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ES2861381T3 - Agente terapéutico celular para el tratamiento del cáncer y politerapia con el mismo - Google Patents

Agente terapéutico celular para el tratamiento del cáncer y politerapia con el mismo Download PDF

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ES2861381T3
ES2861381T3 ES16761938T ES16761938T ES2861381T3 ES 2861381 T3 ES2861381 T3 ES 2861381T3 ES 16761938 T ES16761938 T ES 16761938T ES 16761938 T ES16761938 T ES 16761938T ES 2861381 T3 ES2861381 T3 ES 2861381T3
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ES
Spain
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cancer
therapeutic agent
cells
cellular therapeutic
msc
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Active
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ES16761938T
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English (en)
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Hae Young Suh
Sung Soo Kim
Da Young Chang
Jin Hwa Jung
Young Don Lee
Woo Sup Hwang
Jin Sung Park
Su Jung Lee
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Original Assignee
Ajou University Industry Academic Cooperation Foundation
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Abstract

Un método para preparar un agente terapéutico celular que comprende: 1) introducir citosina desaminasa (CD) en una célula madre mesenquimatosa (MSC) para preparar una célula madre mesenquimatosa/citosina desaminasa (MSC/CD) y después cultivarla; 2) congelar la MSC/CD cultivada para preparar una MSC/CD congelada; y 3) descongelar y suspender la MSC/CD congelada para preparar un agente terapéutico celular, en el que la MSC/CD no se somete a cultivo celular después de congelar y descongelar.

Description

DESCRIPCIÓN
Agente terapéutico celular para el tratamiento del cáncer y politerapia con el mismo
[Campo técnico]
La presente divulgación se refiere a un método para preparar células para el tratamiento del cáncer, a un adyuvante contra el cáncer que comprende células preparadas por el mismo, y a un kit para el tratamiento del cáncer.
[Antecedentes de la técnica]
Millones de personas en todo el mundo mueren a consecuencia de diversos tipos de cáncer, incluido el cáncer de huesos, cáncer de vejiga, cáncer de sangre (leucemia), cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de cuello uterino, cáncer de esófago, cáncer de intestino, cáncer de riñón, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer oral, cáncer nasal, cáncer neuronal, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de estómago, cáncer de próstata, cáncer de cuello, cáncer de útero y cáncer de vagina. A lo largo de los años, se han utilizado varios métodos, que incluyen radiación y quimioterapia, para tratar el cáncer, pero el número de pacientes con cáncer sigue aumentando. Se ha informado ampliamente de que la radiación y la quimioterapia pueden causar enfermedades relacionadas con la toxicidad e incluso algunos pacientes mueren. Asimismo, en el caso de cánceres específicos, existe el problema de que las células neoplásicas siguen siendo difíciles de tratar. Como resultado, se requiere un estudio exhaustivo de la fisiología o el fenotipo de las células cancerosas para encontrar un método de tratamiento que destruya selectivamente las células cancerosas sin causar efectos adversos en las células sanas del paciente.
En particular, un tumor cerebral es un tipo de cáncer que causa un gran daño al cerebro y tiene una tasa de supervivencia muy baja. Entre los métodos de tratamiento convencionales para el tumor cerebral, la extracción mediante intervención quirúrgica es el tratamiento más eficaz, pero hay diversos casos en los que la cirugía no es posible según el tipo y la ubicación del tumor cerebral, y el riesgo de complicaciones postoperatorias es muy alto en el momento de la extracción completa. Además, debido a la existencia de la barrera hematoencefálica (BHE) en el cerebro, que inhibe la entrada de fármacos, para tratar un tumor cerebral mediante quimioterapia usando un agente anticanceroso, se requiere administrar una alta concentración de un agente anticanceroso en comparación con otros tipos de cáncer, lo que causa efectos secundarios graves en otros órganos del cuerpo. Por lo tanto, existe la necesidad de un método adyuvante novedoso, un agente terapéutico y un adyuvante, que puedan reducir la dosis del agente anticanceroso potenciando los efectos del mismo.
Asimismo, un método de terapia génica es un método para introducir directamente en las células cancerosas, un gen que inhiba la proliferación de las mismas. Para la introducción de genes, se utiliza principalmente un virus, pero como el virus en sí mismo no tiene la capacidad de desplazarse hasta el lugar del cáncer, se requiere inyectar el virus quirúrgicamente. Sin embargo, es prácticamente imposible inyectar los virus en cada tumor microscópico o en las células cancerosas y, por lo tanto, existe una limitación para dirigirse a las células cancerosas.
En este sentido, en el registro de patente coreana (RC) n.° 10-1022401 se da a conocer un método para introducir un gen suicida en una célula madre mesenquimatosa para potenciar el direccionamiento y tratar el cáncer. Sin embargo, en el RC 10-1022401 no se desvela ningún adyuvante de politerapia para mejorar el efecto de un agente anticanceroso manipulando la célula madre mesenquimatosa en un entorno especial y administrando la célula madre mesenquimatosa junto con otro agente anticanceroso, ni tampoco se desvela ningún método de administración periódica.
Además, recientemente, se han realizado diversos estudios sobre politerapias, tales como la politerapia de dos o más tipos de agentes anticancerosos. A este respecto, recientemente se ha informado de una terapia combinada no sólo de un agente quimioterapéutico, sino también de una terapia combinada de un agente quimioterapéutico junto con diferentes tipos de terapias anticancerosas, etc. Sin embargo, en el caso de politerapia, hay muchos casos en los que la administración combinada de cada fármaco muestra un efecto aditivo sencillo del mismo grado de eficacia del fármaco. Además, se han notificado efectos secundarios impredecibles, por ejemplo, un efecto de los fármacos se ve más bien deteriorado por una interacción de los mismos, etc. Por tanto, se siguen realizando estudios sobre la administración combinada de fármacos.
En relación con la administración combinada en el cáncer, también hay un estudio sobre la politerapia de agentes quimioterapéuticos y agentes terapéuticos celulares, tales como células madre mesenquimatosas. Sin embargo, en la politerapia usando células madre mesenquimatosas, se han llevado a cabo de forma intensiva investigaciones dirigidas a la administración de células, tales como células madre autólogas, para la recuperación de células dañadas después de la terapia anticancerosa con agentes quimioterapéuticos, y no hay muchos intentos de utilizar las propias células madre como agentes terapéuticos para la politerapia. Chang, D.Y., Yoo, S.W., Hong, Y., Kim, S., Kim, S.J., Yoon, S.H., Cho, K.G., Paek, S.H., Lee, Y.D., Kim, S.S. y Suh-Kim, H., 2010. El crecimiento de tumores cerebrales puede suprimirse mediante el trasplante múltiple de células madre mesenquimatosas que expresan citosina desaminasa. En el documento International Journal of Cancer, 127(8), págs. 1975-1983, se desvelan las posibles ventajas de las MSC (del inglés mesenchymal stem cells) autoinjertables en comparación con otros tipos de células madre alogénicas para el tratamiento de glioblastomas recurrentes a través de tratamientos repetitivos. Nouri, F.S., Wang, X. y Hatefi, A., 2015. Genetically engineered theranostic mesenchymal stem cells for the evaluation of the anticancer efficacy of enzyme/prodrug systems. Journal of controlled release, 200, págs. 179-187, desvelan que el sistema de enzima/profármaco yCD:UPRT/5-FC es el más eficaz entre las TK (mutantes TK007 y TKsr39), citosina desaminasa de levadura:uracil fosforribosiltransferasa (yCD:UPRT, yeast cytosine deaminase:uracil phosphoribosyltransferase) y nitrorreductasa (NTR, nitroreductase). Joven, J.H., Kim, A.A., Chang, D.Y., Park, Y.R., Suh-Kim, H. y Kim, S.S., 2015. Three-dimensional assessment of bystander effects of mesenchymal stem cells carrying a cytosine deaminase gene on glioma cells. American journal of cancer research, 5(9), pág. 2686, desvelan un método para evaluar efectos espectadores de células madre terapéuticas frente a células de glioma cultivadas en 3 dimensiones en tiempo real.
Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar un agente terapéutico, así como un método de tratamiento que sea capaz de tener un alto direccionamiento para que los agentes terapéuticos contra el cáncer o el tumor puedan transferirse con precisión a un tejido canceroso, que no sea tóxico para que no afecte a otras partes que no sean el tumor, y que se administre reiteradamente hasta que se elimine el cáncer porque no hay inmunotoxicidad. Además, existe la necesidad y se requiere un nuevo método terapéutico, agente terapéutico, adyuvante terapéutico y politerapia, que puedan mejorar o potenciar la eficacia de los agentes anticancerosos existentes.
[Divulgación]
[Problema técnico]
Los presentes inventores estudiaron un nuevo agente terapéutico contra el cáncer que podía superar las limitaciones de la quimioterapia existente, y descubrieron que las células preparadas introduciendo un gen de citosina desaminasa en una célula madre mesenquimatosa para preparar una célula madre mesenquimatosa/citosina desaminasa (MSC/CD), seguido de congelación y descongelación, podrían exhibir un efecto supresor tumoral y un efecto de mejora de la tasa de supervivencia sumamente excelentes en comparación con células MSC/CD simplemente cultivadas, y maximizar los efectos de la politerapia con agentes anticancerosos existentes, y completaron la presente divulgación.
Un objeto de la presente divulgación es proporcionar un método para preparar un agente terapéutico celular, un agente terapéutico celular para su uso en el tratamiento del cáncer, un agente de administración combinado con el agente terapéutico celular y un agente quimioterapéutico.
[Solución técnica]
La realización de la presente invención se refleja en las reivindicaciones independientes 1 y 2. Las realizaciones preferentes de la presente invención se reflejan en las reivindicaciones dependientes 3 a 9. Para lograr los objetos anteriores, la presente divulgación proporciona un método para preparar un agente terapéutico celular, que comprende: 1) introducir citosina desaminasa (CD) en una célula madre mesenquimatosa (MSC) para preparar una célula madre mesenquimatosa/citosina desaminasa (MSC/CD); 2) congelar la MSC/CD preparada para preparar una MSC/CD congelada; y 3) descongelar y suspender la MSC/CD congelada para preparar el agente terapéutico celular.
Asimismo, la presente divulgación proporciona un agente terapéutico celular para su uso en el tratamiento del cáncer.
Además, la presente divulgación proporciona un agente terapéutico celular para su uso en el tratamiento del cáncer con 5-fluorocitosina (5-FC).
Asimismo, la presente divulgación proporciona un agente terapéutico celular para su uso en el tratamiento del cáncer que comprende: 1) introducir citosina desaminasa (CD) en una célula madre mesenquimatosa (MSC) para preparar una célula madre mesenquimatosa/citosina desaminasa (MSC/CD); 2) congelar la MSC/CD preparada para preparar una MSC/CD congelada; 3) descongelar y suspender las MSC/CD congeladas para preparar el agente terapéutico celular; 4) administrar el agente terapéutico celular a un sujeto que necesite tratamiento; y 5) administrar 5-fluorocitosina (5-FC) a un sujeto que necesite tratamiento.
[Efectos ventajosos]
Según el método de preparación de la presente divulgación, es posible proporcionar el agente terapéutico celular, a pesar de no haber diferencias en la capacidad proliferativa en comparación con las células madre mesenquimatosas que expresan citosina desaminasa, que se recogen y se usan inmediatamente después del cultivo, que muestre un efecto supresor tumoral sumamente excelente a través del tratamiento junto con 5-FC, e induzca un efecto sinérgico notable que supere un efecto de la politerapia con un agente anticanceroso existente, incluso en casos de una politerapia con otro agente anticanceroso. Por lo tanto, la presente divulgación se puede utilizar como un kit para el tratamiento del cáncer, que comprende dicho agente terapéutico celular y, por tanto, se puede usar favorablemente para maximizar el efecto de los tratamientos existentes contra el cáncer.
[Descripción de los dibujos]
La figura 1 es un diagrama esquemático de una línea de células madre mesenquimatosas (MSC/CD) que expresan de manera estable citosina desaminasa, un efecto suicida y un efecto espectador de las mismas.
La figura 2 muestra el proceso de tratamiento de MSC o MSC/CD con 5-FC (A) y los resultados del efecto suicida (B) obtenidos del mismo.
La figura 3 muestra el tratamiento de MSC o MSC/CD con 5-FC (A) y los resultados del efecto espectador (B, C) obtenidos del mismo.
La figura 4 muestra el proceso de preparación celular y el tratamiento de la célula I, el agente terapéutico celular (DMSO, indicado como célula F (DSMO) en la figura), y agente terapéutico celular (CS10, indicado como célula F (CS10) en la figura) (A) para comparar el efecto espectador en las células respectivas y los efectos espectadores (B) en las células respectivas.
La figura 5 muestra una observación microscópica de la capacidad de formación de colonias de la célula I y del agente terapéutico celular (indicado como célula F en la figura) (A), y un gráfico para comparar los resultados del análisis cuantitativo usando el E-UFC (ensayo de unidades formadoras de colonias) (B).
La figura 6 muestra un proceso de tratamiento de la célula I o del agente terapéutico celular (indicado como célula F en la figura) con 5-FC en un modelo de tumor cerebral (A), los resultados de los cambios del tumor cerebral después del tratamiento, observados con un microscopio de disección, obtenidos observando los cambios del tumor cerebral debido al tratamiento (B) y los cambios del volumen tumoral (C).
La figura 7 muestra un gráfico de los cambios del volumen tumoral según el tratamiento con la célula I o el agente terapéutico celular (indicado como célula F en la figura) (A) en modelos de tumores subcutáneos en los que se implantan células de cáncer de hígado por vía subcutánea, y modelos de tumores representativos que muestran un tamaño externo del tumor (B).
La figura 8 muestra los cambios del volumen tumoral según el tratamiento con la célula I o el agente terapéutico celular (indicado como célula F en la figura), en modelos de tumores subcutáneos en los que se implantan células de cáncer de páncreas por vía subcutánea (A), en modelos de tumores subcutáneos en los que se implantan células de cáncer de pulmón por vía subcutánea (B), y en modelos de tumores subcutáneos en los que se implantan células de cáncer de colon por vía subcutánea (C).
La figura 9 muestra la politerapia del agente terapéutico celular 5-FC TMZ (A), los efectos espectadores obtenidos de la misma (B, C), la confirmación sobre los resultados de la muerte celular a través de imágenes de fluorescencia de U87MG que expresan GFP (D) y los resultados del isobolograma de los valores de CI50 (E). La figura 10 muestra la politerapia del agente terapéutico celular 5-FC agente anticanceroso (A), los resultados del isobolograma de los valores de CI50 de carmustina (B) y los resultados del isobolograma de los valores de CI50 de irinotecán (C), respectivamente, en la politerapia de agentes anticancerosos.
La figura 11 muestra el proceso de la politerapia del agente terapéutico celular 5-FC temozolomida (TMZ) (A), los resultados de los cambios del tumor cerebral después del tratamiento, observados con un microscopio de disección que muestra los cambios del tumor cerebral (B), los cambios del volumen tumoral (C), y los efectos sinérgicos en la mejora de las tasas de supervivencia (D) con la politerapia.
La figura 12 muestra el proceso de análisis sobre los efectos de la politerapia de la célula I o del agente terapéutico celular 5-FC temozolomida (TMZ) en los modelos de tumores subcutáneos (A), los cambios del volumen tumoral (B), y los efectos sinérgicos del agente terapéutico celular 5-FC temozolomida (TMZ) en el análisis de las tasas de supervivencia (C).
[Mejor modo]
La presente divulgación proporciona un método para preparar un agente terapéutico celular, que incluye: 1) introducir citosina desaminasa (CD) en una célula madre mesenquimatosa (MSC) para preparar una célula madre mesenquimatosa/citosina desaminasa (MSC/CD); 2) congelar la MSC/CD preparada para preparar una MSC/CD congelada; y 3) descongelar y suspender la MSC/CD congelada para preparar el agente terapéutico celular.
Según el método para preparar el agente terapéutico celular de la presente divulgación, es posible proporcionar el agente terapéutico celular, a pesar de no haber diferencias en la capacidad proliferativa en comparación con las células madre mesenquimatosas que expresan citosina desaminasa, que se recogen y se usan inmediatamente después del cultivo de células I, que muestre un efecto supresor tumoral sumamente excelente cuando se trata con 5-FC, e induzca un efecto sinérgico notable que supere un efecto de la politerapia con un agente anticanceroso existente, incluso en casos de una politerapia con otro agente anticanceroso.
La "MSC/CD" usada en este documento se refiere a una célula madre mesenquimatosa preparada para expresar citosina desaminasa (CD) en la célula madre mesenquimatosa. La célula madre mesenquimatosa en la que se introduce la citosina desaminasa, se refiere a una célula que se desplaza a las proximidades de las células cancerosas con un tropismo hacia las células cancerosas, y expresa continuamente citosina desaminasa para inducir el propio efecto suicida, y convertir un profármaco no tóxico en un agente anticanceroso activo para exhibir un efecto espectador en el que se destruyen células cancerosas circundantes. La MSC/CD tiene la ventaja de que, al sufrir muerte celular, pueden reducirse los efectos secundarios que pueden causar los efectos continuos no deseados, y dado que se desplaza a las proximidades de las células cancerosas, las células cancerosas infiltradas pueden destruirse, actuando así como un agente anticanceroso eficaz. En particular, la "célula F", que es una célula preparada congelando/descongelando la MSC/CD, muestra un efecto sinérgico en el que un efecto anticanceroso aumenta significativamente cuando se usa junto con el agente anticanceroso existente, utilizándose de este modo como un adyuvante que potencia el efecto del agente anticanceroso.
La expresión "célula madre mesenquimatosa (MSC)" de la presente divulgación, es un tipo de células madre que se pueden extraer de la médula ósea y de la sangre del cordón umbilical, y se refiere a una célula estromal multipotente que es capaz de proliferar, y en particular, que es capaz de diferenciarse en varios tipos de células, tales como osteocitos, condrocitos, miocitos y adipocitos, a diferencia de las células madre hematopoyéticas. Por lo tanto, la célula madre mesenquimatosa de la presente divulgación puede ser, preferentemente, la célula madre mesenquimatosa multipotente.
La expresión "citosina desaminasa" de la presente divulgación se refiere a un gen suicida, que actúa convirtiendo un profármaco inofensivo para el cuerpo humano en un material anticanceroso citotóxico, y específicamente, un gen que convierte la 5-fluorocitosina (5-FC) que es un profármaco de 5-fluorouracilo (5-FU), en 5-FU.
El gen suicida puede introducirse en la célula madre mesenquimatosa según métodos conocidos en la técnica de introducción intracelular de genes, tales como un método de uso de un vector no vírico o un vector vírico que lo incluya, o un método físico. Como ejemplos de dichos métodos físicos para la transferencia de genes, pueden incluirse, electroporación, hidroporación, inyección, etc. Como ejemplos de transferencia de genes usando vectores no víricos pueden incluirse métodos de uso de lípidos catiónicos, polímeros lipídicos o nanopartículas. El vector vírico puede incluir, sin limitación, un vector vírico replicable, un vector vírico no replicable, tal como un vector adenovírico, un vector vírico adenoasociado, un vector retrovírico, el virus del herpes simple, un sistema adenovírico híbrido, el virus de la viruela, un vector de lentivirus y el virus de Epstein Barr.
Por ejemplo, en una realización ilustrativa de la presente divulgación, el gen suicida puede introducirse en el vector retrovírico para construir un vector de expresión, el vector se puede transfectar en células de empaquetamiento, las células de empaquetamiento transfectadas se pueden cultivar y filtrar para obtener una solución de retrovirus, y esta solución de retrovirus se puede usar para transfectar la célula madre mesenquimatosa, insertando así el gen suicida en la misma. A continuación, la célula madre mesenquimatosa que expresa continuamente el gen suicida, puede obtenerse usando un marcador de selección incluido en el vector retrovírico.
Asimismo, dado que se sabe que la célula madre mesenquimatosa tiene un inmunorrechazo bajo incluso durante el alotrasplante, usando una base de datos de bancos de sangre, es posible usar células aisladas de otras personas o células recogidas de los propios pacientes con cáncer, y minimizar además el inmunorrechazo entre individuos mediante la separación de la médula ósea que tiene tipos similares de HLA (siglas de inglés human leukocyte antigen, antígeno leucocitario humano).
La MSC/CD de la presente divulgación puede obtenerse introduciendo primero un gen suicida en la célula madre aislada, seguido de exploración, proliferación y diferenciación en condiciones apropiadas en un tubo de ensayo, o puede obtenerse haciendo que la célula madre prolifere suficientemente, introduciendo un gen suicida en la célula madre, seguido de la diferenciación en la célula madre mesenquimatosa. La MSC/CD se inyecta en un sujeto que necesita tratamiento debido a la presencia del gen suicida, y se autodestruye después, por ejemplo, al cabo de 2 a 30 días, preferentemente, de 5 a 15 días, más preferentemente, de 5 a 10 días, pero sin limitarse a ello, de la inyección, reduciendo así los efectos secundarios que pueden inducir la acción continua.
El término "célula F (célula congelada, frozen cell)" de la presente divulgación, se refiere a una célula que no se somete a una etapa de cultivo adicional, liberando del cultivo al agente terapéutico celular, después de congelar y descongelar la MSC/CD, que es la célula madre mesenquimatosa en la que se introduce la citosina desaminasa (CD), y se define como una célula que se descongela y suspende, o se suspende y se lava con la finalidad de administrar las células al sujeto que se va a tratar. Más específicamente, la célula F se refiere a una célula obtenida introduciendo citosina desaminasa (CD) en la célula madre mesenquimatosa para preparar la MSC/CD, cultivando, congelando la célula en un medio de congelación, descongelando la célula a temperatura ambiente inmediatamente antes de su uso, seguido de suspensión, por ejemplo, en una Solución Plasmática A, o similar, que contenga seroalbúmina humana, que no se limite a ello, y centrifugación. Como una célula diferenciada del agente terapéutico celular de la presente divulgación, puede ilustrarse una célula recogida inmediatamente (célula I)", que se obtiene realizando la misma etapa de congelación y descongelación de la MSC/CD, pero maximizando la concentración y la actividad a través del proceso de cultivo posterior, y se usa recogiendo directamente la célula en el cultivo.
El agente terapéutico celular, en comparación con la célula I, de la presente divulgación, se caracteriza por que el efecto anticanceroso aumenta sin la etapa de cultivo, que se realiza generalmente para maximizar la activación y sin aumentar la capacidad de formación de colonias. Asimismo, el agente terapéutico celular de la presente divulgación puede tener la ventaja de administrarse inmediatamente a un paciente que necesite tratamiento junto con la mejora del efecto anticanceroso.
En la presente divulgación, las células en un estado criopreservado o congelado pueden conservarse utilizando cualquier medio conocido en la técnica para mantener las células en estado congelado, tal como un líquido de preservación de congelación, un medio de congelación, etc. Por ejemplo, los medios pueden incluir medios que incluyan protectores de congelación, tales como dimetilsulfóxido (DMSO), dextrano, suero humano, seroalbúmina humana, suero bovino, seroalbúmina bovina, poli L lisina, polivinilpirrolidona, hidroxietil almidón, etilenglicol, polietilenglicol, glicerol y percoll (por ejemplo, cryostor CS2, cryostor CS10 disponible en el comercio de BioLife Solutions Inc.), y específicamente, cryostor CS2, cryostor CS10, y medio de DMSO del 2 al 10 %, y más específicamente, medios de DMSO al 2, 5 y 10 %, etc.
El agente terapéutico celular de la presente divulgación muestra una capacidad de formar de colonias in vitro similar a la de la célula I, y también muestra eficazmente el efecto espectador de la MSC/CD. Además, el agente terapéutico celular muestra un efecto inhibidor in vivo en una variedad de tumores, incluidos los tumores cerebrales y los tumores subcutáneos, que es dos veces mayor o más, en comparación con la célula I o con el grupo de control, y muestra un efecto anticanceroso sumamente elevado en la politerapia con temozolomida (TMZ), que es el agente anticanceroso existente. En otras palabras, aunque el agente terapéutico celular no tiene ninguna diferencia en cuanto a la capacidad de formación de colonias en comparación con la célula I, el agente terapéutico celular muestra un notable efecto anticanceroso que no se puede esperar in vitro y un efecto como adyuvante de un agente anticanceroso, en comparación con otras células I, debido a la actividad intrínseca del agente terapéutico celular administrado según el método de preparación.
Es decir, las células F de la presente divulgación pueden diferenciarse de las células I que se utilizan convencionalmente, mediante métodos de preparación en los que no se realiza el cultivo celular después de la congelación.
Por lo tanto, la presente divulgación proporciona el método para preparar un agente terapéutico celular, caracterizado por que el agente terapéutico celular no se somete a cultivo celular después de la congelación.
El agente terapéutico celular de la presente divulgación puede usarse para el tratamiento del cáncer. El agente terapéutico celular puede usarse para tratar, sin limitación, todos los carcinomas susceptibles de extraerse como cáncer y carcinoma, y puede administrarse a un sujeto que necesite tratamiento antes, simultáneamente con, y después de, la quimioterapia mediante la administración de un agente anticanceroso.
El cáncer puede ser, por ejemplo, al menos uno seleccionado del grupo que consiste en cáncer epidermoide (por ejemplo, cáncer epidermoide epitelial), cáncer microcítico de pulmón, cáncer no microcítico de pulmón, cáncer de pulmón, cáncer peritoneal, cáncer colorrectal, tumor biliar, cáncer nasofaríngeo, cáncer de laringe, cáncer bronquial, cáncer oral, osteosarcoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer de riñón, leucemia, cáncer de vejiga, melanoma, cáncer de cerebro, glioma, tumor cerebral, cáncer de piel, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de hígado, cáncer de hueso, cáncer de esófago, cáncer de colon, cáncer gástrico, cáncer de cuello uterino, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de cabeza y cuello, y cáncer de recto, y más preferentemente, tumor cerebral, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de colon y cáncer de piel.
Además, el agente terapéutico celular de la presente divulgación también puede ser un adyuvante contra el cáncer. El adyuvante contra el cáncer se refiere a un adyuvante que es capaz de inducir una acción más rápida de una terapia primaria y formar fuertemente una acción contra el cáncer de la misma mediante politerapia con la terapia primaria, por ejemplo, tratamiento del cáncer mediante terapia química u operación quirúrgica. El adyuvante contra el cáncer puede usarse para potenciar el efecto del agente anticanceroso, que es un agente terapéutico principal usado principalmente en quimioterapia que usa el agente anticanceroso, y puede usarse para maximizar el efecto del tratamiento del cáncer al tratar las células cancerosas residuales después de la cirugía.
El agente terapéutico celular puede estar presente en forma de una composición para su uso en la terapia del cáncer o para su uso en el adyuvante contra el cáncer, y dicha composición puede incluir excipientes, transportadores y diluyentes farmacéuticamente aceptables. Preferentemente, se formula una forma de inyección particularmente preferida en una forma de inyección adecuada para inyección en un tejido u órgano.
Por consiguiente, la presente divulgación proporciona un adyuvante contra el cáncer que incluye el agente terapéutico celular.
El agente terapéutico celular se puede inyectar en el cuerpo del paciente según la prescripción del médico, o mediante un método bien conocido en la técnica, y se determinará una sola dosis teniendo en cuenta varios factores relacionados, tales como una enfermedad a tratar, la gravedad de la enfermedad, la vía de administración, el peso corporal, la edad y el sexo del paciente, etc.
Además, la presente divulgación proporciona un kit para el tratamiento del cáncer que incluye el agente terapéutico celular y 5-fluorocitosina (5-FC).
Para el tratamiento del cáncer, el kit se prepara con la finalidad de una politerapia del agente terapéutico celular y la 5-fluorocitosina (5-FC), y se refiere a un kit preparado para que el agente terapéutico celular pueda inyectarse, a un sujeto que necesite el tratamiento, antes, simultáneamente con, y después de, la administración de la 5-fluorocitosina (5-FC), que es un profármaco.
Para el tratamiento del cáncer el kit puede comprender un primer compartimento y un segundo compartimento, en el que el primer compartimento puede comprender el agente terapéutico celular para el tratamiento del cáncer o el agente terapéutico celular que actúa como adyuvante contra el cáncer, y el segundo compartimento puede incluir 5-fluorocitosina (5-FC). El kit puede estar contenido en uno o varios recipientes pequeños diferentes, estando cada dosis dividida para mejorar la comodidad y la portabilidad. Por lo tanto, según un método de disposición, en cada recipiente puede haber varios recipientes. El kit de la presente divulgación puede incluir, si fuera necesario, instrumental necesario para su uso, instrucciones que incluyan descripciones de los métodos de administración de cada componente, etc.
Asimismo, para el tratamiento del cáncer de la presente divulgación, un kit puede incluir además un agente anticanceroso. El agente anticanceroso puede incluir, pero sin limitación, agentes anticancerosos conocidos en la técnica, y preferentemente, pueden seleccionarse de al menos uno seleccionado del grupo que consiste en mostaza nitrogenada, imatinib, oxaliplatino, rituximab, elotinib, trastuzumab, gefitinib, bortezomib, sunitinib, carboplatino, sorafenib, bevacizumab, cetuximab, muérdago blanco (Viscum album), asparaginasa, tretinoína, hidroxicarbamida, dasatinib, estramustina, gemtuzumab ozogamicina, ibritumomab tiuxetán, heptaplatino, ácido metil aminolevulínico, amsacrina, alemtuzumab, procarbazina, alprostadilo, quitosano de nitrato de holmio, gemcitabina, doxifluridina, pemetrexed, tegafur, capecitabina, gimeracilo, oteracilo, azacitidina, citarabina, fludarabina, enocitabina, decitabina, mercaptopurina, tioguanina, cladribina, carmofur, raltitrexed, docetaxel, paclitaxel, belotecán, topotecán, vinorrelbina, etopósido, vincristina, vinblastina, tenifocide, idarrubicina, epirrubicina, mitoxantrona, mitomicina, bleomicina, daunorrubicina, dactinomicina, pirarrubicina, aclarrubicina, pepromicina, temozolomida, busulfán, ifosfamida, ciclofosfamida, melfalán, altretamina, dacarbacina, tiotepa, nimustina, clorambucilo, mitolactol, taxotere, gleevec, taxol, herceptina, tarceva, avastin, zoladex, adriamicina, irinotecán, 10058-F4, cisplatino, ciclofosfamida, un agente anticanceroso basado en nitrosourea, metotrexato y doxorrubicina. La nitrosourea incluye carmustina, lomustina y similares. El agente anticanceroso puede incluirse en el tercer compartimento del kit para el tratamiento del cáncer.
Asimismo, la presente divulgación proporciona un método para prevenir o tratar el cáncer que incluye: 1) introducir citosina desaminasa (CD) en una célula madre mesenquimatosa (MSC) para preparar una célula madre mesenquimatosa/citosina desaminasa (MSC/CD); 2) congelar la MSC/CD preparada para preparar una MSC/CD congelada; 3) descongelar y suspender las MSC/CD congeladas para preparar el agente terapéutico celular; 4) administrar el agente terapéutico celular a un sujeto que necesite tratamiento; y 5) administrar 5-fluorocitosina (5-FC) a un sujeto que necesite tratamiento.
El sujeto es, preferentemente, un mamífero, incluyendo un ser humano, y puede incluir a todos los pacientes que necesiten tratamiento contra el cáncer, a un paciente en tratamiento contra el cáncer, a un paciente que ya se haya tratado contra el cáncer y a un paciente que necesite tratarse contra el cáncer, y también puede incluir a un paciente que se ha sometido a una cirugía para extirpar el cáncer para el tratamiento del cáncer.
Además, la presente divulgación proporciona el método para prevenir o tratar el cáncer, que incluye, además: 6) administrar un agente anticanceroso a un sujeto que necesite tratamiento.
Además, la presente divulgación proporciona un agente terapéutico celular para su uso en la prevención o el tratamiento del cáncer, que incluye: 4) administrar un agente anticanceroso a un sujeto que necesite tratamiento antes, simultáneamente con la administración del agente terapéutico celular de la etapa 4).
Es decir, la presente divulgación proporciona el agente terapéutico celular para su uso en la prevención o el tratamiento del cáncer, incluyendo la administración simultánea del agente terapéutico celular y el agente anticanceroso a un sujeto que necesite tratamiento y la administración secuencial, tal como la administración del agente anticanceroso después de la administración del agente terapéutico celular, y la administración del agente terapéutico celular después de la administración del agente anticanceroso a un sujeto que necesite tratamiento.
El agente anticanceroso puede incluir, pero sin limitación, agentes anticancerosos conocidos en la técnica, y preferentemente, pueden seleccionarse de al menos uno seleccionado del grupo que consiste en mostaza nitrogenada, imatinib, oxaliplatino, rituximab, elotinib, trastuzumab, gefitinib, bortezomib, sunitinib, carboplatino, sorafenib, bevacizumab, cetuximab, muérdago blanco (Viscum album), asparaginasa, tretinoína, hidroxicarbamida, dasatinib, estramustina, gemtuzumab ozogamicina, ibritumomab tiuxetán, heptaplatino, ácido metil aminolevulínico, amsacrina, alemtuzumab, procarbazina, alprostadilo, quitosano de nitrato de holmio, gemcitabina, doxifluridina, pemetrexed, tegafur, capecitabina, gimeracilo, oteracilo, azacitidina, citarabina, fludarabina, enocitabina, decitabina, mercaptopurina, tioguanina, cladribina, carmofur, raltitrexed, docetaxel, paclitaxel, belotecán, topotecán, vinorrelbina, etopósido, vincristina, vinblastina, tenifocide, idarrubicina, epirrubicina, mitoxantrona, mitomicina, bleomicina, daunorrubicina, dactinomicina, pirarrubicina, aclarrubicina, pepromicina, temozolomida, busulfán, ifosfamida, ciclofosfamida, melfalán, altretamina, dacarbacina, tiotepa, nimustina, clorambucilo, mitolactol, taxotere, gleevec, taxol, herceptina, tarceva, avastin, zoladex, adriamicina, irinotecán, 10058-F4, cisplatino, ciclofosfamida, un agente anticanceroso basado en nitrosourea, metotrexato y doxorrubicina. La nitrosourea incluye carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), etc. El agente anticanceroso puede prescribirse de forma apropiada y selectiva según una dosis de prescripción del agente anticanceroso muy conocida en la técnica, pero puede prescribirse a una dosis menor que una dosis media de prescripción teniendo en cuenta el efecto sinérgico con el agente terapéutico celular de la presente divulgación.
El agente terapéutico celular de la presente divulgación y la 5-fluorocitosina, pueden administrarse simultánea o secuencialmente con diferencias de tiempo, que puede seleccionarse dependiendo del tiempo y período apropiados para la conversión de la 5-fluorocitosina en 5-fluorouracilo por el agente terapéutico celular.
Por lo tanto, la presente divulgación proporciona el método para prevenir o tratar el cáncer, caracterizado por que el agente terapéutico celular y la 5-fluorocitosina se administran simultánea o secuencialmente.
Además, el agente anticanceroso usado junto con la 5-fluorocitosina de la presente divulgación, puede administrarse simultánea o secuencialmente con diferencias de tiempo, y puede seleccionarse según el tiempo y período apropiados.
Por lo tanto, la presente divulgación proporciona el agente terapéutico celular para su uso en la prevención o el tratamiento del cáncer, caracterizado por que la 5-fluorocitosina y el agente anticanceroso se administran simultánea o secuencialmente.
En la presente divulgación, la administración secuencial significa que los múltiples componentes a administrar, se administran a un sujeto con diferencias de tiempo y que el orden de cada uno de los componentes activos puede ajustarse apropiadamente.
El agente terapéutico celular puede suministrarse en una cantidad farmacéuticamente eficaz en un lugar del tumor del sujeto, y, preferentemente, el suministro se realiza mediante una forma de inyección, aunque no se limita a lo anterior. En particular, es más preferible que la inyección se administre a mamíferos, preferentemente un paciente humano.
El agente terapéutico celular son las células MSC/CD que se usan inmediatamente por congelación, descongelación o descongelación y lavado, y que tienen un efecto citotóxico, que el cuerpo de un sujeto puede eliminar durante un período de tiempo predeterminado a través de un efecto suicida, preferentemente de 5 a 15 días después de la inyección. Por tanto, el agente terapéutico celular puede administrarse repetidamente para un tratamiento continuo. Además, la 5-FC, el agente anticanceroso, se puede administrar repetidamente dependiendo de la finalidad terapéutica y de la afección del paciente. El ciclo de la administración repetida del agente terapéutico celular, la 5-FC y el agente anticanceroso, puede ajustarse apropiadamente según la afección terapéutica del paciente, y el ciclo puede ser, preferentemente, cada 10 a 30 días. Por ejemplo, teniendo en cuenta la muerte celular de la MSC/Cd , la administración repetida es preferible después de al menos 10 días, y la administración repetida cada 30 días también es preferible teniendo en cuenta que las células se inyectan con una jeringa.
Por lo tanto, la presente divulgación proporciona el método para prevenir o tratar el cáncer caracterizado por que la administración del agente terapéutico celular se repite cada 10 a 30 días.
Dependiendo de la repetición del ciclo de administración del agente terapéutico celular, la 5-fluorocitosina también puede administrarse repetidamente de manera periódica y, opcionalmente, el agente anticanceroso para la administración combinada también puede administrarse repetidamente de manera periódica.
En el método para prevenir o tratar el cáncer de la presente divulgación, puede usarse un agente terapéutico celular para tratar, sin limitación, todos los carcinomas susceptibles de extraerse como cáncer y carcinoma, y puede administrarse a un sujeto que necesite tratamiento antes, simultáneamente con, y después de, la quimioterapia mediante la administración de un agente anticanceroso. El cáncer puede ser, por ejemplo, al menos uno seleccionado del grupo que consiste en cáncer epidermoide (por ejemplo, cáncer epidermoide epitelial), cáncer microcítico de pulmón, cáncer no microcítico de pulmón, cáncer de pulmón, cáncer peritoneal, cáncer colorrectal, tumor biliar, cáncer nasofaríngeo, cáncer de laringe, cáncer bronquial, cáncer oral, osteosarcoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer de riñón, leucemia, cáncer de vejiga, melanoma, cáncer de cerebro, glioma, tumor cerebral, cáncer de piel, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de hígado, cáncer de hueso, cáncer de esófago, cáncer de colon, cáncer gástrico, cáncer de cuello uterino, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de cabeza y cuello, y cáncer de recto, y más preferentemente, tumor cerebral, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de colon y cáncer de piel.
En lo sucesivo en el presente documento, para ayudar a comprender la presente divulgación, se describirán Ejemplos de Preparación y Ejemplos preferidos de la presente divulgación. Sin embargo, los siguientes Ejemplos de Preparación y Ejemplos, se proporcionan solo para comprender más fácilmente la presente divulgación y, por lo tanto, la presente divulgación no se limita a ellos.
Ejemplo de Preparación 1: Preparación de células madre mesenquimatosas que expresan citosina desaminasa (CD)
1.1 Aislamiento y cultivo de células madre mesenquimatosas
Cuatro (4) ml de médula ósea humana donada después del examen de la junta de revisión institucional IRB (Institutional Review Board) del Centro Médico de la Universidad de Ajou, se revistieron sobre 4 ml de HISTOPAQUE 1077 (Sigma-Aldrich) en un tubo de ensayo esterilizado de 15 ml y se centrifugaron a 400 xg durante 30 minutos a temperatura ambiente utilizando una centrifugadora. Después de la centrifugación, con una pipeta Pasteur, se recogieron cuidadosamente 0,5 ml de la capa leucoplaquetaria intermedia y se transfirieron a un tubo de ensayo que contenía 10 ml de solución de tampón fosfato esterilizada (pH 7,4). Después de centrifugar a 250 x g durante 10 minutos, el sobrenadante se desechó, se añadieron 10 ml de solución de tampón fosfato y se suspendieron suavemente, seguido de centrifugación a 250 x g durante 10 minutos. Este procedimiento se repitió dos veces y el precipitado final se añadió a un medio DMEM (Gibco) complementado con FBS al 10 % (Hyclone) y se dispensó en una placa de cultivo de células animales de 100 mm para obtener 1 x 109 células. El recipiente de cultivo se colocó en una incubadora y se cultivó a 37 °C durante 4 horas mientras se suministraba dióxido de carbono al 5 % y aire al 95 %. Posteriormente, para eliminar las células no adheridas al fondo del recipiente de cultivo, el sobrenadante se eliminó. Se le añadió medio reciente y se cultivó en una incubadora.
Las células madre mesenquimatosas aisladas se mantuvieron en una incubadora con CO2 a 37°°C, y se cultivaron en un medio de cultivo de células madre mesenquimatosas [(FBS al 10 % (Gibco) bFGF 10 ng/ml (Sigma-Aldrich) penicilina/estreptomicina al 1 % (Gibco) DMEM al 89 % (Gibco)]. Las células se cultivaron mientras se reemplazaba el medio cada dos días. Cuando las células alcanzaron aproximadamente el 80 % en el recipiente de cultivo, las células se aislaron usando tripsina al 0,25 %/EDTA 0,1 mM (Gibco), se diluyeron con el medio para llegar a aproximadamente de 800 a 11000 células/cm2, o de 1:10 a 1:20, y se subcultivaron en un nuevo recipiente de cultivo. Algunas células se conservaron congeladas en un medio de congelación complementado con DMSO al 2-10 % (Sigma-Aldrich, 2, 5, 10 %).
1.2 Preparación de retrovirus que incluyen citosina desaminasa (CD)
Se construyó un retrovirus que expresaba citosina desaminasa (CD), un gen suicida. Su descripción detallada es la siguiente:
Se aisló ADN de la cepa K-12 MG1655 de E. coli (Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology), y después se realizó la PCR en condiciones de 5 minutos a 94°°C, 30 segundos a 94 °C, 40 segundos a 60°°C, 1 minuto a 72°°C, 27 ciclos; 7 minutos a 72°°C, usando los cebadores CD-F(5'-GAA TTC AGG CTA GCA ATG TCT CGA ATA ACG CTT TAC AAA C-3') y CD-R (5'-GGATTC TCT AGC TGG CAG ACA GCC GC-3'). El producto de la PCR se utilizó en un kit de clonación de vectores pGEM-T Easy (Promega), y después se construyó un vector PGEM-CD que contenía el gen CD mediante exploración de colonias azul-blanco usando X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-galactopiranósido, Sigma-Aldrich) e IPTG (Isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido, Sigma-Aldrich). Se confirmó que la secuencia de bases del gen CD obtenido, era idéntica a la de gi: 298594 de GeneBank mediante análisis de secuencia. El plásmido pGEM-CD preparado y el pcDNA3.1 (Clontech) se digirieron con las enzimas de restricción EcoRI y Notl, respectivamente, y el gen CD aislado del plásmido pGEM-CD y el plásmido cortado pcDNA3.1 se ligaron con ADN ligasa de T4. Después, el producto obtenido se usó para transformar la cepa DH5a de E. coli, una célula competente, y se cultivó en una placa LB que contenía 50 mg/ml de ampicilina y se seleccionó para obtener un plásmido pcDNA3.1-CD. Este plásmido se digirió con la enzima de restricción BamH I y se introdujo en un vector retrovírico capaz de producir retrovirus. El plásmido obtenido se aisló mediante una centrífuga de ultra alta velocidad CsCI y se transfectó en la célula FLYRD18, que es una línea celular de empaquetamiento de retrovirus, por precipitación con fosfato de calcio (Jordan, Nucleic Acid Research, 24,596-601 (1996)). Después, las células se cultivaron a 37°°C en una incubadora mientras se suministraba dióxido de carbono al 5 % y aire al 95 %. Después de 48 horas, solo se obtuvo la solución de cultivo y se filtró a través de una membrana de filtro de 0,45 mm para obtener una solución de retrovirus. La solución de retrovirus se dispensó y usó mientras se conservaba -70°°C.
1.3 Preparación de células madre mesenquimatosas en las que se introduce el gen CD
El gen CD se introdujo en las células madre mesenquimatosas aisladas y cultivadas en la descripción del apartado 1.1, usando el retrovirus que contenía CD preparado en la descripción del apartado 1.2. Más específicamente, la célula madre mesenquimatosa se cultivó hasta alcanzar aproximadamente el 70 % en una placa de cultivo de 100 mm. Después, se añadieron 3 ml de la solución de retrovirus, 3 ml del medio de cultivo reciente de células madre mesenquimatosas y 4 mg/ml de polibreno (Sigma-Aldrich), y se cultivó durante 8 horas. Después, la solución de virus se eliminó, se añadieron 10 ml de medio de cultivo de células madre mesenquimatosas y se cultivaron durante 16 horas, y después se infectaron de nuevo con retrovirus. Después de realizar este procedimiento de 1 a 3 veces, finalmente las células madre mesenquimatosas se despegaron con tripsina y se subcultivaron mediante dilución 1:20 con el medio. En el subcultivo, se añadió puromicina (Sigma-Aldrich) al medio hasta una concentración de 2 mg/ml. Las células se exploraron durante 2 semanas para que solo pudieran sobrevivir las células infectadas con retrovirus. Finalmente, se construyó la línea de células madre mesenquimatosas (en lo sucesivo en el presente documento, MSC/CD) que expresan continuamente CD, que es un gen suicida.
Ejemplo 1. Efecto suicida y efecto espectador de MSC/CD
1.1 Confirmación del efecto suicida
La citosina desaminasa (CD) es un gen suicida. La MSC/CD, que es una célula madre mesenquimatosa que expresa la citosina desaminasa (CD), puede convertir la 5-fluorocitosina (5-FC), que es un profármaco, en 5-fluorouracilo (5FU) y puede tener un efecto suicida (las células se autodestruyen) y un efecto espectador (las células periféricas se destruyen) como se muestra en la figura 1. Por lo tanto, se confirmaron el efecto suicida y el efecto espectador de la MSC/CD preparada en la descripción del apartado 1.3. En primer lugar, en una placa de 12 pocillos se cultivaron 10 000 MSC/CD o células madre mesenquimatosas (MSC). Desde el día siguiente, las células se trataron con el profármaco 5-FC a una concentración de 0 a 1000 mM, y una vez cada dos días, se reemplazaron por un medio nuevo que contenía el fármaco. El medio se cambió a un medio de cultivo celular que contenía 0,5 mg/ml de bromuro de MTT (3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio, Sigma-Aldrich), capaz de medir las células vivas seis días después del tratamiento con 5-FC, y reaccionó durante 2 horas a 37°°C. Después, la solución de MTT se eliminó. Se añadieron 500 ml de DMSO a cada pocillo para realizar una reacción de color. Después, los lisados se transfirieron a una placa de 96 pocillos y usando un lector ELISA (E-max, Molecular Device), se midió la absorbancia a 540 nm. En la figura 2 se muestra un diagrama esquemático del método experimental y sus resultados.
Tal como se muestra en la figura 2, se confirmó que la MSC/CD tenía un efecto suicida en el que las células vivas se redujeron a medida que aumentaba la concentración del profármaco 5-FC, y la CI50 que inducía un 50 % de muerte celular fue de 60,4 mM. En el caso de las células madre mesenquimatosas, que era el grupo de control, se confirmó que incluso si se aumentaba la concentración de 5-FC, las células no se auto destruían, y por tanto, no se observó el efecto citototóxico.
1.2 Efecto espectador
En una placa de 12 pocillos, se cultivaron 10000 células de glioma U87MG (Korean Cell Line Bank KCLB N.° 30014) que expresaban GFP y 10000 MSC/CD o células madre mesenquimatosas (MSC). Desde el día siguiente, las células se trataron con el profármaco 5-FC a una concentración de 0 a 1000 mM, y una vez cada dos días, se reemplazaron por un medio nuevo que contenía el fármaco, y después de 6 días, se obtuvieron las células. En la figura 3A se muestra dicho método experimental resumido.
Después, usando un microscopio de fluorescencia de disección (Olympus), se tomaron imágenes de fluorescencia de células U87MG que expresaban GFP que quedaban en todo el pocillo. Después de tomar las imágenes de fluorescencia, se añadieron 200 ml de tampón de lisis pasivo 1X (Promega), el lisado celular se colocó en hielo durante 10 minutos, se transfirió a un tubo en E, se centrifugó a 12000 rpm durante 5 minutos y el sobrenadante se transfirió a un nuevo recipiente. Se transfirieron 100 ml del sobrenadante a una placa negra de 96 pocillos y usando un fluorímetro (GEMINI EM, Molecular Device), se midió el grado de fluorescencia en condiciones de excitación a 488 nm y emisión a 530 nm. Los resultados se muestran en las figuras 3B y 3C.
Como se muestra en las figuras 3B y 3C, las células U87MG cultivadas con MSC/CD mostraron una disminución en cuanto al número de células que expresaban fluorescencia y, a medida que aumentaba la concentración de 5-FC, mostraban una disminución notable en cuanto a la intensidad de fluorescencia, pero cuando las células U87MG se cultivaron con las células madre mesenquimatosas en las que no se expresó CD (citosina desaminasa), no mostraron ninguna diferencia significativa en cuanto al número de células que expresaban fluorescencia ni en cuanto a la intensidad de fluorescencia según la concentración de 5-FC. En este caso, la CI50 que inducía un 50 % de muerte celular fue de 50,48 mM. Los resultados indicaron que la MSC/CD, que es la célula madre mesenquimatosa en la que se introdujo CD, no solo mostró el efecto suicida sino también el efecto espectador en el que las células periféricas se destruyeron conjuntamente.
Ejemplo de Preparación 2. Preparación de la "célula I" y del agente terapéutico celular "célula F"
En el caso de un agente de terapia celular, el efecto puede variar dependiendo del cambio en el estado de la célula en diversas condiciones. Por lo tanto, para confirmar si la capacidad de las células se modificaba según el estado de las MSC/CD, se prepararon células en estado descongelado inmediatamente después de la congelación (en lo sucesivo en el presente documento, células F (células congeladas (Frozen)), y células en estado recogido inmediatamente a partir de las células durante el cultivo (en lo sucesivo en el presente documento, células I (células recogidas inmediatamente (Immediately)).
Para preparar el agente terapéutico celular y las células I, respectivamente, se cultivaron MSC/CD, y después, se dispensaron 2 3 106 células en 1 ml de medio de congelación que contenía DMSO del 2 al 10 % (2, 5, 10 %) o se dispensaron 2X106 en 1 ml de Cryostor CS10 (BioLife Solutions). Las células se congelaron y conservaron en un recipiente con nitrógeno líquido. En primer lugar, para obtener "células I" de MSC/CD, las células de pase 5 se disolvieron a 37 °C y se colocaron en 9 ml de medio de cultivo. Después, las células se centrifugaron a 500 g durante 5 minutos para eliminar el sobrenadante, y las células precipitadas se suspendieron en la solución de cultivo, y se dispensaron en un recipiente de cultivo de 150 mm. Al día siguiente, 1,5 X 105 células se transfirieron al recipiente de cultivo de 150 mm y una vez cada dos días se reemplazaron por medio nuevo. Después de 6 días, las células se recogieron para preparar "células I" correspondientes al pase 6.
Para obtener el agente terapéutico celular "células F", las MSC/CD congeladas y conservadas en el pase 6 a una temperatura de -130°°C o inferior, se disolvieron a 37°°C y se suspendieron en una Solución Plasmática A (CJ Healthcare Corp.) que contenía 9 ml de seroalbúmina humana, seguido de centrifugación a 500 xg durante 5 minutos, o se suspendieron en solución salina fisiológica que contenía un porcentaje final de dextrano-40 del 7,5 % (Daihan Pharm Co., Ltd.) y seroalbúmina humana al 5 % (Green Cross Corp.), seguido de centrifugación a 800 rpm durante 10 minutos. Después, el sobrenadante se eliminó y las células precipitadas se suspendieron en el medio de cultivo y se usaron. En otras palabras, el agente terapéutico celular son células que no se sometieron a la etapa de cultivo después de congelar y descongelar. Las células I y el agente terapéutico celular se lavaron dos veces, respectivamente, antes del trasplante al cerebro.
Ejemplo 1. Efecto espectador y formación de colonias de células F
1.1 Efecto espectador del agente terapéutico celular
Se realizaron experimentos para determinar si el agente terapéutico celular podía mostrar normalmente el efecto espectador de MSC/CD y si el efecto espectador aparecía de manera eficaz independientemente del método de preparación, tal como el tipo de medio. Diez mil (10000) células I preparadas mediante el método de preparación del ejemplo 2, el agente terapéutico celular de 10000 células F preparadas con medio de congelación DMSO al 10 % (DMSO) y el agente terapéutico celular de 10000 células F preparadas con Cryostor CS10 (CS10), se lavaron con una Solución Plasmática A y se cultivaron conjuntamente en placas de 12 pocillos junto con células de glioma U87/GFP en las que, para expresar fluorescencia, el gen de la GFP (Green Fluorescent Protein, proteína verde fluorescente) se transdujo en células de glioma U87MG (KCLB N.° 30014) donadas por el Korean Cell Line Bank. Desde el día siguiente, las células se trataron con el profármaco 5-FC a una concentración de 0 a 1000 mM, y una vez cada dos días, se reemplazaron por un medio nuevo que contenía el fármaco, y después de 6 días, se obtuvieron las células. Se añadieron 200 ml de tampón de lisis pasivo 1X (Promega) y las células se colocaron en hielo durante 10 minutos. El lisado celular se transfirió a un tubo en E, se centrifugó a 12000 rpm durante 5 minutos y el sobrenadante se transfirió a un nuevo recipiente. Se transfirieron 100 ml del sobrenadante a una placa negra de 96 pocillos en la que bloqueó la luz y usando un fluorímetro (GEMINI EM, Molecular Device) se midió el grado de fluorescencia en condiciones de excitación a 488 nm y de emisión 530 nm. En la figura 4 se muestra un diagrama esquemático del método experimental y del efecto espectador.
Como se muestra en la figura 4, los valores de CI50 que indican la concentración a la que se produce el 50 % de la apoptosis, fueron de 60,4 mM para las células I, de 56,2 mM para el agente terapéutico celular preparado con medio de congelación DMSO al 10 % (DMSO) y de 55,4 mM para el agente terapéutico celular preparado con Cryostor CS10 (CS10). Estos resultados indicaron que el agente terapéutico celular era un agente que podía mostrar eficazmente el efecto espectador en comparación con la célula I, y por tanto, se confirmó que el agente terapéutico celular mostraba el efecto espectador de manera más excelente en comparación con la célula I independientemente del método de preparación usando el medio DMSO o el medio CS10.
Por lo tanto, en lo sucesivo en el presente documento, el agente terapéutico celular preparado con el medio de congelación DMSO al 10 % se usó entre el agente terapéutico celular preparado en el Ejemplo de Preparación 2.
1.2. Efecto formador de colonias del agente terapéutico celular
Se realizó un ensayo de unidades formadoras de colonias para confirmar si el agente terapéutico celular preparado mediante congelación y descongelación como se indica en el Ejemplo de Preparación 2, mostraba alguna diferencia en cuanto a la capacidad proliferativa en comparación con las células I. Las células I preparadas como se indica en el Ejemplo de Preparación 2 y correspondientes al mismo pase y el agente terapéutico celular preparado con medio de congelación DMSO al 10 %, se contaron con el contador Countess (Invitrogen), y después, 100 células se colocaron en un recipiente de cultivo de 100 mm, respectivamente, y se cultivaron mientras se reemplazaba el medio por un medio nuevo una vez cada dos días. Después de 2 semanas, las células se fijaron con formol al 10 % durante 10 minutos, se lavaron con solución de tampón fosfato (Gibco), se tiñeron con una solución de violeta cristal (Sigma-Aldrich) durante 10 minutos y se lavaron tres veces con agua para obtener imágenes con el sistema Versa Doc (BioRad). Se contó visualmente el número de colonias formadas al hacer crecer una célula durante 2 semanas y se mostró en la figura 5.
Como se muestra en la figura 5, se confirmó que las células I y el agente terapéutico celular no tenían diferencias en cuanto a la capacidad de formación de colonias. Estos resultados indicaron que el aumento del efecto espectador del agente terapéutico celular en comparación con el de las células I no fue causado por un aumento en el número de células, tal como un aumento en la formación de colonias, y que el propio agente terapéutico celular mostró un efecto espectador más excelente en comparación con el de las células I.
Ejemplo 2. Efecto anticanceroso del agente terapéutico celular
2.1. Efecto anticanceroso del agente terapéutico celular en tumor cerebral
Para confirmar el efecto anticanceroso del agente terapéutico celular en tumor cerebral, se construyó un modelo de glioma ortotópico. En primer lugar, se anestesiaron ratones lampiños inmunodeficientes (animales de laboratorio esenciales) de 7 semanas de vida y sus bocas y orejas se fijaron en un marco estereotáxico. Para realizar la incisión, la cabeza se esterilizó con etanol al 70 % y se hizo una incisión vertical en la coronilla a aproximadamente 0,5 cm. Se trasplantaron 3 x 105/3 ml de células de glioma U87MG que expresaban LacZ a una tasa de 0,3 ml/min en las coordenadas cerebrales de AP = 0,5 mm, ML = -1,8 mm y DV = -3 mm, construyendo así un modelo de glioma ortotópico de tumor cerebral. El 3er día después del trasplante de las células de glioma U87MG que expresaban LacZ, el agente terapéutico celular preparado en el Ejemplo de Preparación 2 se suspendió en una Solución Plasmática A, seguido de centrifugación a 500 x g durante 5 minutos. El sobrenadante se desechó y el procedimiento de lavado se repitió una o dos veces. Después, la suspensión celular se preparó para tener una concentración de 3 x 105/6 ml. La suspensión celular se trasplantó a una tasa de 0,3 ml/min en las coordenadas cerebrales de AP = 0,5 mm, ML = -1,8 mm y DV = - 3 mm. Desde el día siguiente al trasplante de las células, durante una semana se inyectó 5-FC por vía intraperitoneal (solución salina fisiológica 15 mg/ml) a una dosis de 500 mg/kg. Para comparar el efecto anticanceroso del agente terapéutico celular, las células I preparadas en el Ejemplo de Preparación 2, se trasplantaron de la misma manera, y durante una semana desde el día siguiente al trasplante de las células, se inyectó 5-FC por vía intraperitoneal (solución salina fisiológica 15 mg/ml) a una dosis de 500 mg/kg.
Veintiocho (28) días después del trasplante de las células de glioma, los animales se anestesiaron y se realizó una perfusión con solución salina fisiológica insertando una aguja de inyección en el ventrículo izquierdo de los animales, y después, se realizó una perfusión con solución de formol al 10 %. El cerebro se extrajo y se fijó en una matriz de cerebro de ratón (Stoelting). Después, el cerebro se cortó horizontalmente a intervalos de 1 mm y se puso en el mismo líquido de fijación durante 30 minutos, fijando así el corte histológico cerebral. El corte histológico cerebral se lavó tres veces con solución salina tamponada con fosfato, se sumergió en solución salina tamponada con fosfato que contenía 20 mg/ml de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-galactopiranósido, Koma Biotech), ferrocianuro/ferricianuro de potasio 5 mM (Sigma-Aldrich), MgCb 2 mM y n P40 al 0,02 %, y se hizo reaccionar a 37 °C durante 16 horas. A través de un microscopio anatómico, se obtuvo una imagen del tumor cerebral. El tamaño del tumor se calculó usando el programa ImageJ (NIH) y la siguiente Ecuación, y los resultados se muestran en la figura 6.
, Y"1 Número de píxeles del área tumoral
Volumen tumoral (mmJ) = ^ -------- ;— ;— ;--------------———;—;------x 0,5 mm
Z—i Número de píxeles por unidad de área
Como se muestra en la figura 6, en el grupo con trasplante de agente terapéutico celular, el volumen del tumor cerebral se redujo notablemente, y se mostró un efecto más excelente en comparación con el de las células I (B). El tamaño medio calculado del tumor fue de 91,3 mm3 en el grupo de control con vehículo, de 1,5 mm3 en el grupo de comparación de trasplante de células I, pero de 0,6 mm3 en el grupo de animales con trasplante de agente terapéutico celular. Es decir, según los resultados in vivo, se confirmó que el agente terapéutico celular tenía un efecto reductor tumoral dos veces mayor que el de las células I entre las MSC/CD, y que el agente terapéutico celular podría ser un agente anticanceroso más eficaz.
2.2. Efecto anticanceroso del agente terapéutico celular en cáncer de hígado
En 100 ml de una solución de tampón fosfato que contenía Matrigel (BD) al 20 %, se suspendieron 1 x 105 células de cáncer de hígado Huh7 (KCLB N.° 60104), y se trasplantaron por vía subcutánea en ratones lampiños (Balb/c lampiños) inmunodeficientes de 7 semanas de vida. Catorce (14) días después del trasplante, cuando el tamaño del tumor alcanzó un tamaño de 10 a 100 mm3, se inyectaron las células I y el agente terapéutico celular preparados en el Ejemplo de Preparación 2. Más específicamente, las células I y el agente terapéutico celular preparados en el Ejemplo de Preparación 2, se suspendieron en la solución de tampón fosfato, seguido de centrifugación a 500 x g durante 5 minutos. Este procedimiento se repitió dos veces, y después las células I o el agente terapéutico celular se prepararon para tener una concentración de 1 x 106/100 ml en la solución de tampón fosfato y usando una jeringa se inyectaron directamente en el tumor. Desde el siguiente día a la inyección de las células I y del agente terapéutico celular, durante una semana se inyectó 5-FC por vía intraperitoneal (solución salina fisiológica 15 mg/ml) a una dosis de 500 mg/kg. El tamaño del tumor se midió una o dos veces por semana usando un calibrador digital, y el volumen tumoral se calculó usando la siguiente Ecuación, y los resultados se muestran en la figura 7.
Volumen tumoral subcutáneo (mm3) = Anchura (mm) x Longitud (mm) x Altura (mm) 6
[Para medir el volumen tumoral, véase Cancer Chemother. Pharmacol. (1989) 24: 148-154]
Como se muestra en la figura 7 A, el volumen tumoral disminuyó de manera más eficaz en el grupo de experimentación tratado con el agente terapéutico celular, confirmando que el agente terapéutico celular tenía un efecto anticanceroso más excelente que el de la célula I. Como se muestra en la figura 7 B, el aumento del efecto anticanceroso se confirmó visualmente en el modelo de tumor subcutáneo trasplantado con las células de cáncer de hígado y, por tanto, se confirmó que el efecto terapéutico del agente terapéutico celular fue excelente (*, p < 0,05 en comparación con el grupo tratado con PBS).
2.3. Efecto anticanceroso del agente terapéutico celular en cáncer de páncreas
Las células de cáncer de páncreas BxPC3 (ATCC N.° CRL-1687™) tenían una tasa de crecimiento rápida y una ulceración grave por lo que se inyectaron simultáneamente 1 x 106 células de cáncer de páncreas BxPC3, células I y el agente terapéutico celular. Más específicamente, las células I y el agente terapéutico celular preparados en el Ejemplo de Preparación 2, se suspendieron en la solución de tampón fosfato, seguido de centrifugación a 500 x g durante 5 minutos. Este procedimiento se repitió dos veces, y después se prepararon las células I o el agente terapéutico celular para tener una concentración de 1 x 106/100 ml en la solución de tampón fosfato. En 100 ml de una solución de tampón fosfato que contenía Matrigel (BD) al 20 %, se suspendieron 1 x 106 células I o agente terapéutico celular, y se trasplantaron simultáneamente por vía subcutánea en ratones lampiños (Balb/c lampiños) inmunodeficientes de 7 semanas de vida. Desde el siguiente día a la inyección de las células, durante una semana se inyectó 5-FC por vía intraperitoneal (solución salina fisiológica 15 mg/ml) a una dosis de 500 mg/kg.
El volumen tumoral se midió de la misma manera que la del Ejemplo 2.2, y el cambio de volumen tumoral medido se mostró en la figura 8A.
Como se muestra en la figura 8 A, el volumen tumoral disminuyó de manera más eficaz en el grupo de experimentación tratado con el agente terapéutico celular, confirmando que el agente terapéutico celular tenía un efecto anticanceroso más excelente que el de la célula I y que tenía un efecto terapéutico excelente en el modelo de tumor subcutáneo de cáncer de páncreas (*, p < 0,05 en comparación con el grupo tratado con PBS).
2.4. Efecto anticanceroso del agente terapéutico celular en cáncer de pulmón
En 100 ml de una solución de tampón fosfato que contenía Matrigel (BD) al 20 %, se suspendieron 5 x 106 células de cáncer de pulmón A549 (ATCC N.° CCL-185™), y se trasplantaron por vía subcutánea en ratones lampiños (Balb/c lampiños) inmunodeficientes de 7 semanas de vida. Ocho (8) días después del trasplante, cuando el tamaño del tumor alcanzó de 20 a 50 mm3, se inyectaron las células I y el agente terapéutico celular preparados en el Ejemplo de Preparación 2. Más específicamente, las células I y el agente terapéutico celular preparados en el Ejemplo de Preparación 2, se suspendieron en la solución de tampón fosfato, seguido de centrifugación a 500 x g durante 5 minutos.
Este procedimiento se repitió dos veces, y después las células I o el agente terapéutico celular se prepararon para tener una concentración de 1 x 106/100 ml en la solución de tampón fosfato y usando una jeringa se inyectaron directamente en el tumor. Desde el siguiente día a la inyección de las células I y del agente terapéutico celular, durante una semana se inyectó 5-FC por vía intraperitoneal (solución salina fisiológica 15 mg/ml) a una dosis de 500 mg/kg. El volumen tumoral se midió de la misma manera que la del Ejemplo 2.2, y el cambio de volumen tumoral medido se mostró en la figura 8B.
Como se muestra en la figura 8 B, el volumen tumoral disminuyó de manera más eficaz en el grupo de experimentación tratado con el agente terapéutico celular, confirmando que el agente terapéutico celular tenía un efecto anticanceroso más excelente que el de la célula I y que tenía un efecto terapéutico excelente en el modelo de tumor subcutáneo de cáncer de pulmón (*, p < 0,05 en comparación con el grupo tratado con PBS).
2.5. Efecto anticanceroso del agente terapéutico celular en cáncer de colon
En 100 ml de una solución de tampón fosfato que contenía Matrigel (BD) al 20 %, se suspendieron 5 x 106 células de cáncer de colon HT29 (ATCC N.° HTB-38™), y se trasplantaron por vía subcutánea en ratones lampiños (Balb/c lampiños) inmunodeficientes de 7 semanas de vida. Después del trasplante, cuando el tamaño del tumor alcanzó de 40 a 100 mm3, se inyectaron las células I y el agente terapéutico celular preparados en el Ejemplo de Preparación 2. Más específicamente, las células I y el agente terapéutico celular preparados en el Ejemplo de Preparación 2, se suspendieron en la solución de tampón fosfato, seguido de centrifugación a 500 x g durante 5 minutos.
Este procedimiento se repitió dos veces, y después las células I o el agente terapéutico celular se prepararon para tener una concentración de 1 x 106/100 ml en la solución de tampón fosfato y usando una jeringa se inyectaron directamente en el tumor. Desde el siguiente día a la inyección de las células I y del agente terapéutico celular, durante una semana se inyectó 5-FC por vía intraperitoneal (solución salina fisiológica 15 mg/ml) a una dosis de 500 mg/kg. El volumen tumoral se midió de la misma manera que la del Ejemplo 2.2, y el cambio de volumen tumoral medido se mostró en la figura 8C.
Como se muestra en la figura 8 C, el volumen tumoral disminuyó de manera más eficaz en el grupo de experimentación tratado con el agente terapéutico celular, confirmando que el agente terapéutico celular tenía un efecto anticanceroso más excelente que el de la célula I y que tenía un efecto terapéutico excelente en el modelo de tumor subcutáneo de cáncer de colon (*, p < 0,05 en comparación con el grupo tratado con PBS, y #, p < 0,05 en comparación con el grupo tratado con células I).
A partir de los resultados anteriores, se confirmó que el agente terapéutico celular tenía un excelente efecto anticanceroso en varios tipos de cáncer tales como tumor cerebral, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de colon, y mostró un efecto anticanceroso más excelente en todos los tipos de cáncer en comparación con la célula I.
Ejemplo 3. Efecto sinérgico de la politerapia del agente terapéutico celular (in vitro)
3.1 Politerapia in vitro con temozolomida
En una placa de 12 pocilios se cultivaron 10000 células de glioma U87MG (Korean Cell Line Bank KCLB N.° 30014) que expresaban GFP y 10000 células F del agente terapéutico celular o células madre mesenquimatosas (MSC). Al día siguiente, las células se trataron con temozolomida (TMZ) a una concentración de 0 a 1000 mM y el profármaco 5-FC a una concentración de 0 a 1000 mM, y una vez cada dos días se reemplazaron por un medio nuevo que contenía el fármaco y después de 6 días, se obtuvieron las células. En la figura 9 A se muestra un diagrama esquemático de este experimento. Usando un microscopio de fluorescencia de disección (Olympus), se tomaron imágenes de fluorescencia de células U87MG que expresaban GFP que quedaban en todo el pocillo, y la muerte celular se confirmó. Los resultados se muestran en la figura 9 D.
Como se muestra en la figura 9 D, se confirmó que la expresión de fluorescencia disminuyó de acuerdo con un aumento en la concentración del tratamiento con temozolomida y un aumento en la concentración del tratamiento con 5-FC, y el efecto espectador del agente terapéutico celular fue elevado debido a la administración combinada con temozolomida.
Después de tomar las imágenes de fluorescencia, se añadieron 200 ml de tampón de lisis pasivo 1x (Promega) y las células se colocaron en hielo durante 10 minutos. El lisado celular se transfirió a un tubo en E, se centrifugó a 12 000 rpm durante 5 minutos y el sobrenadante se transfirió a un nuevo recipiente. Se transfirieron 100 ml del sobrenadante a una placa negra de 96 pocillos y usando un fluorímetro (GEMINI EM, Molecular Device) se midió la intensidad de fluorescencia en condiciones de excitación a 488 nm y de emisión a 530 nm (B y C de la figura 9). Los valores reales de CI50 obtenidos mediante el tratamiento conjunto de los dos tipos de agentes anticancerosos se expresaron como un isobolograma. La línea continua que une los valores de CI50 en el isobolograma cuando el agente anticanceroso se trató solo, es una línea aditiva teórica, lo que significa que cuando los valores obtenidos al tratar simultáneamente dos agentes anticancerosos están en la línea continua, simplemente hay un efecto aditivo. Por otro lado, significa que cuando el valor está por debajo de la línea continua, hay un efecto sinérgico y, a la inversa, cuando el valor está por encima de la línea continua, hay un efecto antagónico. Los resultados se muestran en la figura 9E.
Como se muestra en la figura 9 E, todos los puntos marcados cuando la MSC/CD se trató con 5-FC y temozolomida en combinación, estaban presentes en el lado inferior en comparación con los valores de CI50cuando el agente anticanceroso se trató solo, lo que confirmó que hubo un efecto sinérgico que era más excelente que el efecto aditivo obtenido mediante el tratamiento sencillo conjunto con los dos agentes anticancerosos.
3.2 Politerapia in vitro con Carmustina (BCNU)
En una placa de 12 pocillos se cultivaron 10000 células de glioma U87MG que expresaban GFP, es decir, U87/GFP (Korean Cell Line Bank KCLB N.° 30014) y 10000 células F del agente terapéutico celular o células madre mesenquimatosas (MSC). Desde el día siguiente, las células se trataron con Carmustina (BCNU, Sigma) a una concentración de 0 a 300 mM y el profármaco 5-FC a una concentración de 0 a 300 mM, y se cultivaron durante 6 días mientras una vez cada dos días se reemplazaba por un medio nuevo que contenía el fármaco. El séptimo día, la solución de cultivo se eliminó, A continuación, a cada pocillo se añadieron 200 ml de tampón de lisis pasivo 1X (Promega), y cada pocillo se dejó reposar a 4 °C durante 10 minutos. El lisado celular se recogió y se centrifugó a 12 000 rpm durante 5 minutos para obtener un sobrenadante. Se transfirieron 100 ml del sobrenadante a una placa negra de 96 pocillos en la que se bloqueó la luz y usando un fluorímetro (GEMINI EM, Molecular Device) se midió la intensidad de fluorescencia en condiciones de excitación a 488 nm y de emisión a 530 nm. En la figura 10 A se muestra un diagrama esquemático de este experimento.
Los valores reales de CI50 obtenidos con el tratamiento conjunto de los dos tipos de agentes anticancerosos se expresaron como un isobolograma, y los resultados se mostraron en la figura 10B.
Como se muestra en la figura 10 B, todos los puntos marcados cuando U87/GFP se trató con [el agente terapéutico celular (MSC/CD) 5-FC] y carmustina en combinación, estaban presentes en el lado inferior de la línea continua en comparación con los valores de CI50 cuando el agente anticanceroso se trató solo, lo que confirmó que hubo un efecto sinérgico que era más excelente que el efecto aditivo obtenido mediante el tratamiento sencillo conjunto con los dos agentes anticancerosos.
3.3 Politerapia in vitro con Irinotecán
En una placa de 12 pocillos se cultivaron 10000 U87/GFP y 10000 células F del agente terapéutico celular (MSC/CD). Desde el día siguiente, las células se trataron con Irinotecán (Sigma) a una concentración de 0 a 30 mM y el profármaco 5-FC a una concentración de 0 a o 300 mM y se cultivaron durante 6 días mientras una vez cada dos días se reemplazaban por un medio nuevo que contenía el fármaco. El séptimo día, la solución de cultivo se eliminó, A continuación, a cada pocillo se añadieron 200 ml de tampón de lisis pasivo 1X, y cada pocillo se dejó reposar a 4 °C durante 10 minutos. El lisado celular se recogió y se centrifugó a 12000 rpm durante 5 minutos para obtener el sobrenadante. Se transfirieron 100 ml del sobrenadante a una placa negra de 96 pocillos en la que se bloqueó la luz y usando un fluorímetro (GEMINI EM) se midió la intensidad de fluorescencia en condiciones de excitación a 488 nm y de emisión a 530 nm. Los valores reales de CI50 obtenidos con el tratamiento conjunto de los dos tipos de agentes anticancerosos se expresaron como un isobolograma, y los resultados se mostraron en la figura 10 C.
Como se muestra en la figura 10 C, el valor de CI50 obtenido con el tratamiento con Irinotecán sólo fue de 3,2 mM y el valor de CI50 obtenido con el tratamiento con 5-FC fue de 73,6 mM, y estos valores de CI50 se unieron en el isobolograma para obtener una línea aditiva teórica que representa un simple efecto aditivo. Los valores de CI50 obtenidos cuando las células U87/GFP se trataron con [agente terapéutico celular (MSC/CD) 5-FC] e irinotecán en combinación, estaban presentes en el lado inferior de la línea continua en comparación con los valores de CI50 cuando el agente anticanceroso se trató solo, lo que confirmó que hubo un efecto sinérgico que era más excelente que el efecto obtenido mediante el tratamiento sencillo conjunto con los dos agentes anticancerosos.
Dado que la temozolomida, la carmustina y el irinotecán son conocidos como agentes anticancerosos que actúan sobre las células en proliferación, si afectan a la supervivencia no sólo de las células U87/GFP sino también del agente terapéutico celular proliferante, el efecto anticanceroso del [agente terapéutico celular (MSC/CD) 5-FC] podría verse reducido. Sin embargo, al contrario de lo que se esperaba, a partir de la figura 9 E, se confirmó que cuando se usó [agente terapéutico celular (MSC/CD) 5-Fc ] junto con temozolomida, se podía obtener un efecto sinérgico bastante elevado en comparación con la administración del agente anticanceroso solo o en combinación. Es decir, el efecto sinérgico es un efecto inesperado que no se puede esperar en las politerapias existentes.
3.4 Politerapia in vivo con temozolomida
Los efectos sinérgicos confirmados en las descripciones anteriores de 3.1 a 3.3 se confirmaron y verificaron también in vivo. Seis (6) días después del trasplante de las células de glioma U87MG que expresan LacZ, el agente terapéutico celular preparado en el Ejemplo de Preparación 2 se suspendió en una Solución Plasmática A, seguido de centrifugación a 500 x g durante 5 minutos. El sobrenadante se desechó y el procedimiento de lavado se repitió dos veces. Después, la suspensión celular se preparó para tener una concentración de 3x 105/6 ml. La suspensión celular se trasplantó a una tasa de 0,3 ml/min en las coordenadas cerebrales de AP = 0,5 mm, ML = - 1,8 mm y DV = -3 mm. Desde el siguiente día al trasplante de las células, durante una semana se inyectó 5-FC por vía intraperitoneal (solución salina fisiológica 15 mg/ml) a una dosis de 500 mg/kg. Después de 4 días, se inyectó temozolomida (1 mg/ml en DMSO: solución salina fisiológica = 1:1) por vía intraperitoneal a una dosis de 5 mg/kg durante 5 días. El día 28, se obtuvieron tejidos cerebrales de 8 animales en cada grupo de animales y para medir el tamaño del tumor cerebral se realizó tinción con X-gal de la misma manera que en el Ejemplo 2. El procedimiento experimental se muestra en la figura 11 A, y los cambios del tamaño del tumor cerebral medido se muestran las figuras 11 A y C.
Como se muestra en las figuras 11 A y C, el tamaño promedio de los tumores del grupo de animales tratados con control de vehículo fue de 59,8 m3, mientras que el del grupo de animales a los que se trasplantó el agente terapéutico celular fue de 11,8 mm3, el tamaño promedio del grupo de animales tratados solo con temozolomida fue de 9,9 mm3, y el tamaño medio del grupo de animales a los que se trasplantó el agente terapéutico celular temozolomida fue de 2,7 mm3. El grupo de animales en los que se trasplantó la politerapia de agente terapéutico celular y temozolomida tuvo el tamaño promedio más reducido del tumor, y mostró el efecto anticanceroso más excelente.
Asimismo, se midió la tasa de supervivencia según el tratamiento del tumor cerebral hasta los 90 días, y los resultados se compararon en cada grupo experimental y se muestran en la figura 11 D.
Como se muestra en la figura 11 D, la mediana de supervivencia del grupo de control fue de 32 días, pero se prolongó a 42 días en el grupo de tratamiento con el agente terapéutico celular y a 42 días en el grupo de tratamiento con temozolomida. En particular, la mediana de supervivencia se prolongó a 70 días en el grupo con la politerapia de células F y temozolomida, y se observó una mejora notable en la tasa de supervivencia incluso en comparación con el grupo tratado solo con el agente anticanceroso y con el grupo de control.
Esto sugiere que la politerapia con células F mostró un efecto notablemente excelente incluso en la politerapia con los agentes anticancerosos existentes y, por tanto, la politerapia con células F puede utilizarse como remedio para mejorar la quimioterapia existente.
Ejemplo 4. Efecto de las células F sobre el tratamiento de tumores subcutáneos
Para determinar si el agente terapéutico celular podría mostrar el efecto anticanceroso en tumores distintos del tumor cerebral, se trasplantaron células de glioma U87MG en tejido subcutáneo para construir un modelo de cáncer no cerebral. En 100 ml de una solución de tampón fosfato que contenía Matrigel (BD) al 20 %, se suspendieron 1 x 106 células de glioma U87MG, y se trasplantaron por vía subcutánea en ratones lampiños inmunodeficientes de 7 semanas de vida. El tamaño del tumor se midió dos veces por semana usando un calibrador digital, y el volumen tumoral se calculó usando la siguiente Ecuación.
Volumen tumoral subcutáneo (mm3) = Anchura (mm) x Longitud (mm) x Altura (mm) 6
Cuando 20 días después de que se trasplantaran las células de glioma U87MG en el tejido subcutáneo el tamaño del tumor alcanzó los 30 mm3 o un tamaño superior, las células I y las células F preparadas en el Ejemplo de Preparación 2, se suspendieron en una Solución Plasmática A, y se centrifugaron a 500 x g durante 5 minutos. Este procedimiento se repitió dos veces, y después las células I o el agente terapéutico celular se prepararon para tener una concentración de 1 x 106/100 ml de células F en la Solución Plasmática A y se inyectaron directamente en el tumor usando una jeringa. Desde el siguiente día a la inyección de las células I y del agente terapéutico celular, durante una semana se inyectó 5-FC por vía intraperitoneal (solución salina fisiológica 15 mg/ml) a una dosis de 500 mg/kg. Después de una semana de suspender la administración de 5-FC, durante 5 días se inyectó temozolomida (Sigma-Aldrich) por vía intraperitoneal a una dosis de 5 mg/kg. Dicho método experimental se muestra resumido en la figura 12 A. El cambio de volumen tumoral medido se muestra en la figura 12 B. En la figura 12 C se muestra el gráfico de supervivencia de Kaplan Meier obtenido midiendo la longevidad de los ratones lampiños en el modelo de tumor subcutáneo.
Como se muestra en la figura 12 B, se confirmó que el volumen tumoral disminuyó de manera más eficaz en el grupo de experimentación tratado con el agente terapéutico celular hasta el día 11 antes de la administración de la temozolomida, y que el agente terapéutico celular mostró un efecto anticanceroso más excelente que con las células I. Además, veintiún (21) días después de la administración de temozolomida, se confirmó que el efecto inhibidor del volumen tumoral en el grupo de tratamiento con el agente terapéutico celular era muy notable en comparación con el del grupo sin tratamiento (el grupo de control) y con el del grupo de tratamiento con células I. Asimismo, como se muestra en la figura 12 C, la mediana de supervivencia del grupo de control fue de 23 días, y la mediana de supervivencia del grupo de tratamiento con células I fue de 30 días, mientras que el grupo de tratamiento con el agente terapéutico celular mostró una mediana de supervivencia de 58 días y, por tanto, el efecto de prolongación de la vida también fue mayor en el grupo de animales tratados con el agente terapéutico celular. Por lo tanto, se puede apreciar que el agente terapéutico celular tiene un excelente efecto terapéutico en el modelo de tumor subcutáneo y, en particular, muestra un efecto terapéutico sinérgico a través de la politerapia con temozolomida, lo que demuestra la superioridad de la politerapia con agentes terapéuticos celulares en otros órganos, lo cual es difícil de esperar a partir de un experimento in vitro únicamente.

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Un método para preparar un agente terapéutico celular que comprende:
1) introducir citosina desaminasa (CD) en una célula madre mesenquimatosa (MSC) para preparar una célula madre mesenquimatosa/citosina desaminasa (MSC/CD) y después cultivarla;
2) congelar la MSC/CD cultivada para preparar una MSC/CD congelada; y
3) descongelar y suspender la m Sc /c D congelada para preparar un agente terapéutico celular,
en el que la MSC/CD no se somete a cultivo celular después de congelar y descongelar.
2. Agente terapéutico celular para su uso en la prevención o el tratamiento del cáncer que comprende:
administrar el agente terapéutico celular a un sujeto que necesite tratamiento; y administrar 5-fluorocitosina (5-FC) a un sujeto que necesite tratamiento,
en el que el agente terapéutico celular se prepara según la reivindicación 1, que comprende:
1) introducir citosina desaminasa (CD) en una célula madre mesenquimatosa (MSC) para preparar una célula madre mesenquimatosa/citosina desaminasa (MSC/CD) y después cultivarla;
2) congelar la MSC/CD cultivada para preparar una MSC/CD congelada; y
3) descongelar y suspender la MSC/CD congelada para preparar un agente terapéutico celular, en el que la MSC/CD no se somete a cultivo celular después de congelar y descongelar.
3. El agente terapéutico para su uso según la reivindicación 2, que además comprende, administrar un agente anticanceroso a un sujeto que necesite tratamiento.
4. El agente terapéutico para su uso según la reivindicación 2, que además comprende, administrar un agente anticanceroso a un sujeto que necesite tratamiento, antes de la administración del agente terapéutico celular o simultáneamente con la administración del agente terapéutico celular.
5. El agente terapéutico para su uso según la reivindicación 3, en el que el agente anticanceroso es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en mostaza nitrogenada, imatinib, oxaliplatino, rituximab, elotinib, trastuzumab, gefitinib, bortezomib, sunitinib, carboplatino, sorafenib, bevacizumab, cetuximab, muérdago blanco (Viscum album), asparaginasa, tretinoína, hidroxicarbamida, dasatinib, estramustina, gemtuzumab ozogamicina, ibritumomab tiuxetán, heptaplatino, ácido metil aminolevulínico, amsacrina, alemtuzumab, procarbazina, alprostadilo, quitosano de nitrato de holmio, gemcitabina, doxifluridina, pemetrexed, tegafur, capecitabina, gimeracilo, oteracilo, azacitidina, citarabina, fludarabina, enocitabina, decitabina, mercaptopurina, tioguanina, cladribina, carmofur, raltitrexed, docetaxel, paclitaxel, belotecán, topotecán, vinorrelbina, etopósido, vincristina, vinblastina, tenifocide, idarrubicina, epirrubicina, mitoxantrona, mitomicina, bleomicina, daunorrubicina, dactinomicina, pirarrubicina, aclarrubicina, pepromicina, temozolomida, busulfán, ifosfamida, ciclofosfamida, melfalán, altretamina, dacarbacina, tiotepa, nimustina, clorambucilo, mitolactol, taxotere, gleevec, taxol, herceptina, tarceva, avastin, zoladex, adriamicina, irinotecán, 10058-F4, cisplatino, ciclofosfamida, un agente anticanceroso basado en nitrosourea, metotrexato, carmustina (BCNU), lomustina (CCNU) y doxorrubicina.
6. El agente terapéutico para su uso según la reivindicación 2, en el que el agente terapéutico celular y la 5-fluorocitosina se administran simultánea o secuencialmente.
7. El agente terapéutico para su uso según la reivindicación 3, en el que la 5-fluorocitosina y el agente anticanceroso se administran simultánea o secuencialmente.
8. El agente terapéutico para su uso según la reivindicación 3, en el que la administración del agente terapéutico celular se repite con un ciclo de 10 a 30 días.
9. El agente terapéutico para su uso según la reivindicación 2, en el que el cáncer es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en cáncer epidermoide, cáncer microcítico de pulmón, cáncer no microcítico de pulmón, cáncer de pulmón, cáncer peritoneal, cáncer colorrectal, tumor biliar, cáncer nasofaríngeo, cáncer de laringe, cáncer bronquial, cáncer oral, osteosarcoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer de riñón, leucemia, cáncer de vejiga, melanoma, cáncer de cerebro, glioma, tumor cerebral, cáncer de piel, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de hígado, cáncer de hueso, cáncer de esófago, cáncer de colon, cáncer gástrico, cáncer de cuello uterino, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de cabeza y cuello, y cáncer de recto.
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