ES2841398T3 - Diagnostico diferencial de eczema y psoriasis - Google Patents
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Abstract
Un método para diagnosticar eczema o psoriasis, en donde dicho método diferencia entre eczema y psoriasis, y comprende determinar la expresión de al menos dos marcadores en una muestra tomada de un individuo, en donde dichos al menos dos marcadores se seleccionan de CCL27, NOS2, IL36G, KLK13, SOST, NPTX1, PLA2G4D, GDA, IL36A, TGM1, CLEC4G, IL13, TCN1, TMPRSS11D y RHCG, siempre que dichos al menos dos marcadores consistan en o comprendan (a) CCL27 y NOS2; (b) CCL27 y KLK13; (c) IL36G y KLK13; (d) CCL27 e IL36G; (e) NOS2 e IL36G; (f) NOS2 y KLK13; (g) SOST; o (h) NPTX1; y evaluar en la base de la expresión de dichos al menos dos marcadores si el individuo está afectado con eczema o psoriasis.
Description
DESCRIPCIÓN
Diagnostico diferencial de eczema y psoriasis
La presente invención se refiere a un método de diagnosticar eczema y/o psoriasis, en donde dicho método diferencia entre eczema y psoriasis, y comprende determinar la expresión de al menos dos marcadores en una muestra tomada de un individuo, en donde dichos al menos dos marcadores se seleccionan de CCL27, NOS2, IL36G, KLK13, SOST, NPTX1, PLA2G4D, GDA, IL36A, TGM1, CLEC4G, IL13, TCN1, TMPRSS11D y RHCG, siempre que dichos al menos dos marcadores consistan en o comprendan (a) CCL27 y NOS2; (b) CCL27 y KLK13; (c) IL36G y KLK13; (d) CCL27 e IL36G; (e) NOS2 e IL36G; (f) NOs 2 y KLK13; (g) SOST; o (h) NPTX1; y evaluar en la base de la expresión de dichos al menos dos marcadores si el individuo está afectado con eczema y/o psoriasis.
En esta especificación, se cita un número de documentos incluyendo solicitudes de patente y manuales de fabricantes.
Psoriasis y eczema son enfermedades inflamatorias de la piel prevalentes con alta carga de enfermedad individual e impacto socioeconómico principal (Bieber T, Atopic dermatitis. N Engl J Med 358, 1483-94 (2008), Nestle FO et al., N Engl J Med 361, 496-509 (2009)). En años recientes, se evaluaron numerosas terapias específicas para ambas enfermedades. Sin embargo, la mayoría de los estudios clínicos eran empíricos y no directamente relacionados con el conocimiento básico aumentado de la patogénesis de la enfermedad.
De forma interesante, la psoriasis y el eczema responden de forma diferente, algunas veces antipódica, a pautas terapéuticas específicas (Eyerich K et al., Allergy 68, 974-82 (2013), Guttman-Yassky E et al., J Allergy Clin Immunol 127, 1420-8 (2011)). Más específicamente, se demostró en pacientes que padecían tanto psoriasis como eczema atópico que medicamentos anti-TNFa, que típicamente se aplican en el tratamiento de psoriasis, mejoran el estado del paciente con respecto a psoriasis, sin embargo, al mismo tiempo el eczema se deteriora (Eyerich S et al., N Engl J Med 365, 231-8 (2011)). Con respecto al eczema atópico, por otra parte, no hay terapia específica aprobada en el momento. Dupilumab es un anticuerpo anti-receptor de IL-4 que actualmente está en ensayos clínicos en fase 3. Este anticuerpo monoclonal bloquea los efectos de IL-4 e IL-13. Por otra parte, se sabe que IL-4 mismo es una terapia útil de psoriasis (Ghoreshi K et al. Nat Med 9, 40-6 (2003)). Por tanto, también en tal marco se debe esperar que el tratamiento que mejora el eczema tenga un impacto negativo sobre psoriasis. Este problema se agrava más por el hecho de que para una fracción significativa de pacientes no es posible una distinción clara entre psoriasis y eczema, incluso para personal clínico experimentado, la razón es que cualquier enfermedad se puede manifestar a sí misma en diferentes formas, en donde los parámetros clínicos estabilizados pueden fracasar para distinguir correctamente entre ciertas formas de eczema y ciertas formas de psoriasis.
Por tanto, un prerrequisito para la medicina personalizada es un entendimiento detallado de los mecanismos moleculares que subyacen ambas enfermedades.
Aunque el conocimiento básico de ambas afecciones aumentó a lo largo de los últimos años, nuestra comprensión de su base molecular aún no está completa. Novedosas técnicas de alto rendimiento que investigan la expresión del genoma entero en material biológico tal como micromatrices son una herramienta útil para ganar percepción en la patogénesis (Suarez-Farinas M et al., J Allergy Clin Immunol 127, 954-64 (2011), Tian S et al., PLoS One 7, e44274 (2012), Suarez-Farinas M et al., J Invest Dermatol 132, 2552-64 (2012)). Intentos previos para usar análisis de expresión génica para comparar psoriasis y eczema atópico estuvieron obstaculizados por la alta variabilidad interindividual que se basa parcialmente en género, edad, y exposición medioambiental a corto plazo antes del muestreo del material (Wenzel J et al., J Invest Dermatol 128, 67-78 (2008), Nomura I et al., J Allergy Clin Immunol 112, 1195-202 (2003), de Jongh GJ et al., J Invest Dermatol 125, 1163-73 (2005)). De hecho, Nomura et al. (loc. cit.), mientras que observaban patrones distintos de expresión génica en las lesiones de la piel de dermatitis atópica y psoriasis, simplemente sugieren que tales observaciones pueden contribuir a una “firma característica” para estas dos enfermedades de la piel. No se proporciona un clasificador, mucho menos un clasificador validado. Wenzel et al. (loc. cit.), mientras que investigan entre otros también en dermatitis atópica y psoriasis, realmente está interesado en un problema diferente, es decir, proporcionar una distinción entre liquen plano por una parte y dermatitis atópica y psoriasis, por otra parte.
Guttman-Yassky E et al. (J Allergy Clin Immunol 124, 1235-1244 (2009)) y Kamsteeg M et al. (Br J Dermatol 162, 568 578 (2010)) describen clasificadores que se van a usar en distinguir entre dermatitis atópica y psoriasis basado en niveles de expresión génica. El clasificador de Guttman-Yassky et al. (loc. cit.) requiere trece genes y el de Kamsteeg et al. (loc. cit.) siete genes. La validación independiente del clasificador respectivo con datos de pacientes no usados para el entrenamiento no se proporciona.
El problema técnico subyacente a la presente invención se puede ver en la provisión de medios y métodos alternativos y mejorados para diagnosticar psoriasis y eczema, en donde tales medios y métodos son capaces de diferenciar entre estas dos enfermedades.
En el primer aspecto, la presente invención se refiere a un método de diagnosticar eczema y/o psoriasis, en donde dicho método diferencia entre eczema y psoriasis, y comprende determinar la expresión de al menos dos marcadores
en una muestra tomada de un individuo, en donde dichos al menos dos marcadores se seleccionan de CCL27, NOS2, IL36G, KLK13, SOST, NPTX1, PLA2G4D, GDA, IL36A, TGM1, CLEC4G, IL13, TCN1, TMPRSS11D y RHCG, siempre que dichos al menos dos marcadores consistan en o comprendan (a) CCL27 y NOS2; (b) CCL27 y KLK13; (c) IL36G y KLK13; (d) CCL27 e IL36G; (e) NOS2 e IL36G; (f) NOS2 y KLK13; (g) SOST; o (h) NPTX1; y evaluar en la base de la expresión de dichos al menos dos marcadores si el individuo está afectado con eczema y/o psoriasis.
Relacionado con ello, la presente invención se refiere a un método de diagnosticar eczema y/o psoriasis, en donde dicho método diferencia entre eczema y psoriasis, y comprende determinar la expresión de al menos dos marcadores en una muestra tomada de un individuo, en donde dichos al menos dos marcadores se seleccionan de CCL27, NOS2, IL36G, KLK13, SOST, NPTX1, PLA2G4D, GDA, IL36A, TGM1, CLEC4G, IL13, TCN1, TMPRSS11D y RHCG, siempre que dichos al menos dos marcadores consistan en o comprendan (a) CCL27 y NOS2; (b) CCL27 y KLK13; (c) IL36G y KLK13; (d) CCL27 e IL36G; (e) NOS2 e IL36G; (f) NOS2 y KLK13; (g) SOST; o (h) NPTX1.
Psoriasis y eczema son enfermedades inflamatorias de la piel conocidas para el personal clínico; véase la sección introductoria anteriormente y las referencias citadas allí.
El término “expresión” tiene su significado establecido en la técnica y define, en un sentido cuantitativo, el grado de transcripción y/o traducción de un gen determinado. Según esto, se entiende que el método de diagnóstico según el primer aspecto de la presente invención puede, en formas de realización preferidas, emplear datos de expresión de ARNm y/o datos de expresión de proteína. Los medios y métodos para determinar los datos de expresión se detallan más adelante.
Como se ha manifestado anteriormente, el método de diagnosticar emplea al menos dos marcadores que se van a seleccionar de la lista de quince marcadores presentada anteriormente, en donde además se tiene que cumplir uno de los requisitos (a) a (h). Según esto, se entiende que el vocabulario “dichos al menos dos marcadores comprenden” se refiere a cualquiera de los puntos (a) a (h), y el vocabulario “dichos al menos dos marcadores consisten en” se refiere a cualquiera de los puntos (a) a (f).
Preferiblemente, solo se usan dos marcadores. Mientras que también se pueden usar tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o el conjunto completo de quince marcadores, es un logro sorprendente de los presentes inventores proporcionar conjuntos muy pequeños de marcadores, es decir, dos marcadores, que - a pesar del pequeño tamaño del conjunto - dan excelentes clasificadores para usar en la evaluación de si el individuo está afectado con eczema y/o psoriasis. Su buen rendimiento ha experimentado validación cruzada, es decir, ensayándolos en conjuntos de datos que no se usaron para el entrenamiento. Esta es una distinción importante del estado de la técnica que no solo usa conjuntos mayores de marcadores, sino también fracasa para establecer validación cruzada independiente del clasificador respectivo.
Según esto, mientras que se prevé que, por ejemplo, el grupo de dos marcadores que consiste en CCL27 y NOS2 se pueda expandir añadiendo uno o más marcadores de los trece marcadores restantes de la lista de quince proporcionada anteriormente, es particularmente preferido usar exclusivamente la expresión de CCL27 y NOS2 para el fin de diagnosticar eczema y/o psoriasis y además diferenciar entre estas dos enfermedades.
Los nombres de los genes usados en la definición del primer aspecto de la presente invención son nombres de genes estándar establecidos en la técnica. La tabla 1 a continuación proporciona los nombres completos y anotaciones funcionales de estos genes.
Tabla 1. 15 genes que distinguen psoriasis y eczema.
La figura 1A presenta los datos de expresión (niveles de ARNm) de los quince genes para las dos enfermedades y además niveles de corte específicos de genes que separan los niveles de expresión característicos de psoriasis de los característicos de eczema. Los valores de corte también se dan en la tabla 2 a continuación.
Tabla 2. Análisis estadístico de genes incluidos en el clasificador de enfermedad para distinguir psoriasis y eczema. Se dan los nombres de los genes, valores p, sensibilidad, especificidad, cociente de verosimilitud positivo y valores de corte obtenidos del análisis de PCR en tiempo real de la cohorte de entrenamiento como parte de la cohorte independiente (n = 19).
Tabla 3. Entradas de base de datos (GenBank publicación 200.0 del 15 de febrero, 2014; Ensembl publicación 75 de febrero de 2014) para los 15 marcadores de la invención.
Sorprendentemente, el clasificador más preferido, es decir, el método de diagnóstico según el primer aspecto, en donde dichos al menos dos marcadores son exactamente dos marcadores que son CCL27 y NOS2, da resultados correctos donde el criterio de referencia diagnóstico establecido, es decir, inspección visual del paciente por el médico experimentado y análisis histológico, falla. En particular, el pronosticador clasificó un paciente como que padece
eczema paciente que, basado en parámetros clínicos, se diagnosticó inicialmente como que tenía psoriasis. Solo el resultado inicialmente sorprendente producido por el método según la presente invención impulsó al personal clínico a volver y revisar una vez más las características clínicas e histológicas de este paciente. En particular, la terapia inicialmente elegida y dirigida a psoriasis no mejoró el estado del paciente, confirmando de esta manera que el diagnóstico clínico era equivocado y el método de la presente invención correcto.
Un segundo caso de interés particular era un paciente que, de anomalía clínica e histológica, no se pudo asignar de forma no ambigua. En otras palabras, los métodos establecidos fallaron para distinguir entre psoriasis y eczema. El clasificador según la presente invención en su lugar claramente estableció eczema. Ambos casos especiales descritos anteriormente se detallan más en los ejemplos adjuntos en el presente documento.
Dado que cualquiera de las dos enfermedades se puede diagnosticar con un alto grado de certeza cuando se usan los métodos según la presente invención, también los pacientes que padecen ambas enfermedades se beneficiarán. Más específicamente, para esos pacientes la se puede dar recomendación de que terapias que mejoran una enfermedad, pero producen empeoramiento de la otra se deben evitar. En su lugar, se tiene que recurrir en tales casos a terapias más convencionales que funcionan menos específicamente y proporcionan alivio, en cualquier caso. Estas terapias convencionales se conocen bien en la técnica e incluyen esteroides.
Las investigaciones de los presentes inventores en expresión génica diferencial entre psoriasis y eczema, mientras que se dirige principalmente a proporcionar clasificadores compactos y fiables, también dan una perspectiva en los mecanismos moleculares y celulares que subyacen la enfermedad respectiva; véase el ejemplo 2.
Mientras que se da preferencia particular al uso de exactamente dos marcadores, la presente invención también proporciona conjuntos mayores de marcadores. Dos grupos particularmente preferidos de tres marcadores se dan a continuación. En otras palabras, en una forma de realización preferida, dichos al menos dos marcadores son al menos tres marcadores y consisten en o comprenden: (i) CCL27, NOS2 e IL36G; o (j) CCL27, KLK13 e IL36G.
Un aspecto clave de la presente invención es la identificación y validación de conjuntos de marcadores particularmente pequeños y particularmente poderosos. Esto está definido por las formas de realización divulgadas anteriormente. Una vez que se han establecido los conjuntos de marcadores que se van a usar, hay varios métodos a disposición del experto en la materia para hacer uso de los marcadores para fines diagnósticos, es decir, la evaluación de si el individuo está afectado con eczema y/o psoriasis.
En una forma de realización preferida, dicho diagnóstico se efectúa mediante un clasificador.
El término “clasificador” tiene su significado establecido en la técnica y se refiere a un algoritmo implementado en el ordenador. Dicho algoritmo, cuando se alimenta con datos del paciente (en el presente caso niveles de expresión) da un resultado que asigna al respectivo paciente o bien al grupo de pacientes de psoriasis o al grupo de pacientes de eczema. Por tanto, la evaluación de si el individuo está afectado con eczema y/o psoriasis preferiblemente se realiza mediante un clasificador.
Mientras que se da preferencia al método según el primer aspecto que se confina a tal diagnóstico basado en clasificador, se entiende que los resultados proporcionados por el método del primer aspecto, preferiblemente por dicho clasificador, se pueden comparar, complementar o validar por métodos clínicos establecidos, en particular, inspección visual del paciente y/o análisis histológico de una muestra tomada del paciente. Los distintivos histológicos de psoriasis por una parte y eczema por la otra parte, en particular en casos bien definidos (que, como se ha indicado anteriormente, no aplica a todos los pacientes) se conocen bien en la técnica; véase, por ejemplo, Bieber (loc. cit.) y Nestle (loc. cit.).
En una forma de realización más preferida, (a) dicho clasificador es obtenible analizando dicha expresión de dichos al menos dos marcadores en muestras tomadas de individuos que padecen eczema y en muestras tomadas de individuos que padecen psoriasis; o (b) dicho método comprende además calcular dicho clasificador analizando dicha expresión de dichos al menos dos marcadores en muestras tomadas de individuos que padecen eczema y en muestras tomadas de individuos que padecen psoriasis.
Según esto, el método de la presente invención puede opcionalmente comprender además la etapa de construir dicho clasificador o, en la alternativa, puede hacer uso de un clasificador previamente establecido.
Dado que la selección específica y ventajosa de marcadores según el primer aspecto de la presente invención evita los problemas discutidos anteriormente que surgen de antecedentes genéticos específicos del paciente, el entrenamiento del clasificador según el punto (b) no plantea desafíos particulares con respecto a la elección de pacientes cuyas muestras se van a usar para el entramiento del clasificador. Se da preferencia a pacientes con síntomas clínicos bien definidos de la respectiva enfermedad. Además, son preferidas grandes cohortes de pacientes.
En una forma de realización particularmente preferida, en donde dicho análisis es por medio de máquinas de vectores de soporte (SVM), modelos lineales generalizados (GLM), análisis discriminante lineal, árboles de decisión, reglas de
decisión, redes neurales, métodos de regresión de Bayes, y/o métodos del vecino más próximo; véase, por ejemplo, Bishop (Pattern Recognition and Machine Learning (Information Science and Statistics), Springer, ISBN:0387310738 (2007)). Las SVM son particularmente preferidas.
Preferiblemente, los datos de expresión se normalizan antes del análisis. La normalización se puede efectuar dividiendo los datos de expresión para un marcador determinado de una muestra enferma por el nivel de expresión del mismo marcador de una muestra sana. En cualquier caso, se prefieren medias. Además, se prefiere usar los logaritmos de los niveles de expresión (véase, por ejemplo, la figura 1).
En una forma de realización particularmente preferida, se usa una SVM lineal, en donde, al nivel que se usan datos de expresión de ARNm, es lo más preferido que la intercepción negativa (rho) esté dada por 0,22 con un intervalo de confianza (IC) al 99 % de [-1,24, 0,89]. Los parámetros correspondientes para escalar los datos para la SVM lineal y el vector de peso se dan como sigue:
Con el IC al 99 % dado entre corchetes y los marcadores de psoriasis: 1 y eczema atópico: -1.
También es preferido usar la información de la figura 1B como se adjunta en el presente documento o la figura 1B como tal para fines de clasificación. Para explicar más, tras determinar los niveles de expresión de ARNm normalizados de NOS2 y CCL27 de un paciente que se va a clasificar, dicho paciente se clasifica determinando si sus datos de expresión están en el área marcada “psoriasis” o en el área marcada “eczema”.
En una forma de realización preferida adicional, dicho eczema se selecciona de eczema atópico (también conocido como dermatitis atópica), dermatitis de contacto, dermatitis numular y eczema dishidrótico. El método de la presente invención distingue con éxito cualquiera de las formas de eczema específicas mencionadas de psoriasis.
En una forma de realización preferida adicional, dicha psoriasis se selecciona de psoriasis vulgar, psoriasis inversa y psoriasis pustulosa.
En una forma de realización preferida adicional, dicha expresión es expresión (a) a nivel de ARNm y/o (b) a nivel de proteína.
En una forma de realización particularmente preferida, dicha determinación se efectúa por PCR, preferiblemente PCR en tiempo real. Se usa PCR para determinar el nivel de ARNm. Los cebadores preferidos que se van a usar se divulgan adicionalmente a continuación junto con los kits de la presente invención.
La PCR es bien conocida en la técnica y se emplea para hacer grandes números de copias de una secuencia diana. La PCR comprende tres etapas principales, que típicamente se repiten durante 30 o 40 ciclos. Esto se hace en un dispositivo ciclador automatizado, que puede calentar y enfriar recipientes con la mezcla de reacción en un tiempo muy corto. La primera etapa es desnaturalización, por ejemplo, a 94 °C. Durante la desnaturalización, la doble cadena se funde para formar a Dn monocatenario. Al mismo tiempo, todas las reacciones enzimáticas se paran. Estas reacciones enzimáticas incluyen, por ejemplo, la reacción de extensión de un ciclo de PCR previo. La segunda etapa es la hibridación, por ejemplo, a 54 °C. Se forman y rompen enlaces constantemente entre el cebador monocatenario y el molde monocatenario. Los enlaces más estables duran un poco más (cebadores que se emparejan exactamente) y en el ADN bicatenario formado que comprende molde y cebador, la polimerasa se puede unir y empieza a copiar el molde. Una vez se han incorporado unas pocas bases, los enlaces son lo suficientemente fuertes entre el molde y el cebador de modo que no se rompe más. La tercera etapa es una etapa de extensión que se realiza a una temperatura de, por ejemplo, 72 °C. Esta es la temperatura ideal para la actividad polimerasa. Los cebadores, donde hay unas pocas bases incorporadas, ya muestran una unión más fuerte al molde en comparación con los cebadores que están en posiciones sin emparejamiento exacto, que a su vez se sueltan otra vez (debido a la mayor temperatura en comparación con la etapa de hibridación) y no dan lugar a una extensión del fragmento.
La PCR en tiempo real es un tipo específico de PCR, donde el proceso de amplificación se puede seguir directamente y en tiempo real, lo que permite una determinación significativamente más precisa de los niveles de expresión que la PCR de punto final convencional. Puede o bien emplear una sonda específica, en la técnica también denominada sonda TaqMan, que tiene un colorante indicador covalentemente unido al extremo 5' y un extinguidor en el extremo 3'. Después de que la sonda TaqMan haya hibridado en la etapa de hibridación de la reacción de PCR al sitio complementario del polinucleótido que se amplifica, el fluoróforo en 5' es cortado por la actividad 5' nucleasa de la Taq polimerasa en la fase de extensión de la reacción de PCR. Esto aumenta la fluorescencia del donante 5' que anteriormente estaba extinguido debido a la cercana proximidad al aceptor 3' en la secuencia de la sonda TaqMan. Alternativamente, se pueden combinar cebadores específicos con un colorante fluorescente (verde SYBR) que se une
a ADN bicatenario. Mediante amplificación específica de genes, se forma ADN bicatenario y se puede medir a través del aumento de fluorescencia en la mezcla de PCR.
En una forma de realización más particularmente preferida, dicha determinación se efectúa mediante anticuerpos, en particular mediante anticuerpos que son específicos para la proteína marcadora determinada. Los anticuerpos se usan preferiblemente para determinar el nivel de proteína anteriormente mencionado.
Los anticuerpos pueden estar marcados, o anticuerpos unidos pueden a su vez detectarse usando anticuerpos marcados (secundarios). Los marcadores preferidos don marcadores fluorescentes, luminiscentes y radioactivos. Particularmente preferidos son los marcadores fluorescentes. El último tipo de esquema de detección también se conoce en la técnica como inmunofluorescencia. Una alternativa establecida en la técnica adicional es enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA).
El término “anticuerpo” incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos monocatenarios, o fragmentos de los mismos que se unen específicamente a dicho péptido o polipéptido, también incluyendo anticuerpos biespecíficos, anticuerpos sintéticos, fragmentos de anticuerpos, tal como Fab, un F(ab2)', Fv o fragmentos scFv, etc., o un derivado químicamente modificado de cualquiera de estos. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar, por ejemplo, por las técnicas originalmente descritas en Kohler G y Milstein C, Nature 256495-7 (1975), y Galfré G y Milstein C, Meth. Enzymol. 73 3-46 (1981), que comprenden la fusión de células de mieloma de ratón a células de bazo derivadas de mamíferos inmunizados con modificaciones desarrolladas por la técnica. Además, se pueden obtener anticuerpos o fragmentos de los mismos para los péptidos anteriormente mencionados usando métodos que se describen, por ejemplo, en Harlow y Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Cuando se obtienen derivados de dichos anticuerpos por la técnica de presentación en fagos, se puede usar resonancia de plasmón de superficie como se emplea en el sistema BlAcore para aumentar la eficacia de los anticuerpos de fagos que se unen a un epítopo del péptido o polipéptido de la invención (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 97-105 (1996); Malmborg, J. Immunol. Methods 183 7-13 (1995)). La producción de anticuerpos quiméricos se describe, por ejemplo, en el documento WO89/09622. Una fuente adicional de anticuerpos que se va a utilizar según la presente invención son los denominados anticuerpos xenógenos. El principio general para la producción de anticuerpos xenógenos tal como anticuerpos humanos en ratones se describe, por ejemplo, en los documentos WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096 y WO 96/33735. Los anticuerpos que se van a emplear según la invención o sus correspondiente(s) cadena(s) de inmunoglobulinas se pueden modificar adicionalmente usando técnicas convencionales conocidas en la materia, por ejemplo, usando deleción(es), inserción(es), sustitución(es), adición(es) de aminoácidos y/o recombinación(es) y/o cualquier otra(s) modificación(es) conocida(s) en la técnica, ya sea solas o en combinación. Los métodos para introducir tales modificaciones en la secuencia de ADN subyacente a la secuencia de aminoácidos de una cadena de inmunoglobulina los conoce bien el experto en la materia; véase, por ejemplo, Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
El término “anticuerpo monoclonal” o “policlonal” (véase, Harlow y Lane, (1988), loc. cit.) también se refiere a derivados de dichos anticuerpos que retienen o esencialmente retienen su especificidad de unión. Mientras que formas de realización particularmente preferidas de dichos derivados se especifican adicionalmente en el presente documento posteriormente, otros derivados preferidos de tales anticuerpos son anticuerpos quiméricos que comprenden, por ejemplo, una región variable de ratón o rata y una región constante humana.
El término “fragmento scFv” (fragmento Fv monocatenario) se entiende bien en la técnica y es preferido debido a su pequeño tamaño y la posibilidad de producir tales fragmentos de forma recombinante.
Preferiblemente, el anticuerpo, fragmento o derivado del mismo específicamente se une a la proteína diana. El término “se une específicamente” en relación con el anticuerpo usado según la presente invención significa que el anticuerpo etc. no o esencialmente no da reacción cruzada con (poli)péptidos de estructuras similares. La reactividad cruzada de un panel de anticuerpos etc. en investigación se puede ensayar, por ejemplo, evaluando la unión de dicho panel de anticuerpos etc. en condiciones convencionales (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, (1988), loc. cit.) al (poli)péptido de interés, así como a un número de (poli)péptidos más o menos (estructural y/o funcionalmente) estrechamente relacionados. Solo esos anticuerpos que se unen al (poli)péptido/proteína de interés, pero no o esencialmente no se unen a ninguno de los otros (poli)péptidos que se expresan preferiblemente por el mismo tejido que el (poli)péptido de interés, se consideran específicos para el (poli)péptido/proteína de interés.
En una forma de realización particularmente preferida del método de la invención, dicho anticuerpo o porción de unión de anticuerpo es o deriva de un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado. El término “anticuerpo humanizado” significa, según la presente invención, un anticuerpo de origen no humano, donde al menos una región determinante de complementariedad (CDR) en las regiones variables tal como la CDR3 y preferiblemente todas las 6 CDR se han sustituido por CDR de un anticuerpo de origen humano que tiene una especificidad deseada. Opcionalmente, la(s) región(es) constante(s) no humana(s) del anticuerpo se ha(n) sustituido por (una) región(es) constante(s) de un anticuerpo humano. Se describen métodos para la producción de anticuerpos humanizados en, por ejemplo, los documentos EP-A1 0239400 y WO90/07861.
Como tal cualquier método, sea PCR o determinación por anticuerpos está bien establecido en la técnica. El anticuerpo está preferiblemente marcado o se va a detectar por compuestos marcados tal como anticuerpos secundarios marcados. Dado que secciones de tejidos de pacientes de psoriasis y eczema están en general disponibles para el médico, inmunohistoquímica y/o inmunofluorescencia son métodos particularmente adecuados de determinar y cuantificar la expresión de proteínas por medio de anticuerpos.
En una forma de realización más preferida, dicha muestra es una muestra de piel afectada por la enfermedad tal como un trozo de piel o una biopsia de piel afectada por la enfermedad. Los trozos se pueden obtener usando un microtomo.
Típicamente, dicha muestra se preprocesa con el fin de obtener una fase homogénea. Se efectúa después determinar la expresión de al menos dos marcadores en dicha fase homogénea.
Sorprendentemente, los presentes inventores descubrieron que clasificar o, más en general, diagnosticar también se puede realizar directamente en una muestra de piel teñida tal como una biopsia de piel o un trozo de piel. La tinción preferiblemente se obtiene mediante el método anteriormente divulgado empleando anticuerpos. Según este enfoque, una muestra de piel teñida se somete a análisis de imágenes. Para implementaciones ejemplares usando o bien transformación de Fourier y/o convolución, se hace referencia al ejemplo 6.
Según esto, y al grado que dicha muestra es una muestra de piel y dicha expresión es una expresión a nivel de proteína, (i) dicha determinación de la expresión se efectúa por tinción de dicha muestra de piel; y (ii) dicho diagnóstico se efectúa por análisis de imágenes de la muestra de piel teñida.
En otras palabras, la distribución morfológica, en particular la distribución morfológica a nivel de morfología celular de marcadores según la presente invención se puede usar para el fin de diagnosticar. La tinción preferiblemente se efectúa por inmunofluorescencia, preferiblemente de trozos de piel. El análisis de imágenes preferiblemente implica transformación de Fourier y/o convolución.
Como se ha indicado anteriormente, tanto eczema como psoriasis son enfermedades inflamatorias de la piel que en general afectan a parte, pero no toda la piel de un paciente determinado. Para el fin de determinar expresión específica de enfermedad, elegir muestras de piel afectadas por la enfermedad es el método de elección.
En una forma de realización más preferida, dicho individuo es blanco.
En un segundo aspecto, la presente divulgación proporciona un kit que comprende o consiste en medios para cuantificar la expresión de al menos dos marcadores seleccionados de CCL27, NOS2, IL36G, KLK13, SOST, NPTX1, PLA2G4D, GDA, IL36A, TGM1, CLEC4G, IL13, TCN1, TMPRSS11D y RHCG, siempre que dichos al menos dos marcadores consistan en o comprendan (a) CCL27 y NOS2; (b) CCL27 y KLK13; (c) IL36G y KLK13; (d) CCL27 e IL36G; (e) NOS2 e IL36G; (f) NOS2 y KLK13; (g) SOST; o (h) NPTX1.
En una forma de realización preferida, dichos medios son cebadores, en donde los cebadores para los respectivos genes son como sigue: CCL27: SEQ ID NO: 1 y 2; NOS2: SEQ ID NO: 3 y 4; IL36G: SEQ ID NO: 5 y 6; KLK13: SEQ ID NO: 7 y 8; SOST: SEQ ID NO: 9 y 10; NPTX1: SEQ ID NO: 11 y 12; PLA2G4D: SEQ ID NO: 13 y 14; GDA: SEQ ID NO: 15 y 16; IL36A: SEQ ID NO: 17 y 18; TGM1: SEQ ID NO: 19 y 20; CLEC4G: SEQ ID NO: 21 y 22; IL13: SEQ ID NO: 23 y 24; TCN1: SEQ ID NO: 25 y 26; TMPRSS11D: SEQ ID NO: 27 y 28; RHCG: SEQ ID NO: 29 y 30.
En una forma de realización más preferida, dichos medios son anticuerpos que son específicos para la proteína marcadora determinada.
El kit de la invención comprende además uno o más de los siguientes: (a) medios para obtener una muestra de piel; (b) medios para aislar o enriquecer ARN de una muestra de piel; (c) medios para realizar PCR; y (d) medios para preparar secciones de tejidos.
En una forma de realización más preferida, el kit según el segundo aspecto de la presente divulgación comprende además un manual que comprende instrucciones para realizar el método del primer aspecto de la presente invención.
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona el uso de al menos dos marcadores seleccionados de CCL27, NOS2, IL36G, KLK13, SOST, NPTX1, PLA2G4D, GDA, IL36A, TGM1, CLEC4G, IL13, TCN1, TMPRSS11D y RHCG, siempre que dichos al menos dos marcadores consistan en o comprendan (a) CCL27 y NOS2; (b) CCL27 y KLK13; (c) IL36G y KLK13; (d) CCL27 e IL36G; (e) NOS2 e IL36G; (f) NOS2 y KLK13; (g) SOST; o (h) NPTX1 para diagnosticar eczema y/o psoriasis en una muestra tomada de un individuo.
Con respecto a las formas de realización caracterizadas en esta especificación, en particular en las reivindicaciones, se pretende que cada forma de realización mencionada en una reivindicación dependiente se combine con cada forma de realización de cada reivindicación (independiente o dependiente) de la que depende dicha reivindicación dependiente. Por ejemplo, en el caso de una reivindicación independiente 1 que enumera 3 alternativas A, B y C, una reivindicación dependiente 2 que enumera 3 alternativas D, E y F y una reivindicación 3 que depende de las
reivindicaciones 1 y 2 y que enumera 3 alternativas G, H e I, se debe entender que la especificación divulga de forma no ambigua formas de realización correspondientes a las combinaciones A, D, G; A, D, H; A, D, I; A, E, G; A, E, H; A, E, I; A, F, G; A, F, H; A, F, I; B, D, G; B, D, H; B, D, I; B, E, G; B, E, H; B, E, I; B, F, G; B, F, H; B, F, I; C, D, G; C, D, H; C, D, I; C, E, G; C, E, H; C, E, I; C, F, G; C, F, H; C, F, I, a menos que específicamente se mencione otra cosa.
De forma similar, y también en esos casos donde las reivindicaciones independientes y/o dependientes no enumeran alternativas, se entiende que, si las reivindicaciones dependientes se remiten a una pluralidad de reivindicaciones precedentes, cualquier combinación de objeto cubierta por las mismas se considera que se divulga explícitamente. Por ejemplo, en caso de una reivindicación independiente 1, una reivindicación dependiente 2 que se remite a la reivindicación 1, y una reivindicación dependiente 3 que se remite a las reivindicaciones tanto 2 como 1, se deduce que la combinación del objeto de las reivindicaciones 3 y 1 se divulga de forma clara y no ambigua como es la combinación del objeto de las reivindicaciones 3, 2 y 1. En caso de que una reivindicación dependiente 4 adicional esté presente que se refiere a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, se deduce que la combinación del objeto de las reivindicaciones 4 y 1, de las reivindicaciones 4, 2 y 1, de las reivindicaciones 4, 3 y 1, así como de las reivindicaciones 4, 3, 2 y 1 se divulga de forma clara y no ambigua.
Las figuras muestran:
Figura 1
A Validación por PCR en tiempo real de 15 genes significativamente diferentes entre psoriasis (n = 9) y eczema (n = 10). La curva muestra los valores de corte entre los dos grupos para cada gen. Los marcos indican los dos genes elegidos para construir el clasificador de la enfermedad. *=p<0,05, **=p<0,01, ***=p<0,0001, sin asterisco p<0,1 (Bonferroni corregido para ensayo múltiple. B Un clasificador de enfermedad que consiste en NOS2 (eje y) y CCL27 (eje x) separa de forma precisa pacientes de psoriasis y eczema en un conjunto de entrenamiento que consiste en 19 pacientes (9 de psoriasis, 10 de eczema). Se muestran las muestras de datos del conjunto de entrenamiento después de la transformación logarítmica y escalado. Las cruces indican los vectores de soporte, los círculos indican las muestras de datos restantes del conjunto de entrenamiento. C Rendimiento del clasificador de enfermedad en una cohorte de prueba independiente (16 pacientes de psoriasis, 18 pacientes de eczema). El cuadro muestra un paciente inicialmente mal clasificado, los cuadros con contorno discontinuo un paciente poco claro clínica e histológicamente ilustrado en D. Las barras de escala indican 100 pm en perspectiva general y 50 pm, en isletas.
Figura 2
Tinciones de inmunofluorescencia para DAPI, NOS2, y CCL27 de piel con eczema y psoriasis.
Figura 3
El patrón de tinción de CCL27 distingue psoriasis de eczema.
Los ejemplos ilustran la invención.
Ejemplo 1
Desarrollo del clasificador
Se seleccionaron 15 marcadores génicos según los siguientes criterios: genes con la diferencia más predominante entre psoriasis y eczema; y anotación funcional como genes epidérmicos, inmunitarios, y metabólicos.
Para entrenar el clasificador en los datos de PCR en tiempo real de una cohorte de enfermedad independiente (n = 19), se aplicó el paquete R “e1071” (http://CRAN.R-project.org/package=e1071) usando máquinas de vectores de soporte (SVM). Para conseguir datos normalmente distribuidos las medidas de los 15 genes seleccionados se transformaron usando el logaritmo en base 10. A continuación, se usó una prueba de la t de Welch de dos muestras, bilateral seguida por una corrección del valor p de Bonferroni para ensayar la expresión diferencial. Los genes que estaban más significativamente disminuido (CCL27, valor p ajustado = 5,31*10A(-4)), o aumentado (NOS2, valor p ajustado = 1,53*10A(-6)) se seleccionaron para el clasificador preferido. Los datos escalados y transformados logarítmicamente de los dos genes se usaron como un conjunto de entrenamiento para una clasificación C usando una función del núcleo lineal con C = 1. Para entrenar el clasificador se usó una validación cruzada de 10 veces. A continuación, el clasificador se ensayó en muestras de datos logarítmicamente transformadas de una tercera cohorte independiente (n = 34) prediciendo la clase de enfermedad y computando predicciones de probabilidad basadas en el modelo entrenado.
Diseño de cebadores y PCR en tiempo real
Los cebadores que amplifican los genes de interés se diseñaron usando el software Primer3 públicamente disponible (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/). Los cebadores usados se dan en la lista de secuencias.
Las reacciones de PCR en tiempo real se realizaron en placas de 384 pocilios usando la mezcla Fasta Start SYBR Green Master (Roche Applied Science) y la máquina de PCR en tiempo real ViiA7 (Applied Biosystems). La expresión de los transcritos se normalizó respecto a la expresión de ARN ribosómico de 18S como gen de mantenimiento. Los datos se expresaron como cambio en veces de ARNm relativo a piel no implicada como calibrador. La cuantificación relativa se determinó según la fórmula (RQ)=2-ñCt.
Ejemplo 2
Función de genes extraordinariamente regulados
Respecto al sistema inmunitario, se observaron diferencias entre psoriasis y eczema: exclusivamente en piel psoriásica, las citoquinas pertenecientes a la familia de IL-10 tal como lL-19 e IL-20, así como IL-36Ae IL-36G estaban significativamente aumentadas. Una tendencia no significativa para una mayor inducción de citoquinas asociadas con Th17 IL-17A, IL-17F, e IL-22 también se observó en placas psoriásicas. Las citoquinas que estaban exclusivamente inducidas en lesiones eczematosas eran IL-6 y la citoquina de Th2 IL-13, con una tendencia para una mayor inducción de otras citoquinas de Th2 IL-4, IL-5, e IL-10 en piel eczematosa comparada con psoriásica.
Las quimioquinas CCL17 y CCL18 estaban aumentadas en lesiones eczematosas a un mayor grado que en piel psoriásica. CCL27 estaba disminuida significativamente en piel psoriásica. Por otra parte, CXCL1 y CXCL8 (lL-8) mostraron un aumento más fuerte en placas psoriásicas, con CXCL8 exclusivamente regulada en piel psoriásica.
Puente entre el sistema inmunitario y el compartimento epidémico, se encontró que numerosos péptidos antimicrobianos (AMP) estaban aumentados en piel tanto psoriásica como eczematosa en comparación con piel no implicada, respectivamente. Los miembros de defensinas DEFB4 y DEFB103B, así como las proteínas S100 S100A7A, S100A7, S100A8, S100A9 y S100A12 estaban significativamente aumentadas en ambas enfermedades. Sin embargo, la inducción de todos los AMP detectados era mucho mayor en piel psoriásica que en eczematosa. Según esto, las peptidasas relacionadas con calicreína inducidas por IL-20 KLK6, KLK9, y KLK13, demostradas que inducen AMP, estaban exclusivamente aumentadas en piel psoriásica, pero no eczematosa.
También se observaron diferencias respecto a marcadores de diferenciación temprana de la familia de proteína rica en prolina pequeña (SPRR) y la familia de envuelta cornificada tardía (LCE). SPRRlA, SPRR1B, SPRR2A, SPRR2B, SPRR2C, SPRR2D, LCE3C y cornifelina estaban exclusivamente aumentadas en placas psoriásicas. LCE3A, LEC3D, y LCE3E estaban aumentadas en piel tanto con psoriasis como con eczema, pero a un mayor grado en psoriasis. Por el contrario, LCE1B y LCE5A estaban disminuidas en piel tanto psoriásica como eczematosa, pero a un mayor grado en eczema. Se observó una imagen heterogénea respecto a la regulación de queratina, con KRT6A, KRT6B, KRT6C, KRT16 y KRT75 muy aumentadas en piel psoriásica y KRT2, KRT19, así como KRT77 disminuidas más en piel psoriásica que eczematosa. Los genes de diferenciación tardía de la familia filagrina FLG y FLG2 también estaban disminuidos tanto en piel psoriásica como eczematosa. La hornerina estaba aumentada más en piel psoriásica que en eczematosa en comparación con la no implicada.
Numerosos genes implicados en el metabolismo de glucosa, lípidos y aminoácidos estaban exclusivamente regulados en piel psoriásica, pero no eczematosa. Es decir, la regulación de la fosfolipasa PLA2G4D, la óxido nítrico sintasa 2 (iNOS o NOS2), los casetes de unión a ATP ABCG4, las serina proteasas p Rs S22, PRSS27, PRSS53, quinureninasa, transcobalamina, y el inhibidor de la señalización de Wtn esclerostina estaban aumentadas exclusivamente en placas psoriásicas. Los miembros de la familia aldo-ceto reductasa AKR1B15, AKR1B10 y el inhibidor de peptidasa PI3 estaban aumentados tanto en piel psoriásica como eczematosa, pero más en psoriasis.
Ejemplo 3
Establecimiento de un clasificador de enfermedad para distinguir psoriasis y eczema
Puesto que se observaron diferencias entre psoriasis y eczema a nivel tanto de genes individuales como de ruta de señalización, se buscó traducir estos resultados básicos a un clasificador de enfermedad que permita distinguir psoriasis de eczema. Los 15 genes de la invención (Tabla 1, Figura 1A) se incluyeron en una cohorte de validación con 19 pacientes (9 para psoriasis, 10 para eczema) para entrenar un clasificador. La expresión de los 15 genes seleccionados se detectó usando PCR en tiempo real en los 19 pacientes y se usó una prueba de la t de Welch de dos muestras, bilateral sobre las medidas logarítmicamente transformadas seguido por una corrección del valor p de Bonferroni para signar a cada uno de los 15 genes un valor p. Las secuencias de cebadores usadas para la PCR en tiempo real se dan en la tabla S4. CCL27 y NOS2 fueron los genes con valores p ajustados menores (para aumento y disminución significativa, respectivamente, de psoriasis frente a eczema). Basado en estos dos genes se entrenó un clasificador usando una validación cruzada de 1o veces y máquinas de vectores de soporte (SVM). Se alcanzó una precisión media del 100% (Figura 1B). Con una tercera cohorte independiente (34 pacientes en total; 16 pacientes de psoriasis y 18 pacientes de eczema), el clasificador se ensayó y pudo clasificar 33 de 34 pacientes como se predice de la evaluación clínica e histológica (kappa = 0,94; Figura 1C).
Ejemplo 4
Rendimiento del clasificador en casos especiales
Un paciente se clasificó como eczema con una probabilidad del 0,85, aunque el diagnóstico dado era psoriasis. Rastrear las características clínicas e histológicas de este paciente reveló que el diagnóstico inicial de psoriasis era lo más probablemente no correcto. El paciente de 54 años de edad presentaba lesiones de la piel de tipo eczema diseminadas, demarcadas con descamación centrípeda que habían surgido dos meses antes. La evaluación histológica reveló microabscesos de neutrófilos, espongiosis, necrosis de células individuales en la epidermis, y un epidermotropismo de células inmunitarias. Otros distintivos para psoriasis tal como acantosis y adelgazamiento epidérmico por encima de las papilas dérmicas que contenían capilares dilatados y tortuosos no se observaron. En línea con esa observación, el paciente no respondió bien a ditranol. Además, las lesiones de la piel no recayeron después de la remisión. Retrospectivamente, otros diagnósticos como pitiriasis rosada, eczema o pitiriasis liquenoide crónica se deben favorecer claramente en este paciente.
Además de pacientes con diagnóstico determinado a partir de evaluación clínica e histológica, se ensayó un paciente donde los métodos estándar de referencia no pudieron distinguir entre psoriasis y eczema (Figura 1D). La paciente mujer de 53 años de edad padecía lesiones inflamatorias de la piel desde hacía años. Se podría haber favorecido eczema porque padecía asma alérgica, su IgE estaba ligeramente elevada (108 UI/ml), y las lesiones eran pruriginosas; los antecedentes familiares positivos para psoriasis y las placas muy estacionarias en áreas de predilección eran típicas más bien para psoriasis. También la evaluación histológica era conflictiva, con una acantosis hinchada, falta parcialmente la capa granular y paraqueratosis que justifica psoriasis. Por otra parte, el epidermotropismo de células T y muy pocos neutrófilos con microabscesos ausentes eran más típicos para eczema. Cuando esta paciente se ensayó en el clasificador, las dos biopsias se clasificaron como eczema con una probabilidad por encima del 99 %, lo que indica que el clasificador podría ser útil incluso en casos donde las herramientas diagnósticas de referencia establecidas fallan.
Ejemplo 5
Inmunofluorescencia
El clasificador de enfermedad propuesto de psoriasis y eczema basado en los marcadores NOS2 y CCL27 es válido a nivel de inmunofluorescencia. Esto se ha confirmado usando datos de 118 pacientes. Biopsias de piel embebidas en parafina de psoriasis, eczema, y lesiones de piel clínicamente, así como histológicamente no claras se tiñeron para DAPI (tinción nuclear), NOS2 y CCL27. En línea con los resultados obtenidos del análisis de PCR a nivel de ARN, las secciones de psoriasis se tiñeron fuertemente positivo para NOS2, pero apenas para CCL27. En contraste, las secciones de eczema fueron positivas para CCL27, pero la tinción de NOS2 fue de muy débil a ausente (Figura 2). En conclusión, el clasificador propuesto para distinguir psoriasis de eczema es válido a nivel de expresión de proteína, como se demuestra usando tinciones dobles de inmunofluorescencia.
Ejemplo 6
Análisis de imágenes
Los marcadores propuestos NOS2 y CCL27 permiten distinguir psoriasis de eczema basado en su patrón de expresión de proteína. En particular, CCL27 se distribuye homogéneamente en el citoplasma en secciones de psoriasis, mientras que las muestras de eczema se caracterizan por un patrón de tinción claramente nuclear (Figura 3).
Se estableció un programa de análisis de imágenes usando el lenguaje de programación Python: se analizaron ambos canales de color de cada imagen (canal azul para tinción nuclear de DAPi y canal rojo para tinción de CCL27) por separado y se compararon entre sí usando dos métodos diferentes simultáneamente.
El primer método se basa en la transformación de Fourier que descompone una imagen en sus frecuencias en un espacio bidimensional (componentes de seno y coseno). Los bordes agudos que se pueden ver en el canal de DAPI, así como en la canal de CCL27 de eczema -donde se encontraron bordes claros entre núcleos positivos y citoplasma bastante negativo- están representados por altas frecuencias, mientras que la aparición citoplásmica ubicua de CCL27 como se ve en psoriasis está representada por bordes bajos y como tal por bajas frecuencias. Densidades de energía de frecuencia similares entre los dos canales producen cocientes próximos a 1, densidades de energía de frecuencia distintas en cocientes próximos a 0.
El segundo método se basa en convolución. Aquí, ambos canales de color de cada parte de la imagen se comparan secuencialmente entre sí en ventanas de 32x32 píxeles. Cuanto mayor sea la congruencia -que es el caso de la distribución de CCL27 en eczema y DAPI, pero no entre la distribución de CCL27 en psoriasis y DAPI- mayores son los valores calculados (valor máximo 1, valor mínimo 0). Para cada imagen ambos valores están representados por un punto en un sistema de coordinadas bidimensional. Se traza una línea en la separación máxima de ambos grupos.
Claims (16)
1. Un método para diagnosticar eczema o psoriasis, en donde dicho método diferencia entre eczema y psoriasis, y comprende determinar la expresión de al menos dos marcadores en una muestra tomada de un individuo, en donde dichos al menos dos marcadores se seleccionan de CCL27, NOS2, IL36G, KLK13, SOST, NPTX1, PLA2G4D, GDA, IL36A, TGM1, CLEC4G, IL13, TCN1, TMPRSS11D y RHCG, siempre que dichos al menos dos marcadores consistan en o comprendan
(a) CCL27 y NOS2;
(b) CCL27 y KLK13;
(c) IL36G y KLK13;
(d) CCL27 e IL36G;
(e) NOS2 e IL36G;
(f) NOS2 y KLK13;
(g) SOST; o
(h) NPTX1; y
evaluar en la base de la expresión de dichos al menos dos marcadores si el individuo está afectado con eczema o psoriasis.
2. El método de la reivindicación 1, en donde dichos al menos dos marcadores consisten en o comprenden:
(i) CCL27 y NOS2.
3. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicho diagnosticar se efectúa mediante un clasificador.
4. El método de la reivindicación 3, en donde
a) dicho clasificador es obtenible analizando dicha expresión de dichos al menos dos marcadores en muestras tomadas de individuos que padecen eczema y en muestras tomadas en individuos que padecen psoriasis; o
b) dicho método además comprende calcular dicho clasificador analizando dicha expresión de dichos al menos dos marcadores en muestras tomadas de individuos que padecen eczema y en muestras tomadas en individuos que padecen psoriasis.
5. El método de la reivindicación 4, en donde dicho análisis es por medio de máquinas de vectores de soporte (SVM), modelos lineales generalizados (GLM), análisis discriminante lineal, árboles de decisión, reglas de decisión, redes neurales, métodos de regresión de Bayes, y/o métodos del vecino más próximo.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho eczema se selecciona de eczema atípico, dermatitis de contacto, dermatitis numular y eczema dishidrótico.
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha psoriasis se selecciona de psoriasis vulgar, psoriasis inversa y psoriasis pustulosa.
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha expresión es expresión
(a) a nivel del ARNm y/o
(b) a nivel de proteína.
9. El método de la reivindicación 8(a), en donde dicha determinación se efectúa por PCR, preferiblemente PCR en tiempo real.
10. El método de la reivindicación 8(b), en donde dicha determinación se efectúa por anticuerpos.
11. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha muestra es una muestra de piel afectada por la enfermedad tal como un trozo de piel o una biopsia de piel afectada por la enfermedad.
12. El método de la reivindicación 11, al nivel que remite a la reivindicación 10 u 8(b), en donde
(i) dicha determinación de la expresión se efectúa por tinción de dicha muestra de piel; y
(ii) dicho diagnóstico se efectúa por análisis de imagen de la muestra de piel teñida.
13. Un kit para uso en un método de diagnosticar eczema o psoriasis, que comprende o consiste en medios para cuantificar la expresión de al menos dos marcadores seleccionados de CCL27 y NOS2, siempre que dichos al menos dos marcadores consisten en CCL27 y NOS2, en donde dicho kit además comprende (a) medios para
obtener una muestra de piel; (b) medios para aislar o enriquecer ARN de una muestra de piel; (c) medios para realizar PCR; y (d) medios para preparar secciones de tejido.
14. El kit de la reivindicación 13, en donde dichos medios son cebadores, en donde los cebadores para los respectivos genes son como sigue:
CCL27: SEQ ID NO: 1 y 2;
NOS2: SEQ ID NO: 3 y 4.
15. El kit de la reivindicación 13, en donde dichos medios son anticuerpos que son específicos para el marcador determinado.
16. Uso de al menos dos marcadores seleccionados de CCL27, NOS2, IL36G, KLK13, SOST, NPTX1, PLA2G4D, GDA, IL36A, TGM1, CLEC4G, IL13, TCN1, TMPRSS11D y RHCG, siempre que dichos al menos dos marcadores consistan en o comprendan
(a) CCL27 y NOS2;
(b) CCL27 y KLK13;
(c) IL36G y KLK13;
(d) CCL27 e IL36G;
(e) NOS2 e IL36G;
(f) NOS2 y KLK13;
(g) SOST; o
(h) NPTX1
para diagnosticar eczema o psoriasis en una muestra tomada de un individuo.
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