ES2848062T3

ES2848062T3 - Sustratos estructurados para mejorar la detección de emisiones de luz y métodos relacionados con los mismos

Info

Publication number: ES2848062T3
Application number: ES14833321T
Authority: ES
Inventors: M Bowen; Bala Venkatesan; Hui Han; Sang Park
Original assignee: Illumina Inc
Current assignee: Illumina Inc
Priority date: 2013-12-23
Filing date: 2014-12-23
Publication date: 2021-08-05
Anticipated expiration: 2034-12-23
Also published as: EP3778890A1; KR20210148407A; US20180073065A1; KR102475314B1; CA2933548A1; KR102333635B1; WO2015100373A3; AU2014369879A1; JP2017503483A; EP3087181B1; CA2933548C; BR112016014923B1; EP3778890B1; EP3087181A2; KR20160101961A; CN106062212A; AU2014369879B2; JP7082860B2; WO2015100373A2; CA3198424A1

Abstract

Una matriz, que comprende: un soporte sólido que comprende una superficie, comprendiendo la superficie una pluralidad de cavidades de reacción, estando separadas las cavidades entre sí por regiones intersticiales; una pluralidad de nanoestructuras plasmónicas, en donde las nanoestructuras plasmónicas comprenden nanopartículas separadas por un espaciado controlado, en donde las nanoestructuras plasmónicas forman un amplificador de ensamble colocado dentro de cada una de las cavidades de reacción y configurado para amplificar al menos una de las ondas electromagnéticas que se propaga a la reacción correspondiente cavidad o amplificar la energía electromagnética que se genera dentro de la correspondiente cavidad de reacción; un material de gel que forma una capa sobre la pluralidad de nanoestructuras plasmónicas; y un ácido nucleico cebador unido al material de gel.

Description

DESCRIPCIÓN

Sustratos estructurados para mejorar la detección de emisiones de luz y métodos relacionados con los mismos

Antecedentes

La presente divulgación se refiere en general al análisis biológico o químico y más particularmente a los sistemas y métodos para detectar emisiones de luz de los sitios de reacción.

Varios protocolos en la investigación biológica o química implican realizar una gran cantidad de reacciones controladas en áreas localizadas de una superficie de soporte o dentro de las cavidades de reacción. Las reacciones designadas pueden observarse o detectarse y el análisis posterior puede ayudar a identificar o revelar las propiedades de los productos químicos involucrados en la reacción. Por ejemplo, en algunos ensayos multiplex, un analito desconocido que tiene un marcador identificable (por ejemplo, marcador fluorescente) puede estar expuesto a miles de sondas conocidas en condiciones controladas. Cada sonda conocida puede depositarse en un pocillo correspondiente de una microplaca. La observación de cualquier reacción química que ocurra entre las sondas conocidas y el analito desconocido dentro de los pocillos puede ayudar a identificar o revelar las propiedades del analito.

Otros protocolos que detectan las emisiones de luz de una matriz de sitios de reacción incluyen protocolos de secuenciación de ADN conocidos, como secuenciación por síntesis (SBS) o secuenciación de matriz cíclica. En SBS, se utilizan una pluralidad de nucleótidos marcados con fluorescencia para secuenciar ácidos nucleicos de numerosos grupos (o poblaciones clonales) de ADN amplificado que se encuentran en la superficie de un sustrato. La superficie puede, por ejemplo, definir un canal en una celda de flujo. Las secuencias de los ácidos nucleicos en los diferentes grupos se determinan ejecutando numerosos ciclos en los que se agrega un nucleótido marcado con fluorescencia al grupo y luego se excita mediante una fuente de luz para proporcionar emisiones de luz.

Aunque los sistemas de secuenciación utilizados actualmente son eficaces para identificar los nucleótidos y determinar una secuencia de ácidos nucleicos, se desean sistemas que sean más rentables y/o que logren una tasa de error aún menor. Por ejemplo, es deseable aumentar la densidad de los sitios de reacción. Sin embargo, las metodologías de secuenciación y los sistemas correspondientes explotan una colección compleja de tecnologías. Se ha demostrado que las mejoras en algunas de estas tecnologías proporcionan reducciones sustanciales de costes. Sin embargo, es difícil predecir cuál, si es que hay alguno, es susceptible de mejoras para reducir costes. Dadas las dependencias entre las tecnologías en los sistemas de secuenciación, es aún más difícil predecir cuál se puede modificar sin tener un impacto adverso en el rendimiento general de la metodología o el sistema.

Un desafío al que se enfrentan muchos sistemas y protocolos es detectar, con un nivel adecuado de confianza, las reacciones designadas que generan emisiones de luz. Este desafío es aún más difícil a medida que los sitios de reacción se vuelven más pequeños y la densidad de los sitios de reacción aumenta. Una consecuencia de que los sitios de reacción se vuelven más pequeños es que la cantidad de emisiones de luz generadas también se reduce. Además, a medida que aumenta la densidad de los sitios de reacción, puede resultar más difícil distinguir qué sitios de reacción proporcionaron las emisiones de luz. Además de lo anterior, generalmente es deseable reducir la cantidad de tiempo utilizado para detectar las emisiones de luz (también denominado tiempo de escaneado o tiempo de imagen). A medida que disminuyen los tiempos de escaneado, se detectan menos fotones, lo que hace que sea aún más difícil detectar de manera confiable las emisiones de luz que son indicativas de una reacción designada.

Por consiguiente, existe la necesidad de aparatos, sistemas y métodos que generen una cantidad suficiente de luz para detectar reacciones designadas dentro de una matriz de sitios de reacción.

Breve sumario

En el presente documento se presentan sustratos de estructuras y métodos para fabricar sustratos de estructuras que mejoran la detectabilidad de las emisiones ópticas proporcionadas por los sitios de reacción discretos. Por ejemplo, los sustratos de las estructuras pueden aumentar la intensidad de una luz de excitación experimentada por sustancias biológicas en los sitios discretos, pueden aumentar la intensidad de las emisiones ópticas de las sustancias biológicas y/o pueden controlar la direccionalidad de las emisiones ópticas. También se presentan en el presente documento métodos para detectar emisiones ópticas de una matriz de sitios discretos. Los sitios discretos pueden ser cavidades de reacción formadas dentro de un cuerpo de sustrato o áreas localizadas a lo largo de una superficie de un sustrato de dispositivo. Las emisiones ópticas se pueden generar mediante, por ejemplo, fluorescencia, quimioluminiscencia, bioluminiscencia, electroluminiscencia, radioluminiscencia y similares. También se presentan aquí sustratos estructurados que tienen una mayor densidad de sitios discretos (o menor paso entre sitios adyacentes) que los sistemas y métodos conocidos de fabricación de los mismos.

Los métodos y sustratos estructurados se pueden configurar para mejorar las emisiones de luz de muestras marcadas con fluorescencia y, más específicamente, ácidos nucleicos marcados con fluorescencia. Los métodos y composiciones presentados en el presente documento proporcionan una mejora fluorescente de grupos de ADN en la secuenciación mediante reacciones de síntesis que implican nucleótidos marcados con colorante.

Se proporcionan métodos y composiciones para mejorar la fluorescencia en una superficie. Los métodos y composiciones son muy adecuados para mejorar la intensidad de fluorescencia de ácidos nucleicos marcados sobre un soporte sólido. Los métodos y composiciones presentados en el presente documento proporcionan una mejora fluorescente de grupos de ADN en la secuenciación mediante reacciones de síntesis que implican nucleótidos marcados con colorante.

Por consiguiente, aquí se presenta un sustrato, que comprende: una pluralidad de nanopartículas distribuidas sobre un soporte sólido; un material de gel que forma una capa en asociación con la pluralidad de nanopartículas; y una biblioteca de ácidos nucleicos diana en el material de gel. Las nanopartículas pueden estar formadas por un material resonante de plasmón. El material resonante de plasmón puede comprender un material seleccionado del grupo que consiste en: oro (Au), plata (Ag), estaño (Sn), rodio (Rh), rutenio (Ru), paladio (Pd), osmio (Os), iridio (Ir), platino (Pt), titanio (Ti) y aluminio (Al), cromo (Cr), cobre (Cu), silicio (Si) (por ejemplo, silicio dopado de tipo p, silicio dopado de tipo n) y arseniuro de galio. El material de gel puede cubrir las nanopartículas. El soporte sólido puede comprender una superficie de una celda de flujo. El soporte sólido puede comprender una superficie plana que tiene una pluralidad de pocillos (o cavidades de reacción), estando distribuidas las nanopartículas dentro de la pluralidad de pocillos.

También se presenta en el presente documento un método para hacer un sustrato, que comprende: (a) proporcionar un soporte sólido que comprende una superficie plana; (b) dispersar una pluralidad de nanopartículas sobre la superficie del soporte sólido; (c) y recubrir al menos una porción del soporte sólido con un material de gel formando así una capa de gel que cubre la pluralidad de nanopartículas. Las nanopartículas pueden estar formadas por un material resonante de plasmón. Las etapas (b) y (c) se pueden realizar simultáneamente. La etapa (b) se puede realizar antes de la etapa (c). El método puede comprender además (d) suministrar una biblioteca de ácidos nucleicos diana al material de gel para producir una serie de características de ácido nucleico en el material de gel. Cada característica puede comprender una especie de ácido nucleico diferente. El material resonante de plasmón puede comprender un material seleccionado del grupo que consiste en: oro (Au), plata (Ag), estaño (Sn), rodio (Rh), rutenio (Ru), paladio (Pd), osmio (Os), iridio (Ir), platino (Pt), titanio (Ti) y aluminio (Al), cromo (Cr), cobre (Cu), silicio (Si) (por ejemplo, silicio dopado tipo p, silicio dopado tipo n) y arseniuro de galio.

También se presenta en el presente documento un método para detectar ácidos nucleicos, que comprende: proporcionar un soporte sólido que comprende una pluralidad de nanopartículas; un material de gel que forma una capa que cubre la pluralidad de nanopartículas; y una biblioteca de ácidos nucleicos diana en el material de gel; poner en contacto el soporte sólido con al menos una sonda marcada con fluorescencia que se une a los ácidos nucleicos diana; y detectar la señal fluorescente en el soporte sólido para distinguir los ácidos nucleicos diana que se unen a la al menos una sonda. Las nanopartículas pueden estar formadas por un material resonante de plasmón. El material resonante de plasmón puede comprender un material seleccionado del grupo que consiste en: oro (Au), plata (Ag), estaño (Sn), rodio (Rh), rutenio (Ru), paladio (Pd), osmio (Os), iridio (Ir), platino (Pt), titanio (Ti) y aluminio (Al), cromo (Cr), cobre (Cu), silicio (Si) (por ejemplo, silicio dopado de tipo p, silicio dopado de tipo n) y arseniuro de galio. El soporte sólido puede comprender una superficie de una celda de flujo. El soporte sólido puede comprender una superficie plana que tiene una pluralidad de pocillos (o cavidades de reacción), las nanopartículas distribuidas entre la pluralidad de pocillos. La sonda marcada con fluorescencia puede comprender un nucleótido marcado con fluorescencia. La sonda marcada con fluorescencia puede comprender un oligonucleótido marcado con fluorescencia. La detección puede comprender la detección de la hibridación de una sonda de oligonucleótidos a ácidos nucleicos diana en cada característica. La detección puede comprender la detección de la incorporación de un nucleótido o una sonda de oligonucleótido a los ácidos nucleicos diana en cada característica.

La invención que se presenta en el presente documento es una matriz, que comprende: un soporte sólido que comprende una superficie, comprendiendo la superficie una pluralidad de pocillos (o cavidades de reacción), estando los pocillos separados entre sí por regiones intersticiales; una pluralidad de nanoestructuras plasmónicas en cada una de dicha pluralidad de pocillos; un material de gel que forma una capa sobre la pluralidad de nanoestructuras plasmónicas; y un ácido nucleico cebador unido al material de gel. En ciertas realizaciones, las nanoestructuras están situadas en el fondo de los pocillos. En determinadas formas de realización, las nanoestructuras están situadas a lo largo de las paredes de los pocillos. En determinadas realizaciones, las regiones intersticiales están sustancialmente desprovistas de nanoestructuras. En determinadas formas de realización, las nanoestructuras comprenden nanopartículas. En determinadas formas de realización, las nanopartículas tienen un diámetro superior a 1 nm, 2 nm, 3 nm, 4 nm, 5 nm, 6 nm, 7 nm, 8 nm, 9 nm, 10 nm, 20 nm, 30 nm, 40 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm o más de 100 nm. En ciertas realizaciones, las nanopartículas tienen un diámetro de menos de 100 nm, 90 nm, 80 nm, 70 nm, 60 nm, 50 nm, 40 nm, 30 nm, 20 nm, 10 nm, 9 nm, 8 nm, 7 nm, 6 nm, 5 nm, 4 nm, 3 nm, 2 nm o menos de 1 nm. En ciertas realizaciones, las nanopartículas comprenden dímeros o trímeros dentro de los pocillos. En determinadas realizaciones, las nanoestructuras comprenden nanoantenas de pajarita. En determinadas formas de realización, las nanoestructuras comprenden nanobarras. En determinadas formas de realización, las nanoestructuras comprenden nanoanillos. En determinadas formas de realización, las nanoestructuras comprenden nanotapones. En determinadas realizaciones, las nanoestructuras comprenden nanorejillas. En determinadas realizaciones, el material de gel comprende un hidrogel. En determinadas realizaciones, el soporte sólido comprende una superficie de una celda de flujo.

También se presenta en el presente documento un método para hacer una matriz, que comprende obtener un soporte sólido que comprende una superficie plana, comprendiendo la superficie una pluralidad de pocillos (o cavidades de reacción), estando los pocillos separados entre sí por regiones intersticiales; recubrir una película metálica sobre el soporte sólido; someter la película metálica a un proceso de recocido térmico, formando así una pluralidad de nanoestructuras en cada una de dicha pluralidad de pocilios; recubrir al menos una porción del soporte sólido con un material de gel, depositando así el material de gel en una pluralidad de pocillos y que comprende un ácido nucleico cebador unido al gel. En determinadas realizaciones, las nanoestructuras están formadas por un material resonante de plasmón. En determinadas realizaciones, el método comprende además pulir la superficie plana para eliminar sustancialmente nanoestructuras de las regiones intersticiales y mantener las nanoestructuras en los pocillos. En determinadas realizaciones, el método comprende además recubrir al menos una porción del soporte sólido con un material de gel, depositando así el material de gel en una pluralidad de pocillos. En determinadas realizaciones, las nanoestructuras comprenden un material seleccionado del grupo que consiste en: Oro (Au), plata (Ag), estaño (Sn), rodio (Rh), rutenio (Ru), paladio (Pd), osmio (Os), iridio (Ir), platino (Pt), titanio (Ti) y aluminio (Al), cromo (Cr), cobre (Cu), silicio (Si) (por ejemplo, silicio dopado de tipo p, silicio dopado de tipo n) y arseniuro de galio.

También se presenta en el presente documento un método para detectar ácidos nucleicos, que comprende: proporcionar un soporte sólido que comprende una superficie plana, comprendiendo la superficie una pluralidad de pocillos, estando los pocillos separados entre sí por regiones intersticiales; una pluralidad de nanoestructuras plasmónicas en cada una de dicha pluralidad de pocillos; un material de gel que forma una capa que cubre la pluralidad de nanoestructuras plasmónicas; un ácido nucleico cebador unido al material de gel; y una biblioteca de ácidos nucleicos diana que siembran pocillos individuales mediante la interacción con el ácido nucleico cebador unido al material de gel; poner en contacto el soporte sólido con al menos una sonda marcada con fluorescencia que se une a los ácidos nucleicos diana; y detectar la señal fluorescente en el soporte sólido para distinguir los ácidos nucleicos diana que se unen a la al menos una sonda. En determinadas realizaciones, las nanoestructuras están formadas por un material resonante de plasmón. En determinadas realizaciones, las nanoestructuras comprenden un material seleccionado del grupo que consiste en: oro (Au), plata (Ag), estaño (Sn), rodio (Rh), rutenio (Ru), paladio (Pd), osmio (Os), iridio (Ir), platino (Pt), titanio (Ti) y aluminio (Al), cromo (Cr), cobre (Cu), silicio (Si) (por ejemplo, silicio dopado de tipo p, silicio dopado de tipo n) y arseniuro de galio. En determinadas realizaciones, las nanoestructuras están situadas en el fondo de los pocillos. En determinadas formas de realización, las nanoestructuras están situadas a lo largo de las paredes de los pocillos. En determinadas realizaciones, las regiones intersticiales están sustancialmente desprovistas de nanoestructuras. En determinadas realizaciones, el material de gel comprende un hidrogel. En determinadas realizaciones, el soporte sólido comprende una superficie de una celda de flujo. En ciertas realizaciones, la sonda marcada con fluorescencia comprende un nucleótido marcado con fluorescencia. En ciertas realizaciones, la sonda marcada con fluorescencia comprende un oligonucleótido marcado con fluorescencia. En determinadas realizaciones, la detección comprende la detección de la hibridación de una sonda oligonucleotídica con ácidos nucleicos diana en cada característica. En determinadas realizaciones, la detección comprende la detección de la incorporación de un nucleótido o una sonda de oligonucleótido a los ácidos nucleicos diana en cada característica.

Se proporciona un sustrato estructurado. El sustrato estructurado incluye un cuerpo de sustrato que tiene un lado activo. El cuerpo del sustrato incluye cavidades de reacción que se abren a lo largo del lado activo y regiones intersticiales que separan las cavidades de reacción. El sustrato estructurado incluye un amplificador de unión colocado dentro de cada una de las cavidades de reacción. El amplificador de unión incluye una pluralidad de nanoestructuras configuradas para al menos una de amplificar la energía electromagnética que se propaga a la correspondiente cavidad de reacción o amplificar la energía electromagnética que se genera dentro de la correspondiente cavidad de reacción.

Se proporciona un método de fabricación de un sustrato estructurado. El método incluye proporcionar una capa base que tiene un lado base y formar nanoestructuras a lo largo del lado base de la capa base. El método también incluye formar una capa de cavidad que se apila sobre el lado base. La capa de cavidad incluye una pluralidad de cavidades de reacción en las que cada cavidad de reacción incluye una pluralidad de nanoestructuras en su interior. La pluralidad de nanoestructuras forman un amplificador de unión de la correspondiente cavidad de reacción que está configurado para al menos uno de amplificar la energía electromagnética que se propaga en la correspondiente cavidad de reacción o amplificar la energía electromagnética generada dentro de la correspondiente cavidad de reacción.

Se proporciona un método de fabricación de un sustrato estructurado. El método incluye proporcionar una capa base que tiene un lado base y formar nanoestructuras a lo largo del lado base de la capa base. El método también incluye proporcionar una capa de litografía de nanoimpresión (NIL) sobre la matriz de nanoestructuras. El método también incluye imprimir una matriz de cavidades de reacción en la capa NIL, en donde una submatriz diferente de nanoestructuras se coloca debajo de cada cavidad de reacción. Cada subconjunto de nanoestructuras está rodeado por una región de relleno respectiva de la capa NIL. El método también incluye eliminar las respectivas regiones de relleno de la capa NIL para exponer las subconjuntos de nanoestructuras dentro de las correspondientes cavidades de reacción. El subconjunto de nanoestructuras dentro de cada cavidad de reacción forma un amplificador de unión de la cavidad de reacción correspondiente que está configurado para al menos uno de amplificar la energía electromagnética que se propaga a la cavidad de reacción correspondiente o amplificar la energía electromagnética generada dentro de la cavidad de reacción correspondiente.

Se proporciona un método de fabricación de un sustrato estructurado. El método incluye proporcionar una capa de base que tiene un lado de base y proporcionar una capa de litografía por nanoimpresión (NIL) a lo largo del lado de base. El método también incluye imprimir la capa NIL para formar una porción base y una matriz de nanocuerpos que se proyectan desde la porción base. El método también incluye depositar una película resonante de plasmón que cubre los nanocuerpos para formar una pluralidad de nanoestructuras. Cada nanoestructura incluye un nanocuerpo correspondiente y una porción de la película resonante de plasmón. El método también incluye formar una capa de cavidades que incluye una pluralidad de cavidades de reacción en las que cada cavidad de reacción incluye una pluralidad de nanoestructuras en su interior. La pluralidad de nanoestructuras forman un amplificador de unión de la correspondiente cavidad de reacción que está configurado para al menos uno de amplificar la energía electromagnética que se propaga en la correspondiente cavidad de reacción o amplificar la energía electromagnética generada dentro de la correspondiente cavidad de reacción.

Los detalles de una o más realizaciones se establecen en los dibujos adjuntos y la descripción a continuación. Otras ventajas resultarán evidentes a partir de la descripción y los dibujos, y de las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un esquema que muestra un método ejemplar para la mejora de la fluorescencia en una superficie. La figura 2 es una representación esquemática de varios ejemplos de nanoestructuras plasmónicas en nanopocillos. La figura 3A muestra un esquema de la deposición de nanopartículas en nanopocillos. Las figuras 3B y 3C son imágenes SEM que muestran la deposición de nanopartículas en varios espesores.

La figura 4 muestra imágenes esquemáticas y SEM que muestran la formación de nanoanillos en nanopocillos. La figura 5 es una imagen SEM de nanopartículas depositadas en nanopocillos después del recocido térmico. La barra de escala es de 2 pm.

La figura 6 es un conjunto de gráficos que muestran la intensidad de los grupos por ciclo para cuatro bases marcadas con fluorescencia en función del espesor de las partículas de Sn/Au.

La figura 7 es una tabla resumen de la mejora de la intensidad de los grupos en el ciclo 1 y el ciclo 26 para películas de nanopartículas recocidas de Sn/Au.

La figura 8A es un esquema que muestra la formación de nanotapones de Au en nanopocillos de acuerdo con una realización. La figura 8B es una imagen SEM que demuestra la formación de nanotapones de Au.

La figura 9A es un gráfico de barras que muestra la mejora de la intensidad de secuenciación del primer ciclo utilizando nanotapones de Au en nanopocillos según una realización. La figura 9B es una tabla resumen de la mejora de la intensidad de los grupos para nanotapones de Au recocidos en nanopocillos.

La figura 10 ilustra una sección transversal de una porción de un sustrato estructurado formado de acuerdo con una realización.

La figura 11 es un diagrama de flujo que ilustra un método de fabricación de un sustrato estructurado de acuerdo con una realización.

La figura 12 es un diagrama de flujo que ilustra un método de fabricación de un sustrato estructurado de acuerdo con una realización que incluye material de litografía de nanoimpresión (NIL).

La figura 13 ilustra diferentes etapas del método que se muestra en la figura 12.

La figura 14 ilustra diferentes etapas del método que se muestra en la figura 12.

La figura 15 es un diagrama de flujo que ilustra un método de fabricación de un sustrato estructurado de acuerdo con una realización que incluye material NIL.

La figura 16 ilustra diferentes etapas del método que se muestra en la figura 15.

Las figuras 17A-17E ilustran vistas en perspectiva de nanoestructuras que se pueden usar con una o más realizaciones.

Las figuras 18A-18D ilustran secciones transversales de nanoestructuras que pueden usarse con una o más realizaciones.

Las figuras 19A-19D ilustran vistas en planta de nanoestructuras que se pueden usar con una o más realizaciones. Descripción detallada

La solicitud cita el siguiente estado de la técnica: solicitud de patente de EE. UU. n.° publicación 2014/0242334; solicitud de patente de EE. UU. n.° publicación 2014/0079923; y solicitud de patente de EE. UU. n.° publicación 2011/0059865.

Una o más realizaciones expuestas en el presente documento están configuradas para mejorar directa o indirectamente las emisiones de luz de una matriz de sitios de reacción de modo que las emisiones de luz puedan detectarse, por ejemplo, mediante un sistema o dispositivo de formación de imágenes. Con este fin, las realizaciones pueden al menos una de: aumentar la intensidad de una luz de excitación experimentada por una sustancia biológica, aumentar la intensidad de las emisiones de luz generadas por la sustancia biológica y/o controlar la direccionalidad de las emisiones de luz para que las emisiones de luz se puedan detectar. El aumento de intensidad y/o control de la direccionalidad de las emisiones de luz puede ser provocado, en parte, por una o más nanoestructuras ubicadas en el correspondiente sitio de reacción. La cantidad de aumento puede medirse en relación con la cantidad de energía electromagnética que existe en el sitio de reacción sin la(s) nanoestructura(s).

La matriz de sitios de reacción puede disponerse a lo largo de un sustrato estructurado. El sustrato estructurado puede ser, por ejemplo, una celda de flujo que tiene un canal para dirigir los reactivos junto a los sitios de reacción. Las emisiones de luz pueden detectarse mediante un sistema de formación de imágenes que puede incluir, por ejemplo, una lente de objetivo que escanea o barre a lo largo del sustrato estructurado para detectar las emisiones de luz de los sitios de reacción. Los sistemas ejemplares capaces de detectar emisiones de luz de los sustratos estructurados establecidos en el presente documento se describen en las solicitudes de patente de EE.UU. n.° publicación 2012/0270305 A1 y 2013/0261028 A1. Alternativamente, el sustrato estructurado puede integrarse con un dispositivo de formación de imágenes, como un dispositivo de formación de imágenes de estado sólido (por ejemplo, CMOS). En tales realizaciones, el dispositivo de formación de imágenes puede tener uno o más sensores de luz que están alineados con los sitios de reacción para capturar las emisiones de luz de los sitios de reacción. Tales realizaciones se describen en la solicitud provisional de e E.UU. n.° 61/914.275 y la solicitud internacional n.° PCT/US14/69373.

Un efecto técnico proporcionado por al menos una de las realizaciones puede incluir una mayor intensidad de señal de los emisores de la sustancia biológica. El aumento de la intensidad de la señal puede reducir la tasa de error al reducir el número de sustancias biológicas que emiten una baja intensidad de luz. Otro efecto técnico puede incluir una disminución en la relación señal/ruido que permite velocidades de escaneado más rápidas y reduce el tiempo total para realizar un protocolo. Por ejemplo, con respecto a la tecnología de secuenciación por síntesis, se desean velocidades de escaneado más rápidas en los instrumentos de secuenciación, pero velocidades de escaneado más rápidas dan como resultado que se recojan menos fotones por grupo en la cámara de imágenes. Con menos fotones capturados, la relación señal/ruido normalmente disminuye y se vuelve más difícil asignar una base con seguridad. Además, en algunos instrumentos de secuenciación, la óptica de baja NA da como resultado señales que son intrínsecamente más grandes y más tenues, lo que puede producir tasas de error más altas. Las realizaciones expuestas en el presente documento pueden aumentar el número de fotones que se capturan. Otro efecto técnico para al menos algunas realizaciones incluye un método de fabricación de un sustrato estructurado que es más fiable que al menos algunos métodos conocidos y más rentable que al menos algunos métodos conocidos.

La presente divulgación se refiere generalmente a la química analítica en fase sólida y tiene una aplicabilidad específica a matrices de ácidos nucleicos para análisis genómicos de alto rendimiento. La tarea de catalogar la variación genética humana y correlacionar esta variación con la susceptibilidad a la enfermedad se beneficiará de los avances en las metodologías de secuenciación del genoma. Este esfuerzo de catalogación es prometedor para identificar los marcadores en el genoma de cada persona que ayudarán a los profesionales médicos a determinar la susceptibilidad de esa persona a la enfermedad, la capacidad de respuesta a terapias específicas como los medicamentos recetados, la susceptibilidad a los efectos secundarios de los medicamentos peligrosos y otras características médicamente procesables. El esfuerzo de catalogación está muy avanzado. Esto se debe en gran parte a las metodologías de secuenciación del genoma disponibles comercialmente que son lo suficientemente rentables como para permitir que los sujetos de prueba sean evaluados en un entorno de investigación. Se necesitan mejoras en las metodologías de secuenciación para acelerar el esfuerzo de catalogación. Además, el coste relativamente alto de la secuenciación ha impedido que la tecnología se mueva más allá de los centros de investigación y llegue a la clínica donde los médicos pueden obtener secuencias para pacientes de la población general.

Las metodologías de secuenciación y los sistemas utilizados para llevarlas a cabo explotan un conjunto complejo de tecnologías. Se ha demostrado que las mejoras en algunas de estas tecnologías proporcionan reducciones sustanciales de costes. Sin embargo, es difícil predecir cuál, si es que hay alguna, es susceptible de mejoras de reducción de costes. Dadas las dependencias entre las tecnologías en los sistemas de secuenciación, es aún más difícil predecir cuál se puede modificar sin tener un impacto adverso en el rendimiento general de la metodología o el sistema. Por lo tanto, existe la necesidad de identificar mejoras que puedan llevar la promesa de la investigación genómica a la clínica donde se pueden mejorar y, en muchos casos, salvar vidas. La presente invención satisface esta necesidad y también proporciona ventajas relacionadas.

Como se usa en el presente documento, una "sustancia biológica" o "sustancia química" incluye biomoléculas, muestras de interés, analitos de interés y otro(s) compuesto(s) químico(s). Una sustancia biológica o química se puede utilizar para detectar, identificar o analizar otro(s) compuesto(s) químico(s), o funcionar como intermediarios para estudiar o analizar otro(s) compuesto(s) químico(s). En realizaciones particulares, la sustancia biológica es un ácido nucleico o, más específicamente, una colonia de ácidos nucleicos que tienen una secuencia común. En realizaciones particulares, las sustancias biológicas o químicas incluyen una biomolécula. Como se usa en el presente documento, una "biomolécula" incluye al menos uno de un biopolímero, nucleósido, ácido nucleico, polinucleótido, oligonucleótido, proteína, enzima, polipéptido, anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, polisacárido, carbohidrato, polifosfato, célula, tejido, organismo, o fragmento del mismo o cualquier otro compuesto químico biológicamente activo, tales como análogos o miméticos de las especies mencionadas anteriormente.

Como otro ejemplo, una sustancia biológica o química puede incluir una enzima o reactivo usado en una reacción acoplada para detectar el producto de otra reacción tal como una enzima o reactivo usado para detectar pirofosfato en una reacción de pirosecuenciación. Las enzimas y reactivos útiles para la detección de pirofosfatos se describen, por ejemplo, en la publicación de patente de EE. UU. n.° 2005/0244870 A1.

Las sustancias biológicas o químicas pueden ser naturales o sintéticas y estar ubicadas dentro de un área o espacio designado. En algunas realizaciones, las sustancias biológicas o químicas pueden unirse a una fase sólida o material de gel. Las biomoléculas, muestras y sustancias biológicas o químicas también pueden incluir una composición farmacéutica. En algunos casos, las biomoléculas, muestras y sustancias biológicas o químicas de interés pueden denominarse dianas, sondas o analitos.

Las realizaciones pueden ser particularmente adecuadas para mejorar las emisiones de ácidos nucleicos marcados con fluorescencia. A modo de ejemplo, las realizaciones pueden proporcionar una potenciación fluorescente de agrupaciones de ADN en la secuenciación mediante reacciones de síntesis que implican nucleótidos marcados con colorante. Las realizaciones pueden aumentar la intensidad de la señal de los marcadores fluorescentes durante la secuenciación por síntesis. El aumento en la intensidad de la señal puede mejorar el rendimiento general de la secuencia al reducir el error de secuenciación que surge de los grupos de baja intensidad y abandonos de los grupos durante las ejecuciones de secuenciación largas.

En el presente documento se presentan métodos y composiciones para la mejora de la fluorescencia en una superficie. Los métodos y composiciones son muy adecuados para mejorar la intensidad de fluorescencia de ácidos nucleicos marcados sobre un soporte sólido (o cuerpo de sustrato). En realizaciones particulares, los métodos y composiciones presentados en el presente documento proporcionan una mejora fluorescente de grupos de ADN en la secuenciación mediante reacciones de síntesis que implican nucleótidos marcados con colorante. Además, en el presente documento se proporcionan métodos para la fabricación rápida, robusta y de bajo coste de nanoestructuras tales como nanoestructuras plasmónicas sobre sustratos de secuenciación capaces de mejorar la fluorescencia de amplio espectro desde aproximadamente 350 nm hasta aproximadamente 750 nm.

La presente divulgación detalla el sorprendente descubrimiento de que se puede obtener una mayor intensidad a partir de ácidos nucleicos agrupados combinando plasmónicos y/o nanoantenas con sustratos/plataformas de secuenciación ejemplares y química de SBS. Esto se logra mediante la nanofabricación de arriba hacia abajo o el autoensamblaje de abajo hacia arriba de nanoestructuras plasmónicas y nanoantenas en el sustrato de secuenciación. En este documento se presentan una variedad de métodos para fabricar nanoestructuras plasmónicas en sustratos tanto sin patrón como con patrón.

Sin desear ceñirse a la teoría, la mejora resultante en la intensidad del grupo se debe a una combinación de resonancia de plasmón superficial localizada y procesos de transferencia de energía resonante. Los métodos y composiciones aquí presentados tienen varias ventajas. Por ejemplo, el aumento de la intensidad de la señal de los marcadores fluorescentes durante la secuenciación por síntesis mejora el rendimiento general de la secuencia al reducir el error de secuenciación que surge de los grupos de baja intensidad y los abandonos del grupo durante las ejecuciones de secuenciación largas. Además, la relación señal/ruido se reduce, lo que permite velocidades de escaneado más rápidas y reduce el tiempo de ejecución de secuenciación general. Se desean velocidades de escaneado más rápidas en los instrumentos de secuenciación, pero las velocidades de escaneado más rápidas dan como resultado que se recolecten menos fotones por grupo en la cámara de imágenes, lo que resulta en una menor señal al ruido y mayores tasas de error. Además, en algunos instrumentos de secuenciación, las ópticas de baja NA dan como resultado señales que son inherentemente más grandes y más tenues, lo que potencialmente produce mayores tasas de error. Por lo tanto, los métodos para aumentar la intensidad de los conglomerados proporcionan numerosos beneficios.

Aquí se presenta un sustrato, que comprende: una pluralidad de nanopartículas formadas por un material resonante de plasmón distribuido sobre un soporte sólido (o cuerpo de sustrato); un material de gel que forma una capa en asociación con la pluralidad de nanopartículas; y una biblioteca de ácidos nucleicos diana en el material de gel.

El material de gel puede cubrir las nanopartículas. El soporte sólido puede comprender una superficie de una celda de flujo. El soporte sólido puede comprender una superficie plana que tiene una pluralidad de pocillos (o cavidades de reacción), estando distribuidas las nanopartículas dentro de la pluralidad de pocillos.

Como se usa en el presente documento, los términos "nanopartícula" y "nanoestructura" se usan indistintamente para referirse a una partícula que tiene una dimensión en el intervalo de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 1000 nm, incluido cualquier valor entero o no entero entre 1 nm y 1000 nm. En realizaciones típicas, la nanopartícula es una partícula metálica. En algunas realizaciones, el núcleo de nanopartículas es una partícula esférica o casi esférica de 20-200 nm de diámetro. En algunas realizaciones, el intervalo es de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 50 nm (por ejemplo, aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 nm). En algunas realizaciones el intervalo es de aproximadamente 350 nm hasta aproximadamente 750 nm. Las nanopartículas anisotrópicas pueden tener una longitud y una anchura. En algunas realizaciones, la longitud de una nanopartícula anisotrópica es una dimensión paralela al plano de la abertura en la que se produjo la nanopartícula. En algunas realizaciones, la longitud de una nanopartícula anisotrópica es la dimensión perpendicular al plano de la abertura en la que se produjo la nanopartícula. En el caso de nanopartículas anisotrópicas, en algunas realizaciones, la nanopartícula tiene un diámetro (anchura) en el intervalo de aproximadamente 350 nm a aproximadamente 750 nm. En otras realizaciones, la nanopartícula tiene un diámetro (anchura) de aproximadamente 350 nm o menos. En otras realizaciones, la nanopartícula tiene un diámetro de 250 nm o menos y en algunas realizaciones, un diámetro de 100 nm o menos. En algunas realizaciones, la anchura está entre 15 nm y 300 nm. En algunas realizaciones, la nanopartícula tiene una longitud de aproximadamente 10-350 nm. En algunas realizaciones, las nanopartículas tienen una forma preseleccionada y pueden ser, por ejemplo, un nanotubo, un nanoalambre, nanoesfera o cualquier forma que comprenda las dimensiones descritas anteriormente (por ejemplo, forma triangular, cuadrada, rectangular o poligonal en 2 dimensiones, o cuboide, piramidal, cilíndrico, esférico, discoide o hemisférico en las 3 dimensiones). La figura 2 es una representación esquemática de varios ejemplos de nanoestructuras plasmónicas en nanopocillos 26. Algunos ejemplos de nanoestructuras incluyen, por ejemplo, nanoantenas de pajarita 28, nanoesferas 34, nanopiramides, nanocapas, nanobarras, nanocables, nanoanillos, nanotapones 30, nanorejillas 32 y similares. Los dímeros 36 y trímeros 28 de nanopartículas preformados también se pueden cargar en pocillos y tienen la ventaja de controlar con precisión el espaciamiento de las nanopartículas.

Estas nanoestructuras se pueden fabricar en una superficie o preformar y luego cargar en nanopocillos. Ejemplos de tales estructuras incluyen nanotapones plasmónicos fabricados en la parte inferior de nanopocillos, antenas de pajarita y de cavidad en nanopocillos, nanorejillas metálicas en las que se podrían formar nanopocillos, nanopartículas refluidas en nanopocillos o una combinación de algunos o todos los anteriores. Un ejemplo sería un nanotapón de metal en un nanopocillo con nanopartículas en las paredes formadas mediante un simple proceso de evaporación por haz de electrones. Las construcciones de nanopartículas (dímeros, n-meros) formadas usando origamis de ADN o moléculas enlazadoras como cucurbitáceas [n] urils también son atractivas para cargar en los pocillos. Dichos métodos permiten un control subnanométrico preciso sobre los espacios de nanopartículas y pueden formarse a gran escala utilizando el autoensamblaje de abajo hacia arriba. En la figura 2 se muestran ejemplos de estas estructuras.

El espacio entre dos nanopartículas cualesquiera en una superficie puede ser cualquier distancia. En algunas realizaciones, el espaciamiento puede ser un múltiplo de una longitud de onda de energía de luz incidente, tal como una emisión particular o una longitud de onda de excitación en espectroscopía de fluorescencia. El espaciado puede ser, por ejemplo, 1 A, 2 A, 3 A, 4 A u otro múltiplo de una longitud de onda elegida (A) de energía de luz incidente. Por lo tanto, usando como ejemplo una longitud de onda de emisión (A) de 532 nm, el espaciado entre nanopartículas puede ser de aproximadamente 532 nm (1 A), aproximadamente 1064 nm (2 A) u otro múltiplo de la longitud de onda de emisión. En algunas realizaciones, el espaciado puede ser una fracción de la longitud de onda de la energía de la luz incidente, tal como una emisión particular o una longitud de onda de excitación en la espectroscopia de fluorescencia. La separación puede ser, por ejemplo, 1 A, 1/2 A, 1/3 A, 1/4 A u otro múltiplo de una longitud de onda elegida de energía de luz incidente. Por lo tanto, usando como ejemplo una longitud de onda de emisión de (A) 532 nm, el espaciado entre nanopartículas puede ser de aproximadamente 532 nm (1 A), 266 nm (1/2 A), 133 nm (1/3 A) u otra fracción de la longitud de onda de emisión.

Los términos "nanoestructura plasmónica" o "estructura nanoplasmónica" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a cualquier estructura independiente que exhiba la característica de resonancia de plasmón de la estructura, incluidas (pero sin limitarse a) tanto nanoestructuras, nanopartículas y combinaciones o asociaciones de nanopartículas.

El término "nanoantena", como se usa en el presente documento, se refiere a una nanopartícula o nanoestructura que actúa para amplificar la energía electromagnética, como la energía luminosa. Como se usa en el presente documento, una nanoantena no exhibe necesariamente características de resonancia de plasmón. En algunas realizaciones, una nanoantena no comprende sustancialmente un material resonante de plasmón. Así, en algunas realizaciones, se presentan nanoantenas que están hechas de un material no metálico pero que exhiben características de amplificación de energía electromagnética. Las nanopartículas aquí presentadas pueden tener cualquier forma y tamaño adecuados para producir la amplificación de energía deseada. Algunas formas ejemplares de nanoantenas incluyen, por ejemplo, nanoantenas de pajarita, nanoesferas, nanopiramides, nanocapas, nanobarras, nanocables, nanoanillos, nanotapones, nanorejillas y similares. Se apreciará que cualquiera de varios métodos conocidos puede ser adecuado para la fabricación y/o deposición de nanoantena sobre un soporte sólido (o cuerpo de sustrato). Los métodos para la fabricación de nanoantenas son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, los métodos descritos en el presente documento para la fabricación y deposición de nanopartículas.

Las nanopartículas pueden comprender cualquier material adecuado para su uso en los métodos y composiciones descritos en el presente documento, por ejemplo, cualquier tipo de material que exhiba resonancia de plasmón superficial (SPR). En determinadas realizaciones preferidas, la nanopartícula comprende un material resonante de plasmón. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, nanopartículas metálicas. Por ejemplo, las nanopartículas pueden comprender un metal como uno o más de oro (Au), plata (Ag), estaño (Sn), rodio (Rh), rutenio (Ru), paladio (Pd), osmio (Os), iridio (Ir), platino (Pt), titanio (Ti) y aluminio (Al), cromo (Cr), cobre (Cu) o cualquier otro metal adecuado. Las nanopartículas se pueden formar a partir de un solo material como, por ejemplo, un solo metal. Adicional o alternativamente, las nanopartículas se pueden formar a partir de una combinación de dos o más materiales diferentes, tales como, por ejemplo, dos o más metales. Por ejemplo, las nanopartículas pueden comprender una mezcla de metal/metal como Sn/Au o Ag/Au. Alternativa o adicionalmente, se pueden aplicar nanopartículas en capas verticales, tales como estructuras multicapa del tipo metal-aislante-metal. Los ejemplos incluyen silicio (Si). Por ejemplo, las nanopartículas pueden incluir silicio dopado de tipo p y silicio dopado de tipo n. También se puede utilizar arseniuro de galio.

La formación de nanopartículas sobre un soporte sólido se puede realizar usando cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica. Las nanopartículas se pueden formar utilizando el autoensamblaje ascendente de nanoestructuras plasmónicas y nanoantenas en el sustrato de secuenciación. Por ejemplo, se puede utilizar cualquiera de varios métodos para la deposición de capas de un material, como los descritos por Gaspar y col. (Scientific Reports, 2013, 3, 1469). En las realizaciones ejemplares descritas en el presente documento e ilustradas en el ejemplo 1 y la figura 1, las nanopartículas 10 se pueden preformar y mezclar en una composición de forma coloidal

con un material de gel 12, que se deposita sobre una superficie 14 de un soporte sólido 16. Puede producirse una operación de siembra en la que los ácidos nucleicos 18 (u otras biomoléculas) se inmovilizan en el material de gel 12. Se puede realizar una operación de agrupamiento para formar un grupo 20 de los ácidos nucleicos 18. Los grupos se pueden generar, por ejemplo, mediante amplificación de puente. Alternativa o adicionalmente, las nanopartículas se pueden depositar primero sobre una superficie seguido de la deposición de un material de gel sobre las nanopartículas. En otras realizaciones, se puede depositar un material de gel sobre una superficie y se depositan nanopartículas sobre el material de gel.

En algunas realizaciones, las nanopartículas se forman en un pocillo (o característica cóncava o cavidad de reacción) de una superficie sólida. Como se muestra en la figura 3A, una película de material de partida 40 tal como Sn/Au puede depositarse sobre una superficie sólida 42 que contiene nanopocillos 44, seguido de un recocido térmico. En algunas realizaciones, se puede utilizar el recocido térmico para promover la formación de nanopartículas 46 a medida que la película se fusiona en partículas discretas. Como demuestran los resultados mostrados en las figuras 3B y 3C, el tamaño de las nanopartículas puede ser una función del espesor de la película inicial. Una etapa de pulido adicional después del recocido térmico puede dar como resultado nanopartículas 46 solo en los pocillos, dejando las regiones intersticiales 48 sustancialmente vacías de nanopartículas. La figura 5 es otro ejemplo de deposición de una capa de Sn/Au seguida de recocido térmico. La imagen SEM de nanopartículas que se muestra en la figura 5 demuestra que las nanopartículas se ven en cada nanopocillo. Las nanopartículas en las regiones intersticiales se pueden eliminar mediante, por ejemplo, pulido químico y/o mecánico. Se observa una distribución de tamaños de nanopartículas en cada nanopocillo que permite una mejora de la fluorescencia de amplio espectro.

En algunas realizaciones, se pueden formar nanoestructuras como un nanorrenado a lo largo de la pared de los pocillos (o características cóncavas o cavidades de reacción) en una superficie. Las nanoestructuras se pueden fabricar usando cualquiera de varias metodologías conocidas en la técnica. Por ejemplo, la figura 4 muestra imágenes esquemáticas y SEM que muestran la formación de nanoanillos 50 en nanopocillos 52. Como se muestra en la figura 4, el Au se puede depositar usando la deposición catódica de una capa 54 de un material como el Au. En la realización que se muestra en la figura 4, la deposición conforme de una capa de Au de ~65 nm fue seguida por un proceso de grabado con iones reactivos (RIE). La capa de Au restante se ubicó a lo largo de las paredes de los nanopocillos, formando nanoanillos 52 en cada uno de los nanopocillos.

Como se usa en el presente documento, el término "superficie" pretende significar una parte externa o capa externa de un soporte sólido o material de gel. La superficie puede estar en contacto con otro material, como un gas, líquido, gel, polímero, polímero orgánico, una segunda superficie de un material, metal o revestimiento similar o diferente. La superficie, o regiones de la misma, pueden ser sustancialmente planas. La superficie puede tener características superficiales tales como pocillos, hoyos, canales, crestas, regiones elevadas, clavijas, postes o similares.

Como se usa en el presente documento, el término "soporte sólido" se refiere a un sustrato rígido que es insoluble en un líquido acuoso. El soporte sólido también puede denominarse cuerpo de sustrato. El sustrato del soporte sólido puede ser no poroso o poroso. El sustrato puede opcionalmente ser capaz de absorber un líquido (por ejemplo, debido a la porosidad) pero típicamente será lo suficientemente rígido como para que el sustrato no se hinche sustancialmente al absorber el líquido y no se contraiga sustancialmente cuando el líquido se retira por secado. Un soporte sólido no poroso es generalmente impermeable a líquidos o gases. Los soportes sólidos pueden, opcionalmente, ser inertes a una química que se usa para modificar un gel. Por ejemplo, un soporte sólido puede ser inerte a la química utilizada para unir analitos, tales como ácidos nucleicos, a geles en un método establecido en el presente documento. Los soportes sólidos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, vidrio y vidrio modificado o funcionalizado, plásticos (incluidos acrílicos, poliestireno y copolímeros de estireno y otros materiales, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, Teflon™, olefinas cíclicas, poliimidas, etc.), nailon, cerámica, resinas, Zeonor, sílice o materiales a base de sílice que incluyen silicio y silicio modificado, carbono, metales, vidrios inorgánicos, haces de fibras ópticas y polímeros.

Realizaciones particulares de los métodos y composiciones presentados en el presente documento utilizan un soporte sólido que tiene un sustrato estructurado o estampado. El sustrato con patrón o estructurado puede comprender una matriz de gel con patrón, como se describe en la solicitud de patente de EE.UU. n.° Serie 13/787.396 (publicación de la solicitud de patente de EE. UU. n.° 2014/0243224 A1). En realizaciones particulares, se puede preparar un sustrato estructurado modelando un material de soporte sólido con pocillos (por ejemplo, micropocillos o nanopocillos), recubriendo el soporte modelado con un material de gel (por ejemplo, PAZAM, SFA o variantes modificadas químicamente de los mismos, como la versión azidolizada de SFA (azido-SFA)) y puliendo el soporte recubierto de gel, por ejemplo mediante pulido químico o mecánico, reteniendo así el gel en los pocillos pero eliminando o inactivando sustancialmente todo el gel de las regiones intersticiales en la superficie del sustrato estructurado entre los pocillos. Los ácidos nucleicos cebadores se pueden unir al material de gel. Una solución de ácidos nucleicos diana (por ejemplo, un genoma humano fragmentado) se puede poner en contacto con el sustrato pulido de manera que los ácidos nucleicos diana individuales sembrarán pocillos individuales mediante interacciones con cebadores unidos al material de gel; sin embargo, los ácidos nucleicos diana no ocuparán las regiones intersticiales debido a la ausencia o inactividad del material de gel. La amplificación de los ácidos nucleicos diana se limitará a los pocillos ya que la ausencia o inactividad del gel en las regiones intersticiales evita la migración hacia el exterior de la colonia de ácidos nucleicos en crecimiento. El proceso se puede fabricar convenientemente, es escalable y utiliza métodos convencionales de micro o nanofabricación.

Un soporte sólido utilizado en un sustrato estructurado expuesto en el presente documento se puede preparar a partir de cualquiera de una variedad de materiales expuestos en el presente documento, por ejemplo, arriba en las definiciones, abajo en los ejemplos o inmediatamente después. Un material particularmente útil es el vidrio. Otros materiales de sustrato adecuados pueden incluir materiales poliméricos, plásticos, silicio, cuarzo (sílice fundida), vidrio borofloat, sílice, materiales a base de sílice, carbono, metales, una fibra óptica o haces de fibras ópticas, zafiro o materiales plásticos tales como COC y epoxis. El material particular se puede seleccionar basándose en las propiedades deseadas para un uso particular. Por ejemplo, los materiales que son transparentes a una longitud de onda de radiación deseada son útiles para técnicas analíticas que utilizarán radiación de la longitud de onda deseada, tales como una o más de las técnicas aquí expuestas. A la inversa, puede ser deseable seleccionar un material que no pase radiación de una determinada longitud de onda (por ejemplo, que sea opaco, absorbente o reflectante). Esto puede ser útil para la formación de una máscara que se utilizará durante la fabricación del sustrato estructurado, tal como un método expuesto en el presente documento; o para ser utilizado para una reacción química o detección analítica llevada a cabo utilizando el sustrato estructurado, como los que se exponen en el presente documento. Otras propiedades de un material que pueden explotarse son la inercia o la reactividad a ciertos reactivos usados en un proceso posterior, como los que se exponen aquí; o facilidad de manipulación o bajo coste durante la fabricación de un proceso de fabricación, como los que se exponen en el presente documento. Otros ejemplos de materiales que se pueden usar en los sustratos estructurados o métodos de la presente divulgación se describen en la solicitud de patente de EE.UU. n.° serie 13/661.524 y la publicación de la solicitud de patente de EE.UU. n.° 2012/0316086 A1.

Los soportes sólidos particularmente útiles para algunas realizaciones se encuentran dentro de un aparato de celda de flujo. Celdas de flujo ejemplares, métodos para su fabricación y métodos para su uso se describen en las publicaciones de las solicitudes de patente de EE.UU. n.° 2010/0111768 A1 o 2012-0270305 A1; o WO 05/065814. Las celdas de flujo proporcionan un formato conveniente para albergar una matriz que se produce mediante los métodos de la presente divulgación y que se somete a una secuenciación por síntesis (SBS) u otra técnica que implica la entrega repetida de reactivos en ciclos (por ejemplo, técnicas de síntesis o técnicas de detección que tienen etapas repetitivos o cíclicos). Los métodos de detección ejemplares se exponen con más detalle a continuación.

En algunas realizaciones se usa una celda de flujo u otro recipiente que tiene múltiples superficies. Los recipientes que tienen múltiples superficies se pueden usar de modo que solo una superficie tenga características cóncavas que contengan gel (por ejemplo, pocillos). Alternativamente, dos o más superficies presentes en el recipiente pueden tener características cóncavas que contienen gel. Se pueden detectar selectivamente una o más superficies de una celda de flujo. Por ejemplo, las superficies opuestas en el interior de una celda de flujo se pueden abordar selectivamente con radiación enfocada usando métodos conocidos en la técnica tales como técnicas confocales.

Las técnicas y dispositivos confocales útiles para dirigir selectivamente la radiación a múltiples superficies de un vaso (por ejemplo, una celda de flujo) se describen, por ejemplo, en la publicación de la solicitud de patente de EE.UU. n.° 2009/0272914 A1 o la patente de EE.UU. n.28.039.817.

Como se usa en el presente documento, el término "material de gel" pretende significar un material semirrígido que es permeable a líquidos y gases. Por lo general, el material de gel puede hincharse cuando se absorbe líquido y contraerse cuando el líquido se elimina por secado. Los geles ejemplares incluyen, pero no se limitan a, aquellos que tienen una estructura coloidal, como agarosa; estructura de malla polimérica, como gelatina; o estructura de polímero reticulado, como poliacrilamida, SFA (ver, por ejemplo, la publicación de la solicitud de patente de EE.UU. n.° 2011/0059865 A1) o PAZAM (ver, por ejemplo, solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° serie 61/753.833 o la publicación de la solicitud de patente de EE. UU. n.° 2011/0059865 A1). El material de gel particularmente útil se adaptará a la forma de un pocillo u otra característica cóncava donde resida. Algunos materiales de gel útiles pueden (a) adaptarse a la forma del pocillo u otra característica cóncava donde reside y (b) tener un volumen que no exceda sustancialmente el volumen del pocillo o característica cóncava donde reside.

Como se usa aquí, el término "región intersticial" se refiere a un área en un sustrato o en una superficie que separa otras áreas del sustrato o superficie. Por ejemplo, una región intersticial puede separar un pocillo (o característica cóncava) de una matriz de otro pocillo (o característica cóncava) de la matriz. Las dos regiones que están separadas entre sí pueden ser discretas, sin contacto entre sí. En otro ejemplo, una región intersticial puede separar una primera porción de una característica de una segunda porción de una característica. En muchas realizaciones, la región intersticial es continua mientras que las características son discretas, por ejemplo, como es el caso de una matriz de pocilios en una superficie que de otro modo sería continua. La separación proporcionada por una región intersticial puede ser una separación parcial o total. Las regiones intersticiales típicamente tendrán un material de superficie que difiere del material de superficie de las características de la superficie. Por ejemplo, las características de una matriz pueden tener una cantidad o concentración de material de gel o analitos que exceda la cantidad o concentración presente en las regiones intersticiales. En algunas realizaciones, el material de gel o los analitos pueden no estar presentes en las regiones intersticiales.

En muchas realizaciones, la región intersticial puede estar sustancialmente desprovista de nanoestructuras puliendo el soporte sólido, por ejemplo, mediante pulido químico o mecánico, reteniendo así nanoestructuras en los pocillos, pero eliminando o inactivando sustancialmente todas las nanoestructuras de las regiones intersticiales en la superficie del sustrato estructurado entre los pocillos. El pulido mecánico se puede realizar aplicando fuerzas abrasivas a la superficie del soporte sólido. Los métodos ejemplares incluyen la abrasión con una suspensión de perlas, limpiar con una hoja o paño, raspar o similares. Se entenderá que las perlas utilizadas para pulir u otros usos establecidos en el presente documento pueden ser esféricas, pero no necesariamente. Más bien, las perlas pueden tener formas irregulares, formas poligonales, formas ovoides, formas alargadas, formas cilíndricas, etc. La superficie de las perlas puede ser lisa o rugosa. Cualquiera de una variedad de partículas puede ser útil como perlas para los métodos y composiciones aquí expuestos. Un ejemplo de pulido incluye el uso de una toallita sin pelusa (grado de sala limpia) recubierta con una suspensión de perlas de sílice de 3 gm (10 % p/v en agua) para eliminar las nanoestructuras intersticiales. También se puede utilizar una rueda de pulido/amoladora con esta suspensión. El pulido mecánico también se puede lograr utilizando un chorro de fluido o gas (por ejemplo, aire o gas inerte como argón o nitrógeno) para eliminar el gel de las regiones intersticiales.

Como se usa en el presente documento, el término "biblioteca", cuando se usa en referencia a analitos, se refiere a una colección de analitos que tienen diferentes composiciones químicas. Normalmente, los analitos en una biblioteca serán especies diferentes que tienen un rasgo común o una característica de un género o clase, pero que por lo demás difieren de alguna manera. Por ejemplo, una biblioteca puede incluir especies de ácido nucleico que difieren en la secuencia de nucleótidos, pero que son similares con respecto a tener un esqueleto de azúcar-fosfato.

Como se usa en el presente documento, los términos "ácido nucleico" y "nucleótido" pretenden ser coherentes con su uso en la técnica e incluir especies de origen natural o análogos funcionales de las mismas. Los análogos funcionales de ácidos nucleicos particularmente útiles son capaces de hibridar con un ácido nucleico de una manera específica de secuencia o pueden usarse como molde para la replicación de una secuencia de nucleótidos particular. Los ácidos nucleicos de origen natural generalmente tienen un esqueleto que contiene enlaces fosfodiéster. Una estructura análoga puede tener un enlace principal alternativo que incluye cualquiera de los conocidos en la técnica. Los ácidos nucleicos de origen natural generalmente tienen un azúcar desoxirribosa (por ejemplo, que se encuentra en el ácido desoxirribonucleico (ADN)) o un azúcar ribosa (que se encuentra en el ácido ribonucleico (ARN)). Un ácido nucleico puede contener nucleótidos que tengan cualquiera de una variedad de análogos de estos restos de azúcar que se conocen en la técnica. Un ácido nucleico puede incluir nucleótidos nativos o no nativos. A este respecto, un ácido desoxirribonucleico nativo puede tener una o más bases seleccionadas del grupo que consiste en adenina, timina, citosina o guanina y un ácido ribonucleico puede tener una o más bases seleccionadas del grupo que consiste en uracilo, adenina, citosina o guanina. Se conocen en la técnica bases no nativas útiles que pueden incluirse en un ácido nucleico o nucleótido. Los términos "sonda" o "diana", cuando se usan en referencia a un ácido nucleico, están pensados como identificadores semánticos para el ácido nucleico en el contexto de un método o composición establecidos en el presente documento y no necesariamente limitan la estructura o función del ácido nucleico más allá de lo que se indica explícitamente de otro modo. Los términos "sonda" y "diana" se pueden aplicar de manera similar a otros analitos tales como proteínas, moléculas pequeñas, células o similares.

Como se usa en el presente documento, los términos "recubrir" y "recubrimiento" y términos similares, cuando se usan como verbo, pretenden significar proporcionar una capa o recubrimiento sobre una superficie. Al menos una porción de la superficie puede estar provista de una capa o cubierta. En algunos casos, toda la superficie se puede proporcionar con una capa o cubierta. En casos alternativos, solo una porción de la superficie estará provista de una capa o recubrimiento. El término "capa", cuando se usa para describir la relación entre una superficie y un material, pretende significar que el material está presente como una capa o cubierta en la superficie. El material puede sellar la superficie, por ejemplo, evitando el contacto de líquido o gas con la superficie. Sin embargo, el material no necesita formar un sello. Por ejemplo, el material puede ser poroso a líquido, gas o uno o más componentes transportados en un líquido o gas. Los materiales ejemplares que pueden revestir una superficie incluyen, pero no se limitan a, un gel, polímero, polímero orgánico, líquido, metal, una segunda superficie, plástico, sílice o gas.

Los sustratos estructurados de la presente divulgación que contienen matrices de ácidos nucleicos pueden usarse para cualquiera de una variedad de propósitos. Un uso particularmente deseable para los ácidos nucleicos es servir como sondas de captura que hibridan con ácidos nucleicos diana que tienen secuencias complementarias. Los ácidos nucleicos diana una vez hibridados con las sondas de captura pueden detectarse, por ejemplo, mediante un marcador reclutado para la sonda de captura. Los métodos para la detección de ácidos nucleicos diana mediante hibridación para capturar sondas son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, los descritos en las patentes de EE.UU. n.° 7.582.420; 6.890.741; 6.913.884 o 6.355.431 o las publicaciones de las solicitudes de patente de EE.UU. n.° 2005/0053980 A1; 2009/0186349 A1 o 2005/0181440 A1. Por ejemplo, un marcador puede reclutarse en una sonda de captura en virtud de la hibridación de la sonda de captura con una sonda diana que lleva el marcador. En otro ejemplo, se puede reclutar un marcador en una sonda de captura hibridando una sonda diana con la sonda de captura de modo que la sonda de captura se pueda extender mediante ligación a un oligonucleótido marcado (por ejemplo, mediante actividad ligasa) o mediante la adición de un nucleótido marcado (por ejemplo, a través de la actividad polimerasa).

También se puede utilizar una matriz de ácido nucleico en un procedimiento de secuenciación, como una técnica de secuenciación por síntesis (SBS). Brevemente, el SBS puede iniciarse poniendo en contacto los ácidos nucleicos diana con uno o más nucleótidos marcados, ADN polimerasa, etc. Aquellas características en las que se extiende un cebador usando el ácido nucleico diana como molde incorporarán un nucleótido marcado que puede detectarse. Opcionalmente, los nucleótidos marcados pueden incluir además una propiedad de terminación reversible que termina la extensión adicional del cebador una vez que se ha agregado un nucleótido a un cebador. Por ejemplo, un análogo de nucleótido que tiene un resto terminador reversible puede añadirse a un cebador de manera que no pueda producirse una extensión posterior hasta que se administre un agente de desbloqueo para eliminar el resto. Por tanto, para las realizaciones que utilizan terminación reversible, se puede administrar un reactivo de desbloqueo a la celda de flujo (antes o después de que se produzca la detección). Los lavados se pueden realizar entre las distintas etapas de entrega. A continuación, el ciclo puede repetirse n veces para extender el cebador en n nucleótidos, detectando así una secuencia de longitud n. Se describen ejemplos de procedimientos SBS, sistemas fluídicos y plataformas de detección que se pueden adaptar fácilmente para su uso con una matriz producida por los métodos de la presente divulgación, por ejemplo, en Bentley y col., Nature 456: 53-59 (2008), WO 04/018497; WO 91/06678; WO 07/123744; patentes de EE.UU. n.° 7.057.026; 7.329.492; 7.211.414; 7.315.019 o 7.405.281 y la publicación de la solicitud de patente de EE.UU. n.22008/0108082 A1.

Se pueden utilizar otros procedimientos de secuenciación que utilizan reacciones cíclicas, como la pirosecuenciación. La pirosecuenciación detecta la liberación de pirofosfato inorgánico (PPi) a medida que se incorporan nucleótidos particulares en una cadena de ácido nucleico naciente (Ronaghi, et al., Analytical Biochemistry 242 (1), 84-9 (1996); Ronaghi, Genome Res. 11 (1), 3-11 (2001); Ronaghi y col. Science 281 (5375), 363 (1998); patentes de EE.Uu . n.° 6.210.891; 6.258.568 y 6.274.320). En la pirosecuenciación, el PPi liberado puede detectarse convirtiéndolo en trifosfato de adenosina (ATP) por la ATP sulfurilasa, y el ATP resultante puede detectarse mediante fotones producidos por luciferasa. Por tanto, la reacción de secuenciación se puede controlar mediante un sistema de detección de luminiscencia. Las fuentes de radiación de excitación utilizadas para los sistemas de detección basados en fluorescencia no son necesarias para los procedimientos de pirosecuenciación. Los sistemas fluídicos, detectores y procedimientos útiles que se pueden usar para la aplicación de pirosecuenciación a matrices de la presente divulgación se describen, por ejemplo, en la solicitud de patente WIPO n.° Serie PCT/US11/57111, la publicación de la solicitud de patente de EE.UU. n.° 2005/0191698 A1, la patente de EE.UU. n.° 7.595.883 y la patente de EE.UU. n.° 7.244.559.

Las reacciones de secuenciación por ligación también son útiles, incluidas, por ejemplo, las descritas en Shendure y col. Science 309: 1728-1732 (2005); la patente de EE.UU. n.° 5.599.675; y la patente de EE.UU. n.° 5.750.341. Algunas realizaciones pueden incluir procedimientos de secuenciación por hibridación como se describe, por ejemplo, en Bains y col., Journal of Theoretical Biology 135 (3), 303-7 (1988); Drmanac y col., Nature Biotechnology 16, 54-58 (1998); Fodor y col., Science 251 (4995), 767-773 (1995); y WO 1989/10977. En los procedimientos de secuenciación por ligación y secuenciación por hibridación, los ácidos nucleicos que están presentes en los pocillos que contienen gel (u otras características cóncavas) se someten a ciclos repetidos de liberación y detección de oligonucleótidos. Los sistemas fluídicos para los métodos de SBS como se establece en el presente documento, o en las referencias citadas en el presente documento, se pueden adaptar fácilmente para la administración de reactivos para procedimientos de secuenciación por ligación o secuenciación por hibridación. Normalmente, los oligonucleótidos están marcados con fluorescencia y pueden detectarse usando detectores de fluorescencia similares a los descritos con respecto a los procedimientos de SBS en el presente documento o en las referencias citadas en el presente documento.

Algunas realizaciones pueden utilizar métodos que implican la monitorización en tiempo real de la actividad de la ADN polimerasa. Por ejemplo, las incorporaciones de nucleótidos pueden detectarse a través de interacciones de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) entre una polimerasa que lleva fluoróforo y nucleótidos marcados con Y -fosfato, o con guías de onda zeromodo. Las técnicas y los reactivos para la secuenciación basada en FRET se describen, por ejemplo, en Levene y col. Science 299, 682-686 (2003); Lundquist y col. Opt. Lett.

33, 1026-1028 (2008); Korlach y col. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 105, 1176-1181 (2008).

Otra aplicación útil para una serie de la presente divulgación es el análisis de expresión génica. La expresión génica se puede detectar o cuantificar utilizando técnicas de secuenciación de ARN, como las denominadas secuenciación de ARN digital. Las técnicas de secuenciación de ARN se pueden llevar a cabo usando metodologías de secuenciación conocidas en la técnica, tales como las expuestas anteriormente. La expresión génica también puede detectarse o cuantificarse usando técnicas de hibridación llevadas a cabo mediante hibridación directa a una matriz o usando un ensayo multiplex, cuyos productos se detectan en una matriz. También se puede usar una matriz de la presente divulgación para determinar los genotipos de una muestra de ADN genómico de uno o más individuos. Los métodos ejemplares para la expresión basada en matrices y el análisis de genotipado que se pueden llevar a cabo en una matriz de la presente divulgación se describen en las patentes de EE.UU. n.° 7.582.420; 6.890.741; 6.913.884 o 6.355.431 o las publicaciones de las solicitudes de patente de EE.UU. n.22005/0053980 A1; 2009/0186349 A1 o 2005/0181440 A1.

Varias aplicaciones para matrices de la presente divulgación se han ejemplificado anteriormente en el contexto de la detección de conjuntos, en el que múltiples copias de un ácido nucleico diana están presentes en cada característica y se detectan juntas. En realizaciones alternativas, se puede detectar un solo ácido nucleico, ya sea un ácido nucleico diana o un amplicón del mismo, en cada característica. Por ejemplo, un pocillo que contiene gel (u otra característica cóncava) se puede configurar para contener una única molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos diana que se va a detectar. Se puede usar cualquiera de una variedad de técnicas de detección de una sola molécula, incluidas, por ejemplo, modificaciones de las técnicas de detección de conjuntos expuestas anteriormente para detectar los sitios con una resolución aumentada o usando marcadores más sensibles. Otros ejemplos de métodos de detección de una sola molécula que se pueden utilizar se establecen en la publicación de la solicitud de patente de EE.UU. n.° 2011/0312529 A1; la solicitud de patente de EE.UU. n.° serie 61/578.684; y la solicitud de patente de EE.UU. n.° serie 61/540.714.

Como se usa en el presente documento, el término "pocillo" se refiere a una característica cóncava discreta en un soporte sólido que tiene una abertura en la superficie que está completamente rodeada por la región o regiones intersticiales de la superficie. Los pocillos pueden tener una variedad de formas en su apertura en una superficie que incluyen, entre otras, redondas, elípticas, cuadradas, poligonales, en forma de estrella (con cualquier número de vértices), etc. La sección transversal de un pocillo tomada ortogonalmente con la superficie puede ser curvo, cuadrado, poligonal, hiperbólico, cónico, angular, etc.

Como se usa en el presente documento, el término "característica cóncava", cuando se usa en referencia a un soporte sólido, se refiere a un rebaje o hendidura en el soporte sólido. Las características cóncavas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, un pocillo, pocillo, orificio, depresión, canal o seno. Una característica cóncava puede tener opcionalmente una sección transversal curvada (en la dimensión ortogonal a la superficie del soporte sólido); sin embargo, también es posible una sección transversal con una o más secciones lineales, ángulos o esquinas. También son posibles secciones transversales con combinaciones de secciones curvas y lineales. Generalmente, una característica cóncava no necesita pasar completamente a través del soporte sólido, por ejemplo, teniendo en su lugar una superficie inferior o un punto en el sustrato.

Las realizaciones expuestas a continuación y enumeradas en las reivindicaciones pueden entenderse a la vista de las definiciones anteriores.

Ejemplo 1

SPR localizado en superficies sin patrón

Este ejemplo describe el uso de resonancia de plasmón de superficie localizada (SPR) para aumentar la intensidad de fluorescencia del ADN amplificado en una superficie sólida ("grupos" de ADN). En este ejemplo, los resultados se muestran en una superficie de vidrio sin patrón recubierta con acrilamida sin silano (SFA) que se enriqueció con nanopartículas de Au. A continuación, se amplificaron los grupos de ADN en esta superficie.

En la figura 1 se presenta un ejemplo de flujo de trabajo. En el primer panel mostrado, SFA enriquecido con nanopartículas de Au 10 se recubre sobre una superficie de vidrio 14 y los cebadores de amplificación (no mostrados) se injertan en el SFA. En el segundo panel que se muestra, la plantilla de ADN 18 se siembra sobre la superficie o material de gel. La plantilla de ADN 18 sembrada luego se amplifica en la superficie como se muestra en el tercer panel, formando grupos 20 de ADN amplificado, con algunos grupos formados directamente sobre nanopartículas de Au 10, mientras que otros grupos se forman en una porción de la superficie que no contiene Au nanopartículas. Como se muestra en el cuarto panel, la fluorescencia 22 de cada grupo se detecta durante una secuenciación por reacción de síntesis. La proximidad a las nanopartículas de Au da como resultado una mayor fluorescencia en comparación con la señal emitida por los grupos que no están cerca de las nanopartículas de Au.

El flujo de trabajo descrito en la figura 1 se llevó a cabo en una superficie de celda de flujo de vidrio D263 con 8 carriles. Los carriles 1,2 eran carriles de control (sin nanopartículas). Los carriles 3-6 se enriquecieron con una concentración de 50 nM de nanopartículas esféricas de Au de 6 nm. La alta concentración de NP de Au impidió la polimerización del SFA revestido in situ en estos carriles, evitando el injerto. Los carriles 7, 8 se recubrieron con SFA enriquecido con nanopartículas de Au de concentración 10 nM. Se observaron intensidades de fluorescencia más altas en los carriles 7, 8 en relación con los carriles de control. Los resultados de la secuenciación indicaron que la intensidad de la base A aumentó ~ 27 % en relación con los carriles de control. Se observó un aumento de -24 % en la intensidad en promedio para las 4 bases en relación con los carriles de control.

Estos datos demuestran que los grupos en las proximidades de nanopartículas de Au exhiben una mayor fluorescencia debido a la interacción de la luz incidente con las nanopartículas de Au subyacentes, lo que induce plasmones de superficie localizados. Los grupos que no se encontraban en las proximidades de las nanopartículas no mostraron esta fluorescencia mejorada.

Ejemplo 2

Fluorescencia mejorada en sustratos estampados con nanopartículas

Las nanoestructuras plasmónicas también se pueden combinar con sustratos de nanopocillos modelados para mejorar la fluorescencia. En este ejemplo, la mejora de la fluorescencia se logró utilizando nanopartículas en nanopocillos. Se formaron nanopartículas en nanopocillos utilizando un nuevo enfoque de reflujo de Sn/Au. Como se ilustra en la figura 3A, se revistió primero una película uniforme de Sn/Au sobre el sustrato de nanopocillo seguido de un proceso de recocido térmico a 400 °C que resultó en el reflujo de la película en pequeñas nanopartículas (ver figuras 3B y 3C). Controlando el espesor de la película inicial, se manipuló el tamaño de las nanopartículas. Se muestran ejemplos de esto en las figuras 3B y 3C para espesores de película inicial de 6 nm y 10 nm, respectivamente, dando como resultado partículas de > 50 nm de diámetro y partículas de < 30 nm respectivamente.

Después de la formación de nanopartículas, se usó pulido mecánico para eliminar las nanopartículas de las regiones intersticiales, lo que resultó en solo partículas en los pocillos. Una ventaja de esta técnica es la eficiencia de carga resultante del hecho de que las nanopartículas se cargan en cada pocillo. Una ventaja adicional de esta técnica es que la amplia distribución de tamaños de nanopartículas proporciona una mejora de la fluorescencia de amplio espectro en comparación con la mejora en un intervalo pequeño de longitudes de onda como se logra típicamente usando un solo tamaño de nanopartícula.

Los experimentos anteriores se repitieron 3 veces en 3 celdas de flujo idénticas. En 3 experimentos separados, se observó una mejora de la fluorescencia para las 4 bases en la Región Sn/Au de ~ 6 nm de espesor con respecto al control D263, correspondiente a nanopartículas de diámetro ~ 50 nm y más en nanopocillos. En promedio, la intensidad de la base aumentó -37 % en relación con el control en estos experimentos con C, G, T experimentando una mejora fuerte, pero A experimentando una mejora más débil. No se observó una mejora de la fluorescencia en la región de Sn/Au de -10 nm de espesor, correspondiente a nanopartículas más pequeñas de < 30 nm.

Las figuras 6 y 7 presentan resultados ejemplares. La figura 6 expone los resultados de la secuenciación usando amplificación isotérmica seguida de secuenciación SBS. La secuenciación por síntesis se realizó durante 26 ciclos y se comparó con una región de control que carecía de deposición de Sn/Au. Se midió la intensidad de la agrupación por ciclo para cada una de las cuatro bases marcadas con fluorescencia en función del espesor de las partículas de Sn/Au. Los sustratos con patrón tenían pocillos de -500 nm de diámetro con un paso de 850 nm. Se depositaron diferentes espesores de Sn/Au en diferentes regiones de una sola celda de flujo y luego se recocieron. La combinación de diferentes espesores de película y una región de control en cada carril permitió una comparación directa de intensidades de diferentes regiones de la misma celda de flujo, desacoplando así las variaciones químicas. Se observaron agrupaciones en las 3 regiones de cada carril, lo que confirma que las nanopartículas de Sn/Au refluidas de varios tamaños soportan la agrupación. En la figura 7 se muestra una comparación de la mejora de la intensidad del grupo normalizado (sobre el control) en estas regiones en el ciclo 1 y el ciclo 26. En la figura 6, la línea superior ilustra la relación entre intensidad y número de ciclo para partículas de 6 nm, la línea media ilustra la relación entre intensidad y número de ciclo para vidrio, y la línea inferior ilustra la relación entre intensidad y número de ciclo para partículas de 10 nm.

Estos datos demuestran que la deposición de nanopartículas en pocillos de una superficie modelada proporciona una mejora de la intensidad de la fluorescencia durante una secuenciación por reacción de síntesis.

Ejemplo 3

Fluorescencia mejorada en sustratos estampados con nanotapones de oro

En este ejemplo, se mejoró la intensidad de la fluorescencia en los nanopocillos utilizando nanotapones de oro depositados en el fondo de los pocillos. La fabricación de nanotapones 60 de Au en nanopocillos 62 se ilustra en la figura 8A. Brevemente, se depositó Au a través de una celda de flujo 64 con patrón, dando como resultado una capa 66 de Au en el fondo de cada pocillo 62 y en cada región intersticial 68. El pulido mecánico eliminó el Au depositado en las regiones intersticiales 68, dejando tapones de Au 60 sólo en el fondo de los pocillos 62. La figura 8B muestra una imagen SEM de los nanotapones resultantes. Se ve un tapón de oro sólido (Au) en el fondo del pocillo con nanopartículas de Au en las paredes y en las regiones intersticiales. Esta estructura simple también permite la mejora de la intensidad de la fluorescencia del grupo, como lo demuestra el experimento de secuenciación que se describe a continuación.

Se llevó a cabo una secuenciación por ejecución de síntesis en una celda de flujo con patrón que tenía nanotapones en algunos carriles y una región de control que carecía de deposición de Au. Se midió la intensidad de la agrupación por ciclo para cada una de las cuatro bases marcadas con fluorescencia. La figura 9B resume la mejora resultante de la intensidad del grupo para nanotapones de Au recocidos en nanopocillos. Estos datos demuestran que la intensidad de la señal aumenta con los nanotapones en los pocillos.

Varias realizaciones utilizan una o más nanoestructuras para amplificar la energía electromagnética en un sitio de reacción. Para realizaciones que utilizan una pluralidad de nanoestructuras (por ejemplo, dos o más nanoestructuras), la pluralidad de nanoestructuras puede denominarse amplificador de unión. Como se usa en el presente documento, los términos "nanoestructura" y "nanopartícula" se usan indistintamente para referirse a una estructura que tiene una dimensión mayor (por ejemplo, altura, ancho, diámetro) en el intervalo de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 1000 nm, incluyendo cualquier número entero o valor no entero entre 1 nm y 1000 nm. En realizaciones típicas, la nanopartícula es una partícula metálica o una partícula de silicio. En algunas realizaciones, el núcleo de nanopartículas es una partícula esférica o casi esférica de 20-200 nm de diámetro. En algunas realizaciones, el intervalo es de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 50 nm (por ejemplo, aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 nm).

Las nanoestructuras anisotrópicas (por ejemplo, estructuras no esféricas) pueden tener una longitud y una anchura o, para algunas realizaciones, un diámetro. En algunas realizaciones, la longitud de la nanoestructura anisotrópica es la mayor dimensión de la nanoestructura. En algunas realizaciones, la longitud de una nanopartícula anisotrópica es una dimensión paralela al plano de la abertura en la que se produjo la nanopartícula. En algunas realizaciones, la longitud de una nanopartícula anisotrópica es la dimensión perpendicular al plano de la abertura en la que se produjo la nanopartícula. En el caso de nanoestructuras anisotrópicas, la nanoestructura puede tener una anchura o diámetro en el intervalo de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 750 nm. En otras realizaciones, la nanoestructura tiene una anchura o diámetro de aproximadamente 350 nm o menos. En otras realizaciones, la nanopartícula tiene una anchura o diámetro de 250 nm o menos y en algunas realizaciones, una anchura o diámetro de 100 nm o menos. En algunas realizaciones, la anchura o diámetro está entre 15 nm y 300 nm.

En algunas realizaciones, la nanopartícula tiene una longitud de aproximadamente 10-750 nm. En algunas realizaciones, las nanoestructuras tienen una forma preseleccionada y pueden ser, por ejemplo, un nanotubo, un nanoalambre, nanoesfera o cualquier forma que comprenda las dimensiones descritas anteriormente (por ejemplo, forma triangular, cuadrada, rectangular o poligonal en 2 dimensiones, o cuboide, piramidal, cilíndrico, esférico, discoide o hemisférico en las 3 dimensiones). Algunos ejemplos de nanoestructuras incluyen, por ejemplo, nanoantenas de pajarita, nanoesferas, nanopiramides, nanocapas, nanobarras, nanocables, nanoanillos, nanotapones, nanorejillas y similares. Los dímeros y trímeros de nanoestructuras preformados también se pueden cargar en pocillos y tienen la ventaja de controlar con precisión el espaciado de nanopartículas.

Las nanoestructuras pueden fabricarse en una superficie o preformarse y luego cargarse en cavidades de reacción, como pocillos (por ejemplo, nanopocillos). Ejemplos de tales estructuras incluyen nanotapones plasmónicos fabricados en la parte inferior de nanopocillos, antenas de pajarita y de cavidad en nanopocillos, nanorejillas metálicas en las que se podrían formar nanopocillos, nanoestructuras refluidas en nanopocillos o una combinación de algunos o todos los anteriores. Un ejemplo sería un nanotapón de metal en un nanopocillo con nanoestructuras en las paredes formadas mediante un proceso de evaporación por haz de electrones. Los amplificadores de unión o construcciones (dímeros, n-meros) también pueden colocarse dentro de las cavidades de reacción. Dichos métodos permiten un control subnanométrico preciso sobre los espacios de nanoestructura y se pueden formar a gran escala utilizando el autoensamblaje de abajo hacia arriba.

El espacio entre dos nanoestructuras en una superficie puede ser cualquier distancia. En algunas realizaciones, el espaciamiento puede ser un múltiplo de una longitud de onda de energía de luz incidente, tal como una emisión particular o una longitud de onda de excitación en espectroscopía de fluorescencia. El espaciado puede ser, por ejemplo, 1 A, 2 A, 3 A, 4 A u otro múltiplo de una longitud de onda elegida (A) de energía de luz incidente. Por lo tanto, usando como ejemplo una longitud de onda de emisión (A) de 532 nm, el espaciamiento entre nanoestructuras puede ser de aproximadamente 532 nm (1 A), aproximadamente 1064 nm (2 A) u otro múltiplo de la longitud de onda de emisión. En algunas realizaciones, el espaciado puede ser una fracción de la longitud de onda de la energía de la luz incidente, tal como una emisión particular o una longitud de onda de excitación en la espectroscopia de fluorescencia. La separación puede ser, por ejemplo, 1 A, 1/2 A, 1/3 A, 1/4 A u otro múltiplo de una longitud de onda elegida de energía de luz incidente. Así, usando como ejemplo una longitud de onda de emisión de (A) 532 nm, el espaciamiento entre nanoestructuras puede ser de aproximadamente 532 nm (1 A), 266 nm (1/2 A), 133 nm (1/3 A) u otra fracción. de la longitud de onda de emisión.

En algunas formas de realización, las nanoestructuras pueden denominarse "nanoestructura plasmónica" o "estructura nanoplásmica". Estos términos pueden usarse indistintamente y se refieren a cualquier estructura independiente que exhiba la característica de resonancia de plasmón de la estructura, incluidas (pero sin limitarse a) tanto nanoestructuras, nanoestructuras y combinaciones o asociaciones de nanoestructuras.

El término "nanoantena", como se usa en el presente documento, incluye una nanoestructura o una pluralidad de nanoestructuras (o amplificador de unión) que actúa para amplificar la energía electromagnética, como la energía luminosa. Como se usa en el presente documento, una nanoantena (o amplificador de unión) no necesariamente exhibe características de resonancia de plasmón. En algunas realizaciones, una nanoantena no comprende sustancialmente un material resonante de plasmón. Así, en algunas realizaciones, se presentan nanoantenas que están hechas de un material no metálico pero que exhiben características de amplificación de energía electromagnética. Las nanoestructuras presentadas en el presente documento pueden tener cualquier forma y tamaño adecuados para producir la amplificación de energía deseada. Algunas formas ejemplares de nanoantenas incluyen, por ejemplo, nanoantenas de pajarita, nanoesferas, nanopiramides, nanocapas, nanobarras, nanocables, nanoanillos, nanotapones, nanorejillas y similares. Se apreciará que cualquiera de varios métodos conocidos puede ser adecuado para la fabricación y/o la deposición de nanoantenas sobre un soporte sólido. Los métodos para la fabricación de nanoantenas son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, los métodos descritos en el presente documento para la fabricación y deposición de nanopartículas.

Las nanoestructuras pueden comprender cualquier material adecuado para su uso en los métodos y composiciones aquí descritos, por ejemplo, cualquier tipo de material que presente resonancia de plasmón superficial (SPR). En determinadas realizaciones preferidas, la nanopartícula comprende un material resonante de plasmón. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, nanoestructuras metálicas. Por ejemplo, las nanoestructuras pueden comprender un metal como uno o más de oro (Au), plata (Ag), estaño (Sn), rodio (Rh), rutenio (Ru), paladio (Pd), osmio (Os), iridio (Ir), platino (Pt), titanio (Ti) y aluminio (Al), cromo (Cr), cobre (Cu) o cualquier otro metal adecuado. Las nanoestructuras se pueden formar a partir de un solo material como, por ejemplo, un solo metal. Adicional o alternativamente, las nanoestructuras se pueden formar a partir de una combinación de dos o más materiales diferentes, tales como, por ejemplo, dos o más metales. Por ejemplo, las nanoestructuras pueden comprender una mezcla de metal/metal como Sn/Au o Ag/Au. Alternativa o adicionalmente, se pueden aplicar nanoestructuras en capas verticales, tales como estructuras multicapa del tipo metal-aislante-metal. Los ejemplos incluyen silicio dopado de tipo p, silicio dopado de tipo n y arseniuro de galio. En realizaciones particulares, las nanoestructuras se pueden formar a partir de un polímero que está recubierto por un material resonante de plasmón y/o un material metálico.

La formación de nanoestructuras sobre un soporte sólido se puede realizar usando cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica. Las nanoestructuras se pueden formar utilizando el autoensamblaje ascendente de nanoestructuras plasmónicas y nanoantenas en el sustrato de secuenciación. Por ejemplo, se puede utilizar cualquiera de varios métodos para la deposición de capas de un material, como los descritos por Gaspar y col. (Scientific Reports, 2013, 3, 1469). Los procesos de fabricación de capas que pueden usarse para formar las nanoestructuras incluyen fotolitografía, grabado, deposición catódica, evaporación, fundición (por ejemplo, recubrimiento por rotación), deposición química en fase vapor, electrodeposición, epitaxia, oxidación térmica, deposición física en fase vapor y similares. En algunas realizaciones, las nanoestructuras se pueden formar usando una técnica de sombras. En algunas realizaciones, las nanoestructuras se pueden formar usando nanolitografía, tal como litografía por nanoimpresión (NIL).

En las realizaciones ejemplares descritas en el presente documento, las nanoestructuras se pueden preformar y mezclar en una composición de tipo coloide con un material de gel, que se deposita sobre una superficie. Alternativa o adicionalmente, las nanoestructuras se pueden depositar primero en una superficie seguido de la deposición de un material de gel sobre las nanoestructuras. En otras realizaciones, se puede depositar un material de gel sobre una superficie y se depositan nanoestructuras sobre el material de gel.

En algunas realizaciones, las nanoestructuras se forman en un pocillo (o característica cóncava) de una superficie sólida. Se puede depositar una película de material de partida como Sn/Au sobre una superficie sólida que contiene nanopocillos, seguido de un recocido térmico. En algunas realizaciones, el recocido térmico se puede utilizar para promover la formación de nanoestructuras a medida que la película se fusiona en partículas discretas. El tamaño de las nanopartículas puede ser función del espesor de la película inicial. Una etapa de pulido adicional después del recocido térmico puede dar como resultado nanoestructuras solo en los pocillos, dejando las regiones intersticiales sustancialmente vacías de nanoestructuras. Las nanoestructuras en las regiones intersticiales se pueden eliminar mediante, por ejemplo, pulido químico y/o mecánico. Se observa una distribución de tamaños de nanopartículas en cada nanopocillo que permite una mejora de la fluorescencia de amplio espectro.

En algunas realizaciones, se pueden formar nanoestructuras como un nanorrenado a lo largo de la pared de los pocillos (o características cóncavas) en una superficie. Las nanoestructuras se pueden fabricar usando cualquiera de varias metodologías conocidas en la técnica. Por ejemplo, el Au se puede depositar usando deposición catódica. En una realización, la deposición conforme de una capa de Au de ~ 65 nm puede ir seguida de un proceso de grabado con iones reactivos (RIE). La capa de Au restante se ubicó a lo largo de las paredes de los nanopocillos, formando nanoanillos en cada uno de los nanopocillos.

Los términos "luz de excitación" y "emisiones de luz" significan energía electromagnética y se utilizan para diferenciar la fuente de energía electromagnética. La luz de excitación generalmente se proporciona desde una fuente de luz (por ejemplo, láser) que se coloca a una distancia del sitio de reacción. Por ejemplo, para las realizaciones que incluyen cavidades de reacción, la fuente de luz se puede colocar fuera de las cavidades de reacción. Sin embargo, las emisiones de luz son generadas típicamente por un emisor dentro o en los sitios de reacción. El emisor puede ser, por ejemplo, un fluoróforo. Se pueden configurar realizaciones particulares para amplificar la energía electromagnética a cualquier longitud de onda entre 300 nm y 750 nm (por ejemplo, 300 nm, 301 nm, 302 nm, 303 nm, 304 nm, 305 nm, 306 nm, 307 nm, 308 nm ... 745 nm, 746 nm, 747 nm, 748 nm, 749 nm y 750 nm). Como se usa en el presente documento, el término "longitud de onda" no se limitará a una sola longitud de onda a menos que se indique expresamente que constituye "una sola longitud de onda" o "solo una longitud de onda". En cambio, el término "longitud de onda" abarcará un intervalo estrecho de longitudes de onda ubicadas alrededor de una longitud de onda deseada u objetivo (por ejemplo, 532 nm ± 10 nm, 532 nm ± 5 nm, 660 nm ± 10 nm, 660 nm ± 5 nm).

Las nanoestructuras de cada amplificador de unión pueden configurarse entre sí para amplificar la energía electromagnética de la manera designada. Por ejemplo, una distancia que separa las nanoestructuras de un amplificador de unión correspondiente puede basarse en la energía electromagnética que se desea amplificar. Las nanoestructuras del amplificador de unión pueden configurarse para una longitud de onda particular (por ejemplo, una banda estrecha de longitudes de onda). Por ejemplo, se pueden configurar una o más realizaciones para amplificar la energía electromagnética que tiene una longitud de onda de 532 nm. Se pueden configurar una o más realizaciones para amplificar la energía electromagnética que tiene una longitud de onda de 660 nm. En algunas realizaciones, los amplificadores de unión pueden ser capaces de amplificar múltiples longitudes de onda o intervalos más amplios de longitudes de onda.

En algunas realizaciones, el amplificador de unión tiene una configuración polarizada de manera que una respuesta del sitio de reacción se basa en una polarización de la energía electromagnética. Por ejemplo, el amplificador de unión puede configurarse para responder preferentemente a energía electromagnética que tiene una o más polarizaciones predeterminadas. Cuando el amplificador de unión está iluminado por energía electromagnética que tiene una polarización predeterminada, las emisiones de luz pueden tener una intensidad de señal que sea mayor que la intensidad de señal de las emisiones de luz si la energía electromagnética no tuviera la polarización predeterminada. Por ejemplo, cuando el amplificador de unión está iluminado por energía electromagnética que tiene una polarización predeterminada, las emisiones de luz pueden tener una intensidad de señal que es X. En este ejemplo, el amplificador de unión puede tener un momento dipolar que es esencialmente paralelo a la energía electromagnética con la polarización predeterminada. Como se usa en el presente documento, sustancialmente paralelo puede ser /- 30° de ser paralelo al momento dipolar. En algunas realizaciones, sustancialmente paralelo puede ser /- 25° de ser paralelo al momento dipolar o /- 20° de ser paralelo al momento dipolar. En realizaciones particulares, esencialmente paralelo puede ser /- 15° de ser paralelo al momento dipolar o /- 10° de ser paralelo al momento dipolar. En realizaciones más particulares, esencialmente paralelo puede ser /- 8° desde ser paralelo al momento dipolar, /- 5° desde ser paralelo al momento dipolar, o /- 3° desde ser paralelo al momento dipolar.

Cuando el amplificador de unión está iluminado por energía electromagnética que no tiene la polarización predeterminada, las emisiones de luz pueden tener una intensidad de señal que es 0,4X o menos (40 % o menos) que la intensidad de la señal cuando el momento dipolar es esencialmente paralelo al energía electromagnética. En este ejemplo, el amplificador de unión puede tener un momento dipolar que es esencialmente perpendicular a la energía electromagnética con la polarización predeterminada. Como se usa en el presente documento, sustancialmente perpendicular puede ser /- 30° desde ser perpendicular (90°) al momento dipolar. En algunas realizaciones, sustancialmente perpendicular puede ser /- 25° de ser perpendicular al momento dipolar o /- 20° de ser perpendicular al momento dipolar. En algunas realizaciones, esencialmente perpendicular puede ser /- 15° de ser perpendicular al momento dipolar o /- 10° de ser perpendicular al momento dipolar. En realizaciones más particulares, esencialmente perpendicular puede ser /- 8° desde ser perpendicular al momento dipolar, /- 5° desde ser perpendicular al momento dipolar, o /- 3° desde ser perpendicular al momento dipolar.

La figura 10 es una sección transversal de una porción de un sustrato estructurado 100 formado de acuerdo con una realización. El sustrato estructurado 100 incluye un cuerpo de sustrato 102, que también puede denominarse soporte sólido. El cuerpo de sustrato (o soporte sólido) 102 tiene un lado activo 104. El lado activo 104 incluye una pluralidad de sitios de reacción 106 y una superficie lateral 105 que se extiende entre los sitios de reacción 106. Como se muestra, los sitios de reacción 106 son cavidades o pocillos de reacción (por ejemplo, nanopocillos). Por consiguiente, los sitios de reacción 106 se denominarán en lo sucesivo cavidades de reacción 106, pero se entiende que otras realizaciones pueden incluir sitios de reacción. Las cavidades de reacción 106 pueden tener dimensiones similares a los nanopocillos descritos aquí. Por ejemplo, las cavidades de reacción 106 pueden tener un diámetro o anchura medidos a lo largo de un eje lateral 191. El diámetro o la anchura de las cavidades de reacción puede ser inferior a 5000 nm. En algunas realizaciones, el diámetro o anchura de las cavidades de reacción es menor de 4000 nm, menor de 3000 nm, menor de 2000 nm o menor de 1000 nm. En realizaciones particulares, el diámetro o anchura de las cavidades de reacción es menor de 900 nm, menor de 800 nm, menor de 700 nm o menor de 600 nm. En realizaciones más particulares, el diámetro o anchura de las cavidades de reacción es menos de 550 nm, menos de 500 nm, menos de 450 nm o menos de 400 nm. Aún en realizaciones más particulares, el diámetro o anchura de las cavidades de reacción es menos de 350 nm, menos de 300 nm, menos de 250 nm, menos de 200 nm, menos de 150 nm o menos de 100 nm. Los sitios de reacción descritos en el presente documento pueden tener diámetros o anchuras similares.

Las cavidades de reacción 106 están separadas entre sí por regiones intersticiales 118 del cuerpo de sustrato 102. Las regiones intersticiales 118 son áreas a lo largo del lado activo 104 o partes del cuerpo del sustrato 102 que separan las cavidades de reacción 106 entre sí. La superficie lateral 105 se extiende a lo largo de las regiones intersticiales 118. En algunas realizaciones, la pluralidad de cavidades de reacción 106 forman una matriz densa de sitios de reacción 106 de manera que las cavidades de reacción adyacentes 106 están separadas, por ejemplo, por menos de 1000 nm. En realizaciones más particulares, las cavidades de reacción adyacentes 106 pueden estar separadas por menos de 900 nm, menos de 800 nm, menos de 700 nm o menos de 600 nm. En realizaciones más particulares, las cavidades de reacción adyacentes 106 pueden estar separadas por menos de 500 nm, menos de 400 nm, menos de 300 nm o menos de 200 nm. En realizaciones más particulares, las cavidades de reacción adyacentes 106 pueden estar separadas por menos de 150 nm, menos de 100 nm o menos de 50 nm. Los sitios de reacción descritos en el presente documento pueden tener distancias de separación similares. En algunas realizaciones, un espaciado de centro a centro 119 entre cavidades de reacción adyacentes 106 puede ser menor de 1000 nm. En realizaciones más particulares, la espaciado de centro a centro 119 puede ser menor de 700 nm, menor de 600 nm, menor de 500 nm o menor de 450 nm. En realizaciones más particulares, la espaciado de centro a centro 119 puede ser menor de 400 nm, menor de 350 nm, menor de 300 nm, menor de 250 nm o menor de 200 nm. Los sitios de reacción descritos en el presente documento pueden tener espacios de centro a centro.

En la realización ilustrada, las regiones intersticiales 118 forman una superficie lateral plana continua 105, pero las regiones intersticiales 118 pueden incluir superficies no planas en otras realizaciones. Las regiones intersticiales 118 pueden incluir un material de superficie que difiera del material de las cavidades de reacción 106 y puede aislar funcionalmente las cavidades de reacción 106 entre sí. En la realización ilustrada, solo se muestran dos cavidades de reacción 106 a lo largo del lado activo 104. Debe entenderse, sin embargo, que las cavidades de reacción 106 pueden ser parte de una matriz de sitios de reacción que pueden incluir cientos, miles o millones de cavidades (o sitios) de reacción.

Las cavidades de reacción 106 son típicamente características cóncavas que forman una depresión o hendidura a lo largo del lado activo 104. Las cavidades de reacción 106 pueden ser, por ejemplo, pocillos, hoyos, canales, rebajes y similares. Sin embargo, debe entenderse que otras realizaciones pueden incluir sitios de reacción que no se encuentran dentro de las cavidades. Por ejemplo, los sitios de reacción se pueden distribuir a lo largo de una superficie plana. Tales realizaciones se describen en la solicitud provisional de EE.UU. n.° 61/920.244.

El cuerpo de sustrato 102 puede estar formado por una o más capas apiladas. En la realización ilustrada, el cuerpo de sustrato 102 incluye una capa base 112 y una capa de cavidad 114. La capa base 112 puede ser, por ejemplo, una oblea de vidrio (SiÜ2). La capa de cavidad 114 puede ser un polímero. Sin embargo, el cuerpo de sustrato 102 puede incluir otras capas en realizaciones alternativas.

Como se usa en el presente documento, el término "capa" no se limita a un solo cuerpo continuo de material a menos que se indique lo contrario. Por ejemplo, cada capa puede formarse a partir de múltiples subcapas del mismo o de diferentes materiales. Además, cada capa puede incluir una o más características de diferentes materiales ubicados en ella o que se extienden a través de ella. Las diferentes capas se pueden formar usando procesos conocidos de fabricación de capas, tales como fotolitografía, grabado, deposición catódica, evaporación, colada (por ejemplo, recubrimiento por rotación), deposición química de vapor, electrodeposición, epitaxia, oxidación térmica, deposición física de vapor y similares. También se pueden formar una o más capas usando nanolitografía, tal como litografía por nanoimpresión (NIL). Como se usa en el presente documento, el término "sustrato de trabajo" incluye una o más capas apiladas en las que al menos una de las capas se procesa para formar un sustrato estructurado a partir del sustrato de trabajo. El sustrato de trabajo puede formar un soporte sólido o un cuerpo de sustrato que está configurado para recibir uno o más de otros elementos para formar el sustrato estructurado. Por ejemplo, el sustrato de trabajo puede recibir nanopartículas y/o un material orgánico (por ejemplo, material de gel) para formar un sustrato estructurado.

Como se muestra en la figura 10, una cavidad de reacción tiene una sección transversal que se toma perpendicular al lado activo 104. La sección transversal puede incluir secciones curvas, secciones lineales, ángulos, esquinas. Generalmente, una cavidad de reacción no necesita pasar completamente a través de una o más capas. Por ejemplo, cada una de las cavidades de reacción 106 tiene al menos una pared lateral 124 que se extiende entre el lado activo 104 y una superficie inferior 126 de la cavidad de reacción 106. Tanto la pared lateral 124 como la superficie inferior 126 están definidas por la capa de cavidad 114. En realizaciones alternativas, la capa base 112 (u otra capa) puede definir el fondo 126 de la cavidad de reacción 106.

Las cavidades de reacción 106 se abren hacia el lado activo 104 de manera que las cavidades de reacción 106 son accesibles a lo largo del lado activo 104. Por ejemplo, las cavidades de reacción 106 pueden ser capaces de recibir material de gel y/o fluido a lo largo del lado activo 104 durante la fabricación del sustrato estructurado 100 o cuando el sustrato estructurado 100 se usa durante el análisis. El lado activo 104 también puede recibir una luz de excitación 108 de una fuente de luz (no mostrada) y/o enfrentarse a un componente óptico (no mostrado), tal como una lente de objetivo, que detecta las emisiones de luz 110 de las cavidades de reacción.

Cada una de las cavidades de reacción 106 puede incluir al menos una nanoestructura 116. Las regiones intersticiales 118 pueden carecer sustancialmente de nanoestructuras. En la realización ilustrada de la figura 10, cada una de las cavidades de reacción 106 incluye una pluralidad de nanoestructuras 116. Sin embargo, debe entenderse que las realizaciones alternativas pueden incluir solo una única nanoestructura. La pluralidad de nanoestructuras 116 puede formar un conjunto de nanoestructuras, que en lo sucesivo se denominará amplificador de unión 120. El amplificador de unión 120 se coloca dentro de cada una de las cavidades de reacción 106 y está configurado para al menos una de amplificar la energía electromagnética que se propaga a la correspondiente cavidad de reacción o amplificar la energía electromagnética que se genera dentro de la correspondiente cavidad de reacción.

Como se usa en el presente documento, un "conjunto de nanoestructuras" o "amplificador de unión" incluye una pluralidad de nanoestructuras que están configuradas para al menos una de amplificar la energía electromagnética que incide en el sitio discreto (por ejemplo, la cavidad de reacción) o amplificar la energía electromagnética que es generado en el sitio discreto. Por ejemplo, la energía electromagnética puede ser la luz de excitación 108 que se propaga desde un entorno exterior hacia una cavidad de reacción 106, en la que la luz de excitación es absorbida por un emisor (por ejemplo, fluoróforo) que está asociado con una sustancia biológica. Como otro ejemplo, la energía electromagnética puede ser emisiones de luz 110 que son emitidas por las sustancias biológicas. Más específicamente, después de ser excitados, los fluoróforos pueden emitir la energía electromagnética (por ejemplo, emisiones de luz 110) que luego es amplificada por el conjunto 120 de nanoestructuras. En algunas realizaciones, el amplificador de unión 120 también puede denominarse nanoantena, porque las nanoestructuras operan colectivamente para amplificar y transmitir las emisiones de luz 110 lejos de los sitios de reacción.

Un amplificador de unión puede incluir dos o más nanoestructuras que operan en concierto para amplificar la energía electromagnética. Como se describe en el presente documento, en algunas realizaciones, un amplificador de unión puede configurarse para amplificar preferentemente un tipo de energía electromagnética o, más específicamente, energía electromagnética que tiene una longitud de onda predeterminada. Por ejemplo, un amplificador de unión puede tener un mayor efecto de amplificación sobre las emisiones de luz que sobre la luz de excitación o viceversa. No obstante, en algunas realizaciones, un amplificador de unión puede amplificar tanto las emisiones de luz como la luz de excitación.

Como se usa en el presente documento, cuando un amplificador de unión está "configurado para amplificar energía electromagnética", cada una de las nanoestructuras puede tener una o más cualidades tales que el amplificador de unión opere colectivamente para amplificar la energía electromagnética. Las cualidades pueden incluir, por ejemplo, una composición de material de la nanoestructura, una forma de la nanoestructura, un tamaño de la nanoestructura y una posición de la nanoestructura con respecto a otras nanoestructuras en el conjunto. Por ejemplo, las nanoestructuras 116 adyacentes pueden tener una distancia 128 entre ellas que está configurada para amplificar la energía electromagnética que está confinada entre ellas. Sin desear estar ligado a una teoría particular, la amplificación resultante en las emisiones de luz puede deberse a una combinación de resonancia de plasmón superficial localizado y procesos de transferencia de energía resonante.

También mostrada en la figura 10, las cavidades de reacción 106 pueden incluir un material orgánico 122 dispuesto dentro de las cavidades de reacción 106. El material orgánico 122 puede cubrir las nanoestructuras 116. En algunas realizaciones, el material orgánico 122 está configurado para retener o inmovilizar una biomolécula dentro de la correspondiente cavidad de reacción. Por ejemplo, la biomolécula puede ser un ácido nucleico.

En realizaciones particulares, el material orgánico 122 incluye un material de gel, tal como un hidrogel. Como se usa en el presente documento, el término "material de gel" pretende significar un material semirrígido que es permeable a líquidos y gases. Normalmente, el material de gel puede hincharse cuando el material de gel absorbe o recibe líquido y puede contraerse cuando se elimina líquido del material de gel (por ejemplo, mediante secado). Los materiales de gel ejemplares incluyen, pero no se limitan a, aquellos que tienen una estructura coloidal, tales como agarosa; estructura de malla polimérica, como gelatina; o estructura de polímero reticulado, como poliacrilamida, SFA (ver, por ejemplo, la publicación de la solicitud de patente de EE.UU. n.° 2011/0059865 A1) o PAZAM (ver, por ejemplo, la solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° serie 61/753.833). El material de gel particularmente útil se adaptará a la forma de una cavidad de reacción donde reside. Algunos materiales de gel útiles pueden tanto (a) adaptarse a la forma de la cavidad de reacción donde reside y (b) tener un volumen que no exceda sustancialmente el volumen de la cavidad de reacción donde reside.

En realizaciones particulares, el material orgánico 122 tiene un volumen que está configurado para acomodar solo una única biomolécula (por ejemplo, ácido nucleico) de manera que la exclusión estérica evita que más de una biomolécula sea capturada o sembrada en la cavidad de reacción. La exclusión estérica puede ser particularmente útil para ácidos nucleicos. Más específicamente, las cavidades de reacción pueden exponer una superficie del material orgánico (por ejemplo, material de gel) que tiene un área equivalente o menor que un diámetro del volumen excluido de ácidos nucleicos diana que se van a sembrar sobre el sustrato. El volumen excluido para un ácido nucleico diana y su diámetro se pueden determinar, por ejemplo, a partir de la longitud del ácido nucleico diana. Los métodos para determinar el volumen excluido de ácidos nucleicos y el diámetro del volumen excluido se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. n.° 7.785.790; Rybenkov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90: 5307-5311 (1993); Zimmerman y col., J. Mol. Biol. 222: 599-620 (1991); o Sobel y col., Biopolymers 31: 1559-1564 (1991). Las condiciones para la exclusión estérica se establecen en la solicitud de patente de EE.UU. n.° serie 13/661.524 y la patente de EE.UU. n.° 7.785.790, y puede usarse fácilmente para sustratos estructurados de la presente divulgación.

En algunas realizaciones, tales como las realizaciones que utilizan la exclusión estérica, se puede administrar una biblioteca de ácidos nucleicos diana a las cavidades de reacción que contienen el material de gel antes del inicio de un proceso de amplificación. Por ejemplo, los ácidos nucleicos diana pueden administrarse a un sustrato estructurado en condiciones para sembrar el material de gel en el sustrato con los ácidos nucleicos diana. El sustrato estructurado se puede lavar opcionalmente para eliminar los ácidos nucleicos diana que no siembran el material de gel, así como cualquier otro material que no sea deseado para el procesamiento o uso posterior del sustrato estructurado.

No obstante, se entenderá que, en otras realizaciones, el área del material de gel expuesto puede ser sustancialmente mayor que el diámetro del volumen excluido de los ácidos nucleicos diana que se transportan a los sitios de amplificación. Por tanto, el área de las características puede ser suficientemente grande para que no se produzca la exclusión estérica.

Volviendo a la figura 10, en algunas realizaciones, las nanoestructuras 116 se forman a lo largo de la capa base 112 de manera que las nanoestructuras 116 se proyectan desde la capa base 112 y dentro de las cavidades de reacción 106. En algunas realizaciones, las nanoestructuras 116 se extienden a través de una parte de la capa de cavidad 114. En otras realizaciones, la superficie inferior 126 puede estar definida por una parte de la capa base 122 de manera que las nanoestructuras 116 no se extiendan a través de la capa de cavidad 114. También se muestra en la figura 10, se puede montar una cubierta 135 de flujo en el cuerpo del sustrato 102.

Durante un protocolo en el que las emisiones de luz son detectadas por un detector, las emisiones de luz pueden generarse en respuesta a la luz de excitación 108. En realizaciones alternativas, no se proporciona la luz de excitación 108 y, en cambio, la luz de excitación 108 es generada por emisores acoplados a la biomolécula 129. En algunas realizaciones, existe un campo de ganancia 130 a lo largo de una de las nanoestructuras 116 o entre dos o más nanoestructuras 116. El campo de ganancia 130 puede representar un espacio donde las nanoestructuras 116 crean un campo eléctrico de alta intensidad en respuesta a la luz de excitación y/o las emisiones de luz. Para algunas aplicaciones, las nanoestructuras 116 amplifican la luz de excitación 108 de manera que los emisores son energizados por la luz de excitación y proporcionan una mayor intensidad de señal para la detección. En otras aplicaciones, las nanoestructuras 116 no amplifican la luz de excitación 108, sino que amplifican las emisiones de luz 110 de manera que las emisiones de luz 110 proporcionen una mayor intensidad de señal para la detección. En algunas aplicaciones, sin embargo, las nanoestructuras 116 pueden ser capaces de amplificar tanto la luz de excitación 108 como las emisiones de luz 110 de manera que los emisores experimenten una mayor intensidad de la luz de excitación 108 y se proporcione una mayor intensidad de las emisiones de luz 110 por los emisores. Por consiguiente, las realizaciones expuestas en el presente documento pueden proporcionar una mayor intensidad de señal que es más fácil de detectar mediante sistemas o dispositivos de formación de imágenes en comparación con los sistemas conocidos que no incluyen nanoestructuras o amplificadores de unión.

La presente solicitud describe varios métodos para fabricar o fabricar sustratos estructurados que pueden usarse para detectar o analizar reacciones designadas. Al menos algunos de los métodos se ilustran en las figuras como una pluralidad de etapas. Sin embargo, debe entenderse que las realizaciones no se limitan a las etapas ilustradas en las figuras. Se pueden omitir etapas, se pueden modificar etapas y/o se pueden agregar otras etapas. A modo de ejemplo, aunque algunas realizaciones descritas en el presente documento pueden incluir solo dos capas, otras realizaciones pueden incluir tres, cuatro o más capas. Además, los etapas descritos en el presente documento pueden combinarse, los etapas pueden realizarse simultáneamente, los etapas pueden realizarse simultáneamente, los etapas pueden dividirse en múltiples subetapas, las etapas pueden realizarse en un orden diferente, o las etapas (o una serie de etapas) se pueden volver a realizar de forma iterativa. Además, aunque aquí se exponen diferentes métodos, debe entenderse que los diferentes métodos (o etapas de los diferentes métodos) se pueden combinar en otras realizaciones.

Los sustratos estructurados pueden formarse usando uno o más procesos que pueden, por ejemplo, usarse para fabricar circuitos integrados, durante la microfabricación y/o para fabricar nanotecnología. La litografía (por ejemplo, fotolitografía) es una categoría de técnicas o procesos que pueden usarse para fabricar los sustratos estructurados descritos en el presente documento. En realizaciones particulares, se forman una o más capas usando litografía por nanoimpresión (NIL). Las técnicas o procesos litográficos ejemplares se describen con mayor detalle en Marc J. Madou, Fundamentals of Microfabrication and Nanotechnology: Manufacturing Techniques for Microfabrication and Nanotechnology, Vol. II, 3a Edición, Parte I (páginas 2-145).

Uno o más procesos para fabricar sustratos estructurados también pueden incluir técnicas sustractivas en las que se elimina material de un sustrato de trabajo. Dichos procesos incluyen técnicas químicas, tales como grabado químico seco, grabado físico/químico, grabado en fase vapor, mecanizado químico (CM), grabado químico húmedo anisotrópico, fotograbado húmedo; técnicas electroquímicas, como grabado electroquímico (ECM), rectificado electroquímico (ECG), grabado fotoelectroquímico; técnicas térmicas, como mecanizado por láser, mecanizado por haz de electrones, mecanizado por descarga eléctrica (EDM); y técnicas mecánicas, como grabado en seco físico, grabado por pulverización catódica, fresado de iones, maquinado por chorro de agua (WJM), maquinado por chorro de agua abrasivo (AWJM), maquinado por chorro de agua abrasivo (AJM), pulido abrasivo, faenado electrolítico en proceso (ELID) ) rectificado, taladrado ultrasónico, fresado con haz de iones enfocado (FIB) y similares. La lista anterior no pretende ser limitante y se pueden utilizar otras técnicas o procesos sustractivos. Las técnicas o procesos sustractivos ejemplares se describen con mayor detalle en Marc J. Madou, Fundamentals of Microfabrication and Nanotechnology: Manufacturing Techniques for Microfabrication and Nanotechnology, Vol. II, 3a Edición, Parte II (páginas 148-384).

Uno o más procesos para fabricar sustratos estructurados también pueden incluir técnicas aditivas en las que se añade material a un sustrato de trabajo. Dichos procesos incluyen deposición física de vapor (PVD), evaporación (por ejemplo, evaporación térmica), pulverización catódica, revestimiento iónico, deposición de haz de racimo de iones, deposición de láser pulsado, deposición de ablación láser, epitaxia de haz molecular, deposición de vapor químico (CVD) (por ejemplo, deposición atmosférica CVD de presión (APCVD), CVD de baja presión (LPCVD), CVD de muy baja presión (VLPCVD), CVD de vacío ultra alto (UHVCVD), CVD metalorgánico (MOCVD), deposición química de vapor asistida por láser (LCVD), CVD mejorada con plasma (PECVD) ), deposición de capa atómica (ALD)), epitaxia (por ejemplo, epitaxia en fase líquida, epitaxia en fase sólida), anodización, deposición por pulverización térmica, galvanoplastia, implantación, difusión, incorporación en la masa fundida, oxidación térmica, deposición por pulverización catódica con láser, reacción moldeo por inyección (RIM), monocapas autoensambladas (SAM), adición de sol-gel, recubrimiento por rotación, pulverización de polímero, laminación de película seca de polímero, fundición, polimerización por plasma, serigrafía, impresión por chorro de tinta, micropotting mecánico, impresión por microcontacto, estereolos tografía o microfotoformado, procesos de formación electroquímica, electrodeposición, pirólisis por pulverización, deposición por rayo láser, deposición por haz de electrones, deposición por pulverización de plasma, micromoldeo, LIGA (que es un acrónimo en alemán de litografía de rayos X, electrodeposición y moldeo), moldeo por compresión y similares. La lista anterior no pretende ser limitante y pueden usarse otras técnicas o procesos aditivos. Las técnicas o procesos aditivos ejemplares se describen con mayor detalle en Marc J. Madou, Fundamentals of Microfabrication and Nanotechnology: Manufacturing Techniques for Microfabrication and Nanotechnology, Vol. II, 3a Edición, Parte III (páginas 384-642). Como se usa en el presente documento, el término "realización ejemplar" significa una realización que sirve como ejemplo. El término no indica que la realización sea preferida a otras realizaciones.

La figura 11 es un diagrama de flujo que ilustra un método de fabricación 200 de un sustrato estructurado. El método 200 incluye proporcionar, en 202, una capa base (o sustrato de trabajo) que tiene un lado base. La capa base puede ser solo una capa única de material o incluir una o más subcapas. El lado base puede tener una superficie plana que está configurada para tener otra capa depositada directamente sobre ella. Sin embargo, se contempla que el lado base puede incluir características no planas antes de combinarse con otras capas. En realizaciones particulares, la capa base incluye una oblea de vidrio (SiO2), pero se pueden utilizar otros materiales.

El método 200 también puede incluir formar, en 204, una matriz de nanoestructuras a lo largo del lado base de la capa base. La formación, en 204, puede incluir múltiples etapas de procesamiento. Por ejemplo, la formación, en 204, puede incluir proporcionar (por ejemplo, mediante deposición, crecimiento u otra técnica aditiva) una capa característica a lo largo del lado base de la capa base. La formación, en 204, puede incluir dar forma (por ejemplo, mediante grabado u otra técnica sustractiva) una subcapa de la capa base para formar las nanoestructuras. La subcapa también puede denominarse capa de características, ya que las nanoestructuras se pueden formar a partir de la subcapa. La capa de características puede incluir un material que se puede moldear en características individuales que pueden formar al menos parcialmente una base de las nanoestructuras. El material puede incluir un material puro (por ejemplo, oro) o una aleación de material. La capa de características también puede incluir múltiples subcapas de material (por ejemplo, oro y cromo) que se apilan una junto a la otra. Opcionalmente, uno o más de los materiales es un material resonante de plasmón.

En realizaciones particulares, la formación, en 204, incluye grabar la capa característica para formar nanocuerpos. Los nanocuerpos pueden disponerse en submatrices o conjuntos en los que cada subconjunto (o conjunto) puede convertirse en un amplificador de unión. En algunas realizaciones, los nanocuerpos formados a partir del proceso de grabado pueden constituir, sin más modificaciones, nanoestructuras que son capaces de amplificar la energía electromagnética. Sin embargo, en otras realizaciones, pueden ser necesarias más etapas de procesamiento para formar las nanoestructuras. Por ejemplo, la capa característica puede comprender un polímero (u otro material que no sea un material resonante de plasmón) que puede moldearse para formar nanocuerpos para construir las nanoestructuras. Posteriormente, se puede agregar una capa o película delgada a las superficies exteriores de los nanocuerpos para formar las nanoestructuras. Aún en otras realizaciones, las nanoestructuras pueden depositarse localmente en ubicaciones seleccionadas.

En algunas realizaciones, las nanoestructuras pueden ser similares y/o estar formadas de manera similar a como se describe en: Li, Zhipeng y col. "Multiple-particle nanoantennas for enormous enhancement and polarization control of light emission." Acs Nano 3.3 (2009): 637-642; Bharadwaj, Palash y col. "Optical Antennas" Advances in Optics and Photonics 1,438-483 (2009); Boltasseva, Alexandra. "Plasmonic components fabrication via nanoimprint." Journal of Optics A: Pure and Applied Optics 11.11 (2009): Kinkhabwala, Anika y col. "Large single-molecule fluorescence enhancements produced by a bowtie nanoantenna." Nature Photonics 3.11 (2009): 654-657; Bakker, Reuben M. y col. "Nanoantenna array-induced fluorescence enhancement and reduced lifetimes." New Journal of Physics 10.12 (2008); Liang, Chia-Ching, et al. "Plasmonic metallic nanostructures by direct nanoimprinting of gold nanoparticles." Optics express 19.5 (2011): 4768-4776; Olmon, Robert L. y Markus B. Raschke. "Antenna-load interactions at optical frequencies: impedance matching to quantum systems." Nanotechnology 23.44 (2012); Krasnok, Aleksandr E., et al. "Optical nanoantennas." Physics-Uspekhi 56.6 (2013)..

El método 200 también incluye formar, en 206, una capa de cavidad a lo largo del lado de base de la capa de base. La capa de la cavidad está configurada para incluir las cavidades de reacción. Para realizaciones que no incluyen cavidades de reacción, la capa de cavidades puede denominarse capa de sitio. Como se usa en el presente documento, la frase "a lo largo del lado base" o "a lo largo de la capa de base" incluye la capa de la cavidad en contacto directo con la capa de base o incluye la capa de la cavidad que está separada de la capa de base por una o más capas intermedias. Como se usa aquí, términos espacialmente relativos, tales como "superior", "arriba", "debajo" y similares, se usan aquí para facilitar la descripción para distinguir un elemento o característica de otro. Los términos espacialmente relativos no requieren que el sustrato estructurado tenga una orientación particular con respecto a la gravedad durante su uso o funcionamiento. Por ejemplo, el lado activo del sustrato estructurado puede estar orientado en una dirección opuesta a la dirección de la fuerza gravitacional en algunas realizaciones. Alternativamente, el lado activo del sustrato estructurado puede estar orientado en la misma dirección que la dirección de la fuerza gravitacional en otras realizaciones. La superficie superior, tal como la superficie lateral por la que fluye el líquido durante el funcionamiento, puede denominarse superficie superior independientemente de la orientación del sustrato estructurado con respecto a la gravedad.

La formación, en 206, puede incluir proporcionar una capa de cavidad que está configurada para tener una serie de cavidades de reacción. La formación, en 206, puede incluir múltiples etapas. En algunas realizaciones, la capa de cavidades incluye cavidades de reacción preformadas. Cada una de las cavidades de reacción puede estar alineada con una submatriz correspondiente o un conjunto de nanoestructuras (por ejemplo, dos o más nanoestructuras). Opcionalmente, la capa de la cavidad se puede grabar para eliminar porciones de la capa de la cavidad y exponer las nanoestructuras dentro de las correspondientes cavidades de reacción.

En otras realizaciones, las cavidades de reacción pueden tener forma mientras la capa de cavidades está colocada encima y acoplada a la capa base. Por ejemplo, el material NIL puede depositarse a lo largo del lado base de la capa base después de que se forman las nanoestructuras y cubren las nanoestructuras. El material NIL puede depositarse usando, por ejemplo, una técnica de revestimiento por rotación o depositando gotitas a lo largo del lado base. El material NIL puede comprender un material que se pueda imprimir utilizando la técnica NIL. Por ejemplo, el material NIL puede comprender un polímero. El material NIL puede luego imprimirse o estamparse con un molde (también llamado plantilla) que tiene un patrón de características que forman las cavidades de reacción en el material NIL. En algunas realizaciones, el molde es transparente para permitir que la luz ultravioleta (UV) o visible se propague a través del mismo. En tales realizaciones, el material NIL puede comprender un polímero fotoendurecible que se cura con luz UV o visible mientras se presiona el molde en el material NIL. Por consiguiente, el material NIL puede curarse (por ejemplo, endurecerse) para formar las cavidades de reacción. Este proceso puede ser idéntico o similar a la litografía de impresión por etapas y flash (SFIL). En otras realizaciones, el material NIL puede curarse mediante la aplicación de energía térmica y/o presión. Las técnicas NIL y procesos similares se describen en Marc J. Madou, Fundamentals of Microfabrication and Nanotechnology: Manufacturing Techniques for Microfabrication and Nanotechnology, Vol. II, 3a Edición, Parte I (páginas 113-116) y Lucas et al., "Nanoimprint Lithography Based Approach for the Fabrication of Large-Area, Uniformly Oriented Plasmonic Arrays" Adv. Mater. 2008, 20, 1129-1134.

Cada una de las cavidades de reacción se puede alinear con una submatriz correspondiente de nanoestructuras. El material NIL se puede grabar preferentemente para exponer la pluralidad de nanoestructuras dentro de la correspondiente cavidad de reacción. Independientemente del método de fabricación, el subconjunto de nanoestructuras puede formar un amplificador de unión de la correspondiente cavidad de reacción. El amplificador de unión está configurado para al menos uno de amplificar la energía electromagnética que se propaga en la correspondiente cavidad de reacción o amplificar la energía electromagnética generada dentro de la correspondiente cavidad de reacción.

Opcionalmente, el método 200 también puede incluir proporcionar, en 208, un material orgánico dentro de las cavidades de reacción. El material orgánico puede cubrir las nanoestructuras. En algunas realizaciones, el material orgánico se proporciona a través del lado activo, incluidas las regiones intersticiales. A continuación, el material orgánico puede eliminarse puliendo el lado activo. Después de pulir el lado activo, cada una de las cavidades de reacción puede incluir el material orgánico correspondiente que se separa de otro material orgánico de otras cavidades de reacción. En realizaciones particulares, el material orgánico es un material de gel, como los descritos en el presente documento (por ejemplo, PAZAM, SFA o variantes modificadas químicamente de los mismos, como la versión azidolizada de SfA (azido-SFA).

El método 200 también puede incluir etapas adicionales, como preparar superficies del sustrato estructurado para interactuar con los fluidos y muestras de un protocolo designado. Como otro ejemplo, el método 200 puede incluir montar, en 210, una cubierta de flujo en el lado activo de la capa de la cavidad. La cubierta de flujo puede definir un canal de flujo entre la cubierta de flujo y el lado activo. Las formas de realización que incluyen cubiertas de flujo se describen en la solicitud provisional de Ee .UU. n.° 61/914.275 y la solicitud internacional n.° PCT/US14/69373.

La figura 12 ilustra un diagrama de flujo de un método 220 de fabricación de un sustrato estructurado 280 (mostrado en la figura 14). El método 220 se describe con referencia a las figuras 13 y 14. El método 220 puede incluir uno o más etapas que son similares o idénticos a los etapas del método 200 (figura 11). El método 220 incluye proporcionar, en 222, una capa base (o sustrato de trabajo) 240 que tiene un lado base 242. El método 220 también incluye formar, en 224, una matriz 244 de nanoestructuras 246 a lo largo del lado base 242. Por ejemplo, se puede proporcionar una capa de características 245 al lado de base 242 (por ejemplo, a través de un proceso de deposición) de la capa de base 240. La capa de características 245 se puede grabar para formar la matriz 244 de nanoestructuras 246. La matriz 244 puede incluir submatrices 248 de las nanoestructuras 246. También se muestra en la figura 13, subconjuntos adyacentes 248 están separados por un espaciado 250 a lo largo del lado de base 242.

Cada subconjunto 248 puede incluir una pluralidad de nanoestructuras 246 que forman colectivamente un amplificador de unión cuando el sustrato estructurado 280 (figura 14) está completamente formado. Por ejemplo, las nanoestructuras 246 de cada subconjunto 248 pueden dimensionarse, formarse y colocarse entre sí de modo que las nanoestructuras 246 amplifiquen la energía electromagnética. En la realización ilustrada, las nanoestructuras 246 se ilustran como postes verticales que tienen una forma y tamaño comunes. Sin embargo, debe entenderse que las nanoestructuras 246 pueden tener diferentes formas en otras realizaciones. En algunas realizaciones, los amplificadores de unión pueden tener esencialmente la misma disposición de nanoestructuras 246. Como se usa en el presente documento, "esencialmente lo mismo" significa que las disposiciones serían idénticas, pero para las tolerancias de fabricación. Sin embargo, en otras realizaciones, no se requiere que las nanoestructuras 246 de una sola submatriz 248 tengan una forma idéntica y/o un tamaño idéntico.

En 226, se puede proporcionar un material NIL 252 a lo largo del lado de base 242 de la capa de base 240. El material NIL 252 puede cubrir la matriz 244 de las nanoestructuras 246. El material NIL 252 puede ser un material viscoso de manera que el material NIL 252 rodea y llena los espacios vacíos entre las nanoestructuras 246. El material NIL 252 puede comprender, por ejemplo, un polímero. En la realización ilustrada, el material NIL 252 se proporciona como una capa NIL a lo largo del lado de base 242. En otras realizaciones, el material NIL puede proporcionarse como una matriz de gotitas discretas que, cuando se comprimen durante una operación de impresión, cubren eficazmente al menos porciones del lado de base 242.

En 228, puede imprimirse una matriz 254 de cavidades de reacción 256 en el material NIL 252. La impresión, en 228, puede incluir la aplicación de un molde 258 al material NIL 252. El molde 258 puede tener un lado 260 no plano que incluya un patrón de características. Las características están dimensionadas, configuradas y posicionadas con relación a cada una para dar forma al material NIL 252 de una manera predeterminada de manera que se formen las cavidades de reacción 256. Cuando el molde 258 se aplica al material NIL 252, se forma un conjunto apilado 262 que incluye el molde 258, el material NIL 252, las nanoestructuras 246 y la capa base 240.

La impresión, en 228, también puede incluir curar el material NIL 252 para solidificar la forma del material NIL 252. Por ejemplo, el proceso de curado puede incluir aplicar una luz ultravioleta o luz visible 264 al conjunto apilado 262. El material NIL 252 puede comprender un fotopolímero que es capaz de solidificarse después de ser expuesto a la luz UV o visible 264. Sin embargo, pueden usarse métodos alternativos para solidificar o curar el material NIL 252. Por ejemplo, se puede aplicar energía térmica (por ejemplo, calor) o presión al material NIL 252 para solidificar el material NIL 252 y formar las cavidades de reacción 256.

Con respecto a la figura 14, después del proceso de curado, el material NIL se convierte en una capa 253 NIL solidificada que tiene la matriz 254 de cavidades de reacción 256. La capa de NIL solidificada 253 puede constituir una capa de cavidades, tal como la capa de cavidades 114 (figura 10), que incluye las cavidades de reacción 256. Cada cavidad de reacción 256 se puede alinear con una submatriz correspondiente 248 de las nanoestructuras 246 de manera que la cavidad de reacción 256 se coloque por encima de la correspondiente submatriz 248. Como se muestra en la figura 13, las nanoestructuras 246 pueden colocarse dentro de una región de relleno 266 de la capa NIL solidificada 253. La región de relleno 266 incluye las nanoestructuras 246 rodeadas por el material solidificado de la capa NIL 253. En esta etapa, la región de llenado 266 puede definir una superficie inferior 268 de la cavidad de reacción 256. También se muestra, en esta etapa, las cavidades de reacción 256 pueden estar separadas por regiones intersticiales 270, que se extienden entre las cavidades de reacción 256.

El método 220 también puede incluir eliminar, en 230, las regiones de relleno 266 para exponer al menos porciones de las nanoestructuras 246 dentro de las correspondientes cavidades de reacción 256. Por ejemplo, se puede aplicar un proceso de grabado preferencial para eliminar el material de la capa NIL 253 que rodea las nanoestructuras 246 sin dañar o eliminar sustancialmente las nanoestructuras 246. Durante la extracción, en 230, la superficie inferior 268 de cada cavidad de reacción 256 se puede bajar de manera que la superficie inferior 268 se acerque a la capa base 240. En algunas realizaciones, la capa NIL 253 dentro de las regiones de relleno 266 se puede grabar completamente de modo que la capa base 240 forme al menos una parte de la superficie inferior 268. En otras realizaciones, similares al sustrato estructurado 100 de la figura 10, una parte de la capa NIL 253 puede permanecer después del proceso de grabado. En tales realizaciones, las nanoestructuras 246 pueden extenderse a través de la capa NIL 253 (o capa de cavidad). Durante la eliminación, en 230, las regiones intersticiales 270 también se pueden grabar, como se indica, de modo que se reduce la altura de las regiones intersticiales 270 con respecto a la capa base 240. La altura se reduce de 271A a 271B.

Como se describió anteriormente, las nanoestructuras 246 dentro de cada cavidad de reacción 256 pueden formar un conjunto amplificador 272 de la correspondiente cavidad de reacción 256. El amplificador de unión 272 está configurado para al menos uno de amplificar la energía electromagnética que se propaga en la correspondiente cavidad de reacción o amplificar la energía electromagnética generada dentro de la correspondiente cavidad de reacción.

El sustrato estructurado 280 se muestra en la parte inferior de la figura 14. El sustrato de estructura 280 incluye un lado activo 282 y tiene las cavidades de reacción 256 y las regiones intersticiales 270 que separan las cavidades de reacción 256. Opcionalmente, el método 200 puede incluir proporcionar, en 232, un material orgánico 274 dentro de las cavidades de reacción 256. Antes de proporcionar el material orgánico 274, el sustrato de trabajo puede procesarse para recibir el material orgánico 274. Por ejemplo, se puede proporcionar una capa de pasivación (por ejemplo, óxido de tantalio o similar) y una capa de silano sobre la capa de pasivación. Tanto la capa de pasivación como la capa de silano pueden cubrir las nanoestructuras 246. El suministro, en 232, puede incluir el revestimiento por rotación del material orgánico sobre el sustrato de trabajo. Sin embargo, también se pueden usar otras técnicas aditivas. Opcionalmente, el sustrato de trabajo que tiene la capa de pasivación, la capa de silano y el material orgánico pueden incubarse.

Como se muestra en la figura 14, el material orgánico 274 puede cubrir las nanoestructuras 246 en las cavidades de reacción 256. En algunas realizaciones, el material orgánico 274 se proporciona a través de todo el lado activo 282 de manera que el material orgánico 274 cubre las superficies de las regiones intersticiales 270. El material orgánico 274 puede eliminarse puliendo el lado activo 282. Después de pulir el lado activo 282, cada una de las cavidades de reacción 256 puede incluir material orgánico 274 que está separado del material orgánico 274 en las cavidades de reacción adyacentes 256. El material orgánico 274 dentro de cada cavidad de reacción 256 rodea las nanoestructuras 246 del conjunto amplificador 272. El material orgánico 274 puede configurarse para soportar y/o contener una sustancia biológica o química que sea capaz de proporcionar emisiones de luz, tales como ácidos nucleicos marcados con colorante.

La figura 15 es un diagrama de flujo que ilustra un método 300 de manufactura o fabricación de un sustrato estructurado. En algunas realizaciones, el método 300 incluye etapas que son similares o idénticas a las etapas de los métodos 200 (figura 11) y 220 (figura 12). Las diferentes etapas del método 300 se ilustran en la figura 16. El método 300 puede incluir proporcionar, en 302, una capa base (o sustrato de trabajo) 320 que tiene un lado base 322 y proporcionar, en 304, material NIL 324 a lo largo del lado base 322 de la capa base 320. En algunas realizaciones, el material NIL 324 puede proporcionarse como una capa NIL. En otras realizaciones, el material NIL 324 puede proporcionarse como gotitas separadas a lo largo del lado base 322.

El método 300 también puede incluir la impresión, en 306, del material NIL 324. Después de la impresión, el material NIL 324 puede ser una capa NIL solidificada 324 que tiene una porción base 326 (indicada por la línea discontinua) y una matriz 328 de nanocuerpos 330 que se proyectan desde la porción base 326. La matriz 328 puede incluir múltiples submatrices 329. La porción de base 326 se extiende entre nanocuerpos adyacentes 330. Como tal, cada uno de los nanocuerpos 330 puede ser parte de la misma capa con patrón. Los nanocuerpos 330 pueden tener una variedad de formas. En la realización ilustrada, los nanocuerpos 330 son postes alargados que sobresalen de la porción de base 326 de la capa NIL 324. En realizaciones alternativas, la porción de base 326 no se forma después de la impresión. En cambio, solo los nanocuerpos 330 pueden formarse después de la impresión. Opcionalmente, la porción de base 326 puede grabarse.

El método 300 también puede incluir proporcionar, en 308, una capa resonante de plasmón 334 a lo largo del material NIL 324 y, en particular, los nanocuerpos 330. El suministro, en 308, también puede denominarse depositar o crecer. En algunas realizaciones, la capa resonante de plasmón 334 puede ser una película delgada o un revestimiento. El suministro, en 308, puede ejecutarse usando una o más técnicas aditivas. Por ejemplo, el suministro, en 308, puede incluir al menos uno de PECVD, ALD, evaporación, pulverización catódica, recubrimiento por centrifugación o similares. La capa resonante de plasmón 334 incluye un material resonante de plasmón (por ejemplo, oro, plata, silicio y similares) que cubre los nanocuerpos 330. La capa 334 resonante de plasmón puede cubrir toda la capa NIL 324. En otras realizaciones, la capa resonante de plasmón 334 puede depositarse selectivamente sobre las submatrices 329. Por consiguiente, pueden formarse nanoestructuras 332 en las que cada nanoestructura 332 incluye un nanocuerpo 330 respectivo y una porción de la capa 334 resonante de plasmón que cubre o rodea el nanocuerpo 330 respectivo.

Opcionalmente, el método 300 puede incluir proporcionar, en 310, una capa de pasivación 336. La capa de pasivación 336 está configurada para proteger las capas subyacentes, tales como la capa resonante de plasmón 334, de daños durante el uso del sustrato estructurado. La capa de pasivación 336 puede ser similar a una o más de las capas de pasivación descritas en la solicitud provisional de EE.UU. n.° 61/914,275 y la solicitud internacional n.° PCT/US14/69373.

También opcionalmente, el método 300 puede incluir proporcionar, en 312, una capa de inmovilización, en lo sucesivo denominada capa de silano (no mostrada). La capa de silano (o capa de inmovilización) puede configurarse para facilitar el acoplamiento entre un material orgánico y/o sustancias biológicas o químicas. A modo de ejemplo, el suministro, en 312, puede realizarse mediante deposición de vapor. En algunas realizaciones, la capa de silano se puede proporcionar después de otras etapas de procesamiento. En esta etapa, la capa base 320, el material NIL 324, la capa resonante de plasmón 334, la capa de pasivación 336 y la capa de silano opcional pueden formar un sustrato de trabajo 339 que tiene un lado operativo 341.

En 314, el método 300 puede incluir formar una capa de cavidades 338 a lo largo del lado operativo 341 que incluye una pluralidad de cavidades de reacción 340. En algunas realizaciones, la capa de cavidades 338 puede formarse usando, por ejemplo, una técnica NIL en la que se imprime y cura un material NIL para formar las cavidades de reacción 340. Sin embargo, se pueden usar otras técnicas de aditivos para proporcionar la capa de cavidad 338. En la figura 16, solo se muestra una única cavidad de reacción 340, pero debe entenderse que se puede formar una serie de cavidades de reacción 340.

Si la capa de cavidad 338 se forma usando un proceso NIL, el espacio vacío entre las nanoestructuras 332 puede llenarse con el material NIL 324. Como se describió anteriormente con respecto al método 220, el material NIL 324 puede eliminarse mediante grabado preferencial. Opcionalmente, la capa de silano se puede proporcionar después de que la capa de cavidades 338 y las cavidades de reacción 340 se formen a lo largo del sustrato de trabajo 339. Una vez eliminado el material NIL, se puede formar un amplificador 342 de conjunto de las nanoestructuras 332 dentro de la correspondiente cavidad de reacción 340. En 316, se puede proporcionar un material orgánico a las cavidades de reacción 340.

En la realización ilustrada, la capa de cavidad 338 se forma usando un proceso NIL. Sin embargo, debe entenderse que la capa de cavidad 338 puede formarse utilizando otros procesos aditivos y, opcionalmente, sustractivos, como los descritos anteriormente.

Las figuras 17-19 ilustran diferentes nanoestructuras que pueden implementarse con una o más realizaciones. Sin embargo, las nanoestructuras mostradas en las figuras 17-19 son solo ejemplares y no pretenden ser limitantes. Pueden usarse otras nanoestructuras en realizaciones alternativas. En las figuras 17A-17D, las nanoestructuras están ubicadas dentro de las correspondientes cavidades de reacción de forma cilíndrica. En otras realizaciones, las cavidades de reacción pueden tener una forma diferente. Por ejemplo, una sección transversal de la cavidad de reacción puede ser de forma ovalada, cuadrada, rectangular, otra forma poligonal o similar. Aún en otras realizaciones, las nanoestructuras pueden ubicarse a lo largo de una superficie plana.

La figura 17A es una vista en perspectiva de un nanotapón 402 en una cavidad de reacción 404, que también puede denominarse nanopocillo. El nanotapón 402 puede comprender oro (Au). En la realización ilustrada, el nanoconector 402 está ubicado centralmente dentro de la cavidad de reacción 404, pero puede tener otras posiciones en otras realizaciones. La figura 17B es una vista en perspectiva de una antena de pajarita 406 que puede usarse dentro de una o más realizaciones. La antena de pajarita 406 incluye dos nanoestructuras separadas 408 que son de forma triangular y se apuntan entre sí con un pequeño espacio entre ellas. La antena de pajarita 406 puede formar un amplificador de unión. La figura 17C ilustra una nanorejilla 410 en una cavidad de reacción 412 que incluye una serie de vigas espaciadas 411. La nanorejilla 410 puede formarse en una capa inferior y posteriormente exponerse cuando la cavidad de reacción 412 se forma por encima de la nanorejilla 410. Como se muestra, la nanorejilla 410 no está confinada dentro de la cavidad de reacción 412 y se extiende más allá de la pared de la cavidad de reacción 412. La figura 17D ilustra una pluralidad de nanopartículas 414 dispuestas dentro de una cavidad de reacción 416. Las nanopartículas 414 se pueden distribuir en ubicaciones aleatorias dentro de la cavidad de reacción 416. Las nanopartículas 414 pueden formarse, por ejemplo, mediante un proceso de reflujo o deposición. La figura 17E ilustra un dímero 420 y un trímero 422. El dímero 420 y el trímero 422 pueden disponerse dentro solos en una única cavidad de reacción (no mostrada) sin otras nanoestructuras dispuestas en ella. Alternativamente, el dímero 420 y el trímero 422 pueden compartir una cavidad de reacción común. Opcionalmente, el dímero 420 y el trímero 422 no están dispuestos dentro de las cavidades de reacción y, en cambio, están distribuidos a lo largo de una superficie plana (no mostrada).

Las figuras 18A-18D ilustran secciones transversales laterales de cavidades de reacción que tienen nanoestructuras dispuestas en ellas. Las cavidades de reacción pueden ser, por ejemplo, de forma cilíndrica o rectangular. En la figura 18A, se muestra una cavidad de reacción 430 que incluye una pluralidad de nanoestructuras 432. Las nanoestructuras 432 son postes que pueden tener forma cilíndrica o cuadrada. En la figura 18B, se muestra una cavidad de reacción 434 que incluye una pluralidad de nanoestructuras 436. Las nanoestructuras 436 pueden ser cónicas o piramidales. En la figura 18c , se muestra una cavidad de reacción 438 que incluye una pluralidad de nanoestructuras 440. Cada una de las nanoestructuras 440 puede ser cónica o piramidal y tener una porción de partículas 442 (por ejemplo, una partícula de oro) dispuesta en la parte superior de la nanoestructura 440. En la figura 18D, se muestra una cavidad de reacción 444 que incluye una pluralidad de nanoestructuras 446. Las nanoestructuras 446 constituyen paredes laterales que se enfrentan entre sí.

Las figuras 19A-19D ilustran vistas en planta de cavidades de reacción que tienen una o más nanoestructuras dispuestas en ellas. Más específicamente, la figura 19A ilustra un nanorretrato 450 que rodea un eje central 452. El nanorretrato 450 es circular en la figura 19A, pero puede tener otras formas (por ejemplo, poligonal) en otras realizaciones. La figura 19B ilustra cinco postes 454 que están colocados uno con relación al otro. Las figuras 19C y 19D muestran las antenas de pajarita 456, 458, respectivamente. Las antenas de pajarita 456, 458 están configuradas para responder preferentemente a diferentes polarizaciones de luz.

En cada una de las figuras 17A-7C, 18A-18D y 19B-19D, las nanoestructuras pueden configurarse para formar un amplificador de unión correspondiente que depende de la orientación, de manera que el amplificador de unión responde preferentemente a una luz polarizada de una orientación designada. Dichos amplificadores de unión pueden denominarse amplificadores polarizados. Por ejemplo, los amplificadores de unión pueden configurarse para tener un momento dipolar que es esencialmente paralelo a una luz de excitación de una polarización designada. La cantidad de emisiones de luz proporcionada por las cavidades de reacción que tienen tales amplificadores polarizados depende de la polarización de la luz de excitación.

En otras realizaciones, los amplificadores de unión pueden configurarse para responder preferentemente a las emisiones de luz de una longitud de onda predeterminada. Por ejemplo, si los emisores proporcionan emisiones de luz que son iguales o cercanas a la longitud de onda predeterminada, los amplificadores de unión pueden amplificar las emisiones de luz. Sin embargo, si los emisores proporcionan emisiones de luz que no son iguales o cercanas a la longitud de onda predeterminada, los amplificadores de unión pueden amplificar solo parcialmente las emisiones de luz o amplificar las emisiones de luz en una cantidad insignificante.

Por consiguiente, la presente solicitud describe diversas realizaciones y uno o más aspectos (por ejemplo, características) que pueden usarse con las realizaciones. Debe entenderse que los diversos aspectos pueden combinarse y/o modificarse adicionalmente en realizaciones particulares.

Varias realizaciones incluyen nanoestructuras. En algunas realizaciones, las nanopartículas pueden incluir dímeros o trímeros dentro de los pocillos. En algunas realizaciones, las nanoestructuras pueden incluir nanoantenas de pajarita. En algunas realizaciones, las nanoestructuras pueden incluir nanobarras. En algunas realizaciones, las nanoestructuras pueden incluir nanoanillos. En algunas realizaciones, las nanoestructuras pueden incluir nanotapones. En algunas realizaciones, las nanoestructuras pueden incluir nanorejillas.

Opcionalmente, las nanoestructuras pueden comprender un material resonante de plasmón. En realizaciones particulares, las nanoestructuras pueden incluir un material seleccionado del grupo que consiste en: oro (Au), plata (Ag), estaño (Sn), rodio (Rh), rutenio (Ru), paladio (Pd), osmio (Os), iridio (Ir), platino (Pt), titanio (Ti) y aluminio (Al), cromo (Cr), cobre (Cu), silicio dopado tipo p, silicio dopado tipo n y arseniuro de galio.

Se proporciona un sustrato estructurado que incluye (a) una pluralidad de nanopartículas distribuidas sobre un soporte sólido; (b) un material de gel que forma una capa en asociación con la pluralidad de nanopartículas; y (c) una biblioteca de ácidos nucleicos diana en el material de gel.

El material de gel puede cubrir las nanopartículas.

El soporte sólido puede incluir una superficie de una celda de flujo.

El soporte sólido puede incluir una superficie plana que tiene una pluralidad de pocillos, las nanopartículas distribuidas dentro de la pluralidad de pocillos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una matriz, que comprende:

un soporte sólido que comprende una superficie, comprendiendo la superficie una pluralidad de cavidades de reacción, estando separadas las cavidades entre sí por regiones intersticiales;

una pluralidad de nanoestructuras plasmónicas, en donde las nanoestructuras plasmónicas comprenden nanopartículas separadas por un espaciado controlado, en donde las nanoestructuras plasmónicas forman un amplificador de ensamble colocado dentro de cada una de las cavidades de reacción y configurado para amplificar al menos una de las ondas electromagnéticas que se propaga a la reacción correspondiente cavidad o amplificar la energía electromagnética que se genera dentro de la correspondiente cavidad de reacción;

un material de gel que forma una capa sobre la pluralidad de nanoestructuras plasmónicas; y

un ácido nucleico cebador unido al material de gel.

2. La matriz de acuerdo con la reivindicación 1, en la que cada una de las nanoestructuras plasmónicas comprende un material seleccionado del grupo que consiste en oro (Au), plata (Ag), estaño (Sn), rodio (Rh), rutenio (Ru), paladio (Pd), osmio (Os), iridio (Ir), platino (Pt), titanio (Ti) y aluminio (Al), cromo (Cr), cobre (Cu), silicio dopado tipo p, silicio dopado tipo n y arseniuro de galio.

3. La matriz de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que las nanoestructuras plasmónicas están situadas en el fondo de las cavidades.

4. La matriz de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que las nanoestructuras plasmónicas están situadas a lo largo de las paredes de las cavidades.

5. La matriz de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que las regiones intersticiales están sustancialmente desprovistas de nanoestructuras plasmónicas.

6. La matriz de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que las nanopartículas comprenden dímeros o trímeros dentro de las cavidades.

7. La matriz de acuerdo con la reivindicación 1, en la que

a) las nanopartículas tienen un diámetro superior a 10 nm, 20 nm, 30 nm, 40 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm o superior a 100 nm, o

(b) las nanopartículas tienen un diámetro de menos de 100 nm, 90 nm, 80 nm, 70 nm, 60 nm, 50 nm, 40 nm, 30 nm, 20 nm o menos de 10 nm.

8. La matriz de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que:

el espaciado entre dos nanopartículas cualesquiera es igual a una longitud de onda de excitación propagada en dicha pluralidad de cavidades de reacción, un múltiplo de la longitud de onda de excitación o una fracción de la longitud de onda de excitación; o

la separación entre dos nanopartículas cualesquiera es igual a una longitud de onda de emisión generada dentro de dicha pluralidad de cavidades de reacción, un múltiplo de la emisión de excitación o una fracción de la longitud de onda de emisión.

9. La matriz de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el material de gel comprende un hidrogel.

10. La matriz de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que el soporte sólido comprende una superficie de una celda de flujo.

11. Un método para hacer una matriz, que comprende:

obtener un soporte sólido que comprende una superficie plana, comprendiendo la superficie una pluralidad de cavidades de reacción, estando separadas las cavidades entre sí por regiones intersticiales;

revestir una película metálica sobre el soporte sólido, teniendo la película metálica un espesor inicial; someter la película metálica a un proceso de recocido térmico, formando así una pluralidad de nanoestructuras plasmónicas en las que las nanoestructuras plasmónicas comprenden nanopartículas separadas por un espaciado controlado, en las que las nanoestructuras plasmónicas forman un amplificador de ensamble colocado dentro de cada una de las cavidades de reacción y configurado para al menos de amplificar las ondas electromagnéticas que se propagan en la correspondiente cavidad de reacción o amplificar la energía electromagnética que se genera dentro de la correspondiente cavidad de reacción, y en el que un tamaño de las nanoestructuras plasmónicas es función del espesor de la película inicial;

recubrir al menos una porción del soporte sólido con un material de gel, depositando así el material de gel en la pluralidad de cavidades; y

unir un ácido nucleico cebador al gel.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, que comprende además pulir la superficie plana para eliminar sustancialmente las nanoestructuras plasmónicas de las regiones intersticiales y mantener las nanoestructuras plasmónicas en las cavidades, en el que opcionalmente las nanoestructuras comprenden un material seleccionado del grupo que consiste en: oro (Au), plata (Ag), estaño (Sn), rodio (Rh), rutenio (Ru), paladio (Pd), osmio (Os), iridio (Ir), platino (Pt), titanio (Ti) y aluminio (Al), cromo (Cr), cobre (Cu), silicio dopado tipo p, silicio dopado tipo n y arseniuro de galio.

13. Un método para detectar ácidos nucleicos, que comprende:

(a) proporcionar un soporte sólido que comprende una superficie plana, comprendiendo la superficie una pluralidad de cavidades de reacción, estando separadas las cavidades entre sí por regiones intersticiales; una pluralidad de nanoestructuras plasmónicas en las que las nanoestructuras plasmónicas comprenden nanopartículas separadas por un espaciado controlado; en donde las nanoestructuras plasmónicas forman un ensamble amplificador posicionado dentro de cada una de las cavidades de reacción y configuradas para amplificar al menos una de las ondas electromagnéticas que se propaga a la correspondiente cavidad de reacción o amplificar la energía electromagnética que se genera dentro de la correspondiente cavidad de reacción; un material de gel que forma una capa que cubre la pluralidad de nanoestructuras plasmónicas; un ácido nucleico cebador unido al material de gel; y una biblioteca de ácidos nucleicos diana que siembran cavidades individuales mediante la interacción con el ácido nucleico cebador unido al material de gel;

(b) poner en contacto el soporte sólido con al menos una sonda marcada con fluorescencia que se une a los ácidos nucleicos diana; y

(c) detectar la señal fluorescente en el soporte sólido para distinguir los ácidos nucleicos diana que se unen a la al menos una sonda;

opcionalmente en el que la superficie plana comprende una superficie de una celda de flujo.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en el que

(i) la sonda marcada con fluorescencia comprende un nucleótido marcado con fluorescencia,

(ii) la sonda marcada con fluorescencia comprende un oligonucleótido marcado con fluorescencia,

(iii) la detección comprende la detección de la hibridación de una sonda oligonucleotídica con los ácidos nucleicos diana en cada cavidad, o

(iv) la detección comprende la detección de la incorporación de un nucleótido o una sonda de oligonucleótido a ácidos nucleicos diana en cada cavidad.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en el que cada una de las nanoestructuras plasmónicas comprende un material seleccionado del grupo que consiste en oro (Au), plata (Ag), estaño (Sn), rodio (Rh), rutenio (Ru), paladio (Pd), osmio (Os), iridio (Ir), platino (Pt), titanio (Ti) y aluminio (Al), cromo (Cr), cobre (Cu), silicio dopado tipo p, silicio dopado tipo n y arseniuro de galio.