ES2855577T3 - Molécula de ácido nucleico funcional y uso de la misma - Google Patents
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Abstract
Una molécula de ácido nucleico funcional que actúa en trans que comprende: (a) una secuencia determinante de la diana que comprende una secuencia antisentido para una secuencia diana en el ARN que codifica la proteína para el que se va a incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas; y (b) una secuencia reguladora que comprende: (1) un ARN, que está codificado por un ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 1; (2) un ARN, que está codificado por un ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 2; (3) un ARN, que está codificado por un ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 3; (4) un ARN codificado por un ADN que consiste en una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias que se muestran en la siguiente tabla: **(Tabla)** o; (5) un ARN que es al menos 95% similar al ARN de (1), (2), (3) o (4) y tiene la función de incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas.
Description
DESCRIPCIÓN
Molécula de ácido nucleico funcional y uso de la misma
Campo técnico
La presente invención se refiere a (a) una molécula de ácido nucleico funcional que tiene la función de incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas, y (b) un uso de la molécula de ácido nucleico funcional.
Técnica anterior
Existen varios tipos de moléculas de ácido nucleico funcionales, tipificadas por moléculas de ARN funcionales relativamente largas, tales como el ARN antisentido, por ejemplo. Otros ejemplos típicos de moléculas de ácido nucleico funcionales son moléculas de ARN funcionales relativamente cortas, tales ARNhc (ARN en horquilla corta), ARNip (ARN de interferencia pequeño) y miARN (ARN micro interferente). Generalmente se sabe que estas moléculas de ARN funcionales contribuyen a la regulación por disminución de la expresión génica. Se han revisado ampliamente varios ejemplos como "ARN de interferencia" como en (Bibliografía no Relacionada con Patentes 1).
Una técnica de ARN antisentido tiene una especificidad de la diana excelente. Sin embargo, esta técnica tiene la desventaja de que se activa una respuesta antiviral en una célula. Por el contrario, la técnica que utiliza moléculas de ARN funcionales relativamente cortas, tales como el ARNhc, no activa prácticamente la respuesta antiviral. En cambio, las moléculas de ARN funcionales relativamente cortas tienen la posibilidad de causar efectos en sitios diferentes al sitio diana ("off-target") ya que es difícil que la longitud de secuencia corta mantenga una alta especificidad para las secuencias diana. Por tanto, las moléculas de ARN funcionales relativamente cortas tienden a mostrar una escasa especificidad diana en comparación con la técnica de ARN antisentido.
La bibliografía Relacionada con Patentes 1 describe una molécula de ácido nucleico funcional (molécula de ADN) que comprende: un promotor pol III de tipo III; una secuencia idéntica o complementaria a una secuencia diana que realiza una regulación por disminución; y una secuencia obtenida de ARN pequeño de 7SL (más específicamente, un fragmento de una secuencia obtenida de Alu) que incluye al menos dominios de unión a proteínas srp9 y srp14. Las proteínas srp9 y srp14 son miembros de una familia de proteínas que se unen a un ARN 7SL en la transcripción génica para formar un complejo de ARN 7SL.
Se describe que la molécula de ácido nucleico funcional descrita en la Bibliografía Relacionada con Patentes 1 se utiliza como una técnica de regulación por disminución de la expresión génica en la que una molécula de ARN transcrita a partir de la molécula de ácido nucleico funcional prácticamente no provoca activación de respuesta antiviral y tiene una excelente especificidad de diana.
Alu se clasifica en un grupo de SINE (Elementos Cortos Intercalados). Obsérvese que la secuencia obtenida de Alu de la molécula de ácido nucleico funcional descrita en la Bibliografía Relacionada con Patentes 1 se inserta en una orientación particular y se considera que está implicada en la estabilidad del ARN.
Por otro lado, se ha informado de que algunas pequeñas moléculas de ARN también pueden mejorar el nivel de transcripción.
Lista de referencias
Bibliografía Relacionada con Patentes 1
Publicación internacional WO 2008/113773 A2 (Fecha de Publicación: 25 de Septiembre de 2008)
Bibliografía No Relacionada con Patentes 1
He L, Hannon GJ. Nat Rev Genet. Julio de 2004; 5(7):522-31. PMID: 15211354
Compendio de la invención
Problema técnico
Como se informa ampliamente en la Bibliografía Relacionada con Patentes 1 y otros documentos, se conocen bien muchos tipos de moléculas de ácido nucleico funcionales que regulan por disminución la expresión génica o similares. Aunque ha habido algunas técnicas para regular por incremento la expresión génica aumentando la eficacia de la transcripción (como en el caso de Nature Chemical Biology 3, 166-173 (2007), B. Janowski et al), el incremento de la eficacia de la transcripción no siempre aumenta la eficacia de la síntesis de proteínas en proporción directa debido al efecto meseta. En este sentido, la síntesis de la proteína traducida puede depender de muchos otros factores, incluida la capacidad de un ARN dado para interactuar de manera eficaz con los ribosomas. Adicionalmente, no siempre es posible aumentar la transcripción del ARNm natural en las células u organismos. Es decir, no se ha informado de ninguna molécula de ácido nucleico funcional que incremente directamente la eficacia de la síntesis de proteínas.
Los autores de la presente invención consideran que existen muchas condiciones en las que se desea actuar únicamente sobre la traducción. Por ejemplo, la potenciación de la traducción de una proteína animal con fines terapéuticos sin interferir en su transcripción puede ser muy deseable porque no requiere la reprogramación de la transcripción del ARNm en el núcleo.
La presente invención se logra en vista del problema anterior. Un objeto de la presente invención es proporcionar una molécula de ácido nucleico funcional que tenga la función de incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas y un uso de la molécula de ácido nucleico funcional.
Solución al problema
El conocimiento actual de los autores de la presente invención sugirió que la traducción de proteínas puede estar regulada por factores que incluyen la estructura de las regiones de los ARNm que se coloca aguas arriba de la fracción traducida de los ARNm. Esta región se conoce como 5' UTR (región 5' no traducida). Para el propósito de esta invención, la 5' UTR puede ser natural (que se encuentre en los ARN naturales, desde el sitio de inicio de la transcripción hasta el codón de inicio de la proteína), o puede ser una secuencia artificial, tal como la secuencia presente en un vector de clonación o cualquier otra secuencia recombinante.
Los autores de la presente invención estudiaron diligentemente para lograr el objeto anterior. En consecuencia, a través del análisis de las funciones de las moléculas de ARN conocidas como ARN no codificantes, los autores de la presente invención encontraron el hecho sorprendente de que una estructura particular de tal molécula de ARN tiene la función de incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas. Este ácido nucleico funcional mostró el efecto contra una proteína diana específica a través de una secuencia antisentido para una secuencia diana. Basándose en los hallazgos, los autores de la presente invención han logrado la presente invención.
Es decir, una molécula de ácido nucleico funcional según la presente invención comprende:
(a) una secuencia determinante de la diana que comprende una secuencia antisentido para una secuencia diana en el ARN que codifica la proteína para el que se va a incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas; y
(b) una secuencia reguladora que tiene la actividad de incrementar la eficacia .
En la molécula de ácido nucleico funcional según la presente invención, la secuencia reguladora comprende un elemento SINE (Elemento Intercalado Corto) B2. Las secuencias SINE B2 se enumeran en la Tabla 1 a continuación.
En la molécula de ácido nucleico funcional de acuerdo con la presente invención, la secuencia reguladora se puede seleccionar del grupo que consiste en los siguientes (1) a (5):
(1) un ARN, que está codificado por un ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 1 (SINE/B2 en AS Uchl1)
(2) un ARN, que está codificado por un ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID n O: 2 (SINE/B2, espaciador de 39 nt indicado como subrayado y SINE/Alu en AS Uchl1)
(3) un ARN, que está codificado por un ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 3 (SINE/B2 en AS Uxt)
(4) un ARN codificado por un ADN que consiste en una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias mostradas en la Tabla 1; o
(5) un ARN que es al menos 95% similar al ARN de los apartados (1), (2), (3) o (4) y tiene la función de incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas.
En la molécula de ácido nucleico funcional de acuerdo con la presente invención, la secuencia determinante de la diana comprende una secuencia antisentido para una secuencia diana en el ARN que codifica la proteína para el que se va a incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas.
En la molécula de ácido nucleico funcional de acuerdo con la presente invención, la secuencia determinante de la diana puede estar ubicada entre un extremo 5' y la secuencia reguladora en la molécula de ácido nucleico funcional.
En la molécula de ácido nucleico funcional de acuerdo con la presente invención, es preferible que la secuencia antisentido en la secuencia determinante de la diana tenga una longitud de más de 7 nucleótidos pero menos de 250 nucleótidos.
En la molécula de ácido nucleico funcional de acuerdo con la presente invención, es preferible que la secuencia antisentido en la secuencia determinante de la diana tenga al menos 60% de similitud con una secuencia diana en el ARN que codifica la proteína o con la secuencia del plásmido aguas arriba del ATG en el ARN que codifica la proteína para el que se va a incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas.
En la molécula de ácido nucleico funcional de acuerdo con la presente invención, es preferible que la dirección de la secuencia obtenida de SINE que está anotada como directa en la secuencia reguladora esté orientada en una dirección inversa con respecto a la dirección (dirección directa como se define anteriormente), en donde la secuencia obtenida de SINE está orientada en la misma dirección que la secuencia consenso de SINE. Es decir, la secuencia reguladora de la molécula de ácido nucleico funcional está orientada en una dirección directa con respecto a la dirección de traducción y en una orientación inversa con respecto a la dirección de transcripción de la molécula de ácido nucleico antisentido.
Si la dirección de 5' a 3' se define como la dirección de avance, la secuencia obtenida de SINE en esta invención, en donde su orientación 5' a 3' concuerda con la secuencia consenso de SINE, está integrada en la dirección inversa de la molécula de ácido funcional en esta invención.
En la molécula de ácido nucleico funcional de acuerdo con la presente invención, la secuencia antisentido en la secuencia determinante de la diana se puede diseñar para que hibride con una secuencia diana en la 5'-UTR del ARN que codifica la proteína para el cual se va a incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas. Alternativamente, la secuencia determinante de la diana se puede diseñar para que hibride con una secuencia diana en la región codificante del ARN que codifica la proteína para el que se va a incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas. Adicionalmente, la secuencia determinante de la diana se puede solapar con la secuencia del plásmido aguas arriba del codón de inicio o incluir el codón de inicio en la secuencia diana del ARN que codifica la proteína. La molécula de ácido nucleico funcional de acuerdo con la presente invención se puede dirigir a variantes de corte y empalme específicas en los extremos 5' del ARN que codifica la proteína o en otras partes de la molécula.
La molécula de ácido nucleico funcional de acuerdo con la presente invención puede ser diseñada y producida apropiadamente por un experto en la técnica relacionada, siempre que la molécula de ácido nucleico funcional incluya: una secuencia determinante de la diana que comprenda una secuencia antisentido para una secuencia diana en el ARN que codifica la proteína para el que se va a incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas; y una secuencia reguladora que tenga la actividad de incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas. Cualquier modificación durante o post/síntesis puede ser aplicada a la molécula de ácido nucleico funcional por un experto en la técnica relacionada de acuerdo con los conocimientos prácticos en procedimientos terapéuticos de ARN o similares.
Una molécula de ADN de acuerdo con la presente invención codifica cualquiera de las moléculas de ARN tales como las moléculas de ácido nucleico funcionales mencionadas anteriormente.
Un vector de expresión de acuerdo con la presente invención incluye una cualquiera de las moléculas de ARN o la molécula de ADN como moléculas de ácido nucleico funcionales mencionadas anteriormente.
Una composición para aumentar la eficacia de la síntesis de proteínas de acuerdo con la presente invención comprende una cualquiera de las moléculas de ácido nucleico funcionales antes mencionadas y/o el vector de expresión mencionado anteriormente.
Un método para incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas de acuerdo con la presente invención comprende la etapa para permitir que una cualquiera de las moléculas de ácido nucleico funcionales antes mencionadas o el vector de expresión antes mencionado coexistan con un ARN que codifique la proteína para el que se va a incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas. El ARN que codifica la proteína se puede hibridar con el antisentido en la secuencia determinante de la diana de la molécula de ácido nucleico funcional.
En el método de incremento de la eficacia de la síntesis de proteínas de la presente invención, el método puede comprender la etapa de transfectar (o transducir a) una célula cualquiera de las moléculas de ácido nucleico funcionales antes mencionadas o el vector de expresión antes mencionado.
Un método de síntesis de proteínas de acuerdo con la presente invención es un método para sintetizar una proteína, que comprende la etapa de incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas mediante uno cualquiera de los métodos de incremento de la eficacia de la síntesis de proteínas mencionados anteriormente.
Las moléculas de ácido nucleico funcionales de la presente invención se pueden utilizar para tratar una enfermedad, en donde la enfermedad está causada por una disminución cuantitativa de una proteína normal predeterminada o de una haploinsuficiencia, incrementando la eficacia de la síntesis de proteínas.
La enfermedad también puede ser causada por una disminución cuantitativa de una proteína normal predeterminada o una haploinsuficiencia. Además, la molécula de ácido nucleico funcional puede incrementar la eficacia de la síntesis de la proteína normal predeterminada.
Adicionalmente, en caso de que la enfermedad sea causada por una disminución cuantitativa de una proteína normal predeterminada o de una haploinsuficiencia, y causada por un incremento cuantitativo de otra proteína que incluya una proteína anormal similar a una proteína mutante, se pueden usar las moléculas funcionales de ácido nucleico de la presente invención combinadas con una molécula convencional para suprimir la expresión de la otra proteína mediante ARNip, ARNhc o similar, y/o una molécula convencional para inactivar una función de una proteína mediante el uso de un anticuerpo, un compuesto de bajo peso molecular, o similar, según sea apropiado.
Adicionalmente, la enfermedad puede ser una enfermedad neurodegenerativa o un cáncer, por ejemplo.
Efectos ventajosos de la invención
De acuerdo con la presente invención, es posible proporcionar satisfactoriamente (a) una molécula de ácido nucleico funcional que tiene la función de incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas y (b) un uso de la molécula de ácido nucleico funcional.
Breve descripción de los dibujos
Fig.1
La Fig. 1, relacionada con el experimento 1, es un diagrama esquemático de la organización genómica Uchl1/AS Uchl1. Los exones de Uchl1 están en color negro; las UTR de 3' y 5' están en color blanco.
Fig.2
La Fig. 2, relacionada con el experimento 2, es un diagrama esquemático de la organización del dominio AS Uchl1. Los exones de AS Uchl1 están en color gris; los elementos repetitivos están en color rojo (Alu/SINEBl) y azul (SINEB2). Los intrones se indican en forma de íneas.
Fig.3
La Fig. 3, relacionada con el experimento 3, es una vista que muestra que AS Uchl1 regula los niveles de proteína UchL1. Las células MN9D transfectadas con AS Uchl1 muestran mayores niveles de proteína UchL1 endógena con respecto al control de vector vacío, con una cantidad de ARNm sin cambios.
Fig .4
La Fig. 4, relacionada con el experimento 4, es una vista que muestra que AS Uchl1 regula los niveles de proteína UchL1. Las dosis crecientes de AS Uchl1 transfectadas valoran la cantidad de proteína UchL1 en las células HEK. Sin cambios en los niveles de ARNm de Uchl1.
Fig.5
La Fig. 5, relacionada con el experimento 5, es una vista que muestra que AS Uchl1 regula los niveles de proteína UchL1. Se requiere AS Uchl1 de longitud completa (FL) para regular los niveles de proteína UchL1 endógena (células MN9D, panel izquierdo) y expresada en exceso (células HEK, panel derecho). Se muestra el esquema de mutantes de deleción A5' o A3'.
Fig.6
La Fig. 6, relacionada con el experimento 6, es una vista que muestra que Uchl1 regula los niveles de proteína UchL1 a través de SINEB2 integrado. SINEB2 invertido es suficiente para controlar los niveles de proteína UchL1. Se muestra el esquema de mutantes.
Fig.7
La Fig. 7, relacionada con el experimento 7, es una vista que muestra los transcritos de la familia de AS con SINEB2 integrado. Familia de clones no codificantes FANTOM 3 que son AS para genes que codifican proteínas y contienen SINEB2 integrado en orientación invertida.
Fig.8
La Fig. 8, relacionada con el experimento 8, es una vista que muestra los transcritos de la familia de AS con SINEB2 integrado. Diagrama esquemático de la organización genómica Uxt/AS Uxt. AS Uxt incrementa los niveles de proteína Uxt endógena en células MN9D transfectadas (izquierda), sin afectar a su transcripción (derecha).
Fig.9
La Fig. 9, relacionada con el experimento 9, es una vista que muestra la expresión de AS Uchl1 en el núcleo de neuronas dopaminérgicas. Los transcritos de AS Uchl1 (rojo) y Uchl1 (verde) se expresan en el núcleo y el citoplasma de las neuronas DA positivas para TH de la Sustancia Negra (azul). Los detalles de la localización están en imágenes de zoom.
Fig.10
La Fig. 10, relacionada con el experimento 10, es una vista que muestra la translocación de AS Uchll al citoplasma tras el tratamiento con rapamicina en células MN9D. Niveles de ARNm medidos con cebadores que abarcan las porciones 5' solapantes o 3' distales del transcrito. Los datos indican la media ± d.t., n > 3 (3). ** p <0,01; *** p <0,005.
Fig.11
La Fig. 11, relacionada con el experimento 11, es una vista que muestra que el tratamiento con rapamicina induce la expresión de la proteína UchL1. El nivel de proteína UchL1 se incrementa en las células MN9D tratadas con rapamicina.
Fig.12
La Fig. 12, relacionada con el experimento 12, es una vista que muestra cómo SINEB2 integrado en Uchll induce la traducción de Uchll tras el tratamiento con rapamicina. El silenciamiento de la transcripción de AS Uchll en células MN9D (ARNhc, que abarca la posición -15/+4 de la secuencia diana) inhibe el nivel de proteína UchL1 inducida por rapamicina. La secuencia reguladora de ARNhc, desorganizada. A la izquierda, niveles de ARNm; a la derecha, niveles de proteína.
Fig.13
La Fig. 13, relacionada con el experimento 13, es una vista que muestra cómo SINEB2 integrado en Uchll induce la traducción de Uchll tras el tratamiento con rapamicina. La deleción de SINEB2 integrad (ASINEB2) es suficiente para inhibir la regulación por incremento de la proteína UchL1 inducida por rapamicina.
Fig.14
La Fig. 14, relacionada con el experimento 14, es una vista que muestra que un transcrito de AS artificial con SINEB2 integrado (AS Gfp) para un ARNm de Proteína Fluorescente Verde (Gfp) mejorada humanizada artificialmente incrementa la síntesis de proteína GFP: (a) de la Fig. 14 muestra el diagrama esquemático de las construcciones de Gfp/AS Gfp, (b) de la Fig. 14 muestra cómo AS Gfp aumenta los niveles de proteína Gfp en células HEK transfectadas mientras que una secuencia solapante desorganizada o un plásmido vacío no aumentan los niveles de proteína Gfp en células HEK transfectadas. El solapamiento tiene una longitud de 72 nt y está centrado en el ATG.
Fig.15
La Fig. 15, relacionada con el experimento 15, es una vista que muestra un transcrito de AS artificial con SINEB2 integrado (clon de AS Fc) para un anticuerpo recombinante artificial en pHYGRO (clones de pHYGRO) que incrementa la síntesis de la proteína codificada en pHYGRO. a, Diagrama esquemático de construcciones pHYGRO/AS Fc. b, AS Fc incrementa los niveles de proteína codificada en las células HEK transfectadas, mientras que una secuencia solapante desorganizada o un plásmido vacío no lo hacen, detectado a través de la etiqueta SV5.
Fig.16
La Fig. 16, relacionada con el experimento 16, es una vista que muestra cómo un transcrito de AS artificial con SINEB2 integrado para un ARNm de Proteína Fluorescente Verde (EGFP) incrementa la síntesis de la proteína EGFP.
Fig.17
La Fig. 17 es una vista que muestra los ejemplos de las posibles estructuras pronosticadas de la secuencia obtenida de SINE B2.
Descripción de realizaciones
A continuación se describe una realización de la presente invención, más específicamente.
[1. Molécula de ARN funcional]
(Constitución de la molécula de ácido nucleico funcional)
Una molécula de ácido nucleico funcional de acuerdo con la presente invención tiene una característica que comprende: una secuencia determinante de la diana que comprende una secuencia antisentido para una secuencia diana en el ARN que codifica la proteína para el cual se va a incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas; y una secuencia reguladora que tiene la actividad de incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas. La molécula de ácido nucleico funcional de acuerdo con la presente invención puede ser diseñada y producida apropiadamente por un experto en la técnica relacionada basándose en la descripción de la presente memoria.
La eficacia de la síntesis de proteínas se incrementa de acuerdo con la presente invención. En una realización, la eficacia de la síntesis de proteínas se incrementa como resultado del incremento de la eficacia de la traducción, preferiblemente, sin cambiar sustancialmente la eficacia de la transcripción. Por tanto, la eficacia de la síntesis de proteínas se puede incrementar aumentando la eficacia de la traducción. En otra realización, tanto la transcripción como la traducción se pueden incrementar por medios independientes; obviamente, puede darse el caso de que un ARN produzca un nivel de expresión más bajo y, sin embargo, la proteína produzca un nivel de expresión más alto.
(ARN que codifica la proteína para el que se va a incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas)
El ARN que codifica la proteína para el que se va a incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas por medio de la molécula de ácido nucleico funcional de acuerdo con la presente invención no está especialmente limitado con respecto a su secuencia, origen y similares, siempre que el ARN comprenda un dominio de traducción (región codificante) que tenga un codón de inicio 5' terminal y un codón de terminación 3' terminal. Específicamente, el ARN que codifica la proteína para el cual se va a incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas (el ARN diana) por medio de la molécula de ácido nucleico funcional de acuerdo con la presente invención puede tener adicionalmente una estructura de protección terminal 5', una región 5' no traducida (5'-UTR) y/o una 3' región no traducida. Estas regiones se pueden obtener de una secuencia endógena en una célula o de una secuencia sintetizada artificialmente. El ORFoma, en el que se colocan Marcos de Lectura Abiertos (secuencias codificantes) de genes en vectores de expresión, es uno de los ejemplos.
Adicionalmente, es preferible que la región 3' no traducida incluya, en su extremo terminal 3', una secuencia (señal de adición de poliA) de modo que se pueda añadir una secuencia de poliA. La señal de adición de poliA puede ser, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que consiste en AAUAAA, una señal de poliA temprana de SV40 que tiene dos secuencias de AAUAAA, una secuencia en la que las señales de poliA tempranas de SV40 se alinean en tándem, o similares. La señal de adición de poliA no se limita a ellas. Como ejemplos, se han descrito en la bibliografía varios sitios alternativos de poliadenilación, y algunos ARNm ni siquiera llevan señales de poliadenilación convencionales (Carninci et al., Genome Res. Junio 2003; 13(6B): 1273-89. Pm ID: 12819125).
El ARN que codifica la proteína para el que se va a incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas de acuerdo con la presente invención puede tener una secuencia de poliA en su extremo 3' terminal. Un ARN que tiene una secuencia de poliA en su extremo 3' terminal tiene una excelente eficacia de síntesis de proteínas a partir de un dominio de traducción y una excelente estabilidad del propio ARN. Tal ARN puede ser, por ejemplo, uno cualquiera de los ARN mostrados en Uchl1, Uxt, GFP o un homólogo de uno cualquiera de estos ARN, aunque tal ARN no se limita a ellos.
Ubiquitina hidrolasa carboxi-terminal L1 (Uchl1) de Mus musculus RefSeq: NM_011670.2
La secuencia de ADN de Uchl1 que codifica el ARN de Uchl1 se muestra en SEQ ID NO: 4.
Transcrito expresado ubicuamente de Mus musculus (Uxt) RefSeq: NM_013840.3
La secuencia de ADN de Uxt que codifica el ARN de Uxt se muestra en SEQ ID NO: 5.
GFP (secuencia del vector pEGFP)
La secuencia de ADN de GFP que codifica la secuencia de ARN de GFP se muestra en SEQ ID NO: 6.
El ARN que codifica la proteína para el que se va a incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas puede ser ARN endógeno de origen biológico (por ejemplo, ARNm) o sintetizado artificialmente. Adicionalmente, el ARNm obtenido de eucariotas abarca ARNm maduro que se ha sometido a lo que se denomina procesamiento y ARNm precursor que no se ha sometido a procesamiento.
(Secuencia determinante de la diana)
La secuencia determinante de la diana es una secuencia que comprende una secuencia antisentido para una secuencia diana en el ARN que codifica la proteína para el que se va a incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas. Una secuencia diana se selecciona arbitrariamente de una secuencia parcial de ARN que codifica una proteína para el cual se va a incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas en la presente invención. Una secuencia diana se puede obtener de la secuencia de ARN transcrita a partir del ADN plasmídico en el que se inserta el ADNc que codifica la proteína y alrededor del primer codón de inicio 5' terminal. La longitud de la secuencia antisentido no está especialmente limitada. Sin embargo, desde el punto de vista del incremento de la especificidad para un ARN diana en un sistema que incluye diferentes ARN, la secuencia antisentido puede tener una longitud de preferiblemente más de 7 nucleótidos, más preferiblemente 10, más preferiblemente 15. Además, la secuencia antisentido puede tener una longitud de preferiblemente menos de 250 nucleótidos, más preferiblemente 200, más preferiblemente 150, más preferiblemente 100, más preferiblemente 90, más preferiblemente 80, más preferiblemente 77 nucleótidos, más preferiblemente 70 nucleótidos, más preferiblemente 60 nucleótidos, más preferiblemente 50 nucleótidos, más preferiblemente 40 nucleótidos, más preferiblemente 30 nucleótidos.
En una realización, se puede incluir más de una secuencia antisentido diferente en la secuencia determinante de la diana. Estas múltiples secuencias antisentido se pueden aplicar al direccionamiento de múltiples proteínas, por ejemplo. Alternativamente, las múltiples secuencias antisentido se pueden aplicar para mejorar la especificidad para un ARN que codifica una proteína en donde las múltiples secuencias antisentido se pueden hibridar con el mismo ARN que codifica una proteína. En una realización, la secuencia determinante de la diana de la presente invención puede contener emparejamientos erróneos contra el ARN diana con el propósito de prevenir la reacción del interferón gamma que puede tener lugar en las células en presencia de una molécula de ácido nucleico de doble hebra larga, como los ARN de doble hebra largos.
Adicionalmente, desde el punto de vista del incremento de la especificidad entre la molécula de ácido nucleico funcional de la presente invención y el ARN diana, la secuencia antisentido en una secuencia determinante de la diana se diseña para que tenga preferiblemente al menos un 60% de similitud, más preferiblemente al menos 65% de similitud, más preferiblemente al menos 70% de similitud, más preferiblemente al menos 75% de similitud, más preferiblemente al menos 80% de similitud, más preferiblemente al menos 85% de similitud, más preferiblemente al menos 90% de similitud, más preferiblemente al menos 95% de similitud con una secuencia diana correspondiente en el ARN que codifica la proteína para el que se va a incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas, siempre que la secuencia antisentido pueda hibridar con la secuencia diana en el ARN que codifica la proteína y/o el ARN obtenido del plásmido que contiene la secuencia diana. Es específicamente preferible que la secuencia antisentido en la secuencia determinante de la diana se diseñe para que sea completamente idéntica a la secuencia correspondiente de la secuencia diana.
Adicionalmente, se puede diseñar una secuencia antisentido en una secuencia determinante de la diana para que hibride con una 5' UTR del ARN que codifica la proteína para el que se va a incrementar la efica de la síntesis de proteínas. Este diseño se puede aplicar a la proteína codificada de longitud completa que se esté sintetizando. La 5' UTR se puede obtener de una secuencia endógena en una célula o secuencia artificial. La secuencia antisentido en la secuencia determinante de la diana se puede diseñar para que se pueda hibridar con otras regiones, excepto la 5' UTR, del ARN diana, tal como una región codificante del ARN diana. Por ejemplo, la secuencia antisentido en la secuencia determinante de la diana se puede diseñar para que se pueda hibridar con una parte determinada de la región codificante del ARN diana. Este diseño es útil para un gen de distrofina o similar en el que una proteína que va a ser codificada por un ARN es muy grande y tiene un dominio que muestra bioactividad por sí mismo.
Además, la secuencia antisentido en la secuencia determinante de la diana se puede diseñar para que hibride tanto con la UTR 5' como con una parte de la otra parte funcional de la secuencia, como la secuencia codificante o las UTR 3' de los ARNm que codifican la proteína.
(Secuencia reguladora)
En la molécula de ácido nucleico funcional de acuerdo con la presente invención, la secuencia reguladora tiene una actividad de incremento de la eficacia de la síntesis de proteínas.
En una realización, se pueden incluir múltiples secuencias SINE en la secuencia reguladora. Estas múltiples secuencias SINE pueden ser una combinación de diferentes secuencias, por ejemplo, una combinación de la secuencia SINE B2 y la secuencia obtenida de Alu o una combinación de diferentes secuencias obtenidas de SINE B2.
Los ejemplos de las posibles estructuras pronosticadas de las secuencias SINE B2 se muestran en los apartados (a) y (b) de la Fig. 17.
La secuencia similar indica una secuencia que tiene al menos 25% de similitud, preferiblemente al menos 50% de similitud, más preferiblemente al menos 55% de similitud, más preferiblemente al menos 60% de similitud, más preferiblemente al menos 65% de similitud, más preferiblemente al menos 70% de similitud, más preferiblemente al menos 75% de similitud, más preferiblemente al menos 80% de similitud, más preferiblemente al menos 85% de similitud, más preferiblemente al menos 90% de similitud, más preferiblemente al menos 95% de similitud con la secuencia consenso del SINE.
La secuencia de un SINE puede desviarse de estos consensos conservativos descritos anteriormente. Por ejemplo, el análisis de la similitud de consenso entre las secuencias SINE B2 de tres secuencias solas, la fracción SINE B2 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, y otro SINE B2 tomado aleatoriamente de la bibliografía (referencia: Espinosa et al., http://rnajournal.cshlp.org/content/13/4/583.full), indica claramente que las fracciones de SINE B2 por sí solas pueden compartir tan poco como 9 bases de 36, con solo 25% de similitud.
Sin embargo, a pesar de diverger, éstas todavía son reconocibles como un elemento SINE B2 utilizando programas como RepeatMask tal como se publicó (Bioinformatics. Noviembre de 2000; 16(11):1040-1.MaskerAid: a performance enhancement to RepeatMasker. Bedel1 JA, Korf I, Gish W.).
En una realización, la longitud se puede limitar a las secuencias más cortas con similitud con los elementos SINE, que son capaces de provocar un aumento de la eficacia de la síntesis de proteínas.
En una realización, es posible sintetizar secuencias de ácidos nucleicos artificiales que tienen similitud parcial con los elementos SINE descritos en la presente invención y actúan para incrementar el nivel de la proteína sintetizada.
Adicionalmente, la molécula de ácido nucleico funcional según la presente invención puede incluir una pluralidad de secuencias reguladoras alineadas en tándem, con el fin de promover aún más la eficacia de la síntesis de proteínas.
En la descripción de la presente invención, "SINE" indica ampliamente, entre el retrotransposón distinto de LTR (repetición terminal larga), una secuencia repetitiva intercalada (a) que codifica una proteína que no tiene actividad de transcripción inversa ni actividad endonucleasa o similar y (b) cuyas secuencias de copias completas o incompletas
existen abundantemente en genomas de organismos vivos. Es decir, SINE es una secuencia de ADN que se inserta en un genoma a través de la transcripción inversa de ARN a ADNc, dependiendo de otros factores del anfitrión en estos procesos. La longitud del SINE no está especialmente limitada, pero generalmente, se encuentra en un intervalo de no menos de 20 pb, preferiblemente no menos de 30 pb, más preferiblemente no menos de 50 pb, más preferiblemente no menos de 50 pb, pero no más de 700 pb, preferiblemente no más de 600 pb, más preferiblemente no más de 500 pb, más preferiblemente no más de 400 pb. Adicionalmente, el origen de SINE no está limitado, sino que generalmente se obtiene de ARNt y tiene una secuencia que tiene una secuencia correspondiente al ARNt en su lado 5'-terminal. Adicionalmente, el SINE puede ser una secuencia obtenida del ARN 7SL, tal como Alu, y una secuencia obtenida del ARNr 5S, tal como SINE 3. Con respecto al SINE 3, se puede hacer referencia al documento de Kapitonov et al. (Vladimir V. Kapitonov y Jerzy Jurka: Molecular Biology AND Evolution 20(5):p694-702, 2003) y documentos similares.
La secuencia reguladora se puede seleccionar, por ejemplo, entre las siguientes (1) a (5):
(1) un ARN, que está codificado por un ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 1
(2) un ARN, que está codificado por un ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 2
(3) un ARN, que está codificado por un ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 3
(4) un ARN codificado por un ADN que consiste en una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias mostradas en la Tabla 1; o
(5) un ARN que es al menos 95% similar al ARN de (1), (2), (3) o (4) y tiene la función de incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas.
El número de nucleótidos que se va a eliminar, sustituir, añadir y/o insertar es preferiblemente no menos de 1 pero no más de 175, más preferiblemente no menos de 1 pero no más de 150, más preferiblemente no menos de 1 pero no más de 125, más preferiblemente no menos de 1 pero no más de 100, más preferiblemente no menos de 1 pero no más de 75, más preferiblemente no menos de 1 pero no más de 50, más preferiblemente no menos de 1 pero no más de 30, más preferiblemente no menos de 1 pero no más de 20.
(Relación posicional entre la secuencia determinante de la diana y la secuencia reguladora)
En la presente invención, una dirección (una dirección de hebra efectora) a lo largo de la cual se traduce una proteína diana se define como "dirección de avance", y la dirección opuesta a la dirección de avance se define como "dirección inversa". En la molécula de ácido nucleico funcional según la presente invención, la relación posicional entre la secuencia determinante de la diana y la secuencia reguladora no está especialmente limitada. Sin embargo, es preferible que la secuencia determinante de la diana se ubique más cerca de un lado en la dirección de avance en la molécula de ácido nucleico funcional que la secuencia reguladora. La secuencia determinante de la diana puede estar vinculada directamente a la secuencia reguladora. Alternativamente, se puede insertar entre ellas una secuencia conectora y/o una secuencia similar para conectar la secuencia determinante de la diana y la secuencia reguladora.
En la molécula de ácido nucleico funcional de acuerdo con la presente invención, es preferible que la dirección de la secuencia SINE, que está anotada como de avance en la secuencia reguladora, esté orientada en una dirección inversa con respecto a esa dirección (dirección de avance como se define anteriormente), en donde la secuencia SINE está orientada en la misma dirección que la secuencia consenso de SINE. Es decir, la secuencia reguladora de la molécula de ácido nucleico funcional está orientada en una orientación de avance con respecto a la dirección de traducción.
Si la dirección de 5' a 3' se define como la dirección de avance, la secuencia SINE en esta invención, en donde su orientación 5' a 3' concuerda con la secuencia consenso de SINE, está integrada en la dirección inversa de la molécula de ácido nucleico funcional en esta invención. Por ejemplo, en el caso de una secuencia de SINE B2, el sitio Abox de la secuencia obtenida de SINE B2 está ubicado en el lado 3' de la molécula de ácido nucleico funcional en comparación con el sitio Bbox de la secuencia SINE B2.
(Producción de molécula de ácido nucleico funcional)
Un método de acuerdo con la presente invención para producir una molécula de ácido nucleico funcional comprende la etapa de preparar la molécula de ARN mencionada anteriormente. Las moléculas de ácido nucleico funcionales se pueden preparar mediante un método de biosíntesis de ácido nucleico bien conocido, o un método tal que (i) se produzca una molécula de ADN que codifique la molécula de ARN funcional y (ii) la molécula de ADN se transcriba a la molécula de ARN funcional, por ejemplo. El tamaño de la molécula de ácido nucleico funcional no está especialmente limitado, pero la molécula de ácido nucleico funcional tiene un tamaño preferiblemente no mayor de 2000 nucleótidos, más preferiblemente no mayor de 250 nucleótidos, por ejemplo, desde el punto de vista de la producción de la molécula de ácido nucleico funcional por medio del método de biosíntesis de ácidos nucleicos.
[2. Molécula de ADN, vector de expresión, composición para incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas]
Una molécula de ADN de acuerdo con la presente invención codifica cualquiera de las moléculas de ácido nucleico funcionales mencionadas anteriormente de acuerdo con la presente invención. Adicionalmente, un vector de expresión de acuerdo con la presente invención es un vector de ARN que comprende una cualquiera de las moléculas de ARN funcionales de la presente invención mencionadas anteriormente o un vector de ADN que comprende la molécula de ADN de acuerdo con la presente invención. Adicionalmente, una composición para aumentar la eficacia de la síntesis de proteínas de acuerdo con la presente invención comprende una cualquiera de las moléculas de ácido nucleico funcionales antes mencionadas o el vector de expresión antes mencionado.
En una realización, la composición de acuerdo con la presente invención puede comprender un agente de traducción basado en un sistema in vitro como extracto de reticulocitos para producir proteína in vitro; o para producir proteína in vivo en células de mamífero que expresan una proteína para uso industrial, con fines de investigación o para cualquier otro escrutinio, por ejemplo.
El esqueleto del vector de expresión de acuerdo con la presente invención no se limita especialmente a ningún tipo particular, y se puede seleccionar apropiadamente de un vector plasmídico. El vector plasmídico puede ser un vector de expresión de mamífero, levadura, insecto, un vector de virus (por ejemplo, un vector de expresión lentiviral o retroviral, vectores de adenovirus o virus adenoasociado), un vector de fago, un vector de cósmido y similares, dependiendo de tipos de células anfitrionas que se utilizarán y de la finalidad del uso. Por ejemplo, en el caso en el que la presente invención se utiliza para el tratamiento génico de mamíferos, incluido un ser humano, la presente invención se puede preparar en forma de un vector de virus, tal como un vector de adenovirus o adenoasociado o un vector de lentivirus.
Alternativamente, el vector de expresión puede finalmente integrarse en el genoma de las células de expresión u organismo al que se dirigirá.
[3. Método para incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas]
(Método para incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas)
Un método para incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas de acuerdo con la presente invención comprende la etapa de permitir que una molécula de ácido nucleico funcional de acuerdo con la presente invención o el vector de expresión mencionado anteriormente coexistan con un ARN que codifica proteínas para las que se va a incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas. Esta etapa se puede llevar a cabo in vivo o in vitro utilizando, por ejemplo, un sistema de síntesis de proteínas sin células. En la presente invención, "in vivo" significa un sistema que utiliza un cultivo celular o un animal completo específicamente, e "in vitro" significa un sistema que utiliza un ensayo sin células específicamente. En caso de que la etapa se lleve a cabo in vivo, se puede permitir que la molécula de ácido nucleico funcional o el vector de expresión mencionado anteriormente coexistan, en una célula o tejido aislados, con un ARN que codifica una proteína para el que se va a incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas. Alternativamente, se puede permitir que la molécula de ácido nucleico funcional o el vector de expresión mencionado anteriormente coexistan, en un organismo vivo, con un ARN para el quel se va a incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas.
El método para incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas de acuerdo con la presente invención puede comprender transfectar a una célula un vector de expresión mencionado anteriormente que codifica la molécula de ácido nucleico funcional o la propia molécula de ácido nucleico funcional para permitir que la molécula de ácido nucleico funcional coexista con el ARN que codifica la proteína. La "célula" indica no solo una célula aislada sino también las que constituyen un individuo. El ARN para el que se va a incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas se puede obtener de una secuencia endógena en una célula o un ARN que codifica una proteína sintetizada artificialmente. La transfección (o inducción génica) de una molécula de ácido nucleico en una célula se puede llevar a cabo de manera apropiada mediante métodos convencionales, por ejemplo, autoinfección por un vector, una técnica de microinyección, una técnica de lipofección, una técnica de electroporación, un método de fosfato de calcio, transducción de un virus y similares. El vector puede estar integrado o no permanentemente en el genoma del anfitrión.
Las células se pueden obtener de una cualquiera de las células de cualquier organismo, incluidos animales y plantas, o una cualquiera de las células seleccionadas de las líneas celulares establecidas.
En la presente invención, los animales incluyen vertebrados, preferiblemente mamíferos, incluido un ser humano, pero no se limitan a estos ejemplos.
En la presente invención, las plantas incluyen tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. En una realización, las plantas son plantas de cultivo (por ejemplo, cereales y leguminosas, maíz, trigo, patatas, tapioca, arroz, sorgo, mijo, mandioca, cebada o guisantes) u otras legumbres. En otra realización, las plantas pueden ser hortalizas o plantas ornamentales. Las plantas de la invención pueden ser: maíz (Zea mays), canola (Brassica napus, Brassica rapa ssp.), Lino (Linum usitatissimum), alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeno (Secale cerale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), girasol (Helianthus annus), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), patata, (Solanum tuberosum), cacahuetes (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium hirsutum), batata (Lopmoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Cofea spp.), coco (Cocos nucifera), piña (Anana comosus),
árboles cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia sinensis), plátano (Musa spp.), aguacate (Persea americana), higo (Ficus carica), guayaba (Psidium guajava), mango (Mangifer indica), olivo (Olea europaea), papaya (Carica papaya), anacardo (Anacardium occidentale), macadamia (Macadamia integrifolia), almendra (Prunus amygdalus), remolacha azucarera (Beta vulgaris), avena o cebada, pero no se limitan a estos ejemplos.
En la presente invención, las líneas celulares establecidas que incluyen células derivadas de mamíferos tales como COS-1 (ATCC Núm. CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), línea de riñón embrionario humano 293 (ATCC Núm. CRL 1573), PerC6 (Crucell), células de riñón de cría de hámster (BHK) (ATCC CRL.1632), BHK570 (ATCC Núm. CRL 10314), células de ovario de hámster chino CHO (p. ej., CHO-K1, ATCC Núm: CCL 61, línea de células CHO DHFR menos tal como DG44, particularmente aquellas líneas celulares CHO adaptadas para cultivo en suspensión, células de Sertoli de ratón, células de riñón de mono, células de riñón de mono verde africano (ATCC CRL-1587), células HeLa, células SH-Y5Y, células de riñón canino (ATCC CCL 34), células pulmonares humanas (ATCC CCL 75), células Hep G2 y de mieloma o linfoma, p. ej., NSO (véase el documento US 5.807.715), Sp2/0, YO, otras células obtenidas de animales tales como las células Sf9, DT40, pero no se limitan a estos ejemplos. Además, las líneas celulares establecidas pueden ser hibridomas o una célula a la que se le ha dotado de una característica concreta mediante transferencia génica, transferencia nuclear y/o tratamiento de un compuesto químico, por ejemplo, una célula madre embrionaria de transferencia nuclear o una célula iPS (documentos WO2007/069666, JP-A 2010-273680, JP-A 2010 284088, JP-A 2011-50379, JP-A 2011-4674, etc.), una célula neuronal diferenciada a partir de una célula madre neural, una célula iPS o similar, o células neuronales obtenidas de fibroblastos reprogramados o similares, pero no se limitan a estos ejemplos.
El método de incremento de la eficacia de la síntesis de proteínas de acuerdo con la presente invención contribuye de manera óptima a incrementar la eficacia de la traducción del ARN. El incremento de la eficacia de la síntesis de proteínas indica que la eficacia de la síntesis de proteínas se incrementa en comparación con un caso en el que no se permite que la molécula de ácido nucleico funcional de acuerdo con la presente invención o el vector de expresión mencionado anteriormente coexistan con el ARN diana en un sistema. No se limita especialmente en qué medida se incrementará la eficacia de la síntesis de proteínas. Sin embargo, es preferible que la cantidad de una proteína que se vaya a sintetizar mediante el método de incremento de la eficacia de la síntesis de proteínas sea al menos 1,5 veces, más preferiblemente al menos 2 veces más que la cantidad de una proteína que se va a producir en el caso en el que no se permita que la molécula de ARN funcional coexista con el ARN diana en el sistema.
En un caso en el que se permite que la molécula de ácido nucleico funcional o el vector de expresión mencionado anteriormente coexistan con el ARN diana en el sistema, la razón cuantitativa entre la molécula de ácido nucleico funcional (o el vector de expresión) y el ARN diana no está especialmente limitada. La razón cuantitativa entre ellos puede ser, por ejemplo, de 1:1 a 1:10.
(Método para sintetizar proteínas)
El método de incremento de la eficacia de la síntesis de proteínas mencionado anteriormente de acuerdo con la presente invención se puede utilizar como un método de síntesis de proteínas. Es decir, un método de síntesis de proteínas de acuerdo con la presente invención es un método para producir una proteína diana, que comprende la etapa de incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas mediante cualquiera de los métodos de incremento de la eficacia de la síntesis de proteínas mencionados anteriormente. Es preferible que el método de síntesis de proteínas permita la síntesis eficaz de la proteína diana mediante el incremento de la eficacia de la traducción de la proteína a partir del ARN diana.
En el método de síntesis de proteínas de la presente invención, un ejemplo de la proteína que se va a sintetizar es un anticuerpo, en particular que sintetiza una cadena ligera o pesada o ambas, del anticuerpo o de la versión recombinante de cadena sencilla de un anticuerpo. La síntesis del anticuerpo se lleva a cabo preferiblemente en un sistema in vitro o en un sistema celular aislado de manera que se pueda permitir que una molécula de ácido nucleico funcional de acuerdo con la presente invención o el vector de expresión mencionado anteriormente coexistan, en el sistema, con un ARN diana para el que se va a incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas.
(Método para tratar enfermedades)
La molécula de ácido nucleico funcional de acuerdo con la presente invención se puede utilizar para el tratamiento de una enfermedad causada por una disminución cuantitativa de una proteína normal predeterminada, por ejemplo. La enfermedad no está especialmente limitada, pero puede ser, por ejemplo; miodegeneración tal como distrofia muscular; enfermedad neurodegenerativa tal como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica y las enfermedades de repetición de tripletes tanto a nivel de codificación de proteínas (es decir, enfermedad de Huntington) como a nivel de ADN/ARN (es decir, X Frágil).
Además, también se puede aplicar la presente invención a un tumor mediante el incremento de la expresión de una proteína proapoptótica o una proteína supresora de tumores para el tratamiento de tumores como, por ejemplo, para los miembros de la familia p53.
Tal tumor, incluido un cáncer, puede ser uno cualquiera de los tumores que incluyen, sin limitación, carcinoma, melanoma y sarcoma, carcinoma de vejiga, tumor cerebral, tumor de mama, tumor cervical, tumor colorrectal, tumor
esofágico, tumor endometrial, carcinoma hepatocelular, tumor del estroma gastrointestinal, tumor de laringe, tumor de pulmón, osteosarcoma, tumor de ovario, tumor de páncreas, tumor de próstata, carcinoma de células renales, tumor de piel o tumor de tiroides.
Para obtener el incremento de la eficacia de la síntesis de proteínas, se permite que la molécula de ácido nucleico funcional de acuerdo con la presente invención o el vector de expresión antes mencionado coexistan, en el organismo de un sujeto, con un ARN diana. La propia molécula de ácido nucleico funcional o un vector de expresión mencionado anteriormente se transfectan a una célula del sujeto. El ARN diana puede ser un ARN endógeno (ARNm o similar) en la célula del sujeto o ARN sintetizado artificialmente. Alternativamente, el ARN diana o una molécula de ADN que codifica el ARN se pueden transfectar a la célula del sujeto.
Adicionalmente, la molécula de ácido nucleico funcional de acuerdo con la presente invención es aplicable al tratamiento de una enfermedad mediante la amplificación en el organismo de un sujeto de un factor proteico (p. ej., interferón, un factor inductor de apoptosis o similar) que mejora la enfermedad. Por ejemplo, un factor inductor de apoptosis amplificado de acuerdo con la presente invención se puede utilizar eficazmente para el tratamiento de tumores o similares.
Cuando se permite que la molécula de ácido nucleico funcional de acuerdo con la presente invención o el vector de expresión mencionado anteriormente coexistan con un ARN diana que codifica una proteína que mejora una enfermedad en el organismo de un sujeto, el ARN diana hibrida con el antisentido en la secuencia determinante de la diana de la molécula de ácido nucleico funcional. La propia molécula de ácido nucleico funcional o el vector de expresión mencionado anteriormente se transfectan a una célula del sujeto. El ARN que codifica la proteína que mejora la enfermedad puede ser un ARN endógeno en la célula del sujeto. Alternativamente, el ARN que codifica la proteína que mejora la enfermedad o una molécula de ADN que codifica el ARN se pueden transfectar a la célula del sujeto.
La molécula de ácido nucleico funcional se puede utilizar como un pretratamiento para una célula aislada que va a ser trasplantada al organismo del sujeto. La célula se puede aislar del organismo del sujeto antes del tratamiento y el trasplante. Se puede permitir que la molécula de ácido nucleico funcional de acuerdo con la presente invención coexista en una célula aislada con un ARN diana; y a continuación la célula puede trasplantarse al organismo de un sujeto. Una célula aislada puede ser una célula que tiene capacidad de diferenciación, por ejemplo, una célula madre embrionaria (célula ES), una célula germinal embrionaria (célula EG), una célula madre somática, especialmente una célula progenitora adulta multipotente, una célula madre, una célula madre hematopoyética, una célula madre endotelial vascular, una célula madre mesenquimatosa, una célula madre hepática, una célula madre neural, una célula madre endotelial, una célula madre pancreática, una célula germinal primordial o una célula de diferenciación multilinaje como una célula Muse (Kuroda et al., 2010, PNAS). Además, una célula aislada puede ser también una célula artificial indiferenciada, por ejemplo, una célula madre embrionaria de transferencia nuclear o una célula que adquiere la capacidad pluripotente mediante transferencia génica y/o tratamiento con un compuesto químico, como una célula madre pluripotente inducida (célula iPS (documentos WO2007/069666, JP-A 2010-273680, JP-A 2010 284088, JP-A 2011-50379, JP-A 2011-4674, etc.)). Adicionalmente, una célula aislada también puede ser un fibroblasto o una célula somática adulta que adquirió la capacidad de convertirse en otra célula somática tras la reprogramación. Además, después de la etapa (a) pero antes de la etapa (b), la célula aislada se puede cultivar indiferenciada. Alternativamente, después de la etapa (a) pero antes de la etapa (b), la célula aislada se puede diferenciar para obtener una célula diferenciada o un grupo de células diferenciadas (lámina de células o similar), y la célula diferenciada o el grupo de células diferenciadas se pueden trasplantar al organismo.
El sujeto indica animales, en donde los animales incluyen un ser humano, preferiblemente mamíferos, incluido un ser humano, más preferiblemente un ser humano. Adicionalmente, el sujeto incluye generalmente (a) uno que ya ha mostrado los síntomas de una enfermedad y (b) uno que tiene una causa predisponente genética pero que todavía no ha mostrado los síntomas de una enfermedad. En vista de esto, el concepto de "tratamiento" en la presente invención incluye el tratamiento terapéutico y el tratamiento preventivo de una enfermedad.
[Ejemplo]
La presente invención se describirá a continuación más específicamente basándose en Ejemplos, Ejemplos Comparativos y similares. Transcripción antisentido en el locus sintético PARK5/Uchl1.
El clon Rik6430596G22 de FANTOM2 se identificó como un supuesto ARN no codificante AntiSentido (AS) empalmado (ARNnc9 del gen 7 de la ubiquitina hidrolasa carboxi terminal 1 (UCHL1) (Experimento 1). UchLI es una proteína restringida a neuronas que actúa como enzima desubiquitinante, ubiquitina ligasa o estabilizador de monoubiquitina (Referencia 1; Liu, Y., Fallon, L., Lashuel, H.A., Liu, Z. y Lansbury, P.T., Jr. The UCH-L1 gene encodes two opposing enzymatic activities that affect alpha-synuclein degradation and Parkinson's disease susceptibility. Cell 111, 209-218 (2002). Referencia 2; Osaka, H., et al. Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1 binds to and stabilizes monoubiquitin in neuron. Hum Mol Genet 12, 1945-1958 (2003)). Está mutada en una forma autosómica dominante de PD (PARK5) (Referencia 3; Leroy, E. et al. The ubiquitin pathway in Parkinson's disease. Nature 395, 451-452 (1998)). En la sustancia negra (SN) de cerebros post-mortem esporádicos, la expresión de UchL1 se encontró reducida y correlacionada con la formación de agregados de aSYN. La pérdida de actividad de Uchl1 también se ha asociado con la demencia con cuerpos de Lewy (DCL) y la enfermedad de Alzheimer (EA). El aumento de la expresión de Uchl1
se ha propuesto como estrategia terapéutica para la EA ya que su expresión ectópica rescató la pérdida inducida por beta-amiloide de la función sináptica y la memoria contextual en un modelo de ratón (Referencia 1, Referencia 4; Butterfield, D.A. et al. Redox proteomics identification of oxidatively modified hippocampal proteins in mild cognitive impairment: Insights into the development of Alzheimer's disease. Neurobiol Dis 22, 223-232 (2006)., Referencia 5; Castegna, A., et al. Proteomic identification of oxidatively modified proteins in Alzheimer's disease brain. Parte II: dihydropirimidinase-related protein 2, alpha-enolase and heat schock cognate 71. J Neurochem 82, 1524-1532 (2002). Referencia 6; Choi, J. et al. Oxidative modifications and down-regulation of ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase L1 associated with idiopathic and Alzheimer's diseases. J Biol Chem 279, 13256-13264 (2004)).
Rik6430596G22 es un transcrito de cabeza a cabeza en 5' típico que se inicia dentro del segundo intrón de Uchl1 y se solapa con los primeros 72 nt del ARNm efector (S), incluido el codón AUG (Experimento 1). La parte no solapante del transcrito también contiene dos secuencias repetitivas integradas, SINEB2 y Alu, identificadas por Repeatmasker. El clon de ADNc de FANTOM2 abarca una región genómica de 70 kb y es un transcrito empalmado compuesto por cuatro exones cuyas uniones de intrones siguen la regla tradicional de GT-AG (Experimento 2). En la parte restante de la divulgación, se hace referencia a Rik6430596G22 como un transcrito antisentido natural para Uchl1 (AS Uchl1).
AS Uchl1 incrementa los niveles de proteína UchL1 con un mecanismo que requiere una repetición SINEB2 invertida integrada.
Después se examinó la interacción entre los transcritos S y AS. Después de clonar el ADNc de longitud completa para AS Uchl1 a partir de células MN9D con amplificación rápida 5' de los extremos del ADNc (RACE), se expresó en exceso transitoriamente un AS Uchl1 impulsado por CMV en células dopaminérgicas MN9D y los niveles de proteína y ARNm de Uchl1 endógenos se controlaron mediante qRT-PCR y transferencia Western. Aunque no se observó ningún cambio significativo en los niveles endógenos de ARNm de Uchl1, se detectó una regulación por incremento fuerte y reproducible del producto proteico UchL1 en 24 horas (Experimento 3). Los autores de la presente invención sometieron a prueba si la cotransfección de ambos ADNc en células HEK que no expresaban ninguno de los transcritos podría recapitular lo que se observó en las células MN9D. Cuando se cotransfectaron cantidades crecientes de AS UchI1 con UchI1 murino, se registró una regulación por incremento de la proteína UchL1 dependiente de la dosis en ausencia de cualquier cambio significativo en el nivel de ARNm de Uch 11 exógeno (Experimento 4). Este efecto específico no se observó para controles no relacionados tales como GFP. Para identificar secuencias y/o elementos estructurales del ARNm de AS Uchl1 que provocan su actividad funcional sobre la proteína UchL1, se produjeron y sometieron a prueba mutantes por deleción en células MN9D, así como en la cotransfección en células HEK. Las construcciones de deleción de AS Uchl1 que carecían del primer exón 5' (AS Uchl1 A 5'), o los últimos tres exones (AS Uchl1 A 3') no lograron inducir los niveles de proteína Uchl1 en los modelos de células MN9D y HEK, lo que sugiere que los componentes tanto 5' como 3' eran importantes para la función de AS Uchl1 (Experimento 5).
Por tanto, se sintetizaron mutantes de deleción adicionales para evaluar el papel de las secuencias repetitivas integradas, Alu y SINEB2, en la regulación por incremento de la proteína UchL1.
La deleción dirigida de la región que contiene los elementos repetidos tanto SINEB2 como Alu (AS Uchl1 A SINEB2+ALU) impidió la inducción de la proteína Uchl1. La deleción de un solo elemento repetitivo, (A-SINE B2 (764 934) y A-ALU (1000-1045), reveló que SINEB2 era la región funcional del transcrito requerida para el incremento de la proteína UchL1 (Experimento 6). En ningún caso se detectó ningún cambio en el nivel de ARNm de Uchl1 por transfección de construcciones de deleción y de tipo salvaje de AS Uchl1.
Además, el mutante A-SINEB2 tiene una actividad negativa dominante sobre el AS Uchl1 de longitud completa.
Dado que el mutante por deleción A-SINEB2 carece de 170 nucleótidos que potencialmente alteran la estructura secundaria del ARN de AS Uchl1, se produjo un mutante con la secuencia de SINEB2 volteada entre los nucleótidos 764-934. Curiosamente, SINEB2 volteado no pudo aumentar los niveles de proteína UchL1, lo que demuestra la actividad dependiente de la orientación del dominio SINEB2 integrado en AS Uchl1 (Experimento 6).
Los pares S/AS con una repetición SINEB2 invertida integrada en el transcrito AS identifican una nueva clase funcional de ARNnc:
La colección FANTOM3 de ADNc no codificantes se escrutó bioinformáticamente en busca de otros ejemplos de transcritos de AS naturales que contuvieran elementos SINEB2 (subclase B3) en la orientación correcta y 5' cabeza a cabeza que se solaparan con un gen que codificara una proteína. Esto identificó 31 pares S/AS similares a la estructura de Uchl1/AS Uchl1 (Experimento 7).
Para someter a prueba si la observación de Uchl1/AS Uchl1 se generaliza a otros ejemplos, se clonó y expresó en exceso el transcrito solapante de AS de Uxt (transcrito expresado de forma ubicua), AS Uxt (Rik4833404H03). La transfección de AS Uxt en células dopaminérgicas MN9D mostró una regulación por incremento del producto proteico Uxt sin cambios en los niveles totales de ARNm, lo que confirma que está funcionando un mecanismo más general (Experimento 8).
AS Uchll es un transcrito nuclear enriquecido expresado en neuronas dopaminérgicas:
La RT-PCR multiplex en un panel de tejidos adultos de ratón, regiones cerebrales disecadas macroscópicamente y líneas celulares neuronales encontradas como expresión de AS Uchl1 estaba restringida al mesencéfalo ventral, la corteza y las células dopaminérgicas MN9D, pero ausente en los tejidos y las líneas celulares no neuronales. La hibridación doble in situ con ribosondas dirigidas a la región no solapante de Uchl1 mostró que el ARNm prevalecía en el citoplasma de las células del hipocampo, la corteza y las regiones subcorticales, así como en el mesencéfalo dorsal y ventral. La ribosonda AS Uchl1 decoró estructuras similares. Una combinación de doble hibridación in situ con inmunohistofluorescencia anti-tirosina hidroxilasa mostró que los ARNm para UchI1 y AS se expresaban en las mismas neuronas DA del SN. Curiosamente, los transcritos para el par S/AS se localizaron predominantemente en dos compartimentos subcelulares diferentes: el ARNm de Uchl1 maduro se observó principalmente en el citoplasma, mientras que el ARN AS era nuclear, acumulándose en regiones subnucleares específicas (Experimento 9). El 50% de los transcritos celulares se ha encontrado recientemente enriquecido en el núcleo representando principalmente ARNnc con función desconocida. Los ARN de retención nuclear tienden a acumularse en zonas, denominadas "paraspeckles" (compartimentos de forma irregular del espacio intercromatínico de núcleo), que se asemejan mucho a los sitios de localización de AS Uchl1 y cuya asociación está regulada por SINE integrados (Referencia 7; Chen, L.L., DeCerbo, J.N. Y Carmichael, G.G. Alu element-mediated gen silencing. Embo J 27, 1694-1705 (2008)).
Aprovechando RACE, se mapeó el sitio de inicio de la transcripción (TSS) preciso del gen AS Uchl1 en células MN9D. Como se muestra en el Experimento 2, el TSS se encuentra 250 pb aguas arriba de la secuencia anotada previamente y está localizado en el segundo intrón de Uchl1.
AS Uchl1 está regulado por disminución en modelos neuroquímicos de EP y cerebros humanos post-mortem:
A continuación, se comparó una región de 70 kb del genoma de ratón que abarcaba el locus AS UchL1 con la secuencia genómica humana correspondiente utilizando el alineamiento Genome Vista (http://genome.lbl.gov/cgibin/GenomeVista). Mediante el uso de cebadores diseñados sobre la secuencia humana en correspondencia con los picos de CST, se clonó un transcrito no codificante de 1,6 kb, 5' cabeza a cabeza AS para el gen UCHL1 humano, a partir de ARN de cerebro humano. La organización anatómica del gen hAS UCHL1 fue muy similar a su contraparte de ratón, incluida la extensión de la región solapante del par S/AS, así como la presencia de elementos repetitivos integrados. La expresión de hAs UCHL1 estaba muy restringida a los tejidos neuronales como se encontró en el ratón.
La síntesis de la proteína UCH-L1 se incrementa con el tratamiento con rapamicina a través del transporte del núcleo al citoplasma del ARN de AS Uchl1 y el reclutamiento de ARNm de Uchl1 dependiente de AS a polisomas activos.
Hasta ahora, el ARNnc de AS puede incrementar los niveles de proteína S sin cambios en la cantidad de ARNm de S. Dado que en condiciones fisiológicas el ARNm de S y el ARNnc de AS parecen estar localizados en diferentes compartimentos subcelulares, se analizaron varios factores estresantes que se han implicado en la patogénesis de la EP por su capacidad para redistribuir el ARNnc de AS nuclear en el citoplasma, donde tiene lugar la traducción. Las células MN9D se expusieron a peróxido de hidrógeno 1 mM, inanición de suero, rapamicina a 1 ug/ml, tunicamicina 20 nM y TNFalfa 20 nM durante 45 minutos y el contenido de ARNm de AS Uchl1 se midió de forma independiente en el citoplasma y el núcleo mediante qRT-PCR. La mayoría de los tratamientos no tuvieron ningún efecto, sin embargo, la rapamicina reguló fuertemente la cantidad de ARNm citoplásmico de AS Uchl1 (Experimento 10).
La rapamicina es un inhibidor bien conocido de la traducción dependiente de CAP a través de su efecto sobre mTORC1 y la subsiguiente represión de las actividades de S6K y 4E-BP1. Actualmente se prueba como fármaco contra el cáncer y se propone para ensayos clínicos de enfermedades neurodegenerativas. El bloqueo del inicio de la traducción mediado por rapamicina es capaz de rescatar la pérdida de células DA observada en moscas modificadas genéticamente para inactivar la expresión del gen de parkina y pink1 así como en aquellas que expresan en exceso la mutación dominante asociada a EP de LRRK2 (Referencia 8; Tain, L.S. et al. Rapamycin activation of 4E-BP prevents parkinsonian dopaminergic neuron loss. Nat Neurosci 12, 1129-1135 (2009)). Además, protege las células DA de mamíferos de la intoxicación neuroquímica in vitro y en ratones (Referencia 9; Malagelada, C., Jin, Z.H., Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. & Greene, L.A. Rapamycin protects against neuron death in vitro and in vivo models of Parkinson's disease J Neurosci 30, 1166-1175 (2010), Referencia 10; Malagelada, C., Ryu, E.J., Biswas, S.C., Jackson-Lewis, V. & Greene, L.A. RTP801 is elevated in Parkinson brain substantia nigral neurons and mediates death in cellular models of Parkinson's disease by a mechanism involving mammalian target of rapamycin inactivation. J Neurosci 26, 9996-10005 (2006)). Recientemente, se demostró que la rapamicina previene la discinesia inducida por L-DOPA, un efecto secundario motor grave común del tratamiento sintomático para la EP (Referencia 11; Santini, E., Heiman, M., Greengard, P., Valjent, E. & Fisone, G. Inhibition of mTOR signaling in Parkinson's disease prevents L-DOPA-induced dyskinesia. Sci Signal 2, ra36 (2009)).
Los efectos de la rapamicina sobre el contenido citoplásmico de AS Uchl1 se confirmaron por la presencia de una disminución concomitante en sus niveles de estado estacionario nuclear y por la ausencia de cualquier transcripción de novo de AS Uchl1 (Experimento 10). El contenido celular total de estos transcritos se mantuvo constante. El ARNm de Uchl1 no mostró cambios en la distribución subcelular, la transcripción de novo o el contenido celular total.
A pesar del bloqueo en la traducción dependiente de CAP, tras el tratamiento con rapamicina, el nivel de proteína
UchLI se incrementó varias veces (Experimento 11).
Los autores de la presente invención evaluaron si se requería AS Uchl1 para la inducción de UchL1. A continuación, se establecieron líneas celulares MN9D estables que expresaban constitutivamente ARNhc para AS Uchl1, dirigidas a la región promotora de AS Uchl1 de -4 a 15 nt alrededor del TSS validado por RACE (Referencia 12; Hawkins, P.G., Santoso, S., Adams, C., Anest, V. y Morris, K.V. Promoter targeted small RNAs induce long-term transcriptional gene silencing in human cells. Nucleic Acids Res 37, 2984-2995 (2009)). Como se esperaba, las células desorganizadas mostraron una regulación por incremento de la proteína UchL1 como en la línea parental MN9D, mientras que las células que expresaban ARNhc para AS Uchl1 carecían de cambios en los niveles de proteína UchL1, lo que demuestra un vínculo causal entre la inducción por rapamicina de la proteína Uchl1 y la expresión de ARNnc de AS Uchl1 (Experimento 12). Como modelo independiente, se establecieron líneas celulares estables con expresión de un mutante negativo dominante de AS Uchl1 (A-SINEB2). Cuando las células de control MN9D estables para el vector vacío se trataron con rapamicina, se encontró que la proteína UchL1 se incrementaba. En presencia de la forma negativa dominante de AS Uchl1, esta regulación por incremento ya no era visible (Experimento 13).
Un modelo para el incremento dependiente de AS en los niveles de proteína codificada por S tras el tratamiento con rapamicina:
En células en crecimiento, la señalización de mTORC1 es necesaria para la proliferación y controla la maquinaria de traducción dependiente de CAP a través de la fosforilación de sus sustratos aguas abajo 4E-BP y S6K. El fármaco citostático rapamicina inhibe la actividad de mTORC1 que conduce al bloqueo de la traducción dependiente de CAP. Aquí, los autores de la presente invención muestran que en estas condiciones se requiere la transcripción de AS para la síntesis de proteínas de ARNm seleccionados. Tras la adición de rapamicina, el ARNnc AS Uchl1 enriquecido nuclear se transporta al citoplasma donde recluta los ARNm de su compañero que codifica la proteína S a los polisomas para su traducción.
AS Uchl1 es, por tanto, el miembro representativo de una nueva clase funcional de ARNnc que están asociados a pares S/AS en el genoma de los mamíferos y parece estar compuesto por dos dominios. La región de solapamiento en el 5' proporciona especificidad a un compañero de ARNm que codifica una proteína transcrito a partir de la hebra complementaria. Se requiere un elemento SINEB2 invertido en 3' para la activación de la traducción, lo que representa una nueva función para SINEB2 integrado en el citoplasma.
Se ha propuesto la manipulación de la expresión de Uchl1 in vivo para la intervención terapéutica en enfermedades neurodegenerativas, incluidas la EP y la EA. Los transcritos de AS naturales con elementos repetitivos integrados pueden representar herramientas moleculares endógenas para incrementar la síntesis de proteínas de ARNm seleccionados que definen una nueva clase potencial de terapias de ARN.
La rapamicina se encuentra actualmente bajo un intenso escrutinio en la investigación biomédica como agente neuroprotector para enfermedades neurodegenerativas y como fármaco contra el cáncer. En ratones, la rapamicina previene la discinesia inducida por L-DOPA, un efecto secundario motor grave común del tratamiento sintomático de la EP. Además, protege a las neuronas de la apoptosis tanto en modelos genéticos de Drosophila como de intoxicación neuroquímica en mamíferos, lo que la convierte en una molécula atractiva para terapias antiparkinsonianas (Referencia 11; Santini, E et al., (2009)). Por tanto, es importante comprender mejor sus modos de acción in vivo y su interacción con las vías implicadas en casos familiares de EP, como se muestra aquí para Uchl1. El papel de la transcripción de AS en la síntesis de proteínas inducida por rapamicina añade un cambio inesperado a sus actividades.
La AS sintetizada artificialmente para aumentar la expresión de EGFP o la expresión de anticuerpos regula por incremento la expresión de cada diana en la célula:
Los autores de la presente invención probaron si se puede lograr o no un incremento síntesis de proteínas en un ARN sintético insertando un antisentido de una secuencia determinante de la diana de 72 nt de longitud a la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) en la secuencia apropiada en AS Uchl1. Como en el Experimento 14, se diseñó la expresión del AS artificial para regular por incremento la expresión de EGFP. Los fragmentos que codifican el AS artificial se clonaron en el vector pcDNA3.1 (Invitrogen). Esto demuestra que una molécula de ácido nucleico funcional con una secuencia determinante de la diana y una secuencia reguladora puede incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas de cualquier gen de interés.
De la misma manera, el anticuerpo se puede aplicar como se muestra en el Experimento 15. Se diseñó un AS artificial para regular por incremento un anticuerpo recombinante para dirigir a la secuencia líder del anticuerpo recombinante (el solapamiento tiene 72 pb alrededor de ATG) y se integró en el vector (AS Fc). También se produjo como control un AS artificial que comprendía una secuencia desorganizada como secuencia determinante de la diana (Desorganizada) (Fig. 15). La secuencia diana del anticuerpo se incluyó en los vectores pHYGRO (pHYGRO). La línea celular HEK se cotransfectó con pHYGRO y AS Fc o control. La transfección transitoria en células HEK produjo una regulación por incremento específica de AS Fc del anticuerpo recombinante en productos lisados celulares. AS Fc incrementa los niveles de proteína codificada en células HEK transfectadas, mientras que una secuencia solapante desorganizada o un plásmido vacío no lo hacen, detectado a través de la etiqueta SV5.
Para un examen más detallado (Experimento 16), la línea celular HEK se transfectó con el vector de expresión de
EGFP pEGFP-C2 (Clontech) con Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, se seleccionaron los transfectantes que expresaban de manera estable una baja expresión de EGFP. AS GFP comprende la secuencia determinante de la diana contra EGFP y se diseñó artificialmente para aumentar la eficacia de la síntesis de la proteína EGFP (Fig. 16). Los transfectantes estables se transfectaron adicionalmente con el vector que codificaba AS GFP o con el vector de control. Después de 24 horas o 48 horas desde la transfección de la construcción de AS GFP o el vector de control, las células se recogieron y lisaron. El nivel de GFP en el producto lisado celular se controló mediante transferencia Western. La baja expresión de EGFP en el transfectante se incrementó mediante la transfección de la construcción de AS GFP (Fig. 16).
En un experimento adicional, se ha sintetizado una construcción con una secuencia determinante de la diana que se solapa durante 44nt a la cadena principal del plásmido hasta el codón ATG para EGFP. Esta construcción (SINEup005) incrementa la síntesis de proteínas del gen diana de manera muy eficaz (más de 10 veces).
Por lo tanto, esta es una de las evidencias de que el nuevo tipo de AS que encontraron los autores de la presente invención se puede diseñar artificialmente siempre que la molécula de ácido nucleico funcional incluya una secuencia determinante de la diana que comprenda una secuencia antisentido para una secuencia diana en el ARN que codifica la proteína para el cual se va a incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas y una secuencia reguladora que tenga la actividad de incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas.
Métodos
Plásmidos
Fragmento RACE: La UTR 5' de AS Uchl1 se amplificó mediante PCR para RACE (GeneRacer, Invitrogen) mediante ARN total de MN9D y se clonó en el vector pGEM®-T Easy (Promega).
AS Uchl1 de longitud completa: la secuencia de ADN de longitud completa de AS se amplificó mediante PCR de fusión a partir del fragmento Ra Ce y el clon FANTOM Rik 6430596G22 con los siguientes cebadores mAS Uchl1 fl Directo 5'-ACAAAGCTCAGCCCACACGT-3' (SEQ ID NO: 13) y mAS Uchl1fl Inverso 5'-CATAGGGTTCATT-3' (SEQ ID NO: 14). Uchl1: El ARNm de Uchl1 de ratón se clonó a partir de FANTOM 2900059022 con los siguientes cebadores: mUchl1 Directo 5'-ATGCAGCTGAAGCCGATG-3' (SEQ ID NO: 15) y mUchl1 Inverso 5'-TTAAGCTGCTTTGCAGAGAGC-3' (SEC ID NO: shRNA: 16): Los oligo que contienen la secuencia -14/+4 alrededor del TSS de AS Uchl1 CGCGCAGTGACACAGCACAAA (SEQ ID NO: 17) se clonan en el vector pSUPER.retro.puro (OligoEngine, Seattle, WA), se utilizó la secuencia desorganizada como control.
Mutantes por deleción:
A5': mAS Uchl1 fl Directo y A 5'AS Uchl1 Inverso 5' TACCATTCTGTGCGGTGCA-3 '(SEQ ID NO: 18).
A3' : mAS Uchl1 Directo GACCTCCTCTAGCACTGCACA-3' (SEQ ID NO: 19) y mAS Uchl1 fl Inverso.
Para mutantes por deleción fina, el fragmento de PCR I se clona en el sitio NheI-EcoRI en PcDNA3.1- y el fragmento de PCR II en el siguiente sitio EcoRI-HindII.
AS Uchll A (Alu SINEB2):
Fragmento de PCR I: mAS Uchl1 fl Directo y pre-SINE B2 Inverso 5'-CAATGGATTCCATGT-3' (SEQ ID NO: 20). Fragmento de PCR II: post-ALU Directo 5'-GAt At AAGGAGAATCTG-3 '(SEQ ID NO: 21) y mAS fl Inverso.
AS Uchl1 A (Alu):
Fragmento de PCR I: mAS Uchl1 fl y pre-Alu Inverso 5'-TTATAG TATGTGTTGTC-3' (SEQ ID NO: 22). Fragmento de PCR II: post-ALU Directo 5'-GATATAAGGAGAATCTG-3' (SEQ ID NO: 23) y mAS fl Inverso clonado en el sitio EcoRI-HindII.
AS Uchl1 A (SINEB2):
Fragmento de PCR I: mAS Uchl1 fl Directo y pre-SINE B2 Inverso 5'-CAATGGATTCCATGT-3' (SEQ ID No: 24). Fragmento de PCR II: post-SINE B2 Directo 5'-GAATTCCTCCAGTCTCTTA-3' (SEQ ID NO: 25) y mAS fl Inverso. AS uchl1 (Alu SINEB2) volteado: fragmento de PCR I: obtenido con SINE B2 Directo dentro de 5'-TGCTAGAGGAGG-3' (SEQ ID NO: 26) y Alu volteado1 Inverso 5'- GTCAGGCAATCC -3' (SEQ ID NO: 27) se clonan en el sitio EcoRI único de AS Uchl1 A (Alu SINEB2). AS uchl1 SINEB2 volteado: el fragmento de PCR obtenido con SINE B2 Directo dentro de 5'-TGCTAGAGGAGG-3' (SEQ ID NO: 28) y SINE volteado Inverso 5'-AAAGAGATGGC-3' (SEQ ID NO: 29) se clonan en el Sitio EcoRI de AS Uchl1 A (SINEB2).
Células
Se sembraron células MN9D en placas de Petri de 10 mm en medio de Eagle modificado de Dulbecco que contenía
10% de suero bovino fetal y penicilina (50 unidades/ml), estreptomicina (50 unidades/ml). Los tratamientos se realizaron añadiendo Rapamicina (R0395, Sigma) a una concentración final de 1 ug/ml en medio de nueva aportación durante 45 minutos.
Para el establecimiento de células estables MN9D (ARNip -15/+4, ARNip desorganizado, pcDNA 3.1- y A SINE B2), se sembraron células MN9D en placas de Petri de 100 mm y se transfectaron con Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, el día después de que las células se sembraran para la selección con 500 uM de neomicina (núm. N1142, Sigma). Las células HEK-293T se cultivaron en DMEM (GIBCO) con un suplemento de suero bovino fetal al 10% (Sigma-Aldrich), 100 unidades/mL de penicilina y estreptomicina de 100 pm/ml (Sigma) a 37°C en una incubadora con CO2 humidificada.
PCR
Análisis de PCR: Se extrajo el ARN total utilizando reactivo Trizol (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se sometió a tratamiento con ADNasa I (Ambion) y se retrotranscribió 1 ug utilizando el Kit de Síntesis de ADNc iScript (BioRad). La qRT-PCR en tiempo real se llevó a cabo utilizando colorante fluorescente verde Sybr (2X iQ5 SYBR Green supermix, BioRad). Se utilizaron actina y GAPDH como patrón interno. La cuantificación relativa se realizó con el método Ct comparativo.
Actina: efector 5'-CACACCCGCCACCAGTTC-3' (SEQ ID NO: 30), antisentido 5'-CCCATTCCCACCATCACACC-3' (SEQ ID NO: 31).
Gapdh: efector 5'-GCAGTGGCAAAGTGGAGATT-3' (SEQ ID NO: 32), antisentido 5'-GCAGAAGGGGCGGAGATGAT-3' (SEQ ID NO: 33).
Solapamiento AS Uchl1: efector 5'-GCACCTGCAGACACAAACC-3' (SEQ ID NO: 34), antisentido 5'-TCTCTCAGCTGCTGGAATCA-3' (SEQ ID NO: 35).
AS Uchl1: 5'CTGGTGTGTATCTCTTATGC (SEQ ID NO: 36) antisentido 5'CT CCCGAGT CT CT GT AGC (SEQ ID NO: 37).
Uchl1: efector 5'-CCCGCCGATAGAGCCAAG (SEQ ID NO: 38), antisentido 5'-ATGGTTCACTGGAAAGGG-3' (SEQ ID NO: 39).
ASUchl1 pre ARN: 5'-CCATGCACCGCACAGAATG-3' (SEQ ID NO: 40), 5'-GAAAGCTCCCTCAAATAGGC-3' antisentido (SEQ ID NO: 41).
ARN pre_A0 ribosómico efector 5'-TGTGGTGTCCAAGTGTTCATGC-3' (SEQ ID NO: 42), antisentido 5'-CGGAGCACCACATCGATCTAAG-3 (SEQ ID NO: 43).
AS_Uxt: efector 5'-CAACGTTGGGGATGACTTCT (SEQ ID NO: 44), antisentido 5'-TCGATTCCCATTACCCACAT (SEQ ID NO: 45);
Uxt: efector 5'-TTGAGCGACTCCAGGAAACT-3' (SEQ ID NO: 46), 5'-GAGTCCTGGTGAGGCTGTC-3' antisentido (SEQ ID NO: 47).
La RT PCR multiplex se realizó con el Sistema de RT-PCR SuperScript® III One-Step con ADN Polimerasa Taq Platinum® (Invitrogen). Se incubaron 500 mg de ARN tratado con ADNasa total con cebadores inversos para Gapdh, Uchl1, AS Uchl1. La reacción se realizó durante 60 minutos a 60 grados.
Después, cada volumen se dividió en tres y se añadieron cebadores directos a una concentración final de 200 nM a la reacción. La reacción de PCR comprendió 40 ciclos de 95 grados durante 15 segundos, seguidos de 60 grados durante 45 segundos y 68 grados finales durante 30 segundos.
Transferencia Western
Las células se lisaron en tampón de muestra SDS 2X. Las proteínas se separaron en gel de poliacrilamida-SDS al 15% y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. La inmunotransferencia se realizó con los anticuerpos primarios: anti-Uchl1 (Señalización Celular núm. 3524) 1:300 y anti-actina b (A5441, Sigma) 1:5000. Las señales se revelaron después de la incubación con anticuerpos secundarios recomendados conjugados con peroxidasa de rábano picante mediante el uso de quimioluminiscencia mejorada para Uchl1 (sustrato núm. WBKLS0500 Immobilion Western Chemioluminescent HRP) y reactivo de detección ECL (RPN2105, g E Healthcare).
Fraccionamiento celular
El fraccionamiento del núcleo citoplasmático se realizó utilizando el kit de separación Nucleo Cytoplasmic (Norgen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se hizo eluir el ARN y se trató con ADNasa I. La pureza de la fracción citoplásmica se confirmó mediante qRT-PCR en tiempo real en ARN pre-ribosómico.
Hibridación in situ con dos colores (ISH)
Reactivos: anticuerpo anti DIG D8156 (Sigma); estreptavidina HRP RPN1231-100 UL (Amersham Bioscience); Mezcla de marcaje DIG núm. 11277073910 (Roche) Mezcla de masaje BIO núm. 11685597910 (Roche), Ácido ribonucleico, de transferencia de levadura de panadería R8759 (Sigma), Ácido desoxirribonucleico, de hebra sencilla de testículos de salmón D7656 (Sigma), Reactivo de bloqueo núm. 11096176001 (Roche), Sistema TSA Cy3 (Perkin Elmer, Heidelberg, Alemania).
Después de la perfusión con formaldehído al 4%, el cerebro del ratón se crioprotegió durante la noche en sacarosa al 30%. La hibridación in situ se realizó en cortes de criostato (16 um). Las sondas efectora y antisentido fueron generadas por transcripción in vitro del ADNc que codifica los 600 pb distales del ADNc de Uchl1 de ratón y los últimos 1000 pb de AS Uchl1 de ratón. Las sondas para Uchl1 se marcaron con digoxigenina, las sondas para As Uchl1 se marcaron con biotina. La incorporación tanto de biotina como de digoxigenina se comprobó mediante Transferencia Northern. Los cortes se trataron previamente con peróxido de hidrógeno al 3% durante 30 minutos. La hibridación se realizó con sondas a una concentración de 1 mg/ml (Uchl1) y 3 mg/ml para AS Uchl1 a 60°C durante 16 h. Para la detección de ARN biotinilado, se utilizó estreptavidina-HRP 1:250 durante 2 horas en tampón TNB (Tris HCl pH 7,5 100 mM, NaCl 150 mM, Reactivo de Bloqueo al 0,5%), y las señales se visualizan utilizando el Sistema TSA Cy3 después del lavado en tampón TNT (Tris HCl pH 7,5 100 mM, NaCl 150 mM, Tween al 0,05%).
La ISH en la sonda marcada con DIG se realizó incubando los cortes con anticuerpo monoclonal anti-DIG después de la reacción de TSA. Para combinar la ISH de ARN con inmunofluorescencia, los cortes se incubaron con el anticuerpo anti TH (núm. AB152, Chemicon) 1:1000. A continuación, las señales se detectan con anticuerpo secundario conjugado con colorante fluorescente 405 anti-conejo de cabra y 488 anti-ratón de cabra. A continuación, las secciones se lavaron, se montaron con medio de montaje Vectashield (Vector lab) y se observaron en un microscopio confocal (Leica).
Muestras post-mortem de cerebro humano
Se obtuvieron muestras de cerebro del banco de cerebros del Instituto de Neuropatología, Hospital de Bellvitge (Universidad de Barcelona, España). Las muestras fueron diseccionadas en autopsia con el consentimiento informado de los pacientes o sus familiares y la aprobación institucional del Comité de Ética de la Universidad de Barcelona. Los cerebros se obtuvieron de casos de EP confirmados patológicamente caucásicos y de controles de la misma edad (Navarro et al., 2009). En resumen, todos los casos de EP habían padecido EP clásica, ninguno presentaba deterioro cognitivo y su caracterización neuropatológica se realizó según criterios establecidos. Los sujetos sanos de control mostraron ausencia de síntomas neurológicos y de enfermedades metabólicas y vasculares, y el estudio neuropatológico no reveló anomalías, incluida la ausencia de enfermedad de Alzheimer y patologías relacionadas. El tiempo entre la muerte y la preparación del tejido estuvo en el intervalo de 3 a 5 horas.
Análisis bioinformático
Para la identificación de un ortólogo humano candidato de AS Uchl1, se realizó la conservación entre seres humanos y ratones en la región del ortólogo de AS uchl1 utilizando el navegador del genoma VISTA. Los autores de la presente invención seleccionaron parámetros para etiquetas de secuencias conservadas (CTS) que tienen un mínimo de 75% de identidad entre el genoma del ratón y el humano. Para cada elemento conservado se diseñó un cebador en la región humana homóloga.
Para la identificación de candidatos activadores de la traducción adicionales, los autores de la presente invención buscaron ADNc de longitud completa de FANTOM3 que fueran ARN no codificantes y se superpusieran al extremo 5' de los transcritos codificantes en una configuración de cabeza a cabeza [PMID: 16141072]. El conjunto filtrado de 8535 transcritos de ARNc de FANTOM3 descrito por Nordstrom et al. 2009 (Nordstrom, K.J. et al. Critical evaluation of the FANTOM3 non-coding RNA transcripts. Genomics 94, 169-176 (2009)) se utilizó como punto de partida de los autores de la presente invenión. Las ubicaciones genómicas de estos transcritos de ARNnc y los transcritos codificantes de REFSEQ (Maglott, D.R., Katz, K.S., Sicotte, H. y Pruitt, K.D. LocusLink y RefSeq de NCBI. Nucleic Acids Res 28, 126-128 (2000)) se extrajeron de los alineamientos en el navegador UCSC Genome (Kent, W.J. et al. The human genome browser at UCSC. Genome Res 12, 996-1006 (2002)) para identificar un conjunto de 788 pares codificantes-efectores:no codificantes-antisentido. A continuación, se comprobaron los ARNnc mediante RepeatMasker para identificar secuencias relacionadas con SINEB2 (Smit, AFA, Hubley, R & Green, P. RepeatMasker Open-3.0.1996-2010 <http://www.repeatmasker.org>). Esto redujo el número de pares a 127 transcritos codificantes de proteínas con superposición en el extremo 5' (60 con una versión de hebra efectora de la repetición, 53 con una versión antisentido y 14 con versiones efectora y antisentido).
El alineamiento de los elementos relacionados con SINEB2 se llevó a cabo utilizando Clustalw (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html. A partir de este análisis, los transcritos solapantes antisentido con una repetición más parecida a la de Uchl1-as y en la misma orientación fueron elegidos para pruebas experimentales (Uxt1 -AS).
Secuencias
Como ejemplo, la siguiente es una lista de secuencias que son complementarias a los ARNm que codifican proteínas.
Contienen una fracción que proporciona ejemplos de una secuencia determinante de la diana [ahora resaltada en azul claro] y una secuencia reguladora [ahora resaltada en rojo]. La secuencia reguladora en esta lista de antisentido natural es tan corta como 89 nucleótidos en este ejemplo. La longitud de las secuencias adaptadoras en esta lista parcial de ARN antisentido es tan corta como 44 nt.
Debajo de cada secuencia hay un resumen de los alineamientos con los elementos de retrotransposón según lo determinado por el programa Repeatmask.
a r o : 9359.1 ( A3 v x t ) (SEO ID No 8)
t a g t c t c g c t g c a g t a c g t c a c t g a t a a o g c c a c t c a a c g t t g g g g a t g a c 11 c 111 c g g c t c g a g c t a c g g a g t
attcarataactattatgctatactgtttgaagtatttattagaaaaacatcagaasgagatttggaccactttc otttacatgaagaaatatcttagggtttcttttcaggtatctttgagtatcttctgacactagaagatcctgtaa actc tacicac11 caacagaa11 gaagaacctggacacagcagag11accaacaagagagcccagggatagca11 aacatggtggetactcaagacctaacccagccagggagacataccaaggcctatgaggcgaagggaaaagaaggg tgacccaaagggcaggaatttettaccctgaactteegagccttatagaaaaacataatctgttgggcatgttcc ct accctcataca tttttaca aceattt aa atata ttcta ctcta ta ctctaea aa tatatc
attttgttttaaatttttgaggt agggttetgctaagttacttgggctggccttggactagtaaccattctgtgt cagccttctgggattagaggtatgtgctagcatgtctagcotctttctatttctttggttttccttctaattaat taaaaaatacattatcttct
En negrita región solapante (UchL1)
sw pete pete p e te problema posición en problema repetición coincidente posición en repetición
puntuación a¿v. o e i . i n » . secuencia inicio fin (izquierda) repetición clase / famila inicio fin (izquierda) 10
417 19. S 0.8 2.3 Secuencia Sin Nombr 1e40 290 (8 i 5 ) C B3 
<79> 137 9 1
883 19.9 12.3 0.S 
Secuencia Sin Nombr 7e74 940 ( 18S) C B3 
(7 | 209 1 2
327 27.5 € .1 ( .3 
Secuencia Sin Nomb 9re77 1090 ( Í 5 ) C ÍB 1D10 SIXE/Ala
(0J 117 2 3
EVIDENCIA DE ANOTACIÓN:
417 19.5« 0.76 2.33 Secuenca Sin Nombre 160 290 55 Í C 
S 1H E /B 2 9 137 79 2
AK02935 9.1 160 áCCAGAAGAAGirGrGGGAUCCCIGCAAC1-CGAGCAACCAACACiriG: 209
1 Ti » t IV Ti 11 -C B345 IN Z /B 2 137 GCCAGAAGA6 GGCGTCSGATCCCCTGGAACTGGAGTTACAGATGG7 T-GT 89
AK9293 S9 .1 210 STGC-ACCATGTGGGTAATGGGAATCGAACCXGGGTCCTCTATAAGACTG 2 S Í v - 1 iv i lv V i l C 334 S 1H E /B 2 88 ; a g c c g c c a tg ; g g g tg c ; g g g a a ic g a a c c c g g g t c c t c is g a a g a g c a 39 AK9293 S9 .1 259 SCCAGTGCTCTTAACTACTGAGGTGCATTTCT 290
11 v - - i
C B3« 3 :H E /B 2 38 GCCAGTGCICIXAACCGCIGAGC--CATCTCI 5
Matriz - 25 p 43 o . matriz
Transieoaes/transversáones - 1.78 (16 / 9J
"aia inicia! espaco • 0.02 (3 / ..30 | , tarrañoespaco proirvedo • 1.3 3 (4 / 3 |
EVIDENCIA DE ANOTACIÓN:
883 19.89 12.30 0.48 Secuenca Sin Nombre 77 « 940 72 C bs________ 3 IS E /B 2 1 209 7 1
AK0293 S9 .1 774 riAXITIAAATATATGACTAITZCACCTGCATAG----- GCGCAC--- 813 vi i 1 11 iv------i ----C B343 IK E /B 2 209 TTATTTTATGTGTATGAGTGTTTTGCCXGCATGTATGTCTGTGCACCACG l«0
AK0293 S9 .1 814 -------- AGTACCCACAGAGACTAGAAGAGGGTGGCAGATC7CCIGAG 854 --------- 1 1 1 1 1 1 1 v 1 1 11 C B395 IK E / 52 159 IGCGTGCCTGGTGCCCSC3GASGCCAGAAGA3GGCGTCGGATCCCCTGGA 110 AK329359.1 ess ACTGGAGTTA--ATGCT7GTGAGCTGCCATGTGSA7GCTGGAAATCAAA 901 ----- v i 1 1 1
C B3931H E /B 2 109 ACTGSASriACAGATGGTTGrSAGCCGCCATGIGGGTGCZGGGAATCGAA 60
AK029339.1 902 CCCAGGICC777GGAAG-GCAGGCAGG7GC7C77AA7CA7GGAAGCA7CZ 950
1 1 - V - 1 liv lv
C B34S 1H E /B 2 59 •CCGGGTCCTCTGGAASAGCAGCCAG-TGCTCTTAACCGCTGAGCCATCT 11
AK0293 S9 .1 951 CITCACCICC 960
C B345 IN S /B 2 10 CICCAGCCCC 1
Otras secuencias del estudio:
E-2 i j~ . SIHD'E-2{SEQ ID NO: 9}
S ííttfg a s á E s tfiE c tts ílíít taaiiícacctsacLSítoT. isc-aicggCectsastK-a-a 11 tí-ca « í acc acat ggtggcteacaatcatt t ge&jtgáj ¿ tc tga tgccc t c t t t t i i t i . tgtt tgaagacageti cagt .gTi . f t t i t a tata i t t i g t i i n l i i a t i l l t t i i t c t t i f i m i m i i H i i i i f i a t t l
>B3 nára. SINE'B221SptJ |BEQ ID NO: 10) G0tácrflttflAaAr*QÍItí|cáaTT*At3AQCJ1CTaíCrBCTCT [CCAaAMACeCSaGTTCflGirCCCASCACCCAfcn GCCGGCTDACAACCÚ rCTGT AACIC T AO T T CCAGGÜ-SA T C TRACN C CC r C T T C T G A CC T CCAC-S6C CACCACÜCAC6C A C G TGCTACACAflACGl ACA TACA HGCAAAACACT CAI ACACAT A MÍA T A AA M t AAA H 1T í f A A Afl A A
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AS Udilldeiaig&dcomételadomadoensifoXba-tftidllaipcDNA3.1 {SEQIDNO: 12)
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Los ejemplos de SINE B2 integrados en la secuencia de clones de ADNc son los siguientes.
Tabla 1
Claims (12)
1. Una molécula de ácido nucleico funcional que actúa en trans que comprende:
(a) una secuencia determinante de la diana que comprende una secuencia antisentido para una secuencia diana en el ARN que codifica la proteína para el que se va a incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas; y
(b) una secuencia reguladora que comprende:
(1) un ARN, que está codificado por un ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 1;
(2) un ARN, que está codificado por un ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 2;
(3) un ARN, que está codificado por un ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 3;
(4) un ARN codificado por un ADN que consiste en una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias que se muestran en la siguiente tabla:
; o
(5) un ARN que es al menos 95% similar al ARN de (1), (2), (3) o (4) y tiene la función de incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas.
2. Una molécula de ácido nucleico funcional que actúa en trans según la reivindicación 1, en donde la secuencia determinante de la diana está ubicada entre un extremo 5' terminal y la secuencia reguladora en la molécula de ácido nucleico funcional.
3. Una molécula de ácido nucleico funcional que actúa en trans según la reivindicación 1 o 2, en donde la secuencia determinante de la diana tiene al menos 60% de similitud con una secuencia complementaria a una secuencia correspondiente en el ARN que codifica la proteína o una secuencia alrededor del primer codón de inicio 5' terminal de la secuencia que codifica la proteína.
4. Una molécula de ácido nucleico funcional que actúa en trans según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la secuencia reguladora de la molécula de ácido nucleico funcional está orientada en una dirección inversa con respecto a la dirección de traducción.
5. Una molécula de ácido nucleico funcional que actúa en trans según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la secuencia determinante de la diana está diseñada para ser hibridable con una 5'-UTR (región no traducida) del ARN que codifica la proteína o una secuencia alrededor de la primera codón de inicio 5'-terminal de la secuencia que codifica la proteína.
6. Un método para producir una molécula de ácido nucleico funcional que actúa en trans de la reivindicación 1, comprendiendo dicho método la etapa de preparar una molécula de ARN que comprende:
(a) una secuencia determinante de la diana que comprende una secuencia antisentido para una secuencia diana en el ARN que codifica la proteína para el que se va a incrementar la eficacia de síntesis de proteínas; y (b) una secuencia reguladora que comprende:
(1) un ARN, que está codificado por un ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEC ID NO: 1;
(2) un ARN, que está codificado por un ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID NO: 2;
(3) un ARN, que está codificado por un ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 3;
(4) un ARN codificado por un ADN que consiste en una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias que se muestran en la siguiente tabla:
; o
(5) un ARN (i) que es al menos 95% similar al ARN de (1), (2), (3) o (4) y tiene la función de incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas.
7. Una molécula de ADN que codifica una molécula de ácido nucleico funcional que actúa en trans según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
8. Un Vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico funcional que actúa en trans según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o una molécula de ADN según la reivindicación 7.
9. Una composición para incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas, que comprende una molécula de ácido nucleico funcional que actúa en trans según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, una molécula de ADN según la reivindicación 7, o un vector de expresión según la reivindicación 8.
10. Un método para incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas, que comprende la paso de (a) permitir que una molécula de ácido nucleico funcional que actúa en trans según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 coexista con un ARN que codifica una proteína, cuya secuencia parcial del ARN que codifica la proteína tiene similitud con la secuencia determinante diana de la molécula de ARN funcional.
11. El método según la reivindicación 10, en donde la etapa (a) comprende transfectar a una célula la molécula de ácido nucleico funcional que actúa en trans o una molécula de ADN según la reivindicación 7.
12. Un método para producir una proteína, que comprende la etapa de incrementar la eficacia de la síntesis de proteínas mediante un método para incrementar la eficiencia de síntesis de proteínas según la reivindicación 10 o la reivindicación 11.
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