ES2864007T3

ES2864007T3 - Células inmunitarias que expresan un receptor de unión a antígeno y un receptor coestimulador quimérico

Info

Publication number: ES2864007T3
Application number: ES17825148T
Authority: ES
Inventors: Dominik Lock; Mario Assenmacher; Andrew Kaiser
Original assignee: Miltenyi Biotec GmbH
Current assignee: Miltenyi Biotec GmbH
Priority date: 2016-12-15
Filing date: 2017-12-11
Publication date: 2021-10-13
Anticipated expiration: 2037-12-11
Also published as: US20190388468A1; EP3555139B1; US20240122976A1; WO2018108766A1; CN110062768A; EP3555139A1; US11890300B2; EP3336107A1

Abstract

Una célula efectora inmunitaria que comprende: a) un receptor de unión a antígeno, en la que dicho receptor de unión a antígeno se une a un marcador de un polipéptido marcado, y en la que el polipéptido de dicho polipéptido marcado se une a un antígeno expresado en la superficie de una célula diana que se va a matar, y en la que la unión de dicho receptor de unión a antígeno a dicho marcador activa y estimula una respuesta inmunitaria de dicha célula efectora inmunitaria, lo cual conduce a una actividad citotóxica y a la liberación de citoquinas de dicha célula efectora inmunitaria, en la que dicho receptor de unión a antígeno es un receptor de antígenos quimérico (CAR) que comprende un dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de señalización citoplasmático que comprende al menos un dominio de señalización citoplásmico primario y al menos un dominio de señalización coestimulador, en la que dicho dominio de unión al antígeno de dicho CAR se une al marcador de dicho polipéptido marcado, y b) un receptor coestimulador quimérico (CCR), en la que dicho CCR se une a un antígeno adicional, en la que dicho antígeno adicional no se expresa en la superficie de dicha célula diana, y en la que la unión de dicho CCR a dicho antígeno adicional refuerza dicha respuesta inmunitaria de dicha célula efectora inmunitaria y/o asegura la supervivencia de dicha célula efectora inmunitaria, en la que dicho CCR comprende un dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana y una parte citoplásmica que comprende al menos un dominio coestimulador, en la que dicho CCR no comprende CD3ζ, y en la que dicho dominio de unión al antígeno de dicho CCR se une a dicho antígeno adicional, en la que dicho CCR no puede mediar en dicha respuesta inmunitaria por sí solo, y en la que la magnitud de la potenciación de la respuesta efectora de la célula inmunitaria que expresa tanto el CAR como el CCR es al menos 1,5 veces mayor en comparación con la respuesta efectora de la célula inmunitaria que es activada y estimulada únicamente por el CAR, y que no es reforzada por el CCR.

Description

DESCRIPCIÓN

Células inmunitarias que expresan un receptor de unión a antígeno y un receptor coestimulador quimérico

Campo de la invención

La presente invención se refiere generalmente al campo de los receptores de unión a antígeno, por ejemplo, receptores quiméricos de unión a antígeno (CAR) expresados en la superficie de células inmunitarias para el tratamiento de un trastorno, tal como el cáncer, en particular a células inmunitarias que coexpresan un receptor coestimulador quimérico (CCR).

Antecedentes de la invención

La redirección de células T hacia antígenos tumorales mediante la expresión de receptores de antígenos quiméricos transgénicos aprovecha los potentes mecanismos efectores celulares mediante el reconocimiento independiente del antígeno leucocitario humano (HLA). El potencial de esta estrategia se ha demostrado recientemente en ensayos clínicos, en los que se infundieron células T que expresan CAR en pacientes adultos y pediátricos con neoplasias malignas de células B, neuroblastoma y sarcoma. Los CAR son receptores recombinantes que normalmente se dirigen a moléculas de la superficie. Los CAR se componen típicamente de un resto extracelular de reconocimiento de antígenos que está unido, mediante dominios espaciadores/bisagra y transmembrana, a un dominio de señalización intracelular que puede incluir dominios coestimuladores y restos de activación de células T. Los CAR reconocen los antígenos no procesados independientemente de su expresión de los antígenos de histocompatibilidad mayor, a diferencia de los receptores fisiológicos de células T (TCR). Por lo tanto, las células T con CAR pueden eludir algunos de los principales mecanismos mediante los cuales los tumores evitan el reconocimiento de células T restringidas por la clase mayor de histocompatibilidad (MHC), como la infrarregulación de la expresión de HLA o el procesamiento de antígenos proteasómicos, dos mecanismos que contribuyen al escape tumoral de la inmunidad mediada por TCR. Otra característica de los CAR es su capacidad para unirse no solo a proteínas, sino también a carbohidratos, gangliósidos, proteoglicanos y proteínas muy glicosiladas, ampliando así la gama de objetivos potenciales. Los CAR se unen a la diana a través del resto de reconocimiento de antígenos, a menudo un fragmento variable monocatenario (scFv) derivado de anticuerpos o un fragmento Fab (revisado, por ejemplo, en Dai et a l, 2016, J. Natl. Cancer Inst., 108 (7): djv439). El documento WO2014/055657A1 describe una composición de señalización trans que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un primer CAR y un segundo CAR, en la que el primer CAR comprende un primer dominio de unión al antígeno, un primer dominio transmembrana y un dominio intracelular de una molécula coestimuladora, y en la que el el segundo CAR comprende un segundo dominio de unión al antígeno, un segundo dominio transmembrana y un dominio intracelular de un receptor de células T, normalmente un único dominio de señalización de CD3Z. El primer dominio de unión al antígeno se une a una primera diana y el segundo dominio de unión al antígeno se une a una segunda diana, y la primera y la segunda diana son cada una un antígeno tumoral asociado con un tumor sólido. La activación suficiente de las células T con CAR ocurre solo cuando el dominio intracelular del receptor de las células T del primer CAR está activo y el dominio intracelular de la molécula coestimuladora del segundo CAR está activo en la célula T. Es una desventaja del sistema CAR descrito que, en un microambiente de tumor sólido hostil e inmunosupresor, la respuesta de las células T con CAR es muy difícil de instigar y mantener.

En el documento WO2014/055668A1 se describe una célula inmunosensible, y la célula comprende a) un receptor de reconocimiento de antígenos que se une a un primer antígeno con baja afinidad, en la que la unión del receptor al primer antígeno activa la célula inmunosensible, yb) un receptor coestimulante quimérico (CCR) que se une a un segundo antígeno y estimula la célula inmunosensible. El dominio de señalización intracelular del receptor de reconocimiento de antígenos consta únicamente del dominio de señalización de CD3Z. La activación de una célula inmunosensible mediante la unión del receptor que reconoce el antígeno al primer antígeno conduce a una inducción de la transducción de señales o a cambios en la expresión de proteínas en la célula, lo que resulta simplemente en el inicio de una respuesta inmunitaria. La estimulación de una célula inmunosensible mediante la unión del CCR a un segundo antígeno conduce a una señal que da como resultado una respuesta inmunitaria robusta y sostenida después de la activación de la célula inmunitaria que no es posible con la activación del primer receptor por sí solo. Los antígenos se seleccionan de antígenos tumorales o antígenos de virus.

El documento WO2015/07547A1 describe una célula T que coexpresa un primer receptor de antígenos quimérico (CAR) y un segundo CAR en la superficie celular, y cada CAR comprende, (i) un dominio de unión al antígeno, (ii) un espaciador, (iii) un dominio transmembrana y (iv) un endodominio, en la que los dominios de unión al antígeno del primer y segundo CAR se unen a diferentes antígenos, y en el que uno del primer o segundo CAR es un CAR activador que comprende un endodominio activador y el otro CAR es un CAR inhibidor que comprende un endodominio inhibidor del acoplamiento.

Roybal et al. (2016, Cell, 164, 1-10) diseñaron un circuito de células T activado combinatoriamente en el que un receptor Notch sintético para un antígeno induce la expresión de un CAR para un segundo antígeno. Estas células T de receptor dual y apertura AND solo se arman y activan en presencia de células tumorales de antígenos duales. Estas células T muestran una discriminación terapéutica precisa in vivo que evita a los tumores "espectadores" de un solo antígeno mientras que eliminan eficazmente los tumores "patológicos" del antígeno combinatorio.

Generalmente, las células tumorales pueden secretar citoquinas que reclutan células supresoras, como T ^reg, células dendríticas inmaduras o células supresoras derivadas de mieloides que inhiben las respuestas de las células T a través de una variedad de mecanismos, por ejemplo, la liberación de citoquinas inmunosupresoras, como IL10 o TGFp. Esto conduce a un microentorno en el que las respuestas inmunitarias son difíciles de instigar y mantener. Además, debido a la heterogeneidad del tumor, se seleccionan las células tumorales que son menos inmunogénicas o tienen factores inmunosupresores sobrerregulados. Estas células pueden subvertir la respuesta inmunitaria y escapar de la vigilancia inmunitaria.

Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de un sistema de receptores alternativo o mejorado, por ejemplo, un sistema CAR, expresado en la superficie de una célula inmunitaria que permite el tratamiento de un trastorno, como el cáncer, utilizando dicha célula inmunitaria.

Sumario de la invención

Una célula modificada genéticamente que coexpresa un receptor reactivo diana, es decir, un receptor de unión a antígenoa, tal como un CAR, y un receptor de refuerzo, es decir, un receptor coestimulador quimérico (CCR), puede, por ejemplo, disminuir los efectos de un entorno tumoral inhóspito, es decir, un medio inmunosupresor que a menudo se asocia con una reactividad tumoral disminuida de células inmunitarias modificadas genéticamente o puede, por ejemplo, asegurar la supervivencia de la célula inmunitaria modificada genéticamente. Por ejemplo, las células inmunitarias modificadas genéticamente que expresan un CAR infarrregulan y/o inactivan su CAR en tales entornos tumorales inhóspitos y, por lo tanto, están fuertemente restringidas con respecto a su potencial citolítico. Estas células modificadas con genes también tienen una persistencia mejorada en un sujeto y pueden ser reforzadas en el caso de una posible recurrencia del tumor mediante la reactivación del receptor de refuerzo. El receptor reactivo diana puede ser un primer receptor de unión a antígeno, como un primer receptor de antígenos quimérico (CAR) o un receptor de células T (TCR) endógeno o transgénico dirigido contra un antígeno expresado en la superficie de una célula diana, como una célula cancerosa (entonces el primer antígeno es un antígeno asociado a tumor) o se une a un marcador que está acoplado a un polipéptido, tal como un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, en el que dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo se une a un antígeno expresado en la superficie de una célula diana, y el receptor de refuerzo puede ser un segundo receptor de unión a antígeno (por ejemplo, un segundo CAR) que es un receptor coestimulador quimérico (CCR) dirigido contra otro antígeno. El primer receptor de unión a antígeno puede ser, por ejemplo, un CAR que media en una respuesta de células efectoras inmunitarias mediante la unión de dicho CAR a dicho primer antígeno expresado en la superficie de una célula diana o dicho marcador. Las construcciones de CAR que ejecutan tales respuestas de células efectoras inmunitarias son bien conocidas en la técnica. El receptor coestimulador quimérico solo refueza la respuesta inmunitaria de la célula manipulada que coexpresa el CAR y el CCR cuando dicho CCR se activa mediante la unión del CCR al antígeno adicional y cuando el CAR se activa mediante la unión del CAR al antígeno expresado en la superficie de una célula diana o al marcador. Es un hallazgo sorprendente que el efecto de refuerzo del CCR se obtenga mediante un diseño de módulo especial del segundo receptor de unión a antígeno, el CCR. El antígeno adicional también se puede expresar en la superficie de la célula diana, por ejemplo, puede ser un antígeno asociado a un tumor, o el antígeno adicional puede expresarse en la superficie de una segunda célula diana, en la que dicha segunda célula diana preferentemente no se encuentra en un estado patológico, por ejemplo, la segunda célula diana es una célula B que expresa dicho antígeno adicional, por ejemplo, CD20. Como alternativa, el antígeno adicional es un antígeno que no se expresa en la superficie de una célula (diana), por ejemplo, es un dextrano. La administración de dextrano a un sujeto que necesita ser tratado con células inmunitarias como se describe en el presente documento puede permitir una respuesta inmunitaria controlada y sostenida de estas células también en un entorno tumoral inhóspito o puede reactivar dichas células con genes modificados, por ejemplo, en el caso de una recurrencia tumoral. Además, la activación del receptor coestimulador quimérico coexpresado puede asegurar la supervivencia de la célula efectora manipulada tan pronto como no esté presente ningún antígeno para el receptor de unión a antígeno, por ejemplo, mediante el reconocimiento de CD20 en células B omnipresentes por el CCR anti-CD20 o mediante el reconocimiento del dextrano que se administra a un paciente por el CCR anti-dextrano.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Representación esquemática de diferentes variantes del sistema de refuerzo. Una célula efectora inmunitaria que coexpresa un receptor de unión a antígeno dirigido contra un antígeno (AG 1) expresado sobre una célula diana y un receptor coestimulador quimérico (CCR) dirigido contra a) un segundo antígeno expresado sobre la célula diana (AG 2), b) un segundo antígeno expresado sobre una segunda célula diana (AG 3), c) CD20 expresado sobre células B (AG 4), d) dextrano soluble o e) un anticuerpo conjugado con dextrano que reconoce específicamente un antígeno expresado sobre la célula diana (AG 2) o sobre una segunda célula diana (AG 3 o AG 4). Para el refuerzo de CAR anti-LLE, la célula efectora inmunitaria comprende un CAR que se une a un anticuerpo biotinilado que es específico para un antígeno expresado sobre una célula diana (AG 1) y un CCR dirigido contra f) un antígeno expresado sobre la célula diana. (AG 2) o un anticuerpo conjugado con dextrano específico para un segundo antígeno expresado sobre la célula diana o g) CD20 expresado sobre células B (AG 4) o un anticuerpo conjugado con dextrano que se une a un antígeno expresado sobre una segunda célula diana (AG 3 o AG 4).

Figura 2: Representación esquemática de los diferentes formatos de CAR anti-HMW-MAA. La secuencia conductora "L" se deriva de CD8 humano (SEQ ID NO:1) o Igkv4 murino (SEQ ID NO:2), los scFv se derivan de SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4, la bisagra y los espaciadores "H" y "CH2", "CH3" y "CD8" se derivan de IgG4 humana o CD8 humano (SEQ ID NO:5-8), respectivamente. El dominio transmembrana "TM" procede de CD8 humano (SEQ ID NO:9), mientras que los dominios coestimuladores y de señalización proceden de 4-1 BB (SEQ ID NO:10) y CD3Z (SEQ ID NO:11). Todos los CAR se expresan junto con el gen marcador ALNGFR unido por un elemento 2A (SEQ ID NO:12).

Figura 3: Representación esquemática de los diferentes formatos de CCR anti-CD20. La secuencia conductora "L" se deriva de c D8 humano (SEQ ID NO:1), scFv se deriva de SEQ ID NO:13, la bisagra y los espaciadores "H" y "CH2", "CH3" y "CD8" se derivan de IgG4 humana (SEQ ID NO:5), CD8 humano (SEQ ID No :8) o IgG 1 humana (SEQ ID NO:14). El dominio transmembrana "TM" procede de CD8 humano (SEQ ID NO:9), mientras que los dominios coestimuladores proceden de 4-1 BB (SEQ ID NO:10) y/o CD28 (SEQ ID NO:16). Todos los CCR se expresan junto con el gen marcador AEGFR unido por un elemento 2A (SEQ ID NO:15).

Figura 4: Ejemplo de expresión transgénica de ALNGFR y AEGFR de células T primarias después de la cotransducción lentiviral con un CAR anti-HMW-MAA y un CCR anti-CD20 el día 6 después de la activación. Ambos marcadores de superficie se expresaron con una frecuencia del 10,9 %.

Figura 5: Ejemplo de expresión transgénica de ALNGFR y AEGFR de células T primarias (día 16) después de un enriquecimiento de células T cotransducidas en el día 7. La frecuencia de células T que coexpresan ALNGFR y AEGFR podría aumentarse del 10,9 % al 55,0 %.

Figura 6: a) Datos sobre la producción de IFN-y , IL-2, IL-6 y TNF-a de células T que coexpresan CAR anti-HMW-MAA y CCR anti-CD20 (señalización 4-1 BB_4-1 BB), células T no transducidas (Mock) así como células T transducidas con CAR anti-HMW-MAA o CCR anti-CD20 (control) después de un cocultivo con células Mel526 (HMW-MAA+) en presencia o ausencia de células JeKo-1 (CD20+) durante 24 h.2 duplicados biológicos; n = 2; 50000 pg/ml fue el límite de detección de MACSplex. b) Datos sobre la producción de IFN-y , IL-2, IL-6 y TNF-a de células T que coexpresan CAR anti-HMW-MAA y CCR anti-CD20 (señalización 4-1BB), células T no transducidas (Mock), así como células T transducidas con CAR anti-HMW-MAA o CCR anti-CD20 (control) después de cocultivarlas con células Mel526 (HMW-MAA+) en presencia o ausencia de células JeKo-1 (CD20 ) durante 24 h .2 duplicados biológicos; n = 2; 50000 pg/ml fue el límite de detección de MACSplex. c) Datos sobre la producción de IFN-y , IL-2, IL-6 y TNF-a de células T que coexpresan CAR anti-HMW-MAA y CCR anti-CD20 (señalización CD28_CD28), células T no transducidas (Mock) así como células T transducidas con CAR anti-HMW-MAA o CCR anti-CD20 (control) después de cocultivarlas con células Mel526 (HMW-MAA+) en presencia o ausencia de células JeKo-1 (CD20+) durante 24 h. 2 duplicados biológicos; n = 2; 50000 pg/ml fue el límite de detección de MACSplex. d) Datos sobre la producción de IFN-y , IL-2, IL-6 y TNF-a de células T que coexpresan CAR anti-HMW-MAA y CCR anti-CD20 (señalización de CD28), células T no transducidas (Mock) así como células T transducidas con CAR anti-HMW-MAA o CCR anti-CD20 (control) después de cocultivarlas con células Mel526 (HMW-MAA+) en presencia o ausencia de células JeKo-1 (CD20+) durante 24 h. 2 duplicados biológicos; n = 2; 50000 pg/ml fue el límite de detección de MACSplex. e) Datos sobre la producción de IFN-y , IL-2, IL-6 y TNF-a de células T que coexpresan CAR anti-HMW-MAA y CCR anti-CD20 (señalización CD28_4-1BB), linfocitos T no transducidos ( Mock), así como células T transducidas con CAR anti-HMW-MAA o CCR anti-CD20 (control) después de cocultivarlas con células Mel526 (HMW-MAA+) en presencia o ausencia de células JeKo-1 (CD20+) durante 24 h. 2 duplicados biológicos; n = 2; 50000 pg/ml fue el límite de detección de MACSplex.

Figura 7: a) Datos sobre la producción de IFN-y , IL-2, IL-6 y TNF-a de células T que coexpresan CAR anti-HMW-MAA y CCR anti-CD20 (con señalización 4-1 BB_4-1 BB, señalización 4-1 BB o señalización CD28_4-1 BB), así como células T transducidas con CAR anti-HMW-MAA o CCR anti-CD20 (control) después de cocultivarlas con células transgénicas Mel526 (HMW-MAA+ y CD20+) durante 24 h. 2 duplicados biológicos; n = 2; 10000 pg/ml fue el límite de detección de MACSplex. b) Datos sobre la producción de IFN-y , IL-2, IL-6 y TNF-a de células T que coexpresan CAR anti-HMW-MAA y CCR anti-CD20 (con señalización CD28_CD28 o señalización CD28), así como células T transducidas con CAR anti-HMW-MAA o CCR anti-CD20 (control) después de cocultivarlas con células Mel526 transgénicas (HMW-MAA+ y CD20+) durante 24 h. 2 duplicados biológicos; n = 2; 10000 pg/ml fue el límite de detección de MACSplex.

Figura 8: Ensayo de citotoxicidad basado en luminiscencia. Células T que coexprsan CAR anti-HMW-MAA y CCR anti-CD20 (con señalización 4-1BB_4-1BB, señalización CD28_4-1BB, señalización 4-1BB, señalización CD28 o señalización CD28_CD28) y células T c A r anti-HMW-MAA (control HMW-MAA) se cocultivaron con células Mel526 transgénicas (HMW-MAA+ y CD20+) durante 18 h. Posteriormente, se midió la luminiscencia usando un lector de placas de luminiscencia.

Descripción detallada de la invención

En un primer aspecto, la invención proporciona una célula efectora inmunitaria que comprende

a) un receptor de unión a antígeno, en la que dicho receptor de unión a antígeno se une a un marcador de un polipéptido marcado, y en la que el polipéptido de dicho polipéptido marcado se une a un antígeno expresado en la superficie de una célula diana que se va a matar,

y en la que la unión de dicho receptor de unión a antígeno a dicho marcador activa y estimula una respuesta inmunitaria de dicha célula efectora inmunitaria, lo cual conduce a una actividad citotóxica y a la liberación de citoquinas de dicha célula efectora inmunitaria,

en la que dicho receptor de unión a antígeno es un receptor de antígenos quimérico (CAR) que comprende o consiste en un dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de señalización citoplásmico que comprende al menos un dominio de señalización citoplásmico primario y al menos un dominio de señalización coestimulador, en la que dicho dominio de unión al antígeno de dicho CAR se une al marcador de dicho polipéptido marcado, y

b) un receptor coestimulador quimérico (CCR), en la que dicho CCR se une a un antígeno adicional, en la que dicho antígeno adicional no se expresa en la superficie de dicha célula diana,

y en la que la unión de dicho CCR a dicho antígeno adicional refuerza dicha respuesta inmunitaria de dicha célula efectora inmunitaria y/o asegura la supervivencia de dicha célula efectora inmunitaria,

en la que dicho CCR comprende o consiste en un dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana y una parte citoplásmica que comprende al menos un dominio coestimulador, en la que dicho CCR no comprende CD3Z, y en la que dicho dominio de unión al antígeno de dicho CCR se une a dicho antígeno adicional,

en la que dicho CCR no puede mediar en dicha respuesta inmunitaria por sí solo,

y en la que la magnitud de la potenciación de la respuesta efectora de la célula inmunitaria que expresa tanto el CAR como el CCR es al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 40 veces o al menos 50 veces mayor en comparación con la respuesta efectora de la célula inmunitaria que es activada y estimulada únicamente por el CAR, y que no es reforzada por el CCR.

Dicha célula diana puede ser una célula cancerosa o una célula autoinmunitaria.

Dicho antígeno expresado en la superficie de una célula diana puede ser un antígeno asociado a tumor (TAA) y dicha célula diana puede ser una célula cancerosa.

Dicho receptor de unión a antígeno puede ser un receptor de unión a antígeno que media en una fuerte respuesta de células efectoras inmunitarias cuando el receptor se une al marcador del polipéptido marcado, es decir, dicho receptor de unión a antígeno, por ejemplo, un CAR, puede ser un receptor de unión a antígeno de alta eficacia, por ejemplo, un CAR con respecto a la respuesta de las células efectoras inmunitarias desencadenada por la unión de dicho receptor de unión a antígeno, por ejemplo, CAR, al marcador. Dicho receptor de unión a antígeno puede unirse a dicho marcador con afinidad alta, intermedia o baja siempre que pueda desencadenar una respuesta de células efectoras inmunitarias.

En dicha célula efectora inmunitaria, dicho dominio de señalización citoplásmico primario de dicho CAR puede ser CD3Z.

En dicha célula efectora inmunitaria, dicha parte citoplásmica de dicho CCR puede comprender o consistir en al menos un dominio coestimulador seleccionado del grupo que consiste en ICOS, CD154, CD5, CD2, CD46, HVEM, CD8, CD97, TNFRSF18, CD30, SLAM, DAP10, CD64, CD16, CD89, MyD88, KIR-2DS, KIR-3DS, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2D, ICAM, CD27, OX40, 4-1BB y CD28.

En dicha célula efectora inmunitaria, dicha parte citoplásmica de dicho CCR puede comprender o consistir en al menos un dominio coestimulador seleccionado del grupo que consiste en ICOS, CD154, CD5, CD2, CD46, HVEM, CD8, CD97, TNFRSF18, CD30, SLAM, DAP10, CD64, CD16, CD89, MyD88, KIR-2DS, KIR-3DS, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2D, ICAM, CD27, OX40, 4-1 BB y CD28, y dicha parte citoplásmica de dicho CCR no comprende o no consta de un dominio que contiene ITAM, tal como CD3Z u otro dominio de señalización citoplásmico primario. En dicha célula efectora inmunitaria, dicha parte citoplásmica de dicho CCR puede comprender o consistir en al menos un dominio coestimulador 4-1BB y/o al menos un dominio coestimulador CD28. En dicha célula efectora inmunitaria, dicha parte citoplásmica de dicho CCR puede comprender o consistir en dos dominios coestimuladores 4-1BB o dos dominios coestimuladores CD28.

Dicha parte citoplásmica de dicho CCR puede comprender o consistir en un dominio coestimulador 4-1 BB y un dominio coestimulador de CD28.

En dicha célula efectora inmunitaria, dicha parte citoplásmica de dicho CCR como se describe anteriormente puede comprender al menos dos dominios coestimuladores, pero ningún dominio de señalización citoplásmico primario.

En dicha célula efectora inmunitaria, el polipéptido de dicho polipéptido marcado puede ser un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, en el que dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo puede unirse a dicho antígeno expresado en la superficie de dicha célula diana, y el marcador de dicho polipéptido marcado puede ser un hapteno. Dicho hapteno puede ser FITC, biotina, PE o estreptavidina.

En dicha célula efectora inmunitaria, el polipéptido de dicho polipéptido marcado puede ser un resto de unión a antígeno (ABM), en el que el marcador de dicho polipéptido marcado puede ser un epítopo enlazador/marcador (LLE) de una molécula de unión a células diana (TCBM), y en la que dicho receptor de unión a antígeno puede ser un receptor de antígenos quimérico antiepítopo enlazador/marcador (CAR anti-LLE) que comprende:

I) un dominio de unión a un epítopo enlazador/marcador (LLE),

II) un dominio transmembrana, y

III) un dominio de señalización citoplasmático que comprende o consiste en al menos un dominio de señalización citoplásmico primario y al menos un dominio de señalización coestimulador,

en la que dicho dominio de unión a LLE extracelular puede unirse a una molécula de unión a células diana (TCBM) que comprende:

i) un resto de unión a antígeno (ABM), en el que dicho ABM puede unirse específicamente a dicho antígeno expresado en la superficie de dicha célula diana,

ii) un resto marcador (LaM), en el que dicho LaM es una molécula que aparece de modo natural en un sujeto o un derivado de la misma,

iii) un resto enlazador (LiM) que conjuga dicho ABM y dicho LaM, formando así un epítopo enlazador/marcador (LLE),

en la que dicho dominio de unión a LLE extracelular se une a dicho LLE con una preferencia mayor que dicha molécula que aparece de modo natural.

Dicho dominio de unión a LLE extracelular puede unirse con una afinidad al menos dos veces mayor a dicho LLE que a dicha molécula que aparece de modo natural.

El valor de k(off) (constante de disociación) para la unión entre dicho dominio de unión a LLE extracelular puede ser mayor con un LLE monomérico y con dicha molécula que aparece de modo natural que con un LLE multimérico. Dicha molécula que aparece de modo natural puede estar en el sistema circulatorio de dicho sujeto.

Dicho LLE puede generarse de forma específica de sitio, formando así un epítopo que comprende una parte de dicho LaM y una parte de dicho LiM.

Dicho LaM puede seleccionarse del grupo que consiste en aminoácidos, péptidos, proteínas, creatinina, biotina, biocitina, lípidos, hormonas, vitaminas, carbohidratos o un derivado de los mismos.

Dicho LiM puede ser una molécula capaz de generar dicho LLE.

Dicho LiM puede seleccionarse del grupo que consiste en péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, polihidroxialcanoatos, cadenas de alquilo, ácidos alcanoicos, ácidos carboxílicos, farnesilos, polietilenglicoles, lípidos o un derivado de los mismos.

Dicho LaM puede ser biotina o un derivado de la misma y dicho LiM puede ser un resto 6-(6-aminohexanamido)hexanoílo o un resto 6-aminohexanoílo.

Dicho dominio de unión a LLE extracelular puede comprender la secuencia de SEQ ID NO:17 y SEQ ID NO:18. Dicho ABM puede ser un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo.

Dicho CAR anti-LLE puede comprender la secuencia de SEQ ID NO:22 y SEQ ID NO:23, y dicho dominio de unión a LLE extracelular se une a un resto 6-[6-(biotinamido) hexanamido]hexanoilo.

En dicha célula efectora inmunitaria, dicho antígeno adicional puede expresarse en la superficie de otra célula distinta de la célula diana.

En dicha célula efectora inmunitaria, dicho antígeno adicional puede expresarse en la superficie de otra célula distinta de la célula diana que no se encuentra en un estado patológico.

Dicha otra célula puede ser una célula (hematopoyética). Dicha segunda célula diana puede ser una célula B. Dicha otra célula puede ser una segunda célula cancerosa, es decir, un tipo diferente de célula cancerosa que la primera célula diana/cancerosa.

En dicha célula efectora inmunitaria, dicho antígeno adicional es CD20 y dicha otra célula es una célula B. Preferiblemente, dicha célula B no se encuentra en un estado patológico. El beneficio de CD20 como dicho antígeno adicional y de una célula B como dicha otra célula es la omnipresencia de las células B que expresan CD20 en el sistema circulatorio de un sujeto.

En dicha célula efectora inmunitaria, dicho dominio de unión al antígeno de dicho CCR puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:13, y dicha parte citoplásmica de dicho CCR puede comprender o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:21.

En dicha célula efectora inmunitaria, dicho antígeno adicional no se expresa en la superficie de una célula. En dicha célula efectora inmunitaria, dicho antígeno adicional puede ser dextrano. Dicho dextrano puede ser dextrano no unido, es decir, dextrano libre, dextrano soluble o dextrano conjugado con nanopartículas o micropartículas coloidales. Dicho dextrano puede administrarse a un paciente que lo necesite y que albergue la célula efectora inmunitaria como se describe en el presente documento para reforzar dicha célula efectora inmunitaria en condiciones controlables. Como alternativa, dicho dextrano puede acoplarse a un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, en el que dicho anticuerpo puede unirse específicamente a otro antígeno que puede expresarse sobre dicha célula diana o sobre dicha otra célula.

En dicha célula efectora inmunitaria, dicho dominio de unión al antígeno de dicho CCR puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:19, y dicha parte citoplásmica puede comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:21.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una célula efectora inmunitaria que comprende:

y en la que la unión de dicho receptor de unión a antígeno a dicho marcador activa y estimula una respuesta inmunitaria de dicha célula efectora inmunitaria conduciendo de ese modo a una actividad citotóxica y a la liberación de citoquinas de dicha célula efectora inmunitaria;

en la que dicho receptor de unión a antígeno es un receptor de antígenos quimérico (CAR) que comprende un dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de señalización citoplasmático que comprende al menos un dominio de señalización citoplásmico primario y al menos un dominio de señalización coestimulador, en la que dicho dominio de unión al antígeno de dicho CAR se une al marcador de dicho polipéptido marcado, y

b) un receptor coestimulador quimérico (CCR), en la que dicho CCR se une a un antígeno adicional, en la que dicho antígeno adicional se expresa en la superficie de

i) dicha célula diana a matar, y

ii) otra célula distinta de la célula diana

en la que dicho CCR comprende un dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana y una parte citoplásmica que comprende al menos un dominio coestimulador, en la que dicho CCR no comprende CD3Z, y en la que dicho dominio de unión al antígeno de dicho CCR se une a dicho antígeno adicional,

en la que dicho CCR no es capaz de mediar en dicha respuesta inmunitaria por sí solo, y en el que la magnitud de la potenciación de la respuesta efectora de la célula inmunitaria que expresa tanto el CAR como el CCR es al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 40 veces o al menos 50 veces mayor en comparación con la respuesta efectora de la célula inmunitaria que es activada y estimulada únicamente por el CAR, y que no es reforzada por el CCR.

Dicho receptor de unión a antígeno puede ser un receptor de unión a antígeno que media en una fuerte respuesta de células efectoras inmunitarias cuando el receptor se une al marcador del polipéptido marcado, es decir, dicho receptor de unión a antígeno, por ejemplo, un CAR, puede ser un receptor de unión a antígeno de alta eficacia, por ejemplo, CAR con respecto a la respuesta de las células efectoras inmunitarias desencadenada por la unión de dicho receptor de unión a antígeno, por ejemplo, CAR, al marcador. Dicho receptor de unión a antígeno puede unirse a dicho marcador con afinidad alta, intermedia o baja siempre que pueda desencadenar una respuesta de células efectoras inmunitarias.

En dicha célula efectora inmunitaria, dicha parte citoplásmica de dicho CCR puede comprender o consistir en al menos un dominio coestimulador seleccionado del grupo que consiste en ICOS, CD154, CD5, CD2, CD46, HVEM, CD8, CD97, TNFRSF18, CD30, SLAM, DAP10, CD64, CD16, CD89, MyD88, KIR-2DS, KIR-3DS, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2D, ICAM, c D27, o X40, 4-1BB y CD28 y dicha parte citoplásmica de dicho CCR no comprende o no consisten en un dominio que contiene ITAM, tal como CD3Z u otro dominio de señalización citoplásmico primario. En dicha célula efectora inmunitaria, dicha parte citoplásmica de dicho CCR puede comprender o consistir en al menos un dominio coestimulador 4-1BB y/o al menos un dominio coestimulador CD28. En dicha célula efectora inmunitaria, dicha parte citoplásmica de dicho CCR puede comprender o consistir en dos dominios coestimuladores 4-1BB o dos dominios coestimuladores CD28.

Dicha parte citoplásmica de dicho CCR puede comprender o consistir en un dominio coestimulador 4-1BB y un dominio coestimulador CD28.

En dicha célula efectora inmunitaria, el polipéptido de dicho polipéptido marcado puede ser un resto de unión a antígeno (ABM), en el que el marcador de dicho polipéptido marcado puede ser un epítopo enlazador/marcador (LLE) de una molécula de unión a células diana (TCBM), y en el que dicho receptor de unión a antígeno puede ser un receptor de antígenos quimérico antiepítopo enlazador/marcador (CAR anti-LLE) como se describe anteriormente y en el presente documento.

En dicha célula efectora inmunitaria, dicho antígeno adicional que puede expresarse en la superficie de dicha otra célula que la célula diana no está en un estado patológico.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una célula efectora inmunitaria que comprende

a) un receptor de unión a antígeno, en la que dicho receptor de unión a antígeno se une a un antígeno asociado a un tumor expresado en la superficie de una célula diana, en la que dicha célula diana es una célula cancerosa,

y en la que la unión de dicho receptor de unión a antígeno a dicho antígeno asociado a tumor activa y estimula una respuesta inmunitaria de dicha célula efectora inmunitaria;

en la que dicho receptor de unión a antígeno es un receptor de antígenos quimérico (CAR) que comprende o consiste en un dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de señalización citoplásmico que comprende al menos un dominio de señalización citoplásmico primario y al menos un dominio de señalización coestimulador, en la que dicho dominio de unión al antígeno de dicho CAR se une al antígeno asociado a tumor, y

b) un receptor coestimulador quimérico (CCR), en la que dicho CCR se une a un antígeno adicional, en la que dicho antígeno adicional es CD20 o no se expresa en la superficie de una célula,

en la que dicho CCR no es capaz de mediar en dicha respuesta inmunitaria por sí solo, y en la que la magnitud de la potenciación de la respuesta efectora de la célula inmunitaria que expresa tanto el CAR como el CCR es al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 40 veces o al menos 50 veces mayor en comparación con la respuesta efectora de la célula inmunitaria que es activada y estimulada únicamente por el CAR, y que no es reforzada por el CCR.

En dicha célula efectora inmunitaria, dicho antígeno adicional puede ser CD20 y no se expresa en dicha célula diana sino en la superficie de otra célula distinta de la célula diana. Dicha otra célula puede ser una célula B.

En dicha célula efectora inmunitaria, dicho dominio de unión al antígeno de dicho CCR puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:13, y dicha parte citoplásmica de dicho CCR puede comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:21.

En dicha célula efectora inmunitaria, en la que dicho antígeno adicional puede ser CD20 y puede expresarse tanto en dicha célula diana como en dicha otra célula.

En dicha célula efectora inmunitaria, dicho antígeno adicional que no se expresa en la superficie de una célula es dextrano. Dicho dextrano puede ser dextrano no unido, es decir, dextrano libre, dextrano soluble o dextrano conjugado con nanopartículas o micropartículas coloidales. Dicho dextrano puede administrarse a un paciente que lo necesite y que albergue la célula efectora inmunitaria como se describe en el presente documento para reforzar dicha célula efectora inmunitaria en condiciones controlables. Como alternativa, dicho dextrano puede acoplarse a un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, en el que dicho anticuerpo puede unirse específicamente a otro antígeno que puede expresarse sobre dicha célula diana o sobre dicha otra célula.

Dicho receptor de unión a antígeno puede ser un receptor de unión a antígeno que media en una fuerte respuesta de células efectoras inmunitarias cuando el receptor se une al antígeno asociado a tumor, es decir, dicho receptor de unión a antígeno, por ejemplo, un CAR, puede ser un receptor de unión a antígeno de alta eficacia, por ejemplo, CAR con respecto a la respuesta de las células efectoras inmunitarias desencadenada por la unión de dicho receptor de unión a antígeno, por ejemplo, CAR, al antígeno asociado a tumor. Dicho receptor de unión a antígeno puede unirse a dicho TAA con afinidad alta, intermedia o baja siempre que pueda desencadenar una respuesta de células efectoras inmunitarias.

Dicha célula diana puede ser una célula cancerosa de un tumor sólido.

Dicha célula efectora inmunitaria, en la que dicho dominio de señalización citoplásmico primario de dicho CAR puede ser CD3Z.

En dicha célula efectora inmunitaria, dicha parte citoplásmica de dicho CCR puede comprender o consistir en al menos un dominio coestimulador seleccionado del grupo que consiste en ICOS, CD154, CD5, CD2, CD46, HVEM, CD8, CD97, TNFRSF18, CD30, SLAM, DAP10, CD64, CD16, CD89, MyD88, KIR-2DS, KIR-3DS, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2D, ICAM, CD27, o X40, 4-1BB y CD28, y dicha parte citoplásmica de dicho CCR no comprende o no consiste en un dominio que contiene ITAM, tal como CD3Z u otro dominio de señalización citoplásmico primario. En dicha célula efectora inmunitaria, dicha parte citoplásmica de dicho CCR puede comprender o consistir en al menos un dominio coestimulador 4-1BB y/o al menos un dominio coestimulador CD28. En dicha célula efectora inmunitaria, dicha parte citoplásmica de dicho CCR puede comprender o consistir en dos dominios coestimuladores 4-1BB o dos dominios coestimuladores CD28.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una célula efectora inmunitaria como se describe en el presente documento para su uso en inmunoterapia (terapia celular) o para el tratamiento de un trastorno en un paciente.

En otro aspecto, la invención proporciona una o más moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un receptor de unión a antígeno como se describe en este documento y un CCR como se describe en este documento.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una composición de inmunoterapia que comprende una célula que expresa un receptor de unión a antígeno como se describe en este documento y un CCR como se describe en este documento.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición de inmunoterapia que comprende una o más moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un receptor de unión a antígeno como se describe en este documento y un CCR como se describe en este documento.

Se describe además un método para tratar un trastorno en un sujeto que comprende la etapa de administrar al sujeto una o más poblaciones terapéuticamente eficaces de células efectoras inmunitarias que coexpresan el receptor de unión a antígeno como se describe en este documento y el CCR como se describe en este documento.

Dicho método puede comprender la etapa adicional de administrar al sujeto una o más formulaciones de un polipéptido marcado que está unido por dicho receptor de unión a antígeno.

En dicho método, dichas más formulaciones de polipéptidos marcados son las mismas formulaciones o formulaciones diferentes de polipéptidos marcados, o dicho método puede comprender la etapa adicional de administrar al sujeto una o más formulaciones de dextrano (por ejemplo, Deltadex; Dextran 40 al 10 % en NaCI; infusión, por ejemplo, de 1,5 g de dextrano por kg de peso corporal o menos) que está unido por el CCR que se une al dextrano.

En dicho método, dichas poblaciones más terapéuticamente eficaces de células inmunitarias que coexpresan el receptor de unión a antígeno como se describe en este documento y el CCR como se describe en este documento son poblaciones iguales o poblaciones diferentes de células inmunitarias que coexpresan el receptor de unión a antígeno como se describe en este documento y el CCR como se describe en este documento.

En dicho método, dicho receptor de unión a antígeno de dichas poblaciones más terapéuticamente eficaces son receptores de unión a antígeno iguales o receptores de unión a antígeno iguales diferentes, o dicho CCR de dichas poblaciones más terapéuticamente eficaces son CCR iguales o CCR diferentes.

En dicho método, dicha administración de dichas más formulaciones de una o más formulaciones de un polipéptido marcado, que se une a dicho receptor de antígenos, a un sujeto que necesita tratamiento se administra simultánea o posteriormente.

En dicho método, dicha administración de dichas poblaciones de células inmunitarias más terapéuticamente eficaces que coexpresan el receptor de unión a antígeno como se describe en este documento y el CCR como se describe en este documento se administra simultánea o posteriormente.

Dichas una o más formulaciones de un polipéptido marcado, que se une a dicho receptor de antígenos, se pueden administrar al sujeto antes, simultáneamente o después de administrar al sujeto dichas una o más poblaciones terapéuticamente eficaces de células inmunitarias que coexpresan el receptor de unión a antígeno como se describe. en este documento y el CCR como se describe en este documento.

Dichas una o más formulaciones de un polipéptido marcado que se une a un receptor de unión a antígeno pueden ser reemplazadas por una o más poblaciones terapéuticamente eficaces de células (hematopoyéticas) que expresan dicho antígeno en su superficie celular.

En dicho método, dicha administración de dichas más formulaciones de una o más formulaciones de dextrano, que se une a CCR, a un sujeto que necesita tratamiento se administra simultánea o posteriormente.

Dichas una o más formulaciones de dextrano que se une a dicho CCR pueden administrarse al sujeto antes, simultáneamente o después de administrar al sujeto dichas una o más poblaciones terapéuticamente eficaces de células inmunitarias que coexpresan el receptor de unión a antígeno como se describe en este documento y el CCR como se describe en este documento.

La construcción o construcciones de ADN o ARN (la molécula o moléculas de ácido nucleico) que codifican el receptor de unión a antígeno como se describe en este documento y el CCR como se describe en este documento ("que codifica el sistema de refuerzo como se describe en este documento") se pueden transfectar o transducir hacia el interior de una célula huésped por métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, sistemas basados en virus que incluyen retrovirus y lentivirus, métodos físicos que incluyen electroporación, métodos biológicos, métodos químicos). Independientemente de los métodos utilizados para integrar, preferentemente integrar de manera estable, el ADN que codifica el receptor de unión a antígeno como se describe en este documento y el CCR como se describe en este documento, en la célula huésped, como resultado, la célula huésped expresa el receptor de unión a antígeno como se describe en este documento y el CCR como se describe en este documento. Como alternativa, las secuencias de ácidos nucleicos pueden producirse sintéticamente.

Una célula modificada que expresa el receptor de unión a antígeno como se describe en este documento y el CCR como se describe en este documento puede aislarse (enriquecerse o separarse) después del proceso de transfección/transducción para generar dicha célula modificada a partir de células no transfectadas/transducidas por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo tecnologías de separación basadas en fluorescencia, como FACS®, o métodos de separación de células magnéticos, como MACS® (Miltenyi Biotec GmbH).

Generalmente, las células, tales como células inmunitarias, preferentemente células T para generar células modificadas genéticamente que expresan el receptor de unión a antígeno como se describe en este documento y el CCR como se describe en este documento, pueden obtenerse de un sujeto. Pueden obtenerse células, tales como células inmunitarias, preferentemente células T, de una variedad de fuentes, tales como células mononucleares de sangre periférica (PMBC), médula ósea, tejido de los ganglios linfáticos, sangre del cordón umbilical o tejido del timo. Para el enriquecimiento de estas células, se pueden usar métodos bien conocidos en la técnica, como la centrifugación a través de un gradiente de Ficoll™ o PERCOLL™, o las técnicas de selección positiva/negativa, como la clasificación fluorescente (por ejemplo, FACSsort) o la clasificación magnética (por ejemplo, MACS®).

Preferiblemente, la población celular enriquecida comprende al menos aproximadamente 90 % del tipo celular seleccionado. En aspectos particulares, la población celular comprende al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o incluso 100 % del tipo celular seleccionado. .

A modo de ejemplo, las células T de una muestra de sangre de un sujeto se marcan magnéticamente, por ejemplo, con una esfera magnética acoplada a anticuerpos específicos para CD4, se lavan, se enriquecen magnéticamente y se recogen. Entonces, estas células T pueden modificarse para expresar el receptor de unión a antígeno como se describe en este documento y el CCR como se describe en este documento en su superficie celular.

En una realización de la invención, la célula modificada aislada/enriquecida, tales como células inmunitarias, preferentemente células T que expresan el receptor de unión a antígeno como se describe en este documento y el CCR como se describe en este documento, pueden activarse antes o después de la modificación genética y expandirse para aumentar el número de células (T) usando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo la estimulación policlonal de células T con el reactivo de células T TransAct (Miltenyi Biotec; documento WO2014048920A1) que consiste en una nanomatriz coloidal conjugada con agonistas de CD3 y CD28 humanizados. Preferiblemente, dicho número de células modificadas, tales como células inmunitarias, por ejemplo, células T, puede aumentar hasta una cantidad terapéuticamente eficaz.

Una célula que expresa el receptor de unión a antígeno como se describe en este documento y el CCR como se describe en este documento puede diseñarse mediante un ARN que codifica el receptor de unión a antígeno como se describe en este documento y el CCR como se describe en este documento. El ARN se puede transfectar o transducir hacia el interior de una célula huésped mediante métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, sistemas basados en virus, métodos físicos, métodos biológicos, métodos químicos). Independientemente de los métodos utilizados para transferir el ARN que codifica el receptor de unión a antígeno como se describe en este documento y el CCR como se describe en este documento a la célula huésped, como resultado, la célula huésped expresa el receptor de unión a antígeno como se describe en este documento y el CCR como se describe en este documento. Las "células modificadas por ARN" expresan el receptor de unión a antígeno como se describe en este documento y el CCR como se describe en este documento durante un tiempo limitado (expresión transitoria).

Las células genéticamente modificadas (inmunitarias) que expresan el receptor de unión a antígeno como se describe en este documento y el CCR como se describe en este documento, preferentemente células T, pueden generarse en un proceso automatizado en un sistema cerrado. Un proceso para la generación de células modificadas genéticamente, preferentemente células T, puede comprender, por ejemplo, las etapas de:

a) proporcionar una muestra de células que comprenda células (inmunitarias),

b) preparación de la muestra celular por centrifugación,

c) separación magnética de las células (inmunitarias), preferentemente células T,

d) activación de las células (inmunitarias) enriquecidas, preferentemente células T, utilizando agentes moduladores,

e) modificación genética las células (inmunitarias), preferentemente células T, para expresar el receptor de unión a antígeno como se describe en este documento y el CCR como se describe en este documento

f) expansión de las células (inmunitarias) genéticamente modificadas, preferentemente células T, en una cámara de cultivo,

g) lavado de las células (inmunitarias) cultivadas, preferentemente células T.

Todas estas etapas se pueden realizar automáticamente en un sistema cerrado, preferentemente en un sistema cerrado y estéril.

El proceso es especialmente adecuado para preparar células modificadas genéticamente, tales como células inmunitarias, preferentemente células T, en las que las células (inmunitarias) enriquecidas, preferentemente células T, se modifican genéticamente mediante el uso de vectores virales y/o no virales.

Cualquiera de estas etapas se puede multiplicar, omitir o puede aparecer en un orden diferente.

Los agentes moduladores pueden seleccionarse entre citoquinas y/o anticuerpos agonistas.

Las células (inmunitarias) genéticamente modificadas, preferentemente las células T, pueden enriquecerse mediante el marcaje magnético de las células (inmunitarias) y la separación magnética antes o después del cultivo para obtener una mayor frecuencia de células (inmunitarias) genéticamente modificadas, preferentemente células T, en el producto celular final. Como sistema cerrado y estéril para la modificación celular, se puede utilizar el dispositivo de procesamiento celular totalmente automático CliniMACS Prodigy® y los conjuntos de tubos asociados (Miltenyi Biotec GmbH, Alemania) (documento WO2009/072003). Este sistema cerrado cumple con los requisitos de procesamiento de calidad GMP de casi cualquier tipo de productos celulares y puede permitir reducir los requisitos de sala limpia, mejorar la transferencia de tecnología y armonizar los procesos de fabricación de células.

En una realización de la invención, el sistema de refuerzo tal como se describe en el presente documento puede usarse en el tratamiento de un sujeto que padece un trastorno, como el cáncer. Pueden aislarse células, tales como células inmunitarias, por ejemplo, células T de un sujeto, o pueden usarse líneas celulares inmunitarias establecidas. El sujeto puede sufrir dicho trastorno, tal como cáncer (un paciente), o puede ser un sujeto sano. Estas células inmunitarias se modifican genéticamente in vitro para expresar el CAR que se une a un marcador como se describe en este documento y el CCR como se describe en este documento. Estas células diseñadas pueden activarse y expandirse in vitro para producir una población terapéuticamente eficaz de células que expresan el CAR que se une a un marcador como se describe en este documento y al CCR como se describe en este documento. En terapia celular, estas células modificadas se pueden infundir a un receptor que las necesite como una composición farmacéutica (o una formulación de una población terapéuticamente eficaz de células que expresan el CAR que se une a un marcador como se describe en este documento y el CCR como se describe en este documento), además de una segunda composición farmacéutica, una formulación de hapteno o TCBM. Las células infundidas en el receptor pueden ser capaces de matar células cancerosas (o al menos detener su crecimiento) que expresan el antígeno que es reconocido por el sistema de refuerzo como se describe en este documento. El CCR refuerza la respuesta inmunitaria de la célula modificada genéticamente cuando se activa al unirse al antígeno adicional. Este antígeno adicional podría ser CD20 que se expresa sobre las células B o dextrano que se aplica de forma controlable al sujeto. El receptor puede ser el mismo sujeto del que se obtuvieron las células (terapia de células autólogas) o puede ser de otro sujeto de la misma especie (terapia de células alogénicas).

La población terapéuticamente eficaz de células que expresan el CAR que se une a un marcador como se describe en este documento y el CCR como se describe en este documento se pueden administrar al paciente antes de la administración de la formulación de hapteno o TCBM, al sujeto. Como alternativa, la formulación de hapteno o TCBM puede administrarse al sujeto antes o al mismo tiempo que la administración de la población terapéuticamente eficaz de células que expresan el CAR que se une al marcador ma como se describe en este documento y el CCR como se describe en este documento, al sujeto. Una variación adicional incluye cultivar in vitro la población terapéuticamente eficaz de células que expresan el CAR que se une a un marcador como se describe en este documento y el CCR como se describe en este documento con el hapteno o TBCM de la formulación de hapteno o TCBM antes de la administración al sujeto.

La población terapéuticamente eficaz de células que expresan el CAR que se une a un antígeno, tal como un antígeno asociado a un tumor como se describe en este documento, y el CCR que se une al dextrano tal como se describe en este documento, se pueden administrar al paciente antes de la administración de la formulación de dextrano al sujeto. Como alternativa, la formulación de dextrano puede administrarse al sujeto antes o al mismo tiempo que la administración de la población terapéuticamente eficaz de células que expresan el CAR que se une al antígeno, tal como un antígeno asociado a tumor como se describe en este documento y el CCR que se une a dextrano como se describe en el presente documento, al sujeto. Una variación adicional incluye cultivar in vitro la población terapéuticamente eficaz de células que expresan el CAR que se une al antígeno, tal como un antígeno asociado a tumor como se describe en este documento y el CCR que se une al dextrano como se describe en este documento, con el dextrano de la formulación de dextrano antes de la administración al sujeto.

Las poblaciones de células que expresan el receptor de unión a antígeno como se describe en este documento y el CCR como se describe en este documento pueden formularse para su administración a un sujeto usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica.

Las formulaciones que comprenden una o más poblaciones terapéuticamente eficaces de células que expresan el receptor de unión a antígeno como se describe en este documento y el CCR como se describe en este documento pueden incluir un excipiente o excipientes farmacéuticamente aceptables (vehículo o diluyentes). Los excipientes incluidos en las formulaciones tendrán diferentes propósitos dependiendo, por ejemplo, de la naturaleza del dominio de unión al antígeno del CAR y CCR como se describe en este documento, la (sub)población de células inmunitarias utilizada y el modo de administración. Los ejemplos de excipientes usados generalmente incluyen, sin limitación: disolución salina, disolución salina tamponada, dextrosa, agua para inyección, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos, agentes estabilizantes, agentes solubilizantes y tensioactivos, tampones y conservantes, agentes de tonicidad, agentes de carga y agentes lubricantes.

Una formulación de una o más poblaciones terapéuticamente eficaces de células que expresan el receptor de unión a antígeno como se describe en este documento y el CCR como se describe en este documento puede incluir una población de células que expresan el receptor de unión a antígeno como se describe en este documento y el CCR como se describe en este documento, o más de una población de células que expresan el receptor de unión a antígeno como se describe en este documento y el CCR como se describe en este documento. Las diferentes poblaciones de células que expresan el receptor de unión a antígeno como se describe en este documento y el CCR como se describe en este documento pueden variar según la identidad del dominio de unión al antígeno, la identidad del dominio de activación, la identidad de la (sub)población de células inmunitarias, o una combinación de los mismos.

Las formulaciones que comprenden una o más poblaciones terapéuticamente eficaces de células que expresan el receptor de unión a antígeno como se describe en este documento y el CCR como se describe en este documento pueden administrarse a un sujeto usando modos y técnicas conocidos por los expertos en la técnica. Los ejemplos de modos incluyen, pero no se limitan a inyección intravenosa. Otros modos incluyen, sin limitación, intratumoral, intradérmico, subcutáneo (sc, sq, sub-Q, Hypo), intramuscular (im), intraperitoneal (ip), intraarterial, intramedular, intracardíaco, intraarticular (articulación), intrasinovial (área de líquido articular), intracraneal, intraespinal e intratecal (fluidos espinales).

Las formulaciones que comprenden una o más poblaciones terapéuticamente eficaces de células que expresan el receptor de unión a antígeno como se describe en este documento y el CCR como se describe en este documento que se administran a un sujeto comprenden varias células que expresan el receptor de unión a antígeno como se describe en este documento y el CCR como se describe que es eficaz para el tratamiento de la indicación específica 0 el cáncer.

En general, se pueden administrar formulaciones que comprendan entre aproximadamente 1 x 104 y aproximadamente de 1 x 1010 células que expresan el receptor de unión a antígeno como se describe en este documento y el CCR como se describe en este documento. En la mayoría de los casos, la formulación puede comprender entre aproximadamente 1 x 105 y aproximadamente de 1 x 109 células que expresan el receptor de unión a antígeno como se describe en este documento y el CCR como se describe en este documento, de aproximadamente 5 x 105 a aproximadamente 5 x 108 células que expresan el receptor de unión a antígeno como se describe en este documento y el CCR como se describe en este documento, o de aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 x 107 células que expresan el receptor de unión a antígeno como se describe en este documento y el CCR como se describe en este documento. Sin embargo, el número de células que expresan el receptor de unión a antígeno como se describe en este documento y el CCR como se describe administrado a un sujeto puede variar entre amplios límites, dependiendo de la ubicación, la fuente, la identidad, la extensión y la gravedad del trastorno, la edad y la condición de el individuo que se va a tratar, etc. Un médico puede determinar en última instancia las dosificaciones apropiadas que se utilizarán.

Los haptenos o TCBM o dextrano se pueden formular para su administración a un sujeto usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Las formulaciones de los haptenos o TCBM o dextrano pueden incluir un excipiente o excipientes farmacéuticamente aceptables (vehículos o diluyentes). Los excipientes incluidos en las formulaciones tendrán diferentes propósitos dependiendo, por ejemplo, de la naturaleza del resto marcador, el resto enlazador, el ABM, el hapteno y el modo de administración. Los ejemplos de excipientes usados generalmente incluyen, sin limitación: disolución salina, disolución salina tamponada, dextrosa, agua para inyección, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos, agentes estabilizantes, agentes solubilizantes y tensioactivos, tampones y conservantes, agentes de tonicidad, agentes de carga y agentes lubricantes.

Una formulación de hapteno o TCBM puede incluir un tipo de hapteno o TCBM, o más de un tipo de hapteno o TCBM. Los diferentes tipos de TCBM pueden variar en función de la identidad del resto marcador, el resto enlazador, el resto de unión al antígeno o una combinación de los mismos en el caso de los TCBM.

Los haptenos o TCBM o dextrano pueden administrarse a un sujeto usando modos y técnicas conocidos por los expertos en la técnica. Los ejemplos de modos incluyen, pero no se limitan a inyección intravenosa, intraperitoneal e intratumoral. Otros modos incluyen, sin limitación, intradérmico, subcutáneo (sc, sq, sub-Q, Hypo), intramuscular (im), intraarterial, intramedular, intracardíaco, intraarticular (articulación), intrasinovial (área de líquido articular), intracraneal, intraespinal e intratecal (fluidos espinales).

Las formulaciones que comprenden los haptenos o TCBM o dextrano se administran a un sujeto en una cantidad que es eficaz para tratar la indicación o trastorno específico. En general, las formulaciones que comprenden al menos de aproximadamente 1 pg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal del hapteno o TCBM o dextrano pueden administrarse a un sujeto que necesite tratamiento. En la mayoría de los casos, la dosificación puede ser de aproximadamente 100 pg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal del hapteno o TCBM o dextrano diariamente, teniendo en cuenta las vías de administración, los síntomas, etc. Sin embargo, la cantidad de hapteno o El TCBM o el dextrano en las formulaciones administradas a un sujeto puede variar entre amplios límites, dependiendo de la ubicación, la fuente, la identidad, la extensión y la gravedad del trastorno, la edad y condición del individuo a tratar, etc. Un médico puede determinar en última instancia las dosificaciones apropiadas que se vayan a utilizar.

Realizaciones

Además de las aplicaciones descritas anteriormente del sistema de refuerzo como se describe en este documento, a continuación se describen realizaciones adicionales de la invención sin intención de limitarse a estas realizaciones.

En una realización de la invención, el receptor de unión a antígeno es un CAR o TCR (TCR endógeno o transgénico) como se describe en el presente documento. El receptor de unión a antígeno y el CCR, como se describe en el presente documento, se expresan en la superficie celular de una célula inmunitaria. El receptor de unión a antígeno se dirige contra un antígeno asociado a tumor (antígeno = AG) expresado en la superficie de una célula diana, mientras que el CCR se dirige a otro (segundo) antígeno, sobre la misma célula diana (el llamado estratega cis) (figura 1a). La activación del CCR mediante la unión del antígeno adicional, por ejemplo, un TAA, a dicho CCR conduce a un aumento de la coestimulación, es decir, un efecto de refuerzo, que está asociado con una mejor destrucción de las células diana, inducida por el CAR.

En otra realización de la invención, el primer receptor de unión a antígeno es un CAR o TCR (TCR endógeno o transgénico) como se describe en el presente documento. El receptor de unión a antígeno y el CCR, como se describe en el presente documento, se expresan en la superficie celular de una célula inmunitaria. El receptor de unión a antígeno se dirige contra un AG definido (un antígeno asociado a un tumor) sobre una célula diana, es decir, una célula cancerosa, mientras que el CCR se dirige contra un segundo AG expresado sobre una segunda célula diana (figura 1b), por ejemplo, o CD20 expresado sobre células B (enfoque trans) (figura 1c). En ambos casos, el sistema de refuerzo trans permite una coestimulación no asociada al tumor que conduce a un aumento de la citotoxicidad de las células T contra las células tumorales tras la activación tanto del receptor de unión a antígeno como del CCR.

En otra realización de la invención, el receptor de unión a antígeno es un CAR o TCR (TCR endógeno o transgénico) como se describe en el presente documento. El receptor de unión a antígeno y el CCR, como se describe en el presente documento, se expresan en la superficie celular de una célula inmunitaria. El receptor de unión a antígeno se dirige contra un AG definido (un antígeno asociado a un tumor) sobre una célula diana, es decir, una célula cancerosa, mientras que el CCR es específico para el dextrano (figura 1d). El dextrano no está unido a la superficie de una célula. Al hacerlo, por ejemplo, la respuesta de las células T inducida por CAR contra la célula diana puede reforzarse mediante el dextrano que reconoce a CCR, administrado al paciente.

En otra realización de la invención, el receptor de unión a antígeno es un CAR o TCR (TCR endógeno o transgénico) como se describe en el presente documento. El receptor de unión a antígeno y el CCR, como se describe en el presente documento, se expresan en la superficie celular de una célula inmunitaria. El receptor de unión a antígeno se dirige contra un AG definido (un antígeno asociado a un tumor) sobre una célula diana, mientras que el CCR reconoce específicamente un anticuerpo conjugado con dextrano o un fragmento de unión al antígeno del mismo (dextrano-AB) que se une a un antígeno (por ejemplo, un antígeno asociado a un tumor) expresado sobre la célula diana o un segundo antígeno expresado sobre una segunda célula diana (figura 1e). De este modo, la citotoxicidad de las células T puede mejorarse mediante la inyección de un anticuerpo conjugado con dextrano a los pacientes que activa el CCR al unirse, lo que conduce a un estado de activación y estimulación intensificado de las células T modificadas.

En otra realización de la invención, el receptor de unión a antígeno es un CAR como se describe en el presente documento. El CAR y el CCR como se describen en este documento se expresan en la superficie celular de una célula inmunitaria. En este caso, el CAR se dirige contra un AB marcado específico para un AG (un antígeno asociado a un tumor) expresado sobre la célula diana y el CCR se une a un antígeno (por ejemplo, un antígeno asociado a un tumor) expresado sobre la célula diana o un anticuerpo conjugado con dextrano, específico para un segundo AG expresado sobre la célula diana (figura 1f) o CD20 expresado sobre una célula B o un anticuerpo conjugado con dextrano, específico para un segundo AG expresado sobre una segunda célula diana (figura 1g). Este llamado enfoque CAR universal define una plataforma que puede permitir el tratamiento de varios tipos de cánceres que difieren con respecto a sus AG expresados. Por ejemplo, el tumor A puede tratarse con un primer CAR como se describe en este documento, en combinación con la unión del hapteno-AB A que se une a un antígeno definido expresado sobre el tumor A, mientras que el tumor B puede tratarse con el mismo CAR que se describe en este documento, aunque en combinación con la unión del hapteno-AB B a un antígeno definido expresado sobre el tumor B. La citotoxicidad de las células T de ambas combinaciones, un CAR con el hapteno-AB A y también B, puede potenciarse mediante la unión de CCR a CD20 sobre las células B o un anticuerpo conjugado con dextrano que puede dirigirse contra un AG expresado sobre la célula diana o sobre una segunda célula diana.

El sistema de refuerzo como se describe en este documento puede expresarse en una célula, tal como una célula inmunitaria (efectora), para dirigirse a un antígeno de una célula diana, tal como una célula cancerosa, para tratar el trastorno, por ejemplo, cáncer (tumor). Los cánceres que pueden tratarse incluyen tumores que no están vascularizados, o que aún no están sustancialmente vascularizados, así como tumores vascularizados. Los cánceres pueden comprender tumores no sólidos (tales como tumores hematológicos, por ejemplo, leucemias y linfomas) o pueden comprender tumores sólidos. Los tipos de cánceres que se van a tratar con el sistema de refuerzo como se describe en este documento incluyen, pero no se limitan a carcinoma, blastoma y sarcoma y ciertas neoplasias leucémicas o linfoides, tumores benignos y malignos, y neoplasias, por ejemplo, sarcomas, carcinomas y melanomas. También se incluyen tumores/cánceres de adultos y tumores/cánceres pediátricos.

Los ejemplos de cánceres hematológicos incluyen leucemias, incluyendo leucemias agudas (como leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mielógena aguda y mieloblastos, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucemia), leucemias crónicas (como leucemia mielocítica crónica (granulocítica), leucemia mieloide crónica y leucemia linfocítica crónica), policitemia vera, linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma no hodgkiniano (formas indolentes y de alto grado), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadenas pesadas, síndrome mielodisplásico, leucemia de células pilosas y mielodisplasia.

Los tumores sólidos son masas anómalas de tejido que generalmente no contienen quistes o áreas líquidas. Los tumores sólidos pueden ser benignos o malignos. Los diferentes tipos de tumores sólidos se nombran según el tipo de células que los forman (como sarcomas, carcinomas y linfomas). Los ejemplos de tumores sólidos, tales como sarcomas y carcinomas, incluyen fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, osteosarcoma y otros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, neoplasia linfoide, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma medular de tiroides, carcinoma papilar de tiroides, feocromocitomas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma papilar broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de conductos biliares, coriocarcinoma, tumor de Wilms, cáncer de cuello uterino, tumor testicular, seminoma, carcinoma de vejiga, melanoma y tumores del SNC (como un glioma (como glioma del tronco encefálico y gliomas mixtos), glioblastoma (también conocido como glioblastoma multiforme) astrocitoma, linfoma del SNC, germinoma, meduloblastoma, craneofaringioma, schwannoma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, neuroblastoma, retinoblastoma y metástasis cerebrales).

El sistema de refuerzo como se describe en este documento puede expresarse en una célula efectora inmunitaria para dirigirse a un antígeno asociado con un virus, bacteria, parásito u otra infección con el fin de tratar la infección.

El sistema de refuerzo como se describe en el presente documento puede expresarse en una célula, tal como una célula inmunitaria, para dirigirse a un autoantígeno para tratar un trastorno autoinmunitario.

Definiciones

A menos que se defina de otro modo, los términos y expresiones técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención.

La expresión "receptor de unión a antígeno", como se usa en el presente documento, se refiere a un receptor que se expresa en la superficie celular de una célula, tiene un dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana y dominios de señalización citoplásmicos. Los ejemplos de tales receptores de unión a antígeno son los receptores de antígenos quiméricos (CAR), los receptores de células T (TCR), los TCR endógenos y transgénicos o los receptores de tipo inmunoglobulina de células asesinas (KIR).

En general, un CAR puede comprender un dominio extracelular (parte extracelular) que comprende el dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de señalización citoplásmico (dominio de señalización intracelular). El dominio extracelular se puede unir al dominio transmembrana mediante un enlazador. El dominio extracelular también puede comprender un péptido señal. En algunas realizaciones de la invención, el dominio de unión al antígeno de un CAR se une a un hapteno que está acoplado a un polipéptido (polipéptido "haptenilado" o "marcado"), en el que el polipéptido puede unirse a un antígeno asociado a un tumor. Este CAR también puede denominarse CAR "antimarcador" como se describe, por ejemplo, en el documento US9233125B2. En otras realizaciones de la invención, la parte extracelular del CAR puede comprender un dominio de unión a epítopo marcador/enlazador (LLE) como dominio de unión al antígeno que se une a un epítopo marcador/enlazador (LLE) que forma parte de un TCBM. Dicho CAR puede denominarse CAR anti-LLE como se describe en la solicitud de patente europea n.° EP16196487.9. Ambos tipos de CAR son CAR universales y/o adaptables. Tanto el hapteno o haptenos como el LLE son "marcadores" que se acoplan directa o indirectamente a un polipéptido (el polipéptido marcado), en el que el polipéptido puede unirse a un antígeno asociado a tumor expresado en la superficie (celular) de una célula diana.

Un "péptido señal" se refiere a una secuencia de péptido que dirige el transporte y la localización de la proteína dentro de una célula, por ejemplo, hacia un determinado orgánulo celular (como el retículo endoplásmico) y/o la superficie celular.

Generalmente, un "dominio de unión al antígeno" se refiere a la región del CAR que se une específicamente a un antígeno. Los CAR de la invención pueden comprender uno o más dominios de unión al antígeno. Generalmente, las regiones de unión específica en el CAR son extracelulares. El dominio de unión al antígeno puede comprender un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo. El dominio de unión al antígeno puede comprender, por ejemplo, una cadena pesada de longitud completa, fragmentos Fab, fragmentos Fv monocatenarios (scFv), anticuerpos monocatenarios divalentes o diacuerpos. Cualquier molécula que se una específicamente a un antígeno dado, tales como aficuerpos o dominios de unión al ligando procedentes de receptores naturales, puede usarse como dominio de unión al antígeno. A menudo, el dominio de unión al antígeno es un scFv. Normalmente, en un scFv, las regiones variables de una cadena pesada y una cadena ligera de inmunoglobulina se fusionan mediante un enlazador flexible para formar un scFv. Dicho enlazador puede ser, por ejemplo, el "(G4/S)3-enlazador".

En algunos casos, es beneficioso que el dominio de unión al antígeno se derive de la misma especie en la que se usará el CAR. Por ejemplo, cuando se planea usarlo terapéuticamente en humanos, puede ser beneficioso que el dominio de unión al antígeno del CAR comprenda un anticuerpo humano o humanizado o un fragmento de unión al antígeno del mismo. Pueden prepararse anticuerpos humanos o humanizados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos mediante una variedad de métodos bien conocidos en la técnica. En algunas realizaciones de la invención, el CAR como se describe en este documento tiene un dominio de unión a epítopo marcador/enlazador extracelular como un dominio de unión de antígeno que permite unirse indirectamente, a través de una molécula de unión a células diana como se describe en este documento, a un antígeno expresado en la superficie de una célula diana.

"Espaciador" o "bisagra", como se usa en este documento, se refiere a la región hidrófila que está entre el dominio de unión al antígeno y el dominio transmembrana. Los CAR de la invención pueden comprender un dominio espaciador extracelular, pero también es posible omitir dicho espaciador. El espaciador puede incluir por ejemplo, fragmentos Fc de anticuerpos o fragmentos de los mismos, regiones bisagra de anticuerpos o fragmentos de los mismos, regiones CH2 o CH3 de anticuerpos, proteínas accesorias, secuencias espaciadoras artificiales o combinaciones de las mismas. Un ejemplo destacado de espaciador es la bisagra CD8alfa. El dominio transmembrana del CAR puede derivarse de cualquier fuente natural o sintética deseada para dicho dominio. Cuando la fuente es natural, el dominio puede derivar de cualquier proteína transmembrana o unida a membrana. El dominio transmembrana puede derivarse, por ejemplo, de CD8alfa o CD28. Cuando los módulos (dominios) de reconocimiento de antígenos y de señalización clave están en dos (o incluso más) polipéptidos, entonces el CAR puede tener dos (o más) dominios transmembrana. La división de los módulos de reconocimiento de antígenos y de señalización clave permiten un control reversible, titulable y dependiente de moléculas pequeñas sobre la expresión de células CAR (Wu etal., 2015, Science, 350:293-303) debido a dominios heterodimerizantes dependientes de moléculas pequeñas en cada polipéptido del CAR.

El dominio de señalización citoplasmático (o el dominio de señalización intracelular) del CAR es responsable de la activación de al menos una de las funciones efectoras normales de la célula inmunitaria en la que se expresa el CAR. "Función efectora" significa una función especializada de una célula, por ejemplo, en una célula T, una función efectora puede ser la actividad citolítica o la actividad auxiliar, incluida la secreción de citoquinas. El dominio de señalización intracelular se refiere a la parte de una proteína que transduce la señal de la función efectora y dirige a la célula que expresa el CAR para que realice una función especializada. El dominio de señalización intracelular puede incluir cualquier parte completa, mutada o truncada del dominio de señalización intracelular de una proteína dada suficiente para transducir una señal que inicia o bloquea las funciones efectoras de las células inmunitarias.

Los ejemplos destacados de dominios de señalización intracelular para su uso en los CAR incluyen las secuencias de señalización citoplásmicas del receptor de células T (TCR) y correceptores que inician la transducción de señales después de la unión del receptor y el antígeno.

Por lo general, la activación de las células T puede estar mediada por dos clases distintas de secuencias de señalización citoplasmáticas, en primer lugar, aquellas que inician la activación primaria dependiente de antígeno a través del TCR (secuencias de señalización citoplasmáticas primarias, dominio de señalización citoplasmático primario) y, en segundo lugar, aquellas que actúan de una manera independiente de antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimuladora (secuencias de señalización citoplásmicas secundarias, dominio de señalización coestimulador). Por tanto, un dominio de señalización intracelular de un CAR puede comprender uno o más dominios de señalización citoplásmicos primarios y/o uno o más dominios de señalización citoplásmicos secundarios.

Los dominios de señalización citoplásmicos primarios que actúan de manera estimulante pueden contener ITAM (motivos de activación basados en tirosina de inmunorreceptor).

Los ejemplos de ITAM que contienen dominios de señalización citoplasmáticos primarios que se utilizan a menudo en los c A r son los derivados de TCRZ (CD3Z), FcRgamma, FcRbeta, CD3gamma, CD3delta, CD3épsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b y CD66d. El más destacado es la secuencia derivada de CD3Z.

El dominio citoplásmico del CAR puede diseñarse para que comprenda el dominio de señalización de CD3Z por sí mismo o combinado con cualquier otro dominio citoplásmico deseado. El dominio citoplásmico del CAR puede comprender una parte de la cadena CD3Z y una región de señalización coestimuladora (dominio). La región de señalización coestimuladora se refiere a una parte del CAR que comprende el dominio intracelular de una molécula coestimuladora. Una molécula coestimuladora es una molécula de la superficie celular distinta de un receptor de antígenos o sus ligandos que se requiere para una respuesta eficaz de los linfocitos a un antígeno. Los ejemplos de una molécula coestimuladora son CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno asociado a la función de linfocitos-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3.

Las secuencias de señalización citoplasmáticas dentro de la parte de señalización citoplásmica del CAR pueden estar enlazadas entre sí con o sin un enlazador en un orden aleatorio o especificado. Un enlazador oligopéptido o polipéptido corto, que preferiblemente tiene entre 2 y 10 aminoácidos de longitud, puede formar el enlace. Un enlazador destacado es el doblete de glicina-serina.

Como ejemplo, el dominio citoplásmico puede comprender el dominio de señalización de CD3Z y el dominio de señalización de CD28. En otro ejemplo, el dominio citoplásmico puede comprender el dominio de señalización de CD3Z y el dominio de señalización de CD27. En un ejemplo adicional, el dominio citoplásmico puede comprender el dominio de señalización de CD3Z, el dominio de señalización de CD28 y el dominio de señalización de CD27.

Como se mencionó anteriormente, la parte extracelular o el dominio transmembrana o el dominio citoplásmico de un CAR también pueden comprender un dominio heterodimerizante con el objetivo de dividir los módulos de señalización y reconocimiento de antígenos clave del CAR.

El CAR puede modificarse adicionalmente para incluir, a nivel del ácido nucleico que codifica el CAR, uno o más elementos operativos para eliminar las células T CAR en virtud de un interruptor suicida. El interruptor suicida puede incluir, por ejemplo, una cascada de señalización inductora de la apoptosis o un fármaco que induce la muerte celular. En una realización, el ácido nucleico que expresa y codifica el CAR puede modificarse adicionalmente para expresar una enzima tal como timidina quinasa (TK) o citosina desaminasa (CD).

El receptor coestimulador quimérico (CCR) es un segundo receptor de unión a antígeno del sistema de refuerzo como se describe en este documento y puede considerarse como un tipo especial de CAR (el segundo CAR del sistema de refuerzo, el otro CAR del sistema de refuerzo es el primer CAR cuando el receptor de unión a antígeno es un CAR, generalmente este primer CAR se denomina en la presente "el CAR", mientras que el segundo CAR se denomina generalmente en la presente CCR). El CCR potencia la magnitud de la respuesta efectora de la célula inmunitaria que expresa el receptor de unión a antígeno, por ejemplo, un CAR y el CCR y estimula la supervivencia prolongada. La magnitud de la potenciación de la respuesta efectora de la célula inmunitaria que expresa el receptor de unión a antígeno, por ejemplo, un CAR, y el CCR puede ser al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 40 veces o al menos 50 veces mayor en comparación con el respuesta efectora de la célula inmunitaria que es activada y estimulada únicamente por el receptor de unión a antígeno, por ejemplo, el CAR, y que no está reforzada por el CCR. El aumento de magnitud de la respuesta efectora de la célula inmunitaria se puede medir o determinar, por ejemplo, mediante la secreción de citoquinas efectoras, tales como IL-2, IFN-y, TNF-a.

Por ejemplo, la cantidad de secreción de citoquinas efectoras, tales como IL-2, IFN-y, TNF-a, por la célula inmunitaria que expresa el receptor de unión a antígeno, por ejemplo, un CAR, y el CCR puede ser al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 40 veces o al menos 50 veces mayor en comparación con la cantidad de secreción de citoquinas efectoras, como IL-2, IFN-y, TNF-a, de la célula inmunitaria que es activada y estimulada únicamente por el receptor de unión a antígeno, por ejemplo, el CAR, y que no está reforzada por el CCR.

Por ejemplo, el número de células diana destruidas por la célula inmunitaria que expresa el receptor de unión a antígeno, por ejemplo, un CAR, y el CCR puede ser al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 40 veces o al menos 50 veces mayor en comparación con el número de células diana destruidas por la célula inmunitaria que es activada y estimulada únicamente por el receptor de unión a antígeno, por ejemplo, el CAR, y que no está reforzada por el CCR.

El CCR no es capaz de mediar en dicha respuesta inmunitaria de la célula inmunitaria por sí solo, es decir, para activar dicha respuesta inmunitaria, es necesario que la célula inmunitaria exprese el CAR, el CCR simplemente refuerza (ayuda) dicha respuesta inmunitaria de dicha célula inmunitaria.

A diferencia de un CAR, un CCR no contiene dominios que contengan ITAM, como CD3Z o FcsRIy y, por lo tanto, no se pueden inducir acontecimientos de señalización mediados por TCR comúnmente conocidos, incluida la activación cis y/o trans, tras la activación de CCR.

El CCR también puede hacer que la célula inmunitaria sea menos sensible a las señales supresoras de tumores.

El CCR comprende un dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana y una parte citoplásmica que comprende al menos un dominio coestimulador como se describe en el presente documento. Dicho al menos un dominio coestimulador de dicho CCR se puede seleccionar del grupo que consiste en ICOS, CD154, CD5, CD2, CD46, HVEM, CD8, CD97, TNFRSF18, CD30, SLAM, DAP10, CD64, CD16, CD89, MyD88, KIR-2DS, KIR-3DS, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2D, ICAM, CD27, OX40, 4-1BB y CD28.

Los CAR de la presente invención se pueden diseñar para que comprendan cualquier porción o parte de los dominios mencionados anteriormente como se describe en el presente documento en cualquier orden y/o combinación que resulte en un CAR funcional, es decir, un CAR que media en una respuesta inmunitaria efectora del inmunoefector. célula que expresa el CAR.

Los CCR de la presente invención pueden diseñarse para comprender cualquier porción o parte de los dominios mencionados anteriormente como se describe en el presente documento en cualquier orden y/o combinación que dé como resultado un CCR funcional, es decir, un CRR que refuerza la respuesta inmunitaria efectora de la célula inmunoefectora que expresa el CAR y el CCR.

Las expresiones "célula inmunitaria" o "célula efectora inmunitaria" se refieren a una célula que puede ser parte del sistema inmunológico y ejecuta una función efectora particular, como células T alfa-beta, células NK, células NKT, células B, células linfoides innatas (ILC), células asesinas inducidas por citoquinas (CIK), células asesinas activadas por linfocinas (LAK), células T gamma-delta, células madre mesenquimáticas o células estromales mesenquimáticas (MSC), monocitos o macrófagos. Las células inmunitarias preferidas son células con función efectora citotóxica, tales como células T alfa-beta, células NK, células NKT, células ILC, células CIK, células LAK o células T gamma-delta. Las células efectoras inmunitarias más preferidas son las células T y las células NK. "Función efectora" significa una función especializada de una célula, por ejemplo, en una célula T, una función efectora puede ser la actividad citolítica o la actividad auxiliar, incluida la secreción de citoquinas.

La expresión "polipéptido marcado" como se usa en este documento se refiere a un polipéptido al que se ha unido, directa o indirectamente, al menos a un componente adicional, es decir, el marcador. El polipéptido puede ser un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une a un antígeno expresado en la superficie de una célula diana, tal como un antígeno asociado a un tumor en una célula cancerosa. El marcador puede ser un hapteno tal como FITC, biotina, PE o estreptavidina y el hapteno puede unirse a través del dominio de unión antihapteno (antimarcador) del CAR.

Los haptenos son moléculas pequeñas que provocan una respuesta inmunitaria solo cuando se unen a un portador grande, como una proteína; el portador puede ser un portador que tampoco provoque una respuesta inmunitaria por sí mismo. Una vez que el cuerpo ha generado anticuerpos contra un aducto portador de hapteno, el hapteno de molécula pequeña también puede unirse al anticuerpo, pero por lo general no iniciará una respuesta inmunitaria; normalmente solo el aducto de portador-hapteno puede hacer esto.

Como alternativa, el "polipéptido marcado" puede ser una "molécula de unión a células diana" (TCBM) que se une a través de un CAR antiepítopo enlazador/marcador (CAR anti-LLE) como se describe en la solicitud de patente europea n.° EP16196487.9. El sistema CAR adaptable del TCBM y el CAR anti-LLE se describen brevemente a continuación.

El CAR anti-LLE puede comprender un dominio de unión extracelular capaz de discriminar entre una molécula que aparece de modo natural en un sujeto y una molécula de unión a células diana (TCBM) que comprende una molécula de unión a antígeno (ABM), un grupo marcador (LaM) y un grupo conector (LiM), en el que dicho LiM conjuga dicho ABM y dicho LaM. El ABM es la parte polipeptídica de dicho polipéptido marcado. El resto marcador (LaM) es una molécula que aparece de modo natural en un sujeto o un derivado de la misma. El resto enlazador (LiM) está acoplado al resto marcador (LaM). LiM y LaM representan juntos la parte de marcador de dicho polipéptido marcado. El receptor de antígenos quimérico anti-LLE se une a TCBM con LaM y cierto LiM con mayor afinidad que el resto marcador endógeno sin resto enlazador. De ese modo, se mejora el reconocimiento/unión de TCBM en condiciones fisiológicas en las que podría estar presente el LaM endógeno.

El beneficio de esta estrategia es que el LaM que permite un sistema CAR adaptable no es inmunogénico, ya que es una molécula natural endógena al sujeto. El LaM es un autoantígeno, el LaM acoplado al LiM es un autoantígeno modificado, que construye un nuevo epítopo, el epítopo enlazador/marcador (LLE), y el LLE se une mejor al dominio de unión a l Le del CAR que la molécula que aparece de modo natural en el sujeto.

El uso de un autoantígeno puro como LaM conlleva un mayor riesgo de autoinmunidad desencadenada por la célula inmunitaria que expresa un CAR que tiene un dominio de unión al antígeno contra el LaM, que es un autoantígeno, que el uso de un autoantígeno modificado, el LLE. El riesgo de autoinmunidad es menor, puesto que el CAR se une con una preferencia menor, por ejemplo, con menor afinidad, al autoantígeno que al autoantígeno modificado.

El CAR adaptable aún permite el reclutamiento eficiente de las células inmunitarias CAR al TCBM que se une específicamente a un antígeno expresado en la superficie de una célula diana, por ejemplo, una célula cancerosa. La molécula que aparece de modo natural puede ser una molécula presente en el sistema circulatorio de un sujeto, pero se une al CAR con una afinidad menor que el TCBM como se describe en el presente documento. Preferentemente, la molécula que aparece de modo natural en un sujeto puede ser una molécula extracelular o una molécula con estructura extracelular parcial, más preferentemente, la molécula que aparece de modo natural en un sujeto puede ser una proteína humana no nuclear. Este CAR adaptable mejora la eficacia de la terapia al tiempo que minimiza los riesgos antes mencionados de usar LaM/LiM inmunogénica.

El resto enlazador y el resto marcador son parte de la molécula de unión a células diana (TCBM) que también comprende un resto de unión a antígeno (ABM), en el que el resto enlazador conjuga LaM y ABM. Generalmente, dicho ABM se dirige contra un antígeno expresado en la superficie de una célula diana.

Mediante la administración de TCBM junto con las células efectoras inmunitarias que expresan CAR, la respuesta de las células efectoras inmunitarias puede dirigirse únicamente a aquellas células que expresan el antígeno en la superficie de las células diana, reduciendo así la toxicidad fuera de la diana. Las células inmunitarias que expresan CAR se pueden usar como células efectoras inmunitarias "universales" para dirigirse a una amplia variedad de células diana, por ejemplo, una amplia variedad de tumores sin la necesidad de preparar construcciones CAR separadas. El epítopo marcador/enlazador del TCBM reconocido por el CAR también puede permanecer constante. Solo debe modificarse el ABM del TCBM para permitir que el sistema se dirija a células diana de diferente identidad.

El CAR anti-LLE utiliza TCBM como puente entre las células efectoras inmunitarias que expresan el CAR y las células diana que expresan el antígeno. El TCBM comprende un resto marcador (LaM) en un extremo de la molécula y un resto de unión a antígeno (ABM) en el otro extremo, conectado por un resto enlazador. El único requisito para la identidad del radical marcador es que debe ser una molécula que aparece de modo natural en un sujeto (un autoantígeno), y que la variante conjugada del resto enlazador pueda ser reconocida y unida por un CAR expresado por una célula efectora inmunitaria con mayor afinidad por la variante conjugada con el resto enlazador (el autoantígeno modificado) que por la variante que aparece de modo natural conjugada con el resto no enlazador.

Cada molécula que podría ser capaz de generar un LLE se puede usar como resto enlazador. El único requisito para la identidad de un resto enlazador es que el resto enlazador pueda estar químicamente conjugado (o acoplado) a un resto marcador o codificado genéticamente (de modo recombinante) y debería poder generar un nuevo epítopo en el contexto, la interfase y/o el entorno del resto enlazador y el resto marcador. El LiM puede ser preferentemente una molécula que no evoca ni tiende a provocar una reacción inmunitaria en el sujeto, por ejemplo, el LiM es un autoantígeno. En este caso, la interfase de LaM y LiM genera un epítopo nuevo, el LLE.

El LiM puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, polihidroxialcanoatos, cadenas de alquilo, ácidos alcanoicos, ácidos carboxílicos (por ejemplo, ácido £-aminocaproico (ácido 6-aminohexanoico) o ácido 6-(6-aminohexanamido)hexanoico) farnesilos, polietilenglicoles, lípidos y derivados de los mismos.

Un LiM especialmente preferido puede ser un resto 6-(6-aminohexanamido)hexanoílo, por ejemplo, derivado del ácido 6-(6-aminohexanamido)hexanoico o el éster activo 6-(6-aminohexanamido)hexanoico, o un resto 6-aminohexanoílo, por ejemplo, derivado del ácido 6-aminohexanoico o éster activo 6-aminohexanoico. El CAR anti-LLE puede ser un CAR en el que dicho LaM es biotina y dicho LiM es un resto enlazador de 6-(6-aminohexanamido)hexanoílo o un resto enlazador de 6-aminohexanoílo.

La expresión "activa y estimula una respuesta inmunitaria de dicha célula efectora inmunitaria" en el contexto de activación del receptor de unión a antígeno, por ejemplo, el CAR, significa una inducción primaria de una cascada de señalización que está asociada con un estado alterado de expresión génica en la célula efectora inmunitaria que inicia una respuesta inmunitaria que incluye, pero no se limita a proliferación, diferenciación, liberación de citoquinas, función efectora citolítica y similares. Por ejemplo, la unión de TCR dependiente de MHC conduce a la agrupación de TCR y la formación de una sinapsis inmunológica, que incluye, entre otros, CD3, CD4, CD8. Posteriormente, conduce a la unión de ZAP70 a CD3Z que permite la activación. A continuación, varias vías conducen a la expresión de factores de transcripción que activan, en última instancia, a las células T, tales como AP-1, NFAT y NF-kB, que se requieren, por ejemplo, para una mayor producción de IL-2 que permite la proliferación y las respuestas inmunitarias mediadas por células T. Sin embargo, para inducir una respuesta inmunitaria persistente, los receptores coestimuladores como CD28, CD27, CD137 (4-1BB) o ICOS tienen que activarse concomitantemente. Cualquier unión de TCR (señal 1) sin señales coestimuladoras (señal 2) está asociada con la inhibición de la función efectora de las células T, y esto significa que las células T se vuelven anérgicas. La expresión "media en una respuesta inmunitaria de dicha célula efectora inmunitaria" tiene el mismo significado que "activa y estimula una respuesta inmunitaria de dicha célula efectora inmunitaria" y puede usarse indistintamente. La expresión "refuerza dicha respuesta inmunitaria de dicha célula efectora inmunitaria y/o asegura la supervivencia de dicha célula efectora inmunitaria" en el contexto de la activación del CCR significa una activación de una cascada de señalización coestimuladora independiente de la señal-1 en la célula efectora inmunitaria que proporciona condiciones intracelulares que estimulan la supervivencia y permiten una respuesta inmunitaria dependiente de la señal-1 mejorada. Por ejemplo, una célula efectora inmunitaria que coexpresa tanto un CAR como un CCR solo puede ser activada por el CAR que comprende por ejemplo, el dominio de activación CD3Z, pero, sin embargo, el potencial citolítico puede reforzarse mediante una activación adicional de vías coestimuladoras (por ejemplo, 4-1 BB o CD28) a través del CCR.

El término "anticuerpo", como se usa en este documento, se usa en el sentido más amplio para cubrir las diversas formas de estructuras de anticuerpos que incluyen, entre otros, anticuerpos monoclonales y policlonales (incluidos anticuerpos de longitud completa), anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), fragmentos de anticuerpos, es decir, fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo, inmunoadhesinas y quimeras anticuerpoinmunoadhesina, que reconocen específicamente (es decir, se unen) a un antígeno diana. Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo de longitud completa, preferiblemente el dominio variable del mismo, o al menos el sitio de unión al antígeno del mismo ("un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo"). Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen Fab (fragmento de unión al antígeno), scFv (fragmento variable monocatenario), anticuerpos de dominio único, diacuerpos, dsFv, Fab', diacuerpos, moléculas de anticuerpo monocatenario y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

Como se usa en el presente documento, el término "antígeno" pretende incluir sustancias que se unen o provocan la producción de uno o más anticuerpos y pueden comprender, entre otros, proteínas, péptidos, polipéptidos, oligopéptidos, lípidos, carbohidratos como el dextrano, haptenos y combinaciones de los mismos, por ejemplo una proteína glicosilada o un glicolípido. El término "antígeno", como se usa en el presente documento, se refiere a una entidad molecular que puede expresarse en la superficie de una célula diana y que puede ser reconocida por medio del sistema inmunológico adaptativo que incluye, entre otros, anticuerpos o TCR, o moléculas modificadas que incluyen, pero no se limitan a TCR endógenos o transgénicos, CAR, scFv o multímeros de los mismos, fragmentos Fab o multímeros de los mismos, anticuerpos o multímeros de los mismos, anticuerpos monocatenarios o multímeros de los mismos, o cualquier otra molécula que pueda ejecutar la unión a una estructura con alta afinidad.

La expresión "antígeno adicional", como se usa aquí, se refiere al antígeno que se une al dominio de unión al antígeno del CCR. Puede ser el segundo antígeno del sistema de refuerzo, como se describe en este documento, si el receptor de unión a antígeno se une directamente a un antígeno (el primer antígeno) expresado en la superficie de una célula diana. Como alternativa, puede ser el tercer antígeno del sistema de refuerzo, como se describe en este documento, si el receptor de unión a antígeno se une a un marcador (el primer antígeno) de un polipéptido marcado, en el que el polipéptido se une a un antígeno expresado en la superficie de una célula diana (segundo antígeno). La expresión "dicho antígeno adicional no se expresa sobre dicha célula diana" significa que el antígeno adicional se expresa en la superficie de otra célula que no es una célula cancerosa, preferiblemente es una célula que no está en un estado patológico, o es un antígeno que circula libremente en el sistema circulatorio, por ejemplo, un antígeno soluble, de un sujeto.

Las expresiones "dicho antígeno adicional se expresa en la superficie de otra célula que no es la célula diana" y "dicho antígeno adicional se expresa en la superficie de una segunda célula diana" pueden usarse indistintamente. La segunda célula diana que expresa un antígeno reconocido por el CCR puede ser un tipo específico de otra célula (pero otro tipo de célula distinta de la (primera) célula diana) o puede ser cualquier célula, por ejemplo, en un sujeto que se trata con la célula efectora inmunitaria como se describe en el presente documento, pero no es la (primera) célula diana (por ejemplo, la célula cancerosa). La otra célula que no es la célula diana (o la segunda célula diana) puede no estar en un estado patológico. Una célula que no está en un estado patológico puede ser una célula que no está destinada a ser destruida por la célula efectora inmunitaria como se describe en el presente documento, preferentemente la célula que no está en un estado patológico es una célula sana, por ejemplo, de un sujeto que se trata con la célula efectora inmunitaria como se describe en el presente documento.

La expresión "dicho antígeno adicional no se expresa en la superficie de una célula" como se usa en este documento significa que el antígeno adicional no se expresa y/o no se presenta en la superficie de una célula de mamífero. Si el antígeno adicional no es un polipéptido, por ejemplo, es un polisacárido, como el dextrano, entonces el significado es que el antígeno adicional no se presenta en la superficie de una célula de mamífero. El significado de esta expresión es que dicho antígeno adicional no es una molécula que aparece de modo natural en la superficie de una célula de mamífero.

El antígeno asociado a tumor (TAA) como se usa en este documento se refiere a una sustancia antigénica producida en células tumorales. Los antígenos asociados a tumores son marcadores tumorales o cancerosos útiles para identificar células tumorales/cancerosas con pruebas de diagnóstico y son candidatos potenciales para su uso en la terapia del cáncer. Preferiblemente, el TAA puede expresarse en la superficie celular de la célula tumoral/cancerosa, de modo que pueda ser reconocido por el receptor de unión a antígeno como se describe en este documento.

El antígeno asociado a tumor puede seleccionarse del grupo que consiste en CD33 (Siglec-3), CD123 (IL3RA), CD135 (FLT-3), CD44 (HCAM), CD44V6, CD47, CD184 (CXCR4), CLEC12A (CLL1), LeY , FRp, MICA/B, CD305 (LAIR-1), CD366 (TIM-3), CD96 (TACTILE), CD133, CD56, CD29 (ITGB1), CD44 (HCAM), CD47 (IAP), CD66 (CEA), CD112 (Nectin2), CD117 (c-Kit), CD133, CD146 (MCAM), CD155 (PVR), CD171 (L1CAM), CD221 (IGF1), CD227 (MUC1), CD243 (MRD1), CD246 (ALK), CD271 (LNGFR), CD19, CD20, GD2, EGFR y HMW-MAA (CSPG4), pero no hay limitación para los TAA enumerados en este documento, ya que el sistema de refuerzo como se describe en este documento puede aplicarse a cualquier TAA expresado sobre un tumor o célula cancerosa.

El cúmulo de diferenciación (abreviado como CD) es un protocolo utilizado para la identificación e investigación de moléculas de la superficie celular, normalmente polipéptidos, que proporcionan dianas para la inmunofenotipificación de células.

La expresión "célula diana" como se usa en este documento se refiere a una célula que expresa un antígeno en su superficie celular que debería ser reconocido (unido) por el receptor de unión a antígeno como se describe en este documento y/o por el CCR como se describe en este documento.

La (primera) célula diana del sistema de refuerzo como se describe en este documento puede ser una célula en un estado patológico, tal como una célula cancerosa que expresa un antígeno asociado a tumor que es reconocido directa o indirectamente por el receptor de unión a antígeno como se describe en este documento. La segunda célula diana del sistema de refuerzo como se describe en este documento puede ser una célula distinta de la primera célula diana. Esta segunda célula diana puede expresar un antígeno en su superficie que el CCR reconozca directa o indirectamente como se describe en el presente documento.

Los receptores de antígenos, por ejemplo, los CAR y los CCR como se describen en el presente documento (uno o más polipéptidos), la molécula o moléculas de ácido nucleico que codifican los CAR y/o los CCR, los vectores de expresión recombinantes, las células que expresan los CAR y los CCR, y las poblaciones de células que expresan los CAR y los CCR, pueden aislarse y/o purificarse. El término "aislado" significa alterado o retirado del estado natural. Por ejemplo, una población aislada de células significa un enriquecimiento de dichas células y la separación de otras células que normalmente están asociadas en su estado natural con dichas células aisladas. Una población aislada de células significa una población de células sustancialmente purificadas que son una población de células más homogénea que la que se encuentra en la naturaleza. Preferiblemente, la población celular enriquecida comprende al menos aproximadamente el 90 % del tipo celular seleccionado. En aspectos particulares, la población celular comprende al menos alrededor del 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o incluso 100 % del tipo celular seleccionado .

Por ejemplo, un ácido nucleico o un péptido presente de forma natural en un animal vivo no está "aislado", pero el mismo ácido nucleico o péptido parcial o completamente separado de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislado". Un ácido nucleico o una proteína aislados también pueden existir en un entorno no nativo como, por ejemplo, en una célula huésped.

El dextrano es un glucano complejo ramificado (polisacárido formado por muchas moléculas de glucosa) compuesto por cadenas de diferentes longitudes (de 3 a 2000 kilodaltons). Puede usarse dextrano de cualquier longitud, por ejemplo, de 3 a 2000 kDa, para las aplicaciones descritas en la presente. Preferiblemente, el dextrano utilizado puede ser mayor que 5, 10, 20, 100 o 200 kDa. En algunas realizaciones de la invención, el dextrano usado puede ser un dextrano de 60 a 200 kDa. El dextrano soluble como se usa en este documento puede presentar muchos antígenos para el CCR que se une al dextrano como se describe en este documento. El dextrano puede ser un poliantígeno en lugar de un monoantígeno para el CCR antidextrano.

Dicho dextrano puede ser dextrano no unido, es decir, dextrano libre, dextrano soluble o dextrano conjugado con nanopartículas o micropartículas coloidales. Dicho dextrano puede administrarse a un paciente que lo necesite y que albergue la célula efectora inmunitaria como se describe en el presente documento para reforzar dicha célula efectora inmunitaria en condiciones controlables. Como alternativa, dicho dextrano puede acoplarse a un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, en el que dicho anticuerpo puede unirse específicamente a otro antígeno que puede expresarse sobre dicha célula diana o sobre dicha otra célula.

Como se usa en este documento, el término "sujeto" se refiere a un mamífero, tal como un ratón, rata, vaca, cerdo, cabra, perro, pollo, mono o ser humano. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano. El sujeto puede ser un sujeto que padece un trastorno como el cáncer (un paciente), pero el sujeto también puede ser un sujeto sano.

El término "autólogo", como se usa en este documento, se refiere a cualquier material derivado del mismo sujeto al que después se le reintroduce.

El término "alogénico" como se usa en este documento se refiere a cualquier material derivado de un sujeto diferente de la misma especie que el sujeto al que se le reintroduce el material.

Las expresiones "cantidad terapéuticamente eficaz" o "población terapéuticamente eficaz" significan una cantidad de una población celular que proporciona un beneficio terapéutico en un sujeto.

Las expresiones "se une específicamente" o "específico para" con respecto a un dominio de unión al antígeno de un anticuerpo, de un fragmento de unión al antígeno del mismo, como se usa por ejemplo, en el CAR y CCR como se describe en este documento, o en el polipéptido marcado, por ejemplo, el TCBM, se refieren a un dominio de unión al antígeno que reconoce y se une a un antígeno específico, pero no reconoce ni se une sustancialmente a otras moléculas en una muestra. Un dominio de unión al antígeno que se une específicamente a un antígeno de una especie puede unirse también a ese antígeno de otra especie. Esta reactividad entre especies es típica de muchos anticuerpos y, por lo tanto, no es contraria a la definición de ese dominio de unión al antígeno como específico. Un dominio de unión al antígeno que se une específicamente a un antígeno puede unirse también a diferentes formas alélicas del antígeno (variantes alélicas, variantes de corte y empalme, isoformas, etc.) o variantes homólogas de este antígeno de la misma familia de genes. Esta reactividad cruzada es típica de muchos anticuerpos y, por lo tanto, no es contraria a la definición de ese dominio de unión al antígeno como específico.

Las expresiones "célula modificada" y "célula modificada genéticamente" como se usan en este documento se pueden usar indistintamente. Los términos significan contener y/o expresar un gen o secuencia de ácido nucleico extraños que, a su vez, modifican el genotipo y/o fenotipo de la célula o su progenie. Especialmente, los términos se refieren al hecho de que las células, preferentemente las células inmunitarias, pueden manipularse mediante métodos recombinantes bien conocidos en la técnica para expresar de forma estable o transitoria péptidos o proteínas que no se expresan en estas células en el estado natural. Por ejemplo, las células inmunitarias se modifican para expresar una construcción artificial, tal como un receptor de antígenos quimérico, en su superficie celular.

El término "trastorno" significa una anomalía o alteración funcional en un sujeto, como un cáncer, un trastorno autoinmunitario o una infección por virus, bacterias, parásitos u otros.

El término "tratar" (tratamiento de) un trastorno (por ejemplo, cáncer) como se usa en este documento significa reducir la frecuencia o gravedad de al menos un signo o síntoma de una enfermedad o trastorno experimentado por un sujeto.

El término "expresión", como se usa en el presente documento, se define como la transcripción y/o traducción de una secuencia de nucleótidos particular dirigida por su promotor en una célula.

El término "epítopo" significa la parte de un antígeno que puede ser reconocido por el sistema inmunológico, específicamente por anticuerpos, células B o células T. Por ejemplo, el epítopo es la pieza específica del antígeno a la cual se une un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo.

Los términos "epítopo enlazador/marcador" (LLE) o "epítopo marcador/enlazador" como se usan en este documento se pueden usar indistintamente y se refieren a un epítopo formado por el contexto, la interfase y/o el entorno del resto enlazador conjugado y el resto marcador del TCBM como se describe en este documento.

El epítopo generado por el acoplamiento del resto marcador con un resto enlazador no se produce de forma natural en un sujeto. El epítopo generado comprende una parte de dicho LaM y una parte de dicho LiM. Preferiblemente, el LLE no evoca ni tiende a provocar una reacción inmunitaria en un sujeto previsto para ser tratado con células que expresan el CAR anti-LLE como se describe en el presente documento. El único requisito para el LLE es que sea un epítopo con respecto al CAR que comprende el dominio de unión a LLE. Un dominio extracelular de unión a LLE de un CAR como se describe en este documento que se deriva de una molécula de reconocimiento de epítopo, como un anticuerpo que reconoce el epítopo marcador/enlazador, se une con una preferencia mayor al epítopo recién creado, es decir, el epítopo marcador/enlazador (el autoantígeno modificado) que al resto marcador endógeno sin resto enlazador, es decir, la molécula que aparece de modo natural en el sujeto (el autoantígeno).

Dicho dominio de unión a LLE extracelular del CAR anti-LLE se une con una afinidad al menos doble, preferentemente al menos 5 veces, más preferentemente al menos 10 veces mayor a dicho LLE que a dicha molécula que aparece de modo natural.

Las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:23 como se indica en el protocolo de listado de secuencias son en su mayoría secuencias parciales o completas de CAR como se describe en este documento. Dichas secuencias de SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:23 también pueden comprender variantes de estas secuencias, respectivamente, que tienen algunos aminoácidos suprimidos, añadidos o reemplazados, conservando al mismo tiempo la función prevista como se describe en este documento. Por lo tanto, en esta definición se incluyen variantes de las secuencias de aminoácidos en SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:23, respectivamente, tales como secuencias de aminoácidos esencialmente similares a SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:23, respectivamente, que tiene una identidad de secuencia de al menos 70 %, o al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % a nivel de secuencia de aminoácidos. En general, en esta definición se incluyen todas las variaciones de aminoácidos que no conducen a cambios deliberados de la función prevista de las secuencias SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:23, respectivamente. En el contexto de la presente invención, la "identidad de secuencia" puede determinarse usando alineaciones por pares usando programas de alineación para secuencias de aminoácidos bien conocidos en la técnica.

El "sistema circulatorio" es un sistema de órganos de un sujeto que permite que la sangre circule y transporte nutrientes (como aminoácidos y electrolitos), oxígeno, dióxido de carbono, hormonas y células sanguíneas hacia y desde las células del cuerpo para proporcionar nutrición y ayuda a combatir enfermedades, estabilizar la temperatura y el pH y mantener la homeostasis. El sistema circulatorio comprende dos sistemas separados: el sistema cardiovascular, que distribuye la sangre, y el sistema linfático, que hace circular la linfa.

La expresión "molécula que aparece de modo natural en un sujeto o un derivado de la misma" como se usa en este documento se refiere a moléculas o sustancias en un sujeto, y preferentemente dichas moléculas están ubicadas extracelularmente o tienen al menos una parte extracelular, por ejemplo, una proteína transmembrana. La molécula que aparece de modo natural puede existir en forma libre o unida covalente o no covalentemente a otra molécula, por ejemplo, unida a una proteína. Por ejemplo, la biotina existe en forma libre circulando en el sistema sanguíneo, pero también unida, por ejemplo, a una proteína del plasma.

Debido a este requisito, estas moléculas no son inmunogénicas, ya que son moléculas endógenas (autoantígenos) del sujeto. Por ejemplo, la biotina es una molécula que aparece de modo natural en un sujeto, ya que es una molécula circulatoria en el sistema sanguíneo (sistema circulatorio) de un sujeto. La expresión "derivado de la misma" significa en este contexto que dicha molécula que aparece de modo natural en un sujeto puede sufrir algunas modificaciones menores sin que cambie la naturaleza de dicha molécula. Dichas modificaciones no son idénticas a la conjugación del resto enlazador con dicha molécula. El término "tumor" se conoce médicamente como neoplasia. No todos los tumores son cancerosos; los tumores benignos no invaden los tejidos vecinos y no se diseminan por todo el cuerpo.

El término "cáncer" se conoce médicamente como neoplasia maligna. El cáncer es un grupo amplio de enfermedades que implican un crecimiento celular no regulado e incluyen todo tipo de leucemias. En el cáncer, las células (células cancerosas) se dividen y crecen sin control, formando tumores malignos e invadiendo partes cercanas del cuerpo. El cáncer también se puede diseminar a partes más alejadas del cuerpo a través del sistema linfático o el torrente sanguíneo. Hay más de 200 cánceres diferentes conocidos que afectan a los seres humanos.

Las expresiones "método automático" o "proceso automático" como se usan en este documento se refieren a cualquier proceso que se automatiza mediante el uso de dispositivos y/o ordenadores y software de ordenador que, de otra manera, sería o podría ser realizado manualmente por un operario. Los métodos (procesos) que se han automatizado requieren menos intervención humana y menos tiempo humano para su ejecución. En algunos casos, un método es automático si al menos una etapa del método se realiza sin ningún apoyo o intervención humana. Preferiblemente, el método es automático si todas las etapas del método se realizan sin apoyo o intervención humana.

Esta invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse de ninguna manera como una imposición de limitaciones al alcance de la misma.

Ejemplos

Ejemplo 1. Generación de células T que coexpresan CAR anti-HMW-MAA y CCR anti-CD20

1.1 Diseño de las construcciones

Para desarrollar células T CAR/CCR que reconozcan tanto HMW-MAA como CD20, se diseñaron diferentes construcciones lentivirales que codifican CAR y CCR. El CAR anti-HMW-MAA comprende una secuencia conductora de CD8 humana (SEQ ID NO:1) o una secuencia conductora murina (SEQ ID NO:2) seguida de un scFv derivado de los anticuerpos monoclonales murinos (mAB) 225.28s en la orientación VL-VH (SEQ ID NO:3) o 763,74 en la orientación VH-VL (SEQ ID NO:4), unidas por un enlazador (G4S)3 flexible, respectivamente. Estos scFv se subclonaron en plásmidos de vectores de transferencia lentivirales que contenían diferentes variantes de espaciadores extracelulares basadas en IgG4 (HC) humana (SEQ ID NO:5-7) o CD8 (SEQ ID NO:8), un dominio transmembrana CD8 humano (SEQ ID NO:9), un dominio de coestimulación 4-1BB humano intracelular (SEQ ID NO:10) unido a un dominio de señalización de CD3Z humano (SEQ ID NO:11), así como un marcador de superficie unido al elemento 2A (ALNGFR) (SEQ ID NO:12) (figura 2). Las construcciones lentivirales que codifican CCR anti-CD20 se generaron subclonando la secuencia conductora de CD8 humana (SEQ ID NO:1) en combinación con un scFv derivado del mAB Leu16 murino en la orientación VL-VH (SEQ ID NO:13), unido por un enlazador (G4S)3, en plásmidos de vector de transferencia lentiviral que contienen variantes de espaciadoras extracelulares derivadas de IgG 1 humana (SEQ ID NO:14), IgG4 humana (SEQ ID NO:5) o tallo de CD8 humano (SEQ ID NO:8). Todas las construcciones que codifican CCR anti-CD20 contienen el mismo dominio transmembrana de CD8 humano (SEQ ID NO:9) así como el AEGFR unido al elemento 2A colocado en el extremo C (SEQ ID NO:15) como marcador de superficie, pero difieren con respecto a los dominios de coestimulación que pueden ser 4-1BB (SEQ ID NO:10), CD28 (SEQ ID NO:16) o combinaciones de los mismos (figura 3).

Cualquier versión de ambas construcciones que codifican CAR también se puede unir a través de un elemento 2A seguido de un ALNGFR colocado en el extremo C en el esqueleto lentiviral para generar construcciones dobles (DC).

1.2 Generación de partículas LV

Para la producción de partículas lentivirales se sembraron 0,5 x 105/cm2 de células HEK293T en un matraz de cultivo celular T175 (175 cm2) usando 25 mL de medio (DMEM, FCS al 10 % (en v/v), L-glutamina 2 mM) y se incubó durante la noche a 37 °C, 5 % de CO². Al día siguiente, las células adherentes mostraron típicamente un 75-90 % de confluencia. El medio se cambió a DMEM con L-glutamina 2 mM, sin FCS y se prepararon mezclas de ADN de transfección (usando Lipofectamine 3000, protocolo de reactivo ThermoFisher). Para esto, una cantidad de ADN total de 0,2 pg/cm2 (35 pg para un matraz T175) y se prepararon dos mezclas separadas A (ADN) y B (Lipofectamine). Para la mezcla A: plásmido de vector de transferencia 0,073 pg/cm2 (12,7 pg), plásmido auxiliar 1 (VSVg) 0,018 pg/cm2 (3,18 pg), plásmido auxiliar 2 (gag/rev/pol) 0,109 pg/cm2 (19,09 pg), reactivo potenciador P30002 pL/pg de ADN total y Opti-MEM 0,033 mL/cm2 se mezclaron agitando brevemente en vórtice. Para la mezla B: Lipofectamine 3000 0,75 pL/cm2 se resuspendió en Opti-MEM 0,033 mL/cm2. Las mezclas A y B se incubaron por separado durante 5 minutos, luego las mezclas A y B se mezclaron juntas suavemente y se incubaron durante 20 minutos a TA. A continuación, se añadieron gota a gota los complejos de lípido/ADN a las células en placa y se incubaron a 37 °C durante aproximadamente 12 horas. Después de esto, el medio se reemplazó por 0,133 mL/cm2 de medio fresco (DMEM, FCS al 10 %, L-glutamina 2 mM) y se incubó a 37 °C, 5 % de CO²durante 24 horas. Las partículas lentivirales ensambladas se recolectaron eliminando cuidadosamente el sobrenadante del cultivo celular mediante pipeteo. Los restos celulares se eliminaron del sobrenadante mediante centrifugación durante 10 min a 5000 xg. El sobrenadante que contenía LV se utilizó luego directamente para la transducción de células T, se conservó durante la noche a 4 °C o se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C. Para una segunda ronda de producción de partículas lentivirales se añadieron 0,133 mL/cm2 de medio fresco (DMEM, FCS al 10 %, L-glutamina 2 mM) a las células HEK293T transfectadas y se continuó la incubación durante otras 24 horas a 37 °C, 5 % de CO². Después de 24 h, se recogió el sobrenadante como se describió anteriormente.

1.3 Análisis de la transducción, expansión, enriquecimiento y expresión de células T que coexpresan CAR anti-HMW-MAA y CCR anti-CD20

Se extrajeron muestras de sangre de donantes sanos y se generaron PBMC mediante separación en Pancoll (PAN-Biotech). Las células T PAN se seleccionaron utilizando la tecnología MACS (Miltenyi Biotec). Para la activación y expansión de la células T, se usó el kit de activación/expansión de células T, humano (Miltenyi Biotec) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células T se sembraron en placas de 24 pocillos con 2 ml de suspensión de células T por pocillo a una concentración de 1x106 células/mL en medio TexMACS que contenía suero AB humano (al 10 % (en v/v), GemCell), IL-7 (6,25 ng/mL) e IL-15 (12,5 ng/mL) (Miltenyi Biotec).

La transducción/cotransducción con LV_CAR anti-HMW-MAA en combinación con LV_CCR anti-CD20 o ambos por separado se realizó el día 2 después de la activación. El día 6 después de la activación, se midió la efichacia de la transducción mediante análisis de flujo usando APC anti-LNGFR (Miltenyi Biotec) y anti-EGFR-PE (BD) (figura 4). Al día siguiente, las células que expresan ALNGFR/EGFR se separaron utilizando el kit anti-biotina MultiSort (Miltenyi Biotec) con microesferas anti-ALNGFR-biotina/anti-biotina y microesferas anti-EGFR-PE/anti-PE (Miltenyi Biotec) según las instrucciones del fabricante, respectivamente. Las células enriquecidas se reactivaron utilizando el kit de activación/expansión de células T, humano (Miltenyi Biotec) y se sembraron en una placa de 24 pocillos a una concentración de 1x106 células/mL (2 mL por pocillo). A continuación, las células se expandieron continuamente y se determinó de nuevo la eficacia de transducción el día 16 después de su primera activación mediante análisis de flujo (figura 5).

Ejemplo 2. Generación de líneas celulares diana para el análisis de la citotoxicidad

2.1 Generación de líneas celulares que expresan luciferasa transducidas de modo estable

Se generó un plásmido de vector de transferencia lentiviral que codifica un gen de luciferasa de luciérnaga y una secuencia de GFP unida al elemento 2A como es bien conocido en la técnica. Las partículas de LV se generaron como se describió en 1.2. La transducción de células tumorales fue similar a la de las células T descritas en 1.3. Después de la transducción, las células tumorales se enriquecieron y la eficacia de la transducción se evaluó mediante citometría de flujo (láser de 488 nm de excitación de GFP, filtro de paso de banda 525/50 nm). Posteriormente, se realizó una expansión unicelular de acuerdo con los protocolos conocidos por los expertos. Los subclones que expresan GFP se ampliaron de nuevo, se crioconservaron y se utilizaron para los análisis funcionales. Al hacerlo, se g_Ne_An_Le_Mra_6lr_{_}o_un_tiferasl_aa_{_}s_eGFPsiguientes líneas celulares: Mel526Luciferasa_eGFP, JeKo-1Luciferasa_eGFP, RajiLuciferasa_eGFP y

2.2 Generación de líneas celulares de coexpresión de luciferasa y CD20 transducidas de manera estable

Debido a la falta de líneas celulares que expresan HMW-MAA y que coexpresan CD20, se modificó Mel526Luciferasa_eGFP aún más usando una construcción lentiviral que codifica el gen CD20 humano de acuerdo con la descripción en 2.1. La línea celular recién generada Mel526Luciferasa_eGFP_CD20 expresa de forma estable la luciferasa, eGFP y CD20 según se detecta por citometría de flujo usando APC anti-CD20 (Miltenyi Biotec).

Ejemplo 3. Ensayo de funcionalidad mediante un ensayo de liberación de citoquinas y de muerte

3.1 Análisis de la funcionalidad en trans a través de un ensayo de liberación de citoquinas

El día 16 después de la activación, se cultivaron conjuntamente células T CAR/CCR 1E5 en un volumen total de 200 gl de medio TexMACS (Miltenyi Biotec) en una placa de 96 pocillos con células Mel526 que expresan 2E4 HMW-MAA en presencia o ausencia de 1E5 células que expresan CD20 (por ejemplo, células B autólogas, JeKo-1 o Raji) durante 24 h. Posteriormente, se midió la liberación de citoquinas en el sobrenadante usando el kit MACSPlex Cytokine 12, humano (Miltenyi Biotec) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (figura 6).

3.2 Análisis de la funcionalidad en cis mediante un ensayo de liberación de citoquinas

Según 3.1, se cocultivaron 1E5 células T CAR/CCR 1E5 con 2E4 células Mel526Luciferasa_eGFP_CD20 durante 24 h, antes de que se cuantificaran las citoquinas liberadas usando el kit MACSPlex Cytokine 12, humano (Miltenyi Biotec) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (figura 7).

3.3 Análisis de la funcionalidad en cis o trans mediante un ensayo de muerte basado en luminiscencia

Para determinar la actividad citolítica de las células T CAR generadas, se cocultivaron 2E4 células Mel526Luciferase_eGFP para la estrategia trans o células Mel526Luciferase_eGFP_CD20 para la estrategia cis con células T CAR/CCR en diferentes proporciones de efector a diana (10:1; 5:1; 2,5:1; 1,25:1) en un volumen total de 200 gl de medio TexMACS (Miltenyi Biotec) en placas de 96 pocillos negras (Miltenyi Biotec). Para el ensayo de trans, se agregó el mismo número de células que expresan CD20 (por ejemplo, células B, JeKo-1 o Raji) como células T. Después de una incubación de 18 h, se añadió el sustrato bioluminiscente XenoLight D-Luciferin-K+ Salt (PerkinElmer), diluido en medio TexMACS (Miltenyi Biotec), hasta una concentración final de 300 gg/ml. La luminiscencia se midió usando un lector de placas de luminiscencia (PerkinElmer) (figura 8). Los datos de luminiscencia se correlacionan con la viabilidad y se correlacionan inversamente con la muerte de las células diana como es bien conocido en la técnica.

Ejemplo 4. Estrategias de CAR anti-LLE

4.1 Generación de un banco de construcciones de vectores de transferencia lentivirales que codifican diferentes variantes de espaciadores del CAR anti-LLE

Con el fin de generar CAR anti-LLE que reconocen la biotina, así como partes del resto enlazador que conecta la biotina con el anticuerpo que reconoce el epítopo de la célula diana, se diseñó un scFv (fragmento variable de cadena única) basado en las cadenas variables pesada (VH) y ligera (VL) de un anticuerpo antibiotina en la orientación VH-VL y VL-VH (SEQ ID NO:17 y 18). Las cadenas variables estaban conectadas por un enlazador (G4S)3 flexible y la secuencia conductora de CD8 humana (SEQ ID NO:1) se colocó en el extremo N-terminal del scFv y se subclonó en plásmidos de vector de transferencia que contenían diferentes variantes de espaciadores basadps en IgG4 humana (HC) (SEQ ID NO:5-7) y tallo de CD8 humano (SEQ ID NO:8), un elemento 2A así como un marcador de expresión (ALNGFR) (SEQ ID NO:12).

4.2 Generación de partículas LV, análisis de la transducción, expansión y expresión de células T CAR anti-LLE

Las partículas de LV se generaron como ya se describió en 1.2.

De acuerdo con el protocolo descrito en 1.3, se prepararon células T para la transducción con LV_CAR anti-LLE. El día 8 después de la activación, las células que expresan ALNGFR se separaron mediante MACS utilizando microesferas anti-ALNGFR en una columna LS (Miltenyi Biotec) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células seleccionadas se reactivaron utilizando el kit de activación/expansión de células T, humano (Miltenyi Biotec) y se sembraron en una placa de 24 pocillos a una concentración de 1x106 células/mL (2 mL por pocillo). A continuación, las células se expandieron continuamente y se determinó la eficacia de transducción el día 14 después de su primera

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una célula efectora inmunitaria que comprende:

b) un receptor coestimulador quimérico (CCR), en la que dicho CCR se une a un antígeno adicional,

en la que dicho antígeno adicional no se expresa en la superficie de dicha célula diana,

y en la que la magnitud de la potenciación de la respuesta efectora de la célula inmunitaria que expresa tanto el CAR como el CCR es al menos 1,5 veces mayor en comparación con la respuesta efectora de la célula inmunitaria que es activada y estimulada únicamente por el CAR, y que no es reforzada por el CCR.

2. La célula efectora inmunitaria según la reivindicación 1, en la que dicha célula diana es una célula cancerosa.

3. La célula efectora inmunitaria según la reivindicación 1 o 2, en la que dicho dominio de señalización citoplásmico primario de dicho CAR es CD3Z, y en la que dicha parte citoplásmica de dicho CCR comprende al menos un dominio coestimulador seleccionado del grupo que consiste en ICOS, CD154, CD5, CD2, CD46, HVEM, CD8, CD97, TNFRSF18, CD30, SLAM, DAP10, CD64, CD16, CD89, MyD88, KIR-2DS, KIR-3DS, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2D, ICAM, CD27, OX40, 4-1BB y CD28.

4. La célula efectora inmunitaria según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha parte citoplásmica de dicho CRR comprende al menos un dominio coestimulador 4-1 BB y/o al menos un dominio coestimulador CD28.

5. La célula efectora inmunitaria según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicha parte citoplásmica de dicho CRR comprende dos dominios coestimuladores 4-1 BB o dos dominios coestimuladores CD28.

6. La célula efectora inmunitaria según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el polipéptido de dicho polipéptido marcado es un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, en la que dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo se une a dicho antígeno expresado en la superficie de dicha célula diana. y en la que el marcador de dicho polipéptido marcado es un hapteno.

7. La célula efectora inmunitaria según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el polipéptido de dicho polipéptido marcado es un resto de unión a antígeno (ABM), en la que el marcador de dicho polipéptido marcado es un epítopo conector/marcador (LLE) de una molécula de unión a células diana (TCBM), y en la que dicho CAR es un receptor de antígenos quimérico antiepítopo enlazador/marcador (CAR anti-LLE) que comprende:

I) un dominio de unión a epítopo enlazador/marcador (LLE),

II) un dominio transmembrana, y

III) un dominio de señalización citoplasmático que comprende al menos un dominio de señalización citoplásmico primario y al menos un dominio de señalización coestimulador,

en la que dicho dominio de unión a LLE extracelular se une a una molécula de unión a células diana (TCBM) que comprende:

i) un resto de unión a antígeno (ABM), en la que dicho ABM se une específicamente a dicho antígeno expresado en la superficie de dicha célula diana,

ii) un resto marcador (LaM), en la que dicho LaM es una molécula que aparece de modo natural en un sujeto o un derivado de la misma,

en la que dicho dominio de unión a LLE extracelular se une a dicho LLE con una preferencia mayor que a dicha molécula que aparece de modo natural.

8. La célula efectora inmunitaria según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicho antígeno adicional se expresa en la superficie de otra célula distinta de la célula diana, en la que la otra célula no está en un estado patológico.

9. La célula efectora inmunitaria según la reivindicación 8, en la que dicho antígeno adicional es CD20 y dicha segunda célula diana es una célula B.

10. La célula efectora inmunitaria según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicho antígeno adicional no se expresa en la superficie de una célula.

11. La célula efectora inmunitaria según la reivindicación 10, en la que dicho antígeno adicional es dextrano.

12. - La célula efectora inmunitaria según la reivindicación 11, en la que dicho dominio de unión al antígeno de dicho CCR comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:19 y en la que dicha parte citoplásmica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:21.

13. Una célula efectora inmunitaria que comprende:

y en la que la unión de dicho receptor de unión a antígeno a dicho marcador activa y estimula una respuesta inmunitaria de dicha célula efectora inmunitaria, lo cual conduce a una actividad citotóxica y la liberación de citoquinas de dicha célula efectora inmunitaria;

b) un receptor coestimulador quimérico (CCR), en la que dicho CCR se une a un antígeno adicional, en la que dicho antígeno adicional se expresa en la superficie de:

i) dicha célula diana a matar, y

ii) otra célula distinta de la célula diana,

en la que dicho CCR no es capaz de mediar en dicha respuesta inmunitaria por sí mismo, y en la que la magnitud de la potenciación de la respuesta efectora de la célula inmunitaria que expresa tanto el CAR como el CCR es al menos 1,5 veces mayor en comparación con la respuesta efectora de la célula inmunitaria que es activada y estimulada únicamente por el CAR, y que no es reforzada por el CCR.

14. La célula efectora inmunitaria según la reivindicación 13, en la que dicha célula diana es una célula cancerosa.

15. La célula efectora inmunitaria según la reivindicación 14, en la que la otra célula no está en un estado patológico.