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ES2861594T3 - Composiciones de dendrímeros y su uso en el tratamiento de enfermedades del ojo - Google Patents

Composiciones de dendrímeros y su uso en el tratamiento de enfermedades del ojo Download PDF

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ES2861594T3
ES2861594T3 ES15786462T ES15786462T ES2861594T3 ES 2861594 T3 ES2861594 T3 ES 2861594T3 ES 15786462 T ES15786462 T ES 15786462T ES 15786462 T ES15786462 T ES 15786462T ES 2861594 T3 ES2861594 T3 ES 2861594T3
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Kannan Rangaramanujam
Gerard Lutty
Siva Pramodh Kambhampati
Manoj Mishra
Imran Bhutto
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Johns Hopkins University
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Abstract

Una composición para su uso en el tratamiento de una o más enfermedades y trastornos inflamatorios y/o angiogénicos en el ojo que comprende a) nanopartículas de dendrímero y b) un agente biológicamente activo, en la que las nanopartículas de dendrímero comprenden dendrímeros de poli(amidoamina) terminados en hidroxilo (PAMAM), en la que las nanopartículas de dendrímero están unidas covalentemente al agente biológicamente activo y en la que la composición se administra por vía sistémica en una cantidad eficaz para suprimir o inhibir las una o más enfermedades o trastornos del ojo.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones de dendrímeros y su uso en el tratamiento de enfermedades del ojo
Antecedentes de la invención
La microglía está formada por los macrófagos residentes en el cerebro y la retina. Estos se activan en enfermedades, tales como la diabetes y la degeneración retiniana, en las que las células mueren, lo que hace que la microglía fagocite los restos celulares. La activación de la microglía retiniana se produce en un modelo de ratón de lesión por isquemia/reperfusión (I/R), como se produce en las enfermedades inflamatorias del ojo, incluido el glaucoma, la degeneración macular relacionada con la edad (DME), la retinopatía diabética y la oclusión de la vena ramificada. La oclusión vascular retiniana, ya sea a causa de la presión intraocular en el modelo de I/R o un trombo en la OVR, provoca una reducción en el flujo sanguíneo dentro del ojo, lo que provoca isquemia retiniana. Esto provoca la muerte de neuronas, lo que inicia la activación adicional de la microglía.
La DME (forma húmeda) se caracteriza por la separación serosa o hemorrágica del epitelio pigmentario o de la capa neurosensorial de la retina. Los pacientes pueden desarrollar neovascularización coroidea (NVC), que se manifiesta por acumulación de fluido, hemorragia y/o exudación de lípidos.
El estadio más temprano de la retinopatía diabética (RD) se caracteriza por anomalías vasculares retinianas que incluyen microaneurismas (bolsas saculares que sobresalen de la pared capilar), hemorragias intrarretinianas y exudados algodonosos (infartos en la capa de fibras nerviosas). A medida que evoluciona la enfermedad, el cierre gradual de los vasos retinianos provoca isquemia retiniana, lo que ocasiona síntomas que incluyen anomalías venosas (cordones, bucles), anomalías microvasculares intrarretinianas y el aumento de la hemorragia y la exudación retiniana. La retinopatía diabética no proliferativa se clasifica como leve, moderada, grave y muy grave dependiendo de la presencia y el alcance de las lesiones anteriores.
El estadio más avanzado de la RD implica la formación de nuevos vasos sanguíneos, inducida por la isquemia retiniana, que se disemina o bien desde el disco (neovascularización del disco, NVD) o desde otra parte de la retina (neovascularización en otra parte, NVE). Los nuevos vasos, que se extienden hacia el humor vítreo, pueden provocar hemorragia vítrea y desprendimientos de retina por tracción asociados con el tejido fibroso contráctil asociado (nueva Fig. 1).
Los dendrímeros son un grupo de polímeros nanoestructurados que tienen el potencial de suministrar fármacos y terapias de molécula pequeña, debido a su gran número de grupos funcionales, a los dominios intracelulares. Kannan y col. han demostrado la capacidad terapéutica de una terapia a base de dendrímero en el tratamiento de un modelo de ratón de parálisis cerebral (PC). Este modelo de ratón imita la neuroinflamación observada en el cerebro adulto afectado por PC. EL documento US 2011/034422 se publicó el 10 de febrero de 2011 y tiene por título "Dendrimers for sustained release of compounds".
Hasta la fecha, el único tratamiento que ha demostrado ser beneficioso a largo plazo para la RD es la fotocoagulación láser focal.
El tratamiento convencional para pacientes con DME es la inyección intravítrea de anticuerpos anti-VEGF en el ojo y hay estudios que demuestran que la terapia anti-VEGF puede ser útil para tratar el edema macular diabético (EMD). Sin embargo, la administración sistémica puede tener diversas ventajas más allá de los tratamientos actuales, dado que en la actualidad no se dispone de tratamientos sistémicos para las retinopatías isquémicas o la DME. Entre estas ventajas se incluyen inyecciones menos frecuentes debido a la retención en la microglía y a la capacidad de administración sistémica, lo que evita las frecuentes inyecciones intraoculares como en los tratamientos anti-VEGF actuales o de fármacos o implantes liberadores de fármaco de dispositivos de liberación sostenida erosionables o no erosionables.
En la actualidad, no hay terapias dirigidas a la DME o la RD. El direccionamiento a la microglía/los macrófagos activados mediante administración sistémica puede aumentar la eficacia de los fármacos y reducir los efectos secundarios.
Sumario de la invención
La invención se define por las reivindicaciones. Cualquier materia objeto que no se encuentre dentro del ámbito de las reivindicaciones se proporciona únicamente a título informativo.
Cualquier referencia en la descripción a procedimientos de tratamiento se refieren a dispositivos, compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.
De acuerdo con una realización, los presentes inventores investigaron la capacidad de los dendrímeros administrados por vía sistémica para dirigirse a la microglía activada en la retina en una retina isquémica. La activación de la microglía indujo una lesión por isquemia/reperfusión. Se comparó la captación diferencial de dendrímeros entre la retina normal e isquémica.
Sorprendentemente, los inventores descubrieron que los dendrímeros PAMAM son capaces de dirigirse a un tipo celular clave en la neuroinflamación retiniana, la microglía/macrófagos activados (mi/ma). La retención por la microglía/macrófagos activados (mi/ma) se produjo cuando el dendrímero se administró tanto por vía intravenosa como por vía intravítrea. Además, la microglía y las células epiteliales del pigmento retiniano conservaron el dendrímero, mientras que otros tipos de células en el ojo y otros órganos no captaron el dendrímero. Los dendrímeros se mantuvieron en los mi/ma durante un periodo de tiempo prolongado, 21 días, el punto de tiempo más prolongado evaluado en este estudio.
De acuerdo con esta realización, los presentes inventores también administraron dendrímeros por vía sistémica (intravenosa), en animales en los que se había inducido neovascularización retiniana (NVR) y coroidea (NVC) mediante una inyección de lípidos subretiniana. Se comparó la captación diferencial de dendrímeros entre la retina y la coroides normales y en las que se han inyectado lípidos.
Los inventores descubrieron que los dendrímeros administrados por vía sistémica se localizaban de manera selectiva en la microglía/los macrófagos activados en las áreas de NVR y los macrófagos en las áreas de NVC, pero no se encontraban en el otro ojo no lesionado.
La presente invención proporciona una composición para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria y/o angiogénica en el ojo de un sujeto, que comprende administrar al sujeto, por vía sistémica, una composición que comprende nanopartículas de dendrímero, en la que las nanopartículas de dendrímero comprenden dendrímeros de poli(amidoamina) (PAMAM) terminados en hidroxilo unidos covalentemente a al menos un agente biológicamente activo, en una cantidad suficiente para suprimir o inhibir la enfermedad inflamatoria y/o angiogénica en el ojo.
La presente invención proporciona un procedimiento para tratar la neovascularización coroidea, tras la administración sistémica de un dendrímero que porta un agente biológicamente activo.
De acuerdo con otra realización, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad inflamatoria y/o angiogénica en el ojo de un sujeto, que comprende administrar al sujeto periódicamente por vía intravenosa, una composición que comprende nanopartículas de dendrímero, en la que las nanopartículas de dendrímero comprenden dendrímeros de poli(amidoamina) (PAMAM) terminados en hidroxilo unidos covalentemente a un agente biológicamente activo, en una cantidad suficiente para suprimir o inhibir la enfermedad inflamatoria y/o angiogénica en el ojo.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un esquema que muestra la patogénesis de la DME y cómo la N-acetilcisteína (NAC) es un fármaco multimodal que puede atenuar múltiples vías.
Las figuras 2a -2l muestra secciones de ojos de control sin I/R, 24 horas después de la inyección intravítrea. 2A-D: Veinticuatro horas después de la inyección de D-Cy5, no se conserva dendrímero en la retina. 2E-H: Había presencia de Cy5 libre por toda la retina interna y en la capa plexiforme interna (CPI). Las puntas de flechas indican la membrana limitante interna (MLI). 21-L: Las inyecciones de PBS no dieron como resultado fluorescencia en la longitud de onda de Cy5. [Marcador nuclear DAPI (en azul). Dendrímero-Cy5 y Cy5 (en rojo). marcador de células de la microglía Iba-1 (en verde). barras = 40 pm]
Las figuras 3A-3L muestran secciones de ojos con isquemia/reperfusión 24 horas después de la inyección intravítrea. 3A-D. Hay presencia de dendrímero-Cy5 (en rojo) en la microglía/macrófagos Iba-1+ (flechas). La flecha con un asterisco indica una célula retinal Iba1+ con dendrímero mostrada en el recuadro. 3E-H. Mayor ampliación de D-Cy5 (en rojo) en la microglía Iba-1+. La flecha con un asterisco indica una célula subretinal Iba1+ con dendrímero mostrada en el recuadro. 3I-L. Cy5 o el colorante libre se encuentra por toda la retina interna y no se asocia con la microglía Iba-1+ (puntas de flecha). [DAPI (en azul), Iba-1 (en verde), D-Cy5 y Cy5 (en rojo); CFN=capa de fibra nerviosa, CNI = capa nuclear interna, CNE = capa nuclear externa; 3A-D y 3I-L barra = 40 pm, 3E-H barra = 20 pm.]
Las figuras 4A-4L muestran las 72 h posteriores a la inyección intravítrea. 4A-D. D-Cy5 sigue presente en la microglía (flechas) y las células del EPR (lado izquierdo, fluorescencia lineal) en los ojos con I/R. La flecha con un asterisco indica una célula Iba1+ en la retina con el dendrímero mostrado en el recuadro. 4E-H. Ampliación de D-Cy5 en la microglía/los macrófagos (flechas). La flecha con un asterisco indica una célula subretinal Iba1+ con dendrímero mostrada en el recuadro. 41-L. D-Cy5 no estaba presente en los ojos de control sin I/R. [DAPI (en azul), D-Cy5 (en rojo), CFN=capa de fibra nerviosa, CNI = capa nuclear interna, CNE = capa nuclear externa; 4A-D y 3 i-L barras = 40 pm, 4E-H barras =20 pm].
Las figuras 5A-5L muestran los veintiún días posteriores a la inyección intravítrea. 5A-D. D-Cy5 se mantiene en las células Iba-1+ en los ojos con I/R (flechas). Algunos parecen ser macrófagos subretinianos (flechas hacia la izquierda). La flecha con un asterisco indica una célula subretinal Iba1+ con dendrímero mostrada en el recuadro.
5E-H. Retina de los ojos en los que se ha inyectado D-Cy5 después de la I/R a mayor aumento. La flecha con un asterisco indica una célula Iba1+ en la retina con el dendrímero mostrado en el recuadro. 5I-L, No hay presencia de la longitud de onda de fluorescencia de D-Cy5 en los ojos sin I/R que reciben PBS (control de fluorescencia).
[DAPI (en azul), D-Cy5 y Cy5 (en rojo), Iba-1 (en verde); 5A-D y 5I-L barras = 40 pm, 5E-H barras =20 pm].
Las figuras 6A-6P muestran secciones de las retinas de ojos con I/R 24 h después de la inyección intravenosa. 6A-H. D-Cy5 se localiza junto con Iba-1 en las células marcadas (en verde) en la retina y también parece encontrarse en las células del EPR (parte inferior izquierda). La flecha con un asterisco indica una célula subretinal Iba1+ con dendrímero mostrada en el recuadro. 6E-H. Ampliación del mismo área que en 6A-D. 51-L. El colorante Cy5 libre sigue presente en la coroides después de 24 h. 6M-P. No hay fluorescencia en la longitud de onda de Cy5 en los ojos que recibieron PBS por vía intravenosa. [DAPI (en azul), D-Cy5 y Cy5 (en rojo), Iba-1 (en verde); 6A-D y 6I-L barras = 40 jm , 6E-H barras =20 |jm].
Las figuras 7A-7L muestran secciones de retinas 72 horas después de la administración intravenosa de D-Cy5.
7A-D. Hay muchas células Iba-1+ en las retinas con I/R y unas pocas en este campo tienen D-Cy5 colocalizado.
7E-H. Se muestra la colocalización (en amarillo) de manera ampliada. 71-L, En los ojos de control sin I/R no hay células que tengan D-Cy5. [DAPI (en azul). D-Cy5 y Cy5 (en rojo). Iba-1 (en verde); 7A-D y 7I-L barras = 40 jm , 7E-H barras =20 jm].
Las figuras 8A-8L muestran secciones de la retina y la coroides 21 días después de la inyección de D-Cy5. 8A-D. La retina con I/R sigue teniendo Cy-5 colocalizado con una célula Iba-1+ (flecha). 8E-H. Colocalización de D-Cy5 con Iba-1 mostrada a mayor aumento en una célula Iba-1+ ramificada. 8I-L. Administración de D-Cy5 a ojos de control sin I/R. 8A-H. Las flechas marcan la colocalización de D-Cy5 (en rojo) y células marcadas con Iba-1 (en verde). [DAPI (en azul), D-Cy5 y Cy5 (en rojo); 8A-D y 8I-L barras = 40 jm , 8e-H barras = 15 jm ]
Las figuras 9A-9D muestran la cuantificación de las células Iba-1+ en la retina. Se entrenó al programa informático Imaris para contar las células Iba-1+ en secciones de retina desde la ora serrata hasta la ora serreta. 9A. Hubo un aumento significativo en el número de células Iba-1+ en las retinas con I/R (p <0,01). 9B. Se entrenó el programa informático para seleccionar únicamente células somáticas y no procesar aquellas que tuvieran o solo el marcador Iba-1 (flechas de color amarillo) o Iba-1 y D-Cy5 (flechas de color blanco) en este volumen de superficie en 3-D. El número total de células de microglía/macrófagos (en verde) y aquellas con D-Cy5 se muestran en los tres puntos de tiempo después de la administración intravítrea (9C) e intravenosa (9D) a ojos con I/R. Estos valores son significativamente mayores que en las retinas sin I/R, en las que ninguna de las células en la retina tenían D-Cy5. Las figuras 10A-10C muestran la cuantificación de las concentraciones de D-Cy5 en las copas oculares posteriores mediante espectroscopía de fluorescencia, tras la extracción de D-Cy5 del tejido. 10A) Concentraciones de dendrímero tras una sola inyección intravítrea de 20 jg de D-Cy5, se observa una diferencia significativa entre los ojos sin I/R y con I/R. 10B) Concentraciones de D-Cy5 tras una sola inyección intravenosa de 600 jg ; 10C) Comparación de las concentraciones de dendrímero en los ojos con I/R administrado por vía tanto intravítrea como intravenosa (a una dosis 30X). Estas son similares (n=8, prueba de la t de Student). Para la cuantificación, se homogeneizaron y liofilizaron copas oculares posteriores y los dendrímeros se extrajeron en un pequeño volumen de metanol. La fluorescencia se midió usando protocolos previamente establecidos, con calibración y controles para D-Cy5 adecuados. D-Cy5 se encontraba próximo al límite de detección (PLD) en los ojos sanos (3 y 21 días).(* indica p <0,01 cuando se compara la I/R con la ausencia de I/R).
La figura 11 muestra la síntesis de los conjugados D-AT y Cy5-D-AT.
Las figuras 12A-12C (nuevas) muestran los cromatogramas que ilustran la pureza de los conjugados D-AT (12A) y Cy5-D-AT (12B). 12C) muestra el tamaño, el potencial zeta y las masas moleculares de los conjugados.
Las figuras 13A-13B (nuevas) representan la caracterización por RMN de los conjugados D-AT (13A) y Cy5-D-AT (13B).
La figura 14 muestra la liberación in vitro de AT a partir de D-AT en un modelo de humor vítreo simulado.
La figura 15 representa la biodistribución de D-Cy5 en diversos órganos y su eliminación con el paso del tiempo. Se cuantificó la captación en los órganos, utilizando mediciones de la fluorescencia de D-Cy5, frente a curvas de calibración adecuadas (n=8).(* indica p <0,01 cuando se comparan 24 con 72 h; # indica p <0,05).
Las figuras 16A-16B muestran cromatografías de permeación en gel del dendrímero bifuncional sintetizado. 16A muestra un tiempo de elución de 14,84 min a partir de la columna que difería con respecto al tiempo de elución del dendrímero G4-OH (tiempo de elución de 14,42 min). Esto indica la formación de un nuevo compuesto y que solo hay una pequeña variación en el tiempo de elución, lo que indica que las propiedades estructurales del dendrímero G4-OH no han cambiado significativamente. La aparición de un nuevo pico simultáneamente a los 16,69 min a 647 nm (Amáx UV para Cy5) y a 645 nm (emisión de fluorescencia de Cy5), que es diferente a los picos de Cy5 (20,39 min) 16B, confirma la satisfactoria conjugación del colorante a los dendrímeros.
Las figuras 17A-17L representan secciones de ojos sin isquemia/reperfusión 24 horas después de la inyección intravenosa. 17A-D. Hay presencia de dendrímero-Cy5 (en rojo) en la microglía Iba-1+ en la coroides (flechas). Recuadro: Mayor ampliación de D-Cy5 (en rojo) en la microglía Iba-1+. 17E-H. Cy5 libre se encuentra por toda la coroides (asterisco) y no asociado con la microglía Iba-1+ (flecha). 171 -L. No hay emisión de fluorescencia en la longitud de onda de Cy5 en el ojo cuando se administra PBS por vía intravenosa (control negativo). [DAPI (en azul), Iba-1 (en verde), D-Cy5 y Cy5 (en rojo); CFN=capa de fibra nerviosa, CNI = capa nuclear interna, CNE = capa nuclear externa; 17A-D y 171-L barra = 40 jm , 17E-H barra = 20 jm .]
Las figuras 18A-18I muestran la evaluación cualitativa de las concentraciones de D-Cy5 en el riñón en función del tiempo, usando microscopía confocal. 18A-C. (Panel superior) secciones trasversales de los riñones a las 24 h, 72 h y 21 días, respectivamente, después de la inyección de D-Cy5 por vía intravenosa. D-Cy5 (en rojo) tras la inyección intravenosa, se eliminó rápidamente de la circulación sistémica y se observó que se acumulaba predominantemente en los túbulos proximales de la corteza renal y se excretaba los puntos de tiempo posteriores (72 h y 21 días). Por debajo se muestran los cromatogramas de HPLC del extracto de riñón, que demuestra que las señales de fluorescencia de la corteza renal proceden de D-Cy5 intacto (basado en el tiempo de retención de 14,92 min), mientras que a medida que pasa el tiempo, se reduce la señal del pico, lo que indica la excreción de D-Cy5 por medio de la orina y concuerda bien con las imágenes confocales.
Las figuras 19A-19B son gráficas que representan la semicuantificación de los dendrímeros en la copa ocular posterior. Se administró D-Cy5 o bien por vía intravenosa (19A) o por vía intravítrea (19B) y se cuantificó en los ojos tanto lesionados (I/R) como sanos (sin I/R) a las 24 horas, 72 horas, 21 días. Se observan diferencias significativas en la captación entre los ojos lesionados y no lesionados.
La figura 20 es una ilustración del modelo de NVC en ratas y de los protocolos de tratamiento.
La figura 21 muestra un montaje coroidal plano en el que se ha desarrollado NVC a causa de la inyección de lípido, lo que ha provocado el desarrollo de vasos sanguíneos anormales (neovascularización) (isolectina, panel de color azul). Acumulación de microglía/macrófagos (Iba-1, panel de color verde) y dendrímeros localizados en la microglía/los macrófagos en el área de NVC (D-Cy5, panel de color rojo). Todos los canales están superpuestos para mostrar la colocalización (fusionados).
La figura 22 es una gráfica que representa las áreas de NVC medias en coroides no tratadas y tratadas con D-NAC en el modelo de rata con inyección de lípido. Hay una reducción significativa de ~80 % en el área de NVC en los animales tratados con D-NAC, en comparación con el grupo de animales no tratados. Los datos se analizaron estadísticamente usando la prueba de la t de Student unilateral con corrección de Welch, obteniéndose resultados significativos con p=0,0003 para un tamaño de muestra de n=6.
La figura 23 muestra la inflamación retiniana y la neovascularización provocadas por la inyección subretiniana de lípido. La neovascularización retiniana (NVR) formada en la retina muestra tortuosos vasos sanguíneos anormales teñidos por isolectina (panel de color azul) mostrados en el círculo azul. Migración y acumulación de las células inflamatorias de la microglía teñidas con Iba-1 (panel de color verde) y colocalización de D-Cy5 en las células de la microglía (D-Cy5, panel de color rojo). El panel fusionado muestra el efecto combinado de la inflamación y la neovascularización y la colocalización de los dendrímeros específicamente en células inflamatorias, como se indica por las flechas de color blanco (fusionado).
La figura 24 muestra el área de NVR en el montaje plano retinal que indica que los dendrímeros (en rojo) se acumulan en el área de inflamación y son captados por las células de la microglía. También se ha observado migración de la microglía retiniana hacia el área lesionada (de inflamación), indicada por las flechas de color blanco. (Azul-Isolectina) vasos sanguíneos, (Verde, Iba-1) microglía/macrófagos (rojo o rosa) D-cy5.
Las figuras 25A-25B representan el efecto de NAC, D-NAC (20 mg/kg basado en nAc ) o PBS libre sistémico, en la NVC, evaluada con enmascaramiento, usando protocolos de montaje plano coroidal establecidos. Los animales tratados con D-NAC mostraron una reducción significativa en las áreas de NVC, en comparación con PBS. El NAC libre mostró una ligera reducción que no fue significativa. Las áreas de NVC se evaluaron usando análisis morfométrico (delineación en color amarillo) en el programa informático Image-J. El panel A muestra la coroides tratada con PBS con NVC aumentada y una población aumentada de macrófagos (en verde) en el área de la cápsula, mientras que el panel B muestra la eficacia de D-NAC con NVC reducida y acumulación de macrófagos. La vasculatura se tiñó con GSA lectina (en azul) y los macrófagos se tiñeron con IBA-1 (en verde). Los valores se analizaron usando la prueba de la t de Mann-Whitney con n=12 y P <0,001.
La figura 26 muestra el análisis de imágenes de montaje plano (aumento de 20X) de coroides para evaluar la acumulación de macrófagos en el área de la cápsula que rodea a la NVC. Los macrófagos se tiñeron con IBA-1 (en verde) y D-Cy5 (en rojo). El análisis de los recuentos de macrófagos mostró una reducción de ~63 % en el número de macrófagos y una reducción de -60 % en los macrófagos activados tras el tratamiento con D-NAC en comparación con PBS, con una colocalización próxima a 90 %+ de macrófagos activados y dendrímeros. El análisis de los recuentos celulares se realizó usando el programa informático Imaris (Bitplane) usando la función de superficie con factor de suavizado y un umbral para el tamaño celular de 8-12 pm de diámetro con la función de división. Los macrófagos activados y quiescentes se contaron basándose en la forma celular (ameboide frente a ramificada) usando la relación de superficie a volumen celular, con una esfericidad de 0,758 y una función de elipticidad de 0,298 como umbral. La colocalización de D-Cy5 se evaluó la función de puntos. N=6 ojos por cada grupo, se analizaron y promediaron 3 áreas por cada coroides.
Las figuras 27A-27C representan las coroides de los diferentes grupos analizados usando ELISA (n=8 coroides/grupo). Aunque NAC libre no era eficaz en comparación con los controles, D-NAC mostró una atenuación significativa de las citocinas proinflamatorias (27A y B). *** indica p <0,001. D-NAC también mejoró la IL-10 antiinflamatoria (27C). * indica p <0,01.
Las figuras 28A-28C representan montajes planos de retinas (aumento de 40X) con los vasos sanguíneos teñidos con GSA, IBA-1 para mi/ma y dendrímero (D-Cy5); 28A) área "sana" sin patología de la misma retina con estructura habitual de los vasos sanguíneos y mi/ma quiescente (ramificada) (flechas de color blanco) y sin D-Cy5; 28B) área patológica de la misma retina cerca de la cápsula que muestra vasos anormales, mi/ma activadas ("redondas" y ameboides) y dendrímeros "añadidos" colocalizados en las mi/ma activadas (flechas de color blanco); 28C) retinas tratadas con D-NAC que muestran ambas poblaciones: (i) microglía quiescente (ramificada) (flechas de color amarillo) y (ii) mi/ma activadas (ameboides) con dendrímero (flechas de color blanco), lo que sugiere el efecto terapéutico de D-NAC en calmar la activación de la microglía.
Figuras 29A-29B. 29A) es un diagrama de barras que muestra los recuentos de la microglía retinal en la retina para el tratamiento con PBS y D-NAC. El tratamiento con D-NAC revierte el fenotipo de la microglía activada. 29B) ilustra imágenes representativas en 3-D de la microglía tratada con PBS y D-NAC.
Las figuras 30A-30C muestran los resultados de las retinas de tres grupos diferentes, analizadas mediante ELISA (n=8/grupo). Aunque NAC libre no era eficaz en comparación con PBS, D-NAC mostró una atenuación significativa de las citocinas proinflamatorias. D-NAC también potenció la IL-10 antiinflamatoria. *** indica p <0,001.
Las figuras 31A-31B muestran el efecto de AT en la supresión de la NVC. 31A muestra un montaje coroidal plano en el que se ha desarrollado NVC a causa de la inyección de lípido (HpODE), lo que ha provocado el desarrollo de vasos sanguíneos anormales (31A, C, E, G) y después se ha tratado con D-TA (31B, D, F, H). 31B es un diagrama de barras que representa la medición de las áreas de NVC (mm2) de HpODE, D-AT o AT libre (F-AT). Aproximadamente un 95 % de la reducción de la NVC puede atribuirse a un efecto dual antiinflamatorio y antiangiogénico.
La figura 32 muestra el análisis preliminar del área de NVC de las coroides tratadas con D-NAC+D-AT: El día 21, las coroides tratadas con PBS muestran un área de NVC significativamente mayor con vasos sanguíneos irregulares totalmente formados, en comparación con las coroides tratadas con D-NAC en el día 11, lo que sugiere la eficacia para la DME tardía. El día 21, las coroides tratadas con D-NAC (en el día 11) muestran una menor área de NVC en comparación con las coroides tratadas con PBS en el día 10, lo que sugiere regresión.
Las figuras 33A-33C ilustran imágenes representativas (a la derecha) que muestran la NVC de PBS-día 21 (33A) y PBS-día 10 (33B) y de D-NAC+D-AT-día 21 (33C). ** indica p <0,01. Barra de escala a 100 pm.
Las figuras 34A-34C muestran que los dendrímeros se dirigen a microglía/los macrófagos retinianos tras la administración por las vías sistémica e intravítrea, comparables a dosis sistémicas 30X mayores.
Descripción detallada de la invención
De acuerdo con una o más realizaciones, la presente invención desvela la capacidad de los dendrímeros PAMAM para dirigirse a un tipo celular clave en la neuroinflamación retiniana, la microglía activada mediante inyección sistémica intravenosa. Sorprendentemente, la retención por la microglía activada se produjo cuando el dendrímero se administró mediante inyección tanto intravenosa como intravítrea. Además, la microglía retuvo el dendrímero, mientras que otros tipos celulares no captaron el dendrímero. Los dendrímeros se mantuvieron en la microglía durante un periodo de tiempo prolongado, 21 días, el punto de tiempo más prolongado evaluado en este estudio. La microglía/macrófagos activados se han relacionado con enfermedades retinianas inflamatorias y/o angiogénicas, tales como degeneración macular, retinopatía diabética, glaucoma y retinopatía del prematuro. La lesión por isquemiareperfusión (I/R) se ha usado para modelar ciertos aspectos del glaucoma crónico, la retinopatía diabética y la oclusión de la vena ramificada (OVR). La lesión por I/R provoca oclusión de los vasos sanguíneos tanto retinianos como coroidales, lo que causa una reducción del flujo sanguíneo e hipoxia tisular. Se ha notificado que las afecciones anteriores provocan la alteración de la barrera hematorretiniana (BHR), la activación de la microglía/los macrófagos residentes, la infiltración de la microglía y los macrófagos de la coroides y la circulación sistémica, la producción elevada de citocinas (TNF-a, INF-a, TGF-p. IL-1p e IL-6) y la muerte de las células ganglionares retinianas (CGR).
Un aspecto importante de los procedimientos de la invención fue el hecho de que D-Cy5 se mantuvo prácticamente de manera exclusiva en la microglía activada, independientemente de que se hubiese administrado por vía intravenosa o intravítrea. La administración intravenosa es más segura que la intravítrea, pero la intravítrea es actualmente el tratamiento de referencia para las terapias dirigidas contra el VEGF usadas en el tratamiento de la degeneración macular relacionada con la edad exudativa (DME húmeda) y el edema macular diabético. La retención de D-Cy5 en la microglía a los 21 días después de la inyección por vía femoral también es muy significativa, en tanto que las inyecciones repetidas, como en las terapias actuales anti-VEGF, no requerirán la inyección intravítrea.
Este procedimiento se vio respaldado adicionalmente por el sorprendente hallazgo de que en un modelo de rata de neovascularización coroidal (NVC), la inyección intravenosa sistémica de un compuesto de dendrímero de la presente invención conjugado a N-acetil-cisteína redujo significativamente el área de NVC en los animales tratados, en comparación con el control.
La presente invención proporciona una composición para su uso en el tratamiento de una o más enfermedades y trastornos oculares inflamatorios y/o angiogénicos que comprende nanopartículas de dendrímero, en la que las nanopartículas de dendrímero comprenden principalmente dendrímeros de poli(amidoamina) terminada en hidroxilo (PAMAM) unidos covalentemente a un agente biológicamente activo y en la que la composición se administra sistémicamente en una cantidad eficaz para suprimir o inhibir una enfermedad inflamatoria y/o angiogénica en el ojo. Como se usa en el presente documento, la expresión "predominantemente terminada en hidroxilo" significa que una mayoría de los grupos funcionales superficiales de los dendrímeros son grupos OH. En algunas realizaciones, los dendrímeros pueden tener una mezcla de diferentes grupos funcionales.
Por tanto, de acuerdo con otra realización, se proporciona un procedimiento de tratamiento de una enfermedad inflamatoria y/o angiogénica en el ojo de un sujeto, mediante la administración por vía intravenosa de una composición que comprende nanopartículas de dendrímero; en la que las nanopartículas de dendrímero comprenden uno o más dendrímeros con núcleo de etilendiamina de poli(amidoamina) (PAMAM) terminados en hidroxilo, unidos covalentemente a al menos uno o más agentes biológicamente activos, que pueden ser iguales o diferentes, en una cantidad suficiente para suprimir o inhibir la enfermedad inflamatoria y/o angiogénica en el ojo.
Como se usa en el presente documento, la expresión "dendrímero de PAMAM" significa dendrímero de poli(amidoamina), que puede contener diferentes núcleos, con bloques de construcción de amidoamina. El procedimiento para producirlos es conocido por los expertos en la materia y en general, implica una secuencia de reacción iterativa en dos etapas que produce cubiertas concéntricas (generaciones) de unidades dendríticas de palanina alrededor de un núcleo iniciador central. Esta arquitectura de núcleo-cubierta de PAMAM crece linealmente en diámetro en función de las cubiertas (generaciones) añadidas. Por otra parte, los grupos de la superficie aumentan exponencialmente en cada generación, según la matemática de la ramificación dendrítica. Se encuentran disponibles en generaciones de G0 a 10 con 5 tipos de núcleo diferentes y 10 grupos funcionales superficiales. El polímero de dendrímero ramificado puede consistir en dendrímeros polipeptídicos de poliamidoamina (PAMAM), poliéster, poliéter, polilisina o polietilenglicol (PEG). Los expertos en la materia entenderán que las composiciones de dendrímero descritas y reivindicadas en el presente documento pueden ser dendrímeros en el intervalo de G3 a G10, normalmente, en el intervalo de G4 o G5, también siendo posibles mezclas de diferentes niveles de G.
De acuerdo con algunas realizaciones, los dendrímeros de PAMAM usados pueden ser dendrímeros de generación 4, con grupos hidroxilo unidos a sus grupos funcionales de la superficie.
En algunas realizaciones, los dendrímeros se encuentran en forma de nanopartícula y se describen de manera detallada en la Publicación Internacional de Patente n.° WO2009/046446.
Como se usa en el presente documento, la expresión "enfermedad inflamatoria del ojo" significa enfermedades del ojo asociadas con la inflamación de los tejidos del ojo, entre las que se incluyen, por ejemplo, degeneración macular relacionada con la edad (DME), retinitis pigmentosa, neuritis óptica, infección, sarcoidosis, anemia drepanocítica, desprendimiento de retina, arteritis de células gigantes, isquemia retiniana, retinopatía arterioesclerótica, retinopatía hipertensiva, bloqueo de la arteria retiniana, bloqueo de la vena retiniana, hipotensión, retinopatía diabética, edema macular y también incluye enfermedades angiogénicas entre las que se incluyen, por ejemplo, neovascularización coroidea.
La presente invención proporciona el uso de las composiciones desveladas en el presente documento, para tratar una enfermedad inflamatoria y/o angiogénica en el ojo de un sujeto, lo que comprende administrarlas por vía sistémica al sujeto, en una cantidad eficaz, para suprimir o inhibir la enfermedad inflamatoria y/o angiogénica en el ojo del sujeto.
Los presentes inventores también desvelan un procedimiento para atenuar o tratar trastornos del ojo en un sujeto provocados por estrés oxidativo y de ER en la córnea del sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición de dendrímero que comprende un agente biológicamente activo.
En el presente documento, agente activo y agente biológicamente activo se usan indistintamente para hacer referencia a un compuesto químico o biológico que induce un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado, en el que el efecto puede ser profiláctico o terapéutico. Los términos también abarcan derivados farmacéuticamente aceptables y farmacológicamente activos de estos principios activos específicamente mencionados en el presente documento, entre los que se incluyen, pero sin limitación, sales, ésteres, amidas, profármacos, metabolitos activos, análogos. Cuando se usan los términos y expresiones "principio activo", "principio farmacológicamente activo" y "fármaco", ha de entenderse que la invención incluye el principio activo en sí, así como sales, ésteres, amidas, profármacos, metabolitos, farmacéuticamente aceptables y farmacológicamente activos. El principio activo puede ser una entidad biológica, tal como un virus o una célula, ya sea de origen natural o manipulada, tal como transformada.
En algunas realizaciones, los agentes biológicamente activos pueden incluir restos detectables. Como se usa en el presente documento, la expresión "resto detectable" significa que esta porción específica de la molécula comprende al menos uno o más agentes para la formación de imágenes que están unidos a la molécula de dendrímero. Al menos uno de los agentes para la formación de imágenes es un colorante fluorescente. Los colorantes pueden ser emisores en el espectro visible o infrarrojo cercano (NIR). Los colorantes conocidos útiles en la presente invención incluyen carbocianina, indocarbocianina, oxacarbocianina, tricarbocianina y merocianina, polimetina, cumarina, rodamina, xanteno, fluoresceína, boro-dipirrometano (BODIPY), Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7, VivoTag-680, VivoTag-S680, VivoTag-S750, AlexaFluor660, AlexaFluor680, AlexaFluor7o0, AlexaFluor750, AlexaFluor790, Dy677, Dy676, Dy682, Dy752, Dy780, DyLight547, Dylight647, HiLyte Fluor 647, HiLyte Fluor 680, HiLyte Fluor 750, IRDye 800CW, IRDye 800RS, IRDye 700DX, ADS780WS, ADS830WS y ADS832WS.
Se conocen en aplicaciones biomédicas colorantes orgánicos que son activos en la región del NIR. Sin embargo, solo hay unos pocos colorantes en el NIR que estén fácilmente disponibles debido a las limitaciones de los colorantes convencionales, tales como escasas hidrofilia y fotoestabilidad, bajo rendimiento cuántico, insuficiente estabilidad y baja sensibilidad de detección en sistemas biológicos, etc. Se han producido avances significativos gracias al reciente desarrollo de colorantes del NIR (incluidos colorantes de cianina, escuaraína, ftalocianinas, derivados de porfirina y análogos de BODIPY (borodipirrometano)) con una estabilidad química y a la luz mejoradas, alta intensidad de fluorescencia y una prolongada vida de la fluorescencia. Entre los ejemplos de colorantes del NIR se incluyen colorantes de cianina (también denominados colorantes de polimetina cianina), que son pequeñas moléculas orgánicas con dos heterociclos aromáticos que contienen nitrógeno unidos por medio de un puente de polimetina e incluyen Cy5, Cy5.5, Cy7 y sus derivados. Las escuarainas (normalmente denominadas colorantes de escuarilio) consisten en un núcleo de oxociclobutenolato con componentes aromáticos o heterocíclicos en ambos extremos de las moléculas, un ejemplo es KSQ-4-H. Las ftalocianinas son derivados de porfirina bidimensionales con 18 electrones n, que constan de cuatro subunidades de pirrol puenteado unidas entre sí por medio de átomos de nitrógeno. Los colorantes BODIPY (borodipirrometano) tienen una estructura general de 4,4'-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indaceno) y una fluorescencia nítida con alto rendimiento cuántico y una excelente estabilidad térmica y fotoquímica.
De acuerdo con una realización, el agente biológicamente activo se selecciona entre el grupo que consiste en enzimas, antagonistas o agonistas de receptores, hormonas, factores de crecimiento, anticuerpos, oligonucleótidos, ARNpi, microARN, vitamina A, vitamina C, vitamina E, beta-caroteno y moléculas pequeñas.
De acuerdo con otra realización, las moléculas pequeñas se seleccionan entre el grupo que consiste en agentes antiinflamatorios, tales como esteroides, entre los que se incluyen prednisona, dexametasona, agentes antiinflamatorios no esteroideos, incluidos inhibidores de COX-2, agentes antiinflamatorios corticoesteroides, agentes antiinflamatorios de compuestos de oro, antiinflamatorios inmunosupresores y agentes antiangiogénicos, agentes antiinflamatorios de salicilato, ranibizumab, minociclina, agentes anti-VEGF, incluidos aflibercept y rapamicina. También pueden incluir antioxidantes, tales como N-acetil cisteína, derivados de ácidos grasos omega-3, tales como resolvinas y neuroprotectina-D1 (NPD1).
De acuerdo con algunas realizaciones diferentes, las moléculas pueden incluir anticuerpos, entre los que se incluyen, por ejemplo, daclizumab, bevacizumab (avastin®), ranibizumab (Lucentis®), basiliximab, ranibizumab y pegaptanib sódico o péptidos, tales como SN50 y antagonistas del NF-Kp.
De acuerdo con algunas realizaciones, el agente biológicamente activo puede ser N-acetilcisteína (NAC) y/o acetónido de triamcinolona (AT).
En algunas realizaciones, las composiciones de dendrímero usadas en los procedimientos descritos en el presente documento son dendrímeros de PAMAM de 4.a generación terminados en hidroxilo (G4-OH) conjugados con uno o más agentes biológicamente activos. Por ejemplo, pueden usarse en los procedimientos de la invención dendrímeros de G4-OH conjugados a NAC y/o AT.
En algunas realizaciones, se contemplan composiciones con función terapéutica y diagnóstica que podrían incluir al menos un agente biológicamente activo y al menos un resto detectable. Por ejemplo, una composición con función terapéutica y diagnóstica podría incluir un dendrímero de G4-OH o amina-G4-NH2 conjugado a NAC y a D-Cy5 para ayudar en la visualización del agente terapéutica o biológicamente activo en el organismo.
El acetónido de triamcinolona (4aS,4bR,5S,6aS,6bS,9aR,10aS,10bS)-4b-fluoro-6b-glicolil-5-hidroxi-4a,6a,8,8-tetrametil-4a,4b,5,6,6a,6b,9a,10,10a,10b,11,12-dodecahidro-2H-nafto[2',1':4,5]indeno[1,2-d][1,3]dioxol-2-ona) es un corticoesteroide sintético usado para tratar diversas afecciones cutáneas, para aliviar las molestias causadas por aftas bucales y en forma de pulverizador nasal, para tratar la rinitis alérgica. Es un derivado de la triamcinolona más potente y es aproximadamente ocho veces más potente que la prednisona. Como inyección intravítrea, el acetónido de triamcinolona se ha usado para tratar diversas enfermedades oculares y se ha observado que es útil para reducir el edema macular. Se ha observado en ensayos con el fármaco que es igual de eficaz que los fármacos anti-VEGF en ojos con lentes artificiales a lo largo de un periodo de dos años.
Entiéndase que las composiciones de dendrímero usadas con los procedimientos de la presente invención pueden encontrarse en cualquier formulación adecuada. Entre los ejemplos de dichas formulaciones se incluyen uno o más de un liposoma, una microcápsula y una nanocápsula.
También se desvela un procedimiento para preparar productos farmacéuticos que comprenden los compuestos. La expresión "producto farmacéutico" significa una composición adecuada para uso farmacéutico (composición farmacéutica), como se define en el presente documento. También se describen composiciones farmacéuticas formuladas para aplicaciones particulares, que comprenden los compuestos de la presente invención.
Como se usa en el presente documento, el término "tratar", así como términos derivados del mismo, incluye tratamiento preventivo, así como cualquier tratamiento que cause la remisión del trastorno. Los términos "reducir", "suprimir", "prevenir" e "inhibir", así como términos derivados del mismo, tienen su significado comúnmente entendido de aminorar o reducir. Estos términos no implican un tratamiento, reducción, supresión o inhibición completo o al 100 %.
Con respecto a las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento, el portador farmacéuticamente aceptable puede ser cualquiera de los habitualmente usados y está limitado únicamente por consideraciones fisicoquímicas, tales como solubilidad y falta de reactividad con los compuestos activos y por la vía de administración. Los portadores farmacéuticamente aceptables descritos en el presente documento, por ejemplo, vehículos, adyuvantes, excipientes y diluyentes son bien conocidos por los expertos en la materia y se encuentran fácilmente disponibles al público. Los ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables incluyen portadores solubles, tales como tampones conocidos que pueden ser fisiológicamente aceptables (por ejemplo, tampón fosfato), así como composiciones sólidas, tales como portadores en estado sólido o microperlas de látex. Se prefiere que el portador farmacéuticamente aceptable sea uno químicamente inerte con los principios activos y uno que tenga pocos o ningún efecto secundario perjudicial o toxicidad en las condiciones de uso.
Los portadores o diluyentes usados en el presente documento pueden ser portadores o diluyentes sólidos para formulaciones sólidas, portadores o diluyentes líquidos para formulaciones líquidas, o mezclas de los mismos.
Los portadores o diluyentes sólidos incluyen, pero sin limitación, gomas, almidones (por ejemplo, almidón de maíz, almidón pregelatinizado), azúcares (por ejemplo, lactosa, manitol, sacarosa, dextrosa), materiales celulósicos (por ejemplo, celulosa microcristalina), acrilatos (por ejemplo, polimetacrilato), carbonato de calcio, óxido de magnesio, talco o mezclas de los mismos.
Para las formulaciones líquidas, los portadores farmacéuticamente aceptables pueden ser, por ejemplo, soluciones, suspensiones, emulsiones acuosas o no acuosas o aceites. Los ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen, por ejemplo, agua, soluciones alcohólicas/acuosas, ciclodextrinas, emulsiones o suspensiones, entre las que se incluyen solución salina y medios tamponados.
Los ejemplos de aceites son los derivados del petróleo o de origen animal, vegetal o sintético, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de oliva, aceite de girasol, aceite de hígado de pescado, aceite de sésamo, aceite de semillas de algodón, aceite de maíz, de oliva, vaselina y mineral. Los ácidos grasos adecuados para su uso en formulaciones parenterales incluyen, por ejemplo, ácido oleico, ácido esteárico y ácido isoesteárico. El oleato de etilo y el miristato de isopropilo son ejemplos de ésteres de ácidos grasos adecuados.
Los vehículos parenterales (para inyección subcutánea, intravenosa, intraarterial o intramuscular) incluyen, por ejemplo, solución de cloruro de sodio, solución glucosada de Ringer, solución glucosalina, solución de lactato de Ringer y aceites no volátiles. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen, por ejemplo, soluciones estériles para inyección isotónicas acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones, agentes bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto, y suspensiones acuosas y no acuosas estériles que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y conservantes.
Los vehículos para vía intravenosa incluyen, por ejemplo, reconstituyentes de fluidos y nutrientes, reconstituyentes de electrolitos, tales como los basados en la solución glucosada de Ringer. Entre los ejemplos se encuentran líquidos estériles, tales como agua y aceites, con o sin la adición de un tensioactivo y otros adyuvantes farmacéuticamente aceptables. En general, entre los portadores líquidos preferidos se incluyen agua, solución salina, solución glucosada y soluciones glucosadas relacionadas y glicoles, tales como propilenglicoles o polietilenglicol, en particular para las soluciones inyectables.
Además, en una realización, los compuestos de la presente invención pueden comprender además, por ejemplo, aglutinantes (por ejemplo, goma arábiga, maicena, gelatina, carbómero, etilcelulosa, goma guar, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, povidona), agentes disgregantes (por ejemplo, maicena, fécula de patata, ácido algínico, dióxido de silicio, croscarmelosa sódica, crospovidona, goma guar, carboximetilalmidón sódico), tampones (por ejemplo, Tris-clorhidrato, acetato, fosfato) con diversos pH y fuerzas iónicas, aditivos, tales como albúmina o gelatina para impedir la absorción en las superficies, detergentes (por ejemplo, Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, sales de ácidos biliares), inhibidores de proteasas, tensioactivos (por ejemplo, laurilsulfato de sodio), potenciadores de la permeación, agentes solubilizantes (por ejemplo, Cremophor, glicerol, polietilenglicerol, cloruro de benzalconio, benzoato de bencilo, ciclodextrinas, ésteres de sorbitán, ácidos esteáricos), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito sódico, hidroxianisol butilado), estabilizantes (por ejemplo, hidroxipropilcelulosa, hipromelosa), agentes aumentadores de la viscosidad (por ejemplo, carbómero, dióxido de silicio coloidal, etilcelulosa, goma guar), edulcorantes (por ejemplo, aspartamo, ácido cítrico), conservantes (por ejemplo, tiomersal, alcohol de bencilo, parabenos), lubricantes (por ejemplo, ácido esteárico, estearato de magnesio, polietilenglicol, laurilsulfato de sodio), adyuvantes de la fluidez (por ejemplo, dióxido de silicio coloidal), plastificantes (por ejemplo, ftalato de dietilo, citrato de trietilo), emulsionantes (por ejemplo, carbómero, hidroxipropilcelulosa, laurilsulfato de sodio), recubrimientos poliméricos (por ejemplo, poloxámeros o poloxaminas), agentes de recubrimiento y formadores de película (por ejemplo, etilcelulosa, acrilatos, polimetacrilatos) y/o adyuvantes.
Se determinará la elección del vehículo, en parte, dependiendo del compuesto particular, así como del procedimiento particular usado para administrar el compuesto. Por consiguiente, existe una gran variedad de formulaciones adecuadas de la composición farmacéutica de la invención. Las siguientes formulaciones para administración parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal e intraperitoneal son ilustrativas y en modo alguno limitantes. Puede usarse más de una vía para administrar los compuestos y en ciertos casos, una vía particular puede proporcionar una respuesta más inmediata y más eficaz que otra ruta.
Los jabones adecuados para su uso en formulaciones parenterales incluyen, por ejemplo, sales grasas de metales alcalinos, amonio y trietanolamina y los detergentes adecuados incluyen, por ejemplo, (a) detergentes catiónicos, tales como, por ejemplo, haluros de dimetil dialquil amonio y haluros de alquil piridinio, (b) detergentes aniónicos, tales como, por ejemplo, sulfonatos de alquilo, arilo y olefina, sulfatos y sulfosuccinatos de alquilo, olefina, éter y monoglicéridos, (c) detergentes no iónicos, tales como, por ejemplo, óxidos de aminas grasas, alcanolaminas de ácidos grasos y copolímeros de polioxietilenopolipropileno, (d) detergentes anfóteros, tales como, por ejemplo, alquil-P-aminopropionatos y sales de amonio cuaternario de 2-alquil-imidazolina y (e) mezclas de los mismos.
Las formulaciones inyectables son de acuerdo con la invención. Los requisitos para los portadores farmacéuticos eficaces para composiciones inyectables son de sobra conocidos por los expertos habituales en la materia (véase, por ejemplo, Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.B. Lippincott Company, Filadelfia, PA, Banker y Chalmers, eds., páginas 238-250 (1982) y ASHP Handbook on Injectable Drugs, Trissel, 15.a ed., páginas 622-630 (2009)).
En una realización, el término "administrar" significa que los compuestos de la presente invención se introducen en un sujeto, preferentemente un sujeto que reciba tratamiento para una enfermedad inflamatoria relacionada del ojo y se deja que los compuestos entren en contacto con las una o más células o con la población de células enfermas in vivo.
Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" se refiere a cualquier mamífero, entre los que se incluyen, pero sin limitación, mamíferos del orden Rodentia, tales como ratones y hámsteres y mamíferos del orden Lagomorpha, tales como conejos. Se prefiere que los mamíferos sean del orden Carnivora, incluidos félidos (gatos) y cánidos (perros). Es más preferido que los mamíferos sean del orden Artiodactyla, incluidos bóvidos (vacas) y suidos (cerdos) o del orden Perssodactyla, incluidos équidos (caballos). Lo más preferido es que los mamíferos sean del orden Primates, Ceboides o Simoides (monos) o del orden Antropoides (humanos y gorilas). Un mamífero especialmente preferido es el ser humano.
Los expertos en la materia entenderán que una pauta posológica usada en los procedimientos de la invención puede tener cualquier duración suficiente para proporcionar una reducción en la enfermedad inflamatoria y/o el estrés oxidativo del sujeto. El término "crónico", como se usa en el presente documento, significa que la duración de la pauta posológica puede ser horas, días, semanas, meses o posiblemente años.
En una realización adicional, las composiciones y los procedimientos de la presente invención pueden usarse en combinación con uno o más agentes terapéuticamente activos conocidos por ser capaces de tratar las afecciones o enfermedades analizadas anteriormente. Por ejemplo, las composiciones de la presente invención podrían usarse en combinación con uno o más agentes terapéuticamente activos conocidos, para tratar enfermedades inflamatorias y/o angiogénicas o una enfermedad relacionada con el estrés oxidativo. Los ejemplos no limitantes de otros agentes terapéuticamente activos que pueden combinarse fácilmente en una composición farmacéutica con las composiciones y procedimientos de la presente invención incluyen fármacos de la clase de fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE).
Los presentes inventores también desvelan un procedimiento para atenuar o tratar un trastorno del ojo en un sujeto causado por una enfermedad inflamatoria, estrés oxidativo y/o angiogénesis en un ojo del sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende una composición de dendrímero conjugada con un fármaco antiinflamatorio no esteroideo.
Los ejemplos de AINE usados en los procedimientos de la presente invención incluyen ácido mefenámico, aspirina, diflunisal, salsalato, ibuprofeno, naproxeno, fenoprofeno, ketoprofeno, dexketoprofeno, flurbiprofeno, oxaprozina, loxoprofeno, indometacina, sulindaco, etodolaco, ketorolaco, diclofenaco, nabumentona, piroxicam, meloxicam, tenoxicam, droxicam, lornoxicam, isoxicam, ácido meclofenámico, ácido flufenámico, ácido tolfenámico, celecoxib, rofecoxib, valdecoxib, parecoxib, lumiracoxib, etoricoxib, firocoxib, sulfoanilidas, nimesulida, ácido niflúmico y licofelona.
Normalmente, un médico a cargo del tratamiento decidirá la dosis de la composición con la que tratar a cada sujeto individual, teniendo en cuenta diversos factores, tales como la edad, el peso corporal, el estado de salud general, la dieta, el sexo, el compuesto que se va a administrar, la vía de administración y la gravedad de la afección que se esté tratando. A modo de ejemplo y sin pretender limitar la invención, la dosis sistémica de las composiciones de la presente invención puede ser de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal del sujeto que se esté tratando, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg y de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal. En una realización de la presente invención, se trata periódicamente a los pacientes con las composiciones de dendrímero-fármaco de acuerdo con una pauta posológica.
Por tanto, de acuerdo con otra realización, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar enfermedades inflamatorias y angiogénicas en el ojo de un sujeto, que comprende administrar periódicamente por vía sistémica al sujeto, una composición que comprende nanopartículas de dendrímero, en la que las nanopartículas de dendrímero comprenden dendrímeros de poli(amidoamina) (PAMAM) terminados en hidroxilo unidos covalentemente a un agente biológicamente activo, en una cantidad suficiente para suprimir o inhibir la enfermedad inflamatoria en el ojo.
Se contempla que en una realización de la presente invención, los pacientes son tratados con las composiciones de dendrímero antiinflamatorio, con una periodicidad bisemanal, mensual, bimensual o trimestral.
Ejemplos
Análisis por cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC). Se analizó la pureza de los conjugados de dendrímero-Cy5 (D-Cy5) usando un instrumento HPLC Waters (Waters Corporation, Milford, Massachusetts) equipado con un desgasificador en línea de Waters, bomba binaria, detector de matriz de fotodiodos (PDA), detector de fluorescencia de múltiple A y automuestreador (mantenido a 4 °C) interconectado con el programa informático Empower. Se controló simultáneamente la absorbancia del cromatograma de HPLC a 210 nm para el dendrímero y 650 nm para Cy5 usando un detector de PDA Waters 2998 y la fluorescencia con excitación a 645 nm y emisión a 662 nm usando un detector fluorescencia Waters 2475. La mezcla de agua/acetonitrilo (con TFA al 0,1 % p/p) se preparó fresca, se filtró, se desgasificó y se usó como fase móvil. Se usó TSK-Gel ODS-80 Ts (250 X 4,6 mm, 25 cm de longitud con un tamaño de partícula de 5 |jm) conectado a una columna de guarda TSK-Gel. Se usó un flujo de gradiente con condiciones iniciales de 90:10 (H2O/ACN) y posteriormente se aumentó la concentración de acetonitrilo hasta 10:90 (H2O/ACN) en 30 min y se volvió a las condiciones iniciales originales de 90:10 (H2O/ACN) en 60 min con un caudal de 1 ml/min.
Análisis de dispersión de luz dinámica y del potencial Zeta. Se determinaron el tamaño de partículas y el potencial Z de los conjugados G4-OH y D-Cy5 mediante dispersión de luz dinámica (DLS) usando un instrumento Zetasizer Nano ZS (Malvern Instrument Ltd. Worchester, R. U.) equipado con un láser de He-Ne de 50 mW (633 nm). Para la separación por tamaños, las muestras se disolvieron en agua desionizada (18,2 O) obteniendo una concentración final de 50 jg/ml. La solución se filtró a través de una membrana de acetato de celulosa (0,45 micrómetros, PALL Life Science) y se llevaron a cabo las mediciones de DLS a 25 °C con un ángulo de dispersión de 173°. Los potenciales Zeta se calcularon usando el modelo de Smolokowsky y las mediciones se efectuaron por triplicado.
Animales y lesión por isquemia y reperfusión (I/R). Todos los procedimientos con animales se efectuaron de manera acorde con la Declaración ARVO para el uso de animales en investigación oftalmológica y de la visión. Para los estudios de transporte y de I/R, se usaron ratones albinos BALB/c, con un peso cada uno de ~25 gramos, alojados en las instalaciones para animales Wilmer en la Universidad Johns Hopkins. Todas las cirugías se efectuaron bajo anestesia peritoneal con ketamina (100 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg). En cada grupo y cada punto de tiempo se usaron seis ratones. La lesión por I/R se practicó en el ojo izquierdo siguiendo el procedimiento descrito en otra parte. En resumen, se canuló la cámara anterior con una aguja del calibre 30 unida a un tubo de infusión de solución salina. El sistema de solución salina se monta en un depósito para solución salina hecho a medida y elevado a una cierta altura (calibrado a 90 mmHg). El IOP se elevó hasta 90 mmHg durante 90 minutos ya lesión por I/R y la interrupción de la circulación coroidal se evidenció por el blanqueamiento del segmento posterior examinando el fondo del ojo con el microscopio de la operación. Tras la isquemia, se retiró inmediatamente la aguja para la reperfusión inmediata de la sangre. El ojo derecho no tenía lesión por I/R y sirvió como control.
Inyección de dendrímero y sacrificio de los animales. Seis días después de la lesión por I/R, se inyectó el dendrímero en los ratones BALB/c por vía intravítrea o intravenosa. Para las inyecciones intravítreas, se inyectaron 2 j l que contenían 20 jg de D-Cy5 usando una aguja de vidrio ayudada con un inyector de compresión (Harvard Apparatus, Holliston, MA, EE. UU.) en la cámara vítrea. Para las inyecciones intravenosas, se inyectaron 600 jg de D-Cy5 disuelto en 100 j l de PBS estéril por medio de una aguja del calibre 30 g en la vena femoral tras practicar una pequeña incisión en la región femoral. Como controles positivos o negativos para este estudio se usaron animales a los que se inyectó Cy5 libre y PBS. En los puntos de tiempo adecuados (24 h, 72 h y 21 días) después de las inyecciones del dendrímero, se anestesió a los animales usando ketamina/xilazina y se les sacrificó usando una dosis letal de pentobarbital sódico. Los ojos se desnuclearon inmediatamente y se procesaron para su análisis por inmunohistoquímica.
Inmunohistoquímica y microscopía confocal. Se desnuclearon los ojos y se fijaron en paraformaldehído al 2 % (PFA) en PBS. Se extrajo la cámara anterior del ojo y se criopreservó la copa ocular usando protocolos previamente establecidos (Lutty y col., IOVS, 1993). Los ojos se congelaron en sacarosa al 20 % con compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) (Sakura Finetek USA Inc., Torrance, CA) a una relación 1:2 usando cuidadosamente nieve carbónica en isopentano. Los criobloques se conservan a -80 °C hasta que se seccionan. Se cortaron secciones de ocho jm de los bloques congelados usando un criostato. Las secciones se incubaron en anticuerpo de conejo dirigido contra molécula adaptadora 1 de unión a calcio ionizado (Iba-1) (Wako Chemicals, EE. UU.), que es un marcador de células de la microglía y se aplicó un anticuerpo secundario de cabra conjugado a Cy3 anti-conejo. Las secciones se analizaron en un microscopio confocal Zeiss 510. Las longitudes de onda de excitación y emisión y los ajustes del láser fueron idénticos para analizar todo el tejido en los animales sometidos a inyección intravítrea e i.v. Se tomaron pilas Z de las secciones y se solaparon para obtener una imagen a través de la sección completa.
Conjugación de conjugados de dendrímero. La síntesis del conjugado de dendrímero-acetónido de triamcinolona (D-AT) y de Cy5-D-AT se muestra en las figuras 11-13. La conjugación de los dendrímeros a Cy5 se efectuó usando procedimientos anteriormente notificados (Biomaterials. 2012;33:979-88). Este es un procedimiento de síntesis convergente y en las figuras 16A-16B se muestra un cromatograma representativo.
Análisis de biodistribución de D-Cy5 en los órganos vitales. Para este estudio se usaron doce ratones BALB-C con un peso corporal de ~25 g. En cada punto de tiempo se sacrificó a cuatro animales: 24 horas, 72 horas y 21 días. Se inyectaron en cada ratón a través de la vena femoral 600 jg de D-Cy5 en 100 j l de PBS estéril. En cada punto de tiempo respectivo, se sacrificó a los animales y se extrajeron inmediatamente los órganos vitales (corazón, pulmones, bazo, riñón, hígado y ojos) y se documentaron los pesos en húmedo de los órganos. Los órganos se congelaron inmediatamente sobre nieve carbónica y se conservaron a -80 °C hasta su análisis. Tras el análisis, se descongelaron los tejidos y se midieron y homogeneizaron 100-150 mg de tejido con 1 ml de MeOH en tubos con baja unión al ADN (Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania) usando bolas de acero inoxidable y un homogeneizador de tejidos (Tissuelyzer LT, QIAGEN, Hilden, Alemania) obteniéndose una suspensión de pulpa de tejido. La suspensión se trató con ultrasonidos durante 30 minutos y se dispusieron volúmenes adecuados que contenían 100 mg de tejido en diferentes viales con baja unión al ADN y se diluyeron con metanol hasta 1 ml, de tal forma que en cada muestra se analizó la misma cantidad de tejido y el mismo volumen. Las muestras se centrifugaron a 10.000 rpm durante 10 minutos a 4 °C, obteniéndose sobrenadantes, que se sometieron a espectroscopía de fluorescencia (f Ls ).
Modelo de rata de NVC. Para este estudio se eligieron ratas SD macho de ~300 gramos cada una. Se disolvió el lípido ácido 3(S)-hidroperoxi-9Z,11E-octadecadienoico (HpODE) (Cayman Chemicals, Michigan, EE. UU.) en tampón borato frío a una concentración de 500 jg/33 jl. Se inyectaron j l de lípido por vía subretiniana en el día 1, formando una cápsula en la retina. En el día 3, la cápsula de lípido había desaparecido y comenzó la degeneración retiniana. En el día 7 después de la inyección del lípido, comienza a formarse la neovascularización coroidal (NVC) y se produce inflamación en la retina y la coroides, así como neovascularización retiniana (NVR). Este modelo provoca daños tanto en la coroides como en la retina y tiene características de la DME tanto seca como húmeda (figura 20).
Análisis estadístico. Se analizó la repetibilidad de los resultados usando la prueba de la t de Student para determinar la significación entre los dos grupos. Se consideró significativo un valor de p igual o menor que 0,05.
Ejemplo 1
Caracterización de los conjugados de D-Cy5. Se marcaron dendrímeros de poli-(amidoamina) con núcleo de etilendiamina [PAMAM] de 4.a generación terminados en hidroxilo (G4-OH) con colorante fluorescente del IR cercano Cy5, como se ha notificado con anterioridad (Molecular Pharmaceutics. 2013;10:4560-71; Biomaterials. 2012;33:979-88). En resumen, G4-OH se funcionalizó parcialmente con ácido 6-amino caproico usando química de protección/desprotección con FMOC, obteniéndose dendrímeros bifuncionales con ~5-6 grupos NH2 en su superficie. Los dendrímeros bifuncionales resultantes con grupos amina reactivos se hicieron reaccionar con monoéster de N-hidroxisuccinimida-colorante Cy5 para obtener el conjugado de D-Cy5. Los conjugados resultantes se purificaron usando diálisis y GPC (cromatografía de permeación en gel) y se caracterizaron usando RMN de 1H (figuras 11-13).
El cromatograma HPLC del dendrímero bifuncional mostró un tiempo de elución de 14,84 min de la columna, que era diferente al tiempo de elución del dendrímero G4-OH (tiempo de elución de 14,42 min) (figuras 16A-16B). Esto indica la formación de un nuevo compuesto y que solo hay una pequeña variación en el tiempo de elución, lo que indica que las propiedades estructurales del dendrímero G4-OH no han cambiado significativamente. Esto concuerda asimismo con los resultados de la DLS, en los que se observaron el tamaño aproximado y el potencial Zeta del dendrímero G4-OH (4,36±0,18nm y 4,59±0,11 mV, respectivamente). Asimismo, el tamaño y los valores del potencial Zeta del dendrímero bifuncional fueron de 4,87±0,20 nm y 6,63±0,24 mV, respectivamente, lo que indica que no hubo un cambio significativo en el tamaño y las propiedades superficiales de los dendrímeros. La aparición de un nuevo pico simultáneamente a los 16,69 min a 647 nm (Amáx de UV para Cy5) y 645 nm (emisión de fluorescencia de Cy5), que es diferente a los picos de Cy5 (20,39 min), confirma la exitosa conjugación del colorante a los dendrímeros.
Ejemplo 2
Isquemia-reperfusión: Diferencias en la población de microglía/macrófagos, morfología y cambios estructurales en la retina. La microglía/macrófagos Iba-1 residentes en la retina normal eran menos numerosos y tenían una morfología ramificada con dendritas características. Las poblaciones heterogéneas de células de la microglía se observaron principalmente en la coroides y la capa nuclear interna (CNI) y se observaron muy pocas de estas en la capa plexiforme externa (CPE) (figuras 2A-D; 2I-L). Las retinas tenían una laminación normal tras la inyección intravítrea (figura 2). La lesión por I/R causó una retina estructuralmente dañada y una activación notable de la microglía en la retina y la coroides, según el cambio de una morfología dendrítica a redondeada o fusiforme. A los seis días después de la I/R, la microglía/macrófagos retinianos se activaron y aumentó su número, distribuyéndose por todas las capas retinianas: capa plexiforme interna (CPI), CNI, capa nuclear externa (CNE) y el espacio subretiniano (figuras 3A-D). De forma interesante, los presentes inventores observaron números reducidos de microglía/macrófagos coroidales. La lesión por I/R provocó el colapso de las capas retinianas internas y desprendimiento de retina de la coroides y las capas del EPR, lo que causó pliegues en la retina. Los presentes inventores también observaron un adelgazamiento de los valores de espesor retiniano, especialmente las capas nucleares en las retinas con lesión por I/R cuando se compararon con la retina normal, lo que sugiere la muerte de células neuronales y ganglionares (figura 3).
Ejemplo 3
Biodistribución retiniana de D-Cy5 tras la administración intravítrea e intravenosa: Administración intravítrea. La administración intravítrea de D-Cy5 mostró una biodistribución diferencial entre las retinas normales y con I/R. En las retinas normales a las 24 horas después de la inyección intravítrea de D-Cy5, había una fluorescencia mínima en la retina y la coroides (figuras 2A-D). No había señal de fluorescencia de D-Cy5 después de 24 horas, lo que sugiere que los dendrímeros se eliminaban completamente de la retina. Por el contrario, Cy5 libre se mantenía en la retina interna a las 24 horas después de la inyección (figuras 2D-F). Esto sugiere que D-Cy5 se elimina rápidamente de la retina interna. En las retinas con lesión por I/R, se observó una señal de fluorescencia significativa por D-Cy5 en las secciones de retina a las 24 horas después de la inyección (figuras 3A-H). Se observaron dendrímeros (D-Cy5) en la microglía/macrófagos Iba-1+ en el espacio subretiniano, la CNE, la CNI y en la parte próxima a la membrana limitante interna (MLI) de la retina. Los presentes inventores también observaron dendrímero en el humor vítreo y localizado en otras células en la retina interna y la coroides. A las 72 horas después de la inyección intravítrea, D-Cy5 se eliminó de otras células y el humor vítreo en los ojos con I/R (figuras 4A-H). D-Cy5 se encontró en las células marcadas con Iba-1 y se mantuvo en la microglía/macrófagos próximos a la MLI, en la retina interna y el espacio subretiniano (figuras 4A-H, flechas). De forma interesante, a los 21 días después de la inyección, D-Cy5 se conservó específicamente en las células de la microglía en la capa fotorreceptora, la CPI y cerca de la MLI (figura 5). Sin embargo, en el caso de los animales a los que se inyectó Cy5 libre, en los ojos tanto con I/R como normales, Cy-5 puede observarse en la retina interna y parece estar concentrado en los vasos sanguíneos próximos a la MLI (figuras 2I-L, flechas) pero se eliminaba por completo a las 72 horas después de la inyección (datos no mostrados).
Ejemplo 4
Administración intravenosa. Se inyectaron D-Cy5, Cy5 libre o PBS por vía intravenosa a través de la vena femoral seis días después de la lesión por I/R en un ojo. En los respectivos puntos de tiempo después de la inyección (24 horas, 72 horas y 21 días), se desnuclearon los ojos para el análisis cualitativo de las diferencias en la biodistribución retiniana de dendrímeros entre las retinas con lesión por I/R y las normales usando IHC. En los ojos con I/R a las 24 horas después de la administración intravítrea de D-Cy5, D-Cy5 había entrado en la retina desde la circulación y se observó en la microglía/los macrófagos por toda la retina y en el espacio subretiniano. Sin embargo, tanto en los ojos normales como con I/R 24 horas después de la administración de colorante Cy5 libre, Cy-5 parecía estar presente en los vasos sanguíneos retinianos como en la coriocapilaris (figuras 6I-L, flechas). Cy5 libre se eliminó en puntos de tiempo posteriores. Dado que D-Cy5 estaba presente en los macrófagos coroidales (figura 17), aparentemente los dendrímeros pueden escapar de la coriocapilaris normal. De forma interesante, los presentes inventores no observaron ninguna señal de fluorescencia procedente de D-Cy5 en las retinas sin I/R, lo que indica que una barrera hematorretiniana intacta impidió la entrada del dendrímero. Setenta y dos horas después de la inyección intravenosa de D-Cy5, los D-Cy5 se localizaron de manera selectiva y retuvieron en la microglía/macrófagos en la I/R retenidos en el espacio subretiniano (figuras 7A-H, flechas). A pesar de que las células de la microglía activadas estaban dispersas y distribuidas en todas las capas retinianas, los dendrímeros se encontraron retenidos únicamente en las células de la microglía en la coroides y en el espacio subretiniano (figuras 7E-H). A los 21 días después de la inyección, D-Cy5 se conservaba en unas pocas células de la microglía dispersas por la retina y la coroides. A los 21 días, había relativamente menos células de la microglía Iba-1+ con D-Cy5, en comparación con las retinas en los puntos de tiempo de 24 y 72 horas. Las células de la microglía con D-Cy5 parecían haber revertido a su morfología ramificada, pero seguían conservando D-Cy5 (figuras 8E-H).
EJEMPLO 5
Biodistribución ocular de D-Cy5: intravítrea frente a i.v. La dosis i.v. de D-Cy5 fue 30 veces mayor que la dosis intravítrea. De forma interesante, la captación cualitativa y el patrón de retención en la retina fue similar tras ambos modos de administración (figura 10). Esto demuestra una captación relativamente baja en el ojo de control sano, seguido de una rápida eliminación y una captación mucho mayor en el otro ojo con I/R y después la retención sostenida en el ojo con I/R. De hecho, no hubo diferencias significativas en el patrón de captación/retención entre los dos modos de administración. Aunque hay cierta presencia de D-Cy5 en la coroides del ojo normal tras la dosis i.v., parece que se elimina en su mayoría a las 72 horas (figuras 7I-L). En el ojo con I/R después de la administración i.v., se conserva ~40 % de la captación de D-Cy5 observada tras 24 horas hasta 21 días. Para la administración intravítrea, se conserva -16 % de la concentración de D-Cy5 a las 24 horas hasta 21 días.
Ejemplo 6
Cuantificación de células Iba-1+ y de D-Cy5. Se usó el programa informático Imaris para contar el número de células Iba-1+ en criosecciones de 8 mm de ora serrata a ora serrata. Se contaron cuatro secciones de cada grupo. Había una cantidad significativamente mayor de células Iba-1+ en los ojos con I/R que en los ojos sin I/R (figura 9A). El programa informático no solo cuenta un solo marcador, sino células con dos marcadores colocalizados. La figura 9B muestra las células seleccionadas por el programa informático que tienen ambos marcadores (puntas de flecha) tras establecer los parámetros de que solo se contarán los somas celulares y no procedimientos delicados. Los presentes inventores determinaron que un número significativo de células Iba-1+ tenían D-Cy5 en todos los puntos de tiempo con ambos modos de administración de D-Cy5 (figuras 9C-D) debido a que ninguna de las células estaba doblemente marcada en las retinas sin I/R.
Ejemplo 7
Biodistribución cuantitativa de D-Cy5 en órganos vitales. Se evaluó la biodistribución cuantitativa en los órganos vitales (hígado, riñón, bazo, corazón, pulmones y suero) y la cinética de D-Cy5 inyectado por vía intravenosa en los animales con lesión por I/R usando un procedimiento de FLS (espectroscopía de fluorescencia). Para el análisis, se midió el peso de los tejidos antes de homogeneizarlos y se extrajo D-Cy5 usando metanol como se ha descrito anteriormente por Lesniak y col. (Molecular Pharmaceutics 10 (12), 4560-4571). Los conjugados de D-Cy5 se encontraban intactos y estables en plasma humano a 37 °C e in vivo y asimismo, el protocolo de extracción con metanol proporcionó la mejor recuperación de un 96 %. Los extractos con metanol se sometieron a mediciones de fluorescencia para determinar sus valores de emisión usando un espectrómetro de fluorescencia. Se calculó la cantidad de D-Cy5 acumulado en cada órgano incorporando los valores de emisión (con el fondo restado de los valores de emisión de los órganos respectivos a los que se inyecta PBS) en las gráficas de calibración y posteriormente se volvieron a calcular los valores en el % de la dosis inyectada (DI)/órgano usando los pesos en húmedo de los órganos completos.
Tras la inyección intravenosa, un porcentaje de D-Cy5 se eliminó inmediatamente de la circulación a través de la orina. Los presentes inventores observaron que los animales a los que se inyectó D-Cy5 o Cy5 libre expulsaron una orina de color azul oscuro en -5-7 minutos. Veinticuatro horas después de la inyección, la mayoría de D-Cy5 se eliminó del plasma sanguíneo, pero se mantenía en cantidades diferenciales en los órganos vitales (figura 15). A las 24 horas, de acuerdo con el análisis por FLS, ~0,18 % de la dosis inyectada se mantenía en la sangre. El volumen total de sangre en los ratones BALB/C es de 10,35 ±0,16 ml/g de tejido.
La microscopía confocal de las secciones de riñón (figura 18) reveló una elevada señal de D-Cy5 en los túbulos proximales de la corteza renal a las 24 h (figura 18A), reduciéndose la señal a las 72 h (figura 18B), lo que concuerda bien con los datos de biodistribución. La HPLC de los extractos de riñón a las 24 h mostró un pequeño pico procedente de Cy5 libre, pero la fracción principal del pico fue D-Cy5 (figura 18D). Basándose en la calibración de la HPLC, los presentes inventores han estimado que un 12 % de Cy5 conjugado se liberaba transcurrido este tiempo, lo que sugiere que los conjugados se encuentran en su mayoría intactos in vivo. La tinción con hematoxilina y eosina de secciones de riñón de los animales a los que se había inyectado D-Cy5 demostraron que no había infiltración de neutrófilos o monocitos, ni daño estructural o indicios de toxicidad (figuras 18G-I).
Los conjugados de D-Cy5 se eliminaron, pero algunos se acumularon en los riñones (figura 18). Esto concuerda bien con los resultados anteriores basados en las mediciones de fluorescencia como se ha descrito anteriormente y con el radiomarcaje (Drug Deliv Transl Res. 1 de junio de 2013;3(3):260-271). La biodistribución y acumulación de D-Cy5 es como se muestra a continuación: riñón (29,98 ± 2,5 %), hígado (11,19 ± 2,2) y bazo (3,33±1,26) (figura 15). El corazón y los pulmones tuvieron una acumulación mínima de D-Cy5 (0,0049 % y 0,01 %, respectivamente). Por otra parte, se observó que el Cy5 libre se eliminaba rápidamente de la sangre y tenía una acumulación significativamente menor del 0,82 ± 2,93 % de la dosis inyectada en los riñones a las 24 horas. Además, no se pudieron detectar señales fluorescentes en otros órganos, lo que indica que Cy5 libre se elimina rápidamente. A las 72 horas después de la inyección, D-Cy5 se eliminó del corazón, los pulmones y el bazo, pero se observó predominante y persistentemente retenido en los riñones (5,53 ± 1,5 %) y en muy pequeña cantidad en el hígado (0,73 ± 0,026 %). Cy5 libre no era detectable en ninguno de los órganos, lo que indica que o bien se eliminaba del organismo o que la cantidad se encontraba por debajo de los límites de detección (LDD). Veintiún días después de la inyección, los dendrímeros se eliminaban por completo de todos los órganos examinados.
Dado que había una acumulación predominante de D-Cy5 en los riñones, se efectuó un análisis microscópico cualitativo usando microscopía confocal. A las 24 horas, la intensidad de la señal del canal de D-Cy5 fue elevada en los túbulos proximales (figura 17) de la corteza renal, pero la intensidad de la señal se redujo en los riñones a las 72 horas, lo que concuerda bien con los datos de biodistribución. También se analizaron los extractos de riñón usando HPLC para confirmar que la emisión de fluorescencia procede de D-Cy5 o de especies de D-Cy5 libres. Los cromatogramas de HPLC de los extractos de riñón a las 24 horas mostraron un pequeño pico procedente de Cy5 libre, pero la fracción principal del pico fue D-Cy5. Se liberó un doce por ciento del Cy5 conjugado, basándose en las gráficas de calibración de Cy5 libre, lo que sugiere que los conjugados se encuentran hasta cierto punto intactos in vivo hasta 72 horas. Los análisis con tinción de H y E en estas secciones de riñón (datos no mostrados) muestran que no había infiltración de neutrófilos o monocitos, la ausencia de daño estructural o de cualquier indicio de toxicidad, lo que sugiere que la dosis de D-Cy5 inyectado no causó efectos tóxicos en los órganos.
Ejemplo 8
Captación de dendrímero en la copa ocular posterior. Se evaluó la captación del dendrímero en los ojos lesionados y no lesionados tras las inyecciones sistémicas (figura 19, panel A) e intravítreas (figura 19, panel B, a dosis 30 veces mayores), usando aislamiento en tejidos de D-Cy5 y cuantificación de la fluorescencia. De forma interesante, los presentes estudios muestran una captación y retención significativamente mayor del dendrímero en el ojo con lesión por I/R, incluso hasta 21 días, después de la administración sistémica. Sorprendentemente, entre las 24 horas y los 21 días, parece haber una reducción de tan solo el 50 % en la concentración de dendrímero en el ojo lesionado. Por el contrario, aparentemente el dendrímero se elimina en su mayoría del ojo sano a las 72 horas. El hecho de que los dendrímeros están presentes de manera selectiva en las células inflamatorias, sugiere que los tratamientos sistémicos con dendrímeros son viables y sostenidos durante varias semanas. Por el contrario, los fármacos de molécula pequeña, administrados por vía intravenosa e intravítrea, se eliminan rápidamente del ojo en un breve periodo de tiempo.
Ejemplo 9
Efecto de la N-acetil-cisteína (NAC) en el modelo de NVC. Se inyectó una combinación de D-NAC (dendrímero-NAC; 10 mg/kg basándose en la NAC) y 6 mg de D-Cy5 por vía intravenosa a través de la vena peneana en el día 3 después de la inyección del lípido y se sacrificó a los animales en el día 7 después de la inyección. Los animales a los que se inyectó D-Cy5 sirvieron como controles. Los ojos se desnuclearon inmediatamente tras el sacrificio y se fijaron. Las retinas y las coroides se tiñeron con anticuerpo específico para Iba-1 en la microglía/macrófagos, los vasos sanguíneos se tiñeron con GSA lectina y los núcleos se tiñeron con DAPI y después se visualizaron como montajes planos separados inicialmente con un microscopio confocal Zeiss Meta710. Tras el análisis de los montajes planos, los tejidos se criopreservaron por separado y se congelaron en OCT/sacarosa al 20 %. En las imágenes confocales de las coroides de los grupos tratados con D-NAC y de control se analizaron las mediciones del área de NVC usando el programa informático Image-J.
El análisis por imagen confirmó que la inyección de lípido provocó una fuerte respuesta inflamatoria en la coroides, que dio como resultado la activación de la microglía/macrófagos (Iba-1, en verde), migración y acumulación en el área de NVC (marcaje de vasos sanguíneos con isolectina, en azul) (figura 21). Los resultados sugieren que los dendrímeros administrados por vía sistémica se localizaron específicamente en las células positivas para Iba-1 en el área de NVC (Cy5-Rojo). Los grupos de D-NAC+D-Cy5 mostraron eficacia terapéutica a la hora de reducir el área de NVC en comparación con los grupos a los que se inyectó D-Cy5. D-NAC (20 mg/kg) se administró por vía sistémica, 3 días después de la administración del lípido, en el día 3 y en día 6 y los animales fueron sacrificados en el día 10. Los animales tratados con D-NAC mostraron una reducción significativa e inesperada en la NVC (~80 %) (figura 22).
Los dendrímeros pueden suministrar la NAC específicamente a las células que provocan la inflamación, atenuándolas de este modo y lo que a su vez, reduce la producción de VEGF y de este modo se controla la neovascularización. Las imágenes de montaje plano de la retina demuestran que D-Cy5 es captado por la microglía retiniana en el área de inflamación (figura 23). También resulta evidente que las células de la microglía se activan debido a la inflamación provocada por el lípido (similar a la DME seca) y el lípido y la microglía inducen el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos (similar a la DME húmeda). Los presentes inventores también han observado la migración de células de la microglía hacia el área de inflamación en la retina (figura 24).
Ejemplo 10
El conjugado de D-NAC administrado por vía sistémica suprime la NVC, cuando se administra de manera temprana. Se administró D-NAC en el día 3 (dos días después de la administración del lípido) y en los días 5 y 7 a 20 mg/kg basándose en la NAC. D-NAC provocó una supresión significativa de la NVC cuando se evaluó en el día 10, en comparación con NAC libre a dosis equivalentes y los controles no tratados (supresión de ~78 % en comparación con PBS, n=12 ojos, p <0,001). Como se muestra en la figura 25, el efecto de NAC libre sistémica, D-NAC (20 mg/kg basándose en la NAC) o PBS, en la NVC, se evaluó con enmascaramiento, usando protocolos de montaje plano coroidal establecidos. Los animales tratados con D-NAC mostraron una reducción significativa en las áreas de NVC, en comparación con PBS. El NAC libre mostró una ligera reducción que no fue significativa. Las áreas de NVC se evaluaron usando análisis morfométrico (delineación en color amarillo) en el programa informático Image-J. En la figura 25, el panel A muestra la coroides tratada con PBS con NVC aumentada y una población aumentada de macrófagos (en verde) en el área de la cápsula, mientras que en la figura 25, el panel B muestra la eficacia de D-NAC con NVC reducida y acumulación de macrófagos. La vasculatura se tiñó con GSA lectina (en azul) y los macrófagos se tiñeron con IBA-1 (en verde). Los valores se analizaron usando la prueba de la t de Mann-Whitney con n=12 y P <0,001.
Ejemplo 11
D-NAC por vía sistémica reduce la migración de macrófagos al área de NVC y atenúa la inflamación coroidal. El grado de eliminación de macrófagos en la región de NVC, tras el tratamiento sistémico con D-NAC a 20 mg/kg de NAC se evaluó en el día 10, usando tinción para IBA-1. Se observó una reducción significativa en la acumulación total de macrófagos (~63 %) tras el tratamiento con D-NAC. Los estudios anteriores por Ambati y colaboradores demostró que la eliminación de macrófagos estaba correlacionada con la reducción de la NVC. De forma interesante, el análisis estructural usando Imaris71 sugirió que había una reducción del 80 % en los macrófagos activados y ~90 % de estos macrófagos activados contenía D-Cy5 (en animales tratados tanto con PBS como con D-NAC), lo que indica selectividad (figura 26).
Ejemplo 12
El efecto de D-NAC en la inflamación coroidal se evaluó con enmascaramiento, midiendo los niveles de citocinas proinflamatorias (IL-1 p, IL-6, quimioatrayente de monocitos MCP-1 y TNFa) y antiinflamatorias (IL-10). 10,23,72 Hubo una reducción significativa en todas las citocinas proinflamatorias, que volvieron a las concentraciones observadas en controles sanos, mientras que la NAC libre no fue eficaz (figuras 27A y B). De forma interesante, D-NAC pareció potenciar la citocina antiinflamatoria IL-10 (figura 27C). Esto sugiere que puede lograrse la atenuación selectiva de la respuesta proinflamatoria con D-NAC.
Ejemplo 13
El dendrímero sistémico se dirige a la microglía/los macrófagos retinianos y D-NAC atenúa la inflamación retiniana. De manera similar al patrón de biodistribución observado en el área de NVC, D-Cy5 se localizó de manera selectiva en los mi/ma activados en el área de la cápsula (figura 28B), pero no se localizó en las áreas no afectadas de la misma retina (figura 28A). En la retina tratada con D-NAC, hubo una reducción en el número de mi/ma en el área de la cápsula y que no estaban más ramificados con menos captación de D-Cy5.
Se evaluó el efecto de D-NAC en la inflamación retiniana con enmascaramiento, midiendo las concentraciones de citocinas proinflamatorias (IL-1p, IL-6, MCP-1 y TNFa) y antiinflamatorias (IL-10). Hubo una reducción significativa en todas las citocinas proinflamatorias, que volvieron a las concentraciones observadas en controles sanos, mientras que la NAC libre no fue eficaz (figuras 30A y B). De forma interesante, D-NAC pareció potenciar la citocina antiinflamatoria IL-10 (figura 30C). Esto sugiere que puede lograrse la atenuación selectiva de la respuesta proinflamatoria con D-NAC.
Ejemplo 14
La politerapia sistémica con D-NAC y D-TA, provoca regresión de la NVC. Se administró una combinación de D-NAC (20 mg/kg basándose en la NAC) y D-TA (10 mg/kg basándose en el TA) por vía sistémica en una etapa posterior (el día 11, el día 13 y el día 15) para evaluar la eficacia, cuando ya se había producido una NVC significativa: (1) en el día 21, se produjo una reducción del 72 % en la NVC en los animales tratados con dendrímero, en comparación con los controles de PBS, lo que sugiere que este último tratamiento es eficaz; (2) en comparación con el alcance del área de NVC en el día 10, hubo una reducción de -45% en los animales tratados con dendrímero en el día 21, lo que muestra indicios sólidos de regresión de la NVC (figuras 31-33). Estos resultados a escala piloto (n=3) sugieren que una supresión significativa de la NVC puede ser posible con los tratamientos sistémicos suministrados con dendrímeros. La politerapia sistémica no provocó aumento del IOP o toxicidad sistémica, evaluada mediante histología. Además, como se muestra en la figura 34, la administración tanto intravítrea como sistémica de las composiciones de la invención tuvo una biodistribución retiniana y un efecto similares en las retinas lesionadas, lo que significa que la administración sistémica es una alternativa viable a la inyección intravítrea.
El uso de los términos "un" y "una" y "el/la" y referencias similares en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) debe interpretarse que abracan tanto el singular como el plural, a menos que se indique otra cosa en el presente documento o claramente se contradiga por el contexto. Las expresiones "que comprende", "que tiene", "que incluye", y "que contiene" deben interpretarse como expresiones abiertas (es decir, que significan "que incluye, pero sin limitación") a menos que se indique otra cosa. El recitado de los intervalos de valores en el presente documento pretende meramente servir como un procedimiento abreviado para referirse de manera individual a cada valor separado que está dentro del intervalo, salvo que se indique otra cosa en el presente documento, y cada valor separado se incorpora en la memoria descriptiva como si se citara de forma individual en el presente documento. Todos los procedimientos descritos en el presente documento se pueden realizar en cualquier orden adecuado salvo que se indique lo contrario en el presente documento o claramente se contradiga por el contexto. El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o del lenguaje de ejemplo (por ejemplo, "tal como") proporcionado en el presente documento, tiene como objeto simplemente explicar mejor la invención y no representa una limitación en el ámbito de la invención a menos que se reivindique otra cosa. Ninguna expresión de la memoria descriptiva debe interpretarse en el sentido de que indica algún elemento no reivindicado como esencial para la práctica de la invención.
Las realizaciones preferidas de la presente invención se describen en el presente documento, incluido el mejor modo conocido por los inventores para llevar a cabo la invención. Las variaciones de las realizaciones preferidas pueden resultar evidentes para los expertos en la materia al leer la descripción anterior. Los inventores esperan que los expertos en la materia empleen tales variaciones según sea apropiado, y los inventores pretenden que la invención se lleve a la práctica de una manera distinta a la descrita específicamente en el presente documento.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Una composición para su uso en el tratamiento de una o más enfermedades y trastornos inflamatorios y/o angiogénicos en el ojo que comprende a) nanopartículas de dendrímero y b) un agente biológicamente activo, en la que las nanopartículas de dendrímero comprenden dendrímeros de poli(amidoamina) terminados en hidroxilo (PAMAM), en la que las nanopartículas de dendrímero están unidas covalentemente al agente biológicamente activo y en la que la composición se administra por vía sistémica en una cantidad eficaz para suprimir o inhibir las una o más enfermedades o trastornos del ojo.
2. La composición para el uso de la reivindicación 1, en la que el agente biológicamente activo se selecciona entre el grupo que consiste en agentes antiinflamatorios, agentes antiangiogénicos y antioxidantes.
3. La composición para el uso de la reivindicación 2, en la que el agente antiinflamatorio se selecciona entre el grupo que consiste en agentes antiinflamatorios no esteroideos, agentes antiinflamatorios corticoesteroides, agentes antiinflamatorios de compuestos de oro, agentes antiinflamatorios inmunosupresores y agentes antiinflamatorios de salicilato.
4. La composición para el uso de la reivindicación 2, en la que el agente antiinflamatorio se selecciona entre el grupo que consiste en acetónido de triamcinolona (AT), metilprednisona, dexametasona, inhibidores de COX-2, minociclina, péptidos SN50 y antagonistas de NF-Kp.
5. La composición para el uso de la reivindicación 2, en la que el agente antiangiogénico se selecciona entre el grupo que consiste en bevacizumab, ranibizumab, pegaptanib sódico y aflibercept.
6. La composición para el uso de la reivindicación 2, en la que el antioxidante se selecciona entre el grupo que consiste en N-acetil cisteína (NAC), beta-caroteno, rapamicina, vitamina A, vitamina C, vitamina E, resolvinas y neuroprotectina-DI.
7. La composición para el uso de la reivindicación 1, en la que el agente biológicamente activo se selecciona entre el grupo que consiste en oligonucleótidos y moléculas pequeñas.
8. La composición para el uso de la reivindicación 7, en la que el oligonucleótido se selecciona entre el grupo que consiste en ARNpi y microARN.
9. La composición para el uso de la reivindicación 1, en la que las una o más enfermedades y trastornos del ojo se seleccionan entre el grupo que consiste en degeneración macular relacionada con la edad (DME), retinitis pigmentosa, neuritis óptica, infección, uveítis, sarcoidosis, anemia drepanocítica, desprendimiento de retina, arteritis de células gigantes, isquemia retiniana, retinopatía arterioesclerótica, retinopatía hipertensiva, bloqueo de la arteria retiniana, bloqueo de la vena retiniana, hipotensión, retinopatía diabética, edema macular y neovascularización coroidea.
10. La composición para el uso de la reivindicación 1, en la que la nanopartícula de dendrímero se incluye en una formulación que comprende uno o más de liposomas, microcápsulas, nanopartículas y nanocápsulas.
11. La composición para el uso de la reivindicación 1, en la que el dendrímero de PAMAM es un dendrímero de PAMAM de G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9 o G10.
12. La composición para el uso de la reivindicación 9, en la que la composición se administra al sujeto en un periodo de tiempo seleccionado entre el grupo que consiste en: diariamente, semanalmente, bisemanalmente, mensualmente y bimensualmente.
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