ES2845690T3 - Combinación de adenovirus e inhibidores de punto de control para el tratamiento del cáncer - Google Patents

Abstract

Vector adenovírico oncolítico ONCOS-102 de serotipo que comprende una eliminación de 24 pares de bases (bp) en la región constante 2 (CR2) de gen E1A, una eliminación en la región temprana 3 (E3) que codifica las 5 proteínas 6.7K y gp19K, un transgén que codifica la proteína factor estimulante de colonias de granulocitosmacrófagos (GM-CSF) insertado en la región E3, que sustituye dichas 6.7K y gp19K, y que presenta un botón de fibra de serotipo 5 sustituido por fibra de serotipo 3 para la utilización en el tratamiento de cáncer resistente a inhibidor de PD-1 humano, en el que el vector vírico se administra en combinación con pembrolizumab o nivolumab a un paciente, en el que la administración comprende en primer lugar la sensibilización con el vector de virus, seguida por la administración de pembrolizumab o nivolumab, en el que la administración del vector de virus se lleva a cabo mediante una inyección intratumoral, intrapleural o intraperitoneal.

Description

DESCRIPCIÓN

Combinación de adenovirus e inhibidores de punto de control para el tratamiento del cáncer

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la medicina. Específicamente, la presente invención se refiere a una nueva estrategia de utilización de adenovirus ONCOS-102 para el tratamiento de cáncer humano en combinación con un inhibidor de punto de control (“checkpoint”) o inhibidores de punto de control. Además, se dan a conocer métodos de utilización de dicha combinación de virus e inhibidor de punto de control o inhibidores de punto de control en el tratamiento de cáncer humano. Otras medicaciones además del virus y el inhibidor de punto de control o inhibidores de punto de control también pueden incluirse en el protocolo de tratamiento.

Antecedentes de la invención

Una parte importante del sistema inmunitario es su capacidad de distinguir las células normales en el cuerpo de las que percibe como "extrañas" (“foreign”). Lo anterior permite que el sistema inmunitario ataque a las células extrañas sin afectar a las células normales. Para ello, utiliza "puntos de control" -moléculas sobre determinadas células inmunitarias que necesitan estar activadas (o inactivadas) para iniciar una respuesta inmunitaria.

Las células de cáncer en ocasiones encuentran maneras de utilizar dichos puntos de control para evitar ser atacadas por el sistema inmunitario. Los inhibidores de puntos de control inmunitario son fármacos, con frecuencia realizados en anticuerpos, que desatan el ataque del sistema inmunitario sobre las células de cáncer. Se han conseguido algunos éxitos impresionantes en los últimos años, particularmente en algunos pacientes con melanoma metastásico o linfoma de Hodgkin, y mostrando grandes posibilidades en ensayos clínicos con pacientes que presentaban otros tipos de cáncer.

La utilización como diana de las proteínas de punto de control se está convirtiendo rápidamente en una parte importante del tratamiento de algunos cánceres, tales como el melanoma y el cáncer pulmonar de células no pequeñas. Los investigadores también han tenido prometedores resultados preliminares contra varios otros tipos de cáncer. Al contrario que la mayoría de demás fármacos de cáncer, dichos inhibidores de punto de control aparentemente ayudan contra muchos tipos diferentes de cáncer.

La viroterapia es un enfoque de tratamiento relativamente nuevo que aprovecha la capacidad natural de algunos virus de matar las células en las que prolifera y la capacidad de extenderse a células vecinas, amplificando de esta manera el efecto terapéutico de la dosis introducida inicial. En viroterapia, la transducción de las células de cáncer y la replicación vírica se controlan cuidadosamente mediante ingeniería genética del genoma vírico para conseguir una erradicación tumoral eficaz y segura. Una erradicación tumoral segura exige la introducción de diversas modificaciones genéticas en el genoma adenovírico, restringiendo de esta manera la replicación a exclusivamente las células tumorales y obteniendo finalmente la erradicación selectiva del tumor sin efectos secundarios en el tejido sano.

Pueden utilizarse eliminaciones (“deletions”) específicas de genes adenovíricos reguladores clave para crear proteínas disfuncionales o la falta de su expresión, que conduce a una dependencia de una característica genética específica presente en las células diana. Las eliminaciones parciales de E1A resultan en una replicación restringida en las células normales, pero permiten la replicación en las células diana, tales como las células de cáncer. Se han creado virus de replicación condicional con una eliminación de 24 pares de bases en la CR2 (región constante 2) y se ha demostrado que resultan potentes y selectivos en el tratamiento del glioma y los xenoinjertos de cáncer de mama (Fueyo et al., 2000; Heise et al., 2000). Su especificidad para el cáncer resulta de la incapacidad de E1A disfuncional de liberar factor de transcripción E2F1, conduciendo a que se requiera E2F1 libre. E2F1 es abundante en las células de cáncer, en donde la ruta de pRb resulta interrumpida más frecuentemente (Hanahan y Weinberg, 2000).

Los resultados clínicos y preclínicos han mostrado que el tratamiento con virus oncolíticos desarmados no es suficientemente inmunoestimulante para resultar en respuestas inmunitarias terapéuticas antitumorales sostenidas. A este respecto, los virus oncolíticos han sido armados para ser más inmunoestimuladores. Los virus pueden manipularse para expresar proteínas altamente inmunogénicas, tales como factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF). En el caso de que se expresen proteínas inmunogénicas dentro del microambiente tumoral, son potentes estimuladores de inmunidad antitumoral específica y duradera. La introducción de genes inmunoterapéuticos en células tumorales y, además, su traducción en proteínas, conduce a la activación de la respuesta inmunitaria y a una destrucción más eficiente de las células tumorales. Las células inmunitarias más relevantes a este respecto son las células asesinas naturales (NK) y las células T CD8+ citotóxicas.

El ONCOS-102 (Ad5/3-D24-GM-CSF; dado a conocer en el documento n° WO 2010/072900) es un adenovirus de serotipo 5, que comprende una cápside quimérica para la administración génica potenciada en células de cáncer y una eliminación de 24 bp en el sitio de unión de Rb de la región E1A para la replicación restringida a las células de cáncer. El ONCOS-102 está armado con factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) para un efecto inmunoestimulador potenciado. La seguridad y actividad inmunitaria de ONCOS-102 ya ha sido demostrado en estudio clínico de fase 1 (NCT01598129). En dicho estudio de fase 1 de los presentes inventores, el tratamiento local de mesotelioma pleural con ONCOS-102 indujo una respuesta sistémica de células T CD8+ antitumorales y la infiltración de las células T CD8+ en los tumores en el paciente de mesotelioma pleural maligno refractario de estadio terminal.

Koski et al. (2010) dan a conocer el tratamiento de un total de 21 pacientes con tumores sólidos avanzados refractarios a terapias estándares con ONCOS-102. Según dichos estudios, ONCOS-102 aparentemente resulta seguro en el tratamiento de los pacientes de cáncer. También se observaron signos prometedores de eficacia.

Se han dado a conocer algunos ejemplos de terapias de combinación que utilizan viroterapia junto con inhibidores de punto de control. El documento WO2014/047350 contempla un virus oncolítico recombinante con un gen codificante de un anticuerpo anti-PD-1 insertado en el genoma vírico. La publicación WO 2014/036412 se refiere a métodos de tratamiento del melanoma utilizando un virus herpes simplex en combinación con un inhibidor de punto de control inmunitaria. Actualmente se está realizando un estudio de fase 1b/3 de talimogén laherparepvec (T-VEC, bajo el nombre comercial Imlygic), que es una inmunoterapia oncolítica basada en el virus del herpes simple (VHS)-1 diseñado para replicarse selectivamente en tumores, producir GM-CSF y estimular respuestas inmunitarias antitumorales en el melanoma, y de pembrolizumab en melanoma de estadio IIIB-IV no resecable.

La publicación US 20150086541A1 da a conocer un método para reducir o retrasar un incremento del tamaño de un tumor localizado o metastásico mediante la utilización de una combinación de una terapia génica citotóxica inmunoestimuladora y un agente modulador de punto de control inmunitaria, junto con otras terapias, entre ellas la terapia de radiación, la quimioterapia, la cirugía y las inmunoterapias.

Ranki et al. (Journal for Immunotherapy of Cancer, vol. 4:17, 2016) dan a conocer que ONCOS-1O2 es seguro, induce inmunidad antitumoral y muestra eficacia clínica. Además, Ranki et al. indican que "el tratamiento resultó en la infiltración de células T CD8+ en tumores y la regulación positiva de PD-L1", subrayando el potencial de ONCOS-102 como agente inmunosensibilizador para terapias de combinación con inhibidores de punto de control. Ranki et al. concluye además que ONCOS-102 sensibiliza tumores pobres en células inmunitarias para el bloqueo de PD-1/PD-L1.

En el tratamiento del melanoma, se ha demostrado que un enfoque combinado, en el que los tratamientos presentan como diana dos inhibidores diferentes de punto de control, funciona mejor que la utilización de cualquiera de los tratamientos por sí solo. Sin embargo, la combinación comporta un mayor riesgo de efectos secundarios graves. Existe una necesidad adicional de terapias de combinación para mejorar la eficacia y la seguridad de tratamientos dirigidos a inducir una respuesta inmunitaria contra diversos cánceres. De esta manera, existe una necesidad de tratamientos adicionales para el cáncer, especialmente para el melanoma avanzado.

Sumario de la invención

Tradicionalmente se ha considerado que la presencia de virus en las lesiones resulta necesaria para su eficacia. Actualmente los inventores han encontrado inesperadamente que el virus produce un efecto sistémico, aunque éste se administre localmente. También ha resultado inesperado que, tras un periodo de sensibilización intensa a ONCOS-102, los tumores originalmente refractarios a inhibidor de PD-1, se vuelven sensibles a los inhibidores de PD-1.

Los objetivos de la presente invención son: proporcionar una nueva combinación de adenovirus oncolíticos y un inhibidor de punto de control o inhibidores de punto de control, una nueva terapia de combinación que utiliza adenovirus oncolíticos y un inhibidor de punto de control o inhibidores de punto de control para el tratamiento de cáncer en un paciente y además la resolución de problemas relacionados con la terapia convencional del cáncer.

Un aspecto de la presente divulgación es el adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento de cáncer humano, preferentemente en el tratamiento de melanoma maligno humano, en el que la administración del virus en el paciente humano que lo requiere se lleva a cabo en combinación con la administración de uno o más inhibidores de punto de control.

Otro aspecto de la presente divulgación es un método de tratamiento de cáncer humano, preferentemente melanoma maligno humano, en un paciente, que comprende una etapa de administración en dicho paciente de adenovirus ONCOS-102 y uno o más inhibidores de punto de control.

Todavía otro aspecto de la presente divulgación es la utilización de adenovirus ONCOS-102 en el tratamiento del melanoma humano, en el que se administra el virus en el paciente en combinación con uno o más inhibidores de punto de control.

Breve descripción de los dibujos

La figura siguiente se incluye para demostrar adicionalmente determinados aspectos y características de la presente invención. La invención podrá entenderse mejor haciendo referencia a uno o más de dichos dibujos en combinación con la descripción detallada de formas de realización específicas, incluyendo ejemplos.

Figura 1. Tratamiento de tumores basados en células A-375 de melanoma humano en ratones inmunodeficientes y humanizados con ONCOS-102 solo, con inhibidor de punto de control solo o con inhibidor de punto de control en combinación con ONCOS-102 en un estudio de eficacia. A) Un tumor basado en células A-375 mostraba sensibilidad dependiente de la dosis de virus en ratones inmunodeficientes. B) Un sistema inmunitario humano inhibía el crecimiento tumoral de A-375 en ratones humanizados, mientras que el crecimiento tumoral no resultó inhibido en ratones inmunodeficientes no tratados. C) Se muestra el efecto sistémico del virus oncolítico en combinación con pembrolizumab (Keytruda) en ratones NOG humanizados con injertación de células tumorales A375. El crecimiento de tanto el tumor SK-MEL2 derecho tratado con ONCOS-102 (5x107 VP) como el crecimiento del tumor SK-MEL2 izquierdo no tratado con ONCOS-102 resultó inhibido de manera similar, en comparación con el tumor tratado con pembrolizumab solo. El tumor en ratones, en el que sólo se administró pembrolizumab en forma de una inyección IP (Keytruda), no mostró reducción de la tasa de crecimiento, ilustrando adicionalmente que la presencia de ONCOS-102 no resulta necesaria para el efecto sistémico. D) La combinación de pembrolizumab (Keytruda) y ONCOS-102 muestra un efecto antitumoral potenciado del tumor A-375 en ratones humanizados en comparación con el tratamiento de los ratones con ONCOS-102, pembrolizumab o nivolumab (Opdivo) solos.

Descripción detallada de la invención

A menos que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente solicitud presentan los mismos significados entendidos comúnmente por el experto ordinario en la materia a la que se refiere la presente invención.

La expresión "respuesta antivírica" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la respuesta de una célula a la infección vírica e incluye, por ejemplo, la producción de interferones, la liberación de citocinas, la producción de quimiocinas, la producción de linfocinas o cualquier combinación de las mismas.

Las expresiones "célula hospedadora normal" y "tejido normal" tal como se utilizan en la presente memoria se refieren a una célula o tejido no infectado no canceroso con una respuesta antivírica intacta.

La expresión "agente oncolítico" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un agente capaz de inhibir el crecimiento de las células tumorales y/o eliminarlas.

El término "sujeto" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier organismo vivo, incluyendo seres humanos y animales, tejido humano y animal, y células humanas y animales.

El término "paciente" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier sujeto (preferentemente humano) que sufre una enfermedad, tal como melanoma, que es probable que se beneficie de un tratamiento con una terapia de combinación tal como se indica en la presente memoria.

Los adenovirus son virus sin cubierta de 70 a 90 nm de diámetro con una cápside icosaédrica. Su genoma es de ADN de doble cadena lineal y 25 a 45 kilobases de tamaño con repeticiones terminales invertidas (RTI) en ambos extremos y una proteína terminal unida a los extremos 5'.

La cápside icosaédrica está formada de tres proteínas principales, de las que los trímeros de hexona son los más abundantes. Cada uno de los doce vértices de la cápside también contiene una proteína pentamérica, una base de pentona que está unida covalentemente a la fibra. La fibra es una proteína trimérica que sobresale de la base pentona y es una estructura de tipo barra con salientes. Otras proteínas víricas: IIIa, IVa2, VI, VIII y IX, también están asociadas a la cápside vírica. Las proteínas VII, el péptido pequeño mu y una proteína terminal (PT) están asociadas al ADN. La proteína V proporciona una unión estructural a la cápside mediante la proteína VI.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "cápside" se refiere a la cubierta proteica del virus, que incluye proteínas de base hexona, fibra y pentona.

Todos los adenovirus humanos presentan similitudes en su estructura de fibra. Cada una presenta una cola N-terminal, un eje con secuencias repetidas y un dominio de botón (“knob”) C-terminal con una estructura globular. El dominio de botón es responsable principalmente de la unión al receptor celular diana y su estructura globular presenta una gran superficie para la unión lateral y apical. Las proteínas de fibra de los adenovirus de diferentes subgrupos característicamente difieren en longitud y capacidad de flexión.

La fibra participa en la unión del virus a la célula diana. En primer lugar, el dominio de botón de la proteína de fibra se une al receptor de la célula diana; en segundo lugar, el virus interactúa con una molécula de integrina y, en tercer lugar, el virus resulta endocitado por la célula diana. A continuación, el genoma vírico es transportado desde los endosomas hasta el interior del núcleo y puede iniciarse la replicación del genoma vírico.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "quimerismo Ad5/3" de la cápside se refiere a un quimerismo en el que la parte de botón de la fibra es de Ad serotipo 3 y el resto de la fibra es de Ad serotipo 5.

Los adenovirus dependen de la maquinaria celular para replicar el genoma vírico. Pueden infectar las células quiescentes e inducir un estado similar a la etapa S del ciclo celular, activando la replicación del ADN vírico. El genoma adenovírico puede dividirse en genes tempranos inmediatos (E1A), tempranos (E1B, E2, E3, E4), intermedios (IX, Iva) y tardíos (L1-L5).

Los productos del gen E3 no resultan esenciales para la replicación vírica in vitro, aunque están dedicados al control de diversas respuestas inmunitarias del huésped. E3-gp19K inhibe el transporte del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) de clase I del retículo endoplásmico (RE) a la membrana plasmática, bloqueando de esta manera la presentación de péptidos a los linfocitos T mediante el CMH.

La proteína adenovírica E1A se describió originariamente como una proteína de unión PRb capaz de inducir la replicación del ADN en células normales quiescentes. Una de las funciones clave de la proteína E1A es interrumpir las interacciones de pRb-E2F, liberando de esta manera los factores de transcripción E2F, que activan los promotores sensibles a E2F y la transcripción de los genes que controlan, tal como E2A adenovírico. La región conservada 2 (CR2) en la proteína E1A establece una interacción fuerte con el dominio de unión de bolsillo de pRb y CR1 media en la rotura misma de la unión de E2F y pRb. Se han creado virus de replicación condicional con una eliminación de 24 pares de bases en la CR2 y se ha demostrado que son potentes y selectivos en el tratamiento del glioma y los xenoinjertos de cáncer de mama. Su especificidad para el cáncer resulta de la incapacidad de E1A disfuncional de liberar factor de transcripción E2F1, conduciendo a que se requiera E2F1 libre.

El adenovirus ONCOS-102 se ha dado a conocer anteriormente en la publicación WO 2010/072900. El ONCOS-102 es un adenovirus de serotipo 5 (Ad5) que muestra las modificaciones siguientes, difiriendo del genoma de Ad5:

1. una eliminación de 24 pares de bases (bp) en la región constante 2 (CR2) del gen E1A. La proteína E1A disfuncional no puede unirse y liberar el factor de transcripción E2F1 respecto de la proteína del retinoblastoma (Rb), conduciendo a que se requiera E2F1 libre para la transcripción génica del adenovirus. El factor E2F1 libre es abundante en las células de cáncer, en donde la ruta de pRb resulta interrumpida más frecuentemente. De esta manera, los virus con la eliminación de 24 bp en E1A son capaces de replicarse eficientemente en las células de cáncer. La transcripción del gen E1A en ARNm está controlada por el promotor endógeno de E1A.

2. Se ha introducido una eliminación de 965 bp en la región temprana 3 (E3) codificante de las proteínas 6.7K y gp19K. Dichas proteínas están asociadas a la capacidad del adenovirus de evadir los mecanismos de control inmunitario del huésped y sus funciones son prescindibles en la replicación adenovírica.

3. Un transgén codificante de la proteína factor estimulador de colonias de macrófagos-granulocitos (GM-CSF) humana ha sido insertado en la región E3, sustituyendo 6.7K y GP19K. La transcripción génica del GM-CSF en ARNm está controlada por el promotor endógeno de e 3. Es decir, en adenovirus ONCOS-102, los 965 pares de bases codificantes de los genes víricos gp19K y 6.7K han sido eliminados de la región E3 y se ha introducido un transgén de GM-CSF para sustituirlos.

4. El botón de fibra de serotipo 5 ha sido sustituido por fibra de serotipo 3, permitiendo de esta manera la entrada del virus en las células mediante el receptor de serotipo 3 en lugar del receptor CAR de serotipo 5.

En el adenovirus ONCOS-102, se encuentra presente el promotor de E1A nativo, es decir, no ha sido sustituido por otro promotor.

Brevemente, en adenovirus ONCOS-102, GM-CSF se encuentra bajo elementos endógenos de control de E3 vírico, dando como resultado la expresión del transgén asociado a la replicación a partir de aproximadamente 8 horas de la infección. El virus se replica de una manera selectiva tumoral, resultando de esta manera en la producción restringida al tumor de GM-CSF. La especificidad tumoral se consigue mediante una eliminación de 24 bp, que anula el sitio de unión a Rb de E1A y, tal como se ha demostrado en publicaciones anteriores, el virus se replica selectivamente en las células con defectos de la ruta de p16-Rb, entre ellas la mayoría, si no todos, los cánceres humanos. La potencia oncolítica del adenovirus ONCos-102 se ha demostrado que resulta más eficaz que el virus de control de tipo salvaje.

Los adenovirus oncolíticos que expresan GM-CSF inducen inmunidad anticáncer, actuando simultáneamente de manera directa sobre las células de cáncer mediante oncólisis. GM-CSF es un potente inductor de la inmunidad antitumoral sistémica asociada al reclutamiento y maduración de las células presentadoras de antígenos (CPA), principalmente células dendríticas, así como el reclutamiento de células del brazo innato de la inmunidad. Sin embargo, los niveles de citocinas elevados sistémicamente representan un riesgo de efectos secundarios tóxicos. Aparte del riesgo directo de efectos secundarios mediados por concentraciones séricas elevadas de GM-CSF, un riesgo indirecto resulta del reclutamiento de células mieloides supresoras (MDSC). Aunque el efecto inmunosupresor de las MDSC resulta potencialmente perjudicial para los pacientes de cáncer en general, podría resultar particularmente contraproducente en el contexto de la inmunoterapia del cáncer. De esta manera, la restricción de la expresión de GM-CSF al sitio tumoral resulta crucial.

El adenovirus ONCOS-102 ha mostrado un buen potencial oncolítico y la producción de GM-CSF humano funcionalmente activo in vitro (Koski et al., 2010). Se ha demostrado en hámster inmunocompetentes que el virus resulta eficaz en detener el crecimiento de tumores pancreáticos singénicos agresivos. La evidencia de replicación del virus en tumores se demostró mediante medición del número de copia vírico. Se demostró selectividad de la replicación, ya que no se produjo ningún incremento del número de copia vírico en tejido hepático inyectado directamente. Se demostró la producción ligada a la replicación local de GM-CSF en tumores, mientras que se produjeron muy pocas fugas de GM-CSF al suero o al hígado. También se demostró que la combinación de una dosis baja de ciclofosfamida con adenovirus ONCOS-102 puede potenciar el efecto antitumoral, mientras que el tratamiento de ciclofosfamida solo no resultaba en una reducción significativa del crecimiento tumoral.

Globalmente, el tratamiento de los pacientes de cáncer avanzado con adenovirus ONCOS-102 aparentemente resulta seguro y se han observado signos prometedores de posible eficacia. Aunque el virus se encuentra presente en suero durante periodos prolongados incluso después de una única dosis, las inyecciones múltiples es probable que mejoren la transducción tumoral y potencien la inmunidad antitumoral.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "inhibidor de punto de control inmunitario" o "inhibidor de punto de control" se refiere a moléculas que reducen, inhiben, interfieren o modulan total o parcialmente una o más proteínas de punto de control. Las proteínas de punto de control regulan la activación o función de las células T. Son cruciales al proceso de punto de control inmunitaria las rutas de punto de control inmunitaria del antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4) y de la proteína 1 de muerte programada (PD-1). Las rutas de CTLA-4 y PD-1 se cree que funcionan en diferentes estadios de la respuesta inmunitaria. Se considera que CTLA-4 es el "líder" de los inhibidores de punto de control inmunitaria, ya que detiene las células T potencialmente autorreactivas en la etapa inicial de activación de células T no expuestas, típicamente en ganglios linfáticos. La ruta de PD-1 regula células T previamente activadas en las etapas posteriores de la respuesta inmunitaria, principalmente en tejidos periféricos.

Los pacientes en progresión se ha demostrado que no presentan regulación positiva de PD-L1 por las células tumorales o células inmunitarias infiltrantes de tumor (Romano et al., 2015). Las terapias inmunitarias con diana en la ruta de PD-L1/PD-1, de esta manera, podrían resultar especialmente eficaces en tumores en los que dicho eje inmunosupresor es funcional, y revertir el equilibrio hacia un medio inmunoprotector reactivaría y fortalecería una respuesta inmunitaria antitumoral preexistente. Los anticuerpos monoclonales pueden bloquear las interacciones celulares que regulan negativamente las respuestas inmunitarias de células T, tales como CD80/CTLA-4 y PD-1/PD-1L, amplificando la inmunidad preexistente e induciendo de esta manera respuestas inmunitarias antitumorales (Sagiv-Barfi et al., 2015).

De esta manera, PD-1 limita la actividad de las células T en tejidos periféricos en el tiempo de una respuesta inflamatoria a la infección y limitar el bloqueo de PD-1 autoinmunitario in vitro potencia la proliferación de las células T y la producción de citocinas en respuesta a un reto por dianas antigénicas específicas o por células alogénicas en reacciones de linfocitos mixtas. El bloqueo de PD-1 puede conseguirse mediante una diversidad de mecanismos, incluyendo anticuerpos que se unen a PD-1 o su ligando, PD-L1.

La inhibición de las rutas de punto de control inmunitario ha llevado a la autorización de varios fármacos nuevos: ipilimumab (anti-CTLA-4, Yervoy®), pembrolizumab (anti-PD-1; Keytruda®) y nivolumab (anti-PD-1; Opdivo®). También se encuentran disponibles inhibidores de PD-L1, tales como Atezolizumab (MPDL3280), Avelumab (MSB0010718C) y Durvalumab (MEDI4736),. Estos anticuerpos antagonistas se han asociado a respuestas clínicas objetivas en pacientes de cáncer. Los anticuerpos con diana en CTLA-4 ya han sido comercializados (por ejemplo, Ipilimumab, Yervoy, Bristol-Myers Squibb, b Ms ) para el melanoma metastásico. También continúan las terapias de anticuerpos con anti-PD-L1 (p.ej., MPDL3280A, Roche) y anti-PD-1 (por ejemplo, Nivolumab, BMS).

Entre otros inhibidores de punto de control inmunitario se incluyen inhibidores del gen 3 de activación linfocitaria (LAG3), tales como IMP321, una proteína de fusión de Ig soluble. Entre otros inhibidores de punto de control inmunitario se incluyen los inhibidores de B7, tales como los inhibidores de B7-H3 y de B7-H4. En particular, el anticuerpo anti-B7-H3 llamado MGA271. También se encuentran incluidos los inhibidores de TIM3 (dominio de inmunoglobulina de células T y dominio 3 de mucina).

Según la descripción, los bloqueantes de PD-1 pueden incluir anticuerpos anti-PD-L1. Según la descripción, entre los bloqueantes de PD-1 se incluyen anticuerpos anti-PD-1 y proteínas de unión similares, tales como nivolumab (MDX 1106, BMS 936558, ONO 4538), un anticuerpo IgG4 totalmente humano que se une a PD-1 y bloquea su activación por sus ligandos PD-L1 y PD-L2; lambrolizumab (MK-3475 o SCH 900475), un anticuerpo IgG4 monoclonal humanizado contra PD-1; CT-011, un anticuerpo humanizado que se une a PD-1; AMP-224 es una proteína de fusión de B7-DC; una parte Fc de anticuerpo; BMS-936559 (MdX- 1105-01) para el bloqueo de PD-L1 (B7-H1). Son ejemplos adicionales de inhibidores de PD-L1 que pueden utilizarse, atezolizumab (MPDL3280), avelumab (MSB0010718C) y durvalumab.

Preferentemente, en la invención se utilizan los anticuerpos anti-PD-1, pembrolizumab (Keytruda) y nivolumab (Opdivo). La descripción da a conocer que también pueden utilizarse inhibidores de PD-L1, tales como durvalumab, en combinación con anticuerpos anti-PD-1. El inhibidor de punto de control preferido de la presente invención es PD-1.

El pembrolizumab (Keytruda) y el nivolumab (Opdivo) se ha demostrado que resultan útiles en el tratamiento de varios tipos de cáncer, incluyendo el melanoma de la piel, el cáncer pulmonar de células no pequeñas, el cáncer renal, los cánceres de cabeza y cuello y el linfoma de Hodgkin. También se están estudiando para la utilización contra muchos otros tipos de cáncer. Un ensayo clínico de fase 1B de durvalumab y tremelimumab (anticuerpos monoclonales con diana en PD-L1) han mostrado cierta actividad en el cáncer pulmonar de células no pequeñas (NSCLC). Los datos de fase 1 en vejiga urotelial metastásico avanzado (estudio 1108) ha conducido a la designación de terapia innovadora de la FDA. Además, los primeros resultados del ensayo de fase I de combinación de durvalumab y gefitinib en pacientes de cáncer de pulmón "se han mostrado prometedores". Un ejemplo adicional de un fármaco con diana en PD-L1 es el atezolizumab (Tecentriq). Este fármaco puede utilizarse para tratar el cáncer de vejiga y también se está estudiando para la utilización contra otros tipos de cáncer.

Son tipos de cáncer que pueden tratarse mediante el método de la invención utilizando ONCOS-102 en combinación con uno o más inhibidores de punto de control, por ejemplo, melanoma, cáncer renal, cáncer ovárico, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón (tal como carcinoma pulmonar de células pequeñas, carcinoma pulmonar de células no pequeñas y carcinoma pulmonar escamoso de células no pequeñas), cáncer gástrico, linfoma de Hodgking clásico, mesotelioma y cáncer hepático. Preferentemente, el cáncer que debe tratarse con la presente invención es melanoma avanzado.

El melanoma es un tumor de los melanocitos, células que se derivan de la cresta neural. El melanoma se produce principalmente en adultos, y más de la mitad de los casos aparecen en zonas aparentemente normales de la piel. Aunque la mayoría de melanomas aparecen en la piel, también pueden aparecer en superficies mucosas o en otros sitios a los que migran las células de la cresta neural. La expresión "melanoma maligno" o "melanoma" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un tipo de cáncer que se desarrolla a partir de células que contienen pigmento conocidas como melanocitos. Los melanomas se producen típicamente en la piel, aunque raramente aparecen en la boca, intestinos u ojos. Al extenderse el melanoma a otros sitios del cuerpo se denomina metastásico o avanzado. De esta manera, "melanoma avanzado" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a melanoma metastásico. El melanoma avanzado es la diana principal de la terapia de combinación tal como se describe en la presente memoria.

El pronóstico del paciente de melanoma resulta afectado por factores clínicos e histológicos y por la localización anatómica de la lesión. El grosor y/o nivel de invasión del melanoma, linfocitos infiltrantes de tumor, índice mitótico y ulceración o sangrado en el sitio primario afectan al pronóstico. La estadificación clínica se basa en si el tumor se ha extendido a ganglios linfáticos regionales o a sitios distantes. El melanoma puede extenderse por extensión local (a través del sistema linfático) y/o por vías hemáticas a sitios distantes. Cualquier órgano puede resultar afectado por metástasis, aunque los pulmones y el hígado son sitios comunes.

Los melanomas de estadio IV (es decir, los melanomas avanzados) con frecuencia resultan difíciles de curar, ya que ya se han extendido a ganglios linfáticos distantes o a otras zonas del cuerpo. Entre las terapias no quirúrgicas tradicionales para melanoma no resecable o avanzado en adultos se incluyen la quimioterapia (dacarbazina, temozolomida u otros agentes, solos o en combinación) o la interleucina-2. Aunque algunos regímenes producen respuestas objetivas, habitualmente son efímeras. Algunas terapias más nuevas, tales como la inhibición de BRAF (vemurafenib) y agentes estimuladores inmunitarios (ipilimumab) han mostrado una mejora significativa de la supervivencia global en comparación con los tratamientos de control para un porcentaje limitado de pacientes tratados; sin embargo, la toxicidad es un problema.

El tratamiento de los melanomas avanzados ha cambiado en los últimos años, a medida que las formas más nuevas de inmunoterapia y fármacos dirigidos se ha demostrado que resultan más eficaces que la quimioterapia. Los enfoques actuales de inmunoterapia para el melanoma se clasifican en siete categorías principales: inhibidores de punto de control inmunitario, terapias de virus oncolítico, vacunas contra el cáncer, inmunoterapia de adyuvante, terapia de células adoptivas, anticuerpos monoclonales y citocinas. Un concepto nuclear en la inmunoterapia del cáncer es que las células tumorales, que normalmente resultarían reconocidas por las células T, han desarrollado maneras para evadir el sistema inmunitario del huésped aprovechando la tolerancia periférica. Se ha demostrado que inhibidores de punto de control tales como el pembrolizumab (Keytruda), el nivolumab (Opdivo) y el ipilimumab (Yervoy) ayudan a algunas personas con melanoma avanzado a vivir más tiempo.

La "quimioterapia", tal como se utiliza el término en la presente memoria, se refiere a la utilización de compuestos químicos o fármacos en el tratamiento de una enfermedad, aunque el término quimioterapia está más frecuentemente asociado al tratamiento del cáncer. Los compuestos quimioterápicos del cáncer comprenden prácticamente 100 fármacos individuales.

Tal como se ha dado a conocer anteriormente, la terapia del cáncer con adenovirus ONCOS-102, así como la terapia con un inhibidor de punto de control, ha mostrado cierta eficacia al utilizarlo solo. Los inventores querían estudiar si la combinación de terapia de genes adenovíricos con inhibidores de punto de control podría resultar más eficaz en el tratamiento del melanoma avanzado que cualquiera de los dos por sí solo. Particularmente, los presentes inventores estaban interesados en si el melanoma avanzado, que ha dejado de responder al tratamiento anterior con inhibidores de punto de control, empezará a responder nuevamente si se trata con ONCOS-102.

La "terapia de combinación" tal como se utiliza la expresión en la presente memoria se refiere a la administración de ONCOS-102 y uno o más inhibidores de punto de control que se administran en un paciente que lo necesita. Preferentemente, ONCOS-102 se utiliza en combinación con un anticuerpo anti-PD-1, tal como pembrolizumab. Según la descripción, puede administrarse una combinación de ONCOS-102 y dos anticuerpos anti-PD-1, una combinación de anticuerpo anti-PD-1 y anticuerpo anti-PD-L1 o dos anticuerpos anti-PD-L1, en un paciente que lo necesita.

En estudios anteriores, ha ocurrido que algunos pacientes adquirían resistencia al tratamiento de inhibidor de PD-.1 Probablemente el problema es que no existe ninguna inmunidad subyacente contra el tumor, en cuyo caso los inhibidores de punto de control resultan ineficaces, ya que reducen la supresión inmunitaria pero no generan inmunidad.

Los presentes inventores han mostrado anteriormente que ONCOS-102 induce respuestas de células T específicas tumorales (células T CD8+ en sangre periférica) en pacientes en los que no podían detectarse respuestas de células T específicas tumorales antes del tratamiento (Ranki et al., 2014; Ranki et al., 2016 y Vassilev et al., 2015). Además, se observó un cambio adaptativo dinámico en las células de cáncer ilustrado en la forma de regulación positiva de PD-L1 tras el tratamiento, sugiriendo de esta manera que ONCOS-102 podría ayudar a sensibilizar los tumores a los inhibidores de punto de control, tales como los inhibidores de PD-1/PD-L1.

En la terapia de combinación, el virus y también el inhibidor o inhibidores de punto de control pueden administrarse en varias dosis durante varios días. El protocolo de tratamiento comprende, en primer lugar, sensibilizar con el virus, seguido de la administración del inhibidor de punto de control y después, opcionalmente, continuar con la administración de tanto virus como inhibidor de punto de control. También puede utilizarse una secuencia inversa de administraciones, es decir, en primer lugar, sensibilizar con el inhibidor o inhibidores de punto de control, seguido de la administración del virus, y después, opcionalmente, continuar con la administración de tanto virus como inhibidor de punto de control.

El término "sensibilización" (“priming”) tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a, por ejemplo, la administración de virus oncolítico en primer lugar para sensibilizar las células frente a los efectos de los inhibidores de punto de control. Además, pueden utilizarse inhibidores de punto de control para sensibilizar las células antes de administrar el virus. El término "sensibilización" también puede referirse a la utilización de un pretratamiento inductor de apoptosis. La sensibilización tumoral realizada con virus oncolíticos resulta en la muerte inmunogénica de células de cáncer, que está asociada a la presentación de calreticulina sobre la superficie celular y la liberación de adyuvantes naturales, específicamente proteína B1 de grupo de alta movilidad (HMGB1) y ATP procedentes del interior de las células moribundas, conduciendo finalmente a la estimulación de las CD y la consiguiente activación de la respuesta inmunitaria adaptativa. Dicho cambio inducido por virus en el medio tumoral resulta esencial en la facilitación de una respuesta inmunitaria antitumoral significativa. Las células presentadoras de antígeno capturan antígenos tumorales a partir de células tumorales moribundas y las procesan para la presentación a CMH de clases I y II, migran a ganglios linfáticos secretores y estimulan las células B y T específicas de antígeno.

La expresión "sensibilizador vírico" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un agente que puede mejorar la eficacia del virus oncolítico. Entre los agentes adecuados para dicha terapia de combinación o que pueden utilizarse como sensibilizadores víricos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, ácido retinoico todo-trans, azacitidina, azatioprina, bleomicina, carboplatino, capecitabina, cisplatino, clorambucilo, ciclofosfamida, citarabina, daunorrubicina, docetaxel, doxifluridina, doxorrubicina, epirrubicina, epotilón, erlotinib, etopósido, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, idarrubicina, imatinib, mecloretamina, mercaptopurina, Mmetotrexato, mitoxantrona, oxaliplatino, paclitaxel, pemetrexed, temozolomida, tenipósido, tioguanina, valrrubicina, vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina. Preferentemente, el sensibilizador vírico que debe utilizarse es la ciclofosfamida.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "concurrente" se refiere a una medicación o terapia que se ha administrado antes, después o simultáneamente con la terapia de combinación tal como se indica en la presente memoria. El periodo para una terapia concurrente puede variar entre minutos y varias semanas. Típicamente, la terapia que es concurrente con la terapia de combinación tal como se indica en la presente memoria dura algunos días o algunas semanas.

Tal como se indica en la presente memoria, la expresión "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de un compuesto, agente terapéutico, virus o fármaco, que es capaz de llevar a cabo el resultado deseado. Por ejemplo, una cantidad eficaz de un inhibidor de punto de control y/o adenovirus es una cantidad suficiente para producir resultados clínicos beneficiosos o deseados, incluyendo resultados clínicos. Puede administrarse una cantidad eficaz en una o más administraciones. Tal como se indica en la presente memoria, la cantidad eficaz es una cantidad suficiente para mejorar, estabilizar, revertir, enlentecer y/o retrasar la progresión de un melanoma maligno o de curar un melanoma maligno. Según la presente divulgación, el efecto de un inhibidor de punto de control y adenovirus ONCOS-102 puede monitorizarse, por ejemplo mediante monitorización de la reacción del tumor a dicho tratamiento. La monitorización de la reacción del tumor puede llevarse a cabo con cualquier método adecuado conocido de la técnica. Puede llevarse a cabo, por ejemplo, con métodos que miden el estado inmunitario de las células, tales como los indicados en Ranki et al. (2014). Por ejemplo, la monitorización puede llevarse a cabo mediante medición de la presencia de linfocitos infiltrantes tumorales en el tumor; la respuesta de tipo TH1 puede monitorizarse con una micromatriz y también puede utilizarse el ensayo de Inmunospot (ELISPOT) en la monitorización.

La cantidad eficaz es, de esta manera, una cantidad capaz de, o necesaria, para causar un efecto o reacción deseado en el tumor. Tal como se entiende en la técnica, una cantidad eficaz puede variar dependiendo, entre otros, de la historia del paciente, así como de otros factores, tales como el tipo y/o dosis de inhibidor de punto de control utilizado.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "periodo de tratamiento" se refiere a un periodo de tiempo en el que se lleva a cabo el tratamiento de combinación. El periodo de tratamiento puede consistir en varias administraciones de ONCOS-102 e inhibidor de punto de control, en el que las administraciones pueden llevarse a cabo en ciclos. El periodo de tratamiento puede durar semanas o meses. El periodo de tratamiento puede durar hasta un año.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "periodo de administración" se refiere a un periodo de tiempo durante el que el adenovirus, los inhibidores de punto de control u otra medicación se administra en un paciente. Durante el periodo de administración, puede administrarse una única dosis o varias dosis del agente en cuestión. El periodo de administración puede ser de minutos, horas, días, semanas o meses. El periodo de administración puede consistir en ciclos. Por ejemplo, puede utilizarse un ciclo de tres semanas (21 días) en la administración del inhibidor o inhibidores de punto de control.

El pembroluzumab (Keytruda) habitualmente se administra en forma de una dosis en tres semanas, aunque también pueden utilizarse otros ciclos, tales como la administración de una cantidad reducida cada semana. El nivolumab (Opdivo) habitualmente se administra en forma de una dosis cada dos semanas, aunque también pueden utilizarse otros ciclos, tales como la administración de una cantidad reducida cada semana.

Las composiciones terapéuticas generalmente se formulan respecto a la vía de administración particular. En la terapia de combinación tal como se indica en la presente memoria, se utiliza un inhibidor de punto de control, tal como el pembroluzumab, en su concentración eficaz. A título de ejemplo, puede administrarse pembroluzumab en forma de una infusión intravenosa (i.v.) durante 10 minutos el día 1 de cada ciclo de 21 días, en el caso de que se utilice un ciclo de 21 días.

Otro objeto de la presente invención es el adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento del melanoma humano, especialmente el melanoma humano avanzado, en el que el virus se administra en combinación con un inhibidor de punto de control en un paciente, y en el que el inhibidor de punto de control es el pembrolizumab.

En algunas formas de realización de la presente divulgación, también pueden utilizarse diversas combinaciones de ciclohexamida, cianocobalamina, ácido fólico y dexametasona, además de ONCOS-102 y uno o más inhibidores de punto de control. Más específicamente, a partir de la lista de agentes que consiste en ciclohexamida, cianocobalamina, ácido fólico y dexametosa, puede utilizarse uno, dos, tres o cuatro y cualquier combinación de los mismos concurrentemente con la terapia de combinación que comprende ONCOS-102 y un inhibidor de punto de control. A título de ejemplo, el sujeto puede tratarse con uno o más agentes auxiliares que reducen o eliminan las reacciones de hipersensibilidad antes, durante y después de la administración de los agentes de la terapia de combinación indicada, tal como uno o más de dexametasona, ácido fólico y vitamina B12 antes, durante y después de la administración de los agentes de la terapia de combinación. En determinadas formas de realización, el sujeto se trata con 2 a 25 mg de dexametosa por vía oral el día antes, el mismo día y el día después de la administración de los agentes de la terapia de combinación; 400 a 1000 |jg de ácido fólico por vía oral diarios, durante un periodo que se inicia 7 días antes de la administración de los agentes de la terapia de combinación, durante por lo menos un periodo de tratamiento, y durante 21 días después de la última administración de agentes de la terapia de combinación, y 1000 jg de vitamina B12 por vía intramuscular antes de la primera administración de agentes de la terapia de combinación en un periodo de tratamiento.

Puede utilizarse cualquier método convencional para la administración de ONCOS-102 en un paciente que necesita del mismo. La vía de administración depende de la formulación o forma de la composición, la enfermedad, la localización de los tumores, el paciente, las comorbilidades y otros factores. En una forma de realización preferente de la presente divulgación, la administración se lleva a cabo mediante una administración intratumoral, intramuscular, intraarterial, intrapleural, intravesicular, inyección intracavitaria o peritoneal, o una administración oral. Preferentemente, la administración se lleva a cabo en forma de inyección intratumoral o inyección intraperitoneal.

La inyección puede personalizarse para cada paciente según la localización y tamaño de los tumores. Por ejemplo, el virus puede inyectarse (i.t.) en un volumen de 0,5 ml a 10 ml. La inyección puede llevarse a cabo en varios, preferentemente hasta cinco, sitios tumorales diferentes. El volumen de dosis intraperitoneal puede variar entre 200 ml y 800 ml. Preferentemente, el volumen administrado es de 500 ml.

La dosis eficaz de vectores depende de por lo menos el sujeto que requiere de tratamiento, tipo tumoral, localización del tumor y estadio del tumor. La dosis puede variar, por ejemplo, entre aproximadamente 108 partículas víricas (VP) y aproximadamente 1014 VP, preferentemente entre 5x109 VP y aproximadamente 1013 VP, y más preferentemente, entre aproximadamente 8x109 VP y aproximadamente 1012VP. En una forma de realización específica de la invención, la dosis se encuentra comprendida en el intervalo de entre aproximadamente 5x1010y 5x1011 VP. De esta manera, la cantidad de adenovirus ONCOS-102 que debe administrarse puede encontrarse comprendida en el intervalo de entre 5x1010 y 5x1011 VP. Preferentemente, ONCOS-102 se administra a una dosis de 3 x 1011 VP. Por otra parte, expresado en las unidades formadoras de placa, ONCOS-102 puede administrarse mediante inyección directa en el tumor, tal como tumor de melanoma avanzado, de dicho paciente o por vía intraperitoneal a una dosis de entre aproximadamente 108 y 1012 unidades formadoras de placa.

Un objeto de la invención es adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento de cáncer humano, tal como melanoma avanzado, en el que el virus se administra en combinación con un inhibidor de punto de control, tal como pembrolizumab, en un paciente que lo necesita, y en el que la cantidad de virus es de entre 5 x 1010y 5 x 1011 VP.

Otro objeto de la presente divulgación es el adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento de cáncer humano, tal como melanoma avanzado, en el que el virus se administra en combinación con un inhibidor de punto de control en un paciente, y en el que el virus se administra en una cantidad de 3 x 1011 VP/5 ml.

Un aspecto adicional de la presente divulgación es adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento de cáncer humano, tal como melanoma avanzado, en el que el virus se administra en combinación con un inhibidor de punto de control en un paciente, y en el que el inhibidor de punto de control y el virus se administran en cantidades eficaces.

Todavía otro objeto de la presente divulgación es adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento de cáncer humano, tal como melanoma avanzado, en el que el virus se administra en combinación con un inhibidor de punto de control en un paciente que lo necesita, y en el que el virus se administra por vía intraperitoneal o mediante inyección directa en el tumor y el inhibidor o inhibidores de punto de control se administran por vía intravenosa o intraperitoneal.

Según un aspecto de la presente divulgación, el adenovirus ONCOS-102 está destinado a la utilización en el tratamiento de cáncer humano, tal como melanoma avanzado, en el que el virus se administra en combinación con un inhibidor de punto de control en un paciente que lo necesita, y en el que el virus se administra antes de la administración del inhibidor o inhibidores de punto de control y también durante el periodo de administración de dicho inhibidor o inhibidores de punto de control.

Según una forma de realización preferida, los agentes de la terapia de combinación pueden administrarse en primer lugar sensibilizando mediante la administración del virus en una dosis o entre una y diez veces durante un periodo de un día a diez meses y después administrando un inhibidor de punto de control, por ejemplo una a cuatro semanas después de iniciar la administración de virus. La administración puede realizarse, por ejemplo, en el orden secuencial siguiente: la sensibilización con el virus se lleva a cabo mediante la administración del virus en el sujeto que lo necesita tres veces durante 8 días (días 1, 4 y 8) y después se administra pembrolizumab (Keytruda) el día 21 y posteriormente cada tres semanas. La administración del inhibidor de punto de control, preferentemente pembrolizumab, puede, de esta manera, iniciarse tras tres semanas desde la administración del virus. La administración de uno o más inhibidores de punto de control puede continuarse de manera que la administración se lleve a cabo, por ejemplo, durante un total de seis veces en ciclos de aproximadamente tres semanas. Los tiempos de administración pueden variar entre una y seis veces.

El vector adenovírico oncolítico de la invención induce oncólisis mediada por el virión de las células tumorales y activa la respuesta inmunitaria humana contra las células tumorales. En una forma de realización preferida de la presente divulgación, el método o utilización comprende además la administración de sustancias capaces de regular negativamente las células T reguladoras en un sujeto. La expresión "sustancias capaces de regular negativamente las células T reguladoras" se refiere a agentes que reducen la cantidad de células identificadas como células T supresoras o T reguladoras. Dichas células se han identificado como consistentes en uno o muchos de los marcadores inmunofenotípicos siguientes: CD4+, CD25+, FoxP3+, CD127- y GITR+. Dichos agentes que reducen las células T supresoras o T reguladoras pueden seleccionarse de un grupo que consiste en anticuerpos anti-CD25 o quimioterápicos.

Las funciones inmunomoduladoras del GM-CSF de transgén constituyen un mecanismo de acción crucial de los adenovirus oncolíticos armados y, además, el adenovirus mismo es un fuerte activador del sistema inmunitario y ello contribuye significativamente a la eficacia antitumoral global del virus.

Otro aspecto de la presente divulgación es un método de tratamiento de cáncer humano, preferentemente melanoma maligno avanzado, en un paciente, que comprende una etapa de administración en dicho paciente de adenovirus ONCOS-102 y un inhibidor de punto de control en cantidades y durante un tiempo suficiente para eliminar células de cáncer o para prevenir el crecimiento de células de cáncer.

Un aspecto preferido de la presente divulgación es un método de tratamiento del cáncer humano, tal como el melanoma maligno avanzado, en un paciente, que comprende una etapa de administración en dicho paciente de adenovirus ONCOS-102 y uno o más inhibidores de punto de control, en el que el tratamiento comprende la administración del inhibidor de punto de control pembrolizumab.

Otro aspecto preferido de la presente divulgación es un método de tratamiento de cáncer humano, tal como el melanoma avanzado, en un paciente, que comprende las etapas de administrar en dicho paciente el adenovirus ONCOS-102 y uno o más inhibidores de punto de control, en el que dicho virus se administra en primer lugar antes de iniciarse el periodo de administración del inhibidor o inhibidores de punto de control y el virus también puede administrarse durante el periodo de administración de dicho inhibidor o inhibidores de punto de control.

Todavía otro aspecto preferido de la presente divulgación es un método de tratamiento del cáncer humano, tal como el melanoma avanzado, en un paciente, que comprende las etapas de administración en dicho paciente de adenovirus ONCOS-102 y uno o más inhibidores de punto de control, en el que el adenovirus ONCOS-102 se administra entre una y diez veces y uno o más inhibidores de punto de control se administran entre una y seis veces en dicho paciente.

Todavía otro aspecto preferido de la presente divulgación es un método de tratamiento del cáncer humano, tal como el melanoma avanzado, en un paciente, que comprende las etapas de administración en dicho paciente de adenovirus ONCOS-102 y uno o más inhibidores de punto de control, en el que la cantidad de adenovirus ONCOS-102 que debe administrarse se encuentra comprendida en el intervalo de entre 5x1010 y 5x1011 VP.

Todavía otro aspecto preferido de la presente divulgación es un método de tratamiento del cáncer humano, tal como el melanoma avanzado, en un paciente, que comprende las etapas de administración en dicho paciente de adenovirus ONCOS-102 y uno o más inhibidores de punto de control, en el que dichos inhibidores de punto de control se administran como: pembrolizumab (Keytruda) 2 mg/kg cada tres semanas, nivolumab (Opdivo) 2 mg/mg cada dos semanas y durvalamb 20 mg/kg cada cuatro semanas o 10 mg/kg cada dos semanas. El durvalumab puede administrarse mediante infusión IV una vez cada cuatro semanas durante un total de 12 ciclos de cuatro semanas.

Un aspecto adicional de la presente divulgación es una utilización de adenovirus ONCOS-102 en el tratamiento del cáncer humano, tal como el melanoma maligno avanzado, en el que el virus se administra en un paciente en combinación con uno o más inhibidores de punto de control.

Todavía un aspecto adicional de la presente divulgación es adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento del cáncer humano, tal como el melanoma avanzado, en el que el virus se administra en combinación con uno, dos o tres inhibidores de punto de control en un paciente que lo necesita.

Todavía un aspecto adicional de la presente divulgación es el adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento del cáncer humano, tal como el melanoma avanzado, en el que el adenovirus ONCOS-102 se administra entre una y diez veces y el inhibidor de punto de control se administra entre 1 y 5 veces en el paciente que lo necesita.

La administración concurrente de ciclofosfamida (CPO) en el paciente puede llevarse a cabo durante el periodo de tiempo de la terapia de combinación. La ciclofosfamida es un agente quimioterápico común, que también ha sido utilizada en algunos trastornos autoinmunitarios. La ciclofosfamida se ha demostrado que mejora la eficacia del virus oncolítico mediante varios mecanismos. Atenúa la respuesta antivírica innata, enlentece la generación de anticuerpos neutralizantes de virus antioncolítico, puede presentar como diana las T reg. y puede afectar la vasculatura tumoral, potenciando la extravasación del virus oncolítico. Varios estudios preclínicos han demostrado que la ciclofosfamida puede retardar el lavado inmunitario de los virus oncolíticos, potenciando la persistencia de la infección vírica y prolongando la eficacia terapéutica. En la presente divulgación, la ciclofosfamida puede utilizarse como un sensibilizador vírico para potenciar la replicación vírica y los efectos de la estimulación inducida por GM-CSF de las células NK y T citotóxicas para una respuesta inmunitaria potenciada contra el tumor. Puede utilizarse en forma de dosis de bolo intravenoso o como administración metronómica oral de dosis baja. Otros sensibilizadores de virus adecuados que pueden utilizarse en formas de realización de la presente divulgación incluyen la temozolomida y el erlotinib.

Para reducir las células T reguladoras, los pacientes reciben CPO a dosis baja uno a cuatro días antes de la primera inyección de ONCOS-102. Se administra CPO, por ejemplo, en forma de un bolo i.v. de 300 mg/m2 El bolo puede variar entre 100 y 600 mg/m2. La vía de administración de CPO también puede ser, por ejemplo, la administración oral. También puede utilizarse la quimioterapia metronómica.

También puede administrarse ácido fólico en el paciente antes de iniciar la terapia de combinación y también durante la terapia de combinación. La administración de ácido fólico puede iniciarse por lo menos cinco días antes de la administración de la primera dosis de agentes quimioterápicos de la terapia de combinación. Por ejemplo, la administración puede iniciarse 1 a 2 semanas antes de iniciar la administración de los agentes de la terapia de combinación. El ácido fólico puede administrarse diariamente (administración oral, PO) y la administración puede continuarse también durante la terapia de combinación. La administración puede continuarse hasta aproximadamente tres semanas después de la última dosis de los agentes de la terapia de combinación. La dosis típica de ácido fólico es de 4 mg (PO). Un aspecto preferente de la presente divulgación es un método de tratamiento del melanoma en un paciente que lo necesita, que comprende las etapas de (a) administración en dicho paciente de adenovirus ONCOS-102 y un inhibidor de punto de control y una etapa de administración de ácido fólico en el paciente.

La cianocobalamina (vitamina B12) puede administrarse en el paciente antes de iniciar la terapia de combinación y también durante la terapia de combinación. La administración de cianocobalamina típicamente se inicia 1 a 2 semanas antes de iniciar la administración de los agentes de la terapia de combinación. La cianocobalamina puede administrarse, por ejemplo, en forma de inyección intramuscular (i.m.) a intervalos de nueve semanas y también durante la terapia de combinación. La administración puede continuarse hasta aproximadamente tres semanas después de la última dosis de los agentes de la terapia de combinación. La cantidad típica de cianocobalamina es de 1000 mcg (|jg). Un aspecto preferido de la presente divulgación es un método de tratamiento del melanoma en un paciente que lo necesita, que comprende las etapas de (a) administración en dicho paciente de adenovirus ONCOS-102 y un inhibidor de punto de control y una etapa de administración de cianocobalamina en el paciente.

El ácido fólico y la cianocobalamina generalmente se utilizan para reducir la toxicidad hemática y gastrointestinal relacionada con el tratamiento.

Además, la dexametasona puede administrarse en el paciente sometido a la terapia de combinación. Típicamente, la dexametasona se administra el día antes, el mismo día y el día después de la administración de los demás agentes de la terapia de combinación. La dexametasona puede administrarse en forma de 4 mg BD (es decir, dos veces al día) durante 5 días y en una frecuencia de cada tres semanas durante hasta seis ciclos. Un objeto de la presente divulgación es un método de tratamiento del melanoma en un paciente que lo necesita, que comprende las etapas de (a) administración en dicho paciente de adenovirus ONCOS-102 y un inhibidor de punto de control y (b) administración de dexametasona en el paciente.

La terapia de combinación tal como se indica en la presente memoria puede comprender además la administración de ciclofosfamida en el paciente. Un objeto de la presente divulgación es un método de tratamiento del melanoma en un paciente que lo necesita, que comprende una etapa de (a) administración en dicho paciente de adenovirus ONCOS-102 y dos agentes quimioterápicos y que comprende, además, antes de la etapa (a), la administración de ciclofosfamida en el paciente.

Un aspecto adicional de la presente divulgación es un método para reducir el crecimiento tumoral en un paciente, en el que dicho método comprende la administración de adenovirus ONCOS-102 y uno o más inhibidores de punto de control en dicho paciente bajo condiciones en las que se reduce el crecimiento tumoral en dicho paciente.

El método puede comprender la identificación de que el paciente presenta un tumor antes de la administración de la terapia de combinación. El diagnóstico tumoral puede llevarse a cabo mediante cualquier método convencional. Puede identificarse que el paciente presenta el tumor, utilizando, por ejemplo, una técnica de obtención de imágenes diagnósticas. El método puede comprender además la medición de una reducción del crecimiento tumoral después de la administración de la terapia de combinación en el paciente. La reducción del tumor puede estudiarse mediante cualquier método convencional. La reducción del crecimiento tumoral puede medirse utilizando, por ejemplo, una técnica de obtención de imágenes diagnósticas.

Otro aspecto de la presente divulgación es la utilización de terapia de combinación a fin de inhibir el crecimiento del tumor. Las señales de inhibición del crecimiento tumoral pueden ser, por ejemplo, una reducción del peso tumoral y una reducción del volumen tumoral. Además, la terapia de combinación puede utilizarse para inhibir la extensión del tumor.

Además, puede indicarse que la pseudoprogresión tumoral que corresponde a un incremento del tamaño de la lesión relacionado con el tratamiento, puede afectar al resultado del seguimiento de las imágenes destinado a revelar el efecto de la terapia de combinación actual sobre el tamaño tumoral. Dicho tipo de efecto se ha observado después de la quimioterapia y radioterapia combinadas, en aproximadamente 30% de los pacientes. De esta manera, la pseudoprogresión puede encontrarse presente en determinadas partes de los pacientes al utilizar la terapia de combinación tal como se indica en la presente memoria. Para estos pacientes, la reducción del tamaño tumoral no es un indicador adecuado de la eficacia de la terapia.

Se da a conocer además un método de reducción del crecimiento de las células de cáncer, que comprende administrar en el sujeto la necesidad de tratamiento de una cantidad eficaz de adenovirus ONCOS-102 y uno o más inhibidores de punto de control.

Un método de inhibición o eliminación de las células tumorales o de cáncer en un paciente humano, que consiste en tratar el paciente con adenovirus ONCOS-102 y uno o más inhibidores de punto de control, en el que el inhibidor de punto de control es un inhibidor de PD-1 o PD-L1, o cualquier combinación de los mismos, también se da a conocer mediante la descripción.

Además, mediante la descripción se da a conocer un método de eliminación de células tumorales o de cáncer que comprende poner en contacto las células tumorales o de cáncer con adenovirus ONCOS-102, el inhibidor o inhibidores de punto de control, en el que el inhibidor de punto de control es un inhibidor de PD-1 o PD-L1, o cualquier combinación de los mismos.

Además, se da a conocer además un método de tratamiento del cáncer humano, tal como melanoma avanzado, que comprende administrar en el sujeto que lo necesita, una cantidad eficaz de adenovirus ONCOS-102 y cantidades eficaces de uno o más inhibidores de punto de control para proporcionar una terapia de combinación que presenta un efecto terapéutico potenciado en comparación con el efecto del adenovirus ONCOS-102 administrado solo o del inhibidor o inhibidores de punto de control administrados sin dicho virus.

En una forma de realización de la presente divulgación, ONCOS-102 actúa como una vacuna in situ del cáncer. Tal como se utiliza en la presente memoria, "vacuna in situ del cáncer" se refiere a una vacuna del cáncer, que tanto elimina células tumorales como también incrementa la respuesta inmunitaria contra las células tumorales. La replicación vírica es una fuerte señal de peligro al sistema inmunitario (=necesario para una respuesta de tipo TH1) y, de esta manera, actúa como un potente fenómeno coestimulador de la maduración mediada por GM-CSF y la activación de las CPA, y el reclutamiento de las células NK. La lisis de las células tumorales también ayuda a presentar fragmentos tumorales y epítopos a la sCPA y, además, se produce coestimulación mediante inflamación. De esta manera, se produce una respuesta independiente de los epítopos (es decir, no restringida a HLA) en el contexto de cada tumor y, por lo tanto, tiene lugar in situ. La respuesta inmunitaria específica tumoral resulta activada en el ambiente tumoral al liberarse antígenos tumorales específicos a partir de las células moribundas con la lisis de las células tumorales.

En una forma de realización preferida de la presente divulgación, el método o utilización comprende además la administración de radioterapia concurrente en el sujeto.

En una forma de realización preferida de la presente divulgación, el método o utilización comprende además la administración de agentes inductores de autofagia en el sujeto. La autofagia se refiere a un proceso catabólico que implica la degradación de los componentes de la propia célula mediante la maquinaria lisosómica. La expresión "agentes inductores de autofagia" se refiere a agentes capaces de inducir la autofagia y pueden seleccionarse de un grupo que consiste en, aunque sin limitación, inhibidores de mTOR, inhibidores de PI3K, litio, tamoxifeno, cloroquina, bafilomicina, temsirolimus, sirolimus y temozolomida. En una forma de realización específica de la presente divulgación, el método comprende además la administración de temozolomida en un sujeto. La temozolomida puede ser temozolomida oral o intravenosa.

De esta manera, un objeto de la presente divulgación es adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento del cáncer humano, en el que el virus se administra en combinación con uno o más inhibidores de punto de control en un paciente.

En la terapia de combinación tal como se indica en la presente memoria, el adenovirus ONCOS-102 y el inhibidor o inhibidores de punto de control pueden administrarse en varias dosis y en diferentes tiempos.

Otro objeto de la invención es adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento del cáncer humano, en el que el cáncer humano se selecciona de entre el grupo que consiste en melanoma avanzado, cáncer renal, cáncer ovárico, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer pulmonar, cáncer gástrico, linfoma de Hodgkin clásico, mesotelioma y cáncer hepático.

Todavía otro objeto de la invención es adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento del cáncer humano, en el que el cáncer humano es el melanoma avanzado.

Un objeto adicional de la presente divulgación es adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento del cáncer humano, en el que el inhibidor del punto de control es un anticuerpo anti-PD-1.

Un objeto adicional de la invención es adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento del cáncer humano, en el que el anticuerpo anti-PD-1 es pembrolizumab o nivolumab.

La descripción da a conocer adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento del cáncer humano, en el que el anticuerpo anti-PD-L1 es durvalumab.

Un objeto adicional de la invención es adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento del cáncer humano, en el que la cantidad del virus es de entre 5 x 1010 y 5 x 1011 VP.

El adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento del cáncer humano, en el que el virus se administra en una cantidad de 3 x 1011 VP también es un aspecto de la invención.

Según un aspecto de la presente divulgación, el adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento del cáncer humano, en el que el virus se administra mediante inyección directa en el tumor y el inhibidor o inhibidores de punto de control se administran por vía intravenosa.

El adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento del cáncer humano, en el que el virus se administra antes de administrar el inhibidor o inhibidores de punto de control y opcionalmente el virus también se administra durante el periodo de administración de dicho inhibidor o inhibidores de punto de control y/o después de la administración del inhibidor o inhibidores de punto de control, también es un aspecto de la presente divulgación.

Un objeto de la presente divulgación es un método de tratamiento del cáncer en un paciente, que comprende una etapa de administración en dicho paciente de adenovirus ONCOS-102 y uno o más inhibidores de punto de control.

Una forma de realización preferida de la presente divulgación es un método de tratamiento del cáncer en un paciente, que comprende una etapa de administración en dicho paciente de adenovirus ONCOS-102 y uno o más inhibidores de punto de control, en el que dicho cáncer es el melanoma avanzado.

La descripción da a conocer además un método de tratamiento del cáncer en un paciente, que comprende una etapa de administración en dicho paciente de adenovirus ONCOS-102 y uno o más inhibidores de punto de control; el inhibidor o inhibidores de punto de control son anticuerpos anti-PD-1 o anticuerpos anti-PD-L1, o cualquier combinación de los mismos.

Según otra forma de realización preferida de la presente descripción, el anticuerpo anti-PD-1 pembrolizumab o nivolumab se utiliza en el método de tratamiento del cáncer en un paciente, en el que dicho método comprende una etapa de administración en dicho paciente de adenovirus ONCOS-102 y uno o más inhibidores de punto de control. Según la descripción, el anticuerpo anti-PD-L1 es el durvalumab. De esta manera, según la descripción, el anticuerpo anti-PD-1 es preferentemente pembrolizumab o nivolumab y el anticuerpo anti-PD-L1 es preferentemente durvalumab.

Una forma de realización preferida de la presente divulgación es un método de tratamiento del cáncer en un paciente, que comprende una etapa de administración en dicho paciente de adenovirus ONCOS-102 y uno o más inhibidores de punto de control, en el que el virus se administra antes de la administración del inhibidor o inhibidores de punto de control y opcionalmente el virus también se administra durante el periodo de administración de dicho inhibidor o inhibidores de punto de control y/o después de la administración del inhibidor o inhibidores de punto de control.

Otra forma de realización preferida de la presente divulgación es un método de tratamiento del cáncer en un paciente, que comprende una etapa de administración en dicho paciente de adenovirus ONCOS-102 y uno o más inhibidores de punto de control, en el que el adenovirus ONCOS-102 se administra entre una y diez veces y el inhibidor de punto de control se administra entre 1 y 15 veces en dicho paciente.

Todavía otra forma de realización preferida de la presente divulgación es un método de tratamiento del cáncer en un paciente, que comprende una etapa de administración en dicho paciente de adenovirus ONCOS-102 y uno o más inhibidores de punto de control, en el que la cantidad de adenovirus ONCOS-102 que debe administrarse se encuentra comprendida en el intervalo de entre 5x1010 y 5x1011 VP.

Otro aspecto de la presente divulgación es un método de tratamiento del cáncer en un paciente, que comprende una etapa de administración en dicho paciente de adenovirus ONCOS-102 y uno o más inhibidores de punto de control, que comprende además la administración de ciclofosfamida antes de la etapa de administración del adenovirus ONCOS-102 y uno o más inhibidores de punto de control en el paciente que lo necesita.

La utilización del adenovirus ONCOS-102 en el tratamiento del cáncer humano, en el que el virus se administra en un paciente que lo necesita en combinación con uno o más inhibidores de punto de control, también es un aspecto de la presente divulgación.

Un objetivo de la presente divulgación era desarrollar un nuevo uso terapéuticamente eficaz del adenovirus oncolíticos ONCOS-102 y uno o más inhibidores de punto de control con propiedades de seguridad mejoradas y con un efecto mejorado sobre el cáncer en comparación con la utilización de terapia vírica sola o uno o más inhibidores de punto de control solos.

Además de permitir el transporte del vector hasta el sitio de interés, el vector adenovírico de la presente divulgación también garantiza la expresión y persistencia del transgén. Además, se minimiza la respuesta inmunitaria contra el vector, así como el transgén.

La presente invención resuelve los problemas relacionados con la resistencia terapéutica a los tratamientos convencionales. Además, la presente divulgación proporciona herramientas y métodos para tratamientos selectivos, con menor toxicidad y daños en los tejidos sanos. Entre las ventajas de la presente invención se incluyen también efectos secundarios diferentes y menores comparado con otros terapéuticos. Resulta importante que el enfoque es sinérgico con muchas otras formas de terapia, incluyendo la terapia de radiación y, por lo tanto, resulta adecuado para la utilización en regímenes de combinación.

La presente invención consigue la terapia del cáncer, en la que las células tumorales son destruidas mediante oncólisis causada por viriones. Además, se reúnen diversos mecanismos diferentes que activan la respuesta inmunitaria humana, entre ellos la activación de las células asesinas naturales (NK) y las células dendríticas (CD) para la utilización terapéutica en la presente invención.

De esta manera, la presente solicitud describe estrategias y proporciona métodos y medios para reclutar eficazmente el sistema inmunitario del huésped contra células malignas y proporciona simultáneamente un efecto oncolítico directo y de inhibición de las proteínas de punto de control en las células malignas, manteniendo simultáneamente excelentes características de seguridad.

Los aspectos de la invención se refieren a nuevos métodos y métodos para conseguir una transferencia génica eficiente y precisa, así como una especificidad incrementada y suficiente capacidad de eliminación tumoral en la terapia del cáncer.

En resumen, los datos presentados proporcionan una justificación fuerte para combinar ONCOS-102 con uno o más inhibidores de punto de control en el tratamiento del cáncer humano.

Ejemplos

Construcción de ONCOS-102

La construcción y caracterización de adenovirus oncolítico quimérico codificante de GM-CSF humano (ONCOS-102) ha sido descrita anteriormente (documento WO 2010/072900 y Koski et al.). Brevemente, se generó Ad5/3-D24-GMCSF y se amplificó utilizando técnicas estándares de preparación de adenovirus. Se creó un plásmido derivado de pAdEasy-1 que contenía una fibra quimérica 5/3, pAdEasy5/3, mediante recombinación homóloga en Escherichia coli de genoma vírico Ad5/3luc1 y se digirió con BstXI un fragmento de 8,9 kb de pAdEasy-1. A continuación, un vector lanzadera que contenía una eliminación de 24 bp en E'M(pShuttleD24) se linealizó con Pmel y se recombinó con pAdEasy5/3, resultando en pAd5/3-D24. Con el fin de insertar el gen de GMCSF humano en la región E3, se creó un vector de clonación de E3, pTHSN, mediante la inserción del fragmento Spel a Ndel del genoma Ad5 en el sitio de multiclonación de pGEM5Zf* (Promega, Madison, WI). Se digirió adicionalmente pTHSN con Sunl/Munl, creando una eliminación de 965 bp en la región E3 (6.7K y gp19K eliminados). El ADN complementario de 432 bp codificante de GM-CSF humano (Invitrogen, Carlsbad, c A) se amplificó con cebadores que presentaban sitios de restricción específicos Sunl/Munl flanqueantes del gen y después se insertó en pTHSN digerido con Sunl/Mnl. Se generó pAd5-D24-GMCSF mediante recombinación homóloga en E. coli entre pTHSN-GMCSF linealizado con Fspl y pAd5/3-D24 linealizado con Srfl. El genoma vírico Ad5/3-D24-GMCSF se liberó mediante digestión con PacI y transfección en células A549 para la amplificación y rescate. Todas las etapas de la clonación se confirmaron mediante PCR y múltiples digestiones de restricción. Se secuenció el plásmido lanzadera pTHSN-GM-CSF. La ausencia de E1 de tipo salvaje se confirmó mediante PCR. La región E1, transgén y la fibra se comprobaron en el virus final mediante secuenciación y PCR. Se llevó a cabo la producción del virus según los principios de GMPc en Oncos Therapeutics (Helsinki, Finlandia) en células a 549 para evitar el riesgo de recombinación de tipo salvaje. La formulación de tampón para la solución concentrada de virus era base Trizma 10 mmoles/l, NaCl 75 mmoles/l, sacarosa al 5% (p/v), MgCl 1 mmol/l, L(+)histidina 10 mmoles/l, EtOH al 0.5% (v/v), Tween al 0.02%, EDTA 100 pmoles/l; como diluyente se utilizó solución de NaCl al 0.9% (p/v) (B. Braun, Melsungen, Alemania). Se produjo ONCOS-102 en Biovian (Turku, Finlandia) en GLP y se almacenó a -80°C hasta la utilización. Para la utilización, se descongeló ONCOS-102 poco antes de la aplicación y se almacenó sobre hielo hasta su utilización. Tras descongelar, se diluyó ONCOS-102 en una campana de flujo laminar a fin de obtener la concentración requerida; se prepararon jeringas de inyección y se almacenaron sobre hielo hasta la utilización. Líneas celulares

Se cultivaron células de melanoma humano A-375 (ATCC n° CRL-1619TM), 2x106 células/flanco, a 37°C con 5% de CO² en DMEM con 4500 mg/ml de glucosa (Sigma-S5671), complementado con FBS inactivado por calor al 10% (origen: Sudáfrica, Dutscher P30-1506) y penicilina/estreptomicina al 1% (Dutscher L0018). El mismo protocolo de cultivo se aplica también a las células de melanoma humano SK-MEL2 (ATCC n° HTB-68).

Inhibidores de punto de control (IPC):

Para el pembrolizumab (Keytruda) la dosis humana es de 2 mg/kg y, tras la extrapolación, se utilizaron 40 pg/ratón. Para el nivolumab (Opdivo), la dosis humana es de 3 mg/kg y, tras la extrapolación, se utilizaron 60 pg/ratón. La dosis extrapolada de IPC se calculó considerando que el peso de un ratón es de 20 g. Para el durvalumab, la dosis humana puede ser de 10 a 20 mg/kg. Actualmente el programa de dosis recomendado para el durvalumab es de 20 mg/kg Q4W o 10 mg/kg Q2W. Basándose en la información indicada en los modelos FC de MedImmune, lo anterior se está pasando a una dosis y programa fijos de 1500 mg de durvalumab Q4W. Tras la extrapolación, pueden utilizarse 200 a 400 pg/ratón. La dosis extrapolada de IPC considera que el peso de un ratón es de 20 g. Selección de animales, aleatorización, asignación de grupos, alojamiento, dieta y agua, y aclimatación

Los animales se separaron aleatoriamente en grupos. Los grupos de animales se mantuvieron en jaulas separadas con tarjetas de estudio en las jaulas. Las tarjetas se marcaron con el número de estudio, grupo de tratamiento, ID de animal individual, así como su origen y fecha de llegada. Los animales individuales en cada jaula se marcaron con perforación del oído para la identificación. Sólo se manipuló una jaula cada vez a fin de evitar mezclar los animales de diferentes jaulas.

Los animales se alojaron en una instalación de nivel de bioseguridad 2 (BSL2) en un ambiente de humedad y temperatura monitorizadas. Los animales se alojaron en jaulas de plástico ventiladas individualmente con una tapa de filtro (GreenLine, Scanbur).

Los animales se alimentaron con dieta en gránulos estándar proporcionada ad libitum. Se suministró agua ad libitum durante los periodos de aclimatación y estudio.

Los animales se aclimataron durante 7 días antes de iniciar la parte experimental. Todos los animales se mantuvieron con buena salud durante todo el periodo de aclimatación.

Análisis de la progresión del tamaño tumoral

Se midieron los tamaños tumorales y se registraron desde los 7-11 días después de las inyecciones celulares. El primer día de tratamiento y el primer día de medición del tamaño tumoral se indican como día 0. Los tumores se midieron cada tres días.

Se registró el diámetro más largo y el más corto y se calculó el volumen tumoral utilizando la fórmula (anchura x longitud x altura)/2.

Se midió el peso corporal cada 3 días durante todo el experimento.

Volúmenes tumorales: El volumen tumoral absoluto era el punto final en el análisis del volumen tumoral. Se aplicó análisis de la varianza para mediciones repetidas como método de análisis para los volúmenes tumorales, ya que se midieron dos tumores en cada ratón. El modelo contenía el efecto de grupo y el valor de línea base como variables como efectos fijos. Las comparaciones por pares entre grupos se ajustaron con el método de Tukey. El cálculo de las sinergias se llevó a cabo mediante la utilización del método de VTF (volumen tumoral fraccionario). Modelo de xenoinjerto de melanoma humano

Los experimentos fueron llevados a cabo por TCS en Archamps, Francia, con la cepa de ratón inmunodeficiente NOD/Shiscid/IL-2Rynull (NOG). Se injertaron ratones NOG inmunodeficientes de cuatro semanas de edad (Taconic) con células madre y progenitoras hematopoyéticas CD34+ derivadas de sangre del cordón (French Blood Institute) dos días después del tratamiento mieloablativo químico. La injertación consistía en la inyección intravenosa de células CD34+. Catorce semanas después de la inyección celular, se monitorizó el nivel de injertación con el análisis de las células CD45+ humanas entre los leucocitos sanguíneos totales mediante citometría de flujo (Attune, Life Technologies). Para dicho estudio piloto, sólo se seleccionaron los ratones con una tasa humanizada (definida como la proporción de CD45+_h circulantes/leucocitos totales) superior a 20%. Los presentes inventores utilizaron únicamente ratones hembra. Todos los estudios animales descritos en el presente estudio fueron revisados y aprobados por el comité ético local (01_TransCurebioServices-AB-01). Los ratones se alojaron en grupos de 3 a 5 individuos. Cada ratón presentaba un identificador único. Los animales se alojaron en una jaula ventilada (tipo II (16x19x35 cm, superficie de suelo=500 cm2)) bajo las condiciones controladas siguientes:

• Temperatura ambiente (22±2°C)

• Higrometría (55±10%)

• Fotoperiodo (ciclo luz-oscuridad de 12:12-horas, 7:00 a 19:00)

• Agua y alimento (ref. 2018, Harlan France) disponibles ad libitum.

Los ratones fueron anestesiados con isoflurano Forane (Baxter); se inyectaron células A-375 x 100 j l en ambos flancos (2x106/flanco). Se indujo uno o dos tumores en cada ratón. Los tumores se dejaron crecer durante 7 a 11 días antes de los tratamientos. Los virus se administraron los días 1, 3 y 5 después de la formación de tumor y se administraron inhibidores de punto de control (Keytruda y Opdivo) los días 9, 13 y 17 tras la formación de tumor, respectivamente. Al estudiar el efecto sistémico, sólo se trató un tumor/ratón (ver la figura 1C). Los animales de control se trataron con solución salina al 0.9%. Se diluyó ONCOS-102 en solución salina al 0.9% y se inyectó por vía intratumoral a una dosis de 5x107 VP en cada tumor. Las inyecciones se proporcionaron en un patrón de tipo abanico para garantizar una distribución uniforme en todo el tumor. Se diluyeron los inhibidores de punto de control (Keytruda y Opdivo) en NaCl al 0.9% y se administraron por vía intraperitoneal a dosis de 40 jg/ratón (peso: 20 g) de Keytruda y 60 jg/ratón de Opdivo, respectivamente. El volumen de inyección era de 50 pl de inhibidor de punto de control.

Se registró el diámetro más largo y el más corto y se calculó el volumen tumoral utilizando la fórmula (anchura x longitud x altura)/2.

Ejemplo 1. Actividad antineoplásica mejorada contra el melanoma en ratones mediante la utilización de ONCOS-102 combinado con un inhibidor de punto de control.

En el presente estudio, los ratones o bien no fueron tratados o bien se trataron con ONCOS-102 únicamente, con un inhibidor de punto de control únicamente o con una combinación de ONCOS-102 y un inhibidor de punto de control. Los grupos de estudio 1 a 9, números de ratones y tiempos mínimos de rotación se muestran en la Tabla 1. Brevemente, en el grupo de estudio 1, se trataron ratones inmunodeficientes con 5x106 VP de ONCOS-102. En el grupo 2, por el contrario, se utilizaron 5x107 VP de ONCOS-102, mientras que los ratones en el grupo 3 no recibieron ningún tratamiento en absoluto. Los resultados obtenidos mediante la medición del volumen tumoral de dichos grupos se muestran en la figura 1A. Los resultados demuestran que el volumen tumoral se redujo en dependencia de la dosis de virus.

Los ratones humanizados en el grupo 4 se trataron con 5x107 VP de ONCOS-102, mientras que los ratones en el grupo 5 se dejaron sin tratar. Los ratones humanizados de los grupos 6 y 7 se trataron con Keytruda (40 jg/ratón) y Opdivo (60 jg/ratón), respectivamente. Los ratones humanizados en el grupo 8 se trataron en primer lugar con ONCOS-102 (5X107 VP), seguido de Keytruda (40 jg/ratón). En el grupo 9, los ratones presentaban dos tumores (izquierda y derecha, respectivamente). Los ratones de otro modo se trataron tal como en el grupo 8, aunque sólo se trató el tumor derecho con el virus. Los resultados del tumor derecho tratado en comparación con el tumor izquierdo tratado en ratones humanizados en el grupo 9 y tumores de ratones humanizados con tratamiento con Keytruda únicamente (grupo 6) se muestran en la figura 1C y demuestran un efecto sistémico del tratamiento vírico, ya que el tumor tratado con virus y el tumor no tratado con virus resultan afectados de manera similar. En la figura 1B, se muestra una comparación entre ratones inmunodeficientes y humanizados no tratados de los grupos 3 y 5. Los resultados demuestran que el sistema inmunitario humano inhibe el crecimiento tumoral en los ratones. En la figura 1D, las diferencias entre ratones de los grupos 8 (ONCOS-102 Keytruda) y 4 (ONCOS-102 únicamente) y los grupos 8 y 6 (Keytruda únicamente) sugiere que la terapia de combinación, en la que el tumor en primer lugar se sensibiliza con ONCOS-102 antes de administrar el inhibidor de punto de control, resulta más eficiente que el tratamiento con ONCOS-102 solo o con Keytruda sin sensibilización.

Tabla 1. Grupos de estudio del experimento (grupos 1 a 9).

Referencias

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Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Vector adenovírico oncolítico ONCOS-102 de serotipo 5 que comprende una eliminación de 24 pares de bases (bp) en la región constante 2 (CR2) de gen E1A, una eliminación en la región temprana 3 (E3) que codifica las proteínas 6.7K y gp19K, un transgén que codifica la proteína factor estimulante de colonias de granulocitosmacrófagos (GM-CSF) insertado en la región E3, que sustituye dichas 6.7K y gp19K, y que presenta un botón de fibra de serotipo 5 sustituido por fibra de serotipo 3 para la utilización en el tratamiento de cáncer resistente a inhibidor de PD-1 humano, en el que el vector vírico se administra en combinación con pembrolizumab o nivolumab a un paciente, en el que la administración comprende en primer lugar la sensibilización con el vector de virus, seguida por la administración de pembrolizumab o nivolumab, en el que la administración del vector de virus se lleva a cabo mediante una inyección intratumoral, intrapleural o intraperitoneal.

2. Vector adenovírico oncolítico para la utilización en el tratamiento del cáncer humano según la reivindicación 1, en el que el cáncer humano se selecciona de entre el grupo que consiste en melanoma avanzado, cáncer renal, cáncer ovárico, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer pulmonar, cáncer gástrico, linfoma de Hodgking clásico, mesotelioma y cáncer hepático.

3. Vector adenovírico oncolítico para la utilización en el tratamiento del cáncer humano según la reivindicación 1 o 2, en el que el cáncer humano es el melanoma avanzado.

4. Vector adenovírico oncolítico para la utilización en el tratamiento del cáncer humano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la cantidad del vector vírico es desde 5 x 1010 a 5 x 1011 partículas víricas (VP).

5. Vector adenovírico oncolítico para la utilización en el tratamiento del cáncer humano según la reivindicación 4, en el que el vector vírico se administra en una cantidad de 3 x 1011 VP.