ES2843798T3

ES2843798T3 - Conjugados y profármacos para el tratamiento del cáncer y de enfermedades inflamatorias

Info

Publication number: ES2843798T3
Application number: ES15709742T
Authority: ES
Inventors: Sébastien Papot; Isabelle Opalinski; Brigitte Renoux; Thibaut Legigan
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite de Poitiers
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite de Poitiers
Priority date: 2014-02-07
Filing date: 2015-02-06
Publication date: 2021-07-20
Anticipated expiration: 2035-02-06
Also published as: EP3139963B1; EP3766510A1; WO2015118497A1; FR3017298B1; US20170095525A1; CN106573071A; CN114917358A; JP6721512B2; FR3017298A1; US10293021B2; CA2938501A1; EP3139963A1; CA2938501C; JP2017506628A; DK3139963T3

Abstract

Conjugado de fórmula general (I): **(Ver fórmula)** en la que: - A representa la monometilauristatina E (MMAE), - L representa una unidad de maleimidocaproilo, - G comprende y preferentemente representa un radical glucuronilo o uno de sus derivados, - Y representa un radical atrayente de electrones, en particular elegido entre NO2, CF3 y un halógeno, - R1 y R2 representan, independientemente entre sí, H o un radical alquilo en C1-C10, lineal o ramificado, saturado o insaturado, - Z representa un radical separador de hidrocarburo que comprende en cada uno de sus extremos funciones de enlaces covalentes, - X representa -O- o -NR3COO-, con R3 que puede representar un átomo de hidrógeno o un radical alquilo C1-C10, lineal o ramificado, saturado o insaturado, estando el enlace con el radical G asegurado por el átomo de oxígeno (-O), uno de sus isómeros y/o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

Description

DESCRIPCIÓN

Conjugados y profármacos para el tratamiento del cáncer y de enfermedades inflamatorias

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere al campo del cáncer y de las enfermedades inflamatorias. Más en particular, la presente invención está dirigida a proponer nuevas formas conjugadas de principios activos que pertenecen a la familia de las dolastatinas.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

[0002] El cáncer y las enfermedades inflamatorias están entre las afecciones patológicas más comunes hoy en día. Especialmente, el cáncer es en la actualidad una de las primeras causas de mortalidad en Francia y en la mayor parte de los países industrializados. Entre los diferentes modos de tratamientos que pueden plantearse, la quimioterapia es el único que puede usarse frente a los tumores circulantes, tales como los linfomas y las leucemias, así como las metástasis.

[0003] Entre los activos que pueden contemplarse en quimioterapia, figuran algunos compuestos peptídicos naturales a imagen, especialmente, de la dolastatina ^{1 0}, un compuesto natural lineal obtenido del mundo marino, constituido por cuatro aminoácidos, de los que tres son específicos. Hoy en día también se dispone de derivados sintéticos de la dolastatina 10, que se privilegian. Se trata más en particular, de la auristatina PE, la auristatina E o la monometilauristatina E (MMAE). La dolastatina, la auristatina E y sus derivados poseen la propiedad de inhibir la polimerización de la tubulina y de impedir, con ello, la división celular (antimitóticos).

[0004] Sin embargo, estos activos de la familia de las dolastatinas están por desgracia desprovistos, a imagen de otros activos anticancerosos usados clínicamente, de una selectividad satisfactoria ante las células tumorales. De hecho, también se dirigen a tejidos sanos. Esta destrucción no selectiva conlleva graves efectos secundarios y en la mayoría de los casos conduce a una interrupción prematura del tratamiento.

[0005] El desarrollo de nuevos agentes anticancerosos capaces de destruir selectivamente los tumores sin afectar a los órganos sanos tiene por tanto un interés de primer orden en la lucha contra el cáncer.

[0006] Una de las estrategias conservadas para paliar esta falta de selectividad se basa en la puesta a punto de conjugados de estos activos. Estos conjugados, llamados también profármacos, se obtienen así, con la mayor frecuencia, por injerto del activo considerado con una entidad cuya función es inactivar este último cuando está en esta forma de profármaco, transferirlo, hasta los tejidos o células diana, promover su liberación y restablecer entonces su actividad biológica curativa. Esta estrategia se basa más en particular en la observación de especificidades propias de los tejidos tumorales. Así, se sabe que el microentorno tumoral se distingue de los tejidos sanos por un pH más ácido, un potencial reductor más importante, una permeabilidad aumentada para las macromoléculas o la presencia de una concentración relativamente elevada de ciertas enzimas, tales como, por ejemplo, la p-glucuronidasa. Asimismo, se ha demostrado que los tejidos enfermos se distinguen de los tejidos sanos por el hecho de que las células malignas se expresan en su superficie de los receptores de membrana o de antígenos que las diferencian de las células sanas, tales como los receptores del ácido fólico o el antígeno CD33.

[0007] En consecuencia, se han puesto a punto ya derivados de activos convencionales para aprovechar estas diferencias con el fin de aumentar, especialmente, su selectividad para las células tumorales.

[0008] Así, la monometilauristatina E (MMAE) se ha conjugado a un anticuerpo anti-CD30 por medio de un brazo escindible (documento US 7.829.531). Sin embargo, dicho conjugado presenta una especificidad demasiado alta con respecto a su diana y demuestra ser poco eficaz, o incluso ineficaz, frente a cánceres y/o enfermedades inflamatorias no dependientes de CD30.

[0009] Teming y col. (2006, Bioconjugate Chem) conjugaron una molécula de la monometilauristatina E (MMAE) con un motivo de albúmina, por medio de un grupo enlazador escindible, con el fin de dirigirse a los tejidos tumorales.

[0010] Más recientemente, Legigan y col. (2013, Eur. Chem.) y Tranoy-Opalinski y col. (2014, Eur. J. Med. Chem.) conjugaron una molécula de la monometilauristatina E (MMAE) con un motivo de glucuronilo por medio de un brazo autorreactivo. Esta forma conjugada de la MMAE, llamada también profármaco, es inactiva y solo una escisión a escala tumoral por p-glucuronidasas, mayoritariamente extracelulares, permite que la MMAE ejerza su actividad biológica antimitótica. No obstante, se observa una eliminación rápida de este profármaco en los riñones. Al reducirse significativamente la semivida de este profármaco, se desprende que es necesario aumentar la dosis, lo que se acompaña de efectos secundarios perjudiciales.

[0011] Legigan y col. (2012, Angew. Chem. Int. Ed.) han propuesto también una monometilauristatina E (MMAE) bifuncionalizada por un grupo galactósido y un grupo que se une a los receptores del ácido fólico, siendo llevados los dos grupos por un brazo autorreactivo. Sin embargo, este profármaco necesita una etapa de internalización celular antes de ser escindido por una p-galactosidasa intracelular y liberar la monometilauristatina E (MMAE).

[0012] En consecuencia, aunque estas formas profármacos de la monometilauristatina E estén dirigidas específicamente al nivel tumoral, su eficacia citotóxica sigue siendo relativa, y no permite plantear un tratamiento clínico efectivo de un tumor.

[0013] Sigue existiendo, por tanto, una necesidad de profármacos de la familia de las dolastatinas, aptos para transmitir este tipo de activo con una especificidad muy alta y, en forma inactiva, en los tejidos o células enfermos.

[0014] Existe también una necesidad de profármacos de la familia de las dolastatinas cuya citotoxicidad se exprese eficazmente de manera específica en el microentorno tumoral.

[0015] Existe también una necesidad de profármacos de la familia de las dolastatinas cuya eficacia tumoral no requiera una cantidad excesiva de activo, con el fin de prevenir la aparición de efectos secundarios perjudiciales, especialmente en las células, los tejidos o los órganos sanos.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0016] La presente invención tiene por objeto en concreto satisfacer estas necesidades.

[0017] Según un primer aspecto, la presente invención se refiere a un conjugado de fórmula general (I):

en la que:

- A representa la monometilauristatina E (MMAE),

- L representa un motivo de maleimidocaproilo,

- G comprende y preferentemente representa un radical glucuronilo,

- Y representa un radical atrayente de electrones, en particular elegido entre NO², CF³y un halógeno,

- R¹y R²representan, independientemente entre sí, H o un radical alquilo en C¹-C¹⁰, lineal o ramificado, saturado o insaturado,

- Z representa un radical separador de hidrocarburo que comprende en cada uno de sus extremos funciones de enlaces covalentes,

- X representa -O- o -NR³COO-, con R³que puede representar un átomo de hidrógeno o un radical alquilo en C¹-C¹⁰, lineal o ramificado, saturado o insaturado, de manera que el enlace con el radical G está asegurado por el átomo de oxígeno (-O),

uno de sus isómeros y/o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

[0018] De forma inesperada, los autores de la invención observaron de hecho que un conjugado de fórmula general (I) y que se deriva de la monometilauristatina E posee una eficacia terapéutica in vivo significativamente mejorada con respecto a la monometilauristatina E no funcionalizada.

[0019] En consecuencia, un conjugado según la invención demuestra ser especialmente interesante para el tratamiento clínico de cánceres, en lo que respecta a su selectividad y a su dosis terapéutica.

[0020] Según un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un profármaco que comprende al menos una molécula de un conjugado de fórmula general (I) según la invención, estando dicha molécula de dicho conjugado unida por un enlace covalente a una molécula de albúmina, en particular endógeno, o uno de sus derivados.

[0021] Como se detalla a continuación, la estructura química de un conjugado según la invención es propicia muy en particular para su interacción con una molécula de albúmina, especialmente endógena y más en particular una molécula de albúmina sérica. Todavía más en particular, esta interacción se establece especialmente in vivo, y se permite privilegiando una naturaleza de radical L que tenga una afinidad por el átomo de azufre de la cisteína en posición 34 de la albúmina endógena. Esta interacción con el átomo de azufre de la cisteína puede derivarse especialmente de una reacción de Michael. El establecimiento de un enlace covalente entre una molécula de conjugado y una molécula de albúmina por medio de una reacción de Michael permite así aprovecharse del fenómeno de acumulación de la albúmina en el microentorno tumoral y acceder a un direccionamiento mejorado de un conjugado según la invención.

[0022] Según otro aspecto, la presente invención se refiere también a una composición farmacéutica que comprende al menos una cantidad eficaz de al menos un conjugado de fórmula general (I) según la invención, o una forma acoplada de dicho conjugado con al menos una molécula de albúmina y preferentemente un profármaco de fórmula general (VI), tal como se define según la invención.

[0023] Según otro aspecto, la presente invención se refiere a un conjugado de fórmula general (I), según la invención, para su uso en la prevención y/o el tratamiento de un cáncer y/o de una enfermedad inflamatoria.

[0024] Según otro aspecto, la presente invención se refiere a una forma acoplada de dicho conjugado con al menos una molécula de albúmina, y especialmente un profármaco de fórmula general (VI) según la invención, para su uso en la prevención y/o el tratamiento de un cáncer y/o de una enfermedad inflamatoria.

[0025] Según otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición, según la invención, para su uso en la prevención y/o al tratamiento de un cáncer y/o de una enfermedad inflamatoria.

[0026] Según otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento de tratamiento de un cáncer, y/o de una enfermedad inflamatoria que comprende la administración de un conjugado de fórmula general (I) según la presente invención.

[0027] Según otro aspecto, la presente invención se refiere también a un procedimiento de tratamiento de un cáncer y/o de una enfermedad inflamatoria que comprende la administración de una forma acoplada de dicho conjugado con al menos una molécula de albúmina y especialmente de un profármaco de fórmula general (VI) según la presente invención.

[0028] Finalmente, según un último aspecto, la presente invención se refiere también a un procedimiento de tratamiento de un cáncer y/o de una enfermedad inflamatoria que comprende la administración de una composición farmacéutica según la presente invención.

LEYENDAS DE LAS FIGURAS

[0029]

La Figura 1 ilustra un esquema de reacción de síntesis de un conjugado de fórmula (III).

La Figura 2 ilustra la evolución del volumen de un tumor humano de páncreas de tipo Mia Paca injertado en ortotópico en un ratón. Se aplican dos inyecciones de MMAE no funcionalizada (0,3 mg/kg) o de un conjugado de fórmula (III), es decir, una MMAE bifuncionalizada (2 o 4 mg/kg) en los días D⁷y D¹⁴después del injerto. El volumen tumoral se evalúa por ecocardiografía durante 70 días después del injerto. Una ampliación representa esta evolución en una escala de tiempo de 30 días postinjerto.

La Figura 3 ilustra la evolución del volumen de un tumor de páncreas de tipo MIA-PaCa injertado en ortotópico seguido por ecocardiografía (5 animales por grupo). El conjugado de fórmula (III), para una dosis de 4 mg/kg, (A) y el excipiente (B) se administraron por vía intravenosa una vez por semana durante 9 semanas.

La Figura 4 ilustra la evolución del volumen de un tumor humano de mama de tipo MDA-MB-231 injertado en ortotópico seguido por ecocardiografía ^{( 6}animales por grupo). Los animales tratados con MMAE (B) recibieron una dosis de 0,5 mg/kg (intravenosa) una vez por semana durante 5 semanas. Los animales tratados con el conjugado MMAE bifuncionalizado (conjugado de fórmula (III) (C)) recibieron una dosis de 4 mg/kg (intravenosa) una vez por semana durante 5 semanas. Los animales de control se tratan con el excipiente (vehículo (A)). DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

• Conjugados

[0030] Como se indica anteriormente, un conjugado según la invención responde a la fórmula general (I):

en la que:

- A representa la monometilauristatina E (MMAE)

- L representa un motivo de maleimidocaproilo

- G comprende y preferentemente representa un radical glucuronilo,

- R1 y R2 representan, independientemente entre sí, H o un radical alquilo en C¹-C¹⁰, lineal o ramificado, saturado o insaturado,

- X representa -O- o -NR3COO-, con R3 que puede representar un átomo de hidrógeno o un radical alquilo en C¹-C¹⁰, lineal o ramificado, saturado o insaturado, de manera que el enlace con el radical G está asegurado por el átomo de oxígeno (-O),

uno de sus isómeros y/o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

[0031] En el marco de la presente invención un «radical atrayente de electrones» se refiere a la propiedad de un átomo o de un grupo de átomos de atraer los electrones.

[0032] En el marco de la presente invención un «isómero» se refiere a una molécula en la que la posición de al menos dos grupos químicos en un carbono asimétrico está invertida con respecto a la molécula de referencia. Especialmente, un radical de la familia de las dolastatinas presenta numerosos carbonos asimétricos. Además, el término «isómero» se refiere exclusivamente a una molécula capaz de ejercer una o varias actividades biológicas idénticas o similares con respecto a la de la molécula de referencia.

[0033] Se comprende que la invención se extiende tanto a los enantiómeros aislados como a la mezcla racémica correspondiente.

[0034] En el marco de la presente invención, una «sal farmacéuticamente aceptable» puede ser una sal de un conjugado, o de un profármaco según la invención, y de un metal alcalino, de un metal alcalinotérreo o de amonio, que comprende las sales obtenidas con bases orgánicas de amonio, o sales de un conjugado, o de un profármaco según la invención, y de ácido orgánico o inorgánico.

[0035] Las sales que convienen más en particular a la invención pueden ser sales de sodio, de potasio, de calcio, de magnesio, sales de amonio cuaternario tales como tetrametilamonio o tetraetilamonio, y sales de adición con amoniaco y aminas orgánicas farmacéuticamente aceptables, tal como metilamina, dimetilamina, trimetilamina, etilamina, trietilamina, etanolamina o tris-(2-hidroxietil)-amina.

[0036] Las sales de un conjugado, o de un profármaco según la invención, y de ácido inorgánico conveniente para la invención pueden obtenerse con ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico o ácido fosfórico.

[0037] Las sales de un conjugado, o de un profármaco según la invención, y de ácido orgánico conveniente para la invención pueden obtenerse con ácidos carboxílicos y ácidos sulfónicos tales como ácido fórmico, ácido acético, ácido oxálico, ácido cítrico, ácido láctico, ácido málico, ácido succínico, ácido malónico, ácido benzoico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido metanosulfónico, ácido bencenosulfónico o ácido p-toluensulfónico.

• Radical de la familia de las dolastatinas y sus derivados (radical A)

[0038] La familia de las dolastatinas representa una clase de compuestos que presentan una estructura de al menos 4 aminoácidos, de los cuales al menos 3 le son específicos, es decir, diferentes de los 20 aminoácidos encontrados más corrientemente en la naturaleza.

[0039] Podrá hacerse referencia especialmente al documento WO 2004/010957, cuyo contenido se incorpora como referencia, que describe compuestos según los convenientes para la presente invención.

[0040] La diferencia estructural entre la dolastatina 10 y los compuestos sintéticos de la subfamilia de la auristatina reside especialmente en la sustitución del grupo amino tiazolfenetil en posición C-terminal de la dolastatina 10, por una unidad de norefedrina en el caso de la auristatina PE, la auristatina E o la monometilauristatina.

[0041] En el marco de la presente invención, el radical de la familia de las dolastatinas se elige ventajosamente entre la monometilauristatina E (MMAE).

[0042] En el sentido de la invención, la monometilauristatina E presenta una estructura química muy semejante a al menos uno de sus activos y posee propiedades antimitóticas atribuidas a los compuestos de la familia de las dolastatinas.

[0043] Su o sus diferencias estructurales pueden especialmente ser, por ejemplo, una sustitución en al menos una cadena lateral de al menos uno de los cuatro aminoácidos que lo componen. Esta sustitución puede realizarse de manera que contenga o represente un grupo alquilo, lineal, cíclico y/o ramificado, un grupo arilo, un heterociclo o un carbociclo.

[0044] Esta diferencia estructural puede consistir asimismo en una modificación de una molécula de la dolastatina 10, la auristatina PE o la auristatina E, por ejemplo, en su amina terciaria en posición N-terminal, para hacer esta función compatible con el establecimiento de un enlace covalente con el brazo de enlace considerado.

[0045] Es de conocimiento general para el experto en la materia cómo seleccionar las modificaciones más adecuadas para estos fines.

• Radical L

[0046] Como se desprende de lo expuesto anteriormente, los conjugados según esta descripción tienen como original el hecho de que están funcionalizados doblemente y sobre todo de que están funcionalizados por un radical capaz de conferirles una aptitud para interaccionar con una macromolécula, en particular una macromolécula endógena, y más en particular todavía, una molécula de albúmina sérica.

[0047] Dado que actualmente se conocen macromoléculas biológicas, y especialmente la albúmina endógena, para su acumulación por efecto «EPR» («Enhanced Permeability and Retention») en el microentorno de los tumores sólidos, el acoplamiento in situ de un conjugado según la invención con una molécula de albúmina endógena permite dirigirse a la entidad acoplada así formada, llamada también profármaco, en el microentorno tumoral y superar así el defecto de selectividad de las formas libres de los derivados de dolastatinas. Debe observarse que dicho efecto «EPR» se aplica al microentorno de los tejidos inflamados.

[0048] También debe observarse que este principio de direccionamiento a los tejidos y/o células enfermos, por medio de una macromolécula, ya se ha propuesto para la doxorrubicina (Legigan y col. 2012, J. Med. Chem). No obstante, si este profármaco presenta una semivida mejorada con respecto a un profármaco funcionalizado por un único radical glucuronilo, no permite tener una ganancia de eficacia con respecto a la doxorrubicina no funcionalizada, lo que presenta el inconveniente de ser muy poco eficaz y por tanto de necesitar dosis elevadas, poco compatibles con un tratamiento soportable por un sujeto.

[0049] Como se detallará más adelante (ejemplo 2 y Figura 2), un conjugado según la invención y administrado por vía parenteral revela por el contrario tener una eficacia significativamente mejorada comparada con la de un compuesto de la familia de las dolastatinas tomado en un estado aislado, es decir, no funcionalizado.

[0050] En el caso en que el profármaco contemplado está destinado a generarse in vivo, es decir, mediante el establecimiento de un enlace covalente entre un conjugado de fórmula general (I) y una macromolécula como la albúmina, es especialmente ventajoso primar, en el conjugado, un radical L que comprenda un motivo apto para interaccionar con una función tiol libre, con el fin de privilegiar la afinidad del conjugado por la albúmina sérica.

[0051] Dicho motivo, permite establecer in vivo un enlace covalente con una función tiol (-SH) libre de la albúmina sérica, especialmente por interacción con la función tiol (-SH) libre de la cisteína en posición 34. Este enlace covalente, es decir, un enlace tioéter, se realiza ventajosamente mediante una reacción de Michael.

[0052] Así, la invención se refiere a un conjugado, en el que L representa un motivo de tipo maleimidocaproilo.

[0053] Sin embargo, en el caso en que se plantee sintetizar el profármaco antes de su administración, el conjugado de fórmula (I) puede presentar un radical L que comprende un motivo apto para reaccionar con una función amino (-NH²), hidroxi (-OH) o tiol (-SH). Estas funciones reactivas permiten realizar enlaces covalentes entre, por una parte, el conjugado de fórmula (I), por medio del radical L y, por otra parte, una macromolécula o un fragmento de una macromolécula.

[0054] La elección del motivo llevado por el radical L y apto para reaccionar con una función amino (-NH²), hidroxi (-OH) o tiol (-SH) se lleva a cabo en relación con la naturaleza de la función presente en la macromolécula para acoplamiento y queda claramente dentro de las competencias del experto en la materia.

• Radical alucuronilo y sus derivados (radical G)

[0055] En el marco de la presente invención, el radical glucuronilo (radical G) está destinado a ser eliminado por vía enzimática, para asegurar así una reordenación intramolecular del brazo de enlace que lo asocia con la molécula de la familia de las dolastatinas y, en consecuencia, conducir a una liberación de esta molécula activa (radical A).

[0056] Además, un radical glucuronilo según la invención, enzimáticamente hidrolizable, puede conferir una especificidad tisular y/o celular a los conjugados y profármacos según la presente invención.

[0057] Se sabe que la p-glucuronidasa es una enzima presente de forma natural en concentración importante cerca de numerosos tumores. Los conjugados y profármacos de la invención que comprenden un grupo glucuronilo pueden así activarse ventajosamente en el nivel extracelular, en el curso de monoterapias con profármaco o PMT (Prodrug Mono-Therapy). En el marco de la invención, por el término «activación» se hace referencia a la liberación en el sitio tumoral, por ejemplo, del radical de la familia de las dolastatinas, que así son capaces de ejercer su actividad biológica antimitótica.

[0058] Además, la p-glucuronidasa es una enzima lisosómica que está presente en la mayor parte de las células malignas. Así, la activación de un profármaco glucuronilado por una p-glucuronidasa puede realizarse opcionalmente en el medio intracelular después de la internalización por endocitosis.

[0059] Según una variante de realización, un radical glucuronilo enzimáticamente hidrolizable conveniente para la invención puede ser especialmente un polisacárido que comprende de 2 a 20, especialmente de 3 a 10, y más en particular de 4 a 6 unidades de glucuronilo.

[0060] Este radical glucuronilo puede interaccionar ventajosamente con el brazo de enlace considerado según la invención por medio de una de sus funciones hidroxilos y el enlace covalente representado por X es entonces un átomo de oxígeno.

[0061] Como se indica anteriormente, -X-G puede representarse también por un derivado carbamoilglucurónido.

• Brazo de enlace entre los radicales A, L y G

[0062] Como se indica anteriormente, los conjugados según la invención poseen un brazo de enlace dedicado por una parte a reunir, en forma de una sola y misma molécula, las diferentes funcionalidades representadas por los radicales A, L y G y por otra parte a permitir la liberación de la molécula activa (radical A) en respuesta a la hidrólisis enzimática del glucuronilo (radical G).

[0063] Además, este brazo de enlace es tal que:

- no altera las propiedades anticancerosas y/o antiinflamatorias llevadas por el compuesto de la familia de las dolastatinas (radical A),

- no compromete las propiedades lábiles del radical glucuronilo (radical G), destinado a ser escindido por una pglucuronidasa en el microentorno del tejido para tratar, lo que permite la reordenación de la molécula conjugada y la liberación del radical A que lleva el principio activo,

- hace posibles las interacciones entre una molécula de un conjugado de fórmula general (I) y una macromolécula, dicho de otro modo, mantener la accesibilidad de la función apta para reaccionar con la función amino, hidroxi o tiol de la albúmina endógena, y

- no afecta a la semivida del conjugado en el organismo en el que puede administrarse.

[0064] Un brazo de enlace adaptado especialmente a la implantación de la presente invención se describe especialmente en el documento WO 2011/145068, el que se incorpora además como referencia.

[0065] Este brazo de enlace está de acuerdo especialmente con la fórmula (II) siguiente:

[0066] Los grupos R1, R2 e Y son tal como se define anteriormente.

[0067] Z1 representa una función de enlace L-click, según se detalla más adelante y que forma parte del radical separador Z del conjugado de fórmula (I).

[0068] En una realización preferida especialmente de la invención Y representa NO²en posición orto de X, y R¹y R²representan H.

• Radical separador Z

[0069] Como se indica anteriormente el brazo de enlace está unido por medio de la función Z¹al resto del radical Z del conjugado de fórmula (I) descrito en la presente invención.

[0070] Así, Z se representa por la cadena -Z¹-Z²-(Z³)^m-, para la que:

- m representa 0 o 1,

- Z¹representa una función de enlace L-click entre el carbono que lleva las funciones R¹y R², y la función Z², - Z²representa un grupo alquileno, lineal o ramificado, saturado o insaturado, en C¹-C¹⁰, opcionalmente interrumpido por uno o varios heteroátomos elegidos entre O o N, un radical glucosilo, un radical O-(CHR⁴-CHR⁵-O-)^po N-(^cH^r4-CHR⁵-O-)^pen los que p representa un número entero natural comprendido entre 1 y 20, y R⁴y R⁵representan, independientemente entre sí, H o CH³, con la salvedad de que R⁴y R⁵no representan simultáneamente CH³, un grupo obtenido de un aminoácido o un péptido, o una combinación de estos grupos, de manera que un extremo de Z²forma un enlace covalente con L, ya sea directamente por una función éter o indirectamente por una función Z³,

- Z³, si está presente, representa una función de tipo éster, amida, éter, carbamato o carbonato entre Z²y el radical L.

[0071] En el marco de la invención, una «función de enlace L-click» se refiere al producto de la reacción de 2 funciones adaptadas a la química click. La química click reúne un conjunto de procedimientos de reacción bien conocido por el experto en la materia y permite realizar de manera sencilla y rápida enlaces covalentes entre dos funciones reactivas o funcionalizadas. En este contexto puede hacerse referencia especialmente a la revisión de Kolb y col. (2004, Angew. Chem. Int. Ed.).

[0072] Dentro de las competencias del experto en la materia figura la elección de una función Z¹adaptada para establecer un enlace covalente con la función reactiva activable por química click.

[0073] Según una realización preferida, Z¹puede ser el resultado de la reacción de 2 funciones reactivas activables por química click que se elige entre -CecR6, -N³, -SH, -C=CH², ciclooctinos, maleimida, -SO²N³, o -COSR⁶, de manera que R⁶representa H o un radical alquilo, lineal o ramificado, saturado o insaturado, en C¹-C¹⁰.

[0074] Según otra realización preferida, Z¹puede ser el resultado de la reacción de 2 funciones reactivas activables por química click que se elige entre -C=CH, -N³, -SH, -C=CH², ciclooctinos, maleimida, -SO²N³, o -COSR⁶, con R⁶tal como se describe anteriormente.

[0075] Según una realización preferida más en particular, Z¹puede ser el resultado de la reacción entre una función reactiva -CeCH y una función reactiva -N³.

[0076] En una realización preferida especialmente de la invención, Z²representa un radical O-(CHR⁴-CHR⁵-O-)^p, en el que p representa un número entero natural comprendido entre 1 y 20, y R⁴y R⁵representan, independientemente entre sí, H o CH³, con la salvedad de que R⁴y R⁵no representan simultáneamente CH³, un grupo obtenido de un aminoácido o de un péptido, o una combinación de estos grupos.

[0077] En otra realización preferida de la invención, Z2 representa un radical O-(CH²-CH²-O-)p, en el que p representa un número entero natural comprendido entre 1 y 20.

[0078] En otra realización preferida especialmente de la invención, Z2 representa un radical O-(CH²-CH²-O-)¹⁰.

[0079] Así, en una realización en particular, la presente invención se refiere a un conjugado de fórmula (III) siguiente:

uno de sus isómeros y/o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

• Síntesis de los conjugados según la presente invención

[0080] Un conjugado de fórmula general (I), según la presente invención, puede sintetizarse a partir de una molécula precursora del brazo de enlace de fórmula (II), tal como se representa por la fórmula general (IV) siguiente:

en la que:

- X' puede representar -OH o -NR³COOH, con R³que puede representar un átomo de hidrógeno o un radical alquilo en C¹-C¹⁰, lineal o ramificado, saturado o insaturado,

- Y puede representar H, o un grupo atrayente de electrones, en particular elegido entre NO², CF³y un halógeno, - R1 y R2 pueden representar, independientemente entre sí, H o un radical alquilo en C¹-C¹⁰, lineal o ramificado, saturado o insaturado,

- F representa una función reactiva activable por química click.

[0081] Este tipo de compuesto se describe especialmente en la publicación WO 2011/145068, que además se incorpora como referencia.

[0082] El injerto de los diferentes grupos o radicales presentes se encuentra dentro de las competencias generales del experto en la materia.

[0083] En una realización especialmente privilegiada, este compuesto es el compuesto de fórmula (V) siguiente:

[0084] Se entiende que el experto en la materia, por sus conocimientos generales, puede determinar el orden de las reacciones que se han de aplicar para formar, a partir de dicho compuesto, un conjugado de fórmula general (I).

[0085] Las reacciones que permiten sucesivamente establecer un enlace covalente entre un compuesto de fórmula (IV) o (V) y i) un radical glucuronilo (radical G), ii) un radical de la familia de las dolastatinas (radical A), iii) un radical separador de hidrocarburo (Z) son bien conocidas por el experto en la materia y no presentan dificultades de realización especiales. Además, dichas reacciones se describen por ejemplo en particular en los documentos de Legigan y col. (2013, Eur. J. Med. Chem.) y Legigan y col. (2012, J. Med. Chem). Si fuera necesario, antes de las reacciones de copulación pueden considerarse reacciones de protección referidas a funciones alcohol (-OH), amina (-NH²) u otras.

[0086] La reacción que permite establecer un enlace covalente entre un radical separador de hidrocarburo (radical Z) y un radical apto para reaccionar con una función tiol (radical L) se describe en particular en el documento de Legigan y col. (2012, J. Med. Chem).

[0087] Las condiciones adaptadas para implementar estas reacciones, los procedimientos de purificación y los procedimientos de evaluación de la pureza de los compuestos sintetizados forman parte de los conocimientos generales del experto en la materia.

• Profármacos

[0088] Según otro de sus aspectos, la invención se refiere a un profármaco que comprende al menos una molécula de conjugado según la invención, unida por un enlace covalente a al menos una molécula de albúmina o uno de sus derivados.

[0089] En el sentido de la invención, «profármaco» se refiere a una molécula apta para transportar en forma inactivada un compuesto de la familia de las dolastatinas en un organismo, y de liberarlo en un órgano, un tejido o células diana específicamente, bajo la acción de una p-glucuronidasa.

[0090] Más exactamente, dicho profármaco responde ventajosamente a la fórmula general (VI) siguiente:

para la que los radicales A, G, X, Y, Z, R1 y R2 son tal como se define anteriormente.

[0091] El motivo L', por su parte, procede de la reacción entre por un lado un radical L que comprende un motivo apto para reaccionar con una función amino, hidroxi o tiol libre y en particular con una función tiol libre transportada por una macromolécula, ventajosamente una molécula de albúmina, todavía más ventajosamente albúmina sérica.

[0092] En el marco de la presente invención, el profármaco puede formarse in vivo o in vitro con una macromolécula, preferentemente con una molécula de albúmina.

[0093] Así, puede contemplarse una albúmina endógena o exógena, y en particular una albúmina sérica humana, una albúmina recombinante o un fragmento de una albúmina.

[0094] En una primera realización preferida de la invención, el enlace covalente entre una molécula del conjugado, tal como se describe mediante la presente invención, y una molécula de albúmina endógena, en particular una molécula de albúmina sérica humana, o uno de sus derivados, se realiza in vivo.

[0095] En una realización preferida más en particular, un profármaco según la invención comprende al menos una molécula de conjugado según la invención unida por un enlace tioéter con el azufre de la cisteína en posición 34 de una molécula de albúmina endógena.

[0096] De hecho, se ha demostrado que se establece espontáneamente un enlace covalente in vivo, por ejemplo, entre por una parte un compuesto que lleva un radical apto para reaccionar con una función tiol y la función tiol de la cisteína en posición 34 de la albúmina sérica humana (Kratz y col. 2002, J. Med. Chem.).

[0097] Según una realización preferida especialmente, la invención se refiere también a un profármaco, que tiene como fórmula la fórmula (VII) siguiente:

uno de sus isómeros y/o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

[0098] Según una segunda realización en particular, un profármaco según la invención puede formarse también in vitro mediante al menos una molécula del conjugado unida por un enlace covalente a una molécula de albúmina, una molécula de albúmina recombinante o un fragmento de una molécula de albúmina o uno de sus derivados.

[0099] En el sentido de la invención es importante que el «fragmento de una molécula de albúmina» designe a un fragmento de una molécula de albúmina que presenta un tamaño suficiente para garantizar una biodisponibilidad satisfactoria, una permeabilidad frente a los tejidos tumorales y una impermeabilidad frente a la barrera endotelial de los tejidos sanos, del profármaco así generado.

[0100] En esta realización en particular, el acoplamiento in vitro entre un conjugado de fórmula general (I), por su radical L, y una molécula de albúmina, una molécula de albúmina recombinante o un fragmento de una molécula de albúmina puede realizarse con una función reactiva libre y complementaria presente en la molécula de albúmina, la molécula de albúmina recombinante o el fragmento de una molécula de albúmina.

[0101] En una realización en particular, el fragmento de una molécula de albúmina puede comprender la cisteína correspondiente a la cisteína en posición 34 de la secuencia de la albúmina endógena.

[0102] Frente a todo lo esperado, el acoplamiento de un conjugado de fórmula general (I) y de una molécula de albúmina no afecta en nada a la aptitud del profármaco así formado para:

- ser transportado y dirigido de manera específica en el microentorno del tejido para tratar,

- ser escindido en el microentorno del tejido para tratar por una p-glucuronidasa, y

- experimentar, después de la escisión del radical glucuronilo, una reordenación del brazo de enlace de manera que libere el radical que representa un compuesto de la familia de las dolastatinas.

[0103] Además, el acoplamiento entre un conjugado de fórmula general (I), por su radical L, y la función amino, hidroxi o tiol de una molécula de albúmina, en particular endógena, no afecta en nada a la aptitud del compuesto de la familia de las dolastatinas así liberado de ejercer su actividad biológica, es decir, su actividad antimitótica.

[0104] Finalmente, el acoplamiento entre un conjugado de fórmula general (I), por su radical L, y la función amino, hidroxi o tiol de una molécula de albúmina, en particular endógena, limita la eliminación del profármaco en los riñones. La semivida en sangre de un profármaco según la invención se ve así aumentada en comparación con la de un profármaco representado por un compuesto de la familia de las dolastatinas funcionalizado por un radical glucuronilo.

[0105] En otra realización de la invención, la molécula de albúmina, o fragmento de albúmina, del profármaco puede además estar modificado, especialmente por glucosilación o por pegilación.

• Composiciones, usos y procedimientos de tratamiento según la invención

[0106] Según otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos una cantidad eficaz de al menos un conjugado o un profármaco, tal como se define anteriormente.

[0107] Estas composiciones farmacéuticas pueden estar en un estado sólido o líquido y presentarse en todas las formas farmacéuticas usadas normalmente en medicina humana y/o veterinaria, como por ejemplo, en la forma de comprimidos simples o en grageas, píldoras, tabletas, cápsulas duras, gotas, granulados, preparaciones inyectables, pomadas, cremas o geles.

[0108] Estas composiciones farmacéuticas pueden prepararse según los procedimientos habituales. Al principio activo pueden incorporarse los excipientes empleados habitualmente en estas composiciones farmacéuticas, tales como talco, goma arábiga, lactosa, almidón, estearato de magnesio, mantequilla de cacao, vehículos acuosos o no, cuerpos grasos de origen animal o vegetal, derivados de parafinas, glicoles, diversos agentes humectantes, dispersantes o emulsionantes y conservantes.

[0109] La invención se refiere igualmente a un conjugado de fórmula general (I), un profármaco de fórmula general (VI) o una composición farmacéutica, tal como se define en la presente invención, para su uso en la prevención y/o el tratamiento de un cáncer y/o de una enfermedad inflamatoria.

[0110] La invención se refiere también a un procedimiento de tratamiento de un cáncer y/o de una enfermedad inflamatoria que comprende la administración de un conjugado de fórmula general (I), de un profármaco de fórmula general (VI) o de una composición farmacéutica, según la presente invención.

[0111] La invención se refiere también a un procedimiento de tratamiento de un cáncer y/o de una enfermedad inflamatoria que comprende la administración de un conjugado de fórmula (I), de un profármaco de fórmula general (VI) o de una composición farmacéutica según la invención, en asociación con otro tratamiento elegido en un grupo que comprende quimioterapia, radioterapia, tratamiento por al menos un agente antiinflamatorio y combinaciones de los mismos.

• Cáncer

[0112] Puede aplicarse un conjugado de fórmula general (I), un profármaco de fórmula general (VI) o una composición farmacéutica según la presente invención, para su uso en la prevención y/o el tratamiento de un cáncer sólido, elegido preferentemente en un grupo que comprende un neuroblastoma, un glioblastoma, un osteosarcoma, un retinoblastoma, un sarcoma de los tejidos blandos, un cáncer del sistema nervioso central, un nefroblastoma, un cáncer de pulmón, un cáncer de mama, un cáncer de próstata, un cáncer colorrectal, un cáncer de tiroides, un cáncer de cuello de útero, un cáncer de endometrio, un cáncer de ovarios, un cáncer de riñón, un cáncer de hígado, un cáncer cerebral, un cáncer testicular, un cáncer de páncreas, un cáncer de huesos, un cáncer de piel, un cáncer de intestino delgado, un cáncer de estómago, un cáncer de la pleura, un cáncer de esófago, un cáncer de laringe y un cáncer de vejiga.

[0113] En una realización en particular, el cáncer sólido se elige entre un grupo que comprende cáncer de páncreas, cáncer de pulmón y cáncer de mama.

[0114] En una realización en particular puede aplicarse un conjugado de fórmula general (I), un profármaco de fórmula general (VI) o una composición farmacéutica según la presente invención, para su uso en la prevención y/o el tratamiento de metástasis.

• Enfermedades inflamatorias

[0115] En lo que respecta a las enfermedades inflamatorias, se trata especialmente de patologías crónicas del intestino o reumatoides.

• Modos de administración

[0116] Un conjugado de fórmula general (I), un profármaco de fórmula general (VI) o una composición farmacéutica, tal como se describe en la presente invención, pueden administrarse por vía oral, por vía parenteral (subcutánea, intravenosa o intramuscular) o por vía local en aplicación tópica sobre la piel o las mucosas.

[0117] La presente invención tiene por objeto también el uso de conjugados, profármacos o composiciones farmacéuticas, tal como se define anteriormente, para la preparación de medicamentos.

[0118] Dichos medicamentos pueden usarse en solitario o en asociación.

[0119] Los conjugados, profármacos o composiciones farmacéuticas según la presente invención pueden administrarse especialmente en solitario o en asociación con quimioterapia o radioterapia o también en asociación, por ejemplo, con otros agentes terapéuticos, especialmente agentes anticancerosos o agentes antimitóticos e igualmente en asociación con agentes antiinflamatorios.

[0120] La dosis conveniente para la invención puede determinarse según un enfoque aplicado habitualmente en la técnica de forma rutinaria. Su ajuste entra claramente dentro de las competencias generales del experto en la materia.

[0121] De hecho, depende especialmente del peso, la edad, el sexo del individuo para tratar y el estado de avance de la enfermedad para tratar.

EJEMPLOS

Ejemplo 1

Síntesis de un conjugado de fórmula (III) (ver Figura 1)

1) Síntesis del compuesto 1

[0122]

[0123] Se ponen en suspensión 17,9 g (48 mmol; 1 eq.) de glucurónido peracetilado en 36 mL de HBr al 33% en ácido acético. Después de 4 h de agitación, el compuesto de partida se consume totalmente. A continuación, se vierte el medio de reacción en una mezcla de agua y hielo y la fase acuosa obtenida se extrae tres veces con diclorometano. A continuación, se neutraliza la fase orgánica con una solución saturada de NaHCO³, se seca en MgSO⁴y se evapora. Se añaden 3 mL de etanol absoluto al producto en crudo y después se almacena la mezcla una noche en el frigorífico. El precipitado formado se recoge por filtración y después se lava con éter de petróleo. Después de secado al vacío, se aíslan 17,4 g (43,8 mmol; Rdt = 91%) de compuesto 1 en forma de un sólido beis.

2) Síntesis del compuesto 2

[0124]

[0125] En un matraz de tres bocas de 250 mL equipado con un refrigerante y una ampolla de adición, se recubren 648 mg (24 mmol; 6,25 eq.) de aluminio y una cantidad catalítica de HgCh con 10 mL de THF anhidro. Se añaden gota a gota 2 mL (24 mmol; 6,25 eq.) de una solución de bromuro de propargilo al 80% en tolueno. La reacción se inicia cuando se observa desprendimiento de calor y ennegrecimiento de la solución. Cuando termina la adición, se calienta la mezcla a reflujo durante 6 horas. Se enfría la solución a 0°C y se añade una solución de 650 mg (3,84 mmol; 1 eq.) de 4-hidroxi-3-nitro-benzaldehído en 5 mL de THF anhidro gota a gota. Después de 30 minutos de agitación, el aldehído ha desaparecido totalmente y la reacción se hidroliza con 10 mL de una solución de HCl 1 N y después se extrae tres veces con acetato de etilo. Se seca la fase orgánica en MgSO⁴y después se evapora para conducir a un aceite marrón que se purifica por cromatografía de resolución rápida (eluyente: EP/AcOEt 70/30). Entonces se obtiene el compuesto 2 en forma de un aceite amarillo contaminado con cantidades traza de productos derivados de la reacción de Wurtz. Una extracción básica permite eliminar estas impurezas. Para ello, se solubiliza el aceite en 30 mL de diclorometano. Se extrae la fase orgánica tres veces con una solución de NaOH 1 N. Se acidifica la fase acuosa obtenida con una solución de HCl concentrada y después se extrae tres veces con cloroformo para conducir, después de evaporación, al compuesto 2 (754 mg; 3,6 mmol) en forma de un aceite marrón, con un rendimiento del 94%.

3) Síntesis del compuesto 3

[0126]

[0127] Se ponen en suspensión 33,7 g (122,25 mmol; 3,7 eq.) de Ag²CO³en 33 mL de acetonitrilo y se añaden 6,3 mL (23,12 mmol; 0,7 eq.) de HMTTA. Se deja la mezcla en agitación protegida de la luz durante 2 h. Se añaden 4,56 g (22,03 mmol; 1 eq.) de compuesto 2 y 13,10 g (33,04 mmol; 1,5 eq.) de compuesto 1 en solución en 20 mL de acetonitrilo. Se deja la mezcla en agitación durante 4 h y después se añade agua. Esta fase acuosa se extrae tres veces con acetato de etilo. Se lava la fase orgánica tres veces con una solución de HCl 1 M, se seca en MgSO⁴y se evapora. Una purificación por cromatografía de resolución rápida del producto de reacción en crudo (eluyente EP/AcOEt 60/40; 50/50; 40/60) permite obtener 7,62 g (14,56 mmol; rendimiento = 66%) del compuesto 3 en forma de un sólido blanco (2 diastereoisómeros).

4) Síntesis del compuesto 4

[0128]

[0129] Se ponen en solución 180 mg (0,34 mmol; 1 eq.) de alcohol bencílico y 140 mg (0,68 mmol; 2 eq.) de cloroformiato de paranitrofenol en 3,5 mL de diclorometano anhidro. Se añaden 70 pL de piridina (0,87 mmol; 2,5 eq.) gota a gota a 0°C. Después de 1 h de agitación a temperatura ambiente, el producto de partida se consumió completamente. Se hidroliza la reacción con una solución saturada de NaHCO³. Se extrae la fase orgánica con diclorometano. Las fases orgánicas resultantes se secan y se evaporan en seco. Una cromatografía de resolución rápida (60/40 EP/AcOEt) permite aislar 235 mg (0,343 mmol) del compuesto 4 en forma de un sólido blanco con un rendimiento cuantitativo.

5) Síntesis del compuesto 5

[0130]

[0131] El compuesto 4 (57,5 mg; 0,0835 mmol) y la MMAE (60 mg; 1 eq.) se ponen en solución en 2 mL de una mezcla de DMF/piridina(8/2). Se añaden 11,3 mg de HOBt (0,0835 mmol; 1 eq.) y 17 pL de DIPEA (0,1 mmol; 1,2 eq.). La agitación se mantiene 36 h a temperatura ambiente. Se elimina el disolvente al vacío y se purifica el residuo por cromatografía de resolución rápida (eluyente: DCM/MeOH 3%-5%). Se obtienen 70 mg del compuesto 5 (0,055 mmol; 66%) en forma de un sólido blanco.

6) Síntesis del compuesto 6

[0132]

[0133] El compuesto 5 (70 mg; 0,055 mmol) se pone en solución en DCM anhidro (2,8 mL) en presencia del nitrogeniuro de fórmula NH²-(CH²)²-(O-CH²-CH²)¹⁰-N³(37,8 mg; 0,0717 mmol; 1,3 eq). Se añaden 30 mg (0,08 mmol; 1,5 eq.) de Cu(MeCN)⁴PF⁶y se deja la mezcla en agitación durante 20 h a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno. Se añade una solución de EDTA disódico (350 mg en solución en 5,2 mL de una solución de tampón de fosfato 0,2 M) y se mantiene la agitación durante 5 h. La mezcla se extrae 3 veces con diclorometano. Se secan las fases orgánicas en MgSO⁴, se filtran y se evaporan al vacío. El producto en crudo obtenido se purifica en placas

preparatorias (eluyente DCM/MeOH, 2-5%). El compuesto ⁶correspondiente (53 mg; 0,029 mmol) se aísla con un rendimiento del 53,5%. “

7) Síntesis del compuesto de fórmula (III)

[0134]

[0135] El compuesto 6 (53 mg; 0,029 mmol) se pone en solución en el MeOH (2,2 mL) a 0°C. Se añade gota a gota una solución de LOH.H²O (10,6 mg; 0,259 mmol) en 2,2 mL de H²O, enfriada previamente a 0°C. El medio de reacción se mantiene en agitación a esta temperatura. Un seguimiento CCM indica la desaparición del producto de partida después de 15 minutos. A continuación, se realiza la neutralización del medio mediante adición de la resina IRC-50. Después de 30 minutos, se filtra la resina y se evapora el medio de reacción al vacío. El producto en crudo se retoma directamente en el DMSO (0,7 mL) en presencia del compuesto 7 (1,2 eq.; 11 mg). La agitación se mantiene durante 12 h a temperatura ambiente. Después de la evaporación del disolvente al vacío, se purifica el producto de reacción en crudo por HPLC semipreparatoria. Se aíslan así 18 mg de conjugado de fórmula (III) (0,0097 mmol) con una pureza superior al 95% y un rendimiento global del 33% (calculado en 3 etapas click-desprotección-purificación HPLC semipreparatoria).

HRMS (ESI): C⁸⁸H⁴¹N¹¹O³, [M+2H]2+: teórico: 923,9638; encontrado: 923,9892

8) Seguimiento HPLC

[0136] El seguimiento de la reacción y el análisis de los compuestos se realizaron en un aparato HPLC DIONEX Ultimate 3000 equipado con un detector UV de cuádruples longitudes de onda y con una columna DIONEX Acclain® 120 (C18, 5 |jm, 120 Á) en un compartimento regulado por termostato a 30°C. Los cromatogramas se registran a 220 y 254 nm. La integración se garantiza mediante el software Chromeleon versión 6.80 SP1 Build 2238. Los eluyentes son compuestos de A (H²O TFA 0,2%), B (CH³CN).

Ejemplo 2

Evaluación de la eficacia terapéutica del conjugado de fórmula (III) in vivo en un modelo murino de cáncer de páncreas humano

1) Materiales y métodos

a) Animales usados

[0137] Se evaluó la eficacia terapéutica del conjugado de fórmula (III), tal como se sintetizó según el protocolo de reacción descrito en el ejemplo 1, en ratones hembra Swiss Nude de 6 semanas de vida (Laboratoires Charles River France, L'Arbresle). Se aclimató a los animales durante 7 días en el laboratorio antes del experimento. Se alojó a los ratones en el interior de jaulas de plástico equipadas con tapas filtrantes (Filtro HEPA), dentro de una gradilla ventilada, alojados a una temperatura de 20 ± 2°C con un ciclo de luz-oscuridad de 12/12 horas, con un acceso libre al agua y al alimento ad libitum.

b) Tumor humano de páncreas de tipo Mia Paca injertado en ortotópico

[0138] Las células Mia Paca 2 provienen de un adenocarcinoma pancreático de un hombre de 65 años. El linaje

celular Mia Paca 2 de cáncer de páncreas fue suministrado por la American Type Culture Collection (Rockville, MD). Estas células se eligieron porque permiten generar tumores de naturaleza hipóxica, reflejo de la situación patológica clínica.

[0139] Estas células fueron modificadas para expresar el gen de la luciferasa (Mia PaCa 2-Luc). Se cultivaron las células en matraces de 75 cm³y se mantuvieron en una incubadora humidificada a 37 °C en el 5% de CO²con Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado con el 10% de suero de ternera fetal, el 2,5% de suero de caballo, el 1% de L-glutamina y el 1% de penicilina y de estreptomicina.

[0140] Para las implantaciones, se desinfectaron los abdómenes de los ratones con una solución de povidona yodada (Betadine®, ASTA Medica, Bélgica). Se realizó una incisión de 1 cm en el cuadrante superior izquierdo del abdomen. Se asió el extremo de la cola del páncreas y se externalizó con suavidad el páncreas, así como el bazo en una dirección lateral para dejarlos plenamente expuestos. La aguja se introdujo en la cola del páncreas y se colocó hasta la región de la cabeza del páncreas. Las 2 x 106 células Mia PaCa 2-Luc en 50 pL de PBS se inyectaron lentamente con ayuda de una aguja de calibre 27. A continuación se volvió a colocar el bazo en la posición apropiada en el abdomen y se suturaron la piel y el peritoneo con un hilo reabsorbible de diámetro 5,0. Se trató el dolor de los animales con un analgésico opioide (microgránulos de Skenan LP 10 mg, Bristol-Myers Squibb).

c) Modalidades de tratamiento

[0141] Los ratones (6 animales por grupo) recibieron un tratamiento 7 días después de las implantaciones tumorales. Las inyecciones intravenosas se efectuaron una vez por semana durante 2 semanas con dosis de 2 mg/kg y de 4 mg/kg de MmAE bifuncionalizada (conjugado de fórmula (III), D⁷y D¹⁴). Los grupos de control se trataron bien con MMAE en solitario con una dosis de 0,3 mg/kg o bien con el excipiente constituido por una mezcla de DMSO y PBS (5%/95%; control).

[0142] Se llevó un seguimiento de la evolución del volumen tumoral mediante ecocardiografía. Las medidas se realizaron con el sistema VisualSonics Vevo™ 2100, un sistema de imagenología in vivo de alta resolución (VisualSonics™ Inc., Toronto, Canadá) en los días 3, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 21, 23, 28, 38, 52, 66 y 78.

2) Resultados

[0143] La Figura 2 ilustra la evolución del volumen tumoral durante 70 días. Se observa un aumento significativo del volumen tumoral a partir del 35° día para el control y la MMAE no funcionalizada. Así, la MMAE no funcionalizada no está adaptada para el tratamiento de un tumor de páncreas. Cuando los ratones reciben 2 inyecciones (D⁷y D¹⁴) de 2 mg/kg de MMAE bifuncionalizada, es decir, un conjugado de fórmula (III), la progresión del volumen tumoral es más lenta que con el control o la MMAE no funcionalizada. Por el contrario, la administración de 2 inyecciones (D⁷y D¹⁴) de una dosis de 4 mg/kg tiene como consecuencia la ausencia total de crecimiento del tumor. Ejemplo 3 Evaluación de la eficacia terapéutica del conjugado de fórmula (III) in vivo en un modelo murino de cáncer de páncreas humano

1) Materiales y métodos

a) Animales usados

[0144] Se evaluó la eficacia terapéutica del conjugado de fórmula (III), tal como se sintetiza según el protocolo de reacción descrito en el ejemplo 1, en ratones hembra Balb/c Nude de 6 semanas de vida (Laboratoires Charles River France - L'Arbresle) como se indica anteriormente en el ejemplo 2.

b) Tumor humano de páncreas de tipo Mia Paca injertado en ortotópico

[0145] El tumor humano de páncreas de tipo Mia Paca injertado en ortotópico es tal como se describe en el ejemplo 2.

c) Modalidades de tratamiento

[0146] Los ratones (5 animales por grupo) recibieron un tratamiento cuando los volúmenes tumorales alcanzaron un tamaño comprendido entre 2,5 y 3,5 cm3, es decir, volúmenes representativos de la situación en el hombre en el que los cánceres de páncreas se detectan de manera tardía en la mayor parte de los casos. Las inyecciones intravenosas del conjugado MMAE bifuncionalizado, es decir, el conjugado de fórmula (III) (sintetizado según el protocolo de reacción descrito en el ejemplo 1) se aplicaron una vez por semana durante 9 semanas con una dosis de 4 mg/kg. El grupo de control fue tratado con el excipiente constituido por una mezcla de DMSO y PBS (5% / 95%). La evolución del volumen tumoral se siguió mediante ecocardiografía, como se describe en el ejemplo 2. 2) Resultados

[0147] La Figura 3 ilustra la evolución del volumen de un tumor de páncreas de tipo MIA-PaCa injertado en ortotópico seguido por ecocardiografía durante 80 días.

[0148] Puede observarse una regresión del volumen de los tumores comprendida entre el 92 y el 100% en los ratones tratados con el conjugado de fórmula (III) (panel A) mientras que los animales no tratados por el conjugado de fórmula (III) (vehículo, correspondiente al excipiente DMSO/PBS; panel B) sucumbieron todos en los veinte días posteriores al inicio del protocolo terapéutico.

Ejemplo 4

Evaluación de la eficacia terapéutica del conjugado de fórmula (III) in vivo en un modelo murino de cáncer de mama humano

1) Materiales y métodos

a) Animales usados

[0149] La eficacia terapéutica del conjugado de fórmula (III), sintetizado según el protocolo de reacción descrito en el ejemplo 1, se evaluó en ratones hembra Balb/c Nude de 6 semanas de vida (Laboratoires Charles River France - L'Arbresle) tal como se indica en el ejemplo 3.

b) Tumor humano de mama de tipo MDA-MB-231 injertado en ortotópico

[0150] Las células MDA-MB-231 provienen de un adenocarcinoma mamario de una mujer de 51 años. El linaje celular MDA-MB-231 de cáncer de mama fue suministrado por Caliper LifeSciences (Roissy, Francia). Estas células se eligieron porque permiten generar tumores de naturaleza hipóxica, reflejo de la situación patológica clínica.

[0151] Estas células se modifican para expresar el gen de la luciferasa. Las células se cultivaron en matraces de 75 cm³y se mantuvieron en una incubadora humidificada a 37°C en una atmósfera constituida por aire con Eagle Minimal Essential Medium (EMEM) suplementado con el 10% de suero de ternera fetal, el 1% de L-glutamina, el 1% de piruvato de sodio, el 1% de aminoácidos no esenciales, el 2% de bicarbonato de sodio y el 1% de penicilina y de estreptomicina.

[0152] Para las implantaciones, se desinfectaron los abdómenes de los ratones con una solución de povidona yodada (Betadine®, ASTA Medica, Bélgica). La aguja se introdujo en el espacio subcutáneo, en la ubre inferior izquierda. Las 2 x 10⁶células MDA-MB-231-Luc en 100 pL de PBS se inyectaron lentamente con ayuda de una aguja de calibre 27. A continuación se retiró la aguja lentamente. Para ello se anestesió a los ratones por inhalación de isoflurano (2% en aire).

c) Modalidades de tratamiento

[0153] Los ratones (6 animales por grupo) recibieron un tratamiento 15 días después de las implantaciones tumorales. Las inyecciones intravenosas se aplicaron una vez por semana durante 5 semanas con dosis de 4 mg/kg conjugado de fórmula (III) (D¹⁵, D²², D²⁹, D³⁶y D⁴³). Los grupos de control se trataron bien con MMAE en solitario con una dosis de 0,3 mg/kg o bien con excipiente constituido por una mezcla de DMSO y PBS (5% / 95%).

[0154] La evolución del volumen tumoral se siguió mediante ecocardiografía 3D. Las medidas se realizaron tal como se describe en el ejemplo 2, los días 7, 11, 15, 19, 22, 25, 27, 29, 32, 34, 36, 39, 43 y 50.

2) Resultados

[0155] La figura 4 ilustra la evolución del volumen de un tumor humano de mama de tipo MDA-MB-231 injertado en ortotópico seguido por ecocardiografía durante 50 días.

[0156] Puede observarse una regresión total y duradera del tumor en los animales tratados con el conjugado de fórmula (III) (4 mg/kg) (panel C) mientras que la MMAE libre (panel B) solo conduce a una actividad antitumoral muy modesta en comparación con los animales de control (panel A). Estos resultados se obtuvieron sin efectos secundarios visibles en el grupo de ratones que recibieron el conjugado de fórmula (III).

REFERENCIAS

Documentos de tipo patente

[0157]

US 7.829.531

WO 2011/145068

Documentos de tipo distinto a patente

[0158] Kolb y col. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew. Chem. Int. Ed. 2001, vol 40(11), 2004-2021.

[0159] Kratz y col. Probing the cysteine-34 position of endogenous serum albumin with thiol-binding doxorubicin derivatives. Improved efficacy of an acid-sensitive doxorubicin derivative with specific albumin-binding properties compared to that of the parent compound. J. Med. Chem. 2002, vol 45, 5523-5533.

[0160] Legigan y col. The first generation of p-galactosidase-responsive prodrugs designed for the selective treatment of solid tumors in prodrug monotherapy. Angew. Chem. Int. Ed. 2012, vol 51, 11606-11610.

[0161] Legigan y col. Synthesis and antitumor efficacy of a p-glucuronidase-responsive albumin-binding prodrug of doxorubicin. J. Med. Chem. 2012, vol 55, 4516-4520.

[0162] Legigan y col. Synthesis and biological evaluations of monomethylauristatin E glucuronide prodrug for selective cancer chemotherapy. Eur. J. Med. Chem. 2013, vol 67, 75-80.

[0163] Teming y col. Evaluation of RGD-targeted albumin carriers for specific delivery of auristatin E to tumor blood vessels. Bioconjugate Chem. 2006, vol 17, 1385-1394.

[0164] Tranoy-Opalinski y col. p-glucuronidase-responsive prodrugs for selective cancer chemoterapy: an update. Eur. J. Med. Chem., 2014, vol 74, 302-313.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Conjugado de fórmula general (I):

5

en la que:

- A representa la monometilauristatina E (MMAE),

10 - L representa una unidad de maleimidocaproilo,

- G comprende y preferentemente representa un radical glucuronilo o uno de sus derivados,

15 - Z representa un radical separador de hidrocarburo que comprende en cada uno de sus extremos funciones de enlaces covalentes,

- X representa -O- o -NR3COO-, con R3 que puede representar un átomo de hidrógeno o un radical alquilo C¹-C¹⁰, lineal o ramificado, saturado o insaturado, estando el enlace con el radical G asegurado por el átomo de oxígeno (-O), 20 uno de sus isómeros y/o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

2. Conjugado según la reivindicación 1, en el que Y representa NO²en posición orto de X, y R¹y R²representan H.

3. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que Z representa un radical Z¹-Z²-(Z³)^m, en el que: 25 - m representa 0 o 1

- Z¹representa una función de enlace L-click entre el carbono que lleva las funciones R¹y R², y la función Z², - Z²representa un grupo alquileno C¹-C¹⁰, lineal o ramificado, saturado o insaturado, opcionalmente interrumpido por uno o varios heteroátomos elegidos entre O o N, un radical glucosilo, un radical O-(CHR⁴-CHR⁵-O-)^po N-(CHR⁴-CHR⁵-O-)^pen los que p representa un número entero natural comprendido entre 1 y 20, y R⁴y R⁵representan, 30 independientemente entre sí, H o CH³, con la salvedad de que R⁴y R⁵no representan simultáneamente CH³, un grupo obtenido de un aminoácido o un péptido, o una combinación de estos grupos, de manera que un extremo de Z²forma un enlace covalente con L, ya sea directamente por una función éter o indirectamente por una función Z³,

- Z³representa una función de tipo éster, amida, éter, carbamato o carbonato establecido entre la función Z²y el radical L.

35

4. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, de la fórmula (III) siguiente:

40 siendo p tal como se define en la reivindicación 3,

uno de sus isómeros y/o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

5. Profármaco que comprende al menos una molécula del conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, estando dicha molécula del conjugado unida por un enlace covalente a una molécula de albúmina o uno de sus fragmentos o derivados.

6. Profármaco según la reivindicación 5, en el que el enlace covalente se establece con la función tiol de la cisteína en posición 34 de la albúmina endógena.

7. Profármaco según cualquiera de las reivindicaciones 5 y 6, que tiene como fórmula la fórmula (VII) siguiente:

uno de sus isómeros y/o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

8. Composición farmacéutica que comprende al menos una cantidad eficaz de al menos un conjugado tal como se define según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o un profármaco tal como se define según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.

9. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para su uso en la prevención y/o el tratamiento de un cáncer y/o de una enfermedad inflamatoria.

10. Profármaco según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, para su uso en la prevención y/o el tratamiento de un cáncer y/o de una enfermedad inflamatoria.

11. Composición según la reivindicación 8, para su uso en la prevención y/o el tratamiento de un cáncer y/o de una enfermedad inflamatoria.