ES2844578T3 - Timosina alfa 1 para su uso en el tratamiento de fibrosis quística - Google Patents

Abstract

Composición farmacéutica que comprende o que consiste en timosina alfa 1 para su uso en el tratamiento de fibrosis quística, en la que la timosina alfa 1 es un agente corrector de CFTR, potenciador de CFTR y antiinflamatorio.

Description

DESCRIPCIÓN

Timosina alfa 1 para su uso en el tratamiento de fibrosis quística

La presente invención se refiere a timosina alfa 1 para su uso en el tratamiento de fibrosis quística como un corrector de CFTR, potenciador de CFTR y agente antiinflamatorio.

La fibrosis quística (CF, OMIM 219700) es un trastorno genético potencialmente mortal que afecta principalmente a los pulmones y el sistema digestivo. Es un trastorno autosómico recesivo que limita la vida diaria que afecta a 70000 individuos en todo el mundo. Las perspectivas de los pacientes con la enfermedad han mejorado constantemente durante muchos años, en gran medida como resultado de un diagnóstico temprano, un tratamiento más agresivo y la prestación de cuidados en centros especializados (1). Los investigadores ahora tienen una comprensión más completa del defecto biológico a nivel molecular subyacente a CF, que está dando lugar a nuevas estrategias para el tratamiento.

La CF está causada por mutaciones en el gen que codifica el regulador de conductancia transmembranario de CF (CFTR) que regula la secreción de líquido superficial epitelial en el aparato respiratorio y gastrointestinal. El procesamiento celular de CFTR implica la traducción, plegamiento en el retículo endoplásmico, transporte al Golgi, modificaciones postraduccionales, dirección a la membrana plasmática apical y reciclado endosómico y recuperación. El CFTR de membrana plasmática se internaliza por endocitosis y después se recicla a la membrana plasmática o se dirige a degradación lisosómica (2, 3).

Se ha informado de casi 2000 variantes en la Cystic Fibrosis Mutation Database (4). Estas mutaciones se han agrupado en seis clases: los mutantes de clase I incluyen eliminaciones, desplazamientos del marco de lectura y mutaciones finalizadoras que provocan productos proteínicos de CFTR truncados prematuramente, los mutantes de clase II son defectuosos en el tráfico intracelular, los mutantes de clase III son proteínas de longitud completa con poca o ninguna actividad de canal de iones, los mutantes de clase IV producen CFTR con actividad de canal solo ligeramente reducida y las proteínas mutantes de clase V son funcionales, pero se expresan a niveles reducidos, mientras que los mutantes de clase VI se expresan a niveles de tipo silvestre, pero muestran estabilidad disminuida en la membrana plasmática (5). A pesar de esta gran cantidad de alelos de enfermedad de CFTR, la inmensa mayoría (>90 %) de los pacientes con CF originarios del Norte de Europa tienen al menos una copia de un solo alelo mutante, AF508, que codifica una molécula de CFTR que acere de una fenilalanina en la posición 508. La eliminación de fenilalanina en la posición 508 (AF508) en CFTR provoca un defecto de plegamiento sensible a la temperatura, retención de la proteína en el retículo endoplásmico y posteriormente se dirige al proteasoma para degradación térmica (6). El plegamiento de AF508-CFTR es ineficaz, con más de un 99 % de AF508-CFTR dirigido a degradación proteasómica antes de alcanzar el aparato de Golgi.

La alteración del destino intracelular de CFTR mal plegado por intervención del plegamiento de las proteínas, procesamiento y las rutas proteolíticas se ha mostrado prometedora para interrumpir la "patología posterior". La identificación de dianas específicas para corregir el plegamiento defectuoso de AF508-CFTR o el procesamiento celular (correctores) y la abertura de canales (potenciadores) proporciona una estrategia para el tratamiento de CF que corrija el defecto subyacente. Los correctores podrían actuar como "chaperonas farmacológicas" interactuando con el propio F508del-CFTR, facilitando su plegamiento y procesamiento celular o como "reguladores de la proteostasis" modulando la maquinaria de control de calidad celular para alterar el reconocimiento y procesamiento de AF508-CFTR (7). En contraste con los tratamientos actuales, tales como antibióticos, agentes antiinflamatorios, mucolíticos, solución salina hipertónica nebulizada y remplazo de enzimas pancreáticas, que tratan las manifestaciones de la enfermedad CF, los correctores y potenciadores corrigen el defecto subyacente del canal de aniones CFTR.

Hasta ahora, se han identificado numerosos potenciadores de CFTR y se ha verificado que son eficaces en estudios tanto in vitro como in vivo (8, 9), aunque las eficacias de la mayoría de los correctores han sido algo decepcionantes. En 2012, la FDA estadounidense aprobó Ivacaftor (VX-770, Kalydeco, Vertex Pharmaceuticals), un potenciador que puede aumentar el transporte de cloruro mediado por CFTR, para el tratamiento de pacientes con CF con la mutación G551D-CFTR, que causa solamente defecto de abertura (10). Kalydeco también se ha ensayado en pacientes que son homocigóticos para F508del-CFTR con poco beneficio clínico porque solamente una pequeña cantidad de F508del-CFTR se dirige a la membrana plasmática celular. Después de ello, se ensayó una politerapia de potenciador (la carboxamida de ciclopropano VX-809 (Lumacaftor, de Vertex Pharmaceuticals)/Ivacaftor (ORKAMBI) en pacientes con CF homocigóticos para F508del-CFTR CF. La combinación de fármacos mejoró la función pulmonar de un 3 a un 4 por ciento y redujo las exacerbaciones en un 35 % (11). Aunque el estudio confirmó que la politerapia breve de Ivacaftor/Lumacaftor podría potenciar la actividad de AF508-CFTR rescatada por Lumacaftor, también se ha informado de resultados desalentadores. En particular, algunos potenciadores de abertura (incluyendo Ivacaftor) podrían reducir la eficacia de corrección de Lumacaftor, probablemente debido a la desestabilización de AF508-CFTR corregido por Ivacaftor (12).

El efecto anulador de Ivacaftor en la eficacia de corrección de Lumacaftor sugiere la necesidad de mayor optimización de los potenciadores para maximizar el beneficio clínico de la politerapia de corrector-potenciador en CF.

Además, dado que AF508 no debe considerarse como un simple muíante de clase II, sino como un muíante mixto con las propiedades de las clases II, III, y V, esto sugiere que debe considerarse o diseñarse una estrategia terapéutica más compleja para corregir múltiples defectos del procesamiento de proteínas causados por la mutación AF508 individual (6).

Es más, no ha habido progreso significativo en la identificación de estrategias terapéuticas para invertir la enfermedad pulmonar desde las fases crónicas. Por tanto, sigue habiendo una cuestión no resuelta sobre si el rescate de la función del canal de cloruro es adecuado para invertir la patología inflamatoria de la enfermedad pulmonar crónica de CF (13).

De hecho, el defecto génico (o mutación) de CF que da lugar a una proteína CFTR que funciona mal tiene consecuencias tanto en células epiteliales como inflamatorias del pulmón, provocando flujo saliente de cloruro disminuido y respuesta inflamatoria aumentada (14).

Con respecto a la inflamación excesiva en las vías respiratorias con CF, que la respuesta hiperinflamatoria sea un resultado de la infección crónica o sea un resultado primario de la disfunción de CFTR aún es un asunto de debate (15) .

El transporte defectuoso de iones y líquidos debido a la mutación de CFTR provoca una eliminación inadecuada del moco y el material que atrapa en las vías respiratorias con CF. El material retenido provoca un ciclo de obstrucción de las vías respiratorias, inflamación e infección. Por consiguiente, la respuesta inmunitaria pulmonar en CF se caracteriza por una activación temprana y que no se resuelve del sistema inmunitario innato, que está desregulado a varios niveles (16) , que no provoca eliminación bacteriana y fúngica potenciada (17) y desempeña una función central en la patogenia de la enfermedad pulmonar en CF (18). La erradicación alterada de bacterias en las etapas iniciales de la vida induce una respuesta inflamatoria predominantemente neutrófila que lesiona los pulmones y promueve el remodelado de las vías respiratorias y la obstrucción de las vías respiratorias. La notable persistencia de infecciones pulmonares crónicas de CF a pesar del tratamiento antibiótico intensivo (19) ha inspirado algunas estrategias innovadoras dentro de las que la dilucidación de la respuesta inflamatoria inicial de las vías respiratorias en enfermedad pulmonar de CF ha llegado a ser un área de prioridad de la investigación de transferencia (20). Las evidencias indican que abordar rutas inflamatorias/antiinflamatorias específicas puede representar una estrategia terapéutica válida en CF experimental (21,22).

Solamente un fármaco antiinflamatorio (el agente no esteroideo ibuprofeno) ha demostrado hasta ahora eficacia con una mejora en la tasa de deterioro en FEV1 durante un periodo de 2 años y un perfil de riesgo favorable; se recomienda, por lo tanto, como tratamiento beneficioso para pacientes de 7 a 18 años de edad (23).

El desarrollo de tratamientos antiinflamatorios en CF ha sido problemático porque su mecanismo de acción puede ser prevenir el deterioro clínico a largo plazo en lugar de lograr cambios breves en medidas de evolución clínica más normalmente usadas, tal como la función pulmonar o frecuencia de exacerbaciones pulmonares. A pesar de estos problemas, varios tratamientos actualmente han pasado al estado de fase 2. Tres ejemplos incluyen N-acetilcisteína, ácido docosahexaenoico y sildenafilo. La N-acetilcisteína es una medicación antioxidante oral que ha demostrado en un ensayo en fase 2 influir en las medidas inflamatorias en pacientes con CF y la inflamación basal, un efecto que hipotéticamente se produce abordando un desequilibrio de oxidorreducción en neutrófilos (24). Un ensayo clínico en fase 2b reciente de N-acetilcisteína demostró un efecto sobre la función pulmonar, pero el efecto sobre la inflamación no se reprodujo (24). Asimismo, el ácido docosahexaenoico es un ácido graso omega-3 que demostró actividad antiinflamatoria en un ensayo clínico corto en 2003 y ha completado un ensayo en fase 2 en niños; los resultados son inminentes. Actualmente un ensayo en fase 2 de sildenafilo está evaluando el efecto sobre este inhibidor oral de fosfodiesterasa sobre marcadores de inflamación de las vías respiratorias (25).

En vista de lo anterior, por lo tanto, es evidente la necesidad de proporcionar nuevos tratamientos para fibrosis quística (CF) que puedan superar las desventajas de los tratamientos conocidos, incluyendo los fármacos antiinflamatorios potentes, los corticoesteroides, que está provistos de efectos secundarios importantes, especialmente supresión del crecimiento y la glándula suprarrenal en niños (26).

El consenso general en la terapéutica de CF es que los tratamientos futuros estarán dirigidos a prevenir, en lugar de mejorar, el daño orgánico existente, incluyendo la inflamación patógena, antes de que los pacientes lleguen a ser sintomáticos.

Está claro que un tratamiento farmacológico ideal para CF debe poder no solamente rescatar la proteína CFTR de membrana, sino también aliviar la respuesta hiperinflamatoria y atenuar potencialmente la progresión de la enfermedad pulmonar crónica de CF. La identificación de compuestos individuales con actividades dobles de corrector y potenciador, así como actividad antiinflamatoria, sería muy deseable en el campo.

La timosina alfa 1 (Ta1) es un polipéptido de origen natural de 28 aminoácidos descrito y caracterizado por primera vez por Goldstein et al. en 1972 (27). Ta1 es bien conocida en el campo médico por sus propiedades inmunorreguladoras en varios ensayos in vitro e in vivo (27).

El uso previo de Tal ya es conocido. El péptido se ha usado en todo el mundo como adyuvante o agente inmunoterápico para tratar enfermedades humanas dispares, incluyendo infecciones víricas, inmunodeficiencias y neoplasias (28, 29). El péptido puede potenciar las respuestas de linfocitos T, células dendríticas y anticuerpos, modula la producción de citocinas y quimiocinas y bloquea la apoptosis inducida por esteroides de los timocitos. Sus funciones centrales en la modulación de la función de las células dendríticas y la activación de múltiples rutas de señalización que contribuyen de manera diferencial en diferentes funciones, pueden ofrecer una explicación plausible de su acción pleiotrópica. Además, la capacidad de activar la enzima indolamina 2,3-dioxigenasa, que confiere tolerancia inmunitaria durante trasplantes y que frena el ciclo vicioso que perpetúa la inflamación crónica, ha sido un punto de inflexión, lo que sugiere una posible función específica en la inmunidad (30). Por consiguiente, Ta1 ha demostrado recientemente que promueve la reconstitución inmunitaria y mejora la supervivencia de los destinatarios de trasplantes de células madre hermanas con reducción de linfocitos T de HLA coincidente en un ensayo clínico en fase I/II (31).

Stevens et al. (Allergic bronchopulmonary aspergillosis in cystic fibrosis-state of the art: Cystic Fibrosis Foundation Consensus Conference; Clin Infect Dis.; 1 oct 2003; 37 Supl. 3; páginas S225-64) divulga el tratamiento de infecciones con Aspergillus en un paciente con CF.

Aaron et al. (Treatment of Aspergillus fumigatus in patients with cystic fibrosis: a randomized, placebo-controlled pilot study; PLoS One; 2012; Vol. 7(4): e36077, doi: 10.1371/journal.pone.0036077. Publicación electrónica de 30 abril de 2012) no identificó beneficio clínico del tratamiento con itraconazol para pacientes con CF cuyo esputo estaba colonizado de manera crónica con A. fumigatus. Las limitaciones de este estudio piloto fueron su pequeño tamaño de muestra y el fracaso en conseguir niveles terapéuticos de itraconazol en muchos pacientes.

El documento WO2004/087067 A2 (14 de octubre de 2004) analiza un método para tratar a un ser humano infectado con Aspergillus usando timosina alfa 1 como inmunoestimulador en la activación de células dendríticas.

Goldstein et al. (From lab to bedside: emerging clinical applications of thymosin alpha 1; Expert Opin Biol Ther.; mayo 2009; Vol. 9(5): páginas 593-608, doi: 10.1517/14712590902911412) informa de que ensayos clínicos con Talfa(1) señalan a aplicaciones en varias enfermedades y trastornos, incluyendo choque séptico, síndrome de dificultad respiratoria aguda, peritonitis, infección aguda por citomegalovirus, TB, síndrome respiratorio agudo grave e infecciones pulmonares en pacientes críticos.

De acuerdo con la presente invención, se ha descubierto que Ta1 tiene eficacia antiinflamatoria en pacientes con CF. De hecho, Ta1 pudo rectificar el procesamiento incorrecto del mutante AF508-CFTR con defectos de tráfico/estabilidad; para restablecer la actividad del canal de cloruro y para redirigir el equilibrio inflamatorio/antiinflamatorio en CF murina por medio de la inhibición de la producción de citocinas inflamatorias (IL1p y IL1 a), aumentando la producción de la citocina de bloqueo inflamatorio IL-1RA, promoviendo el eje tolerogénico de Th1/Treg protector, mientras se frena el eje inflamatorio de Th17/Th2 implicado en la inflamación pulmonar de CF. Conjuntamente, los resultados sugieren que la corrección de Ta1 podría alcanzar niveles que afecten a la función epitelial de las vías respiratorias y, por lo tanto, puede ser clínicamente significativa. Esto, además de su actividad antiinflamatoria inherente, hace de Ta1 el candidato ideal en el tratamiento de CF.

La presente invención, por lo tanto, proporciona una composición farmacéutica que comprende o que consiste en timosina alfa 1 para su uso en el tratamiento de fibrosis quística, en la que la timosina alfa 1 es un corrector de CFTR, potenciador de CFTR y agente antiinflamatorio en pacientes afectados por fibrosis quística. En una realización, la presente invención se refiere también a una combinación de la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la invención con al menos un agente elegido del grupo que consiste en agente antibiótico, antifúngico, corrector de CFTR, potenciador de CFTR, siendo dicho corrector o potenciador de CFTR distinto de timosina alfa 1, para uso separado o secuencial en el tratamiento de fibrosis quística.

De acuerdo con la combinación de la presente invención, el agente antibiótico puede elegirse, por ejemplo, del grupo que consiste en tobramicina, ciprofloxacina, colistina; el agente antifúngico puede elegirse, por ejemplo, del grupo que consiste en itraconazol, anfotericina B; finalmente, el agente corrector o potenciador de CFTR distinto de timosina alfa 1 puede elegirse, por ejemplo, del grupo que consiste en Ivafactor, Lumacaftor.

La composición farmacéutica para el uso de la presente invención puede comprender o consistir en timosina alfa 1, como principio activo, junto con uno o más excipientes y/o coadyuvantes.

La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la presente invención puede comprender además al menos un agente elegido del grupo que consiste en agente antibiótico, antifúngico, corrector de CFTR, potenciador de CFTR, siendo dicho corrector o potenciador de CFTR distinto de timosina alfa 1.

Como se menciona anteriormente, el agente antibiótico puede elegirse, por ejemplo, del grupo que consiste en tobramicina, ciprofloxacina, colistina; el agente antifúngico puede elegirse, por ejemplo, del grupo que consiste en itraconazol, anfotericina B; finalmente, el agente corrector o potenciador de CFTR distinto de timosina alfa 1 puede elegirse, por ejemplo, del grupo que consiste en Ivafactor, Lumacaftor.

Como se describe anteriormente, la timosina alfa 1 muestra eficacia antiinflamatoria en pacientes afectados por fibrosis quística.

La presente invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende o que consiste en timosina alfa 1 para su uso en el tratamiento y/o en la prevención de la inflamación en pacientes afectados por fibrosis quística, en la que la timosina alfa 1 es un agente corrector de CFTR, potenciador de CFTR y antiinflamatorio.

En una realización, la presente invención se refiere también a una combinación de la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la invención con al menos un agente elegido del grupo que consiste en agente antibiótico, antifúngico, corrector de CFTR, potenciador de CFTR, siendo dicho corrector o potenciador de CFTR distinto de timosina alfa 1, para uso separado o secuencial en el tratamiento y/o en la prevención de la inflamación en pacientes afectados por fibrosis quística.

De acuerdo con la combinación de la presente invención, el agente antibiótico puede elegirse, por ejemplo, del grupo que consiste en tobramicina, ciprofloxacina, colistina; el agente antifúngico puede elegirse, por ejemplo, del grupo que consiste en itraconazol, anfotericina B; finalmente, el agente corrector o potenciador de CFTR distinto de timosina alfa 1 puede elegirse, por ejemplo, del grupo que consiste en Ivafactor, Lumacaftor.

En una realización, la composición farmacéutica para el uso use de la presente invención puede comprender o consistir en timosina alfa 1, como principio activo, junto con uno o más excipientes y/o coadyuvantes para su uso en el tratamiento y/o en la prevención de la inflamación en pacientes afectados por fibrosis quística.

La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la presente invención puede comprender además al menos un agente elegido del grupo que consiste en agente antibiótico, antifúngico, corrector de CFTR, potenciador de CFTR, siendo dicho corrector o potenciador de CFTR distinto de timosina alfa 1.

Como se menciona anteriormente, el agente antibiótico puede elegirse, por ejemplo, del grupo que consiste en tobramicina, ciprofloxacina, colistina; el agente antifúngico puede elegirse, por ejemplo, del grupo que consiste en itraconazol, anfotericina B; finalmente, el agente corrector o potenciador de CFTR distinto de timosina alfa 1 puede elegirse, por ejemplo, del grupo que consiste en Ivafactor, Lumacaftor.

En el uso de acuerdo con la invención, los términos "tratar" o "tratamiento" albergan su significado habitual que incluye prevenir, impedir, aliviar, inhibir, mejorar, detener, frenar, ralentizar o invertir la progresión, activación o reducción de la gravedad de la fibrosis quística o inflamación crónica en pacientes afectados por fibrosis quística.

De acuerdo con la presente invención se entiende que "uso separado" significa la administración, al mismo tiempo, de los dos o más compuestos de la combinación de acuerdo con la invención en distintas formas farmacéuticas. Se entiende que "uso secuencial" significa la administración sucesiva de los dos o más compuestos de la composición para su uso de acuerdo con la invención, cada uno en una forma farmacéutica distinta.

Una cantidad eficaz de Ta1 que se administra en un esfuerzo por tratar una reacción inflamatoria es esa cantidad que se requiere para prevenir, impedir, aliviar, mejorar, detener, frenar, ralentizar o invertir la progresión, o reducir la gravedad de dicha reacción inflamatoria, y la dosis diaria a administrar dependerá, de acuerdo con el criterio del médico de atención primaria, del peso del sujeto, su edad y estado general del paciente.

Ta1 puede administrarse en forma de una composición farmacéutica en combinación con vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables, cuya proporción y naturaleza se determinan por la solubilidad y propiedades químicas del compuesto en los vehículos y/o excipientes seleccionados, la vía elegida de administración, y la práctica farmacéutica convencional.

El vehículo o excipiente puede ser un material sólido, semisólido o líquido, que puede servir como vehículo o medio para el ingrediente activo. Los vehículos o excipientes adecuados son bien conocidos en la técnica. La composición farmacéutica puede adaptarse para uso oral, por inhalación, parenteral o tópico y puede administrarse al paciente en forma de comprimidos, cápsulas, aerosoles, inhalantes, supositorios, solución, suspensiones, liposoma o similares.

La presente invención se describirá ahora de manera ilustrativa, pero no limitativa, de acuerdo con realizaciones preferidas de la misma, con referencia particular a dibujos adjuntos, en los que:

La figura 1 muestra un modelo de fisiopatología de enfermedad pulmonar de CF. De acuerdo con este modelo, el trasporte defectuoso de iones y líquidos debido a mutación de CFTR provoca una eliminación inadecuada de moco y el material que atrapa en las vías respiratorias con CF. El material retenido provoca un ciclo de obstrucción, inflamación e infección de las vías respiratorias. CFTR, regulador de conductancia transmembranario de fibrosis quística.

La figura 2 muestra una inmunotransferencia representativa de la proteína celular total de células de control (HBE WT) y AF508 (HBE AF508) tratadas con Ta1 (A); Ta1 aumentó la expresión de AF508 CFTR en PM (B); la medición densitométrica del CFTR (banda C) en PM se expresó como la relación total de CFTR PM/CFTR (C); Tal aumentó la expresión de CFTR (banda C) en 3 (paciente n.° 1,2 y 5) de 5 pacientes (D).

La figura 3 muestra que Ta1 aumentaba la permeabilidad al cloruro de células AF508 CFTR hasta aproximadamente un 70 % con respecto al control (considerando el control WT como el valor de referencia del 100 %) en células CFBE41o-(A) y células HBE de pacientes con CF (B).

La figura 4 muestra que Ta1 aumentaba notablemente la expresión de TMEM16A en células de control y CF después de 4 horas de exposición. Sin embargo, aunque la expresión de TMEM16A volvía a los niveles basales en células de control a las 24 horas, sigue elevado en células CF (A).

La figura 5 muestra que Ta1 aumentaba la expresión de la forma madura (indicada por C) con respecto a la forma inmadura (indicada por B) de CFTR en células transfectadas con AF508 (A, inmunotransferencia representativa de proteína celular total. Las bandas de CFTR se cuantificaron por densitometría y se expresaron como la relación de C/B). Las flechas indican las posiciones de las formas B y C de CFTR basadas en la movilidad relativa. Ta1, en solitario o en combinación con Ivacaftor, aumentó la permeabilidad a cloruro de células AF508 CFTR entre un 60 y un 70 % con respecto al control (considerando el control WT como el valor de referencia del 100 %) (B, evaluado por un ensayo de fluorescencia tras estimulación con forskolina, Fsk). En comparación con Lumacaftor, la actividad de Ta1 fue menor en células CFBE41o- que expresaban AF508 CFTR (B), pero similar en células HBE de pacientes con CF (C). Combinada con Lumacaftor, Ta1 no aumentó la actividad de Lumacaftor (B y C).

La figura 6 muestras que ratones con CF son susceptibles a patología inflamatoria en infección. Se observó una respuesta inflamatoria mantenida y persistente, caracterizada por reclutamiento de neutrófilos (PMN) y eosinófilos (EOS) en BAL (A) y pulmón (B y C), en ratones CftR- en que ya era visible un grado de inflamación antes de la infección (C, histología pulmonar (ácido peryódico-Schiff y, en la inserción, tinción de Gomori) en diferente dpi). El recuento celular diferencial de monomorfonucleares (MNC), células PMN y EOS se determinó tras tinción de May Grunwald Giemsa en diferentes días después de infección (dpi). Los valores representan la media ETM de tres ratones por grupo y son representativos de 3 experimentos. Se tomaron fotografías con un microscopio de alta resolución Olympus DP71 usando un objetivo x20. Barra de escala 200 pm. (C) Los números de células Gr1+ positivas se evaluaron por citometría de flujo sobre las células pulmonares totales en diferentes dpi. *P <0,05.

La figura 7 muestra que Ta1 protege a los ratones con CF de la patología inflamatoria. Ta1, pero no el péptido mezclado, disminuyó significativamente el reclutamiento de células inflamatorias locales y la patología pulmonar tanto en ratones C57/BL6 e, incluso más, ratones Cftr-/-, como se indica por el reclutamiento disminuido de células inflamatorias (principalmente PMN, véanse las inserciones) en el pulmón (A), así como en BAL (B). (A) Histología pulmonar (ácido peryódico-Schiff y, en la inserción, reclutamiento celular). Se tomaron fotografías con un microscopio de alta resolución Olympus DP71 usando un objetivo x20. Barra de escala 200 pm. (B) Morfometría de BAL a los7 días después de infección (dpi). El recuento celular diferencial de monomorfonucleares (MNC), células polimorfonucleares (PMN) y eosinófilos (EOS) se determinó tras tinción de May Grunwald Giemsa. Los valores representan la media ± ETM de tres ratones por grupo y son representativos de 3 experimentos. *P <0,05; **P <0,01; ***P <0,001.

La figura 8 muestra que Ta1 regula por disminución las citocinas inflamatorias en ratones con CF con aspergilosis. Los niveles de IL-1 p, IL-1 a e IL-1RA en BAL se midieron por ELISA (pg/ml) a los 7 días después de infección. Los resultados mostrados representan datos combinados de dos experimentos. *P <0,05; **P <0,01; ***P < 0,001.

La figura 9 muestra que Ta1 regula el equilibrio de células Th en ratones con CF con aspergilosis. Ta1 disminuyó la activación de células Th17 (niveles disminuidos de IL-17A y del factor de transcripción Rorc de Th17), Th2 (lL-4 y Gata3 bajos) mientras se promueve la actividad celular tanto de Th1 (IFN-y y Tbet aumentados) como de Treg (IL-10 y Foxp3 aumentados). Los resultados mostrados representan datos combinados de dos experimentos. n.d. no realizado. *P <0,05; **P <0,01; ***P <0,001.

Ejemplo 1: Estudio que se refiere al efecto de timosina a 1 como agente corrector y protector de CFTR y antiinflamatorio en fibrosis quística

Materiales y métodos

Células. Las líneas celulares y células epiteliales bronquiales humanas (HBE) en cultivo celular, homocigóticas para la mutación 5F508 y su tipo silvestre isogénico obtuvieron de trasplantes pulmonares (pacientes con CF) o resecciones pulmonares (pacientes sin CF) (proporcionados amablemente por LJ Galietta de la Fundación Italiana de Fibrosis Quística). Las células se mantuvieron a 37 °C en una estufa de incubación humidificada en una atmósfera que contenía CO2 al 5 %, y los experimentos se hicieron 5 días después de la siembra (21, 22). La transducción estable basada en lentivirus de las células CFBE41o- precursoras (AF508/AF508), originalmente inmortalizadas y caracterizadas por Dr. D. Gruenert y colaboradores (32) con WT-CFTR o AF508-CFTR, se realizó por Tranzyme, Inc. (Birmingham, AL). Las células CFBE41o- transducidas se mantuvieron en medio de Eagle mínimo complementado con 50 unidades/ml de penicilina, 50 pg/ml de estreptomicina, L-glutamina 2 mM, suero bovino fetal al 10 % y 1 pg/ml de blasticidina (WTCFTR) o 2 pg/ml de puromicina (AF508-CFTR) en una estufa de incubación con CO2 al 5 %, aire al 95 % a 37 °C. Las células CFBE41o- precursoras se mantuvieron en las mismas condiciones de cultivo, pero con blasticidina o puromicina. Para establecer monocapas polarizadas, se sembraron células CFBE41o- en soportes permeables Transwell de 24-mm de diámetro (0,4 mm de tamaño de poro; Corning Corp., Corning, NY) a 2 x 106 y se hicieron crecer en cultivo de contacto entre aire-líquido a 37 °C durante 6-9 días y después a 27 °C durante 36 horas. Las células se incubaron con Ta1 a 100 ng/ml (CRIBI Biotechnology, Padova, véase a continuación), VX-809 3 pM (Lumacaftor, Aurogene Rome, Italia), VX-770 1 pM (Ivacaftor, Aurogene) en solitario o en combinación durante 24 horas antes de la evaluación de la expresión y función de la proteína CFTR. Se usó vehículo DMSO en solitario (0,1 %, v/v) durante 24 h como control.

Ratones. Se adquirieron ratones C57BL6 endogámicos de tipo silvestre (WT), de 8 a 12 semanas de edad, de Charles River Breeding Laboratories (Calco, Italia). Se criaron ratones Cftr/' homocigóticos genomanipulados (33) en la instalación central de animales de Fibrosis Quística en San Raffaele Hospital, Milán, Italia. Los experimentos se realizaron siguiendo protocolos aprobados por el comité institucional de animales y de acuerdo con la Directiva Comunitaria de la Comunidad Económica Europea, así como las directrices institucionales sobre cuidados y uso de animales.

Infección y tratamientos. Los ratones se anestesiaron por inyección i.p. de avertina al 2,5 % (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) antes de instilación intranasal de 2 x 107 conidios quiescentes de A. fumigatus (Af293)/20 pl de solución salina. Para la histología, se tiñó tejido incluido en parafina con ácido peryódico-Schiff (PAS), y la recogida de líquido de BAL se hizo como se describe (21, 22). Los tratamientos fueron los siguientes: Ta1 y el polipéptido mezclado se suministraron como polipéptido purificado (los niveles de endotoxina fueron <0,03 pg/ml, por un ensayo de lisado de Limulus convencional) estéril, liofilizado, acetilado. Las secuencias fueron las siguientes: Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-O (Ta1) (SEQ ID NO:1) y Ac-Ala-Lys-Ser-Asp-Val-Lys-Ala-Glu-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Asp-Thr-Thr-Glu-Leu-Asp-Glu-Lys-Val-Glu-Val-Lys-Ala-Asn-Glu-OH (péptido mezclado) (SEQ ID NO:2). Los polvos liofilizados se reconstituyeron en agua estéril y se administraron 200 pg/kg/i.p. al día durante 6 días consecutivos empezando el día de la infección.

Citometría de flujo. La tinción para la expresión de antígenos celulares se hizo como se describe (21,22). Las células se analizan con un citofluorímetro de flujo FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA) equipado con el programa informático CELLQuestTM. Antes del marcaje, se realizó bloqueo de FcR. Se usa tinción de control de las células con anticuerpos irrelevantes para obtener valores de fluorescencia de fondo. Los datos se expresan como un porcentaje de células positivas sobre las células totales analizadas.

Análisis de inmunotransferencia de CFTR. Se usaron técnicas de inmunotransferencia que usan el anticuerpo anti-CFTR (clon CF3, Abcam) para medir la maduración de CFTR en células FRT, HEK-293 o HBE que expresan CFTR o F508del-CFTR(34). Después de incubación, las células se recogieron en solución de D-PBS helada (sin calcio y magnesio) y se sedimentaron a 1000 x g a 4 °C. Los sedimentos celulares se lisaron en Nonidet P-40 al 1 %, desoxicolato de sodio al 0,5 %, NaCl 200 mM, Tris 10 mM, pH 7,8 y EDTA 1 mM más mezcla inhibidora de proteasa (1:250; Roche) durante 30 min en hielo. Los lisados se centrifugaron durante 10 min a 10000 x g a 4 °C para sedimentar los núcleos y el material insoluble. Se calentaron aproximadamente 12 pg de proteína total en tampón de Laemmli con p-mercaptoetanol al 5 % a 37 °C durante 5 min y se cargaron en un gel de Tris-acetato del 3 % al 8 % (Invitrogen). El gel se transfirió a nitrocelulosa y se procesó para transferencia de Western usando anticuerpo monoclonal contra CFTR o policlonal contra p-actina (Santa Cruz Biotechnology). Las transferencias se revelaron por quimioluminiscencia potenciada. El sustrato de quimioluminiscencia LiteAblotPlus (Euroclone S.p.A.), usando el sistema de imágenes ChemiDocTM XRS+ (Bio-Rad Laboratories) y la cuantificación de transferencia se obtuvo por análisis de imágenes de densitometría usando el programa informático Image Lab 3.1.1 (Bio-Rad).

Activación de CFTR. Como el canal CFTR es permeable al yoduro, es posible determinar el flujo saliente de este ion desde células cargadas previamente por un ensayo colorimétrico usando la sonda fluorescente SPQ (6-metoxi-N-(3-sulfopropil)quinolinio) (35).

Reacción en cadena de la polimerasa con retrotranscripción (RT-PCR). La extracción y síntesis del ARN total y la PCR del ADNc se hicieron en células de pulmón total como se describe (21,22). Las eficacias de amplificación se validaron y normalizaron frente a Gapdh. El perfil térmico para PCR ultrarrápida con SYBR Green fue a 95 °C durante 3 min, seguido de 40 ciclos de desnaturalización durante 30 s a 95 °C y una etapa de hibridación/prolongación de 30 s a 60 °C. Cada dato puntual se examinó para la integridad por análisis del diagrama de amplificación. Los datos normalizados al ARNm se expresaron como ARNm relativo en células tratadas en comparación con el de las células no estimuladas.

Determinación de citocinas por ELISA. Se determinaron los niveles de citocinas en homogeneizados pulmonares de ratones tratados y no tratados por ELISA específico de citocinas (R&D Systems, Inc. Space Import-Export srl, Milán, Italia) como se describe (21,22).

Análisis estadísticos. Se usó ensayo de la t de Student para determinar la significación de los valores en muestras experimentales (la significación se definió como P <0,05). Los datos de supervivencia se analizaron usando el ensayo de la U de Mann-Whitney. Los grupos in vivo consistían en 6 animales. Salvo que se indique de otro modo, los datos son la media ± ET. Los datos se analizaron por el programa GraphPad Prism 4.03 (GraphPad Software).

Resultados

Ta1 actúa como corrector aumentando la expresión en superficie celular de AF508-CFTR en células CF

Se usó la línea celular epitelial de las vías respiratorias con CF transformada con SV40 (CFBE41o-), homocigótica para la mutación AF508-CFTR (32). Se trataron células CFBE41o- que expresan de forma estable AF508 CFTR o WT CFTR con 100 ng/ml de Ta1 durante 30 min a 24 horas. La figura 2 muestra una inmunotransferencia representativa de proteína celular total de células de control (HBE WT) y AF508 (HBE AF508) tratadas con Ta1 (panel A, figura 2). Se usaron técnicas de inmunotransferencia para medir la salida de AF508-CFTR del retículo endoplásmico y el peso a través del Golgi, que se caracteriza por un aumento en el peso molecular de CFTR (a partir de una banda de 135­ 140 kDa hasta una banda de 170-180 kDa) como resultado de glucosilación. Después de procesarse CFTR por el Golgi, se suministra la forma de CFTR madura, con glucosilación compleja a la superficie celular. Ta1 aumentó de manera persistente la expresión celular de CFTR maduro AF508 (indicado por C), desde tan pronto como 30 min después de la exposición hasta 24 horas después, en oposición a WT CFTR. Las bandas de CFTR se cuantificaron por densitometría y se expresaron como la relación de C/B. En la figura 2, las flechas indican las posiciones de las formas C (madura) y B (inmadura) de CFTR basadas en la movilidad relativa. Para demostrar que la expresión aumentada de AF508 CFTR se correlacionaba con su tráfico y estabilidad aumentados en la membrana plasmática (PM), se purificaron las proteínas de PM de los componentes citosólicos de células tratadas con Ta1 como anteriormente. Las fracciones se inmunotransfirieron con anticuerpo anti-CFTR y se usó FLOT1 (clon C-2 Santa Cruz Biotechnology) para confirmar la localización específica de proteína de superficie celular. Los resultados muestran que Ta1 aumentaba la expresión de AF508 CFTR en PM (panel B, figura 2). La medición densitométrica del CFTR (banda C) en la PM se expresó como la relación de CFTR PM/CFTR total (panel C, figura 2). Para evaluar si Ta1 también aumentaba la expresión de CFTR en pacientes con CF, se trataron células broncoalveolares (HBE, BE humano) de 5 pacientes con CF con 100 ng/ml de Ta1 durante 24 horas y se evaluaron para la expresión de la proteína CFTR. Los resultados muestran que Ta1 aumentaba la expresión de CFTR (banda C) en 3 (paciente n.° 1,2 y 5) de 5 pacientes (panel D, figura 2). Estos resultados indican que Ta1 aumenta la maduración de AF508 CFTR provocando una densidad en superficie celular y estabilidad aumentadas y clasifican Ta1 como corrector.

Ta1 actúa como potenciador aumentando la actividad funcional de AF508-CFTR en células CF

Los potenciadores están destinados a restablecer la actividad de canal de cloruro dependiente de AMPc de CFTR mutante en la superficie celular. Se cree que el restablecimiento incluso de menos de un 30 % de la función de CFTR in vivo (entre un 5 y un 30 %) confiere un beneficio clínico al menos parcial a pacientes con CF mejorando la función pulmonar (36). Para evaluar la actividad del canal de Cl- de Ta1, se trataron células CFBE41o- y células HBE de pacientes con CF con 100 ng/ml de Ta1 durante 24 horas y se evaluaron para el transporte de cloruro mediante el uso de las sondas fluorescentes sensibles a haluro (6-metoxi-N-(-sulfopropil)quinolinio (SPQ)) tras estimulación con forskolina para activar CFTR a través de la ruta de AMPc/PKA (35). Los resultados muestran que Ta1 aumentaba la permeabilidad a cloruro de células AF508 CFTR hasta aproximadamente un 70 % con respecto al control (consideran el control WT como el valor de referencia del 100 %) en células CFBE41o- (panel A, figura 3) y células HBE de pacientes con CF (panel B, figura 3). Por tanto, Ta1 aumentaba significativamente la permeabilidad a cloruro mediada por CFTR en asociación con niveles aumentados de CFTR asociado a membrana.

Ta1 induce la expresión del canal alternativo de iones TMEM16A

La corrección farmacológica del defecto del transporte de iones abordando CFTR mutante, o canales alternativos de iones que puedan compensar la disfunción de CFTR, se ha considerado desde hace tiempo una estrategia atractiva a un tratamiento causal de CF (37). TMEM16A, un canal de Cl- activado por Ca2+, está asociado con la corriente de cloruro dependiente de calcio (38) y, aunque distinto de CFTR, muestra interacción funcional y molecular con CFTR (39). La activación de TMEM16A con agentes farmacológicos podría esquivar el defecto principal en CF, independientemente del genotipo de CFTR (40). El análisis de micromatrices de ADN ha indicado que la expresión de TMEM16A se aumentaba enormemente en ratones con aspergilosis pulmonar tras tratamiento con Ta1 (resultados no publicados). Basándose en estos hallazgos, se ha evaluado si la expresión de TMEM16A se inducía por Ta1 en células HBE de pacientes de control o con CF. Para este propósito las células se han expuesto a 100 ng/ml de Ta1 hasta 24 horas y se evaluó la expresión del ARNm de TMEM16A por RT-PCR sobre el ARN total de las células. Los resultados muestran que Ta1 aumentaba notablemente la expresión de TMEM16A en células de control y CF después de 4 horas de exposición. Sin embargo, aunque la expresión de TMEM16Avolvía a los niveles basales en células de control a las 24 horas, siguen elevados en células CF (figura 4A). Estos resultados sugieren que Ta1, mediante inducción de la expresión del canal alternativo de Cl- TMEM16A, podría mejorar adicionalmente la actividad de canal de iones en CF.

Ta1, en solitario o en combinación con el potenciador Ivacaftor, restablece la actividad de AF508 CFTR a un grado similar que el corrector Lumacaftor

La actividad de T a l, en solitario o en combinación con Ivacaftor, se ha evaluado comparativamente con la de Lumacaftor en células CFBE41o- que expresan AF508 CFTR y en células HBE de pacientes con CF. Para este propósito, las células se trataron con Tal (100 ng/ml), VX-770 (1 pM) o VX-809 (3 pM) en solitario o en combinación durante 24 horas y se evaluaron para la expresión y función de la proteína CFTR. Los resultados muestran que, similar a Lumacaftor, Ta1 aumentaba la expresión de la forma madura (indicada por C) con respecto a la forma inmadura (indicada por B) de CFTR en células transfectadas con AF508 (A, inmunotransferencia representativa de proteína celular total (figura 5). Las bandas de CFTR se cuantificaron por densitometría y se expresaron como la relación de C/B). Las flechas en la figura 5 indican las posiciones de las formas B y C de CFTR basadas en la movilidad relativa). Ivacaftor no aumentó la expresión de CFTR, pero la combinación de Ta1/Ivacaftor sí. En términos de actividad de canal de iones, Ta1, en solitario o en combinación con Ivacaftor, aumentó la permeabilidad a cloruro de células AF508 CFTR entre un 60 y un 70 % con respecto al control (consideran el control WT como el valor de referencia del 100 %) (B, evaluado por un ensayo de fluorescencia tras estimulación con forskolina, Fsk). En comparación con Lumacaftor, la actividad de Ta1 fue menor en células CFBE41o que expresaban AF508 CFTR (B), pero similar en células HBE de pacientes con CF (C). Combinada con Lumacaftor, Ta1 no aumentaba la actividad de Lumacaftor (B y C). Estos resultados indican que la capacidad de Ta1 de aumentar la expresión de CFTR era comparable a la de Lumacaftor y podría explotarse para politerapia con Ivacaftor.

Ratones con CF son susceptibles a patología inflamatoria en infección

Para evaluar la actividad terapéutica de Ta1 en CF, se ha evaluado la susceptibilidad de ratones C57BL/6 y Cftr-/- a la patología inflamatoria asociada con la infección con Aspergillus fumigatus, un colonizador microbiano conocido de las vías respiratorias de pacientes con CF (41). Se infectaron ratones C57BL/6 y Cftr1' por vía intranasal con conidios vivos de A. fumigatus y se evaluaron para los parámetros de inflamación. Se observó una respuesta inflamatoria mantenida y persistente, caracterizada por reclutamiento de neutrófilos (PMN) y eosinófilos (EOS) en BAL (panel A, figura 6) y pulmón (paneles B y C, figura 6), en ratones Cftr/- en que ya era visible un grado de inflamación antes de la infección (C, histología pulmonar (ácido peryódico-Schiff y, en la inserción, tinción de Gomori) en diferente dpi). El recuento celular diferencial de monomorfonucleares (MNC), células PMN y EOS se determinó tras tinción de May Grunwald Giemsa a diferentes días después de infección (dpi). Los valores representan la media ETM de tres ratones por grupo y son representativos de 3 experimentos. Se tomaron fotografías con un microscopio de alta resolución Olympus DP71 usando un objetivo x20. Barra de escala 200 pm. (C) Los números de células Gr1+ positivas se evaluaron por citometría de flujo sobre las células pulmonares totales en diferente dpi. *P <0,05.

Ta1 protege a ratones con CF de patología inflamatoria

Los ratones con CF son susceptibles a la respuesta inflamatoria asociada con infección por Aspergillus y alergia y, por tanto, representan un modelo adecuado para evaluar los efectos de Ta1.

Ratones infectados con Aspergillus se trataron con 200 pg/kg/i.p. al día de Ta1 durante 6 días consecutivos empezando el día de la infección. Los ratones se controlaron para patología inflamatoria pulmonar y el reclutamiento celular a los 7 días después de infección. Ta1, pero no el péptido mezclado, disminuyó significativamente el reclutamiento de células inflamatorias locales y la patología pulmonar tanto en ratones C57/BL6 e, incluso más, ratones Cftr/-, como se indica por el reclutamiento disminuido de células inflamatorias (principalmente PMN, véanse las inserciones) en el pulmón (panel A, figura 7), así como en BAL (panel B, figura 7). Estos datos indican que Ta1 es eficaz en limitar el reclutamiento de células inflamatorias en el pulmón de ratones con CF durante infección. (A) Histología pulmonar (ácido peryódico-Schiff y, en la inserción, reclutamiento celular). Se tomaron fotografías con un microscopio de alta resolución Olympus DP71 usando un objetivo x20. Barra de escala 200 pm. (B) Morfometría de BAL a los 7 días después de infección (dpi). El recuento celular diferencial de monomorfonucleares (MNC), células polimorfonucleares (PMN) y eosinófilos (EOS) se determinó tras tinción de May Grunwald Giemsa. Los valores representan la media ± ETM de tres ratones por grupo y son representativos de 3 experimentos. *P <0,05; **P <0,01; ***P <0,001.

Ta1 regula por disminución las citocinas inflamatorias en ratones con CF con aspergilosis

Se infectaron ratones C57BL/6 y Cftr/- por vía intranasal con conidios vivos de A. fumigatus y se trataron con 200 pg/kg/i.p. de Ta1 al día durante 6 días consecutivos empezando el día de la infección. Los resultados se muestran en la figura 8. Muestran que la respuesta inflamatoria aumentada y no resuelta en ratones Cftr'1' estaba asociada con niveles mayores, en comparación con C57/BL6, de IL-1 p e IL-1 a en BAL durante infección. Tras el tratamiento con Ta1, los niveles tanto de IL-1 p como de IL-1 a disminuían abruptamente en cualquier tipo de ratón y, de gran interés, los niveles de la citocina de bloqueo inflamatorio (IL-1 RA) aumentaban. Dado que se observan niveles altos de IL-1 p e IL-1 a en pacientes con CF (42), estos datos indican que Ta1 puede contribuir en el equilibrio de citocinas inflamatorias/antiinflamatorias locales en pacientes con CF. Los niveles de IL-1 p, IL-1 a e IL-1 RA en BAL se midieron por ELISA (pg/ml) a los 7 días después de infección. Los resultados mostrados representan datos combinados de dos experimentos. *P <0,05; **P <0,01; ***P <0,001.

Ta1 regula el equilibrio de células Th en ratones con CF con aspergilosis

La ruta inflamatoria de Th17 está implicada en inflamación pulmonar de CF (21,22, 43) mientras que la ruta de Th2 está asociada con alergia fúngica de CF (44). Para la evaluación de los efectos de Ta1 sobre la activación de células Th, se han medido los niveles de citocinas Th en los pulmones y de los factores de transcripción correspondientes en los ganglios linfáticos torácicos de drenaje en ratones C57BL/6 y Cftr1' infectados y se trataron con Ta1 como anteriormente. Ta1 disminuyó la activación de células Th17 (niveles disminuidos de IL-17A y del factor de transcripción Rorc de Th17), Th2 (IL-4 y Gata3 bajos) mientras promueve la actividad celular tanto de Th1 (IFN-y y Tbet aumentados) como de Treg (IL-10 y Foxp3 aumentados). Estos resultados indican que Ta1 es un potente activador del eje antiinflamatorio de Th1/Treg en CF mientras frena la activación de las células inflamatorias Th17/Th2 (figura 9). Los niveles de citocinas se evaluaron en homogeneizados pulmonares (por ELISA o RT-PCR) y la expresión de los correspondientes factores de transcripción de Th (por RT-PCR) en los ganglios linfáticos torácicos de drenaje. Los resultados mostrados representan datos combinados der dos experimentos. n.d. no realizado. *P <0,05; **P <0,01; ***P <0,001.

Referencias

1. O'Sullivan BP, Freedman SD. Cystic fibrosis. Lancet 2009; 373: 1891 -1904.

2. Welsh MJ, Smith AE. Molecular mechanisms of CFTR chloride channel dysfunction in cystic fibrosis. Cell. 1993; 73:1251-1254.

3. Guggino WB, Stanton BA. New insights into cystic fibrosis: molecular switches that regulate CFTR. Nature Rev. Mol. Cell. Biol. 2006; 7:426-436.

4. Cystic Fibrosis Foundation. Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry Annual Data Report 2011. Cystic Fibrosis Foundation; 2012.

5. The Cystic Fibrosis Genotype-Phenotype Consortium Correlation between genotype and phenotype in patients with cystic fibrosis. N. Engl. J. Med. 1993; 329:1308-1313.

6. Cutting GR. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application Nat Rev Genet. 2015; 16: 45-56.

7. Mall MA, Galietta LJ. Targeting ion channels in cystic fibrosis. J Cyst Fibros. 2015. pii: S1569-1993(15)00150-2. 8. Pettit RS, Fellner C. CFTR modultators for the treatment of Cystic fibrosis. P&T 2014; 39:500-511.

9. Yang H, Ma T. F508del-cystic fibrosis transmembrane regulator correctors for treatment of cystic fibrosis: a patent review. Expert Opin. Ther. Patents 2015.

10. Ramsey BW, Davies J, McElvaney NG, Tullis E, Bell SC, Drevínek P, Griese M, McKone EF, Wainwright CE, Konstan mW, Moss R, Ratjen F, Sermet-Gaudelus I, Rowe SM, Dong Q, Rodriguez S, Yen K, Ordoñez C, Elborn JS.

11. Wainwright CE, Elborn JS, Ramsey BW, Marigowda G, Huang X, Cipolli M, Colombo C, Davies JC, De Boeck K, Flume PA, Konstan MW, McColley s A, McCoy K, McKone EF, Munck A, Ratjen F, Rowe SM, Waltz D, Boyle MP; TRAFFIC Study Group; TRANSPORT Study Group. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. N Engl J Med. 2015; 373:220-31.

12. Cholon DM, Quinney NL, Fulcher ML, Esther CR Jr, Das J, Dokholyan NV, Randell SH, Boucher RC, Gentzsch M. Potentiator ivacaftor abrogates pharmacological correction of AF508 CFTR in cystic fibrosis. Sci Transl Med. 2014; 6:246ra96.

13. Corvol H, Thompson KE, Tabary O, le Rouzic P, Guillot L.Translating the genetics of cystic fibrosis to personalized medicine. Transl Res. 15 de abril de 2015. pii: S1931-5244 (15)00131-0.

14. Belcher CN, Vij N. Protein processing and inflammatory signaling in Cystic Fibrosis: challenges and therapeutic strategies. Curr Mol Med. 2010; 10:82-94.

15. Cantin AM, Hartl D, Konstan MW, Chmiel JF. Inflammation in cystic fibrosis lung disease: Pathogenesis and therapy. J Cyst Fibros. 2015 Jul; 14:419-30).

16. Hartl D, Gaggar A, Bruscia E, et al. Innate immunity in cystic fibrosis lung disease. J Cyst Fibros 2012; 11: 363­ 382.

17. Mizgerd JP, Lupa MM, Kogan MS, et al. Nuclear factor-kappaB p50 limits inflammation and prevents lung injury during Escherichia coli pneumonia. Am J Respir Crit Care Med 2003; 168: 810-817.

18. Cohen TS, Prince A. Cystic fibrosis: a mucosal immunodeficiency syndrome. Nat Med 2012; 18: 509-519.

19. Hoffman LR, Ramsey BW. Cystic fibrosis therapeutics: the road ahead. Chest 2013; 143: 207-213.

20. Ramsey B, Banks-Schlegel S, Accurso F, et al. Future Directions in Early Cystic Fibrosis Lung Disease Research. Am J Respir Crit Care Med 2012; 185: 887-892.

21. lannitti RG, Carvalho A, Cunha C, et al. Th17/Treg imbalance in murine cystic fibrosis is linked to indoleamine 2,3-dioxygenase deficiency but corrected by kynurenines. Am J Respir Crit Care Med 2013; 187: 609-620.

22. lannitti RG, Casagrande A, De Luca A, et al. Hypoxia promotes danger-mediated inflammation via receptor for advanced glycation end products in cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med 2013; 188: 1338-1350.

23. Lands LC, Stanojevic S. Oral non-steroidal anti-inflammatory drug therapy for lung disease in cystic fibrosis. Cochrane Database Syst Rev. 13 de junio de 2013; 6:CD001505.

24. Conrad C, Lymp J, Thompson V, Dunn C, Davies Z, Chatfield B, Nichols D, Clancy J, Vender R, Egan ME, Quittell L, Michelson P, Antony V, Spahr J, Rubenstein RC, Moss RB, Herzenberg LA, Goss CH, Tirouvanziam R. Long-term treatment with oral N-acetylcysteine: affects lung function but not sputum inflammation in cystic fibrosis subjects. A phase II randomized placebo-controlled trial. J Cyst Fibros. 2015; 14:219-27.

25. P.J. Mogayzel Jr., E.T. Naureckas, K.A. Robinson, G. Mueller, D. Hadjiliadis, J.B. Hoag, et al. Cystic fibrosis pulmonary guidelines. Chronic medications for maintenance of lung health Am J Respir Crit Care Med. 2013 187. 680­ 689.

26. De Benedictis FM, Bush A. Corticosteroids in respiratory diseases in children. Am J Respir Crit Care Med. 2012; 185:12-23.

27. Goldstein AL, Guha A, Zatz MM, et al. Purification and biological activity of thymosin, a hormone of the thymus gland. Proc Natl Acad Sci U S A 1972; 69: 1800-1803.

28. Garaci E., Pica F., Rasi G., et al. Combination therapy with BRM in cancer and infections disease. Mech. Ageing Dev, 1997, 96, 103 - 116.

29. Tuthill C, Rios I, McBeath R. Thymosin alpha 1: past clinical experience and future promise. Ann N Y Acad Sci 2010; 1194: 130-135.

30. Romani L, Bistoni F, Perruccio K, et al. Thymosin alpha1 activates dendritic cell tryptophan catabolism and establishes a regulatory environment for balance of inflammation and tolerance. Blood 2006; 108: 2265-2274.

31. Perruccio K, Bonifazi P, Topini F, et al. Thymosin alpha1 to harness immunity to pathogens after haploidentical hematopoietic transplantation. Ann N Y Acad Sci 2010; 1194: 153-161.

32. Bruscia E, Sangiuolo F, Sinibaldi P, Goncz KK, Novelli G, Gruenert DC. Isolation of CF cell lines corrected at DeltaF508-CFTR locus by SFHR-mediated targeting. Gene Ther. 2002; 9:683-5.

33. Zhou L, Dey CR, Wert SE, et al. Correction of lethal intestinal defect in a mouse model of cystic fibrosis by human CFTR. Science 1994; 266: 1705-1708.

34. Van Goor F, Hadida S, Grootenhuis PD, Burton B, Stack JH, Straley KS, Decker CJ, Miller M, McCartney J, Olson ER, Wine JJ, Frizzell RA, Ashlock M, Negulescu PA. Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011; 108: 18843-8.

35. Munkonge F1, Alton EW, Andersson C, Davidson H, Dragomir A, Edelman A, Farley R, Hjelte L, McLachlan G, Stern M, Roomans GM. Measurement of halide efflux from cultured and primary airway epithe lial cells using fluorescence indicators. J Cyst Fibros. 2004; 3 Supl. 2:171-6.

36. Ramalho AS1, Beck S, Meyer M, Penque D, Cutting GR, Amaral MD. Five percent of normal cystic fibrosis transmembrane conductance regulator mRNA ameliorates the severity of pulmonary disease in cystic fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol. 2002; 27: 619-27).

37. Mall MA, Galietta LJ. Targeting ion channels in cystic fibrosis. J Cyst Fibros. 201523. pii: S1569-1993(15)00150-2.

38. Caputo A1, Caci E, Ferrera L, Pedemonte N, Barsanti C, Sondo E, Pfeffer U, Ravazzolo R, Zegarra-Moran O, Galietta LJ. TMEM16A, a membrane protein associated with calcium-dependent chloride channel activity. Science.

2008; 322: 590-4.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Composición farmacéutica que comprende o que consiste en timosina alfa 1 para su uso en el tratamiento de fibrosis quística, en la que la timosina alfa 1 es un agente corrector de CFTR, potenciador de CFTR y antiinflamatorio.

2. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 1, que comprende una combinación de timosina alfa 1 con al menos un agente elegido del grupo que consiste en agente antibiótico, antifúngico, corrector de CFTR, potenciador de CFTR, siendo dicho corrector o potenciador de CFTR distinto de timosina alfa 1.

3. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 2, en la que dicho al menos un agente antibiótico se elige del grupo que consiste en tobramicina, ciprofloxacina y colistina.

4. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 2, en la que dicho al menos un agente antifúngico se elige del grupo que consiste en itraconazol y anfotericina B.

5. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 2, en la que dicho al menos un agente corrector o potenciador de CFTR distinto de timosina alfa 1 se elige del grupo que consiste en Ivafactor y Lumacaftor.

6. La composición farmacéutica para el uso de una cualquiera de la reivindicación 1 a reivindicación 5, en la que la composición farmacéutica comprende uno o más excipientes y/o coadyuvantes.

7. Composición farmacéutica que comprende o que consiste en timosina alfa 1 para su uso en el tratamiento y/o en la prevención de inflamación crónica en pacientes afectados por fibrosis quística, en la que la timosina alfa 1 es un agente corrector de CFTR, potenciador de CFTR y antiinflamatorio.

8. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 7, que comprende una combinación de timosina alfa 1 con al menos un agente elegido del grupo que consiste en agente antibiótico, antifúngico, corrector de CFTR, potenciador de CFTR, siendo dicho corrector o potenciador de CFTR distinto de timosina alfa 1.

9. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 7, en la que el agente antibiótico se elige del grupo que consiste en tobramicina, ciprofloxacina y colistina.

10. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 7, en la que el agente antifúngico se elige del grupo que consiste en itraconazol y anfotericina B.

11. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 7, en la que el agente corrector o potenciador de CFTR distinto de timosina alfa 1 se elige del grupo que consiste en Ivafactor, Lumacaftor.

12. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 2, en la que la timosina alfa 1 y el al menos un agente elegido del grupo que consiste en agente antibiótico, antifúngico, corrector de CFTR, potenciador de CFTR ser administran al paciente por separado o secuencialmente.

13. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 8, en la que la timosina alfa 1 y el al menos un agente elegido del grupo que consiste en agente antibiótico, antifúngico, corrector de CFTR, potenciador de CFTR se administran al paciente por separado o secuencialmente.