ES2845693T3

ES2845693T3 - Método de partición trifásica (TPP) para la purificación de virus

Info

Publication number: ES2845693T3
Application number: ES18826154T
Authority: ES
Inventors: Haifeng Chen
Original assignee: Virovek Inc
Current assignee: Virovek Inc
Priority date: 2017-11-28
Filing date: 2018-11-28
Publication date: 2021-07-27
Anticipated expiration: 2038-11-28
Also published as: US20190161725A1; DK3538649T3; US10889797B2; EP3538649A1; EP3538649B1; WO2019108615A1

Abstract

Un método para purificar un virus de un lisado celular infectado con virus, comprendiendo el método: a) formar una primera mezcla que comprende i) una fase acuosa que comprende agua y un lisado celular que comprende un virus, ii) t-butanol y iii) sulfato de amonio a una primera concentración; b) separar la primera mezcla para formar una primera fase orgánica, una primera interfase y una primera fase acuosa; y c) recoger la primera fase acuosa, en la que el sulfato de amonio en una primera concentración es sulfato de amonio a una concentración a la cual el t-butanol es inmiscible con agua, en donde el virus es un virus adenoasociado (AAV).

Description

DESCRIPCIÓN

Método de partición trifásica (TPP) para la purificación de virus

Referencia a la solicitud previa

Esta solicitud reivindica el beneficio y la prioridad de la Solicitud Provisional de EE.U 62 / 591,383 presentada el 28 de noviembre de 2017. Solicitud 62/591,383

Campo técnico

Esta divulgación está en el campo de la purificación de virus, en particular la purificación de un virus no envueltos tales como virus adenoasociados cultivados in vitro.

Antecedentes

El vector recombinante de virus adenoasociados (AAV) ha surgido como un dispositivo versátil y vehículos eficaces de entrega de terapia génica. Sin embargo, la purificación de AAV por cromatografía de columna (p. ej., Brument, N., et al., Molecular Therapy 6, 678-686, 2002) es caro y complicado. Métodos de centrifugación en gradiente de purificación de AAV utilizando cloruro de cesio o yodixanol (p. ej., Wim, T., et al., Human Gene Therapy. Julio de 2004, 10 (11): 1885-1891; Zolotukhin, S., et al., Gene Therapy (1999) 6, 973-985, 1999) son difíciles de ampliar debido a la pequeña capacidad de los tubos de centrífuga. Polietilenglicol (PEG) / métodos acuosos de partición en dos fases (p. ej., Guo, P, et al., Bioengineered, 4: 2, 103-106, DOI: 10.4161 / bioe.22293) producen cantidades limitadas de vectores AAV.

La partición trifásica (TPP) es una tecnología no cromatográfica para separación de proteínas bioactivas de fuentes naturales (Yan, JK, et al., Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 2017, 1-16.) Recientemente se ha utilizado como un método escalable para la purificación de varias proteínas (Duman, YA y Kaya, E., Appl. Biochem. Biotechnol., 2013, 170, 1119 1126; Gagaoua, M., et al., Int. J. Biol. Macromol., 2017, 102, 515-525; Alici, EH & Arabaci, G., int. J. Biol. Macromol., 2016, 93, 1051-1056; Sagu, ST, et al., Food Chem., 2015, 183, 144-153) y antígenos virales (Maxwell, et al., Mol. Carcinog. 1989, 2, 322-335; Ward, WW, Innovaciones en tecnología farmacéutica, 28-34, 2009. Patente de Estados Unidos 7.439.337 de Ward., WW). TPP se basa en el uso de un solvente orgánico, generalmente butanel terciario (tbutanol) y una sal, generalmente sulfato de amonio, para precipitar proteínas de solución acuosa. El butanol terciario y solventes similares son normalmente completamente miscibles con agua, pero tras la adición de una sal como el sulfato de amonio, una mezcla de los disolventes acuosos y orgánicos pueden separarse en dos fases, una fase acuosa inferior y una fase orgánica superior (t-butanol). Si la proteína está presente en la muestra acuosa original, una tercera fase ("interfase") que comprende la proteína puede formarse entre la fase acuosa inferior y la fase superior de t-butanol, dependiendo de la concentración de sulfato de amonio adicional. TPP se ha utilizado para purificar varias proteínas, pero no ha habido informes del uso de TPP para purificar partículas de virus como las partículas de AAV. Negrete, A. y col. (J Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci., 2007, 854, 13-19) describen la recuperación acuosa de bacteriófagos utilizando sistemas de detergentes PEG, pero no describen el uso de solventes orgánicos. Szermer-Olearnik, B. y Boratynski, J. (PLoS ONE, 2015, 10, e0122672) describen el aislamiento de bacteriófagos usando 1-butanol, pero este isómero de butanol no es miscible en agua y, por lo tanto, no es adecuado para TPP. Todavía se necesitan métodos simples y escalables de purificación de virus.

Sumario

El inventor actual ha desarrollado métodos para purificar partículas de virus como partículas AAV de lisados de células crudas usando partición trifásica (TPP).

En algunas realizaciones, se describen métodos para purificar un virus a partir de lisados de un cultivo celular. Todos los métodos implican al menos una ronda de particionamiento trifásico (TPP).

En diversas configuraciones, un método de las presentes enseñanzas puede comprender a) formar una primera (o única) composición que comprende i) un lisado celular que comprende un virus, ii) sulfato de amonio y iii) t-butanol; b) agitar la primera (o única) composición, por ejemplo, por agitación, formar así una primera (o única) mezcla, c) separar la primera (o única) mezcla en una primera (o única) fase acuosa, una primera (o única) interfase y una primera (o única) fase orgánica; y d) recoger la primera (o única) fase acuosa. En varias configuraciones, el sulfato de amonio puede estar en una primera (o única) concentración en la que t-butanol es inmiscible con agua.

Los virus que pueden ser aislados por un método de estas enseñanzas es un virus adeno-asociado (AAV), como, por ejemplo, un a Av 2, un AAVS o un Aa V6.

En varias configuraciones, un lisado celular puede ser un lisado celular de insectos infectados con virus células tales como, sin limitación, células Sf9 infectadas con un AAV o infectadas con virus células de mamífero tales como, sin limitación, células HEK293 infectadas con AAV.

En varias configuraciones, en un procedimiento TPP de las presentes enseñanzas, se puede agregar sulfato de amonio a una muestra que comprende un virus, seguido de la adición de t-butanol.

En varias configuraciones de métodos de las presentes enseñanzas, en la primera (o única) ronda de TPP, la cantidad de sulfato de amonio que se puede agregar a una muestra que comprende un virus puede ser de aproximadamente 10% a aproximadamente 30% de saturación, o de 10% a 30% de saturación. En varias configuraciones, la cantidad de sulfato de amonio que se puede agregar para una muestra que comprende un virus en una primera o única ronda de TPP puede ser aproximadamente 10%, 10%, aproximadamente 15%, 15%, aproximadamente 20%, 20%, aproximadamente 25%, 25%, aproximadamente 30% o 30% de saturación. En algunas configuraciones, cuando el virus es un AAV2, en la primera (o única) ronda de TPP, la primera (o única) concentración de sulfato de amonio puede ser de aproximadamente 10% a aproximadamente 25% de saturación, o de 10% a 25% de saturación. En varias configuraciones, cuando el virus es un AAV2, en la primera (o única) ronda de TPP, la primera (o única) concentración de sulfato de amonio puede ser aproximadamente 10%, 10%, aproximadamente 15%, 15%, aproximadamente 20%, 20%, aproximadamente 25% o aproximadamente 25% de saturación. En algunas configuraciones, cuando el virus es un AAVS, en la primera (o única) ronda de TPP, la primera (o única) concentración de sulfato de amonio puede ser de aproximadamente 10% a aproximadamente 20% de saturación, o de 10% a 20% de saturación. En algunos configuraciones, cuando el virus es un AAVS, en la primera (o única) ronda de TPP, la primera (o única) concentración de sulfato de amonio puede ser de aproximadamente 10%, 10%, aproximadamente 15%, 15%, aproximadamente 20% o 20% de saturación. En algunas configuraciones, cuando el virus es un AAV6, en la primera (o única) ronda de TPP, la primera (o única) concentración de sulfato de amonio puede ser de aproximadamente 15% a aproximadamente 30% de saturación, o de 15% a 30% de saturación. En varios configuraciones, cuando el virus es un AAV6, en la primera (o única) ronda de TPP, la primera (o única) concentración de sulfato de amonio puede ser de aproximadamente 15%, 15%, aproximadamente 20%, 20%, aproximadamente 25%, 25%, aproximadamente 30% o 30% de saturación.

En diversas configuraciones, los métodos pueden comprender formar una composición mediante la agregación de sulfato de amonio a una muestra que comprende un virus, luego agregar el t-butanol. En varios aspectos, el volumen de t-butanol puede ser aproximadamente el mismo que el de la muestra. Una composición que comprende la muestra, el sulfato de amonio y el t-butanol, luego se puede agitar para formar una mezcla.

En varias configuraciones, agitar la composición para formar una mezcla puede comprende agitar la composición.

En varias configuraciones, agitar la composición para formar una mezcla puede comprende agitar vigorosamente la composición.

En varias configuraciones, siguiendo la agitación, una mezcla puede separarse espontáneamente en al menos tres capas, es decir, una fase orgánica, una interfase y una fase acuosa, por sedimentación de la mezcla.

En varias configuraciones, tal arreglo trifásico puede formarse estableciéndose durante al menos 30 minutos, o durante aproximadamente 30 a aproximadamente 60 minutos, después de la formación de la primera (o única) mezcla. En varios aspectos, una primera interfase puede comprender, consistir esencialmente en, o consiste en una masa suelta y esponjosa.

En varias configuraciones, un método TPP de las presentes enseñanzas, además de o en lugar de asentarse, puede comprender someter una primera (o única) mezcla agitada a centrifugación, acelerando o promoviendo la separación de la primera (o única) mezcla en una fase acuosa, una fase orgánica (t-butanol) y una interfase. En algunos aspectos, una primera interfase puede comprender, consistir esencialmente o consistir en una capa esponjosa semisólida, y la centrifugación puede promover su formación.

En algunas configuraciones, la centrifugación de una mezcla de las presentes enseñanzas puede comprende centrifugar la mezcla a aproximadamente 4000 rpm (aproximadamente 4293 = g) durante aproximadamente 10 min. En algunas configuraciones, la centrifugación puede comprender centrifugar una mezcla de las presentes enseñanzas a 3000 rpm a 5000 rpm (aprox. 2400 xg a 6700 = g) durante aproximadamente 5 minutos a unos 10 minutos.

En diversas realizaciones, un primer procedimiento de separación de TPP de un lisado de célula infectada con virus puede conducir a la primera fase acuosa que comprende la mayoría del virus. Esta primera fase acuosa se puede recoger, y se puede usar el virus contenido en él o más purificado. En algunas configuraciones, la primera interfase puede comprender, consistir esencialmente en, o consistir en proteínas celulares, ADN y otros componentes celulares.

En algunas configuraciones, los métodos de las presentes enseñanzas pueden comprender además una segunda ronda de TPP, que puede comprender e) formar una segunda composición que comprende i) una primera fase acuosa recogida en d), ii) sulfato de amonio a una segunda concentración en el que t-butanol es inmiscible con agua, y iii) tbutanol. En varias configuraciones, la segunda composición puede agitarse, formando así una segunda mezcla. En varios aspectos, después de la agitación, la segunda mezcla se puede separar en al menos tres fases, incluyendo una segunda fase orgánica, una segunda interfase y una segunda fase acuosa. En varios aspectos, la segunda interfase, que puede comprender la mayoría del virus, puede ser recogida. En algunas configuraciones, en un método de estos aspectos, la concentración del sulfato de amonio en el paso e) puede ser de aproximadamente 25% a aproximadamente 40% de saturación, o puede ser de 25% a 40% de saturación. En varias configuraciones, en un método de estas enseñanzas, la concentración de sulfato de amonio en la etapa e) puede ser aproximadamente del 25%, 25%, 30%, aproximadamente 30%, 35%, aproximadamente 35%, aproximadamente 40% o 40% de saturación. En algunas configuraciones, cuando el virus es un AAV2, la segunda concentración de sulfato de amonio en el paso e) puede ser de aproximadamente 35% a aproximadamente 40% de saturación, o puede ser de 35% a 40% de saturación. En varias configuraciones, cuando el virus es un AAV2, la segunda concentración de sulfato de amonio en el paso e) puede ser aproximadamente 35%, 35%, aproximadamente 36%, 36%, aproximadamente 37%, 37%, aproximadamente 38%, 38%, aproximadamente 39%, 39%, aproximadamente 40% o 40% de saturación. En algunas configuraciones, cuando el virus es un AAVS, la segunda concentración de sulfato de amonio en el paso e) puede ser de aproximadamente 35% a aproximadamente 40% de saturación, o puede ser de 35% a 40% de saturación. En varias configuraciones, cuando el virus es un AAV5, la segunda concentración de sulfato de amonio en el paso e) puede ser aproximadamente 35%, 35%, aproximadamente 36%, 36%, aproximadamente 37%, 37%, aproximadamente 38%, 38%, aproximadamente 39%, 39%, aproximadamente 40% o 40% de saturación. En algunas configuraciones, cuando el virus es un AAV6, la segunda concentración de sulfato de amonio en el paso e) puede ser de aproximadamente 30% a aproximadamente 35% de saturación, o puede ser de 30% a 35% de saturación. En varias configuraciones, cuando el virus es un AAV6, la segunda concentración de sulfato de amonio en el paso e) puede ser aproximadamente 30%, 30%, aproximadamente 31%, 31%, aproximadamente 32%, 32%, aproximadamente 33%, 33%, aproximadamente 34%, 34%, aproximadamente 35% o 35% de saturación.

En algunas configuraciones, después de la agitación, la segunda mezcla se puede separar en al menos tres fases por asentamiento, por ejemplo, durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 60 minutos. En algunas configuraciones, la segunda mezcla se puede separar en al menos tres fases por una segunda centrifugación además de o en lugar de un segundo asentamiento. En varios aspectos, un la segunda centrifugación puede comprender centrifugar la segunda mezcla a aproximadamente 4293 = g (aproximadamente 4000 rpm) durante aproximadamente 10 min, o centrifugando la segunda mezcla a 4293 (4000 rpm) durante 10 min, o centrifugando la segunda mezcla a 3000 rpm a 5000 rpm (aprox. 2400 x g a 6700 x g) durante 5 minutos a 10 minutos. En varias configuraciones, una segunda interfase puede comprender, consistir esencialmente o consistir en una masa esponjosa y suelta. Esta segunda interfase puede comprender la mayoría de las partículas de virus y puede ser sustancialmente más pura que el lisado celular. En algunas configuraciones, las partículas de AAV recogidas de una segunda interfase después de dos rondas de TPP pueden infectar células diana al menos también como partículas de AAV preparadas por métodos estándar.

En algunas configuraciones, los métodos de purificación de virus de las presentes enseñanzas pueden comprender además someter el virus recogido en una fase acuosa en el paso d) después de una ronda de TPP como se describió anteriormente para una purificación adicional en un procedimiento de purificación de cromatografía. Un procedimiento de purificación por cromatografía en columna puede ser, para ejemplo y sin limitación, una cromatografía de afinidad de heparina, una cromatografía de afinidad de heparina de HPLC, una cromatografía de intercambio catiónico por HPLC, o una combinación de los mismos. (Zolotukhin, S., et al., Gene Therapy 6, 973-985, 1999.) En algunas configuraciones, un procedimiento de purificación por cromatografía en columna puede ser, por ejemplo y sin limitación, un procedimiento de cromatografía de intercambio iónico, un procedimiento de cromatografía de filtración en gel, o una combinación de los mismos. (Tomono, T., et al., Molecular Therapy - Methods & Clinical Development 3, 15058, 2016.)

En algunas configuraciones, los métodos de purificación de virus de las presentes enseñanzas pueden comprender además someter el virus recogido en una fase acuosa en el paso d) después de una ronda de TPP como se describió anteriormente para una purificación adicional en un procedimiento de centrifugación en gradiente de densidad. En varios aspectos, un procedimiento de purificación por gradiente de densidad puede comprender, para ejemplo y sin limitación, un procedimiento de purificación en gradiente de densidad de sacarosa, un procedimiento de purificación de gradiente de densidad de cloruro de cesio, un gradiente de densidad de yodixanol procedimiento, o una combinación de los mismos.

La presente divulgación incluye, sin limitación, los siguientes aspectos.

En algunas realizaciones de las presentes enseñanzas, un método para purificar un virus de un lisado celular infectado con virus puede comprender a) formar una primera composición que comprende i) un lisado celular que comprende un virus, ii) sulfato de amonio y iii) t-butanol; b) agitar la primera composición formando así una primera mezcla; c) separar la primera mezcla para formar una primera fase orgánica, una primera interfase y una primera fase acuosa; y d) recoger la primera fase acuosa, en donde la primera fase acuosa comprende el virus, y en donde el sulfato de amonio se encuentra en una primera concentración en la que el t-butanol es inmiscible con agua.

El virus es un virus adenoasociado (AAV). En algunas configuraciones, el virus puede ser un virus adenoasociado seleccionado del grupo que consiste en AAV2, AAV5 y AAV6.

En varias configuraciones de un método de las presentes enseñanzas, la primera concentración de sulfato de amonio puede ser de 10% a 30% de saturación. En varios configuraciones, el virus puede ser un AAV2 y la primera concentración de sulfato de amonio puede ser de 10% a 25% de saturación. En varias configuraciones, el virus puede ser un AAVS5 y la primera concentración de sulfato de amonio puede ser de 10% a 20% de saturación. En varias configuraciones, el virus puede ser AAV6 y la primera concentración de sulfato de amonio puede ser del 15% al 30% de saturación.

En varias configuraciones de un método de las presentes enseñanzas, la separación de la primera mezcla puede comprender sedimentar la primera mezcla durante al menos 30 minutos. En varias configuraciones, la separación de la primera mezcla puede comprender la solución de la primera mezcla para aproximadamente 30 a aproximadamente 60 minutos. En varias configuraciones, la separación de la primera mezcla comprende centrifugar la primera mezcla. En algunas configuraciones, la centrifugación de la primera mezcla comprende centrifugar la primera mezcla a aproximadamente 4000 rpm (aproximadamente 4293 x g) durante unos 10 min.

En diversas configuraciones, un método de acuerdo con las presentes enseñanzas puede comprende además e) formar una segunda composición que comprende i) la primera fase acuosa recogido en d), ii) sulfato de amonio a una segunda concentración en la que t-butanol es inmiscible con agua, y iii) t-butanol; f) agitar la segunda composición de ese modo formando una segunda mezcla; g) separar la segunda mezcla para obtener una segunda orgánica capa, una segunda interfase y una segunda capa acuosa; y h) recoger la segundo interfase. En algunas configuraciones, la segunda concentración de sulfato de amonio puede ser de 25% a 40% de saturación. En varias configuraciones, el virus puede ser un AAV2 y la segunda concentración de sulfato de amonio puede ser del 35% al 40% de saturación. En varias configuraciones, el virus puede ser un AAVS5 y la segunda concentración de sulfato de amonio puede ser del 35% al 40% de saturación. En varias configuraciones, el virus puede ser AAV6 y la segunda concentración de sulfato de amonio puede ser saturación al 30% al 35%. En diversas configuraciones, la separación de la segunda mezcla puede comprender sedimentando la segunda mezcla durante aproximadamente 30 a aproximadamente 60 minutos. En varias configuraciones, la separación de la segunda mezcla puede comprender centrifugar la segunda mezcla. En algunas configuraciones, la centrifugación de la segunda mezcla puede comprender la centrifugación de la segunda mezcla a aproximadamente 4000 rpm (aproximadamente 4293 x g) durante aproximadamente 10 min. En varias configuraciones, un método de las presentes enseñanzas puede comprender además someter la segunda solución acuosa fase recogida en h) a un procedimiento de purificación en gradiente de densidad de cloruro de cesio.

En diversas configuraciones, un método de las presentes enseñanzas puede comprender además someter la primera fase acuosa recogida en d) a un procedimiento de purificación de cromatografía en columna. En algunas configuraciones, el procedimiento de purificación por cromatografía en columna puede seleccionarse del grupo que consiste en cromatografía de afinidad de heparina, cromatografía de afinidad por heparina HPLC y cromatografía de intercambio catiónico por HPLC. (Zolotukhin, S., et al., Gene Therapy 6, 973-985, 1999.) En algunas configuraciones, el procedimiento de purificación por cromatografía en columna se selecciona del grupo que consiste en un procedimiento de cromatografía de intercambio iónico, un procedimiento de cromatografía de filtración en gel, y una combinación de los mismos. (Tomono, T., et al., Molecular Therapy - Methods & Clinical Development 3, 15058, 2016.)

En diversas configuraciones, un método de las presentes enseñanzas puede comprender además someter la primera fase acuosa recogida en d) a un procedimiento de centrifugación de purificación en gradiente de densidad.

En diversas configuraciones, un método de las presentes enseñanzas puede comprender además someter la primera fase acuosa recogida en d) a un procedimiento de purificación de gradiente de densidad de sacarosa.

En diversas configuraciones, un método de las presentes enseñanzas puede comprender además someter la primera fase acuosa recogida en d) a un procedimiento de purificación de gradiente de densidad de cloruro de cesio.

En diversas configuraciones, un método de las presentes enseñanzas puede comprender además someter la primera fase acuosa recogida en d) a un procedimiento de purificación de gradiente de densidad de yodixanol.

En varias configuraciones, en un método de las presentes enseñanzas, el lisado celular que comprende un virus puede ser un lisado de una célula de insecto que comprende un virus. En algunas configuraciones, la célula de insecto que comprende un virus puede ser una célula Sf9 que comprende un virus. En varias configuraciones, la célula de insecto que comprende un virus puede ser una célula Sf9 que comprende un AAV.

En varias configuraciones, en un método de las presentes enseñanzas, el lisado celular que comprende un virus es un lisado de una célula de mamífero que comprende un virus. En algunas configuraciones, la célula de mamífero que comprende un virus puede ser una célula HEK293 que comprende un virus. En algunas configuraciones, la célula de mamífero que comprende un virus puede ser una célula HEK293 que comprende un AAV.

En diversas realizaciones, una composición de las presentes enseñanzas puede comprender un lisado celular que comprende un virus; sulfato de amonio; y t-butanol. En algunas configuraciones, el sulfato de amonio puede estar en una concentración en la que el t-butanol es inmiscible con agua. En varias configuraciones, el virus puede ser un virus no envuelto. En varios configuraciones, el virus se puede seleccionar del grupo que consiste en un adenovirus y un virus adenoasociado. En varias configuraciones, el virus puede ser un virus adeno-asociado. En varias configuraciones, el virus se puede seleccionar del grupo que consiste en un AAV2, un AAVS5 y un AAV6. En varias configuraciones, el lisado celular que comprende un virus puede ser un lisado celular de una célula de insecto que comprende un virus. En varias configuraciones, el lisado celular que comprende un virus puede ser un lisado celular de una célula de insecto Sf9 que comprende un virus adenoasociado. En varias configuraciones, el lisado celular que comprende un virus puede ser un lisado celular de una célula de insecto Sf9 que comprende un virus adeno-asociado seleccionado del grupo que consiste en un AAV2, un AAV5 y un AAV6.

En diversas realizaciones, las presentes enseñanzas pueden abarcar un virus AAV purificado por el método como se describe en este documento.

Breve descripción de los dibujos

FIG. 1 ilustra los efectos de diferentes saturaciones de sulfato de amonio en la primera ronda de TPP en recuperación AAV2.

FIG. 2 ilustra los efectos de diferentes saturaciones de sulfato de amonio en la primera ronda de TPP en recuperación AAV5S.

FIG. 3 ilustra los efectos de diferentes saturaciones de sulfato de amonio en la primera ronda de TPP en recuperación AAV6.

FIG. 4 ilustra los efectos de diferentes saturaciones de sulfato de amonio en la segunda ronda de TPP en recuperación AAV2.

FIG. 5 ilustra los efectos de diferentes saturaciones de sulfato de amonio en la segunda ronda de TPP en recuperación AAV5.

FIG. 6 ilustra los efectos de diferentes saturaciones de sulfato de amonio en la segunda ronda de TPP en recuperación AAV6.

FIG. 7 ilustra los efectos de diferentes valores de pH en la recuperación del vector AAV2 en un método TPP de las presentes enseñanzas.

FIG. 8 ilustra los efectos de diferentes valores de pH en la recuperación del vector AAVS5 en un método TPP de las presentes enseñanzas.

FIG. 9 ilustra los efectos de diferentes valores de pH en la recuperación del vector AAV6 en un método TPP de las presentes enseñanzas.

FIG. 10 ilustra un análisis representativo de SDS-PAGE de muestras de AAV recogidas de un método TPP de las presentes enseñanzas.

FIG. 11 ilustra una purificación a gran escala de AAV5-Luciferase utilizando un método TPP de las presentes enseñanzas.

Descripción detallada

El inventor ha desarrollado métodos para purificar un virus de un lisado celular, como, por ejemplo, un virus adenoasociado de un lisado de células de insecto, utilizando tres fases particionamiento.

En diversas configuraciones, un método de las presentes enseñanzas puede comprender una primera ronda de particionamiento trifásico (TPP), es decir, a) formando una primera (o única) composición que comprende i) un lisado celular que comprende un virus, ii) sulfato de amonio y iii) t-butanol; b) agitando la primera (o única) composición, por ejemplo, agitando o agitando vorticialmente, formando así la primera (o única) mezcla, c) separar la primera (o única) mezcla en una primera (o única) fase acuosa, una primera (o única) interfase y una primera (o única) fase orgánica (es decir, formando capas que comprenden una fase acuosa, una interfase y una fase orgánica); y d) recoger la primera (o única) fase acuosa. En varias configuraciones, el amonio el sulfato puede estar en una primera (o única) concentración en la que el t-butanol es inmiscible con agua. En diversas configuraciones, los métodos de las presentes enseñanzas pueden comprender además una segunda ronda de TPP, que puede comprender e) formar una segunda composición que comprende i) una primera fase acuosa recogida en d), ii) sulfato de amonio a una segunda concentración en cuyo t-butanol es inmiscible con agua y iii) t-butanol. En varias configuraciones, la segunda composición puede agitarse, formando así una segunda mezcla. En varios aspectos, después de la agitación, la segunda mezcla se puede separar en al menos tres fases, incluyendo una segunda fase orgánica, una segunda interfase y una segunda fase acuosa. En varios aspectos, la segunda interfase, que puede comprender la mayoría del virus, puede ser recogida. En varias configuraciones, la fase acuosa puede comprender el virus con impurezas reducidas tales como restos celulares y proteínas celulares en comparación con el lisado.

Los virus que pueden aislarse mediante un método de las presentes enseñanzas es un virus adenoasociado (AAV), como, por ejemplo y sin limitación, un AAV2, un AAV5 o un AAV6. En varias configuraciones, un lisado celular puede ser un lisado celular de células de insectos infectados con virus tales como, sin limitación, células Sf9 infectadas con un AAV o células de mamífero infectadas con virus tales como, sin limitación, células HEK293 infectadas con AAV. En varios configuraciones, en un procedimiento TPP de las presentes enseñanzas, el sulfato de amonio puede ser añadido a una muestra que comprende un virus, seguido de la adición de t-butanol.

En general, un método de purificación de TPP requiere la saturación de una sal tal que t-butanol ya no es miscible en agua, de modo que los solventes acuosos y orgánicos pueden separar en fases. El sulfato de amonio es una sal adecuada, y generalmente las concentraciones requeridas para hacer que el t-butanol sea inmiscible son del 10 al 40% de saturación de sulfato de amonio. Como se describe en el presente documento, un método de las presentes enseñanzas puede optimizarse para un virus particular. Por ejemplo, la recuperación de AAV2 es óptima cuando la primera (o única) concentración de sulfato de amonio es de 10% a 25% de saturación y la segunda concentración de sulfato de amonio (si se realiza) es de 35% a 40% de saturación. La recuperación de AAV5 es óptima cuando la primera (o única) concentración de sulfato de amonio es del 10% al 20% de saturación y la segunda concentración de sulfato de amonio (si realizado) es de 35% a 40% de saturación. La recuperación de AAV6 es óptima cuando la primera (o única) la concentración de sulfato de amonio es de 15% a 30% de saturación y la segunda La concentración de sulfato de amonio (si se realiza) es de 30% a 35% de saturación. Los expertos podrán optimizar los métodos de las presentes enseñanzas para otros virus basados en los ejemplos de este documento utilizando experimentación de rutina.

También se describen experimentos para optimizar el pH del lisado para la recuperación viral. La recuperación viral óptima ocurre a pH 6,5 para AAV2 y AAVS5 con rendimientos decrecientes en pH más bajo. En general, la recuperación óptima ocurre a un pH de 5,5 a 7,5, y un experto podría optimizar el pH para virus adicionales utilizando la experimentación de rutina.

En varias configuraciones, los virus purificados por un método de las presentes enseñanzas: incluyendo una purificación o dos purificaciones, pueden purificarse aún más mediante métodos de purificación previamente conocidos en la técnica, tales como, sin limitación, un procedimiento de cromatografía de columna, como cromatografía de afinidad de heparina, cromatografía de afinidad de heparina HPLC o cromatografía de intercambio catiónico por HPLC. Procedimientos de cromatografía de columna conocidos en la técnica adecuados para su uso en métodos de las presentes enseñanzas incluyen cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en procedimiento de gel. La cromatografía de intercambio iónico puede incluir columnas de desalinización y el intercambio de membranas. Tales métodos son conocidos en la técnica.

Los métodos y composiciones descritos en este documento utilizan bien las técnicas de laboratorio conocidas por expertos artesanos, y se pueden encontrar en manuales de laboratorio como Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 2001; Spector, DL et al., Cells: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1998; Nagy, A., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (3a Ed.), Cold Spring Harbor, NY, 2003 y Harlow, E., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1999. Como se usa en la presente descripción y cualquier reivindicación adjunta, las formas singulares “un”, “una”, “el” y “la” están destinadas para incluir también las formas plurales, a menos que el contexto indique lo contrario.

Todas las velocidades de centrífuga se dan en rpm y x g. Los artesanos expertos reconocerán que estas conversiones dependerán del rotor utilizado y que las fuerzas expresadas en x g serán constantes, independientemente de las RPM reales del rotor.

Materiales y métodos

Cultivo celular Sf9. Las células Sf9 (Jeang, KT, et al., J. Virol. 61: 708-713, 1987) fueron cultivadas en botellas de almacenamiento CORNING® (Corning, Inc., Tewksbury, MA) a 28°C en Medio Es F 921™ (Expression Systems, Davis, CA) suplementado con 100 unidades/ml penicilina y estreptomicina 100 pg/ml (Mediatech, Inc., Manassas, VA). Las células fueron divididas 1:4 una vez que la densidad celular alcanzó 1,00107 células/ml para mantenimiento.

El cultivo celular HEK293. Las células del embrión humano cortical renal (HEK293) (Simmons, NL, Experimental Physiol. 75, 309-319, 1990) se cultivaron en matraces T-75 en medios DMEM suplementados con 100 unidades/ml de penicilina y 100 g/ml de estreptomicina (Mediatech) y 10% de FBS (ATCC, Manassas, VA). Los matraces se incubaron a 37°C en una incubadora de CO². Las células se dividieron 1:10 una vez que alcanzaron la confluencia para fines de mantenimiento.

Producción de partículas AAV. La producción de partículas AAV se realizó de acuerdo con los protocolos estándar de Virovek (Chen, H., Methods Mol. Biol. 2011; 737: 235-46). Brevemente, las células Sf9 se cultivaron a aproximadamente 1,00 x 107 células/ml y se diluyeron 1:1 con medios ESF™ 921 recientes. 10 moi de baculovirus recombinante (rBV) que contiene genes rep-cap designados y 5 moi de rBV que contienen un gen de interés (como, por ejemplo, un gen que codifica una proteína fluorescente verde o una luciferasa) se agregaron para infectar las células Sf9 durante 3 días a 28°C en una incubadora con agitador. Las células Sf9 infectadas fueron cosechadas por centrifugación a 2415 = g durante 10 min y se almacenaron a -20°C antes de su uso.

Preparación de lisado celular. Los sedimentos celulares que contenían partículas de AAV se lisaron en tampón de lisis Sf9 (Tris-HCl 50 mM, pH 7,8, NaCl 500 mM, MgCl 2 mM, Sarkosyl al 1% y 1% TRITON™ X-100 (Dow Chemical Company, Midland, MI)) y 60 unidades/ml Endonucleasa inespecífica ARCTICZYMES® HL-SAN (ArcticZymes, Inc., Plymouth Meeting, PA) sonicando durante 30 segundos. El ADN genómico se digirió por incubación a 37°C por una hora.

Particionamiento trifásico. Se añadió sulfato de amonio en polvo al lisado celular en las saturaciones discutidas infra y disueltas por vórtice. Se añadió un volumen igual de t-butanol al lisado celular y se mezcló mediante agitación vigorosa durante 1 minuto. La mezcla de lisado de células-t-butanol se centrifugó a 4293 x g durante 10 minutos para formar tres fases. Después de eliminar la fase superior, la fase acuosa inferior (L1) que contiene AAV se recogieron partículas y la interfase, que contenía la mayoría de las células. Se descartaron proteínas y otros restos celulares. Esto completó la primera ronda de TPP. La fase acuosa (L1) ahora se puede usar para cromatografía en columna, procesos de centrifugación de gradiente de densidad, o una segunda ronda de TPP para purificar aún más los vectores AAV.

Para una segunda ronda de TPP, el nivel de saturación de sulfato de amonio en L1 fue llevado a la saturación deseada según sea necesario. Una cantidad igual de t-butanol fue entonces añadida y mezclada con agitación vigorosa durante 1 min. La mezcla acuosa de t-butanol fue centrifugada a 4293 x g durante 10 minutos para formar tres fases. Las fases superior e inferior fueron eliminadas, y la interfase que contiene partículas de AAV fue disuelta por sonicación durante 1 minuto en el tampón de lisis Sf9 que contiene citrato de sodio 100 mM (Tris-HCl 50 mM, pH 7,8, NaCl 500 mM, MgCl 2 mM, citrato de sodio 100 mM, Sarkosyl al 1%, y 1% TRITON™ X-100) seguido de balanceo a temperatura ambiente durante 1 hora. La interfase disuelta se centrifugó a 10322 x g durante 20 minutos para eliminar los residuos insolubles. El sobrenadante se usó para intercambio de tampón y filtración estéril. La cantidad de partículas de AAV se determinó usando un ensayo de p Cr cuantitativa (QPCR), y la pureza se determinó por SDS-PAGE y tinción.

La purificación por cromatografía en columna de AAV: muestras que contienen partículas AAV en el L1 acuoso pueden purificarse adicionalmente usando MUSTANG® S y monedas de membrana MUSTANG® Q (Pall Industries, Port Washington, NY) según el protocolo del fabricante. Brevemente, las monedas MUSTANG® S y Q se pueden tratar primero con 10 ml de NaOH 1 M seguido de 10 ml de NaCl 1 M y 10 ml de Tris-HCl 20 mM (pH 9,0). Entonces se pueden desalar 5 ml de muestra de AAV L1 con columnas de desalación PD-10 diluido 1:10 con Tris-HCl 20 mM (pH 9,0) y aplicado a la moneda Mustang S. El paso de flujo se puede recoger y aplicar a la moneda MUSTANG® Q. Después de lavar con 1,5 mL de Tris-HCl 20 mM (pH 9,0), las partículas de AAV pueden eluirse con tampón de elución (20 Tris-HCl mM (pH 9,0), NaCl 300 mM), desalado con columnas de desalación PD-10, y Los títulos pueden determinarse con un método QPCR.

Purificación por gradiente de densidad de AAV: muestras que contienen partículas de AAV en el L1 acuoso se pueden cargar en la parte superior del gradiente escalonado con 1,55 g/cc y 1,32 g/cc de soluciones de CsCl y se centrifugan a 28.000 rpm durante la noche (~ 20 horas). Las partículas de AAV pueden recogerse con una jeringa, se desalan con columnas de desalación PD-10 y los títulos pueden ser determinados con un método qPCR.

SDS-PAGE y tinción de proteínas. Se mezclaron muestras que contenían partículas de AAV con tampón de carga SDS-PAGE (Invitrogen) y se calentaron a 95°C durante 5 min. Luego se cargaron en un gel de SDS-PAGE al 10% y se ejecutaron a 100 V hasta que el colorante (bromofenol Azul) llegó al fondo del gel. El gel se tiñó de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen).

Medición de la concentración de proteínas. Las concentraciones de proteínas en los lisados celulares fueron medidas utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA PIERCE™ (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) según el protocolo del fabricante. En resumen, 25 pl de muestras que contienen partículas de AAV se mezcló con 200 pl de mezcla de reactivo de ensayo de proteínas BCA PIERCE™ (50 partes de Reactivo A mezclado con 1 parte de Reactivo B). Después de la incubación a temperatura ambinte durante 15-20 min, los valores de OD se registraron en el lector de placa Tecan Ultra 384 (Morrisville, NC).

Cuantificación de partículas AAV. Las cantidades de partículas de AAV fueron determinadas usando un ensayo cuantitativo de PCR en tiempo real usando un sistema CHROMO4™ (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, las muestras de AAV se digirieron con DNasal durante una hora a 37°C para eliminar ADN contaminante de la superficie de las partículas del virus. Al final de la digestión, las muestras de AAV se mezclaron con un volumen igual de EDTA 200 mM y se calentaron a 95°C durante 30 minutos para inactivar DNasal. Las muestras de AAV digeridas fueron luego analizadas por un Ensayo QPCR en el detector de tiempo real CHROMO4™.

Ensayo de infectividad de AAV. Las partículas de AAV purificadas se usan para transducir células HEK293 para determinar la infectividad de las partículas. Brevemente, las partículas de AAV se diluyen en DMEM que contiene etopósido 20 uM y se agrega a las células HEK293 en placas de 24 pocillos. Después de incubación a 37°C en una incubadora de CO2 durante 3 días, las células que expresan GFP pueden ser fotografiadas, analizadas y comparadas con partículas de AAV purificadas usando un método convencional de ultracentrifugación de CsCl.

Ejemplos

Las presentes enseñanzas, incluidas las descripciones proporcionadas en los ejemplos que no pretenden limitar el alcance de cualquier reivindicación o aspecto. A menos que se presente específicamente en un tiempo pasado, un ejemplo puede ser un ejemplo profético o real. Los siguientes ejemplos no limitantes se proporcionan para ilustrar adicionalmente las presentes enseñanzas. Personas de habilidad en la técnica, a la luz de la presente divulgación, apreciarán que se pueden realizar muchos cambios hechos en las realizaciones específicas que se divulgan y todavía obtienen un resultado similar sin apartarse del espíritu y el alcance de las presentes enseñanzas.

Ejemplo 1

Este ejemplo ilustra los efectos de variar los niveles de saturación de sulfato de amonio sobre la distribución de AAV2 en la primera ronda de TPP de los lisados celulares sometidos a TPP.

Inicialmente, se descubrió que someter a los lisados celulares a una primera ronda de TPP resultó en partículas de AAV2 que quedan en la fase acuosa mientras que las proteínas celulares y los restos celulares formaron una interfase sólida. Una segunda ronda de TPP condujo a las partículas de AAV a formar una interfase sólida, con proteínas celulares y restos celulares que quedan en la fase acuosa. En otros experimentos, fueron investigados los efectos de los diferentes valores de saturación de sulfato de amonio en la primera ronda de TPP en la distribución de AAV2 en los lisados celulares sometidos a TPP. Los resultados, mostrados en la FIG. 1, son representativos de promedios de lisados de tres experimentos independientes. En la FIG. 1, A, B, C y D corresponden a lisados celulares de células Sf9 infectadas con AAV2 con saturación de amonio al 10%, 15%, 20% y 25% sulfato, respectivamente en la primera ronda de TPP; L1 representa la fase acuosa después de la primera ronda de TPP; L2 representa la fase acuosa después de la segunda ronda de TPP en saturación fija de 35% de sulfato de amonio; Int representa la interfase después de la segunda ronda de TPP a una saturación fija de 35% de sulfato de amonio. Las barras de error indican desviación estándar.

La distribución máxima de AAV2 a la fase acuosa en la primera ronda fue lograda a 15% de saturación de sulfato de amonio. Cuando el valor de saturación de amonio sulfato en la primera ronda de TPP se incrementó a 25%, hubo una ligera disminución de AAV2 en la fase acuosa (FIG. 1, comparar D-L1 con C-L1 y D-Int con C-Int). En la segunda ronda, se observó una distribución máxima de AAV2 a la interfase de lisados sometidos a 20% de saturación de sulfato de amonio en la primera ronda (C-Int). Se realizaron ensayos de proteínas para controlar la eliminación de proteínas celulares a lo largo de todo el proceso de TPP. Los resultados presentados en la FIG. 1 indican que del 70% al 80% de las proteínas celulares se eliminaron en la primera ronda de TPP. Además, hay un ligero aumento del poder de eliminación de proteínas con el aumento del valor de saturación de sulfato de amonio del 10% al 30%.

Ejemplo 2

Este ejemplo ilustra los efectos sobre la distribución AAVS5S de niveles variables de saturación de sulfato de amonio en la primera ronda de TPP de lisados celulares sometidos a TPP.

En estos experimentos, los efectos de los diferentes valores de saturación de sulfato de amonio en la primera ronda de TPP en distribución AAV5 en lisados celulares sometidos a TPP fueron investigados. Los resultados, mostrados en la FIG. 2, son representativos de los valores promedio de tres lisados con 10%, 15%, 20% y 25% de saturación de sulfato de amonio (A, B, C y D, respectivamente) en la primera ronda de TPP; L1 representa la fase acuosa después de la primera ronda de TPP; L2 representa la fase acuosa después de la segunda ronda de TPP en una saturación fija de 35% de sulfato de amonio; Int representa la interfase después de la segunda ronda de TPP a una saturación fija de 35% de sulfato de amonio.

Cuando los lisados celulares que contienen vectores AAV5 se sometieron a una primera ronda de TPP con saturación de sulfato de amonio al 10%, 15%, 20% o 25%, y una segunda ronda de TPP con saturación fija de 35% de sulfato de amonio, una disminución importante de los vectores AAV5 en la fase acuosa se observó al 25% de saturación de sulfato de amonio (Figura 2, comparar D-L1 con C-L1 y D-Int con C-Int). Los análisis de proteínas indican que la mayoría de proteínas celulares (del 69% al 62%) se eliminaron en la primera ronda de TPP. La segunda ronda de TPP eliminó proteínas celulares adicionales. Solo el 17% o menos de proteínas celulares permanecieron en la interfase que contenía los vectores AAV5.

Se realizaron ensayos de proteínas para controlar la eliminación de proteínas celulares a través de todo el proceso de TPP. Los resultados de la FIG. 2 indican que del 70% al 80% de las proteínas celulares se eliminaron en la primera ronda de TPP. Hay un ligero aumento de poder de eliminación de proteínas con el aumento del valor de saturación de sulfato de amonio de 10% a 30%.

Ejemplo 3

Este ejemplo ilustra los efectos sobre la distribución de AAV6 de los diferentes tipos de niveles de saturación de sulfato de amonio en la primera ronda de TPP de lisados celulares sometidos a TPP. En estos experimentos, los efectos de variar los niveles de saturación de sulfato de amonio en la primera ronda de TPP en la distribución AAV6 en lisados celulares sometidos a TPP fueron investigados. Los resultados, mostrados en la FIG. 3, son representativos de los valores promedio de tres lisados. A, B, C y D representan lisados celulares con niveles de saturación de sulfato de amonio al 15%, 20%, 25% y 30%, respectivamente en la primera ronda de TPP; L1 representa la fase acuosa después de la primera ronda de TPP; L2 representa la fase acuosa después de la segunda ronda de TPP a una concentración fija de 35% de saturación de sulfato de amonio; Int representa la interfase después de la segunda ronda de TPP a una concentración fija de 35% de saturación de sulfato de amonio.

Cuando los lisados celulares que contienen vectores AAV6 se sometieron a la primera ronda de TPP con 15%, 20%, 25% o 30% de saturación de sulfato de amonio, y la segunda ronda de TPP con un valor fijo de saturación del 35% de sulfato de amonio, recuperación de AAV6 fue estable en todos los tratamientos, incluso cuando la saturación de sulfato de amonio aumentó a 30% en la primera ronda. Esto difiere de AAV2, que mostró una ligera disminución al 25% de sulfato de amonio, y de AAV5, que no se benefició de aumento de sulfato de amonio más allá del 20% de saturación.

Se realizaron ensayos de proteínas para controlar la eliminación de proteínas celulares a través de todo el proceso de TPP. Los resultados presentados en la FIG. 3 indican que del 70% al 80% de las proteínas celulares se eliminaron en la primera ronda de TPP. Hay un ligero aumento de poder de eliminación de proteínas con el aumento del valor de saturación de sulfato de amonio de 10% a 30%.

Ejemplo 4

Este ejemplo ilustra los efectos sobre la distribución de AAV2 de los diferentes tipos de niveles de saturación de sulfato de amonio en la segunda ronda de TPP en lisados celulares sometidos a TPP.

En estos experimentos, los lisados celulares que contienen vectores AAV2 fueron sometidos a una primera ronda de TPP con una saturación fija de 20% de sulfato de amonio. La fase acuosa para cada muestra de a AV2 se dividió en 4 fracciones, y cada fracción se dividió sometida a una segunda ronda de TPP con 25%, 30%, 35% o 40% de saturación de sulfato de amonio. Se recogieron la fase acuosa y la interfase y el título de AAV2 determinado. Los resultados se muestran en la FIG. 4. FIG. 4 ilustra los resultados de tres experimentos independientes: L1 representa la fase acuosa después de la primera ronda de TPP en una saturación fija de 20% de sulfato de amonio; A, B, C y D representan la fase acuosa L1 dividida en 4 fracciones y ajustada para contener 25%, 30%, 35% o 40% de saturación de sulfato de amonio, respectivamente, en la segunda ronda de TPP; L2 representa la fase acuosa después de la segunda ronda de TPP; Int representa la interfase después de la segunda ronda de TPP. Se observó una recuperación sustancial de AAV para todos los valores de saturación probados. Entre Los 4 valores de saturación diferentes probados, el 35% de saturación mostró la tasa de recuperación más alta para las tres muestras de AAV1 en la interfase (ver Figura 4, Int).

Ejemplo 5

Este ejemplo ilustra los efectos sobre la distribución de AAVS5 de los diferentes tipos niveles de saturación de sulfato de amonio en la segunda ronda de TPP de lisados celulares sometidos a TPP. En estos experimentos, los lisados celulares que contienen vectores AAV5 se sometieron a una primera ronda de TPP con una saturación fija de 20% de sulfato de amonio. La fase acuosa para cada muestra de AAV5 se dividió luego en 4 fracciones, y cada fracción se sometió a una segunda ronda de TPP con 25%, 30%, 35% o 40% de saturación de sulfato de amonio. Se recogió cada fase acuosa e interfase y se determinó el título de AAV5. Los resultados se muestran en la FIG. 5. FIG. 5 ilustra los resultados de tres independientes experimentos: L1 representa la fase acuosa después de la primera ronda de TPP a una saturación fija al 20% de sulfato de amonio; A, B, C y D representan la fase acuosa L1 dividida en 4 fracciones y ajustada para contener 25%, 30%, 35% o 40% de saturación de amonio sulfato respectivamente en la segunda ronda de TPP; L2 representa la fase acuosa después la segunda ronda de TPP; Int representa la interfase después de la segunda ronda de TPP. Se observó una recuperación sustancial de AAV para todos los valores de saturación probados. Entre los 4 diferentes valores de saturación probados, el 35% de saturación mostró la tasa de recuperación más alta para muestras de AAYV5 en la interfase (ver Figura 5, Int).

Ejemplo 6

Este ejemplo ilustra los efectos sobre la distribución de AAV6 de los diferentes tipos de niveles de saturación de sulfato de amonio en la segunda ronda de TPP de lisados celulares sometidos a TPP. En estos experimentos, los lisados celulares que contienen vectores AAV6 fueron sometidos a una primera ronda de TPP con una saturación fija de 20% de sulfato de amonio. La fase acuosa para cada muestra AAV5 se dividió en 4 fracciones; cada fracción fue sometida a una segunda ronda de TPP con 25%, 30%, 35% o 40% de saturación de sulfato de amonio. Se recogieron la fase acuosa y la interfase y se determinó el título de AAVS. Los resultados se muestran en la FIG. 6. FIG. 6 ilustra los resultados de tres experimentos independientes: L1 representa la fase acuosa después de la primera ronda de TPP a una saturación fija de 20% de sulfato de amonio; A, B, C y D representan la fase acuosa L1 dividida en 4 fracciones y ajustadas para contener 25%, 30%, 35% o 40% de saturación de amonio sulfato respectivamente en la segunda ronda de TPP; L2 representa la fase acuosa después la segunda ronda de TPP; Int representa la interfase después de la segunda ronda de TPP. Se observó una recuperación sustancial de AAV para todos los valores de saturación probados. Entre los 4 diferentes valores de saturación probados, el 35% de saturación mostró la tasa de recuperación más alta para Muestras de AAV6 en la interfase (ver Figura 6, Int).

Ejemplo 7

Este ejemplo ilustra los efectos de alterar el pH en la distribución de AAV2 en lisados celulares sometidos a TPP. En estos experimentos, las condiciones de pH variaron en los lisados celulares para purificación AAV2 utilizando TPP. Los lisados celulares que contienen vectores AAV2 se prepararon en tampón de lisis Sf9 (pH 7,5) al 20% de saturación de sulfato de amonio y luego se dividieron en 4 fracciones. Después de la incubación con nucleasa durante 1 hora a 37°C para digerir los ácidos nucleicos celulares. Se añadió sulfato de amonio al 20% de saturación y el lisado se dividió en 4 fracciones iguales. Tres fracciones del lisado se ajustaron a pH 6,5, pH 5,5 y pH 4,5 respectivamente con ácido acético; la cuarta fracción se usó para analizar el lisado a pH 7,5. Todos los lisados fueron luego sometidos a dos rondas de TPP, y los títulos de AAV2 fueron luego determinados. Los resultados se muestran en la FIG. 7. En la FIG. 7, L1 representa la fase acuosa después de una primera ronda de TPP a una saturación fija de sulfato de amonio al 20%; L2 representa la fase acuosa después de la segunda ronda de TPP a una saturación fija de sulfato de amonio al 35%; Int representa la interfase después de una segunda ronda de TPP.

La mayoría de los vectores AAV2 se recuperaron en la interfase en todos los valores de pH probado, pero el pH 6,5 mostró la mayor tasa de recuperación de AAV2 (FIG. 7, pH 6,5-Int).

Se realizaron ensayos de proteínas para controlar la eliminación de proteínas celulares a diferentes valores de pH. Los resultados indican que a medida que disminuyeron los valores de pH, se eliminaron más proteínas celulares. Más del 95% de proteínas celulares se eliminaron de las muestras de AAV2 cuando los lisados celulares se ajustaron a pH 4,5 (FIG. 7, pH 4,5-Int).

Ejemplo 8

Este ejemplo ilustra los efectos de variar el pH en la distribución de AAVS en células sometidas a TPP.

En estos experimentos, las condiciones de pH variaron en los lisados celulares para purificación AAV5 en TPP. Los lisados celulares que contienen vectores AAV5 se prepararon en tampón de lisis Sf9 (pH 7,5) al 20% de saturación de sulfato de amonio y luego se dividieron en 4 fracciones. Después de la incubación con nucleasa durante 1 hora a 37°C para digerir los ácidos nucleicos celulares, se añadió sulfato de amonio al 20% de saturación; los lisados se dividieron en 4 partes iguales. Se ajustaron tres fracciones a pH 6,5, pH 5,5 y pH 4,5 respectivamente con ácido acético, la cuarta fracción se usó para analizar el lisado a pH 7,5. Todos los lisados luego fueron sometidos a dos rondas de TPP; Los títulos AAV5S se determinaron a continuación. Los resultados se muestran en la FIG. 8. En la FIG. 8, L1 representa la fase acuosa después de la primera ronda de TPP a una saturación fija de 20% de sulfato de amonio; L2 representa la fase acuosa después de la segunda ronda de TPP a una saturación fija de 35% de sulfato de amonio; Int representa la interfase después de una segunda ronda de TPP.

La mayoría de los vectores AAV5 se recuperaron de pH 7.6, pH 6,5 y pH 5,5. Sin embargo, casi el 80% de los vectores AAV5 se perdieron cuando el valor de pH del lisado disminuyó a 4,5 (FIG. 8, pH 4,5-Int).

Se realizaron ensayos de proteínas para controlar la eliminación de proteínas celulares en diferentes valores de pH. Los resultados indican que a medida que disminuyeron los valores de pH, se eliminaron más proteínas celulares. Sin embargo, la eliminación de proteínas celulares resultó en una pérdida significativa de vectores AAVS5 cuando el pH se redujo a 4,5 (figura 8, pH 4,5-Int).

Ejemplo 9

Este ejemplo ilustra los efectos de variar el pH en la distribución de AAV6 en las células sometidas a TPP.

En estos experimentos, las condiciones de pH variaron en los lisados celulares para purificación AAV6 en TPP. Los lisados celulares que contienen vectores a AV6 se prepararon en tampón lisis Sf9 (pH 7,5) a 20% de saturación de sulfato de amonio y luego se dividieron en 4 fracciones. Después de la incubación con nucleasa durante 1 hora a 37°C para digerir los ácidos nucleicos celulares, se añadió sulfato de amonio al 20% de saturación y cada lisado se dividió en 4 fracciones iguales. Tres fracciones de lisado se ajustaron a pH 6,5, pH 5,5 y pH 4,5 respectivamente con ácido acético, la cuarta fracción se usó para analizar el lisado a pH 7,5. Todos los lisados luego se sometieron a dos rondas de TPP y se determinaron los títulos de AAV6. Los resultados se muestran en la FIG. 9. En la FIG. 9, L1 representa la fase acuosa después de la primera ronda de TPP a una saturación fija de sulfato de amonio al 20%; L2 representa la fase acuosa después de la segunda ronda de TPP a una saturación fija de sulfato de amonio al 35%; Int representa la interfase después de una segunda ronda de TPP.

La mayoría de los vectores AAV6 se recuperaron en la interfase en todos los valores de pH probado, pero el pH 6,5 mostró la mayor tasa de recuperación de AAV6 (FIG. 9, pH 6,5-Int). Se realizaron ensayos de proteínas para controlar la eliminación de proteínas celulares a diferentes valores pH. Los resultados indican que a medida que disminuyeron los valores de pH, se eliminaron más proteínas celulares. Se eliminaron más del 95% de proteínas celulares de las muestras de AAV6 cuando los lisados celulares se ajustaron a pH 4,5 (figura 9, pH 4,5-Int).

Ejemplo 10

Este ejemplo ilustra la visualización del proceso de purificación usando los métodos de TPP de las presentes enseñanzas.

El análisis de SDS-PAGE se realizó para controlar el proceso de purificación utilizando métodos de TPP a diferentes valores de pH. Los geles se tiñeron con el kit de tinción Simply Blue. Una imagen SDS-PAGE representativa se muestra en la FIG. 10. Los carriles son etiquetados del siguiente modo: carril M, escaleras de proteínas; carril 1, vector AAV9 purificado como control; carril 2, lisado celular; carriles 3 - 6, fases acuosas de la primera ronda de TPP a pH 7,5, 6,5, 5,5 y 4,5; carriles 7-10, fases acuosas de la segunda ronda de TPP a pH 7,5, 6,5, 5,5, y 4,5; carriles 11-14, interfases a pH 7,5, 6,5, 5,5 y 4,5 después de la segunda ronda de TPP; los carriles 15-18 contienen las mismas muestras que los carriles 11-14 pero con un 50% menos de muestra cargada en el gel. FIG. 10 ilustra que después de dos rondas de TPP, se eliminó la mayoría de las proteínas celulares y se observaron las proteínas de la cápside AAV2 VP1, VP2 y VP3 (véanse las fracciones 15, 16, 17 y 18, indicadas a la derecha).

Ejemplo 11

Este ejemplo ilustra una preparación a gran escala de vectores AAV5.

En estos experimentos, tres litros de cultivo de células Sf fueron doblemente infectados con rBV-inCap5-inRep y rBV-CMV-Luciferasa, luego cultivados y lisados como se describe supra. Los vectores AAV5 se purificaron de los lisados utilizando el método TPP de 2 rondas de las presentes enseñanzas. Los resultados se muestran en la FIG. 11. En la FIG. 11, L1 representa la fase acuosa después de la primera ronda de TPP a 20% de saturación de sulfato de amonio; L2 representa la fase acuosa después de la segunda ronda de TPP a una saturación del 35% de sulfato de amonio; Int, representa la interfase después de la segunda ronda de TPP; Int-sup representa el sobrenadante cosechado después de la centrifugación de Int a 10322 = g durante 20 min. Se recuperaron hasta 3,55e 15vg de vectores AAV5 (95%) de un cultivo celular de 3 litros después de la purificación de TPP.

Ejemplo 12

Este ejemplo ilustra una preparación a gran escala de vectores AAV2.

Tres litros de cultivo celular Sf9 están doblemente infectados con rBV-inCap2-inRep y rBV-CMV-Luciferasa y se cultivó y se lisó como se describió anteriormente. Los vectores AAV2 luego se purifican de los lisados utilizando dos rondas de TPP de acuerdo con los métodos de las enseñanzas actuales.

Ejemplo 13

Este ejemplo ilustra una preparación a gran escala de vectores AAV6.

Tres litros de cultivo celular Sf9 están doblemente infectados con rBV-inCap6-inRep y rBV-CMV-Luciferasa y cultivados y lisados como se describe en materiales y métodos. Los vectores AAV6 se purifican luego de los lisados usando dos rondas de TPP de acuerdo con con métodos de las presentes enseñanzas.

Ejemplo 14

Este ejemplo ilustra la purificación de partículas AAV2 usando TPP y cromatografía de columna.

Un lisado celular AAV2 se somete a una ronda de TPP. La fase acuosa L1 luego se purifica aún más con monedas de membrana MUSTANG® S y MUSTANG® Q (Pall Corporation, Port Washington, NY) según el protocolo del fabricante. Brevemente, las monedas MUSTANG® S y Q se tratan con 10 ml de NaOH 1 M seguido de 10 ml de NaCl 1 M y 10 ml de Tris-HCl 20 mM (pH 9,0). 5 ml de AAV purificado son entonces desalados usando columnas de desalación PD-10 y diluido 1:10 con Tris-HCl 20 mM (pH 9,0). Esta solución diluida se aplica luego a la moneda MUSTANG® S. El flujo a través es recogido y aplicado a una moneda MUSTANG® Q. Después de lavado con 1,5 ml de Tris-HCl 20 mM (pH 9,0), las partículas de AAV se eluyen con tampón de elución (Tris 20 mM HCl (pH 9,0), NaCl 300 mM), y se desalan con columnas de desalación PD-10. Los títulos son luego medidos con QPCR.

Ejemplo 15

Este ejemplo ilustra la purificación de partículas AAV6 usando TPP y cromatografía de columna. Un lisado de células AAV6 se somete a una ronda de TPP. La fase acuosa L1 es luego se purifica aún más con monedas de membrana MUSTANG® S y MUSTANG® Q (Pall Corporation, Port Washington, NY) según el protocolo del fabricante. Brevemente, las monedas MUSTANG® S y Q se tratan con 10 ml de NaOH 1 M seguido de 10 ml de NaCl 1 M y 10 ml de Tris-HCl 20 mM (pH 9,0). 5 ml de una muestra AAV6 de ronda purificada con TPP se desala con columnas de desalación PD-10 y se diluye 1:10 con Tris-HCl 20 mM (pH 9,0). Esta solución diluida se aplica luego a la moneda de MUSTANG® S. El flujo continuo se recoge y se aplica a la moneda MUSTANG® Q. Después lavando con 1,5 ml de Tris-HCl 20 mM (pH 9,0), las partículas de AAv se eluyen con tampón de elución (Tris-HCl 20 mM (pH 9,0), NaCl 300 mM) y se desalan con columnas desaladoras PD-10. Los títulos de AAV6 se miden luego con un ensayo QPCR.

Ejemplo 16

Este ejemplo ilustra una combinación de una ronda de TPP seguida de una centrifugación en gradiente de densidad para purificar partículas AAV2.

Un lisado de células AAV2 se somete a una primera ronda de TPP. La fase acuosa L1 se carga en la parte superior de un gradiente escalonado con 1,55 g/cc y 1,32 g/cc de soluciones de CsCl y centrifugado a 28.000 rpm durante la noche (~ 20 horas). Las partículas de a AV2 son recogidas con una jeringa, luego desaladas con columnas de desalación PD-10. Los títulos AAV2 se determinan entonces con un ensayo QPCR.

Ejemplo 17

Este ejemplo ilustra la purificación de AAV5 mediante una combinación de una ronda de TPP seguido de centrifugación en gradiente de densidad. Un lisado de células AAVS se somete a una primera ronda de TPP. La fase acuosa L1 se carga en la parte superior de un gradiente escalonado que comprende 1,55 g/cc y 1,32 g/cc de soluciones CsCl, y se centrifuga a 28.000 rpm durante la noche (~ 20 horas). Las partículas AAVS5 son recogidas con una jeringa y desaladas con columnas de desalación PD-10. Los títulos AAVS luego se determinan usando QPCR.

Ejemplo 18

Este ejemplo ilustra la purificación de partículas AAV6 mediante una combinación de una ronda de TPP seguida de centrifugación en gradiente de densidad.

Un lisado de células AAV6 se somete a una primera ronda de TPP. La fase acuosa L1 se carga en la parte superior de un gradiente escalonado con 1,55 g/cc y 1,32 g/cc de soluciones de CsCl y se centrifuga a 28.000 rpm durante la noche (~ 20 horas). Las partículas de AAV2 son recogidas con una jeringa, desaladas con columnas de desalación PD-10 y luego los títulos se determinan con QPCR.

Ejemplo 19

Este ejemplo ilustra la infectividad de partículas AAV2 purificadas por dos rondas de TPP de acuerdo con las enseñanzas actuales, y comparadas con dos rondas de centrifugación en gradiente de densidad.

En estos experimentos, se prepararon dos conjuntos de partículas AAV2 que albergan un gen indicador de luciferasa uno al lado del otro: un conjunto se purificó realizando dos rondas de centrifugación en gradiente de densidad con CsCl; el otro conjunto se purificó usando dos rondas de TPP como se describió anteriormente. Se usaron cantidades iguales de partículas AAV2 para transducir células HEK293 durante tres días según el protocolo de Virovek (Chen, H., Mol. Ther. Nucleic Acids, 2012, 1, e57), y luego se puntuaron las células emisoras de luz. Los resultados que se muestran en la Tabla 1 demuestran que las partículas AAV2 purificadas por TPP infectan al menos tan bien como los preparados por métodos estándar.

Ejemplo 20

Este ejemplo ilustra la infectividad de partículas AAV5 purificadas por dos rondas de TPP de acuerdo con las enseñanzas actuales, en comparación con dos rondas de centrifugación en gradiente de densidad.

En estos experimentos, dos conjuntos de partículas AAVS que albergan un gen indicador de luciferasa se prepararon uno al lado del otro: un conjunto se purificó realizando dos rondas de centrifugación en gradiente de densidad con CsCl; el otro conjunto se purificó usando dos rondas de TPP como se describió anteriormente. Se usaron cantidades iguales de partículas AAVs para transducir células HEK293 durante tres días según el protocolo de Virovek (Chen, H., Mol. Ther. Nucleic Acids, 2012, 1, e57), y luego se puntuaron las células emisoras de luz. Los resultados que se muestran en la tabla 1 demuestran que las partículas de AAV5 purificadas por TPP infectan al menos tan bien como las preparadas por métodos estándar.

Ejemplo 21

Este ejemplo ilustra la infectividad de partículas AAV6 purificadas por dos rondas de TPP de acuerdo con las enseñanzas actuales, en comparación con dos rondas de centrifugación en gradiente de densidad. En estos experimentos, dos conjuntos de partículas AAV6 que albergan un gen indicador de luciferasa se prepararon uno al lado del otro: un conjunto se purificó realizando dos rondas de centrifugación en gradiente de densidad con CsCl; el otro conjunto se purificó usando dos rondas de TPP como se describió anteriormente. Se usaron cantidades iguales de partículas AAV6 para transducir células HEK293 durante tres días según el protocolo de Virovek (Chen, H., Mol. Ther. Nucleic Acids, 2012, 1, e57), y luego se puntuaron las células emisoras de luz. Los resultados que se muestran en la Tabla 1 demuestran que las partículas de AAV6 purificadas por TPP infectan al menos tan bien como los preparados por métodos estándar.

Tabla 1. Comparación de la infectividad de los vectores AAV purificados por métodos CsCl o TPP.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para purificar un virus de un lisado celular infectado con virus, comprendiendo el método:

a) formar una primera mezcla que comprende i) una fase acuosa que comprende agua y un lisado celular que comprende un virus, ii) t-butanol y iii) sulfato de amonio a una primera concentración;

b) separar la primera mezcla para formar una primera fase orgánica, una primera interfase y una primera fase acuosa; y

c) recoger la primera fase acuosa, en la que el sulfato de amonio en una primera concentración es sulfato de amonio a una concentración a la cual el t-butanol es inmiscible con agua, en donde el virus es un virus adenoasociado (AAV).

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el virus adenoasociado se selecciona de grupo formado por AAV2, AAVS5 y AAV6.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la primera concentración de sulfato de amonio es de 10% a 30% de saturación.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la separación de la primera mezcla comprende la sedimentación de la primera mezcla durante al menos 30 minutos.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la separación de la primera mezcla comprende la centrifugación de la primera mezcla.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además:

d) formar una segunda mezcla que comprende i) la primera fase acuosa recogida en c), ii) t-butanol, y iii) sulfato de amonio a una segunda concentración en la que el t-butanol es inmiscible con agua;

e) separar la segunda mezcla para obtener una segunda capa orgánica, una segunda interfase, y una segunda capa acuosa; y

f) recoger la segunda interfase.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la segunda concentración de sulfato de amonio es de 25% a 40% de saturación.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además someter la primera fase acuosa recogida en c) a un procedimiento de purificación por cromatografía en columna seleccionada del grupo que consiste en cromatografía de afinidad de heparina, cromatografía de afinidad de heparina HPLC y cromatografía de intercambio catiónico por HPLC.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además someter la primera fase acuosa recogida en c) un procedimiento de purificación por cromatografía en columna seleccionada del grupo que consiste en un procedimiento de cromatografía de intercambio iónico, un procedimiento de cromatografía de filtración en gel y una combinación de los mismos.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el lisado celular que comprende un virus adenoasociado es un lisado de una célula de insecto que comprende un virus adenoasociado.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el lisado celular que comprende un virus adenoasociado es un lisado de una célula de mamífero que comprende un virus adenoasociado.

12. Una composición que comprende:

un lisado celular que comprende un virus;

sulfato de amonio; y

t-butanol;

en donde el virus es un virus adenoasociado y el sulfato de amonio está en un concentración en la que el t-butanol es inmiscible con agua.

13. Una composición de acuerdo con la reivindicación 12, en la que se selecciona el virus adenoasociado del grupo que consiste en un AAV2, un AAVS y un AAV6.

14. Una composición de acuerdo con la reivindicación 12, en la que el lisado celular que comprende un virus adeno asociado es un lisado celular de una célula de insecto Sf9 que comprende un virus adenoasociado seleccionado del grupo que consiste en un AAV2, un AAVS y un AAV6.

15. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, que comprende además someter la segunda capa acuosa recogida en e) un procedimiento de purificación en gradiente de densidad de cloruro de cesio.