATT

ACTGTGCCTGTTTGCCTCCTGTCCATAGCTGCGATGCTGACAGTATGGGCATGCCAGGGTCGACAGTG

CTCCTACAGGAAGAAAAAGAGACCAAATGTGGAGGAACCACTCTCTGAGTGCAATCTGGTAAATGCTG

GAAAAACTCTGAAAGATCTGATTTATGATGTGACCGCCTCTGGATCTGGCTCTGGTCTACCTCTGTTG

GTTCAAAGGACAATTGCAAGGACGATTGTGCTTCAGGAAATAGTAGGAAAAGGTAGATTTGGTGAGGT

GTGGCATGGAAGATGGTGTGGGGAAGATGTGGCTGTGAAAATATTCTCCTCCAGAGATGAAAGATCTT

GGTTTCGTGAGGCAGAAATTTACCAGACGGTCATGCTGCGACATGAAAACATCCTTGGTTTCATTGCT

GCTGACAACAAAGATAATGGAACTTGGACTCAACTTTGGCTGGTATCTGAATATCATGAACAGGGCTC

CTTATATGACTATTTGAATAGAAATATAGTGACCGTGGCTGGAATGATCAAGCTGGCGCTCTCAATTG

CTAGTGGTCTGGCACACCTTCATATGGAGATTGTTGGTACACAAGGTAAACCTGCTATTGCTCATCGA

GACATAAAATCAAAGAATATCTTAGTGAAAAAGTGTGAAACTTGTGCCATAGCGGACTTAGGGTTGGC

TGTGAAGCATGATTCAATACTGAACACTATCGACATACCTCAGAATCCTAAAGTGGGAACCAAGAGGT

ATATGGCTCCTGAAATGCTTGATGATACAATGAATGTGAATATCTTTGAGTCCTTCAAACGAGCTGAC

ATCTATTCTGTTGGTCTGGTTTACTGGGAAATAGCCCGGAGGTGTTCAGTCGGAGGAATTGTTGAGGA

GTACCAATTGCCTTATTATGACATGGTGCCTTCAGATCCCTCGATAGAGGAAATGAGAAAGGTTGTTT

GTGACCAGAAGTTTCGACCAAGTATCCCAAACCAGTGGCAAAGTTGTGAAGCACTCCGAGTCATGGGG

AGAATAATGCGTGAGTGTTGGTATGCCAACGGAGCGGCCCGCCTAACTGCTCTTCGTATTAAGAAGAC

TATATCTCAACTTTGTGTCAAAGAAGACTGCAAAGCC (SEQ ID NO: 303)

Una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido ALK7 extracelular (isoforma 2) es la siguiente (SEQ ID NO: 304):

ATGCTAACCAATGGAAAAGAGCAGGTGATCAAATCCTGTGTCTCCCTTCCAGAACTGAATGCTCAAGT

CTTCTGTCATAGTTCCAACAATGTTACCAAAACCGAATGCTGCTTCACAGATTTTTGCAACAACATAA

CACTGCACCTTCCAACAGCATCACCAAATGCCCCAAAACTTGGACCCATGGAG (SEQ ID NO:

304)

La secuencia de aminoácidos de una proteína precursora de ALK7 humana alternativa, la isoforma 3 (NCBI Ref Seq NP_001104502.1), se muestra como sigue (SEQ ID NO: 305), donde el péptido señal se indica mediante un subrayado único.

1 MTRALCSALR QALLLLAAAA ELSPGLKCVC LLCDSSNFTC QTEGACWASV

MLTNGKEQVI

61 KSCVSLPELN AQVFCHSSNN VTKTECCFTD FCNNITLHLP TGLPLLVQRT

IARTIVLQEI

121 VGKGRFGEVW HGRWCGEDVA VKIFSSRDER SWFREAEIYQ TVMLRHENIL

GFIAADNKDN

181 GTWTQLWLVS EYHEQGSLYD YLNRNIVTVA GMIKLALSIA SGLAHLHMEI

VGTQGKPAIA

241 HRDIKSKNIL VKKCETCAIA DLGLAVKHDS ILNTIDIPQN PKVGTKRYMA

PEMLDDTMNV

301 NIFESFKRAD IYSVGLVYWE IARRCSVGGI VEEYQLPYYD MVPSDPSIEE

MRKVVCDQKF

361 RPSIPNQWQS CEALRVMGRI MRECWYANGA ARLTALRIKK TISQLCVKED CKA

(SEQ ID NO: 305)

La secuencia de aminoácidos del polipéptido ALK7 procesado (isoforma 3) es la siguiente (SEQ ID NO: 306). Esta isoforma carece de dominio transmembrana y, por lo tanto, se propone que sea soluble en su totalidad (Roberts y col., 2003, Biol Reprod 68:1719-1726). Las variantes de extremo N de SEQ ID NO: 306 se predicen como se explica a continuación.

1 ELSPGLKCVC LLCDSSNFTC QTEGACWASV MLTNGKEQVI KSCVSLPELN

AQVFCHSSNN

61 VTKTECCFTD FCNNITLHLP TGLPLLVQRT IARTIVLQEI VGKGRFGEVW

HGRWCGEDVA

121 VKIFSSRDER SWFREAEIYQ TVMLRHENIL GFIAADNKDN GTWTQLWLVS

EYHEQGSLYD

181 YLNRNIVTVA GMIKLALSIA SGLAHLHMEI VGTQGKPAIA HRDIKSKNIL

VKKCETCAIA

241 DLGLAVKHDS ILNTIDIPQN PKVGTKRYMA PEMLDDTMNV NIFESFKRAD

IYSVGLVYWE

301 IARRCSVGGI VEEYQLPYYD MVPSDPSIEE MRKVVCDQKF RPSIPNQWQS

CEALRVMGRI

361 MRECWYANGA ARLTALRIKK TISQLCVKED CKA (SEQ ID NO: 306)

A continuación se muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína precursora del polipéptido ALK7 sin procesar (isoforma 3) (SEQ ID NO: 307), correspondiente a los nucleótidos 244-1482 de la secuencia de referencia NCBI NM_001111032.1. La secuencia señal es indicada por saubrayado sólido.

ATGACCCGGGCGCTCTGCTCAGCGCTCCGCCAGGCTCTCCTGCTGCTCGCAGCGGCCGCCGAGCTCTC

GCCAGGACTGAAGTGTGTATGTCTTTTGTGTGATTCTTCAAACTTTACCTGCCAAACAGAAGGAGCAT

GTTGGGCATCAGTCATGCTAACCAATGGAAAAGAGCAGGTGATCAAATCCTGTGTCTCCCTTCCAGAA

CTGAATGCTCAAGTCTTCTGTCATAGTTCCAACAATGTTACCAAAACCGAATGCTGCTTCACAGATTT

TTGCAACAACATAACACTGCACCTTCCAACAGGTCTACCTCTGTTGGTTCAAAGGACAATTGCAAGGA

CGATTGTGCTTCAGGAAATAGTAGGAAAAGGTAGATTTGGTGAGGTGTGGCATGGAAGATGGTGTGGG

GAAGATGTGGCTGTGAAAATATTCTCCTCCAGAGATGAAAGATCTTGGTTTCGTGAGGCAGAAATTTA

CCAGACGGTCATGCTGCGACATGAAAACATCCTTGGTTTCATTGCTGCTGACAACAAAGATAATGGAA

CTTGGACTCAACTTTGGCTGGTATCTGAATATCATGAACAGGGCTCCTTATATGACTATTTGAATAGA

AATATAGTGACCGTGGCTGGAATGATCAAGCTGGCGCTCTCAATTGCTAGTGGTCTGGCACACCTTCA

TATGGAGATTGTTGGTACACAAGGTAAACCTGCTATTGCTCATCGAGACATAAAATCAAAGAATATCT

TAGTGAAAAAGTGTGAAACTTGTGCCATAGCGGACTTAGGGTTGGCTGTGAAGCATGATTCAATACTG

AACACTATCGACATACCTCAGAATCCTAAAGTGGGAACCAAGAGGTATATGGCTCCTGAAATGCTTGA

TGATACAATGAATGTGAATATCTTTGAGTCCTTCAAACGAGCTGACATCTATTCTGTTGGTCTGGTTT

ACTGGGAAATAGCCCGGAGGTGTTCAGTCGGAGGAATTGTTGAGGAGTACCAATTGCCTTATTATGAC

ATGGTGCCTTCAGATCCCTCGATAGAGGAAATGAGAAAGGTTGTTTGTGACCAGAAGTTTCGACCAAG

TATCCCAAACCAGTGGCAAAGTTGTGAAGCACTCCGAGTCATGGGGAGAATAATGCGTGAGTGTTGGT

ATGCCAACGGAGCGGCCCGCCTAACTGCTCTTCGTATTAAGAAGACTATATCTCAACTTTGTGTCAAA

GAAGACTGCAAAGCC (SEQ ID NO: 307)

Una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido ALK7 procesado (isoforma 3) es la siguiente (SEQ ID NO: 308):

GAGCTCTCGCCAGGACTGAAGTGTGTATGTCTTTTGTGTGATTCTTCAAACTTTACCTGCCAAACAGA

AGGAGCATGTTGGGCATCAGTCATGCTAACCAATGGAAAAGAGCAGGTGATCAAATCCTGTGTCTCCC

TTCCAGAACTGAATGCTCAAGTCTTCTGTCATAGTTCCAACAATGTTACCAAAACCGAATGCTGCTTC

ACAGATTTTTGCAACAACATAACACTGCACCTTCCAACAGGTCTACCTCTGTTGGTTCAAAGGACAAT

TGCAAGGACGATTGTGCTTCAGGAAATAGTAGGAAAAGGTAGATTTGGTGAGGTGTGGCATGGAAGAT

GGTGTGGGGAAGATGTGGCTGTGAAAATATTCTCCTCCAGAGATGAAAGATCTTGGTTTCGTGAGGCA

GAAATTTACCAGACGGTCATGCTGCGACATGAAAACATCCTTGGTTTCATTGCTGCTGACAACAAAGA

TAATGGAACTTGGACTCAACTTTGGCTGGTATCTGAATATCATGAACAGGGCTCCTTATATGACTATT

TGAATAGAAATATAGTGACCGTGGCTGGAATGATCAAGCTGGCGCTCTCAATTGCTAGTGGTCTGGCA

CACCTTCATATGGAGATTGTTGGTACACAAGGTAAACCTGCTATTGCTCATCGAGACATAAAATCAAA

GAATATCTTAGTGAAAAAGTGTGAAACTTGTGCCATAGCGGACTTAGGGTTGGCTGTGAAGCATGATT

CAATACTGAACACTATCGACATACCTCAGAATCCTAAAGTGGGAACCAAGAGGTATATGGCTCCTGAA

ATGCTTGATGATACAATGAATGTGAATATCTTTGAGTCCTTCAAACGAGCTGACATCTATTCTGTTGG

TCTGGTTTACTGGGAAATAGCCCGGAGGTGTTCAGTCGGAGGAATTGTTGAGGAGTACCAATTGCCTT

ATTATGACATGGTGCCTTCAGATCCCTCGATAGAGGAAATGAGAAAGGTTGTTTGTGACCAGAAGTTT

CGACCAAGTATCCCAAACCAGTGGCAAAGTTGTGAAGCACTCCGAGTCATGGGGAGAATAATGCGTGA

GTGTTGGTATGCCAACGGAGCGGCCCGCCTAACTGCTCTTCGTATTAAGAAGACTATATCTCAACTTT

GTGTCAAAGAAGACTGCAAAGCC (SEQ ID NO: 308)

La secuencia de aminoácidos de una proteína precursora alternativa de ALK7 humana, la isoforma 4 (NCBI Ref Seq NP_001104503.1), se muestra a continuación (SEQ ID NO: 309), donde el péptido señal es indicado por un subrayado único.

1 MTRALCSALR QALLLLAAAA ELSPGLKCVC LLCDSSNFTC QTEGACWASV

MLTNGKEQVI

61 KSCVSLPELN AQVFCHSSNN VTKTECCFTD FCNNITLHLP TDNGTWTQLW

LVSEYHEQGS

121 LYDYLNRNIV TVAGMIKLAL SIASGLAHLH MEIVGTQGKP AIAHRDIKSK

NILVKKCETC

181 AIADLGLAVK HDSILNTIDI PQNPKVGTKR YMAPEMLDDT MNVNIFESFK

RADIYSVGLV

241 YWEIARRCSV GGIVEEYQLP YYDMVPSDPS IEEMRKVVCD QKFRPSIPNQ

WQSCEALRVM

301 GRIMRECWYA NGAARLTALR IKKTISQLCV KEDCKA (SEQ ID NO: 309)

La secuencia de aminoácidos del polipéptido ALK7 procesado (isoforma 4) es la siguiente (SEQ ID NO: 310). Al igual que la isoforma 3 de ALK7, la isoforma 4 carece de dominio transmembrana y, por lo tanto, se propone que sea soluble en su totalidad (Roberts y col., 2003, Biol Reprod 68:1719-1726). Variantes de extremo N de SEQ ID NO: 310 se predicen como se explica a continuación.

1 ELSPGLKCVC LLCDSSNFTC QTEGACWASV MLTNGKEQVI KSCVSLPELN

AQVFCHSSNN

61 VTKTECCFTD FCNNITLHLP TDNGTWTQLW LVSEYHEQGS LYDYLNRNIV

TVAGMIKLAL

121 SIASGLAHLH MEIVGTQGKP AIAHRDIKSK NILVKKCETC AIADLGLAVK

HDSILNTIDI

181 PQNPKVGTKR YMAPEMLDDT MNVNIFESFK RADIYSVGLV YWEIARRCSV

GGIVEEYQLP

240 YYDMVPSDPS IEEMRKVVCD QKFRPSIPNQ WQSCEALRVM GRIMRECWYA

NGAARLTALR

301 IKKTISQLCV KEDCKA (SEQ ID NO: 310)

A continuación se muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína precursora del polipéptido ALK7 sin procesar (isoforma 4). (SEQ ID NO: 311), correspondiente a los nucleótidos 244-1244 de la secuencia de referencia NCBI NM_001111033.1. La secuencia señal está indicada por subrayado sólido.

ATGACCCGGGCGCTCTGCTCAGCGCTCCGCCAGGCTCTCCTGCTGCTCGCAGCGGCCGCCGAGCTCTC

GCCAGGACTGAAGTGTGTATGTCTTTTGTGTGATTCTTCAAACTTTACCTGCCAAACAGAAGGAGCAT

GTTGGGCATCAGTCATGCTAACCAATGGAAAAGAGCAGGTGATCAAATCCTGTGTCTCCCTTCCAGAA

CTGAATGCTCAAGTCTTCTGTCATAGTTCCAACAATGTTACCAAAACCGAATGCTGCTTCACAGATTT

TTGCAACAACATAACACTGCACCTTCCAACAGATAATGGAACTTGGACTCAACTTTGGCTGGTATCTG

AATATCATGAACAGGGCTCCTTATATGACTATTTGAATAGAAATATAGTGACCGTGGCTGGAATGATC

AAGCTGGCGCTCTCAATTGCTAGTGGTCTGGCACACCTTCATATGGAGATTGTTGGTACACAAGGTAA

ACCTGCTATTGCTCATCGAGACATAAAATCAAAGAATATCTTAGTGAAAAAGTGTGAAACTTGTGCCA

TAGCGGACTTAGGGTTGGCTGTGAAGCATGATTCAATACTGAACACTATCGACATACCTCAGAATCCT

AAAGTGGGAACCAAGAGGTATATGGCTCCTGAAATGCTTGATGATACAATGAATGTGAATATCTTTGA

GTCCTTCAAACGAGCTGACATCTATTCTGTTGGTCTGGTTTACTGGGAAATAGCCCGGAGGTGTTCAG

TCGGAGGAATTGTTGAGGAGTACCAATTGCCTTATTATGACATGGTGCCTTCAGATCCCTCGATAGAG

GAAATGAGAAAGGTTGTTTGTGACCAGAAGTTTCGACCAAGTATCCCAAACCAGTGGCAAAGTTGTGA

AGCACTCCGAGTCATGGGGAGAATAATGCGTGAGTGTTGGTATGCCAACGGAGCGGCCCGCCTAACTG

CTCTTCGTATTAAGAAGACTATATCTCAACTTTGTGTCAAAGAAGACTGCAAAGCCTAA (SEQ

ID NO: 311)

Una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido ALK7 procesado (isoforma 4) es la siguiente (SEQ ID NO: 312):

GAGCTCTCGCCAGGACTGAAGTGTGTATGTCTTTTGTGTGATTCTTCAAACTTTACCTGCCAAACAGA

AGGAGCATGTTGGGCATCAGTCATGCTAACCAATGGAAAAGAGCAGGTGATCAAATCCTGTGTCTCCC

TTCCAGAACTGAATGCTCAAGTCTTCTGTCATAGTTCCAACAATGTTACCAAAACCGAATGCTGCTTC

ACAGATTTTTGCAACAACATAACACTGCACCTTCCAACAGATAATGGAACTTGGACTCAACTTTGGCT

GGTATCTGAATATCATGAACAGGGCTCCTTATATGACTATTTGAATAGAAATATAGTGACCGTGGCTG

GAATGATCAAGCTGGCGCTCTCAATTGCTAGTGGTCTGGCACACCTTCATATGGAGATTGTTGGTACA

CAAGGTAAACCTGCTATTGCTCATCGAGACATAAAATCAAAGAATATCTTAGTGAAAAAGTGTGAAAC

TTGTGCCATAGCGGACTTAGGGTTGGCTGTGAAGCATGATTCAATACTGAACACTATCGACATACCTC

AGAATCCTAAAGTGGGAACCAAGAGGTATATGGCTCCTGAAATGCTTGATGATACAATGAATGTGAAT

ATCTTTGAGTCCTTCAAACGAGCTGACATCTATTCTGTTGGTCTGGTTTACTGGGAAATAGCCCGGAG

GTGTTCAGTCGGAGGAATTGTTGAGGAGTACCAATTGCCTTATTATGACATGGTGCCTTCAGATCCCT

CGATAGAGGAAATGAGAAAGGTTGTTTGTGACCAGAAGTTTCGACCAAGTATCCCAAACCAGTGGCAA

AGTTGTGAAGCACTCCGAGTCATGGGGAGAATAATGCGTGAGTGTTGGTATGCCAACGGAGCGGCCCG

CCTAACTGCTCTTCGTATTAAGAAGACTATATCTCAACTTTGTGTCAAAGAAGACTGCAAAGCCTAA

(SEQ ID NO: 312)

Basado en la secuencia señal de ALK7 de longitud completa (isoforma 1) en la rata (ver Secuencia de referencia NCBI NP_620790.1) y sobre el alto grado de identidad de secuencia entre ALK7 humana y de rata, se predice que una forma procesada de la isoforma 1 de ALK7 humana es la siguiente (SEQ ID NO: 313).

1 LKCVCLLCDS SNFTCQTEGACWASVMLTNG KEQVIKSCVS LPELNAQVFC

HSSNNVTKTE

61 CCFTDFCNNI TLHLPTASPNAPKLGPME (SEQ ID NO: 313)

Se predicen variantes activas de la isoforma 1 de ALK7 procesada en las que SEQ ID NO: 39 está truncada por 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 aminoácidos en el extremo N y SEQ ID NO : 313 está truncada por 1 o 2 aminoácidos en el extremo N. De acuerdo con la SEQ ID NO: 313, se espera además que la leucina sea el aminoácido de extremo N en las formas procesadas de la isoforma 3 de ALK7 humana (SEQ ID NO: 306) y la isoforma 4 de ALK7 humana (SEQ ID NO: 310). En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a complejos heteromultiméricos de brazo único que comprenden al menos un polipéptido de ALK7, que incluye fragmentos, variantes funcionales y formas modificadas de los mismos. Preferiblemente, los polipéptidos de ALK7 para uso de acuerdo con las invenciones de la divulgación (p.ej., complejos heteromultímeros de brazo único que comprenden un polipéptido de ALK7 y usos del mismo) son solubles (por ejemplo, un dominio extracelular de ALK7). En otras realizaciones preferidas de la invención, los polipéptidos de ALK7 para su uso de acuerdo con las invenciones de la divulgación se unen a y/o inhiben (antagonizan) la actividad (p.ej., inducción de Smad 2/3 y/o señalización de Smad 1/5/8) de uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-beta. En algunas realizaciones, los complejos heteromultímeros de brazo único de la divulgación comprenden al menos un polipéptido de ALK7 que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 38, 39, 134, 136, 301,302, 305, 306, 309, 310, 313, 423, o 424. En algunas realizaciones, los complejos heteromultímeros de brazo único de la divulgación consiste o consiste esencialmente de al menos un polipéptido de ALK7 que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, 39, 134, 136, 301,302, 305, 306, 309, 310, 313, 423, o 424.

En algunas realizaciones, la presente divulgación contempla la elaboración de variantes funcionales mediante la modificación de la estructura de un polipéptido receptor de tipo I de la superfamilia de TGF-beta (por ejemplo, ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6 y ALK7) o un polipéptido receptor de tipo II de superfamilia de TGF-beta (p.ej., ActRNA, ActRIIB, TGFBRII, BMPRII y MⁱS^r II) con fines tales como mejorar la eficacia o la estabilidad terapéutica (p.ej., vida útil y resistencia a la degradación proteolítica in vivo). Las variantes se pueden producir mediante sustitución, eliminación o adición de aminoácidos o combinaciones de las mismas. Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo similar de un aminoácido con un aminoácido relacionado estructuralmente (por ejemplo, mutaciones conservativas) no tendrá un efecto importante sobre la actividad biológica de la molécula resultante. Las sustituciones conservadoras son aquellas que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en cuanto a sus cadenas laterales. Si un cambio en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de la divulgación da como resultado un homólogo funcional, se puede determinar fácilmente evaluando la capacidad del polipéptido variante para producir una respuesta en las células de una manera similar al polipéptido de tipo natural, o para unirse a uno o más ligandos de TGF-beta que incluyen, por ejemplo, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-p1, TGF-p2, TGF-p3, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, nodal, GDNF, neurturina, artemina, persefina, MIS y Lefty.

En determinadas realizaciones, la presente divulgación contempla mutaciones específicas de un polipéptido receptor de tipo I de la superfamilia de TGF-beta (p.ej., ALK1, ALK2, ALk3, ALK4, ALK5, AlK6 y ALK7) o un polipéptido receptor de tipo II de la superfamilia de TGF-beta (p.ej., ActRIIA, ActRIIB, TGFBRII, BMPRII y MISRII) de la divulgación para alterar la glicosilación del polipéptido. Tales mutaciones se pueden seleccionar para introducir o eliminar uno o más puntos de glucosilación, tales como puntos de O-glucosilación o N-glucosilación. Los puntos de reconocimiento de la glucosilación en asparagina generalmente comprenden una secuencia tripeptídica, asparagina-X-treonina o asparagina-X-serina (en la que “X” es cualquier aminoácido) que es reconocida específicamente por las enzimas de glucosilación celular apropiadas. La alteración también se puede hacer mediante la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina en la secuencia del polipéptido (para puntos de O-glucosilación). Un abanico de sustituciones o eliminaciones de aminoácidos en una o ambas de la primera o tercera posiciones de aminoácido de un punto de reconocimiento de la glucosilación (y/o eliminación de aminoácidos en la segunda posición) dan como resultado la ausencia de glucosilación en la secuencia tripeptídica modificada. Otro medio para aumentar el número de restos carbohidrato en un polipéptido es mediante acoplamiento químico o enzimático de glucósidos al polipéptido. En función del modo de acoplamiento usado, el uno o más glúcidos se pueden fijar a (a) arginina e histidina; (b) grupos carboxilo libres; (c) grupos sulfhidrilo libres tales como los de cisteína; (d) grupos hidroxilo libres tales como los de serina, treonina o hidroxiprolina; (e) residuos aromáticos tales como los de fenilalanina, tirosina o triptófano; o (f) el grupo amida de la glutamina. La retirada de uno o más restos carbohidrato presentes en un polipéptido se puede lograr química y/o enzimáticamente. La desglucosilación química puede implicar, por ejemplo, la exposición de un polipéptido al compuesto ácido trifluorometanosulfónico o a un compuesto equivalente. Este tratamiento da como resultado la escisión de la mayor parte o la totalidad de los glúcidos a excepción del glúcido enlazador (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina) a la vez que deja la secuencia de aminoácidos intacta. La escisión enzimática de restos carbohidrato en polipéptidos se puede lograr mediante el uso de un abanico de endo- y exoglucosidasas como describen Thotakura y col. [Meth. Enzymol. (1987) 138:350]. La secuencia de un polipéptido se puede ajustar, según proceda, en función del tipo de sistema de expresión usado, ya que las células de mamífero, levadura, insecto o vegetales pueden introducir patrones de glucosilación diferentes que se pueden ver afectados por la secuencia de aminoácidos del péptido. En general, los complejos de brazo único del receptor de tipo I y II de la superfamilia de TGF-beta de la presente divulgación para su uso en humanos pueden expresarse en una línea celular de mamífero que proporciona una glicosilación adecuada, como las líneas celulares HEK293 o CHO, aunque se espera que otras líneas celulares de expresión en mamíferos también sean útiles.

La presente divulgación contempla además un procedimiento para generar mutantes, particularmente conjuntos de mutantes combinatorios de un polipéptido receptor de tipo I de la superfamilia de TGF-beta (p.ej., ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6 y ALK7) o un polipéptidop receptor de tipo II de la superfamilia de TGF-beta (p.ej., ActRIIA, ActRIIB, TGFBRII, BMPRII y MISRII) de la presente divulgación, así como mutantes de truncamiento. Conjuntos de mutantes combinatorios son especialmente útiles para identificar secuencias de receptores de la superfamilia de TGF-beta tipo I o de la superfamilia de TGF-beta tipo II. El fin de cribar tales colecciones combinatorias puede ser el de generar, por ejemplo, variantes de polipéptido que tienen propiedades alteradas, tales como farmacocinética alterada o unión a ligando alterada. A continuación, se proporciona un abanico de ensayos de cribado, y tales ensayos se pueden usar para evaluar variantes. Por ejemplo, las variantes del polipéptido receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta se pueden cribar para determinar su capacidad para unirse a un ligando de la superfamilia de TGF-beta (p. ej., BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-P1, TGF-P2, TGF-P3, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina AE, activina BC, activina BE, nodal, GDNF, neurturina, artemina, persefina, MIS, y Lefty), para impedir la unión de un ligando de la superfamilia de TGF-beta a un receptor de la superfamilia de TGF-beta, y/o para interferir con la señalización causada por un ligando de la superfamilia TGF-beta.

La actividad de un complejo heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación también se puede probar en un ensayo basado en células o in vivo. Por ejemplo, puede evaluarse el efecto de un complejo heteromultímero de brazo único sobre la expresión de genes implicados en la producción de músculo en una célula muscular. Esto se puede realizar, según sea necesario, en presencia de una o más proteínas ligandos de la superfamilia de TGF-beta recombinantes (p. ej., BMP2, BMP2/7, b Mp3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-p1, TGF-p2, TGF-p3, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina AE, activina BC, activina BE, nodal, GDNF, neurturina, artemina, persefina, MIS, y Lefty), y las células se pueden transfectar para producir un complejo de brazo único de receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta y, opcionalmente, un ligando de la superfamilia de TGF-beta. Asimismo, se puede administrar un complejo de heteromultímero de brazo único de la divulgación a un ratón u otro animal, y se pueden evaluar una o más mediciones, como la formación y la fuerza muscular, usando procedimientos reconocidos en la técnica. De manera similar, la actividad de un polipéptido receptor de la superfamilia de TGF-beta o sus variantes puede probarse en osteoblastos, adipocitos, y/o células neuronales para cualquier efecto sobre el crecimiento de estas células, por ejemplo, mediante los ensayos descritos en esta invención y los de conocimiento común en la técnica. Puede usarse un gen informador que responde a SMAD en tales líneas celulares para controlar los efectos sobre la señalización corriente abajo.

Se pueden generar variantes derivadas de la combinación que tienen una selectividad aumentada o una potencia generalmente aumentada en relación con un complejo heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de referencia. Tales variantes, cuando se expresan a partir de construcciones de ADN recombinante, se pueden usar en protocolos de genoterapia. Asimismo, la mutagénesis puede dar lugar a variantes que tienen semividas extracelulares dramáticamente diferentes del correspondiente complejo de heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta no modificado. Por ejemplo, la proteína alterada se puede hacer más estable o menos estable a la degradación proteolítica u otros procedimientos celulares que dan como resultado la destrucción, o inactivación de otro modo, de un polipéptido no modificado. Tales variantes, y los genes que las codifican, se pueden utilizar para alterar los niveles de complejos de polipéptidos mediante modulación de la semivida del polipéptido. Por ejemplo, una semivida corta puede dar lugar a efectos biológicos más transitorios y, cuando forma parte de un sistema de expresión inducible, puede permitir un control más estricto de los niveles del complejo del polipéptido fuera de la célula. En una proteína de fusión Fc, pueden realizarse mutaciones en el enlazador (si existe) y/o la porción Fc para alterar la vida media del complejo heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia TGF-beta.

Se puede producir una biblioteca combinatoria por medio de una biblioteca degenerada de genes que codifican una biblioteca de polipéptidos que incluyen cada uno al menos una porción de secuencias de receptores de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta potencial. Por ejemplo, una mezcla de oligonucleótidos sintéticos se puede ligar enzimáticamente en secuencias de genes de modo que el conjunto degenerado de secuencias de nucleótidos que codifican el receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta potencial se pueda expresar como polipéptidos individuales, o alternativamente, como un conjunto de proteínas de fusión más grande (por ejemplo, para la presentación de fagos).

Hay muchas maneras mediante las que se puede generar la colección de homólogos potenciales a partir de una secuencia de oligonucleótido degenerada. La síntesis química de una secuencia genética degenerada se puede llevar a cabo en un sintetizador de ADN automático, y los genes sintéticos se pueden ligar a continuación en un vector apropiado para la expresión. La síntesis de oligonucleótidos degenerados es muy conocida en la técnica véase, p. ej., Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura y col. (1981) Recombinant DnA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier páginas 273-289; Itakura y col. (1984) Annu. Rev. Biochem.

53:323; Itakura y col. (1984) Science 198:1056; Ike y col. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477. Tales técnicas se han empleado en la evolución dirigida de otras proteínas. Ver, p.ej., Scott y col., (1990) Science 249:386-390; Roberts y col. (1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin y col. (1990) Science 249: 404-406; Cwirla y col., (1990) PNAS USA 87: 6378-6382; as well as U.S. Patent Nos: 5,223,409, 5,198,346, y 5,096,815.

Alternativamente, se pueden utilizar otras formas de mutagénesis para generar una colección combinatoria. Por ejemplo, los complejos de heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación pueden generarse y aislarse de una biblioteca mediante cribado usando, por ejemplo, mutagénesis de exploración de alanina [ver, p.ej., Ruf y col. (1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wang y col. (1994) J. Biol. Chem.

269:3095-3099; Balint y col. (1993) Gene 137:109-118; Grodberg y col. (1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601; Nagashima y col. (1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892; Lowman y col. (1991) Biochemistry 30:10832-10838; and Cunningham y col. (1989) Science 244:1081-1085], por mutagénesis de escaneo de enlazador [véase, p.ej., Gustin y col. (1993) Virology 193:653-660; and Brown y col. (1992) Mol. Cell Biol. 12:2644-2652; McKnight y col. (1982) Science 232:316], por mutagénesis de saturación [véase, p.ej., Meyers y col., (1986) Science 232:613]; by PCR mutagenesis [véase, p.ej., Leung y col. (1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19]; o por mutagénesis aleatoria, incluida la mutagénesis química [véase, p.ej., Miller y col. (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY; y Greener y col. (1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34]. La mutagénesis de escaneo del enlazador, particularmente en un entorno combinatorio, es un procedimiento atractivo para identificar formas truncadas (bioactivas) de polipéptidos del receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta.

Se conoce un abanico de técnicas en la técnica para cribar productos genéticos de colecciones combinatorias fabricadas mediante mutaciones y truncamientos puntuales y, por ende, para cribar genotecas de ADNc para seleccionar productos genéticos que tienen una cierta propiedad. Tales técnicas serán generalmente adaptables para el rastreo rápido de las bibliotecas de genes generadas por la mutagénesis combinatoria de complejos de heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación. Las técnicas usadas más ampliamente para cribar genotecas grandes comprenden típicamente clonar la genoteca en vectores de expresión replicables, transformar células apropiadas con la colección de vectores resultante y expresar los genes combinatorios en condiciones en las que la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento relativamente fácil del vector que codifica el gen cuyo producto se detectó. Los ensayos preferidos incluyen ensayos de unión y/o ensayos de señalización celular para ligandos de la superfamilia de TGF-beta (p. ej., BMP2, BMP2/7, BMP3, B^m P4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-p1, TGF-p2, TGF-p3, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina AE, activina BC, activina BE, nodal, GDNF, neurturina, artemina, persefina, MIS y Lefty).

En determinadas realizaciones, los complejos heteromultímeros de brazo único del receptor de tipo I y tipo II de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación pueden comprender además modificaciones postraduccionales además de cualquiera que esté presente de forma natural en el polipéptido receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, acetilación, carboxilación, glucosilación, fosforilación, lipidación y acilación. Como resultado, el complejo de heteromultímero de brazo único del receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta puede comprender elementos que no son aminoácidos, tales como polietilenglicoles, lípidos, polisacáridos o monosacáridos y fosfatos. Los efectos de dichos elementos que no son aminoácidos sobre la funcionalidad de un complejo de heteromultímero de brazo único pueden ensayarse como se describe en esta invención para otras variantes del complejo de heteromultímero de brazo único. Cuando se produce un polipéptido de la descripción en células escindiendo una forma incipiente del polipéptido, el procesamiento postraduccional también puede ser importante para el plegamiento y/o la función correctos de la proteína. Células diferentes (p.ej., CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 o HEK293) tienen maquinaria celular específica y mecanismos característicos para tales actividades postraduccionales y pueden elegirse para asegurar la modificación y el procesamiento correctos del polipéptido receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta.

En ciertos aspectos, los polipéptidos descritos en esta invención pueden formar complejos de proteínas que comprenden al menos un polipéptido receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta asociado, covalente o no covalentemente, con al menos un polipéptido que comprende un miembro complementario de un par de interacción. Preferiblemente, los polipéptidos descritos en esta invención forman complejos heterodiméricos de brazo único, aunque también se incluyen complejos heteromultiméricos de orden superior (heteromultímeros) tales como, pero sin limitarse a, heterotrímeros, heterotetrámeros y otras estructuras oligoméricas (ver, por ejemplo, la Figura 1). En algunas realizaciones, los polipéptidos receptores de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta de la presente divulgación comprenden al menos un dominio de multimerización. Como se describe en esta invención, el término "dominio de multimerización" se refiere a un aminoácido o secuencia de aminoácidos que promueven la interacción covalente o no covalente entre al menos un primer polipéptido y al menos un segundo polipéptido. Los polipéptidos descritos en esta invención pueden unirse de forma covalente o no covalente a un dominio de multimerización. Preferiblemente, un dominio de multimerización promueve la interacción entre un polipéptido de brazo único (por ejemplo, un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido receptor de tipo I de la superfamilia de TGF-beta o un polipéptido receptor de tipo II de la superfamilia de TGF-beta) y un miembro complementario de un par de interacción para promover la formación de heteromultímero (p. ej., formación de heterodímeros) y opcionalmente obstaculiza o desfavorece de otro modo la formación de homomultímeros (p. ej., formación de homodímeros), aumentando así el rendimiento del heteromultímero deseado (ver, p. ej., Figura 2).

Se pueden usar muchos procedimientos conocidos en la técnica para generar complejos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación. Por ejemplo, los enlaces disulfuro de origen no natural se pueden construir reemplazando en un primer polipéptido (por ejemplo, un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta) un aminoácido de origen natural con un residuo que contiene tiol libre, como la cisteína, de manera que el tiol libre interactúa con otro residuo que contiene tiol libre en un segundo polipéptido (por ejemplo, un miembro complementario de un par de interacción) de manera que se forma un enlace disulfuro entre el primer y segundo polipéptidos. Ejemplos adicionales de interacciones para promover la formación de heteromultímeros incluyen, pero no se limitan a, interacciones iónicas como las descritas en Kjaergaard y col., WO2007147901; efectos de dirección electrostática como los descritos en Kannan y col., US8,592,562; interacciones en espiral como se describe en Christensen y col., US20120302737; cremalleras de leucina como las descritas en Pack & Plueckthun, (1992) Biochemistry 31: 1579-1584; y motivos de hélice-vuelta-hélice como los descritos en Pack y col., (1993) Bio/Technology 11: 1271-1277. El enlace de los diversos segmentos se puede obtener mediante, p.ej, unión covalente tal como por reticulación química, enlazadores peptídicos, puentes disulfuro, etc, o interacciones de afinidad tales como por tecnología de cremallera avidina-biotina o leucina.

En ciertos aspectos, un dominio de multimerización puede comprender un componente de un par de interacción. En algunas realizaciones, los polipéptidos descritos en esta invención pueden formar complejos de proteínas que comprenden un primer polipéptido asociado covalente o no covalentemente con un segundo polipéptido, donde el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de un polipéptido receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta y la secuencia de aminoácidos de un primer miembro de un par de interacción; y el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de un segundo miembro de un par de interacción. El par de interacción puede ser dos secuencias polipeptídicas cualesquiera que interaccionen para formar un complejo, particularmente un complejo heterodimérico, aunque las realizaciones operativas también pueden emplear un par de interacción que puede formar una secuencia homodimérica. Un miembro del par de interacción puede fusionarse con un polipéptido receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta como se describe en esta invención, que incluye, por ejemplo, una secuencia polipeptídica que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % idéntico a la secuencia de cualquiera de SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6, 10, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 51, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 302, 306, 310 y 313. Un par de interacción puede seleccionarse para conferir una propiedad/actividad mejorada como un aumento de la vida media en suero, o para actuar como un adaptador al que se une otro resto para proporcionar una propiedad/actividad mejorada. Por ejemplo, un resto de polietilenglicol puede unirse a uno o ambos componentes de un par de interacción para proporcionar una propiedad/actividad mejorada como una mejor vida media en suero.

El primer y segundo miembros del par de interacción pueden ser un par asimétrico, lo que significa que los miembros del par se asocian preferentemente entre sí en lugar de autoasociarse. Por consiguiente, el primer y segundo miembros de un par de interacción asimétrica pueden asociarse para formar un complejo de par de interacción heterodimérico (ver, por ejemplo, la Figura 2). Alternativamente, el par de interacción puede ser no guiado, lo que significa que los miembros del par pueden asociarse entre sí o autoasociarse sin una preferencia sustancial y, por tanto, pueden tener la misma secuencia de aminoácidos o diferentes. Por consiguiente, los miembros primero y segundo de un par de interacción no guiada pueden asociarse para formar un complejo de par de interacción de homodímero o un complejo de par de acción heterodimérico. Opcionalmente, el primer miembro del par de interacción (por ejemplo, un par asimétrico o un par de interacción no guiada) se asocia covalentemente con el segundo miembro del par de interacción. Opcionalmente, el primer miembro del par de interacción (por ejemplo, un par asimétrico o un par de interacción no guiada) se asocia no covalentemente con el segundo miembro del par de interacción.

Como ejemplos específicos, la presente divulgación proporciona complejos de proteínas de fusión que comprenden al menos un polipéptido receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta fusionado a un polipéptido que comprende un dominio constante de una inmunoglobulina, como CH1, CH2, o dominio CH3 de una inmunoglobulina o un dominio Fc. Los dominios Fc derivados de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas se proporcionan en esta invención. Se conocen otras mutaciones que disminuyen la actividad de CDC o ADCC y, colectivamente, cualquiera de estas variantes se incluyen en la divulgación y se pueden usar como componentes ventajosos de un complejo heteromultimérico de brazo único de la divulgación. Opcionalmente, el dominio Fc de IgG1 de SEQ ID NO: 208 tiene una o más mutaciones en residuos tales como Asp-265, Lys-322 y Asn-434 (numerados de acuerdo con la correspondiente IgG1 de longitud completa). En ciertos casos, el dominio Fc mutante que tiene una o más de esas mutaciones (por ejemplo, mutación Asp-265) tiene una capacidad reducida para unirse a los receptores Fcy con respecto a un dominio Fc de tipo natural. En otros casos, el dominio Fc mutante que tiene una o más de esas mutaciones (por ejemplo, mutación Asn-434) tiene una capacidad aumentada para unirse al receptor Fc relacionado a la clase I de MHC (FcRN) con respecto a un dominio Fc de tipo natural.

A continuación se muestra un ejemplo de una secuencia de aminoácidos nativa que se puede usar para la porción Fc de IgG1 humana (G1Fc) (SEQ ID NO: 208). El subrayado punteado indica la región de la bisagra y el subrayado sólido indica posiciones con variantes naturales. En parte, la divulgación proporciona polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos con 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o identidad del 99 % con SEQ ID NO: 208. Las variantes que ocurren naturalmente en G1Fc incluirían E134D y M136L de acuerdo con el sistema de numeración usado en SEQ ID NO: 208 (ver Uniprot P01857).

1 THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPE

51 VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK

101 VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF

151 YPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV

201 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK (SEQ IDNO: 208)

A continuación se muestra un ejemplo de una secuencia de aminoácidos nativa que se puede usar para la porción Fc de IgG2 humana (G2Fc) (SEQ ID NO: 209). El subrayado punteado indica la región de la bisagra y el subrayado doble indica las posiciones donde hay conflictos de base de datos en la secuencia (de acuerdo con UniProt P01859). En parte, la divulgación proporciona polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos con 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o identidad del 99 % con SEQ ID NO: 209.

1 VECPPCPAPP VAGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVQ

51 FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QFNSTFRWS VLTVVHQDWL NGKEYKCKVS

101 NKGLPAPIEK TISKTKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP

151 SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPMLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS

201 CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK (SEQ ID NO::209)

A continuación se muestran dos ejemplos de secuencias de aminoácidos que pueden usarse para la porción Fc de IgG3 humana (G3Fc). La región de bisagra en G3Fc puede ser hasta cuatro veces más larga que en otras cadenas Fc y contiene tres segmentos idénticos de 15 residuos precedidos por un segmento similar de 17 residuos. La primera secuencia de G3Fc que se muestra a continuación (SEQ ID NO: 210) contiene una región de bisagra corta que consta de un solo segmento de 15 residuos, mientras que la segunda secuencia de G3Fc (SEQ ID NO: 211) contiene una región de bisagra de longitud completa. En cada caso, el subrayado punteado indica la región de la bisagra y el subrayado sólido indica las posiciones con variantes naturales de acuerdo con UniProt P01859. En parte, la divulgación proporciona polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos con 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o identidad del 99 % con SEQ ID NO: 210 y 211.

1 EPKSCDTPPP CPRCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVD

51 VSHEDPEVQF KWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTFRVVSVLTVLHQDWLN

101 GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKTKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL

151 TCLVKGFYPS DIAVEWESSG QPENNYNTTP PMLDSDGSFF LYSKLTVDKS

201 RWQQGNIFSC SVMHEALHNR FTQKSLSLSP GK (SEQ IDNO: 210)

1 ELKTPLGDTT HTCPRCPEPK SCDTPPPCPR CPEPKSCDTP PPCPRCPEPK

51 SCDTPPPCPR CPAPELLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH

101 EDPEVQFKWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNS TFRVVSVLTV LHQDWLNGKE

151 YKCKVSNKAL PAPIEKTISKTKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLTCL

201 VKGFYPSDIAVEWESSGQPE NNYNTTPPML DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ

251 QGNIFSCSVM HEALHNRFTQ KSLSLSPGK (SEQ IDNO: 211)

Las variantes que ocurren naturalmente en G3Fc (por ejemplo, ver Uniprot P01860) incluyen E68Q, P76L, E79Q, Y81F, D97N, N100D, T124A, S169N, S169del, F221Y cuando se convierten al sistema de numeración usado en SEQ ID NO: 210, y la presente divulgación proporciona proteínas de fusión que comprenden dominios G3Fc que contienen una o más de estas variaciones. Además, el gen IgG3 de inmunoglobulina humana (IGHG3) muestra un polimorfismo estructural caracterizado por diferentes longitudes de bisagra [ver Uniprot P01859]. Específicamente, la variante WIS carece de la mayor parte de la región V y de toda la región CH1. Tiene un enlace disulfuro adicional entre cadenas en la posición 7 además del 11 normalmente presente en la región de bisagra. La variante ZUC carece de la mayor parte de la región V, toda la región CH1 y parte de la bisagra. La variante OMM puede representar una forma alélica u otra subclase de cadena gamma. La presente divulgación proporciona proteínas de fusión adicionales que comprenden dominios G3Fc que contienen una o más de estas variantes.

A continuación se muestra un ejemplo de una secuencia de aminoácidos nativa que se puede usar para la porción Fc de IgG4 humana (G4Fc) (SEQ ID NO: 212). El subrayado punteado indica la región de la bisagra. En parte, la divulgación proporciona polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos con 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o identidad del 99 % con SEQ ID NO: 212.

1 ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSQ

51 EDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE

101 YKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL

151 VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ

201 EGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSLGK (SEQ IDNO: 212)

Se presentan en esta invención una variedad de mutaciones diseñadas en el dominio Fc con respecto a la secuencia G1Fc (SEQ ID NO: 208), y mutaciones análogas en G2Fc, G3Fc y G4Fc pueden derivarse de su alineación con G1Fc en la Figura 5. Debido a longitudes de bisagra desiguales, posiciones Fc análogas basadas en la alineación de isotipo (Figura 5) poseen diferentes números de aminoácidos en las SEQ ID NO: 208, 209, 210 y 212. También se puede apreciar que una posición de aminoácido dada en una secuencia de inmunoglobulina que consiste en regiones bisagra, C^h2 y C^h 3 (por ejemplo, SEQ ID NO: 208, 209, 210, 211 o 212) se identificará mediante un número diferente a la misma posición cuando la numeración abarca todo el dominio constante de la cadena pesada de IgG1 (que consta de las regiones C^h 1, bisagra, C^h2 y C^h 3) como en la base de datos Uniprot. Por ejemplo, la correspondencia entre posiciones C^h 3 seleccionadas en una secuencia G1Fc humana (SEQ ID NO: 208), el dominio constante de la cadena pesada de IgG1 humana (Uniprot P01857), y la cadena pesada de IgG1 humana es como sigue.

Correspondencia de posiciones C^h 3 en diferentes sistemas de numeración

G1Fc (la numeración comienza en la Dominio constante de la cadena Cadena pesada de IgG1 (esquema de primera treonina en la región de la pesada de IgG1 (la numeración numeración de la UE de Kabat y col., bisagra) comienza en C^h 1) 1991*)

K187 K292 K409

* Kabat y col. (eds) 1991; pp. 688-696 in Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., Vol. 1, NIH, Bethesda, MD.

Un problema que surge en la producción a gran escala de proteínas asimétricas basadas en inmunoglobulinas a partir de una única línea celular se conoce como "cuestión de asociación de cadena". Como se enfrenta de manera prominente en la producción de anticuerpos biespecíficos, el problema de la asociación de cadenas se refiere al desafío de producir de manera eficiente una proteína de cadena múltiple deseada entre las múltiples combinaciones que resultan inherentemente cuando diferentes cadenas pesadas y/o cadenas ligeras se producen en una sola línea celular [ver, por ejemplo, Klein y col (2012) mAbs 4:653-663]. Este problema es más agudo cuando se producen dos cadenas pesadas diferentes y dos cadenas ligeras diferentes en la misma célula, en cuyo caso hay un total de 16 combinaciones de cadenas posibles (aunque algunas de ellas son idénticas) cuando normalmente solo se desea una. Sin embargo, el mismo principio explica la disminución del rendimiento de una proteína de fusión de múltiples cadenas deseada que incorpora solo dos cadenas pesadas diferentes (asimétricas).

Se conocen varios procedimientos en la técnica que aumentan el apareamiento deseado de cadenas polipeptídicas de fusión que contienen Fc en una única línea celular para producir una proteína de fusión asimétrica preferida con rendimientos aceptables.[ver, por ejemplo, Klein y col (2012) mAbs 4:653-663]. Los procedimientos para obtener el emparejamiento deseado de cadenas que contienen Fc incluyen, pero no se limitan a, emparejamiento basado en carga (dirección electrostática), emparejamiento estérico "protuberancias en orificios", emparejamiento de SEEDbody y emparejamiento basado en cremallera de leucina. Ver, por ejemplo, Ridgway y col (1996) Protein Eng 9:617-621; Merchant y otros (1998) Nat Biotech 16:677-681; Davis y col (2010) Protein Eng Des Sel 23:195-202; Gunasekaran y col (2010); 285:19637-19646; Wranik y otros (2012) J Biol Chem 287:43331-43339; US5932448; WO 1993/011162; WO 2009/089004, y WO 2011/034605.

Por ejemplo, un medio por el cual se puede promover la interacción entre polipéptidos específicos es mediante la ingeniería de regiones complementarias de protuberancia en la cavidad (protuberancias en orificios), como se describe en Arathoon y col., U.S.7,183,076 y Carter y col., U.S.5,731,168. Las "protuberancias" se construyen reemplazando pequeñas cadenas laterales de aminoácidos de la interfaz del primer polipéptido (por ejemplo, un primer par de interacción) con cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). "Cavidades" complementarias de tamaño idéntico o similar a las protuberancias se crean opcionalmente en la interfaz del segundo polipéptido (p.ej., un segundo par de interacción) reemplazando cadenas laterales de aminoácidos grandes por otras más pequeñas (p.ej., alanina o treonina). Cuando exista una protuberancia o cavidad adecuadamente posicionada y dimensionada en la interfaz del primer o segundo polipéptido, sólo es necesario diseñar una cavidad o protuberancia correspondiente, respectivamente, en la interfaz adyacente.

A pH neutro (7,0), el ácido aspártico y el ácido glutámico tienen carga negativa y la lisina, arginina e histidina tienen carga positiva. Estos residuos cargados se pueden usar para promover la formación de heterodímeros y al mismo tiempo impedir la formación de homodímeros. Se producen interacciones atractivas entre cargas opuestas y se producen interacciones repulsivas entre cargas similares. En parte, los complejos de proteínas descritos en esta invención hacen uso de interacciones atractivas para promover la formación de heteromultímeros (por ejemplo, formación de heterodímeros) y, opcionalmente, interacciones repulsivas para dificultar la formación de homodímeros (por ejemplo, formación de homodímeros) al llevar a cabo mutagénesis dirigida al sitio de residuos de interfaz cargados.

Por ejemplo, la interfaz del dominio CH3 de IgG1 comprende cuatro pares de residuos de carga únicos involucrados en interacciones dominio-dominio: Asp356-Lys439 ', Glu357-Lys370', Lys392-Asp399 'y Asp399-Lys409' [la numeración del residuo en la segunda cadena se indica mediante (')]. Cabe señalar que el esquema de numeración utilizado aquí para designar residuos en el dominio CH3 de IgG1 se ajusta al esquema de numeración de la UE de Kabat. Debido a la simetría doble presente en las interacciones del dominio CH3-CH3, cada interacción única se representará dos veces en la estructura (por ejemplo, Asp-399-Lys409 'y Lys409-Asp399'). En la secuencia de tipo natural, K409-D399' favorece tanto la formación de heterodímeros como de homodímeros. Una sola mutación que cambia la polaridad de la carga (p. ej., K409E; carga positiva a negativa) en la primera cadena conduce a interacciones desfavorables para la formación del homodímero de la primera cadena. Las interacciones desfavorables surgen debido a las interacciones repulsivas que ocurren entre las mismas cargas (negativo-negativo; K409E-D399' y D399-K409E'). Una mutación similar que cambia la polaridad de carga (D399K'; negativa a positiva) en la segunda cadena conduce a interacciones desfavorables (K409'-D399K' y D399K-K409') para la formación del homodímero de la segunda cadena. Pero, al mismo tiempo, estas dos mutaciones (K409E y D399K') conducen a interacciones favorables (K409E-D399K' y D399-K409 ') para la formación de heterodímeros.

El efecto de dirección electrostática sobre la formación de heterodímeros y el desaliento de los homodímeros se puede mejorar aún más mediante la mutación de residuos de carga adicionales que pueden estar emparejados o no con un residuo de carga opuesta en la segunda cadena, incluidos, por ejemplo, Arg355 y Lys360. La siguiente tabla enumera posibles mutaciones de cambio de carga que se pueden usar, solas o en combinación, para mejorar la formación de heteromultímeros de los complejos polipeptídicos descritos en esta invención.

En algunas realizaciones, uno o más residuos que forman la interfase CH3-CH3 en una proteína de fusión de la presente solicitud se reemplazan con un aminoácido cargado de manera que la interacción se vuelve electrostáticamente desfavorable. Por ejemplo, un aminoácido cargado positivamente en la interfase (por ejemplo, una lisina, arginina o histidina) se reemplaza con un aminoácido cargado negativamente (por ejemplo, ácido aspártico o ácido glutámico). Alternativamente, o en combinación con la sustitución anterior, un aminoácido con carga negativa en la interfaz se reemplaza por un aminoácido con carga positiva. En determinadas realizaciones, el aminoácido se reemplaza por un aminoácido que no se encuentra de forma natural y que tiene la característica de carga deseada. Cabe señalar que la mutación de residuos cargados negativamente (Asp o Glu) a His conducirá a un aumento en el volumen de la cadena lateral, lo que puede causar problemas estéricos. Además, su forma de donante y aceptor de protones depende del entorno localizado. Estos problemas deben tenerse en cuenta con la estrategia de diseño. Debido a que los residuos de la interfase están altamente conservados en las subclases de IgG de ratón y humano, los efectos de dirección electrostática descritos en esta invención pueden aplicarse a IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 de ratón y humano. Esta estrategia también puede extenderse para modificar residuos no cargados a residuos cargados en la interfaz del dominio CH3.

En parte, la divulgación proporciona el emparejamiento deseado de cadenas polipeptídicas asimétricas que contienen Fc usando secuencias Fc diseñadas para ser complementarias sobre la base del emparejamiento de cargas (dirección electrostática). Una de un par de secuencias Fc con complementariedad electrostática se puede fusionar arbitrariamente con el polipéptido receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta de la construcción, con o sin un enlazador opcional, para generar un polipéptido de fusión del receptor de tipo I o tipo II de una superfamilia de TGF-beta. Esta cadena simple puede coexpresarse en una célula de elección junto con la secuencia Fc complementaria a la primera Fc para favorecer la generación de la construcción multicadena deseada (por ejemplo, un complejo heteromérico de brazo único del receptor de la superfamilia TGF-beta). En este ejemplo basado en dirección electrostática, SEQ ID NO: 200 [G1Fc(E134K/D177K) humano] y SEQ ID NO: 201 [G1Fc(K170D/K187D) humano] son ejemplos de secuencias Fc complementarias en las que las sustituciones de aminoácidos modificadas genéticamente están subrayadas dos veces, y el polipéptido receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta de la construcción puede fusionarse con SEQ ID NO: 200 o SEQ ID NO: 201, pero no ambos. Dado el alto grado de identidad de secuencia de aminoácidos entre hG1Fc nativo, hG2Fc nativo, hG3Fc nativo y hG4Fc nativo, se puede apreciar que las sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes en hG2Fc, hG3Fc o hG4Fc (véase Figura 5) generarán pares Fc complementarios que pueden usarse en lugar del par de hG1Fc complementario a continuación (SEQ ID NO: 200 y 201).

1 THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPE

51 VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCK

101 VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSRKEMTKNQ VSLTCLVKGF

151 YPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVL^SDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV

201 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK (SEQ IDNO: 200)

1 THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPE

51 VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCK

101 VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF

151 YPSDIAVEWE SNGQPENNYD TTPPVLDSDG SFFLYSDLTV DKSRWQQGNV

201 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK (SEQ IDNO: 201)

En parte, la divulgación proporciona el apareamiento deseado de cadenas polipeptídicas asimétricas que contienen Fc usando secuencias Fc diseñadas para la complementariedad estérica. En parte, la divulgación proporciona emparejamiento de protuberancias en orificios como ejemplo de complementariedad estérica. Una de un par de secuencias Fc con complementariedad estérica puede fusionarse arbitrariamente con el polipéptido receptor tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta de la construcción, con o sin un enlazador opcional, para generar un polipéptido de fusión del receptoruna de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta. Esta cadena sencilla se puede coexpresar en una célula de elección junto con la secuencia Fc complementaria a la primera Fc para favorecer la generación de la construcción de cadenas múltiples deseada (por ejemplo, un complejo heteromérico de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta). En este ejemplo basado en apareamiento protuberancias en orificios, SEQ ID NO: 202 [G1Fc(T144Y) humano] y s Eq ID NO: 203 [G1Fc(Y185T) humano] son ejemplos de secuencias Fc complementarias en las que las sustituciones de aminoácidos modificadas genéticamente están subrayadas dos veces, y el polipéptido de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta de la construcción puede fusionarse con la SEQ ID NO: 202 o SEQ ID NO: 203, pero no ambas. Dado el alto grado de identidad de secuencia de aminoácidos entre hG1Fc nativo, hG2Fc nativo, hG3Fc nativo y hG4Fc nativo, se puede apreciar que las sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes en hG2Fc, hG3Fc o hG4Fc (véase Figura 5) generarán pares Fc complementarios que pueden usarse en lugar del par de hG1Fc complementario a continuación (SEQ ID NO: 202 y 203).

1 THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPE

51 VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCK

101 VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLXCLVKGF

151 YPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV

201 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK (SEQ IDNO: 202)

1 THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPE

51 VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK

101 VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF

151 YPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLTSKLTV DKSRWQQGNV

201 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK (SEQ ID NO: 203)

Un ejemplo de complementariedad de Fc basado en el emparejamiento de protuberancias en orificios combinado con un enlace disulfuro diseñado se describe en SEQ ID NO: 204 [hG1Fc(S132C/T144W)] y SEQ ID NO: 205 [hG1Fc(Y127C/T144S/L146A/Y185V)]. Las sustituciones de aminoácidos modificadas genéticamente en estas secuencias están subrayadas doble, y el polipéptido de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta de la construcción puede fusionarse con SEQ ID NO: 204 o SEQ ID NO: 205, pero no con ambos. Dado el alto grado de identidad de secuencia de aminoácidos entre hG1Fc nativo, hG2Fc nativo, hG3Fc nativo y hG4Fc nativo, se puede apreciar que las sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes en hG2Fc, hG3Fc o hG4Fc (véase Figura 5) generarán pares Fc complementarios que pueden usarse en lugar del par de hG1Fc complementario a continuación (SEQ ID NO: 204 y 205).

1 THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPE

51 VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK

101 VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PCREEMTKNQ VSLWCLVKGF

151 YPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV

201 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK (SEQ ID NO: 204)

1 THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPE

51 VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK

101 VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVCTLP PSREEMTKNQ VSLSCAVKGF

151 YPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLVSKLTV DKSRWQQGNV

201 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK (SEQ ID NO: 205)

THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE

VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK

VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PFRPEVHLLP PSREEMTKNQ VSLTCLARGF

YPKDIAVEWE SNGQPENNYK TTPSRQEPSQ GTTTFAVTSK LTVDKSRWQQ

GNVFSCSVMH EALHNHYTQK TISLSPGK (SEQ ID NO: 206)

THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE

VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK

VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PPSEELALNE LVTLTCLVKG

FYPSDIAVEW ESNGQELPRE KYLTWAPVLD SDGSFFLYSI LRVAAEDWKK

GDTFSCSVMH EALHNHYTQK SLDRSPGK (SEQ ID NO: 207)

1 THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPE

51 VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK

101 VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF

151 YPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV

201 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGKGGSAQ LEKELQALEK ENAQLEWELQ

251 ALEKELAQGAT (SEQ ID NO: 213)

1 THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPE

51 VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK

101 VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF

151 YPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV

201 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGKGGSAQ LKKKLQALKK KNAQLKWKLQ

251 ALKKKLAQGAT (SEQ ID NO: 214)

Se entiende que los diferentes elementos de las proteínas de fusión (por ejemplo, proteínas de fusión de inmunoglobulina Fc) pueden disponerse de cualquier manera que sea consistente con la funcionalidad deseada. Por ejemplo, un dominio polipeptídico del receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta puede colocarse en el extremo C de un dominio heterólogo o, alternativamente, un dominio heterólogo puede colocarse en el extremo C de un dominio polipeptídico receptor.de tipo I o tipo II de una superfamilia de TGF-beta. El dominio polipeptídico del receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta y el dominio heterólogo no necesitan ser adyacentes en una proteína de fusión, y pueden incluirse dominios o secuencias de aminoácidos adicionales en el extremo C o N en cualquier dominio o entre los dominios.

Por ejemplo, un polipéptido de fusión del receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta puede comprender una secuencia de aminoácidos como se expone en la fórmula A-B-C. La porción B corresponde a un dominio de polipéptido receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta. Las porciones A y C pueden ser independientemente cero, uno o más de un aminoácido, y las porciones tanto A como C, cuando están presentes, son heterólogas a B. Las porciones A y/o C se pueden fijar a la porción B a través de una secuencia de enlazador. Un enlazador puede ser rico en glicina (por ejemplo, 2-10, 2-5, 2-4, 2-3 residuos de glicina) o residuos de glicina y prolina y puede, por ejemplo, contener una única secuencia de treonina/serina y glicinas o secuencias repetidas de treonina/serina y/o glicinas, por ejemplo, GGG (SEQ ID NO: 58), GGGG (SEQ ID NO: 59), TG⁴ (SEQ ID nO: 60), SG⁴ (SEQ ID NO: 61), TG³ (S^eQ ID NO: 62), o SG³ (SEQ ID NO: 63) singletes o repeticiones. En determinadas realizaciones, un polipéptido de fusión del receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la fórmula ABC, donde A es una secuencia líder (señal), B consiste en un dominio polipeptídico del receptor de tipo I o de tipo II de la superfamilia de TGF-beta, y C es una porción polipeptídica que mejora una o más de la estabilidad in vivo, la vida media in vivo, la captación/administración, la localización o distribución tisular, la formación de complejos proteicos y/o la purificación. En ciertas realizaciones, un polipéptido de fusión del receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la fórmula a Bc , donde A es una secuencia líder de TPA, B consiste en un dominio polipeptídico del receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta y C es un dominio Fc de inmunoglobulina. Los polipéptidos de fusión preferidos comprenden la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de SEQ ID NOs: 101, 103, 104, 106, 107, 109, 110, 112, 113, 115, 116, 118, 119, 121, 122, 124, 125, 127, 128, 130, 131, 133, 134, 136, y 401-424.

En algunas realizaciones, los complejos heteromultímeros de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la presente divulgación comprenden además una o más porciones heterólogas (dominios) para conferir una propiedad deseada. Por ejemplo, algunos dominios de fusión son particularmente útiles para el aislamiento de proteínas de fusión mediante cromatografía de afinidad. Los ejemplos muy conocidos de tales dominios de fusión incluyen, pero no se limitan a, polihistidina, Glu-Glu, glutatión S-transferasa (GST), tiorredoxina, proteína A, proteína G, una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina (Fc), proteína de unión a maltosa (MBP) o albúmina sérica humana. Con fines de purificación por afinidad, se usan matrices relevantes para cromatografía de afinidad, tales como resinas conjugadas a glutatión, amilasa y níquel o cobalto. Muchas de tales matrices están disponibles en forma de “kit”, tal como el sistema de purificación de GST de Pharmacia y el sistema QIAexpress™ (Qiagen) útiles con parejas de fusión (HIS⁶). Como otro ejemplo, se puede seleccionar un dominio de fusión para facilitar la detección de los polipéptidos de trampa de ligando. Los ejemplos de tales dominios de detección incluyen las diversas proteínas fluorescentes (p. ej., GFP), así como “epítopos de identificación”, que normalmente son secuencias peptídicas cortas para las que está disponible un anticuerpo específico. Los epítopos de identificación muy conocidos para los que se dispone fácilmente de anticuerpos monoclonales específicos incluyen epítopos FLAG, hemaglutinina (HA) del virus de la gripe y c-myc. En algunos casos, los dominios de fusión tienen un punto de escisión de proteasas, tal como para el Factor Xa o la trombina, que permite que la proteasa relevante digiera parcialmente las proteínas de fusión y libere de ese modo las proteínas recombinantes de las mismas. Las proteínas liberadas se pueden aislar a continuación del dominio de fusión mediante separación cromatográfica posterior.

En determinadas realizaciones, los polipéptidos del receptor de tipo I y/o tipo II de la superfamilia de TGF-beta de la presente divulgación contienen una o más modificaciones que son capaces de estabilizar los polipéptidos. Por ejemplo, tales modificaciones mejoran la semivida in vitro de los polipéptidos, mejoran la semivida circulatoria de los polipéptidos y/o reducen la degradación proteolítica de los polipéptidos. Tales modificaciones estabilizadoras incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos de fusión (que incluyen, por ejemplo, polipéptidos de fusión que comprenden un dominio polipeptídico receptor tipo I o tipo II de la superfamilia TGF-beta y un dominio estabilizador), modificaciones de un sitio de glicosilación (incluyendo, por ejemplo, adición de un sitio de glicosilación a un polipéptido de la divulgación) y modificaciones de resto de carbohidrato (incluyendo, por ejemplo, la eliminación de restos de carbohidrato de un polipéptido de la divulgación). Como se emplea en esta solicitud, el término “dominio estabilizador” no solo se refiere a un dominio de fusión (p.ej., un dominio Fc de inmunoglobulina) como en el caso de las proteínas de fusión, sino que también incluye modificaciones no proteicas tales como un resto de carbohidrato, o resto no proteico, tal como polietilenglicol.

En realizaciones preferidas de la invención, los complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta que se utilizan de acuerdo con los procedimientos descritos en esta invención son complejos polipeptídicos aislados. Como se usa en esta invención, una proteína (o complejo de proteína) o polipéptido (o complejo de polipéptido) aislado es uno que se ha separado de un componente de su entorno natural. En algunas realizaciones, un complejo de heteromultímero de brazo único de la divulgación se purifica hasta una pureza superior al 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %, según se determina, por ejemplo, mediante electroforesis (p.ej., SDS-PAGE, ifocalización isoeléctrica (IEF), electroforesis capilar) o cromatográfica (p.ej., (por ejemplo, intercambio iónico o HPLC de fase inversa). Los procedimientos para la evaluación de la pureza de los anticuerpos son muy conocidos en la técnica [Ver, p.ej., Flatman y col., (2007) J. Chromatogr. B 848:79-87].

En determinadas realizaciones, los polipéptidos receptores de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta, así como los complejos heteromultiméricos de brazo único de los mismos de la divulgación pueden producirse mediante una variedad de técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, los polipéptidos de la descripción se pueden sintetizar usando técnicas de química proteica estándar, tales como las descritas en Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlín (1993) y Grant G. A. (ed.), Synthetic Peptides: A User's Guide, W. H. Freeman and Company, Nueva York (1992). Además, se comercializan sintetizadores peptídicos automatizados (véase, p. ej., Advanced Chemtech Model 396; Milligen/Biosearch 9600). Alternativamente, los polipéptidos y complejos de la descripción, lo que incluye fragmentos o variantes de los mismos, se pueden producir recombinantemente usando diversos sistemas de expresión [p. ej., E. coli, células de ovario de hámster chino (CHO), células COS, baculovirus], como se sabe bien en la técnica. En una realización adicional, los polipéptidos modificados o no modificados de la descripción se pueden producir mediante digestión de polipéptidos receptores de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta de longitud completa producidos recombinantemente usando, por ejemplo, una proteasa, p, ej., tripsina, termolisina, quimotripsina, pepsina o enzima convertidora de aminoácidos básicos emparejados (PACE). Se puede usar análisis informático (usando un software comercializado, p. ej., MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.) para identificar puntos de escisión proteolítica.

3. Ácidos nucleicos que codifican polipéptidos receptores de la superfamilia de TGFp

En determinadas realizaciones, la presente divulgación proporciona ácidos nucleicos aislados y / o recombinantes que codifican receptores de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGFp (incluidos fragmentos, variantes funcionales y proteínas de fusión de los mismos) descritos en esta invención. Por ejemplo, la SEQ ID NO: 12 codifica el polipéptido precursor de ActRIIA humano de origen natural, mientras que la SEQ ID NO: 13 codifica el dominio extracelular procesado de ActRIIA. Los ácidos nucleicos objetivo pueden ser monocatenarios o bicatenarios. Tales ácidos nucleicos pueden ser moléculas de ADN o ARN. Estos ácidos nucleicos pueden usarse, por ejemplo, en procedimientos para preparar complejos heteromultímeros de brazo único de la superfamilia de TGF-beta de la presente divulgación.

Como se emplea en esta solicitud ácido nucleico aislado se refiere a una molécula de ácido nucleico que ha sido separada de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que normalmente contienen la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente extracromosómicamente o en una ubicación cromosómica que es diferente de su ubicación cromosómica natural.

En determinadas realizaciones, se entiende que los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos receptores de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGFp de la presente divulgación incluyen ácidos nucleicos que son variantes de cualquiera de SEQ ID NO: 7, 8, 12, 13, 16, 17, 20, 21,24, 25, 28, 29, 32, 33, 36, 37, 40, 41, 44, 45, 48, 49, 52, 53, 69, 70, 73, 74, 77, 78, 81, 82, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 102, 105, 108, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 303, 304, 307, 308, 311 y 312. Las variantes de secuencias de nucleótidos incluyen secuencias que difieren en una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de nucleótidos, lo que incluye variantes alélicas, y, por lo tanto, incluirán secuencias codificantes que difieren de la secuencia de nucleótidos designada en una cualquiera de SEQ ID NOs: 7, 8, 12, 13, 16, 17, 20, 21, 24, 25, 28, 29, 32, 33, 36, 37, 40, 41, 44, 45, 48, 49, 52, 53, 69, 70, 73, 74, 77, 78, 81, 82, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 102, 105, 108, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 303, 304, 307, 308, 311, y 312.

En determinadas realizaciones, los polipéptidos receptores de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGFp de la presente divulgación están codificados por secuencias de ácido nucleico aisladas o recombinantes que son al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a SEQ ID NO: 7, 8, 12, 13, 16, 17, 20, 21, 24, 25, 28, 29, 32, 33, 36, 37, 40, 41, 44, 45, 48, 49, 52, 53, 69, 70, 73, 74, 77, 78, 81, 82, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 102, 105, 108, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 303, 304, 307, 308, 311 y 312. Un experto en la materia apreciará que las secuencias de ácidos nucleicos que son al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % idénticas a las secuencias complementarias a las SEQ ID NO: 7, 8, 12, 13, 16, 17, 20, 21, 24, 25, 28, 29, 32, 33, 36, 37, 40, 41, 44, 45, 48, 49, 52, 53, 69, 70, 73, 74, 77, 78, 81, 82, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 102, 105, 108, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 303, 304, 307, 308, 311, y 312 también están dentro del alcance de la presente descripción. En realizaciones adicionales, las secuencias de ácido nucleico de la divulgación pueden aislarse, recombinarse y / o fusionarse con una secuencia de nucleótidos heteróloga o en una biblioteca de ADN.

En otras realizaciones, los ácidos nucleicos de la presente divulgación también incluyen secuencias de nucleótidos que hibridan en condiciones muy astringentes con la secuencia de nucleótidos designada en las SEQ ID NO: 7, 8, 12, 13, 16, 17, 20, 21, 24, 25, 28, 29, 32, 33, 36, 37, 40, 41, 44, 45, 48, 49, 52, 53, 69, 70, 73, 74, 77, 78, 81, 82, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 102, 105, 108, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 303, 304, 307, 308, 311 y 312, la secuencia del complemento de SEQ ID NO: 7, 8, 12, 13, 16, 17, 20, 21, 24, 25, 28, 29, 32, 33, 36, 37, 40, 41, 44, 45, 48, 49, 52, 53, 69, 70, 73, 74, 77, 78, 81, 82, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 102, 105, 108, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 303, 304, 307, 308, 311 y 312, o fragmentos de los mismos. Un experto en la materia entenderá fácilmente que las condiciones de rigurosidad apropiadas que favorecen la hibridación de ADN se pueden variar. Por ejemplo, se podría realizar la hibridación a 6,0 x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C, seguido de un lavado de 2,0 x SSC a 50 °C. Por ejemplo, la concentración salina en la etapa de lavado se puede seleccionar desde una rigurosidad baja de aproximadamente 2,0 x SSC a 50 °C hasta una rigurosidad alta de aproximadamente 0,2 x SSC a 50 °C. Además, la temperatura de la etapa de lavado se puede aumentar de condiciones de rigurosidad baja a temperatura ambiente, aproximadamente 22 °C, a condiciones de rigurosidad alta a aproximadamente 65 °C. Tanto la temperatura como la sal se pueden variar, o la temperatura o la concentración salina se pueden mantener constantes mientras se cambia la otra variable. En una realización, la descripción proporciona ácidos nucleicos que se hibridan en condiciones de astringencia baja de 6 x SSC a temperatura ambiente, seguido de un lavado en 2 x SSC a temperatura ambiente.

Ácidos nucleicos aislados que difieren de los ácidos nucleicos como se establece en SEQ ID NO: 7, 8, 12, 13, 16, 17, 20, 21, 24, 25, 28, 29, 32, 33, 36, 37, 40, 41, 44, 45, 48, 49, 52, 53, 69, 70, 73, 74, 77, 78, 81, 82, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 102, 105, 108, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 303, 304, 307, 308, 311 y 312 debido a la degeneración en el código genético también están dentro del alcance de la divulgación. Por ejemplo, varios aminoácidos se designan mediante más de un triplete. Los codones que especifican el mismo aminoácido, o sinónimos (por ejemplo, CAU y CAC son sinónimos para histidina), pueden dar como resultado mutaciones “imperceptibles” que no afectan a la secuencia de aminoácidos de la proteína. Sin embargo, se espera que los polimorfismos de la secuencia de ADN que conducen a cambios en las secuencias de aminoácidos de las proteínas objetivo existan entre las células de mamíferos. Un experto en la técnica apreciará que estas variaciones en uno o más nucleótidos (hasta aproximadamente 3-5 % de los nucleótidos) de los ácidos nucleicos que codifican una proteína particular pueden existir entre individuos de una especie dada debido a la variación alélica natural. Cualquiera y todas tales variaciones de nucleótidos y los polimorfismos de aminoácidos resultantes se encuentran dentro del alcance de esta descripción.

En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos recombinantes de la presente descripción se pueden enlazar operativamente a una o más secuencias de nucleótidos reguladoras en una construcción de expresión. Las secuencias de nucleótidos reguladoras generalmente serán apropiadas para la célula hospedadora usada para la expresión. Se conocen en la técnica numerosos tipos de vectores de expresión apropiados y secuencias reguladoras adecuadas para un abanico de células hospedadoras. Típicamente, dicha una o más secuencias de nucleótidos reguladoras pueden incluir, pero no se limitan a, secuencias promotoras, secuencias líder o señal, puntos de unión al ribosoma, secuencias de inicio y terminación de la transcripción, secuencias de inicio y terminación de la traducción y secuencias potenciadoras o activadoras. La descripción contempla los promotores constitutivos o inducibles como se conocen en la técnica. Los promotores pueden ser promotores de origen natural o promotores híbridos que combinan elementos de más de un promotor. Una construcción de expresión puede estar presente en una célula en un episoma, tal como un plásmido, o la construcción de expresión se puede insertar en un cromosoma. En algunas realizaciones, el vector de expresión contiene un gen marcador seleccionable para permitir la selección de células hospedadoras transformadas. Los genes marcadores seleccionables son muy conocidos en la técnica y variarán con la célula hospedadora usada.

En ciertos aspectos de la presente divulgación, el ácido nucleico objeto se proporciona en un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGFp y operativamente unido a al menos una secuencia reguladora. Las secuencias reguladoras están reconocidas en la técnica y se seleccionan para dirigir la expresión del polipéptido receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGFp. Por consiguiente, el término secuencia reguladora incluye promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión. Secuencias reguladoras ejemplares se describen en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990). Por ejemplo, cualquiera de una amplia variedad de secuencias de control de expresión que controlan la expresión de una secuencia de ADN cuando se une operativamente a ella puede usarse en estos vectores para expresar secuencias de ADN que codifican un polipéptido receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGFp. Tales secuencias de control de la expresión útiles incluyen, por ejemplo, los promotores temprano y tardío de SV40, el promotor tet el promotor temprano inmediato de adenovirus o citomegalovirus, los promotores de RSV, el sistema lac, el sistema trp el sistema TAC o TRC, el promotor T7 cuya expresión es dirigida por la T7 ARN polimerasa, las principales regiones operadoras y promotoras del fago lambda, las regiones de control para la proteína de la envoltura de fd, el promotor para la 3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glucolíticas, los promotores de la fosfatasa ácida, p. ej., Pho5, los promotores de los factores de apareamiento a de la levaduras, el promotor de poliedros del sistema de baculovirus y otras secuencias que se sabe que controlan la expresión de genes de células procariotas o eucariotas o sus virus y diversas combinaciones de los mismos. Se debe entender que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped que se va a transformar y/o el tipo de proteína que se desea expresar. Asimismo, también se debe considerar el número de copias del vector, la capacidad para controlar ese número de copias y la expresión de cualquier otra proteína codificada por el vector, tal como los marcadores de antibióticos.

Un ácido nucleico recombinante de la presente descripción se puede producir ligando el gen clonado, o una porción del mismo, a un vector adecuado para la expresión en células procariotas, células eucariotas (levadura, ave, insecto o mamífero) o ambas. Los vehículos de expresión para la producción de un polipéptido receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGFp recombinante incluyen plásmidos y otros vectores. Por ejemplo, vectores adecuados incluyen plásmidos de los tipos siguientes: plásmidos derivados de pBR322, plásmidos derivados de pEMBL, plásmidos derivados de pEX, plásmidos derivados de pBTac y plásmidos derivados de pUC para la expresión en células procariotas, tales como E. coli.

Algunos vectores de expresión de mamífero contienen tanto secuencias procariotas para facilitar la propagación del vector en bacterias, como una o más unidades de transcripción eucariotas que se expresan en células eucariotas. Los vectores derivados de pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/cMv, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo y pHyg son ejemplos de vectores de expresión de mamífero adecuados para la transfección de células eucariotas. Algunos de estos vectores se modifican con secuencias de plásmidos bacterianos, tales como pBR322, para facilitar la replicación y la selección por resistencia a fármacos tanto en células procariotas como en eucariotas. Alternativamente, los derivados de virus tales como el virus del papiloma bovino (VPB-1) o el virus de Epstein-Barr (pHEBo, derivado de pREP y p205) se pueden usar para la expresión transitoria de proteínas en células eucariotas. Los ejemplos de otros sistemas de expresión víricos (lo que incluye los retrovíricos) se pueden encontrar más adelante en la descripción de sistemas de administración de genoterapia. Los diversos procedimientos empleados en la preparación de los plásmidos y en la transformación de organismos hospedadores son muy conocidos en la técnica. Para consultar otros sistemas de expresión adecuados tanto para células procariotas como eucariotas, así como procedimientos recombinantes generales, véase, p. ej., Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3a ed., ed. por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). En algunos aspectos, puede ser deseable expresar los polipéptidos recombinantes mediante el uso de un sistema de expresión de baculovirus. Ejemplos de tales sistemas de expresión de baculovirus incluyen vectores derivados de pVL (tales como pVL1392, pVL1393 y pVL941), vectores derivados de pAcUW (como pAcUW1) y vectores derivados de pBlueBac (tal como el pBlueBac III que contiene p-gal).

En una realización preferida de la invención, se diseñará un vector para la producción del polipéptido receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGFp en células CHO, tal como un vector Pcmv-Script (Stratagene, La Jolla, Calif.), vectores pcDNA4 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) y vectores pCI-neo (Promega, Madison, Wisc.). Como resultará evidente, las construcciones genéticas objetivo se pueden usar para provocar la expresión del polipéptido receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGFp objetivo en células propagadas en cultivo, p. ej., para producir proteínas, lo que incluye proteínas de fusión o variantes de proteínas, para purificación.

Esta descripción se refiere también a una célula hospedadora transfectada con un gen recombinante que incluye una secuencia codificante para uno o más de los polipéptidos receptores de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGFp objetivo. La célula hospedadora puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, un polipéptido receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGFp de la descripción se puede expresar en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto (p. ej usando un sistema de expresión de baculovirus), células de levadura o de mamífero [p. ej., una estirpe de células de ovario de hámster chino (CHO)]. Los expertos en la materia conocen otras células hospedadoras adecuadas.

Por consiguiente, la presente descripción se refiere además a procedimientos para producir los polipéptidos receptores de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGFp objetivo. Por ejemplo, una célula hospedadora transfectada con un vector de expresión que codifica un polipéptido receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGFp se puede cultivar en condiciones apropiadas para permitir que se produzca la expresión del polipéptido receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGFp. El polipéptido puede ser secretado y aislado de una mezcla de células y medio que contiene el polipéptido. Alternativamente, el polipéptido receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGFp puede aislarse de una fracción citoplásmica o de membrana obtenida de células recolectadas y lisadas. Un cultivo celular incluye células hospedadoras, medios y otros subproductos. Los medios adecuados para el cultivo celular son bien conocidos en la técnica. Los polipéptidos en cuestión se pueden aislar del medio de cultivo celular, células huésped o ambos, utilizando técnicas conocidas en la técnica para purificar proteínas, que incluyen cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel, ultrafiltración, electroforesis, purificación por inmunoafinidad con anticuerpos específicos para epítopos particulares de los polipéptidos receptores tipo I o tipo II de la superfamilia TGFp. y purificación por afinidad con un agente que se une a un dominio fusionado al polipéptido receptor tipo I o tipo II de la superfamilia TGFp (p.ej., se puede usar una columna de proteína A para purificar un receptor Fc tipo I de la superfamilia TGFp o complejo proteico o polipéptido de fusión receptor de tipo II-Fc). En algunas realizaciones, el polipéptido receptor tipo I o tipo II de la superfamilia de TGFp es un polipéptido de fusión o complejo proteico que contiene un dominio que facilita su purificación.

En algunos aspectos, la purificación se consigue mediante una serie de etapas de cromatografía en columna, que incluyen, por ejemplo, tres o más de las siguientes, en cualquier orden: cromatografía en columna de proteína A, cromatografía en columna de Q sefarosa, cromatografía en columna de fenilsefarosa, cromatografía de exclusión molecular y cromatografía de intercambio catiónico. La purificación se podría completar con filtración vírica e intercambio de tampón. Un polipéptido o complejo proteico de fusión de receptor tipo I-Fc o receptor tipo II-Fc de la superfamilia de TGFp puede purificarse hasta una pureza de > 90 %,> 95 %,> 96 %,> 98 % o> 99 %, según se determine por cromatografía de exclusión por tamaño y > 90 %,> 95 %,> 96 %,> 98 % o> 99 % según lo determinado por SDS PAGE. El nivel objetivo de pureza debe ser uno que sea suficiente para conseguir resultados deseables en sistemas de mamífero, particularmente de primates no humanos, roedores (ratones) y seres humanos.

En otro aspecto, un gen de fusión que codifica una secuencia líder de purificación, tal como una secuencia de un punto de escisión de poli-(His)/enteroquinasa en el extremo N de la porción deseada del polipéptido receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGFp recombinante, puede permitir la purificación de la proteína de fusión expresada mediante cromatografía de afinidad usando una resina metálica de Ni2+. La secuencia líder de purificación a continuación se puede eliminar posteriormente mediante tratamiento con enterocinasa para proporcionar el polipéptido receptor tipo I o tipo II de la superfamilia de TGFp purificado. Véase, p.ej., Hochuli y col. (1987) J. Chromatography 411:177; and Janknecht y col. (1991) PNAS USA 88:8972.

Las técnicas para fabricar genes de fusión son muy conocidas. Esencialmente, la unión de diversos fragmentos de ADN que codifican diferentes secuencias de polipéptidos se realiza según técnicas convencionales, empleando extremos romos o irregulares para la ligadura, digestión con enzimas de restricción para proporcionar extremos apropiados, relleno de extremos cohesivos según proceda, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar uniones no deseables y ligadura enzimática. En otra realización, puede sintetizarse el gen de fusión mediante técnicas convencionales, incluyendo sintetizadores de ADN automatizados. Alternativamente, la amplificación por PCR de fragmentos genéticos se puede llevar a cabo usando cebadores de anclaje que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos genéticos consecutivos que posteriormente se pueden hibridar para generar una secuencia genética quimérica. Véase, p.ej., Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel y col., John Wiley & Sons: 1992.

4. Ensayos de cribado

En ciertos aspectos, la presente divulgación se refiere al uso de complejos heteromultiméricos de brazo único de receptor de tipo I y tipo II de la superfamilia de TGFp para identificar compuestos (agentes) que son agonistas o antagonistas de los receptores de la superfamilia de TGFp. Los compuestos identificados a través de este cribado pueden probarse para evaluar su capacidad para modular tejidos como huesos, cartílagos, músculos, grasas, y/o neuronas, para evaluar su capacidad para modular el crecimiento de tejido in vivo o in vitro. Estos compuestos se pueden ensayar, por ejemplo, en modelos animales.

Existen numerosas estrategias para el cribado de agentes terapéuticos para modular el crecimiento tisular dirigiéndose a la señalización del ligando de la superfamilia TGFp (p.rj., señalización SMAD 2/3 y/o SMAD 1/5/8). En ciertas realizaciones, el cribado de alto rendimiento de compuestos se puede llevar a cabo para identificar agentes que perturban los efectos mediados por receptor de la superfamilia de TGFp sobre una estirpe celular seleccionada. En determinadas realizaciones, el ensayo se lleva a cabo para seleccionar e identificar compuestos que inhiben o reducen específicamente la unión de un complejo heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta a su compañero de unión, como un ligando de la superfamilia de TGFp (por ejemplo, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-p1, TGF-p2, TGF-p3, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina AE, activina BC, activina B^e , nodal, GDNF, neurturina, artemina, persefina, MIS y Lefty). Alternativamente, el ensayo puede usarse para identificar compuestos que mejoran la unión de un complejo heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta a su compañero de unión, tal como un ligando de la superfamilia de TGFp. En una realización adicional, los compuestos pueden identificarse por su capacidad para interactuar con un complejo heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación.

Bastará un abanico de formatos de ensayo y, a la vista de la presente descripción, aquellos no descritos expresamente en esta solicitud serán comprendidos, no obstante, por un experto en la materia. Como se describe en esta solicitud, los compuestos de ensayo (agentes) de la descripción se pueden crear mediante cualquier procedimiento químico combinatorio. Alternativamente, los compuestos objetivo pueden ser biomoléculas de origen natural sintetizadas in vivo o in vitro. Los compuestos (agentes) que se van a ensayar para determinar su capacidad para actuar como moduladores del crecimiento tisular pueden ser producidos, por ejemplo, por bacterias, levaduras, plantas u otros organismos (p. ej., productos naturales), producidos químicamente (p. ej., moléculas pequeñas, lo que incluye peptidomiméticos) o producidos recombinantemente. Los compuestos de ensayo contemplados por la presente invención incluyen moléculas orgánicas no peptidílicas, péptidos, polipéptidos, peptidomiméticos, glúcidos, hormonas y moléculas de ácido nucleico. En ciertos aspectos, el agente de ensayo es una molécula orgánica pequeña que tiene un peso molecular inferior a aproximadamente 2.000 Daltons.

Los compuestos de ensayo de la descripción se pueden proporcionar como entidades únicas y discretas o como colecciones de mayor complejidad, tal como fabricadas mediante química combinatorio. Estas colecciones pueden comprender, por ejemplo, glúcidos, haluros de alquilo, aminas, amidas, ésteres, aldehídos, éteres y otras clases de compuestos orgánicos. La presentación de los compuestos de ensayo al sistema de ensayo puede ser de forma aislada o como mezclas de compuestos, especialmente en las etapas iniciales de cribado. Opcionalmente, los compuestos se pueden derivatizar opcionalmente con otros compuestos y tienen grupos de derivatización que facilitan el aislamiento de los compuestos. Ejemplos no limitativos de grupos de derivatización incluyen biotina, fluoresceína, digoxigenina, proteína fluorescente verde, isótopos, polihistidina, microesferas magnéticas, glutatión S transferasa (GST), agentes de reticulación fotoactivable o cualquier combinación de los mismos.

En muchos programas de cribado de fármacos con colecciones de compuestos y extractos naturales de ensayo, son deseables ensayos de alto rendimiento con el fin de maximizar el número de compuestos estudiados en un periodo de tiempo determinado. Los ensayos que se realizan en sistemas exentos de células, tales como los que se pueden derivar con proteínas purificadas o semipurificadas, a menudo se prefieren como cribados "principales", ya que se pueden generar para permitir el desarrollo rápido y la detección relativamente fácil de una alteración en una diana molecular que está mediada por un compuesto de ensayo. Además, los efectos de la toxicidad celular o la biodisponibilidad del compuesto de prueba generalmente pueden ignorarse en el sistema in vitro, centrándose el ensayo principalmente en el efecto del fármaco sobre la diana molecular, como puede manifestarse en una alteración de la afinidad de unión entre un complejo heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta y su socio de unión (p.ej., BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-p1, TGF-p2, TGF-p3, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina AE, activina BC, activina BE, nodal, GDNF, neurturina, artemina, persefina, MIS y Lefty).

Simplemente para ilustrar, en un ensayo de selección ejemplar de la presente divulgación, el compuesto de interés se pone en contacto con un complejo heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta aislado y purificado que normalmente es capaz de unirse a un ligando de la superfamilia de TGF-beta, como apropiado para la intención del ensayo. A la mezcla del compuesto y el complejo heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta se añade el ligando de la superfamilia de TGF-beta apropiado (por ejemplo, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-P1, TGF-p2, TGF-p3, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina AE, activina BC, activina b E, nodal, GDNF, neurturina, artemina, persefina, MIS y Lefty). La detección y cuantificación de complejos entre heteromultímeros de brazo único y ligandos de superfamilia proporciona un medio para determinar la eficacia del compuesto para inhibir (o potenciar) la formación de complejos entre el complejo de heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia TGF-beta y su proteína de unión. La eficacia del compuesto se puede evaluar generando curvas de dosis-respuesta a partir de datos obtenidos usando diversas concentraciones del compuesto de ensayo. Asimismo, también se puede realizar un ensayo de control para proporcionar un valor de referencia para la comparación. Por ejemplo, en un ensayo de control, se añade ligando de la superfamilia de TGF-beta aislado y purificado a una composición que contiene el complejo heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, y se cuantifica la formación del complejo heteromultímero-ligando en ausencia del compuesto de prueba. Se entenderá que, en general, el orden en el que se pueden mezclar los reactivos se puede variar, y se pueden mezclar simultáneamente. Asimismo, en lugar de proteínas purificadas, se pueden usar extractos y lisados celulares para conseguir un sistema de ensayo exento de células adecuado.

La unión de un complejo heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta a otra proteína puede detectarse mediante una variedad de técnicas. Por ejemplo, la modulación de la formación de complejos se puede cuantificar utilizando, por ejemplo, proteínas marcadas de forma detectable como las marcadas radiactivamente (p.ej., 32P, 35S, 14C o 3H), marcadas fluorescentemente (p.ej., FITC), o complejo heteromultimérico de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta marcado enzimáticamente y su proteína de unión mediante inmunoensayo o detección cromatográfica.

En determinadas realizaciones, la presente divulgación contempla el uso de ensayos de polarización de fluorescencia y ensayos de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) para medir, directa o indirectamente, el grado de interacción entre un complejo heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia TGF-beta y su proteína de unión. Además, otros modos de detección, tales como los basados en guías de ondas ópticas (véase, p.ej., Publicación PCT WO 96/26432 y Pat. EE.UU. No. 5,677,196), resonancia de plasmón de superficie (SPR), sensores de carga de superficie y sensores de fuerza de superficie son compatibles con muchas realizaciones de la divulgación.

Además, la presente divulgación contempla el uso de un ensayo de trampa de interacción, también conocido como ensayo de dos híbridos, para identificar agentes que interrumpen o potencian la interacción entre un complejo heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia TGF-beta y su compañero de unión. Véase, p.ej., U.S. Pat. No. 5,283,317; Zervos y col. (1993) Cell 72:223-232; Madura y col. (1993) J Biol Chem 268:12046-12054; Bartel y col. (1993) Biotechniques 14:920-924; y Iwabuchi y col. (1993) Oncogene 8:1693-1696). En una realización específica, la presente divulgación contempla el uso de sistemas de dos híbridos inversos para identificar compuestos (p.ej., moléculas pequeñas o péptidos) que disocian interacciones entre un complejo heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta y su proteína de unión [véase, p.ej., Vidal and Legrain, (1999) Nucleic Acids Res 27:919-29; Vidal and Legrain, (1999) Trends Biotechnol 17:374-81; y Pat. EE. UU. Nos. 5,525,490; 5,955,280; y 5,965,368].

En determinadas realizaciones, los compuestos objeto se identifican por su capacidad para interactuar con un complejo heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación. La interacción entre el compuesto y el complejo heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta puede ser covalente o no covalente. Por ejemplo, tal interacción se puede identificar a nivel proteico usando procedimientos bioquímicos in vitro que incluyen fotorreticulación, unión a ligando radiomarcado y cromatografía de afinidad. Véase, p.ej., Jakoby WB y col. (1974) Methods in Enzymology 46:1. En ciertos casos, los compuestos pueden cribarse en un ensayo basado en mecanismos, tal como un ensayo para detectar compuestos que se unen a un complejo heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta. Esto puede incluir un acontecimiento de unión en fase sólida o en fase fluida. Alternativamente, el gen que codifica un complejo de heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta se puede transfectar con un sistema indicador (p.ej., pgalactosidasa, luciferasa o proteína verde fluorescente) en una célula y cribado contra la biblioteca preferiblemente por alto rendimiento. proyección o con miembros individuales de la biblioteca. Se pueden usar ensayos de unión a base de otros mecanismos, por ejemplo, ensayos de unión que detectan cambios en la energía libre. Los ensayos de unión se pueden realizar con la diana fijada a un pocillo, una perla o un chip o capturada por un anticuerpo inmovilizado o resuelta mediante electroforesis capilar. Los compuestos unidos se pueden detectar normalmente usando criterios de valoración colorimétricos, fluorescencia, o resonancia de plasmones superficiales.

5. Usos terapéuticos ejemplares

En determinadas realizaciones, un complejo de heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, o combinaciones de complejos de heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, de la presente divulgación pueden usarse para tratar o prevenir una enfermedad o afección actividad de un receptor de la superfamilia TGFp (p.ej., ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6, ALK7, ActRIIA, ActRIIB, BMPRII, TGFBRII, y MISRII) y/o un ligando de la superfamilia de TGFp (p.ej, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-p1, TGF-p2, TGF-p3, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina AE, activina BC, activina BE, nodal, GDNF, neurturina, artemina, persefina, MIS, y Lefty). Estas enfermedades, trastornos o afecciones se denominan generalmente en esta invención "afecciones asociadas a la superfamilioa de TGFp". En determinadas realizaciones, la presente invención proporciona procedimientos para tratar o prevenir a un individuo que lo necesite mediante la administración al individuo de una cantidad terapéuticamente eficaz de un complejo heteromultimérico de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, o combinaciones de complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta como se describe en esta invención. Los términos "sujeto", "individuo" o "paciente" son intercambiables en toda la especificación. Cualquiera de los complejos heteromultímeros de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la presente divulgación se puede emplear potencialmente individualmente o en combinación para los usos terapéuticos descritos en esta invención. Estos procedimientos se pueden usar para tratamientos terapéuticos y profilácticos de mamíferos y, en particular, seres humanos.

Como se usa en esta solicitud, un agente terapéutico que "previene" un trastorno o afección se refiere a un compuesto que, en una muestra estadística, reduce la aparición del trastorno o afección en la muestra tratada con respecto a una muestra de control no tratada, o retrasa la aparición o reduce la gravedad de uno o más síntomas del trastorno o afección con respecto a la muestra de control no tratada. El término “tratar”, como se empela en esta solicitud, incluye la mejora o eliminación de la afección una vez que se ha consolidado. En cualquier caso, la prevención o el tratamiento se pueden discernir del diagnóstico proporcionado por un médico u otro profesional sanitario y del resultado previsto de la administración del agente terapéutico.

Los complejos receptor-ligando de la superfamilia de TGFp nativos desempeñan un papel esencial en el crecimiento de los tejidos, así como en los procedimientos de desarrollo temprano, como la formación correcta de varias estructuras o en una o más capacidades de posdesarrollo, incluyendo desarrollo sexual, producción de hormonas pituitarias y creación de huesos y cartílagos. Por tanto, las afecciones / trastornos asociados a la superfamilia de TGFp incluyen el crecimiento de tejido anormal y defectos del desarrollo. Además, las afecciones asociadas a la superfamilia de TGFp incluyen, pero no se limitan a, trastornos del crecimiento y diferenciación celular tales como inflamación, alergia, enfermedades autoinmunes, enfermedades infecciosas y tumores.

Las afecciones ejemplares asociadas a la superfamilia de TGFp incluyen trastornos neuromusculares (p.el., distrofia muscular y atrofia muscular), enfermedad pulmonar obstructiva congestiva (y desgaste muscular asociado con EPOC), síndrome de desgaste muscular, sarcopenia, caquexia, trastornos del tejido adiposo (p.rj., obesidad), diabetes tipo 2 (NIDDM, diabetes de inicio en la edad adulta) y enfermedad degenerativa ósea (p.ej., osteoporosis). Otras afecciones asociadas a la superfamilia de TGFp ejemplares incluyen trastornos musculodegenerativos y neuromusculares, reparación de tejidos (p.ej., cicatrización de heridas), enfermedades neurodegenerativas (p.ej., esclerosis lateral amiotrófica) y trastornos inmunológicos (p.ej., trastornos relacionados con la proliferación o función anormal de los linfocitos).

En determinadas realizaciones, un complejo heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, o combinaciones de complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, de la divulgación se utilizan como parte de un tratamiento para una distrofia muscular. El término "distrofia muscular" se refiere a un grupo de enfermedades musculares degenerativas caracterizadas por debilitamiento gradual y deterioro de los músculos esqueléticos y, algunas veces, del corazón y los músculos respiratorios. Las distrofias musculares son trastornos genéticos caracterizados por un desgaste muscular progresivo y debilidad que comienzan con cambios microscópicos en el músculo. A medida que los músculos se degeneran con el tiempo, la fuerza muscular de la persona disminuye. Distrofias musculares ejemplares que se pueden tratar con un régimen que incluye los complejos heteromultímeros de brazo único del receptor de la superfamilia TGF-beta en cuestión incluyen: distrofia muscular de Duchenne (DMD), distrofia muscular de Becker (BMD), distrofia muscular de Emery-Dreifuss (EDMD), distrofia muscular extremidad-cintura (LGMD), distrofia muscular facioescapulohumeral (FSH o FSHD) (también conocida como Landouzy-Dejerine), distrofia miotónica (MMD; también conocida como enfermedad de Steinert), distrofia muscular oculofaríngea (OPMD), distrofia muscular distal (DD), distrofia muscular congénita (DMC).

La distrofia muscular de Duchenne (DMD) fue descrita por primera vez por el neurólogo francés Guillaume Benjamin Amand Duchenne en la década de 1860. La distrofia muscular de Becker (BMD) lleva el nombre del médico alemán Peter Emil Becker, quien describió por primera vez esta variante de la DMD en la década de 1950. La DMD es una de las enfermedades hereditarias más frecuentes en los hombres, afectando a uno de cada 3.500 niños. La DMD ocurre cuando el gen de la distrofina, ubicado en el brazo corto del cromosoma X, es deficiente. Dado que los hombres solo tienen una copia del cromosoma X, solo tienen una copia del gen de la distrofina. Sin la proteína distrofina, el músculo se daña fácilmente durante los ciclos de contracción y relajación. Mientras que al principio de la enfermedad, el músculo se compensa mediante la regeneración, más adelante las células progenitoras del músculo no pueden seguir el ritmo del daño continuo y el músculo sano es remplazado por tejido fibro-graso no funcional.

La BMD resulta de diferentes mutaciones en el gen de la distrofina. Los pacientes con D tienen algo de distrofina, pero es insuficiente en cantidad o de mala calidad. Tener algo de distrofina protege los músculos de las personas con BMD de degenerar tan mal o tan rápidamente como los de las personas con DMD.

Estudios en animales indican que la inhibición de la vía de señalización de GDF8 puede tratar eficazmente varios aspectos de la enfermedad en pacientes con DMD y BMD (Bogdanovich y col., 2002, Nature 420:418-421; Pistilli y col., 2011, Am J Pathol 178:1287-1297). Por lo tanto, los complejos heteromultímeros de brazo único del receptor de la superfamilia TGF-beta de la divulgación pueden actuar como inhibidores de GDF8 (antagonistas) y constituir un medio alternativo para bloquear la señalización de GDF8. y/o ligandos de la superfamilia de TGFp relacionados in vivo en pacientes con DMD y BMD.

De manera similar, los complejos heteromultímeros de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación pueden proporcionar un medio eficaz para aumentar la masa muscular en otras enfermedades que necesitan crecimiento muscular. Por ejemplo, la esclerosis lateral amiotrófica (ALS), también llamada enfermedad de Lou Gehrig o enfermedad de las neuronas motoras, es un trastorno del SNC crónico, progresivo e incurable que ataca a las neuronas motoras, que son componentes del sistema nervioso central necesarios para el inicio de la contracción del músculo esquelético. En la ALS, las neuronas motoras se deterioran y finalmente mueren, y aunque el cerebro de una persona normalmente permanece en pleno funcionamiento y alerta, la orden de moverse nunca llega a los músculos. Las personas que desarrollan ALS tienen típicamente entre 40 y 70 años, y las primeras neuronas motoras en degenerar son las que inervan los brazos o las piernas. Las personas con ALS pueden tener problemas para caminar, pueden dejar caer cosas, caerse, arrastrar las palabras y reír o llorar incontrolablemente. Finalmente, los músculos de las extremidades comienzan a atrofiarse por falta de uso. La debilidad muscular se vuelve debilitante y los pacientes eventualmente requieren una silla de ruedas o quedan confinados a la cama. La mayoría de los pacientes con ALS mueren por insuficiencia respiratoria o por complicaciones de la asistencia del ventilador, como neumonía, entre 3 y 5 años desde el inicio de la enfermedad.

La promoción de un aumento de la masa muscular mediante complejos heteromultímeros de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta también podría beneficiar a quienes padecen enfermedades de desgaste muscular. Gonzalez-Cadavid y col. (supra) informaron que la expresión de GDF8 se correlaciona inversamente con la masa libre de grasa en seres humanos y que la expresión aumentada del gen GDF8 está asociada con la pérdida de peso en hombres con síndrome de desgaste por SIDA. Al inhibir la función de GDF8 en pacientes con SIDA, al menos ciertos síntomas de SIDA se pueden aliviar, si no eliminar por completo, mejorando así significativamente la calidad de vida en pacientes con SIDA.

Dado que la pérdida de la función de GDF8 también se asocia con la pérdida de grasa sin disminución de la ingesta de nutrientes (Zimmers y col., Supra; McPherron y Lee, supra), los complejos de heteromultímeros de brazo único del receptor de la superfamilia TGF-beta en cuestión pueden usarse además como un agente terapéutico para retardar o impedir el desarrollo de obesidad y diabetes tipo 2.

El síndrome de anorexia-caquexia por cáncer se encuentra entre los aspectos más debilitantes y potencialmente mortales del cáncer. Este síndrome es una característica común de muchos tipos de cáncer, presente en aproximadamente el 80 % de los pacientes con cáncer al morir, y es responsable no solo de una mala calidad de vida y una mala respuesta a la quimioterapia, sino también de un tiempo de supervivencia más corto que el que se encuentra en los pacientes. con tumores comparables pero sin pérdida de peso. Se debe sospechar caquexia en pacientes con cáncer si ocurre una pérdida de peso involuntaria de más del cinco por ciento del peso premórbido dentro de un período de seis meses. Asociada con la anorexia, la pérdida de tejido graso y muscular y el malestar psicológico, la caquexia surge de una interacción compleja entre el cáncer y el huésped. La caquexia por cáncer afecta la producción de citocinas, la liberación de factores movilizadores de lípidos y factores inductores de proteólisis y alteraciones en el metabolismo intermedio. Aunque la anorexia es común, una disminución de la ingesta de alimentos por sí sola no puede explicar los cambios en la composición corporal observados en los pacientes con cáncer, y el aumento de la ingesta de nutrientes no puede revertir el síndrome de desgaste. Actualmente, no existe un tratamiento para controlar o revertir el procedimiento. Dado que se encontró que la sobreexpresión sistémica de GDF8 en ratones adultos induce una pérdida profunda de músculo y grasa análoga a la observada en los síndromes de caquexia humana (Zimmers y col., Supra), las composiciones farmacéuticas del complejo de heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia TGF-beta en cuestión pueden ser utilizados de forma beneficiosa para prevenir, tratar o aliviar los síntomas del síndrome de caquexia, donde se desea el crecimiento muscular.

En determinadas realizaciones, un complejo de heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, o combinaciones de complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, de la presente divulgación pueden usarse en procedimientos de inducción ósea y/o formación de cartílago, prevención de la pérdida ósea, aumento de la mineralización ósea, prevención de la desmineralización del hueso, y/o aumentando la densidad ósea. Los complejos heteromultímeros de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta pueden ser útiles en pacientes a los que se les diagnostica baja densidad ósea subclínica, como medida protectora contra el desarrollo de osteoporosis.

En algunas realizaciones, un complejo de heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, o combinaciones de complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, de la presente divulgación pueden encontrar utilidad médica en la curación de fracturas óseas y defectos del cartílago en seres humanos y otros animales. Las composiciones objeto también pueden tener uso profiláctico en la reducción de fracturas cerradas así como abiertas y también en la fijación mejorada de articulaciones artificiales. La formación de hueso de novo inducida por un agente osteogénico contribuye a la reparación de defectos craneofaciales congénitos, inducidos por traumatismos u provocados por resección oncológica, y también es útil en cirugía plástica cosmética. Además, las composiciones de la descripción pueden usarse en el tratamiento de la enfermedad periodontal y en otros procedimientos de reparación de dientes. En ciertos casos, un complejo de heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, o combinaciones de complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, pueden proporcionar un ambiente para atraer células formadoras de hueso, estimular el crecimiento de células formadoras de hueso o inducir la diferenciación de progenitores de células formadoras de hueso. Los complejos heteromultímeros de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación también pueden ser útiles en el tratamiento de la osteoporosis. Además, los complejos heteromultímeros de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta pueden usarse en la reparación de defectos del cartílago y prevención/reversión de la osteoartritis.

Rosen y col. (ed) Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism, 7a ed. American Society for Bone and Mineral Research, Washington D.C. proporciona una amplia discusión de los trastornos óseos que pueden estar sujetos a tratamiento con un complejo heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia TGF-beta o con combinaciones de complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia TGF-beta. En esta invención se proporciona una lista parcial. Los procedimientos y composiciones de la invención se pueden aplicar a afecciones caracterizadas por o que causan pérdida ósea, tales como osteoporosis (incluida la osteoporosis secundaria), hiperparatiroidismo, enfermedad renal crónica, trastorno mineral óseo, privación o ablación de hormonas sexuales (por ejemplo, andrógenos). y/o estrógeno), tratamiento con glucocorticoides, artritis reumatoide, quemaduras graves, hiperparatiroidismo, hipercalcemia, hipocalcemia, hipofosfatemia, osteomalacia (incluida la osteomalacia inducida por tumores), hiperfosfatemia, deficiencia de vitamina D, hiperparatiroidismo (incluido el hiperparatiroidismo familiar) y pseudohipoparatiroidismo óseo pérdida como consecuencia de un tumor o quimioterapia, tumores de hueso y médula ósea (p. ej., mieloma múltiple), trastornos óseos isquémicos, enfermedad periodontal y pérdida de hueso oral, enfermedad de Cushing, enfermedad de Paget, tirotoxicosis, estado diarreico crónico o malabsorción, acidosis tubular renal o anorexia nerviosa. Los procedimientos y composiciones de la invención también se pueden aplicar a afecciones caracterizadas por una falla en la formación o curación ósea, incluidas fracturas sin consolidación, fracturas que de otra manera son lentas para curar, displasias óseas fetales y neonatales (por ejemplo, hipocalcemia, hipercalcemia, receptor de calcio defectos y deficiencia de vitamina D), osteonecrosis (incluida la osteonecrosis de la mandíbula) y osteogénesis imperfecta. Además, los efectos anabólicos harán que dichos antagonistas disminuyan el dolor óseo asociado con el daño o la erosión ósea. Como consecuencia de los efectos antirresortivos, tales antagonistas pueden ser útiles para tratar trastornos de formación ósea anormal, tales como metástasis tumorales osteoblásticas (p. ej., asociadas con cáncer primario de próstata o de mama), osteosarcoma osteogénico, osteopetrosis, displasia diafisaria progresiva, endosteal. hiperostosis, osteopoiquilosis y melorreostosis. Otros trastornos que pueden tratarse incluyen displasia fibrosa y condrodisplasias.

En otra realización específica, la divulgación proporciona un método terapéutico y una composición para reparar fracturas y otras afecciones relacionadas con defectos de cartílago y / o huesos o enfermedades periodontales. La descripción proporciona además composiciones terapéuticas para la cicatrización de heridas y la reparación de tejidos. Los tipos de heridas incluyen, pero no se limitan a, quemaduras, incisiones y úlceras. Véase, p.ej., Publicación PCT No. WO 84/01106. Dichas composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos uno de los complejos heteromultímeros de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación en mezcla con un vehículo, portador o matriz farmacéuticamente aceptable.

En algunas realizaciones, un complejo de heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, o combinaciones de complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, de la divulgación se pueden aplicar a afecciones que causan pérdida ósea como la osteoporosis, hiperparatiroidismo, enfermedad de Cushing, tirotoxicosis, estado diarreico crónico o malabsorción, acidosis tubular renal o anorexia nerviosa. Comúnmente se aprecia que ser mujer, tener un peso corporal bajo y llevar un estilo de vida sedentario son factores de riesgo de osteoporosis (pérdida de densidad mineral ósea que conduce al riesgo de fracturas). Sin embargo, la osteoporosis también puede resultar del uso prolongado de ciertos medicamentos. La osteoporosis resultante de medicamentos u otra afección médica se conoce como osteoporosis secundaria. En una afección conocida como enfermedad de Cushing, el exceso de cortisol producido por el cuerpo provoca osteoporosis y fracturas. Los medicamentos más comunes asociados con la osteoporosis secundaria son los corticosteroides, una clase de fármacos que actúan como el cortisol, una hormona producida naturalmente por las glándulas suprarrenales. Aunque se necesitan niveles adecuados de hormonas tiroideas (que son producidas por la glándula tiroides) para el desarrollo del esqueleto, el exceso de hormona tiroidea puede disminuir la masa ósea con el tiempo. Los antiácidos que contienen aluminio pueden provocar la pérdida de masa ósea cuando las personas con problemas renales los toman en dosis altas, en particular las que se someten a diálisis. Otros medicamentos que pueden causar osteoporosis secundaria incluyen fenitoína (Dilantin) y barbitúricos que se usan para prevenir convulsiones; metotrexato (Rheumatrex, Immunex, Folex PFS), un fármaco para algunas formas de artritis, cáncer y trastornos inmunitarios; ciclosporina (Sandimmune, Neoral), un fármaco que se usa para tratar algunas enfermedades autoinmunes y para inhibir el sistema inmunológico en pacientes con trasplante de órganos; agonistas de la hormona liberadora de hormona luteinizante (Lupron, Zoladex), usados para tratar el cáncer de próstata y la endometriosis; heparina (Calciparine, Liquaemin), un medicamento anticoagulante; y colestiramina (Questran) y colestipol (Colestid), usados para tratar el colesterol alto. La pérdida ósea resultante de la terapia del cáncer es ampliamente reconocida y se denomina pérdida ósea inducida por la terapia del cáncer (CTIBL). Las metástasis óseas pueden crear cavidades en el hueso que pueden corregirse mediante el tratamiento con un complejo heteromultímero de la superfamilia de TGF-beta. La pérdida ósea también puede ser causada por la enfermedad de las encías, una infección crónica en la que las bacterias ubicadas en los huecos de las encías producen toxinas y enzimas dañinas.

En una realización adicional, la presente divulgación proporciona procedimientos y agentes terapéuticos para tratar enfermedades o trastornos asociados con el crecimiento óseo anormal o no deseado. Por ejemplo, los pacientes con el trastorno congénito fibrodisplasia osificante progresiva (FOP) se ven afectados por un crecimiento óseo ectópico progresivo en los tejidos blandos de forma espontánea o en respuesta a un traumatismo tisular, con un impacto importante en la calidad de vida. Además, puede ocurrir un crecimiento óseo anormal después de la cirugía de reemplazo de cadera y, por lo tanto, arruinar el resultado quirúrgico. Este es un ejemplo más común de crecimiento óseo patológico y una situación en la que los procedimientos y composiciones en cuestión pueden ser terapéuticamente útiles. Los mismos procedimientos y composiciones también pueden ser útiles para tratar otras formas de crecimiento óseo anormal (por ejemplo, crecimiento patológico del hueso después de un trauma, quemaduras o lesión de la médula espinal), y para tratar o prevenir las condiciones indeseables asociadas con el crecimiento óseo anormal observado en conexión con cáncer de próstata metastásico u osteosarcoma.

En determinadas realizaciones, un complejo de heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, o combinaciones de complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, de la divulgación pueden usarse para promover la formación ósea en pacientes con cáncer. Los pacientes que tienen ciertos tumores (por ejemplo, de próstata, mama, mieloma múltiple o cualquier tumor que cause hiperparatiroidismo) tienen un alto riesgo de pérdida ósea debido a la pérdida ósea inducida por el tumor, metástasis óseas y agentes terapéuticos. Dichos pacientes pueden tratarse con un complejo heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, o una combinación de complejos, incluso en ausencia de evidencia de pérdida ósea o metástasis óseas. Los pacientes también pueden ser monitoreados para detectar evidencia de pérdida ósea o metástasis óseas, y pueden ser tratados con un complejo heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia TGF-beta en el caso de que los indicadores sugieran un mayor riesgo. Generalmente, las exploraciones DEXA se emplean para evaluar los cambios en la densidad ósea, mientras que los indicadores de remodelación ósea pueden usarse para evaluar la probabilidad de metástasis óseas. Se pueden controlar los marcadores séricos. La fosfatasa alcalina específica de hueso (BSAP) es una enzima que está presente en los osteoblastos. Los niveles sanguíneos de BSAP aumentan en pacientes con metástasis ósea y otras afecciones que provocan un aumento de la remodelación ósea. Los péptidos de osteocalcina y procolágeno también están asociados con la formación ósea y las metástasis óseas. Se han detectado aumentos de BSAP en pacientes con metástasis óseas por cáncer de próstata y, en menor grado, en metástasis óseas por cáncer de mama. Los niveles de BMP7 son altos en el cáncer de próstata que ha hecho metástasis en los huesos, pero no en las metástasis óseas debidas a cáncer de vejiga, piel, hígado o pulmón. El telopéptido carboxi-terminal de tipo I (ICTP) es un enlace cruzado que se encuentra en el colágeno y que se forma durante la reabsorción del hueso. Dado que el hueso se descompone y reforma constantemente, el ICT^p se encontrará en todo el cuerpo. Sin embargo, en el sitio de la metástasis ósea, el nivel será significativamente más alto que en un área de hueso normal. Se ha encontrado ICTP en niveles altos en metástasis óseas debido a cáncer de próstata, pulmón y mama. Otro entrecruzamiento de colágeno, el telopéptido N-terminal de tipo I (NTx), se produce junto con ICTP durante el recambio óseo. La cantidad de NTx aumenta en la metástasis ósea causada por muchos tipos diferentes de cáncer, incluidos los de pulmón, próstata y mama. Además, los niveles de NTx aumentan con la progresión de la metástasis ósea. Por lo tanto, este marcador puede usarse tanto para detectar metástasis como para medir la extensión de la enfermedad. Otros marcadores de reabsorción incluyen piridinolina y desoxipiridinolina. Cualquier aumento en los marcadores de resorción o marcadores de metástasis óseas indica la necesidad de terapia con un complejo heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, o combinaciones de complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, en un paciente.

En otra realización, un complejo de heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, o combinaciones de complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, pueden usarse en pacientes con trastorno óseo mineral de enfermedad renal crónica (CKD-MBD), síndrome de trastornos esqueléticos, cardiovasculares y mineral-metabólicos interrelacionados que surgen de una enfermedad renal. CKD-MBD abarca varias patologías esqueléticas a menudo denominadas osteodistrofia renal (ROD), que es una realización preferida de la invención para el tratamiento con un complejo de heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, o combinaciones de complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta. Dependiendo de la contribución relativa de diferentes factores patogénicos, ROD se manifiesta como diversos patrones patológicos de remodelación ósea (Hruska y col., 2008, Chronic kidney disease mineral bone disorder (CKD-MBD); in Rosen y col. (ed) Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism, 7a ed. American Society for Bone and Mineral Research, Washington D.C., pp 343-349). En un extremo del espectro se encuentra la ROD con osteodistrofia urémica y bajo recambio óseo, que se caracteriza por un bajo número de sitios de remodelación activa, formación ósea profundamente suprimida y baja resorción ósea. En el otro extremo está la ROD con hiperparatiroidismo, alto recambio óseo y osteítis fibrosa. Dado que un complejo de heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, o combinaciones de complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, pueden ejercer efectos tanto anabólicos como antirresortivos, estos agentes pueden ser útiles en pacientes del espectro patológico de la ROD.

Un complejo de heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, o combinaciones de complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, de la divulgación, pueden administrarse conjuntamente con otros agentes farmacéuticos activos para los huesos. La administración conjunta se puede realizar mediante la administración de una única co-formulación, mediante administración simultánea o mediante administración en momentos separados. Los complejos heteromultímeros de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta pueden ser particularmente ventajosos si se administran con otros agentes activos para los huesos. Un paciente puede beneficiarse de recibir conjuntamente un complejo heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia TGF-beta y tomar suplementos de calcio, vitamina D, ejercicio apropiado y/o, en algunos casos, otros medicamentos. Ejemplos de otros medicamentos incluyen bisfosfonatos (alendronato, ibandronato y risedronato), calcitonina, estrógenos, hormona paratiroidea y raloxifeno. Los bisfosfonatos (alendronato, ibandronato y risedronato), calcitonina, estrógenos y raloxifeno afectan el ciclo de remodelación ósea y se clasifican como medicamentos antirresortivos. La remodelación ósea consta de dos etapas distintas: reabsorción ósea y formación ósea. Los medicamentos antirresortivos ralentizan o detienen la parte de reabsorción ósea del ciclo de remodelación ósea, pero no retrasan la parte del ciclo de formación de hueso. Como resultado, la nueva formación continúa a un ritmo mayor que la resorción ósea y la densidad ósea puede aumentar con el tiempo. La teriparatida, una forma de hormona paratiroidea, aumenta la tasa de formación ósea en el ciclo de remodelación ósea. El alendronato está aprobado tanto para la prevención (5 mg al día o 35 mg una vez a la semana) como para el tratamiento (10 mg al día o 70 mg una vez a la semana) de la osteoporosis posmenopáusica. El alendronato reduce la pérdida ósea, aumenta la densidad ósea y reduce el riesgo de fracturas de columna, muñeca y cadera. El alendronato también está aprobado para el tratamiento de la osteoporosis inducida por glucocorticoides en hombres y mujeres como resultado del uso prolongado de estos medicamentos (es decir, prednisona y cortisona) y para el tratamiento de la osteoporosis en hombres. El alendronato más vitamina D está aprobado para el tratamiento de la osteoporosis en mujeres posmenopáusicas (70 mg una vez a la semana más vitamina D) y para el tratamiento para mejorar la masa ósea en hombres con osteoporosis. El ibandronato está aprobado para la prevención y el tratamiento de la osteoporosis posmenopáusica. Tomado como una pastilla de una vez al mes (150 mg), ibandronato debe tomarse el mismo día cada mes. El ibandronato reduce la pérdida ósea, aumenta la densidad ósea y reduce el riesgo de fracturas de columna. El risendronato está aprobado para la prevención y el tratamiento de la osteoporosis posmenopáusica. Tomado diariamente (dosis de 5 mg) o semanalmente (dosis de 35 mg o dosis de 35 mg con calcio), el risedronato ralentiza la pérdida ósea, aumenta la densidad ósea y reduce el riesgo de fracturas de la columna y otras fracturas. El risedronato también está aprobado para su uso por hombres y mujeres para prevenir y/o tratar la osteoporosis inducida por glucocorticoides que resulta del uso prolongado de estos medicamentos (es decir, prednisona o cortisona). La calcitonina es una hormona natural involucrada en la regulación del calcio y el metabolismo óseo. En mujeres que han pasado más de 5 años después de la menopausia, la calcitonina retarda la pérdida ósea, aumenta la densidad ósea espinal y puede aliviar el dolor asociado con las fracturas óseas. La calcitonina reduce el riesgo de fracturas de columna. La calcitonina está disponible en forma de inyección (50-100 UI al día) o aerosol nasal (200 UI al día).

Un paciente también puede beneficiarse de recibir conjuntamente un complejo heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia TGF-beta, o combinaciones de complejos heteromultímeros de brazo único del receptor de la superfamilia TGF-beta, y medicamentos óseos adicionales. Terapia de estrógenos (Et)/terapia hormonal (HT) está aprobada para la prevención de la osteoporosis. Se ha demostrado que la ET reduce la pérdida ósea, aumenta la densidad ósea tanto en la columna como en la cadera y reduce el riesgo de fracturas de cadera y columna en mujeres posmenopáusicas. La ET se administra con mayor frecuencia en forma de píldora o parche cutáneo que administra una dosis baja de aproximadamente 0,3 mg al día o una dosis estándar de aproximadamente 0,625 mg al día y es eficaz incluso cuando se inicia después de los 70 años. Cuando el estrógeno se toma solo, puede aumentar el riesgo de que una mujer desarrolle cáncer del revestimiento del útero (cáncer de endometrio). Para eliminar este riesgo, los médicos recetan la hormona progestina en combinación con estrógeno (terapia de reemplazo hormonal o HT) para aquellas mujeres que tienen el útero intacto. ET/HT alivia los síntomas de la menopausia y se ha demostrado que tiene un efecto beneficioso sobre la salud ósea. Los efectos secundarios pueden incluir sangrado vaginal, sensibilidad en los senos, alteraciones del estado de ánimo y enfermedad de la vesícula biliar. El raloxifeno, 60 mg al día, está aprobado para la prevención y el tratamiento de la osteoporosis posmenopáusica. Es de una clase de medicamentos llamados moduladores selectivos del receptor de estrógeno (SERM) que se han desarrollado para proporcionar los efectos beneficiosos de los estrógenos sin sus posibles desventajas. El raloxifeno aumenta la masa ósea y reduce el riesgo de fracturas de la columna. Aún no se dispone de datos que demuestren que el raloxifeno puede reducir el riesgo de fracturas de cadera y otras fracturas no vertebrales. La teriparatida, una forma de hormona paratiroidea, está aprobada para el tratamiento de la osteoporosis en mujeres posmenopáusicas y hombres con alto riesgo de fractura. Este medicamento estimula la formación de hueso nuevo y aumenta significativamente la densidad mineral ósea. En mujeres posmenopáusicas, se observó una reducción de las fracturas en la columna, la cadera, el pie, las costillas y la muñeca. En los hombres, se observó una reducción de las fracturas en la columna, pero no hubo datos suficientes para evaluar la reducción de las fracturas en otros sitios. La teriparatida se autoadministra en forma de inyección diaria durante un máximo de 24 meses.

En otras realizaciones, un complejo de heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, o combinaciones de complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta se pueden usar para regular el contenido de grasa corporal en un animal y para tratar o prevenir afecciones relacionadas con el mismo, y particularmente, las condiciones que comprometen la salud relacionadas con los mismos. De acuerdo con la presente descripción, regular (controlar) el peso corporal puede referirse a reducir o aumentar el peso corporal, reducir o aumentar la tasa de ganancia de peso, o aumentar o reducir la tasa de pérdida de peso, y también incluye mantener activamente, o no significativamente cambio de peso corporal (p.ej., contra influencias externas o internas que de otro modo podrían aumentar o disminuir el peso corporal). Una realización de la presente divulgación se refiere a la regulación del peso corporal administrando a un animal (p. ej., un ser humano) que lo necesite un complejo heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, o combinaciones de complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, de la divulgación.

En algunas realizaciones, un complejo de heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, o combinaciones de complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, de la presente divulgación pueden usarse para reducir el peso corporal y/o reducir el aumento de peso en un animal y, más particularmente, para tratar o mejorar la obesidad en pacientes con riesgo de o que padecen obesidad. La presente descripción puede estar dirigida a compuestos para tratar a un animal que no puede ganar o retener peso (p. ej., un animal con síndrome de desgaste). Tales compuestos son eficaces para aumentar el peso corporal y/o la masa, o para reducir el peso y/o la pérdida de masa, o para mejorar las condiciones asociadas con o causadas por un peso y/o masa corporal indeseablemente bajos (p. ej., insalubres). Además, los trastornos de colesterol alto (por ejemplo, hipercolesterolemia o dislipidemia) pueden tratarse con un complejo heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia TGF-beta, o combinaciones de complejos heteromultímeros de brazo único del receptor de la superfamilia TGF-beta, de la divulgación.

En ciertos aspectos, un complejo de heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, o una combinación de complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, de la presente divulgación se puede utilizar para aumentar los niveles de glóbulos rojos, tratar o prevenir una anemia, y/o tratar o prevenir la eritropoyesis ineficaz en un sujeto que lo necesite. En ciertos aspectos, un complejo de heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, o una combinación de complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, de la presente divulgación puede usarse en combinación con estrategias terapéuticas convencionales para aumentar los niveles de glóbulos rojos., en particular los que se utilizan para tratar anemias de origen multifactorial. Las estrategias terapéuticas convencionales para aumentar los niveles de glóbulos rojos incluyen, por ejemplo, transfusión de glóbulos rojos, administración de uno o más activadores del receptor de EPO, trasplante de células madre hematopoyéticas, biológicos inmunosupresores y fármacos (por ejemplo, corticosteroides). En determinadas realizaciones, un complejo de heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, o una combinación de complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, de la presente divulgación se puede utilizar para tratar o prevenir la eritropoyesis ineficaz. y/o los trastornos asociados con la eritropoyesis ineficaz en un sujeto que lo necesite. En ciertos aspectos, un complejo de heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, o una combinación de complejos de heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, de la presente divulgación, se puede usar en combinación con estrategias terapéuticas convencionales para tratar o prevenir una anemia. o trastorno de eritropoyesis ineficaz, particularmente los que se usan para tratar anemias de origen multifactorial.

En general, el tratamiento o la prevención de una enfermedad o condición como se describe en la presente divulgación se logra mediante la administración de un complejo heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, o una combinación de complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la presente divulgación en una "cantidad efectiva". Una cantidad efectiva de un agente se refiere a una cantidad efectiva, en dosis y durante períodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Una “cantidad terapéuticamente efectiva” de un agente de la presente descripción puede variar en función de factores tales como el estado patológico, la edad, el sexo y peso del individuo y la capacidad del agente para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una “cantidad profilácticamente efectiva” se refiere a una cantidad efectiva, en dosis y durante períodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado profiláctico deseado.

En ciertas realizaciones, un complejo de heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, o una combinación de complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta, opcionalmente combinado con un activador del receptor de EPO, puede usarse para aumentar los niveles de glóbulos rojos, hemoglobina o reticulocitos en individuos sanos y poblaciones de pacientes seleccionadas. Ejemplos de las poblaciones de pacientes apropiados incluyen aquellos con niveles indeseablemente bajos de glóbulos rojos o hemoglobina, tales como los pacientes que tienen anemia y aquellos que están en riesgo de desarrollar niveles indeseablemente bajos de glóbulos rojos y hemoglobina, tales como aquellos pacientes que están a punto de someterse a una cirugía mayor u otros procedimientos que pueden dar lugar a una pérdida considerable de sangre. En una realización, un paciente con niveles adecuados de glóbulos rojos se trata con un complejo heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia TGF-beta, o una combinación de complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia TGF-beta, para aumentar los niveles de glóbulos rojos, y luego se extrae sangre y se almacena para su uso posterior en transfusiones.

Uno o más complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación, opcionalmente combinados con un activador del receptor de EPO, pueden usarse para aumentar los niveles de glóbulos rojos, niveles de hemoglobina, y/o niveles de hematocrito en un paciente con anemia. Al observar los niveles de hemoglobina y/o hematocrito en seres humanos, un nivel inferior al normal para la categoría de edad y sexo apropiada puede ser indicativo de anemia, aunque se tienen en cuenta variaciones individuales. Por ejemplo, un nivel de hemoglobina de 10-12,5 g / dl, y típicamente alrededor de 11,0 g / dl, se considera dentro del rango normal en adultos sanos, aunque, en términos de terapia, un nivel objetivo más bajo puede causar menos efectos secundarios cardiovasculares. [véase, p.ej., Jacobs y col. (2000) Nephrol Dial Transplant 15, 15-19]. Alternativamente, los niveles de hematocrito (porcentaje del volumen de una muestra de sangre ocupado por las células) se pueden usar como una medida de anemia. Los niveles de hematocrito para individuos sanos varían de aproximadamente 41-51 % para hombres adultos y de 35-45 % para mujeres adultas. En ciertos aspectos, se puede tratar a un paciente con una pauta posológica destinada a restaurar al paciente a un nivel diana de glóbulos rojos, hemoglobina y/o hematocrito. Como los niveles de hemoglobina y hematocrito varían de persona a persona, óptimamente, el nivel de hemoglobina y/o hematocrito objetivo se puede individualizar para cada paciente.

A menudo se observa anemia en pacientes que tienen una lesión tisular, una infección y/o una enfermedad crónica, particularmente cáncer. En algunos sujetos, la anemia se distingue por niveles de eritropoyetina bajos y/o una respuesta inadecuada a la eritropoyetina en la médula ósea [véase, p.ej., Adamson (2008) Harrison's Principles of Internal Medicine, 17a ed.; McGraw Hill, New York, pp 628-634]. Las causas potenciales de anemia incluyen, por ejemplo, pérdida de sangre, carencias nutricionales (p.ej. ingesta nutricional reducida de proteína), reacción a la medicación, diversos problemas asociados a la médula ósea y muchas enfermedades. Más particularmente, la anemia se ha asociado con una variedad de trastornos y afecciones que incluyen, por ejemplo, trasplante de médula ósea; tumores sólidos (p.ej., cáncer de mama, cáncer de pulmón y cáncer de colon); tumores del sistema linfático (p.ej., por ejemplo, leucemia linfocitaria crónica, linfoma no Hodgkin y linfoma Hodgkin); tumores del sistema hematopoyético (p.ej., leucemia, síndrome mielodisplásico y mieloma múltiple); radioterapia; quimioterapia (por ejemplo, regímenes que contienen platino); enfermedades inflamatorias y autoinmunes, que incluyen, pero no se limitan a, artritis reumatoide, otras artritis inflamatorias, lupus eritematosis sistémico (LES), enfermedades cutáneas agudas o crónicas (p.ej., psoriasis), enfermedad inflamatoria del intestino (p.ej., enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa); insuficiencia o enfermedad renal aguda o crónica, incluidas afecciones idiopáticas o congénitas; enfermedad hepática aguda o crónica; sangrado agudo o crónico; situaciones en las que la transfusión de glóbulos rojos no es posible debido a aloanticuerpos o autoanticuerpos del paciente y / o por razones religiosas (p.ej., algunos Testigos de Jehova); infecciones (p.ej., malaria y osteomielitis); hemoglobinopaías incluyendo, por ejemplo, enfermedad de células falciformes (anemia), talasemias; uso o abuso de fármacos (p.ej., abuso de alcohol); pacientes pediátricos con anemia por cualquier causa para evitar transfusiones; y pacientes ancianos o pacientes con enfermedad cardiopulmonar subyacente con anemia que no pueden recibir transfusiones debido a preocupaciones sobre la sobrecarga circulatoria [véase, p.ej., Adamson (2008) Harrison's Principles of Internal Medicine, 17a ed.; McGraw Hill, New York, pp 628-634].

Muchos factores pueden contribuir a la anemia relacionada con el cáncer. Algunos están asociados al propio procedimiento de enfermedad y a la generación de citocinas inflamatorias, tales como interleucina-1, interferón-gamma y factor de necrosis tumoral [Bron y col. (2001) Semin Oncol 28 (Supl. 8):16]. Entre sus efectos, la inflamación induce el péptido regulador de hierro clave, la hepcidina, inhibiendo de ese modo la exportación de hierro desde los macrófagos y limitando generalmente la disponibilidad de hierro para la eritropoyesis [véase, p. ej., Ganz (2007) J Am Soc Nephrol 18:394-400]. La pérdida de sangre a través de diversas vías también puede contribuir a la anemia relacionada con el cáncer. La prevalencia de la anemia debida a la progresión del cáncer varía con el tipo de cáncer, que varía desde 5 % en el cáncer de próstata hasta 90 % en el mieloma múltiple. La anemia relacionada con el cáncer tiene consecuencias graves para los pacientes, que incluyen cansancio y calidad de vida reducida, eficacia del tratamiento reducida y mortalidad aumentada. En algunas realizaciones, podrían usarse uno o más complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación, combinados opcionalmente con un activador del receptor de EPO, para tratar una anemia relacionada con el cáncer.

Una anemia hipoproliferativa puede ser consecuencia de una disfunción o insuficiencia primarias de la médula ósea. Las anemias hipoproliferativas incluyen: anemia por enfermedad crónica, anemia por nefropatía, anemia asociada a estados hipometabólicos y anemia asociada a cáncer. En cada uno de estos tipos, los niveles de eritropoyetina endógena son inapropiadamente bajos para el grado de anemia observado. Otras anemias hipoproliferativas incluyen: anemia ferropénica incipiente y anemia provocada por lesión en la médula ósea. En estos tipos, los niveles de eritropoyetina endógena son apropiadamente elevados para el grado de anemia observado. Los ejemplos destacados serían mielosupresión provocada por fármacos contra el cáncer y/o quimioterápicos o por radioterapia contra el cáncer. Un análisis amplio de los ensayos clínicos encontró que se puede producir la anemia leve se puede producir en 100 % de los pacientes después de la quimioterapia, mientras que la anemia más grave se puede producir en hasta 80 % de tales pacientes [véase, p. ej., Groopman y col. (1999) J Natl Cancer Inst 91:1616-1634]. Los fármacos mielosupresores incluyen, por ejemplo: 1) agentes alquilantes como mostazas nitrogenadas (p.ej., melfalan) y nitrosoureas (p.ej., estreptozocina); 2) antimetabolitos como antagonistas del ácido fólico (p.ej., metotrexato), análogos de purina (p.ej., tioguanina), y análogos de pirimidina (p.ej., gemcitabina); 3) antibióticos citotóxicos como antraciclinas (p.ej., doxorubicina); 4) inhibidores de quinasa (p.ej., gefitinib); 5) inhibidores mitóticos como taxanos (p.ej., paclitaxel) y vinca alcaloides (p.ej., vinorelbine); 6) anticuerpos monoclonales (p.ej., rituximab); y 7) inhibidores de topoisomerasa (p.ej., topotecan y etoposida). Además, las afecciones que son consecuencia de una tasa hipometabólica pueden producir una anemia hipoproliferativa de leve a moderada. Entre tales afecciones están los estados de carencia endocrina. Por ejemplo, se puede producir anemia en la enfermedad de Addison, el hipotiroidismo, el hiperparatiroidismo o en machos castrados o tratados con estrógeno. En algunas realizaciones, podrían usarse uno o más complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación, combinados opcionalmente con un activador del receptor de EPO, para tratar una anemia hiperproliferativa.

La nefropatía crónica en ocasiones está asociada a anemia hipoproliferativa, y el grado de la anemia varía en cuanto a su gravedad con el nivel de insuficiencia renal. Tal anemia se debe principalmente a la producción inadecuada de eritropoyetina y a la supervivencia reducida de los glóbulos rojos. Normalmente, la nefropatía crónica avanza gradualmente a lo largo de un periodo de años o décadas a enfermedad terminal (Etapa 5), momento en el que se requiere diálisis o trasplante de riñón para la supervivencia del paciente. La anemia a menudo se desarrolla de forma precoz en este procedimiento y empeora a medida que progresa la enfermedad. Las consecuencias clínicas de la anemia por nefropatía están bien documentadas e incluyen desarrollo de hipertrofia ventricular izquierda, función cognitiva deficiente, calidad de vida reducida y función inmunitaria alterada [véase, p.ej., Levin y col. (1999) Am J Kidney Dis 27:347-354; Nissenson (1992) Am J Kidney Dis 20(Suppl 1):21-24; Revicki y col. (1995) Am J Kidney Dis 25:548-554; Gafter y col., (1994) Kidney Int 45:224-231]. En algunas realizaciones, uno o más complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación, opcionalmente combinados con un activador del receptor de EPO, podrían usarse para tratar la anemia asociada con insuficiencia o enfermedad renal aguda o crónica.

La anemia resultante de la pérdida de sangre aguda de volumen suficiente, tal como de un traumatismo o hemorragia postparto, se conoce como anemia posthemorrágica aguda. La pérdida aguda de sangre provoca inicialmente hipovolemia sin anemia, ya que no hay reducción proporcional de los RBC junto con otros componentes de la sangre. Sin embargo, la hipovolemia desencadenará rápidamente mecanismos fisiológicos que desvían el líquido del compartimento extravascular al vascular, lo que da como resultado hemodilución y anemia. La pérdida de sangre, si es crónica, reduce gradualmente las reservas de hierro corporal y, en última instancia, conduce a carencia de hierro. En algunas realizaciones, podrían usarse uno o más complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación, combinados opcionalmente con un activador del receptor de EPO, para tratar una anemia resultante de una pérdida aguda de sangre.

La anemia ferropénica es la etapa final de una progresión gradual de la carencia creciente de hierro, que incluye balance negativo de hierro y eritropoyesis ferropénica como etapas intermedias. La carencia de hierro puede ser consecuencia de la demanda de hierro aumentada, ingesta de hierro reducida o pérdida de hierro aumentada, como se ejemplifica en afecciones tales como embarazo, dieta inadecuada, absorción intestinal insuficiente, inflamación aguda o crónica y pérdida de sangre aguda o crónica. Con anemia de leve a moderada de este tipo, la médula ósea sigue siendo hipoproliferativa y la morfología de los RBC es en gran medida normal; sin embargo, incluso la anemia leve puede dar como resultado algunos RBC hipocrómicos microcíticos, y la transición a anemia ferropénica grave va acompañada de hiperproliferación de la médula ósea y RBC microcíticos e hipocrómicos cada vez más prevalentes [véase, p. ej.., Adamson (2008) Harrison's Principles of Internal Medicine, 17a ed.; McGraw Hill, Nueva York, páginas 628-634]. La terapia apropiada para la anemia ferropénica depende de su causa y gravedad, con los preparados orales de hierro, las formulaciones parenterales de hierro y la transfusión de RBC como opciones convencionales principales. En algunas realizaciones, podrían usarse uno o más complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación, combinados opcionalmente con un activador del receptor de EPO, para tratar una deficiancia de hierro crónica.

El síndrome mielodisplásico (MDS) es un conjunto heterogéneo de afecciones hematológicas caracterizadas por producción inefectiva de células sanguíneas mieloides y riesgo de transformación a leucemia mielógena aguda. En los pacientes con MDS, las células madre sanguíneas no maduran para convertirse en glóbulos rojos, glóbulos blancos o plaquetas sanos. Los trastornos de MDS incluyen anemia refractaria, anemia refractaria con sideroblastos anillados, anemia refractaria con exceso de blastos, anemia refractaria con exceso de blastos en transformación, citopenia refractaria con displasia multilinaje y síndrome mielodisplásico asociado a una anomalía aislada del cromosoma 5q. Como estos trastornos se presentan como defectos irreversibles tanto en la cantidad como en la calidad de las células hematopoyéticas, la mayoría de los pacientes con MDS padecen anemia crónica. Por lo tanto, los pacientes con MDS requieren en última instancia transfusiones de sangre y/o tratamiento con factores de crecimiento (p. ej., eritropoyetina o G-CSF) para aumentar los niveles de glóbulos rojos. Sin embargo, muchos pacientes con MDS desarrollan efectos secundarios debido a la frecuencia de tales terapias. Por ejemplo, los pacientes que reciben transfusiones de glóbulos rojos frecuentes pueden presentar lesiones en los tejidos y órganos debido a la acumulación de hierro adicional. Por consiguiente, uno o más complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación pueden usarse para tratar pacientes que tienen MDS. En determinadas realizaciones, los pacientes que padecen MDS pueden ser tratados usando uno o más complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación, opcionalmente en combinación con un activador del receptor de EPO. En otras realizaciones, los pacientes que padecen MDS pueden ser tratados usando una combinación de uno o más complejos heteromultímeros de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación y uno o más agentes terapéuticos adicionales para tratar MDS que incluyen, por ejemplo, talidomida, lenalidomida, azacitadina, decitabina, eritropoyetinas, deferoxamina, globulina antitimocítica y filgrastrim (G-CSF).

Originalmente distinguido de la anemia aplásica, hemorragia o hemólisis periférica sobre la base de estudios ferrocinéticos [véase, p.ej., Ricketts y col. (1978) Clin Nucí Med 3:159-164], la eritropoyesis ineficaz describe un grupo diverso de anemias en las que la producción de glóbulos rojos maduros es menor de lo que cabría esperar dada la cantidad de precursores eritroides (eritroblastos) presentes en la médula ósea [Tanno y col. (2010) Adv Hematol 2010:358283]. En tales anemias, la hipoxia tisular persiste a pesar de los niveles elevados de eritropoyetina debido a la producción ineficaz de glóbulos rojos maduros. Con el tiempo se desarrolla un círculo vicioso en el que los niveles elevados de eritropoyetina impulsan la expansión masiva de los eritroblastos, lo que puede conducir a esplenomegalia (agrandamiento del bazo) debido a eritropoyesis extramedular. [véase, por ejemplo, Aizawa y col. (2003) Soy J Hematol 74:68-72], patología ósea inducida por eritroblasto [véase, por ejemplo, Di Matteo y col. (2008) J Biol Regul Homeost Agents 22:211-216], y sobrecarga tisular de hierro, incluso en ausencia de transfusiones terapéuticas de glóbulos rojos [véase, por ejemplo, Pippard y col. (1979) Lancet 2:819-821]. Por lo tanto, al aumentar la eficacia eritropoyética, uno o más complejos heteromultímeros de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la presente divulgación pueden romper el ciclo antes mencionado y, por lo tanto, aliviar no solo la anemia subyacente sino también las complicaciones asociadas de niveles elevados de eritropoyetina, esplenomegalia, patología y sobrecarga tisular de hierro. En algunas realizaciones, se pueden usar uno o más complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la presente divulgación para tratar o impedir la eritropoyesis ineficaz, que incluyen anemia y niveles elevados de EPO, así como complicaciones tales como esplenomegalia, patología ósea inducida por eritroblastos, sobrecarga de hierro y sus patologías concomitantes. Con la esplenomegalia, tales patologías incluyen dolor torácico o abdominal e hiperplasia reticuloendotelial. La hematopoyesis extramedular puede producirse no solo en el bazo sino potencialmente en otros tejidos en forma de pseudotumores hematopoyéticos extramedulares [véase, por ejemplo, Musallam y col. (2012) Cold Spring Harb Perspect Med 2:a013482]. Con la patología ósea inducida por eritroblastos, las patologías concomitantes incluyen baja densidad mineral ósea, osteoporosis y dolor óseo. [véase, por ejemplo, Haidar y col. (2011) Hueso 48:425-432]. Con la sobrecarga de hierro, las patologías concomitantes incluyen supresión de hepcidina e hiperabsorción de hierro en la dieta. [véase, por ejemplo, Musallam y col. (2012) Blood Rev 26 (Supl. 1):S16-S19], múltiples endocrinopatías e hígado fibrosis/cirrhosis [véase, por ejemplo, Galanello y col. (2010) Orphanet J Rare Dis 5:11], y miocardiopatía por sobrecarga de hierro [Lekawanvijit y col., 2009, Can J Cardiol 25:213-218].

Las causas más comunes de eritropoyesis ineficaz son los síndromes de talasemia, hemoglobinopatías hereditarias en las que los desequilibrios en la producción de cadenas de hemoglobina alfa y beta intactas conducen a un aumento de la apoptosis durante la maduración de los eritroblastos [véase, p.ej., Schrier (2002) Curr Opin Hematol 9:123-126]. Las talasemias se encuentran colectivamente entre los trastornos genéticos más frecuentes en todo el mundo, y se prevé que los patrones epidemiológicos cambiantes contribuirán a un creciente problema de salud pública tanto en los EE. u U. como a nivel mundial [Vichinsky (2005) Ann NY Acad Sci 1054:18-24]. Los síndromes de talasemia se denominan según su gravedad. Por lo tanto, las a-talasemias incluyen a-talasemia menor (también conocida como rasgo de a-talasemia; dos genes de a-globina afectados), enfermedad de la hemoglobina H (tres genes de a-globina afectados) y a-talasemia mayor (también conocida como hidropesía fetal; cuatro genes de a-globina afectados). Las p-talasemias incluyen p-talasemia menor (también conocida como rasgo de p-talasemia; un gen de p-globina afectado), p-talasemia intermedia (dos genes de p-globina afectados), talasemia de hemoglobina E (dos genes de pglobina afectados), y p-talasemia mayor (también conocida como anemia de Cooley; dos genes de p-globina afectados resultan en una ausencia completa de la proteína p-globina). La p-talasemia afecta a múltiples órganos, se asocia con una morbilidad y mortalidad considerables y actualmente requiere atención de por vida. Aunque la esperanza de vida en pacientes con p-talasemia ha aumentado en los últimos años debido al uso de transfusiones de sangre periódicas en combinación con quelación de hierro, la sobrecarga de hierro resultante tanto de las transfusiones como de la absorción gastrointestinal excesiva de hierro puede causar complicaciones graves como enfermedades cardíacas, trombosis, hipogonadismo, hipotiroidismo, diabetes, osteoporosis y osteopenia [véase, por ejemplo, Rund y col. (2005) N Engl J Med 353:1135-1146]. En determinadas realizaciones, pueden usarse uno o más complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación, combinados opcionalmente con un activador del receptor de EPO, para tratar o prevenir un síndrome de talasemia.

En algunas realizaciones, uno o más complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación, opcionalmente combinados con un activador del receptor de EPO, pueden usarse para tratar trastornos de eritropoyesis ineficaz además de los síndromes de talasemia. Dichos trastornos incluyen anemia siderblástica (heredada o adquirida); anemia diseritropoyética (tipos I y II); anemia falciforme; esferocitosis hereditaria; deficiencia de piruvato quinasa; anemias megaloblásticas, potencialmente causadas por afecciones como la deficiencia de folato (debido a enfermedades congénitas, disminución de la ingesta o aumento de las necesidades), deficiencia de cobalamina (debido a enfermedades congénitas, anemia perniciosa, alteración de la absorción, insuficiencia pancreática o disminución de la ingesta), ciertos medicamentos, o causas inexplicables (anemia diseritropoyética congénita, anemia megaloblástica refractaria o eritroleucemia); anemias mieloptísicas que incluyen, por ejemplo, mielofibrosis (metaplasia mieloide) y mieloptisis; porfiria eritropoyética congénita; y envenenamiento por plomo.

En determinadas realizaciones, pueden usarse uno o más complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación en combinación con terapias de apoyo para la eritropoyesis ineficaz. Tales terapias incluyen transfusiones con glóbulos rojos o sangre completa para tratar la anemia. En las anemias crónicas o hereditarias, los mecanismos normales de la homeostasis del hierro se ven abrumados por transfusiones repetidas, lo que eventualmente conduce a una acumulación tóxica y potencialmente fatal de hierro en tejidos vitales como el corazón, el hígado y las glándulas endocrinas. Por lo tanto, las terapias de apoyo para pacientes que padecen de eritropoyesis ineficaz de forma crónica también incluyen el tratamiento con una o más moléculas quelantes de hierro para promover la excreción de hierro en la orina. y/o heces y por lo tanto impedir o revertir la sobrecarga tisular de hierro [véase, por ejemplo, Hershko (2006) Haematologica 91:1307-1312; Cao y col. (2011), Pediatr Rep 3(2):e17]. Los agentes quelantes de hierro efectivos deben ser capaces de unir y neutralizar selectivamente el hierro férrico, la forma oxidada del hierro no unida a transferrina que probablemente explica la mayor parte de la toxicidad del hierro a través de la producción catalítica de radicales hidroxilo y productos de la oxidación [véase, p.ej., Esposito y col. (2003) Blood 102:2670-2677]. Estos agentes son estructuralmente diversos, pero todos poseen átomos donantes de oxígeno o nitrógeno capaces de formar complejos de coordinación octaédrica neutralizantes con átomos de hierro individuales en estequiometrías de 1:1 (agentes hexadentados), 2:1 (tridentados) o 3:1 (bidentados) [Kalinowski y col. (2005) Pharmacol Rev 57:547-583]. En general, los agentes quelantes de hierro efectivos también tienen un peso molecular relativamente bajo (p. ej., inferior a 700 daltons), con solubilidad tanto en agua como en lípidos para permitir el acceso a los tejidos afectados. Los ejemplos específicos de moléculas quelantes de hierro incluyen deferoxamina, un agente hexadentado de origen bacteriano que requiere administración parenteral diaria, y los agentes sintéticos oralmente activos deferiprona (bidentado) y deferasirox (tridentado). La politerapia que consiste en la administración en el mismo día de dos agentes quelantes de hierro se presenta prometedora en pacientes resistentes a la monoterapia de quelación y también para superar los problemas de cumplimiento terapéutico deficiente del paciente con la deferoxamina sola [Cao y col. (2011) Pediatr Rep 3(2):e17; Galanello y col. (2010) Ann NY Acad Sci 1202:79-86].

Como se usa en esta solicitud, "en combinación con" o "administración conjunta" se refiere a cualquier forma de administración de modo que la segunda terapia aún sea efectiva en el cuerpo (por ejemplo, los dos compuestos son simultáneamente efectivos en el paciente, lo que puede incluir efectos sinérgicos de los dos compuestos). La eficacia puede no correlacionarse con la concentración mensurable del agente en sangre, suero o plasma. Por ejemplo, los diferentes compuestos terapéuticos se pueden administrar en la misma formulación o en formulaciones independientes, concomitante o secuencialmente, y en diferentes programas. Por tanto, un individuo que recibe tal tratamiento se puede beneficiar de un efecto combinado de diferentes terapias. Uno o más complejos heteromultiméricoss de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación se pueden administrar simultáneamente con, antes o después de, uno o más de otros agentes adicionales o terapias de apoyo. En general, cada agente se administrará en una dosis y/o con una programación determinados para ese agente particular. La combinación particular que se va a emplear en una pauta tendrá en cuenta la compatibilidad del antagonista de la presente descripción con la terapia y/o el efecto terapéutico deseado que se va a conseguir.

En ciertas realizaciones, pueden usarse uno o más complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación en combinación con hepcidina o un agonista de hepcidina para la eritropoyesis ineficaz. Un polipéptido circulante producido principalmente en el hígado, la hepcidina, se considera un regulador maestro del metabolismo del hierro en virtud de su capacidad para inducir la degradación de la ferroportina, una proteína exportadora de hierro ubicada en los enterocitos, hepatocitos y macrófagos absorbentes. En términos generales, la hepcidina reduce la disponibilidad de hierro extracelular, por lo que los agonistas de hepcidina pueden ser beneficiosos en el tratamiento de la eritropoyesis ineficaz [véase, p. ej., Nemeth (2010) Adv Hematol 2010:750643]. Esta opinión está respaldada por los efectos beneficiosos del aumento de la expresión de hepcidina en un modelo de ratón de p-talasemia. [Gardenghi y col. (2010) J Clin Invest 120:4466-4477].

Uno o más complejos de heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación, opcionalmente combinados con un activador del receptor de EPO, también serían apropiados para tratar anemias de maduración desordenada de glóbulos rojos, que se caracterizan en parte por tamaño insuficiente (microcítico), sobredimensionado (glóbulos rojos macrocíticos), deformes o de color anormal (hipocrómicos).

En determinadas realizaciones, la presente divulgación proporciona procedimientos para tratar o prevenir la anemia en un individuo que lo necesite administrando al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación y un activador del receptor de EPO. En determinadas realizaciones, pueden usarse uno o más complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación en combinación con activadores del receptor de EPO para reducir la dosis requerida de estos activadores en pacientes que son susceptibles a los efectos adversos de la EPO. Estos procedimientos se pueden usar para tratamientos terapéuticos y profilácticos de un paciente.

Se pueden usar uno o más complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación en combinación con activadores del receptor de EPO para lograr un aumento en los glóbulos rojos, particularmente en intervalos de dosis más bajos de activadores del receptor de EPO. Esto puede ser beneficioso para reducir los efectos inespecíficos y riesgos conocidos asociados a dosis altas de activadores del receptor de EPO. Los efectos adversos principales de EPO incluyen, por ejemplo, un aumento excesivo de los niveles de hematocrito o hemoglobina y policitemia. Los niveles de hematocrito elevados pueden conducir a hipertensión (más particularmente a agravamiento de la hipertensión) y trombosis vascular. Otros efectos adversos de los EPO que se han descrito, algunos de los cuales se relacionan con la hipertensión, son cefalea, síndrome seudogripal, obstrucción de derivaciones, infartos de miocardio y convulsiones cerebrales debidas a trombosis, encefalopatía hipertensiva y aplasia de glóbulos rojos. Véase, p.ej., Singibarti (1994) J. Clin Investig 72(suppl 6), S36-S43; Horl y col. (2000) Nephrol Dial Transplant 15(suppl 4), 51-56; Delanty y col. (1997) Neurology 49, 686-689; y Bunn (2002) N Engl J Med 346(7), 522-523).

Siempre que los complejos heteromultímeros de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la presente divulgación actúen mediante un mecanismo diferente al de la EPO, estos antagonistas pueden ser útiles para aumentar los niveles de glóbulos rojos y hemoglobina en pacientes que no responden bien a la EPO. Por ejemplo, un complejo heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la presente divulgación puede ser beneficioso para un paciente en el que la administración de una dosis normal o aumentada de EPO (> 300 UI / kg / semana) no da como resultado el aumento del nivel de hemoglobina hasta el nivel diana. Se encuentran pacientes con una respuesta inadecuada a la EPO para todos los tipos de anemia, pero los números más altos de pacientes que no respondieron al tratamiento se ha observado con especial frecuencia en pacientes con cáncer y pacientes con nefropatía terminal. Una respuesta inadecuada a los EPO puede ser constitutiva (observada tras el primer tratamiento con EPO) o adquirida (observada tras el tratamiento repetido con EPO).

En ciertas realizaciones, la presente divulgación proporciona procedimientos para manejar a un paciente que ha sido tratado con, o es un candidato para ser tratado con, uno o más complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación midiendo uno o más parámetros hematológicos en el paciente. Los parámetros hematológicos se pueden usar para evaluar la dosis apropiada para un paciente que es candidato para ser tratado con el antagonista de la presente descripción, para supervisar los parámetros hematológicos durante el tratamiento, para evaluar si se debe ajustar la dosis durante el tratamiento con uno o más antagonistas de la descripción y/o para evaluar una dosis de mantenimiento apropiada de uno o más antagonistas de la descripción. Si uno o más de los parámetros hematológicos están fuera del nivel normal, la dosificación con uno o más complejos heteromultímeros de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación puede reducirse, retrasarse o interrumpirse.

Los parámetros hematológicos que se pueden medir según los procedimientos proporcionados en esta solicitud incluyen, por ejemplo, los niveles de glóbulos rojos, la tensión arterial, las reservas de hierro y otros agentes encontrados en los fluidos corporales que se correlacionan con niveles de glóbulos rojos aumentados, usando procedimientos reconocidos en la técnica. Tales parámetros se pueden determinar usando una muestra de sangre de un paciente. Los aumentos en los niveles de glóbulos rojos, niveles de hemoglobina o niveles de hematocrito pueden provocar aumentos en la tensión arterial.

En una realización, si uno o más parámetros hematológicos están fuera del intervalo normal o en el lado alto de lo normal en un paciente que es un candidato para ser tratado con uno o más complejos heteromultímeros de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación, luego, el inicio de la administración de uno o más complejos heteromultímeros de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación puede retrasarse hasta que los parámetros hematológicos hayan vuelto a un nivel normal o aceptable, ya sea de forma natural o mediante una intervención terapéutica. Por ejemplo, si un paciente candidato es hipertenso o prehipertenso, entonces el paciente se puede tratar con un agente hipotensor con el fin de reducir la tensión arterial del paciente. Se puede usar cualquier agente hipotensor apropiado para la afección individual del paciente, lo que incluye, por ejemplo, diuréticos, inhibidores adrenérgicos (que incluyen alfabloqueadores y betabloqueadores), vasodilatadores, bloqueadores de los canales de calcio, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ACE) o bloqueadores del receptor de angiotensina II. La tensión arterial se puede tratar alternativamente usando una pauta de dieta y ejercicio. Similarmente, si un paciente candidato tiene reservas de hierro inferiores a las normales, o en la parte baja de los valores normales, entonces, el paciente se puede tratar con una pauta apropiada de dieta y/o suplementos de hierro hasta que las reservas de hierro del paciente hayan vuelto a un nivel normal o aceptable. Para los pacientes que tienen niveles de glóbulos rojos y / o niveles de hemoglobina más altos de lo normal, la administración de uno o más complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación puede retrasarse hasta que los niveles hayan vuelto a un nivel normal o aceptable.

En ciertas realizaciones, si uno o más parámetros hematológicos están fuera del intervalo normal o en el lado alto de lo normal en un paciente que es un candidato para ser tratado con uno o más complejos heteromultímeros de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación, entonces no se puede retrasar el inicio de la administración. Sin embargo, la cantidad de dosificación o la frecuencia de dosificación de uno o más complejos heteromultímeros de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación puede establecerse en una cantidad que reduciría el riesgo de un aumento inaceptable en los parámetros hematológicos que surgen tras la administración de el uno o más complejos heteromultímeros de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación. Alternativamente, se puede desarrollar un régimen terapéutico para el paciente que combine uno o más complejos de heteromultímeros de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación con un agente terapéutico que se dirija al nivel indeseable del parámetro hematológico. Por ejemplo, si el paciente tiene presión arterial elevada, entonces puede diseñarse un régimen terapéutico que implique la administración de uno o más complejos heteromultímeros de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación y un agente reductor de la presión arterial. Para un paciente que tiene reservas de hierro inferiores a las deseadas, se puede desarrollar un régimen terapéutico de uno o más complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación y la suplementación con hierro.

En una realización, se pueden establecer parámetros de línea de base para uno o más parámetros hematológicos para un paciente que es candidato a ser tratado con uno o más complejos de heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación y un régimen de dosificación apropiado establecido para ese paciente en función de los valores de referencia. Alternativamente, los parámetros de referencia establecidos basados en el historial médico de un paciente podrían usarse para informar un régimen de dosificación apropiado para un paciente. Por ejemplo, si un paciente sano tiene una lectura de presión arterial de referencia establecida que está por encima del intervalo normal definido, puede que no sea necesario llevar la presión arterial del paciente al rango que se considera normal para la población general antes del tratamiento con uno o más complejos heteromultímeros de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación. Los valores iniciales de un paciente para uno o más parámetros hematológicos antes del tratamiento con uno o más complejos heteromultímeros de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la descripción también pueden usarse como valores comparativos relevantes para monitorear cualquier cambio en los parámetros hematológicos durante el tratamiento con el uno o más complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación.

En determinadas realizaciones, se miden uno o más parámetros hematológicos en pacientes que están siendo tratados con uno o más complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación. Los parámetros hematológicos pueden usarse para controlar al paciente durante el tratamiento y permitir el ajuste o la terminación de la dosificación con uno o más complejos de heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación o dosificación adicional con otro agente terapéutico. Por ejemplo, si la administración de uno o más complejos heteromultímeros de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación de la divulgación da como resultado un aumento de la presión arterial, el nivel de glóbulos rojos o el nivel de hemoglobina, o una reducción de las reservas de hierro, entonces la dosis de uno o más complejos heteromultiméricoss de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación puede reducirse en cantidad o frecuencia para disminuir los efectos de uno o más complejos heteromultiméricoss de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación sobre uno o más parámetros hematológicos. Si la administración de uno o más complejos heteromultímeros de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación da como resultado un cambio en uno o más parámetros hematológicos que es adverso para el paciente, entonces la dosificación de uno o más complejos heteromultiméricos de brazo único de receptores de la superfamilia de TGF-beta solo la divulgación pueden terminarse ya sea temporalmente, hasta que los parámetros hematológicos vuelvan a un nivel aceptable, o permanentemente. De manera similar, si uno o más parámetros hematológicos no se ponen dentro de un intervalo aceptable después de reducir la dosis o la frecuencia de administración de uno o más complejos de heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación, entonces la dosificación puede terminar. Como alternativa, o además de reducir o terminar la dosificación con uno o más complejos de heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación, el paciente puede recibir una dosis de un agente terapéutico adicional que aborde el nivel indeseable en el o los parámetroa hematológicos, tales como, por ejemplo, un agente reductor de la presión arterial o un suplemento de hierro. Por ejemplo, si un paciente que está siendo tratado con uno o más complejos de heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación tiene presión arterial elevada, entonces la dosificación con uno o más complejos de heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación puede continuar al mismo nivel y se agrega un agente reductor de la presión arterial al régimen de tratamiento, se puede reducir la dosificación con uno o más complejos de heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación (P.ej.,p.ej., en cantidad y / o frecuencia) y se añade un agente reductor de la presión arterial al régimen de tratamiento, o la dosificación con uno o más complejos de heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la divulgación puede terminarse y el paciente puede ser tratado con un agente reductor de la presión arterial.

6. Composiciones farmacéuticas

En ciertos aspectos, los complejos heteromultímeros de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta de la presente divulgación pueden administrarse solos o como un componente de una formulación farmacéutica (también denominada composición terapéutica o composición farmacéutica). El término formulación farmacéutica se refiere a un preparado que es de tal forma que permite que la actividad biológica de un principio activo (p. ej., un agente de la presente descripción) contenido en el mismo sea efectiva y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxico para un sujeto al que se le administraría la formulación. Los compuestos objetivo se pueden formular para administración de cualquier manera conveniente para uso en medicina humana o veterinaria. Por ejemplo, uno o más agentes de la presente descripción se pueden formular con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo farmacéuticamente aceptable se refiere a un ingrediente de una formulación farmacéutica, distinto de un principio activo, que generalmente no es tóxico para un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizante y/o conservante. En general, las formulaciones farmacéuticas para uso en la presente descripción están en una forma exenta de pirógenos fisiológicamente aceptable cuando se administran a un sujeto. Los agentes terapéuticamente útiles distintos de los descritos en esta solicitud, que pueden incluirse opcionalmente en la formulación como se describe anteriormente, pueden administrarse en combinación con los agentes objeto en los procedimientos de la presente divulgación.

En determinadas realizaciones, las composiciones se administrarán por vía parenteral [p.ej., mediante inyección intravenosa (I.V.), inyección intraarterial, inyección intraósea, inyección intramuscular, inyección intratecal, inyección subcutánea o inyección intradérmica]. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para administración parenteral pueden comprender uno o más agentes de la descripción en combinación con una o más soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas isotónicas y farmacéuticamente aceptables, o con polvos estériles que se pueden reconstituir para proporcionar soluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes del uso. Las soluciones o dispersiones inyectables pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos, agentes de suspensión, agentes espesantes o solutos que hacen la formulación isotónica con la sangre del receptor previsto. Ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que se pueden emplear en las composiciones farmacéuticas de la descripción incluyen agua, etanol, polioles (p.ej., glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, etc.), aceites vegetales (p.ej., aceite de oliva), ésteres orgánicos inyectables (p.ej., oleato de etilo), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez correcta se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de materiales de revestimiento (p.ej., lecitina), mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de las dispersiones y mediante el uso de tensioactivos.

En algunas realizaciones, un procedimiento terapéutico de la presente divulgación incluye administrar la composición farmacéutica de forma sistémica o local, desde un implante o dispositivo. Además, la composición farmacéutica se puede encapsular o inyectar en una forma para administración a un punto de tejido objetivo (p. ej., médula ósea o músculo). En ciertas realizaciones, las composiciones de la presente descripción pueden incluir una matriz capaz de administrar uno o más de los agentes de la presente descripción a un punto de tejido diana (p.ej., médula ósea o músculo), proporcionando una estructura para el tejido en desarrollo y óptimamente capaz de ser reabsorbida en el cuerpo Por ejemplo, la matriz puede proporcionar la liberación lenta de uno o más agentes de la presente descripción. Tales matrices pueden estar formadas por materiales actualmente en uso para otras aplicaciones médicas implantadas.

La elección del material de la matriz puede estar basada en uno o más de: biocompatibilidad, biodegradabilidad, propiedades mecánicas, aspecto cosmético y propiedades de la interfase. La aplicación particular de las composiciones objetivo definirá la formulación apropiada. Las matrices potenciales para las composiciones pueden ser sulfato de calcio, fosfato tricálcico, hidroxiapatita, ácido poliláctico y polianhídridos biodegradables y químicamente definidos. Otros materiales potenciales son biodegradables y están biológicamente bien definidos, lo que incluye, por ejemplo, el hueso o el colágeno dérmico. Las matrices adicionales están compuestas por proteínas puras o componentes de la matriz extracelular. Otras matrices potenciales no son biodegradables ni están químicamente definidas, lo que incluye, por ejemplo, hidroxiapatita sinterizada, biovidrio, aluminatos u otros materiales cerámicos. Las matrices pueden estar compuestas por combinaciones de cualquiera de los tipos de material mencionados anteriormente, lo que incluye, por ejemplo, ácido poliláctico e hidroxiapatita o colágeno y fosfato tricálcico. Las biocerámicas pueden estar alteradas en cuanto a la composición (p. ej., aluminato-fosfato de calcio) y procesarse para alterar uno o más de tamaño de poro, tamaño de partícula, forma de la partícula y biodegradabilidad.

En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación se pueden administrar por vía tópica. "Aplicación tópica" o "tópicamente" significa el contacto de la composición farmacéutica con las superficies corporales que incluyen, por ejemplo, la piel, las zonas de las heridas y las membranas mucosas. Las composiciones farmacéuticas tópicas pueden tener diversas formas de aplicación y típicamente comprenden una capa que contiene el fármaco, que está adaptada para colocarse cerca o en contacto directo con el tejido tras la administración tópica de la composición. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración tópica pueden comprender uno o más complejos heteromultiméricos de brazo único del receptor de la superfamilia de TGFp de la divulgación en combinación formulados como un líquido, un gel, una crema, una loción, un ungüento, una espuma, una pasta, una masilla, un semisólido o un sólido. Las composiciones en forma de líquido, gel, crema, loción, pomada, espuma, pasta o masilla se pueden aplicar extendiendo, rociando, untando, frotando o enrollando la composición sobre el tejido diana. Las composiciones también se pueden impregnar en apósitos, parches transdérmicos, tiritas y vendas estériles. Las composiciones de las formas masilla, semisólidas o sólidas pueden ser deformables. Pueden ser elásticos o no elásticos (por ejemplo, flexibles o rígidos). En ciertos aspectos, la composición forma parte de un material compuesto y puede incluir fibras, partículas o múltiples capas con la misma o diferentes composiciones.

Las composiciones tópicas en forma líquida pueden incluir soluciones, emulsiones, microemulsiones y suspensiones farmacéuticamente aceptables. Además del uno o más principios activos, las formas farmacéuticas líquidas pueden contener un diluyente inerte usado habitualmente en la técnica, lo que incluye, por ejemplo, agua u otro disolvente, un agente solubilizante y/o emulsionante [p. ej., alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol o 1,3-butilenglicol), un aceite (p. ej., aceite de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurílico, un polietilenglicol, un éster de ácido graso de sorbitano y mezclas de los mismos].

Las composiciones tópicas de gel, crema, loción, pomada, semisólidas o sólidas pueden incluir uno o más agentes espesantes, tales como un polisacárido, polímero sintético o polímero a base de proteínas. En una realización de la invención, el agente gelificante en esta invención es uno que es adecuadamente no tóxico y proporciona la viscosidad deseada. Los agentes espesantes pueden incluir polímeros, copolímeros y monómeros de: vinilpirrolidonas, metacrilamidas, acrilamidas N-vinilimidazoles, carboxivinilos, ésteres vinílicos, éteres vinílicos, siliconas, óxidos de polietileno, polietilenglicoles, vinilalcoholes, acrilatos de sodio, acrilatos, ácidos maleicos, NN-dimetilacrilamidas, diacetona acrilamidas, acrilamidas, acriloil morfolina, pluronic, colágenos, poliacrilamidas, poliacrilatos, polivinil alcoholes, polivinilenos, polivinil silicatos, poliacrilatos sustituidos con un azúcar (p. ej., sacarosa, glucosa, glucosaminas, galactosa, o lactosa), ácidos acilamidopropanosulfónicos, tetrametoxiosilicatos, metiltrimetoxiortosilicatos, tetraalcoxiorosilicatos, trialcoxiorosilicatos, glicoles, propilenglicol, glicerina, polisacáridos, alginatos, dextranos, ciclodextrina, celulosas, celulosas modificadas, celulosas oxidadas, quitosanos, quitinas, guars, carragenanos, ácidos hialurónicos, inulina, almidones, almidones modificados, agarosa, metilcelulosas, gomas vegetales, hilaronanos, hidrogeles, gelatinas, glicosaminoglicanos, carboximetilcelulosas, hidroxietilcelulosas, hidroxipropilmetilcelulosas, pectinas, pectinas bajas en metoxi, dextranos reticulados, copolímeros de injerto de almidón-acrilonitrilo, poliacrilato sódico de almidón, metacrilatos de hidroxietilo, acrilatos de hidroxil etilo, polivinileno, polietil-vinil-éteres, polimetil-metacrilatos, poliestirenos, poliuretanos, polialcanoatos, ácidos polilácticos, polilactatos, poli (3-hidroxibutirato), hidrogeles sulfonados, AMpS (ácido 2-acrilamido-2-metil-1-propanosulfónico), SEM (metacrilato de sulfoetilo), SPM (metacrilato de sulfopropilo) SPA (acrilato de sulfopropilo), N,N-dimetil-N-metacriloxietil-N- (3-sulfopropil)amonio betaina, ácido metacrílico amidopropil-dimetilamonio sulfobetaína, SPI (ácido itacónico-bis(1-propil sulfonizacida-3) éster sal de di-potasio), ácidos itacónicos, AMBC (ácido 3-acrilamido-3-metilbutanoico), acrilato de beta-carboxietilo (dímeros de ácido acrílico) y polímeros de anhídrido maleico-metilviniléter, derivados de los mismos, sales de los mismos, ácidos de los mismos y combinaciones de los mismos. En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente descripción se pueden administrar por vía oral, por ejemplo, en forma de cápsulas, obleas, píldoras, comprimidos, grageas (usando una base saborizada, tal como sucrosa y acacia o tragacanto), polvos, gránulos, una solución o una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, una emulsión líquida de aceite en agua o agua en aceite, un elixir o jarabe, o pastillas (usando una base inerte, tal como gelatina y glicerina o sucrosa y acacia) y/o un enjuague bucal, conteniendo, cada una, una cantidad predeterminada de un compuesto de la presente descripción y opcionalmente uno o más ingredientes activos distintos. Un compuesto de la presente descripción y opcionalmente uno o más principios activos distintos también se pueden administrar como un bolo, un electuario o una pasta.

En las formas farmacéuticas sólidas para administración por vía oral (p.ej., cápsulas, comprimidos, píldoras, grageas, polvos y gránulos), se pueden mezclar uno o más compuestos de la presente descripción con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables que incluyen, por ejemplo, citrato de sodio o fosfato dicálcico, una carga o un extensor (p.ej., un almidón, lactosa, sucrosa, glucosa, manitol y ácido silícico), un aglutinante (p.ej. carboximetilcelulosa, un alginato, gelatina, polivinilpirrolidona, sucrosa y acacia), un humectante (p.ej., glicerol), un agente desintegrante (p.ej., agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, un silicato y carbonato de sodio), un agente retardante de la solución (p.ej. parafina), un acelerante de la absorción (p.ej. un compuesto de amonio cuaternario) un agente humectante (p.ej., alcohol cetílico y monoestearato de glicerol), un absorbente (p.ej., arcilla de caolín y bentonita), un lubricante (p.ej., un talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato de sodio), un agente colorante y mezclas de los mismos. En el caso de cápsulas, comprimidos y pastillas, la formulación (composición) farmacéutica (composición) también puede comprender un agente tamponador. Las composiciones sólidas de tipo similar también se pueden emplear como cargas en cápsulas de gelatina duras y blandas usando uno o más excipientes que incluyen, p. ej., lactosa o un glúcido de la leche, así como un polietilenglicol de peso molecular alto.

Las formas farmacéuticas líquidas para administración oral de la composición farmacéutica incluyen emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además del uno o más principios activos, las formas farmacéuticas líquidas pueden contener un diluyente inerte usado habitualmente en la técnica, lo que incluye, por ejemplo, agua u otro disolvente, un agente solubilizante y/o emulsionante [p. ej., alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol o 1,3-butilenglicol), un aceite (p. ej., aceite de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurílico, un polietilenglicol, un éster de ácido graso de sorbitano y mezclas de los mismos]. Además de los diluyentes inertes, la formulación oral también puede incluir un adyuvante, lo que incluye, por ejemplo, un agente humectante, un agente emulsionante y de suspensión, un agente edulcorante, un agente saborizante, un agente colorante, un perfume, un agente conservante y combinaciones de los mismos.

Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden contener agentes de suspensión que incluyen, por ejemplo, alcoholes isoestearílicos etoxilados, polioxietileno sorbitol, un éster de sorbitano, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar, tragacanto y mezclas de los mismos.

La prevención de la acción y/o el crecimiento de microorganismos se puede garantizar mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos que incluyen, por ejemplo, parabeno, clorobutanol y ácido fenol sórbico.

En ciertas realizaciones, puede ser deseable incluir un agente isotónico, lo que incluye, por ejemplo, un glúcido o cloruro de sodio, en las composiciones. Además, la absorción prolongada de una forma farmacéutica inyectable se puede lograr mediante la inclusión de un agente que retarda la absorción, lo que incluye, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Se entiende que la pauta posológica será determinada por el médico responsable del tratamiento considerando diversos factores que modifican la acción del uno o más agentes de la presente descripción. En el caso de un complejo heteromultímero de brazo único del receptor de la superfamilia de TGF-beta que promueve la formación de glóbulos rojos, varios factores pueden incluir, entre otros, el recuento de glóbulos rojos del paciente, el nivel de hemoglobina, el recuento de glóbulos rojos deseado, la edad del paciente, el sexo del paciente, la dieta del paciente, la gravedad de cualquier enfermedad que pueda estar contribuyendo a una disminución del nivel de glóbulos rojos, el momento de la administración y otros factores clínicos. La adición de otros agentes activos conocidos a la composición final también puede afectar a la dosis. El progreso se puede supervisar mediante la evaluación periódica de uno o más de los niveles de glóbulos rojos, los niveles de hemoglobina, los niveles de reticulocitos y otros indicadores del procedimiento hematopoyético.

En ciertas realizaciones, la presente descripción también proporciona genoterapia para la producción in vivo de uno o más de los agentes de la presente descripción. Tal terapia conseguiría su efecto terapéutico mediante la introducción de las secuencias de agentes en células o tejidos que tienen los trastornos enumerados anteriormente. La administración de las secuencias de agentes se puede conseguir, por ejemplo, usando un vector de expresión recombinante tal como un virus quimérico o un sistema de dispersión coloidal. La administración terapéutica preferida de una o más de las secuencias de agentes de la descripción es el uso de liposomas dirigidos.

Diversos vectores víricos que se pueden utilizar para genoterapia como se enseña en esta solicitud incluyen adenovirus, virus del herpes, vacunas o un virus de ARN (p. ej., un retrovirus). El vector retrovírico puede ser un derivado de un retrovirus murino o aviar. Los ejemplos de vectores retrovíricos en los que se puede insertar un único gen extraño incluyen, pero no se limitan a: virus de la leucemia murina de Moloney (MoMuLV), virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), virus del tumor mamario murino (MuMTV) y virus del sarcoma de Rous (RSV). Diversos vectores retrovíricos adicionales pueden incorporar múltiples genes. Todos estos vectores pueden transferir o incorporar un gen para un marcador seleccionable de manera que las células transducidas se puedan identificar y generar. Los vectores retrovíricos se pueden hacer específicos de la diana fijando, por ejemplo, un glúcido, un glucolípido o una proteína. El direccionamiento preferido se logra usando un anticuerpo. Los expertos en la materia reconocerán que se pueden insertar secuencias de polinucleótidos específicas en el genoma retrovírico o fijar a una envoltura vírica para permitir la administración específica a la diana del vector retrovírico que contiene uno o más de los agentes de la presente descripción.

Alternativamente, se pueden transfectar directamente células de cultivo tisular con plásmidos que codifican genes estructurales retrovíricos (gaga, pol y env) mediante transfección con fosfato de calcio convencional. Estas células se transfectan a continuación con el plásmido vector que contiene los genes de interés. Las células resultantes liberan el vector retrovírico en el medio de cultivo.

Otro sistema de administración dirigida para uno o más de los agentes de la presente descripción es un sistema de dispersión coloidal. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen, por ejemplo, complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, esferas y sistemas a base de lípidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. En ciertas realizaciones, el sistema coloidal preferido de esta descripción es un liposoma. Los liposomas son vesículas de membrana artificiales que son útiles como vehículos de administración in vitro e in vivo. El ARN, el ADN y los viriones intactos se pueden encapsular dentro del interior acuoso y entregarse a las células en una forma biológicamente activa. Véase, por ejemplo, Fraley, y col. (1981) Trends Biochem. Sci., 6:77. Los procedimientos para la transferencia genética eficiente usando un vehículo liposómico se conocen en la técnica, Véase, p.ej., Mannino, y col. (1988) Biotechniques, 6:682, 1988.

La composición del liposoma normalmente es una combinación de fosfolípidos, que puede incluir un esteroide (p. ej.colesterol). Las características físicas de los liposomas dependen del pH, la fuerza iónica y la presencia de cationes divalentes. También se pueden usar otros fosfolípidos u otros lípidos, que incluyen, por ejemplo, un compuesto de fosfatidilo (p. ej., fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingolípido, cerebrósido o un gangliósido), fosfatidilcolina de huevo, dipalmitoilfosfatidilcolina y diestearoilfosfatidilcolina. El direccionamiento de liposomas se conoce en la técnica y también es posible en función de, por ejemplo, la especificidad para órganos, la especificidad para células y la especificidad para orgánulos.

EJEMPLIFICACIÓN

Habiéndose descrito ahora la invención de forma general, se entenderá más fácilmente con referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen simplemente con fines ilustrativos de determinadas realizaciones de la presente invención, y no pretenden limitar la invención.

Ejemplo 1. Generación y caracterización de un heterodímero de ActRIIB-Fc de brazo único

Los solicitantes construyeron un complejo heterodimérico de ActRIIB-Fc de brazo único soluble que comprende un polipéptido Fc monomérico con una extensión N-terminal corta y un segundo polipéptido en el que el dominio extracelular de ActRIIB humano se fusionó a un dominio Fc separado con un enlazador posicionado entre el dominio extracelular y este segundo dominio Fc. Las construcciones individuales se denominan polipéptido Fc monomérico y polipéptido de fusión ActRIIB-Fc, respectivamente, y las secuencias para cada una se proporcionan a continuación. Una metodología para promover la formación de complejos heteroméricos ActRIIB-Fc:Fc en lugar de complejos homodiméricos ActRIIB-Fc:ActRNB-Fc o Fc:Fc es introducir alteraciones en la secuencia de aminoácidos de los dominios Fc para guiar la formación de complejos heteroméricos asimétricos. En esta descripción se describen muchas estrategias diferentes para hacer pares de interacción asimétrica usando dominios Fc.

En una estrategia, ilustrada en las secuencias de polipéptidos ActRIIB-Fc y Fc monomérico de SEQ ID NOs: 104-106 y 137-139, respectivamente, un dominio Fc se altera para introducir aminoácidos catiónicos en la cara de interacción, mientras que el otro dominio Fc se modifica para introducir aminoácidos aniónicos en la cara de interacción. El polipéptido de fusión ActRIIB-Fc y el polipéptido Fc monomérico emplean cada uno el activador de plasminógeno tisular (TPA) líder: MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (SEQ ID NO: 100).

La secuencia del polipéptido ActRIIB-Fc (SEQ ID NO: 104) se muestra a continuación:

1 MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SPGASGRGEA ETRECIYYNA NWELERTNQS

51 GLERCEGEQD KRLHCYASWR NSSGTIELVK KGCWLDDFNC YDRQECVATE

101 ENPQVYFCCC EGNFCNERFT HLPEAGGPEV TYEPPPTAPT GGGTHTCPPC

151 PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCWVDVSHE DPEVKFNWYV

201 DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP

251 APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRKEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV

301 EWESNGQPEN NYKTTPPVLK SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH

351 EALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO: 104)

La secuencia líder (señal) y el enlazador están subrayados. Para promover la formación del heterodímero ActRIIB-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos (ActRNB-Fc:ActRNB-Fc o Fc:Fc), se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando aminoácidos ácidos con lisina) en el dominio Fc de la proteína de fusión ActRIIB como se indica por el doble subrayado anterior. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 104 se puede proporcionar opcionalmente con la lisina (K) de extremo C eliminada.

Este polipéptido de fusión ActRIIB-Fc está codificado por la siguiente secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 105):

1 ATGGATGCAA TGAAGAGAGG GCTCTGCTGT GTGCTGCTGC TGTGTGGAGC

51 AGTCTTCGTT TCGCCCGGCG CCTCTGGGCG TGGGGAGGCT GAGACACGGG

101 AGTGCATCTA CTACAACGCC AACTGGGAGC TGGAGCGCAC CAACCAGAGC

151 GGCCTGGAGC GCTGCGAAGG CGAGCAGGAC AAGCGGCTGC ACTGCTACGC

201 CTCCTGGCGC AACAGCTCTG GCACCATCGA GCTCGTGAAG AAGGGCTGCT

251 GGCTAGATGA CTTCAACTGC TACGATAGGC AGGAGTGTGT GGCCACTGAG

301 GAGAACCCCC AGGTGTACTT CTGCTGCTGT GAAGGCAACT TCTGCAACGA

351 GCGCTTCACT CATTTGCCAG AGGCTGGGGG CCCGGAAGTC ACGTACGAGC

401 CACCCCCGAC AGCCCCCACC GGTGGTGGAA CTCACACATG CCCACCGTGC

451 CCAGCACCTG AACTCCTGGG GGGACCGTCA GTCTTCCTCT TCCCCCCAAA

501 ACCCAAGGAC ACCCTCATGA TCTCCCGGAC CCCTGAGGTC ACATGCGTGG

551 TGGTGGACGT GAGCCACGAA GACCCTGAGG TCAAGTTCAA CTGGTACGTG

601 GACGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA AAGCCGCGGG AGGAGCAGTA

651 CAACAGCACG TACCGTGTGG TCAGCGTCCT CACCGTCCTG CACCAGGACT

701 GGCTGAATGG CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG TCTCCAACAA AGCCCTCCCA

751 GCCCCCATCG AGAAAAC CAT CTCCAAAGCC AAAGGGCAGC CCCGAGAACC

801 ACAGGTGTAC ACCCTGCCCC CATCCCGGAA GGAGATGACC AAGAACCAGG

851 TCAGCCTGAC CTGCCTGGTC AAAGGCTTCT ATCCCAGCGA CATCGCCGTG

901 GAGTGGGAGA GCAATGGGCA GCCGGAGAAC AACTACAAGA CCACGCCTCC

951 CGTGCTGAAG TCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTATAGCAAG CTCACCGTGG

1001 ACAAGAGCAG GTGGCAGCAG GGGAACGTCT TCTCATGCTC CGTGATGCAT

1051 GAGGCTCTGC ACAACCACTA CACGCAGAAG AGCCTCTCCC TGTCTCCGGG

1101 TAAA (SEQ ID NO: 105)

El polipéptido de fusión ActRIIB-Fc maduro (SEQ ID NO: 106) es el siguiente y opcionalmente se puede proporcionar con la lisina de extremo C eliminada.

1 GRGEAETREC IYYNANWELE RTNQSGLERC EGEQDKRLHC YASWRNSSGT

51 IELVKKGCWL DDFNCYDRQE CVATEENPQV YFCCCEGNFC NERFTHLPEA

101 GGPEVTYEPP PTAPTGGGTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS

151 RTPEVTCVW DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRWS

201 VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS

251 RKEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLKSDGSF

301 FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK

(SEQ ID NO: 106)

El polipéptido G1Fc humano complementario (SEQ ID NO: 137) emplea el líder TPA y es el siguiente:

1 MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SPGASNTKVD KRVTGGGTHT CPPCPAPELL

51 GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCWVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH

101 NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT

151 ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG

201 QPENNYDTTP PVLDSDGSFF LYSDLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH

251 YTQKSLSLSP GK (SEQ ID NO: 137)

La secuencia líder está subrayada, y una extensión de extremo N opcional del polipéptido Fc se indica mediante doble subrayado. Para promover la formación del heterodímero ActRIIB-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando lisinas con residuos aniónicos) en el polipéptido Fc monomérico como se indica por el doble subrayado anterior. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28. 137 puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada. Este polipéptido Fc complementario se codifica por el siguiente ácido nucleico (SEQ ID NO:138).

1 ATGGATGCAA TGAAGAGAGG GCTCTGCTGT GTGCTGCTGC TGTGTGGAGC

51 AGTCTTCGTT TCGCCCGGCG CCAGCAACAC CAAGGTGGAC AAGAGAGTTA

101 CCGGTGGTGG AACTCACACA TGCCCACCGT GCCCAGCACC TGAACTCCTG

151 GGGGGACCGT CAGTCTTCCT CTTCCCCCCA AAACCCAAGG ACACCCTCAT

201 GATCTCCCGG ACCCCTGAGG TCACATGCGT GGTGGTGGAC GTGAGCCACG

251 AAGACCCTGA GGTCAAGTTC AACTGGTACG TGGACGGCGT GGAGGTGCAT

301 AATGCCAAGA CAAAGCCGCG GGAGGAGCAG TACAACAGCA CGTACCGTGT

351 GGTCAGCGTC CTCACCGTCC TGCACCAGGA CTGGCTGAAT GGCAAGGAGT

401 ACAAGTGCAA GGTCTCCAAC AAAGCCCTCC CAGCCCCCAT CGAGAAAACC

451 ATCTCCAAAG CCAAAGGGCA GCCCCGAGAA CCACAGGTGT ACACCCTGCC

501 CCCATCCCGG GAGGAGATGA CCAAGAACCA GGTCAGCCTG ACCTGCCTGG

551 TCAAAGGCTT CTATCCCAGC GACATCGCCG TGGAGTGGGA GAGCAATGGG

601 CAGCCGGAGA ACAACTACGA CACCACGCCT CCCGTGCTGG ACTCCGACGG

651 CTCCTTCTTC CTCTATAGCG ACCTCACCGT GGACAAGAGC AGGTGGCAGC

701 AGGGGAACGT CTTCTCATGC TCCGTGATGC ATGAGGCTCT GCACAACCAC

751 TACACGCAGA AGAGCCTCTC CCTGTCTCCG GGTAAA

(SEQ ID NO: 138)

La secuencia del polipéptido Fc monomérico maduro es la siguiente (SEQ ID NO: 139) y puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

1 SNTKVDKRVT GGGTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV

51 TCWVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL

101 HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT

151 KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYDTTPPVLD SDGSFFLYSD

201 LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK

(SEQ ID NO::139)

El polipéptido de fusión ActRIIB-Fc y el polipéptido Fc monomérico de SEQ ID NO: 106 y SEQ ID NO: 139, respectivamente, pueden coexpresarse y purificarse a partir de una línea celular CHO para dar lugar a un complejo proteico heteromérico de brazo único que comprende ActRIIB-Fc:Fc..

En otro estrategia para promover la formación de complejos heteromultiméricoss usando polipéptidos de fusión Fc asimétricos, los dominios Fc se alteran para introducir interacciones hidrofóbicas complementarias y un enlace disulfuro intermolecular adicional, como se ilustra en las secuencias de polipéptidos ActRIIB-Fc y Fc monomérico de SEQ ID NO: 403-404 y 425-426, respectivamente.

La secuencia del polipéptido ActRIIB-Fc (SEQ ID NO: 403) emplea el líder TPA y se muestra a continuación:

1 MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SPGASGRGEA ETRECIYYNA NWELERTNQS

51 GLERCEGEQD KRLHCYASWR NSSGTIELVK KGCWLDDFNC YDRQECVATE

101 ENPQVYFCCC EGNFCNERFT HLPEAGGPEV TYEPPPTAPT GGGTHTCPPC

151 PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCWVDVSHE DPEVKFNWYV

201 DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP

251 APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPP^REEMT KNQVSLWCLV KGFYPSDIAV

301 EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH

351 EALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO: 403)

La secuencia líder y el enlazador están subrayados. Para promover la formación del heterodímero ActRIIB-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando una serina con una cisteína y una treonina con un triptófano) en el dominio Fc de la proteína de fusión como se indica por el doble subrayado anterior. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28. 403 puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

El polipéptido de fusión ActRIIB-Fc maduro es el siguiente:

1 GRGEAETREC IYYNANWELE RTNQSGLERC EGEQDKRLHC YASWRNSSGT

51 IELVKKGCWL DDFNCYDRQE CVATEENPQV YFCCCEGNFC NERFTHLPEA

101 GGPEVTYEPP PTAPTGGGTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS

151 RTPEVTCVW DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRWS

201 VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPC

251 REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF

301 FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK

(SEQ ID NO: 404)

La forma complementaria del polipéptido Fc monomérico (SEQ ID NO: 425) usa el líder TPA y es como sigue.

1 MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SPGASNTKVD KRVTGGGTHT CPPCPAPELL

51 GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH

101 NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT

151 ISKAKGQPRE PQVCTLPPSR EEMTKNQVSL SCAVKGFYPS DIAVEWESNG

201 QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH

251 YTQKSLSLSP GK (SEQ ID NO: 425)

La secuencia líder está subrayada, y una extensión de extremo N opcional del polipéptido Fc se indica mediante doble subrayado. Para promover la formación del heterodímero ActRIIB-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir cuatro sustituciones de aminoácidos en el polipéptido Fc monomérico como se indica por el doble subrayado anterior. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28. 425 puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

La secuencia del polipéptido Fc monomérico maduro (SEQ ID NO: 426) es como sigue y puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

1 SNTKVDKRVT GGGTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV

51 TCVWDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL

101 HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSREEMT

151 KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLVSK

201 LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK

(SEQ ID NO::426)

El polipéptido de fusión de ActRIIB-Fc y el polipéptido Fc monomérico de SEQ ID NO: 404 y SEQ ID NO: 426, respectivamente, pueden coexpresarse y purificarse a partir de una línea celular CHO para dar lugar a un complejo proteico heteromérico de brazo único que comprende ActRIIB-Fc:Fc.

La purificación de varios complejos ActRIIB-Fc:Fc se podría conseguir mediante una serie de etapas de cromatografía en columna, que incluyen, por ejemplo, tres o más de las siguientes, en cualquier orden: cromatografía en columna de proteína A, cromatografía en columna de Q sefarosa, cromatografía en columna de fenilsefarosa, cromatografía de exclusión molecular y cromatografía de intercambio catiónico. La purificación se podría completar con filtración vírica e intercambio de tampón.

Se usó un ensayo de unión basado en Biacore™ para comparar la selectividad de unión del ligando del complejo heterodimérico ActRIIB-Fc de brazo único descrito anteriormente con la del complejo homodimérico ActRIIB-Fc. ActRIIB-Fc de brazo único y ActRIIB-Fc homodimérico se capturaron independientemente en el sistema usando un anticuerpo anti-Fc. Los ligandos se inyectaron y fluyeron sobre las proteínas del receptor capturadas. Los resultados se resumen en la siguiente tabla, en la que tasas de desviación (kd) típicamente asociadas con las trampas de ligando más efectivas se indican mediante sombreado gris.

Estos datos de unión comparativos demuestran que ActRIIB-Fc de brazo único tiene una mayor selectividad de ligando que ActRIIB-Fc homodimérico. Mientras que el homodímero de ActRIIB-Fc se une fuertemente a cinco ligandos importantes (ver el grupo de activina A, activina B, BMP 10, GDF8 y GDF11 en la Figura 6), ActRIIB-Fc de brazo único discrimina más fácilmente entre estos ligandos. Por lo tanto, ActRIIB-Fc de brazo único se une fuertemente a la activina B y GDF11 y con una fuerza intermedia a GDF8 y activina A. En contraste con el homodímero de ActRIIB-Fc, ActRIIB-Fc de brazo único muestra solo una unión débil a BMP10 y ninguna unión a BMP9. Véase la figura 6,

Estos resultados indican que ActRIIB-Fc de brazo único es un antagonista más selectivo que el homodímero de ActRIIB-Fc. Por consiguiente, ActRIIB-Fc de brazo único será más útil que el homodímero de ActRIIB-Fc en ciertas aplicaciones donde tal antagonismo selectivo es ventajoso. Los ejemplos incluyen aplicaciones terapéuticas en las que es deseable retener el antagonismo de una o más de activina A, activina B, GDF8 y GDF11 excepto minimizar el antagonismo de una o más de BMP9, BMP10, BMP6 y GDF3. La inhibición selectiva de ligandos en el primer grupo sería especialmente ventajosa desde el punto de vista terapéutico porque constituyen una subfamilia que tiende a diferir funcionalmente del último grupo y su conjunto asociado de condiciones clínicas.

Ejemplo 2. Generación y caracterización de un heterodímero de ALK3-Fc de brazo único

Los solicitantes construyeron un complejo heterodimérico de ALK3-Fc de brazo único soluble que comprende un polipéptido Fc monomérico con una extensión de extremo N corta y un segundo polipéptido en el que el dominio extracelular de ALK3 humano se fusionó a un dominio Fc separado con un enlazador posicionado entre el dominio extracelular y este segundo dominio Fc. Las construcciones individuales se denominan polipéptido Fc monomérico y polipéptido de fusión ALK3-Fc, respectivamente, y las secuencias para cada una se proporcionan a continuación. La formación de un heterodímero ALK3-Fc de brazo único puede ser guiada por estrategias similares a las descritas para el heterodímero ActRIIB-Fc de brazo único en el Ejemplo 1. En una primera estrategia, ilustrada en las secuencias de polipéptidos ALK3-Fc y Fc monomérico de SEQ ID NOs: 122-124 y 140-142, respectivamente, se altera un dominio Fc para introducir aminoácidos catiónicos en la cara de interacción, mientras que el otro dominio Fc se altera para introducir aminoácidos aniónicos en la cara de interacción.

El polipéptido de fusión ALK3-Fc emplea el líder TPA y es el siguiente:

1 MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SPGAQNLDSM LHGTGMKSDS DQKKSENGVT

51 LAPEDTLPFL KCYCSGHCPD DAINNTCITN GHCFAIIEED DQGETTLASG

101 CMKYEGSDFQ CKDSPKAQLR RTIECCRTNL CNQYLQPTLP PWIGPFFDG

151 SIRTGGGTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCWVD

201 VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN

251 GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL

301 TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYDTTP PVLDSDGSFF LYSDLTVDKS

351 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP G (SEQ ID NO: 122)

Las secuencia líder y del enlazador están subrayadas. Para promover la formación del heterodímero ALK3-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos (ALK3-Fc:ALK3-Fc o Fc:Fc), se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando lisinas con aminoácidos aniónicos) en el dominio Fc de la proteína de fusión como se indica por el doble subrayado anterior. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 122 se puede proporcionar opcionalmente con una lisina añadida en el extremo C.

Este polipéptido de fusión ALK3-Fc se codifica por el siguiente ácido nucleico (SEQ ID NO:123).

1 ATGGATGCAA TGAAGAGAGG GCTCTGCTGT GTGCTGCTGC TGTGTGGAGC

51 AGTCTTCGTT TCGCCCGGCG CCCAGAATCT GGATAGTATG CTTCATGGCA

101 CTGGGATGAA ATCAGACTCC GACCAGAAAA AGTCAGAAAA TGGAGTAACC

151 TTAGCACCAG AGGATACCTT GCCTTTTTTA AAGTGCTATT GCTCAGGGCA

201 CTGTCCAGAT GATGCTATTA ATAACACAT G CATAACTAAT GGACATTGCT

ZOJC11

-A-A.A.CCACATT 7\/~,/'"T1prp1/'-<7\ X r_j* rK_j* rK*_j

301 TGTATGAAAT ATGAAGGATC TGATTTTCAG TGCAAAGATT CTCCAAAAGC

351 CCAGCTACGC CGGACAATAG AATGTTGTCG GACCAATTTA TGTAACCAGT

401 ATTTGCAACC CACACTGCCC CCTGTTGTCA TAGGTCCGTT TTTTGATGGC

451 AGCATTCGAA CCGGTGGTGG AACTCACACA TGCCCACCGT GCCCAGCACC

501 TGAACTCCTG GGGGGACCGT CAGTCTTCCT CTTCCCCCCA AAACCCAAGG

551 ACACCCTCAT GATCTCCCGG ACCCCTGAGG TCACATGCGT GGTGGTGGAC

601 GTGAGCCACG AAGACCCTGA GGTCAAGTTC AACTGGTACG TGGACGGCGT

651 GGAGGTGCAT AATGCCAAGA CAAAGCCGCG GGAGGAGCAG TACAACAGCA

701 CGTACCGTGT GGTCAGCGTC CTCACCGTCC TGCACCAGGA CTGGCTGAAT

751 GGCAAGGAGT ACAAGTGCAA GGTCTCCAAC AAAGCCCTCC CAGCCCCCAT

801 CGAGAAAAC C ATCTCCAAAG CCAAAGGGCA GCCCCGAGAA CCACAGGTGT

851 ACACCCTGCC CCCATCCCGG GAGGAGATGA CCAAGAACCA GGTCAGCCTG

901 ACCTGCCTGG TCAAAGGCTT CTATCCCAGC GACATCGCCG TGGAGTGGGA

951 GAGCAATGGG CAGCCGGAGA ACAACTACGA CACCACGCCT CCCGTGCTGG

1001 ACTCCGACGG CTCCTTCTTC CTCTATAGCG ACCTCACCGT GGACAAGAGC

1051 AGGTGGCAGC AGGGGAACGT CTTCTCATGC TCCGTGATGC ATGAGGCTCT

1101 GCACAACCAC TACACGCAGA AGAGCCTCTC CCTGTCTCCG GGT

(SEQ ID NO: 123)

La secuencia del polipéptido de fusión ALK3-Fc madura es la siguiente (SEQ ID NO: 124) y opcionalmente se puede proporcionar con una lisina añadida en el extremo C.

1 GAQNLDSMLH GTGMKSDSDQ KKSENGVTLA PEDTLPFLKC YCSGHCPDDA

51 INNTCITNGH CFAIIEEDDQ GETTLASGCM KYEGSDFQCK DSPKAQLRRT

101 IECCRTNLCN QYLQPTLPPV VIGPFFDGSI RTGGGTHTCP PCPAPELLGG

151 PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVWDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA

201 KTKPREEQYN STYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS

251 KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP

301 ENNYDTTPPV LDSDGSFFLY SDLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT

351 QKSLSLSPG (SEQ ID NO: 124)

El polipéptido G1Fc humano complementario (SEQ ID NO: 140) emplea el líder TPA y es el siguiente:

1 MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SPGASNTKVD KRVTGGGTHT CPPCPAPELL

51 GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCWVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH

101 NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT

151 ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR KEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG

201 QPENNYKTTP PVLKSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH

251 YTQKSLSLSP GK (SEQ :ID NO: 140)

La secuencia líder está subrayada, y una extensión de extremo N opcional del polipéptido Fc se indica mediante doble subrayado. Para promover la formación del heterodímero ALK3-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando residuos aniónicos con lisinas) en el polipéptido Fc monomérico como se indica por el doble subrayado anterior. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:140 puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

Este polipéptido se codifica por la siguiente secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO:141).

1 ATGGATGCAA TGAAGAGAGG GCTCTGCTGT GTGCTGCTGC TGTGTGGAGC

51 AGTCTTCGTT TCGCCCGGCG CCAGCAACAC CAAGGTGGAC AAGAGAG TTA

101 CCGGTGGTGG AACTCACACA TGCCCACCGT GCCCAGCACC TGAACTCCTG

151 GGGGGACCGT CAGTCTTCCT CTTCCCCCCA AAACCCAAGG ACACCCTCAT

201 GATCTCCCGG ACCCCTGAGG TCACATGCGT GGTGGTGGAC GTGAGCCACG

251 AAGACCCTGA GGTCAAGTTC AACTGGTACG TGGACGGCGT GGAGGTGCAT

301 AATGCCAAGA CAAAGCCGCG GGAGGAGCAG TACAACAGCA CGTACCGTGT

351 GGTCAGCGTC CTCACCGTCC TGCACCAGGA CTGGCTGAAT GGCAAGGAGT

401 ACAAGTGCAA GGTCTCCAAC AAAGCCCTCC CAGCCCCCAT CGAGAAAACC

451 ATCTCCAAAG CCAAAGGGCA GCCCCGAGAA CCACAGGTGT ACACCCTGCC

501 CCCATCCCGG AAGGAGATGA CCAAGAACCA GGTCAGCCTG ACCTGCCTGG

551 TCAAAGGCTT CTATCCCAGC GACATCGCCG TGGAGTGGGA GAGCAATGGG

601 CAGCCGGAGA ACAACTACAA GACCACGCCT CCCGTGCTGA AGTCCGACGG

651 CTCCTTCTTC CTCTATAGCA AGCTCACCGT GGACAAGAGC AGGTGGCAGC

701 AGGGGAACGT CTTCTCATGC TCCGTGATGC ATGAGGCTCT GCACAACCAC

751 TACACGCAGA AGAGCCTCTC CCTGTCTCCG GGTAAA

(SEQ ID NO: 141)

La secuencia del polipéptido Fc monomérico maduro es la siguiente (SEQ ID NO: 142) y puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

1 SNTKVDKRVT GGGTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV

51 TCVWDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL

101 HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRKEMT

151 KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLK SDGSFFLYSK

201 LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK

(SEQ ID NO: 142)

El polipéptido de fusión de ALK3-Fc y el polipéptido Fc monomérico de SEQ ID NO: 124 y SEQ ID NO: 142, respectivamente, pueden coexpresarse y purificarse a partir de una línea celular CHO para dar lugar a un complejo proteico heteromérico de brazo único que comprende ALK3-Fc:Fc.

En otro estrategia para promover la formación de complejos heteromultiméricoss usando polipéptidos de fusión Fc asimétricos, los dominios Fc se alteran para introducir interacciones hidrofóbicas complementarias y un enlace disulfuro intermolecular adicional, como se ilustra en las secuencias de polipéptidos ALK3-Fc y Fc de SEQ ID NO: 415-416 y 427-428, respectivamente.

El polipéptido de fusión ALK3-Fc (SEQ ID NO: 415) usa el líder TPA y es el siguiente:

1 MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SPGAQNLDSM LHGTGMKSDS DQKKSENGVT

51 LAPEDTLPFL KCYCSGHCPD DAINNTCITN GHCFAIIEED DQGETTLASG

101 CMKYEGSDFQ CKDSPKAQLR RTIECCRTNL CNQYLQPTLP PWIGPFFDG

151 SIRTGGGTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCWVD

201 VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN

251 GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVCTLPPSR EEMTKNQVSL

301 SCAVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LVSKLTVDKS

351 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK (SEQ ID NO: 415)

La secuencia líder y el enlazador están subrayados. Para promover la formación del heterodímero ALK3-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir cuatro sustituciones de aminoácidos en el dominio Fc del polipéptido de fusión ALK3 como se indica por el doble subrayado anterior. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:415 puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

El polipéptido de fusión ALK3-Fc maduro (SEQ ID NO: 416) es como sigue y puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

1 GAQNLDSMLH GTGMKSDSDQ KKSENGVTLA PEDTLPFLKC YCSGHCPDDA

51 INNTCITNGH CFAIIEEDDQ GETTLASGCM KYEGSDFQCK DSPKAQLRRT

101 IECCRTNLCN QYLQPTLPPV VIGPFFDGSI RTGGGTHTCP PCPAPELLGG

151 PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCWVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA

201 KTKPREEQYN STYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS

251 KAKGQPREPQ VCTLPPSREE MTKNQVSLSC AVKGFYPSDI AVEWESNGQP

301 ENNYKTTPPV LDSDGSFFLV SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT

351 QKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 416)

La forma complementaria del polipéptido G1Fc monomérico (SEQ ID NO: 427) emplea el líder TPA y es la siguiente:

1 MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SPGASNTKVD KRVTGGGTHT CPPCPAPELL

51 GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCWVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH

101 NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT

151 ISKAKGQPRE PQVYTLPPCR EEMTKNQVSL WCLVKGFYPS DIAVEWESNG

201 QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH

251 YTQKSLSLSP GK (SEQ ID NO::427)

La secuencia líder está subrayada, y una extensión de extremo N opcional del polipéptido Fc se indica mediante doble subrayado. Para promover la formación del heterodímero ALK3-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando una serina con una cisteína y una treonina con un triptófano) en el polipéptido Fc monomérico como se indica por el doble subrayado anterior. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID ⁿO:427 puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

La secuencia del polipéptido Fc monomérico maduro es la siguiente (SEQ ID NO: 428) y puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

1 SNTKVDKRVT GGGTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV

51 TCVWDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL

101 HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPCREEMT

151 KNQVSLWCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK

201 LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK

(SEQ ID NO::428)

El polipéptido de fusión de ALK3-Fc y el polipéptido Fc monomérico de SEQ ID NO: 416 y SEQ ID NO: 428, respectivamente, pueden coexpresarse y purificarse a partir de una línea celular CHO para dar lugar a un complejo heteromérico de brazo único que comprende ALK3-Fc:Fc.

La purificación de varios complejos ALK3-Fc:Fc se podría conseguir mediante una serie de etapas de cromatografía en columna, que incluyen, por ejemplo, tres o más de las siguientes, en cualquier orden: cromatografía de proteína A, cromatografía de Q Sefarosa, cromatografía de fenilsefarosa, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio catiónico. La purificación se podría completar con filtración vírica e intercambio de tampón.

Se usó un ensayo de unión basado en Biacore™ para comparar la selectividad de unión del ligando del complejo heterodimérico ALK3-Fc de brazo único descrito anteriormente con la del complejo homodimérico ALK3-Fc. ALK3-Fc de brazo único y ALK3-Fc homodimérico se capturaron independientemente en el sistema usando un anticuerpo anti-Fc. Los ligandos se inyectaron y fluyeron sobre las proteínas del receptor capturadas. Los resultados se resumen en la siguiente tabla, en la que tasas de desviación (kd) típicamente asociadas con las trampas de ligando más efectivas se indican mediante sombreado gris.

Estos datos indican que ALK3-Fc de brazo único tiene una mayor selectividad de ligando que ALK3-Fc homodimérico. Mientras que el heterodímero ALK3-Fc de brazo único retiene la unión excepcionalmente estrecha a BMP4 observada con el homodímero ALK3-Fc, presenta una fuerza de unión reducida a ^b MP2 y, por lo tanto, discrimina mejor entre BMP4 y BMP2 (todavía un aglutinante fuerte) que el homodímero ALK3-Fc. ALK3-Fc de brazo único también discrimina mejor entre BMP5 (unión intermedia), GDF7 (unión débil) y GDF6 (sin unión) en comparación con el homodímero de ALK3-Fc, que se une a estos tres ligandos con una fuerza muy similar (todos intermedios). Véase la Figura 7. A diferencia de las construcciones descritas en el Ejemplo 1, ni ALK3-Fc de brazo único ni ALK3-Fc homodimérico se unen a activinas, GDF8, GDF11 o BMP10.

Por lo tanto, estos resultados indican que el ALK3-Fc de brazo único es un antagonista más selectivo de BMP4 que el homodímero de ALK3-Fc. Se puede esperar que ALK3-Fc de brazo único antagonice a BMP4 de una manera más dirigida, con efectos reducidos del antagonismo concurrente de BMP2 o BMP5 y especialmente GDF6 o GDF7, en comparación con el homodímero ALK3-Fc. Por consiguiente, ALK3-Fc de brazo único será más útil que el homodímero de ALK3-Fc en ciertas aplicaciones donde tal antagonismo selectivo es ventajoso. Los ejemplos incluyen aplicaciones terapéuticas en las que es deseable retener el antagonismo de uno o más de BMP4, BMP2 y potencialmente BMP5 en lugar de minimizar el antagonismo de uno o más de BMP6, GDF6 y GDF7.

Ejemplo 3. Generación y caracterización de un heterodímero de ActRIIA-Fc de brazo único

Los solicitantes construyeron un complejo heterodimérico de ActRIIA-Fc de brazo único soluble que comprende un polipéptido Fc monomérico con una extensión de extremo N corta y un segundo polipéptido en el que el dominio extracelular de ActRIIA humano se fusionó a un dominio Fc separado con un enlazador posicionado entre el dominio extracelular y este segundo dominio Fc. Las construcciones individuales se denominan polipéptido Fc monomérico y polipéptido de fusión ActRIIA-Fc, respectivamente, y las secuencias para cada una se proporcionan a continuación. La formación de un heterodímero de ActRIIA-Fc de brazo único puede estar guiada por estrategias similares a las descritas para el heterodímero de ActRIIB-Fc de brazo único en el Ejemplo 1. En una primera estrategia, ilustrada en las secuencias de polipéptidos de ActRIIA-Fc y Fc monomérico de las SEQ ID NO: 101-103 y 137-139, respectivamente, un dominio Fc se altera para introducir aminoácidos catiónicos en la cara de interacción, mientras que el otro dominio Fc se modifica para introducir aminoácidos aniónicos en la cara de interacción.

El polipéptido de fusión ActRIIA-Fc emplea el líder TPA y es el siguiente:

1 MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SPGAAILGRS ETQECLFFNA NWEKDRTNQT

51 GVEPCYGDKD KRRHCFATWK NISGSIEIVK QGCWLDDINC YDRTDCVEKK

101 DSPEVYFCCC EGNMCNEKFS YFPEMEVTQP TSNPVTPKPP TGGGTHTCPP

151 CPAPELLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVWDVSH EDPEVKFNWY

201 VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRWSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL

251 PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSRKEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA

301 VEWESNGQPE NNYKTTPPVL KSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM

351 HEALHNHYTQ KSLSLSPGK (SEQ ID NO: 101)

Las secuencia líder y del enlazador están subrayadas. Para promover la formación del heterodímero ActRIIA-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos (ActRIIA-Fc:ActRNA-Fc o Fc:Fc), se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando residuos aniónicos con lisinas) en el dominio Fc del polipéptido de fusión como se indica por el doble subrayado anterior. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:101 puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

Este polipéptido de fusión ActRIIA-Fc se codifica por el siguiente ácido nucleico (SEQ ID NO:102).

1 ATGGATGCAA TGAAGAGAGG GCTCTGCTGT GTGCTGCTGC TGTGTGGAGC

51 AGTCTTCGTT TCGCCCGGCG CCGCTATACT TGGTAGATCA GAAACTCAGG

101 AGTGTCTTTT CTTTAATGCT AATTGGGAAA AAGACAGAAC CAATCAAACT

151 GGTGTTGAAC CGTGTTATGG TGACAAAGAT AAACGGCGGC ATTGTTTTGC

201 TACCTGGAAG AATATTTCTG GTTCCATTGA AATAGTGAAA CAAGGTTGTT

251 GGCTGGATGA TATCAACTGC TATGACAGGA CTGATTGTGT AGAAAAAAAA

301 GACAGCCCTG AAGTATATTT CTGTTGCTGT GAGGGCAATA TGTGTAATGA

351 AAAGTTTTCT TATTTTCCGG AGATGGAAGT CACACAGCCC ACTTCAAATC

401 CAGTTACACC TAAGCCACCC ACCGGTGGTG GAACTCACAC ATGCCCACCG

451 TGCCCAGCAC CTGAACTCCT GGGGGGACCG TCAGTCTTCC TCTTCCCCCC

501 AAAACCCAAG GACACCCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACATGCG

551 TGGTGGTGGA CGTGAGCCAC GAAGACCCTG AGGTCAAGTT CAACTGGTAC

601 GTGGACGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCGC GGGAGGAGCA

651 GTACAACAGC ACGTACCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTC CTGCACCAGG

701 ACTGGCTGAA TGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGCCCTC

751 CCAGCCCCCA TCGAGAAAAC CATCTCCAAA GCCAAAGGGC AGCCCCGAGA

801 ACCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCG GAAGGAGATG ACCAAGAACC

851 AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTATCCCAG CGACATCGCC

901 GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAAC TACA AGACCACGCC

951 TCCCGTGCTG AAGTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTATAGC AAGCTCACCG

1001 TGGACAAGAG CAGGTGGCAG CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG

1051 CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC

1101 GGGTAAA (SEQ ID NO: 102)

El polipéptido de fusión ActRIIA-Fc maduro es como sigue (SEQ ID NO: 103) y puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

1 ILGRSETQEC LFFNANWEKD RTNQTGVEPC YGDKDKRRHC FATWKNISGS

51 IEIVKQGCWL DDINCYDRTD CVEKKDSPEV YFCCCEGNMC NEKFSYFPEM

101 EVTQPTSNPV TPKPPTGGGT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI

151 SRTPEVTCW VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRW

201 SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP

251 SRKEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLKSDGS

301 FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK

(SEQ ID NO:: 103)

Como se describe en el Ejemplo 1, la forma complementaria del polipéptido G1Fc humano monomérico (SEQ ID NO: 137) emplea el líder TPA e incorpora una extensión de extremo N opcional. Para promover la formación del heterodímero ActRIIA-Fc: Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando lisinas con residuos aniónicos) en el polipéptido Fc monomérico. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:137 puede proporcionarse opcionalmente sin la lisina de extremo C. Este polipéptido Fc complementario está codificado por el ácido nucleico de SEQ ID NO: 138, y el polipéptido Fc monomérico maduro (SEQ ID NO: 139) se puede proporcionar opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada. El polipéptido de fusión de ActRIIA-Fc y el polipéptido Fc monomérico de SEQ ID NO: 103 y SEQ ID NO: 139, respectivamente, pueden coexpresarse y purificarse a partir de una línea celular CHO para dar lugar a un complejo proteico heteromérico de brazo único que comprende ActRIIA-Fc:Fc.

En otra estrategia para promover la formación de complejos heteromultiméricoss usando polipéptidos de fusión Fc asimétricos, los dominios Fc se alteran para introducir interacciones hidrofóbicas complementarias y un enlace disulfuro intermolecular adicional, como se ilustra en las secuencias de polipéptidos ActRIIA-Fc y Fc de SEQ ID NO: 401-402 y 425-426, respectivamente.

El polipéptido de fusión ActRIIA-Fc (SEQ ID NO: 401) usa el líder TPA y es el siguiente:

1 MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SPGAAILGRS ETQECLFFNA NWEKDRTNQT

51 GVEPCYGDKD KRRHCFATWK NISGSIEIVK QGCWLDDINC YDRTDCVEKK

101 DSPEVYFCCC EGNMCNEKFS YFPEMEVTQP TSNPVTPKPP TGGGTHTCPP

151 CPAPELLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCWVDVSH EDPEVKFNWY

201 VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRWSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL

251 PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPCREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA

301 VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM

351 HEALHNHYTQ KSLSLSPGK (SEQ ID NO: 40:

La secuencia líder y el enlazador están subrayados. Para promover la formación del heterodímero ActRIIA-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando una serina con una cisteína y una treonina con un triptófano) en el dominio Fc del polipéptido de fusión ActARIIA como se indica por el doble subrayado anterior. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:401 puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

El polipéptido de fusión de ActRIIA-Fc maduro (SEQ ID NO: 402) es como sigue y puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

1 ILGRSETQEC LFFNANWEKD RTNQTGVEPC YGDKDKRRHC FATWKNISGS

51 IEIVKQGCWL DDINCYDRTD CVEKKDSPEV YFCCCEGNMC NEKFSYFPEM

101 EVTQPTSNPV TPKPPTGGGT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI

151 SRTPEVTCW VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRW

201 SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP

251 CREEMTKNQV SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS

301 FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK

(SEQ ID NO: 402)

Como se describe en el Ejemplo 1, la forma complementaria del polipéptido G1Fc humano monomérico (SEQ ID NO: 425) emplea el líder TPA e incorpora una extensión N opcional. Para promover la formación del heterodímero ActRIIA-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir cuatro sustituciones de aminoácidos en el polipéptido Fc monomérico como se indica. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 425 y el polipéptido G1Fc maduro (SEQ ID NO: 426) se pueden proporcionar opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

El polipéptido de fusión de ActRIIA-Fc y el polipéptido Fc monomérico de SEQ ID NO: 402 y SEQ ID NO: 426, respectivamente, pueden coexpresarse y purificarse a partir de una línea celular CHO para dar lugar a un complejo proteico heteromérico de un solo brazo que comprende ActRIIA-Fc:Fc.

La purificación de varios complejos ActRIIA-Fc:Fc se podría conseguir mediante una serie de etapas de cromatografía en columna, que incluyen, por ejemplo, tres o más de las siguientes, en cualquier orden: cromatografía de proteína A, cromatografía Q Sefarosa, cromatografía de fenilsefarosa, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio catiónico. La purificación se podría completar con filtración vírica e intercambio de tampón.

Se usó un ensayo de unión basado en Biacore™ para comparar la selectividad de unión del ligando del complejo heterodimérico ActRIIA-Fc de brazo único descrito anteriormente con la del complejo homodimérico ActRIIA-Fc. ActRIIA-Fc de brazo único y ActRIIA-Fc homodimérico se capturaron independientemente en el sistema usando un anticuerpo anti-Fc. Los ligandos se inyectaron y fluyeron sobre las proteínas del receptor capturadas. Los resultados se resumen en la siguiente tabla, en la que tasas de desviación (kd) típicamente asociadas con las trampas de ligando más efectivas se indican mediante sombreado gris.

Estos datos de unión comparativos indican que ActRIIA-Fc de brazo único tiene una selectividad de ligando diferente que ActRIIA-Fc homodimérico (y también diferente de ActRIIB-Fc de brazo único o ActRIIB-Fc homomérico - ver Ejemplo 1). Mientras que el homodímero de ActRIIA-Fc exhibe una unión preferencial a la activina B combinada con una fuerte unión a la activina A y GDF11, ActRIIA-Fc de brazo único tiene una preferencia inversa por la activina A sobre la activina B combinada con una selectividad muy mejorada para la activina A sobre GDF11 (agluitinante débil). Véase la Figura 8. Además, ActRIIA-Fc de brazo único retiene en gran medida la unión intermedia a GDF8 y BMP10 observada con el homodímero de ActRIIA-Fc.

Estos resultados indican que el heterodímero de ActRIIA-Fc de brazo único es un antagonista con una selectividad de ligando sustancialmente alterada en comparación con el homodímero de ActRIIA-Fc. Por consiguiente, ActRIIA-Fc de brazo único será más útil que el homodímero de ActRIIA-Fc en ciertas aplicaciones donde tal antagonismo es ventajoso. Los ejemplos incluyen aplicaciones terapéuticas en las que es deseable antagonizar la activina A preferentemente sobre la activina B mientras se minimiza el antagonismo de GDF11.

Juntos, los ejemplos anteriores demuestran que los polipéptidos receptores de tipo I o tipo II, cuando se colocan en el contexto de un complejo proteico heteromérico de brazo único, forman bolsas de unión novedosas que exhiben una selectividad alterada en relación con cualquier tipo de complejo proteico homomérico, lo que permite la formación de nuevos agentes proteicos para su posible uso como agentes terapéuticos.

Ejemplo 4. Generación y caracterización de un heterodímero de BMPRII-Fc de brazo único

Los solicitantes construyeron un complejo heterodimérico de BMPRII-Fc de brazo único soluble que comprende un polipéptido Fc monomérico con una extensión de extremo N corta y un segundo polipéptido en el que el dominio extracelular de BMPRII humano se fusionó a un dominio Fc separado con un enlazador posicionado entre el dominio extracelular y este segundo dominio Fc. Las construcciones individuales se denominan polipéptido Fc monomérico y polipéptido de fusión BMPRII-Fc, respectivamente, y las secuencias para cada una se proporcionan a continuación. Los solicitantes también prevén complejos heterodiméricos BMPRII-Fc de brazo único adicionales que comprenden el dominio extracelular de la isoforma A de BMPRII (SEQ ID NO: 72).

La formación de un heterodímero de BMPRII-Fc de brazo único puede estar guiada por estrategias similares a las descritas para el heterodímero de ActRIIB-Fc de brazo único en el Ejemplo 1. En una primera estrategia, ilustrada en las secuencias de polipéptidos de BMPRII-Fc y Fc monomérico de las SEQ ID NO: 107-109 y 137-139, respectivamente, un dominio Fc se altera para introducir aminoácidos catiónicos en la cara de interacción, mientras que el otro dominio Fc se modifica para introducir aminoácidos aniónicos en la cara de interacción.

El polipéptido de fusión BMPRII-Fc emplea el líder TPA y es el siguiente:

1 MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SPGASQNQER LCAFKDPYQQ DLGIGESRIS

51 HENGTILCSK GSTCYGLWEK SKGDINLVKQ GCWSHIGDPQ ECHYEECWT

101 TTPPSIQNGT YRFCCCSTDL CNVNFTENFP PPDTTPLSPP HSFNRDETGG

151 GTHTCPPCPA PELLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC WVDVSHEDP

201 EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR WSVLTVLHQ DWLNGKEYKC

251 KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSRKEMTKN QVSLTCLVKG

301 FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLKSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN

351 VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK (SEQ ID NO::107)

Las secuencia líder y del enlazador están subrayadas. Para promover la formación del heterodímero BMPRII-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos (BMPRII-Fc:BMPRII-Fc o Fc:Fc), se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando residuos aniónicos con lisinas) en el dominio Fc del polipéptido de fusión como se indica por el doble subrayado anterior. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:107 puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

Este polipéptido de fusión BMPRII-Fc se codifica por el siguiente ácido nucleico (SEQ ID NO:108).

1 ATGGATGCAA TGAAGAGAGG GCTCTGCTGT GTGCTGCTGC TGTGTGGAGC

51 AGTCTTCGTT TCGCCCGGCG CCTCGCAGAA TCAAGAACGC CTATGTGCGT

101 TTAAAGATCC GTATCAGCAA GACCTTGGGA TAGGTGAGAG TAGAATCTCT

151 CATGAAAATG GGACAATATT ATGCTCGAAA GGTAGCACCT GCTATGGCCT

201 TTGGGAGAAA TCAAAAGGGG ACATAAATCT TGTAAAACAA GGATGTTGGT

251 CTCACATTGG AGATCCCCAA GAGTGTCACT ATGAAGAATG TGTAGTAACT

301 ACCACTCCTC CCTCAATTCA GAATGGAACA TACCGTTTCT GCTGTTGTAG

351 CACAGATTTA TGTAATGTCA ACTTTACTGA GAATTTTCCA CCTCCTGACA

401 CAACACCACT CAGTCCACCT CATTCATTTA ACCGAGATGA GACCGGTGGT

451 GGAACTCACA CATGCCCACC GTGCCCAGCA CCTGAACTCC TGGGGGGACC

501 GTCAGTCTTC CTCTTCCCCC CAAAACCCAA GGACACCCTC ATGATCTCCC

551 GGACCCCTGA GGTCACATGC GTGGTGGTGG ACGTGAGCCA CGAAGACCCT

601 GAGGTCAAGT TCAACTGGTA CGTGGACGGC GTGGAGGTGC ATAATGCCAA

651 GACAAAGCCG CGGGAGGAGC AGTACAACAG CACGTACCGT GTGGTCAGCG

701 TCCTCACCGT CCTGCACCAG GACTGGCTGA ATGGCAAGGA GTACAAGTGC

751 AAGGTCTCCA ACAAAGCCCT CCCAGCCCCC ATCGAGAAAA CCATCTCCAA

801 AGCCAAAGGG CAGCCCCGAG AACCACAGGT GTACACCCTG CCCCCATCCC

851 GGAAGGAGAT GACCAAGAAC CAGGTCAGCC TGACCTGCCT GGTCAAAGGC

901 TTCTATCCCA GCGACATCGC CGTGGAGTGG GAGAGCAATG GGCAGCCGGA

951 GAACAACTAC AAGACCACGC CTCCCGTGCT GAAGTCCGAC GGCTCCTTCT

1001 TCCTCTATAG CAAGCTCACC GTGGACAAGA GCAGGTGGCA GCAGGGGAAC

1051 GTCTTCTCAT GCTCCGTGAT GCATGAGGCT CTGCACAACC ACTACACGCA

1101 GAAGAGCCTC TCCCTGTCTC CGGGTAAA (SEQ ID NO: 108)

El polipéptido de fusión de BMPRII-Fc maduro es como sigue (SEQ ID NO: 109) y puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

1 SQNQERLCAF KDPYQQDLGI GESRISHENG TILCSKGSTC YGLWEKSKGD

51 INLVKQGCWS HIGDPQECHY EECWTTTPP SIQNGTYRFC CCSTDLCNVN

101 FTENFPPPDT TPLSPPHSFN RDETGGGTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP

151 KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ

201 YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE

251 PQVYTLPPSR KEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP

301 PVLKSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP

351 GK (SEQ ID NO: :109)

Como se describe en el Ejemplo 1, la forma complementaria del polipéptido G1Fc humano monomérico (SEQ ID NO: 137) usa el líder TPA e incorpora una extensión de extremo N opcional. Para promover la formación del heterodímero BMPRII-Fc: Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando lisinas con residuos aniónicos) en el polipéptido Fc monomérico. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:137 puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada. Este polipéptido Fc complementario se codifica por el ácido nucleico de SEQ ID NO: 138) y el polipéptido Fc monomérico maduro (SEQ ID NO: 139) puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada. El polipéptido de fusión de BMPRII-Fc y el polipéptido Fc monomérico de SEQ ID NO: 103 y SEQ ID NO: 139, respectivamente, pueden coexpresarse y purificarse a partir de una línea celular CHO para dar lugar a un complejo proteico heteromérico de brazo único que comprende BMPRII-Fc:Fc.

En otra estrategia para promover la formación de complejos heteromultiméricoss usando polipéptidos de fusión Fc asimétricos, los dominios Fc se alteran para introducir interacciones hidrofóbicas complementarias y un enlace disulfuro intermolecular adicional, como se ilustra en las secuencias de polipéptidos BMPRII-Fc y Fc de SEQ ID NO: 405-406 y 425-426, respectivamente.

El polipéptido de fusión BMPRII-Fc (SEQ ID NO: 405) usa el líder TPA y es el siguiente:

1 MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SPGASQNQER LCAFKDPYQQ DLGIGESRIS

51 HENGTILCSK GSTCYGLWEK SKGDINLVKQ GCWSHIGDPQ ECHYEECWT

101 TTPPSIQNGT YRFCCCSTDL CNVNFTENFP PPDTTPLSPP HSFNRDETGG

151 GTHTCPPCPA PELLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC WVDVSHEDP

201 EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR WSVLTVLHQ DWLNGKEYKC

251 KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPCREEMTKN QVSLWCLVKG

301 FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN

351 VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK (SEQ ID NO: 405)

La secuencia líder y el enlazador están subrayados. Para promover la formación del heterodímero BMPRII-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando una serina con una cisteína y una treonina con un triptófano) en el dominio Fc del polipéptido de fusión BMPRII como se indica por el doble subrayado anterior. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:405 puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

El polipéptido de fusión de BMPRII-Fc maduro (SEQ ID NO: 406) es como sigue y puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

1 SQNQERLCAF KDPYQQDLGI GESRISHENG TILCSKGSTC YGLWEKSKGD

51 INLVKQGCWS HIGDPQECHY EECWTTTPP SIQNGTYRFC CCSTDLCNVN

101 FTENFPPPDT TPLSPPHSFN RDETGGGTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP

151 KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ

201 YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE

251 PQVYTLPPCR EEMTKNQVSL WCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP

301 PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP

351 GK (SEQ ID NO: 406)

Como se describe en el Ejemplo 1, la forma complementaria del polipéptido G1Fc monomérico (SEQ ID NO: 425) emplea el líder TPA e incorpora una extensión N opcional. Para promover la formación del heterodímero BMPRII-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir cuatro sustituciones de aminoácidos en el polipéptido Fc monomérico como se indica. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:425 y el polipéptido Fc maduro (SEQ ID NO: 426) puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada. El polipéptido de fusión de BMPRII-Fc y el polipéptido Fc monomérico de SEQ ID NO: 406 y SEQ ID NO: 426, respectivamente, pueden coexpresarse y purificarse a partir de una línea celular CHO para dar lugar a un complejo proteico heteromérico de un solo brazo que comprende BMPRII-Fc:Fc.

La purificación de varios complejos BMPRII-Fc: Fc podría lograrse mediante una serie de etapas de cromatografía en columna, que incluyen, por ejemplo, tres o más de los siguientes, en cualquier orden: cromatografía de proteína A, cromatografía de Q sefarosa, cromatografía de fenilsefarosa, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio catiónico. La purificación se podría completar con filtración vírica e intercambio de tampón.

Se usó un ensayo de unión basado en Biacore™ para comparar la selectividad de unión del ligando del complejo heterodimérico BMPRII-Fc de brazo único descrito anteriormente con la del complejo homodimérico BMPRII-Fc. BMPRII-Fc de brazo único y BMPRII-Fc homodimérico se capturaron independientemente en el sistema usando un anticuerpo anti-Fc. Los ligandos se inyectaron y fluyeron sobre las proteínas del receptor capturadas. Los resultados se resumen en la tabla siguiente.

Estos datos de unión comparativos indican que el heterodímero BMPRII-Fc de brazo único conserva la unión a sólo un subconjunto de ligandos unidos por el homodímero BMPRII-Fc. En particular, mientras que el heterodímero BMPRII-Fc de brazo único retiene la unión a BMP10 y BMP15, la unión a BMP9 se elimina esencialmente.

Ejemplo 5. Generación de un heterodímero MISRII-Fc de brazo único

Los solicitantes prevén la construcción de un complejo heterodimérico de MISRII-Fc de brazo único soluble que comprende un polipéptido Fc monomérico con una extensión de extremo N corto y un segundo polipéptido en el que el dominio extracelular de MISRII humano se fusionó a un dominio Fc separado con un enlazador posicionado entre el dominio extracelular y este segundo dominio Fc. Las construcciones individuales se denominan polipéptido Fc monomérico y polipéptido de fusión MISRII-Fc, respectivamente, y las secuencias para cada una se proporcionan a continuación. Los solicitantes también prevén complejos heterodiméricos MISRII-Fc de brazo único adicionales que comprenden el dominio extracelular de la isoforma 2 o 3 de MISRII (SEQ SEQ ID: 76, 80).

La formación de un heterodímero de MISRII-Fc de brazo único puede estar guiada por estrategias similares a las descritas para el heterodímero de ActRIIB-Fc de brazo único en el Ejemplo 1. En una primera estrategia, ilustrada en las secuencias de polipéptidos de MISRII-Fc y Fc monomérico de las SEQ ID NO: 110-112 y 137-139, respectivamente, un dominio Fc se altera para introducir aminoácidos catiónicos en la cara de interacción, mientras que el otro dominio Fc se modifica para introducir aminoácidos aniónicos en la cara de interacción.

El polipéptido de fusión MISRII-Fc emplea el líder TPA y es el siguiente:

1 MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SPGAPPNRRT CVFFEAPGVR GSTKTLGELL

51 DTGTELPRAI RCLYSRCCFG IWNLTQDRAQ VEMQGCRDSD EPGCESLHCD

101 PSPRAHPSPG STLFTCSCGT DFCNANYSHL PPPGSPGTPG SQGPQAAPGE

151 SIWMALTGGG THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV

201 WDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD

251 WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSRKEMTKNQ

301 VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLKSDG SFFLYSKLTV

351 DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK (SEQ ID NO: 110)

Las secuencia líder y del enlazador están subrayadas. Para promover la formación del heterodímero MISRII-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos (MISRN-Fc:MISRN-Fc o Fc:Fc), se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando residuos aniónicos con lisinas) en el dominio Fc del polipéptido de fusión como se indica por el doble subrayado anterior. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:110 puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

El polipéptido de fusión de MISRII-Fc maduro es como sigue (SEQ ID NO: 112) y puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

1 PPNRRTCVFF EAPGVRGSTK TLGELLDTGT ELPRAIRCLY SRCCFGIWNL

51 TQDRAQVEMQ GCRDSDEPGC ESLHCDPSPR AHPSPGSTLF TCSCGTDFCN

101 ANYSHLPPPG SPGTPGSQGP QAAPGESIWM ALTGGGTHTC PPCPAPELLG

151 GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVWDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN

201 AKTKPREEQY NSTYRWSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI

251 SKAKGQPREP QVYTLPPSRK EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ

301 PENNYKTTPP VLKSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY

351 TQKSLSLSPG K (SEQ ID NO: 112)

Como se describe en el Ejemplo 1, la forma complementaria del polipéptido G1Fc humano monomérico (SEQ ID NO: 137) emplea el líder TPA e incorpora una extensión N opcional. Para promover la formación del heterodímero MISRII-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando lisinas con residuos aniónicos) en el polipéptido Fc monomérico conforme se indica. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:137 puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada. Este polipéptido Fc complementario se codifica por el ácido nucleico de SEQ ID NO: 138 y el polipéptido Fc monomérico maduro (SEQ ID NO: 139) puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada. El polipéptido de fusión de MISRII-Fc y el polipéptido Fc monomérico de SEQ ID NO: 112 y SEQ ID NO: 139, respectivamente, pueden coexpresarse y purificarse a partir de una línea celular CHO para dar lugar a un complejo proteico heteromérico de brazo único que comprende MISRII-Fc:Fc.

En otra estrategia para promover la formación de complejos heteromultiméricoss usando polipéptidos de fusión Fc asimétricos, los dominios Fc se alteran para introducir interacciones hidrofóbicas complementarias y un enlace disulfuro intermolecular adicional, como se ilustra en las secuencias de polipéptidos MISRII-Fc y Fc de SEQ ID NO: 407-408 y 425-426, respectivamente.

El polipéptido de fusión MISRII-Fc (SEQ ID NO: 407) usa el líder TPA y es el siguiente:

1 MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SPGAPPNRRT CVFFEAPGVR GSTKTLGELL

51 DTGTELPRAI RCLYSRCCFG IWNLTQDRAQ VEMQGCRDSD EPGCESLHCD

101 PSPRAHPSPG STLFTCSCGT DFCNANYSHL PPPGSPGTPG SQGPQAAPGE

151 SIWMALTGGG THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV

o z - ⁿ y j ⁱ _l T 7T 7T3T 7o 0 T ^{7 T71 T712 7 T 7 0 T 7 T T IT 7 T i} J T P T \T ) T P

^{v v u v i i i i u r i i i T V T I T \ S T JJ 'N a}

^{J T J 3 U ^ T V T T XP A \7TvT C1 r p V D Tli T V 71 "U ±X "MN-¿ 7“\ i X T S \ T X I T \X J- T TY T T J r \ T \ 1 TN T VVT V X T V I ) \ H i l X i V ^ X l N O X 1 I \ V V O V i J 1 V X J11 *^0 J_2}

251 WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PCREEMTKNQ

301 VSLWCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV

351 DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK

(SEQ ID NO: 407)

La secuencia líder y el enlazador están subrayados. Para promover la formación del heterodímero MISRII-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando una serina con una cisteína y una treonina con un triptófano) en el dominio Fc del polipéptido de fusión MISRII como se indica por el doble subrayado anterior. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:407 puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

El polipéptido de fusión de MISRII-Fc maduro (SEQ ID NO: 408) es como sigue y puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

1 PPNRRTCVFF EAPGVRGSTK TLGELLDTGT ELPRAIRCLY SRCCFGIWNL

51 TQDRAQVEMQ GCRDSDEPGC ESLHCDPSPR AHPSPGSTLF TCSCGTDFCN

101 ANYSHLPPPG SPGTPGSQGP QAAPGESIWM ALTGGGTHTC PPCPAPELLG

151 GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCWVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN

201 AKTKPREEQY NSTYRWSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI

251 SKAKGQPREP QVYTLPPCRE EMTKNQVSLW CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ

301 PENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY

351 TQKSLSLSPG K (SEQ ID NO: 408)

Como se describe en el Ejemplo 1, la forma complementaria del polipéptido G1Fc monomérico (SEQ ID NO: 425) emplea el líder TPA e incorpora una extensión N opcional. Para promover la formación del heterodímero MISRII-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir cuatro sustituciones de aminoácidos en el polipéptido Fc monomérico como se indica. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:425 y el polip'peptido Fc maduro (SEQ ID NO: 426) puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

El polipéptido de fusión de MISRII-Fc y el polipéptido Fc monomérico de SEQ ID NO: 408 y SEQ ID NO: 426, respectivamente, pueden coexpresarse y purificarse a partir de una línea celular CHO para dar lugar a un complejo proteico heteromérico de brazo único que comprende MISRII-Fc:Fc.

La purificación se podría conseguir mediante una serie de etapas de cromatografía en columna, que incluyen, por ejemplo, tres o más de las siguientes, en cualquier orden: cromatografía de proteína A, cromatografía de Q sefarosa, cromatografía de fenilsefarosa, cromatografía de exclusión molecular y cromatografía de intercambio catiónico. La purificación se podría completar con filtración vírica e intercambio de tampón.

Ejemplo 6. Generación y caracterización de un heterodímero de TGFpRII-Fc de brazo único

Los solicitantes construyeron un complejo heterodimérico TGFpRII-Fc de brazo único soluble que comprende un polipéptido Fc monomérico con una extensión de extremo N corta y un segundo polipéptido en el que el dominio extracelular del TGFpRII humano (isoforma corta, SEQ ID NO: 43) se fusionó a un dominio Fc separado con un enlazador posicionado entre el dominio extracelular y este segundo dominio Fc. Las construcciones individuales se denominan polipéptido Fc monomérico y polipéptido de fusión TGFpRII-Fc, respectivamente, y las secuencias para cada una se proporcionan a continuación. Los solicitantes también prevén complejos TGFpRII-Fc de brazo único adicionales que comprenden el dominio extracelular de la isoforma A de TGFpRII (SEQ ID NO: 68), así como complejos TGFpRII-Fc de brazo único en los que el dominio extracelular del TGFpRII canónico (isoforma corta, SEQ ID NO: 43) o el de la isoforma A de TGFpRII (SEQ ID NO: 68) contienen un inserto de 36 aminoácidos (SEQ ID NO: 95) derivado de la isoforma C de TGFpRII como se describe en esta invención.

La formación de un heterodímero de TFGpRII-Fc de brazo único puede estar guiada por estrategias similares a las descritas para el heterodímero de ActRIIB-Fc de brazo único en el Ejemplo 1. En una primera estrategia, ilustrada en las secuencias de polipéptidos de TGFpRII-Fc y Fc monomérico de SEQ ID NO: 113-115 y 137-139, respectivamente, un dominio Fc se altera para introducir aminoácidos catiónicos en la cara de interacción, mientras que el otro dominio Fc se modifica para introducir aminoácidos aniónicos en la cara de interacción.

El polipéptido de fusión de TGFpRII-Fc emplea el líder TPA y es el siguiente:

1 MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SPGATIPPHV QKSVNNDMIV TDNNGAVKFP

51 QLCKFCDVRF STCDNQKSCM SNCSITSICE KPQEVCVAVW RKNDENITLE

101 TVCHDPKLPY HDFILEDAAS PKCIMKEKKK PGETFFMCSC SSDECNDNII

151 FSEEYNTSNP DTGGGTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP

201 EVTCVWDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRWSVLT

251 VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRKE

301 MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LKSDGSFFLY

351 SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK

(SEQ ID NO:: 113)

Las secuencia líder y del enlazador están subrayadas. Para promover la formación del heterodímero TGFpRII-Fc: Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos (TGFpRII-Fc: TGFpRII-Fc o Fc:Fc), se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando residuos aniónicos con lisinas) en el dominio Fc del polipéptido de fusión como se indica mediante doble subrayado anterior La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:113 puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

Este polipéptido de fusión de TGFpRII-Fc se codifica por el siguiente ácido nucleico (SEQ ID NO:114).

1 ATGGATGCAA TGAAGAGAGG GCTCTGCTGT GTGCTGCTGC TGTGTGGAGC

51 AGTCTTCGTT TCGCCCGGCG CCACGATCCC ACCGCACGTT CAGAAGTCGG

101 TTAATAACGA CATGATAGTC ACTGACAACA ACGGTGCAGT CAAGTTTCCA

151 CAACTGTGTA AATTTTGTGA TGTGAGATTT TCCACCTGTG ACAACCAGAA

201 ATCCTGCATG AGCAACTGCA GCATCACCTC CATCTGTGAG AAGCCACAGG

251 AAGTCTGTGT GGCTGTATGG AGAAAGAAT G ACGAGAACAT AACACTAGAG

301 ACAGTTTGCC ATGACCCCAA GCTCCCCTAC CATGACTTTA TTCTGGAAGA

351 TGCTGCTTCT CCAAAGTGCA TTATGAAGGA AAAAAAAAAG CCTGGTGAGA

401 CTTTCTTCAT GTGTTCCTGT AGCTCTGATG AGTGCAATGA CAACATCATC

451 TTCTCAGAAG AATATAACAC CAGCAATCCT GACACCGGTG GTGGAACTCA

501 CACATGCCCA CCGTGCCCAG CACCTGAACT CCTGGGGGGA CCGTCAGTCT

551 TCCTCTTCCC CCCAAAACCC AAGGACACCC TCATGATCTC CCGGACCCCT

601 GAGGTCACAT GCGTGGTGGT GGACGTGAGC CACGAAGACC CTGAGGTCAA

651 GTTCAACTGG TACGTGGACG GCGTGGAGGT GCATAATGCC AAGACAAAGC

701 CGCGGGAGGA GCAGTACAAC AGCACGTACC GTGTGGTCAG CGTCCTCACC

751 GTCCTGCACC AGGACTGGCT GAATGGCAAG GAGTACAAGT GCAAGGTCTC

801 CAACAAAGCC CTCCCAGCCC CCATCGAGAA AACCATCTCC AAAGCCAAAG

851 GGCAGCCCCG AGAACCACAG GTGTACACCC TGCCCCCATC CCGGAAGGAG

901 ATGACCAAGA ACCAGGTCAG CCTGACCTGC CTGGTCAAAG GCTTCTATCC

951 CAGCGACATC GCCGTGGAGT GGGAGAGCAA TGGGCAGCCG GAGAACAACT

1001 ACAAGACCAC GCCTCCCGTG CTGAAGTCCG ACGGCTCCTT CTTCCTCTAT

1051 AGCAAGCTCA CCGTGGACAA GAGCAGGTGG CAGCAGGGGA ACGTCTTCTC

1101 ATGCTCCGTG ATGCATGAGG CTCTGCACAA CCACTACACG CAGAAGAGCC

1151 TCTCCCTGTC TCCGGGTAAA (SEQ ID NO: 114)

El polipéptido de fusión de TGFpRII-Fc maduro es como sigue (SEQ ID NO: 115) y puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

1 TIPPHVQKSV NNDMIVTDNN GAVKFPQLCK FCDVRFSTCD NQKSCMSNCS

51 ITSICEKPQE VCVAVWRKND ENITLETVCH DPKLPYHDFI LEDAASPKCI

101 MKEKKKPGET FEMCSCSSDE CNDNIIFSEE YNTSNPDTGG GTHTCPPCPA

151 PELLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VWDVSHEDP EVKFNWYVDG

201 VEVHNAKTKP REEQYNSTYR WSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP

251 IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSRKEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW

301 ESNGQPENNY KTTPPVLKSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA

351 LHNHYTQKSL SLSPGK (:3EQ ID NO: :115)

Como se describe en el Ejemplo 1, la forma complementaria del polipéptido G1Fc humano monomérico (SEQ ID NO: 137) emplea el líder TPA e incorpora una extensión N opcional. Para promover la formación del heterodímero TGFpRII-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando lisinas con residuos aniónicos) en el polipéptido Fc monomérico conforme se indica. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:137 puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada. Este polipéptido Fc complementario se codifica por el ácido nucleico de SEQ ID NO: 138 y el polipéptido Fc monomérico maduro (SEQ ID NO: 139) puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada. El polipéptido de fusión de TGFpRII-Fc y el polipéptido Fc monomérico de SEQ ID NO: 115 y SEQ ID NO: 139, respectivamente, pueden coexpresarse y purificarse a partir de una línea celular CHO para dar lugar a un complejo proteico heteromérico de brazo único que comprende TGFpRII-Fc:Fc.

En otra estrategia para promover la formación de complejos heteromultiméricoss usando polipéptidos de fusión Fc asimétricos, los dominios Fc se alteran para introducir interacciones hidrofóbicas complementarias y un enlace disulfuro intermolecular adicional, como se ilustra en las secuencias de polipéptidos TGFpRII-Fc y Fc de SEQ ID NO: 409-410 y 425-426, respectivamente.

El polipéptido de fusión TGFpRII-Fc (SEQ ID NO: 409) usa el líder TPA y es el siguiente:

1 MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SPGATIPPHV QKSVNNDMIV TDNNGAVKFP

51 QLCKFCDVRF STCDNQKSCM SNCSITSICE KPQEVCVAVW RKNDENITLE

101 TVCHDPKLPY HDFILEDAAS PKCIMKEKKK PGETFFMCSC SSDECNDNII

151 FSEEYNTSNP DTGGGTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP

201 EVTCVWDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRWSVLT

251 VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPCREE

301 MTKNQVSLWC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY

351 SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK

(SEQ ID NO: 409)

La secuencia líder y el enlazador están subrayados. Para promover la formación del heterodímero TGFpRII-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando una serina con una cisteína y una treonina con un triptófano) en el dominio Fc del polipéptido de fusión T^g FPRII como se indica por el doble subrayado anterior. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:409 puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

El polipéptido de fusión de TGFpRII-Fc maduro (SEQ ID NO: 410) es como sigue y puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

1 TIPPHVQKSV NNDMIVTDNN GAVKFPQLCK FCDVRFSTCD NQKSCMSNCS

51 ITSICEKPQE VCVAVWRKND ENITLETVCH DPKLPYHDFI LEDAASPKCI

101 MKEKKKPGET FEMCSCSSDE CNDNIIFSEE YNTSNPDTGG GTHTCPPCPA

151 PELLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC WVDVSHEDP EVKFNWYVDG

201 VEVHNAKTKP REEQYNSTYR WSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP

251 IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPCREEMTKN QVSLWCLVKG FYPSDIAVEW

301 ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA

351 LHNHYTQKSL SLSPGK (SEQ ID NO: 410)

Como se describe en el Ejemplo 1, la forma complementaria del polipéptido G1Fc monomérico (SEQ ID NO: 425) emplea el líder TPA e incorpora una extensión N opcional. Para promover la formación del heterodímero TGFpRII-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir cuatro sustituciones de aminoácidos en el polipéptido Fc monomérico como se indica. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:425 y el polipéptido Fc monomérico maduro (SEQ ID NO: 426) puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

El polipéptido de fusión de TGFpRII-Fc y el polipéptido Fc monomérico de SEQ ID NO: 410 y SEQ ID NO: 426, respectivamente, pueden coexpresarse y purificarse a partir de una línea celular CHO para dar lugar a un complejo proteico heteromérico de brazo único que comprende TGFpRII-Fc:Fc.

La purificación de varios complejos TGFpRII-Fc:Fc podría lograrse mediante una serie de etapas de cromatografía en columna, que incluyen, por ejemplo, tres o más de los siguientes, en cualquier orden: cromatografía de proteína A, cromatografía de Q-sefarosa, cromatografía de fenilsefarosa, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio catiónico. La purificación se podría completar con filtración vírica e intercambio de tampón.

Se usó un ensayo de unión basado en Biacore™ para comparar la selectividad de unión del ligando del complejo heterodimérico TGFpRII-Fc de brazo único descrito anteriormente con la del complejo homodimérico TGFpRII-Fc. TGFpRII-Fc de brazo único y TGFpRII-Fc homodimérico se capturaron independientemente en el sistema usando un anticuerpo anti-Fc. Los ligandos se inyectaron y fluyeron sobre las proteínas del receptor capturadas. Los resultados se resumen en la tabla siguiente.

Ejemplo 7. Generación y caracterización de un heterodímero de ALK1-Fc de brazo único

Los solicitantes construyeron un complejo heterodimérico de ALK1-Fc de brazo único soluble que comprende un polipéptido Fc monomérico con una extensión de extremo N corta y un segundo polipéptido en el que el dominio extracelular de ALK1 humano se fusionó a un dominio Fc separado con un enlazador posicionado entre el dominio extracelular y este segundo dominio Fc. Las construcciones individuales se denominan polipéptido Fc monomérico y polipéptido de fusión ALK1-Fc, respectivamente, y las secuencias para cada una se proporcionan a continuación. La formación de un heterodímero de ALK1-Fc de brazo único puede estar guiada por estrategias similares a las descritas para el heterodímero de ActRIIB-Fc de brazo único en el Ejemplo 1. En una primera estrategia, ilustrada en las secuencias de polipéptidos de ALK1-Fc y Fc monomérico de SEQ ID NO: 116-118 y 140-142, respectivamente, un dominio Fc se altera para introducir aminoácidos catiónicos en la cara de interacción, mientras que el otro dominio Fc se modifica para introducir aminoácidos aniónicos en la cara de interacción.

El polipéptido de fusión de ALK1-Fc emplea el líder TPA y es el siguiente:

1 MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SPGADPVKPS RGPLVTCTCE SPHCKGPTCR

51 GAWCTWLVR EEGRHPQEHR GCGNLHRELC RGRPTEFVNH YCCDSHLCNH

101 NVSLVLEATQ PPSEQPGTDG QLATGGGTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP

151 KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ

201 YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE

251 PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYDTTP

301 PVLDSDGSFF LYSDLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP

351 G (SEQ ID NO: :116)

Las secuencia líder y del enlazador están subrayadas. Para promover la formación del heterodímero ALK1-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos (ALK1-Fc:ALK1-Fc o Fc:Fc), se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando lisinas con aminoácidos aniónicos) en el dominio Fc del polipéptido de fusión como se indica por el doble subrayado anterior. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:116 se puede proporcionar opcionalmente con una lisina añadida en el extremo C.

Este polipéptido de fusión de ALK1-Fc se codifica por el siguiente ácido nucleico (SEQ ID NO:117).

1 ATGGATGCAA TGAAGAGAGG GCTCTGCTGT GTGCTGCTGC TGTGTGGAGC

51 AGTCTTCGTT TCGCCCGGCG CCGACCCTGT GAAGCCGTCT CGGGGCCCGC

101 TGGTGACCTG CACGTGTGAG AGCCCACATT GCAAGGGGCC TACCTGCCGG

151 GGGGCCTGGT GCACAGTAGT GCTGGTGCGG GAGGAGGGGA GGCACCCCCA

201 GGAACATCGG GGCTGCGGGA ACTTGCACAG GGAGCTCTGC AGGGGCCGCC

251 CCACCGAGTT CGTCAACCAC TACTGCTGCG ACAGCCACCT CTGCAACCAC

301 AACGTGTCCC TGGTGCTGGA GGCCACCCAA CCTCCTTCGG AGCAGCCGGG

351 AACAGATGGC CAGCTGGCCA CCGGTGGTGG AACTCACACA TGCCCACCGT

401 GCCCAGCACC TGAACTCCTG GGGGGACCGT CAGTCTTCCT CTTCCCCCCA

451 AAACCCAAGG ACACCCTCAT GATCTCCCGG ACCCCTGAGG TCACATGCGT

501 GGTGGTGGAC GTGAGCCACG AAGACCCTGA GGTCAAGTTC AACTGGTACG

551 TGGACGGCGT GGAGGTGCAT AATGCCAAGA CAAAGCCGCG GGAGGAGCAG

601 TACAACAGCA CGTACCGTGT GGTCAGCGTC CTCACCGTCC TGCACCAGGA

651 CTGGCTGAAT GGCAAGGAGT ACAAGTGCAA GGTCTCCAAC AAAGCCCTCC

701 CAGCCCCCAT CGAGAAAAC C ATCTCCAAAG CCAAAGGGCA GCCCCGAGAA

751 CCACAGGTGT ACACCCTGCC CCCATCCCGG GAGGAGATGA CCAAGAACCA

801 GGTCAGCCTG ACCTGCCTGG TCAAAGGCTT CTATCCCAGC GACATCGCCG

851 TGGAGTGGGA GAGCAATGGG CAGCCGGAGA ACAACTACGA CACCACGCCT

901 CCCGTGCTGG ACTCCGACGG CTCCTTCTTC CTCTATAGCG ACCTCACCGT

951 GGACAAGAGC AGGTGGCAGC AGGGGAACGT CTTCTCATGC TCCGTGATGC

1001 ATGAGGCTCT GCACAACCAC TACACGCAGA AGAGCCTCTC CCTGTCTCCG

1051 GGT (SEQ ID NO:: 117)

La secuencia del polipéptido de fusión de ALK1-Fc maduro es como sigue (SEQ ID NO: 118) y se puede proporcionar opcionalmente con una lisina añadida en el extremo C.

1 DPVKPSRGPL VTCTCESPHC KGPTCRGAWC TWLVREEGR HPQEHRGCGN

51 LHRELCRGRP TEFVNHYCCD SHLCNHNVSL VLEATQPPSE QPGTDGQLAT

101 GGGTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE

151 DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL HQDWLNGKEY

201 KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV

251 KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYDTTPPVLD SDGSFFLYSD LTVDKSRWQQ

301 GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPG (SEQ ID NO: 118)

Como se describe en el Ejemplo 2, la forma complementaria del polipéptido G1Fc humano monomérico (SEQ ID NO: 140) emplea el líder TPA e incorpora una extensión N opcional. Para promover la formación del heterodímero de ALK1-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando residuos aniónicos con lisinas) en el polipéptido Fc monomérico como se indica. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:140 puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada. Este polipéptido Fc complementario se codifica por el ácido nucleico de SEQ ID NO: 141 y el polipéptido Fc monomérico maduro (SEQ ID NO: 142) puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada. El polipéptido de fusión de ALK1-Fc y el polipéptido Fc monomérico de SEQ ID NO: 118 y SEQ ID NO: 142, respectivamente, pueden coexpresarse y purificarse a partir de una línea celular CHO para dar lugar a un complejo proteico heteromérico de brazo único que comprende ALK1-Fc:Fc.

En otra estrategia para promover la formación de complejos heteromultiméricoss usando polipéptidos de fusión Fc asimétricos, los dominios Fc se alteran para introducir interacciones hidrofóbicas complementarias y un enlace disulfuro intermolecular adicional, como se ilustra en las secuencias de polipéptidos ALK1-Fc y Fc de SEQ ID NO: 411-412 y 427-428, respectivamente.

El polipéptido de fusión ALK1-Fc (SEQ ID NO: 411) usa el líder TPA y es el siguiente:

1 MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SPGADPVKPS RGPLVTCTCE SPHCKGPTCR

51 GAWCTWLVR EEGRHPQEHR GCGNLHRELC RGRPTEFVNH YCCDSHLCNH

101 NVSLVLEATQ PPSEQPGTDG QLATGGGTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP

151 KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ

201 YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE

251 PQVCTLPPSR EEMTKNQVSL SCAVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP

301 PVLDSDGSFF LVSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP

351 GK (SEQ ID NO: 411)

La secuencia líder y el enlazador están subrayados. Para promover la formación del heterodímero ALK1-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir cuatro sustituciones de aminoácidos en el dominio Fc del polipéptido de fusión ALK1 como se indica por el doble subrayado anterior. La secuencia de aminoácidos de SEQ ⁱD NO:411 puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

El polipéptido de fusión ALK1-Fc maduro (SEQ ID NO: 412) es como sigue y puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

1 DPVKPSRGPL VTCTCESPHC KGPTCRGAWC TWLVREEGR HPQEHRGCGN

51 LHRELCRGRP TEFVNHYCCD SHLCNHNVSL VLEATQPPSE QPGTDGQLAT

101 GGGTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCWVDVSHE

151 DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL HQDWLNGKEY

201 KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSREEMT KNQVSLSCAV

251 KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ

301 GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO: 412)

Como se describe en el Ejemplo 2, la forma complementaria del polipéptido G1Fc monomérico (SEQ ID NO: 427) emplea el líder TPA e incorpora una extensión N opcional. Para promover la formación del heterodímero ALK1-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando una serina con una cisteína y una treonina con un triptófano) en el polipéptido Fc monomérico como se indica. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:427 y el polip'peptido Fc maduro (SEQ ID NO: 428) puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

El polipéptido de fusión de ALK1-Fc y el polipéptido Fc monomérico de SEQ ID NO: 412 y SEQ ID NO: 428, respectivamente, pueden coexpresarse y purificarse a partir de una línea celular CHO para dar lugar a un complejo proteico heteromérico de un solo brazo que comprende ALK1-Fc:Fc.

La purificación de varios complejos ALK1-Fc:Fc se podría conseguir mediante una serie de etapas de cromatografía en columna, que incluyen, por ejemplo, tres o más de las siguientes, en cualquier orden: cromatografía de proteína A, cromatografía de Q Sefarosa, cromatografía de fenilsefarosa, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio catiónico. La purificación se podría completar con filtración vírica e intercambio de tampón.

Se usó un ensayo de unión basado en Biacore™ para comparar la selectividad de unión del ligando del complejo heterodimérico ALK1-Fc de brazo único descrito anteriormente con la del complejo homodimérico ALK1-Fc. ALK1-Fc de brazo único y ALK1-Fc homodimérico se capturaron independientemente en el sistema usando un anticuerpo anti-Fc. Los ligandos se inyectaron y fluyeron sobre las proteínas del receptor capturadas. Los resultados se resumen en la siguiente tabla, en la que tasas de desviación (kd) típicamente asociadas con las trampas de ligando más efectivas se indican mediante sombreado gris.

Estos datos de unión comparativos indican que ALK1-Fc de brazo único tiene una selectividad de ligando alterada en comparación con ALK1-Fc homodimérico. ALK1-FRc de brazo único retiene la fuerte unión a BMP10 observada con ALK1-Fc homodimérico mientras que se une a BMP9 con menos fuerza que el homodímero de ALK1-Fc, ya que la tasa de desviación de la unión de BMP9 a ALK1-Fc de brazo único es aproximadamente 10 veces más rápida que para unirse a AK1-Fc homodimérico. Estos resultados indican que ALK1-Fc de brazo único es un antagonista más selectivo que el homodímero de ActRIIB-Fc. Por consiguiente, ALK1-Fc de brazo único será más útil que el de ALK1-Fc en ciertas aplicaciones donde tal antagonismo selectivo es ventajoso. Los ejemplos incluyen aplicaciones terapéuticas en las que es deseable retener el antagonismo de BMP10 pero reducir el antagonismo de BMP9.

Ejemplo 8. Generación de un heterodímero de ALK2-Fc de brazo único

Los solicitantes prevén la construcción de un complejo heterodimérico de ALK2-Fc de brazo único soluble que comprende un polipéptido Fc monomérico con una extensión de extremo N corto y un segundo polipéptido en el que el dominio extracelular de ALK2 humano se fusionó a un dominio Fc separado con un enlazador posicionado entre el dominio extracelular y este segundo dominio Fc. Las construcciones individuales se denominan polipéptido Fc monomérico y polipéptido de fusión ALK2-Fc, respectivamente, y las secuencias para cada una se proporcionan a continuación.

La formación de un heterodímero de ALK2-Fc de brazo único puede estar guiada por estrategias similares a las descritas para el heterodímero de ActRIIB-Fc de brazo único en el Ejemplo 1. En una primera estrategia, ilustrada en las secuencias de polipéptidos de ALK2-Fc y Fc monomérico de SEQ ID NO: 119-121 y 140-142, respectivamente, un dominio Fc se altera para introducir aminoácidos catiónicos en la cara de interacción, mientras que el otro dominio Fc se modifica para introducir aminoácidos aniónicos en la cara de interacción.

El polipéptido de fusión de ALK2-Fc emplea el líder TPA y es el siguiente:

1 MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SPGAMEDEKP KVNPKLYMCV CEGLSCGNED

51 HCEGQQCFSS LSINDGFHVY QKGCFQVYEQ GKMTCKTPPS PGQAVECCQG

101 DWCNRNITAQ LPTKGKSFPG TQNFHLETGG GTHTCPPCPA PELLGGPSVF

151 LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VWDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP

201 REEQYNSTYR WSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG

251 QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY

301 DTTPPVLDSD GSFFLYSDLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL

351 SLSPG (SEQ ID NO: 119)

Las secuencia líder y del enlazador están subrayadas. Para promover la formación del heterodimero ALK2-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos (ALK2-Fc:ALK2-Fc o Fc:Fc), se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando lisinas con aminoácidos amónicos) en el dominio Fc del polipéptido de fusión como se indica por el doble subrayado anterior. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:119 se puede proporcionar opcionalmente con una lisina añadida en el extremo C.

Este polipéptido de fusión ALK2-Fc está codificado por el siguiente ácido nucleico (SEQ ID NO: 120).

1 ATGGATGCAA TGAAGAGAGG GCTCTGCTGT GTGCTGCTGC TGTGTGGAGC

51 AGTCTTCGTT TCGCCCGGCG CCATGGAAGA TGAGAAGCCC AAGGTCAACC

101 CCAAACTCTA CATGTGTGTG TGTGAAGGTC TCTCCTGCGG TAATGAGGAC

151 CACTGTGAAG GCCAGCAGTG CTTTTCCTCA CTGAGCATCA ACGATGGCTT

2 01 CCACGTCTAC CAGAAAGGCT GCTTCCAGGT TTATGAGCAG GGAAAGATGA

251 CCTGTAAGAC CCCGCCGTCC CCTGGCCAAG CTGTGGAGTG CTGCCAAGGG

301 GACTGGTGTA ACAGGAACAT CACGGCCCAG CTGCCCACTA AAGGAAAATC

351 CTTCCCTGGA ACACAGAATT TCCACTTGGA GACCGGTGGT GGAACTCACA

401 CATGCCCACC GTGCCCAGCA CCTGAACTCC TGGGGGGACC GTCAGTCTTC

451 CTCTTCCCCC CAAAACCCAA GGACACCCTC ATGATCTCCC GGACCCCTGA

501 GGTCACATGC GTGGTGGTGG ACGTGAGCCA CGAAGACCCT GAGGTCAAGT

551 TCAACTGGTA CGTGGACGGC GTGGAGGTGC ATAATGCCAA GACAAAGCCG

601 CGGGAGGAGC AGTACAACAG CACGTACCGT GTGGTCAGCG TCCTCACCGT

651 CCTGCACCAG GACTGGCTGA ATGGCAAGGA GTACAAGTGC AAGGTCTCCA

701 ACAAAGCCCT CCCAGCCCCC ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AGCCAAAGGG

751 CAGCCCCGAG AACCACAGGT GTACACCCTG CCCCCATCCC GGGAGGAGAT

801 GACCAAGAAC CAGGTCAGCC TGACCTGCCT GGTCAAAGGC TTCTATCCCA

851 GCGACATCGC CGTGGAGTGG GAGAGCAATG GGCAGCCGGA GAACAACTAC

901 GACACCACGC CTCCCGTGCT GGACTCCGAC GGCTCCTTCT TCCTCTATAG

951 CGACCTCACC GTGGACAAGA GCAGGTGGCA GCAGGGGAAC GTCTTCTCAT

1001 GCTCCGTGAT GCATGAGGCT CTGCACAACC ACTACACGCA GAAGAGCCTC

1051 TCCCTGTCTC CGGGT (SEQ ID NO: 120)

La secuencia del polipéptido de fusión de ALK2-Fc maduro es como sigue (SEQ ID NO: 121) y se puede proporcionar opcionalmente con una lisina añadida en el extremo C.

1 MEDEKPKVNP KLYMCVCEGL SCGNEDHCEG QQCFSSLSIN DGFHVYQKGC

51 FQVYEQGKMT CKTPPSPGQA VECCQGDWCN RNITAQLPTK GKSFPGTQNF

101 HLETGGGTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCWVD

151 VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN

201 GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL

251 TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYDTTP PVLDSDGSFF LYSDLTVDKS

301 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP G (SEQ ID NO: 121)

Como se describe en el Ejemplo 2, la forma complementaria del polipéptido G1Fc humano monomérico (SEQ ID NO: 140) emplea el líder TPA e incorpora una extensión N opcional. Para promover la formación del heterodímero de ALK2-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando residuos aniónicos con lisinas) en el polipéptido Fc monomérico como se indica. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:140 puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada. Este polipéptido Fc complementario se codifica por el ácido nucleico de SEQ ID NO: 141 y el polipéptido Fc monomérico maduro (SEQ ID NO: 142) puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada. El polipéptido de fusión de ALK2-Fc y el polipéptido Fc monomérico de SEQ ID NO: 121 y SEQ ID NO: 142, respectivamente, pueden coexpresarse y purificarse a partir de una línea celular CHO para dar lugar a un complejo proteico heteromérico de brazo único que comprende ALK2-Fc:Fc.

En otra estrategia para promover la formación de complejos heteromultiméricoss usando polipéptidos de fusión Fc asimétricos, los dominios Fc se alteran para introducir interacciones hidrofóbicas complementarias y un enlace disulfuro intermolecular adicional, como se ilustra en las secuencias de polipéptidos ALK2-Fc y Fc de SEQ ID NO: 413-414 y 427-428, respectivamente.

El polipéptido de fusión ALK2-Fc (SEQ ID NO: 413) usa el líder TPA y es el siguiente:

1 MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SPGAMEDEKP KVNPKLYMCV CEGLSCGNED

51 HCEGQQCFSS LSINDGFHVY QKGCFQVYEQ GKMTCKTPPS PGQAVECCQG

101 DWCNRNITAQ LPTKGKSFPG TQNFHLETGG GTHTCPPCPA PELLGGPSVF

151 LFPPKPKDTL MISRTPEVTC WVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP

201 REEQYNSTYR WSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG

251 QPREPQVCTL PPSREEMTKN QVSLSCAVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY

301 KTTPPVLDSD GSFFLVSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL

351 SLSPGK (SEQ ID NO: 413)

La secuencia líder y el enlazador están subrayados. Para promover la formación del heterodímero ALK2-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir cuatro sustituciones de aminoácidos en el dominio Fc del polipéptido de fusión ALK2 como se indica por el doble subrayado anterior. La secuencia de aminoácidos de SEQ iD NO:413 puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

El polipéptido de fusión ALK2-Fc maduro (SEQ ID NO: 414) es como sigue y puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

1 MEDEKPKVNPKLYMCVCEGL SCGNEDHCEG QQCFSSLSIN DGFHVYQKGC

51 FQVYEQGKMT CKTPPSPGQA VECCQGDWCN RNITAQLPTK GKSFPGTQNF

101 HLETGGGTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCWVD

151 VSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN

201 GKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVCTLPPSR EEMTKNQVSL

251 SCAVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LVSKLTVDKS

301 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK (SEQ ID NO: 414)

Como se describe en el Ejemplo 2, la forma complementaria del polipéptido G1Fc monomérico (SEQ ID NO: 427) emplea el líder TPA e incorpora una extensión N opcional. Para promover la formación del heterodímero ALK2-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando una serina con una cisteína y una treonina con un triptófano) en el polipéptido Fc monomérico como se indica. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:427 y el polip'peptido Fc maduro (SEQ ID NO: 428) puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

El polipéptido de fusión de ALK2-Fc y el polipéptido Fc monomérico de SEQ ID NO: 414 y SEQ ID NO: 428, respectivamente, pueden coexpresarse y purificarse a partir de una línea celular CHO para dar lugar a un complejo proteico heteromérico de un solo brazo que comprende ALK2-Fc:Fc.

La purificación de varios complejos ALK2-Fc: Fc podría lograrse mediante una serie de etapas de cromatografía en columna, que incluyen, por ejemplo, tres o más de los siguientes, en cualquier orden: cromatografía de proteína A, cromatografía de Q-sefarosa, cromatografía de fenilsefarosa, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio catiónico. La purificación se podría completar con filtración vírica e intercambio de tampón.

Ejemplo 9. Generación de un heterodímero de ALK4-Fc de brazo único

Los solicitantes prevén la construcción de un complejo heterodimérico de ALK4-Fc de brazo único soluble que comprende un polipéptido Fc monomérico con una extensión de extremo N corto y un segundo polipéptido en el que el dominio extracelular de ALK4 humano se fusionó a un dominio Fc separado con un enlazador posicionado entre el dominio extracelular y este segundo dominio Fc. Las construcciones individuales se denominan polipéptido Fc monomérico y polipéptido de fusión ALK4-Fc, respectivamente, y las secuencias para cada una se proporcionan a continuación. Los solicitantes también prevén complejos heterodiméricos ALK4-Fc de brazo único adicionales que comprenden el dominio extracelular de la isoforma B de ALK4 (SEQ ID NO: 84).

La formación de un heterodímero de ALK4-Fc de brazo único puede estar guiada por estrategias similares a las descritas para el heterodímero de ActRIIB-Fc de brazo único en el Ejemplo 1. En una primera estrategia, ilustrada en las secuencias de polipéptidos de ALK4-Fc y Fc monomérico de SEQ ID NO: 125-127 y 140-142, respectivamente, un dominio Fc se altera para introducir aminoácidos catiónicos en la cara de interacción, mientras que el otro dominio Fc se modifica para introducir aminoácidos aniónicos en la cara de interacción.

El polipéptido de fusión de ALK4-Fc emplea el líder TPA y es el siguiente:

1 MDAMKRGLCCVLLLCGAVFV SPGASGPRGV QALLCACTSCLQANYTCETD

51 GACMVSIFNLDGMEHHVRTC IPKVELVPAG KPFYCLSSEDLRNTHCCYTD

101 YCNRIDLRVPSGHLKEPEHP SMWGPVETGG GTHTCPPCPAPELLGGPSVF

151 LFPPKPKDTL MISRTPEVTC WVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP

201 REEQYNSTYR WSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG

251 QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY

301 DTTPPVLDSD GSFFLYSDLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL

351 SLSPG (SEQ ID NO: 125)

Las secuencia líder y del enlazador están subrayadas. Para promover la formación del heterodímero ALK4-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos (ALK4-Fc:ALK4-Fc o Fc:Fc), se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando lisinas con aminoácidos aniónicos) en el dominio Fc del polipéptido de fusión como se indica por el doble subrayado anterior. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:125 se puede proporcionar opcionalmente con una lisina añadida en el extremo C.

Este polipéptido de fusión ALK4-Fc está codificado por el siguiente ácido nucleico (SEQ ID NO: 126).

1 ATGGATGCAA TGAAGAGAGG GCTCTGCTGT GTGCTGCTGC TGTGTGGAGC

51 AGTCTTCGTT TCGCCCGGCG CCTCCGGGCC CCGGGGGGTC CAGGCTCTGC

101 TGTGTGCGTG CACCAGCTGC CTCCAGGCCA ACTACACGTG TGAGACAGAT

151 GGGGCCTGCA TGGTTTCCAT TTTCAATCTG GATGGGATGG AGCACCATGT

201 GCGCACCTGC ATCCCCAAAG TGGAGCTGGT CCCTGCCGGG AAGCCCTTCT

251 ACTGCCTGAG CTCGGAGGAC CTGCGCAACA CCCACTGCTG CTACACTGAC

301 TACTGCAACA GGATCGACTT GAGGGTGCCC AGTGGTCACC TCAAGGAGCC

351 TGAGCACCCG TCCATGTGGG GCCCGGTGGA GACCGGTGGT GGAACTCACA

401 CATGCCCACC GTGCCCAGCA CCTGAACTCC TGGGGGGACC GTCAGTCTTC

451 CTCTTCCCCC CAAAACCCAA GGACACCCTC ATGATCTCCC GGACCCCTGA

501 GGTCACATGC GTGGTGGTGG ACGTGAGCCA CGAAGACCCT GAGGTCAAGT

551 TCAACTGGTA CGTGGACGGC GTGGAGGTGC ATAATGCCAA GACAAAGCCG

601 CGGGAGGAGC AGTACAACAG CACGTACCGT GTGGTCAGCG TCCTCACCGT

651 CCTGCACCAG GACTGGCTGA ATGGCAAGGA GTACAAGTGC AAGGTCTCCA

701 ACAAAGCCCT CCCAGCCCCC ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AGCCAAAGGG

751 CAGCCCCGAG AACCACAGGT GTACACCCTG CCCCCATCCC GGGAGGAGAT

801 GACCAAGAAC CAGGTCAGCC TGACCTGCCT GGTCAAAGGC TTCTATCCCA

851 GCGACATCGC CGTGGAGTGG GAGAGCAATG GGCAGCCGGA GAACAACTAC

901 GACACCACGC CTCCCGTGCT GGACTCCGAC GGCTCCTTCT TCCTCTATAG

951 CGACCTCACC GTGGACAAGA GCAGGTGGCA GCAGGGGAAC GTCTTCTCAT

1001 GCTCCGTGAT GCATGAGGCT CTGCACAACC ACTACACGCA GAAGAGCCTC

1051 TCCCTGTCTC CGGGT (SEQ ID NO: 126)

La secuencia del polipéptido de fusión de ALK4-Fc maduro es como sigue (SEQ ID NO: 127) y se puede proporcionar opcionalmente con una lisina añadida en el extremo C.

1 SGPRGVQALL CACTSCLQAN YTCETDGACM VSIFNLDGME HHVRTCIPKV

51 ELVPAGKPFY CLSSEDLRNT HCCYTDYCNR IDLRVPSGHL KEPEHPSMWG

101 PVETGGGTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCWVD

151 VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN

201 GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL

251 TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYDTTP PVLDSDGSFF LYSDLTVDKS

301 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP G (SEQ ID NO: 127)

Como se describe en el Ejemplo 2, la forma complementaria del polipéptido G1Fc humano monomérico (SEQ ID NO: 140) emplea el líder TPA e incorpora una extensión N opcional. Para promover la formación del heterodímero de ALK4-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando residuos aniónicos con lisinas) en el polipéptido Fc monomérico como se indica. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:140 puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada. Este polipéptido Fc complementario se codifica por el ácido nucleico de SEQ ID NO: 141 y el polipéptido Fc monomérico maduro (SEQ ID NO: 142) puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada. El polipéptido de fusión de ALK4-Fc y el polipéptido Fc monomérico de SEQ ID NO: 127 y SEQ ID NO: 142, respectivamente, pueden coexpresarse y purificarse a partir de una línea celular CHO para dar lugar a un complejo proteico heteromérico de brazo único que comprende ALK4-Fc:Fc.

En otra estrategia para promover la formación de complejos heteromultiméricoss usando polipéptidos de fusión Fc asimétricos, los dominios Fc se alteran para introducir interacciones hidrofóbicas complementarias y un enlace disulfuro intermolecular adicional, como se ilustra en las secuencias de polipéptidos ALK4-Fc y Fc de SEQ ID NO: 417-418 y 427-428, respectivamente.

El polipéptido de fusión ALK4-Fc (SEQ ID NO: 417) usa el líder TPA y es el siguiente:

1 MDAMKRGLCCVLLLCGAVFV SPGASGPRGV QALLCACTSC LQANYTCETD

51 GACMVSIFNLDGMEHHVRTC IPKVELVPAG KPFYCLSSED LRNTHCCYTD

101 YCNRIDLRVPSGHLKEPEHP SMWGPVETGG GTHTCPPCPA PELLGGPSVF

151 LFPPKPKDTL MISRTPEVTC WVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP

201 REEQYNSTYR WSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG

251 QPREPQVQTL PPSREEMTKN QVSL^CAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY

301 KTTPPVLDSD GSFFLVSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL

351 SLSPGK (SEQ ID NO: 417)

La secuencia líder y el enlazador están subrayados. Para promover la formación del heterodímero ALK4-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir cuatro sustituciones de aminoácidos en el dominio Fc del polipéptido de fusión ALK4 como se indica por el doble subrayado anterior. La secuencia de aminoácidos de SEQ iD NO:417 puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

El polipéptido de fusión ALK4-Fc maduro (SEQ ID NO: 418) es como sigue y puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

1 SGPRGVQALL CACTSCLQAN YTCETDGACM VSIFNLDGME HHVRTCIPKV

51 ELVPAGKPFY CLSSEDLRNT HCCYTDYCNR IDLRVPSGHL KEPEHPSMWG

101 PVETGGGTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD

151 VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN

201 GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVCTLPPSR EEMTKNQVSL

251 SCAVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LVSKLTVDKS

301 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK (SEQ :ID NO: 418)

Como se describe en el Ejemplo 2, la forma complementaria del polipéptido G1Fc monomérico (SEQ ID NO: 427) emplea el líder TPA e incorpora una extensión N opcional. Para promover la formación del heterodímero ALK4-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando una serina con una cisteína y una treonina con un triptófano) en el polipéptido Fc monomérico como se indica. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:427 y el polip'peptido Fc maduro (SEQ ID NO: 428) puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

El polipéptido de fusión de ALK4-Fc y el polipéptido Fc monomérico de SEQ ID NO: 418 y SEQ ID NO: 428, respectivamente, pueden coexpresarse y purificarse a partir de una línea celular CHO para dar lugar a un complejo proteico heteromérico de un solo brazo que comprende ALK4-Fc:Fc.

La purificación de varios complejos ALK4-Fc: Fc podría lograrse mediante una serie de etapas de cromatografía en columna, que incluyen, por ejemplo, tres o más de los siguientes, en cualquier orden: cromatografía de proteína A, cromatografía de Q sefarosa, cromatografía de fenilsefarosa, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio catiónico. La purificación se podría completar con filtración vírica e intercambio de tampón.

Ejemplo 10. Generación de un heterodímero ALK5-Fc de brazo único

Los solicitantes prevén la construcción de un complejo heterodimérico de ALK5-Fc de brazo único soluble que comprende un polipéptido Fc monomérico con una extensión de extremo N corto y un segundo polipéptido en el que el dominio extracelular de ALK5 humano se fusionó a un dominio Fc separado con un enlazador posicionado entre el dominio extracelular y este segundo dominio Fc. Las construcciones individuales se denominan polipéptido Fc monomérico y polipéptido de fusión ALK5-Fc, respectivamente, y las secuencias para cada una se proporcionan a continuación. Los solicitantes también prevén complejos heterodiméricos ALK5-Fc de brazo único adicionales que comprenden el dominio extracelular de la isoforma 2 de ALK5 (SEQ ID NO: 88).

La formación de un heterodímero de ALK5-Fc de brazo único puede estar guiada por estrategias similares a las descritas para el heterodímero de ActRIIB-Fc de brazo único en el Ejemplo 1. En una primera estrategia, ilustrada en las secuencias de polipéptidos de ALK5-Fc y Fc monomérico de SEQ ID NO: 128-130 y 140-142, respectivamente, un dominio Fc se altera para introducir aminoácidos catiónicos en la cara de interacción, mientras que el otro dominio Fc se modifica para introducir aminoácidos aniónicos en la cara de interacción.

El polipéptido de fusión de ALK5-Fc emplea el líder TPA y es el siguiente:

1 MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SPGAALLPGA TALQCFCHLC TKDNFTCVTD

51 GLCFVSVTET TDKVIHNSMC IAEIDLIPRD RPFVCAPSSK TGSVTTTYCC

101 NQDHCNKIEL PTTVKSSPGL GPVETGGGTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP

151 PKPKDTLMIS RTPEVTCVW DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE

201 QYNSTYRWS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR

251 EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYDTT

301 PPVLDSDGSF FLYSDLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS

351 PG (SEQ ID NO: 128)

Las secuencia líder y del enlazador están subrayadas. Para promover la formación del heterodímero ALK5-Fc: Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos (ALK5-Fc: ALK5-Fc o Fc:Fc), se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando lisinas con aminoácidos aniónicos) en el dominio Fc del polipéptido de fusión como se indica. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:128 se puede proporcionar opcionalmente con una lisina añadida en el extremo C.

Este polipéptido de fusión ALK5-Fc está codificado por el siguiente ácido nucleico (SEQ ID NO: 129).

1 ATGGATGCAA TGAAGAGAGG GCTCTGCTGT GTGCTGCTGC TGTGTGGAGC

51 AGTCTTCGTT TCGCCCGGCG CCGCGCTGCT CCCGGGGGCG ACGGCGTTAC

101 AGTGTTTCTG CCACCTCTGT ACAAAAGACA ATTTTACTTG TGTGACAGAT

151 GGGCTCTGCT TTGTCTCTGT CACAGAGACC ACAGACAAAG TTATACACAA

201 CAGCATGTGT ATAGCTGAAA TTGACTTAAT TCCTCGAGAT AGGCCGTTTG

251 TATGTGCACC CTCTTCAAAA ACTGGGTCTG TGACTACAAC ATATTGCTGC

301 AATCAGGACC ATTGCAATAA AATAGAACTT CCAACTACTG TAAAGTCATC

351 ACCTGGCCTT GGTCCTGTGG AAACCGGTGG TGGAACTCAC ACATGCCCAC

401 CGTGCCCAGC ACCTGAACTC CTGGGGGGAC CGTCAGTCTT CCTCTTCCCC

451 CCAAAACCCA AGGACACCCT CATGATCTCC CGGACCCCTG AGGTCACATG

501 CGTGGTGGTG GACGTGAGCC ACGAAGACCC TGAGGTCAAG TTCAACTGGT

551 ACGTGGACGG CGTGGAGGTG CATAATGCCA AGACAAAGCC GCGGGAGGAG

601 CAGTACAACA GCACGTACCG TGTGGTCAGC GTCCTCACCG TCCTGCACCA

651 GGACTGGCTG AATGGCAAGG AGTACAAGTG CAAGGTCTCC AACAAAGCCC

701 TCCCAGCCCC CATCGAGAAA ACCATCTCCA AAGCCAAAGG GCAGCCCCGA

751 GAACCACAGG TGTACACCCT GCCCCCATCC CGGGAGGAGA TGACCAAGAA

801 CCAGGTCAGC CTGACCTGCC TGGTCAAAGG CTTCTATCCC AGCGACATCG

851 CCGTGGAGTG GGAGAGCAAT GGGCAGCCGG AGAACAACTA CGACACCACG

901 CCTCCCGTGC TGGACTCCGA CGGCTCCTTC TTCCTCTATA GCGACCTCAC

951 CGTGGACAAG AGCAGGTGGC AGCAGGGGAA CGTCTTCTCA TGCTCCGTGA

1001 TGCATGAGGC TCTGCACAAC CACTACACGC AGAAGAGCCT CTCCCTGTCT

1051 CCGGGT (:3EQ ID NO: :129)

La secuencia del polipéptido de fusión de ALK5-Fc maduro es como sigue (SEQ ID NO: 130) y se puede proporcionar opcionalmente con una lisina añadida en el extremo C.

1 ALLPGATALQ CFCHLCTKDN FTCVTDGLCF VSVTETTDKV IHNSMCIAEI

51 DLIPRDRPFV CAPSSKTGSV TTTYCCNQDH CNKIELPTTV KSSPGLGPVE

101 TGGGTHTCPP CPAPELLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCWVDVSH

151 EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRWSVLTV LHQDWLNGKE

201 YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLTCL

251 VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYDTTPPVL DSDGSFFLYS DLTVDKSRWQ

301 QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPG (SEQ ID NO: 130)

Como se describe en el Ejemplo 2, la forma complementaria del polipéptido G1Fc humano monomérico (SEQ ID NO: 140) emplea el líder TPA e incorpora una extensión N opcional. Para promover la formación del heterodímero de ALK5-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando residuos aniónicos con lisinas) en el polipéptido Fc monomérico como se indica. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:140 puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada. Este polipéptido Fc complementario se codifica por el ácido nucleico de SEQ ID NO: 141 y el polipéptido Fc monomérico maduro (SEQ ID NO: 142) puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada. El polipéptido de fusión de ALK5-Fc y el polipéptido Fc monomérico de SEQ ID NO: 130 y SEQ ID NO: 142, respectivamente, pueden coexpresarse y purificarse a partir de una línea celular CHO para dar lugar a un complejo proteico heteromérico de brazo único que comprende ALK5-Fc:Fc.

En otra estrategia para promover la formación de complejos heteromultiméricoss usando polipéptidos de fusión Fc asimétricos, los dominios Fc se alteran para introducir interacciones hidrofóbicas complementarias y un enlace disulfuro intermolecular adicional, como se ilustra en las secuencias de polipéptidos ALK5-Fc y Fc de SEQ ID NO: 419-420 y 427-428, respectivamente.

El polipéptido de fusión de ALK5-Fc (SEQ ID NO: 419) usa el líder TPA y es el siguiente:

1 MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SPGAALLPGA TALQCFCHLC TKDNFTCVTD

51 GLCFVSVTET TDKVIHNSMC IAEIDLIPRD RPFVCAPSSK TGSVTTTYCC

101 NQDHCNKIEL PTTVKSSPGL GPVETGGGTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP

151 PKPKDTLMIS RTPEVTCWV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE

201 QYNSTYRWS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR

251 EPQVCTLPPS REEMTKNQVS LSCAVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT

301 PPVLDSDGSF FLVSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS

351 PGK (:SEQ ID NO: -419)

La secuencia líder y el enlazador están subrayados. Para promover la formación del heterodímero ALK5-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir cuatro sustituciones de aminoácidos en el dominio Fc del polipéptido de fusión ALK5 como se indica por el doble subrayado anterior. La secuencia de aminoácidos de SEQ iD NO:419 puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

El polipéptido de fusión ALK5-Fc maduro (SEQ ID NO: 420) es como sigue y puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

1 ALLPGATALQ CFCHLCTKDN FTCVTDGLCF VSVTETTDKV IHNSMCIAEI

51 DLIPRDRPFV CAPSSKTGSV TTTYCCNQDH CNKIELPTTV KSSPGLGPVE

101 TGGGTHTCPP CPAPELLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVWDVSH

151 EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRWSVLTV LHQDWLNGKE

201 YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV CTLPPSREEM TKNQVSLSCA

251 VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLVS KLTVDKSRWQ

301 QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK (SEQ ID NO: 420)

Como se describe en el Ejemplo 2, la forma complementaria del polipéptido G1Fc monomérico (SEQ ID NO: 427) emplea el líder TPA e incorpora una extensión N opcional. Para promover la formación del heterodímero ALK5-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando una serina con una cisteína y una treonina con un triptófano) en el polipéptido Fc monomérico como se indica. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:427 y el polipéptido G1Fc monomérico maduro (SEQ ID NO: 428) puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

El polipéptido de fusión de ALK5-Fc y el polipéptido Fc monomérico de SEQ ID NO: 420 y SEQ ID NO: 428, respectivamente, pueden coexpresarse y purificarse a partir de una línea celular CHO para dar lugar a un complejo proteico heteromérico de un solo brazo que comprende ALK5-Fc:Fc.

La purificación de varios complejos ALK5-Fc: Fc podría lograrse mediante una serie de etapas de cromatografía en columna, que incluyen, por ejemplo, tres o más de los siguientes, en cualquier orden: cromatografía de proteína A, cromatografía de Q sefarosa, cromatografía de fenilsefarosa, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio catiónico. La purificación se podría completar con filtración vírica e intercambio de tampón.

Ejemplo 11. Generación de un heterodímero ALK6-Fc de brazo único

Los solicitantes prevén la construcción de un complejo heterodimérico de ALK6-Fc de brazo único soluble que comprende un polipéptido Fc monomérico con una extensión de extremo N corto y un segundo polipéptido en el que el dominio extracelular de ALK6 humano se fusionó a un dominio Fc separado con un enlazador posicionado entre el dominio extracelular y este segundo dominio Fc. Las construcciones individuales se denominan polipéptido Fc monomérico y polipéptido de fusión ALK6-Fc, respectivamente, y las secuencias para cada una se proporcionan a continuación. Los solicitantes también prevén complejos heterodiméricos ALK6-Fc de brazo único adicionales que comprenden el dominio extracelular de la isoforma 2 de ALK6 (SEQ ID NO: 92).

La formación de un heterodímero de ALK6-Fc de brazo único puede estar guiada por estrategias similares a las descritas para el heterodímero de ActRIIB-Fc de brazo único en el Ejemplo 1. En una primera estrategia, ilustrada en las secuencias de polipéptidos de ALK6-Fc y Fc monomérico de SEQ ID NO: 131-133 y 140-142, respectivamente, un dominio Fc se altera para introducir aminoácidos catiónicos en la cara de interacción, mientras que el otro dominio Fc se modifica para introducir aminoácidos aniónicos en la cara de interacción.

El polipéptido de fusión de ALK6-Fc emplea el líder TPA y es el siguiente:

1 MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SPGAKKEDGE STAPTPRPKV LRCKCHHHCP

51 EDSVNNICST DGYCFTMIEE DDSGLPWTS GCLGLEGSDF QCRDTPIPHQ

101 RRSIECCTER NECNKDLHPT LPPLKNRDFV DGPIHHRTGG GTHTCPPCPA

151 PELLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC WVDVSHEDP EVKFNWYVDG

201 VEVHNAKTKP REEQYNSTYR WSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP

251 IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW

301 ESNGQPENNY DTTPPVLDSD GSFFLYSDLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA

351 LHNHYTQKSL SLSPG (SEQ ID NO: 131)

Las secuencia líder y del enlazador están subrayadas. Para promover la formación del heterodímero ALK6-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos (ALK6-Fc:ALK6-Fc o Fc:Fc), se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando lisinas con aminoácidos aniónicos) en el dominio Fc del polipéptido de fusión como se indica por el doble subrayado anterior. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:131 se puede proporcionar opcionalmente con una lisina añadida en el extremo C.

Este polipéptido de fusión de ALK6-Fc está codificado por el siguiente ácido nucleico (SEQ ID NO: 132).

1 ATGGATGCAA TGAAGAGAGG GCTCTGCTGT GTGCTGCTGC TGTGTGGAGC

51 AGTCTTCGTT TCGCCCGGCG CCAAGAAAGA GGATGGTGAG AGTACAGCCC

101 CCACCCCCCG TCCAAAGGTC TTGCGTTGTA AATGCCACCA CCATTGTCCA

151 GAAGACTCAG TCAACAATAT TTGCAGCACA GACGGATATT GTTTCACGAT

201 GATAGAAGAG GATGACTCTG GGTTGCCTGT GGTCACTTCT GGTTGCCTAG

251 GACTAGAAGG CTCAGATTTT CAGTGTCGGG ACACTCCCAT TCCTCATCAA

301 AGAAGATCAA TTGAATGCTG CACAGAAAGG AACGAATGTA ATAAAGACCT

351 ACACCCTACA CTGCCTCCAT TGAAAAACAG AGATTTTGTT GATGGACCTA

401 TACACCACAG GACCGGTGGT GGAACTCACA CATGCCCACC GTGCCCAGCA

451 CCTGAACTCC TGGGGGGACC GTCAGTCTTC CTCTTCCCCC CAAAAC CCAA

501 GGACACCCTC ATGATCTCCC GGACCCCTGA GGTCACATGC GTGGTGGTGG

551 ACGTGAGCCA CGAAGACCCT GAGGTCAAGT TCAACTGGTA CGTGGACGGC

601 GTGGAGGTGC ATAATGCCAA GACAAAGCCG CGGGAGGAGC AGTACAACAG

651 CACGTACCGT GTGGTCAGCG TCCTCACCGT CCTGCACCAG GACTGGCTGA

701 ATGGCAAGGA GTACAAGTGC AAGGTCTCCA ACAAAGCCCT CCCAGCCCCC

751 AT CGAGAAAA CCATCTCCAA AGCCAAAGGG CAGCCCCGAG AACCACAGGT

801 GTACACCCTG CCCCCATCCC GGGAGGAGAT GACCAAGAAC CAGGTCAGCC

851 TGACCTGCCT GGTCAAAGGC TTCTATCCCA GCGACATCGC CGTGGAGTGG

901 GAGAGCAATG GGCAGCCGGA GAACAAC TAC GACACCACGC CTCCCGTGCT

951 GGACTCCGAC GGCTCCTTCT TCCTCTATAG CGACCTCACC GTGGACAAGA

1001 GCAGGTGGCA GCAGGGGAAC GTCTTCTCAT GCTCCGTGAT GCATGAGGCT

1051 CT GCACAAC C ACTACACGCA GAAGAGCCTC TCCCTGTCTC CGGGT

(SEQ ID NO : 132)

La secuencia del polipéptido de fusión de ALK6-Fc maduro es como sigue (SEQ ID NO: 133) y se puede proporcionar opcionalmente con una lisina añadida en el extremo C.

1 KKEDGESTAP TPRPKVLRCK CHHHCPEDSV NNICSTDGYC FTMIEEDDSG

51 LPWTSGCLG LEGSDFQCRD TPIPHQRRSI ECCTERNECN KDLHPTLPPL

101 KNRDFVDGPI HHRTGGGTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR

151 TPEVTCWVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV

201 LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR

251 EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYDTTP PVLDSDGSFF

301 LYSDLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP G

(SEQ ID NO: 133)

Como se describe en el Ejemplo 2, la forma complementaria del polipéptido G1Fc humano monomérico (SEQ ID NO: 140) emplea el líder TPA e incorpora una extensión N opcional. Para promover la formación del heterodímero de ALK6-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando residuos aniónicos con lisinas) en el polipéptido Fc monomérico como se indica. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:140 puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada. Este polipéptido Fc complementario se codifica por el ácido nucleico de SEQ ID NO: 141, y la proteína Fc monomérica madura (SEQ ID NO: 142) puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

El polipéptido de fusión de ALK6-Fc y el polipéptido Fc monomérico de SEQ ID NO: 133 y SEQ ID NO: 142, respectivamente, pueden coexpresarse y purificarse a partir de una línea celular CHO para dar lugar a un complejo proteico heteromérico de brazo único que comprende ALK6-Fc:Fc.

En otra estrategia para promover la formación de complejos heteromultiméricoss usando polipéptidos de fusión Fc asimétricos, los dominios Fc se alteran para introducir interacciones hidrofóbicas complementarias y un enlace disulfuro intermolecular adicional, como se ilustra en las secuencias de polipéptidos ALK6-Fc y Fc de SEQ ID NO: 421-422 y 427-428, respectivamente.

El polipéptido de fusión de ALK6-Fc (SEQ ID NO: 421) usa el líder TPA y es el siguiente:

1 MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SPGAKKEDGE STAPTPRPKV LRCKCHHHCP

51 EDSVNNICST DGYCFTMIEE DDSGLPWTS GCLGLEGSDF QCRDTPIPHQ

101 RRSIECCTER NECNKDLHPT LPPLKNRDFV DGPIHHRTGG GTHTCPPCPA

151 PELLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VWDVSHEDP EVKFNWYVDG

201 VEVHNAKTKP REEQYNSTYR WSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP

251 IEKTISKAKG QPREPQVCTL PPSREEMTKN QVSLSCAVKG FYPSDIAVEW

301 ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLVSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA

351 LHNHYTQKSL SLSPGK (SEQ ID NO: 421)

La secuencia líder y el enlazador están subrayados. Para promover la formación del heterodímero ALK6-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir cuatro sustituciones de aminoácidos en el dominio Fc del polipéptido de fusión ALK6 como se indica por el doble subrayado anterior. La secuencia de aminoácidos de SEQ iD NO:421 puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

El polipéptido de fusión ALK6-Fc maduro (SEQ ID NO: 422) es como sigue y puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

1 KKEDGESTAP TPRPKVLRCK CHHHCPEDSV NNICSTDGYC FTMIEEDDSG

51 LPWTSGCLG LEGSDFQCRD TPIPHQRRSI ECCTERNECN KDLHPTLPPL

101 KNRDFVDGPI HHRTGGGTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISR

151 TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRWSV

201 LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVCTLPPSR

251 EEMTKNQVSL SCAVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFF

301 LVSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK

(SEQ ID NO: 422)

Como se describe en el Ejemplo 2, la forma complementaria del polipéptido G1Fc monomérico (SEQ ID NO: 427) emplea el líder TPA e incorpora una extensión N opcional. Para promover la formación del heterodímero ALK6-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando una serina con una cisteína y una treonina con un triptófano) en el polipéptido Fc monomérico como se indica. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:427 y el polipéptido G1Fc monomérico maduro (SEQ ID NO: 428) puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

El polipéptido de fusión de ALK6-Fc y el polipéptido Fc monomérico de SEQ ID NO: 422 y SEQ ID NO: 428, respectivamente, pueden coexpresarse y purificarse a partir de una línea celular CHO para dar lugar a un complejo proteico heteromérico de un solo brazo que comprende ALK6-Fc:Fc.

La purificación de varios complejos ALK6-Fc: Fc podría lograrse mediante una serie de etapas de cromatografía en columna, que incluyen, por ejemplo, tres o más de los siguientes, en cualquier orden: cromatografía de proteína A, cromatografía de Q sefarosa, cromatografía de fenilsefarosa, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio catiónico. La purificación se podría completar con filtración vírica e intercambio de tampón.

Ejemplo 12. Generación de un heterodímero ALK7-Fc de brazo único

Los solicitantes prevén la construcción de un complejo heterodimérico ALK7-Fc de brazo único soluble que comprende un polipéptido Fc monomérico con una extensión de extremo N corta y un segundo polipéptido en el que el dominio extracelular truncado en el extremo N (NA4) de ALK7 humana se fusiona con un dominio Fc con un enlazador posicionado entre el dominio extracelular y este segundo dominio Fc. Las construcciones individuales se denominan polipéptido Fc monomérico y polipéptido de fusión ALK7-Fc, respectivamente, y las secuencias para cada una se proporcionan a continuación. Los solicitantes también prevén complejos heterodiméricos ALK7-Fc de brazo único adicionales que comprenden otras variantes N-terminalmente truncadas (por ejemplo, variante NA5) de la isoforma 1 de ALK7 (s Eq ID NO: 313), el dominio extracelular de la isoforma 2 de a Lk7 (s Eq ID NO: 302), o secuencias procesadas nativas de las isoformas 3 y 4 de ALK7 (SEQ ID NO: 306, 310).

La formación de un heterodímero de ALK7-Fc de brazo único puede estar guiada por estrategias similares a las descritas para el heterodímero de ActRIIB-Fc de brazo único en el Ejemplo 1. En una primera estrategia, ilustrada en las secuencias de polipéptidos de ALK7-Fc y Fc monomérico de SEQ ID NO: 134-136 y 140-142, respectivamente, un dominio Fc se altera para introducir aminoácidos catiónicos en la cara de interacción, mientras que el otro dominio Fc se modifica para introducir aminoácidos aniónicos en la cara de interacción.

El polipéptido de fusión de ALK7-Fc emplea el líder TPA y es el siguiente:

1 MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SPGAGLKCVC LLCDSSNFTC QTEGACWASV

51 MLTNGKEQVI KSCVSLPELN AQVFCHSSNN VTKTECCFTD ECNNITLHLP

101 TASPNAPKLG PMETGGGTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR

151 TPEVTCWVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV

201 LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR

251 EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYDTTP PVLDSDGSFF

301 LYSDLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP G

(SEQ ID NO: 134)

Las secuencia líder y del enlazador están subrayadas. Para promover la formación del heterodímero ALK7-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos (ALK7-Fc:ALK7-Fc o Fc:Fc), se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando lisinas con aminoácidos aniónicos) en el dominio Fc del polipéptido de fusión como se indica por el doble subrayado anterior. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:134 se puede proporcionar opcionalmente con una lisina añadida en el extremo C.

Este polipéptido de fusión ALK7-Fc se codifica por el siguiente ácido nucleico (SEQ ID NO:135).

1 ATGGATGCAA TGAAGAGAGG GCTCTGCTGT GTGCTGCTGC TGTGTGGAGC

51 AGTCTTCGTT TCGCCCGGCG CCGGACTGAA GTGTGTATGT CTTTTGTGTG

101 ATTCTTCAAA CTTTACCTGC CAAACAGAAG GAGCATGTTG GGCATCAGTC

151 ATGCTAACCA ATGGAAAAGA GCAGGTGATC AAATCCTGTG TCTCCCTTCC

201 AGAACTGAAT GCTCAAGTCT TCTGTCATAG TTCCAACAAT GTTACCAAAA

251 CCGAATGCTG CTTCACAGAT TTTTGCAACA ACATAACACT GCACCTTCCA

301 ACAGCATCAC CAAATGCCCC AAAACTTGGA CCCATGGAGA CCGGTGGTGG

351 AACTCACACA TGCCCACCGT GCCCAGCACC TGAACTCCTG GGGGGACCGT

401 CAGTCTTCCT CTTCCCCCCA AAACCCAAGG ACACCCTCAT GATCTCCCGG

451 ACCCCTGAGG TCACATGCGT GGTGGTGGAC GTGAGCCACG AAGACCCTGA

501 GGTCAAGTTC AACTGGTACG TGGACGGCGT GGAGGTGCAT AATGCCAAGA

551 CAAAGCCGCG GGAGGAGCAG TACAACAGCA CGTACCGTGT GGTCAGCGTC

601 CTCACCGTCC TGCACCAGGA CTGGCTGAAT GGCAAGGAGT ACAAGTGCAA

651 GGTCTCCAAC AAAGCCCTCC CAGCCCCCAT CGAGAAAACC ATCTCCAAAG

701 CCAAAGGGCA GCCCCGAGAA CCACAGGTGT ACACCCTGCC CCCATCCCGG

751 GAGGAGATGA CCAAGAACCA GGTCAGCCTG ACCTGCCTGG TCAAAGGCTT

801 CTATCCCAGC GACATCGCCG TGGAGTGGGA GAGCAATGGG CAGCCGGAGA

851 ACAACTACGA CACCACGCCT CCCGTGCTGG ACTCCGACGG CTCCTTCTTC

901 CTCTATAGCG ACCTCACCGT GGACAAGAGC AGGTGGCAGC AGGGGAACGT

951 CTTCTCATGC TCCGTGATGC ATGAGGCTCT GCACAACCAC TACACGCAGA

1001 AGAGCCTCTC CCTGTCTCCG GGT (:SEQ ID NO: 135)

Se espera que la secuencia del polipéptido de fusión ALK7-Fc maduro sea la siguiente (SEQ ID NO: 136) y se puede proporcionar opcionalmente con una lisina añadida en el extremo C.

1 GLKCVCLLCD SSNFTCQTEG ACWASVMLTN GKEQVIKSCV SLPELNAQVF

51 CHSSNNVTKT ECCFTDFCNN ITLHLPTASP NAPKLGPMET GGGTHTCPPC

101 PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE DPEVKFNWYV

151 DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP

201 APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV

251 EWESNGQPEN NYDTTPPVLD SDGSFFLYSD LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH

301 EALHNHYTQK SLSLSPG (SEQ ID NO: 136)

Como se describe en el Ejemplo 2, la forma complementaria del polipéptido G1Fc humano monomérico (SEQ ID NO: 140) emplea el líder TPA e incorpora una extensión N opcional. Para promover la formación del heterodímero de ALK7-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando residuos aniónicos con lisinas) en el polipéptido Fc monomérico como se indica. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:140 puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada. Este polipéptido Fc complementario se codifica por el ácido nucleico de SEQ ID NO: 141 y el polipéptido Fc monomérico maduro (SEQ ID NO: 142) puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada. El polipéptido de fusión de ALK7-Fc y el polipéptido Fc monomérico de SEQ ID NO: 136 y SEQ ID NO: 142, respectivamente, pueden coexpresarse y purificarse a partir de una línea celular CHO para dar lugar a un complejo proteico heteromérico de brazo único que comprende ALK7-Fc:Fc.

En otra estrategia para promover la formación de complejos heteromultiméricoss usando polipéptidos de fusión Fc asimétricos, los dominios Fc se alteran para introducir interacciones hidrofóbicas complementarias y un enlace disulfuro intermolecular adicional, como se ilustra en las secuencias de polipéptidos ALK7-Fc y Fc de SEQ ID NO: 423-424 y 427-428, respectivamente.

El polipéptido de fusión de ALK7-Fc (SEQ ID NO: 423) usa el líder TPA y es el siguiente:

1 MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SPGAGLKCVC LLCDSSNFTC QTEGACWASV

51 MLTNGKEQVI KSCVSLPELN AQVFCHSSNN VTKTECCFTD FCNNITLHLP

101 TASPNAPKLG PMETGGGTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR

151 TPEVTCWVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV

201 LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVCTLPPSR

251 EEMTKNQVSL SCAVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF

301 LVSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK

(SEQ ID NO:: 423)

La secuencia líder y el enlazador están subrayados. Para promover la formación del heterodímero ALK7-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir cuatro sustituciones de aminoácidos en el dominio Fc del polipéptido de fusión ALK7 como se indica por el doble subrayado anterior. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:423 puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

El polipéptido de fusión ALK7-Fc maduro (SEQ ID NO: 424) se espera que sea como sigue y opcionalmente se puede proporcionar con la lisina del extremo C eliminada.

1 GLKCVCLLCD SSNFTCQTEG ACWASVMLTN GKEQVIKSCV SLPELNAQVF

51 CHSSNNVTKT ECCFTDFCNN ITLHLPTASP NAPKLGPMETGGGTHTCPPC

101 PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE DPEVKFNWYV

151 DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALP

201 APIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSREEMT KNQVSLSCAVKGFYPSDIAV

251 EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMH

301 EALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO: 424)

Como se describe en el Ejemplo 2, la forma complementaria del polipéptido G1Fc monomérico (SEQ ID NO: 427) emplea el líder TPA e incorpora una extensión N opcional. Para promover la formación del heterodímero ALK7-Fc:Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando una serina con una cisteína y una treonina con un triptófano) en el polipéptido Fc monomérico como se indica. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:427 y el polipéptido G1Fc monomérico maduro (SEQ ID NO: 428) puede proporcionarse opcionalmente con la lisina de extremo C eliminada.

El polipéptido de fusión de ALK7-Fc y el polipéptido Fc monomérico de SEQ ID NO: 424 y SEQ ID NO: 428, respectivamente, pueden coexpresarse y purificarse a partir de una línea celular CHO para dar lugar a un complejo proteico heteromérico de un solo brazo que comprende ALK7-Fc:Fc.

La purificación de varios complejos ALK7-Fc: Fc podría lograrse mediante una serie de etapas de cromatografía en columna, que incluyen, por ejemplo, tres o más de los siguientes, en cualquier orden: cromatografía de proteína A, cromatografía de Q sefarosa, cromatografía de fenilsefarosa, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio catiónico. La purificación se podría completar con filtración vírica e intercambio de tampón.

Juntos, estos ejemplos demuestran que los polipéptidos receptores de tipo I o tipo II, cuando se colocan en el contexto de un complejo proteico heteromérico de brazo único, forman bolsas de unión novedosas que exhiben una selectividad alterada con respecto a un complejo homodimérico del mismo polipéptido receptor, lo que permite la formación de nuevos agentes proteicos para su posible uso como agentes terapéuticos.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un complejo proteico que comprende un primer polipéptido asociado covalentemente o no covalentemente con un segundo polipéptido, donde:

a. el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de un primer miembro de un par de interacción y la secuencia de aminoácidos de un polipéptido receptor de tipo II de la superfamilia de TGFp, donde el polipéptido receptor de tipo II de la superfamilia de TGFp es un polipéptido de ActRIIB, donde el polipéptido de ActRIIB comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 85 % idéntica a los aminoácidos 29-109 de SEQ ID NO: 1, y donde el primer polipéptido comprende una leucina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición 79 de SeQ ID nO: 1; y

b. el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de un segundo miembro del par de interacción, y donde el segundo polipéptido no comprende un polipéptido receptor de tipo II de la superfamilia de TGFp; donde el primer miembro del par de interacción es un Fc que comprende un dominio de multimerización, y donde el segundo miembro del par de interacción es un Fc que comprende un dominio de multimerización y donde el polipéptido ActRIIB es capaz de unirse a GDF8 y/o GDF11.

2. El complejo proteico de la reivindicación 1, donde el polipéptido receptor de tipo II de la superfamilia de TGFp es un polipéptido de ActRIIB que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos que es:

a. por lo menos 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de cualquiera de SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5 y 6; o

b. por lo menos 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a un polipéptido que comienza en cualquiera de los aminoácidos 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29 de SEQ ID NO: 1, y termina en cualquiera de los aminoácidos 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134 de SEQ ID NO: 1.

3. El complejo proteico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde el complejo proteico es un heterodímero recombinante.

4. El complejo proteico de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el primer miembro del par de interacción comprende una primera región constante de una cadena pesada de IgG, y/o donde el segundo miembro del par de interacción comprende una segunda región constante de una cadena pesada de IgG.

5. El complejo proteico de la reivindicación 4, donde la región constante es un dominio Fc de inmunoglobulina.

6. El complejo proteico de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde el primer polipéptido y / o el segundo polipéptido comprende uno o más residuos de aminoácidos modificados seleccionados de entre: un aminoácido glicosilado, un aminoácido PEGilado, un aminoácido farnesilado, un aminoácido acetilado ácido, un aminoácido biotinilado, un aminoácido conjugado con un resto lipídico y un aminoácido conjugado con un agente derivatizante orgánico.

7. El complejo proteico de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde el complejo proteico tiene una o más de las siguientes características: i) se une a un ligando de la superfamilia de TGF-beta con una K^d menor o igual a 10' 7.10‘8, 10‘9, o 10_1° M; e ii) inhibe una transducción de señal mediada por receptor de tipo I y/o tipo II de la superfamilia de TGF-beta a una célula.

8. El complejo proteico de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde el complejo proteico se une a uno o más de: BMP10, GDF8, GDF11/BMP11, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina AE, activina BC o activina BE.

9. El complejo proteico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde el complejo proteico inhibe la actividad de uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-beta en un ensayo basado en células; donde el ligando de la superfamilia TGF-beta se selecciona de: BMP10, GDF8, GDF11/BMP11, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina AE, activina BC o activina BE.

10. El complejo proteico de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde el polipéptido ActRIIB comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a los aminoácidos 29-109 de SEQ ID NO: 1.

11. El complejo proteico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde el polipéptido ActRIIB comprende los aminoácidos 29-109 de SEQ ID NO: 1.

12. El complejo proteico de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, donde el primer polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a SEQ ID NO: 404, y donde el segundo polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a SEQ ID NO: 426.

13. El complejo proteico según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, donde el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 404, y donde el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 426.

14. El complejo proteico de la reivindicación 5, donde el dominio Fc de inmunoglobulina es un dominio de inmunoglobulina Fc de IgG1.

15. Una preparación farmacéutica que comprende el complejo proteico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.