ES2848377T3 - Moduladores específicos de alelo de RODOPSINA P23H - Google Patents
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Abstract
Un oligonucleótido modificado que comprende: un segmento de separación que consiste en desoxinucleósidos conectados; un segmento de ala 5' que consiste en nucleósidos conectados; y un segmento de ala 3' que consiste en nucleósidos conectados; en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado que es un azúcar con 2'-O-metoxietilo o bicíclico, y donde el oligonucleótido tiene una secuencia de nucleobases que consiste en uno cualquiera de SEQ ID NO: 21, 15, 29 o 64.
Description
DESCRIPCIÓN
Moduladores específicos de alelo de RODOPSINA P23H
Campo
Se describen métodos, compuestos y composiciones para tratar, prevenir, mejorar o ralentizar la progresión de la retinitis pigmentaria (RP), tal como la retinitis pigmentaria autosómica dominante (RPAdAd) mediante la administración de un inhibidor específico de rodopsina P23H a un sujeto.
Antecedentes
La retinitis pigmentaria (RP) es una descripción amplia de los cambios de pigmento/ y/o daño en la retina. Una forma hereditaria de retinitis pigmentaria llamada retinitis pigmentaria autosómica dominante (RPAd) es una enfermedad degenerativa que generalmente causa ceguera en la mediana edad. Bird AC, American Journal of ophtalmology 1995;119: 543-562; Boughman JA et al. Am J Hum Genet 1980; 32:223-235; Schuster A et al. Br J Ophthalmol 2005; 89: 1258-1264. La RPAd está causada por anomalías de los fotorreceptores (bastones y conos) o del epitelio pigmentario de la retina (EPR) de la retina que conduce a una pérdida progresiva de la visión. Los pacientes con RPAd pueden experimentar una adaptación defectuosa de la luz a la oscuridad, de la oscuridad a la luz o ceguera nocturna como resultado de la degeneración del campo visual periférico. La RPAd da como resultado la pérdida de células fotorreceptoras (bastones) de la retina periférica y después de los conos de la retina central.
Se han identificado más de 100 mutaciones de rodopsina en pacientes con RPAd. Sullivan LS et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 2006; 47:3052-3064; Wang DY et al. Clinica chimica acta; International journal of clinical chemistry 2005; 351:5-16. La mutación P23H es la mutación más prevalente y está presente en ~ 25% de los casos de RPAd y 5-15% de los casos de RP. Dryja TP et al. Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88:9370-9374. La proteína rodopsina mutante, tal como la P23H, tiene una ganancia de función tóxica que induce el plegamiento incorrecto y la interrupción de la proteína rodopsina normal, lo que conduce a la apoptosis de las células fotorreceptoras. Murray SF et al. Investig Ophthalmol Vis Sci 2014; 55:1258. Por lo general, los bastones se degeneran primero y afectan a la visión con poca luz. Después, los conos degeneran, afectando a visión con luz brillante y de los colores. La edad de aparición es variable con una reducción gradual y progresiva de la visión nocturna y periférica, lo que a menudo conduce a un campo visual de "cañón de pistola" o visión en túnel. La edad promedio de aparición de la ceguera nocturna es de 12 a 14 años. La ceguera es frecuente en la mediana edad y la mayoría de los bastones se pierden a los 40 años.
Compendio
La invención se refiere a un oligonucleótido modificado que comprende
un segmento de separación que consiste en desoxinucleósidos conectados;
un segmento de ala 5' que consiste en nucleósidos conectados; y
un segmento de ala 3' que consiste en nucleósidos conectados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado que es un azúcar con 2'-O-metoxietilo o bicíclico, y en donde el oligonucleótido tiene una secuencia de nucleobases que consiste en uno cualquiera de SEQ ID No : 21, 15, 29 o 64.
La invención también se refiere a un oligonucleótido modificado que consiste en 16 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia indicada en SEQ ID NO: 15, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de separación que consiste en diez desoxinucleósidos conectados;
un segmento de ala 5' que consiste en tres nucleósidos conectados; y
un segmento de ala 3' que consiste en tres nucleósidos conectados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar con cEt; en donde cada conexión internucleosídica es una conexión fosforotioato; y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
La invención se refiere adicionalmente a un oligonucleótido modificado que consiste en 16 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia indicada en SEQ ID NO: 64, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de separación que consiste en nueve desoxinucleósidos conectados;
un segmento de ala 5' que consiste en cuatro nucleósidos conectados; y
un segmento de ala 3' que consiste en tres nucleósidos conectados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; en donde el segmento de ala 5' comprende un azúcar con cEt, un azúcar con cEt, un azúcar con cEt y un azúcar con 2'-fluoro en la dirección 5' a 3'; en donde cada nucleósido del segmento de ala 3' comprende un azúcar con cEt; en donde cada conexión internucleosídica es una conexión fosforotioato;
y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
Además, la invención se refiere a un oligonucleótido modificado que consiste en 16 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia indicada en SEQ ID NO: 21, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de separación que consiste en diez desoxinucleósidos conectados;
un segmento de ala 5' que consiste en dos nucleósidos conectados; y
un segmento de ala 3' que consiste en cuatro nucleósidos conectados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; en donde cada nucleósido del segmento de ala 5' comprende un azúcar con cEt; en donde el segmento de ala 3' comprende un azúcar con cEt, un azúcar con 2'-O-metoxietilo, un azúcar con cEt y un azúcar con 2'-O-metoxietilo en la dirección 5' a 3'; en donde cada conexión internucleosídica es una conexión fosforotioato; y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
Además, la invención se refiere a un oligonucleótido modificado que consiste en 15 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia indicada en SEQ ID NO: 29, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de separación que consiste en diez desoxinucleósidos conectados;
un segmento de ala 5' que consiste en dos nucleósidos conectados; y
un segmento de ala 3' que consiste en tres nucleósidos conectados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; en donde cada nucleósido del segmento de ala 5' comprende un azúcar con cEt; en donde el segmento de ala 3' comprende un azúcar con cEt, un azúcar con 2'-O-metoxietilo y un azúcar con cEt en la dirección 5' a 3'; en donde cada conexión internucleosídica es una conexión fosforotioato; y
en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
La invención también proporciona una composición que comprende el oligonucleótido modificado de la invención y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable, opcionalmente en donde:
i) el diluyente farmacéuticamente aceptable es agua;/ y/o
ii) el oligonucleótido modificado es una sal de sodio.
En la presente memoria se describen compuestos y composiciones potentes, tolerables/ y/o selectivas útiles para tratar, prevenir, mejorar o ralentizar la progresión de la retinitis pigmentaria (RP), tal como la retinitis pigmentaria autosómica dominante (RPAd). En ciertos aspectos, los inhibidores de rodopsina P23H proporcionados en la presente memoria son compuestos antisentido específicos de alelo dirigidos a un alelo mutante P23H que son capaces de inhibir selectivamente la expresión de la proteína mutante de rodopsina P23H en mayor medida que la proteína de tipo salvaje. En ciertos aspectos, la administración de los compuestos antisentido específicos de alelo en un sujeto que tiene RPAd da como resultado la inhibición selectiva de la rodopsina P23H y permite que la proteína normal producida a partir del alelo de tipo salvaje mantenga la supervivencia y función de los bastones en el sujeto.
Descripción detallada
Se debe entender que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son únicamente ilustrativas y explicativas y no son restrictivas de la invención, como se reivindica. En la presente memoria, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique específicamente lo contrario. Como se emplea en la presente memoria, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término "que incluye" así como otras formas, tales como "incluye" e "incluido", no es limitante. Asimismo, términos tales como "elemento" o "componente" abarcan elementos y componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, a menos que se indique específicamente lo contrario.
Los títulos de las secciones que se utilizan en la presente memoria son solo para fines organizativos y no deben interpretarse como una limitación del tema descrito.
Se entiende que la secuencia expuesta en cada SEQ ID NO en los ejemplos contenidos en la presente memoria es independiente de cualquier modificación de un radical azúcar, una conexión internucleosídica o una nucleobase. Como tales, los compuestos antisentido definidos por un SEQ ID NO pueden comprender, independientemente, una o más modificaciones de un radical azúcar, una conexión internucleosídica o una nucleobase. Los compuestos antisentido descritos por el número ISIS (núm. ISIS) indican una combinación de secuencia de nucleobases, modificación química y motivo.
A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos tienen los siguientes significados:
"2'-O-metoxietilo" (también 2'-MOE y 2'-O (CH2)2-OCH3) se refiere a una modificación de O-metoxi-etilo en la posición 2' de un anillo de azúcar, p. ej. un anillo de furanosa. Un azúcar modificado con 2'-O-metoxietilo es un azúcar modificado.
“Nucleósido con 2'-MOE” (también nucleósido con 2'-O-metoxietilo) significa un nucleósido que comprende un radical azúcar modificado con 2'-MOE.
"Nucleósido sustituido en 2'" significa un nucleósido que comprende un sustituyente en la posición 2' del anillo de furanosilo distinto de H u OH. En ciertos aspectos, los nucleósidos sustituidos en 2' incluyen nucleósidos con modificaciones de azúcares bicíclicos.
"Sitio diana 3'" se refiere al nucleótido de un ácido nucleico diana que es complementario al nucleótido más 3' de un compuesto antisentido particular.
"Sitio diana 5'" se refiere al nucleótido de un ácido nucleico diana que es complementario al nucleótido más 5' de un compuesto antisentido particular.
"5-metilcitosina" significa una citosina modificada con un grupo metilo unido a la posición 5. Una 5-metilcitosina es una nucleobase modificada.
"Aproximadamente" significa dentro de ± 10% de un valor. Por ejemplo, si se establece que "los compuestos afectaron al menos a aproximadamente 70% de inhibición de la rodopsina P23H, se da a entender que los niveles de rodopsina P23H se inhiben dentro de un intervalo entre 60% y 80%".
"Administración" o "administrar" se refieren a vías de introducción de un compuesto antisentido proporcionado en la presente memoria a un sujeto para realizar su función pretendida. Un ejemplo de una vía de administración que se puede utilizar incluye, pero no se limita a, la administración intravítrea.
"Específico de alelo " con respecto a un inhibidor se refiere a un inhibidor, tal como un compuesto antisentido, diseñado para que hibride con/ y/o inhiba la expresión de una transcripción de un alelo de un gen en mayor medida que el otro alelo del gen.
"Mejoría" se refiere a una disminución de al menos un indicador, signo o síntoma de una enfermedad, trastorno o afección asociados. En ciertos aspectos, la mejoría incluye un retraso o ralentización en la progresión de uno o más indicadores de una afección o enfermedad. La gravedad de los indicadores se puede determinar mediante medidas subjetivas u objetivas, que son conocidas por los expertos en la técnica.
"Animal" se refiere a un ser humano o animal no humano, que incluye, pero no se limita a, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y primates no humanos, que incluyen, pero no se limitan a, monos y chimpancés.
"Actividad antisentido" significa cualquier actividad detectable o medible atribuible a la hibridación de un compuesto antisentido con su ácido nucleico diana. En ciertos aspectos, la actividad antisentido es una disminución en la cantidad o expresión de un ácido nucleico diana o proteína codificada por dicho ácido nucleico diana.
"Compuesto antisentido" significa un compuesto oligomérico que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico diana mediante enlaces de hidrógeno. Los ejemplos de compuestos antisentido incluyen compuestos de hebra sencilla y de doble hebra, tales como oligonucleótidos antisentido, ARNip, ARNhc, ARNhs y compuestos basados en la ocupación.
"Inhibición antisentido" significa la reducción de los niveles de ácido nucleico diana en presencia de un compuesto antisentido complementario a un ácido nucleico diana en comparación con los niveles de ácido nucleico diana en ausencia del compuesto antisentido.
Los "mecanismos antisentido" son todos aquellos mecanismos que implican la hibridación de un compuesto con un ácido nucleico diana, en donde el resultado o efecto de la hibridación es la degradación o la ocupación de la diana con estancamiento concomitante de la maquinaria celular que implica, por ejemplo, transcripción o corte y empalme.
"Oligonucleótido antisentido" significa un oligonucleótido de hebra sencilla que tiene una secuencia de nucleobases que permite la hibridación con una región o segmento correspondiente de un ácido nucleico diana.
La "complementariedad de bases" se refiere a la capacidad para el emparejamiento de bases preciso de nucleobases de un oligonucleótido antisentido con nucleobases correspondientes en un ácido nucleico diana (es decir, hibridación), y está mediada por la unión de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen inversa entre las correspondientes nucleobases.
"Radical azúcar bicíclico" significa un radical azúcar modificado que comprende un anillo de 4 a 7 miembros (que incluye, pero no se limita a, un furanosilo) que comprende un puente que conecta dos átomos del anillo de 4 a 7 miembros para formar un segundo anillo, lo que da como resultado una estructura bicíclica. En ciertos aspectos, el anillo de 4 a 7 miembros es un anillo de azúcar. En ciertos aspectos, el anillo de 4 a 7 miembros es un furanosilo. En algunos de estos aspectos, el puente conecta el carbono 2' y el carbono 4' del furanosilo.
"Estructura de protección terminal" o "radical de protección terminal" significa modificaciones químicas, que se han incorporado en cualquier extremo de un compuesto antisentido.
"cEt" o "etilo limitado" significa un radical azúcar bicíclico que comprende un puente que conecta el carbono 4' y el carbono 2', en donde el puente tiene la fórmula: 4'-CH(CH3)-O-2'.
"Etil nucleósido restringido" (también nucleósido cEt) significa un nucleósido que comprende un radical azúcar bicíclico que comprende un puente 4'-CH(CH3)- O-2'.
"Rodopsina P23H" significa cualquier ácido nucleico o proteína de rodopsina P23H. "Ácido nucleico de rodopsina P23H" significa cualquier ácido nucleico que codifica la rodopsina P23H. Por ejemplo, en ciertos aspectos, un ácido nucleico de rodopsina P23H incluye una secuencia de ADN que codifica la rodopsina P23H, una secuencia de ARN transcrita a partir de ADN que codifica la rodopsina P23H (incluido el ADN genómico que comprende intrones y exones) y una secuencia de ARNm que codifica la rodopsina P23H. "ARNm de rodopsina P23H" significa un ARNm que codifica una proteína rodopsina P23H.
"Inhibidor específico de rodopsina P23H" se refiere a cualquier agente capaz de inhibir específicamente el ARN de rodopsina P23H/ y/o la actividad o expresión de la proteína rodopsina P23H a nivel molecular. Por ejemplo, los inhibidores específicos de rodopsina P23H incluyen ácidos nucleicos (incluidos compuestos antisentido), péptidos, anticuerpos, moléculas pequeñas y otros agentes capaces de inhibir la expresión del ARN de rodopsina P23H/ y/o la proteína rodopsina P23H.
"Región químicamente distinta" se refiere a una región de un compuesto antisentido que de alguna manera es químicamente diferente a otra región del mismo compuesto antisentido. Por ejemplo, una región que tiene nucleótidos con 2'-O-metoxietilo es químicamente distinta de una región que tiene nucleótidos sin modificaciones 2'-O-metoxietilo.
"Compuestos antisentido quiméricos" significa compuestos antisentido que tienen al menos 2 regiones químicamente distintas, teniendo cada posición una pluralidad de subunidades.
"Complementariedad" significa la capacidad de emparejamiento entre las nucleobases de un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico.
Se entenderá que "comprenden", "comprende" y "que comprende" implican la inclusión de una etapa o elemento o grupo de etapas o elementos establecidos pero no la exclusión de cualquier otra etapa o elemento o grupo de etapas o elementos.
"Nucleobases contiguas" significa nucleobases inmediatamente adyacentes entre sí.
"Desoxirribonucleótido" significa un nucleótido que tiene un hidrógeno en la posición 2' de la porción de azúcar del nucleótido. Los desoxirribonucleótidos se pueden modificar con cualquiera de una variedad de sustituyentes.
"Diseño" o "Diseñado para" se refiere al proceso de diseño de un compuesto oligomérico que hibrida específicamente con una molécula de ácido nucleico seleccionada.
"Cantidad eficaz" significa la cantidad de agente farmacéutico activo suficiente para lograr un resultado fisiológico deseado en un individuo que necesita el agente. La cantidad eficaz puede variar entre individuos dependiendo de la salud y condición física del individuo que vaya a ser tratado, el grupo taxonómico de los individuos que vayan a ser tratados, la formulación de la composición, la evaluación de las condiciones médicas del individuo y otros factores relevantes.
"Eficacia" significa la capacidad de producir un efecto deseado.
"Expresión" incluye todas las funciones mediante las cuales la información codificada de un gen se convierte en estructuras presentes y que funcionan en una célula. Tales estructuras incluyen, pero no se limitan a, los productos de transcripción y traducción.
"Completamente complementario" o "100% complementario" significa que cada nucleobase de un primer ácido nucleico tiene una nucleobase complementaria en un segundo ácido nucleico. En ciertos aspectos, un primer ácido nucleico es un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana es un segundo ácido nucleico.
"Gápmero" significa un compuesto antisentido quimérico en el que una región interna que tiene una pluralidad de nucleósidos que soportan la escisión de la ARNasa H se coloca entre regiones externas que tienen uno o más nucleósidos, en donde los nucleósidos que comprenden la región interna son químicamente distintos del nucleósido o nucleósidos que comprenden las regiones externas. La región interna se puede denominar "separación" y las regiones externas se pueden denominar "alas".
"Hibridación" significa la reasociación de moléculas de ácido nucleico complementarias. En ciertos aspectos, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen, pero no se limitan a, un compuesto antisentido y una diana de ácido nucleico. En ciertos aspectos, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen, pero no se limitan a, un oligonucleótido antisentido y una diana de ácido nucleico.
"Identificar a un animal que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad, trastorno/ y/o afección" significa identificar a un animal que ha sido diagnosticado de la enfermedad, trastorno/ y/o afección o identificar a un animal predispuesto a desarrollar la enfermedad, trastorno/ y/o afección. Tal identificación se puede lograr mediante cualquier método, incluida la evaluación del historial médico del individuo y las pruebas o evaluaciones clínicas convencionales.
"Inmediatamente adyacente" significa que no hay elementos intermedios entre los elementos inmediatamente adyacentes.
"Individuo" significa un ser humano o animal no humano seleccionado para el tratamiento o la terapia.
"Inhibir la expresión o actividad" se refiere a una reducción, bloqueo de la expresión o actividad y no necesariamente indica una eliminación total de la expresión o actividad.
"Conexión internucleosídica" se refiere al enlace químico entre nucleósidos.
Los oligonucleótidos antisentido "alargados" son aquellos que tienen uno o más nucleósidos adicionales con relación a un oligonucleótido antisentido descrito en la presente memoria.
"Desoxinucleósido conectado" significa una base de ácido nucleico (A, G, C, T, U) sustituida por desoxirribosa conectada por un éster fosfato para formar un nucleótido.
"Nucleósidos conectados" significa nucleósidos adyacentes conectados entre sí por una conexión internucleosídica. "Emparejamiento erróneo " o "nucleobase no complementaria" se refiere al caso en el que una nucleobase de un primer ácido nucleico no es capaz de emparejarse con la nucleobase correspondiente de un segundo ácido nucleico o diana. "Conexión internucleosídica modificada" se refiere a una sustitución o cualquier cambio de un enlace internucleosídico de origen natural (es decir, un enlace internucleósido fosfodiéster).
"Nucleobase modificada" significa cualquier nucleobase distinta de la adenina, citosina, guanina, timidina o uracilo. Una "nucleobase no modificada" significa las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U).
"Nucleósido modificado" significa un nucleósido que tiene, independientemente, un radical azúcar modificado/ y/o nucleobase modificada.
"Nucleótido modificado" significa un nucleótido que tiene, independientemente, un radical azúcar modificado, una conexión internucleosídica modificada o una nucleobase modificada.
"Oligonucleótido modificado" significa un oligonucleótido que comprende al menos una conexión internucleosídica modificada, un azúcar modificado y/o una nucleobase modificada.
"Azúcar modificado" significa sustitución y/o cualquier cambio de un radical azúcar natural.
"Modular" se refiere a cambiar o ajustar una característica en una célula, tejido, órgano u organismo. Por ejemplo, modular el ARNm de rodopsina P23H puede significar aumentar o disminuir el nivel de ARNm de rodopsina P23H/ y/o la proteína rodopsina P23H en una célula, tejido, órgano u organismo. Un "modulador" efectúa el cambio en la célula, tejido, órgano u organismo. Por ejemplo, un compuesto antisentido de rodopsina P23H puede ser un modulador que disminuye la cantidad de ARNm de rodopsina P23H/ y/o proteína rodopsina P23H en una célula, tejido, órgano u organismo.
"Monómero" se refiere a una sola unidad de un oligómero. Los monómeros incluyen, pero no se limitan a, nucleósidos y nucleótidos, ya sean de origen natural o modificados.
"Motivo" significa el patrón de nucleósidos modificados y no modificados en un compuesto antisentido.
"Radical azúcar natural" significa un radical azúcar que se encuentra en el ADN (2'-H) o ARN (2'-OH).
"Conexión internucleosídica de origen natural" significa un enlace fosfodiéster de 3' a 5'.
"Nucleobase no complementaria" se refiere a un par de nucleobases que no forman enlaces de hidrógeno entre sí ni soportan de otro modo la hibridación.
"Ácido nucleico" se refiere a moléculas compuestas de nucleótidos monoméricos. Un ácido nucleico incluye, pero no se limita a, ácidos ribonucleicos (ARN), ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos de hebra sencilla y ácidos nucleicos de doble hebra.
"Nucleobase" significa un radical heterocíclico capaz de emparejarse con una base de otro ácido nucleico.
"Complementariedad de nucleobases" se refiere a una nucleobase que es capaz de emparejarse con otra nucleobase. Por ejemplo, en el ADN, la adenina (A) es complementaria a la timina (T). Por ejemplo, en el ARN, la adenina (A) es complementaria al uracilo (U). En ciertos aspectos, la nucleobase complementaria se refiere a una nucleobase de un compuesto antisentido que es capaz de emparejarse con una nucleobase de su ácido nucleico diana. Por ejemplo, si una nucleobase en una determinada posición de un compuesto antisentido es capaz de formar enlaces de hidrógeno con una nucleobase en una determinada posición de un ácido nucleico diana, en ese caso se considera que la posición de los enlaces de hidrógeno entre el oligonucleótido y el ácido nucleico diana es complementaria en ese par de nucleobases.
"Secuencia de nucleobases" significa el orden de nucleobases contiguas independientemente de cualquier azúcar, conexión/ y/o modificación de nucleobase.
"Nucleósido" significa una nucleobase conectada a un azúcar.
"Mimético de nucleósido" incluye aquellas estructuras utilizadas para reemplazar el azúcar o el azúcar y la base y no necesariamente la conexión en una o más posiciones de un compuesto oligomérico tal como, por ejemplo, miméticos de nucleósidos que tienen miméticos de azúcares de morfolino, ciclohexenilo, ciclohexilo, tetrahidropiranilo, bicíclicos o tricíclicos, p. ej., unidades de azúcar sin furanosa. El mimético de nucleótido incluye aquellas estructuras utilizadas para reemplazar el nucleósido y la conexión en una o más posiciones de un compuesto oligomérico tal como, por ejemplo, ácidos péptidonucleicos o morfolinos (morfolinos conectados por -N(H)-C(=O)-O- u otra conexión no fosfodiéster). El sustituto de azúcar se solapa con el término mimético de nucleósidos, un poco más amplio, pero está destinado a indicar el reemplazo de la unidad de azúcar (anillo de furanosa) únicamente. Los anillos de tetrahidropiranilo proporcionados en la presente memoria son ilustrativos de un ejemplo de un sustituto de azúcar en donde el grupo azúcar de furanosa se ha reemplazado por un sistema de anillos de tetrahidropiranilo. "Mimético" se refiere a grupos que están sustituidos por un azúcar, una nucleobase/ y/o una conexión internucleosídica. Generalmente, se utiliza un mimético en lugar del azúcar o la combinación de azúcar-conexión internucleosídica, y la nucleobase se mantiene para la hibridación con una diana seleccionada.
"Nucleótido" significa un nucleósido que tiene un grupo fosfato conectado covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido.
"Compuesto oligomérico" significa un polímero de subunidades monoméricas conectadas que es capaz de hibridar con al menos una región de una molécula de ácido nucleico.
"Oligonucleósido" significa un oligonucleótido en el que las conexiones internucleosídicas no contienen un átomo de fósforo.
"Oligonucleótido" significa un polímero de nucleósidos conectados, cada uno de los cuales puede estar modificado o no modificado, independientemente uno de otro.
"Composición farmacéutica" significa una mezcla de sustancias adecuadas para la administración a un individuo. Por ejemplo, una composición farmacéutica puede comprender uno o más agentes farmacéuticos activos y una solución acuosa estéril.
"Sales farmacéuticamente aceptables" significa sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, es decir, sales que conservan la actividad biológica deseada del oligonucleótido original y no confieren a estos efectos toxicológicos no deseados.
"Conexión fosforotioato" significa una conexión entre nucleósidos donde el enlace fosfodiéster se modifica reemplazando uno de los átomos de oxígeno que no forman puentes por un átomo de azufre. Una conexión fosforotioato es una conexión internucleosídica modificada.
"Porción" significa un número definido de nucleobases contiguas (es decir, conectadas) de un ácido nucleico. En ciertos aspectos, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un ácido nucleico diana. En ciertos aspectos, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido.
"Prevenir" se refiere a retrasar o evitar la aparición, desarrollo o progresión de una enfermedad, trastorno o afección durante un período de tiempo desde minutos hasta indefinidamente. Prevenir también significa reducir el riesgo de desarrollar una enfermedad, trastorno o afección.
"Cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio
profiláctico o preventivo a un animal.
"Región" se define como una porción del ácido nucleico diana que tiene al menos una estructura, función o característica identificable.
"Ribonucleótido" significa un nucleótido que tiene un hidroxi en la posición 2' de la porción azúcar del nucleótido. Los ribonucleótidos se pueden modificar con cualquiera de una variedad de sustituyentes.
Los "segmentos" se definen como porciones más pequeñas o sub-porciones de regiones dentro de un ácido nucleico diana.
"Selectivo" con respecto a un efecto se refiere a un efecto mayor en una cosa sobre otra en cualquier medida cuantitativa o diferencia de veces. Por ejemplo, un compuesto antisentido que es "selectivo" para la rodopsina P23H o se dirige a o inhibe "selectivamente" la rodopsina P23H, reduce la expresión del alelo de rodopsina P23H en mayor medida que el alelo de tipo salvaje.
"Efectos secundarios" significa una enfermedad fisiológica/ y/o afecciones atribuibles a un tratamiento distinto de los efectos deseados. En ciertos aspectos, los efectos secundarios incluyen reacciones en el lugar de la inyección, anomalías en las pruebas de función hepática, anomalías en la función renal, toxicidad hepática, toxicidad renal, anomalías del sistema nervioso central, miopatías y malestar. Por ejemplo, niveles elevados de aminotransferasas en suero pueden indicar toxicidad hepática o anomalía de la función hepática. Por ejemplo, el aumento de bilirrubina puede indicar toxicidad hepática o anomalía de la función hepática.
Los "sitios", como se emplean en la presente memoria, se definen como posiciones de nucleobases únicas dentro de un ácido nucleico diana.
"Retrasa la progresión" significa una disminución en el desarrollo de dicha enfermedad.
"Específicamente hibridable" se refiere a un compuesto antisentido que tiene un grado suficiente de complementariedad entre un oligonucleótido antisentido y un ácido nucleico diana para inducir un efecto deseado, mientras que muestra efectos mínimos o nulos sobre ácidos nucleicos no diana en condiciones en las que se desea una unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos en vivo y tratamientos terapéuticos. "Condiciones rigurosas de hibridación" o "condiciones rigurosas" se refieren a condiciones en las que un compuesto oligomérico hibridará con su secuencia diana, pero con un número mínimo de otras secuencias.
"Inhibir específicamente" un ácido nucleico diana significa reducir o bloquear la expresión del ácido nucleico diana mientras muestra menos efectos, efectos mínimos o ningún efecto sobre los ácidos nucleicos no diana y no indica necesariamente una eliminación total de la expresión del ácido nucleico diana.
"Sujeto" significa un animal humano o no humano seleccionado para el tratamiento o la terapia.
"Diana" se refiere a una proteína, cuya modulación se desea.
"Gen diana" se refiere a un gen que codifica una diana.
"Direccionamiento" significa el proceso de diseño y selección de un compuesto antisentido que hibridará específicamente con un ácido nucleico diana e inducirá un efecto deseado.
"Ácido nucleico diana", "ARN diana", "transcrito de ARN diana" y "diana de ácido nucleico" significan todos un ácido nucleico capaz de ser elegido como diana por compuestos antisentido.
"Región diana" significa una porción de un ácido nucleico diana a la que se dirigen uno o más compuestos antisentido. "Segmento diana" significa la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico diana a la que se dirige un compuesto antisentido. "Sitio diana 5'" se refiere al nucleótido más 5' de un segmento diana. "Sitio diana 3'" se refiere al nucleótido más 3' de un segmento diana.
"Cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio terapéutico a un individuo.
"Tratar" se refiere a administrar una composición farmacéutica a un animal para efectuar una alteración o mejoría de una enfermedad, trastorno o afección en el animal. En ciertos aspectos, se pueden administrar al animal una o más composiciones farmacéuticas.
Las nucleobases "no modificadas" significan las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U).
"Nucleótido no modificado" significa un nucleótido compuesto de nucleobases, radicales azúcar y conexiones internucleosídicas de origen natural. En ciertos aspectos, un nucleótido no modificado es un nucleótido de ARN (es decir, p-D-ribonucleósidos) o un nucleótido de ADN (es decir, p-D-desoxirribonucleósido).
Ciertos aspectos
Ciertos aspectos proporcionan métodos, compuestos y composiciones para inhibir o inhibir selectivamente la expresión de la rodopsina P23H.
Ciertos aspectos proporcionan compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de rodopsina P23H. En ciertos aspectos, el ácido nucleico de rodopsina P23H mutante humano tiene una sustitución de C por A en el nucleótido 163 del Número de Acceso GENBANK Nm_000539.3 y se incorpora a la presente memoria como SEQ ID NO: 2. En ciertos aspectos, el ácido nucleico de rodopsina P23H mutante humana tiene una sustitución de C por A en el codón 23 (exón 1) de un gen de rodopsina humana que tiene el Número de Acceso GENBANK NM_000539.3. En ciertos aspectos, el compuesto antisentido es un oligonucleótido de hebra sencilla.
Ciertos aspectos proporcionan un compuesto antisentido que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases contiguas de cualquiera de las secuencias de nucleobases de SEQ ID NO: 11-64. En ciertos aspectos, el compuesto antisentido es un oligonucleótido de hebra sencilla.
Ciertos aspectos proporcionan un compuesto antisentido que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 9 nucleobases contiguas de cualquiera de las secuencias de nucleobases de SEQ ID NO: 11-64. En ciertos aspectos, el compuesto antisentido es un oligonucleótido de hebra sencilla.
Ciertos aspectos proporcionan un compuesto antisentido que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 10 nucleobases contiguas de cualquiera de las secuencias de nucleobases de SEQ ID NO: 11-64. En ciertos aspectos, el compuesto antisentido es un oligonucleótido de hebra sencilla.
Ciertos aspectos proporcionan un compuesto antisentido que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 11 nucleobases contiguas de cualquiera de las secuencias de nucleobases de SEQ ID NO: 11-64. En ciertos aspectos, el compuesto antisentido es un oligonucleótido de hebra sencilla.
Ciertos aspectos proporcionan un compuesto antisentido que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 12 nucleobases contiguas de cualquiera de las secuencias de nucleobases de SEQ ID NO: 11-64. En ciertos aspectos, el compuesto antisentido es un oligonucleótido de hebra sencilla.
Ciertos aspectos proporcionan un compuesto antisentido que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia de nucleobases de uno cualquiera de SEQ ID NO: 11-64. En ciertos aspectos, el compuesto antisentido es un oligonucleótido de hebra sencilla.
Ciertos aspectos proporcionan un compuesto antisentido que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en la secuencia de nucleobases de uno cualquiera de SEQ ID NO: 11-64. En ciertos aspectos, el compuesto antisentido es un oligonucleótido de hebra sencilla.
En ciertos aspectos, un compuesto comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 8 a 80 nucleósidos conectados que tienen al menos una porción de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 nucleobases contiguas complementaria a una porción de la misma longitud dentro de los nucleótidos 157-174, 157-174, 157-171, 157-172 o 159-174 de SEQ ID NO: 2.
En ciertos aspectos, un compuesto comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 8 a 80 nucleósidos conectados complementarios dentro de los nucleótidos 157-174, 157-171, 157-172 o 159-174 de SEQ ID NO: 2.
En ciertos aspectos, un compuesto comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados complementarios dentro de los nucleótidos 157-174, 157-174, 157-174, 157-171, 157-172 o 159-174 de SEQ ID NO: 2.
En ciertos aspectos, un compuesto comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 8 a 80 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos una porción de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 nucleobases contigua de uno cualquiera de SEQ ID NO: 15, 21,29 o 64.
En ciertos aspectos, un compuesto comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases contiguas de uno cualquiera de SEQ ID NO: 15, 21,29 o 64.
En ciertos aspectos, un compuesto comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 9 nucleobases contiguas de uno cualquiera de SEQ ID NO: 15, 21,29 o 64.
En ciertos aspectos, un compuesto comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 10 nucleobases contiguas de uno cualquiera de SEQ ID NO: 15, 21,29 o 64.
En ciertos aspectos, un compuesto comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 11 nucleobases contiguas de uno cualquiera de SEQ ID NO: 15, 21,29 o 64.
En ciertos aspectos, un compuesto comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 12 nucleobases contiguas de uno cualquiera de SEQ ID NO: 15, 21,29 o 64.
En ciertos aspectos, un compuesto comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende uno cualquiera de SEQ ID NO: 15, 21.29 o 64.
En ciertos aspectos, un compuesto comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que tiene una secuencia de nucleobases que consiste en uno cualquiera de SEQ ID NO: 15, 21,29 o 64.
En ciertos aspectos, un oligonucleótido modificado dirigido a la rodopsina P23H es ISIS 564426, ISIS 664844, ISIS 664867 o ISIS 664884. De más de 400 oligonucleótidos antisentido que se analizaron como se describe en la sección de Ejemplos a continuación, ISIS 564426, ISIS 664844, ISIS 664867, e ISIS 664884 emergieron como los principales compuestos cabeza de serie. En particular, ISIS 664844 mostró la mejor combinación de propiedades en términos de potencia, tolerabilidad y selectividad para la rodopsina P23H entre más de 400 oligonucleótidos antisentido.
En ciertos aspectos, cualquiera de los compuestos u oligonucleótidos anteriores comprende al menos una conexión internucleosídica modificada, al menos un azúcar modificado/ y/o al menos una nucleobase modificada.
En ciertos aspectos, cualquiera de los compuestos u oligonucleótidos anteriores comprende al menos un azúcar modificado. En ciertos aspectos, al menos un azúcar modificado comprende un grupo 2'-O-metoxietilo. En ciertos aspectos, al menos un azúcar modificado es un azúcar bicíclico, tal como un grupo 4'-CH(CH3)-O-2', un grupo 4'-CH2-O-2', o un grupo 4'-(CH2)2-O-2'.
En ciertos aspectos, el oligonucleótido modificado comprende al menos una conexión internucleosídica modificada, tal como una conexión internucleosídica fosforotioato.
En ciertos aspectos, cualquiera de los compuestos u oligonucleótidos anteriores comprende al menos una nucleobase modificada, tal como 5-metilcitosina.
En ciertos aspectos, cualquiera de los compuestos u oligonucleótidos anteriores comprende:
un segmento de separación que consiste en desoxinucleósidos conectados;
un segmento de ala 5' que consiste en nucleósidos conectados; y
un segmento de ala 3' que consiste en nucleósidos conectados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado. En ciertos aspectos, el oligonucleótido consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO: 15, 44 o 52.
En ciertos aspectos, un compuesto comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende uno cualquiera de SEQ ID NO: 11 64, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de separación que consiste en desoxinucleósidos conectados;
un segmento de ala 5' que consiste en nucleósidos conectados; y
un segmento de ala 3' que consiste en nucleósidos conectados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.
En ciertos aspectos, un compuesto comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende un cualquiera de SEQ ID NO: 15, 21.29 o 64, donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de separación que consiste en desoxinucleósidos conectados;
un segmento de ala 5' que consiste en nucleósidos conectados; y
un segmento de ala 3' que consiste en nucleósidos conectados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.
En ciertos aspectos, un compuesto comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 16 a 30 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO: 15, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de separación que consiste en diez desoxinucleósidos conectados;
un segmento de ala 5' que consiste en tres nucleósidos conectados; y
un segmento de ala 3' que consiste en tres nucleósidos conectados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar con cEt; en donde cada conexión internucleosídica es una conexión fosforotioato; y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
En ciertos aspectos, un compuesto comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 16 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia indicada en SEQ ID NO: 15, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de separación que consiste en diez desoxinucleósidos conectados;
un segmento de ala 5' que consiste en tres nucleósidos conectados; y
un segmento de ala 3' que consiste en tres nucleósidos conectados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala5' y el segmento de ala 3'; en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar con cEt; en donde cada conexión internucleosídica es una conexión fosforotioato; y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
En ciertos aspectos, un compuesto comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 16 a 30 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO: 64, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de separación que consiste en nueve desoxinucleósidos conectados;
un segmento de ala 5' que consiste en cuatro nucleósidos conectados; y
un segmento de ala 3' que consiste en tres nucleósidos conectados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; en donde el segmento de ala 5' comprende un azúcar con cEt, un azúcar con cEt, un azúcar con cEt y un azúcar con 2'-flouro en la dirección 5' a 3'; en donde cada nucleósido del segmento de ala 3' comprende un azúcar con cEt; en donde cada conexión internucleosídica es una conexión fosforotioato; y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
En ciertos aspectos, un compuesto comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 16 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia indicada en SEQ ID NO: 64, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de separación que consiste en nueve desoxinucleósidos conectados;
un segmento de ala 5' que consiste en cuatro nucleósidos conectados; y
un segmento de ala 3' que consiste en tres nucleósidos conectados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; en donde el segmento de ala 5' comprende un azúcar con cEt, un azúcar con cEt, un azúcar con cEt y un azúcar con 2'-flouro en la dirección 5' a 3'; en donde cada nucleósido del segmento de ala 3' comprende un azúcar con cEt; en donde cada conexión internucleosídica es una conexión fosforotioato; y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
En ciertos aspectos, un compuesto comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 16 a 30 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO: 21, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de separación que consiste en diez desoxinucleósidos conectados;
un segmento de ala 5' que consiste en dos nucleósidos conectados; y
un segmento de ala 3' que consiste en cuatro nucleósidos conectados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; en donde cada nucleósido del segmento de ala 5' comprende un azúcar con cEt; en donde el segmento de ala 3' comprende un azúcar con cEt, un azúcar con 2'-O-metoxietilo, un azúcar con cEt y un azúcar con 2'-O-metoxietilo en la dirección 5' a 3'; en donde cada conexión internucleosídica es una conexión fosforotioato; y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina. En ciertos aspectos, un compuesto comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 16 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia indicada en SEQ ID NO: 21, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de separación que consiste en diez desoxinucleósidos conectados;
un segmento de ala 5' que consiste en dos nucleósidos conectados; y
un segmento de ala 3' que consiste en cuatro nucleósidos conectados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; en donde cada nucleósido del segmento de ala 5' comprende un azúcar con cEt; en donde el segmento de ala 3' comprende un azúcar con cEt, un azúcar con 2'-O-metoxietilo, un azúcar con cEt y un azúcar con 2'-O-metoxietilo en la dirección 5' a 3'; en donde cada conexión internucleosídica es una conexión fosforotioato; y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina. En ciertos aspectos, un compuesto comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 15 a 30 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO: 29, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de separación que consiste en diez desoxinucleósidos conectados;
un segmento de ala 5' que consiste en dos nucleósidos conectados; y
un segmento de ala 3' que consiste en tres nucleósidos conectados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; en donde cada nucleósido del segmento de ala 5' comprende un azúcar con cEt; en donde el segmento de ala 3' comprende un azúcar con cEt, un azúcar con 2'-O-metoxietilo y un azúcar con cEt en la dirección 5' a 3'; en donde cada conexión internucleosídica es una conexión fosforotioato; y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
En ciertos aspectos, un compuesto comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 15 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia indicada en SEQ ID NO: 29, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de separación que consiste en diez desoxinucleósidos conectados;
un segmento de ala 5' que consiste en dos nucleósidos conectados; y
un segmento de ala 3' que consiste en tres nucleósidos conectados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; en donde cada nucleósido del segmento de ala 5' comprende un azúcar con cEt; en donde el segmento de ala 3' comprende un azúcar con cEt, un azúcar con 2'-O-metoxietilo y un azúcar con cEt en la dirección 5' a 3'; en donde cada conexión internucleosídica es una conexión fosforotioato; y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
En cualquiera de los aspectos anteriores, el compuesto u oligonucleótido puede ser al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, al menos 99% o 100% complementario a un ácido nucleico que codifica la rodopsina P23H. En cualquiera de los aspectos anteriores, el compuesto antisentido puede ser un oligonucleótido de hebra sencilla. En ciertos aspectos, el compuesto comprende desoxirribonucleótidos.
En cualquiera de los aspectos anteriores, el compuesto antisentido puede ser de doble hebra. En ciertos aspectos, un compuesto comprende ribonucleótidos.
En ciertos aspectos, los compuestos pueden dirigirse a o inhibir selectivamente la expresión del alelo mutante P23H de rodopsina. En ciertos aspectos, los compuestos tienen al menos aproximadamente una selectividad de 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 11 veces, 12 veces, 13 veces, 14 veces, 15 veces, 16 veces, 17 veces, 18 veces, 19 veces o 20 veces para inhibir la expresión del alelo mutante P23H de rodopsina sobre el alelo de tipo salvaje.
En ciertos aspectos, los compuestos o composiciones proporcionados en la presente memoria comprenden una sal
del oligonucleótido modificado. En ciertos aspectos, la sal es una sal de sodio. En ciertos aspectos, la sal es una sal de potasio.
Ciertos aspectos proporcionan una composición que comprende el compuesto de cualquiera de los aspectos antes mencionados o una sal del mismo y al menos uno de un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. En ciertos aspectos, la composición tiene una viscosidad de menos de aproximadamente 40 centipoises (cP), menos de aproximadamente 30 centipoises (cP), menos de aproximadamente 20 centipoises (cP), menos de aproximadamente 15 centipoises (cP) o menos de aproximadamente 10 centipoises (cP). En ciertos aspectos, la composición que tiene cualquiera de las viscosidades antes mencionadas comprende un compuesto proporcionado en la presente memoria a una concentración de aproximadamente 100 mg/ml, aproximadamente 125 mg/ml, aproximadamente 150 mg/ml, aproximadamente 175 mg/ml, aproximadamente 200 mg/ml, aproximadamente 225 mg/ml, aproximadamente 250 mg/ml, aproximadamente 275 mg/ml o aproximadamente 300 mg/ml. En ciertos aspectos, la composición que tiene cualquiera de las viscosidades/ y/o concentraciones de compuesto mencionadas anteriormente tiene una temperatura de temperatura ambiente o aproximadamente 20°C, aproximadamente 21°C, aproximadamente 22°C, aproximadamente 23°C, aproximadamente 24°C, aproximadamente 25°C, aproximadamente 26°C, aproximadamente 27°C, aproximadamente 28°C, aproximadamente 29°C o aproximadamente 30°C.
Ciertas indicaciones
Ciertos aspectos proporcionados en la presente memoria se refieren a métodos para tratar, prevenir, mejorar o ralentizar la progresión de una enfermedad asociada con la rodopsina P23H en un sujeto mediante la administración de un inhibidor específico de rodopsina P23H, tal como un compuesto antisentido dirigido a la rodopsina P23H. En ciertos aspectos, el inhibidor es específico del alelo P23H de Rhodospina e inhibe selectivamente la expresión de rodopsina P23H sobre la rodopsina de tipo salvaje. Los ejemplos de enfermedades asociadas con la rodopsina P23H tratables, prevenibles/ y/o mejorables con los métodos proporcionados en la presente memoria incluyen retinitis pigmentaria (RP), tal como retinitis pigmentaria autosómica dominante (RPAd).
En ciertos aspectos, un método para tratar, prevenir, mejorar o ralentizar la progresión de la retinitis pigmentaria (RP) o la retinitis pigmentaria autosómica dominante (RPAd) en un sujeto comprende administrar al sujeto un inhibidor específico de rodopsina P23H, tratando, previniendo, mejorando o ralentizando de ese modo la progresión de la retinitis pigmentaria (RP) o la retinitis pigmentaria autosómica dominante (RPAd) en el sujeto. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto antisentido dirigido a la rodopsina P23H, tal como un oligonucleótido antisentido dirigido a la rodopsina P23H. En ciertos aspectos, el compuesto antisentido es específico del alelo P23H de Rhodospina e inhibe selectivamente la expresión de rodopsina P23H sobre la rodopsina de tipo salvaje. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de la rodopsina P23H es un compuesto que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 8 a 80 nucleósidos conectados complementarios dentro de los nucleótidos 157-174, 157-171, 157-172 o 159-174 de SEQ ID NO: 2. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases contiguas de cualquiera de las secuencias de nucleobases de SEQ ID NO: 11-64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia de nucleobases de uno cualquiera de SEQ ID NO: 11 -64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en la secuencia de nucleobases de uno cualquiera de SEQ ID NO: 11 -64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11 o 12 nucleobases contiguas de uno cualquiera de SEQ ID NO: 15, 21, 29 o 64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende uno cualquiera de SEQ ID NO: 15, 21, 29 o 64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de la rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que tiene una secuencia de nucleobases que consiste en uno cualquiera SEQ ID NO: 15, 21,29, o 64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es ISIS 564426, ISIS 664844, ISIS 664867 o ISIS 664884. En cualquiera de los aspectos anteriores, el compuesto antisentido puede ser un oligonucleótido de hebra sencilla de hebra sencilla. En ciertos aspectos, el compuesto antisentido se administra al sujeto por vía intravítrea tal como por inyección intravítrea. En ciertos aspectos, la administración del compuesto antisentido mejora, conserva o previene el empeoramiento de la función visual; campo visual; función de la célula fotorreceptora; respuesta de electrorretinograma (ERG) tal como ERG de campo completo que mide la función amplia de la retina, ERG adaptado a la oscuridad que mide la función de cono escotópico, o ERG adaptado a la luz que mide la función de cono fototópico; agudeza visual y/o calidad de vida relacionada con la visión. En ciertos aspectos, la administración del compuesto antisentido inhibe, previene o retrasa la progresión de la pérdida de células fotorreceptoras/ y/o el deterioro de la capa nuclear externa de la retina (CNE). En ciertos aspectos, se identifica que el sujeto tiene el alelo mutante P23H de rodopsina.
En ciertos aspectos, un método para inhibir la expresión de rodopsina P23H en un sujeto que tiene un alelo mutante P23H de rodopsina comprende administrar un inhibidor específico de rodopsina P23H al sujeto, inhibiendo así la expresión de rodopsina P23H en el sujeto. En ciertos aspectos, la administración del inhibidor inhibe la expresión de
rodopsina P23H en el ojo, la retina, la retina periférica, los fotorreceptores de bastón/ y/o los conos. En ciertos aspectos, el sujeto tiene o corre el riesgo de tener retinitis pigmentaria (RP), tal como retinitis pigmentaria autosómica dominante (RPAd). En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto antisentido específico del alelo P23H de la rodopsina que inhibe selectivamente la expresión de la rodopsina P23H sobre la rodopsina de tipo salvaje. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 8 a 80 nucleósidos conectados complementarios dentro de los nucleótidos 157-174, 157-171, 157-172 o 159-174 de SEQ ID NO: 2. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases contiguas de cualquiera de las secuencias de nucleobases de SEQ ID NO: 11-64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia de nucleobases de uno cualquiera de SEQ ID NO: 11 -64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en la secuencia de nucleobases de uno cualquiera de SEQ ID NO: 11-64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11 o 12 nucleobases contiguas de uno cualquiera de SEQ ID NO: 15, 21,29 o 64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende uno cualquiera de SEQ ID NO: 15, 21,29 o 64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que tiene una secuencia de nucleobases que consiste en uno cualquiera SEQ ID NO: 15, 21, 29, o 64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es ISIS 564426, ISIS 664844, ISIS 664867 o ISIS 664884. En cualquiera de los aspectos anteriores, el compuesto antisentido puede ser un oligonucleótido de hebra sencilla de hebra sencilla. En ciertos aspectos, el compuesto antisentido se administra al sujeto por vía intravítrea tal como por inyección intravítrea.
En ciertos aspectos, un método para mejorar o preservar la función visual, el campo visual, la función de las células fotorreceptoras, la respuesta ERG o la agudeza visual en un sujeto que tiene un alelo mutante P23H de rodopsina o que tiene retinitis pigmentaria (RP), tal como retinitis pigmentaria autosómica dominante (RPAd), comprende la administración de un inhibidor específico de rodopsina P23H al sujeto. En ciertos aspectos, un método para inhibir, prevenir o retrasar la progresión de la pérdida de células fotorreceptoras/ y/o el deterioro de la capa nuclear externa de la retina (CNE) en un sujeto que tiene un alelo mutante P23H de rodopsina o que tiene retinitis pigmentaria (RP), tal como retinitis pigmentaria autosómica dominante (RPAd) comprende la administración de un inhibidor específico de rodopsina P23H al sujeto. En ciertos aspectos, el inhibidor es un compuesto antisentido dirigido a la rodopsina P23H. En ciertos aspectos, el compuesto antisentido es específico del alelo P23H de Rodospina e inhibe selectivamente la expresión de rodopsina P23H sobre la rodopsina de tipo salvaje. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 8 a 80 nucleósidos conectados complementarios dentro de los nucleótidos 157-174, 157-171, 157-172 o 159-174 de SEQ ID NO: 2. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases contiguas de cualquiera de las secuencias de nucleobases de SEQ ID NO: 11-64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia de nucleobases de uno cualquiera de SEQ ID NO: 11-64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en la secuencia de nucleobases de uno cualquiera de SEQ ID NO: 11-64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11 o 12 nucleobases contiguas de uno cualquiera de SEQ ID NO: 15, 21,29 o 64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende uno cualquiera de SEQ ID NO: 15, 21, 29 o 64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de la rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que tiene una secuencia de nucleobases que consiste en uno cualquiera SEQ ID NO: 15, 21,29, o 64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es ISIS 564426, ISIS 664844, ISIS 664867 o ISIS 664884. En cualquiera de los aspectos anteriores, el compuesto antisentido puede ser un oligonucleótido de hebra sencilla. En ciertos aspectos, el compuesto antisentido se administra al sujeto por vía intravítrea tal como por inyección intravítrea.
En ciertos aspectos, un método para inhibir la expresión de rodopsina P23H en una célula comprende poner en contacto la célula con un inhibidor específico de rodopsina P23H en el sujeto. En ciertos aspectos, la célula es una célula fotorreceptora de bastón o una célula cono. En ciertos aspectos, la célula está en el ojo de un sujeto. En ciertos aspectos, la célula está en la retina del ojo. En ciertos aspectos, el inhibidor es un compuesto antisentido dirigido a la rodopsina P23H. En ciertos aspectos, el compuesto antisentido es específico del alelo P23H de la Rodospina e inhibe selectivamente la expresión de rodopsina P23H sobre la rodopsina de tipo salvaje. En ciertos aspectos, el inhibidor
específico de rodopsina P23H es un compuesto que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 8 a 80 nucleósidos conectados complementarios dentro de los nucleótidos 157-174, 157-171, 157-172 o 159-174 de SEQ ID NO: 2. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases contiguas de cualquiera de las secuencias de nucleobases de SEQ ID NO: 11-64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia de nucleobases de uno cualquiera de SEQ ID NO: 11-64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en la secuencia de nucleobases de uno cualquiera de SEQ ID NO: 11-64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11 o 12 nucleobases contiguas de uno cualquiera de SEQ ID NO: 15, 21,29 o 64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende uno cualquiera de SEQ ID NO: 15, 21, 29 o 64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que tiene una secuencia de nucleobases que consiste en uno cualquiera SEQ ID NO: 15, 21,29, o 64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es ISIS 564426, ISIS 664844, ISIS 664867 o ISIS 664884. En cualquiera de los aspectos anteriores, el compuesto antisentido puede ser un oligonucleótido de hebra sencilla.
Ciertos aspectos se refieren a un inhibidor específico de rodopsina P23H para su uso en el tratamiento de la retinitis pigmentaria (RP), tal como la retinitis pigmentaria autosómica dominante (RPAd) asociada con la rodopsina P23H. En ciertos aspectos, el inhibidor es un compuesto antisentido dirigido a la rodopsina P23H. En ciertos aspectos, el compuesto antisentido es especifico del alelo P23H de la Rodopsina e inhibe selectivamente la expresión de rodopsina P23H sobre la rodopsina de tipo salvaje. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 8 a 80 nucleósidos conectados complementarios dentro de los nucleótidos 157-174, 157-171, 157-172 o 159-174 de SEQ ID NO: 2. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases contiguas de cualquiera de las secuencias de nucleobases de SEQ ID NO: 11 -64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia de nucleobases de uno cualquiera de SEQ ID NO: 11-64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en la secuencia de nucleobases de uno cualquiera de SEQ ID NO: 11-64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11 o 12 nucleobases contiguas de uno cualquiera de SEQ ID NO: 15, 21,29 o 64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende uno cualquiera de SEQ ID NO: 15, 21,29 o 64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que tiene una secuencia de nucleobases que consiste en uno cualquiera SEQ ID NO: 15, 21, 29, o 64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es ISIS 564426, ISIS 664844, ISIS 664867 o ISIS 664884. En cualquiera de los aspectos anteriores, el compuesto antisentido puede ser un oligonucleótido de hebra sencilla.
Ciertos aspectos se refieren a un inhibidor específico de rodopsina P23H para su uso en la mejora o preservación de la función visual, el campo visual, la función de las células fotorreceptoras, la respuesta ERG, la agudeza visual/ y/o la calidad de vida relacionada con la visión de un sujeto que tiene retinitis pigmentaria (RP), tal como retinitis pigmentaria autosómica dominante (RPAd) asociada con la rodopsina P23H. Ciertos aspectos se refieren a un inhibidor específico de rodopsina P23H para su uso en la inhibición, prevención o retraso de la progresión de la pérdida de células fotorreceptoras/ y/o el deterioro de la capa nuclear externa de la retina (CNE) en un sujeto que tiene retinitis pigmentaria (RP), tal como autosómica retinitis pigmentaria dominante (RPAd) asociada con la rodopsina P23H. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 8 a 80 nucleósidos conectados complementarios dentro de los nucleótidos 157-174, 157-171, 157-172 o 159-174 de SEQ ID NO: 2. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases contiguas de cualquiera de las secuencias de nucleobases de SEQ ID NO: 11-64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia de nucleobases de uno cualquiera de SEQ ID NO: 11 -64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en la secuencia de nucleobases de uno cualquiera de SEQ ID NO: 11-64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina
P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11 o 12 nucleobases contiguas de uno cualquiera de SEQ ID NO: 15, 21,29 o 64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende uno cualquiera de SEQ ID NO: 15, 21, 29 o 64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de la rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que tiene una secuencia de nucleobases que consiste en uno cualquiera SEQ ID NO: 15, 21, 29, o 64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de la rodopsina P23H es ISIS 564426, ISIS 664844, ISIS 664867 o ISIS 664884. En cualquiera de los aspectos anteriores, el compuesto antisentido puede ser un oligonucleótido de hebra sencilla.
Ciertos aspectos se refieren al uso de un inhibidor específico de rodopsina P23H para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la retinitis pigmentaria (RP), tal como retinitis pigmentaria autosómica dominante (RPAd) asociada con la rodopsina P23H. En ciertos aspectos, el inhibidor es un compuesto antisentido dirigido a la rodopsina P23H. En ciertos aspectos, el compuesto antisentido es especifico del alelo P23H de Rodopsina e inhibe selectivamente la expresión de rodopsina P23H sobre la rodopsina de tipo salvaje. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 8 a 80 nucleósidos conectados complementarios dentro de los nucleótidos 157-174, 157-171, 157-172 o 159-174 de SEQ ID NO: 2. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases contiguas de cualquiera de las secuencias de nucleobases de SEQ ID NO: 11-64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia de nucleobases de uno cualquiera de SEQ ID NO: 11-64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en la secuencia de nucleobases de uno cualquiera de SEQ ID NO: 11-64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11 o 12 nucleobases contiguas de uno cualquiera de SEQ ID NO: 15, 21,29 o 64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende uno cualquiera de SEQ ID NO: 15, 21, 29 o 64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que tiene una secuencia de nucleobases que consiste en uno cualquiera SEQ ID NO: 15, 21,29, o 64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es ISIS 564426, ISIS 664844, ISIS 664867 o ISIS 664884. En cualquiera de los aspectos anteriores, el compuesto antisentido puede ser un oligonucleótido de hebra sencilla.
Ciertos aspectos se refieren al uso de un inhibidor específico de rodopsina P23H para la fabricación de un medicamento para mejorar o preservar la función visual, el campo visual, la función de las células fotorreceptoras, la respuesta ERG, la agudeza visual/ y/o la calidad de vida relacionada con la visión de un sujeto que tiene retinitis pigmentaria (RP), tal como retinitis pigmentaria autosómica dominante (RPAd) asociada con la rodopsina P23H. Ciertos aspectos se refieren al uso de un inhibidor específico de rodopsina P23H para la fabricación de un medicamento para inhibir, prevenir o retrasar la progresión de la pérdida de células fotorreceptoras/ y/o el deterioro de la capa nuclear externa de la retina (CNE) en un sujeto que tiene retinitis pigmentaria (RP), tal como retinitis pigmentaria autosómica dominante (RPAd) asociada con la rodopsina P23H. En ciertos aspectos, el inhibidor es un compuesto antisentido dirigido a la rodopsina P23H. En ciertos aspectos, el compuesto antisentido es especifico del alelo P23H de la Rodopsina e inhibe selectivamente la expresión de la rodopsina P23H sobre la rodopsina de tipo salvaje. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 8 a 80 nucleósidos conectados complementarios dentro de los nucleótidos 157-174, 157-171, 157-172 o 159-174 de SEQ ID NO: 2. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases contiguas de cualquiera de las secuencias de nucleobases de SEQ ID NO: 11-64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia de nucleobases de uno cualquiera de SEQ ID NO: 11-64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en la secuencia de nucleobases de uno cualquiera de SEQ ID NO: 11-64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11 o 12 nucleobases contiguas de uno cualquiera de SEQ ID NO: 15, 21, 29 o 64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende uno cualquiera de SEQ ID NO: 15, 21, 29 o 64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de la rodopsina P23H es un compuesto antisentido que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que tiene una secuencia de
nucleobases que consiste en uno cualquiera SEQ ID NO: 15, 21,29, o 64. En ciertos aspectos, el inhibidor específico de la rodopsina P23H es ISIS 564426, ISIS 664844, ISIS 664867 o ISIS 664884. En cualquiera de los aspectos anteriores, el compuesto antisentido puede ser un oligonucleótido de hebra sencilla.
En cualquiera de los métodos o usos anteriores, el inhibidor específico de rodopsina P23H puede ser un compuesto antisentido dirigido a la rodopsina P23H. En ciertos aspectos, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido, por ejemplo, un oligonucleótido antisentido que consiste en 8 a 80 nucleósidos conectados, 12 a 30 nucleósidos conectados o 20 nucleósidos conectados. En ciertos aspectos, el oligonucleótido antisentido es al menos 80%, 85%, 90%, 95% o 100% complementario a cualquiera de las secuencias de nucleobases indicadas en SEQ ID NO: 1-4. En ciertos aspectos, el oligonucleótido antisentido comprende al menos una conexión internucleosídica modificada, al menos un azúcar modificado/ y/o al menos una nucleobase modificada. En ciertos aspectos, la conexión internucleosídica modificada es una conexión internucleosídica fosforotioato, el azúcar modificado es un azúcar bicíclico o un 2'-O-metoxietilo y la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina. En ciertos aspectos, el oligonucleótido modificado comprende un segmento de separación que consiste en desoxinucleósidos conectados; un segmento de ala 5' que consiste en nucleósidos conectados; y un segmento de ala 3' que consiste en nucleósidos conectados, en donde el segmento de separación se coloca inmediatamente adyacente a, y entre, el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado. En ciertos aspectos, el oligonucleótido antisentido es especifico del alelo P23H de la Rodopsina e inhibe selectivamente la expresión de la rodopsina P23H sobre la rodopsina de tipo salvaje.
En cualquiera de los métodos o usos anteriores, el inhibidor específico de rodopsina P23H puede ser un compuesto que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende uno cualquiera de SEQ ID NO: 11-64, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de separación que consiste en desoxinucleósidos conectados;
un segmento de ala 5' que consiste en nucleósidos conectados; y
un segmento de ala 3' que consiste en nucleósidos conectados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5'y el segmento de ala 3' y en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.
En cualquiera de los métodos o usos anteriores, el inhibidor específico de rodopsina P23H puede ser un compuesto que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende uno cualquiera SEQ ID NO: 15, 21, 29, o 64, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de separación que consiste en desoxinucleósidos conectados;
un segmento de ala 5' que consiste en nucleósidos conectados; y
un segmento de ala 3' que consiste en nucleósidos conectados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.
En cualquiera de los métodos o usos anteriores, el inhibidor específico de rodopsina P23H puede ser un compuesto que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 16 a 30 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO: 15, en donde el oligonucleótido comprende:
un segmento de separación que consiste en diez desoxinucleósidos conectados;
un segmento de ala 5' que consiste en tres nucleósidos conectados; y
un segmento de ala 3' que consiste en tres nucleósidos conectados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar con cEt; en donde cada conexión internucleosídica es una conexión fosforotioato; y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
En cualquiera de los métodos o usos anteriores, el inhibidor específico de rodopsina P23H puede ser un compuesto que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 16 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia indicada en SEQ ID NO: 15, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de separación que consiste en diez desoxinucleósidos conectados;
un segmento de ala 5' que consiste en tres nucleósidos conectados; y
un segmento de ala 3' que consiste en tres nucleósidos conectados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar con cEt; en donde cada conexión internucleosídica es una conexión fosforotioato; y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
En cualquiera de los métodos o usos anteriores, el inhibidor específico de rodopsina P23H puede ser un compuesto que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 16 a 30 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO: 64, en donde el oligonucleótido comprende:
un segmento de separación que consiste en nueve desoxinucleósidos conectados;
un segmento de ala 5' que consiste en cuatro nucleósidos conectados; y
un segmento de ala 3' que consiste en tres nucleósidos conectados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; en donde el segmento de ala 5' comprende un azúcar con cEt, un azúcar con cEt, un azúcar con cEt y un azúcar con 2'-flouro en la dirección 5' a 3'; en donde cada nucleósido del segmento de ala 3' comprende un azúcar con cEt; en donde cada conexión internucleosídica es una conexión fosforotioato; y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
En cualquiera de los métodos o usos anteriores, el inhibidor específico de rodopsina P23H puede ser un compuesto que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 16 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 64, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de separación que consiste en nueve desoxinucleósidos conectados;
un segmento de ala 5' que consiste en cuatro nucleósidos conectados; y
un segmento de ala 3' que consiste en tres nucleósidos conectados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; en donde el segmento de ala 5' comprende un azúcar con cEt, un azúcar con cEt, un azúcar con cEt y un azúcar con 2'-flouro en la dirección 5' a 3'; en donde cada nucleósido del segmento de ala 3' comprende un azúcar con cEt; en donde cada conexión internucleosídica es una conexión fosforotioato; y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
En cualquiera de los métodos o usos anteriores, el inhibidor específico de rodopsina P23H puede ser un compuesto que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 16 a 30 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO: 21, en donde el oligonucleótido comprende:
un segmento de separación que consiste en diez desoxinucleósidos conectados;
un segmento de ala 5' que consiste en dos nucleósidos conectados; y
un segmento de ala 3' que consiste en cuatro nucleósidos conectados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; en donde cada nucleósido del segmento de ala 5' comprende un azúcar con cEt; en donde el segmento de ala 3' comprende un azúcar con cEt, un azúcar con 2'-O-metoxietilo, un azúcar con cEt y un azúcar con 2'-O-metoxietilo en la dirección 5' a 3'; en donde cada conexión internucleosídica es una conexión fosforotioato; y donde cada citosina es una 5-metilcitosina. En cualquiera de los métodos o usos anteriores, el inhibidor específico de rodopsina P23H puede ser un compuesto que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 16 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia indicada en SEQ ID NO: 21, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de separación que consiste en diez desoxinucleósidos conectados;
un segmento de ala 5' que consiste en dos nucleósidos conectados; y
un segmento de ala 3' que consiste en cuatro nucleósidos conectados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; en donde cada nucleósido del segmento de ala 5' comprende un azúcar con cEt; en donde el segmento de ala 3' comprende un azúcar con cEt, un azúcar con 2'-O-metoxietilo, un azúcar con cEt y un azúcar con 2'-O-metoxietilo en la dirección 5' a 3'; en
donde cada conexión internucleosídica es una conexión fosforotioato; y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
En cualquiera de los métodos o usos anteriores, el inhibidor específico de rodopsina P23H puede ser un compuesto que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 15 a 30 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO: 29, en donde el oligonucleótido comprende:
un segmento de separación que consiste en diez desoxinucleósidos conectados;
un segmento de ala 5' que consiste en dos nucleósidos conectados; y
un segmento de ala 3' que consiste en tres nucleósidos conectados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; en donde cada nucleósido del segmento de ala 5' comprende un azúcar con cEt; en donde el segmento de ala 3' comprende un azúcar con cEt, un azúcar con 2'-O-metoxietilo y un azúcar con cEt en la dirección 5' a 3'; en donde cada conexión internucleosídica es una conexión fosforotioato; y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
En cualquiera de los métodos o usos anteriores, el inhibidor específico de rodopsina P23H puede ser un compuesto que comprende o consiste en un oligonucleótido modificado que consiste en 15 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia indicada en SEQ ID NO: 29, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de separación que consiste en diez desoxinucleósidos conectados;
un segmento de ala 5' que consiste en dos nucleósidos conectados; y
un segmento de ala 3' que consiste en tres nucleósidos conectados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; en donde cada nucleósido del segmento de ala 5' comprende un azúcar con cEt; en donde el segmento de ala 3' comprende un azúcar con cEt, un azúcar con 2'-O-metoxietilo y un azúcar con cEt en la dirección 5' a 3'; en donde cada conexión internucleosídica es una conexión fosforotioato; y donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
En cualquiera de los métodos o usos anteriores, el inhibidor específico de rodopsina P23H se administra por vía intravítrea, tal como mediante inyección intravítrea.
Compuestos antisentido
Los compuestos oligoméricos incluyen, pero no se limitan a, oligonucleótidos, oligonucleósidos, análogos de oligonucleótidos, miméticos de oligonucleótidos, compuestos antisentido, oligonucleótidos antisentido y ARNip. Un compuesto oligomérico puede ser "antisentido" para un ácido nucleico diana, lo que significa que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico diana a través de enlaces de hidrógeno.
En ciertos aspectos, un compuesto antisentido tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en la dirección 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que se dirige.
En ciertos aspectos, un compuesto antisentido tiene de 10 a 30 subunidades de longitud. En ciertos aspectos, un compuesto antisentido tiene una longitud de 12 a 30 subunidades. En ciertos aspectos, un compuesto antisentido tiene una longitud de 12 a 22 subunidades. En ciertos aspectos, un compuesto antisentido tiene una longitud de 14 a 30 subunidades. En ciertos aspectos, un compuesto antisentido tiene una longitud de 14 a 20 subunidades. En ciertos aspectos, un compuesto antisentido tiene una longitud de 15 a 30 subunidades. En ciertos aspectos, un compuesto antisentido tiene una longitud de 15 a 20 subunidades. En ciertos aspectos, un compuesto antisentido tiene una longitud de 16 a 30 subunidades. En ciertos aspectos, un compuesto antisentido tiene una longitud de 16 a 20 subunidades. En ciertos aspectos, un compuesto antisentido tiene una longitud de 17 a 30 subunidades. En ciertos aspectos, un compuesto antisentido tiene una longitud de 17 a 20 subunidades. En ciertos aspectos, un compuesto antisentido tiene una longitud de 18 a 30 subunidades. En ciertos aspectos, un compuesto antisentido tiene una longitud de 18 a 21 subunidades. En ciertos aspectos, un compuesto antisentido tiene una longitud de 18 a 20 subunidades. En ciertos aspectos, un compuesto antisentido tiene una longitud de 20 a 30 subunidades. En otras palabras, dichos compuestos antisentido tienen de 12 a 30 subunidades conectadas, de 14 a 30 subunidades conectadas, de 14 a 20 subunidades, de 15 a 30 subunidades, de 15 a 20 subunidades, de 16 a 30 subunidades, de 16 a 20 subunidades, de 17 a 30 subunidades, de 17 a 20 subunidades, de 18 a 30 subunidades, de 18 a 20 subunidades, de 18 a 21 subunidades, de 20 a 30 subunidades o de 12 a 22 subunidades conectadas, respectivamente. En ciertos aspectos, un compuesto antisentido tiene 14 subunidades de longitud. En ciertos aspectos, un compuesto antisentido tiene 16 subunidades de longitud. En ciertos aspectos, un compuesto antisentido tiene 17 subunidades de longitud. En ciertos aspectos, un compuesto antisentido tiene 18 subunidades de longitud. En ciertos aspectos, un compuesto antisentido tiene 19 subunidades de longitud. En ciertos aspectos, un compuesto antisentido tiene 20 subunidades de longitud. En otros aspectos, el compuesto antisentido tiene de 8 a 80, de 12 a 50, de 13 a 30, de 13 a 50, de 14 a 30, de 14 a 50, de 15 a 30, de 15 a 50, de 16 a 30, de 16 a 50, de 17 a 30, de 17 a
50, de 18 a 22, de 18 a 24, de 18 a 30, de 18 a 50, de 19 a 22, de 19 a 30, de 19 a 50 o de 20 a 30 subunidades conectadas. En ciertos aspectos, los compuestos antisentido tienen 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28. , 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53,54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 ,79 u 80 subunidades conectadas de longitud, o un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores. En algunos aspectos, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido y las subunidades conectadas son nucleótidos.
En ciertos aspectos, los oligonucleótidos antisentido se pueden acortar o truncar. Por ejemplo, una sola subunidad se puede eliminar del extremo 5' (truncamiento 5') o, alternativamente, del extremo 3' (truncamiento 3'). Un compuesto antisentido acortado o truncado dirigido a un ácido nucleico de rodopsina P23H puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 5', o alternativamente puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 3' del compuesto antisentido. Alternativamente, los nucleósidos eliminados se pueden dispersar por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene un nucleósido eliminado del extremo 5' y un nucleósido eliminado del extremo 3'.
Cuando una única subunidad adicional está presente en un compuesto antisentido alargado, la subunidad adicional puede ubicarse en el extremo 5' o 3' del compuesto antisentido. Cuando dos o más subunidades adicionales están presentes, las subunidades añadidas pueden ser adyacentes entre sí, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene dos subunidades añadidas al extremo 5' (adición 5'), o alternativamente al extremo 3' (3 'adición), del compuesto antisentido. Alternativamente, las subunidades añadidas se pueden dispersar por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene una subunidad añadida al extremo 5' y una subunidad añadida al extremo 3'.
Es posible aumentar o disminuir la longitud de un compuesto antisentido, tal como un oligonucleótido antisentido, y/o introducir bases con emparejamientos erróneos sin eliminar la actividad. Por ejemplo, Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992), se sometió a prueba una serie de oligonucleótidos antisentido de 13-25 nucleobases de longitud para determinar su capacidad para inducir la escisión de un ARN diana en un modelo de inyección de ovocitos. Los oligonucleótidos antisentido con 25 nucleobases de longitud con 8 u 11 bases de emparejamiento erróneo cerca de los extremos de los oligonucleótidos antisentido pudieron dirigir la escisión específica del ARNm diana, aunque en menor medida que los oligonucleótidos antisentido que no contenían emparejamientos erróneos. De manera similar, la escisión específica de la diana se logró utilizando oligonucleótidos antisentido de 13 nucleobases, incluidos aquellos con 1 o 3 emparejamientos erróneos.
Gautschi et al. (J. Natl. Cancer Inst. 93:463-471, marzo de 2001) demostraron la capacidad de un oligonucleótido que tiene 100% de complementariedad con el ARNm de bcl-2 y que tiene 3 emparejamientos erróneos con el ARNm de bcl-xL para reducir la expresión de bcl-2 y bcl-xL in vitro e in vivo. Además, este oligonucleótido demostró una potente actividad antitumoral in vivo.
Maher y Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358,1988) sometieron a prueba una serie de oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases en tándem y oligonucleótidos antisentido de 28 y 42 nucleobases compuestos por la secuencia de dos o tres de los oligonucleótidos antisentido en tándem, respectivamente, por su capacidad para detener la traducción de DHFR humana en un ensayo de reticulocitos de conejo. Cada uno de los tres oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases por sí solo pudo inhibir la traducción, aunque a un nivel más modesto que los oligonucleótidos antisentido de 28 o 42 nucleobases.
Ciertos motivos y mecanismos de compuestos antisentido
En ciertos aspectos, los compuestos antisentido tienen subunidades químicamente modificadas dispuestas en patrones, o motivos, para conferir a los compuestos antisentido propiedades tales como una mejor actividad inhibidora, una mayor afinidad de unión por un ácido nucleico diana o resistencia a la degradación por nucleasas in vivo.
Los compuestos antisentido quiméricos contienen típicamente al menos una región modificada para conferir mayor resistencia a la degradación por nucleasas, mayor captación celular, mayor afinidad de unión por el ácido nucleico diana/ y/o mayor actividad inhibidora. Una segunda región de un compuesto antisentido quimérico puede conferir otra propiedad deseada, p. ej., servir como sustrato para la endonucleasa celular ARNasa H, que escinde la hebra de ARN de un dúplex ARN:AdN.
La actividad antisentido puede ser resultado de cualquier mecanismo que implique la hibridación del compuesto antisentido (p. ej., oligonucleótido) con un ácido nucleico diana, en donde la hibridación finalmente da como resultado un efecto biológico. En ciertos aspectos, se modula la cantidad/ y/o actividad del ácido nucleico diana. En ciertos aspectos, se reduce la cantidad/ y/o actividad del ácido nucleico diana. En ciertos aspectos, la hibridación del compuesto antisentido con el ácido nucleico diana da como resultado finalmente la degradación del ácido nucleico diana. En ciertos aspectos, la hibridación del compuesto antisentido con el ácido nucleico diana no da como resultado la degradación del ácido nucleico diana. En algunos de tales aspectos, la presencia del compuesto antisentido hibridado con el ácido nucleico diana (ocupación) da como resultado una modulación de la actividad antisentido. En ciertos aspectos, los compuestos antisentido que tienen un motivo químico concreto o patrón de modificaciones químicas son particularmente adecuados para explotar uno o más mecanismos. En ciertos aspectos, los compuestos antisentido funcionan a través de más de un mecanismo/ y/o a través de mecanismos que no se han dilucidado. Por consiguiente, los compuestos antisentido
descritos en la presente memoria no están limitados por un mecanismo particular.
Los mecanismos antisentido incluyen, sin limitación, antisentido mediado por ARNasa H; mecanismos de ARNi, que utilizan la vía RISC e incluyen, sin limitación, mecanismos de ARNip, ARNhs y microARN; y mecanismos basados en la ocupación. Ciertos compuestos antisentido pueden actuar a través de más de uno de tales mecanismos/ y/o mediante mecanismos adicionales.
Antisentido mediado por ARNasa H
En ciertos aspectos, la actividad antisentido resulta, al menos en parte, de la degradación del ARN diana por la ARNasa H. La ARNasa H es una endonucleasa celular que escinde la hebra de ARN de un dúplex ARN:ADN. Se sabe en la técnica que los compuestos antisentido de hebra sencilla que son "de tipo ADN" provocan actividad de ARNasa H en células de mamífero. Por consiguiente, los compuestos antisentido que comprenden al menos una porción de ADN o nucleósidos de tipo a ADN pueden activar la ARNasa H, dando como resultado la escisión del ácido nucleico diana. En ciertos aspectos, los compuestos antisentido que utilizan ARNasa H comprenden uno o más nucleósidos modificados. En ciertos aspectos, tales compuestos antisentido comprenden al menos un bloque de 1-8 nucleósidos modificados. En algunos de tales aspectos, los nucleósidos modificados no soportan la actividad de la ARNasa H. En ciertos aspectos, tales compuestos antisentido son gápmeros, como se describe en la presente memoria. En algunos de tales aspectos, la separación del gápmero comprende nucleósidos de tipo ADN. En algunos de tales aspectos, la separación del gápmero comprende nucleósidos de tipo ADN. En algunos de tales aspectos, la separación del gápmero comprende nucleósidos de ADN y nucleósidos de tipo a ADN.
Ciertos compuestos antisentido que tienen un motivo gápmero se consideran compuestos antisentido quiméricos. En un gápmero, una región interna que tiene una pluralidad de nucleótidos que soporta la escisión por ARNasaH se coloca entre las regiones externas que tienen una pluralidad de nucleótidos que son químicamente distintos de los nucleósidos de la región interna. En el caso de un oligonucleótido antisentido que tiene un motivo gápmero, el segmento de separación generalmente sirve como sustrato para la escisión por endonucleasas, mientras que los segmentos de ala comprenden nucleósidos modificados. En ciertos aspectos, las regiones de un gápmero se diferencian por los tipos de radicales azúcar que comprenden cada región distinta. Los tipos de radicales azúcar que se utilizan para diferenciar las regiones de un gápmero pueden incluir en algunos aspectos p-D-ribonucleósidos, p-D-desoxirribonucleósidos, nucleósidos modificados en 2' (tales nucleósidos modificados en 2' pueden incluir 2'-MOE y 2'-O-CH3, entre otros) y nucleósidos modificados con azúcar bicíclico (tales nucleósidos modificados con azúcar bicíclico pueden incluir los que tienen un etilo limitado). En ciertos aspectos, los nucleósidos en las alas pueden incluir varios radicales azúcar modificados, que incluyen, por ejemplo, radicales azúcar 2'-MOE y bicíclicos tales como etilo limitado o LNA. En ciertos aspectos, las alas pueden incluir varios radicales azúcar modificados y no modificados. En ciertos aspectos, las alas pueden incluir diversas combinaciones de nucleósidos 2'-MOE, radicales azúcar bicíclicos tales como nucleósidos con etilo limitado o nucleósidos ANB y 2'-desoxinucleósidos.
Cada región distinta puede comprender radicales azúcar uniformes, variantes o radicales azúcar alternos. El motivo del ala-espacio-ala se describe con frecuencia como "XYZ", donde "X" representa la longitud del ala 5', "Y" representa la longitud del espacio y "Z" representa la longitud del ala 3'. "X" y "Z" pueden comprender radicales azúcar uniformes, variantes o alternantes. En ciertos aspectos, "X" e "Y" pueden incluir uno o más 2'-desoxinucleósidos. "Y" puede comprender 2'-desoxinucleósidos. Como se emplea en la presente memoria, un gápmero descrito como "X-Y-Z" tiene una configuración tal que la separación se coloca inmediatamente adyacente a cada una de las alas 5' y 3'. Por tanto, no existen nucleótidos intermedios entre el ala 5' y la separación, o la separación y el ala 3'. Cualquiera de los compuestos antisentido descritos en al presente memoria puede tener un motivo gápmero. En ciertos aspectos, "X" y "Z" son iguales; en otros aspectos son diferentes. En ciertos aspectos, "Y" está entre 8 y 15 nucleósidos. X, Y o Z pueden tener cualquiera de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o más nucleósidos.
En ciertos aspectos, el compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de rodopsina P23H tiene un motivo gápmero en el que la separación consiste en 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 nucleósidos conectados.
En ciertos aspectos, el oligonucleótido antisentido tiene un motivo azúcar descrito por la Fórmula A como sigue: (J)m-(B)n-(J)p-(B)r-(A)t-(D)g-(A)v-(B)w-(J)X-(B)y-(J)z
en donde:
cada A es independientemente un nucleósido sustituido en 2';
cada B es independientemente un nucleósido bicíclico;
cada J es independientemente un nucleósido sustituido en 2' o un 2'-desoxinucleósido;
cada D es un 2'-desoxinucleósido;
m es 0-4; n es 0-2; p es 0-2; r es 0-2; t es 0-2; v es 0-2; w es 0-4; x es 0-2; y es 0-2; z es 0-4; g es 6-14; siempre que:
al menos uno de m, n y r sea distinto de 0;
al menos uno de w e y sea distinto de 0;
la suma de m, n, p, r y t sea de 2 a 5; y
la suma de v, w, x, y, y z sea de 2 a 5.
Compuestos de ARNi
En ciertos aspectos, los compuestos antisentido son compuestos de ARN de interferencia (ARNi), que incluyen compuestos de ARN de doble hebra (también denominados ARN de interferencia corto o ARNip) y compuestos de ARNi de hebra sencilla (o ARNhs). Tales compuestos funcionan al menos en parte a través de la ruta RISC para degradar/ y/o secuestrar un ácido nucleico diana (por tanto, incluyen microARN/compuestos que imitan microARN). En ciertos aspectos, los compuestos antisentido comprenden modificaciones que los hacen particularmente adecuados para tales mecanismos.
i. Compuestos de ARNAhs
En ciertos aspectos, los compuestos antisentido, incluidos aquellos particularmente adecuados para su uso como compuestos de ARNi de hebra sencilla (ARNhs) comprenden un extremo terminal 5' modificado. En algunos de tales aspectos, el extremo 5' terminal comprende un radical fosfato modificado. En ciertos aspectos, tal fosfato modificado está estabilizado (p. ej., resistente a la degradación/escisión en comparación con el 5'-fosfato no modificado). En ciertos aspectos, tales nucleósidos terminales 5' estabilizan el radical de fósforo 5'. Ciertos nucleósidos 5' terminales modificados se pueden encontrar en la técnica, por ejemplo en el documento WO/2011/139702.
En ciertos aspectos, el 5'-nucleósido de un compuesto de ARNhs tiene la Fórmula IIc:
en donde:
T1 es un radical de fósforo opcionalmente protegido;
T 2 es un grupo de conexión internucleosídica que conecta el compuesto de Fórmula IIc al compuesto oligomérico; A tiene una de las fórmulas:
Q1 y Q2 son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6, alcoxi C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6, alquinilo C2-C6 sustituido o N(R3)(R4 );
Q3 es O, S, N(R5) o C(R6)(R7);
cada R3, R4 R5, R6 y R7 es, independientemente, H, alquilo C1-C6 , alquilo C1-C6 sustituido o alcoxi C1-C6; M3 es O, S, NR14, C(R15)(R16), C(R15)(R16)C(R17)(R18), C(R15)=C(R17), OC(R15)(R16) u OC(R15)(Bx2);
R14 es H, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6, alcoxi C 1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 , alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido;
R15, R16, R17 y R18 son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6, alcoxi C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido;
Bx1 es un radical de base heterocíclica;
o si Bx2 está presente, en ese caso Bx2 es un radical de base heterocíclico y Bx1 es H, halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6, alcoxi C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido;
J4, J5, J6 y J7 son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C i -C6, alcoxi C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido; o J4 forma un puente con uno de J5 o J7 en donde dicho puente comprende de 1 a 3 grupos birradicales conectados seleccionados entre O, S, NR19, C(R20)(R21), C(R20)=C(R21), C[=C(R20)(R21)] y C(=O) y los otros dos de J5, J6 y J7 son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6, alcoxi C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido; cada R19, R20 y R21 es, independientemente, H, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6, alcoxi C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido;
G es H, OH, halógeno u O-[C(R8)(R9)]n-[(C=O)m-X1]rZ;
cada R8 y R9 es, independientemente, H, halógeno, alquilo C 1-C6 o alquilo C1-C6 sustituido;
X1 es O, S o N(E1);
Z es H, halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6, alquinilo C2-C6 sustituido o N(E2)(E3);
E1, E2 y E3 son cada uno, independientemente, H, alquilo C1-C6 o alquilo C1-C6 sustituido;
n es de 1 a aproximadamente 6;
m es 0 o 1;
j es 0 o 1;
cada grupo sustituido comprende uno o más grupos sustituyentes opcionalmente protegidos seleccionados independientemente entre halógeno, O1, N(J1)(J2), = NJ1, SJ1, N3, CN, OC(=X2)J1, OC(=X2)N(J1)(J2) y C(=X2)NJ1)(J2);
X2 es O, S o NJ3;
cada J1, J2 y J3 es, independientemente, H o alquilo C1-C6;
cuando j es 1, en ese caso Z es distinto de halógeno o N(E2)(E3); y
en donde dicho compuesto oligomérico comprende de 8 a 40 subunidades monoméricas y se puede hibridar con al menos una porción de un ácido nucleico diana.
En ciertos aspectos, M3 es O, CH=CH, OCH2 o OC(H)(Bx2). En ciertos aspectos, M3 es O.
En ciertos aspectos, J4, J5, J6 y J7 son cada uno H. En ciertos aspectos, J4 forma un puente con uno de J5 o J7. En ciertos aspectos, A tiene una de las fórmulas:
o
en donde:
Q1 y Q2 son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6 o alcoxi C1-C6. En ciertos aspectos, Q1 y Q2 son cada uno H. En ciertos aspectos, Q1 y Q2 son cada uno, independientemente, H o halógeno. En ciertos aspectos, Q1 y Q2 son H y el otro de Q1 y Q2 es F, CH3 o OCH3.
En ciertos aspectos, T 1 tiene la fórmula:
en donde:
Ra y Rc son cada uno, independientemente, hidroxilo protegido, tiol protegido, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6, alcoxi C1-C6 sustituido, amino protegido o amino sustituido; y
Rb es O o S. En ciertos aspectos, Rb es O y Ra y Rc son cada uno, independientemente, OCH3, OCH2CH3 o CH (CH3)2.
En ciertos aspectos, G es halógeno, OCH3, OCH2F, OCHF2, OCF3, OCH2CH3, O(CH2)2F, OCH2CHF2, OCH2CF3, OCH2-CH = CH2, O(CH2)2-OCH3, O(CH2)2-SCH3, O(CH2)2-OCF3 , O(CH2)3-N(R10)(R11), O(CH2)2-ON(R10)(R11), O(CH2)2-O(CH2)2-N(R10)(R11), OCH2C(=O)-N(R10)(R11), OCH2C(=O)-N(R12)-(CH2)2-N(R10)(Rh ) u O (CH)2-N(R12)-C(=NR13)[N(R10)(Rn )] en donde R10, R11, R12 y R13 son cada uno, independientemente, H o alquilo C1-C6. En ciertos aspectos, G es halógeno, OCH3, OCF3, OCH2CH3, OCH2CF3, OCH2-CH=CH2, O(CH2)2-CH3, O(CH2)2-O(CH2)2-N(CH3)2, OCH2C(=O)-N(H)CH3, OCH2C(=O)-N(H)-(CH2)2-N(CH3)2 u OCH2-N(H)-C(=NH)NH2. En ciertos aspectos, G es F, OCH3 u O(CH2)2-OCH3. En ciertos aspectos, G es O(CH2)2-OCH3.
En ciertos aspectos, el nucleósido 5'-terminal tiene la Fórmula IIe:
En ciertos aspectos, los compuestos antisentido, incluidos los particularmente adecuados para ARNhs, comprenden uno o más tipos de radicales azúcar modificados/ y/o radicales azúcar de origen natural dispuestos a lo largo de un oligonucleótido o región del mismo en un patrón definido o motivo de modificación de azúcar. Tales motivos pueden incluir cualquiera de las modificaciones de azúcar discutidas en la presente memoria y/u otras modificaciones de azúcar conocidas.
En ciertos aspectos, los oligonucleótidos comprenden o consisten en una región que tiene modificaciones uniformes de azúcar. En algunos de tales aspectos, cada nucleósido de la región comprende la misma modificación de azúcar de tipo ARN. En ciertos aspectos, cada nucleósido de la región es un nucleósido 2'-F. En ciertos aspectos, cada nucleósido de la región es un nucleósido 2'-OMe. En ciertos aspectos, cada nucleósido de la región es un nucleósido 2'-MOE. En ciertos aspectos, cada nucleósido de la región es un nucleósido cEt. En ciertos aspectos, cada nucleósido de la región es un nucleósido ANB. En ciertos aspectos, la región uniforme constituye todo o esencialmente todo el oligonucleótido. En ciertos aspectos, la región constituye el oligonucleótido completo excepto los nucleósidos 1-4 terminales.
En ciertos aspectos, los oligonucleótidos comprenden una o más regiones de modificaciones alternantes de azúcar, en donde los nucleósidos alternan entre nucleótidos que tienen una modificación de azúcar de un primer tipo y nucleótidos que tienen una modificación de azúcar de un segundo tipo. En ciertos aspectos, los nucleósidos de ambos tipos son nucleósidos de tipo ARN. En ciertos aspectos, los nucleósidos alternos se seleccionan entre: 2'-OMe, 2'-F, 2'-MOE, ANB y cEt. En ciertos aspectos, las modificaciones alternantes son 2'-F y 2'-OMe. Tales regiones pueden ser contiguas o pueden estar interrumpidas por nucleósidos modificados de manera diferente o nucleósidos conjugados. En ciertos aspectos, la región alternante de las modificaciones alternantes consisten cada una en un solo nucleósido (es decir, el patrón es (AB)XAy en donde A es un nucleósido que tiene una modificación de azúcar de un primer tipo y B es un nucleósido que tiene una modificación de azúcar de un segundo tipo; x es 1-20 e y es 0 o 1). En ciertos aspectos, una o más regiones alternantes en un motivo alternante incluyen más de un solo nucleósido de un tipo. Por ejemplo, los oligonucleótidos pueden incluir una o más regiones de cualquiera de los siguientes motivos de nucleósidos:
AABBAA;
ABBABB;
AABAAB;
ABBABAABB;
ABABAA;
AABABAB;
ABABAA;
ABBAABBABABAA;
BABBAABBABABAA; o
ABABBAABBABABAA;
en donde A es un nucleósido de un primer tipo y B es un nucleósido de un segundo tipo. En ciertos aspectos, A y B se seleccionan cada uno entre 2'-F, 2'-OMe, BNA y MOE.
En ciertos aspectos, los oligonucleótidos que tienen tal motivo alternante también comprenden un nucleósido terminal 5' modificado, tal como los de fórmula IIc o IIe.
En ciertos aspectos, los oligonucleótidos comprenden una región que tiene un motivo 2-2-3. Tales regiones comprenden el siguiente motivo:
-(A)2-(B)X-(A)2-(C)y-(A)3-en donde: A es un primer tipo de nucleósido modificado;
B y C, son nucleósidos que están modificados de manera diferente que A, sin embargo, B y C pueden tener modificaciones iguales o diferentes entre sí;
x e y son de 1 a 15.
En ciertos aspectos, A es un nucleósido modificado 2'-OMe. En ciertos aspectos, B y C son ambos nucleósidos modificados en 2'-F. En ciertos aspectos, A es un nucleósido modificado en 2'-OMe y B y C son ambos nucleósidos modificados en 2'-F.
En ciertos aspectos, los oligonucleósidos tienen el siguiente motivo de azúcar:
5'-(Q)-(AB)XAy-(D)z
en donde:
Q es un nucleósido que comprende un radical fosfato estabilizado. En ciertos aspectos, Q es un nucleósido que tiene la fórmula IIc o IIe;
A es un primer tipo de nucleósido modificado;
B es un segundo tipo de nucleósido modificado;
D es un nucleósido modificado que comprende una modificación diferente del nucleósido adyacente a él. Por lo tanto, si y es 0, en ese caso D debe modificarse de manera diferente a B y si y es 1, en ese caso D debe modificarse de manera diferente a A. En ciertos aspectos, D difiere tanto de A como de B.
X es 5-15;
Y es 0 o 1;
Z es 0-4.
En ciertos aspectos, los oligonucleósidos tienen el siguiente motivo de azúcar:
5'-(Q) -(A)X-(RE)z
donde:
Q es un nucleósido que comprende un radical fosfato estabilizado. En ciertos aspectos, Q es un nucleósido que tiene la fórmula IIc o IIe;
A es un primer tipo de nucleósido modificado;
D es un nucleósido modificado que comprende una modificación diferente de A.
X es 11-30;
Z es 0-4.
En ciertos aspectos, A, B, C y D en los motivos anteriores se seleccionan entre: 2'-OMe, 2'-F, 2'-MOE, ANB y cEt. En ciertos aspectos, D representa nucleósidos terminales. En ciertos aspectos, tales nucleósidos terminales no están diseñados para hibridar con el ácido nucleico diana (aunque uno o más podrían hibridar al azar). En aspectos, la nucleobase de cada nucleósido D es adenina, independientemente de la identidad de la nucleobase en la posición correspondiente del ácido nucleico diana. En ciertos aspectos, la nucleobase de cada nucleósido D es timina.
En ciertos aspectos, los compuestos antisentido, incluidos los particularmente adecuados para su uso como ARNhs, comprenden conexiones internucleosídicas modificadas dispuestas a lo largo del oligonucleótido o región del mismo en un patrón definido o motivo de conexión internucleosídica modificada. En ciertos aspectos, los oligonucleótidos comprenden una región que tiene un motivo de conexión internucleosídica alternante. En ciertos aspectos, los oligonucleótidos comprenden una región de conexiones internucleosídicas uniformemente modificadas. En algunos de tales aspectos, el oligonucleótido comprende una región que está conectada uniformemente por conexiones
internucleosídicas fosforotioato. En ciertos aspectos, el oligonucleótido está uniformemente conectado por conexiones internucleosídicas fosforotioato. En ciertos aspectos, cada conexión internucleosídica del oligonucleótido se selecciona entre fosfodiéster y fosforotioato. En ciertos aspectos, cada conexión internucleosídica del oligonucleótido se selecciona entre fosfodiéster y fosforotioato y al menos una conexión internucleosídica es fosforotioato.
En ciertos aspectos, el oligonucleótido comprende al menos 6 conexiones internucleosídicas fosforotioato. En ciertos aspectos, el oligonucleótido comprende al menos 8 conexiones internucleosídicas fosforotioato. En ciertos aspectos, el oligonucleótido comprende al menos 10 conexiones internucleosídicas fosforotioato. En ciertos aspectos, el oligonucleótido comprende al menos un bloque de al menos 6 conexiones internucleosídicas fosforotioato consecutivas. En ciertos aspectos, el oligonucleótido comprende al menos un bloque de al menos 8 conexiones internucleosídicas fosforotioato consecutivas. En ciertos aspectos, el oligonucleótido comprende al menos un bloque de al menos 10 conexiones internucleosídicas fosforotioato consecutivas. En ciertos aspectos, el oligonucleótido comprende al menos un bloque de al menos 12 conexiones internucleosídicas fosforotioato consecutivas. En algunos de tales aspectos, al menos uno de tales bloques está ubicado en el extremo 3' del oligonucleótido. En algunos de tales aspectos, al menos uno de tales bloques está ubicado en los 3 nucleósidos del extremo 3' del oligonucleótido.
Los oligonucleótidos que tienen cualquiera de los diversos motivos de azúcar descritos en la presente memoria pueden tener cualquier motivo de conexión. Por ejemplo, los oligonucleótidos, que incluyen pero no se limitan a los descritos anteriormente, pueden tener un motivo de conexión seleccionado entre los no limitantes de la siguiente tabla:
ii. Compuestos de ARNip
En ciertos aspectos, los compuestos antisentido son compuestos de ARNi de doble hebra (ARNip). En tales aspectos, una o ambas hebras pueden comprender cualquier motivo de modificación descrito anteriormente para ARNhs. En ciertos aspectos, los compuestos de ARNhs pueden ser ARN sin modificar. En ciertos aspectos, los compuestos de ARNip pueden comprender nucleósidos de ARN no modificados, pero conexiones internucleosídicas modificadas.
Varios aspectos se refieren a composiciones de doble hebra en donde cada hebra comprende un motivo definido por la ubicación de uno o más nucleósidos modificados o no modificados. En ciertos aspectos, se proporcionan composiciones que comprenden un primer y un segundo compuestos oligoméricos que hibridan total o al menos parcialmente para formar una región dúplex y que adicionalmente comprenden una región que es complementaria e hibrida con un ácido nucleico diana. Es adecuado que tal composición comprenda un primer compuesto oligomérico que es una hebra antisentido que tiene complementariedad total o parcial con una diana de ácido nucleico y un segundo compuesto oligomérico que es una hebra efectora que tiene una o más regiones de complementariedad y que forma al menos una región dúplex con el primer compuesto oligomérico.
Varias composiciones descritas modulan la expresión génica hibridando con un ácido nucleico diana dando como resultado la pérdida de su función normal. En ciertos aspectos, la degradación de la rodopsina P23H diana es facilitada por un complejo RISC activado que se forma con composiciones como se describe en la presente memoria.
Varios aspectos están dirigidos a composiciones de doble hebra en donde una de las hebras es útil, por ejemplo, para influir en la carga preferencial de la hebra opuesta en el complejo RISC (o escisión). Las composiciones son útiles para el direccionamiento a moléculas de ácido nucleico seleccionadas y la modulación de la expresión de uno o más genes. En algunos aspectos, las composiciones descritas en la presente memoria hibridan con una porción de un ARN diana dando como resultado la pérdida de la función normal del ARN diana.
Ciertos aspectos se refieren a composiciones de doble hebra en donde ambas hebras comprenden un motivo hemímero, un motivo totalmente modificado, un motivo posicionalmente modificado o un motivo alternante. Cada hebra de las composiciones descritas en la presente memoria puede modificarse para cumplir un papel particular, por ejemplo, en la ruta del ARNip. El uso de un motivo diferente en cada hebra o el mismo motivo con diferentes modificaciones químicas en cada hebra permite dirigir la hebra antisentido para el complejo RISC mientras se inhibe la incorporación de la hebra efectora. Dentro de este modelo, cada hebra puede modificarse de forma independiente de modo que se mejore para su función particular. La hebra antisentido se puede modificar en el extremo 5' para mejorar su función en una región del RISC, mientras que el extremo 3' se puede modificar de forma diferencial para mejorar su función en una región diferente del RISC.
Las moléculas de oligonucleótidos de doble hebra pueden ser una molécula polinucleotídica de doble hebra que comprende regiones autocomplementarias efectoras y antisentido, en donde la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico
diana o una porción de la misma y la región efectora que tiene una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico diana o una porción de la misma. Las moléculas de oligonucleótidos de doble hebra se pueden ensamblar a partir de dos oligonucleótidos separados, donde una hebra es la hebra efectora y la otra es la hebra antisentido, en donde las hebras efectora y antisentido son autocomplementarias (es decir, cada hebra comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos en la otra hebra; tal como cuando la hebra antisentido y la hebra efectora forman una estructura dúplex o de doble hebra, por ejemplo en donde la región de doble hebra es de aproximadamente 15 a aproximadamente 30, p. ej., aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 pares de bases; la hebra antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico diana o una porción de la misma y la hebra efectora comprende la secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico diana o una porción de la misma (p. ej., de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 o más nucleótidos de la molécula de oligonucleótido de doble hebra son complementarios al ácido nucleico diana o una porción del mismo). Alternativamente, el oligonucleótido de doble hebra se ensambla a partir de un único oligonucleótido, donde las regiones autocomplementarias efectora y antisentido del ARNip están conectadas por medio de conectores basados en ácido nucleico o no basados en ácido nucleico.
El oligonucleótido de doble hebra puede ser un polinucleótido con una estructura secundaria dúplex, dúplex asimétrico, horquilla u horquilla asimétrica, que tiene regiones autocomplementarias efectora y antisentido, en donde la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico diana separada o una porción de la misma y la región efectora que tiene la secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico diana o una porción de la misma. El oligonucleótido de doble hebra puede ser un polinucleótido circular de hebra sencilla que tiene dos o más estructuras de bucle y un tallo que comprende regiones autocomplementarias efectora y antisentido, en donde la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico diana o una porción de la misma y la región efectora que tiene la secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico diana o una porción de la misma, y en donde el polinucleótido circular puede procesarse in vivo o in vitro para generar una molécula de ARNip activa capaz de mediar ARNi.
En ciertos aspectos, el oligonucleótido de doble hebra comprende secuencias o regiones efectoras y antisentido separadas, en donde las regiones efectoras y antisentido están conectadas covalentemente por moléculas conectoras de nucleótidos o no nucleótidos como se conoce en la técnica, o están conectadas alternativamente no covalentemente por interacciones iónicas, enlaces de hidrógeno, interacciones de van der waals, interacciones hidrófobas, y/o interacciones de apilamiento. En ciertos aspectos, el oligonucleótido de doble hebra comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de un gen diana. En otro aspecto, el oligonucleótido de doble hebra interacciona con la secuencia de nucleótidos de un gen diana de una manera que provoca la inhibición de la expresión del gen diana.
Como se emplea en la presente memoria, no es necesario que los oligonucleótidos de doble hebra se limiten a aquellas moléculas que contienen solo ARN, sino que adicionalmente engloban nucleótidos y no nucleótidos químicamente modificados. En ciertos aspectos, las moléculas de ácidos nucleicos de interferencia cortos carecen de nucleótidos que contienen 2'-hidroxi (2'-OH). En ciertos aspectos, los ácidos nucleicos de interferencia cortos no incluyen opcionalmente ningún ribonucleótido (p. ej., nucleótidos que tienen un grupo 2'-OH). Sin embargo, tales oligonucleótidos de doble hebra que no requieren la presencia de ribonucleótidos dentro de la molécula para soportar el ARNi pueden tener un conector o conectores anclados u otros grupos, radicales o cadenas anclados o asociados que contienen uno o más nucleótidos con grupos 2'-OH. Opcionalmente, los oligonucleótidos de doble hebra pueden comprender ribonucleótidos en aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40 o 50% de las posiciones de nucleótidos. Como se emplea en la presente memoria, se pretende que el término ARNip sea equivalente a otros términos utilizados para describir moléculas de ácido nucleico que son capaces de mediar ARNi específicos de secuencias, por ejemplo ARN de interferencia corto (ARNip), ARN de doble hebra (ARNdh), microARN (miARN), ARN en horquilla corta (ARNhc), oligonucleótido de interferencia corto, ácido nucleico de interferencia corto, oligonucleótido modificado de interferencia corto, ARNip químicamente modificado, ARN de silenciamiento de genes postranscripcional (ARNsgpt), y otros. Además, como se emplea en la presente memoria, se pretende que el término ARNi sea equivalente a otros términos utilizados para describir la interferencia de ARN específica de secuencia, tal como silenciamiento de genes postranscripcional, la inhibición de la traducción, o la epigenética. Por ejemplo, pueden utilizarse oligonucleótidos de doble hebra para silenciar genes epigenéticamente tanto a nivel postranscripcional como a nivel pretranscripcional. En un ejemplo no limitante, la regulación epigenética de la expresión génica por moléculas de ARNip como se describe en la presente memoria puede ser el resultado de la modificación mediada por ARNip de la estructura de la cromatina o el patrón de metilación para alterar la expresión génica (véanse, por ejemplo, Verdel et al., 2004, Science, 303, 672 676; Pal-Bhadra et al., 2004, Science, 303, 669-672; Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; y Hall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237).
Se contempla que varios aspectos de compuestos y composiciones divulgados en la presente memoria pueden dirigirse a la rodopsina P23H mediante un mecanismo de silenciamiento génico o mediado por ARNdh o ARNi, que incluyen, p. ej., moléculas efectoras de ARN de doble hebra en horquilla o tallo-bucle en las que una sola hebra de ARN con secuencias auto-complementarias es capaz de asumir una conformación de doble hebra, o moléculas efectoras de ARNdh dúplex que comprenden dos hebras separadas de ARN. En varios aspectos, el ARNdh consiste enteramente en ribonucleótidos o consiste en una mezcla de ribonucleótidos y desoxinucleótidos, tales como los
híbridos de ARN/ADN descritos, por ejemplo, por el documento WO 00/63364, presentado el 19 de abril de 2000 o U.S. Núm. de Serie 60/130,377, presentada el 21 de abril de 1999. El ARNdh o la molécula efectora de ARNdh pueden ser una sola molécula con una región de auto-complementariedad de modo que los nucleótidos en un segmento de la base de la molécula emparejan las bases con nucleótidos en otro segmento de la molécula. En varios aspectos, un ARNdh que consiste en una sola molécula consiste completamente en ribonucleótidos o incluye una región de ribonucleótidos que es complementaria a una región de desoxirribonucleótidos. Alternativamente, el ARNdh puede incluir dos hebras diferentes que tienen una región de complementariedad entre sí.
En varios aspectos, ambas hebras consisten completamente en ribonucleótidos, una hebra consiste completamente en ribonucleótidos y una hebra consiste completamente en desoxirribonucleótidos, o una o ambas hebras contienen una mezcla de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos. En ciertos aspectos, las regiones de complementariedad son al menos 70, 80, 90, 95, 98 o 100% complementarias entre sí y con una secuencia de ácido nucleico diana. En ciertos aspectos, la región del ARNdh que está presente en una conformación de doble hebra incluye al menos 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 50, 75,100, 200, 500, 1000, 2000 o 5000 nucleótidos o incluye todos los nucleótidos en un ADNc u otra secuencia de ácido nucleico diana que está representada en el ARNdc. En algunos aspectos, el ARNdh no contiene ninguna región de hebra sencilla, tal como extremos de hebra sencilla, o el ARNdh es una horquilla. En otros aspectos, el ARNdh tiene una o más regiones de hebra sencilla o salientes. En ciertos aspectos, los híbridos de ARN/ADN incluyen una hebra o región de ADN que es una hebra o región antisentido (p. ej., tiene al menos 70, 80, 90, 95, 98 o 100% de complementariedad con un ácido nucleico diana) y una hebra o región de ARN que es una hebra o región efectora (p. ej., tiene al menos 70, 80, 90, 95, 98 o 100% de identidad con un ácido nucleico diana), y viceversa.
En varios aspectos, el híbrido de ARN/ADN se elabora in vitro utilizando métodos enzimáticos o de síntesis química como los descritos en la presente memoria o los descritos en el documento WO 00/63364, presentado el 19 de abril de 2000 o el documento U.S. con Núm. de Serie 60/130.377, presentado el 21 de abril de 1999. En otros aspectos, una hebra de ADN sintetizada in vitro forma complejo con una hebra de ARN elaborada in vivo o in vitro antes, después o al mismo tiempo que la transformación de la hebra de ADN en la célula. En otros aspectos más, el ARNdh es un único ácido nucleico circular que contiene una región efectora y una antisentido, o el ARNdh incluye un ácido nucleico circular y un segundo ácido nucleico circular o un ácido nucleico lineal (véase, por ejemplo, el documento WO 00/63364, presentado el 19 de abril de 2000 o el documento U.S. con Núm. de Serie 60/130o377, presentado el 21 de abril de 1999.) Los ácidos nucleicos circulares ilustrativos incluyen estructuras de lazo en las que el grupo fosforilo 5' libre de un nucleótido se conecta al grupo hidroxilo 2' de otro nucleótido en forma de bucle inverso.
En otros aspectos, el ARNdh incluye uno o más nucleótidos modificados en los que la posición 2' en el azúcar contiene un halógeno (tal como un grupo flúor) o contiene un grupo alcoxi (tal como un grupo metoxi) que aumenta la semivida del ARNdh in vitro o in vivo comparado con el ARNdh correspondiente en el que la posición 2' correspondiente contiene un hidrógeno o un grupo hidroxilo. En otros aspectos más, el ARNdh incluye una o más conexiones entre nucleótidos adyacentes distintas de una conexión fosfodiéster de origen natural. Los ejemplos de tales conexiones incluyen conexiones fosforamida, fosforotioato y fosforoditioato. Los ARNdh también pueden ser moléculas de ácido nucleico modificadas químicamente como se ilustra en la Patente de Estados Unidos Núm. 6.673.661. En otros aspectos, el ARNdh contiene una o dos hebras protegidas terminalmente, como se describe, por ejemplo, en el documento WO 00/63364, presentado el 19 de abril de 2000 o en el documento U.S. con el Núm. de Serie 60/130.377, presentado el 21 de abril de 1999.
En otros aspectos, el ARNdh puede ser cualquiera de las moléculas de ARNdh al menos parcialmente descritas en el documento WO 00/63364, así como cualquiera de las moléculas de ARNdh descritas en la Solicitud Provisional de Estados Unidos 60/399.998; y la Solicitud Provisional de Estados Unidos 60/419.532 y el documento PCT/US2003/033466. Cualquiera de los ARNdh puede expresarse in vitro o in vivo utilizando los métodos descritos en la presente memoria o métodos convencionales, tales como los descritos en el documento WO 00/63364.
Ocupación
En ciertos aspectos, no se espera que los compuestos antisentido den como resultado la escisión del ácido nucleico diana a través de la ARNasa H o que den como resultado la escisión o secuestro a través de la ruta RISC. En algunos de tales aspectos, la actividad antisentido puede ser resultado de la ocupación, en donde la que la presencia del compuesto antisentido hibridado interrumpe la actividad del ácido nucleico diana. En algunos de tales aspectos, el compuesto antisentido puede modificarse uniformemente o puede comprender una mezcla de modificaciones/ y/o nucleósidos modificados y no modificados.
Ácidos nucleicos diana, regiones diana y secuencias de nucleótidos
Secuencias de nucleótidos que codifican la rodopsina de tipo salvaje, sin limitación, secuencia genómica que tiene la secuencia establecida en el Núm. de Acceso de GENBANK NT_005612.16 truncada a partir de los nucleótidos 35737800 a 35755500 (incorporada a la presente memoria como SEQ ID NO: 1) y secuencia codificante que tiene la secuencia establecida en el Núm. de Acceso de GENBANK NM_000539.3 (incorporada a la presente memoria como SEQ ID NO: 3). Las secuencias de nucleótidos que codifican el ácido nucleico de rodopsina P23H mutante tienen una mutación de C a A en el nucleótido 163 del Núm. de Acceso de GENBANK NM_000539.3 y se incorporan a la presente memoria como SEQ ID NO: 2.
Hibridación
En algunos aspectos, se produce la hibridación entre un compuesto antisentido descrito en la presente memoria y un ácido nucleico de rodopsina P23H. El mecanismo más común de hibridación implica enlaces de hidrógeno (p. ej., enlaces de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen inverso) entre nucleobases complementarias de las moléculas de ácido nucleico.
La hibridación puede ocurrir en diversas condiciones. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y están determinadas por la naturaleza y composición de las moléculas de ácido nucleico que se van a hibridar.
Los métodos para determinar si una secuencia se puede hibridar específicamente con un ácido nucleico diana son bien conocidos en la técnica. En ciertos aspectos, los compuestos antisentido proporcionados en la presente memoria se pueden hibridar específicamente con un ácido nucleico de rodopsina P23H.
Complementariedad
Un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana son complementarios entre sí cuando un número suficiente de nucleobases del compuesto antisentido puede unirse por enlaces de hidrógeno con las correspondientes nucleobases del ácido nucleico diana, de modo que se producirá el efecto deseado (p. ej., inhibición antisentido de un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleico de rodopsina P23H).
Se pueden tolerar nucleobases no complementarias entre un compuesto antisentido y un ácido nucleico de rodopsina P23H siempre que el compuesto antisentido siga siendo capaz de hibridar específicamente con un ácido nucleico diana. Por otra parte, un compuesto antisentido puede hibridar sobre uno o más segmentos de un ácido nucleico de rodopsina P23H de manera que los segmentos intermedios o adyacentes no estén implicados en el evento de hibridación (p. ej., una estructura de bucle, un emparejamiento erróneo o una estructura de horquilla).
En ciertos aspectos, los compuestos antisentido proporcionados en la presente memoria, o una porción específica de los mismos, son, o son al menos, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% complementarios a un ácido nucleico de rodopsina P23H, una región diana, segmento diana o una porción específica del mismo. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con un ácido nucleico diana se puede determinar utilizando métodos de rutina.
Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de 20 nucleobases del compuesto antisentido son complementarias a una región diana y, por lo tanto, se hibridaría específicamente, representaría un 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, las nucleobases no complementarias restantes se pueden agrupar o intercalar con nucleobases complementarias y no es necesario que sean contiguas entre sí o con nucleobases complementarias. Como tal, un compuesto antisentido que tiene 18 nucleobases de longitud que tiene cuatro nucleobases no complementarias que están flanqueadas por dos regiones de completa complementariedad con el ácido nucleico diana tendría 77,8% de complementariedad total con el ácido nucleico diana y, por tanto, estaría dentro del alcance de la presente divulgación. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico diana se puede determinar de forma rutinaria utilizando programas BLAST (herramientas básicas de búsqueda de alineamiento local) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649656). El porcentaje de homología, identidad de secuencia o complementariedad se puede determinar, por ejemplo, mediante el programa Gap (Paquete de Análisis de Secuencias de Wisconsin, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), utilizando la configuración predeterminada, que emplea el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981,2, 482489).
En ciertos aspectos, los compuestos antisentido proporcionados en la presente memoria, o partes específicas de los mismos, son completamente complementarios (es decir, 100% complementarios) a un ácido nucleico diana, o una porción específica del mismo. Por ejemplo, un compuesto antisentido puede ser completamente complementario a un ácido nucleico de rodopsina P23H, o una región diana, o un segmento diana o secuencia diana del mismo. Como se emplea en la presente memoria, "completamente complementario" significa que cada nucleobase de un compuesto antisentido susceptible de emparejamiento de bases de forma precisa con las correspondientes nucleobases de un ácido nucleico diana. Por ejemplo, un compuesto antisentido de 20 nucleobases es completamente complementario a una secuencia diana que tiene 400 nucleobases de longitud, siempre que haya una porción correspondiente de 20 nucleobases del ácido nucleico diana que sea completamente complementaria al compuesto antisentido. También se puede utilizar completamente complementario en referencia a una porción específica del primer y/o segundo ácidos nucleicos. Por ejemplo, una porción de 20 nucleobases de un compuesto antisentido de 30 nucleobases puede ser "completamente complementaria" a una secuencia diana que tiene 400 nucleobases de longitud. La porción de 20 nucleobase del oligonucleótido de 30 nucleobase es completamente complementaria a la secuencia diana si la secuencia diana tiene una porción de 20 nucleobase correspondiente en donde cada nucleobase es complementaria a la porción de 20 nucleobase del compuesto antisentido. Al mismo tiempo, el compuesto antisentido de 30 nucleobases completo puede ser o no completamente complementario a la secuencia diana, dependiendo de si las 10 nucleobases restantes del compuesto antisentido también son complementarias a la secuencia diana.
La ubicación de una nucleobase no complementaria puede estar en el extremo 5' o en el extremo 3' del compuesto antisentido. Alternativamente, la nucleobase o las nucleobases no complementarias pueden estar en una posición
interna del compuesto antisentido. Cuando están presentes dos o más nucleobases no complementarias, pueden ser contiguas (es decir, conectadas) o no contiguas. En un aspecto, una nucleobase no complementaria está ubicada en el segmento de ala de un oligonucleótido antisentido del gápmero.
En ciertos aspectos, los compuestos antisentido que tienen o tienen hasta 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleobases de longitud comprenden no más de 4, no más de 3, no más de 2, o no más de 1 nucleobases no complementarias con respecto a un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleico de rodopsina P23H, o una porción específica del mismo.
En ciertos aspectos, compuestos antisentido que tienen, o tienen hasta 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleobases de longitud comprenden no más de 6, no más de 5, no más de 4, no más de 3, no más de 2 o no más de 1 nucleobases no complementarias con respecto a un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleico de rodopsina P23H, o una porción específica del mismo.
Los compuestos antisentido proporcionados también incluyen aquellos que son complementarios a una porción de un ácido nucleico diana. Como se emplea en la presente memoria, "porción" se refiere a un número definido de nucleobases contiguas (es decir, conectadas) dentro de una región o segmento de un ácido nucleico diana. Una "porción" también puede referirse a un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido. En ciertos aspectos, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 8 nucleobases de un segmento diana. En ciertos aspectos, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 9 nucleobases de un segmento diana. En ciertos aspectos, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 10 nucleobases de un segmento diana. En ciertos aspectos, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 11 nucleobases de un segmento diana. En ciertos aspectos, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 12 nucleobases de un segmento diana. En ciertos aspectos, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 13 nucleobases de un segmento diana. En ciertos aspectos, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 14 nucleobases de un segmento diana. En ciertos aspectos, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 15 nucleobases de un segmento diana. También se contemplan compuestos antisentido que son complementarios a al menos una porción de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más nucleobases de un segmento diana, o un intervalo definido por dos de estos valores.
Identidad
Los compuestos antisentido proporcionados en la presente memoria también pueden tener un porcentaje definido de identidad con una secuencia de nucleótidos particular, SEQ ID NO, o compuesto representado por un número Isis específico, o parte del mismo. Como se emplea en la presente memoria, un compuesto antisentido es idéntico a la secuencia descrita en la presente memoria si tiene la misma capacidad de emparejamiento de nucleobases. Por ejemplo, un ARN que contiene uracilo en lugar de timidina en una secuencia de ADN descrita se consideraría idéntico a la secuencia de ADN ya que tanto el uracilo como la timidina se emparejan con la adenina. También se contemplan versiones acortadas y alargadas de los compuestos antisentido descritos en la presente memoria, así como compuestos que tienen bases no idénticas con respecto a los compuestos antisentido proporcionados en la presente memoria. Las bases no idénticas pueden estar adyacentes entre sí o dispersas por todo el compuesto antisentido. El porcentaje de identidad de un compuesto antisentido se calcula según el número de bases que tienen un emparejamiento de bases idéntico con respecto a la secuencia con la que se está comparando.
En ciertos aspectos, los compuestos antisentido, o porciones de los mismos, son, o son al menos, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96 %, 97%, 98%, 99% o 100% idénticos a uno o más de los compuestos antisentido o SEQ ID NO, o una porción de los mismos, descritos en la presente memoria.
En ciertos aspectos, una porción del compuesto antisentido se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico diana. En ciertos aspectos, una porción de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24 o 25 nucleobases se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico diana.
En ciertos aspectos, una porción del oligonucleótido antisentido se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico diana. En ciertos aspectos, una porción de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleobases se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico diana.
Modificaciones
Un nucleósido es una combinación de bases y azúcar. La porción de nucleobases (también conocidas como bases) del nucleósido es normalmente un radical de base heterocíclica. Los nucleótidos son nucleósidos que incluyen adicionalmente un grupo fosfato conectado covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar pentofuranosilo, el grupo fosfato puede estar conectado al radical hidroxilo 2', 3' o 5' del azúcar. Los oligonucleótidos se forman a través de la conexión covalente de nucleósidos adyacentes entre sí, para formar un oligonucleótido polimérico lineal. Dentro de la estructura de oligonucleótidos, los grupos fosfato se denominan comúnmente como formadores de las conexiones internucleosídicas del oligonucleótido.
Las modificaciones de compuestos antisentido abarcan sustituciones o cambios en conexiones internucleosídicas,
radicales azúcar o nucleobases. Los compuestos antisentido modificados a menudo se prefieren a las formas nativas debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, mayor captación celular, mayor afinidad por el ácido nucleico diana, aumento de la estabilidad en presencia de nucleasas o aumento de la actividad inhibidora.
También pueden emplearse nucleósidos químicamente modificados para aumentar la afinidad de unión de un oligonucleótido antisentido acortado o truncado por su ácido nucleico diana. En consecuencia, a menudo se pueden obtener resultados comparables con compuestos antisentido más cortos que tienen tales nucleósidos químicamente modificados.
Conexiones internucleosídicas modificadas
El enlace internucleósido natural de ARN y ADN es un enlace fosfodiéster de 3' a 5'. Los compuestos antisentido que tienen una o más conexiones internucleosídicas modificadas, es decir, que no ocurren naturalmente, a menudo se seleccionan sobre los compuestos antisentido que tienen conexiones internucleosídicas naturales debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, mejor captación celular, mayor afinidad por los ácidos nucleicos diana y aumento de estabilidad en presencia de nucleasas.
Los oligonucleótidos que tienen conexiones internucleosídicas modificadas incluyen conexiones internucleosídicas que conservan un átomo de fósforo así como conexiones internucleosídicas que no tienen un átomo de fósforo. Las conexiones internucleosídicas que contienen fósforo representativas incluyen, pero no se limitan a, fosfodiésteres, fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidato y fosforotioatos. Los métodos de preparación de las conexiones que contienen fósforo y que no contienen fósforo son bien conocidos.
En ciertos aspectos, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de rodopsina P23H comprenden una o más conexiones internucleosídicas modificadas. En ciertos aspectos, las conexiones internucleosídicas modificadas son conexiones fosforotioato. En ciertos aspectos, cada conexión internucleosídica de un compuesto antisentido es una conexión internucleosídica fosforotioato.
Radicales azúcar modificados
Los compuestos antisentido pueden contener opcionalmente uno o más nucleósidos en donde el grupo azúcar se ha modificado. Tales nucleósidos modificados en el azúcar pueden conferir una mayor estabilidad frente a la nucleasa, aumentar la afinidad de unión o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a los compuestos antisentido. En ciertos aspectos, los nucleósidos comprenden radicales de anillo de ribofuranosa químicamente modificados. Los ejemplos de anillos de ribofuranosa modificados químicamente incluyen, sin limitación, la adición de grupos sustituyentes (incluidos los grupos sustituyentes 5' y 2', la unión por medio de puentes de átomos del anillo no geminal para formar ácidos nucleicos bicíclicos (BNA), la sustitución del átomo de oxígeno del anillo ribosilo por S, N(R) o C(R1)(R2) (R, R1 y R2 son cada uno independientemente H, alquilo C1-C12 o un grupo protector) y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de azúcares modificados químicamente incluyen nucleósido sustituido con 2'-F-5'-metilo (véase la Solicitud Internacional PCT WO 2008/101157 Publicada el 21/8/08 para otros nucleósidos 5' 2'-bis sustituidos descritos) o el reemplazo del átomo de oxígeno del anillo de ribosilo por S con sustitución adicional en la posición 2' (véase la Solicitud de Patente de Estados Unidos US2005-0130923, publicada el 16 de Junio de 2005) o, alternativamente, la sustitución 5' de un BNA (véase la Solicitud Internacional pCt WO 2007/134181 Publicada el 22/11/07 en donde 4'-(CH2)-O-2' (ANB) está sustituido, por ejemplo, con un grupo 5'-metilo o 5'-vinilo).
Los ejemplos de nucleósidos que tienen radicales azúcar modificados incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden grupos sustituyentes 5'-vinilo, 5'-metilo (R o S), 4'-S, 2'-F, 2'-OCH3, 2'-OCH2CH3, 2'-OCH2CH2F y 2'-O(CH2)2OCH3 . El sustituyente en la posición 2' también se puede seleccionar entre alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O alquilo C1-C10, OCF3, OCH2F, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn) y O-CH2-C(=O)-N(R1)-(CH2)2-N(Rm) (Rn), donde cada Rl, Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido.
Como se emplea en la presente memoria, "nucleósidos bicíclicos" se refiere a nucleósidos modificados que comprenden un radical azúcar bicíclico. Los ejemplos de nucleósidos bicíclicos incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden un puente entre los átomos del anillo de ribosilo 4' y 2'. En ciertos aspectos, los compuestos antisentido proporcionados en la presente memoria incluyen uno o más nucleósidos bicíclicos que comprenden un puente 4' a 2'. Los ejemplos de tales nucleósidos bicíclicos con puente 4' a 2', incluyen pero no se limitan a una de las fórmulas: 4'-(CH2)-O-2' (ANB); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (EnA); 4'-CH(CH3)-O-2' (también denominado etilo limitado o cEt) y 4'-CH(CH2OCH3)-O-2'(y análogos del mismo véase la Patente de Estados Unidos 7.399.845, presentada el 15 de julio de 2008); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' (y sus análogos, véase la Solicitud Internacional publicada WO/2009/006478, publicada el 8 de enero de 2009); 4'-CH2-N(OCH3)-2' (y sus análogos, véase la Solicitud Internacional publicada WO/2008/150729, publicada el 11 de diciembre de 2008); 4'-CH2-O-N(CH3)-2' (véase la Solicitud de Patente de Estados Unidos US2004-0171570, publicada el 2 de septiembre de 2004); 4'-CH2-N(R)-O-2', donde R es H, alquilo C1-C12, o un grupo protector (véase la Patente de Estados Unidos 7.427.672, presentada el 23 de septiembre de 2008); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (véase Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); y 4'-CH2-C(=CH2)-2' (y sus análogos, véase la Solicitud Internacional publicada WO 2008/154401, publicada el 8 de septiembre de 2008).
También se pueden encontrar informes adicionales relacionados con los nucleósidos bicíclicos en la bibliografía publicada (véase por ejemplo: Singh et al., Chem. Comun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54,
3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379; Elayadi et al., Curr. Opinion Invest. Drugs, 2001,2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001,8, 1-7; y Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001,3, 239-243; Patentes de Estados Unidos Núm. 6.268.490; 6.525.191; 6.670.461; 6.770.748; 6.794.499; 7.034.133; 7.053.207; 7.399.845; 7.547.684; y 7.696.345; Publicación de Patente de Estados Unidos Núm. US2008-0039618; US2009-0012281; Patentes de Estados Unidos con los Núm. de Serie 60/989.574; 61/026.995; 61/026.998; 61/056.564; 61/086.231; 61/097.787; y 61/099.844; Solicitudes Internacionales PCT publicadas WO 1994/014226; WO 2004/106356; WO 2005/021570; WO 2007/134181; WO 2008/150729; WO 2008/154401; y WO 2009/006478. Cada uno de los nucleósidos bicíclicos anteriores se puede preparar con una o más configuraciones de azúcar estereoquímicas que incluyen, por ejemplo, a-L-ribofuranosa y p-D-ribofuranosa (véase la Solicitud Internacional PCT PCT/DK98/00393, publicada el 25 de marzo de 1999 como w O 99/14226).
En ciertos aspectos, los radicales azúcar bicíclicos de nucleósidos de BNA incluyen, pero no se limitan a, compuestos que tienen al menos un puente entre la posición 4' y 2' del radical azúcar pentofuranosilo en donde tales puentes comprenden independientemente 1 o de 2 a 4 grupos conectados seleccionados independientemente entre -[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=O)-, -C(=NRa)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)2-, -S(=O)x- y -N(Ra)-
en donde:
x es 0, 1 o 2;
n es 1, 2, 3 o 4;
cada Ra y Rb es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, radical heterociclo, radical heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical alicíclico C5-C7, radical alicíclico C5-C7 sustituido, halógeno, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)2-J1) o sulfoxilo (S(=O)-J1); y
cada J 1 y J2 es, independientemente, H, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, aminoalquilo C1-C12, aminoalquilo C1-C12 sustituido o un grupo protector.
En ciertos aspectos, el puente de un radical azúcar bicíclico es -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(RaRb)-N(R)-O- o -C (RaRb)-O-N(R)-. En ciertos aspectos, el puente es 4'-CH2-2', 4'-(CH2^-2', 4'-(Ch2)3-2', 4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R)-2' y 4'-CH2-N(R)-O-2'- en donde cada R es, independientemente, H, un grupo protector o alquilo C1-C12.
En ciertos aspectos, los nucleósidos bicíclicos se definen adicionalmente por la configuración isomérica. Por ejemplo, un nucleósido que comprende un puente 4'-2'metileno-oxi, puede estar en la configuración a-L o en la configuración p-D. Anteriormente, los BNA a-L-metilenoxi (4'-CH2-O-2') se han incorporado a los oligonucleótidos antisentido que mostraban actividad antisentido (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21,6365-6372).
En ciertos aspectos, los nucleósidos bicíclicos incluyen, pero no se limitan a, (A) a-L-metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA, (B) p-D-metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA, (C) etilenoxi (4'-(CH)2-O-2') BNA, (D) aminooxi (4'-CH2-O-N(R)-2') BNA, (E) oxiamino (4'-CH2-N(R)-O-2') BNA y (F) metil(metilenoxi) (4'-CH(CH3)-O-2') BNA, (G) metilen-tio (4'-CH2-S-2') BNA, (H) metilen-amino (4'-CH2-N(R)-2') BNA, (I) metilo carbocíclico (4'-CH2-CH(CH3)-2') BNA, (J) propileno carbocíclico (4'-(CH2)3-2') BNA y (K) vinilo BnA como se muestra a continuación:
en donde Bx es el radical de base y R es independientemente H, un grupo protector, alquilo C1-C12 o alcoxi C1-C12. En ciertos aspectos, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula I:
Bx es un radical de base heterocíclica;
-Qa-Qb-QC- es -CH2-N(Rc)-CH2-, -C(=O)-N(Rc)-CH2-, -CH2-O-N(Rc)-, -CH2-N(Rc)-O- o -N(Rc)-O-CH2;
Rc es alquilo C1-C12 o un grupo protector de amino; y
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un radical de fósforo o un anclaje covalente a un medio de soporte.
En ciertos aspectos, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula II:
en donde:
Bx es un radical de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un radical de fósforo o un anclaje covalente a un medio de soporte;
Za es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6 , alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 sustituido, acilo, acilo sustituido, amida sustituida, tiol o tio sustituido.
En un aspecto, cada uno de los grupos sustituidos está, independientemente, mono o polisustituido con grupos sustituyentes seleccionados independientemente entre halógeno, oxo, hidroxilo, OJc, NJcJd, SJc, N3, OC(=X)Jc, y NJeC(=X)NJcJ(t, en donde cada Jc, Jd y Je es, independientemente, H, alquilo C1-C6 o alquilo C1-C6 sustituido y X es O o NJc .
En ciertos aspectos, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula III:
en donde:
Bx es un radical de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un radical de fósforo o un anclaje covalente a un medio de soporte;
Zb es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 sustituido o acilo sustituido (C(=O)-).
En ciertos aspectos, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula IV:
en donde:
Bx es un radical de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un radical de fósforo o un anclaje covalente a un medio de soporte;
Rd es alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido;
cada qa, qb, qc y qd es, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido, alcoxilo C1-C6, alcoxilo C1-C6 sustituido, acilo, acilo sustituido, aminoalquilo C1-C6 o aminoalquilo C1-C6 sustituido;
En ciertos aspectos, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula V:
en donde:
Bx es un radical de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo fósforo reactivo, un radical de fósforo o un anclaje covalente a un medio de soporte;
qa, qb, qc y qf son cada uno, independientemente, hidrógeno, halógeno, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12, alcoxi C1-C12, alcoxi C1-C12 sustituido, Oj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)-NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk;
o qe y qf juntos son = C(qg)(qh);
qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C12 o alquilo C1-C12 sustituido.
Se han descrito la síntesis y preparación de los monómeros de BNA con metilenoxi (4'-CH2-O-2') adenina, citosina, guanina, 5-metil-citosina, timina y uracilo, junto con su oligomerización y propiedades de reconocimiento de ácidos nucleicos (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). Los BNA y su preparación también se describen en los documentos WO 98/39352 y WO 99/14226.
Los análogos de BNA con metilenoxi (4'-CH2-O-2') y 2'-tio-BNA, también se han preparado (Kumar et al., Bioorg. Medicina. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). También se ha descrito la preparación de análogos de nucleósidos bloqueados que comprenden dúplex de oligodesoxirribonucleótidos como sustratos para polimerasas de ácido nucleico (Wengel et al., documento WO 99/14226). Además, se ha descrito en la técnica la síntesis de 2'-amino-BNA, un nuevo análogo de oligonucleótido de alta afinidad conformacionalmente restringido (Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Además, se han preparado 2'-amino- y 2'-metilamino-BNA y se ha informado previamente
de la estabilidad térmica de sus dúplex con hebras complementarias de ARN y ADN.
En ciertos aspectos, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula VI:
en donde:
Bx es un radical de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo fósforo reactivo, un radical de fósforo o un anclaje covalente a un medio de soporte;
cada qi, qj, qk y q l es, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, alcoxilo C1-C12, alcoxilo C1-C12 sustituido, Oj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk; y
qi y qj o ql y qk juntos son =C(qg)(qh), en donde qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C12 o alquilo C1-C12 sustituido.
Un nucleósido carbocíclico bicíclico que tiene un puente 4'-(CH2)3-2' y el puente análogo de alquenilo 4'-CH=CH-CH2-2' han sido descritos (Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443. y Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71,7731-7740). También se han descrito la síntesis y preparación de nucleósidos carbocíclicos bicíclicos junto con sus estudios de oligomerización y bioquímicos (Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129 (26), 8362-8379).
Como se emplea en la presente memoria, "nucleósido bicíclico 4'-2'" o "nucleósido bicíclico 4' a 2'" se refiere a un nucleósido bicíclico que comprende un anillo de furanosa que comprende un puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de furanosa que conecta el átomo de carbono 2' y el átomo de carbono 4' del anillo de azúcar.
Como se emplea en la presente memoria, "nucleósidos monocíclicos" se refiere a nucleósidos que comprenden radicales azúcar modificados que no son radicales azúcar bicíclicos. En ciertos aspectos, el radical azúcar, o el análogo de radical azúcar, de un nucleósido puede estar modificado o sustituido en cualquier posición.
Como se emplea en la presente memoria, "azúcar modificado en 2'" significa un azúcar furanosilo modificado en la posición 2'. En ciertos aspectos, tales modificaciones incluyen sustituyentes seleccionados entre: un haluro, que incluye, pero no se limita a, alcoxi sustituido y no sustituido, tioalquilo sustituido y no sustituido, aminoalquilo sustituido y no sustituido, alquilo sustituido y no sustituido, alilo sustituido y no sustituido, y alquinilo sustituido y no sustituido. En ciertos aspectos, las modificaciones 2' se seleccionan entre sustituyentes que incluyen, pero no se limitan a: O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nF, O(CH2)nONH2, OCH2C(=O)N(H)CH3 y O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2, donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. También se pueden seleccionar otros grupos sustituyentes en 2' entre: alquilo C1-C12, alquilo sustituido, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, F, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo informador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un compuesto antisentido y otros sustituyentes que tienen propiedades similares . En ciertos aspectos, los nucleósidos modificados comprenden una cadena lateral de 2'-MOE (Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). Se ha descrito que dicha sustitución 2'-MOE tiene una afinidad de unión mejorada en comparación con los nucleósidos no modificados y con otros nucleósidos modificados, tales como 2'-O-metilo, O-propilo y O-aminopropilo. También se ha demostrado que los oligonucleótidos que tienen el sustituyente 2'-MOE son inhibidores antisentido de la expresión génica con características prometedoras para su uso in vivo (Martin, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; y Altmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).
Como se emplea en la presente memoria, un "nucleósido de tetrahidropirano modificado" o "nucleósido de THP modificado" significa un nucleósido que tiene un "azúcar" de tetrahidropirano de seis miembros sustituido por el resto pentofuranosilo en los nucleósidos normales (un sustituto de azúcar). Los nucleósidos de THP modificados incluyen, pero no se limitan a, lo que se denomina en la técnica ácido nucleico de hexitol (HNA), ácido nucleico de anitol (ANA), ácido nucleico de manitol (MNA) (véase Leumann, Bioorg. Medicina. Chem., 2002, 10, 841 -854) o fluoro HNA (F-HNA) que tiene un sistema anular de tetrahidropirano como se ilustra a continuación:
En ciertos aspectos, se seleccionan sustitutos de azúcar que tienen la Fórmula VII:
en donde independientemente para cada uno de dichos al menos un análogo de nucleósido de tetrahidropirano de Fórmula VII:
Bx es un radical de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente, un grupo de conexión internucleosídica que conecta el análogo de nucleósido de tetrahidropirano al compuesto antisentido o uno de Ta y Tb es un grupo de conexión internucleosídica que conecta el análogo de nucleósido de tetrahidropirano al compuesto antisentido y el otro de Ta y Tb es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado conectado o un grupo terminal 5' o 3';
q1, q2, q3 , q4 , q5, q6 y q7 son cada uno independientemente, H, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido; y cada uno de R1 y R2 se selecciona entre hidrógeno, hidroxilo, halógeno, alcoxi sustituido o no sustituido, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJJ2, NJ3C(=X)NJJ2 y CN, en donde X es O, S o NJ1 y cada J1, J2 y J3 es, independientemente, H o alquilo C1-C6.
En ciertos aspectos, se proporcionan los nucleósidos de THP modificados de Fórmula VII en donde q1, q2, q3, q4 , q5, q6 y q7 son cada uno H. En ciertos aspectos, al menos uno de q1, q2, q3 , q4 , q5 , q6 y q7 es diferente de H. En ciertos aspectos, al menos uno de q1, q2, q3, q4 , q5, q6 y q7 es metilo. En ciertos aspectos, se proporcionan nucleósidos de THP de Fórmula VII en donde uno de R1 y R2 es flúor. En ciertos aspectos, R1 es fluoro y R2 es H; R1 es metoxi y R2 es H y R1 es metoxietoxi y R2 es H.
En ciertos aspectos, los sustitutos de azúcar comprenden anillos que tienen más de 5 átomos y más de un heteroátomo. Por ejemplo, se ha informado de nucleósidos que comprenden radicales azúcar morfolino y su uso en compuestos oligoméricos (véanse por ejemplo: Braasch et al., Biochemistry, 2002, 41,4503-4510; y las Patentes de Estados Unidos 5.698.685; 5.166.315; 5.185.444; y 5.034.506). Como se emplea en la presente memoria, el término "morfolino" significa un sustituto de azúcar que tiene la siguiente fórmula:
En ciertos aspectos, los morfolinos pueden modificarse, por ejemplo, añadiendo o alterando varios grupos sustituyentes de la estructura de morfolino anterior. Tales sustitutos de azúcar se denominan en la presente memoria "morfolinos modificados".
También se proporcionan combinaciones de modificaciones sin limitación, tales como nucleósidos sustituidos con 2'-F-5'-metilo (véase la Solicitud Internacional PCT WO 2008/101157 publicada el 21/8/08 para otros nucleósidos 5',2'-bis sustituidos descritos) y el reemplazo del átomo de oxígeno del anillo de ribosilo por S y la sustitución adicional en la posición 2' (véase la Solicitud de Patente de Estados Unidos publicada US2005-0130923, publicada el 16 de junio de 2005) o alternativamente la sustitución 5' de un ácido nucleico bicíclico (véase la Solicitud Internacional PCT WO 2007/134181, publicada el 22/11 /07 en donde un nucleósido bicíclico 4'-CH2-O-2' está adicionalmente sustituido en la posición 5' con un grupo 5'-metilo o 5'-vinilo). También se han descrito la síntesis y preparación de nucleósidos bicíclicos carbocíclicos junto con sus estudios de oligomerización y bioquímicos (véase, p. ej., Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129(26), 8362-8379).
En ciertos aspectos, los compuestos antisentido comprenden uno o más nucleósidos de ciclohexenilo modificados, que son nucleósidos que tienen un ciclohexenilo de seis miembros en lugar del resto pentofuranosilo en nucleósidos de origen natural. Los nucleósidos de ciclohexenilo modificados incluyen, pero no se limitan a, los descritos en la
técnica (véanse, por ejemplo, los de titularidad compartida, Solicitud PCT publicada WO 2010/036696, publicada el 10 de abril de 2010, Robeyns et al., J. Am. Chem. Soc., 2008, 130(6), 1979-1984; Horváth et al., Tetrahedron Letters, 2007, 48, 3621-3623; Nauwelaerts et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129 (30), 9340-9348; Gu et al., Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, 2005, 24(5-7), 993-998; Nauwelaerts et al., Nucleic Acids Research, 2005, 33(8), 2452 2463; Robeyns et al., Acta Crystallographica, Sección F: Structural Biology and Crystallization Communications, 2005, F61(6), 585-586; Gu et al., Tetrahedron, 2004, 60(9), 2111-2123; Gu et al., Oligonucleotides, 2003, 13(6), 479-489; Wang et al., J. Org. Chem., 2003, 68, 4499-4505; Verbeure et al., Nucleic Acids Research, 2001,29(24), 4941-4947; Wang et al., J. Org. Chem., 2001,66, 8478-82.; Wang et al., Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, 2001,20(4-7), 785-788; Wang et al., J. Am. Chem., 2000, 122, 8595-8602; Solicitud PCT publicada, WO 06/047842; y Solicitud PCT publicada WO 01/049687. Ciertos nucleósidos de ciclohexenilo modificados tienen la fórmula X.
en donde independientemente para cada uno de dichos al menos un análogo de nucleósido de ciclohexenilo de Fórmula X:
Bx es un radical de base heterocíclico;
T3 y T4 son cada uno, independientemente, un grupo de conexión internucleosídica que une el análogo de nucleósido de ciclohexenilo a un compuesto antisentido o uno de T3 y T4 es un grupo de conexión internucleosidica que conecta el análogo de nucleósido de tetrahidropirano a un compuesto antisentido y el otro de T3 y T4 es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado conectado o un grupo terminal 5' o 3'; y
q1, q2, q3, q4 , q5, q6, q7, qs y q9 son cada uno, independientemente, H, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6, alquinilo C2-C6 sustituido u otro grupo sustituyente de azúcar.
Como se emplea en la presente memoria, "modificado en 2'" o "sustituido en 2'" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un sustituyente en la posición 2' distinto de H u OH. Los nucleósidos modificados en 2' incluyen, pero no se limitan a, nucleósidos bicíclicos en los que el puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar conecta el carbono 2' y otro carbono del anillo de azúcar; y nucleósidos con sustituyentes en 2' que no forman puentes, tales como alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-alquilo C1-C10, -OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2'-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), u O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), donde cada Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido. Los nucleósidos modificados en 2' pueden comprender adicionalmente otras modificaciones, por ejemplo en otras posiciones del azúcar y/o en la nucleobase.
Como se emplea en la presente memoria, "2'-F" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo fluoro en la posición 2' del anillo de azúcar.
Como se emplea en la presente memoria, "2'-OMe" o "2'-OCH3" o "2'-O-metilo" hacen referencia cada uno a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo -OCH3 grupo en la posición 2' del anillo de azúcar.
Como se emplea en la presente memoria, "oligonucleótido" se refiere a un compuesto que comprende una pluralidad de nucleósidos conectados. En ciertos aspectos, se modifica uno o más de la pluralidad de nucleósidos. En ciertos aspectos, un oligonucleótido comprende uno o más ribonucleósidos (ARN)/ y/o desoxirribonucleósidos (ADN).
También se conocen en la técnica muchos otros sistemas de anillos de biciclos y triciclos sustitutos de azúcares que se pueden utilizar para modificar nucleósidos para incorporarlos compuestos antisentido (véase, por ejemplo, el artículo de revisión: Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854.). Tales sistemas de anillos pueden sufrir varias sustituciones adicionales para mejorar la actividad.
Los métodos para la preparación de azúcares modificados son bien conocidos por los expertos en la técnica. Algunas Patentes de Estados Unidos representativas que ilustran la preparación de tales azúcares modificados incluyen, sin limitación, U.S.: 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.670.633; 5.700.920; 5.792.847 y 6.600.032 y la Solicitud Internacional PCT/US2005/019219, presentada el 2 de junio de 2005 y publicada como WO 2005/121371 el 22 de diciembre de 2005.
En los nucleótidos que tienen radicales azúcar modificados, los radicales de nucleobase (naturales, modificados o una combinación de los mismos) se mantienen para la hibridación con un ácido nucleico diana apropiado.
En ciertos aspectos, los compuestos antisentido comprenden uno o más nucleósidos que tienen radicales azúcar
modificados. En ciertos aspectos, el radical azúcar modificado es 2'-MOE. En ciertos aspectos, los nucleósidos modificados con 2'-MOE están dispuestos en un motivo gápmero. En ciertos aspectos, el radical azúcar modificado es un nucleósido bicíclico que tiene un grupo (4'-CH(CH3)-O-2') formador de puente. En ciertos aspectos, los nucleósidos (4'-CH(CH3)-O-2') modificados están dispuestos a lo largo de las alas de un motivo gápmero.
Nucleobases modificadas
Las modificaciones o sustituciones de nucleobases (o bases) son estructuralmente distinguibles de, aunque funcionalmente intercambiables con, nucleobases no modificadas sintéticas o de origen natural. Tanto las nucleobases naturales como las modificadas son capaces de participar en el enlace de hidrógeno. Tales modificaciones de nucleobases pueden impartir estabilidad de nucleasa, afinidad de unión o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a compuestos antisentido. Las nucleobases modificadas incluyen nucleobases sintéticas y naturales tales como, por ejemplo, 5-metilcitosina (5-me-C). Ciertas sustituciones de nucleobases, incluidas las sustituciones de 5-metilcitosina, son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de un compuesto antisentido por un ácido nucleico diana. Por ejemplo, se ha demostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina aumentan la estabilidad del dúplex de ácidos nucleicos en 0,6-1,2°C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. y Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pág. 276-278).
Las nucleobases modificadas adicionales incluyen 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil (-CEC-CH3) uracilo y citosina y otros derivados de alquinilo de bases pirimidínicas, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-desazaguanina y 7-desazaadenina y 3-desazaguanina y 3-desazaadenina.
Los radicales de bases heterocíclicas también pueden incluir aquellos en los que la base de purina o pirimidina se reemplaza por otros heterociclos, por ejemplo, 7-desaza-adenina, 7-desazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Las nucleobases que son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de compuestos antisentido incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y O-6 sustituidas, incluyendo 2- aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina.
En ciertos aspectos, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de rodopsina P23H comprenden una o más nucleobases modificadas. En ciertos aspectos, los oligonucleótidos antisentido acortados o ensanchados por separación dirigidos a un ácido nucleico de rodopsina P23H comprenden una o más bases nucleicas modificadas. En ciertos aspectos, la nucleobase modificada es 5-metilcitosina. En ciertos aspectos, cada citosina es una 5-metilcitosina.
Compuestos antisentido conjugados
Los compuestos antisentido se pueden conectar covalentemente a uno o más radicales o productos conjugados que mejoran la actividad, distribución celular o captación celular de los oligonucleótidos antisentido resultantes. Los grupos conjugados típicos incluyen radicales de colesterol y radicales de lípidos. Los grupos conjugados adicionales incluyen carbohidratos, fosfolípidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y colorantes.
Los compuestos antisentido también se pueden modificar para que tengan uno o más grupos estabilizadores que generalmente están unidos a uno o ambos extremos de los compuestos antisentido para mejorar propiedades tales como, por ejemplo, la estabilidad de la nucleasa. Incluidas en los grupos estabilizadores están las estructuras de protección terminal. Estas modificaciones terminales protegen el compuesto antisentido que tiene un ácido nucleico terminal de la degradación por exonucleasa y pueden ayudar en el suministro y/o localización dentro de una célula. La protección terminal puede estar presente en el extremo 5' (protección terminal 5') o en el extremo 3’ (protección terminal 3'), o puede estar presente en ambos extremos. Las estructuras de protección terminal son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, protecciones terminales abásicas desoxi invertidas. Otros grupos estabilizadores 3’ y 5' que se pueden usar para proteger uno o ambos extremos de un compuesto antisentido para impartir estabilidad nucleasa incluyen los descritos en el documento WO 03/004602 publicado el 16 de enero de 2003.
En ciertos aspectos, los compuestos antisentido, incluidos, pero sin limitarse a, los particularmente adecuados para su uso como ARNhs, se modifican mediante la unión de uno o más grupos conjugados. En general, los grupos conjugados modifican una o más propiedades del oligonucleótido anclado, que incluyen pero no se limitan a farmacodinamia, farmacocinética, estabilidad, unión, absorción, distribución celular, captación, carga y aclaramiento celular. Los grupos conjugados se usan de forma rutinaria en la técnica química y se unen directamente o mediante un radical conector conjugado opcional o un grupo conector conjugado a un compuesto original tal como un oligonucleótido. Los grupos conjugados incluyen, sin limitación, intercaladores, moléculas indicadoras, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles, tioéteres, poliéteres, colesteroles, tiocolesteroles, radicales de ácido cólico, folato, lípidos, fosfolípidos, biotina, fenazina, fenantridina, antraquinona, adamantano, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y colorantes. Ciertos grupos conjugados se han descrito previamente, por ejemplo: radical de colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 1989, 86, 6553-6556), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg.
Medicina. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), un tioéter, p. ej., hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), una cadena alifática, por ejemplo, restos de do-decano-diol o undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991,10, 1111-1118; Kabanov et al., f Eb S Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-racglicero-3-H-fosfonato de trietilamonio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), o ácido adamantano acético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651 -3654), un radical palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), o un radical de octadecilamina o hexilaminocarboniloxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937).
Para productos conjugados adicionales, incluidos los útiles para ARNhs y su ubicación dentro de compuestos antisentido, véase, por ejemplo, la Solicitud de Estados Unidos Núm.; 61/583.963.
Pruebas in vitro de oligonucleótidos antisentido
En la presente memoria se describen métodos para el tratamiento de células con oligonucleótidos antisentido, que pueden modificarse apropiadamente para el tratamiento con otros compuestos antisentido.
Las células pueden tratarse con oligonucleótidos antisentido cuando las células alcanzan aproximadamente 60-80% de confluencia en cultivo.
Un reactivo comúnmente utilizado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye el reactivo de transfección de lípidos catiónicos LIPOFECTIN (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se pueden mezclar oligonucleótidos antisentido con LIPOFECTIN en OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración final deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTIN que puede oscilar entre 2 y 12 ug/ml por oligonucleótido antisentido 100 nM.
Otro reactivo utilizado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye LIPOFECTAMINE (Invitrogen, Carlsbad, CA). El oligonucleótido antisentido se mezcla con LIPOFECTAMINE en medio de suero reducido OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTAMINE que puede variar de 2 a 12 ug/mL por oligonucleótido antisentido 100 nM.
Otra técnica utilizada para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye la electroporación.
Otra técnica más utilizada para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye la captación libre de los oligonucleótidos por las células.
Las células se tratan con oligonucleótidos antisentido mediante métodos de rutina. Las células se pueden recolectar 16-24 horas después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido, momento en el que se miden los niveles de ARN o proteína de ácidos nucleicos diana mediante métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente memoria. En general, cuando los tratamientos se realizan en múltiples repeticiones, los datos se presentan como el promedio de los tratamientos replicados.
La concentración de oligonucleótido antisentido usada varía de una línea celular a otra. Los métodos para determinar la concentración óptima de oligonucleótidos antisentido para una línea celular particular son bien conocidos en la técnica. Los oligonucleótidos antisentido se usan típicamente a concentraciones que varían de 1 nM a 300 nM cuando se transfectan con LIPOFECTAMINE. Los oligonucleótidos antisentido se usan a concentraciones más altas que varían de 625 a 20.000 nM cuando se transfectan usando electroporación.
Aislamiento de ARN
El análisis de ARN se puede realizar en ARN celular total o ARNm poli (A)+. Los métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El ARN se prepara usando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, usando el reactivo TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con los protocolos recomendados por el fabricante.
Composiciones y métodos para formular composiciones farmacéuticas
Los compuestos antisentido se pueden mezclar con sustancias activas o inertes farmacéuticamente aceptables para la preparación de composiciones o formulaciones farmacéuticas. Las composiciones y los métodos para la formulación de composiciones farmacéuticas dependen de varios criterios, que incluyen, pero no se limitan a, la vía de administración, el grado de la enfermedad o la dosis que se debe administrar.
Un compuesto antisentido dirigido al ácido nucleico de rodopsina P23H se puede utilizar en composiciones farmacéuticas combinando el compuesto antisentido con un diluyente o portador adecuados farmacéuticamente aceptables. En ciertos aspectos, un diluyente farmacéuticamente aceptable es agua, tal como agua esterilizada adecuada para inyectables. Por consiguiente, en un aspecto, se emplea en los métodos descritos en la presente memoria una composición farmacéutica que comprende un compuesto antisentido dirigido al ácido nucleico de rodopsina P23H y un diluyente farmacéuticamente aceptable. En ciertos aspectos, el diluyente farmacéuticamente
aceptable es agua. En ciertos aspectos, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido proporcionado en la presente memoria.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos antisentido abarcan cualquier sal, éster o sales farmacéuticamente aceptables de dichos ésteres, o cualquier otro oligonucleótido que, tras la administración a un animal, incluido un ser humano, sea capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito o residuo biológicamente activos del mismo. Por consiguiente, por ejemplo, la divulgación también se refiere a sales farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, profármacos, sales farmacéuticamente aceptables de tales profármacos y otros bioequivalentes. Las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen, pero no se limitan a, sales de sodio y potasio.
Un profármaco puede incluir la incorporación de nucleósidos adicionales en uno o ambos extremos de un compuesto antisentido que son escindidos por nucleasas endógenas dentro del organismo, para formar el compuesto antisentido activo.
En ciertos aspectos, los compuestos o composiciones comprenden adicionalmente un portador o diluyente farmacéuticamente aceptables.
Ejemplos
Los ejemplos siguientes describen el procedimiento de selección para identificar los compuestos principales dirigidos a la rodopsina mutante P23H. De más de 400 oligonucleótidos antisentido que se escrutaron, ISIS 564426, ISIS 664844, ISIS 664867 e ISIS 664884 emergieron como los principales compuestos principales. En particular, ISIS 664844 exhibió la mejor combinación de propiedades en términos de potencia, tolerabilidad y selectividad para la rodopsina P23H entre más de 400 oligonucleótidos antisentido.
Divulgación no limitante
Si bien ciertos compuestos, composiciones y métodos descritos en la presente memoria se han descrito con especificidad de acuerdo con ciertos aspectos, los siguientes ejemplos sirven solo para ilustrar los compuestos descritos en la presente memoria y no pretenden limitar los mismos.
Aunque la lista de secuencias que acompaña a esta presentación identifica cada secuencia como "ARN" o "ADN" según se requiera, en realidad, esas secuencias pueden modificarse con cualquier combinación de modificaciones químicas. Un experto en la técnica apreciará fácilmente que tal designación como "ARN" o "ADN" para describir oligonucleótidos modificados es, en ciertos casos, arbitraria. Por ejemplo, un oligonucleótido que comprende un nucleósido que comprende un radical azúcar con 2'-OH y una base de timina podría describirse como un ADN que tiene un azúcar modificado (2'-OH para el 2'-H natural del ADN) o como un ARN que tiene una base modificada (timina (uracilo metilado) para el uracilo natural de ARN).
En consecuencia, se pretende que las secuencias de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria, incluidas, entre otras, las de la lista de secuencias, abarquen ácidos nucleicos que contienen cualquier combinación de ARN y/o ADN natural o modificado, incluidos, pero sin limitarse a, tales ácidos nucleicos que tienen nucleobases modificadas. A modo de ejemplo adicional y sin limitación, un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleobases "ATCGATCG" abarca cualquier oligonucleótido que tenga dicha secuencia de nucleobases, ya sea modificada o sin modificar, incluidos, pero sin limitarse a, compuestos que comprenden bases de ARN, tales como los que tienen secuencia " AUCGAUCG "y los que tienen algunas bases de ADN y algunas bases de ARN tales como "AUCGATCG".
Ejemplo 1: Diseño y escrutinio in vitro de rodopsina humana
Se diseñaron oligonucleótidos antisentido dirigidos al ácido nucleico de rodopsina mutante P23H o de tipo salvaje humana y se probaron sus efectos sobre el ARNm de rodopsina in vitro. En los ensayos se utilizaron líneas celulares que expresaban la secuencia genómica de rodopsina completa o transfectadas con un minigen. Las líneas celulares se describen con más detalle en los experimentos de los Ejemplos siguientes. Se probaron in vitro doscientos doce gápmeros con MOE, con varios motivos (5-10-5, 6-8-6, 7-6-7, 4-10-4, 5-8-5, 6-6-6, 3-10-3, 4-8-4 y 5-6-5) para determinar la potencia. Se probaron in vitro doscientos dos gápmeros con cEt, así como también gápmeros con modificaciones cEt y MOE. De todos estos gápmeros probados, 104 gápmeros se probaron en ensayos de respuesta a la dosis in vitro.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de nuevo diseño de la Tabla siguiente se diseñaron como gápmeros decEt 3-10-3 3-10-3. Los gápmeros tienen una longitud de 16 nucleósidos, en donde el segmento de separación central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5’ y la dirección 3' que comprende tres nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento de ala 5’ y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tiene una modificación cEt. Las conexiones internucleosídicas a lo largo de cada gápmero son conexiones fosforotioato (P=S). Todos los restos de citosina en cada gápmero son 5-metilcitosinas. El "sitio de inicio" indica el nucleósido más 5’ al que se dirige el gápmero en la secuencia génica humana. El "sitio de parada" indica el nucleósido más 3' al que se dirige el gápmero en la secuencia génica humana. "Emparejamiento erróneo" indica el número de emparejamientos erróneos que puede tener la secuencia de oligonucleótidos con la secuencia genómica. No se
consideraron los emparejamientos erróneos de más de 1. Los gápmeros se dirigen a la secuencia genómica de rodopsina humana, designada en la presente memoria como SEQ ID NO: 1 (Núm. de Acceso de GENBANK NT_005612.16 truncada en los nucleótidos 35737800 a 35755500 o a la secuencia mutante de rodopsina P23H que tiene una sustitución de citosina por adenina en la posición 163 del Núm. de Acceso de GENBANK NM_000539.3; designada en la presente memoria como SEQ ID NO: 2 que representa la secuencia mutante), o ambas secuencias. "n/a" indica que el oligonucleótido particular tenía más de un emparejamiento erróneo con la secuencia del gen diana. Los gápmeros se presentan en la tabla siguiente.
Tabla 1
Los gápmeros se probaron a varias dosis en células HEK-293. Para estos ensayos se utilizaron células HEK-293 que expresaban la secuencia de rodopsina P23H genómica humana como un transfectante estable. Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados de
cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran a continuación. Las células se sembraron en placa a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con oligonucleótido antisentido, como se especifica en las Tablas siguientes. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de rodopsina mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizó el conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3374 (secuencia directa GGAGGTCAACAACGAGTCTTTTG, designada en la presente memoria como SEQ ID NO: 5; secuencia inversa GGCCTCCTTGACGGTGAA, designada en la presente memoria como SEQ ID NO: 6; secuencia de la sonda TTATCATCTTTTTCTGCTATGGGCAGCTCG, designada en la presente memoria como SEQ ID NO: 7) para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de rodopsina se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total, medido mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de rodopsina, con relación a las células de control no tratadas.
Tabla 2
Tabla 3
Ejemplo 2: Diseño de oligonucleótidos antisentido con química desoxi, 2'-alfa-fluoro y cEt
Se diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales con la misma secuencia que ISIS 564387 pero con química diferente. Los nuevos oligonucleótidos antisentido se diseñaron como oligonucleótidos desoxi, 2'-alfa-fluoro y cEt.
La columna 'Química' de la siguiente Tabla presenta modificaciones químicas en el oligonucleótido, incluida la posición de las modificaciones del azúcar, donde 'e' indica una modificación MOE, 'k' indica una modificación cEt, d indica un azúcar desoxirribosa y 'f 'indica una modificación 2'-alfa-fluoro; 'mC' indica 5-metitosina; 'A', 'C', 'T', 'G' y 'U' representan las notaciones de nucleótidos convencionales. Todos los oligonucleótidos tienen 15 o 16 nucleósidos de longitud. Las conexiones internucleosídicas a lo largo de cada gápmero son conexiones fosforotioato (P=S). El "sitio de inicio" indica el nucleósido más 5’ al que se dirige el gápmero en la secuencia génica humana. El "sitio de parada" indica el nucleósido más 3' al que se dirige el gápmero en la secuencia génica humana. Los oligonucleótidos antisentido se diseñaron para dirigirse a la secuencia mutante (SEQ ID NO: 2). Los oligonucleótidos se presentan en la Tabla siguiente. Todos los oligonucleótidos se dirigen a los nucleótidos 151-166 de SEQ ID NO: 2.
Tabla 4
Ejemplo 3: Inhibición antisentido de rodopsina humana P23H mutante
Se diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales dirigidos a la región de secuencia alrededor del sitio de mutación P23H del gen de la rodopsina y se probaron sus efectos sobre el ARNm de la rodopsina mutante in vitro. Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran a continuación. En este ensayo se usó HEK293 cultivado transfectado con un minigén SOD1 que contenía rodopsina P23H mutante.
El minigén de SOD1 contiene la secuencia que no ha experimentado corte y empalme del exón 4, intrón 4 y exón 5 de SOD1, con una secuencia de rodopsina humana con la mutación en P23H. Cada secuencia se clonó en pcDNA4/TO en el sitio HindIII/EcoRI.
Se transfectaron células HEK-293 con el minigen SOD1 que contenía rodopsina P23H mutante usando electroporación con oligonucleótido antisentido 5 pM o 20 pM. ISIS 564425, descrito en el estudio anterior, también se incluyó en el ensayo. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de rodopsina mediante PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sondas de cebadores humanos RTS4220 (secuencia directa CACTATAGGGAGACCCAAGC, designada en la presente memoria
como SEQ ID NO: 8; secuencia inversa CTGCTTTTTCATGGACCACCA, designada en la presente memoria como SEQ ID NO: 9; secuencia de la sonda CAAAGATGGTGTGGCCG, designada en la presente memoria como SEQ ID NO: 10), que está dirigido al sitio P23H, se utilizó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de rodopsina se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total, medido mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de rodopsina, con relación a las células de control no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de nuevo diseño de la Tabla siguiente se diseñaron como gápmeros cEt 3-10-3, gápmeros cEt 3-9-3, oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt, o oligonucleótidos desoxi, 2'-alfa-fluoro y cEt. La columna 'Química' de la siguiente tabla presenta modificaciones químicas en el oligonucleótido, incluida la posición de las modificaciones del azúcar, donde 'e' indica una modificación MOE, 'k' indica una modificación cEt, d indica un azúcar desoxirribosa y 'f 'indica una modificación 2'-alfa-fluoro; 'mC' indica 5-metitosina; 'A', 'C', 'T', 'G' y 'U' representan las notaciones de nucleótidos convencionales. Todos los oligonucleótidos tienen 15 o 16 nucleósidos de longitud. Las conexiones internucleosídicas a lo largo de cada gápmero son conexiones fosforotioato (P=S). El "sitio de inicio" indica el nucleósido más 5’ al que se dirige el gápmero en la secuencia génica humana. El "sitio de parada" indica el nucleósido más 3' al que se dirige el gápmero en la secuencia génica humana. Los oligonucleótidos antisentido se diseñaron para dirigirse a la secuencia mutante de P23H (SEQ ID NO: 2). Los oligonucleótidos se presentan en la Tabla siguiente.
Tabla 5
Ejemplo 4: Potencia y selectividad de oligonucleótidos antisentido dirigidos al gen de rodopsina P23H mutante Los oligonucleótidos antisentido del Ejemplo 3 que exhiben potentes inhibición in vitro del ARNm de rodopsina P23H mutante se seleccionaron y probaron a diversas dosis en células HEK-293 transfectadas con la construcción de minigen de rodopsina/SOD1 P23H mutante (E5-M) o de tipo salvaje (E5-C)/.
Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran a continuación. Las células se transfectaron usando electroporación con concentraciones 1,25 pM, 2,50 pM, 5,00 pM, 10,00 pM y 20 pM de oligonucleótido antisentido, como se especifica en las Tablas siguientes. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de rodopsina mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizó el conjunto de sondas de cebadores humanos RTS4220 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de rodopsina se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total, medido
mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de rodopsina, con relación a las células de control no tratadas.
También se presenta la concentración inhibidora semimáxima (CI50) de cada oligonucleótido. Varios oligonucleótidos antisentido inhibieron selectivamente la expresión de la secuencia de rodopsina P23H mutante en comparación con la secuencia WT.
Tabla 6
Tabla 7
Tabla 8
Tabla 9
Ejemplo 5: Caracterización de la potencia y selectividad de compuestos antisentido humanos dirigidos a la rodopsina mutante P23H
Se diseñaron varios oligonucleótidos antisentido adicionales para dirigirse al gen de rodopsina P23H mutante y se transfectaron a células HEK293 con el minigen de rodopsina P23H mutante (E5-M) o de rodopsina de tipo salvaje (E5-C)/. La secuencia del minigén de SOD1 contiene la secuencia que no ha experimentado corte y empalme del exón 4, intrón 4 y exón 5 de SOD1, con la rodopsina humana de tipo salvaje o una secuencia de rodopsina con la mutación en P23H. Cada secuencia se clonó en pcDNA4/TO en el sitio Hind 11 I/EcoRI.
Estudio 1
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de nuevo diseño en la Tabla siguiente se diseñaron como oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt con oligonucleótidos antisentido con separación una separación desoxi de 7 u 8 bases que tienen una separación desoxi de 7 u 8 bases son potentes y selectivos para dirigirse a la mutación SNP del gen de la huntingtina (HTT). Ostergaard ME et al., Nucleic Acids Res. 2013 Noviembre; 41(21):9634-50; Publicación PCT WO 2013/022990. Se esperaba que los oligonucleótidos antisentido que tenían una separación desoxi de 7 u 8 bases también se dirigieran potente y selectivamente a la rodopsina P23H.
La columna 'Química' de la siguiente tabla presenta modificaciones químicas en el oligonucleótido, incluida la posición de las modificaciones de azúcar, en donde 'e' indica una modificación MOE, 'k' indica una modificación cEt y el número indica el número de azúcares desoxirribosa. Todos los oligonucleótidos tienen 16 nucleósidos de longitud. Las conexiones internucleosídicas a lo largo de cada gápmero son conexiones fosforotioato (P=S). Todas las citosinas son 5-metilcitosinas. El "sitio de inicio" indica el nucleósido más 5’ al que se dirige el gápmero en la secuencia génica humana. El "sitio de parada" indica el nucleósido más 3' al que se dirige el gápmero en la secuencia génica humana. Los oligonucleótidos antisentido se diseñaron para dirigirse a la secuencia de la rodopsina mutante humana P23H (SEQ ID NO: 2). Los oligonucleótidos se presentan en la Tabla siguiente.
Tabla 10
Oligonucleótidos antisentido dirigidos a la rodopsina P23H mutante (SEQ ID NO: 2)
Núm. Sitio de inicio SEQ ID Sitio de Parada SEQ ID Secuencia Química SEC ID
ISIS NO: 2 NO: 2 NO
589187 158 173 GTACTCGAAGTGGCTG eek 589203 158 173 GTACTCGAAGTGGCTG e 589188 159 174 GGTACTCGAAGTGGCT eek 589204 159 174 GGTACTCGAAGTGGCT e 589189 160 175 GGGTACTCGAAGTGGC eek 589205 160 175 GGGTACTCGAAGTGGC e 589190 161 176 TGGGTACTCGAAGTGG eek 589206 161 176 TGGGTACTCGAAGTGG e 589191 162 177 GTGGGTACTCGAAGTG eek 589207 162 177 GTGGGTACTCGAAGTG e
589192 163 178 TGTGGGTACTCGAAGT eek
589208 
163 
178 
TGTGGGTACTCGAAGT e 
Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran a continuación. ISIS 564387 e ISIS 598206, descritos en los estudios anteriores, también se incluyeron en estos ensayos. Se transfectaron células cultivadas a una densidad de 20,000 células por pocillo usando electroporación con oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de rodopsina mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizó el conjunto de sondas de cebadores humanos RTS4220 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de rodopsina se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total, medido mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de rodopsina, con relación a las células de control no tratadas. Un valor de cero solo indica que el oligonucleótido antisentido no inhibió la expresión de ARNm.
La concentración inhibidora semimáxima (CI50) de cada oligonucleótido también se presenta. Algunos oligonucleótidos antisentido redujeron selectivamente los niveles de ARNm de rodopsina P23H mutante en comparación con la expresión de rodopsina WT.
Tabla 11
Tabla 12
Tabla 13
Tabla 14
La tabla de resumen se muestra a continuación e indica que sólo algunos, mucho menos de lo esperado, oligonucleótidos antisentido que tienen una separación desoxi de 7 u 8 bases reducen potente y selectivamente los niveles de ARNm de rodopsina P23H mutante en comparación con los niveles de WT. Los datos muestran que el
motivo de desoxi gap de 7 u 8 bases puede no ser siempre eficaz para apuntar potente y selectivamente a una mutación de un gen a otro.
Tabla 15
Estudio 2
Se probaron adicionalmente los oligonucleótidos antisentido descritos en los estudios anteriores. Los oligonucleótidos
antisentido se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Se usó como control ISIS 549144 (Gg CCAATACGCCGTCA; designado en la presente memoria como SEQ ID NO: 89), un gápmero cEt 3 10-3 que no se dirige a ningún gen conocido. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran a continuación. Se transfectaron células HEK293 cultivadas a una densidad de 30,000 células por pocillo usando electroporación con oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de rodopsina mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Para medir los niveles de ARNm se utilizó el conjunto de sondas de cebadores humanos RTS4220, que están dirigidas al minigen SOD1. Los niveles de ARNm de rodopsina se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total, medido mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de rodopsina, con relación a las células de control no tratadas. Un valor de cero solo indica que el oligonucleótido antisentido no inhibió la expresión de ARNm.
También se presenta la concentración inhibidora semimáxima (CI50) de cada oligonucleótido. Varios oligonucleótidos antisentido redujeron los niveles de ARNm de rodopsina mutante de forma potente y selectiva.
Tabla 16
Tabla 17
Tabla 18
Tabla 19
Reducción del porcentaje de ARNm de rodopsina P23H en células HEK293 mutantes (E5-M)
N
pM)
La tabla de resumen se muestra a continuación e indica que algunos oligonucleótidos antisentido, incluido ISIS 664844, redujeron potente y selectivamente los niveles de ARNm de rodopsina mutante en comparación con los niveles de rodopsina WT.
Tabla 20
Estudio 3
Se probaron adicionalmente oligonucleótidos antisentido de los estudios descritos anteriormente. Se diseñaron dos nuevos oligonucleótidos y se presentan en la Tabla siguiente.
ISIS 586139 es un gápmero cEt 3-10-3, en donde el segmento de separación central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5’ y la dirección 3' que comprenden tres nucleósidos cada uno. ISIS 643801 es un gápmero cEt 2-10-2, en donde el segmento de separación central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5’ y la dirección 3' que comprenden dos nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento de ala 5’ y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tiene una modificación cEt. Las conexiones internucleosídicas a lo largo de cada gápmero son conexiones fosforotioato (P=S). Todos los restos de citosina en cada gápmero son 5-metilcitosinas. Las conexiones internucleosídicas a lo largo de cada gápmero son conexiones fosforotioato (P=S). El "sitio de inicio" indica el nucleósido más 5’ al que se dirige el gápmero en la secuencia génica humana. El "sitio de parada" indica el nucleósido más 3’ al que se dirige el gápmero en la secuencia génica humana. Los oligonucleótidos antisentido se diseñaron para dirigirse a la secuencia mutante (SEQ ID NO: 2). Los oligonucleótidos se presentan en la Tabla siguiente.
Tabla 21
Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Se utilizó ISIS 549144 como control. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran a continuación. Se transfectaron células HEK293 cultivadas que tenían el minigén SOD-1 a una densidad de 30,000 células por pocillo usando electroporación con oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de rodopsina mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Para medir los niveles de ARNm se utilizó el conjunto de sondas de cebadores humanos RTS4220, que están dirigidas al minigen SOD1. Los niveles de ARNm de rodopsina se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total, medido mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de rodopsina, con relación a las células de control no tratadas. Un valor de cero solo indica que el oligonucleótido antisentido no inhibió la expresión de ARNm.
También se presenta la concentración inhibidora semimáxima (CI50) de cada oligonucleótido. Varios oligonucleótidos antisentido redujeron los niveles de ARNm de rodopsina mutante de forma potente y selectiva.
Tabla 22
Tabla 23
Los resultados de los estudios en células mutantes y WT se resumen en la Tabla siguiente. Los valores de CI50 muestran la potencia de ciertos oligonucleótidos. Los datos muestran que algunos oligonucleótidos, incluido ISIS 664844, demuestran potencia y selectividad por el gen de rodopsina P23H mutante humano. También se muestra la secuencia del oligonucleótido con la mutación en negrita y subrayada.
Tabla 24
Ejemplo 6: Eficacia de oligonucleótidos antisentido dirigidos a rodopsina humana en ratones transgénicos Se diseñaron y probaron oligonucleótidos antisentido adicionales en dos modelos de ratones transgénicos (Tg). A la
línea germinal de estos ratones se le insertó un alelo mutante P23H de un paciente con retinitis pigmentaria (Olsson, J.E. et al., Neuron. 1992. 9: 815-830). Se probaron un total de 144 oligonucleótidos antisentido. No todos los oligonucleótidos antisentido probados demostraron potencia para inhibir la expresión de la rodopsina mutante.
Estudio 1
Se trataron ratones P23HTg con oligonucleótidos ISIS descritos en los estudios anteriores. También se incluyeron en el estudio dos gápmeros cEt 3-10-3 de nuevo diseño dirigidos a la rodopsina separados del sitio P23H, ISIS 564426 e ISIS 564432.
Tabla 25
Se dividieron aleatoriamente ratones Tg P23H en grupos de tratamiento de 3-5 ratones cada uno. Los gápmeros se inyectaron a una dosis de 50 pg mediante inyección intravítrea en el ojo derecho de cada uno de los ratones. Al ojo izquierdo de los animales se le inyectó PBS y sirvió como control. Los ratones se sacrificaron después de 7 días. La expresión de rodopsina P23H humana a partir de tejido ocular se midió con el conjunto de sondas de cebadores específicos para seres humanos RTS3363. Los resultados se normalizan a la expresión del homeobox de conos y bastones de ratón. El porcentaje de inhibición es relativo a la expresión observada en ratones tratados con PBS. Los datos se presentan en la Tabla siguiente y demuestran que algunos oligonucleótidos antisentido redujeron la expresión de rodopsina P23H humana mutante in vivo.
Tabla 26
Estudio 2
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de nuevo diseño en las tablas siguientes se diseñaron como gápmeros cEt 3-10-3, gápmeros cEt 5-7-4, gápmeros MOE 5-10-5, gápmeros MOE 6-8-6, gápmeros MOE 7-6-7 , gápmeros MOE 4-10-4, gápmeros MOE 5-8-5, gápmeros MOE 4-8-4 o gápmeros MOE 5-6-5
Los gápmeros cEt 3-10-3 tienen una longitud de 16 nucleósidos, en donde el segmento de separación central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5’ y la dirección 3' que comprenden tres nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento de ala 5’ y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tienen una modificación cEt. Los gápmeros cEt 5-7-4 tienen 16 nucleósidos de longitud, en donde el segmento de separación central comprende siete 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5’ y la dirección 3' que comprenden cinco y cuatro nucleósidos respectivamente. Cada nucleósido en el segmento de ala 5’ y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tienen una modificación cEt. Los gápmeros MOE 5-10-5 tienen 20 nucleósidos de longitud, en donde el segmento de separación central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está
flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5’ y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento del ala 5’ y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tienen una modificación MOE. Los gápmeros MOE 6-8-6 tienen 20 nucleósidos de longitud, en donde el segmento de separación central comprende ocho 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5’ y la dirección 3' que comprenden seis nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento del ala 5’ y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tienen una modificación MOE. Los gápmeros MOE 7-6-7 tienen 20 nucleósidos de longitud, en donde el segmento de separación central comprende seis 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5’ y la dirección 3' que comprenden siete nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento del ala 5’ y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tienen una modificación MOE. Los gápmeros MOE 4-10-4 tienen 18 nucleósidos de longitud, en donde el segmento de separación central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5’ y la dirección 3' que comprenden cuatro nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento del ala 5’ y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tienen una modificación MOE. Los gápmeros MOE 5-8-5 tienen 18 nucleósidos de longitud, en donde el segmento de separación central comprende ocho 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5’ y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento del ala 5’ y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tienen una modificación MOE. Los gápmeros MOE 4-8-4 tienen 16 nucleósidos de longitud, en donde el segmento de separación central comprende ocho 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5’ y la dirección 3' que comprenden cuatro nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento del ala 5’ y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tienen una modificación MOE. Los gápmeros de MOE 5-6-5 tienen 16 nucleósidos de longitud, en donde el segmento de separación central comprende seis 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5’ y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento del ala 5’ y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tienen una modificación MOE.
Las conexiones internucleosídicas a lo largo de cada gápmero son conexiones fosforotioato (P=S). Todos los restos de citosina en cada gápmero son 5-metilcitosinas. El "sitio de inicio" indica el nucleósido más 5’ al que se dirige el gápmero en la secuencia génica humana. El "sitio de parada" indica el nucleósido más 3' al que se dirige el gápmero en la secuencia génica humana. Los oligonucleótidos antisentido se diseñaron para dirigirse a la secuencia mutante (SEQ ID NO: 2).
Se dividieron aleatoriamente ratones Tg P23H en grupos de tratamiento de 3-5 ratones cada uno. Los gápmeros se inyectaron a una dosis de 50 gg mediante inyección intravítrea en el ojo derecho de cada uno de los ratones. Al ojo izquierdo de los animales se le inyectó PBS y sirvió como control. Los ratones se sacrificaron después de 7 días. La expresión de rodopsina humana se midió con el conjunto de sondas de cebadores específicos para seres humanos RTS3363. Los resultados se normalizan a la expresión del homeobox de conos y bastones de ratón. El porcentaje de inhibición es relativo a la expresión observada en ratones tratados con PBS. Una inhibición de valor '0' solo indica que el oligonucleótido no inhibió la expresión en este caso particular. Los datos se presentan en la tabla siguiente.
Tabla 27
Inhibición de la expresión de rodopsina en ratones Tg P23H
Núm. de i de pa Motivo Secuencia % SEC ID
ISIS ID N ID N
ibici NO
614089 157 176 MOE 6
8-6 TGGGTACTCGAAGTGGCTGC 0 42
614105 151 170 MOE 7
6-7 CTCGAAGTGGCTGCGTACCA 0 46
614111 157 176 MOE 7
6-7 TGGGTACTCGAAGTGGCTGC 
0 42
614166 150 167 MOE 4
10-4 GAAGTGGCTGCGTACCAC 0 47
614167 151 168 MOE 4
10-4 CGAAGTGGCTGCGTACCA 34 48
614187 151 168 MOE 5
8-5 CGAAGTGGCTGCGTACCA 0 48
614188 152 169 MOE 5
8-5 TCGAAGTGGCTGCGTACC 1 49
614194 158 175 MOE 5
8-5 GGGTACTCGAAGTGGCTG 0 50
614195 159 176 MOE 5
8-5 TGGGTACTCGAAGTGGCT 11 51
614250 158 173 MOE 4
8-4 GTACTCGAAGTGGCTG 5 20
614251 159 174 MOE 4
8-4 GGTACTCGAAGTGGCT 0 21
614263 153 168 MOE 5
6-5 CGAAGTGGCTGCGTAC 0 14
614268 MOE 5 
158 
173 
6-5 
GTACTCGAAGTGGCTG 
16 
20
Estudio 3
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de nuevo diseño en las Tablas siguientes se diseñaron como gápmeros cEt 3-10-3, gápmeros MOE 6-8-6, gápmeros MOE 4-10-4, gápmeros MOE 5-8-5, gápmeros MOE 6-6-6, gápmeros MOE 3-10-3 o gápmeros MOE 4-8-4.
Los gápmeros cEt 3-10-3 tienen una longitud de 16 nucleósidos, en donde el segmento de separación central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5’ y la dirección 3' que comprenden tres nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento de ala 5’ y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tienen una modificación cEt. Los gápmeros MOE 6-8-6 tienen 20 nucleósidos de longitud, en donde el segmento de separación central comprende ocho 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5’ y la dirección 3' que comprenden seis nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento del ala 5’ y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tienen una modificación MOE. Los gápmeros MOE 4-10-4 tienen 18 nucleósidos de longitud, en donde el segmento de separación central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5’ y la dirección 3' que comprenden cuatro nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento del ala 5’ y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tienen una modificación MOE. Los gápmeros MOE 5-8-5 tienen 18 nucleósidos de longitud, en donde el segmento de separación central comprende ocho 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5’ y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento del ala 5’ y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tienen una modificación MOE. Los gápmeros MOE 6-6-6 tienen 18 nucleósidos de longitud, en donde el segmento de separación central comprende seis 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5’ y la dirección 3' que comprenden seis nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento del ala 5’ y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tienen una modificación MOE. Los gápmeros MOE 3-10-3 tienen una longitud de 16 nucleósidos, en donde el segmento de separación central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5’ y la dirección 3' que comprenden tres nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento del ala 5’ y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tienen una modificación MOE. Los gápmeros MOE 4-8-4 tienen 16 nucleósidos de longitud, en donde el segmento de separación central comprende ocho 2'
desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5’ y la dirección 3' que comprenden cuatro nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento del ala 5’ y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tienen una modificación MOE. Las conexiones internucleosídicas a lo largo de cada gápmero son conexiones fosforotioato (P=S). Todos los restos de citosina en cada gápmero son 5-metilcitosinas.
El "sitio de inicio" indica el nucleósido más 5’ al que se dirige el gápmero en la secuencia génica humana. El "sitio de parada" indica el nucleósido más 3’ al que se dirige el gápmero en la secuencia génica humana. Los oligonucleótidos antisentido se diseñaron para dirigirse a la secuencia mutante (SEQ ID NO: 2).
Se dividieron aleatoriamente ratones Tg P23H en grupos de tratamiento de 3-5 ratones cada uno. Los gápmeros se inyectaron a una dosis de 50 gg mediante inyección intravítrea en el ojo derecho de cada uno de los ratones. Al ojo izquierdo de los animales se le inyectó PBS y sirvió como control. Los ratones se sacrificaron después de 7 días. La expresión de rodopsina humana se midió con el conjunto de sondas de cebadores específicos para seres humanos RTS3363. Los resultados se normalizan a la expresión del homeobox de conos y bastones de ratón. El porcentaje de inhibición es relativo a la expresión observada en ratones tratados con PBS. Una inhibición de valor '0' solo indica que el oligonucleótido no inhibió la expresión en este caso particular. Los datos se presentan en la tabla siguiente.
Tabla 28
Estudio 4
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de nuevo diseño en las Tablas siguientes se diseñaron como gápmeros cEt 3-10-3 u oligonucleótidos desoxi, 2'-fluoro y cEt. Los gápmeros cEt 3-10-3 tienen una longitud de 16 nucleósidos, en donde el segmento de separación central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5’ y la dirección 3' que comprenden tres nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento de ala 5’ y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tienen una modificación cEt. Los oligonucleótidos desoxi, 2'-fluoro y cEt tienen una longitud de 16 nucleósidos. La columna 'Química' de la siguiente tabla presenta la posición de las modificaciones de azúcar, en donde 'e' indica una modificación MOE, 'k' indica una modificación cEt, d indica un azúcar desoxirribosa y 'f' indica una modificación 2’-alfa-fluoro; 'mC' indica 5-metitosina; 'A', 'C', 'T', 'G' y 'U' representan las notaciones de nucleótidos convencionales. Las conexiones internucleosídicas a lo largo de cada gápmero son conexiones fosforotioato (P=S).
El "sitio de inicio" indica el nucleósido más 5’ al que se dirige el gápmero en la secuencia génica humana. El "sitio de parada" indica el nucleósido más 3’ al que se dirige el gápmero en la secuencia génica humana. Los gápmeros se dirigen a la secuencia genómica de la rodopsina humana, designada en la presente memoria como SEQ ID NO: 1 (Núm. de Acceso de GENBANK NT_005612.16 truncada en los nucleótidos 35737800 a 35755500) o la secuencia mutante (SEQ ID NO: 2), o ambas. "n/a" indica que el oligonucleótido antisentido no se dirige a esa secuencia genética particular con 100% de complementariedad.
Se dividieron aleatoriamente ratones Tg P23H en grupos de tratamiento de 3-5 ratones cada uno. También se incluyó en este ensayo ISIS 564340 de los estudios descritos anteriormente. Se inyectaron gápmeros cEt 3-10-3 a una dosis de 50 gg mediante inyección intravítrea en el ojo derecho de cada uno de los ratones. El ojo izquierdo de los animales se inyectó con PBS y sirvió como control. Los ratones se sacrificaron después de 7 días. La expresión de rodopsina humana a partir del tejido ocular se midió con el conjunto de sondas de cebadores específicos para seres humanos RTS3363. Los resultados se normalizan a la expresión del homeobox de conos y bastones de ratón. El porcentaje de inhibición es relativo a la expresión observada en ratones tratados con PBS.
Tabla 29
Estudio 5
Se diseñaron oligonucleótidos adicionales con la misma secuencia que los oligonucleótidos antisentido descritos anteriormente pero con diferentes químicas. Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de nuevo diseño en las Tablas siguientes se diseñaron como gápmeros cEt 3-10-3 u oligonucleótidos desoxi, 2'-fluoro y cEt. Los gápmeros cEt 3-10-3 tienen una longitud de 16 nucleósidos, en donde el segmento de separación central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5’ y la dirección 3' que comprenden tres nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento de ala 5’ y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tienen una modificación cEt. Los oligonucleótidos desoxi, 2'-fluoro y cEt tienen una longitud de 16 nucleósidos. La columna 'Química' de la siguiente tabla presenta la posición de las modificaciones de azúcar, en donde 'e' indica una modificación MOE, 'k' indica una modificación cEt, d indica un azúcar desoxirribosa y 'f' indica una modificación 2’-alfafluoro; 'mC' indica 5-metitosina; 'A', 'C', 'T', 'G' y 'U' representan las notaciones de nucleótidos convencionales. Las conexiones internucleosídicas a lo largo de cada gápmero son conexiones fosforotioato (P=S).
"Oligo parental" indica el oligonucleótido ISIS con la misma secuencia que el oligonucleótido de nuevo diseño. El "sitio de inicio" indica el nucleósido más 5’ al que se dirige el gápmero en la secuencia génica humana. El "sitio de parada" indica el nucleósido más 3’ al que se dirige el gápmero en la secuencia génica humana. Los gápmeros se dirigen a la secuencia de P23H mutante humana (SEQ ID NO: 2). "n/a" indica que el oligonucleótido antisentido no se dirige a esa secuencia genética particular con un 100% de complementariedad.
Tabla 30
Se dividieron aleatoriamente ratones Tg P23H en grupos de tratamiento de 3-5 ratones cada uno. También se incluyeron en este ensayo ISIS 564431 e ISIS 598206, descritos en los estudios anteriores. Los oligonucleótidos antisentido se inyectaron a una dosis de 50 gg mediante inyección intravítrea en el ojo derecho de cada uno de los ratones. Al ojo izquierdo de los animales se le inyectó PBS y sirvió como control. Los ratones se sacrificaron después de 7 días. La expresión de la rodopsina humana a partir del tejido ocular se midió con el conjunto de sondas de cebadores específicos para seres humanos RTS3363. Los resultados se normalizan a la expresión del homeobox de conos y bastones de ratón. El porcentaje de inhibición es relativo a la expresión observada en ratones tratados con PBS. Una inhibición de valor '0' solo indica que el oligonucleótido no inhibió la expresión en este caso particular. Los datos se presentan en la Tabla siguiente y demuestran que algunos oligonucleótidos antisentido redujeron la expresión de rodopsina humana mutante in vivo.
Tabla 31
Ejemplo 7: Potencia y selectividad de compuestos antisentido humanos dirigidos a rodopsina P23H mutante humana
Se diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales dirigidos al sitio P23H de la rodopsina P23H mutante humana. Estos oligonucleótidos, así como los oligonucleótidos antisentido descritos en los estudios anteriores, se probaron
adicionalmente. Los oligonucleótidos se transfectaron en células HEK293 que expresaban el minigén de rodopsina/SODI mutante P23H (E5-M) o el minigén de rodopsina/SOD1 de tipo salvaje (E5-C).
Los nuevos oligonucleótidos antisentido se diseñaron como gápmeros cEt 3-10-3. Los gápmeros tienen una longitud de 16 nucleósidos, en donde el segmento de separación central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5’ y la dirección 3' que comprenden tres nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento de ala 5’ y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tiene una modificación cEt. Las conexiones internucleosídicas a lo largo de cada gápmero son conexiones fosforotioato (P=S).
El "sitio de inicio" indica el nucleósido más 5’ al que se dirige el gápmero en la secuencia génica humana. El "sitio de parada" indica el nucleósido más 3’ al que se dirige el gápmero en la secuencia génica humana. Los gápmeros se dirigen a la secuencia de P23H mutante humana (SEQ ID NO: 2. 'El emparejamiento erróneo indica el número de emparejamientos erróneos que tiene el oligonucleótido con la secuencia de rodopsina además de la mutación P23H.
Tabla 32
Gápmeros cEt 3-10-3 dirigidos a SEQ ID NO: 2
Sitio de inicio
Núm. en SEQ ID NO: Sitio de parada Emparejamientos erróneos SEC ISIS
2 en SEQ ID NO: 2 con SEQ ID NO: 2 ID NO
Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran a continuación. Se transfectaron células cultivadas a una densidad de 30.000 células por pocillo usando electroporación con oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de rodopsina mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizó el conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3374 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de rodopsina se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total, medido mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de rodopsina, con relación a las células de control no tratadas. Un valor de cero solo indica que el oligonucleótido antisentido no inhibió la expresión de ARNm.
También se presenta la concentración inhibidora semimáxima (CI50) de cada oligonucleótido. Varios oligonucleótidos antisentido redujeron diferencialmente los niveles de ARNm de rodopsina mutante en comparación con la expresión de rodopsina WT.
Tabla 33
Tabla 34
Tabla 35
Tabla 36
A continuación se muestra la tabla compendio e indica que sólo unos pocos oligonucleótidos antisentido redujeron selectivamente los niveles de ARNm de rodopsina mutante en comparación con los niveles de rodopsina WT. Una
selectividad de '1' indica que el oligonucleótido antisentido no redujo selectivamente la secuencia mutante en comparación con el control. Un valor de selectividad negativo indica que el oligonucleótido antisentido se dirigió a la secuencia de tipo salvaje de forma más potente que a la secuencia mutante.
Tabla 37
Ejemplo 8: WEficacia y selectividad de oligonucleótidos antisentido dirigidos a rodopsina humana en ratones transgénicos
Los oligonucleótidos antisentido seleccionados de los estudios descritos anteriormente se probaron adicionalmente en modelos de ratones transgénicos. A la línea germinal de estos ratones se le insertó un alelo de rodopsina de tipo salvaje o un alelo de rodopsina mutante P23H de un paciente con retinitis pigmentaria.
Estudio 1
Se dividieron aleatoriamente ratones Tg P23H en grupos de tratamiento de 4 ratones cada uno. Se inyectaron oligonucleótidos ISIS mediante inyección intravítrea en el ojo derecho de cada uno de los ratones. Al ojo izquierdo de los animales se le inyectó PBS y sirvió como control. Los ratones se sacrificaron después de 7 días. La expresión de rodopsina humana a partir del tejido ocular se midió con el conjunto de sondas de cebadores específicos para seres humanos RTS3363. Los resultados se normalizan a la expresión del homeobox de conos y bastones de ratón. El porcentaje de inhibición es relativo a la expresión observada en el tejido ocular tratado con PBS. Una inhibición de valor '0' solo indica que el oligonucleótido no inhibió la expresión en este caso particular. Los datos se presentan en la Tabla siguiente y demuestran que los oligonucleótidos antisentido inhiben la expresión del gen de rodopsina P23H mutante de una manera dependiente de la dosis.
Tabla 38
Estudio 2
Se dividieron aleatoriamente ratones Tg con rodopsina WT humana en grupos de tratamiento de 3-6 ratones cada uno. Se inyectaron oligonucleótidos ISIS, seleccionados de los estudios descritos anteriormente, mediante inyección intravítrea en el ojo derecho de cada uno de los ratones. Al ojo izquierdo de los animales se le inyectó PBS y sirvió como control. Los ratones se sacrificaron después de 7 días. La expresión de rodopsina humana a partir del tejido ocular se midió con el conjunto de sondas de cebadores específicos para seres humanos RTS3363. Los resultados se normalizan a la expresión del homeobox de conos y bastones de ratón. El porcentaje de inhibición es relativo a la expresión observada en el tejido ocular tratado con PBS. Una inhibición de valor '0' solo indica que el oligonucleótido no inhibió la expresión en este caso particular. Los resultados se presentan en la Tabla siguiente y demuestran que varios oligonucleótidos antisentido no inhiben eficazmente la expresión del gen de la rodopsina de tipo salvaje.
Tabla 39
Ejemplo 9: confirmación de la eficacia y selectividad de oligonucleótidos antisentido dirigidos a la rodopsina humana en ratones transgénicos
Los oligonucleótidos antisentido seleccionados que demostraron potencia y selectividad en los estudios descritos anteriormente se probaron adicionalmente en los modelos de ratón transgénico con rodopsina P23H humana o de tipo salvaje. Los datos demuestran la selectividad de los compuestos cabeza de serie para el gen de la rodopsina mutante.
Estudio 1
Se dividieron aleatoriamente ratones Tg P23H en grupos de tratamiento de 4 ratones cada uno. Se inyectaron oligonucleótidos ISIS, seleccionados de los estudios descritos anteriormente, mediante inyección intravítrea en el ojo derecho de cada uno de los ratones. Al ojo izquierdo de los animales se le inyectó PBS y sirvió como control. Los ratones se sacrificaron después de 7 días. La expresión de rodopsina humana a partir del tejido ocular se midió con el conjunto de sondas de cebadores específicos para seres humanos RTS3363. Los resultados se normalizan a la expresión del homeobox de conos y bastones de ratón. El porcentaje de inhibición es relativo a la expresión vista en el ojo tratado con PBS. Los datos presentados en la Tabla siguiente son el promedio de dos experimentos separados y demuestran que los oligonucleótidos antisentido inhiben la expresión del gen de rodopsina mutante de una manera dependiente de la dosis.
Tabla 40
Estudio 2
Se dividieron aleatoriamente ratones Tg con rodopsina WT humana en grupos de tratamiento de 4 ratones cada uno. Se inyectaron oligonucleótidos ISIS, seleccionados de los estudios descritos anteriormente, mediante inyección intravítrea en el ojo derecho de cada uno de los ratones. Al ojo izquierdo de los animales se le inyectó PBS y sirvió como control. Los ratones se sacrificaron después de 7 días. La expresión de rodopsina humana a partir del tejido ocular se midió con el conjunto de sondas de cebadores específicos para seres humanos RTS3363. Los resultados se normalizan a la expresión del homeobox de conos y bastones de ratón. El porcentaje de inhibición es relativo a la expresión vista en el ojo tratado con PBS. Los datos presentados en la Tabla siguiente son el promedio de dos experimentos separados y demuestran que los oligonucleótidos antisentido no se dirigen al gen de la rodopsina WT.
Tabla 41
Ejemplo 10: Estudio de tolerabilidad de oligonucleótidos antisentido dirigidos a la rodopsina P23H muíante humana en monos cinomolgos
Se trataron monos cinomolgos con oligonucleótidos antisentido ISIS seleccionados de los estudios descritos en los Ejemplos anteriores. El objetivo de este estudio fue determinar la tolerabilidad de los oligonucleótidos antisentido cuando se administran como una única inyección intravítrea a monos cinomolgos. Se incluyó en el estudio un ASO sustituto de cinomolgos, ISIS 602881.
En el momento en que se llevó a cabo este estudio, la secuencia genómica del mono cinomolgo no estaba disponible en la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI); por lo tanto, no se pudo confirmar la reactividad cruzada con la secuencia del gen del mono cinomolgo. En cambio, las secuencias de los oligonucleótidos antisentido de ISIS usados en los monos cinomolgos se compararon con una secuencia de mono rhesus para la determinar la homología. Se espera que los oligonucleótidos de ISIS con homología con la secuencia del mono rhesus también presenten una reacción cruzada completa con la secuencia del mono cinomolgo. Los oligonucleótidos antisentido humanos probados presentan reactividad cruzada con la secuencia genómica de rhesus (el complemento del Núm. de acceso de GENBANK NW_001096632.1 truncado en los nucleótidos 1522000 a 1532000, designado en la presente memoria como SEQ ID NO: 4). Cuanto mayor sea la complementariedad entre el oligonucleótido humano y la secuencia del mono rhesus, más probable es que el oligonucleótido humano pueda reaccionar de forma cruzada
con la secuencia del mono cinomolgo. "Sitio de inicio" indica el nucleótido más en 5’ al que se dirige el gápmero en la secuencia del gen del mono rhesus. "Emparejamientos erróneos" indica el número de nucleobases emparejadas erróneamente entre la secuencia de oligonucleótidos humanos y la secuencia genómica del mono rhesus.
Tabla 42
Tratamiento
Antes del estudio, los monos se mantuvieron en cuarentena durante la cual se observó a los animales diariamente para verificar su salud general. Los monos tenían entre 2 y 4 años y pesaban entre 2 y 6 kg. Los monos fueron aleatorizados y asignados a grupos, como se muestra en la Tabla siguiente. A los monos se les inyectaron en el ojo izquierdo (OS) PBS o varias dosis de ASO y en el ojo derecho (OD) varias dosis de ASO. 'OS' significa 'oculus sinister' (ojo izquierdo) y 'OD' significa 'oculus dexter' (ojo derecho).
Tabla 43
Las dosis se administraron el día 1. Se retiró la comida antes de la sedación. Los animales se sedaron con ketamina y dexdomitor para el procedimiento de dosificación. Los ojos se limpiaron con Betadine® y se enjuagaron con solución salina estéril. Antes de la administración de la dosis, se instiló un midriático (tropicamida al 1%) en cada ojo, seguido
de un anestésico tópico. Se administró una inyección intravítrea de ASO o PBS en cada ojo. Se insertó un espéculo de párpado para mantener los párpados abiertos durante el procedimiento y se retrajo el globo. La aguja se insertó a través de la esclerótica y la pars plana aproximadamente 4 mm por detrás del limbo. La aguja se dirigió por detrás del cristalino hacia el vítreo medio. El material de prueba se inyectó lentamente en el vítreo medio. Se utilizaron fórceps para sujetar la conjuntiva que rodea la jeringa antes de retirar la aguja. Después de la dosificación, todos los ojos se examinaron con un oftalmoscopio indirecto para identificar cualquier problema visible posterior a la dosificación y confirmar el depósito del material de prueba. La sedación se revirtió con Antisedan. Se dispensó un antibiótico tópico en cada ojo inmediatamente después de la dosificación y un día después de la dosificación para prevenir la infección.
Análisis de ARN
El día 70, los ojos se recolectaron en el plazo de los 10 minutos posteriores a la exanguinación, se congelaron rápidamente por inmersión en nitrógeno líquido y se colocaron en hielo seco. Se extrajeron ojos de monos que habían sido tratados con 150 pg o 450 pg de ISIS 564426, ISIS 664844, ISIS 664867, ISIS 664884 y 400 pg de ISIS 602881. Se extrajo ARN del tejido del ojo para un análisis de PCR en tiempo real de la expresión de ARNm. Se evaluaron los datos de los ojos de control de PBS y se calculó el promedio. Los resultados se presentan como inhibición porcentual de ARNm, con relación al control de PBS, normalizado a la expresión de homeobox de conos y bastones. Una inhibición de valor '0' solo indica que el oligonucleótido no inhibió la expresión en este caso particular.
Tabla 44
Electrorretinografía (ERG)
El efecto potencial de los oligonucleótidos antisentido sobre la tolerabilidad ocular se determinó midiendo la respuesta ERG de los animales después de 9 semanas de tratamiento. La respuesta ERG de onda b adaptada a la luz proporcionó una evaluación de la función de los fotorreceptores de los conos y las células bipolares en el ojo (Hood y Birch, Visual Neuroscience. 1992. 8: 107-126; Bouskila et al., Plos One 2014. 9: e111569). Los electrorretinogramas (ERG) se registraron utilizando un sistema de electrodiagnóstico visual UTAS E-3000. Se midieron las respuestas ERG de onda b adaptadas a la luz en monos anestesiados después de la estimulación con luz blanca a una intensidad de luminancia de 2,7 cd.m2.
Los resultados se presentan en la Tabla siguiente como porcentaje de la amplitud de la línea base (media ± DE). Como se muestra en la tabla siguiente, a la dosis más alta de 750 pg de ISIS 564426, ISIS 664867 e ISIS 664884 por ojo, la respuesta de la onda b tendió a niveles más bajos. Además, la respuesta en animales tratados con ISIS 564426 tendió a disminuir con una dosis de 450 pg por ojo. Estos resultados indican que ISIS 664844 es más tolerable que ISIS 564426, ISIS 664867 o ISIS 664884.
Tabla 45
Patología
Después de la exanguinación, los ojos con conjuntiva bulbar y nervio óptico adherido se recogieron de varios grupos y se conservaron en fijador de Davidson modificado durante 48-72 horas. A continuación, los tejidos se transfirieron a alcohol del 70% durante al menos 24 horas antes de procesarlos en bloques de parafina. Las muestras incluidas en parafina se seccionaron en paralelo a la arteria ciliar para incluir el nervio óptico, la mácula y el disco óptico. Después de revestir la sección, se recogieron 5 secciones en etapas de aproximadamente 30 micrómetros. Las secciones se montaron en portaobjetos de vidrio, se tiñeron con hematoxilina y eosina y se analizaron para determinar histopatología. Los resultados se presentan en la tabla siguiente. 'OS' indica 'franja externa'; 'IS' indica 'franja interna'; 'CNE' indica 'capa nuclear externa'; 'CNI' indica 'capa nuclear interna'; 'CCG' indica 'capa de células ganglionares'. Estos resultados indican que ISIS 664844 es más tolerable que ISIS 564426, ISIS 664867 o ISIS 664884.
Tabla 46
Hallazgos patológicos en un estudio de escrutinio en monos
Ensayos de tolerabilidad adicionales
Los exámenes oftálmicos fueron realizados por un Científico Oftalmológico Individual una vez durante el pretratamiento, durante la semana 1 (en el plazo de los 2-4 días posteriores a la administración de la dosis) y durante las semanas 3, 6 y 9. Los animales fueron sedados ligeramente con ketamina antes de este procedimiento. Se utilizó biomicroscopía con lámpara de hendidura y oftalmoscopía indirecta. El segmento anterior se puntuó utilizando la escala de Hackett McDonald (Hackett, R.B. y McDonald, T.O. 1996. "Assessing Ocular Irritation" in: Dermatotoxicology.
5a edición. Ed. de F. B. Marzuli y H.I. Maiback. Hemisphere Publishing Corp., Washington, D.C.).
Las evaluaciones de tonometría se realizaron una vez antes del tratamiento y durante las semanas 3 y 9 aproximadamente a la misma hora del día. Se realizaron mediciones de presión intraocular (PIO) en animales sedados usando un neumotonómetro en condiciones de luz de laboratorio.
Se realizaron mediciones de paquimetría (grosor de la córnea) una vez antes del tratamiento y durante las semanas 6 y 9. Las mediciones de la córnea central se realizaron en animales sedados.
Se realizó microscopía especular sin contacto (NCSM) una vez antes del tratamiento y durante las semanas 5 y 9.
Todas las evaluaciones se tabulan a continuación. Un signo 'V' indica resultados aceptables; una 'X' indica que no es aceptable. Los resultados indican que ISIS 664844 es más tolerable en comparación con ISIS 564426, ISIS 664867 o ISIS 664884.
Tabla 47
Escrutinio de tolerabilidad en un estudio con monos
Prueba Utilidad ISIS ISIS ISIS ISIS ISIS 442 484 486 488 2881 Examen atas, retina may oftálmico omalías vítreas. V V V X V Tonometri IOP V V V V V
Paquimetrí
spesor corneal 
V 
V 
V 
V 
V
Claims (11)
1. Un oligonucleótido modificado que comprende:
un segmento de separación que consiste en desoxinucleósidos conectados;
un segmento de ala 5’ que consiste en nucleósidos conectados; y
un segmento de ala 3’ que consiste en nucleósidos conectados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5’ y el segmento de ala 3'; en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado que es un azúcar con 2'-O-metoxietilo o bicíclico, y donde el oligonucleótido tiene una secuencia de nucleobases que consiste en uno cualquiera de SEQ ID NO: 21, 15, 29 o 64.
2. El oligonucleótido modificado de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente al menos una conexión internucleosídica modificada o al menos una nucleobase modificada.
3. El oligonucleótido modificado de la reivindicación 2, en donde:
i) la conexión internucleosídica modificada es una conexión internucleosídica fosforotioato;
ii) el azúcar bicíclico se selecciona del grupo que consiste en: 4'-(CH2)-O-2' (ANB), 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); y 4'-CH(CH3)-O-2' (cEt); y/o
iii) la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina.
4. Un oligonucleótido modificado que consiste en 16 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia indicada en SEQ ID NO: 15, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de separación que consiste en diez desoxinucleósidos conectados;
un segmento de ala 5’ que consiste en tres nucleósidos conectados; y
un segmento de ala 3’ que consiste en tres nucleósidos conectados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5’ y el segmento de ala 3'; en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar con cEt; en donde cada conexión internucleosídica es una conexión fosforotioato; y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
5. Un oligonucleótido modificado que consiste en 16 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia indicada en SEQ ID NO: 64, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de separación que consiste en nueve desoxinucleósidos conectados;
un segmento de ala 5’ que consiste en cuatro nucleósidos conectados; y
un segmento de ala 3’ que consiste en tres nucleósidos conectados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5’ y el segmento de ala 3'; en donde el segmento de ala 5’ comprende un azúcar con cEt, un azúcar con cEt, un azúcar con cEt y un azúcar con 2'-fluoro en la dirección 5' a 3’; en donde cada nucleósido del segmento de ala 3’ comprende un azúcar con cEt; en donde cada conexión internucleosídica es una conexión fosforotioato; y donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
6. Un oligonucleótido modificado que consiste en 16 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia indicada en SEQ ID NO: 21, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de separación que consiste en diez desoxinucleósidos conectados;
un segmento de ala 5’ que consiste en dos nucleósidos conectados; y
un segmento de ala 3’ que consiste en cuatro nucleósidos conectados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5’ y el segmento de ala 3'; en donde cada nucleósido del segmento de ala 5’ comprende un azúcar con cEt; en el que el segmento de ala 3’ comprende un azúcar con cEt, un azúcar con 2'-O-metoxietilo, un azúcar con cEt y un azúcar con 2'-O-metoxietilo en la dirección 5' a 3’; en donde cada conexión internucleosídica es una conexión fosforotioato; y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
7. Un oligonucleótido modificado que consiste en 15 nucleósidos conectados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia indicada en SEQ ID NO: 29, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de separación que consiste en diez desoxinucleósidos conectados;
un segmento de ala 5’ que consiste en dos nucleósidos conectados; y
un segmento de ala 3’ que consiste en tres nucleósidos conectados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5’ y el segmento de ala 3'; en donde cada nucleósido del segmento de ala 5’ comprende un azúcar con cEt; en el que el segmento de ala 3’ comprende un azúcar con cEt, un azúcar con 2'-O-metoxietilo y un con azúcar cEt en la dirección 5' a 3’; en donde cada conexión internucleosídica es una conexión fosforotioato; y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
8. El oligonucleótido modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el oligonucleótido modificado es de hebra sencilla.
9. Una composición que comprende el oligonucleótido modificado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptables, opcionalmente en donde:
i) el diluyente farmacéuticamente aceptable es agua; y/o
ii) el oligonucleótido modificado es una sal de sodio.
10. El oligonucleótido modificado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o la composición de la reivindicación 9, para su uso en el tratamiento, prevención, mejora o ralentización de la progresión de la retinitis pigmentaria (RP).
11. El oligonucleótido modificado o la composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la retinitis pigmentaria (RP) es retinitis pigmentaria autosómica dominante (RPAd), en donde opcionalmente la RPAd está asociada con P23H.
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