ES2859651T3 - Dipéptidos de aspartilo para el cuidado de la piel y uso cosmético - Google Patents

Abstract

Uso de una composición que comprende uno o más ß-dipéptidos, o sus oligómeros, o sus sales, en el que los ß- dipéptidos comprenden ß-L-aspartilo como un primer residuo de aminoácido, para el cuidado cosmético dermatológico y/o capilar.

Description

DESCRIPCIÓN

Dipéptidos de aspartilo para el cuidado de la piel y uso cosmético

La invención proporciona el uso de una composición cosmética que comprende uno o más dipéptidos de J-aspartilo, o sus oligómeros, o sus sales, en la que dichos dipéptidos de J-aspartilo comprenden un resto J-L-aspartilo como primer residuo de aminoácido, para cuidado cosmético dermatológico y/o capilar. La invención se refiere, además, a un procedimiento para cuidado de la piel y/o cuidado del cabello utilizando esta composición.

Antecedentes de la invención

En general, los aminoácidos son ampliamente usados en productos cosméticos. Entre ellos, el ácido aspártico, la arginina y la lisina, así como sus sales/mezclas, son considerados nutritivos para la piel y/o acondicionadores para el cabello, por ejemplo, por el portal de Internet acreditado "Análisis cosmético", una iniciativa de la "Institución para avance de la salud cutánea" alemana, en base a una evaluación de aproximadamente 8000 componentes por fuentes independientes. También, la lista "Cosmética-Ingredientes-Funciones" de la "Asociación industrial para higiene personal y detergentes para ropa" (IKW) clasifica estos aminoácidos y sus sales como "cuidado para la piel" y "acondicionamiento del cabello". Dichas sales/mezclas de aminoácidos están integradas, por ejemplo, en algunos productos cosméticos de alta calidad de la empresa japonesa Shisheido. Las pruebas dermatológicas con arginina y aspartato describieron esta combinación como protectora contra la resequedad de la piel y como regenerativa de la piel (véase las patentes de Shisheido EP-B- 0506956 y US 5.478.560). Sin embargo, la utilidad de estas mezclas/sales de los aminoácidos en aplicaciones cosméticas está limitada por su captación moderada por las células cutáneas. También, la arginina de aminoácido sola es conocida por proporcionar efectos similares a la piel y ser útil contra la pérdida de cabello, como es reivindicada por la empresa alemana Henkel para algunos de sus productos ampliamente conocidos. Además, el documento WO2011/126163 divulga composiciones blanqueadoras para la piel que contienen dipéptidos.

Breve descripción de la invención

Ahora se descubrió que los dipéptidos de J-L-aspartilo, notablemente aquellos conocidos a partir del documento WO2009150252 sí poseen propiedades de cuidado de la piel y del cabello altamente efectivas y representan por consiguiente una forma nueva para aplicación de sus aminoácidos constitutivos en el campo de la cosmética. Dichos dipéptidos, además, no están ligados a la limitación de captación conocida para los aminoácidos debido a los transportes de tri-/dipéptidos separados y especializados, que no aceptan aminoácidos o moléculas más grandes que los tripéptidos (Daniel et al. Physiology 21:93-102 (2006)). La invención proporciona, de este modo:

(1) un uso de una composición que comprende uno o más J-dipéptidos, o sus oligómeros, o sus sales, en la que los J-dipéptidos comprenden J-L-aspartilo como un primer residuo de aminoácido, para cuidado cosmético dermatológico y/o capilar;

(2) un procedimiento cosmético que comprende aplicar en forma tópica la composición según lo definido en (1) sobre la piel y/o el cabello de un ser humano o animal; y

(3) el uso de la composición según lo definido en (1) para revitalización, acondicionamiento o en el tratamiento antienvejecimiento de la piel y/o el cabello de un ser humano o animal.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1: Resume la ilustración de los resultados del Ensayo de Vitalidad MMT después de 48 de incubación sistemática.

Fig. 2: Resume la ilustración de los resultados del Ensayo de Vitalidad MMT después de 48 de aplicación tópica.

Fig. 3: Resume la ilustración de los resultados del Ensayo de MMT después de 120 de incubación sistemática.

Fig. 4: Resume la ilustración de los resultados del Ensayo de MMT después de 120 de aplicación tópica.

Fig. 5: Ilustración ejemplar de los queratinocitos basales con proliferación después de 3 días de exposición. Las imágenes (fluorescencia azul y roja) fueron tomadas individualmente y posteriormente fusionadas. Los núcleos fluorescentes azules (puntos oscuros) fueron teñidos con DAPI. La fluorescencia roja (puntos brillantes) representa núcleos proliferativos en la Fase S de mitosis (tinción con Click-iT®-Edu). Cabezas de flecha: células en proliferación, flechas: núcleos teñidos con DAPI, no proliferativos.

Fig. 6: Las imágenes del área de patas de gallo (ojo izquierdo) fueron tomadas antes (A) y después de 4 semanas de aplicación de J-L-aspartil-L-arginina (B); las imágenes del área de pata de gallo (ojo derecho) fueron tomadas antes (C) y después de 4 semanas de aplicación de J-L-aspartil-L-lisina (D). Flecha: arruga que fue elegida para medición 3d óptica de la superficie de la piel con el sistema PRIMOS.

Descripción detallada de la invención

Los 13-dipéptidos o los oligómeros de 13-dipéptidos de las composiciones del aspecto (1) de la presente invención son derivados de cianoficina, (también abreviada CGP, Péptido de Gránulo de Cianoficina) o polímero similar a cianoficina por hidrólisis selectiva.

En la naturaleza, y además de diversas bacterias heterotróficas, la mayoría de las especies cianobacteriales (algas azul-verde) acumulan el polipéptido CGP como material de reserva para carbono y nitrógeno. El CGP es acumulado en la fase de crecimiento estacionario inicial de las bacterias y está compuesto principalmente por dos aminoácidos, a saber ácido aspártico y arginina. Uno o más aminoácidos, que son estructuralmente similares a la arginina tales como lisina, ornitina, glutamato, citrulina y canavanina, pueden reemplazar parcialmente el residuo de arginina de CGP dependiendo de las condiciones ambientales/de cultivo.

En comparación con los dipéptidos sintetizados químicamente, los dipéptidos CGP son sustancias naturales y estereoespecíficas (estructuralmente homogéneas) que son producidas a partir de la biomasa en un modo biotecnológico y amigable para el medio ambiente. La producción de dipéptidos CGP requiere, además, mucho menos esfuerzo y gasto tecnológico, muy poco tiempo, y significativamente menos esfuerzo financiero. Como el proceso de producción no emplea grupos protectores ni disolventes nocivos o peligrosos para el medio ambiente, la biocompatibilidad de estos dipéptidos siempre está asegurada (Sallam et al. 2009. AEM 75:29-38)

Dichas composiciones de 13-dipéptido CGP que pueden obtenerse por la degradación /hidrólisis pueden estar compuestas por un tipo individual de 13-dipéptidos, o una mezcla de diferente 13-dipéptidos, o por un solo tipo de oligómeros de 13-dipéptidos, o por una mezcla de diferentes oligómeros de 13-dipéptidos, o por mezclas de dichos 13-dipéptidos y oligómeros de 13-dipéptidos. Sin embargo, es preferente, que los 13-dipéptidos comprenden residuos de aminoácidos seleccionados de aspartato, arginina, lisina y otros residuos de aminoácidos presente en CGP o en los polímeros similares a CGP. Es particularmente preferente que los 13-dipéptidos se seleccionen de 13-L-aspartil-L-arginina y 13-L-aspartil-L-lisina.

Una CGPasa adecuada para la degradación de CGP es una CGPasa de P. alcaligenes, particularmente preferente de P. alcaligenes, cepa DlP1. Dicha CGPasa (i) tiene un peso molecular de 45 kDa, una temperatura óptima de 50 °C, y un intervalo de pH óptimo de 7-8,5 y degrada la CGP en I3-Asp-Arg; y/o (ii) es la CGPasa de P. alcaligenes DIP1 CphE^al que ha sido depositada con DSMZ como DSM 21533, o es un mutante, derivado o fragmento de ésta capaz de disociación de CGP o polímeros similares a CGP en dipéptidos.

Los mutantes, derivados o fragmentos de la CGPasa nativa antes mencionada incluyen fragmentos (que tienen al menos 50 residuos de aminoácidos consecutivos de la secuencia nativa, preferentemente productos de truncamiento N- y/o terminales, en los que hasta 50 residuos de aminoácidos terminales son removidos), derivados (notablemente productos de fusión con proteínas funcionales y péptidos tales como péptidos de secreción, secuencias líder, etc., y productos de reacción con restos químicos tales como PEG, alcoholes, aminas, etc.) y mutantes (notablemente mutantes de adición, sustitución, inversión y eliminación que tienen al menos 80%, preferentemente al menos 90%, mucho más preferentemente al menos 95% de identidad de la secuencia con la enzima nativa sobre la base de aminoácidos o en los que 1 a 20, preferentemente 1 a 10, residuos de aminoácidos consecutivos son añadidos, sustituidos, invertidos y/o eliminados; para los mutantes de sustitución es (particularmente preferente), con la condición de que, sin embargo, dichas CGPasas modificadas tengan la actividad enizmática de la CGPasa nativa.

El proceso de degradación puede ser precedido por una etapa que proporcione la CGP o la preparación polimérica similar a CGP, a saber, mediante cultivo de una línea celular procariótica o eucariótica. La línea celular productora puede ser cualquier línea celular capaz de producir CGP o el polímero similar a CGP. Es preferente que la línea celular productora sea seleccionada de Escherichia coli, Ralstonia eutropha, Acinetobacter baylyi, Corynebacterium glutamicum, Pseudomonas putida, cepas de levadura y biomasa vegetal. Las líneas celulares productoras particularmente preferentes son Ralstonia eutropha H16-PHB^'4-Aeda (pBBR1MCS-2;;cphA⁶³⁰⁸/edaH16) y E. coli DH1 (pMa/c5-914:: cphA^PCC6803).

Los procedimientos anteriores pueden comprender, además, las etapas de aislar, purificar y/o modificar químicamente el producto de CGP obtenido por cultivo de la línea celular productora. Dicho aislamiento, purificación, modificación química y separación pueden ser efectuados por procedimientos bien establecidos en la técnica.

Sin embargo, es preferente que el producto de CGP obtenido por cultivo de la línea celular productora sea sometido directamente, es decir, sin aislamiento o purificación, a degradación con la CGPasa.

Alternativamente, el producto de degradación puede ser purificado y/o modificado químicamente. Nuevamente, dichas purificación, separación o modificación química pueden ser efectuadas mediante procedimientos bien establecidos en la técnica.

En la composición del aspecto (1) cada uno de los uno o más 13-dipéptidos comprende 13-L-aspartilo como primer residuo de aminoácido, que está unido covalentemente a un segundo residuo de aminoácido. El segundo residuo de aminoácido puede ser seleccionado de arginina, lisina, ornitina, glutamato, citrulina y canavanina. Preferentemente, el segundo residuo de aminoácido es arginina o lisina. Además, el segundo residuo de aminoácido puede ser de configuración L o D. De este modo los dipéptidos pueden tener la fórmula I

(13-L-aspartil-R)

y los oligómeros de dipéptido pueden tener la fórmula II

(U-L-aspartil-R)ⁿ,

en la que R es seleccionado independientemente de los residuos de aminoácidos definidos en la presente memoria con anterioridad y n es un número entero de 2 a 150, preferentemente 2 a 30, mucho más preferentemente 2 a 10.

La composición dermatológica y/o para el cuidado del cabello del aspecto (1) puede comprender, además, dos o más dipéptidos como fue descrito con anterioridad que estén unidos covalentemente, y en los que el segundo residuo de aminoácido de cada dipéptido esté seleccionado independientemente, preferentemente, de arginina, lisina, ornitina, glutamato, citrulina y canavanina. Mucho más preferentemente, el segundo residuo de aminoácido es arginina o lisina. En otra realización, uno o más 13-dipéptidos son químicamente modificados. Dicha modificación química incluye fosforilación, farnesilación, ubiquitinación, glicosilación, acetilación, formilación, amidación, sumoilación, biotinilación, N-acilación, esterificación y ciclación. En una realización preferente, la composición del aspecto (1) comprende de 0,00001 a 50% en peso de 13-dipéptidos o sus oligómeros, más preferentemente de 0,0001 a 10% en peso y mucho más preferentemente de 0,01 a 5% en peso. La composición del aspecto (1) puede comprender, además, uno o más aminoácidos o sus sales. Estos aminoácidos libres son seleccionados preferentemente de arginina, lisina, cisteína, glicina, prolina y metionina. El contenido de aminoácidos libres o sus sales en la composición es preferentemente de 0,001 a 10% en peso.

Los oligómeros de 13-dipéptidos incluyen estructuras homoméricas (es decir, compuestas por un 13-dipéptido) y heteroméricas (es decir, compuestas por dos o más 13-dipéptidos diferentes, en las que las unidades de 13-dipéptidos están unidas covalentemente unas a otras.

Los productos 13-dipeptídicos descritos con anterioridad son altamente estables en varias condiciones, y son adecuados para ser mezclados en vehículos aceptables y compuestos convencionalmente usados en composiciones dermatológicas y/o para el cuidado del cabello.

El vehículo aceptable para uso dermatológico (y también para uso farmacológico) incorporado en la composición de la presente invención puede ser cualquier vehículo usado convencionalmente en la técnica para la composición dermatológica y/o de cuidado del cabello. Ejemplos de éste incluyen agua, alcoholes inferiores, alcoholes superiores, alcoholes polihídricos, monosacáridos, disacáridos, polisacáridos, aceites de hidrocarburos, grasas y aceites, ceras, ácidos grasos, aceites de silicona, tensioactivos no iónicos, tensioactivos iónicos, tensioactivos de silicona,, compuestos de alto peso molecular, y mezclas de base acuosa y mezclas en emulsión de vehículos opcionalmente seleccionados de los vehículos mencionados con anterioridad.

La composición dermatológica y/o para el cuidado del cabello de la presente invención puede contener, además, varios componentes usados convencionalmente en productos cosméticos y fármacos, etc. Ejemplos de dichos componentes incluyen vitamina A tal como aceite de vitamina, retinol y acetato de retinol; vitamina B² tal como riboflavina, riboflavina butírica y dinucleótido de flavina adenina; vitamina B6 tal como clorhidrato de piridoxina y dioctanotao de piridoxina, vitamina C tal como ácido L-ascórbico, éster del ácido dipalmítico del ácido L-ascórbico, sulfato 2-sódico del ácido L-ascórbico, éster del ácido fosfórico del ácido L-ascórbico, diéster dipotásico del ácido fosfórico del ácido DL-a-tocoferol-L-ascórbico, ácidos patoténicos tales como pantotenato de calcio, alcohol D-pantotenílico, éter etílico de pantotenilo y éter etílico de acetilpantotenilo, vitamina D tal como ergocalciferol y colecalciferol; ácidos nicotínicos tales como ácido nicotínico, amida del ácido nicotínico y nicotinato de bencilo; vitamina E tal como a-tocoferol, acetato de tocoferol, nicotinato de DL-a-tocoferol y cinamato de DL-a-tocoferol; vitaminas tales como vitamina P y biotina; aceites tales como aceite de palta, aceite de palmera, aceite de maní, grasa de res, aceite de salvado de arroz, aceite de jojoba, aceite de onagra vespertina, cera carnauba, lanolina, parafina líquida, esqualano, palmitato de isoestearilo, alcohol isoestearílico y tri-2-etilhexanoato de glicerol; humectantes tales como glicerol, sorbitol, polietilenglicol, 1,3-butilenglicol, colágeno, ácido hialurónico, sulfato de condroitina y sulfato sódico de dextrano; absorbentes ultravioletas tales como p-di-metilaminobenzoato de amilo, metoxicinamato de octilo, 4-terc-butil-4-metoxi-dibenzoil-metano, di-p-metoxicinamato mono-2-etil hexanoato de glicerilo, 2-hidroxi-4-metoxibenzofenona, 2-hidroxi-4-metoxibenzofenona-5-sulfonato de sodio, ácido urocánico y diisopropilcinamato de etilo; antioxidantes tales como eritorbato de sodio y p-hidroxianisol; tensioactivos tales como estearilsulfato de sodio, cetilsulfato de dietanolamina, sacarina de cetiltrimetilamonio, isoestearato de polietilenglicol, alcohol de polioxietilenoctildodecilo, monoisoestearato sorbitano, aceite de ricino polioxietilenohidrogenado, araquidato de glicerilo, diisoestearato de diglicerilo y fosfolípido; conservantes tales como p-oxibenzoato de metilo, p-oxibenzoato de etilo y p-oxibenzoato de butilo; antiflogísticos tales como derivados del ácido glicirrizínico, derivados del ácido glicirrezínico, derivados del ácido salicílico, quinoquitiol, óxido de zinc y alantoína; agentes blanqueadores de belleza tales como extracto de placenta, glutationa y extracto de saxífraga; extractos de felodendron, rizoma de coptis, litospermo, raíz de plony, herba swertia, abedul, salvia, níspero, zanahoria, aloe, malva, iris, uvas, semilla de coix, lufa egipcia, azucena, azafrán, rizoma de cnidium, jengibre, Mosto de San Juan, aznillo, romero y ajo, agentes de activación tales como tal como gelatina real, principio fotosensible, derivados del colesterol y extracto de sangre de bovinos bebé; agentes estimulantes del flujo sanguíneo tales como Y-orizanol; agentes antiseborreicos tales como azufre y tiantol; aglutinantes tales como polímero de carboxivinilo, carboximetil celulosa y carboxihidroxipropil celulosa; perfumes; agua; alcoholes; materiales colorantes tales como amarillo de titanio, rojo cartamina y cártamo, y resinas en polvo tales como polietileno y nylon.

La forma farmacéutica de la composición dermatológica y/o para el cuidado del cabello de acuerdo con la presente invención no está limitada. Ejemplos de ésta incluyen preparaciones solubilizadas tales como preparaciones en agua o aceite, lavado de belleza, emulsiones sales como lociones lechosas o cremas, y ungüentos, dispersiones y polvos.

Las composiciones dermatológicas y/o para cuidado del cabello particulares y los constituyentes de las mismas son descritas, pero bajo ningún concepto son limitadas a, las siguientes (las cantidades no están limitadas a las dadas específicamente y son expresadas en términos de % en peso): Líquido cosmético: Componente dipéptido (5,0); acetato de tocoferol (0,01); glicerol (4,0); 1,3-butilenglicol (4,0); etanol (7,0); éter de alcohol oleílico de polioxietileno (50 mol) (0,5); p-oxibenzoato de metilo (0,2); ácido cítrico (0,05); citrato de sodio (0,1); perfume (0,05) y agua purificada (resto). El componente ácido cítrico, citrato de sodio, glicerol, 1,3-butilenglicol y dipéptido debe ser disuelto en el agua purificada. Por separado, el éter de alcohol oleílico de polioxietileno, acetato de tocoferol, perfume y p-oxibenzoato de metilo deben ser disueltos en etanol. La solución resultante debe ser añadida a la solución de agua purificada para solubilización, y la mezcla debe ser filtrada para dar un líquido cosmético.

Crema: (1) Alcohol cetoestearílico (3,5); (2) equalano (40,0); (3) cera de abeja (3,0); (4) lanolina reducida (5,0); (5) poxibenzoato de etilo (0,3); (6) monopalmitato sorbitano de polioxietileno (20 mol) (2,0); (7) estearato monoglicérido (2.0) ; (8) N-estearoil glutamato de sodio (0,5); (9) 2-hidroxi-4-metoxibenzofenona (1,0); (10) acetato de retinol (2,0); (11) aceite de onagra vespertina (0,05); (12) perfume (0,03); (13) componente dipéptido (0,01); (14) 1,3-butilenglicol (5.0) ; (15) polietilenglicol 1500 (5,0) y (16) agua purificada (resto). Los componentes (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11) y (12) serán disueltos con calor entre sí, y la solución será añadida a los componentes (13), (14), (15) y (16) calentada hasta 75 °C con agitación. La mezcla será tratada por un homomezclador para reducir el tamaño de las partículas emulsionadas y cocinada rápidamente mientras se agita para dar una crema.

Loción lechosa: ácido esteárico (1,5); alcohol cetílico (0,5); cera de abejas (2,0); monooleato de polioxietileno (10 mol) (1.0) ; metoxicinamato de octilo (2,0); fosfato de L-ascorbato de magnesio (0,2); componente dipéptido (1,0); hialuronato de sodio (0,1); trietanolamina (0,75); glicerol (7,0); etanol (3,0); p-oxibenzoato de etilo (0,3); perfume (0,03) y agua purificada (resto). El perfume será añadido a etanol, para disolver el perfume (fase alcohólica). El glicerol, la trietanolamina, el hialuronato de sodio, el diéster dipotásico del ácido fosfórico del ácido DL-a-tocoferol-L-ascórbico y el dipéptido serán añadidos y disueltos en agua purificada, y la solución será mantenida a 70 °C (fase acuosa). Los otros componentes serán mezclados y disueltos con calor entre sí, y la solución luego será mantenida a 70 °C (fase oleosa). La fase oleosa será añadida a la fase acuosa para conducir una emulsificación preliminar, y la mezcla será emulsionada homogéneamente por una homomezcladora. La emulsión será añadida a la fase alcohólica mientras se agita, y la mezcla será enfriada hasta 30 °C mientras se agita para dar una solución emulsionada.

Espuma: (1) Componente dipéptido (0,5); (2) 1,3-butilenglicol (5,0); (3) glicerol (7,0); (4) p-oxibenzoato de metilo (0,1); (5) hidróxido de potasio (0,15); (6) ácido esteárico (0,5); (7) ácido mirístico (1,0); (8) alcohol batílico (1,5); (9) polioxietileno (60 mol)-aceite de ricino hidrogenado (3,0); (10) perfume (0,05); (11) petróleo gaseoso licuado (6,0); (12) éter de dimetilo (3,0) y (13) agua purificada (resto). Los componentes (1), (2), (3), (4) y (5) serán añadidos y disueltos con calor en el componente (13) a 70 °C, y una solución preparada por disolución con calor de los componentes (6), (7), (8), (9) y (10) entre sí a 75 °C serán añadidos a lo anterior. La mezcla será agitada minuciosamente y luego enfriada, y a partir de entonces, la mezcla será envasada en un recipiente, y los componentes (11) y (12) serán envasados finamente en el recipiente para dar una máscara de espuma.

Ungüento: Componente dipéptido (0,5); acetato de tocoferol (1,0); palmitato de retinol (0,5); alcohol estearílico (18,0); cera japonesa (20,0); monooleato de polioxietileno (20 mol) (0,25); monoestearato de glicerol (0,3); vaselina (40,0) y agua purificada (resto). El componente dipéptido será añadido al agua purificada, y la solución será mantenida a 70 °C (fase acuosa). Los componentes restantes serán mezclados y disueltos entre sí a 70 °C (fase oleosa). La fase oleosa será añadida a la fase acuosa, y la mezcla será emulsionada homogéneamente por una homomezcladora y luego enfriada para dar un ungüento. El aspecto (2) de la invención se refiere a un procedimiento cosmético que comprende aplicar en forma tópica la composición dermatológica y/o para el cuidado del cabello respecto del aspecto (1) según lo definido con anterioridad a la piel u/o al cabello de un ser humano o un animal. En una realización preferente el procedimiento es para la revitalización o para tratamiento antienvejecimiento de la piel de un ser humano, o para la revitalización, acondicionamiento, o contra la pérdida del cabello del cabello humano o animal. Aunque la cantidad aplicada de la composición dermatológica de acuerdo con la presente invención no está limitada en particular, es preferente que la composición sea aplicada dos veces por día en una cantidad de 1,5 a 2 ml cada vez para el lavado de belleza, 1 a 1,5 ml cada vez para la loción lechosa, y aproximadamente 0,2 g cada vez para la crema.

El aspecto (3) de la invención se refiere al uso de la composición dermatológica y/o para el cuidado del cabello del aspecto (1) según lo definido anteriormente para revitalización o en un tratamiento antienvejecimiento de la piel de un ser humano, o para la revitalización, acondicionamiento, o contra la pérdida del cabello del cabello humano o animal. Para las realizaciones preferentes del aspecto (3), aplican igualmente las del aspecto (2).

La CGPasa DIP1 CphE^{a i}fue depositada por Westfalische Wilhelms-Universitat Münster, Corrensstr. 3, 48149 Münster, Alemania con el DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7b, 38124 Braunschweig, Alemania como DSM 21533.

La invención se describirá además en los siguientes Ejemplos que no se consideran limitativos de la invención.

Ejemplos

Materiales y procedimientos (estudios in vitro; ejemplos 1 y 2):

Producción de composiciones de dipéptidos: La CGP y la enzima CGPasa extracelular fueron producidas por medio de fermentaciones separadas antes de que tuviera lugar la descomposición final catalizada por CGPasa de CGP en dipéptidos. Fue usada una cepa recombinante de Ralstonia eutropha H16-PHB^'4-Aeda (pBBR1MCS-2::cph^⁶³⁰⁸/edaH16) para la producción de CGP en una fermentación de 500L, mientras que la CGPasa fue producida con la cepa de P. alcaligenes DIP1 CphE^al que ha sido depositada ante DSMZ como DSM 21533. La CGP fue extraída luego de la biomasa producida y purificada. La enzima CGPasa fue purificada del sobrenadante de cultivo. La CGP y la CGPasa producidas fueron combinadas luego bajo condiciones específicas, tras lo cual el biopolímero fue descompuesto en sus 13-dipéptidos constituyentes. Las fracciones de dipéptido de p-L-aspartil-L-arginina y I3-L-aspartil-L-lisina fueron separadas luego del resto de la reacción, analizadas para determinar la pureza por medio de HPLC, y finalmente secadas para obtener un polvo (WO2009150252 y Sallam et al., AEM 75:29-38(2009)). Los 13-dipéptidos puros fueron utilizados en los siguientes experimentos.

Aplicación experimental de los productos de análisis: En este estudio, 30 ml de una solución acuosa al 5 % de las sustancias de análisis fueron aplicados como sigue, usando una pipeta calibrada:

Análisis de vitalidad/viabilidad (Ejemplo 1): una vez al día (véase Tab. 1) por aplicación tópica así como sistémica, con agua estéril (negativa) y Triton® X-100 (positivo) como controles, y momentos de medición del análisis a las 48 y 120 h.

Análisis de proliferación de queratinocitos basales (Ejemplo 2): por vía tópica con modelos expuestos al aire como referencia y momentos de medición del análisis para la tasa de proliferación después de 3 y 6 días.

La aplicación fue realizada por duplicado (2 modelos) en todos los momentos de medición y los modelos fueron cultivados y analizados en paralelo bajo condiciones idénticas.

Modelos de piel Epidérmicos 3D EpiDerm: Actualmente, los procedimientos de análisis in vitro son una alternativa muy buena para los experimentos en animales y son cada vez más importantes para la industria cosmética. Para los productos cosméticos que son usados durante un período más prolongado, los análisis dermatológicos para determinar la inocuidad son un requisito previo esencial para la alta seguridad en la aplicación y satisfacción del cliente. Durante el desarrollo de nuevos productos cosméticos los efectos biológicos de los principios activos particulares o las formulaciones completas entran en el foco de los intereses cosméticos. El modelo de piel humana EpiDerm es un tejido epitelial de múltiples capas reconstituido in vitro que es cultivado de queratinocitos humanos normales. Comparado con la explanta de la piel humana natural el modelo muestra todas las capas típicas (stratum basale-, spinosum-, granulosum-, und stratum corneum) de la piel humana nativa. El modelo es mitóticamente así como metabólicamente activo y expresa el marcador de diferenciación típico como la pro-filagrina 1 y la citoqueratina 1/10. Más aún, el modelo muestra muchas características de la barrera cutánea humana por lo cual es apto para estudios de aplicación cosmética y análisis in vitro (P. Hayden et al., GTAM 2011, Newark, EE.UU. (2011)). Los modelos de piel Epidérmicos 3D utilizados fueron adquiridos de MatTek Corporation, Ashland, EE.UU. y cultivados bajo condiciones atmosféricas óptimas con 37 °C, 95 % de H²O y 5 % de CO² siguiendo las instrucciones de los fabricantes.

Ensayo MTT para el análisis de vitalidad/viabilidad epidérmica in vitro (Ejemplo 1): La viabilidad es considerada como la capacidad amplia de vida. Este término resume todas las actividades metabólicas que necesitan las células para sus requerimientos básicos así como para su crecimiento y proliferación. Un procedimiento establecido para medir la vitalidad de las células y los tejidos es el ensayo de vitalidad MMT. La 3-(4,5-dimetiltiazol-il)-2,5-difeniltetrazoliumbromuro, llamada en forma sintética MTT, es una sal amarilla, soluble en agua, que se convierte en formazan azul-púrpura dentro de las células, a través de reducción química del anillo de tetrazolio (T. Weiss et al., Toxicol. In Vitro J. 18(3):231-43 (2004); M. V. Berridge et al., Biochemica 4:14-19 (1996)). Los cristales de formazan son precipitados en el citosol celular, por lo cual la cantidad de precipitado se correlaciona cuantitativamente con la vitalidad celular general. Por consiguiente, el Ensayo de MMT puede considerarse un indicador para la vitalidad o "Aptitud" de un tejido, porque los procesos celulares como la respiración y la extracción de energía conducen a la reducción de MTT.

El objetivo de este experimento fue examinar el potencial de las sustancia de prueba para revitalizar el tejido. Para este fin, fueron usados modelos de piel Epidérmicos 3D. Los modelos de piel utilizados fueron incubados en medio de ensayo (MatTek) con 1 mg/ml de solución de MTT durante 3 horas a 37 °C, 95 % de H²O, 5 % de CO² en la oscuridad. Después del período de incubación la base de las jarras modelo fueron tocadas suavemente con paño estéril para retirar el exceso de mezcla medio/MTT. Los modelos fueron transferidos a una nueva placa estéril de 24 pocillos y se añadieron posteriormente 2 ml de isopropilo. Para evitar la evaporación, las placas fueron selladas con parafilm, cubiertas con papel aluminio e incubadas 2 horas en un agitador para extraer los cristales de formazan. La densidad óptica de los cristales liberados de todos los extractos fue determinada en 570 nm. Los valores medidos fueron analizados y evaluados. La OD⁵⁷⁰ del control negativo (agua) tenía que ser como mínimo 0,8. El coeficiente de variación (CV) de las muestras tratadas idénticas tiene que ser < 30 % con excepción de las muestras de menos de 0,3. La vitalidad fue derivada de promedios de las OD determinadas por lo cual el agua tratada, el control de cultivo óptimo, fue fijada como 100 % de vitalidad [vitalidad: 100* (OD^{sustancia de prueba} / OD^control)].

Tabla 1: Diseño e implementación del estudio

(continuación)

Evaluación de la tasa de proliferación de queratinocitos basales (Ejemplo 2): La piel humana está compuesta por epidermis, dermis y sub-cutis. La epidermis descansa sobre la dermis papilar y está anclada a través de una lámina basal que consiste en proteínas de la matriz extracelular, que es llamada zona de junción dermo-epidérmica (F. Chehrehasa et al., J. Neu Meth. 177:122-130 (2009); A. Tuschil et. al., J. Invest. Dermatol. 99:294-298 (1992)). La epidermis posee una capa de células basales con células en constante crecimiento (queratinocitos basales). Esas células actúan exclusivamente para la regeneración de la epidermis y la retención de la homeóstasis de tejidos. Surgen células recién nacidas a través del proceso de mitosis y migran a las capas supra basales (stratum spinosum) donde pierden su capacidad de proliferar y comenzar a diferenciarse. Al final de este proceso, las células altamente diferenciadas del estrato granuloso se cornifican, mueren y constituyen el estrato córneo. El origen de queratinocitos dentro de la capa basal compensa la pérdida de células que se descaman de la capa callosa. Esto conduce a una renovación constantemente y uniformemente de células epidérmicas y el mantenimiento de la homeóstasis epidérmica (H.J. Stark et al., J. Inv. Derm. 11:93-105 (2006); H. A. Rennekampff et. al., J. Surg.I Res. 93:41-54 (2000)).

Click iT®-EdU (ensayo de proliferación celular): Para marcar específicamente el crecimiento y la proliferación de queratinocitos basales, fue utilizado el Ensayo Click-iT®-EdU (Life Technologies) (F. Chehrehasa et al., J. Neu Meth.

177:122-130 (2009)). La 5- etinil-2'-desoxiuridina (EdU) es un análogo a base de timidina cuyo grupo metilo terminal fue intercambiado con un grupo etino. Este grupo etino reacciona con una azida activa fluorescente y permite la detección molecular visual de DNS que se replica dentro de la fase de síntesis de la mitosis (fase S).

Evaluación de la tasa de proliferación: A partir de cada modelo de piel usado, fueron tomadas biopsias por punción de 6 mm, sumergidas en O.C.T.™, crioconservadas en la fase gaseosa de nitrógeno líquido y posteriormente cortadas en secciones de 5-6 |jm. Los núcleos de cada sección fueron contados (fluorescencia azul, DAPI) y el porcentaje de los núcleos que proliferaron (fluorescencia roja) fue determinado.

Microscopio con fluorescencia: Las células marcadas con Click-iT®-EdU fueron teñidas de rojo (Aex 594 nm). Los núcleos completos del tejido se contra-tiñeron de azul con DAPI (Aex 358 nm). Las células teñidas con Click-iT®-EdU y DAPI fueron registradas solamente y posteriormente fusionadas. El análisis de fluorescencia y la documentación fue realizado con el ZEISS, Axio Scope A1HAL 100.

Tabla 2: Diseño e implementación del estudio

Materiales y procedimientos (estudios in vivo: ejemplo 3):

Producción de composiciones de dipéptidos: ambos dipéptidos fueron producidos y analizados de acuerdo con los procedimientos descritos para los análisis in vitro anteriores.

Panelistas: El panel de prueba incluyó 5 voluntarias adultas con piel seca, elasticidad inferior al promedio y patas de gallo en la periferia ocular. Al comienzo de la prueba de aplicación todos los sujetos habían sido controlados por un dermatólogo. Solo fue permitido unirse al estudio a sujetos sin diagnóstico de modificaciones patológicas de la piel. Durante la prueba de aplicación todos los sujetos tuvieron, en caso de irritaciones cutáneas agudas, acceso a consultas diarias de un especialista médico a cargo quien acompañó la prueba. Fueron posibles las consultas diarias sobre las condiciones de la piel a través del médico que acompañó en el estudio.

Aplicación experimental de los productos de análisis: Las áreas de análisis fueron de aproximadamente 3 cm de diámetro. Los productos de análisis fueron aplicados en el antebrazo (soluciones acuosas al 5 % y 10 %, análisis de elasticidad de la piel e hidratación) así como las patas de gallo (solución acuosa al 5 %). La aplicación de las preparaciones había sido realizada dos veces por día durante todo el período de análisis (4 semanas). Se les había instruido a los sujetos que no utilizaran otros productos para el cuidado en esta área de análisis. Las áreas de piel no tratadas fueron usadas como control.

Análisis de elasticidad: El análisis fue realizado en un Cutometer MPA 580 Fa. Courage+Khazaka electronics GmbH. El principio de medición está basado en el principio de succión / elongación. Para obtener las condiciones de partida el instrumento fue ajustado para una presión baja de 450 mbar. El tiempo de succión fue definido en 5 seg. El tiempo de relajación (pérdida abrupta de baja presión) fue fijado en 3 segundos. Todas las mediciones han sido repetidas tres veces para cada área de análisis y de control. Después de eso, ha sido calculada una media de los valores de R2 obtenidos de tres mediciones independientes por área. Para realizar las mediciones el instrumento fue ajustado para los parámetros nombrados antes de comenzar el análisis. Todos los ajustes de parámetros descritos en la bibliografía como usados principalmente y confiables permanecieron sin cambios durante las mediciones. La cutometría ha sido realizada al comienzo y al final del período de aplicación. Los valores de R2 han sido medidos y analizados para cada sujeto.

Humedad de la piel: este aspecto fue analizado usado el Corneometer CM 825 (Firma Courage+Khazaka). Los productos de análisis fueron aplicados dos veces por día en áreas predeterminadas relevantes de la piel durante el período de aplicación. Las personas del análisis fueron aclimatadas durante 45 minutos a una temperatura de 22 grados centígrados y 60% de humedad relativa antes de cada medición, luego, los valores de medición de la piel fueron medidos en tres lugares diferentes dentro de las respectivas áreas de análisis. Los valores registrados fueron promediados. La piel no tratada cerca del área de análisis fue usada como área de medición de control. Las mediciones fueron tomadas antes de la aplicación y después de cuatro semanas de aplicación. Todas las mediciones fueron realizadas al menos 10-12 horas después de la última aplicación del producto usado anteriormente con respecto al producto de análisis.

Profundidad de arrugas individuales: La medición 3D óptica usando un sistema portátil compacto PRIMOS (Medición Rápida de Desviación de Fases In vivo de la Piel) para esta medición. El sistema PRIMOS compacto portátil fue aplicado en un área de 40 x 30 mm y fueron tomadas fotos digitales del área medida. Una resolución lateral de 63 |jm y una resolución de profundidad de > 4 jm fueron aplicadas para medir fotos 3D (la exactitud de medición es > 5 jm). Para una densidad particular de los puntos seleccionados para los ejes x e y, un programa de ordenador extrae una imagen tridimensional realista del alivio de la piel sobre una pantalla de color. Finalmente, los datos de la medición generados fueron procesados y luego evaluados. Este análisis consiste en las siguientes etapas: 1. Procedimiento de coincidencia del área de la referencia y superficie de la piel que será comparada con 2. Medición de los datos geométricos, es decir, profundidad, distancia o radio. Con el software PRIMOS los cambios en la estructura de la epidermis pueden clasificarse cuantitativamente con ayuda de varios parámetros estandarizados de medición de superficies de acuerdo con DIN (Deutsche Industrie Norm, estándares industriales alemanes) e ISO (Organización de Estándares Internacionales). Los cálculos fueron llevados a cabo por referencia a los estándares DIN relevantes, y los elementos de perfil de onda larga son removidos según se requiera para realizar los polinomios. El perfil de la vista de corte usada aquí sirve para proporcionar la profundidad de una aguja individual. La profundidad del pliegue de la piel puede medirse por determinación de las distancias.

Ejemplo 1: Vitalidad/viabilidad epidérmica in vitro.

Según lo mostrado en la Fig. 1, todas las sustancias de análisis utilizadas condujeron a un aumento de la vitalidad después de 48 horas de incubación, comparado con los modelos tratados con agua. El control positivo, 1% Triton® X-100, redujo la viabilidad celular por debajo de 50 % (7,12 %) como se esperaba. El valor más alto (127,23 %) después de 48 horas de incubación sistemática fue objetivado para determinar el dipéptido p-L-aspartil-L-arginina.

La aplicación tópica de las sustancias de análisis produjeron vitalidades de tejido elevadas también (véase la Fig. 2) pero no hasta un grado distinto que para la aplicación sistemática. Este es el caso principalmente debido a la mejor biodisponibilidad de los productos de análisis aplicados sistemáticamente, porque no tuvieron que pasar la barrera cutánea. Los valores más altos (112,36 %) fueron observados nuevamente para la sustancia p-L-aspartil-L-arginina. Después de 120 horas de incubación sistémicamente, fueron objetivados valores levemente inferiores (véase la Fig. 3), comparado con 48 horas. Los valores más altos (118,16 %) fueron observados nuevamente para la sustancia de análisis p-L-aspartil-L-arginina.

Después de 120 horas de aplicación tópica fueron observados valores más altos, comparado con los resultados a las 48 horas (véase la Fig. 4). Debido al tiempo de incubación más extenso una concentración suficiente de sustancias de análisis pareció alcanzar capas celulares más profundas y se tornó disponible para las células. Los valores más altos (120,61 %) fueron observados también aquí para el dipéptido de análisis p-L-aspartil-L-arginina. El presente análisis de viabilidad reveló que las sustancias analizadas fueron muy bien toleradas por los modelos de piel Epidérmicos 3D utilizados. Cada sustancia mostró un efecto revitalizante sobre las células de la piel después de 48 horas y 120 horas sin importar el modo de aplicación. La aplicación a corto plazo (48 horas) mostró tasas de vitalidad levemente más altas a través de la aplicación sistémica mientras que después de una incubación prolongada (120 horas) los modelos aplicados en forma tópica tuvieron tasas de vitalidad más alta. Los valores más altos fueron observados en forma consistente con el dipéptido p-L-aspartil-L-arginina.

Ejemplo 2: Proliferación in vitro de queratinocitos basales.

Los modelos de piel expuestos al aire fueron comparados con los tratados con sustancias respecto de la tasa de proliferación de queratinocitos basales epidérmicos. Los modelos fueron crioconservados, preparados histológicamente y teñidos específicamente después del respectivo período de incubación (por ejemplo, Fig. 5 después de 3 días). Para evaluar la tasa de proliferación, los queratinocitos basales fueron contados y la relación entre la fluorescencia roja (proliferativa) y la fluorescencia azul (no proliferativa) fue determinada (véase la Fig. 5). Un mínimo de 1500 núcleos fueron contados para cada sustancia de análisis y para los modelos expuestos al aire, dos veces. Los resultados del conteo fueron resumidos en las Tablas 3 y 4.

Tabla 3: Recuento resumido de células proliferativas después de 3 días de incubación

Después de un período de incubación de 3 días fue encontrado que el dipéptido p-L-aspartil-L-lisina (16,33 %) aumentó la actividad de proliferación de queratinocitos basales, comparado con los modelos expuestos al aire (11,21%), mientras que la proporción más alta fue encontrada en modelos tratados con el dipéptido p-L-aspartil-L-arginina con 30,98 %.

Tabla 4: Recuento resumido de células proliferativas después de 6 días de

incubación

Después de 6 días el dipéptido p-L-aspartil-L-arginina mostró el aumento de proliferación determinado más alto confirmando los resultados obtenidos después de 3 días.

El presente estudio reveló que las sustancias analizadas fueron muy bien toleradas por los modelos de piel Epidérmico 3D utilizados. No fue observado efecto negativo sobre la vitalidad o la morfología de los tejidos.

Cada sustancia mostró un efecto estimulante sobre la proliferación de queratinocitos basales sobre los modelos de piel 3D, lo que fue más prominente para el dipéptido p-L-aspartil-L-arginina.

Ejemplo 3: Estudios in vivo para tolerancia, elasticidad, hidratación y profundidad de las arrugas cutáneas.

Tolerancia: La totalidad de los 5 participantes del estudio toleraron ambos productos de análisis y todas las concentraciones analizadas fueron bien toleradas durante el transcurso del análisis de aplicación de cuatro semanas bajo criterios dermatológicos y clínicos. No fueron observadas reacciones cutáneas indeseadas o patológicas en el área del análisis.

Elasticidad de la piel: p-L-aspartil-L-arginina: En el área tratada del antebrazo volar, fue medida una mejora en la elasticidad de la piel de aproximadamente 9,11 % para la solución acuosa al 5 % y 8,70 % para la solución acuosa al 10 %. La mejora promedio en la elasticidad de la piel sobre el antebrazo, después de 4 semanas de aplicación de producto llegó al 9,26 % (solución acuosa al 5 %) y 8,85 % (solución acuosa al 10 %) así como 8,08 % de mejora en el área de las patas de gallo(solución acuosa al 5 %) después de la deducción del área de control.

p -L-aspartil-L-lisina (5 %): En el área tratada del antebrazo volar, fue medida una mejora en la elasticidad de la piel de aproximadamente 6,03 %. En el área tratada de patas de gallo (ojo izquierdo), fue medida una mejora promedio de 11,06 %. El cambio promedio en la elasticidad de la piel en el área de control no tratada ascendió a -0,15 %. La mejora promedio en la elasticidad de la piel sobre el antebrazo, después de 4 semanas de aplicación de producto llegó 6,18 % así como 11,21 % de mejora en el área de las patas de gallo después de la deducción del área de control.

Hidratación de la piel: p-L-aspartil-L-arginina: En el área tratada del antebrazo volar, fue medida una mejora en la humedad de la piel de aproximadamente 1,126 % (solución acuosa al 5 %) y 0,871 % (solución acuosa al 10 %). En el área tratada de patas de gallo (periferia del ojo izquierdo) fue medida una mejora en la humedad de la piel de aproximadamente 1,873 %. El cambio promedio en la humedad de la piel en el área de control no tratada ascendió a 0,31 %. La mejora promedio en la humedad de la piel después de 4 de aplicación del producto ascendió al 0,82 % y 0,56 % en el antebrazo volar y 1,56 % en las patas de gallo (después de la deducción del área de control).

p -L-aspartil-L-lisina (5 %): En el área tratada del antebrazo volar, fue medida una mejora en la humedad de la piel de aproximadamente 2,05 %. En el área tratada de patas de gallo (periferia del ojo izquierdo) fue medida una mejora en la humedad de la piel de aproximadamente 16,10 %. El cambio promedio en la humedad de la piel en el área de control no tratada ascendió a 0,31 %. La mejora promedio en la humedad de la piel después de 4 semanas de aplicación de producto llegó 1,74 % en el antebrazo volar y 15,79 % junto a los ojos (después de la deducción del área de control).

Profundidad de la arruga individual: La profundidad de las arrugas en una arruga individual ha sido medida en 5 sujetos antes y después de usar preparaciones durante un período de cuatro semanas para determinar el efecto de la preparación de soluciones acuosas al 5 % de los productos de análisis.

Las arrugas cutáneas fueron medidas con el uso de mediciones 3D ópticas extendidas sobre la superficie de la piel. En las áreas tratadas, la mejora promedio en la profundidad de las arrugas ascendió a 16,4 % en el caso de p-L-aspartil-L-arginina, y a 20,02 % en el caso de p-L-aspartil-L-lisina (véase la fig. 6).

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Uso de una composición que comprende uno o más 13-dipéptidos, o sus oligómeros, o sus sales, en el que los 13-dipéptidos comprenden 13-L-aspartilo como un primer residuo de aminoácido, para el cuidado cosmético dermatológico y/o capilar.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que el segundo residuo de aminoácido es seleccionado de arginina, lisina, ornitina, glutamato, citrulina y canavanina.

3. El compuesto de la reivindicación 1, en el que

(i) el segundo residuo de aminoácido es arginina o lisina; y/o

(ii) el segundo residuo de aminoácido es de configuración L o D.

4. El uso de la reivindicación 1, en el que la composición comprende los dipéptidos p-L-aspartil-L-arginina y/o p-L-aspartil-L-lisina.

5. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que

(i) el oligómero comprende dos o más p-dipéptidos unidos covalentemente, y/o

(ii) uno o más 13-dipéptidos son químicamente modificados.

6. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la composición comprende de 0,00001 a 50% en peso de 13-dipéptidos o sus oligómeros, preferentemente de 0,0001 a 10% en peso y mucho más preferentemente de 0,01 a 5% en peso de los dipéptidos.

7. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la composición comprende, además, uno o más aminoácidos o sus sales.

8. El compuesto de la reivindicación 7, en el que

(i) los aminoácidos libres son seleccionados de arginina, lisina, cisteína, glicina, prolina, y/o

(ii) la composición comprende de 0,001 a 10% en peso de los aminoácidos libres.

9. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la composición comprende, además, un componente de soporte seleccionado de vitaminas, ácidos grasos, minerales u oligoelementos convencionalmente usados en composiciones dermatológicas y/o para el cuidado de la piel incluyendo vitamina A, C, D, E, B5, B6, B7, B12, ácido fólico omega-3, selenio, zinc, magnesio y hierro.

10. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la composición comprende, además, un vehículo aceptable para uso dermatológico y/o para el cuidado del cabello, incluyendo agua, alcoholes inferiores, alcoholes superiores, alcoholes polihídricos, monosacáridos, disacáridos, polisacáridos, aceites de hidrocarburos, grasas y aceites, ceras, ácidos grasos, aceites de silicona, tensioactivos no iónicos, tensioactivos iónicos, tensioactivos de silicona, compuestos de alto peso molecular, y mezclas de base acuosa y mezclas en emulsión de los vehículos antes mencionados, y componentes usados convencionalmente en las composiciones dermatológicas y/o para el cuidado del cabello.

11. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la composición es una composición dermatológica cosmética y/o para el cuidado del cabello aplicable de manera externa/tópica que incluye líquido cosmético, crema, loción lechosa, máscara de espuma y ungüento.

12. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la composición es una composición revitalizante de la piel, humectante, antienvejecimiento, acondicionadora de la piel, acondicionadora del cabello o estimulante del crecimiento del cabello.

13. Un procedimiento cosmético que comprende aplicar en forma tópica la composición según lo definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 a la piel o al cabello de un ser humano o animal.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, que es una composición revitalizante, humectante, antienvejecimiento, acondicionadora de la piel, acondicionadora del cabello o estimulante del crecimiento del cabello.