ES2843654T3

ES2843654T3 - Composiciones de interferencia por ARN y métodos para tumores malignos

Info

Publication number: ES2843654T3
Application number: ES15874366T
Authority: ES
Inventors: Wenbin Ying; Yoshiro Niitsu; Kenjirou Minomi; Bharat Majeti; Li Wang; Jihua Liu; Roger Adami
Original assignee: Nitto Denko Corp
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 2014-12-26
Filing date: 2015-12-28
Publication date: 2021-07-20
Anticipated expiration: 2035-12-28

Abstract

Composición que comprende moléculas de iARN dirigidas a una GST-p humana, moléculas de iARN dirigidas a una p21 humana codificada por un gen CDKN1A, y un portador farmacéuticamente aceptable.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones de interferencia por ARN y métodos para tumores malignos

Campo técnico de la invención

Esta invención se refiere a los campos de biofármacos y agentes terapéuticos que se componen de moléculas basadas en ácido nucleico. Más particularmente, esta invención se refiere a métodos y a composiciones para administrar agentes de interferencia por ARN para prevenir, tratar o mejorar los efectos de estados y enfermedades que implican tumores malignos.

Antecedentes de la invención

La mutación de un gen KRAS puede relacionarse con tumores malignos, tales como adenocarcinoma de pulmón, adenoma mucinoso, carcinoma ductal del páncreas y carcinoma colorrectal. Observaciones recientes indican que niveles elevados de la proteína glutatión S-transferasa-rc (GST-rc) se asocia con tales mutaciones de KRAS.

Sin desear estar ligado a ninguna teoría particular, se ha encontrado que tras la supresión de GST-rc en las células, el nivel de la proteína p21 que regula el ciclo celular puede ser sorprendentemente elevado.

Una de las funciones de la proteína p21 que regula el ciclo celular es inhibir la apoptosis. Por ejemplo, p21 puede tener el efecto de proteger una célula de la apoptosis inducida por un agente quimioterápico, tanto in vitro como in vivo. Véanse, por ejemplo, Gartel y Tyner, 2002, Mol Cancer Ther., 2002, 1(8): 639-49; Abbas y Dutta, 2009, Nat Rev Cancer., 2009, 9(6): 400-14. p21 está codificado por el gen CDKN1A y pertenece a la familia CIP/KIP. p21 puede funcionar para inhibir la progresión del ciclo celular en la fase G1 y la fase G2/M al unirse a un complejo ciclina-CDK. Por ejemplo, el gen p21 experimenta activación por p53, un gen supresor de tumores. Tras la activación de p53 debido al daño del ADN, p53 activa p21 de modo que el ciclo celular se detiene en la fase G1 y la fase G2/M.

GST-rc es un miembro de la familia de seis isoenzimas de la glutatión S-transferasa (IUBMB EC 2.5.1.18) que desempeñan un papel en la destoxificación catalizando la conjugación de compuestos hidrófobos y electrófilos con glutatión reducido. El gen GST-rc (GSTP1) es un gen polimórfico que codifica para proteínas variantes GSTP1 activas y funcionalmente diferentes que se cree que funcionan en el metabolismo xenobiótico. GSTP1 puede desempeñar un papel en la susceptibilidad al cáncer y se expresa abundantemente en las células tumorales. Véase, por ejemplo, Aliya S. et al. Mol Cell Biochem., Noviembre de 2003; 253(1-2):319-327. La glutatión S-transferasa-^ es una enzima que en los humanos está codificada por el gen GSTP1. Véase, por ejemplo, Bora PS et al. (octubre de 1991) J. Biol. Chem., 266 (25): 16774-16777. Se ha demostrado que la isoenzima GST-rc cataliza la conjugación de GSH con algunos antineoplásicos alquilantes, lo que sugiere que la sobreexpresión de GST-rc daría como resultado la resistencia de las células tumorales.

Se observaron niveles elevados de GST-rc en suero en pacientes con diversas neoplasias malignas gastrointestinales, incluyendo cánceres de estómago, de esófago, de colon, de páncreas, hepatocelular y de las vías biliares. Más del 80% de los pacientes con cáncer de estómago en estadio III o IV e incluso alrededor del 50% de aquellos con estadio I y II tenían niveles elevados de GST-rc en suero. Véase, por ejemplo, Niitsu Y, et al. Cancer, 15 de enero de 1989; 63(2):317-23. Se encontró que GST-rc es un marcador útil para predecir la recidiva de tumores en pacientes con cáncer de boca después de la quimioterapia. Véase, por ejemplo, Hirata S. et al. Cancer, 15 de noviembre de 1992:70(10):2381-7.

En el cáncer colorrectal humano, la mutación de KRAS parece inducir la sobreexpresión de GST-rc mediante la activación de AP-1. Véase, por ejemplo, Miyanishi et al., Gastroenterology, 2001; 121 (4):865-74.

La expresión de GST-rc aumenta en diversas células cancerosas, lo que puede estar relacionado con la resistencia a algunos antineoplásicos. Véanse, por ejemplo, Ban et al., Cancer Res., 1996, 56(15):3577-82; Nakajima et al., J Pharmacol Exp Ther., 2003, 306(3):861-9.

Se han divulgado agentes para suprimir GST-rc para inducir apoptosis en células. Sin embargo, tales composiciones y técnicas también provocaron autofagia y requirieron la acción combinada de diversos agentes. Véase, por ejemplo, el documento US 2014/0315975 A1. Además, no se ha encontrado que la supresión de GST-rc disminuya o reduzca los tumores. Por ejemplo, en un cáncer que sobreexpresaba GST-rc, los pesos de los tumores no se vieron afectados por la supresión de GST-rc, aunque se observaron otros efectos. Véase, por ejemplo, Hokaiwado et al., Carcinogenesis, 2008, 29(6):1134-1138.

Existe la necesidad urgente de métodos y composiciones para desarrollar terapias para pacientes con neoplasias malignas, tales como secuencias de ARNip, compuestos y estructuras para la inhibición de la expresión de GST-rc y Lo que se necesita son métodos y composiciones para prevenir o tratar tumores malignos. Existe la necesidad continua de moléculas de iARN y otras estructuras y composiciones para prevenir, tratar o reducir tumores malignos.

Breve sumario

Esta invención proporciona composiciones y métodos para moléculas de iARN que se dirigen a GST-rc humana, en combinación con moléculas de iARN dirigidas a p21 humana, codificadas por el gen CDKN1A. Las composiciones incluyen un portador farmacéuticamente aceptable. La p21 humana según la invención tal como se describe a continuación está codificada por el gen CDKN1A.

Esta invención se refiere a moléculas y composiciones de las mismas para su uso en biofármacos y agentes terapéuticos para tumores malignos. Más particularmente, esta invención se refiere a compuestos, composiciones y métodos para proporcionar nanopartículas para administrar y distribuir agentes activos o compuestos farmacológicos a células, tejidos, órganos y sujetos que tienen tumores malignos.

Se incluyen composiciones según la invención para su uso en métodos para prevenir, tratar o mejorar uno o más síntomas de un tumor maligno en un sujeto que lo necesita. El método puede implicar administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición de moléculas de iARN dirigidas a GST-rc y p21.

Las realizaciones de esta invención incluyen las siguientes:

una composición que comprende moléculas de iARN dirigidas a GST-rc humana, moléculas de iARN dirigidas a p21 humana, y un portador farmacéuticamente aceptable. Las moléculas de iARN pueden contener un 2'-desoxinucleótido en una o más de posiciones 2 a 8 desde el extremo 3' de la cadena antisentido.

El portador puede incluir nanopartículas liposómicas que encapsulan las moléculas de iARN. Las nanopartículas liposómicas pueden encapsular las moléculas de iARN y conservar al menos el 80% de las moléculas de iARN encapsuladas después de 1 hora de exposición a suero humano. Las nanopartículas liposómicas pueden tener un tamaño de 10 a 1000 nm, o de 10 a 150 nm.

La composición puede ser activa para tratar un tumor maligno, que puede ubicarse en cualquier órgano o tejido, incluyendo pulmón, colon, riñón, páncreas, hígado, hueso, piel o intestino.

La nanopartículas liposómicas pueden componerse de un lípido ionizable, un lípido estructural, uno o más lípidos estabilizadores, y un lípido para reducir la inmunogenicidad de las nanopartículas. El lípido ionizable puede seleccionarse del grupo del compuesto 81, compuesto 71, compuesto 57, compuesto 84, compuesto 49, compuesto 76, compuesto 78 y compuesto 102.

Esta invención contempla además composiciones según la invención para su uso en métodos para prevenir, tratar o mejorar uno o más síntomas de un tumor maligno en un sujeto que lo necesita. El método puede implicar la administración al sujeto de una cantidad eficaz de una composición anterior.

En algunas realizaciones, el tumor maligno puede asociarse con mutación de KRAS, comprendiendo el método además identificar una célula tumoral en el sujeto, comprendiendo la célula tumoral al menos uno de: (i) una mutación del gen KRAS, y (ii) un nivel de expresión aberrante de proteína KRAS.

En determinadas realizaciones, el tumor maligno puede sobreexpresar GST-rc.

Las moléculas de iARN pueden disminuir la expresión de GST-rc y p21 en el sujeto. En algunas realizaciones, la administración puede disminuir la expresión de GST-rc y p21 en el sujeto en al menos el 5% durante al menos 5 días. La administración puede disminuir el volumen del tumor maligno en el sujeto en al menos el 5%, o al menos el 10%, o al menos el 20%, o al menos el 30%, o al menos el 40%, o al menos el 50%. El método puede reducir uno o más síntomas del tumor maligno, o retrasar o terminar la progresión del tumor maligno.

En determinadas realizaciones, la administración puede reducir el crecimiento de células tumorales malignas en el sujeto. La administración puede reducir el crecimiento para al menos el 2%, o al menos el 5%, o al menos el 10%, o al menos el 15%, o al menos el 20% de las células tumorales malignas en el sujeto.

En algunos aspectos, el tumor maligno puede ser cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer de riñón, cáncer de pulmón, cáncer de mama, fibrosarcoma, adenocarcinoma de pulmón, adenoma mucinoso, carcinoma ductal del páncreas o carcinoma colorrectal.

Las realizaciones de esta invención pueden proporcionar composiciones según la invención para su uso en métodos en los que la administración se realiza desde 1 hasta 12 veces por día. La administración puede realizarse durante una duración de 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 días, o durante una duración de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 ó 12 semanas.

En algunas realizaciones, la administración puede ser una dosis de desde 0,01 hasta 2 mg/kg de las moléculas de iARN al menos una vez por día durante un periodo de hasta doce semanas. En realizaciones adicionales, la administración puede proporcionar una AUC(0-última) media de desde 1 hasta 1000 ug*min/ml y una Cmáx media de desde 0,1 hasta 50 ug/ml para la molécula de iARN de GST-rc. En determinadas realizaciones, la administración puede proporcionar una AUC(0-última) media de desde 1 hasta 1000 ug*min/ml y una Cmáx media de desde 0,1 hasta 50 ug/ml para la molécula de iARN de p21.

Los métodos de administración pueden ser inyección intravenosa, inyección intradérmica, inyección subcutánea, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, oral, tópica, infusión o inhalación.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: la figura 1 muestra una reducción profunda de tumores de xenoinjerto de cáncer in vivo usando una formulación de ARNip de GST-rc y p21 de esta invención. Los ARNip de GST-rc y p21 proporcionaron potencia de atenuación génica in vivo cuando se administraron en una formulación liposómica a los tumores de xenoinjerto de cáncer. Se utilizó un modelo de xenoinjerto de cáncer con una dosis relativamente baja a 1,15 mg/kg para el ARNip de GST-rc y 0,74 mg/kg para el ARNip de p21. La formulación de ARNip de GST-rc y p21 mostró una eficacia de inhibición del tumor significativa a los pocos días después de la administración. Después de 30 días, los ARNip de GST-rc y p21 mostraron una eficacia de inhibición del tumor marcadamente ventajosa, con un volumen del tumor reducido en más de 2 veces en comparación con el control.

Figura 2: la figura 2 muestra una reducción profunda de tumores de xenoinjerto de cáncer in vivo usando una formulación de ARNip de GST-rc y p21 de esta invención. Los ARNip de GST-rc y p21 proporcionaron potencia de atenuación génica in vivo cuando se administraron en una formulación liposómica a los tumores de xenoinjerto de cáncer. Se utilizó un modelo de xenoinjerto de cáncer con una dosis relativamente baja a 0,75 mg/kg para cada ARNip. La formulación de ARNip de GST-rc y p21 mostró una eficacia de inhibición del tumor significativa a los pocos días después de la administración. Después de 30 días, los ARNip de GST-rc y p21 mostraron una eficacia de inhibición del tumor marcadamente ventajosa, con un volumen del tumor reducido en 1,7 veces en comparación con el control.

Figura 3: la figura 3 muestra que las formulaciones de ARNip de GST-rc y p21 de esta invención demostraron una muerte de células cancerosas por apoptosis de células cancerosas in vitro. Se monitorizó la apoptosis de células cancerosas in vitro observando la regulación por incremento de PUMA, un biomarcador para apoptosis, que se asocia con la pérdida de viabilidad celular. Tal como se muestra en la figura 3, el nivel de expresión de PUMA para una formulación de ARNip de GST-rc y p21 se aumentó mucho a partir de aproximadamente 2-4 días desde la transfección de los ARNip de GST-rc y p21.

Figura 4: la figura 4 muestra la reducción profunda de tumores de cáncer de pulmón ortotópicos in vivo mediante un ARNip de esta invención que selecciona como diana GST-rc. El ARNip de GST-rc se administró en una formulación liposómica a una dosis de 2 mg/kg a ratones desnudos atímicos que presentaban tumores de cáncer de pulmón ortotópicos A549. Los pesos finales de los tumores primarios se midieron en la necropsia para el grupo de tratamiento y un grupo de control de vehículo. El ARNip de GST-rc mostró una eficacia significativa para la inhibición de tumores de cáncer de pulmón en este estudio de seis semanas. Tal como se muestra en la figura 4, después de 43 días, el ARNip de GST-rc mostró una inhibición del tumor marcadamente ventajosa, con presos promedio finales de los tumores primarios significativamente reducidos en 2,8 veces, en comparación con el control.

Figura 5: la figura 5 muestra eficacia de inhibición del tumor in vivo para un ARNip de GST-rc. Se utilizó un modelo de xenoinjerto de cáncer usando células A549 con una dosis relativamente baja de ARNip a 0,75 mg/kg. El ARNip de GST-rc mostró una inhibición del tumor ventajosa a los pocos días. Después de 36 días, el ARNip de GST-rc mostró inhibición del tumor marcadamente ventajosa, con volúmenes promedio finales de los tumores significativamente reducidos en aproximadamente 2 veces, en comparación con el control.

Figura 6: la figura 6 muestra que un ARNip de GST-rc de esta invención aumentó mucho la muerte de células cancerosas por apoptosis in vitro. El ARNip de GST-rc provocó regulación por incremento de PUMA, un biomarcador para la apoptosis, que se asocia con la pérdida de viabilidad celular. En la figura 6, la expresión de PUMA se aumentó mucho a partir de 2-6 días después de la transfección del ARNip de GST-rc.

Figura 7: la figura 7 muestra que un ARNip de GST-rc de esta invención proporcionó eficacia de atenuación para tumores de xenoinjerto A549 in vivo. Se observó atenuación dependiente de la dosis de ARNm de GST-rc en ratones hembra (nu/nu) desnudos atímicos (Charles River) con el ARNip que selecciona como diana GST-rc. Tal como se muestra en la figura 7, a una dosis de 4 mg/kg, se detectó reducción significativa de aproximadamente el 40% en ARNm de GST-rc 24 horas después de la inyección.

Descripción detallada de la invención

Esta divulgación proporciona compuestos y composiciones para su uso en combinaciones terapéuticas para la administración a tumores malignos. En algunos aspectos, esta divulgación se refiere a compuestos, composiciones y métodos para proporcionar nanopartículas para administrar y distribuir agentes activos o compuestos farmacológicos a células tumorales malignas, así como a tejidos, órganos y sujetos que tienen tumores malignos.

Esta divulgación proporciona una gama de compuestos ionizables para administrar los agentes activos a células de tumores malignos. Entre otros usos, los compuestos ionizables de esta divulgación pueden usarse para formar nanopartículas para administrar y distribuir agentes activos para mejorar tumores malignos.

Los aspectos de esta divulgación incluyen una amplia gama de compuestos que tienen propiedades similares a los lípidos, y tales compuestos pueden usarse para administrar agentes activos para su captación en células tumorales malignas.

Las composiciones y métodos de esta divulgación pueden usarse para distribuir agentes para suprimir la expresión génica. Los ejemplos de un agente para suprimir la expresión génica incluyen moléculas de ácido nucleico inhibidoras, incluyendo ribozimas, ácidos nucleicos antisentido y moléculas de interferencia por ARN (moléculas de iARN).

En otro aspecto, esta divulgación proporciona métodos para utilizar composiciones terapéuticas que disminuyen la expresión de una molécula de ácido nucleico o polipéptido GST-rc y una molécula de ácido nucleico o polipéptido p21 para el tratamiento de una neoplasia en un sujeto, en donde la neoplasia está asociada con células que contienen una mutación de KRAS o que muestran niveles de expresión de KRAS aberrantes.

Las composiciones terapéuticas de esta divulgación pueden incluir moléculas de ácido nucleico inhibidoras tales como ARNip, ARNhc y ARN antisentido, así como ARN dirigido por ADN (ddARN), ARN que interactúa con Piwi (piARN) y ARNip asociados a repeticiones (rasiARN).

Un tumor maligno asociado a KRAS o cáncer asociado a KRAS se define en el presente documento como (a) una célula cancerosa o una célula tumoral que contiene una mutación somática de KRAS, o (b) una célula cancerosa o una célula tumoral con un nivel de expresión anómalo de KRAS incluyendo, pero sin limitarse a amplificación del ADN que codifica para KRAS, o sobreexpresión del gen KRAS, o subexpresión del gen KRAS en comparación con el nivel encontrado en células normales no cancerosas.

GST-rc indica una enzima, que está codificada por el gen GSTP1 y cataliza la conjugación de glutatión. GST-rc está presente en diversos animales, incluyendo los humanos, y su información de secuencia se conoce y se proporciona en los números de registro de la base de datos del NCBI (por ejemplo, humano: NP_000843 (NM_000852), rata: NP_036709 (NM_012577), ratón: NP_038569 (NM_013541), etc.

Esta divulgación abarca moléculas de iARN para suprimir el ADN que codifica para GST-rc, ribozimas, ácidos nucleicos antisentido, polinucleótidos quiméricos de ADN/ARN y vectores para expresarlos, y variantes negativas dominantes de GST-rc.

p21 está presente en diversos animales, incluyendo los humanos, y su información de secuencia también se conoce públicamente (por ejemplo, humano: NM_000389.4, NM_078467.2, NM 001291549.1, NM 001220778.1, NM 001220777.1 (NP_001207707.1, NP_001278478.1, NP_001207706.1, NP_510867.1, NP_000380.1), etc.; los números representan los números de registro de la base de datos NCBI, y la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos se indican fuera y dentro de los paréntesis, respectivamente). Como ejemplo, la secuencia de nucleótidos del gen CDKN1A humano está registrada en la base de datos como NM_000389.4. En cuanto a p21, la información de secuencia se ha registrado con una pluralidad de números de registro tal como se mencionó anteriormente, y están presentes una pluralidad de variantes de transcripto.

Esta divulgación abarca moléculas de iARN para suprimir el ADN que codifica para p21, ribozimas, ácidos nucleicos ^{antisentido, polinucleótidos quiméricos de}aDn/ARN ^{y vectores para expresarlos, y variantes negativas dominantes}de p21.

En general, después de que se diagnostica que un sujeto tiene una neoplasia, por ejemplo, cáncer de pulmón, cáncer de riñón o cáncer de páncreas, asociado con una mutación de KRAS o una amplificación de KRAS, se selecciona un método de tratamiento que implica la supresión de GST-rc y p21.

Los ejemplos de un agente que suprime GST-rc tal como se usa en el presente documento incluyen un fármaco que suprime la producción y/o actividad de GST-rc, y un fármaco que promueve la degradación y/o inactivación de GST-rc. Los ejemplos del fármaco que suprime la producción de GST-rc incluyen una molécula de iARN, una ribozima, un ácido nucleico antisentido, un polinucleótido quimérico de ADN/ARN para el ADN que codifica para GST-rc o un vector que expresa el mismo.

Los ejemplos de un agente que suprime p21 tal como se usa en el presente documento incluyen un fármaco que suprime la producción y/o actividad de p21, y un fármaco que promueve la degradación y/o inactivación de p21. Los ejemplos del fármaco que suprime la producción de p21 incluyen una molécula de íaRn , una ribozima, un ácido nucleico antisentido, un polinucleótido quimérico de ADN/ARN para el ADN que codifica para p21 o un vector que expresa el mismo.

Moléculas de iARN

Un experto en la técnica entendería que una secuencia informada puede cambiar a lo largo del tiempo e incorporar cualquier cambio necesario en las moléculas de ácido nucleico en el presente documento por consiguiente.

Los aspectos de esta divulgación pueden proporcionar composiciones y métodos para el atenuación génica de la expresión de GST-rc usando moléculas de ácido nucleico.

Los aspectos de esta divulgación pueden proporcionan composiciones y métodos para silenciamiento génico de expresión de p21 usando moléculas de ácido nucleico.

Los aspectos de esta divulgación pueden proporcionan composiciones y métodos para silenciamiento génico de una combinación de expresión de GST-rc y p21 usando moléculas de ácido nucleico.

Los ejemplos de moléculas de ácido nucleico capaces de mediar la interferencia por ARN incluyen moléculas activas en la interferencia por ARN (moléculas de iARN), incluyendo un ARN dúplex tal como un ARNip (ARN de interferencia ^{pequeño), miARN (micro}aRn), ^{ARNhc (ARN en horquilla corto), ddARN (ARN dirigido por}AdN), ^{piARN (ARN que}interactúa con Piwi) o rasiARN (ARNip asociado a repeticiones) y formas modificadas de los mismos.

La composición y los métodos divulgados en el presente documento también pueden usarse en el tratamiento de diversas clases de tumores malignos en un sujeto.

Las moléculas de ácido nucleico y métodos de esta divulgación pueden combinarse, o usarse en combinación para regular por disminución la expresión de genes que codifican para GST-rc, y para regular por disminución la expresión de genes que codifican para p21.

Las composiciones y los métodos de esta divulgación pueden incluir una o más moléculas de ácido nucleico, que en combinación pueden modular o regular la expresión de las proteínas GST-rc y p21 y/o genes que codifican para las proteínas, proteínas y/o genes que codifican para las proteínas que están asociadas con el mantenimiento y/o desarrollo de enfermedades, así como condiciones o trastornos asociados con GST-rc y p21, tales como tumor maligno. Las composiciones y los métodos de esta divulgación se describen con referencia a secuencias a modo de ejemplo de GST-rc y p21. Un experto habitual en la técnica entendería que diversos aspectos de la divulgación se refieren a cualquier gen, secuencia o variante de GST-rc o p21 relacionado, como genes homólogos y variantes de transcripto, y polimorfismos, incluyendo el polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) asociado con cualquier gen GST-rc o p21. En algunos aspectos, las composiciones y los métodos de esta divulgación pueden proporcionar una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ARNip) bicatenario que regula por disminución la expresión de un gen GST-rc, por ejemplo, GST-rc humano. Las composiciones y los métodos de esta divulgación contemplan además proporcionar una molécula de ácido nucleico de interferencia corto (ARNip) bicatenario que regula por disminución la expresión de un gen p21, por ejemplo, p21 humano.

Una molécula de iARN de esta divulgación puede dirigirse a GST-rc o p21, y cualquier secuencia homóloga, por ejemplo, usando secuencias complementarias o incorporando pares de bases no canónicos, por ejemplo, apareamientos erróneos y/o pares de bases oscilantes, que pueden proporcionar secuencias diana adicionales. En los casos en los que se identifican apareamientos erróneos, pueden usarse pares de bases no canónicos, por ejemplo, apareamientos erróneos y/o bases oscilantes para generar moléculas de ácido nucleico dirigidas a más de una secuencia génica.

Por ejemplo, los pares de bases no canónicos tales como los pares de bases UU y CC pueden usarse para generar moléculas de ácido nucleico que son capaces de seleccionar como diana secuencias para diferentes dianas que comparten homología de secuencia. Por tanto, una molécula de iARN puede seleccionar como diana una secuencia de nucleótidos que se conserva entre genes homólogos, y puede usarse una única molécula de iARN para inhibir la expresión de más de un gen.

En algunos aspectos, las composiciones y los métodos de esta divulgación incluyen moléculas de iARN que son activas contra cualquier porción de ARNm de GST-rc. La molécula de iARN puede incluir una secuencia complementaria a cualquier ARNm que codifique para una secuencia GST-rc. Esta divulgación contempla además composiciones y métodos que incluyen moléculas de iARN que son activas contra cualquier porción del ARNm de p21. La molécula de iARN puede incluir una secuencia complementaria a cualquier ARNm que codifique para una secuencia de p21.

En algunos aspectos, una molécula de iARN de esta divulgación puede tener actividad contra el ARN de GST-rc, en el que la molécula de iARN incluye una secuencia complementaria a un ARN que tiene una secuencia codificante de GST-rc variante, por ejemplo, un gen GST-rc mutante conocido en la técnica para asociarse con un tumor maligno. En algunas realizaciones, una molécula de iARN de esta divulgación puede tener actividad contra el ARN de p21, en el que la molécula de iARN incluye una secuencia complementaria a un ARN que tiene una secuencia codificante de p21 variante, por ejemplo, un gen p21 mutante conocido en la técnica por estar asociado con tumor maligno.

En aspectos adicionales, una molécula de iARN de esta divulgación puede incluir una secuencia de nucleótidos que puede mediar en el silenciamiento de la expresión del gen GST-rc. En aspectos adicionales, una molécula de iARN de esta divulgación puede incluir una secuencia de nucleótidos que puede mediar en el silenciamiento de la expresión del gen p21.

Los ejemplos de moléculas de iARN comprendidas en composiciones de esta invención, tal como se definen en las reivindicaciones, dirigidas a ARNm de GST-rc se muestran en la tabla 1.

Tabla 1: secuencias de moléculas de iARN para GST-rc

Leyenda para la tabla 1: las mayúsculas A, G, C y U se refieren a ribo-A, ribo-G, ribo-C y ribo-U, respectivamente. Las letras minúsculas a, u, g, c, t se refieren a 2'-desoxi-A, 2'-desoxi-U, 2'-desoxi-G, 2'-desoxi-C y desoxitimidina, respectivamente.

Los ejemplos de moléculas de iARN comprendidas en composiciones de esta invención, tal como se definen en las reivindicaciones, dirigidas a ARNm de GST-rc se muestran en la tabla 2.

Tabla 2: secuencias de moléculas de iARN para GST-rc

Leyenda para la tabla 2: las mayúsculas A, G, C y U se refieren a ribo-A, ribo-G, ribo-C y ribo-U, respectivamente. Las letras minúsculas a, u, g, c, t se refieren a 2'-desoxi-A, 2'-desoxi-U, 2'-desoxi-G, 2'-desoxi-C y desoxitimidina (dT = T = t) respectivamente. El subrayado se refiere a sustituido con 2'-OMe, por ejemplo, U. La letra f minúscula se refiere a la sustitución con 2'-desoxi-2'-fluoro, por ejemplo, fU es 2'-desoxi-2'-fluoro-U. N es A, C, G, U, U, a, c, g, u, t, o un nucleótido modificado, invertido o químicamente modificado.

Los ejemplos de moléculas de iARN comprendidas en composiciones de esta invención, tal como se definen en las reivindicaciones, dirigidas a ARNm de GST-rc se muestran en la tabla 3.

Tabla 3: secuencias de moléculas de iARN para GST-rc

Clave para la tabla 3: las mayúsculas A, G, C y U se refieren a ribo-A, ribo-G, ribo-C y ribo-U, respectivamente. Las letras minúsculas a, u, g, c, t se refieren a 2'-desoxi-A, 2'-desoxi-U, 2'-desoxi-G, 2'-desoxi-C y desoxitimidina (dT = T = t) respectivamente. El subrayado se refiere a sustituido con 2'-OMe, por ejemplo, U. La letra f minúscula se refiere a la sustitución con 2'-desoxi-2'-fluoro, por ejemplo, fU es 2'-desoxi-2'-fluoro-U. N es A, C, G, U, U, a, c, g, u, t, o un nucleótido modificado, invertido o químicamente modificado.

Los ejemplos de moléculas de iARN comprendidas en composiciones de esta invención, tal como se definen en las reivindicaciones, dirigidas a ARNm de GST-rc se muestran en la tabla 4.

Tabla 4: secuencias de moléculas de iARN para GST-rc

Clave para la tabla 4: las mayúsculas A, G, C y U se refieren a ribo-A, ribo-G, ribo-C y ribo-U, respectivamente. Las letras minúsculas a, u, g, c, t se refieren a 2'-desoxi-A, 2'-desoxi-U, 2'-desoxi-G, 2'-desoxi-C y desoxitimidina (dT = T = t) respectivamente. El subrayado se refiere a sustituido con 2'-OMe, por ejemplo, U. La letra f minúscula se refiere a la sustitución con 2'-desoxi-2'-fluoro, por ejemplo, fU es 2'-desoxi-2'-fluoro-U. N es A, C, G, U, U, a, c, g, u, t, o un nucleótido modificado, invertido o químicamente modificado.

Los ejemplos de moléculas de iARN comprendidas en composiciones de esta invención, tal como se definen en las reivindicaciones, dirigidas a ARNm de GST-rc se muestran en la tabla 5.

Tabla 5: secuencias de moléculas de iARN para GST-rc

Clave para la tabla 5: las mayúsculas A, G, C y U se refieren a ribo-A, ribo-G, ribo-C y ribo-U, respectivamente. Las letras minúsculas a, u, g, c, t se refieren a 2'-desoxi-A, 2'-desoxi-U, 2'-desoxi-G, 2'-desoxi-C y desoxitimidina (dT = T = t) respectivamente. El subrayado se refiere a sustituido con 2'-OMe, por ejemplo, U. La letra f minúscula se refiere a la sustitución con 2'-desoxi-2'-fluoro, por ejemplo, fU es 2'-desoxi-2'-fluoro-U. N es A, C, G, U, U, a, c, g, u, t, o un nucleótido modificado, invertido o químicamente modificado.

Los ejemplos de moléculas de iARN comprendidas en composiciones de esta invención, tal como se definen en las reivindicaciones, dirigidas a ARNm de GST-rc se muestran en la tabla 6.

Tabla 6: secuencias de moléculas de iARN para GST-rc

Leyenda para la tabla 6: las mayúsculas A, G, C y U se refieren a ribo-A, ribo-G, ribo-C y ribo-U, respectivamente. Las letras minúsculas a, u, g, c, t se refieren a 2'-desoxi-A, 2'-desoxi-U, 2'-desoxi-G, 2'-desoxi-C y desoxitimidina (dT = T = t) respectivamente. El subrayado se refiere a sustituido con 2'-OMe, por ejemplo, U. La letra f minúscula se refiere a la sustitución con 2'-desoxi-2'-fluoro, por ejemplo, fU es 2'-desoxi-2'-fluoro-U. N es A, C, G, U, U, a, c, g, u, t, o un nucleótido modificado, invertido o químicamente modificado.

Los ejemplos de moléculas de iARN comprendidas en composiciones de esta invención, tal como se definen en las reivindicaciones, dirigidas a ARNm de p21 se muestran en la tabla 7.

Tabla 7: secuencias de moléculas de iARN para p21

Leyenda para la tabla 7: las mayúsculas A, G, C y U se refieren a ribo-A, ribo-G, ribo-C y ribo-U, respectivamente. Las letras minúsculas a, u, g, c, t se refieren a 2'-desoxi-A, 2'-desoxi-U, 2'-desoxi-G, 2'-desoxi-C y desoxitimidina respectivamente. mU es 2'-metoxi-U.

Los ejemplos de moléculas de iARN comprendidas en composiciones de esta invención, tal como se definen en las reivindicaciones, dirigidas a ARNm de p21 se muestran en la tabla 8.

Tabla 8: secuencias de moléculas de iARN para p21

Leyenda para la tabla 8: las mayúsculas A, G, C y U se refieren a ribo-A, ribo-G, ribo-C y ribo-U, respectivamente. Las letras minúsculas a, u, g, c, t se refieren a 2'-desoxi-A, 2'-desoxi-U, 2'-desoxi-G, 2'-desoxi-C y desoxitimidina (dT = T = t) respectivamente. El subrayado se refiere a sustituido con 2'-OMe, por ejemplo, U. N es A, C, G, U, U, a, c, g, u, t, o un nucleótido modificado, invertido o químicamente modificado.

En algunos aspectos, esta divulgación proporciona una gama de moléculas de ácido nucleico, en la que a) la molécula tiene una cadena sentido de polinucleótido y una cadena antisentido de polinucleótido; b) cada cadena de la molécula tiene de desde 15 hasta 30 nucleótidos de longitud; c) una región contigua de desde 15 hasta 30 nucleótidos de la cadena antisentido es complementaria una secuencia de un ARNm que codifica para p21; y d) al menos una porción de la cadena sentido es complementaria a al menos una porción de la cadena antisentido, y la molécula tiene una región dúplex de desde 15 hasta 30 nucleótidos de longitud.

En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico puede tener una región contigua de desde 15 hasta 30 nucleótidos de la cadena antisentido que es complementaria a una secuencia de un ARNm que codifica para p21, y está ubicada en la región dúplex de la molécula.

En aspectos adicionales, la molécula de ácido nucleico puede tener una región contigua de desde 15 hasta 30 nucleótidos de la cadena antisentido que es complementaria a una secuencia de un ARNm que codifica para p21.

En aspectos adicionales, una molécula de ácido nucleico de esta divulgación puede tener cada cadena de la molécula que tenga desde 18 hasta 22 nucleótidos de longitud. Una molécula de ácido nucleico puede tener una región dúplex de 19 nucleótidos de longitud.

En determinados aspectos, una molécula de ácido nucleico puede tener una cadena sentido de polinucleótido y la cadena antisentido de polinucleótido que estás conectadas como una cadena sencilla, y forman una región dúplex conectada en un extremo por un bucle.

Las moléculas de ácido nucleico de esta divulgación pueden tener un extremo romo, y pueden tener una o más proyecciones en 3'.

Las moléculas de ácido nucleico de esta invención son moléculas de iARN que son activas para silenciamiento génico, por ejemplo, un ARNbc que es activo para silenciamiento génico, un ARNip, un micro-ARN, o un ARNhc activos para silenciamiento génico, así como un ARN dirigido por ADN (ddARN), un ARN que interactúa con Piwi (piARN), y un ARNip asociado con repeticiones (rasiARN).

Esta divulgación proporciona una gama de moléculas de ácido nucleico que son activas para inhibir la expresión de p21. En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico puede tener una CI50 para la atenuación de p21 de menos de 100 pM.

En aspectos adicionales, la molécula de ácido nucleico puede tener una CI50 para la atenuación de p21 de menos de 50 pM.

Esta divulgación contempla además composiciones que contienen una o más moléculas de ácido nucleico de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. El portador puede ser una molécula de lípido o liposoma.

Los compuestos y las composiciones de esta divulgación son útiles en métodos para prevenir o tratar una enfermedad asociada con p21, administrando un compuesto o una composición a un sujeto que los necesita.

En aspectos adicionales, esta divulgación incluye métodos para tratar una enfermedad asociada con la expresión de p21, administrando a un sujeto que lo necesita una composición que contiene una o más moléculas de ácido nucleico de la invención. La enfermedad puede ser un tumor maligno, que puede presentarse en una enfermedad tal como cánceres asociados con la expresión de p21, entre otros.

En algunos aspectos, esta divulgación proporciona una gama de moléculas de ácido nucleico, en la que: a) la molécula tiene una cadena sentido de polinucleótido y una cadena antisentido de polinucleótido; b) cada cadena de la molécula tiene de desde 15 hasta 30 nucleótidos de longitud; c) una región contigua de desde 15 hasta 30 nucleótidos de la cadena antisentido es complementaria a una secuencia de un ARNm que codifica para GST-rc; d) al menos una porción de la cadena sentido es complementaria a al menos una porción de la cadena antisentido, y la molécula tiene una región dúplex de desde 15 hasta 30 nucleótidos de longitud.

En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico puede tener una región contigua de desde 15 hasta 30 nucleótidos de la cadena antisentido que es complementaria a una secuencia de un ARNm que codifica para GST-rc está ubicada en la región dúplex de la molécula.

En aspectos adicionales, la molécula de ácido nucleico puede tener una región contigua de desde 15 hasta 30 nucleótidos de la cadena antisentido que es complementaria una secuencia de un ARNm que codifica para GST-rc. En determinados aspectos, cada cadena de la molécula de ácido nucleico puede tener de desde 18 hasta 22 nucleótidos de longitud. La región dúplex de las molécula de ácido nucleico puede tener 19 nucleótidos de longitud. En formas alternativas, la molécula de ácido nucleico puede tener una cadena sentido de polinucleótido y una cadena antisentido de polinucleótido que están conectadas como una cadena sencilla, y forman una región dúplex conectada en un extremo por un bucle.

Algunos aspectos de una molécula de ácido nucleico de esta divulgación pueden tener un extremo romo. En determinados aspectos, una molécula de ácido nucleico pueden tener una o más proyecciones en 3'.

Esta divulgación proporciona una gama de moléculas de ácido nucleico que son moléculas de iARN activas para silenciamiento génico. Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden ser un ARNbc, un ARNip, a micro-ARN, o un ARNhc activos para silenciamiento génico, así como un ARN dirigido por ADN (ddARN), ARN que interactúa con Piwi (piARN), o a ARNip asociado con repeticiones (rasiARN). Las moléculas de ácido nucleico pueden ser activas para inhibir la expresión de GST-rc.

Aspectos de esta divulgación proporcionan además moléculas de ácido nucleico que tienen una CI50 para atenuación de GST-rc de menos de 100 pM.

Aspectos adicionales de esta divulgación proporcionan moléculas de ácido nucleico que tienen una CI50 para atenuación de GST-rc de menos de 50 pM.

Esta divulgación contempla además composiciones que contienen una o más de las moléculas de ácido nucleico de la invención, junto con un portador farmacéuticamente aceptable. En determinados aspectos, el portador puede ser una molécula de lípido o liposoma.

Los compuestos y las composiciones de esta divulgación son útiles en métodos para prevenir o tratar una enfermedad asociada con GST-rc, administrando un compuesto o una composición a un sujeto que lo necesita.

Tal como se usa en el presente documento, la molécula de iARN indica cualquier molécula que provoca interferencia por ARN, incluyendo un ARN dúplex tal como ARNip (ARN de interferencia pequeño), miARN (micro ARN), ARNhc ^{(ARN en horquilla corto), ddARN (ARN dirigido por}ARn), ^{piARN (ARN que interactúa con Piwi), o rasiARN (ARNip}asociado con repeticiones) y formas modificadas de los mismos. Estas moléculas de iARN pueden estar disponibles comercialmente o pueden diseñarse y prepararse basándose en una información de secuencia conocida, etc. El ácido nucleico incluye ARN, ADN, APN, o un complejo de los mismos. Tal como se usa en el presente documento, el polinucleótido quimérico de ADN/ARN incluye un polinucleótido bicatenario que se compone de ADN y ARN que inhibe la expresión de un gen diana.

En un aspecto, los agentes de esta divulgación contienen ARNip como un agente terapéutico. Una molécula de ARNip puede tener una longitud de desde aproximadamente 10-50 o más nucleótidos. Una molécula de ARNip puede tener una longitud de desde aproximadamente 15-45 nucleótidos. Una molécula de ARNip puede tener una longitud de desde aproximadamente 19-40 nucleótidos. Una molécula de ARNip puede tener una longitud de desde 19-23 nucleótidos. Una molécula de ARNip de esta invención puede mediar iARN contra un ARNm diana. Las herramientas de diseño y kits disponibles comercialmente, tales como los disponibles de Ambion, Inc. (Austin, TX), y el Whitehead Institute of Biomedical Research en MIT (Cambridge, MA) permiten el diseño y producción de ARNip.

Métodos para tratar un tumor maligno

Las realizaciones de esta invención pueden proporcionar composiciones que comprenden un portador farmacéuticamente aceptable y moléculas de iARN que pueden usarse para regular por disminución o inhibir la expresión de GST-n y/o proteínas GST-n, así como moléculas de iARN que pueden usarse para regular por disminución la expresión de p21 y/o proteínas p21.

En algunas realizaciones, una molécula de iARN comprendida en composiciones de esta invención, tal como se define en las reivindicaciones, puede usarse para regular por disminución o inhibir la expresión de GST-n y/o proteínas GST-n que surgen de polimorfismos de haplotipo GST-n que pueden asociarse con una enfermedad o un estado tal como tumor maligno. Las moléculas de iARN comprendidas en composiciones de esta invención, tal como se define en las reivindicaciones, pueden usarse para regular por disminución o inhibir la expresión de p21 y/o proteínas p21 que surgen de polimorfismos de haplotipo p21 que pueden asociarse con una enfermedad o un estado tal como tumor maligno.

La monitorización de los niveles de ARNm o proteína GST-n, así como los niveles de ARNm o proteína p21, puede usarse para caracterizar el silenciamiento génico y para determinar la eficacia de los compuestos y composiciones de esta invención.

Las moléculas de iARN de esta divulgación pueden usarse individualmente o en combinación con otros ARNip para modular la expresión de uno o más genes.

Las moléculas de iARN de esta divulgación pueden usarse individualmente o en combinación, o junto con otros fármacos conocidos para prevenir o tratar enfermedades, o mejorar los síntomas de estados o trastornos asociados con GST-n y p21, incluyendo un tumor maligno.

Las moléculas de iARN comprendidas en composiciones de esta invención, tal como se definen en las reivindicaciones, pueden usarse para modular o inhibir la expresión de GST-n de una manera específica de secuencia. Además, las moléculas de iARN comprendidas en composiciones de esta invención, tal como se definen en las reivindicaciones, pueden usarse para modular o inhibir la expresión de p21 de una manera específica de secuencia. Las moléculas de iARN de esta divulgación pueden incluir una cadena guía para la cual una serie de nucleótidos contiguos son al menos parcialmente complementarios a un ARNm de GST-n o un ARNm de p21.

En determinados aspectos, el tumor maligno puede tratarse por interferencia por ARN usando una composición, tal como se define en las reivindicaciones, de esta invención que comprende moléculas de iARN, tal como se define en las reivindicaciones.

El tratamiento del tumor maligno puede caracterizarse en modelos basados en células adecuados, así como en modelos animales ex vivo o in vivo.

El tratamiento de un tumor maligno puede caracterizarse determinando el nivel de ARNm de GST-n o el nivel de proteína GST-n en las células del tejido afectado. El tratamiento de un tumor maligno también puede caracterizarse determinando el nivel de ARNm de p21 o el nivel de proteína p21 en las células del tejido afectado.

El tratamiento de un tumor maligno puede caracterizarse por una exploración médica no invasiva de un órgano o tejido afectado.

Los aspectos de esta divulgación pueden incluir métodos para prevenir, tratar o mejorar los síntomas de una enfermedad o estado asociados con GST-n y/o p21 en un sujeto que lo necesita.

En algunos aspectos, los métodos para prevenir, tratar o mejorar los síntomas de un tumor maligno en un sujeto pueden incluir administrar al sujeto una molécula de iARN de esta divulgación para modular la expresión de un gen GST-n y/o de un gen p21 en el sujeto u organismo.

En algunos aspectos, esta divulgación contempla métodos para regular por disminución la expresión de un gen GST-n en una célula u organismo, poniendo en contacto la célula u organismo con una molécula de iARN de esta invención. Esta divulgación contempla además métodos para regular por disminución la expresión de un gen p21 en una célula u organismo, poniendo en contacto la célula u organismo con una molécula de iARN de esta invención.

Las moléculas de ácido nucleico inhibidoras de GST-n y p21 pueden ser oligómeros de nucleótidos que pueden emplearse como molécula de ácido nucleico monocatenaria o bicatenaria para disminuir la expresión génica. En un enfoque, la molécula de ácido nucleico inhibidora es un ARN bicatenario usado para la atenuación mediada por interferencia por ARN (iARN) de la expresión génica. En un aspecto, se produce una molécula de ARN bicatenario (ARNbc) que es activa en la interferencia del ARN que incluye desde ocho hasta veinticinco (por ejemplo, 21, 22, 23, 24, 25) nucleótidos consecutivos de un oligómero de nucleótidos de la invención. El ARNbc puede ser dos cadenas complementarias de ARN que se han duplicado, o una sola cadena de ARN que se ha autoduplicado (ARN en horquilla corto (hc)).

En algunos aspectos, los ARNbc que son activos en interferencia por ARN tienen aproximadamente 21 ó 22 pares de bases, pero pueden ser más cortos o más largos, hasta aproximadamente 29 nucleótidos. Puede prepararse ARN bicatenario usando técnicas convencionales, por ejemplo, síntesis química o transcripción in vitro. Los kits están disponibles, por ejemplo, en Ambion (Austin, Texas) y Epicenter (Madison, Wis.).

Los métodos para expresar ARNbc en células de mamífero se describen en Brummelkamp et al. Science 296:550-553, 2002; Paddison et al. Genes & Devel. 16:948-958, 2002; Paul et al. Nature Biotechnol. 20:505-508, 2002; Sui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5515-5520, 2002; Yu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6047-6052, 2002; Miyagishi et al., Nature Biotechnol. 20:497-500, 2002; y Lee et al., Nature Biotechnol. 20:500-5052002.

Una molécula de ácido nucleico inhibidora que “corresponde” a un gen GST-rc comprende al menos un fragmento del gen bicatenario, de manera que cada cadena de la molécula de ácido nucleico inhibidora bicatenaria es capaz de unirse a la cadena complementaria del gen GST-rc diana. La molécula de ácido nucleico inhibidora no necesita tener una correspondencia perfecta con la secuencia de GST-rc de referencia.

Una molécula de ácido nucleico inhibidora que “corresponde” a un gen p21 comprende al menos un fragmento del gen bicatenario, de manera que cada cadena de la molécula de ácido nucleico inhibidora bicatenaria es capaz de unirse a la cadena complementaria del gen p21 diana. La molécula de ácido nucleico inhibidora no necesita tener una correspondencia perfecta con la secuencia de p21 de referencia.

En un aspecto, un ARNip tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, o incluso el 99% con el ácido nucleico diana. Por ejemplo, un dúplex de 19 pares de bases que tiene un apareamiento erróneo de 1-2 pares de bases se considera útil en los métodos de la invención. En otros aspectos, la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico inhibidora presenta 1, 2, 3, 4, 5 o más apareamientos erróneos.

Las moléculas de ácido nucleico inhibidoras proporcionadas por la divulgación no se limitan a ARNip, sino que incluyen cualquier molécula de ácido nucleico suficiente para disminuir la expresión de una molécula de ácido nucleico o polipéptido de GST-rc o p21. Las secuencias de ADN proporcionadas en el presente documento pueden usarse, por ejemplo, en el descubrimiento y desarrollo de una molécula terapéutica de ácido nucleico antisentido para disminuir la expresión de la proteína codificada. La invención proporciona además moléculas de ARN catalíticas o ribozimas. Tales moléculas de a Rn catalíticas pueden usarse para inhibir la expresión de una molécula de ácido nucleico diana in vivo. La inclusión de secuencias de ribozimas dentro de un ARN antisentido confiere actividad de escisión de ARN sobre la molécula, aumentando así la actividad de los constructos. El diseño y uso de ribozimas específicas de ARN diana se describe en Haseloff et al., Nature 334:585-591. 1988 y en el documento US 2003/0003469 A1.

En diversos aspectos de esta divulgación, la molécula de ácido nucleico catalítica se forma en un motivo en cabeza de martillo o en horquilla. Los ejemplos de tales motivos en cabeza de martillo se describen en Rossi et al., Aids Research and Human Retroviruses, 8:183, 1992. Los ejemplos de motivos en horquilla se describen en Hampel et al., Biochemistry, 28:4929, 1989 y Hampel et al., Nucleic Acids Research, 18: 299, 1990. Los expertos en la técnica reconocerán que lo que se necesita en una molécula de ácido nucleico enzimática es un sitio de unión de sustrato específico que es complementario a una o más de las regiones de ARN del gen diana, y que tiene secuencias de nucleótidos dentro o alrededor de ese sitio de unión de sustrato que confieren una actividad de escisión de ARN a la molécula.

La supresión de una diana puede determinarse mediante la expresión o actividad de la proteína correspondiente en las células que se suprimen, en comparación con las células en las que no se utiliza un agente supresor. La expresión de proteína puede evaluarse mediante cualquier técnica conocida; ejemplos de las mismas incluyen un método de inmunoprecipitación que utiliza un anticuerpo, EIA, ELISA, IRA, IRMA, un método de inmunotransferencia de tipo Western, un método inmunohistoquímico, un método inmunocitoquímico, un método de citometría de flujo, diversos métodos de hibridación que utilizan un ácido nucleico que se hibrida específicamente con un ácido nucleico que codifica para la proteína o un fragmento único de la misma, o un producto de transcripción (por ejemplo, ARNm) o un producto de corte y empalme de dicho ácido nucleico, un método de transferencia de tipo Northern, un método de transferencia de tipo Southern y diversos métodos de PCR.

La actividad de la proteína puede evaluarse analizando una actividad conocida de la proteína incluyendo la unión a una proteína tal como, por ejemplo, Raf-1 (en particular Raf-1 fosforilada) o EGFR (en particular EGFR fosforilado) por medio de cualquier un método conocido tal como, por ejemplo, un método de inmunoprecipitación, un método de inmunotransferencia de tipo Western, un método de análisis de acumulación, un método de extracción o un método de resonancia de plasmón superficial (SPR).

Los ejemplos de KRAS mutado incluyen, pero no se limitan a, aquellos que tienen una mutación que provoca la activación constante de KRAS, tales como una mutación que inhibe la GTPasa endógena o una mutación que aumenta la tasa de intercambio de nucleótidos de guanina. Los ejemplos específicos de tal mutación incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, la mutación en los aminoácidos 12, 13 y/o 61 en KRAS humano (inhibiendo la GTPasa endógena) y la mutación en los aminoácidos 116 y/o 119 en KRAS humano (aumentando la tasa de intercambio de nucleótidos de guanina) (Bos, Cancer Res. 1989; 49 (17): 4682-9, Levi et al., Cancer Res. 1991; 51 (13): 3497-502).

En algunos aspectos de la presente divulgación, el KRAS mutado puede ser un KRAS que tenga una mutación en al menos uno de los aminoácidos 12, 13, 61, 116 y 119 del KRAS humano. En un aspecto de la presente divulgación, el KRAS mutado tiene una mutación en el aminoácido 12 del KRAS humano. En algunos aspectos, el KRAS mutado puede ser uno que induzca la sobreexpresión de GST-n. Las células que tienen KRAS mutado pueden presentar una sobreexpresión de GST-n.

La detección de KRAS mutado puede llevarse a cabo usando cualquier técnica conocida, por ejemplo, hibridación selectiva por medio de una sonda de ácido nucleico específica para una secuencia de mutación conocida, un método de escisión por apareamiento erróneo de enzimas, secuenciación (Bos, Cancer Res. 1989; 49 (17): 4682-9) y un método PCR-RFLP (Miyanishi et al., Gastroenterology. 2001; 121 (4): 865-74).).

La detección de la expresión diana puede llevarse a cabo usando cualquier técnica conocida. Puede evaluarse si la diana se sobreexpresa o no comparando, por ejemplo, el grado de expresión de la diana en células que tienen KRAS mutado con el grado de expresión de la diana en el mismo tipo de células que tienen KRAS normal. En esta situación, la diana se sobreexpresa si el grado de expresión de la diana en células que tienen KRAS mutado excede el grado de expresión de la diana en el mismo tipo de células que tienen KRAS normal.

En un aspecto, la divulgación presenta un vector que codifica para una molécula de ácido nucleico inhibidora de cualquiera de los aspectos anteriores. En un aspecto particular, el vector es un vector retroviral, adenoviral, viral adenoasociado o lentiviral. En otra realización, el vector contiene un promotor adecuado para la expresión en una célula de mamífero.

La cantidad de principio activo que induce la interferencia por ARN formulado en la composición de la presente divulgación puede ser una cantidad que no provoque un efecto adverso que exceda el beneficio de la administración. Una cantidad de este tipo puede determinarse mediante una prueba in vitro usando células cultivadas, o una prueba en un modelo animal o mamífero, tal como un ratón, una rata, un perro o un cerdo, etc., y tales métodos de prueba son conocidos por los expertos en la técnica. Los métodos de esta divulgación pueden ser aplicables a cualquier animal, incluyendo humanos.

La cantidad de principio activo formulado puede variar según la forma en la que se administre el agente o la composición. Por ejemplo, cuando se usa una pluralidad de unidades de la composición para una administración, la cantidad de principio activo a formular en una unidad de la composición puede determinarse dividiendo la cantidad de principio activo necesaria para una administración entre dicha pluralidad de unidades.

Esta divulgación también se refiere a un procedimiento para producir un agente o una composición para suprimir GST-n y p21, y al uso de una composición que suprime GST-n y p21 para reducir o encoger tumores malignos.

Interferencia por ARN

La interferencia por ARN (iARN) se refiere a un silenciamiento génico postranscripcional específico de secuencia en animales mediado por ARN de interferencia pequeños (ARNip). Véanse, por ejemplo, Zamore et al., Cell, 2000, vol.

101, págs. 25-33; Fire et al., Nature, 1998, vol. 391, págs. 806811; Sharp, Genes & Development, 1999, vol. 13, págs.

139-141.

Una respuesta de ARNi en las células puede ser desencadenada por un ARN bicatenario (ARNbc), aunque el mecanismo aún no se comprende completamente. Determinados ARNbc en las células pueden sufrir la acción de la enzima Dicer, una enzima ribonucleasa III. Véanse, por ejemplo, Zamore et al., Cell, 2000, vol. 101, págs.25-33; Hammond et al., Nature, 2000, vol. 404, págs. 293-296. Dicer puede procesar el ARNbc en trozos más cortos de ARNbc, que son ARNip.

En general, los ARNip pueden tener desde aproximadamente 21 hasta aproximadamente 23 nucleótidos de longitud e incluyen una región dúplex de pares de bases de aproximadamente 19 nucleótidos de longitud.

La iARN implica un complejo de endonucleasa conocido como complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). Un ARNip tiene una cadena guía o antisentido que entra en el complejo RISC y media la escisión de una diana de ARN monocatenaria que tiene una secuencia complementaria a la cadena antisentido del dúplex de ARNip. La otra cadena del ARNip es la cadena pasajera. La escisión del ARN diana tiene lugar en el medio de la región complementaria a la cadena antisentido del dúplex de ARNip Véase, por ejemplo, Elbashir et al., Genes & Development, 2001, vol. 15, págs.188-200.

Tal como se usa en el presente documento, el término “cadena sentido” se refiere a una secuencia de nucleótidos de una molécula de ARNip que es parcial o totalmente complementaria a al menos una porción de una cadena antisentido correspondiente de la molécula de ARNip. La cadena sentido de una molécula de ARNip puede incluir una secuencia de ácido nucleico que tenga homología con una secuencia de ácido nucleico diana.

Tal como se usa en el presente documento, el término “cadena antisentido” se refiere a una secuencia de nucleótidos de una molécula de ARNip que es parcial o totalmente complementaria a al menos una porción de una secuencia de ácido nucleico diana. La cadena antisentido de una molécula de ARNip puede incluir una secuencia de ácido nucleico que es complementaria de al menos una porción de una cadena sentido correspondiente de la molécula de ARNip.

Las moléculas de iARN pueden regular por disminución o atenuar la expresión génica mediando la interferencia por ARN de una manera específica de secuencia. Véanse, por ejemplo, Zamore et al., Cell, 2000, vol. 101, págs. 25-33; Elbashir et al., Nature, 2001, vol. 411, págs. 494-498; Kreutzer et al., documento WO2000/044895; Zernicka-Goetz et al., documento WO2001/36646; Fire et al., documento WO1999/032619; Plaetinck et al., documento WO2000/01846; Mello et al., documento WO2001/029058.

Tal como se usa en el presente documento, los términos “inhibir”, “regular por disminución” o “reducir” con respecto a la expresión génica significa que la expresión del gen, o el nivel de moléculas de ARNm que codifican para una o más proteínas, o la actividad de una o más de las proteínas codificadas se reducen por debajo de lo observado en ausencia de una molécula de iARN o ARNip de esta invención. Por ejemplo, el nivel de expresión, el nivel de ARNm o el nivel de actividad de la proteína codificada pueden reducirse en al menos el 1%, o al menos el 10%, o al menos el 20%, o al menos el 50%, o al menos el 90%, o más de lo observado en ausencia de una molécula de iARN o ARNip de esta invención.

Las moléculas de iARN también pueden usarse para atenuar la expresión génica viral y, por tanto, afecta a la replicación viral.

Las moléculas de iARN pueden prepararse a partir de cadenas polinucleotídicas separadas: una cadena sentido o cadena pasajera y una cadena antisentido o cadena guía. Las cadena guía y pasajera son al menos parcialmente complementarios. La cadena de guía y la cadena pasajera pueden formar una región dúplex que tiene desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 49 pares de bases.

En algunos aspectos, la región dúplex de un ARNip puede tener 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 ó 49 pares de bases.

En determinados aspectos, una molécula de iARN puede ser activa en un complejo RISC, con una longitud de región dúplex activa para RISC.

En aspectos adicionales, una molécula de iARN puede ser activa como un sustrato de Dicer, que va a convertirse en una molécula de iARN que puede ser activa en un complejo RISC.

En algunos aspectos, una molécula de ARNi puede tener porciones de secuencia guía y pasajera complementarias en los extremos opuestos de una molécula larga, de modo que la molécula puede formar una región dúplex con las porciones de secuencia complementaria, y las cadenas están unidas en un extremo de la región dúplex por ligadores nucleotídicos o no nucleotídicos. Por ejemplo, una disposición en horquilla o una disposición en tallo y bucle. Las interacciones del ligador con las cadenas pueden ser enlaces covalentes o interacciones no covalentes.

Una molécula de iARN de esta divulgación puede incluir un ligador nucleotídico, no nucleotídico o nucleotídico/no nucleotídico mixto que une la región sentido del ácido nucleico a la región antisentido del ácido nucleico. Un ligador nucleótidico puede ser un ligador de ^ 2 nucleótidos de longitud, por ejemplo, aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 nucleótidos de longitud. El ligador nucleotídico puede ser un aptámero de ácido nucleico. Por “aptámero” o “aptámero de ácido nucleico” tal como se usa en el presente documento se refiere a una molécula de ácido nucleico que se une específicamente a una molécula diana en la que la molécula de ácido nucleico tiene una secuencia que incluye una secuencia reconocida por la molécula diana en su entorno natural. Alternativamente, un aptámero puede ser una molécula de ácido nucleico que se une a una molécula diana, en la que la molécula diana no se une de manera natural a un ácido nucleico. Por ejemplo, el aptámero puede usarse para unirse a un dominio de unión a ligando de una proteína, evitando así la interacción del ligando que se produce de manera natural con la proteína. Véase, por ejemplo, Gold et al., Annu Rev Biochem, 1995, vol. 64, págs. 763-797; Brody et al., J. Biotechnol., 2000, vol. 74, págs.

5-13; Hermann et al., Science, 2000, vol. 287, págs. 820-825.

Los ejemplos de un ligador no nucleotídico incluyen un nucleótido abásico, poliéter, poliamina, poliamida, péptido, hidrato de carbono, lípido, polihidrocarburo u otros compuestos poliméricos, por ejemplo polietilenglicoles tales como los que tienen desde 2 hasta 100 unidades de etilenglicol. Algunos ejemplos se describen en Seela et al., Nucleic Acids Research, 1987, vol. 15, págs.3113-3129; Cload et al., J. Am. Chem. Soc., 1991, vol. 113, págs.6324-6326; Jaeschke et al., Tetrahedron Lett., 1993, vol. 34, págs. 301; Arnold et al., documento WO1989/002439; Usman et al., documento WO1995/006731; Dudycz et al., documento WO1995/011910 y Ferentz et al., J. Am. Chem. Soc., 1991, vol. 113, págs.4000-4002.

Una molécula de iARN puede tener una o más proyecciones de la región dúplex. Las proyecciones, que son regiones monocatenarias no emparejadas por bases, pueden ser desde uno hasta ocho nucleótidos de longitud, o más largas. Una proyección puede ser una proyección en el extremo 3', en la que el extremo 3' de una cadena tiene una región monocatenaria de desde uno hasta ocho nucleótidos. Una proyección puede ser una proyección en el extremo 5', en la que el extremo 5' de una cadena tiene una región monocatenaria de desde uno hasta ocho nucleótidos.

Las proyecciones de una molécula de iARN pueden tener la misma longitud, o pueden ser de diferentes longitudes. Una molécula de iARN puede tener uno o más extremos romos, en la que los extremos de la región dúplex sin proyección, y las cadenas se emparejan por bases en el extremo de la región dúplex.

Una molécula de iARN de esta divulgación puede tener uno o más extremos romos, o puede tener una o más proyecciones, o puede tener una combinación de un extremo romo y un extremo de proyección.

Un extremo 5' de una cadena de una molécula de iARN puede estar en un extremo romo, o puede estar en una proyección. Un extremo 3' de una cadena de una molécula de iARN puede estar en un extremo romo, o puede ser en una proyección.

Un extremo 5' de una cadena de una molécula de iARN puede estar en un extremo romo, mientras que el extremo 3' está en una proyección. Un extremo 3' de una cadena de una molécula de iARN puede estar en un extremo romo, mientras que el extremo 5' está en una proyección.

En algunos aspectos, ambos extremos de una molécula de iARN son extremos romos.

En aspectos adicionales, ambos extremos de una molécula de iARN tienen una proyección.

Las proyecciones en los extremos 5' y 3 pueden ser de longitudes diferentes.

En determinados aspectos, una molécula de iARN puede tener un extremo romo en el que el extremo 5' de la cadena antisentido y el extremo 3' de la cadena sentido no tienen ningún nucleótido de proyección.

En aspectos adicionales, una molécula de iARN puede tener un extremo romo en el que el extremo 3' de la cadena antisentido y el extremo 5' de la cadena sentido no tienen ningún nucleótido de proyección.

Una molécula de iARN puede tener apareamientos erróneos en el emparejamiento por bases en la región dúplex. Cualquier nucleótido en una proyección de una molécula de iARN puede ser un desoxirribonucleótido, o un ribonucleótido.

Uno o más desoxirribonucleótidos pueden estar en el extremo 5', en el que el extremo 3' de la otra cadena de la molécula de iARN puede no tener una proyección, o puede no tener una proyección de desoxirribonucleótido.

Uno o más desoxirribonucleótidos pueden estar en el extremo 3', en el que el extremo 5' de la otra cadena de la molécula de iARN puede no tener una proyección, o puede no tener una proyección de desoxirribonucleótido.

En algunos aspectos, uno o más, o todos de los nucleótidos de proyección de una molécula de iARN pueden ser 2'-desoxirribonucleótidos.

Moléculas de iARN de sustrato de Dicer

En algunos aspectos, una molécula de iARN puede tener una longitud adecuada como sustrato de Dicer, que puede procesarse para producir una molécula de iARN activa para RISC. Véase, por ejemplo, Rossi et al., documento US2005/0244858.

Un ARN bicatenario (ARNbc) que es un sustrato de Dicer puede tener una longitud suficiente de manera que se procese por Dicer para producir una molécula de iARN activa, y puede incluir además una o más de las siguientes propiedades: (i) el ARNbc del sustrato de Dicer puede ser asimétrico, por ejemplo, teniendo una proyección en 3' en la cadena antisentido, y (ii) el ARNbc del sustrato de Dicer puede tener un extremo 3' modificado en la cadena sentido para dirigir la orientación de la unión de Dicer y el procesamiento del ARNbc a una molécula de iARN activa.

Métodos de uso de moléculas de iARN

Las moléculas de ácido nucleico y moléculas de iARN comprendidas en las composiciones de esta invención, tal como se definen en las reivindicaciones, pueden administrarse a una célula o un tejido mediante la aplicación directa de las moléculas, o con las moléculas combinadas con un portador o diluyente.

Las moléculas de ácido nucleico y moléculas de iARN comprendidas en las composiciones de esta invención, tal como se definen en las reivindicaciones, pueden suministrarse o administrarse a una célula, un tejido, órgano o sujeto mediante la aplicación directa de las moléculas con un portador o diluyente, o cualquier otro vehículo de administración que actúa para ayudar, fomentar o facilitar la entrada en una célula, por ejemplo, secuencias virales, material viral o formulaciones de lípidos o liposomas.

Las moléculas de ácido nucleico y moléculas de iARN comprendidas en las composiciones de esta invención, tal como se definen en las reivindicaciones, pueden formar complejos con lípidos catiónicos, empaquetarse dentro de liposomas o administrarse de otro modo a células o tejidos diana. El ácido nucleico o los complejos de ácido nucleico pueden administrarse por vía local a tejidos relevantes ex vivo o in vivo mediante aplicación dérmica directa, aplicación transdérmica o inyección.

Los sistemas de administración pueden incluir, por ejemplo, geles acuosos y no acuosos, cremas, emulsiones, microemulsiones, liposomas, pomadas, disoluciones acuosas y no acuosas, lociones, aerosoles, bases hidrocarbonadas y polvos, y pueden contener excipientes tales como solubilizantes y potenciadores de la permeación.

Una composición o molécula de ácido nucleico inhibidora de esta divulgación puede administrarse dentro de un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable, en forma de dosificación unitaria. Puede emplearse la práctica farmacéutica convencional para proporcionar formulaciones o composiciones adecuadas para administrar los compuestos a pacientes que padecen una enfermedad que está provocada por una proliferación celular excesiva. La administración puede comenzar antes de que el paciente sea sintomático. Puede emplearse cualquier vía de administración apropiada, por ejemplo, la administración puede ser parenteral, intravenosa, intraarterial, subcutánea, intratumoral, intramuscular, intracraneal, intraorbital, oftálmica, intraventricular, intrahepática, intracapsular, intratecal, intracisternal, intraperitoneal, intranasal, aerosol, supositorio o administración oral. Por ejemplo, las formulaciones terapéuticas pueden estar en forma de disoluciones o suspensiones líquidas; para la administración oral, las formulaciones pueden estar en forma de comprimidos o cápsulas; y para formulaciones intranasales, en forma de polvos, gotas nasales o aerosoles.

Las composiciones y los métodos de esta divulgación pueden incluir un vector de expresión que incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica para al menos una molécula de iARN de esta invención de una manera que permite la expresión de la molécula de ácido nucleico.

Las moléculas de ácido nucleico y moléculas de iARN de esta divulgación pueden expresarse a partir de unidades de transcripción insertadas en vectores de ADN o ARN. Los vectores recombinantes pueden ser plásmidos de ADN o vectores virales. Pueden usarse vectores virales que proporcionan la expresión transitoria de moléculas de ácido nucleico.

Por ejemplo, el vector puede contener secuencias que codifican para ambas cadenas de una molécula de iARN de un dúplex, o para una única molécula de ácido nucleico que es autocomplementaria y, por tanto, forma una molécula de iARN. Un vector de expresión puede incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica para dos o más moléculas de ácido nucleico.

Una molécula de ácido nucleico puede expresarse dentro de células a partir de promotores eucariotas. Los expertos en la técnica se dan cuenta de que cualquier ácido nucleico puede expresarse en células eucariotas a partir del vector de ADN/ARN apropiado.

En algunos aspectos, puede usarse un constructo viral para introducir un constructo de expresión en una célula, para la transcripción de un constructo de ARNbc codificado por el constructo de expresión, en el que el ARNbc es activo en la interferencia por ARN.

Las formulaciones de lípidos pueden administrarse a animales mediante inyección intravenosa, intramuscular o intraperitoneal, o por vía oral o por inhalación u otros métodos conocidos en la técnica.

Se conocen y pueden usarse formulaciones farmacéuticamente aceptables para administrar oligonucleótidos.

En un aspecto del método anterior, la molécula de ácido nucleico inhibidora se administra en una dosificación de aproximadamente 5 a 500 mg/m2/día, por ejemplo, 5, 25, 50, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275 ó 300 mg/m2/día.

En algunos aspectos, las moléculas de ácido nucleico inhibidoras de esta divulgación se administran por vía sistémica en dosificaciones de desde aproximadamente 1 hasta 100 mg/kg, por ejemplo, 1, 5, 10, 20, 25, 50, 75 ó 100 mg/kg.

En aspectos adicionales, la dosificación puede oscilar desde aproximadamente 25 hasta 500 mg/m2/día.

Los métodos conocidos en la técnica para elaborar formulaciones se encuentran, por ejemplo, en “Remington: The Science and Practice of Pharmacy” Ed. A. R. Gennaro, Lippincourt Williams & Wilkins, Filadelfia, Pa., 2000.

Las formulaciones para administración parenteral pueden contener, por ejemplo, excipientes, agua estéril o solución salina, polialquilenglicoles tales como polietilenglicol, aceites de origen vegetal o naftalenos hidrogenados. Para controlar la liberación de los compuestos pueden usarse polímero de lactida, copolímero de lactida/glicolida o copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno biocompatibles y biodegradables. Otros sistemas de administración parenteral potencialmente útiles para moléculas de ácido nucleico inhibidoras incluyen partículas de copolímero de etileno-acetato de vinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusión implantables y liposomas. Las formulaciones para inhalación pueden contener excipientes, por ejemplo, lactosa, o pueden ser disoluciones acuosas que contienen, por ejemplo, polioxietilen-9-lauril éter, glicocolato y desoxicolato, o pueden ser disoluciones oleosas para la administración en forma de gotas nasales o como un gel.

Las formulaciones pueden administrarse a pacientes humanos en cantidades terapéuticamente eficaces (por ejemplo, cantidades que previenen, eliminan o reducen un estado patológico) para proporcionar terapia para una enfermedad o un estado neoplásicos. La dosificación preferida de un oligómero nucleotídico de la invención puede depender de variables tales como el tipo y la extensión del trastorno, el estado de salud general del paciente particular, la formulación de los excipientes del compuesto y su vía de administración.

Todos los métodos anteriores para reducir tumores malignos pueden ser o bien un método in vitro o bien un método in vivo. La dosificación puede determinarse mediante una prueba in vitro usando células cultivadas, etc., tal como se conoce en la técnica. Una cantidad eficaz puede ser una cantidad que reduce el tamaño del tumor en los tumores asociados a KRAS en al menos el 10%, al menos el 20%, o al menos el 30%, o al menos el 40%, o al menos el 50%, o al menos el 60%, o al menos el 70%, o al menos el 80%, o al menos el 90%, hasta el 100% del tamaño del tumor.

Una composición farmacéutica de esta divulgación puede ser eficaz en el tratamiento de una enfermedad asociada a KRAS. Los ejemplos de las enfermedades incluyen una enfermedad debida a la proliferación celular anómala, una enfermedad debida a la mutación de KRAS y una enfermedad debida a la sobreexpresión de GST-rc.

Los ejemplos de la enfermedad debida a la proliferación celular anómala incluyen tumores malignos, hiperplasia, queloide, síndrome de Cushing, aldosteronismo primario, eritroplasia, policitemia vera, leucoplasia, cicatriz hiperplásica, liquen plano y lentiginosis.

Los ejemplos de la enfermedad debida a la mutación de KRAS incluyen tumor maligno (también denominado cáncer o neoplasia maligna).

Los ejemplos de la enfermedad debida a la sobreexpresión de GST-rc incluyen tumor maligno.

Los ejemplos de cáncer incluyen sarcomas tales como fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, liposarcoma, rabdomiosarcoma, leiomiosarcoma, angiosarcoma, sarcoma de Kaposi, linfangiosarcoma, sarcoma sinovial, condrosarcoma y osteosarcoma, carcinomas tales como tumor de cerebro, carcinoma de cabeza y cuello, carcinoma de mama, carcinoma de pulmón, carcinoma de esófago, carcinoma de estómago, carcinoma de duodeno, carcinoma de apéndice, carcinoma de colon, carcinoma de recto, carcinoma de hígado, carcinoma de riñón, carcinoma de páncreas, carcinoma de vesícula biliar, carcinoma de vías biliares, carcinoma renal, carcinoma del uréter, carcinoma de vejiga, carcinoma de próstata, carcinoma de testículo, carcinoma de útero, carcinoma de ovario, carcinoma de piel, leucemia y linfoma maligno.

El cáncer incluye neoplasia maligna epitelial y neoplasia maligna no epitelial. Un cáncer puede estar presente en cualquier parte del cuerpo

En un aspecto de la presente divulgación, el cáncer incluye células cancerosas que tienen el KRAS mutado definido anteriormente. En otro aspecto, el cáncer incluye células cancerosas que presentan proliferación independiente de hormonas o factores de crecimiento. En aspectos adicionales, un cáncer incluye células cancerosas que presentan sobreexpresión de GST-rc.

Agentes activos adicionales o fármacos para suprimir GST-rc

Los ejemplos de agentes activos adicionales para inhibir la actividad de GST-pi incluyen, pero no se limitan a, sustancias que se unen a GST-pi, por ejemplo, glutatión, análogos de glutatión (por ejemplo, los descritos en los documentos WO95/08563, WO96/40205, WO99/54346), ketoprofeno, indometacina (véase, por ejemplo, Hall et al., Cancer Res. 1989; 49 (22): 6265-8), ácido etacrínico, piriprost (véase por ejemplo, Tew et al., Cancer Res. 1988; 48 (13): 3622-5), anticuerpos anti-GST-pi y mutantes negativos dominantes de GST-rc. Estos agentes o bien están disponibles comercialmente o bien pueden producirse de manera apropiada sobre la base de técnicas conocidas públicamente.

Formulaciones con tres componentes para la administración de agentes en un tumor maligno

Tal como se usa en el presente documento, un componente de una formulación, tal como un “lípido”, puede ser un solo compuesto o puede ser una combinación de uno o más compuestos lipídicos adecuados. Por ejemplo, “un lípido estabilizador” puede referirse a un único lípido estabilizador o a una combinación de uno o más lípidos estabilizadores adecuados. Un experto en la técnica puede apreciar fácilmente que pueden usarse determinadas combinaciones de los compuestos descritos en el presente documento sin una experimentación excesiva, y que la descripción de un componente de una formulación abarca diversas combinaciones de compuestos.

Esta divulgación puede proporcionar una composición para su uso en la distribución de un agente activo en células, tejidos u órganos, organismos y sujetos, en la que la composición incluye una o más moléculas de lípidos ionizables de esta invención.

Las composiciones de esta invención pueden incluir una o más de las moléculas de lípidos ionizables, junto con un lípido estructural y uno o más lípidos para reducir la inmunogenicidad de las nanopartículas.

Una molécula de lípido ionizable de esta invención puede ser cualquier % en moles de una composición de esta invención.

Las moléculas de lípidos ionizables de una composición de esta divulgación pueden ser desde el 50% en moles hasta el 80% en moles de los componentes lipídicos de la composición. En determinados aspectos, las moléculas de lípidos ionizables de una composición pueden ser desde el 55% en moles hasta el 65% en moles de los componentes lipídicos de la composición. En aspectos adicionales, las moléculas de lípidos ionizables de una composición pueden ser aproximadamente el 60% en moles de los componentes lipídicos de la composición.

El lípido estructural de una composición de esta divulgación puede ser desde el 20% en moles hasta el 50% en moles de los componentes lipídicos de la composición. En determinados aspectos, el lípido estructural de una composición puede ser desde el 35% en moles hasta el 45% en moles de los componentes lipídicos de las composición.

El uno o más lípidos para reducir la inmunogenicidad de las nanopartículas puede ser desde un total del 1% en moles hasta el 8% en moles de los componentes lipídicos de la composición. En determinados aspectos, el uno o más lípidos para reducir la inmunogenicidad de las nanopartículas puede ser desde un total del 1% en moles hasta el 5% en moles de los componentes lipídicos de la composición.

En aspectos adicionales, una composición de esta divulgación puede incluir además un lípido catiónico, que puede ser desde el 5% en moles hasta el 25% en moles de los componentes lipídicos de la composición. En determinados aspectos, una composición de esta invención puede incluir además un lípido catiónico, que puede ser desde el 5% en moles hasta el 15% en moles de los componentes lipídicos de la composición. En estos aspectos, la razón molar de las concentraciones del lípido catiónico con respecto a las moléculas de lípidos ionizables de una composición de esta divulgación puede ser desde 5:80 hasta 25:50.

En composiciones de esta invención, la totalidad de los componentes lipídicos pueden incluir uno o más de los componentes moleculares de lípidos ionizables, uno o más lípidos estructurales, y uno o más lípidos para reducir la inmunogenicidad de las nanopartículas.

Formulaciones con cuatro componentes para la administración de agentes en un tumor maligno

Esta divulgación puede proporcionar una composición para su uso en la distribución de un agente activo en células, tejidos u órganos, organismos y sujetos, en la que la composición incluye una o más moléculas de lípidos ionizables de esta divulgación.

Las composiciones de esta invención pueden incluir una o más de las moléculas de lípidos ionizables, junto con un lípido estructural, uno o más lípidos estabilizadores y uno o más lípidos para reducir la inmunogenicidad de las nanopartículas.

Las moléculas de lípidos ionizables de una composición de esta divulgación pueden ser desde el 15% en moles hasta el 40% en moles de los componentes lipídicos de la composición. En determinados aspectos, las moléculas de lípidos ionizables de una composición pueden ser desde el 20% en moles hasta el 35% en moles de los componentes lipídicos de la composición. En aspectos adicionales, las moléculas de lípidos ionizables de una composición pueden ser desde el 25% en moles hasta el 30% en moles de los componentes lipídicos de la composición.

El lípido estructural de una composición de esta divulgación puede ser desde el 25% en moles hasta el 40% en moles de los componentes lipídicos de la composición. En determinados aspectos, el lípido estructural de una composición puede ser desde el 30% en moles hasta el 35% en moles de los componentes lipídicos de la composición.

La suma de los lípidos estabilizadores de una composición de esta divulgación puede ser desde el 25% en moles hasta el 40% en moles de los componentes lipídicos de la composición. En determinados aspectos, la suma de los lípidos estabilizadores de una composición puede ser desde el 30% en moles hasta el 40% en moles de los componentes lipídicos de la composición.

En algunos aspectos, una composición de esta invención puede incluir dos o más lípidos estabilizadores, en la que cada uno de los lípidos estabilizadores de manera individual puede ser desde el 5% en moles hasta el 35% en moles de los componentes lipídicos de la composición. En determinados aspectos, una composición de esta divulgación pueden incluir dos o más lípidos estabilizadores, en la que cada uno de los lípidos estabilizadores de manera individual puede ser desde el 10% en moles hasta el 30% en moles de los componentes lipídicos de la composición.

En determinados aspectos, la suma del uno o más lípidos estabilizadores puede ser desde el 25% en moles hasta el 40% en moles de los lípidos de la composición, en la que cada uno de los lípidos estabilizadores de manera individual puede ser desde el 5% en moles hasta el 35% en moles.

En determinados aspectos, la suma del uno o más lípidos estabilizadores puede ser desde el 30% en moles hasta el 40% en moles de los lípidos de la composición, en la que cada uno de los lípidos estabilizadores de manera individual puede ser desde el 10% en moles hasta el 30% en moles.

El uno o más lípidos para reducir la inmunogenicidad de las nanopartículas puede ser desde un total del 1% en moles hasta 8% en moles de los componentes lipídicos de la composición. En determinados aspectos, el uno o más lípidos para reducir la inmunogenicidad de las nanopartículas puede ser desde un total del 1% en moles hasta el 5% en moles de los componentes lipídicos de la composición.

En aspectos adicionales, una composición de esta divulgación puede incluir además un lípido catiónico, que puede ser desde el 5% en moles hasta el 25% en moles de los componentes lipídicos de la composición. En determinados aspectos, una composición de esta invención puede incluir además un lípido catiónico, que puede ser desde el 5% en moles hasta el 15% en moles de los componentes lipídicos de la composición. En estos aspectos, la razón molar de las concentraciones del lípido catiónico con respecto a las moléculas de lípidos ionizables de una composición de esta divulgación puede ser desde 5:35 hasta 25:15.

En composiciones de esta invención, la totalidad de los componentes lipídicos puede incluir uno o más de los componentes moleculares de lípidos ionizables, uno o más lípidos estructurales, uno o más lípidos estabilizadores y uno o más lípidos para reducir la inmunogenicidad de las nanopartículas.

Ejemplos de composiciones de lípidos

En algunas realizaciones, tres componentes similares a lípidos, es decir, una o más moléculas ionizables, un lípido estructural y uno o más lípidos para reducir la inmunogenicidad de las nanopartículas pueden ser el 100% de los componentes lipídicos de la composición. En determinados aspectos, puede incluirse un lípido catiónico.

Los ejemplos de composiciones de esta invención, tal como se definen en las reivindicaciones, se muestran en la tabla 9.

Tabla 9: composiciones de componentes lipídicos (cada uno en % en moles del total)

En determinados aspectos, cuatro componentes similares a lípidos, es decir, una o más moléculas de lípidos ionizables, un lípido estructural, uno o más lípidos estabilizadores y uno o más lípidos para reducir la inmunogenicidad de las nanopartículas pueden ser el 100% de los componentes lipídicos de la composición.

Los ejemplos de composiciones de esta invención, tal como se definen en las reivindicaciones, se muestran en la tabla

Tabla 10: Composiciones de componentes lipídicos (cada uno en % en moles del total)

Moléculas similares a lípidos ionizables

Los ejemplos de un lípido ionizable incluyen compuestos que tienen la estructura mostrada en la fórmula I

R1 = CH2(CH2)nOC(=O)R4

R2 = CH2(CH2)mOC(=O)R5

en los que n y m son desde 1 hasta 2; y R4 y R5 son independientemente para cada aparición un grupo alquilo C(12-20) o un grupo alquenilo C(12-20) que tiene desde cero hasta dos dobles enlaces;

en la que R3 se selecciona de

en los que

R6 se selecciona de H, alquilo, hidroxialquilo, alcoxilo, alcoxialcoxilo, aminoalquilo;

R7 se selecciona de H, alquilo, hidroxialquilo;

Q es O NR7;

p es de desde 1 hasta 4.

Los ejemplos de un lípido ionizable incluyen el siguiente compuesto:

que es (9Z,9’Z,12Z,12’Z)-bis(octadeca-9,12-dienoato) de ((2-((3S,4R)-3,4-dihidroxipirrolidin-1-il)acetil)azanodiil)bis(etano-2,1 -diílo).

Los ejemplos de un lípido ionizable incluyen el siguiente compuesto:

que es ditetradecanoato de ((2-(3-(hidroximetil)azetidin-1-il)acetil)azanodiil)bis(etano-2,1-diílo).

Los ejemplos de un lípido ionizable incluyen el siguiente compuesto:

que es (9Z,9’Z,12Z,12’Z)-bis(octadeca-9,12-dienoato) de ((2-(4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il)acetil)azanodiil)bis(etano-2,1-diílo).

Los ejemplos de un lípido ionizable incluyen el siguiente compuesto:

Los ejemplos de un lípido ionizable incluyen compuestos que tienen la estructura mostrada en la fórmula IV

R1 = C(=O)OR4

R2 = C(=O)OR5

en los que R4 y R5 son independientemente para cada aparición un grupo alquilo C(12-20) o un grupo alquenilo C(12-20) que tiene desde cero hasta dos dobles enlaces;

en la que R3 se selecciona de

en los que

R7 se selecciona de H, alquilo, hidroxialquilo;

Q es O NR7;

p es de desde 1 hasta 4.

Los ejemplos de un lípido ionizable incluyen el siguiente compuesto:

que es 2-((1-(((9Z,12Z)-heptadeca-9,12-dien-1-il)oxi)-5-(((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)oxi)-1,5-dioxopentan-3-¡l)amino)-N,N,N-trimet¡l-2-oxoetan-1-amimo.

Los ejemplos de un lípido ionizable incluyen compuestos que tienen la estructura mostrada en la fórmula VI

en la que R1 es

R1 = OC(=O)R4

en la que R2 y R4 son independientemente para cada aparición un grupo alquilo C(12-20) o un grupo alquenilo C(12-20) que tiene desde cero hasta dos dobles enlaces;

en la que R3 se selecciona de aminoalquilo, aminoalquilo cuaternario.

Los ejemplos de un lípido ionizable incluyen el siguiente compuesto:

que es (9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoato de 2-((9Z,12Z)-N-(3-(d¡met¡lam¡no)prop¡l)octadeca-9,12-d¡enam¡do)et¡lo. Los ejemplos de un lípido ionizable incluyen el siguiente compuesto:

que es N,N,N-tr¡met¡l-3-((9Z,12Z)-N-(2-(((9Z,12Z)-octadeca-9,12-d¡eno¡l)ox¡)et¡l)octadeca-9,12-d¡enam¡do)propan-1 -aminio.

Los ejemplos de un líp¡do ¡on¡zable ¡ncluyen compuestos que t¡enen la estructura mostrada en la fórmula IX

en la que R1 y R2 son

R1 = C(=O)OR4

R2 = NHC(=O)R5

en los que R4 y R5 son ¡ndepend¡entemente para cada aparidón un grupo alqu¡lo C(12-20) o un grupo alquen¡lo C(12-20) que t¡ene desde cero hasta dos dobles enlaces;

en la que r es de desde 1 hasta 4;

en la que R3 se selecc¡ona de

en los que

R7 se selecciona de H, alquilo, hidroxialquilo;

Q es O NR7.

Los ejemplos de un lípido ionizable incluyen el siguiente compuesto:

que es N,N,N-trimetil-2-(((S)-3-(((9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)oxi)-2-((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienamido)-3-oxopropil)amino)-2-oxoetan-1-aminio.

Los ejemplos de una molécula de lípido ionizable incluyen compuestos que tienen la estructura mostrada en la fórmula III

en la que R1 y R2 son

R1 = CH2(CH2)nOC(=O)R4

R2 = CH2(CH2)mOC(=O)R5

en los que n y m son desde 1 hasta 2; y R4 y R5 son independientemente para cada aparición un grupo alquilo C(12-20) o un grupo alquenilo C(12-20);

en la que R3 se selecciona de alquilo, hidroxialquilo, alcoxialcoxilo y carboxialquilo;

en la que R6 se selecciona de NR72, N+HR72 y N+R73;

en la que R7 se selecciona de H, alquilo, hidroxialquilo.

Los ejemplos de una molécula de lípido ionizable incluyen compuestos que tienen la estructura mostrada en la fórmula IV-B

Fórmula IV-B

en la que R1 y R2 son

R1 = C(=O)OR4

R2 = C(=O)OR5

en los que R4 y R5 son independientemente para cada aparición un grupo alquilo C(12-20) o un grupo alquenilo C(12-20);

en la que Z es S u O;

en la que R3 se selecciona de

en los que

cada R6 se selecciona independientemente de H, alquilo, hidroxialquilo, alcoxilo, alcoxialcoxilo, aminoalquilo;

R7 se selecciona de H, alquilo, hidroxialquilo;

p es de desde 1 hasta 4.

Los ejemplos de una molécula de lípido ionizable incluyen compuestos que tienen la estructura mostrada en la fórmula V

en la que R1 y R2 son

R1 = NHC(=O)R4

R2 = C(=O)OR5

en la que p es de desde 1 hasta 4;

en la que R3 se selecciona de

en los que

R7 se selecciona de H, alquilo, hidroxialquilo;

Q es O NR7.

Los ejemplos de una molécula de lípido ionizable incluyen compuestos que tienen la estructura mostrada en la fórmula VII

en la que R1 y R2 son

R1 = CH2(CH2)nOC(=O)R4

R2 = CH2(CH2)mOC(=O)R5

en los que n y m son de desde 1 hasta 2; y R4 y R5 son independientemente para cada aparición un grupo alquilo C(12-20) o un grupo alquenilo C(12-20);

en la que R3 se selecciona de aminoalquilo, aminoalquilo cuaternario, alcoxialquilo, alcoxialcoxialquilo.

Los ejemplos de una molécula de lípido ionizable incluyen compuestos que tienen la estructura mostrada en la fórmula VIII

Fórmula VIII

en la que R1 y R2 son

R1 = OC(=O)R4

R2 = C(=O)ZR5

en los que Z es NH u O,

en la que R3 se selecciona de

amino;

amino cuaternario;

aminoalquilo;

aminoalquilo cuaternario;

NHC(=O)(CH2)pR8;

NHC(=O)SR9;

en los que R8 se selecciona de

carboxialquilo;

aminoalquilo;

aminoalquilo;

y en los que

R7 se selecciona de H, alquilo, hidroxialquilo;

Q es O NR7.

Los ejemplos de una molécula de lípido ionizable incluyen compuestos que tienen la estructura mostrada en la fórmula VIII-B

Fórmula VIII-B

en la que R1 y R2 son

R1 = CH2(CH2)nOC(=O)R4

R2 = CH2(CH2)mOC(=O)R5

en los que n y m son desde 1 hasta 2;

R4 y R5 son independientemente para cada aparición un grupo alquilo C(12-20) o un grupo alquenilo C(12-20); en la que Z es N, O;

en la que R3 se selecciona de

en los que

R7 se selecciona de H, alquilo, hidroxialquilo;

p es de desde 1 hasta 4.

Los ejemplos de una molécula de lípido ionizable incluyen compuestos que tienen la estructura mostrada en la fórmula X

en la que R1 y R2 son

R1 = C(=O)OR4

R2 = NHC(=O)R5

en la que R3 se selecciona de

amino;

amino cuaternario;

aminoalquilo;

aminoalquilo cuaternario;

hidroxialquilamino;

hidroxialquilamino cuaternario.

Los ejemplos de una molécula de lípido ionizable incluyen compuestos que tienen la estructura mostrada en la fórmula XI

en la que R1 y R2 son

R1 = C(=O)R4

R2 = C(=O)OR5

en la que p es de desde 1 hasta 4;

en la que R3 se selecciona de

en los que

R7 se selecciona de H, alquilo;

Q es O NR7.

Lípidos estructurales

Los ejemplos de lípidos estructurales incluyen colesteroles, esteroles y esteroides.

Los ejemplos de lípidos estructurales incluyen colanos, colestanos, ergostanos, campestanos, poriferastanos, estigmastanos, gorgostanos, lanostanos, gonanos, estranos, androstanos, pregnanos y cicloartanos.

Los ejemplos de lípidos estructurales incluyen esteroles y zoosteroles tales como colesterol, lanosterol, zimosterol, zimostenol, desmosterol, estigmastanol, dihidrolanosterol y 7-deshidrocolesterol.

Los ejemplos de lípidos estructurales incluyen colesteroles pegilados y compuestos de colestano-3-oxo-acilo (C1-22), por ejemplo, acetato de colesterilo, araquidonato de colesterilo, butirato de colesterilo, hexanoato de colesterilo, miristato de colesterilo, palmitato de colesterilo, behenato de colesterilo, estearato de colesterilo, caprilato de colesterilo, n-decanoato de colesterilo, dodecanoato de colesterilo, nervonato de colesterilo, pelargonato de colesterilo, n-valerato de colesterilo, oleato de colesterilo, elaidato de colesterilo, erucato de colesterilo, heptanoato de colesterilo, linolelaidato de colesterilo y linoleato de colesterilo.

Los ejemplos de lípidos estructurales incluyen esteroles tales como fitoesteroles, beta-sitosterol, campesterol, ergosterol, brassicasterol, delta-7-estigmasterol y delta-7-avenasterol.

Lípidos estabilizadores

Los ejemplos de lípidos estabilizadores incluyen lípidos zwitteriónicos.

Los ejemplos de lípidos estabilizadores incluyen compuestos tales como fosfolípidos.

Los ejemplos de fosfolípidos incluyen fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, ácido fosfatídico, palmitoiloleoilfosfatidilcolina, lisofosfatidilcolina, lisofosfatidiletanolamina, dipalmitoilfosfatidilcolina, dioleoilfosfatidilcolina, diestearoilfosfatidilcolina y ordilinoleoilfosfatidilcolina.

Los ejemplos de lípidos estabilizadores incluyen compuestos de fosfatidiletanolamina y compuestos de fosfatidilcolina. Los ejemplos de lípidos estabilizadores incluyen 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC).

Los ejemplos de lípidos estabilizadores incluyen difitanoilfosfatidiletanolamina (DPhPE) y 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPhPC).

Los ejemplos de lípidos estabilizadores incluyen 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), 1,2-dipalmitoil-snglicero-3-fosfocolina (DPPC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DPPE) y 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE).

Los ejemplos de lípidos estabilizadores incluyen 1,2-dilauroil-sn-glicerol (DLG); 1,2-dimiristoil-sn-glicerol (DMG); 1,2-dipalmitoil-sn-glicerol (DPG); 1,2-diestearoil-sn-glicerol (DSG); 1,2-diaraquidoil-sn-glicero-3-fosfocolina (Da PC); 1,2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfocolina (DLPC); 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC); 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-O-etil-3-fosfocolina (DPePC); 1,2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (Dl PE); 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DMPE); 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DSPE); 1-palmitoil-2-linoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina; 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC); 1-palmitoil-2-liso-sn-glicero-3-fosfocolina (P-Liso-PC); y 1-estearoil-2-liso-sn-glicero-3-fosfocolina (S-Liso-PC).

Lípidos para reducir la inmunogenicidad

Los ejemplos de lípidos para reducir la inmunogenicidad incluyen compuestos poliméricos y conjugados polímero lípido.

Los ejemplos de lípidos para reducir la inmunogenicidad incluyen lípidos pegilados que tienen regiones de polietilenglicol (PEG). Las regiones de PEG pueden ser de cualquier masa molecular. En algunas realizaciones, una región de PEG puede tener una masa molecular de 200, 300, 350, 400, 500, 550, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 3500, 4000 ó 5000 Da.

Los ejemplos de lípidos para reducir la inmunogenicidad incluyen compuestos que tienen una región de metoxipolietilenglicol.

Los ejemplos de lípidos para reducir la inmunogenicidad incluyen compuestos que tienen una región de carbonilmetoxipolietilenglicol.

Los ejemplos de lípidos para reducir la inmunogenicidad incluyen compuestos que tienen una región de PEG multirramificado.

Los ejemplos de lípidos para reducir la inmunogenicidad incluyen compuestos que tienen una región de poliglicerina. Los ejemplos de lípidos para reducir la inmunogenicidad incluyen lípidos poliméricos tales como DSPE-mPEG, DMPE-mPEG, DPPE-mPEG y DOPE-mPEG.

Los ejemplos de lípidos para reducir la inmunogenicidad incluyen PEG-fosfolípidos y PEG-ceramidas.

Lípidos catiónicos

Los ejemplos de lípidos catiónicos incluyen compuestos catiónicos de HEDC tal como se describe en el documento US 2013/0330401 A1. Algunos ejemplos de lípidos catiónicos se proporcionan en el documento US 2013/0115274 A1. Los ejemplos adicionales de lípidos catiónicos se conocen en la técnica.

Composiciones de lípidos

En algunos aspectos, una composición puede contener el lípido ionizable compuesto 81, el lípido estructural colesterol, los lípidos estabilizadores DOPc y DOPe y el lípido para reducir la inmunogenicidad DPPE-mPEG. En determinados aspectos, el compuesto 81 puede ser del 15 al 25% en moles de la composición; el colesterol, DOPC y DOPE combinados pueden ser del 75 al 85% en moles de la composición; y DPPE-mPEG puede ser el 5% en moles de la composición.

En un aspecto, el compuesto 81 puede ser el 25% en moles de la composición; el colesterol puede ser el 30% en moles de la composición, DOPC puede ser el 20% en moles de la composición, DOPE puede ser el 20% en moles de la composición; y DPPE-mPEG(2000) puede ser el 5% en moles de la composición.

Nanopartículas

Los aspectos de esta divulgación pueden proporcionar composiciones de nanopartículas de liposomas. Las moléculas ionizables de esta divulgación pueden usarse para formar composiciones de liposomas, que pueden tener una bicapa de moléculas similares a lípidos.

Una composición de nanopartículas puede tener una o más de las moléculas ionizables de esta invención en una estructura liposómica, una estructura de bicapa, una micela, una estructura laminar o una mezcla de las mismas. En algunos aspectos, una composición puede incluir uno o más componentes de vehículo líquido. Un vehículo líquido adecuado para la administración de agentes activos de esta invención puede ser un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable. Un vehículo líquido puede incluir un disolvente orgánico o una combinación de agua y un disolvente orgánico.

Los aspectos de esta divulgación pueden proporcionar nanopartículas lipídicas que tienen un tamaño de desde 10 hasta 1000 nm. En algunos aspectos, las nanopartículas liposómicas pueden tener un tamaño de desde 10 hasta 150 nm.

En determinados aspectos, las nanopartículas liposómicas de esta divulgación pueden encapsular la molécula de iARN y conservar al menos el 80% de las moléculas de iARN encapsuladas después de 1 hora de exposición a suero humano.

Composiciones farmacéuticas

Esta divulgación contempla además métodos para distribuir un agente activo a un órgano de un sujeto para tratar un tumor maligno mediante la administración al sujeto de una composición de esta invención. Los órganos que pueden tratarse incluyen pulmón, hígado, páncreas, riñón, colon, hueso, piel e intestino.

En algunos aspectos, esta divulgación proporciona métodos para tratar una enfermedad tumoral maligna de pulmón mediante la administración al sujeto de una composición de esta invención.

En aspectos adicionales, esta divulgación proporciona una gama de formulaciones farmacéuticas.

Una formulación farmacéutica en el presente documento puede incluir un agente activo, así como un portador de fármacos, o un lípido de esta invención, junto con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. En general, los agentes activos de esta descripción incluyen cualquier agente activo para el tumor maligno, incluyendo cualquier molécula de ácido nucleico inhibidora y cualquier fármaco molecular pequeño. Los ejemplos de moléculas de ácido nucleico inhibidoras incluyen ribozimas, ácidos nucleicos antisentido y moléculas de interferencia por ARN (moléculas de iARN).

Los ejemplos de fármacos antitumorales y antineoplásicos incluyen factores relacionados con oncogenes, factor de angiogénesis tumoral, factores relacionados con la metástasis, citocinas tales como TGF-beta, factor de crecimiento, proteinasa tal como MMP, caspasa y factor de supresión de inmunización.

Un portador de fármacos puede dirigir una composición para alcanzar células estrelladas. Un portador de fármacos puede incluir un fármaco en su interior, o estar adherido al exterior de una sustancia que contiene un fármaco, o mezclarse con un fármaco siempre que se incluya un derivado retinoideo y/o un análogo de la vitamina A en el portador de fármacos, y está al menos parcialmente expuesto en el exterior de la preparación. La composición o preparación puede cubrirse con un material apropiado, tal como, por ejemplo, un recubrimiento entérico o un material que se disgrega a lo largo del tiempo, o puede incorporarse en un sistema de liberación de fármacos apropiado.

Una formulación farmacéutica de esta divulgación puede contener uno o más de cada uno de los siguientes: un agente tensioactivo, un diluyente, un excipiente, un conservante, un estabilizante, un tinte y un agente de suspensión.

Algunos portadores, diluyentes y componentes farmacéuticos para una formulación farmacéutica, así como los métodos para formular y administrar los compuestos y las composiciones de esta invención se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed., Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1990).

Los ejemplos de conservantes incluyen benzoato de sodio, ácido ascórbico y ésteres de ácido p-hidroxibenzoico.

Los ejemplos de agentes tensioactivos incluyen alcoholes, ésteres, alcoholes alifáticos sulfatados.

Los ejemplos de excipientes incluyen sacarosa, glucosa, lactosa, almidón, celulosa cristalizada, manitol, silicato anhidro ligero, aluminato de magnesio, aluminato-metasilicato de magnesio, silicato de aluminio sintético, carbonato de calcio, bicarbonato de sodio, hidrogenofosfato de calcio y carboximetilcelulosa de calcio.

Los ejemplos de agentes de suspensión incluyen aceite de coco, aceite de oliva, aceite de sésamo, aceite de cacahuete, soja, acetato-ftalato de celulosa, copolímero de acetato de metilo-metacrilato y ftalatos de éster.

Una formulación terapéutica de esta divulgación para la administración de una o más moléculas activas para el silenciamiento génico puede administrarse a un mamífero que lo necesita. Puede administrarse a un mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de la formulación y el agente activo, que puede encapsularse en un liposoma, para prevenir o tratar un tumor maligno.

La vía de administración puede ser local o sistémica.

Una formulación terapéuticamente eficaz de esta invención puede administrarse por diversas vías, incluyendo intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea y oral.

Las vías de administración pueden incluir, por ejemplo, administración parenteral, incluyendo inyecciones intramusculares, subcutáneas, intravenosas, intramedulares, así como inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intraperitoneales, intranasales o intraoculares.

La formulación también puede administrarse en formas de dosificación de liberación sostenida o controlada, incluyendo inyecciones de depósito, bombas osmóticas y similares, para una administración repetida prolongada y/o programada a una velocidad predeterminada.

La composición de la presente divulgación puede administrarse a través de diversas vías, incluyendo las vías oral y parenteral, y los ejemplos de las mismas incluyen, pero no se limitan a, vías orales, intravenosas, intramusculares, subcutáneas, locales, intrapulmonares, intrarrespiratorias, intratraqueales, intrabronquiales, nasales, rectales, intraarteriales, intraportales, intraventriculares, intramedulares, intraganglionares, intralinfáticas, intracerebrales, intratecales, intracerebroventriculares, transmucosas, percutáneas, intranasales, intraperitoneales e intrauterinas, y puede formularse en una forma de dosificación adecuada para cada vía de administración. Una forma de dosificación y un método de formulación de este tipo pueden seleccionarse según sea apropiado de cualquier forma y método de dosificación conocidos. Véase, por ejemplo, Hyojun Yakuzaigaku, Standard Pharmaceutics, ed. por Yoshiteru Watanabe et al., Nankodo, 2003.

Los ejemplos de formas de dosificación adecuadas para la administración oral incluyen, pero no se limitan a, polvo, gránulo, comprimido, cápsula, líquido, suspensión, emulsión, gel y jarabe, y los ejemplos de formas de dosificación adecuadas para la administración parenteral incluyen inyecciones tales como una disolución inyectable, una suspensión inyectable, una emulsión inyectable y una inyección lista para usar. Las formulaciones para administración parenteral pueden ser una forma tal como una disolución o suspensión estéril isotónica acuosa o no acuosa.

Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección en bolo o infusión continua, incluyen disoluciones acuosas de la formulación activa en forma soluble en agua. Las suspensiones de los compuestos activos pueden prepararse como suspensiones de inyección oleosas apropiadas. Las suspensiones de inyección acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de disoluciones altamente concentradas.

Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en envases multidosis, con un conservante añadido. Las formulaciones pueden tomar formas tales como suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de un vademécum tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, el principio activo puede estar en forma de polvo para su reconstitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso.

Además de las preparaciones descritas anteriormente, las formulaciones también pueden formularse como preparación de depósito. Tales formulaciones de acción prolongada pueden administrarse mediante inyección intramuscular. Por tanto, por ejemplo, la formulación puede formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados, por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable, o resinas de intercambio iónico, o como derivados poco solubles, por ejemplo, como una sal poco soluble.

Las composiciones de esta invención y las formulaciones divulgadas en el presente documento también pueden formularse para administración tópica y pueden aplicarse a la piel del sujeto usando cualquier procedimiento adecuado para la aplicación del vehículo de administración tópica. Por ejemplo, la formulación puede aplicarse de manera manual, usando un aplicador, o mediante un procedimiento que involucre ambos. Después de la aplicación, puede hacerse que la formulación actúe en la piel del sujeto, por ejemplo, frotando. La aplicación puede realizarse varias veces al día o una vez al día. Por ejemplo, la formulación puede aplicarse a la piel de un sujeto una vez al día, dos veces al día o varias veces al día, o puede aplicarse una vez cada dos días, una vez cada tres días o aproximadamente una vez a la semana, una vez cada dos semanas o una vez cada varias semanas.

Las formulaciones o composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden administrarse al sujeto por cualquier medio adecuado. Los ejemplos de métodos de administración incluyen, entre otros, (a) administración a través de inyección, por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraorbital, intracapsular, intraespinal, intraesternal o similares, incluyendo la administración con bomba de infusión; (b) administración por vía local tal como mediante inyección directamente en el área renal o cardíaca, por ejemplo, mediante implantación de depósito; así como también consideren apropiado los expertos en la técnica para poner en contacto el compuesto activo con tejido vivo.

El médico individual puede elegir la formulación exacta, la vía de administración y la dosificación para las composiciones farmacéuticas en vista del estado del paciente. Véase, por ejemplo, Goodman & Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 12a ed., sec. 1, 2011. Normalmente, el intervalo de dosificación de la composición administrada al paciente puede ser de desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal del paciente. La dosificación puede ser una sola o una serie de dos o más administradas en el transcurso de uno o más días, según lo necesite el paciente. En los casos en los que se han establecido dosificaciones humanas para los compuestos para al menos algún estado, las dosificaciones serán aproximadamente las mismas, o dosificaciones que serán aproximadamente del 0,1% a aproximadamente el 500%, más preferiblemente de aproximadamente el 25% a aproximadamente el 250% de la dosificación humana establecida. Cuando no se establece ninguna dosificación humana, como será el caso de las composiciones farmacéuticas recién descubiertas, puede inferirse una dosificación humana adecuada a partir de los valores de DE50 o DI50, u otros valores apropiados derivados de estudios in vitro o in vivo, según califican estudios de toxicidad y estudios de eficacia en animales.

Métodos para prevenir o tratar un tumor maligno

La presente divulgación se refiere además a un método para controlar la actividad o el crecimiento de tumores malignos, incluyendo el método administrar una cantidad eficaz de la composición a un sujeto que lo necesita. La cantidad eficaz a la que se hace referencia en este caso, en un método para tratar un tumor maligno, alivia sus síntomas o retrasa o detiene su progresión, y es preferiblemente una cantidad que impide la aparición o recidiva de un tumor maligno, o lo cura. También es preferiblemente una cantidad que no provoca ningún efecto adverso que exceda el beneficio de la administración. Una cantidad de este tipo puede determinarse según sea apropiado mediante una prueba in vitro usando células cultivadas o mediante una prueba en un animal o mamífero del modelo tal como un ratón, una rata, un perro o un cerdo, y tales métodos de prueba son bien conocidos por un experto en la técnica. Además, la dosis de los agentes activos en el portador y la dosis de los agentes activos usados en el método de la presente divulgación son conocidos por un experto en la técnica, o pueden determinarse según sea apropiado mediante las pruebas mencionadas anteriormente.

La frecuencia de administración depende de las propiedades de la composición usada y de las condiciones del sujeto antes mencionadas, y puede ser una pluralidad de veces al día (es decir, 2, 3, 4, 5 o más veces al día), una vez al día, cada pocos días (es decir, cada 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 días, etc.), algunas veces a la semana (por ejemplo, 2, 3, 4 veces, etc. a la semana), cada dos semanas o cada pocas semanas (es decir, cada 2, 3, 4 semanas, etc.).

En algunos aspectos, la presente divulgación también se refiere a un método para administrar un fármaco a una célula tumoral maligna, utilizando el portador anterior. Este método incluye una etapa de administrar o añadir el portador que tiene la sustancia que va a administrarse a un ser vivo o a un medio, por ejemplo, un medio de cultivo, que contiene una célula que produce matriz extracelular en el pulmón. Estas etapas pueden lograrse según sea apropiado según cualquier método conocido o un método descrito en esta invención. Además, el método anterior incluye un modo llevado a cabo in vitro y un modo en el que se selecciona como diana una célula tumoral maligna en el pulmón dentro del cuerpo.

Una formulación terapéuticamente eficaz de esta divulgación puede administrarse mediante administración sistémica que puede proporcionar una amplia biodistribución del agente activo.

Los aspectos de esta divulgación pueden proporcionar una formulación terapéutica, que incluye una molécula terapéutica de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.

Puede administrarse una dosis eficaz de una formulación de esta invención desde 1 hasta 12 veces al día o una vez a la semana. La duración de la administración puede ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 días, o puede ser de 1,2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 ó 12 semanas.

Aspectos adicionales

Una composición para su uso en la distribución de un agente activo para el tratamiento de un tumor maligno en un sujeto, comprendiendo la composición un lípido ionizable, un lípido estructural y un lípido para reducir la inmunogenicidad de las nanopartículas. El tumor maligno puede ubicarse en el pulmón, colon, riñón o páncreas. El tumor maligno puede ubicarse en el hígado, los huesos, la piel o el intestino. El lípido ionizable puede ser desde el 50% en moles hasta el 80% en moles de los lípidos de la composición, o desde el 55% en moles hasta el 65% en moles de los lípidos de la composición. El lípido estructural puede ser desde el 20% en moles hasta el 50% en moles de los lípidos de la composición, o desde el 35% en moles hasta el 55% en moles de los lípidos de la composición. El lípido estructural puede ser colesterol, esterol o esteroide. El lípido para reducir la inmunogenicidad de las nanopartículas puede ser desde el 1% en moles hasta el 8% en moles de los lípidos de la composición. El lípido para reducir la inmunogenicidad de las nanopartículas puede tener una región de polietilenglicol (PEG) que tiene una masa molecular de desde 200 hasta 5000 Da. El lípido para reducir la inmunogenicidad de las nanopartículas puede ser DPPE-mPEG, DSPE-mPEG, DMPE-mPEG o DOPE-mPEG.

Esta divulgación contempla además una composición para su uso en la distribución de un agente activo para el tratamiento de un tumor maligno en un sujeto, comprendiendo la composición un lípido ionizable, un lípido estructural, uno o más lípidos estabilizadores y un lípido para reducir la inmunogenicidad de las nanopartículas. El lípido ionizable puede ser desde el 15% en moles hasta el 40% en moles de los lípidos de la composición, o desde el 20% en moles hasta el 35% en moles de los lípidos de la composición. El lípido estructural puede ser desde el 25% en moles hasta el 40% en moles de los lípidos de la composición, o desde el 30% en moles hasta el 35% en moles de los lípidos de la composición.

La suma del uno o más lípidos estabilizadores puede ser desde el 25% en moles hasta el 40% en moles de los lípidos de la composición, en la que cada uno de los lípidos estabilizadores de manera individual es desde el 5% en moles hasta el 35% en moles. El uno o más lípidos estabilizadores pueden ser compuestos de fosfatidiletanolamina o compuestos de fosfatidilcolina.

La composición puede estar (compuesto 81/colesterol/DOPC/DOPE/DPPE-PEG-2000) en una de las siguientes combinaciones, en las que los números se refieren a la concentración en % en moles del componente: (25/30/30/10/5), (25/30/25/15/5), (25/30/20/20/5), (25/30/15/25/5), (25/30/10/30/5), (25/35/15/20/5), (25/35/20/15/5), (30/30/15/20/5), (30/30/20/15/5), (35/30/15/15/5). En algunos aspectos, el lípido ionizable puede ser el compuesto 81, el lípido estructural puede ser colesterol, los lípidos estabilizadores pueden ser DOPC y DOPE y el lípido para reducir la inmunogenicidad de las nanopartículas puede ser DSPE-mPEG-2000, en la que el compuesto 81 comprende del 15 al 25% en moles de la composición, en la que el colesterol, DOPC y DOPE combinados comprenden del 75 al 85% en moles de la composición, en la que el DSPE-mPEG-2000 comprende desde el 1 hasta el 5% en moles de la composición y en la que el compuesto 81, colesterol, DOPC, DOPE y DSPE-mPEG-2000 combinados comprenden sustancialmente el 100% en moles de los lípidos de la composición.

El agente activo puede ser moléculas de iARN dirigidas a GST-rc y moléculas de iARN dirigidas a p21. En algunos aspectos, el agente activo comprende moléculas de iARN dirigidas a GST-rc y moléculas de iARN dirigidas a p21, y la composición comprende nanopartículas liposómicas que encapsulan las moléculas de iARN. En determinados aspectos, el agente activo comprende moléculas de iARN dirigidas a GST-rc y moléculas de iARN dirigidas a p21, y las composición comprende nanopartículas liposómicas que encapsulan las moléculas de iARN y conservan al menos el 80% de las moléculas de iARN encapsuladas después de 1 hora de exposición a suero humano.

Esta divulgación también contempla composiciones farmacéuticas que comprenden una composición de lípidos y un agente activo. El agente activo puede ser una o más moléculas de iARN. Las moléculas de iARN para tratar un tumor maligno pueden incluir moléculas de iARN dirigidas a GST-rc y moléculas de iARN dirigidas a p21. Las moléculas de iARN para tratar un tumor maligno pueden ser, por ejemplo, ARNip, ARNhc o micro-ARN, así como ARN dirigidos por ARN (ddARN), ARN que interactúa con Piwi (piARN) y ARNip asociados con repeticiones (rasiARN).

En determinados aspectos, esta divulgación proporciona una composición farmacéutica que contiene moléculas de iARN para tratar un tumor maligno que son moléculas de iARN dirigidas a sólo GST-rc.

Los aspectos de esta divulgación incluyen además métodos para distribuir un agente activo a un órgano de un sujeto para tratar una neoplasia maligna, mediante la administración al sujeto de una composición de esta invención. El tumor maligno puede ubicarse en el pulmón, colon, riñón o páncreas. El tumor maligno puede ubicarse en el hígado, los huesos, la piel o el intestino. El tumor maligno puede ubicarse en una región anatómica seleccionada del grupo que consiste en cabeza y cuello, cerebro, mama, esófago, estómago, intestino, duodeno, hígado, vesícula biliar, vías biliares, riñón, uretra, vejiga, próstata, testículo, útero, ovario, piel, hueso, médula ósea, sangre, piel y capa epitelial.

La administración puede ser una dosis de desde 0,01 hasta 2 mg/kg de las moléculas de iARN al menos una vez al día durante un período de hasta doce semanas. La administración puede proporcionar una AUC(0-última) media de desde 1 hasta 1000 ug*min/ml y una Cmáx media de desde 0,1 hasta 50 ug/ml para la molécula de iARN de GST-rc. La administración puede proporcionar una AUC(0-última) media en plasma de desde 1 hasta 1000 ug*min/ml y una Cmáx media en plasma de desde 0,1 hasta 50 ug/ml para la molécula de iARN de p21.

Esta invención proporciona composiciones, tal como se definen en las reivindicaciones, para su uso en métodos para prevenir, tratar o mejorar uno o más síntomas de un tumor maligno en un mamífero que lo necesita, o cualquier animal, comprendiendo el método administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende moléculas de iARN, en la que una parte de las moléculas de iARN son activas para reducir la expresión de GST-rc y una parte de las moléculas de iARN son activas para reducir la expresión de p21. En algunas realizaciones, el tumor maligno está asociado con la mutación de KRAS en el mamífero, comprendiendo el método además identificar una célula tumoral en el mamífero, comprendiendo la célula tumoral al menos uno de: (i) una mutación del gen KRAS y (ii) un nivel de expresión aberrante de la proteína KRAS.

Los métodos de esta divulgación pueden aplicarse a cualquier animal, incluyendo humanos.

El mamífero puede ser un humano, la GST-rc puede ser una GST-rc humana y la p21 puede ser una p21 humana. En algunos aspectos, el tumor maligno sobreexpresa GST-rc, y si la expresión de GST-rc se regula por disminución, entonces el nivel de p21 puede regularse por incremento. Las moléculas de iARN pueden disminuir la expresión de GST-rc y p21 en el mamífero. La administración puede disminuir la expresión de GST-rc y p21 en el mamífero en al menos un 5% durante al menos 5 días. El método puede reducir uno o más síntomas del tumor maligno, retrasar o interrumpir la progresión del tumor maligno o reducir el crecimiento de células tumorales malignas en el sujeto. Las células tumorales pueden comprender niveles aumentados de expresión de la proteína KRAS de tipo natural en comparación con la de una célula normal. Las células tumorales pueden sobreexpresar proteína o ARN de GST-rc de tipo natural, y si se suprime la expresión de GST-rc, puede elevarse el nivel de proteína o ARN de p21.

En algunos aspectos, las células tumorales pueden comprender mutaciones en la proteína KRAS en uno o más de los residuos 12, 13 y 61. En determinados aspectos, las células tumorales pueden comprender mutaciones en la proteína KRAS y el tumor es un cáncer seleccionado de cáncer de colon, cáncer de páncreas y cáncer de pulmón. El tumor puede ser un sarcoma seleccionado del grupo que consiste en adenocarcinoma de pulmón, adenoma mucinoso, carcinoma ductal del páncreas y carcinoma colorrectal. El tumor maligno puede ser un sarcoma seleccionado del grupo de adenocarcinoma de pulmón, adenoma mucinoso, carcinoma ductal del páncreas, carcinoma colorrectal, cáncer de mama y fibrosarcoma. El tumor maligno puede ubicarse en cualquier región anatómica, que en algunos aspectos puede seleccionarse del grupo de pulmón, hígado, páncreas, colon, riñón, hueso, piel, intestino y cualquier combinación de los mismos.

En otro aspecto, esta invención se refiere al sorprendente descubrimiento de que el tamaño de los tumores malignos puede reducirse in vivo mediante el tratamiento con composiciones que comprenden un portador farmacéuticamente aceptable e inhibidores de ARNip de GST-rc y p21. Además, esta invención proporciona el resultado inesperadamente ventajoso de que la apoptosis de las células tumorales puede aumentarse hasta un nivel de letalidad sintética para proporcionar métodos y composiciones para prevenir o tratar tumores malignos.

Esta invención se refiere a composiciones y su uso en métodos que incorporan compuestos terapéuticos basados en ácidos nucleicos para su uso en la administración a diversos órganos para prevenir, tratar o mejorar estados y enfermedades de tumores malignos. En algunos aspectos, esta divulgación proporciona composiciones de moléculas de interferencia por ARN (moléculas de iARN) para el silenciamiento génico de diversas dianas relacionadas con tumores malignos.

Esta divulgación puede proporcionar composiciones para administrar moléculas terapéuticas, así como métodos de uso de las mismas. Pueden usarse diversas composiciones farmacológicas y basadas en ARN de esta divulgación en métodos para prevenir o tratar tumores malignos.

En algunas realizaciones, los tumores malignos que contienen una mutación de KRAS o que muestran niveles de expresión de KRAS aberrantes pueden reducirse mediante el tratamiento con composiciones que comprenden un portador farmacéuticamente aceptable y agentes de ARNip que modulan la expresión de GST-rc y p21 a un nivel que crea letalidad sintética para las células tumorales.

Esta invención se refiere a composiciones y a su uso en métodos para compuestos terapéuticos basados en ácidos nucleicos contra tumores malignos. En algunas realizaciones, esta invención proporciona composiciones que comprenden un portador farmacéuticamente aceptable y moléculas, estructuras y composiciones de iARN que pueden silenciar la expresión de GST-rc y p21. Las estructuras y composiciones de esta divulgación pueden usarse en la prevención, el tratamiento o la reducción del tamaño de tumores malignos.

Esta divulgación proporciona composiciones y métodos que pueden usarse para tratar una neoplasia en un sujeto. En particular, esta divulgación proporciona composiciones terapéuticas que pueden disminuir la expresión de una molécula de ácido nucleico o un polipéptido de GST-rc, así como una molécula de ácido nucleico o un polipéptido de p21 para tratar una neoplasia asociada a KRAS.

En algunos aspectos, esta divulgación incluye una molécula de ácido nucleico inhibidora que corresponde a, o es complementaria de, al menos un fragmento de una molécula de ácido nucleico de GST-rc, y que disminuye la expresión de GST-rc en una célula. En aspectos adicionales, esta divulgación incluye una molécula de ácido nucleico inhibidora que corresponde a, o es complementaria de, al menos a un fragmento de una molécula de ácido nucleico de p21 y que disminuye la expresión de p21 en una célula.

En determinados aspectos, esta divulgación proporciona moléculas de ácido nucleico bicatenarias que son moléculas de iARN tales como ARNip o ARNhc, así como ARN dirigidos por ADN (ddARN), ARN que interactúan con Piwi (piARN) y ARNip asociados con repeticiones (rasiARN) para suprimir GST-rc y p21.

En algunos aspectos, esta divulgación incluye uno o más vectores que codifican para las moléculas de ácido nucleico inhibidoras descritas anteriormente. Un vector puede ser un vector retroviral, adenoviral, viral adenoasociado o lentiviral. En aspectos adicionales, un vector puede contener un promotor adecuado para la expresión en una célula de mamífero. Los aspectos adicionales incluyen células cancerosas que contienen una mutación de KRAS o que muestran niveles de expresión de KRAS aberrantes, que también pueden contener el vector, o una molécula de ácido nucleico inhibidora según uno cualquiera de los aspectos anteriores. En aspectos adicionales, las células pueden ser células neoplásicas in vivo.

En algunos aspectos, esta divulgación incluye métodos para disminuir la expresión de GST-rc y p21 en una célula tumoral maligna que contiene una mutación de KRAS o que muestra una expresión de KRAS aberrante. Los métodos pueden incluir poner en contacto la célula con una cantidad eficaz de moléculas de ácido nucleico inhibidoras, en los que las moléculas de ácido nucleico inhibidoras inhiben la expresión de un polipéptido de GST-rc y un polipéptido de p21, disminuyendo así la expresión de GST-rc y p21 en la célula.

En aspectos adicionales, los métodos de esta divulgación pueden disminuir la transcripción o traducción de GST-rc y p21 en tumores malignos.

En aspectos particulares, esta divulgación incluye métodos para disminuir la expresión de GST-rc y p21 en una célula tumoral maligna, en los que la célula puede ser una célula humana, una célula neoplásica, una célula in vivo o una célula in vitro.

Los aspectos de esta divulgación también pueden proporcionar métodos para tratar a un sujeto que tiene una neoplasia, en los que las células cancerosas de la neoplasia contienen una mutación de KRAS o muestran niveles de expresión de KRAS aberrantes. Los métodos pueden implicar la administración al sujeto de una cantidad eficaz de dos o más moléculas de ácido nucleico inhibidoras, en los que las moléculas de ácido nucleico inhibidoras reducen la expresión de GST-rc y p21, tratando así la neoplasia. En algunos aspectos, los métodos de esta divulgación pueden reducir el tamaño de una neoplasia, en relación con el tamaño de una neoplasia antes del tratamiento o sin tratamiento.

En diversos aspectos, una molécula de ácido nucleico inhibidora puede administrarse en un liposoma, un polímero, una microesfera, una nanopartícula, un vector de terapia génica o un vector de ADN desnudo.

En aspectos adicionales, esta divulgación presenta métodos para tratar a un sujeto, por ejemplo, un paciente humano, que tiene una neoplasia en la que las células cancerosas de la neoplasia contienen una mutación de KRAS o muestran niveles de expresión de KRAS aberrantes. En determinados aspectos, los métodos pueden incluir administrar al sujeto una cantidad eficaz de moléculas de ácido nucleico inhibidoras, en los que las moléculas de ácido nucleico inhibidoras son moléculas de ácido nucleico antisentido, ARNip, ARNbc que son activos para la interferencia por ARN, o una combinación de los mismos, que inhiben la expresión de un polipéptido de GST-rc y un polipéptido de p21.

En aspectos particulares, una célula de la neoplasia sobreexpresa GST-rc y, si se suprime GST-rc, puede elevarse el nivel de p21.

En determinados aspectos, la neoplasia puede ser un tumor maligno o cáncer de pulmón, cáncer de riñón o cáncer de páncreas.

Estructuras de las colas lipídicas

Un compuesto similar a lípidos de esta divulgación puede tener una o más colas lipófilas que contienen uno o más grupos alquilo o alquenilo. Los ejemplos de colas lipófilas incluyen alquenilo C(14:1(5)), alquenilo C(14:1(9)), alquenilo C(16:1(7)), alquenilo C(16:1(9)), alquenilo C(18:1(3)), alquenilo C(18:1(5)), alquenilo C(18:1(7)), alquenilo C(18:1(9)), alquenilo C(18:1(11)), alquenilo C(18:1(12)), alquenilo C(18:2(9,12)), alquenilo C(18:2(9,11)), alquenilo C(18:3(9,12,15)), alquenilo C(18:3(6,9,12)), alquenilo C(18:3(9,11,13)), alquenilo C(18:4(6,9,12,15)), alquenilo C(18:4(9,11,13,15)), alquenilo C(20:1(9)), alquenilo C(20:1(11)), alquenilo C(20:2(8,11)), alquenilo C(20:2(5,8)), alquenilo C(20:2(11,14)), alquenilo C(20:3(5,8,11)), alquenilo C(20:4(5,8,11,14)), alquenilo C(20:4(7,10,13,16)), alquenilo C(20:5(5,8,11,14,17)), alquenilo C(20:6(4,7,10,13,16,19)), alquenilo C(22:1(9)), alquenilo C(22:1(13)) y alquenilo C(24:1(9)).

Definiciones químicas

El término “alquilo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un radical hidrocarbilo de un grupo alifático saturado, que puede tener cualquier longitud. Un grupo alquilo puede ser un grupo alifático ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido que contiene de 1 a 22 átomos de carbono. Por ejemplo, esta definición también se aplica a la porción alquilo de otros grupos tales como, por ejemplo, cicloalquilo, alcoxilo, alcanoílo y aralquilo.

Tal como se usa en el presente documento, un término tal como “alquilo C(1-5)” incluye alquilo C(1), alquilo C(2), alquilo C(3), alquilo C(4) y alquilo C(5). De manera similar, por ejemplo, el término “alquilo C(3-22)” incluye alquilo C(1), alquilo C(2), alquilo C(3), alquilo C(4), alquilo C(5), alquilo C(6), alquilo C(7), alquilo C(8), alquilo C(9), alquilo C(10), alquilo C(11), alquilo C(12), alquilo C(13), alquilo C(14), alquilo C(15), alquilo C(16), alquilo C(17), alquilo C(18), alquilo C(19), alquilo C(20), alquilo c (21) y alquilo C(22).

Tal como se usa en el presente documento, un grupo alquilo puede designarse mediante un término tal como Me (metilo), Et (etilo), Pr (cualquier grupo propilo), nPr (n-Pr, n-propilo), iPr (i-Pr, isopropilo), Bu (cualquier grupo butilo), nBu (n-Bu, n-butilo), Bu (i-Bu, isobutilo), sBu (s-Bu, sec-butilo) y ‘Bu (t-Bu, terc-butilo).

El término “alquenilo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un radical hidrocarbilo que tiene al menos un doble enlace carbono-carbono. Un grupo alquenilo puede ser un radical hidrocarbilo ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido que tiene de 2 a 22 átomos de carbono y al menos un doble enlace carbonocarbono.

El término “sustituido”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un átomo que tiene una o más sustituciones o uno o más sustituyentes que pueden ser iguales o diferentes y pueden incluir un sustituyente de hidrógeno. Por tanto, los términos alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alcoxilo, alcanoílo y arilo, por ejemplo, se refieren a grupos que pueden incluir variaciones sustituidas. Las variaciones sustituidas incluyen variaciones lineales, ramificadas y cíclicas, y grupos que tienen un sustituyente o sustituyentes que reemplaza(n) uno o más hidrógenos unidos a cualquier átomo de carbono del grupo.

En general, un compuesto puede contener uno o más centros quirales. Los compuestos que contienen uno o más centros quirales pueden incluir los descritos como un “isómero”, un “estereoisómero”, un “diastereómero”, un “enantiómero”, un “isómero óptico” o como una “mezcla racémica”. Las convenciones para la nomenclatura estereoquímica, por ejemplo, las reglas de nomenclatura de estereoisómeros de Cahn, Ingold y Prelog, así como los métodos para la determinación de la estereoquímica y la separación de estereoisómeros, se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Michael B. Smith y Jerry March, March's Advanced Organic Chemistry, 5a edición, 2001. Se pretende que los compuestos y las estructuras de esta divulgación abarquen todos los posibles isómeros, estereoisómeros, diastereómeros, enantiómeros y/o isómeros ópticos que se entendería que existen para el compuesto o la estructura especificados, incluida cualquier mezcla, racémica o de otro tipo, de los mismos.

Esta divulgación abarca todas y cada una de las formas tautoméricas, solvatadas o no solvatadas, hidratadas o no hidratadas, así como cualquier forma isotópica de átomos de los compuestos y las composiciones divulgados en el presente documento.

Esta divulgación abarca todos y cada uno de los polimorfos cristalinos o diferentes formas cristalinas de los compuestos y las composiciones divulgados en el presente documento.

Protocolo de ejemplo para determinar la atenuación in vitro

Un día antes de la transfección, se sembraron en placa las células en una placa de 96 pocillos a 2 x 103 células por pocillo con 100 |il de DMEM (n.° de cat. SH30243.01 de HyClone) que contenía FBS al 10% y se cultivaron en una incubadora a 37°C que contenía una atmósfera humidificada del 5% de CO²en aire. Antes de la transfección, se cambió el medio a 90 |il de medio de suero reducido Opti-MEM I (n.° de cat. 31985-070 de Life Technologies) que contenía FBS al 2%. Entonces, se mezclaron 0,2 |il de Lipofectamine RNAiMax (n.° de cat. 13778-100 de Life Technologies) con 4,8 |il de Opti-MEM I durante 5 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se mezcló 1 |il de ARNip con 4 |il de Opti-MEM I y se combinó con la disolución de LF2000, y se mezcló suavemente, sin agitar con vórtex. Después de 5 minutos a temperatura ambiente, se incubó la mezcla durante 10 minutos adicionales a temperatura ambiente para permitir que se formaran los complejos ARN-RNAiMax. Además, se añadieron 10 |il de complejos ARN-RNAiMax a un pocillo y se agitó suavemente la placa a mano. Se incubaron las células en una incubadora a 37°C que contenía una atmósfera humidificada del 5% de CO²en aire durante 2 horas. Se cambió el medio por medio de suero reducido Opti-MEM I recién preparado que contenía FBS al 2%. 24 horas después de la transfección, se lavaron las células una vez con PBS helado. Se lisaron las células con 50 |il de tampón de lisis Cellto-Ct (n.° de cat. 4391851 C de Life Technologies) durante 5-30 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 5 |il de disolución de parada y se incubó durante 2 minutos a temperatura ambiente. Se midió el nivel de ARNm mediante RT-qPCR con TAQMAN inmediatamente. Pueden congelarse las muestras a -80°C y someterse a ensayo más adelante.

Protocolo de ejemplo para determinar la estabilidad en suero

Se incubaron 0,2 mg/ml de ARNip con suero humano al 10% a 37°C. En determinados puntos de tiempo (0, 5, 15 y 30 min), se tomaron alícuotas de 200 |il de muestra y se extrajeron con 200 |il de disolvente de extracción (cloroformo:fenol:alcohol isoamílico = 24:25:1). Se agitó la muestra con vórtex y se centrifugó a 13.000 rpm durante 10 min a TA, luego se transfirió la disolución de la fase superior y se filtró con un filtro de 0,45 |im. Se transfirió el filtrado a un vial de inyección de HPLC de 300 |il. Para CL-EM, la fase móvil fue MPA: HFIP 100 mM TEA 7 mM en H²O, MPB: metanol al 50% acetonitrilo al 50%. La columna: Waters Acquity OST 2,1 x 50 mm, 1,7 |im.

Ejemplos

Ejemplo 1: la formulación de ARNip de GST-rc y p21 de esta invención mostró una reducción profunda de los tumores de xenoinjerto de cáncer in vivo. Los ARNip de GST-rc y p21 proporcionaron potencia de atenuación génica in vivo cuando se administraron en una formulación liposómica a los tumores de xenoinjerto de cáncer.

La figura 1 muestra la eficacia de inhibición del tumor para una formulación liposómica de ARNip de GST-rc (SEQ ID NO: 61 y 126) y p21 (SEQ ID NO: 341 y 355, N = U). Se utilizó un modelo de xenoinjerto de cáncer con una dosis relativamente baja de 1,15 mg/kg para el ARNip de GST-rc y de 0,74 mg/kg para el ARNip de p21.

La formulación de ARNip de GST-rc y p21 mostró una eficacia de inhibición del tumor significativa e inesperadamente ventajosa a los pocos días después de la administración. Después de 30 días, los ARNip de GST-rc y p21 mostraron una eficacia de inhibición del tumor notablemente ventajosa, con un volumen del tumor reducido en más de 2 veces en comparación con el control.

Se administró el ARNip de GST-rc en cuatro inyecciones (día 1, 8, 15 y 22) de una formulación liposómica que tenía la composición (lípido ionizable:colesterol:DOPE:DOPC:DPPE-PEG-2K) (25:30:20:20:5).

Para el modelo de xenoinjerto de cáncer, se obtuvo una línea celular A549 de ATCC. Se mantuvieron las células en medio de cultivo complementado con suero bovino fetal al 10% y penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 |ig/ml. Se dividieron las células 48 horas antes de la inoculación para que las células estuvieran en fase de crecimiento logarítmico cuando se recogieran. Se sometieron ligeramente las células a tripsinización con tripsina-EDTA y se recogieron del cultivo tisular. Se contó el número de células viables y se determinó en un hemocitómetro en presencia de azul trípano (sólo se cuentan las células viables). Se resuspendieron las células a una concentración de 5 * 107/ml en medio sin suero. Luego, se mezcló bien la suspensión celular con BD Matrigel descongelado en hielo en una razón 1:1 para inyección.

Los ratones eran ratones hembra atímicos desnudos (nu/nu) del Charles River Laboratory, inmunodeprimidos, de 6 a 8 semanas de edad, de 7 a 8 ratones por grupo.

Para la preparación del modelo tumoral, se inoculó a cada ratón por vía subcutánea en el costado derecho con 0,1 ml de un inóculo de 2,5 * 106 de células A549 usando una jeringa y aguja de 25 G, un inóculo por ratón. Los ratones no fueron anestesiados para la inoculación.

Para las mediciones del volumen del tumor y la aleatorización, se midió el tamaño del tumor al 0,1 mm más cercano. Se calcularon los volúmenes de los tumores usando la fórmula: volumen del tumor = largo x anchura2/2. Una vez que los tumores establecidos alcanzaron aproximadamente 120-175 mm3, el volumen del tumor promedio fue de aproximadamente 150 mm3, se asignaron los ratones a los diversos grupos de control de vehículo y de tratamiento de modo que los volúmenes medios de los tumores en los grupos tratados estuvieran dentro del 10% del volumen medio del tumor en el grupo de control de vehículo, idealmente, el % de CV del volumen del tumor fue inferior al 25%. El mismo día, se administraron los artículos de prueba y el vehículo de control según la pauta posológica. Se monitorizaron los volúmenes de los tumores tres veces durante la semana 1, dos veces durante el resto de las semanas, incluyendo el día de finalización del estudio.

Para la administración de la dosificación, el día de la dosificación, se sacaron los artículos de prueba del congelador a -80°C y se descongelaron en hielo. Antes de aplicarlo a las jeringas, se invirtió el frasco que contenía la formulación con las manos unas cuantas veces. Se dosificaron todos los artículos de prueba por i.v., a 10 ml/kg.

Para determinar el peso corporal, se pesaron los ratones con una precisión de 0,1 g. Se monitorizaron y registraron diariamente los pesos corporales dentro de los 7 días posteriores a la administración de la primera dosis. Se monitorizaron y registraron los pesos corporales dos veces por semana, durante el resto de las semanas, incluyendo el día de finalización del estudio.

Para la recolección de tumores, 28 días después de la primera dosis, se midió el volumen del tumor y se diseccionó el tumor para medir el peso y se almacenó para el estudio de biomarcadores de PD. Se registró el peso del tumor.

Ejemplo 2: la formulación de ARNip de GST-rc y p21 de esta invención mostró una reducción profunda de los tumores de xenoinjerto de cáncer in vivo. Los ARNip de GST-rc y p21 proporcionaron potencia de atenuación génica in vivo cuando se administraron en una formulación liposómica a los tumores de xenoinjerto de cáncer.

La figura 2 muestra la eficacia de inhibición del tumor para una formulación liposómica de ARNip de GST-rc (SEQ ID N°:156 y 182) y p21 (SEQ ID N°:341 y 355, N = U). Se utilizó un modelo de xenoinjerto de cáncer con una dosis relativamente baja de 0,75 mg/kg para cada ARNip.

La formulación de ARNip de GST-rc y p21 mostró una eficacia de inhibición del tumor significativa e inesperadamente ventajosa a los pocos días después de la administración. Después de 30 días, los ARNip de GST-rc y p21 mostraron una eficacia de inhibición del tumor notablemente ventajosa, con un volumen del tumor reducido en 1,7 veces en comparación con el control.

Ejemplo 3: las formulaciones de ARNip de GST-rc y p21 de esta invención demostraron un aumento de la muerte de células cancerosas por apoptosis de las células cancerosas in vitro. Se monitorizó la apoptosis de las células cancerosas in vitro mediante la observación de la regulación por incremento de PUMA, un biomarcador para la apoptosis, que se asocia con la pérdida de la viabilidad celular.

Las formulaciones de ARNip de GST-rc y p21 proporcionaron un aumento inesperado de apoptosis de las células cancerosas.

Tal como se muestra en la figura 3, el nivel de expresión de PUMA para una formulación de ARNip de GST-rc y p21 (figura 3, p21(A) GSTP(A), SEQ ID NO: 341 y 355 de P21, N = U, SEQ ID NO: 156 y 182 de GSTP) se incrementó en gran medida desde aproximadamente 2-4 días después de la transfección de los ARNip de GST-rc y p21.

Estos datos muestran que las formulaciones de ARNip de GST-rc y p21 de esta invención proporcionaron un aumento inesperado de apoptosis de las células cancerosas.

El protocolo para el biomarcador PUMA fue el siguiente. Un día antes de la transfección, se sembraron en placa las células en una placa de 96 pocillos a 2 x 103 células por pocillo con 100 |il de DMEM (n.° de cat. SH30243.01 de HyClone) que contenía FBS al 10% y se cultivaron en una incubadora a 37°C que contenía una atmósfera humidificada del 5% de CO²en aire. Al día siguiente, antes de la transfección, se reemplazó el medio con 90 |il de medio de suero reducido Opti-MEM I (n.° de cat. 31985-070 de Life Technologies) que contenía FBS al 2%. Entonces, se mezclaron 0,2 |il de Lipofectamine RNAiMax (n.° de cat. 13778-100 de Life Technologies) con 4,8 |il de Opti-MEM I durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se mezcló 1 |il de los ARNip (conc. de disolución madre 1 |iM) con 4 |il de Opti-MEM I y se combinó con la disolución de RNAiMAX, y luego se mezcló suavemente. Se incubó la mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente para permitir que se formaran los complejos ARN-RNAiMAX. Se añadieron 10 |il de complejos ARN-RNAiMax por pocillo, hasta una concentración final de 10 nM. Se incubaron las células durante 2 horas y se cambió el medio por medio de suero reducido Opti-MEM I recién preparado que contenía FBS al 2%. 1, 2, 3, 4 y 6 días después de la transfección, se lavaron las células una vez con PBS helado y luego se lisaron con 50 |il de tampón de lisis Cell-to-Ct (n.° de cat. 4391851 C de Life Technologies) durante 5-30 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 5 |il de disolución de parada y se incubó durante 2 minutos a temperatura ambiente. Se midieron los niveles de ARNm de PUMA (BBC3, n.° de cat. Hs00248075, Life Technologies) mediante qPCR con TAQMAN.

Ejemplo 4: un estudio in vitro de doble atenuación de ARNip dirigidos a GST-n y p21 mostró que la combinación era muy activa para suprimir los niveles de ARNm de ambas proteínas. Tal como se muestra en la tabla 11, el nivel de atenuación para cada uno de GST-n y p21 fue alto para concentraciones de 2, 10 y 50 nM.

Tabla 11: doble atenuación en A549

Protocolo: transfectar con ARNip de P21 a 2, 10 y 50 nM. Después de 1,2, 3 ó 4 días, transfectar con ARNip de GST-n a 10 nM. 1 día después, analizar mediante RT-PCR para determinar los niveles de ARNm de P21 y ARNm de GST-K.

Ejemplo 5: modelo de ratón con cáncer de pulmón ortotópico A549. Los ARNip de GST-n comprendidos en las composiciones de esta invención, tal como se definen en las reivindicaciones, pueden presentar una reducción profunda de los tumores de cáncer de pulmón ortotópicos in vivo. En este ejemplo, un ARNip de GST-n proporcionó potencia de atenuación génica in vivo cuando se administró en una formulación liposómica a los tumores de cáncer de pulmón ortotópicos en ratones atímicos desnudos.

En general, un modelo de tumor ortotópico puede presentar relevancia clínica directa para la eficacia y potencia de un fármaco, así como una capacidad predictiva mejorada. En el modelo de tumor ortotópico, las células tumorales se implantan directamente en la misma clase de órgano del que se originaron las células.

Se evaluó la eficacia antitumoral de la formulación de ARNip contra el cáncer de pulmón humano A549 comparando los pesos finales de los tumores primarios medidos en la necropsia para el grupo de tratamiento y el grupo de control de vehículo.

La figura 4 muestra la inhibición de un tumor de cáncer de pulmón ortotópico in vivo para un ARNip de GST-n basado en la estructura BU2 (SEQ ID NO: 61 y 126). Se utilizó un modelo de ratón con cáncer de pulmón ortotópico A549 con una dosis relativamente baja de 2 mg/kg del ARNip dirigido a GST-n.

El ARNip de GST-n mostró una eficacia de inhibición del tumor de pulmón significativa e inesperadamente ventajosa en este estudio de seis semanas. Tal como se muestra en la figura 4, después de 43 días, el ARNip de GST-n mostró una eficacia de inhibición del tumor notablemente ventajosa, con los pesos promedio de los tumores finales significativamente reducidos en 2,8 veces en comparación con el control.

Para este estudio, se usaron ratones macho NCr nu/nu, de 5 a 6 semanas de edad. Los animales de experimentación se mantuvieron en un ambiente filtrado con HEPA durante el período experimental. Las formulaciones de ARNip se almacenaron a 4°C antes de su uso y se calentaron a temperatura ambiente 10 minutos antes de la inyección en el ratón.

Para este modelo de cáncer de pulmón ortotópico humano A549, en el día de la implantación ortotópica quirúrgica (SOI), se recogieron los tumores madre del sitio subcutáneo de animales que portaban un xenoinjerto de tumor A549 y se colocaron en medio RPMI-1640. Se extrajeron los tejidos necróticos y se cortaron los tejidos viables en piezas de 1,5-2 mm3 Se anestesiaron los animales con inhalación de isoflurano y se esterilizó el área quirúrgica con yodo y alcohol. Se realizó una incisión transversal de aproximadamente 1,5 cm de longitud en la parte izquierda de la pared torácica del ratón usando un par de tijeras quirúrgicas. Se realizó una incisión intercostal entre la tercera y la cuarta costilla y se expuso el pulmón izquierdo. Se trasplantó un fragmento de tumor A549 a la superficie del pulmón con una sutura quirúrgica 8-0 (nailon). Se cerró la pared torácica con una sutura quirúrgica 6-0 (seda). Se volvió a inflar el pulmón mediante punción intratorácica usando una jeringa de 3 cc con una aguja de 25 G X 1 A para extraer el aire restante en la cavidad torácica. Se cerró la pared torácica con una sutura quirúrgica 6-0 de seda. Todos los procedimientos de la operación descrita anteriormente se realizaron con un microscopio con un aumento de 7x bajo campanas de flujo laminar filtradas con HEPA.

Tres días después de la implantación del tumor, se dividieron aleatoriamente los ratones del modelo que portaban tumores en grupos de diez ratones por grupo. Para el grupo de interés, se inició el tratamiento de los diez ratones tres días después de la implantación del tumor.

Para el grupo de interés, la formulación fue (lípido ionizable:colesterol:DOPE:DOPC:DPPE-PEG-2K:DSPE-PEG-2K), una composición liposómica. Los liposomas encapsularon el ARNip de GST-rc.

Para el final del estudio, se sacrificaron los ratones de experimentación cuarenta y dos días después del inicio del tratamiento. Se extirparon y pesaron los tumores primarios en una balanza electrónica para su posterior análisis.

Para una estimación de la toxicidad del compuesto, el peso corporal medio de los ratones en los grupos tratados y de control se mantuvo dentro del intervalo normal durante todo el período experimental. No se observaron otros síntomas de toxicidad en los ratones.

Ejemplo 6: los ARNip de GST-rc comprendidos en las composiciones de esta invención, tal como se definen en las reivindicaciones, mostraron una reducción profunda de los tumores de xenoinjerto de cáncer in vivo. Los ARNip de GST-rc proporcionaron potencia de atenuación génica in vivo cuando se administraron en una formulación liposómica a los tumores de xenoinjerto de cáncer.

La figura 5 muestra la eficacia de inhibición del tumor para un ARNip de GST-rc (SEQ ID NO: 156 y 182). Se utilizó un modelo de xenoinjerto de cáncer con una dosis relativamente baja de 0,75 mg/kg de ARNip dirigido a GST-rc.

El ARNip de GST-rc mostró una eficacia de inhibición del tumor significativa e inesperadamente ventajosa a los pocos días de la administración. Después de 36 días, el ARNip de GST-rc mostró una eficacia de inhibición del tumor notablemente ventajosa, con un volumen del tumor reducido al doble en comparación con el control.

Tal como se muestra en la figura 5, el ARNip de GST-rc demostró una eficacia de inhibición del tumor significativa e inesperadamente ventajosa en el día final. En particular, el peso del tumor se redujo más del doble.

Se administró el ARNip de GST-rc en dos inyecciones (día 1 y 15) de una formulación liposómica que tenía la composición (lípido ionizable:colesterol:DOPE:DoPC:DPPE-PEG-2K) (25:30:20:20:5).

Los ratones fueron ratones hembra atímicos desnudos (nu/nu) del Charles River Laboratory, inmunodeprimidos, de 6 a 8 semanas de edad, de 7 a 8 ratones por grupo.

Para la administración de la dosificación, el día de la dosificación, se sacaron los artículos de prueba del congelador a -80°C y se descongelaron en hielo. Antes de aplicarlo a las jeringas, se invirtió el frasco que contenía la formulación con las manos unas cuantas veces. Se dosificaron todos los artículos de prueba a 0,75 mg/kg por i.v., cada dos semanas X 2, a 10 ml/kg.

Ejemplo 7: los ARNip de GST-rc comprendidos en las composiciones de esta invención, tal como se definen en las reivindicaciones, demostraron un aumento de la muerte de las células cancerosas por apoptosis de las células cancerosas in vitro. Los ARNip de GST-rc proporcionaron atenuación de GST-rc, lo que dio como resultado una regulación por incremento de PUMA, un biomarcador para la apoptosis y asociado con la pérdida de la viabilidad celular.

El ARNip de GST-rc, SEQ ID NO: 156 y 182, que contenía una combinación de desoxinucleótidos en la región semilla, un desoxinucleótido sustituido en 2'-F y ribonucleótidos sustituidos en 2'-OMe, proporcionó un aumento inesperado de apoptosis de las células cancerosas.

El nivel de expresión de PUMA para ARNip de GST-rc, SEQ ID NO: 156 y 182, se midió tal como se muestra en la figura 6. En la figura 6, la expresión de PUMA aumentó considerablemente desde 2-4 días después de la transfección del ARNip de GST-rc.

Estos datos muestran que la estructura de los ARNip de GST-rc que contienen una combinación de desoxinucleótidos en la región semilla, un desoxinucleótido sustituido en 2'-F y ribonucleótidos sustituidos en 2'-OMe, proporcionó un aumento inesperado de apoptosis de las células cancerosas.

El protocolo para el biomarcador PUMA fue el siguiente. Un día antes de la transfección, se sembraron en placa las células en una placa de 96 pocillos a 2 x 103 células por pocillo con 100 |il de DMEM (n.° de cat. SH30243.01 de HyClone) que contenía FBS al 10% y se cultivaron en una incubadora a 37°C que contenía una atmósfera humidificada del 5% de CO²en aire. Al día siguiente, antes de la transfección, se reemplazó el medio con 90 |il de medio de suero reducido Opti-MEM I (n.° de cat. 31985-070 de Life Technologies) que contenía FBS al 2%. Entonces, se mezclaron 0,2 |il de Lipofectamine RNAiMax (n.° de cat. 13778-100 de Life Technologies) con 4,8 |il de Opti-MEM I durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se mezcló 1 |il del ARNip de GST-rc (conc. de disolución madre 1 |iM) con 4 |il de Opti-MEM I y se combinó con la disolución de RNAiMAX, y se mezcló suavemente. Se incubó la mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente para permitir que se formaran los complejos ARN-RNAiMAX. Se añadieron 10 |il de complejos ARN-RNAiMax por pocillo, hasta una concentración final del ARNip de 10 nM. Se incubaron las células durante 2 horas y se cambió el medio por medio de suero reducido Opti-MEM I recién preparado que contenía FBS al 2%. 1, 2, 3, 4 y 6 días después de la transfección, se lavaron las células una vez con PBS helado y luego se lisaron con 50 |il de tampón de lisis Cell-to-Ct (n.° de cat. 4391851 C de Life Technologies) durante 5-30 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 5 |il de disolución de parada y se incubaron durante 2 minutos a temperatura ambiente. Se midieron los niveles de ARNm de PUMA (BBC3, n.° de cat. Hs00248075, Life Technologies) mediante qPCR con TAQMAN.

Ejemplo 8: los ARNip de GST-rc comprendidos en las composiciones de esta invención, tal como se definen en las reivindicaciones, pueden presentar una reducción profunda de los tumores de xenoinjerto de cáncer in vivo. Los ARNip de GST-rc pueden proporcionar potencia de atenuación génica in vivo cuando se administran en una formulación liposómica a los tumores de xenoinjerto de cáncer.

La figura 7 muestra la eficacia de inhibición del tumor para un ARNip de GST-rc (SEQ ID NO: 61 y 126). La atenuación dependiente de la dosis de ARNm de GST-rc se observó in vivo con el ARNip dirigido a GST-rc. Se utilizó un modelo de xenoinjerto de cáncer con un ARNip dirigido a GST-rc.

El ARNip de GST-rc mostró una eficacia de inhibición del tumor significativa e inesperadamente ventajosa a los pocos días de la administración. Tal como se muestra en la figura 7, el tratamiento con un ARNip de GST-rc dio como resultado una reducción significativa de la expresión del ARNm de GST-rc 4 días después de la inyección en una formulación lipídica. A la dosis más alta de 4 mg/kg, se detectó una reducción significativa de aproximadamente el 40% 24 horas después de la inyección.

Se administró el ARNip de p21 en una única inyección de 10 ml/kg de una formulación liposómica que tenía la composición (lípido ionizable:colesterol:DOPE:DOPC:DPPE-PEG-2K) (25:30:20:20:5).

Para el modelo de xenoinjerto de cáncer, se obtuvo una línea celular A549 de ATCC. Se mantuvieron las células en medio de cultivo complementado con suero bovino fetal al 10% y penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 |ig/ml. Se dividieron las células 48 horas antes de la inoculación para que las células estuvieran en fase de crecimiento logarítmico cuando se recogieran. Se sometieron ligeramente las células a tripsinización con tripsina-EDTA y se recogieron del cultivo tisular. Se contó el número de células viables y se determinó en un hemocitómetro en presencia de azul trípano (sólo se cuentan las células viables). Se resuspendieron las células a una concentración de 4 * 107/ml en medio sin suero. Luego, se mezcló bien la suspensión celular con BD Matrigel descongelado en hielo en una razón 1:1 para inyección.

Los ratones fueron ratones hembra atímicos desnudos (nu/nu) del Charles River Laboratory, inmunodeprimidos, de 6 a 8 semanas de edad, 3 ratones por grupo.

Para las mediciones del volumen del tumor y la aleatorización, se midió el tamaño del tumor al 0,1 mm más cercano. Se calcularon los volúmenes de los tumores usando la fórmula: volumen del tumor = largo x anchura2/2. Se monitorizaron los volúmenes de los tumores dos veces por semana. Una vez que los tumores establecidos alcanzaron aproximadamente 350-600 mm3, se asignaron los ratones a grupos con puntos de tiempo variados. El mismo día, se administraron los artículos de prueba según la pauta posológica.

Para la administración de la dosificación, el día que los tumores establecidos alcanzaron aproximadamente 350 - 600 mm3, se sacaron los artículos de prueba del frigorífico a 4°C. Antes de aplicarlo a las jeringas, se invirtió el frasco que contenía la formulación con las manos unas cuantas veces para homogeneizar la disolución.

Para determinar el peso corporal, se pesaron los ratones con una precisión de 0,1 g. Se monitorizaron y registraron los pesos corporales dos veces por semana, durante el resto de las semanas, incluyendo el día de finalización del estudio.

Para la recolección de tumores, se sacrificaron los animales por sobredosis de CO²y se diseccionaron los tumores a las 0, 24, 48, 72, 96 (opcional) y 168 horas después de la dosificación. En primer lugar, se pesaron los tumores en húmedo y luego se separaron en tres partes para el análisis de KD, distribución y biomarcadores. Se congelaron rápidamente las muestras en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C hasta que estuvieron listas para ser procesadas.

Las realizaciones y los aspectos de la divulgación descritos en el presente documento no son limitativos y un experto en la técnica puede apreciar fácilmente que pueden someterse a prueba combinaciones específicas de las modificaciones descritas en el presente documento sin experimentación excesiva para identificar moléculas de ácido nucleico con actividad de iARN mejorada.

Se entiende que esta invención no se limita a la metodología, los protocolos, materiales y reactivos particulares descritos, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento tiene el fin de describir únicamente realizaciones particulares. Será fácilmente evidente para un experto en la técnica que pueden realizarse diversas sustituciones y modificaciones a la descripción divulgada en el presente documento sin apartarse del alcance y espíritu de la descripción, y que esas realizaciones están dentro del alcance de esta descripción y las reivindicaciones adjuntas.

Debe observarse que, tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un/uno”, “una” y “el/la” incluyen la referencia en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Además, los términos “un/uno” (o “una”), “uno o más” y “al menos uno” pueden usarse indistintamente en el presente documento. También debe observarse que los términos “comprende”, “que comprende”, “que contiene”, “que incluye” y “que tiene” pueden usarse indistintamente, y se leerán de manera amplia y sin limitación.

La enumeración de intervalos de valores en el presente documento está destinada simplemente a servir como un método abreviado para hacer referencia individualmente a cada valor por separado que se encuentre dentro del intervalo, a menos que se indique lo contrario en el presente documento, y cada valor por separado se incorpora en la memoria descriptiva como si se enumerara individualmente en el presente documento. Para los grupos de Markush, los expertos en la técnica reconocerán que esta descripción incluye los miembros individuales, así como los subgrupos de los miembros del grupo de Markush.

Sin más elaboración, se cree que un experto en la técnica puede utilizar, basándose en la descripción anterior, la presente invención en su máxima extensión.

Todas las características divulgadas en esta memoria descriptiva pueden combinarse en cualquier combinación. Cada característica divulgada en esta memoria descriptiva puede ser reemplazada por una característica alternativa que tenga el mismo propósito, equivalente o similar.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Composición que comprende moléculas de iARN dirigidas a una GST-rc humana, moléculas de iARN dirigidas a una p21 humana codificada por un gen CDKN1A, y un portador farmacéuticamente aceptable.

2. Composición según la reivindicación 1, en la que:

I) cada una de las moléculas de iARN dirigidas a GST-rc tiene una cadena antisentido SEQ ID NO: 131 y una cadena sentido SEQ ID NO: 157;

II) cada una de las moléculas de iARN dirigidas a p21 tiene una cadena antisentido SEQ ID NO:341 y una cadena sentido SEQ ID NO:355;

III) cada una de las moléculas de iARN dirigidas a GST-rc tiene una cadena antisentido SEQ ID NO: 156 y una cadena sentido SEQ ID NO: 182; o

IV) cada una de las moléculas de iARN dirigidas a diana p21 tiene una cadena antisentido SEQ ID NO:343 y una cadena sentido SEQ ID NO:357.

3. Composición según la reivindicación 1, en la que uno o más de los nucleótidos en la región dúplex de las moléculas de iARN están modificados o modificados químicamente, preferiblemente en la que los nucleótidos modificados o modificados químicamente son 2'-desoxinucleótidos, nucleótidos sustituidos con 2'-O-alquilo, nucleótidos sustituidos con 2'-desoxi-2'-fluoro, nucleótidos fosforotioato, nucleótidos bloqueados, o cualquier combinación de los mismos.

4. Composición según la reivindicación 1, en la que cada una de las moléculas de iARN contiene un desoxinucleótido T en una o más de posiciones 2 a 8 desde el extremo 5' de la cadena antisentido.

5. Composición según la reivindicación 1, en la que la cadena antisentido de cada de una de las moléculas de iARN tiene desoxinucleótidos en una pluralidad de posiciones, siendo la pluralidad de posiciones una de las siguientes:

cada una de las posiciones 4, 6 y 8, desde el extremo 5' de la cadena antisentido;

cada una de las posiciones 3, 5 y 7, desde el extremo 5' de la cadena antisentido;

cada una de las posiciones 1, 3, 5 y 7, desde el extremo 5' de la cadena antisentido;

cada una de las posiciones 3-8, desde el extremo 5' de la cadena antisentido; o

cada una de las posiciones 5-8, desde el extremo 5' de la cadena antisentido.

6. Composición según la reivindicación 1, en la que la composición inhibe la expresión del ARNm de GST-rc con una CI50 de menos de 50 pM, e inhibe la expresión del ARNm de p21 con una CI50 de menos de 50 pM, o en la que una única administración de la composición inhibe la expresión de los niveles de ARNm de GST-rc in vivo en al menos el 25%.

7. Composición según la reivindicación 1, en la que el portador comprende:

I) nanopartículas liposómicas que encapsulan las moléculas de iARN;

II) nanopartículas liposómicas que encapsulan las moléculas de iARN y conservan al menos el 80% de las moléculas de iARN encapsuladas después de 1 hora de exposición a suero humano; o

III) nanopartículas liposómicas que tienen un tamaño de 10 a 1000 nm, o de 10 a 150 nm.

8. Composición según la reivindicación 1, en la que la composición es activa para tratar un tumor maligno, preferiblemente en la que el tumor maligno está ubicado en el pulmón, colon, riñón, páncreas, hígado, hueso, piel o intestino.

9. Composición según la reivindicación 1, en la que el portador comprende nanopartículas liposómicas que comprenden un lípido ionizable, un lípido estructural, uno o más lípidos estabilizadores, y un lípido para reducir la inmunogenicidad de las nanopartículas, preferiblemente en la que el lípido ionizable se selecciona del grupo de los siguientes compuestos:

10. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, para su uso en un método para prevenir, tratar o mejorar uno o más síntomas de un tumor maligno en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad eficaz de dicha composición.

11. Composición según la reivindicación 10 para su uso según la reivindicación 10, en la que:

I) el tumor maligno se asocia con la mutación de KRAS, comprendiendo el método además identificar una célula tumoral en el sujeto, comprendiendo la célula tumoral al menos uno de: (i) una mutación del gen KRAS, y (ii) un nivel de expresión aberrante de la proteína KRAS

II) el tumor maligno sobreexpresa GST-tc; o

III) las moléculas de iARN disminuyen la expresión de GST-tc y p21 en el sujeto.

12. Composición según la reivindicación 10 para su uso según la reivindicación 10, en la que en el método la administración:

I) disminuye la expresión de GST-tc y p21 en el sujeto en al menos el 5% durante al menos 5 días;

II) disminuye el volumen del tumor maligno en el sujeto en al menos el 5%, o al menos el 10%, o al menos el 20%, o al menos el 30%, o al menos el 40% o al menos el 50%;

III) reduce el crecimiento de células tumorales malignas en el sujeto; o

IV) reduce el crecimiento para al menos el 2%, o al menos el 5%, o al menos el 10%, o al menos el 15% o al menos el 20% de las células tumorales malignas en el sujeto.

13. Composición según la reivindicación 10 para su uso según la reivindicación 10, en la que el método reduce uno o más síntomas del tumor maligno, o retrasa o termina la progresión del tumor maligno.

14. Composición según la reivindicación 10 para su uso según la reivindicación 10, en la que el tumor maligno es cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer de riñón, cáncer de pulmón, cáncer de mama o fibrosarcoma, o en la que el tumor maligno es adenocarcinoma de pulmón, adenoma mucinoso, carcinoma ductal del páncreas o carcinoma colorrectal.

15. Composición según la reivindicación 10 para su uso según la reivindicación 10, en la que en el método la administración:

I) se realiza desde 1 hasta 12 veces por día;

II) se realiza durante una duración de 1,2, 3, 4, 5, 6 ó 7 días;

III) se realiza durante una duración de 1,2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 ó 12 semanas;

IV) es una dosis de desde 0,01 hasta 2 mg/kg de las moléculas de iARN al menos una vez por día durante un periodo de hasta doce semanas;

V) proporciona una AUC(O-última) media de desde 1 hasta 1000 ug*min/ml y una Cmáx media de desde 0,1 hasta 50 ug/ml para la molécula de iARN de GST-rc;

VI) proporciona una AUC(O-última) media de desde 1 hasta 1000 ug*min/ml y una Cmáx media de desde 0,1 hasta 50 ug/ml para la molécula de iARN de p21; o

VII) es una inyección intravenosa, inyección intradérmica, inyección subcutánea, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, oral, tópica, infusión o inhalación.