ES2861355T3 - Método y composición - Google Patents
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Abstract
Un método para identificar un componente de material genético, comprendiendo el método las etapas de: (a) poner en contacto una composición que comprende una célula o cápside con una composición que comprende: (i) un compuesto de amonio cuaternario; (b) poner en contacto la composición obtenida en la etapa (a) con una composición que comprende un agente de lavado proteico; y (c) usar el material obtenido en la etapa (b) en un método de amplificación; en donde no hay etapas de purificación entre la etapa (b) y la etapa (c); en donde en la etapa (b) la composición obtenida en la etapa (a) se añade a una composición que comprende el agente de lavado proteínico en una relación de 10:1 a 1:100.
Description
DESCRIPCIÓN
Método y composición
La presente invención se refiere a métodos y composiciones para usar en la extracción de ADN y/o ARN.
Los métodos de extracción de ADN son bien conocidos en la técnica y tienen diversas aplicaciones en diagnóstico, productos farmacéuticos e investigación. Por ejemplo, dichos métodos se usan en la modificación genética de plantas y animales, para el diagnóstico de muchas afecciones médicas, en la fabricación de una serie de productos farmacéuticos y en la huella genética y en investigaciones de escenas de crimen. En la mayoría de estos métodos es necesario amplificar el ADN o ARN extraído y típicamente el ADN o ARN extraído se debe purificar antes de usar en un procedimiento de amplificación.
Los procedimientos de la técnica anterior para obtener ADN y/o ARN para usar en métodos de amplificación implican varias etapas, que incluyen una etapa de purificación. Esta puede necesitar usar perlas magnéticas, perlas de sílice o centrifugación.
En muchas aplicaciones, el ADN o ARN purificado aislado se usa en un método de PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Los métodos de PCR son muy conocidos por los expertos en la técnica. Para muchas técnicas de PCR, es esencial una muestra que tenga un alto grado de pureza para lograr resultados fiables. Este también es el caso para la clonación y secuenciación y otras técnicas de amplificación tales como la amplificación isotérmica.
Los problemas con los métodos actuales de extracción de ADN y/o ARN incluyen la complejidad del procedimiento de múltiples etapas, la cantidad de tiempo necesario para completar el procedimiento, el coste de los reactivos e instrumentos requeridos y los rendimientos potencialmente bajos de ADN o ARN ya que se puede perder material durante las etapas de purificación.
El documento WO2014/155078 describe un método de extracción de ADN/ARN usando compuestos de amonio cuaternario sililado.
El documento WO2016/051177 describe un método de detección e identificación de uno o más microorganismos en una muestra biológica.
Es un objetivo de la presente invención proporcionar un método de extracción de ADN y/o ARN de una célula o cápside que supere al menos una de las desventajas de la técnica anterior.
La presente invención busca, en particular, proporcionar un método para obtener ADN y/o ARN que se pueda usar directamente en un procedimiento de amplificación, por ejemplo, un método para obtener ADN y/o ARN que se pueda usar directamente en PCR, métodos de secuenciación o clonación. El ADN y/o ARN también se podrían usar en procedimientos de amplificación tales como amplificación isotérmica, amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), amplificación dependiente de helicasa (HDA) y reacción de amplificación con enzimas de corte (NEAR).
También sería deseable proporcionar ADN y/o ARN que se puedan usar en aplicaciones de chip-en-chip y sondas de hibridación.
Según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un método de identificación de un componente de material genético, comprendiendo el método las etapas de:
(a) poner en contacto una composición que comprende una célula o cápside con una composición que comprende (i) un compuesto de amonio cuaternario o un precursor del mismo; y
(b) poner en contacto la composición obtenida en la etapa (a) con una composición que comprende un agente de lavado proteico, y
(c) usar el material obtenido en la etapa (b) en un método de amplificación;
en donde no hay etapas de purificación entre la etapa (b) y la etapa (c);
en donde en la etapa (b) la composición obtenida en la etapa (a) se añade a una composición que comprende el agente de lavado proteico en una relación de 10:1 a 1:100.
El método de la presente invención puede implicar la extracción de ADN. El método puede implicar la extracción de ARN. El método de la presente invención puede implicar la extracción de ADN y ARN.
El ADN y/o ARN se pueden extraer de cualquier célula o cápside adecuada. Las cápsides son las cubiertas de proteínas de los virus que encierran el material genético. El virus puede ser cualquier virus adecuado.
Las células se pueden seleccionar de células procariotas, eucariotas o arqueas. Las células se pueden obtener de bacterias Gram positivas o Gram negativas, micobacterias, micoplasma, hongos u organismos parásitos; o de animales o plantas. Las células pueden ser células animales, por ejemplo, células derivadas de seres humanos, mamíferos u otros animales. Las células pueden ser células vegetales. Las células pueden ser una célula de tejido humano o animal. Las células se pueden seleccionar de células de tejido conjuntivo, muscular, nervioso o epitelial. Las células se pueden obtener de un fluido corporal de un ser humano o animal, por ejemplo sangre, moco, esputo, orina, vómito u otros excrementos.
Las bacterias Gram negativas de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, bacterias de los géneros Bacteroides, Bartonella, Bordetella, Borrelia, Brucella, Campylobacter, Chlamydia, Escherichia, Francisella, Haemophilus, Helicobacter, Klebsiella, Legionella, Leptospira, Moraxella, Neisseria, Pasteurella, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Spirillum, Streptobacillus, Treponema, Vibro y Yersinia.. Las bacterias Gram positivas de ejemplo incluyen, pero no se limitan a bacterias de los géneros Actinomyces, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Listeria, Nocardia, Peptostreptococcus, Propionibacterium, Staphylococcus, Streptococcus y Streptomyces.
Las células fúngicas de ejemplo incluyen cualquier especie de Aspergillus Las células de levadura de ejemplo incluyen, pero no se limitan a cualquier especie de Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Schwanniomyces.
Las células parasitarias incluyen, pero no se limitan a las que pertenecen a los géneros Acanthamoeba, Ancylostoma, Ascaradia, Babesia, Balamuthia, Balantidium, Brugia, Clonorchis, Cryptosporidium, Dicrocoelium, Dicytocaulus, Dientamoeba, Diphylobothrium, Dirofilaria, Echinococcus, Echinostoma, Entamoeba, Enterobius, Fasciola, Fascioloides, Giardia, Hymenolepsis, Isospora, Leishmania, Mesocestoides, Moniezia, Necator, Naegleria, Onchocerca, Opisthorchis, Paragonimus, Plasmodium, Rhabditida, Schistosoma, Spirurida, Strongyloides, Taenia, Trichomonas, Trichuris, Toxocara, Trypanosoma, Uncinaria y Wuchereria.
Las células pueden ser células de tejido conjuntivo. Las células del tejido conjuntivo incluyen células de almacenamiento tales como células adiposas marrones o blancas y lipocitos hepáticos, células secretoras de matriz extracelular (MEC) tales como fibroblastos, condrocitos y osteoblastos, y células sanguíneas/del sistema inmunitario tales como linfocitos (linfocitos T, linfocitos B, o células plasmáticas), granulocitos tales como basófilos, eosinófilos y neutrófilos y monocitos. Las células pueden ser una célula epitelial. Los tipos de células epiteliales incluyen células glandulares especializadas para la secreción tales como células epiteliales glandulares endocrinas y exocrinas, y epiteliales de la superficie tales como células epiteliales de la superficie queratinizantes y no queratinizantes. Las células pueden ser una célula de tejido nervioso. Las células del tejido nervioso incluyen células gliales y neuronas del sistema nervioso central o periférico. Las células pueden ser células musculares. Las células de tejido muscular incluyen células de músculo esquelético, cardiaco y liso. Muchos de estos tipos de células se pueden dividir adicionalmente. Las células pueden ser de origen endodérmico, mesodérmico o ectodérmico. Las células pueden ser células madre o células diferenciadas maduras. Las células madre de ejemplo incluyen células madre hematopoyéticas, células madre neurales y células madre mesenquimales. Los tipos de células diferenciadas maduras de ejemplo incluyen adipocitos tales como células de la grasa blanca o células de la grasa marrón, miocitos cardiacos, condrocitos, células endoteliales, células de glándulas exocrinas, fibroblastos, hepatocitos, queratinocitos, macrófagos, monocitos, melanocitos, neuronas, neutrófilos, osteoblastos, osteoclastos, células de los islotes pancreáticos tales como células beta, miocitos esqueléticos, células de músculo liso, células B, células plasmáticas, linfocitos T tales como células reguladoras, citotóxicas y auxiliares y dendríticas.
Los virus pueden ser un virus de ADN o un virus de ARN. Los virus incluyen, pero no se limitan a, los de las familias Adenoviridae, Arenaviradae, Arteriviridae, Ascoviridae, Asfarviridae, Astroviridae, Baculoviridae, Barnaviridae, Birnaviridae, Bornaviridae, Bromoviridae, Bunyaviridae, Caliciviridae, Caulimoviridae, Comoviridae, Coronaviridae, Chrysoviridae, Circoviridae, Closteroviridae, Cystoviridae, Dicistroviridae, Entomopoxvirinae, Filoviridae, Flaviviridae, Flexiviridae, Geminiviridae, Guttaviridae, Hepadnaviridae, Hepeviridae, Herpesviridae, Hypoviridae, Iflaviridae, Inoviridae, Iridoviridae, Leviviridae, Luteoviridae, Marnaviridae, Microviridae, Mimiviridae, Myoviridae, Nanoviridae, Narnaviridae, Nidovirales, Nimaviridae, Orthomyxoviridae, Papovaviridae, Papillomaviridae, Parvoviridae, Paramyxoviridae, Picornaviridae, Podoviridae, Polyomaviridae, Potyviridae, Poxyiridae, Pseudoviridae, Reoviridae, Retroviridae, Rhabdoviridae, Roniviridae, Rudiviridae, Sequiviridae, Siphoviridae, Tetraviridae, Togaviridae, Tombusviridae, Totiviridae y Tymoviridae. Los virus de ejemplo incluyen, pero no se limitan a adenovirus, virus de la viruela bovina, virus del dengue, virus del ébola, virus de Epstein-Barr, fago T4 de enterobacterias, virus de la fiebre aftosa, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus del herpes simple tipo 1, virus del herpes simple tipo 2, adenovirus humano C, virus linfotrófico b humano, virus de inmunodeficiencia humana, poliovirus humano, virus linfotrófico de células T humanas, virus de necrosis hematopoyética infecciosa, virus de necrosis pancreática infecciosa, virus de influenza tipos A, B y C, virus ME, virus del sarampión (virus de la rubéola), mengovirus, virus de las paperas, virus del mixoma, virus del papiloma, virus de parainfluenza, poliovirus, virus de la rabia, rinovirus, rotavirus, virus de la rubéola y virus de la fiebre amarilla.
Las células o cápsides pueden ser indicativas de enfermedad. En algunas realizaciones, las células pueden ser células cancerosas. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a cánceres derivados de células cerebrales, células epiteliales (carcinoma), tejido conjuntivo (sarcoma), células hematopoyéticas (linfoma y leucemia), células pluripotentes (tumor de células germinales) y tejido embrionario (blastoma). En otra realización, las células pueden ser indicativas de una enfermedad autoinmunitaria. Las enfermedades autoinmunitarias comúnmente afectan a tipos de órganos y tejidos,
tales como vasos sanguíneos, tejidos conjuntivos, glándulas endocrinas, articulaciones, músculos, glóbulos rojos y la piel. Los ejemplos de trastornos autoinmunitarios incluyen, pero no se limitan a enfermedad de Addison, enfermedad celiaca, dermatomiositis, enfermedad de Graves, enfermedad de Guillan-Barre, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerosis múltiple, anemia perniciosa, psoriasis, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico y diabetes tipo I. En una realización adicional, las células pueden ser indicativas de una enfermedad que puede ser causada por un patógeno. El patógeno puede ser viral, bacteriano, fúngico, parasitario o priónico.
En algunas realizaciones, la composición que comprende la célula o cápside puede ser una muestra extraída de una planta o animal. Por ejemplo, la célula o cápside puede estar presente en una muestra de fluido corporal obtenida de un ser humano o animal. Los fluidos corporales adecuados incluyen sangre y componentes sanguíneos, moco, saliva, orina, vómito, heces, sudor, semen, secreción vaginal, lágrimas, pus, esputo y líquido pleural.
Es particularmente ventajoso que las muestras de fluidos corporales se puedan usar directamente en el método de la presente invención. Por ejemplo, se puede llevar a cabo el método de la presente invención en células o cápsides presentes en una muestra de sangre completa o una muestra de esputo.
En realizaciones preferidas, el método de la presente invención implica extraer ADN y/o ARN de una célula o cápside presente en una muestra de sangre, preferiblemente una muestra de sangre completa.
Preferiblemente, la composición que comprende la célula o cápside es una muestra de sangre, preferiblemente una muestra de sangre completa.
La etapa (a) del método de la presente invención implica poner en contacto la composición que comprende la célula o cápside con una composición que comprende (i) un compuesto de amonio cuaternario.
Se puede incluir cualquier compuesto de amonio cuaternario adecuado en el componente (i).
Algunos compuestos de amonio cuaternario adecuados tienen la estructura (I):
en donde cada uno de R1, R2, R3 y R4 es un grupo alquilo, alquenilo, alquilarilo o arilo opcionalmente sustituido y X- es un anión adecuado. Preferiblemente cada uno de R1, R2, R3 y R4 es un grupo alquilo o alquilarilo opcionalmente sustituido, más preferiblemente un grupo alquilo o alquilarilo no sustituido.
Se puede usar cualquier anión X- adecuado. X- se puede seleccionar de haluro, acetato, nitrito, un sulfato de alquilo inferior, carbonato o carboxilato de alquilo. Preferiblemente X- es cloruro o bromuro.
Cada uno de R1, R2, R3 y R4 puede ser un grupo alquilo no sustituido que tiene de 1 a 30 átomos de carbono o un grupo alquilarilo, por ejemplo un grupo bencilo.
Preferiblemente al menos uno de R1, R2, R3 y R4 es un grupo alquilo no sustituido que tiene al menos 6 átomos de carbono, preferiblemente al menos 8 átomos de carbono.
En una realización preferida R1 es un grupo alquilo que tiene de 6 a 30 átomos de carbono, preferiblemente de 8 a 24 átomos de carbono, adecuadamente de 8 a 20 átomos de carbono, por ejemplo de 10 a 18 átomos de carbono y lo más preferiblemente de 12 a 16 átomos de carbono; cada uno de R2 y R3 es un grupo alquilo que tiene de 1 a 4 átomos de carbono, preferiblemente metilo y R4 es un grupo alquilo que tiene de 1 a 4 átomos de carbono, preferiblemente metilo o un grupo alquilarilo, preferiblemente bencilo. La persona experta apreciará que dichos compuestos a menudo pueden estar presentes como una mezcla de homólogos.
Los compuestos de amonio cuaternario adecuados de este tipo incluyen cloruro de bencildialquilmetilamonio y cloruro de dialquildimetilamonio en los que los grupos alquilo tienen de 10 a 24 átomos de carbono.
Algunos compuestos de amonio cuaternario preferidos de este tipo incluyen cloruro de didecildimetilamonio y cloruro de dimetilbencilalquilamonio en los que el grupo alquilo contiene una mezcla de cadenas de alquilo Cs a C16.
Algunos compuestos de amonio cuaternario adecuados incluyen un compuesto de piridinio sustituido, por ejemplo, un compuesto de piridinio sustituido con alquilo o alquenilo. Los ejemplos incluyen compuestos de piridinio que tienen un sustituyente alquilo o alquenilo de 8 a 30, preferiblemente de 10 a 20 átomos de carbono. Los contraiones preferidos son haluros. Un compuesto adecuado de este tipo es el cloruro de cetilpiridinio.
Algunos compuestos precursores adecuados de este tipo son compuestos que incluyen un resto guanidina. La composición puede comprender un compuesto que no contiene un catión permanente pero que se protona en solución al pH al que se usa la composición. Estos se pueden denominar precursores de compuestos de amonio cuaternario. Se prefieren los compuestos de guanidina no poliméricos. Los ejemplos de dichos compuestos incluyen sales de clorhexidina, se prefiere en especial el gluconato de clorhexidina.
En algunas realizaciones especialmente preferidas del método del primer aspecto de la presente invención, la composición que comprende la célula o cápside se pone en contacto con una composición que comprende un compuesto de amonio cuaternario que incluye un grupo funcional que contiene silicio. Por grupo que contiene silicio se hace referencia a cualquier grupo que incluye un átomo de silicio. Los grupos funcionales que contienen silicio preferidos son aquellos que incluyen un átomo de silicio unido covalentemente por cuatro enlaces simples a cuatro restos orgánicos. El átomo de silicio puede estar unido directamente a átomos de oxígeno y/o de carbono.
Preferiblemente, el método del primer aspecto del componente (i) de la presente invención comprende un compuesto de fórmula general (II):
o una sal derivada del mismo en donde L es un grupo conector; cada uno de R1, R2, R3, R4, R5 y R6 se selecciona independientemente de H o un grupo alquilo, alquenilo, arilo o alcoxi opcionalmente sustituido; y n es 0 o 1.
Se apreciará que en las realizaciones en las que n es 1, la especie mostrada en la fórmula (I) es una especie catiónica. En dichas realizaciones, la especie de fórmula (I) estará presente como un aducto o sal que incluye un contraión adecuado. Sin embargo, para facilitar la referencia, en este documento se puede hacer una referencia general a los compuestos de fórmula (I) y cualquier referencia de este tipo incluye, cuando sea adecuado, cualquier contraión que deba estar presente.
Se puede usar cualquier contraión adecuado. Se prefieren contraiones monovalentes. Los contraiones adecuados incluyen iones haluro y oxihalo, por ejemplo cloruro, bromuro, bromito, clorito, hipoclorito, clorato, bromato y yodato. En una realización más preferida, el contraión es un ion cloruro.
En esta memoria descriptiva cualquier grupo alquilo, alquenilo, arilo o alcoxi opcionalmente sustituido puede estar opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de halógeno, hidroxi, nitro, mercapto, amino, alquilo, alcoxi, arilo, sulfo y sulfoxi.
Los sustituyentes preferidos que pueden estar presentes en los grupos alquilo, alquenilo, arilo o alcoxi definidos en el presente documento son halógenos, en particular flúor. En particular, cada uno de R1, R2, R3, R4, R5 o R6 puede comprender grupos fluoroalquilo o fluoroalcoxi que pueden comprender uno o más átomos de flúor.
Cada uno de R1, R2 y R3 se selecciona independientemente de un grupo alquilo, alquenilo, arilo o alcoxi opcionalmente sustituido. Preferiblemente, al menos uno de R1, R2 y R3 es un grupo alcoxi opcionalmente sustituido. Más preferiblemente, cada uno de R1, R2 y R3 es un grupo alcoxi opcionalmente sustituido, lo más preferiblemente cada uno es un grupo alcoxi no sustituido. El grupo alquilo del grupo alcoxi puede ser de cadena lineal o ramificada. Preferiblemente, cada uno de R1, R2 y R3 es un grupo alcoxi que tiene de 1 a 20 átomos de carbono, preferiblemente de 1 a 16 átomos de carbono, más preferiblemente de 1 a 12 átomos de carbono, preferiblemente de 1 a 8 átomos de carbono, adecuadamente de 1 a 6 átomos de carbono, más preferiblemente de 1 a 4 átomos de carbono.
En realizaciones preferidas, cada uno de R1, R2 y R3 se selecciona independientemente de metoxi, etoxi, propoxi, butoxi e isómeros de los mismos. Lo más preferiblemente, cada uno de R1, R2 y R3 se selecciona de metoxi, etoxi e isopropoxi. Preferiblemente, cada uno de R1, R2 y R3 se selecciona de metoxi y etoxi. Lo más preferiblemente, cada uno de R1, R2 y R3 es metoxi. Preferiblemente, cada uno de R1, R2 y R3 es el mismo.
R4 y R6 son preferiblemente un grupo alquilo que tiene de 1 a 8 átomos de carbono, lo más preferiblemente de 1 a 6 átomos de carbono, más preferiblemente de 1 a 4 átomos de carbono. R4 y R6 se pueden seleccionar adecuadamente de metilo, etilo, propilo, butilo e isómeros de los mismos. Preferiblemente, R4 y R6 son metilo o etilo. Lo más preferiblemente, R4 y R6 son metilo.
Preferiblemente, R5 es un grupo alquilo que tiene de 8 a 30 átomos de carbono, por ejemplo, de 10 a 26 átomos de carbono, adecuadamente de 12 a 24 átomos de carbono, preferiblemente de 14 a 22 átomos de carbono,
adecuadamente de 16 a 20 átomos de carbono, por ejemplo de 17 a 19 átomos de carbono, adecuadamente 18 átomos de carbono.
L es un grupo conector. Puede ser convenientemente un enlace o un grupo alquileno, alquenileno o arileno opcionalmente sustituido. Preferiblemente, L es un grupo alquenileno opcionalmente sustituido. Puede estar sustituido a lo largo de la cadena o dentro de la cadena. Por ejemplo, L puede ser un resto de unión éter, es decir, un grupo de fórmula O(CH2)n en la que n es de 1 a 12, preferiblemente de 1 a 6.
Preferiblemente L es un grupo alquileno no sustituido, más preferiblemente un grupo alquileno que tiene de 1 a 12 átomos de carbono, preferiblemente de 1 a 10 átomos de carbono, adecuadamente de 1 a 8 átomos de carbono, por ejemplo de 2 a 8 átomos de carbono, más preferiblemente de 2 a 6 átomos de carbono, adecuadamente de 2 a 5 átomos de carbono, por ejemplo, de 2 a 4 átomos de carbono. En realizaciones especialmente preferidas, L es un grupo propileno.
En realizaciones especialmente preferidas del compuesto de fórmula (I), R1, R2 y R3 son cada uno alcoxi C1 a C4, L es un grupo alquileno C2 a C5, R4 y R6 son cada uno grupos alquilo C1 a C4 y R5 es un grupo alquilo C12 a C24.
Lo más preferiblemente, el compuesto de fórmula (I) es el compuesto mostrado en la fórmula (IV). Este compuesto está disponible en el mercado como una solución en metanol.
El experto en la técnica apreciará que las fuentes comerciales de dichos compuestos pueden incluir algún material de partida residual y otras impurezas menores.
Preferiblemente, el componente (i) se selecciona de sales de amonio cuaternario de fórmula (I), sales de piridinio, sales de guanidina y compuestos de fórmula (II).
Lo más preferiblemente, el componente (i) comprende un compuesto de fórmula (IV).
En realizaciones preferidas, la composición que se pone en contacto con la célula o cápside en la etapa (a) del método de la presente invención comprende además (ii) un tensioactivo no iónico.
El componente (ii) se puede seleccionar de cualquier tensioactivo no iónico adecuado. El experto en la técnica conocerá los tensioactivos no iónicos adecuados e incluyen etoxilatos de alcohol, ésteres de ácidos grasos y alquilpoliglicósidos.
Los tensioactivos no iónicos pueden tener una parte hidrófila, adecuadamente un resto alcoxilato o un resto azúcar. Los tensioactivos no iónicos adecuados incluyen etoxilatos de alcohol y poliglicósidos de alcoholes grasos. De manera adecuada, el valor del equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) de un tensioactivo no iónico usado en la presente invención es al menos 7, y preferiblemente al menos 10. Los tensioactivos no iónicos especialmente adecuados pueden tener un valor de HlB comprendido en el intervalo de 10-16, preferiblemente 10-14. Para los fines de estas definiciones, el valor de HLB se determina por el método clásico de Griffin (Griffin WC: "Calculation of HLB Values of Non-Ionic Surfactants", Journal of the Society of Cosmetic Chemists 5 (1954): 249).
Los tensioactivos no iónicos preferidos para usar en el presente documento incluyen compuestos de hidrocarbilsacárido. Por compuesto hidrocarbil-sacárido se hace referencia a un compuesto que incluye un grupo hidrocarbilo y un resto sacárido.
El grupo hidrocarbilo puede estar unido al resto sacárido por un enlace carbono-carbono o por un enlace carbonooxígeno. Preferiblemente, está unido al resto sacárido por un enlace carbono-oxígeno, por ejemplo por un enlace éster o un enlace éter. Lo más preferiblemente, está unido al resto de oligosacárido por un enlace éter. Por lo tanto, en realizaciones preferidas, el tensioactivo no iónico es un éter de hidrocarbilo de un resto sacárido.
El compuesto de hidrocarbil-sacárido puede incluir uno o más grupos hidrocarbilo. Preferiblemente comprende un grupo hidrocarbilo. El grupo hidrocarbilo puede ser un grupo alquilo, alquenilo o alquinileno opcionalmente sustituido. Lo más preferiblemente es un grupo alquilo opcionalmente sustituido. Los sustituyentes adecuados incluyen halógeno, hidroxi, nitro, mercapto, amino, alquilo, alcoxi, arilo, sulfo y sulfoxi. Cualquier sustitución puede estar dentro de la cadena o a lo largo de ella, por ejemplo, la cadena puede incluir un enlace éter.
Preferiblemente, el grupo hidrocarbilo es un grupo alquilo no sustituido. Puede ser de cadena lineal o ramificada. Lo más preferiblemente es de cadena lineal. Los grupos hidrocarbilo especialmente preferidos son grupos alquilo que tienen de 1 a 30 átomos de carbono, preferiblemente de 2 a 24 átomos de carbono, más preferiblemente de 4 a 20 átomos de carbono, adecuadamente de 4 a 16 átomos de carbono, preferiblemente de 6 a 14 átomos de carbono, por ejemplo de 6 a 12 átomos de carbono y lo más preferiblemente de 8 a 10 átomos de carbono. Se prefieren los grupos alquilo de cadena lineal que tienen de 6 a 12 átomos de carbono.
El resto sacárido de la especie hidrocarbil-oligosacárido puede incluir de 1 a 10 especies monosacárido. Por lo tanto, puede ser una unidad de monosacárido, una unidad de disacárido o una unidad de oligosacárido. Preferiblemente, el resto sacárido comprende de 2 a 8, adecuadamente de 2 a 6, preferiblemente de 2 a 5, por ejemplo 3 o 4 unidades de monosacárido. Puede estar incluida cualquier unidad de monosacárido adecuada. Los sacáridos preferidos incluyen alosa, altrosa, glucosa, manosa, gulosa, idosa, galactosa y talosa.
Pueden estar presentes mezclas de dos o más monosacáridos en el resto sacárido. Preferiblemente, el resto sacárido comprende glucosa. Más preferiblemente, todas las unidades de monosacárido presentes en el resto sacárido son glucosa.
En una realización preferida, el tensioactivo no iónico es un alquilpoliglucósido (APG), preferiblemente un monoalquilpoliglucósido. Adecuadamente, el tensioactivo no iónico es un compuesto de fórmula general (III):
en donde n es de 5 a 12, preferiblemente de 6 a 10, más preferiblemente de 7 a 9 y m es de 1 a 6, preferiblemente de 2 a 5, más preferiblemente 3 o 4.
La composición que se pone en contacto con la composición que comprende la célula o cápside en la etapa (a) del método del primer aspecto se puede proporcionar en cualquier forma adecuada. Puede consistir esencialmente en el componente (i) o el componente (i) y un disolvente. Puede consistir esencialmente en los componentes (i) y (ii) o puede comprender uno o más componentes adicionales. De forma adecuada, la composición incluye uno o más disolventes. Los disolventes preferidos son agua y disolventes miscibles en agua. En las realizaciones en las que el compuesto de amonio cuaternario se obtiene comercialmente como una solución en metanol, gran parte del metanol se elimina adecuadamente antes de usar el compuesto en el método de la presente invención.
Preferiblemente, la composición es acuosa. En realizaciones especialmente preferidas, el agua comprende al menos 90% en peso, más preferiblemente al menos 95% en peso o al menos 99% en peso de disolventes celulares presentes en la composición. En una realización preferida, la composición se liofiliza. En dichas realizaciones, se puede proporcionar una mezcla acuosa tras ponerse en contacto con una composición acuosa que comprende las células o cápsides. Las composiciones liofilizadas pueden ser ventajosas para el almacenamiento y distribución.
En algunas realizaciones, la composición usada en la etapa (a) se puede inmovilizar sobre un soporte sólido, por ejemplo, sobre una perla de resina o sobre un sustrato plano.
La composición usada en la etapa (a) del método de la presente invención puede incluir una mezcla de dos o más compuestos de amonio cuaternario y/o una mezcla de dos o más tensioactivos no iónicos.
La composición que se pone en contacto con la célula o cápside en la etapa (a) del método de la presente invención comprende preferiblemente al menos 0,0001% en peso de un compuesto de amonio cuaternario, preferiblemente al menos 0,0005% en peso, más preferiblemente al menos 0,001% en peso, y más preferiblemente al menos 0,002% en peso.
El compuesto de amonio cuaternario preferiblemente comprende hasta 10% en peso de la composición que se pone en contacto con la célula o cápside en la etapa (a), adecuadamente hasta 5% en peso, preferiblemente hasta 1% en peso, preferiblemente hasta 0,1% en peso, más preferiblemente hasta 0,01% en peso, y más preferiblemente hasta 0,005% en peso.
En realizaciones en las que está presente más de un compuesto de amonio cuaternario, las cantidades anteriores se refieren al total de todos estos compuestos.
Los tensioactivos no iónicos adecuados incluyen cualquier compuesto que mejore la solubilidad, especialmente la solubilidad en agua, del compuesto de amonio cuaternario que incluye un grupo funcional que contiene silicio.
El tensioactivo no iónico está adecuadamente presente en la composición que se pone en contacto con la célula o cápside en la etapa (a) en una cantidad de al menos 0,0001% en peso, preferiblemente al menos 0,0005% en peso, más preferiblemente al menos 0,001% en peso, y más preferiblemente al menos 0,002% en peso.
El tensioactivo no iónico puede estar presente en la composición que se pone en contacto con la célula o cápside en la etapa (a) en una cantidad de hasta 10% en peso de la composición, adecuadamente hasta 5% en peso, preferiblemente hasta 1% en peso, preferiblemente hasta 0,1% en peso, más preferiblemente hasta 0,01% en peso y más preferiblemente hasta 0,005% en peso.
En realizaciones en las que la composición comprende dos o más tensioactivos no iónicos, las cantidades anteriores se refieren al total de todos estos compuestos.
La relación en peso del componente funcional compuesto de amonio cuaternario al tensioactivo no iónico es preferiblemente de 1:10 a 10:1, preferiblemente de 1:5 a 5:1, preferiblemente de 1:3 a 3:1, adecuadamente de 1:2,5 a 2,5:1.
La composición que se pone en contacto con la composición que comprende la célula o cápside en la etapa (a) tiene preferiblemente un pH de 6 a 8.
La composición que se pone en contacto con la célula o cápside preferiblemente comprende (i) un compuesto de amonio cuaternario y (ii) un tensioactivo no iónico. En algunas realizaciones, la composición puede consistir esencialmente en estos componentes.
En algunas realizaciones, la composición incluye además un disolvente, preferiblemente agua.
También pueden estar presentes otros componentes, por ejemplo cloruro de magnesio y tampones tris. Sin embargo, esto no se prefiere.
Adecuadamente, los componentes (i) y (ii), que pueden comprender cada uno una mezcla de componentes, juntos constituyen al menos el 50% en peso de todos los ingredientes distintos del disolvente presentes en la composición usada en la etapa (a), preferiblemente al menos 70% en peso, más preferiblemente al menos 90% en peso, preferiblemente al menos 95% en peso, por ejemplo al menos 99% en peso.
Preferiblemente, la composición usada en la etapa (a) del método de la presente invención comprende menos de 0,01 mmol de iones magnesio, preferiblemente menos de 0,001 mmol.
En la etapa (a) del método del primer aspecto de la presente invención, la composición que comprende la célula o cápside se pone en contacto con una composición que comprende (i) un compuesto de amonio cuaternario y opcionalmente (ii) un tensioactivo no iónico. Adecuadamente, la relación de la composición de muestra (es decir, la composición que comprende la célula o cápside) a la composición usada en la etapa (a) es de 10:1 a 1:1000, preferiblemente de 5:1 a 1:100, adecuadamente de 1:1 a 1:20 por ejemplo de 1:3 a 1:10, en volumen.
Adecuadamente, la composición se agita para asegurar la mezcla y después se incuba a temperatura ambiente durante un periodo de 1 segundo a 24 horas, adecuadamente de 5 segundos a 1 hora, preferiblemente de 5 segundos a 30 minutos, preferiblemente de 10 segundos a 15 minutos, adecuadamente de 20 segundos a 10 minutos, preferiblemente de 30 segundos a 5 minutos, por ejemplo durante aproximadamente 40 a 100 segundos, adecuadamente durante aproximadamente 1 minuto. Aunque se prefieren tiempos de incubación más cortos, la composición es estable durante 24 horas.
Este material se usa adecuadamente directamente en la etapa (b) del método de la presente invención.
La etapa (b) del método del primer aspecto de la presente invención implica poner en contacto la composición obtenida en la etapa (a) con una composición que comprende un agente de lavado proteico. Adecuadamente, no hay etapas de purificación entre la etapa (a) y la etapa (b) y el material obtenido en la etapa (a) se usa directamente en la etapa (b). La etapa (b) implica poner en contacto una composición obtenida en la etapa (a) con una composición que contiene un agente de lavado proteico.
Los agentes de lavado proteicos preferidos son proteínas aniónicas.
Los agentes de lavado proteicos adecuados incluyen triptona, gelatina, caseína y albúmina de suero bovino (BSA). Los agentes de lavado proteicos preferidos incluyen albúmina de suero bovino y caseína. Un agente de lavado especialmente preferido es BSA. Se prefiere particularmente la albúmina de suero bovino acetilada (BSA).
De forma adecuada, el agente de lavado proteico está presente en la composición usada en la etapa (b) en una cantidad de 0,01 a 50% en peso, preferiblemente de 0,1 a 10% en peso, adecuadamente de 0,1 a 5% en peso, por ejemplo aproximadamente 1% en peso.
De forma adecuada, la composición usada en la etapa (b) del método del primer aspecto de la presente invención es una composición acuosa. De forma adecuada, el agua comprende al menos 90% en peso de todos los disolventes
presentes en la composición, preferiblemente al menos 95% en peso, por ejemplo, al menos 99% en peso de todos los disolventes presentes en la composición.
En una realización, la composición se puede liofilizar. En dicha realización, se puede proporcionar una mezcla acuosa tras ponerse en contacto con la composición acuosa obtenida en la etapa (a).
En la etapa (b) del método de la presente invención, la composición obtenida en la etapa (a) se añade a una composición que contiene el agente de lavado proteico en una relación de 10:1 a 1:100, preferiblemente de 5:1 a 1:50, adecuadamente de 1:1 a 1:10.
Se debe indicar que el método de la presente invención no incluye necesariamente el uso de toda la mezcla obtenida en la etapa (a) en la etapa (b). En muchos casos, una parte de la composición obtenida en la etapa (a) se pone en contacto con la composición que comprende el agente de lavado proteico en la etapa (b).
De forma adecuada en la etapa (b) del método de la presente invención, la mezcla se agita brevemente a temperatura ambiente. Se puede dejar durante un período de 1 segundo a 24 horas, adecuadamente de 5 segundos a 1 hora, preferiblemente de 5 segundos a 30 minutos, preferiblemente de 10 segundos a 10 minutos, adecuadamente de 30 segundos a 5 minutos, por ejemplo aproximadamente 1 minuto.
Se ha descubierto sorprendentemente que la mezcla obtenida en la etapa (b) de la presente invención se puede usar directamente en un método de amplificación de ADN o ARN.
Es muy ventajoso que el método de la presente invención proporcione un procedimiento simple en el que se puede obtener ADN o ARN adecuado para la amplificación directamente de sangre completa. Los expertos en la técnica conocerán métodos de amplificación de ADN adecuados. Los métodos de amplificación de ADN preferidos incluyen secuenciación, clonación y PCR.
En el presente documento se describe un kit que comprende:
(a) una primera composición que comprende
(i) un amonio cuaternario; y opcionalmente
(ii) un tensioactivo no iónico; y
(b) una segunda composición que comprende un agente de lavado proteico.
Las características preferidas de la composición del segundo aspecto son las definidas en relación con el primer aspecto.
En algunas realizaciones, la composición del primer aspecto puede ser una perla o un sustrato sólido que lleva los reactivos.
Una ventaja del método del primer aspecto de la presente invención es que el ADN y/o ARN extraídos se pueden usar en aplicaciones posteriores sin necesidad de etapas de aislamiento o purificación.
La presente invención proporciona un método para identificar un componente de material genético, comprendiendo el método las etapas de:
(a) poner en contacto una composición que comprende una célula o cápside con una composición que comprende:
(i) un compuesto de amonio cuaternario; y opcionalmente
(ii) un tensioactivo no iónico;
(b) poner en contacto la composición obtenida en la etapa (a) con una composición que comprende un agente de lavado proteico; y
(c) usar el material obtenido en la etapa (b) en un método de amplificación.
No hay etapas de purificación entre la etapa (b) y la etapa (c).
De forma adecuada la etapa (c) se lleva a cabo en el material obtenido directamente en la etapa (b).
La etapa (c) implica amplificar el ADN o ARN obtenido en las etapas (a) y (b).
El método de amplificación puede ser un método de secuenciación, un método de clonación o puede implicar un método para identificar el ADN y/o el ARN. Los expertos en la técnica conocerán dichos métodos.
En algunas realizaciones, la etapa (c) puede implicar el uso de tecnología de ADN recombinante.
La etapa (c) puede implicar un método de purificación.
La etapa (c) puede incluir un método de chip-en-chip.
En algunas realizaciones en la etapa (c) del método del tercer aspecto, el ADN y/o ARN extraído obtenido en la etapa (b) se usa como molde en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
La etapa de PCR (b) se puede llevar a cabo por cualquier medio conocido por los expertos en la técnica. Las técnicas de PCR adecuadas incluyen PCR básica, PCR con transcripción inversa (RT), PCR de inicio en caliente, PCR larga, PCR cuantitativa de punto final, PCR cuantitativa en tiempo real, análisis de ADN polimórfico amplificado rápido, PCR anidada y PCR de alta fidelidad.
En la etapa (c) del método del tercer aspecto de la presente invención, el ADN y/o ARN extraídos se pueden usar como molde en la PCR. Como apreciará el experto en la técnica, las técnicas de PCR se pueden usar para una serie de propósitos. El método del tercer aspecto puede comprender un método de identificación de un componente de material genético. En la etapa (b) se puede identificar parte o todo el ADN y/o ARN extraído en la etapa (a). La etapa (b) puede implicar la confirmación de que una pequeña parte de ADN y/o ADN coincide con una muestra conocida. La etapa (b) puede implicar un etapa de clonación de ADN; huella genética, por ejemplo, en aplicaciones forenses; análisis funcional de genes; diagnóstico de enfermedad hereditaria; y detección o diagnóstico de enfermedades infecciosas.
En algunas realizaciones, el método del tercer aspecto de la presente invención se puede usar en la detección o diagnóstico de una enfermedad. El método se puede usar para detectar o diagnosticar, entre otras, enfermedades genéticas, cánceres, enfermedades autoinmunitarias e infecciones patógenas. Los marcadores genéticos indicativos de la enfermedad se identifican en una etapa (c) de PCR. Una ventaja particular de la presente invención es que debido a que no es necesario purificar las muestras que contienen células o cápsides antes o después de las etapas (a) o (b), hay una reducción significativa del tiempo necesario para llegar a un diagnóstico.
Debido a que la presente invención se puede llevar a cabo en muestras impuras, permite que el método del tercer aspecto se lleve a cabo rápida y fácilmente y con bajo coste. Esto tiene ventajas significativas, por ejemplo, en la detección de enfermedades en países menos desarrollados donde no están disponibles de forma rutinaria costosas instalaciones de laboratorio. Se prevé que el método de la presente invención se podría llevar a cabo para detectar una enfermedad en muestras de sangre completa o de esputo en clínicas móviles.
Una ventaja adicional de las composiciones usadas en la presente invención es que son muy eficaces en la liberación del ADN y/o ARN de una amplia variedad de células y cápsides. La presente invención puede proporcionar un método mediante el cual el material genético en una muestra puede ser retenido pero en una forma que ya no es activa. Esto es potencialmente muy útil cuando se trata de muestras que contienen patógenos infecciosos.
En algunas realizaciones, la etapa (c) implica un método de clonación del ADN y/o ARN extraído en las etapas (a) o (b) .
En algunas realizaciones, la etapa (c) implica un método de secuenciación del ADN y/o ARN obtenido en las etapas (a) y (b).
En algunas realizaciones, la presente invención puede proporcionar un método de descontaminación de una muestra biológica que contiene una célula o cápside.
Dicho método puede ser aplicable a cualquier muestra adecuada que contenga células o cápsides. En una realización de ejemplo, una muestra de sangre tomada de un paciente que padece malaria se puede hacer segura por el método del primer aspecto ya que el parásito Plasmodium se destruye en el procedimiento. En otra realización de ejemplo, una muestra de sangre tomada de un paciente que padece el virus de inmunodeficiencia humana ya no representaría un riesgo para los usuarios posteriores si se hubiera tratado de acuerdo con el método del primer aspecto, ya que la cápside del virus se destruiría.
Esto es ventajoso porque las muestras tratadas de acuerdo con dicho método se pueden transferir por correo ordinario.
Los métodos y composiciones de la presente invención pueden tener aplicaciones en productos farmacéuticos, diagnósticos, investigación médica, investigación biológica, investigación química y forense.
La presente invención se describirá ahora con más detalle con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplo 1
Se prepararon composiciones que comprendían 0,003% en peso de un alquilpoliglucósido de fórmula (III) como se describe en el presente documento y 0,003% en peso de un compuesto de amonio cuaternario.
Se usaron los siguientes compuestos de amonio cuaternario:
El grupo alquilo del cloruro de bencildimetilalquilamonio contiene una mezcla de cadenas de alquilo Os a C i6.
Se mezclaron 30 pl de una muestra de sangre con 170 pl de cada una de las composiciones A, B, C y D y se agitaron brevemente. Después las composiciones se incubaron durante 1 minuto a temperatura ambiente.
Después, se mezclaron 2,5 pl de la mezcla resultante con 10 pl de una composición que comprendía BSA al 1% en peso. Esta mezcla después se usó directamente en la POR.
Se llevó a cabo una POR para hRNasaP con el kit hRnasaP-ARCIS.
Cada muestra extraída se cargó por duplicado.
Mezcla de reacción para extracción con ARCIS
- Mezcla maestra TaqMan: 12,5 pl
- Cebador directo: 0,5 pl
- Cebador inverso: 0,5 pl Volumen de mezcla: 20 pm - Sonda de RnasaP 1 uM: 0,5 pl 
- H2O: 6 pl
- ADN: 5 pl de solución extraída
Condiciones de PCR
Activación de mezcla 50°C 2 min
Desnaturalización inicial 95°C 10 min
Desnaturalización 95°C 15 s
clos
Reasociación 60°C 60 s } 45 ci
Resultados (Valores de Ct)
Ejemplo 2
El procedimiento del ejemplo 1 se repitió para la composición A pero se usaron 20 pl de una composición que comprendía caseína al 1% en peso en lugar de la composición que comprendía BSA. Esto dio los resultados de la PCR de 32,04 y 33,6.
Claims (11)
1. Un método para identificar un componente de material genético, comprendiendo el método las etapas de:
(a) poner en contacto una composición que comprende una célula o cápside con una composición que comprende:
(i) un compuesto de amonio cuaternario;
(b) poner en contacto la composición obtenida en la etapa (a) con una composición que comprende un agente de lavado proteico; y
(c) usar el material obtenido en la etapa (b) en un método de amplificación;
en donde no hay etapas de purificación entre la etapa (b) y la etapa (c);
en donde en la etapa (b) la composición obtenida en la etapa (a) se añade a una composición que comprende el agente de lavado proteínico en una relación de 10:1 a 1:100.
2. Un método según la reivindicación 1, en donde la composición que comprende la célula o cápside es una muestra de sangre.
3. Un método según la reivindicación 2, en donde la composición que comprende la célula o cápside es una muestra de sangre completa.
4. Un método según cualquier reivindicación precedente, en donde el componente (i) comprende un compuesto de fórmula general (II):
o una sal derivada del mismo, en donde L es un grupo conector; cada uno de R1, R2, R3, R4, R5 y R6 *8se selecciona independientemente de H o un grupo alquilo, alquenilo, arilo o alcoxi opcionalmente sustituido; y n es 0 o 1.
5. Un método según la reivindicación 4, en donde el componente (i) comprende el compuesto de fórmula (IV):
6. Un método según cualquier reivindicación precedente, en donde la composición que se pone en contacto con la célula o cápside en la etapa (a) comprende además (ii) un tensioactivo no iónico.
7. Un método según la reivindicación 6, en donde el tensioactivo no iónico es un alquilpoliglucósido (APG).
8. Un método según la reivindicación 6 o reivindicación 7, en donde el tensioactivo no iónico es un compuesto de fórmula general (III):
en donde n es de 5 a 12 y m es de 1 a 6.
9. Un método según cualquier reivindicación precedente, en donde la composición que se pone en contacto con la composición que comprende la célula o cápside en la etapa (a) tiene un pH de 6 a 8.
10. Un método según cualquier reivindicación precedente, en donde no hay etapas de purificación entre la etapa (a) y la etapa (b).
11. Un método según cualquier reivindicación precedente, en donde el agente de lavado proteico se selecciona de albúmina de suero bovino y caseína.
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