ES2842849T3

ES2842849T3 - Péptidos CTL H3.3 y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2842849T3
Application number: ES16790043T
Authority: ES
Inventors: Hideo Okada; Yafei Hou
Original assignee: University of California Berkeley; University of California San Diego UCSD
Current assignee: University of California Berkeley; University of California San Diego UCSD
Priority date: 2015-05-05
Filing date: 2016-05-04
Publication date: 2021-07-15
Anticipated expiration: 2036-05-04
Also published as: EP3292139B1; WO2016179326A1; AU2016258984A1; AU2016258984B2; US20250090636A1; EP3800199C0; EP4450083A3; EP3292139A1; EP3800199B1; US20220118069A1; EP3292139A4; EP3800199A1; CA2984380A1; EP4450083A2

Abstract

Una célula T que expresa uno o más polipéptidos que comprenden un receptor de células T (TCR) o un fragmento del mismo que se une a un complejo de péptido/complejo principal de histocompatibilidad (MHC), en donde el MHC es HLA-A*0201 y en donde el péptido en el complejo péptido/MHC consiste en 10-14 aminoácidos y comprende RMSAPSTGGV (SEQ ID NO: 2).

Description

DESCRIPCIÓN

Péptidos CTL H3.3 y usos de los mismos

Declaración de derechos a invenciones realizadas bajo investigación y desarrollo con patrocinio federal

La presente invención se realizó con soporte del gobierno con la subvención n.° R21 NS083171, otorgada por el National Institutes of Health. El gobierno posee determinados derechos sobre la invención.

Antecedentes de la invención

Los gliomas malignos, incluyendo glioblastoma (GBM) y gliomas pontinos intrínsecos difusos (DIPG), son tumores cerebrales letales tanto en adultos como en niños. Los estudios genéticos recientes han desvelado que los gliomas malignos en niños y adultos jóvenes a menudo muestran mutaciones sin sentido recurrentes en H3F3A, que codifica la variante H3.3 de histona 3 independiente de la replicación. Véase, por ejemplo, Lewis et al., Science Vol. 340 n.° 6134 pág. 857-861 (2013). Aproximadamente el 30 % del total de GBM y el 70 % de los casos de DIPG albergan la sustitución de aminoácidos de lisina (K) a metionina (M) en la posición 27 de H3.3 (mutación K27M, en lo sucesivo en el presente documento), que se asocia universalmente a una supervivencia más corta en los pacientes con DIPG en comparación con los pacientes con H3.3 no mutada. El sistema inmunitario adaptativo, tal como los linfocitos T (en lo sucesivo en el presente documento, células T), son normalmente tolerantes a las autoproteínas normales, pero pueden reconocer los aminoácidos mutados como no propios. Por tanto, las mutaciones específicas del cáncer pueden ser dianas adecuadas de la inmunoterapia del cáncer, tales como las vacunas contra el cáncer y la terapia de transferencia de células T adoptivas.

El documento US 2014/107039 describe inhibidores del complejo represor Polycomb 2 (prc2) y usos de los mismos. El documento WO 2013/075237 describe mutaciones de proteínas histonas asociadas a trastornos proliferativos. P. W. Lewis et al., Science, 2013, 340:857-861 describen la inhibición de la actividad de PRC2 por una mutación H3 de ganancia de función encontrada en el glioblastoma pediátrico. Cuthbert G. L. et al., Cell, 2004, 118(5):545-553 describen que la desaminación de histonas antagoniza la metilación de la arginina. El documento WO 2009/147201 describe moléculas de unión específicas dirigidas contra epítopos que contienen citrulina para su uso en la terapia y la prevención de afecciones inflamatorias.

Breve sumario de la invención

La presente invención proporciona:

(i) Una célula T que expresa uno o más polipéptidos que comprenden un receptor de células T (TCR) o un fragmento del mismo que se une a un complejo de péptido/complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), en donde el MHC es HLA-A*0201 y en donde el péptido en el complejo péptido/MHC consiste en 10-14 aminoácidos y comprende RMSAPSTGGV (SEQ ID NO: 2).

(ii) Un método de enriquecimiento de células T que expresan un TCR que se une a un complejo péptido/MHC, en donde el MHC es HLA-A*0201, en donde el péptido en el complejo péptido/MHC consiste en 10-14 aminoácidos y en donde el péptido comprende RMSAPSt Gg V (SEQ ID NO: 2), comprendiendo el método

generar un cultivo inicial de células T que expresan TCR;

cultivar las células T en presencia del péptido para generar un cultivo enriquecido de células T, en donde el cultivo enriquecido está enriquecido para células T que expresan TCR que se unen al complejo péptido/MHC en comparación con el cultivo de partida.

(iii) Un péptido aislado que consiste en RMSAPSTGGV (SEQ ID NO: 2), opcionalmente en donde R en SEQ ID NO: 2 está citrulinado o no citrulinado.

(iv) Una composición para estimular una respuesta inmunitaria a la variante H3.3 de histona 3 independiente de la replicación, comprendiendo la composición el péptido de (iii), comprendiendo además opcionalmente un adyuvante.

(v) Un multímero del péptido-complejo mayor de histocompatibilidad (pMHC) conjugado con fluorocromo, en donde el MHC es HLA-A*0201 y en donde el péptido es el péptido de (iii).

(vi) Un ácido nucleico que codifica el péptido de (iii).

(vii) Una célula presentadora de antígeno (APC) que comprende un péptido heterólogo que consiste en 10-12 aminoácidos, en donde el péptido comprende RMSAPSTg Gv (SEQ ID NO: 2).

(viii) Una APC de (vii) para su uso en un método de tratamiento de glioma en un individuo humano, comprendiendo el método, administrar una cantidad suficiente de la APC al individuo humano.

(ix) Una composición que comprende un péptido que consiste en 10-12 aminoácidos, en donde el péptido comprende RMSAPSTGGV (SEQ ID NO: 2), para su uso en un método de tratamiento de glioma en un individuo humano, comprendiendo el método administrar una cantidad suficiente de la composición al individuo humano.

En algunos aspectos, se describe un péptido aislado que consiste en menos de 100, 75, 50 o 30 aminoácidos, en donde el péptido comprende (R/A)MSAP(S/A)TGGV (s Eq ID NO: 1). En algunos aspectos, el péptido consiste en 10 14 aminoácidos. En algunos aspectos, el péptido consiste en (R/A)MSAP(S/A)TGGV (SEQ ID NO: 1). En algunos aspectos, la R en SEQ ID NO: 1 está citrulinada. En algunos aspectos, la R en SEQ ID NO: 1 no está citrulinada.

También se describe un multímero del complejo péptido-mayor de histocompatibilidad (pMHC) conjugado con fluorocromo, en el que el péptido es como se describe anteriormente o en otra parte en el presente documento.

También se describe un ácido nucleico, opcionalmente aislado o purificado, que codifica el péptido como se describe anteriormente o en otra parte en el presente documento. En algunos aspectos, el ácido nucleico es un plásmido o un vector vírico. En algunos aspectos, el vector es capaz de administrar el ácido nucleico a una célula presentadora de antígeno (APC).

También se describe una célula que comprende un péptido heterólogo que consiste en 10-12 o 10-14 (por ejemplo, 10, 11, 12, 13 o 14) aminoácidos, en donde el péptido comprende (R/A)MSAP(S/A)TGGV (SEQ ID NO:1). En algunos aspectos, el péptido consiste en (R/A)MSAP(S/A)TGGV (SEQ ID NO:1). En algunos aspectos, la R en SeQ ID NO:1 está citrulinada. En algunos aspectos, la R en SEQ ID NO:1 no está citrulinada. En algunos aspectos, la célula es una célula presentadora de antígenos (APC). En algunos aspectos, la célula es una célula bacteriana. En algunos aspectos, la célula bacteriana es E. coli o Listeria monocytogenes. En algunos aspectos, la APC presenta el péptido heterólogo en la superficie de la célula. En algunos aspectos, la APC comprende un casete de expresión heterólogo que comprende un promotor operativamente unido a un polinucleótido que codifica el péptido.

También se describe un método para inducir una respuesta inmunitaria en un individuo humano. En algunos aspectos, el método comprende administrar una cantidad suficiente de las APC como se describe anteriormente o en cualquier otro lugar en el presente documento al individuo humano, induciendo de esta manera una respuesta inmunitaria en el individuo humano a la variante H3.3 o H3.1 de la histona 3 independiente de la replicación. En algunos aspectos, las APC son del individuo (autólogas). En algunos aspectos, la respuesta inmunitaria es una respuesta de células T citotóxicas. En algunos aspectos, el individuo humano tiene un glioma. En algunos aspectos, el individuo es portador de un alelo HLA-2*201.

También se describe una composición para estimular una respuesta inmunitaria a la variante H3.3 de histona 3 independiente de la replicación, la composición comprende, un péptido que consiste en 10-12 o 10-14 (por ejemplo, 10, 11, 12, 13 o 14) aminoácidos, en donde el péptido comprende (R/A)MSAP(S/A)TGGV (SEQ ID NO:1). En algunos aspectos, la composición comprende un péptido que consiste en (R/A)MSAP(S/A)TGGV (SEQ ID NO:1). En algunos aspectos, la composición comprende además un adyuvante. En algunos aspectos, la R en SEQ ID NO:1 está citrulinada. En algunos aspectos, la R en SEQ ID NO:1 no está citrulinada.

También se describe un método para inducir una respuesta inmunitaria en un individuo humano, comprendiendo el método administrar una cantidad suficiente de la composición como se describe anteriormente o en cualquier otro lugar en el presente documento al individuo humano, induciendo de esta manera una respuesta inmunitaria en el individuo humano a la variante H3.3 o H3.1 de la histona 3. En algunos aspectos, la composición comprende un adyuvante seleccionado del grupo que consiste en poliICLC y la vacuna del Bacillus de Calmette-Guerin (BCG). En algunos aspectos, la respuesta inmunitaria es una respuesta de células T citotóxicas. En algunos aspectos, el individuo humano tiene un glioma. En algunos aspectos, el individuo es portador de un alelo HLA-2*201.

También se describe un anticuerpo que se une específicamente a RMSAPSTGGV (SEQ ID NO:2) y no se une a RKSAPSTGGV (SEQ ID NO:3). En algunos aspectos, el anticuerpo está enlazado a un marcador detectable heterólogo. En algunos aspectos, el marcador es fluorescente.

También se describe una célula T que expresa un polipéptido o polipéptidos que comprenden un receptor de células T (TCR), o un fragmento de unión al péptido/complejo MHC del mismo, que se une al péptido como se describe anteriormente o en cualquier otro lugar en el presente documento en un complejo péptido/MHC. En algunos aspectos, el TCR es heterólogo a la célula T. En algunos aspectos, la expresión del TCR está bajo el control de un promotor heterólogo (por ejemplo, como transgenes). En algunos aspectos, el TCR comprende una o más de las CDR enumeradas en sEq ID NO: 12-17, opcionalmente en una región marco heteróloga. En general, el TCR estará formado por una cadena alfa y una beta (dos polipéptidos separados). En algunos aspectos, el TCR comprende SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 10, o ambas, ya sea como proteína de fusión o como proteínas separadas.

También se describe un método de enriquecimiento de células T que expresan un TCR que se une al péptido como se describe anteriormente o en otra parte del presente documento. En algunos aspectos, el método comprende generar un cultivo de partida de células T que expresan TCR; cultivar las células T en presencia del péptido para generar un cultivo enriquecido de células T, en donde el cultivo enriquecido está enriquecido para células T que expresan TCR que se unen al péptido en comparación con el cultivo de partida. En algunos aspectos, el cultivo comprende cultivar las células T en presencia de IL-2, IL-4, IL-7, IL-15 o combinaciones de los mismos. En algunos aspectos, el método comprende además clasificar las células en el cultivo enriquecido para las células T que se unen al péptido en un complejo péptido/MHC para formar una población enriquecida adicional de células T que expresan TCR que se unen al complejo péptido/MHC. En algunos aspectos, la clasificación comprende poner en contacto las células del cultivo enriquecido con un multímero del péptido-complejo mayor de histocompatibilidad (pMHC) conjugado con fluorocromo.

Definiciones

"Ácido nucleico" se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma mono- o bicatenaria y complementos de las mismas. La expresión abarca ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos conocidos o restos o enlaces modificados de la cadena principal, que son sintéticos, de origen natural y de origen no natural, que tienen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia y que se metabolizan de forma similar a los nucleótidos de referencia. Los ejemplos de dichos análogos incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforoamidatos, metil fosfonatos, metil fosfonatos quirales, 2-O-metil ribonucleótidos, ácidos nucleicos peptídicos (ANP).

A menos que se indique lo contrario, una secuencia particular del ácido nucleico también abarca implícitamente variantes modificadas conservativamente de la misma (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias, así como la secuencia explícitamente indicada. Específicamente, las sustituciones de codones degenerados pueden lograrse mediante la generación de secuencias en las cuales la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye con restos de base mixta y/o de desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de restos de aminoácidos. Los términos abarcan polímeros de aminoácidos en donde uno o más restos de aminoácidos son un mimético químico artificial de un aminoácido correspondiente de origen natural, así como polímeros de aminoácidos de origen natural y a polímeros de aminoácidos de origen no natural.

El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos de origen natural y sintético, así como a análogos y miméticos de aminoácidos que funcionan de una manera similar a los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos de origen natural son los codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que se modifican después, por ejemplo, hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato y O-fosfoserina. La expresión "análogos de aminoácidos" se refiere a compuestos que tienen la misma estructura química básica que la de un aminoácido de origen natural, es decir, un carbono a que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metil sulfonio de metionina. Dichos análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o estructuras principales peptídicas modificadas, pero retienen la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural. La expresión "miméticos de aminoácidos" se refiere a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funcionan de manera similar a un aminoácido de origen natural.

Los aminoácidos pueden citarse en el presente documento bien por sus símbolos habitualmente conocidos de tres letras, o mediante los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura bioquímica de la IUPAC-IUB. Los nucleótidos, igualmente, pueden citarse por sus códigos de una letra habitualmente aceptados.

"Variantes modificadas conservativamente" se aplica a secuencias tanto de aminoácidos como de ácido nucleico. Con respecto a secuencias de ácidos nucleicos concretas, las variantes modificadas conservativamente se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o si el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias prácticamente idénticas. A causa de la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican, todos ellos, el aminoácido alanina. Por lo tanto, en cada posición donde una alanina se especifica mediante un codón, el codón puede alterarse a cualquiera de los codones descritos correspondientes sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas", que son un tipo de variaciones modificadas conservativamente. Cada secuencia de ácido nucleico en el presente documento que codifica un polipéptido también describe todas y cada una de las posibles variaciones silenciosas del ácido nucleico. Un experto reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que normalmente es el único codón para metionina, y UGG, que es normalmente el único codón para triptófano) puede modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica. En consecuencia, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita con respecto al producto de expresión, pero no con respecto a secuencias de sonda reales.

Para las secuencias de aminoácidos, un experto reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales a una secuencia de ácido nucleico, peptídica, polipeptídica o proteica que altera, añade o elimina un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos de la secuencia codificada es una "variante modificada conservativamente" donde la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Dichas variantes modificadas conservativamente son adicionales, y no excluyen, las variantes polimórficas, homólogos interespecíficos, y alelos de la invención.

Los ocho grupos siguientes contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); y 8) Cisteína (C), Metionina (M) (véase, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)).

Una "marca" o un "resto detectable" es una composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, químicos u otros medios físicos. Por ejemplo, los marcadores útiles incluyen 32P, colorantes fluorescentes, reactivos densos en electrones, enzimas (por ejemplo, como se usa comúnmente en un ELISA), biotina, digoxigenina o haptenos y proteínas que puedan volverse detectables, por ejemplo, incorporando un radiomarcador en el péptido o usado para detectar anticuerpos específicamente reactivos con el péptido.

Un anticuerpo puede consistir en uno o más polipéptidos sustancialmente codificados por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de las regiones constantes kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como innumerables genes de la región variable de inmunoglobulinas. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Un "anticuerpo" funciona como una proteína de unión y se define estructuralmente como que comprende una secuencia de aminoácidos de o derivada de la región marco de un gen que codifica inmunoglobulina de un animal vertebrado.

Se sabe que una unidad estructural de inmunoglobulina (anticuerpo) típica comprende un tetrámero. Cada tetrámero se compone de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kD) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kD). El extremo N de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsable del reconocimiento de antígenos. Las expresiones cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) se refieren a estas cadenas ligeras y pesadas respectivamente.

El término "anticuerpo" como se usa en el presente documento abarca fragmentos de anticuerpos que retienen la especificidad de unión al antígeno. Por ejemplo, hay varios fragmentos de anticuerpos bien caracterizados. Por lo tanto, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo C-terminal a los enlaces disulfuro en la región bisagra para producir F(ab)'2, un dímero de Fab que es, él mismo, una cadena ligera unida a VH-CH1 mediante un enlace disulfuro. El F(ab)'2 puede reducirse en condiciones suaves para romper el enlace disulfuro en la región bisagra, convirtiendo de esta manera el dímero F(ab')2 en un monómero Fab'. El monómero Fab' es esencialmente un Fab con parte de la región bisagra (véase, por ejemplo, Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993), para una descripción más detallada de otros fragmentos de anticuerpos). Aunque diversos fragmentos de anticuerpos se definen en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, un experto apreciará que los fragmentos pueden sintetizarse de novo ya sea químicamente o utilizando metodología de ADN recombinante. Por lo tanto, el término "anticuerpo", como se usa en el presente documento también incluye fragmentos de anticuerpos producidos por la modificación o digestión de anticuerpos completos o sintetizados usando metodologías de ADN recombinante.

Los anticuerpos pueden incluir dímeros V^h-V^l, incluyendo anticuerpos monocatenarios (anticuerpos que existen como una única cadena polipeptídica), tales como anticuerpos Fv de cadena sencilla (sFv o scFv) en los cuales una región pesada variable y una región ligera variable se unen (directamente o mediante un enlazador peptídico) para formar un polipéptido continuo. El anticuerpo Fv monocatenario es un V^h-V^lunido covalentemente que puede expresarse a partir de un ácido nucleico que incluye secuencias codificantes de V^h- y V^l- unidas directamente o unidas por un enlazador que codifica un péptido (por ejemplo, Huston, et al. Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU., 85:5879-5883, 1988). Mientras que la V^hy V^lestán conectadas entre sí como una única cadena polipeptídica, los dominios V^hy V^lse asocian no covalentemente. Alternativamente, el anticuerpo puede ser otro fragmento. También pueden generarse otros fragmentos, por ejemplo, usando técnicas recombinantes, como proteínas solubles o como fragmentos obtenidos a partir de métodos de presentación. Los anticuerpos también pueden incluir diaanticuerpos y minianticuerpos. Los anticuerpos descritos en el presente documento también incluyen dímeros de cadena pesada, tales como los anticuerpos de los camélidos. Por lo tanto, en algunos aspectos, un anticuerpo es dimérico. En otros aspectos, el anticuerpo puede estar en una forma monomérica que tiene un isotipo activo. En algunos aspectos, el anticuerpo está en forma multivalente, por ejemplo, una forma trivalente o tetravalente.

Como se usa en el presente documento, "región determinante de complementariedad (CDR)" se refiere a las tres regiones hipervariables en cada cadena que interrumpen las cuatro regiones "marco" establecidas por las regiones variables de cadena ligera y pesada. Las CDR son responsables principalmente de la unión a un epítopo de un antígeno. Las CDR de cada cadena se denominan normalmente CDR1, CDR2 y CDR3, numeradas secuencialmente empezando desde el extremo N, y también se identifican típicamente por la cadena en la que está ubicada la CDR particular. Por lo tanto, una CDR3 V^hestá ubicada en el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo en el que se encuentra, mientras que una CDR1 V^les la CDR1 del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo en el que se encuentra.

Como se usa en el presente documento, "región V" se refiere a un dominio de región variable de anticuerpo que comprende los segmentos del Marco 1, CDR1, Marco 2, CDR2 y Marco 3, incluyendo CDR3 y Marco 4, cuyos segmentos se añaden al segmento V como consecuencia de la transposición de los genes de la región V de la cadena pesada y la cadena ligera durante la diferenciación de las células B.

Las secuencias de las regiones marco conservadas de diferentes cadenas ligeras o pesadas están relativamente conservadas dentro de una especie. La región marco de un anticuerpo, esto es, las regiones marco conservadas combinadas de las cadenas ligeras y pesadas constituyentes, sirve para colocar y alinear las CDR en el espacio tridimensional.

Las secuencias de aminoácidos de las CDR y las regiones marco pueden determinarse usando diversas definiciones bien conocidas en la técnica, por ejemplo, Kabat, Chothia, base de datos internacional ImMunoGeneTics (IMGT) y AbM (véanse, por ejemplo, Johnson et al., anteriormente citado; Chothia y Lesk, 1987, Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J. Mol. Biol. 196, 901-917; Chothia C. et al., 1989, Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature 342, 877-883; Chothia C. et al., 1992, structural repertoire of the human VH segments J. Mol. Biol. 227, 799-817; Al-Lazikani et al., J. Mol.Biol 1997, 273(4)). Las definiciones de los sitios de combinación de antígenos también se describen en los siguientes: Ruiz et al., IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res., 28, 219-221 (2000); y Lefranc, M.-P. IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res. 1 de enero;29(1):207-9 (2001); MacCallum et al, Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography, J. Mol. Biol., 262 (5), 732-745 (1996); y Martin et al, Proc. Natl Acad. Sci. EE.UU., 86, 9268-9272 (1989); Martin, et al, Methods Enzymol., 203, 121-153, (1991); Pedersen et al, Immunomethods, 1, 126, (1992); y Rees et al, En Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172 1996).

"Epítopo" o "determinante antigénico" se refiere a un sitio sobre un antígeno al que se une un anticuerpo. Los epítopos pueden formarse tanto a partir de aminoácidos contiguos como a partir de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por el plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos normalmente se retienen frente a la exposición a disolventes desnaturalizantes mientras que los epítopos formados por el plegamiento terciario normalmente se pierden tras el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo normalmente incluye al menos 3, y más habitualmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única. Los métodos para determinar la conformación espacial de los epítopos incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos x y resonancia magnética nuclear en 2 dimensiones. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed (1996).

Como se usa en el presente documento, "anticuerpo quimérico" se refiere a una molécula de inmunoglobulina en la cual (a) la región constante, o una porción de la misma, se altera, se sustituye o se intercambia de tal manera que el sitio de unión al antígeno (región variable) está unida a una región constante de una clase, función efectora y/o especie diferente o alterada, o una molécula enteramente diferente que confiere nuevas propiedades al anticuerpo quimérico, por ejemplo, una enzima, toxina, hormona, factor de crecimiento, fármaco, etc.; o (b) la región variable, o una parte de la misma, se altera, se reemplaza o se intercambia con una región variable, o una porción de la misma, que tiene una especificidad antigénica diferente o alterada; o con secuencias correspondientes de otra especie o de otra clase o subclase de anticuerpos.

La expresión "se une específicamente (o selectivamente)" a un anticuerpo o es "específicamente (o selectivamente) inmunorreactivo con", cuando se refiere a una proteína o péptido, se refiere a una reacción de unión que es determinante de la presencia de la proteína, a menudo en una población heterogénea de proteínas y otros productos biológicos, como una mezcla de células o un lisado celular. Por lo tanto, en condiciones de inmunoensayo diseñadas, los anticuerpos especificados se unen a una proteína particular (por ejemplo, SEQ ID NO:2) en al menos dos veces el fondo y, de forma más típica, más de 10 a 100 veces el fondo. La unión específica a un anticuerpo en dichas condiciones requiere un anticuerpo que se selecciona por su especificidad para una proteína en particular. Por ejemplo, pueden seleccionarse anticuerpos policlonales para obtener solamente un subconjunto de anticuerpos que sean específicamente inmunorreactivos con el antígeno seleccionado y no con otras proteínas. Esta selección puede lograrse restando los anticuerpos que reaccionan en cruzado con otras moléculas. Puede usarse una diversidad de formatos de inmunoensayo para seleccionar anticuerpos que son específicamente inmunorreactivos con una proteína en particular. Por ejemplo, los inmunoensayos de ELISA en fase sólida se usan de forma rutinaria para seleccionar anticuerpos que son específicamente inmunorreactivos con una proteína (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998) para una descripción de formatos de inmunoensayos y condiciones que pueden usarse para determinar la inmunorreactividad específica).

Las "células presentadoras de antígenos" o "APC" son células que median en la respuesta inmunitaria celular procesando y presentando antígenos al receptor de células T e incluyen células de Langerhans, células veladas de linfáticos aferentes, células dendríticas y células interdigitantes de órganos linfoides. Las APC incluyen células mononucleares tales como linfocitos y macrófagos.

Una secuencia de polinucleótidos o polipéptidos es "heteróloga" para un organismo o una segunda secuencia de polinucleótidos si se origina a partir de una especie extraña, o, si es de la misma especie, se modifica de su forma original. Por ejemplo, cuando se dice que un promotor heterólogo está operativamente unido a una secuencia codificante, significa que la secuencia codificante deriva de una especie mientras que la secuencia promotora deriva de otra especie diferente; o, si ambas derivan de la misma especie, la secuencia codificante no está asociada de forma natural al promotor (por ejemplo, el promotor es un promotor modificado genéticamente o un fragmento de promotor que no se encuentra asociado de forma natural con la secuencia codificante).

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Identificación de un epítopo restringido a HLA-A*0201 en H3.3 con la mutación K27M. A. La capacidad de unión a HLA-A201 de los péptidos derivados de H3.3 se analizó mediante un ensayo de unión a A2 de células T2. Cap1-6D es un ligando peptídico alterado, que ha derivado de un epítopo en Ag carcinoembrionario humano, CEA605-613 y se usó como control positivo. B. Análisis de tinción con tetrámero H3.3 de los CTL CD8+ generados con la H3.3.K27M (26-35) después de la primera estimulación del antígeno (izquierda) y reestimulaciones semanales (derecha).

Figuras 2A-C. Los CTL derivados de donantes HLA-A*0201+ reconocen específicamente las células de glioma HLA-A*0201+ K27M+ de una manera dependiente de HLA de clase I. Se estimularon las células mononucleares de sangre periférica de un donante HLA-A*0201+ in vitro con el péptido H3.3.K27M y se evaluó su reactividad frente a: (1A) Tetrámero específico de HLA-A*0201/H3.3.K27M y mAb anti-CD8 y (1B) células T2 pulsadas con el péptido H3.3 mutante o no mutado mediante ELISA de IFN-y. En (2A), entre la población de tetrámero CD8+ (64,1 % del total de células seleccionadas por linfocitos), hay una subpoblación tetrámeroalto (2,4 % del total de células seleccionadas por linfocitos), algunas de los cuales se usaron como clones CTL. En (2B), el péptido Cap1-6D (probado a 5 pg/ml solamente) es un epítopo de unión a HLA-A*0201 de alta avidez derivado de CEA4 usado como control negativo irrelevante. (1C) Se evaluó la citotoxicidad de la línea CTL contra las líneas celulares de glioma T98 (HLA-A*0201+ pero K27M negativo), HSJD-DIPG-07 (HLA-A*0201-negativo pero K27M+) y HSJD-DIPG-13 (h La -A*0201+ y k27M+). Las células diana marcadas con CFSE (10e4/pocillo) se incubaron con CTL en la relación E/T de 25 durante 4 horas. Para bloquear la citotoxicidad de CTL, se añadió anti-HLA-ABC 10 pg/ml a un grupo. Al final de la incubación, se añadió 7-ADD a cada pocillo y se incubó durante 10 minutos en hielo. Las muestras se analizaron mediante citometría de flujo y las células diana muertas se identificaron como células CFSE+ y 7-ADD+. La citotoxicidad se calculó como el porcentaje de células CFSE+ y 7-ADD+ en células HLA-A*0201+ CFSE+ totales. (*p<0,05 según las pruebas de suma de rangos de Wilcoxon).

Figura 3. Las líneas de células T CD8+ estimuladas con el péptido H3.3.K27M (26-35) reconocen e1H3.3.K27M (26-35) pero no el homólogo no mutante. Las líneas de células T CD8+ se indujeron y se expandieron con el péptido H3.3.K27M (26-35) de las PBMC derivadas de dos donantes sanos HLA-A*0201+ (n.° 547 y n.° 549). Las células T2 pulsadas con el péptido mutante H3.3.K27M (26-35) o el péptido no mutante H3.3.no-M (26-35) a las concentraciones indicadas se mezclaron con las líneas de células T CD8+ durante 24 horas. El IFN-y en los sobrenadantes se evaluó mediante ELISA.

Figura 4. Los CTL derivados del donante HLA-A2+ reconocen específicamente las células de glioma HLA-A2+ K27M+ y secretan IFN-y de maneras dependientes de HLA-A2 y CD8. Se estimularon las células mononucleares de sangre periférica de un donante HLA-A2 in vitro con péptidos sintéticos para H3.3.K27M (26-35) y evaluaron su reactividad contra las líneas HSID-007 (HLA-A2-negativo pero K27M+) o HSID-013 (HLA-A2+ y k27M+) mediante ensayos IFN-y ELISPOT. También se usaron anticuerpos anti-HLA-ABC (10 pg/ml) y anti-CD8 para evaluar si la respuesta depende de HLA-A2 y CD8+, respectivamente.

Figura 5A-B Caracterización de clones CTL específicos de H3.3.K27M. (5A) Los clones se generaron limitando la clonación por dilución de células individuales positivas al tetrámero HLA-A2-H3.3.K27M de CTL específicos de H3.3 K27M usando clasificación FACS. Los clones con afinidad relativamente alta (1C7, IH5 y 3E5) y moderada (1C6) basados en el índice de fluorescencia medio (MFI) se seleccionaron para evaluaciones adicionales. (5B) Un clon de CTL específico de H3.3.K27M (IH5) demuestra reactividad específica de H3.3.K27M como se muestra por ELISA de IFN-y contra células T2 pulsadas con el péptido H3.3 K27M+ mutante a concentraciones de titulación y el péptido de tipo silvestre (H3.3 K27M negativo; usado a 500 ng/ml).

Figura 6A-C. Evaluación de TCR específico de H3.3.K27M. (6A), Se transdujeron células J.RT-T3.5 con un vector lentivírico que codifica las cadenas a o p de TCR derivadas del clon IH5 de CTL específico de H3.3.K27M (J.RT-T3.5-TCR). Las células J.RT-T3.5-TCR o las células J.RT-T3.5 no transducidas de control se evaluaron para la expresión de TCR de superficie usando tetrámero HLA-A*0201/H3.3.K27M marcado con PE (panel superior) o mAb anti-CD3 marcado con PE (panel inferior) y mAb anti-CD8 humano marcado con FITC (paneles superior e inferior). Dado que las células J.RT3-T3.5 son CD4+ y CD8 negativas, las células tetrámero+ CD8 negativas son las que expresan el TCR derivado del transgén. La regulación positiva de CD3 indica la activación de las células. (6B), J.RT-T3.5-TCR, pero no las células J.RT-T35 control, regulan positivamente la expresión de CD69 tras el reconocimiento del péptido H3.3 K27M cargado en las células T2. (3C), las células DIPG 13 [HLA-A*0201+ (aunque tenue), mutación K27M+] se incubaron con células J.RT-T3.5-TCR o J.RT-T3.5 control. La secreción de IL-2 en los medios de cultivo se ensayó mediante ELISA específico.

Figura 7. Expresión de TCR derivado de transgén. Las células J.RT3-T3.5, que son deficientes para la cadena p de TCR endógena, se transdujeron con vectores lentivíricos (pHIV-mH3TCR-IRES-Luc o pMP270-mH3TCR) que codifican las cadenas a y p de TCR derivadas de un clon CTL específico de H3.3.K27M (IH5; Figura 7) y se evaluó para la expresión de TCR de superficie usando el tetrámero HLA-A2/H3.3.K27M marcado con PE y mAb anti-CD8 humano marcado con FITC. Dado que las células J.RT3-T3.5 son CD4+ y CD8 negativas, las células tetrámero+ CD8-negativas son las que expresan el TCR derivado del transgén. Las células de control negativo son células no transfectadas teñidas con el mismo tetrámero que indica la especificidad de la unión del tetrámero.

Figura 8A-B. Barrido de alanina para determinar los restos de AA inmunogénicos clave del epítopo H3.3.K27M. (8A) La afinidad de unión de HLA-A2 relativa de cada péptido a la de H3.3.K27M (26-35) se determinó mediante un ensayo de unión libre de células usando HLA-A2 purificado por cromatografía de afinidad de la línea celular homocigota JY transformada con EBV. (8B), Se transdujeron células J.RT3-T3.5 con un vector lentivírico que codifica el TCR específico de H3.3.K27M y se evaluó el reconocimiento de cada péptido cargado en las células T2 mediante la producción de IL-2. Cada grupo se analizó por triplicado * <0,05 por t de Student en comparación con el mutante H.3.3. Además de los 10 péptidos sintéticos que contienen cada uno la sustitución con alanina (A1-A10), también se evaluaron péptidos sintéticos diseñados para H3.3 citrulinado. El epítopo K27M (Cit H3.3; es decir, el primer AA del epítopo H3.3.K27M se reemplaza por citrulina) y el epítopo K27M derivado de H3.1 (un homólogo de H3.3) (Mut H.3.1).

Descripción detallada de la invención

Introducción

Los inventores han descubierto que un péptido que abarca las posiciones de aminoácidos 26-35 de H3.3, que incluye la mutación K27M [denominada en el presente documento "H3.3.K27M (26-35)"], puede inducir respuestas específicas de linfocitos T citotóxicos (CTL) en donantes de antígeno leucocitario humano (HLA)-A2+. Adicionalmente, los CTL contra H3.3.K27M (26-35) reconocen líneas celulares de glioma HLA-A2+ que también albergan la mutación K27M. En consecuencia, en el presente documento se describen composiciones para su uso en la generación de una respuesta inmunitaria en sujetos humanos a un péptido que comprende las posiciones de aminoácidos 26-35 de H3.3 o variantes del mismo.

Péptidos CTL

Los péptidos CTL descritos en el presente documento comprenden (R/A)MSAP(S/A)TGGV (SEQ ID NO:1), donde las opciones de aminoácidos entre paréntesis son opciones alternativas para la posición especificada. En consecuencia, los péptidos CTL pueden comprender RM-SAPSTGGV (SEQ ID NO:4), AMSAPSTGGV (SEQ ID NO:5), RMSAPATGGV (SEQ ID NO:6) o AMSAPATGGV (SEQ ID NO:7). Los péptidos CTL que comprenden RMSAPSTGGV (SEQ ID NO:4) o AMSAPSTGGV (SEQ ID NO:5) representan péptidos para dirigirse a H3.3.K27M (26-35). Los péptidos CTL que comprenden RMSAPATGGV (SEQ iD NO:6) o Am Sa PATGGV (SEQ ID NO:7) representan péptidos para dirigirse al correspondiente H3.1 K27M (26-35). La longitud de los péptidos CTL puede variar siempre que los péptidos sean eficaces para inducir una respuesta inmunitaria, por ejemplo, una respuesta CTL. En algunos aspectos, el péptido consistirá en 100 o menos o 50 o menos aminoácidos. En algunos aspectos, los péptidos CTL tendrán 10 14 aminoácidos, es decir, tendrán 10, 11, 12, 13 o 14 aminoácidos de longitud. Como SEQ ID NO:1 tiene 10 aminoácidos de longitud, las opciones de 11 o 14 aminoácidos tendrán de uno a cuatro aminoácidos adicionales en el extremo amino o carboxilo terminal de SEQ ID NO: 1, o en algunos aspectos, uno o dos aminoácidos adicionales en cada uno de los terminales amino y carboxilo de SEQ ID NO:1. Pueden seleccionarse aminoácidos adicionales de cualquiera de los veinte aminoácidos de origen natural o pueden ser un aminoácido de origen no natural.

Los péptidos pueden modificarse para alterar, por ejemplo, su estabilidad in vivo. Por ejemplo, la inclusión de uno o más D-aminoácidos en el péptido aumenta típicamente la estabilidad, particularmente si los restos de D-aminoácidos están sustituidos en uno o ambos extremos de la secuencia peptídica. La estabilidad puede ensayarse de diversas formas, tal como midiendo la semivida de las proteínas durante la incubación con peptidasas o plasma o suero humano. Se han descrito varios de tales ensayos de estabilidad de proteínas (véase, por ejemplo, Verhoef et al., Eur. J. DrugMetab. Pharmacokin. 11:291-302 (1986).).

Los péptidos también pueden modificarse mediante la unión a otras moléculas. Por ejemplo, pueden introducirse diferentes grupos N- o C-terminales para alterar las propiedades físicas y/o químicas de la molécula. Tales alteraciones pueden utilizarse para afectar a, por ejemplo, la adhesión, la estabilidad, la biodisponibilidad, la localización o la detección de las moléculas. Para fines diagnósticos, una amplia variedad de marcadores pueden enlazarse al extremo, que puede proporcionar, directa o indirectamente, una señal detectable. Por lo tanto, los péptidos de la presente invención pueden modificarse de diversas formas para una diversidad de fines finales mientras aún retienen la actividad biológica.

Los siguientes ejemplos de derivados químicos se proporcionan a modo de ilustración y no a modo de limitación.

Los aminoácidos aromáticos pueden reemplazarse por D- o L-nafilalanina, D- o L-fenilglicina, D- o L-2-tienilalanina, D o L-1-, 2-, 3- o 4-pireneilalanina, D- o L-3-tienilalanina, D- o L-(2-piridinil)-alanina, D- o L-(3-piridinil)-alanina, D- o L-(2-pirazinil)-alanina, D- o L-(4-isopropil)-fenilglicina, D-(trifluorometil)-fenil-glicina, D-(trifluorometil)-fenilalanina, D-pfluoro-fenilalanina, D- o L-p-bifenilfenilalanina, D- o L-p-metoxibifenilfenilalanina, D- o L-2-indol-(alquil)alaninas y D- o L-alquilaminas donde el alquilo puede ser metilo, etilo, propilo, hexilo, butilo, pentilo, iso-propilo, iso-butilo, sec-isotilo, iso-pentilo, aminoácidos no ácidos, sustituidos o no sustituidos, de C1-C20.

Los aminoácidos ácidos pueden sustituirse con aminoácidos distintos de carboxilatos mientras se mantiene una carga negativa, y derivados o análogos de los mismos, tales como los ejemplos no limitantes de (fosfono)-alanina, glicina, leucina, isoleucina, treonina o serina; o sulfatados (por ejemplo, -SO³H) treonina, serina, tirosina.

Otras sustituciones pueden incluir aminoácidos hidroxilados no naturales preparados combinando "alquilo" (como se define y ejemplifica en el presente documento) con cualquier aminoácido natural. Los aminoácidos básicos pueden sustituirse con grupos alquilo en cualquier posición de los aminoácidos de origen natural lisina, arginina, ornitina, citrulina, o ácido (guanidino)-acético, u otros ácidos (guanidino) alquil-acéticos, donde "alquilo" se define como anteriormente. Los derivados de nitrilo (por ejemplo, que contienen el resto CN en lugar de COOH) también pueden sustituirse por asparagina o glutamina, y el sulfóxido de metionina puede sustituirse por metionina. Los métodos de preparación de tales derivados peptídicos son bien conocidos por los expertos en la materia.

Además, cualquier enlace amida puede reemplazarse por un resto cetometileno, por ejemplo, (-C(=O) -CH²-) por (-(C=O) -NH-). Se espera que tales derivados tengan la propiedad de aumentar la estabilidad a la degradación por enzimas y, por lo tanto, posean ventajas para la formulación de compuestos que pueden haber aumentado las semividas in vivo, según se administran por vía oral, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, tópica, rectal, intraocular u otras vías.

Además, cualquier aminoácido puede reemplazarse por el mismo aminoácido pero de la quiralidad opuesta. Por lo tanto, cualquier aminoácido de forma natural en la configuración L (que también puede denominarse configuración R o S, dependiendo de la estructura de la entidad química) puede reemplazarse por un aminoácido del mismo tipo estructural químico, pero de la quiralidad opuesta, generalmente denominado el D-aminoácido pero que adicionalmente puede denominarse el R- o el S-, dependiendo de su composición y configuración química. Dichos derivados tienen la propiedad de una estabilidad mucho mayor a la degradación por enzimas y, por lo tanto, son ventajosos en la formulación de compuestos que pueden tener más semividas in vivo, cuando se administran por vía oral, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, tópica, rectal, intraocular u otras vías.

Los péptidos de fusión que incluyen un péptido antigénico como se describe anteriormente fusionado a otra secuencia peptídica se contemplan específicamente para su uso con los métodos y composiciones descritos en el presente documento. En algunos aspectos, los péptidos incluyen péptidos de fusión compuestos por una secuencia CTL como se describe en el presente documento (por ejemplo, SEQ ID NO:1) y una secuencia de epítopo de linfocitos T auxiliares (CD4) fusionados entre sí. Los ejemplos de epítopos CD4 adecuados incluyen la secuencia sintética PADRE, péptidos específicos del tétanos, péptidos derivados del mismo antígeno u otros antígenos del virus al que se dirige. De forma similar, para antígenos del cáncer, puede usarse un péptido CD4 derivado del mismo antígeno, o cualquier otro antígeno celular conocido en la técnica, y similares. También pueden usarse secuencias de péptidos enlazadores en el extremo N- o C-terminal de la fusión o entre los epítopos CTL y CD4 en la fusión. Tales secuencias enlazadoras generalmente pueden ser, por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 aminoácidos de longitud y, por ejemplo, de aproximadamente 2 a aproximadamente 7 aminoácidos o de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 aminoácidos de longitud pueden comprender opcionalmente aminoácidos modificados o no tradicionales.

También se describen multímeros peptídicos/HLA-A2 y, en algunos aspectos, su uso para aislar CTL específicos de péptidos. Los "multímeros" incluyen, por ejemplo, tetrámeros, pentámeros y cualquier número de estructura de MHC-péptido ensamblados alrededor de la molécula central con fluorocromo. En algunos aspectos, las moléculas de MHC seleccionadas (por ejemplo, HLA-A2) junto con beta-2-microgloblina se ensamblan alrededor de una molécula central que conecta una molécula de fluorocromo (tal como FITC, de modo que el multímero emitirá fluorescencia) y múltiples moléculas de MHC-beta-microgloblina (en el caso de tetrámero y pentámero, habrá 4 y 5, respectivamente). Entonces, la molécula de MHC también está unida al péptido de modo que el complejo MHC-péptido de la molécula multimérica puede reconocerse por el TCR en las células T. Véase, por ejemplo, Wooldridge, et al., Immunology 126(2): 147-164 (2009); Yokouchi, et al., Cancer Sci. 97(2): 148-54 (2006). En consecuencia, en algunos aspectos, se describen multímeros del péptido-complejo mayor de histocompatibilidad (pMHC) conjugado con fluorocromo, en donde el péptido es un péptido CTL (por ejemplo, que comprende SEQ ID NO:1).

En algunos aspectos, las poblaciones de células T se enriquecen en células T que expresan uno o más TCR que se unen al complejo péptido CTL/MHC. Por ejemplo, en algunos aspectos, se cultiva una población de células T en presencia del péptido CTL (ya sea el péptido desnudo o el péptido cargado en las APC), estimulando de esta manera preferentemente la división de células T que llevan TCR que se unen al complejo péptido/MHC. En algunos aspectos, el cultivo se produce en presencia de IL-2, IL-4, IL-7 o IL-15 solas, o combinaciones de los mismos de 2 vías, 3 vías o 4 vías. Las poblaciones de células T expandidas de esta manera se enriquecerán en TCR que se unen al complejo proteína/MHC. Posteriormente, los multímeros del péptido-complejo mayor de histocompatibilidad (pMHC) conjugado con fluorocromo pueden usarse para marcar las células T que expresan los TCR que se unen al complejo péptido/MHC, y pueden clasificarse, por ejemplo por FACS.

A continuación se proporcionan ejemplos de secuencias de cadenas alfa y beta de TCR que reconocen el epítopo H3.3.K27M con CDR1, CDR2 y c Dr 3 subrayados.

TCRA-Va19*01/J43

Met L T A S L L R A V I A S I C V V S S Met A Q K V T Q A Q T E I S V V E K E D V T L D C V Y E / R D T I V > L F W Y K Q P P S G E L V F L I R R N S F D E Q N E 1 S G R Y S W N F Q K S T S S F N F T I T A S Q V V D S A V Y F C AL_SE_ E N D Met R F G A G T R L T V K P N I Q N P D P A V Y Q L R D S K S S D K S V C L F T D F D S Q T N V S Q S K D S D V Y I T D K T V L D Met R S Met D F K S N S A V A W S N K S D F A C A N A F N N S I I P E D T F F P S P E S S C D V K L V E K S F E T D T N L N F Q N L S V 1 G F R I L L L K V A G F N L L Met T L R L W S S Parada (SEQ ID N0:8)

CDR1: T R D T T Y Y (SEQ ID NO:12);

CDR2: R N S F (SEQ ID NO:13)

CDR3: A L S E (SEQ ID NO:14)

Secuencia codificante de la secuencia de aminoácidos anterior:

ATGCTGACTGCCAGCCTGTTGAGGGCAGTCATAGCCTCCATCTGTGTTGTATCCAGCA TG GCTCAGAAGGTAACTCAAGCGCAGACTGAAATTTCTGTGGTGGAGAAGGAGGATG TG ACCTTG GACTGTGTGTATGAAACCCGTGATACTACTTATTACTTATTCTGGTACAA GC A ACC ACC A AGT GGAG A ATT GGTTTTC C TT ATT C GTC GGAACTC TTTT GAT GAGC A A AATGAAATAAGTGGTCGGTATTCTTGGAACTTCCAGAAATCCACCAGTTCCTTCAACT TCACCATCACAGCCTCACAAGTCGTGGACTCAGCAGTATACTTCTGTGCTCTGAGTGA

GGAGAATGACATGCGCTTTGGAGCAGGGACCAGACTGACAGTAAAACCAAATATCC AGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTG TCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGA TGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAA CAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAA CAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAG CTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTG ATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGC GGCTGTGGTCCAGCTGA (SEQ ID NO:9)

TCRB-Vb27/J2.7

M et G P Q L L G Y V V L C L L G A G P L E A Q V T Q N P R Y L I T V T G K K L T V T C S O N Met N H E F Met S W Y R Q D P G L G L R Q I Y Y S M e t N VE V T O K G D V P E G Y K V S R K E K R N F P E I L E S P N P N Q T S L Y Y C A S G W G G P F Y E O Y Y G P G T R L T V T E D L K N V F P P E V A V F E P S E A E I S H T Q K A T L V C L A T G F Y P D H V E L S W W V N G K E V H S G V S T D P Q P L K E Q P A L N D S R Y C L S S R L R V S A T F W Q N P R N H F R C Q V Q F Y G L S E N D E W T Q D R A K P V T Q I V S A E A W G R A D C G F T S E S Y Q Q G V L S A T I L Y E I L L G K A T L Y A V L V S A L V L

M et A M et V K R K D S R G Parada (SEQ ID NO: 10)

CDR1: N Met N H E Y (SEQ ID NO:15);

CDR2: Y S Met N V E V T (SEQ ID NO: 16)

CDR3: C A S G W G G P F Y E Q Y (SEQ ID NO:17)

Secuencia codificante de la secuencia de aminoácidos anterior:

A TGGGCCCCCA GCTCCTTGGC TA TG TGG TCCTTTGCCTTCTA GGA GCA GGCCCCC TGGAA

GCCCAAG TGACCCA GAA CCCAAGA TA CCTCA TCA CA G TGACTGGAAA GAAG TTAACA G TGA

CTTGTTCTCAGAA TA TGAACCA TGAGTA TA TGTCCTGGTA TCGA CA A GA CCCA GGGCTGGG

CTTAAGGCAGA TCTACTA TTCAA TGAA TGTTGAGGTGACTGA TAAGGGAGA TGTTCCTGAAG

GGTACAAAG TCTC TCGAAAA GAGA A GA GGA A TTTCCCCCTGA TCC TGGAGTCGCCCAA CCC

CAA CCA GA CCTC TC TOTA CTTCTGTGCCA GCGGCTGtGGGTGiG TCA A TTT’TACGAGCAGTA

CTTCGGGCC GGGC ACC AGGCTC AC GGTC AC AGAGG ACCTG AAAAACGTGTTCCC ACC

CGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCAC

ACTGGTATGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGT

GAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGC

AGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCA

CCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTC

GGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCG

CCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGG

TCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGT

GCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGCTA

G (SEQ ID NO:l I )

Polin ucleótidos

Los polinucleótidos que codifican los péptidos CTL descritos en el presente documento también se describen y se denominan "polinucleótidos CTL". En algunos aspectos, los polinucleótidos CTL pueden ser una secuencia de a Dn o ARN. El polinucleótido CTL puede unirse operativamente a algunos o todos los elementos reguladores transcripcionales y traduccionales, tales como un promotor, potenciador y secuencia de poliadenilación. Las secuencias reguladoras son reconocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). En algunos aspectos, el promotor es un promotor constitutivo, por ejemplo, un promotor vírico fuerte, por ejemplo, el promotor de CMV. El promotor también puede ser específico de células o tejidos, que permite la transcripción sustancial del ADN solo en células predeterminadas, por ejemplo, en células presentadoras de antígeno, tales como el promotor CD1 lc específico de células dendríticas descrito en Brocker T, J. Leuk. Biology 66:331 -335, 1999. El promotor también puede ser un promotor inducible, por ejemplo, un promotor de metalotioneína. Otros promotores inducibles incluyen aquellos que están controlados por la unión inducible, o activación, de un factor de transcripción, por ejemplo, como se describe en las patentes de EE.UU. N.° 5.869.337 y 5.830.462 de Crabtree et al., describir la expresión génica inducible por moléculas pequeñas (un interruptor genético); las Solicitudes de patente internacional PCT/US94/01617, PCT/US95/10591, PCT/US96/09948 y similares, así como en otros sistemas de transcripción heterólogos tales como aquellos que implican la regulación basada en tetraciclina informados por Bujard et al., generalmente conocido como un "interruptor de apagado" alostérico descrito por Gossen y Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1992) 89:5547 y en las Patentes de EE.UU. 5.464.758; 5.650.298; y 5.589.362 de Bujard et al. Otros sistemas de transcripción inducibles implican una regulación basada en esteroides u otras hormonas.

Los polinucleótidos CTL también pueden producirse en parte o en total mediante síntesis química, por ejemplo, por el método de la fosforamidita descrito por Beaucage y Carruthers, Tetra. Letts., 22:1859-1862 (1981) o el método del triéster de acuerdo con el método descrito por Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc, 103:3185 (1981) y puede realizarse en sintetizadores de oligonucleótidos automatizados comerciales. Puede obtenerse un fragmento bicatenario a partir del producto monocatenario de síntesis química sintetizando la cadena complementaria e hibridando la cadena en condiciones apropiadas o añadiendo la cadena complementaria usando ADN polimerasa con una secuencia de cebador apropiada.

El polinucleótido CTL unido operativamente a todos los elementos necesarios de regulación de la transcripción y la traducción puede inyectarse como ADN desnudo en un sujeto o ponerse en contacto in vitro con células presentadoras de antígeno. En algunos aspectos, el polinucleótido CTL y los elementos reguladores están presentes en un plásmido o vector. Por lo tanto, el polinucleótido CTL puede ser ADN, que en sí mismo no se replica, pero se inserta en un plásmido, que puede comprender además un replicador. El ADN puede ser una secuencia diseñada para no integrarse en el genoma de la célula hospedadora. Los vectores de ejemplo son los vectores de expresión, es decir, vectores que permiten la expresión de un ácido nucleico en una célula. Los vectores de expresión de ejemplo son aquellos que contienen ambas secuencias procariotas, para facilitar la propagación del vector en bacterias, y una o más unidades de transcripción eucariotas que se expresan en células eucariotas.

Alternativamente, pueden usarse derivados de virus tales como el virus del papiloma bovino (BPV-1) o el virus Epstein-Barr (pHEBo, derivado de pREP y p205) para la expresión transitoria de proteínas en células eucariotas. Estos virus que expresan los polipéptidos CTL pueden usarse para infectar APC, que después se administran a los pacientes. Para otros sistemas de expresión adecuados tanto para células procariotas como para células eucariotas, así como procedimientos recombinantes generales, véase Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a Ed., ed. por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989), Capítulos 16 y 17.

En algunos aspectos, el polinucleótido CTL se expresa en un procariota. En algunos aspectos, el polipéptido se expresa en E. coli. En algunos aspectos, el polipéptido CTL se expresa en Listeria monocytogenes, que, en algunos aspectos, está atenuado y que puede administrarse a un individuo humano para proporcionar el péptido CTL al individuo. Véase, por ejemplo, la Publicación de Patente de EE.UU. N.° US2013/0259891. En otros aspectos, el polinucleótido CTL se expresa en una célula eucariota. Por ejemplo, el polinucleótido y polipéptido CTL pueden expresarse en levaduras, células de insecto, células animales, incluyendo células de mamíferos, por ejemplo, células humanas.

Inducción de una respuesta inmunitaria

Los péptidos CTL de la invención son capaces de inducir una respuesta inmunitaria cuando se administran a un animal (por ejemplo, un ser humano). Una respuesta inmunitaria de ejemplo es una respuesta CTL. Los péptidos CTL, una vez introducidos, puede procesarse y presentarse al complejo MHC de clase I de una célula presentadora de antígenos. El complejo de MHC de clase I humano incluye los alelos HLA-A, B y C. Los péptidos CTL (por ejemplo, SEQ ID NO:1) tienen una mayor afinidad por los individuos HLA-A2+. Véase la Tabla 1. El epítopo unido al MHC de clase I se transporta después a la superficie celular y se reconoce por los linfocitos T citotóxicos (CTL) a través de los receptores de células T (TCR) ubicados en su superficie. El reconocimiento de un complejo antígeno/MHC por el TCR desencadena una cascada de interacciones de proteínas y citocinas que conducen a, entre otras interacciones, la activación, maduración y proliferación de los CTL precursores, dando como resultado clones CTL capaces de destruir las células que exhiben péptidos CTL reconocidos como extraños.

En un aspecto, se administran al paciente uno o más péptidos CTL como se describen en el presente documento. En otro aspecto, uno o más polinucleótidos que codifican uno o más CTL se introducen en APC, y estas APC que expresan CTL se administran a un paciente humano para inducir una respuesta inmunitaria, la respuesta de las células T citotóxicas. En algunos aspectos, los péptidos CTL se cargan en las APC sin expresar los péptidos CTL en la célula. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.u U. N.° 8.652.462. En algunos aspectos, las APC se recolectan de un individuo, se cargan con los péptidos CTL (o los polinucleótidos CTL se introducen en las APC) y después las APC se introducen nuevamente en el individuo (es decir, las células son autólogas) y se induce una respuesta inmunitaria CTL en el individuo al polipéptido CTL.

En un aspecto, se induce una respuesta inmunitaria administrando directamente los péptidos CTL a los pacientes. No se requieren adyuvantes y/o mediadores inflamatorios inespecíficos, pero puede administrarse opcionalmente con el principio activo antes, durante o después del cebado y/o refuerzo de la respuesta inmunitaria. Los adyuvantes son sustancias que se usan para potenciar de forma específica o inespecífica una respuesta inmunitaria específica de antígeno, quizás a través de la activación de células presentadoras de antígenos. El adyuvante puede ser, por ejemplo, Montanide-ISA 51 (por ejemplo, de Seppic Hiltonol (por ejemplo, de Oncovir), anticuerpos monoclonales agonistas anti-CD40, polyICLC, vacuna del bacilo de Calmette-Guerin (BCG), una exotoxina ribosilante de ADP (por ejemplo, toxina colérica, toxina diftérica, enterotoxina termolábil de E. coli, toxina pertúsica, exotoxina A de P. aeruginosa), un fragmento del mismo que contiene la subunidad A y/o B, un derivado del mismo químicamente modificado o mutado genéticamente, o un derivado del mismo con toxicidad reducida; un conjugado químico o recombinante genético que contiene una exotoxina ribosilante de ADP bacteriana o un derivado de la misma; una quimiocina (por ejemplo, defensinas, HCC-1, HCC-4, MCP-1 MCP-3, MCP-4, MLP-1a, MIP-1 p, MIP-1y, MIP-3a, MIP-2, RANTES); otro ligando de un receptor de quimiocinas (por ejemplo, CCR1, CCR-2, CCR-5, CCR-6, CXCR-1); una citocina (por ejemplo, IL-1p, IL -2, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12; IFN-y; TNF-a; GM-CSF); otro ligando de un receptor de citocina; una sal (por ejemplo, hidróxido o fosfato de aluminio, fosfato de calcio); lípido A o un derivado del mismo (por ejemplo, monofosforil o difosforil lípido A, análogos del lípido A, AGP, ASO2, ASO4, DC-Choi, Detox, OM-174); un patrón molecular asociado a patógenos (PAMP); motivos CpG inmunoestimuladores en el ADN bacteriano o un oligonucleótido (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 6.218.371); un homólogo de Leishmania de elF4a o un derivado del mismo (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 5.876.735); una proteína de choque térmico o un derivado de la misma; matriz en tándem C3d; un dipéptido de muramilo (MDP) o un derivado del mismo (por ejemplo, murabutida, treonil-MDP, tripéptido de muramilo); ISCOMS y saponinas (por ejemplo, Quil A, QS-21); escualeno; superantígenos; un ligando de un receptor de tipo toll o similares. Los adyuvantes pueden elegirse para inducir preferentemente anticuerpos o efectores celulares, isotipos de anticuerpos específicos (por ejemplo, IgM, IgD, IgAl, IgA2, IgA secretora, IgE, IgG1, IgG2, IgG3 y/o IgG4) o subconjuntos específicos de células T (por ejemplo, CTL, ThI, Th2 y/o TDTH). Por ejemplo, las células presentadoras de antígeno pueden presentar antígeno restringido de Clase 11 a las células T CD4+ precursoras y puede ingresar a la ruta Th1 o Th2.

En otro aspecto, se describe en el presente documento un método para administrar células APC que expresan y/o presentan péptidos CTL para inducir una respuesta inmunitaria. Los métodos para administrar polinucleótidos CTL a APC son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, retrovirus, adenovirus, lentivirus, virus adenoasociado (AAV) y virus del herpes simple-1, Los virus vaccinia y los virus de la viruela del canario o de la viruela aviar pueden infectar APC. La mayoría de estos vectores provocan una expresión genética transitoria que dura menos de dos semanas (Bonnet et al, 2000). Para iniciar una respuesta inmunitaria, la expresión de péptidos, proteínas o moléculas de MHC solo necesitan durar entre tres y diez días (véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. 5.656.465 y 5.833.975). Los plásmidos también pueden usarse para transferir un gen a la célula por sí mismos o con sustancias químicas que mejoran la transfección, o a través de vehículos. Por ejemplo, lípidos catiónicos, fosfato cálcico, DEAE-dextrano, polibreno-DMSO o aminoácidos policatiónicos (por ejemplo, polilisina) son transfectantes químicos.

El método puede implicar además una molécula diana que se une preferentemente a una célula diana, por ejemplo, células presentadoras de antígenos. Dichos mecanismos de direccionamiento pueden incluir restos de galactosilo terminales que se unen al receptor de asialoglicoproteína (por ejemplo, ácido nucleico y/o antígeno galactosilado), Unión de oligosacáridos con alto contenido de manosa al receptor de manosa (por ejemplo, ácido nucleico manosilado y/o antígeno), ligando que se une a un receptor Fc (por ejemplo, ácido nucleico y/o antígeno fusionado o unido a la región constante de IgG u otro ligando de CD64), o proteínas de membrana altamente expresadas en células presentadoras de antígeno (por ejemplo, ácido nucleico y/o antígeno fusionado o unido al ligando o anticuerpo específico para la proteína de membrana). Los receptores de manosa son dianas de ejemplo porque están altamente expresados en células dendríticas (especialmente células de Langerhans) e implicados en la captación de antígenos. Esto aumenta significativamente la capacidad de las APC para capturar proteínas exógenas y procesarlas (Sallusto, 1995). El antígeno puede administrarse a las células fagocíticas de la piel tales como, por ejemplo, células de Langerhans, otras células dendríticas, macrófagos y otras células presentadoras de antígenos en la epidermis y la dermis; el antígeno también puede administrarse a las células fagocíticas del hígado, el bazo y la médula ósea que se sabe que sirven como células presentadoras de antígeno a través del torrente sanguíneo o del sistema linfático.

En un aspecto adicional, la composición puede comprender el polipéptido CTL y también el epítopo universal de células T llamado PADRE® (Epimmune, San Diego; descritos, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. N° 5.736.142 o en la Solicitud Internacional WO95/07707. Un "péptido de unión a PanDR" o "péptido PADRE®" es un miembro de una familia de moléculas que se une a más de una molécula HLA de clase II. El patrón que define la familia de moléculas PADRE® puede pensarse como un supermotivo HLA de Clase U. PADRE® se une a la mayoría de las moléculas HLA-DR y estimula las respuestas de linfocitos T auxiliares (HTL) humanos in vitro e in vivo. Alternativamente pueden usarse epítopos T auxiliares de vacunas de uso universal tales como el toxoide tetánico.

Normalmente, una vacuna o composición de vacuna se prepara como un inyectable, ya sea como una solución o suspensión líquida. La inyección puede ser subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intratecal, intradérmica, intraepidérmica o por "pistola de genes". Otros tipos de administración comprenden electroporación, implantación, supositorios, ingestión oral, aplicación entérica, inhalación, aerosolización o pulverizador nasal o gotas. También pueden prepararse formas sólidas, adecuadas para disolverse o suspenderse en, vehículos líquidos antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse o encapsularse en liposomas para potenciar el efecto adyuvante.

Una formulación líquida puede incluir aceites, polímeros, vitaminas, carbohidratos, aminoácidos, sales, tampones, albúmina, tensioactivos o agentes de carga. Los carbohidratos de ejemplo incluyen azúcar o alcoholes de azúcar tales como mono-, di- o polisacáridos, o glucanos solubles en agua. Los sacáridos o glucanos pueden incluir fructosa, dextrosa, lactosa, glucosa, manosa, sorbosa, xilosa, maltosa, sacarosa, dextrano, pululano, dextrina, alfa y beta ciclodextrina, almidón soluble, hidroximetil almidón y carboximetilcelulosa, o mezclas de los mismos. "Alcohol de azúcar" se define como un hidrocarburo C4 a C8 que tiene un grupo -OH e incluye galactitol, inositol, manitol, xilitol, sorbitol, glicerol y arabitol. Estos azúcares o alcoholes de azúcar mencionados anteriormente pueden usarse individualmente o en combinación. No existe un límite fijo para la cantidad usada siempre que el azúcar o el alcohol de azúcar sea soluble en la preparación acuosa. En algunos aspectos, la concentración de azúcar o alcohol de azúcar está entre el 1,0 % (p/v) y el 7,0 % (p/v), por ejemplo, entre el 2,0 y el 6,0 % (p/v). Los aminoácidos de ejemplo incluyen formas levorrotativas (L) de carnitina, arginina y betaína; sin embargo, pueden añadirse otros aminoácidos. Los polímeros de ejemplo incluyen polivinilpirrolidona (PVP) con un peso molecular promedio entre 2.000 y 3.000 o polietilenglicol (PEG) con un peso molecular promedio entre 3.000 y 5.000. En algunos aspectos, puede usarse un tampón en la composición para minimizar los cambios de pH en la solución antes de la liofilización o después de la reconstitución. Puede usarse cualquier tampón fisiológico, pero en algunos casos puede seleccionarse de tampones citrato, fosfato, succinato y glutamato o mezclas de los mismos. Los tensioactivos que pueden añadirse a la formulación se muestran en las solicitudes de patente EP n.° EP 0270799 y EP 0268 110.

Adicionalmente, los polipéptidos pueden modificarse químicamente mediante conjugación covalente con un polímero para aumentar su semivida en circulación, por ejemplo. Los polímeros de ejemplo y métodos para unirlos a péptidos, se muestran en las Patentes de EE.UU. N.° 4.766.106; 4.179.337; 4.495.285; y 4.609.546. Los polímeros de ejemplo son polioles polioxietilados y polietilenglicol (PEG). El PEG es soluble en agua a temperatura ambiente y tiene la fórmula general: R(O-CH²-CH²)nO-R donde R puede ser hidrógeno, o un grupo protector tal como un grupo alquilo o alcanol. En algunos aspectos, el grupo protector tiene entre 1 y 8 carbonos, por ejemplo, metilo. El símbolo n es un número entero positivo, preferentemente entre 1 y 1000, por ejemplo, entre 2 y 500. El PEG puede tener, por ejemplo, peso molecular promedio entre 1000 y 40.000, por ejemplo, entre 2000 y 20.000, por ejemplo, entre 3.000 y 12.000. En algunos aspectos, el PEG tiene al menos un grupo hidroxilo, por ejemplo, tiene un grupo hidroxi terminal.

Los polioles polioxietilados solubles en agua también son útiles y pueden unirse a los polipéptidos CTL descritos en el presente documento. Incluyen sorbitol polioxietilado, glucosa polioxietilada, glicerol polioxietilado (POG), etc. Otro sistema de administración de fármacos para aumentar la semivida circulatoria es el liposoma. Los péptidos y ácidos nucleicos de la invención también pueden administrarse a través de liposomas, que sirven para dirigirse a un tejido en particular, tal como tejido linfoide, o para dirigirse a células infectadas selectivamente, así como para aumentar la semivida de la composición de péptidos y ácidos nucleicos. Los liposomas incluyen emulsiones, espumas, micelas, monocapas insolubles, cristales líquidos, dispersiones de fosfolípidos, capas lamelares y similares. Los liposomas cargados o decorados con un péptido o ácidos nucleicos deseados de la invención pueden dirigirse al sitio de las células linfoides, donde los liposomas administran después las composiciones de péptidos y ácidos nucleicos. Los liposomas para su uso de acuerdo con la invención se forman a partir de lípidos formadores de vesículas convencionales, que generalmente incluyen fosfolípidos neutrales y cargados negativamente y un esterol, tal como colesterol. La selección de lípidos generalmente se guía por la consideración de, por ejemplo, el tamaño del liposoma, la labilidad ácida y la estabilidad de los liposomas en el torrente sanguíneo. Hay una diversidad de métodos disponibles para preparar liposomas, como se describe en, por ejemplo, Szoka et al., 1980 y las patentes de EE.UU. N.° 4.235.871.4.501.728, 4.837.028 y 5.019.369.

Para dirigirse a las células del sistema inmunitario, un ligando que se incorporará al liposoma puede incluir, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos para los determinantes de la superficie celular de las células del sistema inmunitario deseadas. Una suspensión de liposomas que contiene un péptido puede administrarse por vía intravenosa, local, tópica, etc. en una dosis que varía de acuerdo con, entre otros, la forma de administración, el péptido que se administra y la fase de la enfermedad que se está tratando.

Una vez preparada la composición farmacéutica líquida, la composición puede liofilizarse para prevenir la degradación y conservar la esterilidad. Justo antes de su uso, la composición puede reconstituirse con un diluyente estéril (solución de Ringer, agua destilada o solución salina estéril, por ejemplo) que pueden incluir ingredientes adicionales. Tras la reconstitución, la composición puede administrarse a sujetos.

El polipéptido y las APC de la invención pueden usarse para tratar individuos que tienen gliomas. En algunas realizaciones, los gliomas se seleccionan de glioblastoma (GBM) y gliomas pontinos intrínsecos difusos (DIPG). En algunos aspectos, el individuo es del tipo HLA-A2+. Los genes HLA son las versiones humanas de los genes del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) que se encuentran en la mayoría de los vertebrados (y por lo tanto son los genes m Hc más estudiados). Los HLA correspondientes al MHC de clase I son HLA-A, HLA-B y HLA-C. Los HLA correspondientes a MHC de clase II son DP, DM, DOA, DOB, DQ y DR. Las pruebas para la tipificación de HLA están disponibles y pueden usarse para evaluar a los pacientes que probablemente se beneficien del tratamiento, por ejemplo, de http://labtestsonline.org/understanding/analytes/hla-testing/tab/test/. En algunos casos, el paciente también puede presentar síntomas clínicos además de gliomas. El paciente con glioma puede pertenecer a cualquier grupo de edad, incluyendo niños (por ejemplo, 0-18 años).

Anticuerpos que reconocen los péptidos CTL

También se describe un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que reconoce los péptidos CTL descritos en el presente documento. Los fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos abarcan fragmentos que comprenden los dominios hipervariables designados CDR (Regiones de Determinación de Complementariedad) o parte o partes de los mismos de los mismos que abarcan el sitio de reconocimiento para el antígeno, es decir, los péptidos CTL descritos en el presente documento, definiendo de esta manera la especificidad de reconocimiento del antígeno. Cada cadena ligera y pesada (respectivamente VL y VH) de una inmunoglobulina de cuatro cadenas tiene tres CDR, designadas VL-CDR1, VL-CDR2, VL-CDR3 y VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, respectivamente. Por lo tanto, en algunos casos, el anticuerpo comprende fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento (fragmentos de unión a antígeno), que comprenden o consisten en todas o una selección de CDR entre VL-CDR1, VL-CDR2, VL-CDR3 y VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 o porciones funcionales de los mismos, es decir, porciones que exhiben la especificidad de unión deseada, preferentemente con una alta afinidad, para los péptidos CTL de la invención. Por ejemplo, en algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a SEQ ID NO:2 pero no se une a (por ejemplo, se une a no más alto que el fondo) SEQ ID NO:3.

El anticuerpo puede producirse mediante cualquier método conocido para la producción de anticuerpos. Por ejemplo, el anticuerpo puede obtenerse mediante la administración de cualquiera de los aspectos anteriores de los péptidos CTL en un animal y recolectando los anticuerpos producidos como resultado.

Ejemplos

Ejemplo 1. El epítopo de linfocitos T citotóxicos (CTL) restringido por HLA-A*0201 derivado de H3.3.K27M y clonación de ADNc del receptor de células T (TCR)

1. Selección de epítopos de unión a HLA-A*0201 en H3.3 con la mutación K27M

Usando el servidor NetMHC 3.4 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/), un sistema de predicción basado en una red neurona! artificial de motivos de unión de péptidos a HLA, los presentes inventores predijeron que un péptido de 10 aminoácidos (AA) derivado de H3.3 que abarca la posición AA 26-35, que incluye la mutación K27M [H3.3.K27M (26-35)], servirá como un epítopo potente en el contexto de HLA-A*0201, mientras que el homólogo no mutante para las posiciones correspondientes [H3.3.No-M (26-35)] no se predijo que tuviera una alta afinidad por HLA-A*0201 (Tabla 1).

Análisis de péptidos H3.3.K27M (26-35), H3.3.Non-M (26-35) así como péptidos 9-meros H3.3.K27M (19-27) y H3.3.No-M (19-27). A continuación los presentes inventores evaluaron directamente la afinidad de unión relativa de estos péptidos usando el transportador asociado a la línea celular HLA-A*0201+ T2 deficiente en procesamiento de antígenos (TAP). Dado que la unión estable de HLA-A*0201 con epítopos peptídicos estabiliza aún más la expresión superficial de HLA-A*0201, Los niveles de expresión cuantitativa de HLA-A*0201 se correlacionan con la afinidad de unión de los epítopos peptídicos que se incuban conjuntamente con las células T2 (Figura 1). Los valores de MFI para las células T2 sin péptido indican el nivel de expresión de HLA-A2 basal. Cap6D es un epítopo de unión a HLA-A*0201 bien documentado y se usa como control positivo para el ensayo. El H3.3.K27M (26-35), pero ninguno de los otros péptidos derivados de H3.3, demostró un aumento dependiente de la dosis de péptido de la intensidad media de fluorescencia (MFI). Estos datos sugirieron que el péptido H3.3.K27M (26-35) es un epítopo potencial para respuestas específicas de células T. Para medir con precisión la unión de péptidos a moléculas de clase 1HLA-A*02:01, los presentes inventores realizaron un ensayo de inhibición de la unión competitiva y evaluaron la concentración de péptido que producía una inhibición del 50 % de la unión del péptido sonda radiomarcado (CI50). El péptido mutante H3.3.K27M demostró constantemente una CI50 de 95 nM-187 nM en 4 muestras separadas, que se consideran excelentes capacidades de unión. Por otro lado, el péptido H3.3 no mutante (en la posición correspondiente) demostró capacidades de unión >30 veces menores. Estos datos confirman la alta capacidad de unión a HLA A*02:01 del péptido H3.3.K27M.

Después, se estimularon células mononucleares de sangre periférica (PBMC) derivadas de donantes HLA-A*0201 con péptido sintético para H3.3.K27M (26-35) in vitro durante varios ciclos semanales y se evaluó la inducción de células T Cd 8+ capaces de unirse al tetrámero HLA-A*0201-H3.3.K27M (26-35), y se encontró más del 60 % de las células CD8+ unidas al tetrámero (Figura 2A). Adicionalmente, una subpoblación del total de células CD8+ en el cultivo mostró niveles claramente más altos de unión al tetrámero, sugiriendo que estos son aglutinantes de alta afinidad entre las poblaciones de células T reactivas con H3.3.K27M (26-35).

2. producción de IFN-^yespecífico de antígeno y actividad lítica de células T CD8+ estimuladas con H3.3.K27M (26-35).

Las líneas de células T CD8+ que habían sido estimuladas con el péptido H3.3.K27M (26-35) demuestran aumentos dependientes de la dosis de péptido de la producción de IFN-y en respuesta a las células diana T2 cargadas con H3.3.K27M (26-35) en comparación con las células T2 cargadas con el contro1H3.3.Non-M (26-35), péptido cap6D o nada (Figura 2B y 3).

3. Las células T CD8+ estimuladas con H3.3.K27M (26-35) reconocen el epítopo análogo expresado endógenamente en células de glioma HLA-A*0201.

A continuación, los presentes inventores examinaron si la línea de células T CD8+ desarrollada en respuesta al péptido H3.3.K27M (26-35) reconoce células de glioma humano HLA-A*0201 que expresan y presentan de forma endógena el epítopo H3.3.k27M (26- 35). Los presentes inventores usaron HSlD-007 (HLA-A*0201 negativo pero K27M+) o HSID-013 (HLA-A*0201+ y K27M+) como células de glioma diana. Como se ilustra en la Figura 2C y la Figura 4, la línea de células T CD8+ respondió a HSID-013 pero no a células HSID-007 basándose en ensayos de linfocitos T citotóxicos (CTL) (Figura 2C). Adicionalmente, la respuesta observada contra las células HSID-013 fue bloqueada casi completamente por el anticuerpo de bloqueo anti-HLA-clase I. Estos datos son notables porque indican que las líneas de células T CD8+ (los presentes inventores tienen datos similares para dos líneas celulares adicionales; pero aquí solo se muestra una) reconocen el epítopo mutante H3.3.K27M (26-25) expresado endógenamente y presentado por líneas celulares de glioma HLA-A*0201+.

4. Clones CTL específicos de H3.3.K27M de alta afinidad.

Los presentes inventores han obtenido clones de CTL que son reactivos al epítopo H3.3.K27M (Figura 5A-B). Estos clones retienen la especificidad del epítopo H3.3.K27M y los presentes inventores han aislado las cadenas a y p del receptor de células T (TCR) del clon 1H5.

5. Clonación de ADNc del receptor de células T específico de H3.3.K27M.

Los presentes inventores han clonado cadenas a-(SEQ ID NO: 8) y p (SEQ ID NO: 10) de longitud completa de TCR a partir de un clon de células T CD8+ específico de H3.3.K27M (1H5) y han construido un vector lentivírico que codifica las cadenas a y p. Como la primera etapa para confirmar la expresión del transgén-TCR, transdujeron células J.RT3-T3.5, que son deficientes para la cadena p de TCR endógena, con el vector lentivírico y se evaluó la expresión de TCR reactivo con el tetrámero HLA-A*0201/H3.3.K27M mediante citometría de flujo (Figura 6A; paneles superiores; Figura 7). Más del 60 % de las células J.RT3-T3.5 mostraron unión positiva al tetrámero, mientras que solo el 0,69 % de las células J.RT3-T3.5 no transducidas mostraron la señal, lo que indica que el transgén TCR se expresa por ambas construcciones lentivíricas. En el mismo escenario, también se observó que las células transducidas con TCR, pero no las células control regulan positivamente la expresión de CD3 cuando se co-incuban con el tetrámero (paneles inferiores de la Figura 6A). Estas células también regulan positivamente CD69 como una indicación de activación de una manera dependiente de la dosis de péptido y específica de TCR (Figura 6B). Estos datos indican claramente la reactividad específica de antígeno del TCR cuando se transduce en células J.RT3-T3.5.

Finalmente, las células transducidas con TCR, pero no las células control, fueron capaces de producir IL-2 cuando se cultivaron conjuntamente con células HLA-A*0201+, H3.3.K27M+ DIPG-013 (Figura 6C).

6. Ausencia de proteína H3 desiminada detectable en células de glioma cultivadas

El proceso natural de desiminación puede convertir la histona arginina en citrulina, incluyendo el resto arginina dentro del epítopo H3.3.K27M. Por lo tanto, es útil para determinar si las células de glioma se someten a desiminación y, si es así, si el reemplazo del resto de arginina dentro del epítopo H3.3.K27M con citrulina (es decir, desiminación) impacta en la inmunogenicidad del epítopo H3.3.K27M.

Se realizaron análisis de transferencia Western para determinar si las células de glioma H3.3.K27M+ tienen proteína H3 desiminada usando un mAb específico para H3 desiminado (abcam n.° cat ab19847). Mientras que los neutrófilos estimulados con ionóforo de calcio como muestra de control positivo mostraron una única banda de aproximadamente 15 kDa correspondiente al H3 desiminado, ninguna de las líneas celulares de glioma demostró una banda similar, sugiriendo fuertemente que las líneas celulares de glioma no están sustancialmente desiminadas, al menos cuando se cultivan in vitro. La muestra de control positivo proviene de neutrófilos estimulados con ionóforo de calcio. Las células de glioma evaluadas son HSJD-DIPG-13, HSJD-DIPG-12, HSJD-DIPG-08, HSJD-DIPG-07, SU06, SU-D-04, T98 y U87. Cada carril se cargó con 20 pg de lisado de proteína y se confirmó SDS-PAGE de alta calidad cada vez mediante tinción con azul Coomassie. Se repitieron estos análisis de transferencia Western al menos 4 veces (4 series de SDS-PAGE) con diferentes condiciones de incubación y exposición, y se encontró una banda delgada con células de glioma en condiciones de exposición muy altas (no se muestra), sugiriendo que la desiminación puede producirse en cultivos de células de glioma a niveles bajos.

7. Los datos de escaneo de alanina sugieren que no hay proteínas humanas conocidas que compartan los restos de AA inmunogénicos clave del epítopo H3.3.K27M

Para garantizar la especificidad y seguridad del enfoque de focalización H3.3.K27M, es útil determinar los residuos AA clave en el epítopo H3.3.K27M que son responsables de la reactividad CTL. Esto permitirá predicciones y evaluaciones precisas de la reactividad cruzada con otros epítopos derivados de proteínas en células normales no tumorales.

Para este fin, se usó mutagénesis por barrido de alanina. Se introdujeron mutaciones individuales de alanina (10 en total) en cada resto de AA dentro del epítopo del decámetro H3.3.K27M (10-meros). Por tanto, Se prepararon 10 péptidos sintéticos que contenían cada uno la sustitución específica con alanina (A1-A10). Usando cada uno de los péptidos sintéticos con sustituciones de alanina, se evaluó si la sustitución altera la estabilidad de la unión del péptido a HLA-A*0201 (Figura 8A). Cuando la unión disminuye por la sustitución en comparación con el epítopo natural H3.3.K27M ("Mut H3.3." En Figura 8A-B), indica que el resto sustituido era crítico para la unión de HLA-A*0201. También se evaluó si el TCR específico de H3.3.K27M reconoce los epítopos alterados presentados en las células T2. Para este fin, se evaluó la producción de IL-2 como la lectura para la activación de células J.RT3-T3.5 transducidas con TCR cuando se co-cultivaron con células T2 cargadas con cada uno de los péptidos alterados. (Figura 8B). Las sustituciones de AA que disminuyen la producción de IL-2 (que se observó con el péptido Mut H3.3) indican el AA crítico para el reconocimiento por parte del TCR. Ambos enfoques basados en unión (Figura 8A) y función (es decir, IL-2) (Figura 8B) mostraron consistentemente que los AA en las posiciones 1, 2, 4, 6, 7, 8, 9 y 10 son fundamentales para el reconocimiento. Luego se llevó a cabo una búsqueda in silico para identificar secuencias de AA que existen de forma natural usando NCBI BLAST. No se encontraron proteínas humanas conocidas que contengan los mismos restos de AA, lo que indica que sería muy poco probable que la inmunoterapia dirigida a este epítopo provoque reacciones no deseadas fuera de la diana contra las células normales.

También se evaluó si el TCR específico de H3.3.K27M es reactivo con el epítopo desiminado H3.3K.27M usando un péptido sintético en el que el resto de arginina del epítopo H3.3.K27M se reemplaza por citrulina (Cit H3.3 ) (Figura 8A-B). Mientras que el péptido Cit H3.3 conserva parcialmente su afinidad por HLA-A*0201 (Figura 8A ), abroga completamente la producción de IL-2 por las células J.RT3-T3.5 transducidas con TCR, lo que indica que el TCR no reconoce el péptido Cit H3.3.

Una subpoblación de pacientes con glioma lleva la mutación K27M en H3.1 (un homólogo de H3.3). Las secuencias

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una célula T que expresa uno o más polipéptidos que comprenden un receptor de células T (TCR) o un fragmento del mismo que se une a un complejo de péptido/complejo principal de histocompatibilidad (MHC), en donde el MHC es HLA-A*0201 y en donde el péptido en el complejo péptido/MHC consiste en 10-14 aminoácidos y comprende RMSAPSTGGV (SEQ ID NO: 2).

2. La célula T de la reivindicación 1, en donde:

(a) el TCR o fragmento del mismo es heterólogo de la célula T;

(b) la expresión del TCR o fragmento del mismo está bajo el control de un promotor heterólogo;

(c) el péptido consiste en RMSAPSTGGV (SEQ ID NO:2); y/o

(d) R en SEQ ID NO:2 está citrulinado o no citrulinado.

3. Un método de enriquecimiento de células T que expresan un TCR que se une a un complejo péptido/MHC, en donde el MHC es HLA-A*0201, en donde el péptido en el complejo péptido/MHC consiste en 10-14 aminoácidos y en donde el péptido comprende RMSAPSTGGV (SeQ ID NO: 2), comprendiendo el método

generar un cultivo inicial de células T que expresan TCR;

4. El método de la reivindicación 3:

(a) en donde el cultivo comprende cultivar las células T en presencia de IL-2, IL-4, IL-7, IL-15 o combinaciones de los mismos;

(b) comprendiendo además clasificar las células en el cultivo enriquecido para las células T que se unen al complejo péptido/MHC para formar una población enriquecida adicional de células T que expresan TCR que se unen al complejo péptido/MHC;

opcionalmente en donde la clasificación comprende poner en contacto las células del cultivo enriquecido con un multímero del péptido-complejo mayor de histocompatibilidad (pMHC) conjugado con fluorocromo;

(c) en donde el péptido consiste en RMSAPSTGGV (SEQ ID No :2); y/o

(d) en donde R en SEQ ID NO:2 está citrulinado o no citrulinado.

5. Un péptido aislado que consiste en RMSAPSTGGV (SEQ ID NO:2), opcionalmente en donde R en SEQ ID NO: 2 está citrulinado o no citrulinado.

6. Una composición para estimular una respuesta inmunitaria a la variante H3.3 de histona 3 independiente de la replicación, comprendiendo la composición el péptido de la reivindicación 5, comprendiendo además opcionalmente un adyuvante.

7. Un multímero del péptido-complejo mayor de histocompatibilidad (pMHC) conjugado con fluorocromo, en donde el MHC es HLA-A*0201 y en donde el péptido es de acuerdo con la reivindicación 5.

8. Un ácido nucleico que codifica el péptido de la reivindicación 5, opcionalmente en donde el ácido nucleico es un plásmido o un vector vírico, opcionalmente en donde el vector es capaz de administrar el ácido nucleico a una célula presentadora de antígeno (APC).

9. Una célula presentadora de antígenos (APC) que comprende un péptido heterólogo que consiste en 10-12 aminoácidos, en donde el péptido comprende RMSAPSTGGV (SEQ ID NO: 2).

10. La APC de la reivindicación 9, en donde:

(a) el péptido consiste en RMSAPSTGGV (SEQ ID NO:2);

(b) R en SEQ ID NO:2 está citrulinado o no citrulinado;

(c) la APC presenta el péptido heterólogo en la superficie de la célula; y/o

(d) la APC comprende un casete de expresión heterólogo que comprende un promotor operativamente unido a un polinucleótido que codifica el péptido.

11. Una APC de la reivindicación 9 o 10 para su uso en un método de tratamiento de glioma en un individuo humano, comprendiendo el método, administrar una cantidad suficiente de la APC al individuo humano.

12. La APC para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde:

(a) las APC son del individuo (autólogas);

(b) se induce una respuesta inmunitaria en el individuo humano a la variante H3.3 de la histona 3 independiente de la replicación, opcionalmente en donde la respuesta inmunitaria es una respuesta de células T citotóxicas; (c) el individuo humano tiene un glioma seleccionado de glioblastoma (GBM) y gliomas pontinos intrínsecos difusos (DIPG); y/o

(d) el individuo es portador de un alelo HLA-A*0201.

13. Una composición que comprende un péptido que consiste en 10-12 aminoácidos, en donde el péptido comprende RMSAPSTGGV (SEQ ID NO: 2), para su uso en un método de tratamiento de glioma en un individuo humano, comprendiendo el método administrar una cantidad suficiente de la composición al individuo humano.

14. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 13:

(a) en donde el péptido consiste en RMSAPSTGGV (SEQ ID NO:2);

(b) que comprende además un adyuvante; y/o

(c) en donde R en SEQ ID NO:2 está citrulinado o no citrulinado.

15. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 13 o 14, en donde la composición comprende un adyuvante seleccionado del grupo que consiste en poliICLC y la vacuna del bacilo de Calmette-Guerin (BCG), opcionalmente en donde:

(a) se induce una respuesta inmunitaria en el individuo humano a la variante H3.3 de la histona 3, opcionalmente en donde la respuesta inmunitaria es una respuesta de células T citotóxicas;

(b) el individuo humano tiene un glioma seleccionado de GBM y DIPG; y/o

(c) el individuo es portador de un alelo HLA-A*0201.