ES2841378T3 - Polipéptidos fHbp meningocócicos modificados - Google Patents
Polipéptidos fHbp meningocócicos modificadosInfo
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Abstract
Un mutante fHbp v3 o v2 que es: (A) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos mutante fHbp v2, en la que: (i) la secuencia de aminoácidos tiene al menos el 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 5 y/o comprende un fragmento de SEQ ID NO: 5 que tiene al menos 7 aminoácidos de longitud e incluye un residuo correspondiente al residuo 32 de la SEQ ID NO: 5, pero (ii) la secuencia de aminoácidos difiere de la SEQ ID NO: 5 en el residuo 32 por la ssutitución S32V en el que el polipéptido puede provocar anticuerpos que pueden reconocer un polipéptido meningocócico de tipo salvaje que consta de SEQ ID NO. 4 o (B) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos mutante fHbp v3, en el que: (i) la secuencia de aminoácidos tiene al menos el 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 17 y/o comprende un fragmento de SEQ ID NO: 17 que es al menos 7 aminoácidos de longitud e incluye un residuo correspondiente al residuo 32 de SEQ ID NO: 17, pero (ii) la secuencia de aminoácidos difiere de la SEQ ID NO: 17 en el residuo 32, por la sustitución S32V. en el que el polipéptido puede provocar anticuerpos que pueden reconocer un polipéptido meningocócico de tipo salvaje que consta de SEQ ID NO. 40.
Description
DESCRIPCIÓN
Polipéptidos fHbp meningocócicos modificados
Esta solicitud reivindica el beneficio de las solicitudes de patente europeas 14157399.8 (presentada el 28 de febrero de 2014) y 14177566.8 (presentada el 17 de julio de 2014), el contenido completo de los cuales se incorporan en el presente documento por referencia para todos los propósitos.
Campo técnico
La presente invención pertenece al campo de la ingeniería de proteínas, relativas en particular a la proteína meningocócica de unión al factor H (fHbp), que se sabe que es un inmunógeno de vacuna útil.
Técnica anterior
Neisseria meningitidis es una bacteria Gram - negativa encapsulada que coloniza el tracto respiratorio superior de aproximadamente el 10 % de la población humana. Las vacunas conjugadas están disponibles contra los serogrupos A, C, W135 e Y, pero la única vacuna que está disponible para la protección contra el serogrupo B en un régimen de dos dosis es el producto BEXSERO™ que fue aprobado en 2013.
Uno de los inmunógenos protectores en BEXSERO™ es fHbp, que también se ha conocido como proteína '741' (SEQ ID NO: 2536 en la referencia 1; SEC ID 1 en el presente documento), 'NMB1870', 'GNA1870' [2 - 4, 'P2086', 'LP2086' o 'ORF2086' [5 - 7]. Se conoce la estructura 3D de esta proteína [8 , 9], y la proteína tiene dos barriles p conectadas por un engarce corto. Muchas publicaciones han informado sobre la eficacia protectora de esta proteína en las vacunas meningocócicas, por ejemplo, véanse las referencias 10 - 14. La lipoproteína fHbp se expresa en diversas cepas y en todos los serogrupos. Las secuencias de fHbp se han agrupado en tres variantes [2] (denominado en el presente documento v1, v2 y v3), y se ha descubierto en general que el suero producido contra una variante dada es bactericida contra las cepas que expresan esa variante, pero no es activo contra las cepas que expresan una de las otras dos variantes, es decir, hay protección cruzada intra-variantes -, pero no hay protección cruzada - inter-variantes -(a excepción de alguna reactividad cruzada entre v2 y v3).
Para aumentar la reactividad cruzada inter-familia, se ha diseñado la secuencia fHbp para que contenga especificidades para las tres variantes [15]. Se ha utilizado la ingeniería de proteínas también para eliminar la interacción de fHbp con sideróforos [16] y con el factor H [17 - 25]. La interrupción de la interacción con fH se ha informado para las tres variantes y se postula para proporcionar un inmunógeno de vacuna superior [22 , 26]. Para los polipéptidos v2, sin embargo, las referencias 23 y 24 informan de una inestabilidad inherente que también se observa en los mutantes con una unión a fH alterada. La inestabilidad parece surgir desde el dominio de barril p N-terminal, y la referencia 23 advierte que ninguna sustitución en este barril podría promover la inestabilidad. La referencia 35 describe polipéptidos fHbp v2 modificados específicos que tienen mayor estabilidad respecto de un polipéptido v2 de tipo salvaje y menos unión a fH.
Es un objeto de la invención proporcionar más mutantes fHbp V2 y V3, pero después de haber mejorado la estabilidad.
Descripción de la invención
El fHbp de longitud completa de la cepa 2996 en v2 tiene la siguiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2):
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAA QGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAWALQIEKINNPDK IDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQ NVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
La lipoproteína madura carece de los primeros 19 aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (subrayada; proporciona la SEQ ID NO: 4), y la forma AG de SEQ ID NO: 2 carece de los primeros 26 aminoácidos (SEQ ID NO: 5).
El fHbp de longitud completa de la cepa M1239 en v3 tiene la siguiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 3):
MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSI PQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSA WALQIEKINNPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTK KQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKI GEKVHEIGIAGKQ
La lipoproteína madura carece de los primeros 19 aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (subrayada; proporciona la SEQ ID NO: 4), y la forma AG de SEQ ID NO: 3 carece de los primeros 31 aminoácidos (SEQ ID NO: 17).
Los inventores han identificado los residuos dentro de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 que pueden modificarse para aumentar la estabilidad del polipéptido. Estos residuos están presentes en general en las secuencias V2 y V3 por lo que su modificación puede proporcionar secuencias de fHbp V2 y V3 con estabilidad mejorada. Además, los inventores han demostrado que, además de aumentar la estabilidad, la mutación de estos residuos puede de forma ventajosa disminuir la unión al factor H humano (fH). Además, sin embargo, las mutaciones divulgadas en el presente documento se pueden combinar con otras mutaciones, por ejemplo, para disminuir la unión al factor humano H (fH), siendo dichas mutaciones son ya conocidas en la técnica.
Por lo tanto, en general, la invención proporciona un fHbp v2 o v3 mutante con un aumento de la estabilidad con respecto a un fHbp de tipo silvestre (por ejemplo, con respecto a la SEQ ID Nos: 2 o 3) y que, opcionalmente, tiene menor afinidad por el factor H humano que un fHbp de tipo silvestre (porejemplo, con respecto a la SEQ ID NO: 2 o 3). El aumento de la estabilidad y la reducción opcional en la afinidad por fH resultan preferentemente debido a la(s) misma(s) mutación/es, pero en algunos casos puede deberse al efecto independiente de las mutaciones combinadas. Pueden ser preferentes las proteínas mutantes fHbp tanto con una mayor estabilidad y una afinidad reducida por fH.
En un primer aspecto, la invención proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos mutante fHbp v2, en la que: (a) la secuencia de aminoácidos tiene al menos una identidad de secuencia del k % con la SEQ ID NO: 5 y/o comprende un fragmento de SEQ ID NO: 5, pero (b) la secuencia de aminoácidos difiere de la SEQ ID NO: 5 en el residuo 32 por la sustitución S32V. En una realización preferente, la secuencia de aminoácidos se diferencia además de la SEQ ID NO: 5 en los residuos L123, V124, S125, G126, L127 y/o G128.
Cuando la característica (a) se refiere a un fragmento, el fragmento incluye el residuo correspondiente al residuo 32 de la SEQ ID NO: 5. Un fragmento de (a) es de al menos 7 aminoácidos, por ejemplo, 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 24, 26, 28, 40, 45, 50, 55, 60 aminoácidos contiguos o más de SEQ ID NO: 5. El fragmento incluirá típicamente al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 5. La identificación y mapeo del epítopo está determinada para fHbp [11 ; 27 - 31]. La compartición de al menos 30 aminoácidos contiguos con la SEQ ID NO: 5 será típica, y por lo general una secuencia de aminoácidos mutante fHbp v2 incluirá varios (porejemplo, 2, 3, 4, 5 o más) fragmentos de SEQ ID NO: 5. En general, la secuencia de aminoácidos de un mutante fHbp v2 tiene al menos una identidad de la secuencia del k % e incluir varios fragmentos de SEQ ID NO: 5.
El valor de k es al menos 80 y puede ser, por ejemplo 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o más. Por ejemplo, puede ser 90 (es decir la secuencia de aminoácidos mutante fHbp v2 tiene al menos el 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 5) o 95.
El polipéptido puede, después de su administración a un animal huésped, generar anticuerpos que pueden reconocer un - polipéptido meningocócico de tipo silvestre que consiste en la SEQ ID NO: 4. Estos anticuerpos pueden ser bactericidas (véase a continuación). Estos anticuerpos pueden incluir algunos anticuerpos que no reconocen un polipéptido v1 o v3 (porejemplo, un -polipéptido meningocócico de tipo silvestre que consiste en SEQ ID NO: 46 y un - polipéptido meningocócico de tipo silvestre que consiste en SEQ ID NO: 40), aunque también pueden incluir algunos anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con polipéptidos v1 y/o v3.
El polipéptido tiene, en las mismas condiciones experimentales, una mayor estabilidad que el mismo polipéptido pero sin la(s) diferencia(s) de secuencia de (b), por ejemplo, mayor estabilidad que un - polipéptido meningocócico de tipo silvestre que consiste en SEQ ID NO: 4. El aumento de la estabilidad puede evaluarse usando calorimetría diferencial de barrido (DSC), por ejemplo, como se describe en las referencias 32 y 33 . DSC anteriormente ya ha sido utilizado para evaluar la estabilidad de fHbp v2 [24]. Las condiciones adecuadas para DSC para evaluar la estabilidad pueden utilizar 20|jM de polipéptido en una solución tamponada (por ejemplo, Tris 25 mM) con un pH entre 6 y 8 (por ejemplo, 7-7,5) con NaCl 100-200mM (por ejemplo, 150 mM).
En algunos casos, el polipéptido de la invención puede estar truncado con respecto a la SEQ ID NO: 5. En comparación con la secuencia madura de tipo silvestre, SEQ ID NO: 5 ya está truncada en el extremo N-terminal e incluye la secuencia de poliglicina (compárese SEQ ID NO: 4 y 15), pero SEQ ID NO: 5 puede estar truncada en el extremo C -terminal y/o más truncada en el extremo N-terminal.
El aumento de la estabilidad es idealmente de al menos 5 °C por ejemplo al menos 10 °C, 15 °C, 20 °C, 25 °C, 30 °C, 35 °C o más. Estas temperaturas se refieren al aumento del punto medio de transición térmica (Tm) según la evaluación por DSC. El fHbp tipo silvestre muestra dos picos de dSc al desplegarse (uno para el dominio N-terminal y otro para el dominio C - terminal) y, cuando un polipéptido de la invención incluye ambos dominios, el aumento se refiere a la estabilidad del dominio N-terminal, que puede ocurrir incluso por debajo de 40 °C con secuencias v2 de tipo silvestre [24] (mientras que los dominios C-terminal pueden tener una Tm de 80 °C o más). Por lo tanto la secuencia de aminoácidos fHbp v2 mutante de la invención tiene preferentemente un dominio N-terminal con una Tm de al menos 45 °C por ejemplo, > 50 °C, > 55 °C, > 60 °C, > 65 °C, > 70 °C, > 75 °C, o incluso > 80 °C.
En un segundo modo de realización, la invención proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos mutante fHbp v3, en la que: (a) la secuencia de aminoácidos tiene al menos una identidad de secuencia del j % con la SEQ ID NO: 17 y/o comprende un fragmento de SEQ ID NO: 17, pero (b) la secuencia de aminoácidos difiere de la SEQ ID NO: 17 en el residuo S32 por la sustitución S32V. En una realización preferente, la secuencia de aminoácidos difiere además de la SEQ ID NO: 17 en el residuo L126.
Cuando la característica (a) se refiere a un fragmento, el fragmento inlcuye al menos el residuo correspondiente al residuo 32 de la SEQ ID NO: 17. Un fragmento de (a) es de al menos 7 aminoácidos, por ejemplo, 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 24, 26, 28, 40, 45, 50, 55, 60 aminoácidos contiguos o más de SEQ ID NO: 17. El fragmento incluirá típicamente al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 17. La identificación y mapeo del epítopo está determinada para fHbp [11; 27-31]. La compartición de al menos 30 aminoácidos contiguos con la SEQ ID NO: 17 será típica, y por lo general una secuencia de aminoácidos mutante fHbp v3 incluirá varios (porejemplo, 2, 3, 4, 5 o más) fragmentos de SEQ ID NO: 17. En general, la secuencia de aminoácidos de un mutante fHbp v3 tiene al menos una identidad de secuencia del j % y puede incluir varios fragmentos de SEQ ID NO: 17.
El valor de j es al menos 80 y puede ser por ejemplo 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o más. Por ejemplo, puede ser 90 (es decir, la secuencia de aminoácidos mutante fHbp v3 tiene al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 17) o 95.
El polipéptido puede, después de su administración a un animal huésped, generar anticuerpos que pueden reconocer un - polipéptido meningocócico de tipo silvestre que consiste en la SEQ ID NO: 40. Estos anticuerpos pueden ser bactericidas (véase a continuación). Estos anticuerpos pueden incluir algunos anticuerpos que no reconocen un polipéptido v1 o v2 (por ejemplo, un - polipéptido meningocócico de tipo silvestre que consiste en SEQ ID NO: 46 y un - polipéptido meningocócico de tipo silvestre que consiste en SEQ ID NO: 4), aunque también pueden incluir algunos anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con polipéptidos v1 y/o v2.
El polipéptido tiene, en las mismas condiciones experimentales, una mayor estabilidad que el mismo polipéptido pero sin la(s) diferencia() de secuencia de (b), por ejemplo, mayor estabilidad que un - polipéptido meningocócico de tipo silvestre que consiste en SEQ ID NO: 40. El aumento de la estabilidad se puede evaluar usando calorimetría diferencial de barrido (DSC), por ejemplo como se describe en las referencias 32 y 33 DSC anteriormente ya ha sido utilizado para evaluar la estabilidad de fHbp v3 [23]. Las condiciones adecuadas para DSC para evaluar la estabilidad pueden utilizar 20|jM de polipéptido en una solución tamponada (por ejemplo, Tris 25 mM) con un pH entre 6 y 8 (por ejemplo, 7-7,5) con NaCl 100-200mM (por ejemplo, 150 mM).
En algunos casos, el polipéptido de la invención puede estar truncado con respecto a la SEQ ID NO: 17. En comparación con la secuencia madura de tipo silvestre, SEQ ID NO: 17 ya está truncada en el extremo N-terminal e incluye la secuencia de poliglicina (compárese SEQ ID NOs: 40 y 117), pero SEQ ID NO: 17 puede estar truncada en el extremo C -terminal y/o más truncada en el extremo N-terminal.
El aumento de la estabilidad es idealmente de al menos 5 °C por ejemplo al menos 10 °C, 15 °C, 20 °C, 25 °C, 30 °C, 35 °C o más. Estas temperaturas se refieren al aumento del punto medio de transición térmica (Tm) según la evaluación por DSC. El fHbp de tipo silvestre muestra dos picos de DSC al desplegarse (uno para el dominio N-terminal y uno para el dominio C-terminal) y, cuando un polipéptido de la invención incluye ambos dominios, el aumento se refiere a la estabilidad del dominio N-terminal, que puede ocurrir en alrededor de 60 °C o menos con secuencias v3 de tipo silvestre [24] (mientras que los dominios C-terminal pueden tener una Tm de 80 °C o más). Por lo tanto la secuencia de aminoácidos fHbp v3 mutante de la invención tiene preferentemente un dominio N-terminal con una Tm de al menos 65 °C por ejemplo, > 70 °C, > 75 °C, o incluso > 80 °C.
Mutaciones relacionadas con la SEQ ID NO: 5
Los polipéptidos del primer aspecto de la invención comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un k % de identidad con la s Eq ID NO: 5 y/o comprende un fragmento de SEQ ID NO: 5. En comparación con la SEQ ID NO: 5, sin embargo, esta secuencia de amino difiere en el residuo 32 por la sustitución S32V y, opcionalmente, se diferencia además de la SEQ ID NO: 5 en uno o más de los residuos L123, V124, S125, G126, L127, G128, por ejemplo, en 2, 3, 4, 5 o más de estos 6 residuos. Estos residuos están enumerados de acuerdo con la SEQ ID NO: 5; para que coincida con la secuencia de tipo silvestre inicial (SEQ ID NO: 2), la numeración debe cambiar 26 (es decir, La Ser-32 de SEQ ID NO: 5 es la Ser-58 de SEQ iD NO: 2; y para que coincida con la secuencia de tipo silvestre madura (SEQ ID NO: 4) la numeración debe cambiar 7 (que también permite una sencilla comparación con la referencia 25).
Además de la mutación S32V, los residuos preferentes para la mutación adicional son L123, V124, S125, G126, L127, y/o G128. Las mutaciones en estos residuos generan proteínas que tienen buena estabilidad en comparación con las de tipo silvestre v2.
El residuo especificado puede eliminarse, pero preferentemente se sustituye por un aminoácido diferente. Cuando se hace una sustitución, el aminoácido de sustitución en algunos casos puede ser un simple aminoácido como la glicina o la alanina. En otros modos de realización, el aminoácido de sustitución es una sustitución conservadora, por ejemplo, que se realiza dentro de los cuatro grupos siguientes: (1) ácido, es decir, aspartato, glutamato; (2),
básico, es decir, lisina, arginina, histidina; (3) no polar, es decir, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polar sin carga, es decir, glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. En otros casos, la sustitución no es conservadora. En algunos casos la sustitución no utiliza alanina.
Las sustituciones preferentes en los residuos especificados para mutaciones adicionales son las siguientes: L123R; V124I; S125G o S125T; G126D; L127I; G128A.
También se describe en este documento la secuencia de aminoácidos fHbp v2 mutante que incluye una sustitución en E240, esta sustitución no será con alanina si solamente está mutado E240, aunque puede ser alanina si un aminoácido adicional que aparezca enumerado en (b) está sustituido, por ejemplo, si ambos residuos E240 y H239 están mutados. Idealmente, E240 no muta espontáneamente, y así una secuencia de aminoácidos fHbp v2 mutante con una sustitución en E240 también debe incluir una sustitución en un segundo residuo, por ejemplo, tanto en E240 como H239 (véanse mutantes No. 1 y No. 11).
También se describe en este documento la secuencia de aminoácidos fHbp v2 mutante que incluye una sustitución en F122, esta sustitución no será con alanina si está mutado solamente F122, aunque puede ser alanina si un aminoácido adicional que aparezca enumerado en, (b) se sustituye, por ejemplo, si ambos residuos F122 y S151 están mutados. Idealmente, F122 no muta espontáneamente, y así, una secuencia de aminoácidos fHbp v2 mutante con una sustitución en F122 también debe incluir una sustitución en un segundo residuo. Cuando está sustituido F122 se prefiere que S151 también esté sustituido, por ejemplo, ambos están sustituidos con cisteína, para permitir la formación de un puente disulfuro (véase mutante No. 10).
Cuando la secuencia de aminoácidos fHbp v2 mutante incluye una sustitución en L123, se prefiere la sustitución con arginina. Cuando está sustituido L123, (i) S32 está sustituido, como se ve en el mutante No. 3, y opcionalmente también S125 está sustituido, como se ve en los mutantes No. 20 y No. 22; o (ii) S32 está sustituido y uno o más de los residuos 124-128 también están sustituidos.
Cuando la secuencia de aminoácidos fHbp v2 mutante incluye una sustitución en V124, se prefiere la sustitución con isoleucina. Cuando está sustituido V124 se prefiere que uno o más de los residuos 124 a 128 también estén sustituidos.
Cuando la secuencia de aminoácidos fHbp v2 mutante incluye una sustitución en L127, se prefiere la sustitución con isoleucina. Cuando está sustituido L127 se prefiere que uno o más de los residuos 124-128 también estén sustituidos.
La secuencia de aminoácidos fHbp v2 mutante incluye una sustitución en S32, y está sustituida con valina. Idealmente, sin embargo, S32 no muta espontáneamente, y así, una secuencia de aminoácidos fHbp v2 mutante con una sustitución en S32 también debe incluir una sustitución en un segundo residuo. Cuando está sustituido S32, se prefiere que (i) L123 también esté sustituido, por ejemplo, como se ve en el mutante No. 3, y opcionalmente también S125 esté sustituido, como se ve en los mutantes No. 20 y No. 22; o (ii) S125 también esté sustituido, por ejemplo, como se ve en los mutantes No. 19 y No. 21.
También se describe en este documento la secuencia de aminoácidos fHbp v2 mutante que incluye una sustitución en I113, esta sustitución no será con alanina si está mutado solamente I113, aunque puede ser alanina si se sustituye un aminoácido adicional que aparezca en (b). Si I113 muta espontáneamente, se prefiere la sustitución con serina, por ejemplo, como se ve en el mutante No. 7.
También se describe en este documento la secuencia de aminoácidos mutante fHbp v2 que incluye una sustitución en V33, esta sustitución no es preferentemente isoleucina. Cuando la secuencia de aminoácidos mutante fHbp v2 descrita en este documento incluye una sustitución en I113, esta preferentemente no es con treonina ni alanina. Cuando la secuencia de aminoácidos mutante fHbp v2 descrita en este documento incluye una sustitución en S151, esta preferentemente no es con fenilalanina. Cuando la secuencia de aminoácidos mutante fHbp v2 descrita en este documento incluye una sustitución tanto en H239 como en E240, esta preferentemente no es R239 ni Q240.
La divulgación describe secuencias de aminoácidos de fHbp v2 mutante donde se puede realizar más de una sustitución, estas sustituciones pueden seleccionarse de los grupos 2A a 20 del siguiente modo:
2A: los residuos 239 y 240 por ejemplo mutante No. 1.
2B: los residuos 32 y 123 por ejemplo mutante No. 3.
2C: los residuos 125 y 126 por ejemplo mutante No. 5.
2D: los residuos 100, 125 y 126, por ejemplo mutante No. 6.
2E: los residuos 33 y 39, por ejemplo mutante No. 8.
2F: los residuos 41 y 69, por ejemplo mutante No. 9.
2G: los residuos 122 y 151 por ejemplo mutante No. 10.
2H: los residuos 100, 125, 126, 239 y 240, por ejemplo mutante No. 11.
2I: residuos 32 y 125 por ejemplo, mutantes No. 19 y No. 21.
2J: residuos de 32, 123 y 125, por ejemplo mutantes No. 20 y No. 22.
2K: los residuos 33 y 39, ambos sustituidos por Cys por ejemplo mutante No. 8.
2L: los residuos 41 y 69, ambos sustituidos por Cys por ejemplo mutante No. 9.
2M: los residuos 122 y 151, ambos sustituidos por Cys por ejemplo mutante No. 10.
2N: los residuos 123, 124, 125, 126, 127 y 128, por ejemplo mutante No. 12.
2O: los residuos 32, 123, 124, 125, 126, 127 y 128.
El grupo 2B proporciona las mutaciones más preferentes, y particularmente S32V y L123R (por ejemplo, SEQ ID NOs: 20 y 45). El grupo 20 es otro conjunto preferente de mutaciones, que combina 2B, 2C y otras tres mutaciones (por ejemplo, para generar SEQ ID NO: 58).
Los residuos aminoacídicos indicados para la mutación en una secuencia v2 están numerados en relación con la SEQ ID NO: 5, que es de la cepa 2996. Los correspondientes residuos de aminoácidos en una fHbp v2 de cualquier otra cepa pueden identificarse fácilmente por alineamiento de secuencias, por ejemplo siendo el aminoácido que, cuando se alinean con la SEQ ID NO: 5 utilizando un algoritmo de alineamiento por pares (porejemplo, el algoritmo de alineamiento global de Needleman-Wunsch, como se detalla a continuación), se alinea con el aminoácido mencionado en el presente documento. A menudo, el aminoácido será el mismo que se observa en SEQ ID NO: 5 (por ejemplo, residuos 32 será serina), pero el alineamiento identificará fácilmente si este no es el caso.
Además de la(s) mutación(es) indicada(s) anteriormente, que tiene(n) como objetivo aumentar la estabilidad, un polipéptido de la invención puede incluir una o más mutaciones por ejemplo para interrumpir la interacción del polipéptido con sideróforos o, más preferentemente, para interrumpir la capacidad del polipéptido para unirse a fH. Las referencias 19 y 25 informan de que la interacción entre fH y fHbp v2 puede interrumpirse por mutaciones en los residuos R80, D211, E218, E248, T220 H222 (doble mutación), y G236. Numerado de acuerdo con la SEQ ID NO: 5, estos residuos son R73, D203, E210, E240, T213 H215, y G228. De estas posiciones, los polipéptidos mutados en D203, E210 o T213 H215 pueden ser preferentes porque la referencia 25 informa de que no existen alteraciones de los epítopos importantes en estos mutantes. Las sustituciones específicas estudiadas en la referencia 25 eran r73A, D203A, E210A, T213A H215A, G228I, y E240A; estas sustituciones pueden ser adecuadas para su uso de acuerdo con la invención.
La referencia 24 informa de que la interacción entre fH y fHbp v2 puede interrumpirse por mutaciones en los residuos R145, S193, F194, L195, A265, E267, K268, V272, I273, L274, E283, T286, H288, F292, T304, y E313 y E283 T304 (doble mutación). Numerado de acuerdo con la SEQ ID NO: 5, estos residuos son R73, S121, F122, L123, A192, E194, K195, V199, I200, L201, E210, T213, H215, F219, T231 y E240 y E210 T231. Cuatro de ellos se superponen con la referencia 25 (E210, T213, H215, E240). Las sustituciones específicas estudiadas en la referencia 24 alanina usado (a excepción de A265P y T304E), y estas sustituciones pueden ser adecuadas para su uso de acuerdo con la invención.
La referencia 24 informa de que ciertas sustituciones en v2 pueden aumentar la afinidad por fH, y estas deben evitarse si la intención es interrumpir la unión a fH por ejemplo E85 en la SEQ ID NO: 5 (el residuo 157 en la referencia 24).
Los residuos que interaccionan con sideróforos pueden mutarse, utilizando la guía de las referencias 16 y 34 por ejemplo, mediante el alineamiento de la SEQ ID NO: 5 en el presente documento con la SEQ ID NO: 4 de la referencia 16 para identificar los residuos que pueden interactuar con sideróforos por ejemplo, con catecolatos, hidroxamatos o carboxilatos.
Otros residuos que pueden mutarse incluyen, pero no se limitan a, S23, L24, D30, Q31, R34, D95, y/o L102 por ejemplo, utilizando las mutaciones sugeridas en la referencia 35 .
El polipéptido del primer aspecto de la invención puede comprender cualquiera de las SEQ ID NOs: 18 hasta 36. Del mismo modo, teniendo en cuenta la mutación 'AG' (es decir, truncamiento en el extremo N-terminal inicial e incluyendo la secuencia de poli-Gly nativa), el polipéptido del primer aspecto de la invención puede comprender cualquiera de las SEQ ID NOs: 18 a 36 con exclusión de los aminoácidos 1-26 de la misma. Por ejemplo, el polipéptido del primer aspecto puede comprender SEQ ID NO: 45, o puede comprender SEQ ID NO: 58.
Teniendo en cuenta la posibilidad de nuevas mutaciones puntuales (por ejemplo, para interrumpir las interacciones con sideróforos y/o fH) el polipéptido del primer aspecto puede comprender cualquiera de las SEQ ID NOs: 19, 20, 33, 34, 35, y 36, (o cualquiera de las s Eq ID NOS: 19, 20, 33, 34, 35, y 36 excluyendo los aminoácidos 1-26 de las mismas, como SEQ ID NO: 45), pero modificada hasta por 5 cambios de aminoácidos individuales (es decir, 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones, deleciones o inserciones individuales de aminoácidos), siempre que la secuencia modificada pueda, después de su administración a un animal huésped, producir anticuerpos que se unan a un polipéptido fHbp meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. Dichos cambios de aminoácidos no deben invertir las mutaciones en estas secuencias respecto a la secuencia de tipo silvestre por ejemplo, SEQ ID NO: 45 no debe mutarse en los residuos V32 o R123.
Las SEQ ID NO: 60 es otro ejemplo de mutante v2, a saber, la forma madura de mutante No. 3 para la cepa 8047. Mutaciones relacionadas con la SEQ ID NO: 17
Los polipéptidos del segundo aspecto de la invención comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un j % de identidad con la SEQ ID NO: 17 y/o comprende un fragmento de SEQ ID NO: 17. En comparación con la SEQ ID NO: 17, sin embargo, esta secuencia de aminoácidos difiere en el residuo 32 por la sustitución S32V y opcionalmente además difiere de la SEQ ID NO: 17 en el residuo L126. Estos residuos están enumerados de acuerdo con la SEQ ID NO: 17; para que coincida con la secuencia de tipo silvestre inicial (SEQ ID NO: 3), la numeración debe cambiar +31 (es decir, La Ser-32 de SEQ ID NO: 5 es la Ser-58 de SEQ ID NO: 3; y para que coincida con la secuencia de tipo silvestre madura (SEQ ID NO: 40) la numeración debe cambiar 12.
El residuo especificado puede eliminarse, pero preferentemente se sustituye por un aminoácido diferente. Cuando se hace una sustitución, el aminoácido de sustitución en algunos casos puede ser un simple aminoácido como la glicina o la alanina. En otros casos, el aminoácido de sustitución es una sustitución conservadora, por ejemplo, que se realiza dentro de los cuatro grupos siguientes: (1) ácido, es decir, aspartato, glutamato; (2), básico, es decir, lisina, arginina, histidina; (3) no polar, es decir, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polar sin carga, es decir, glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. En otros modos de realización, la sustitución no es conservadora. En algunos casos la sustitución puede no utilizar alanina. Una sustitución preferida en el residuo especificado para mutaciones adicionales es L126R.
También se describe en este documento la secuencia de aminoácidos fHbp v3 mutante que incluye una sustitución en E243, esta sustitución no será con alanina si solamente está mutado E243, aunque puede ser alanina si un aminoácido adicional que aparezca enumero en (b) se sustituye, por ejemplo, si ambos residuos E243 y H242 están mutados. Idealmente, E243 no muta espontáneamente, y así, una secuencia de aminoácidos fHbp v3 mutante con una sustitución en E243 también debe incluir una sustitución en un segundo residuo por ejemplo, tanto en E243 como en H242.
También se describe en este documento la secuencia de aminoácidos fHbp v3 mutante que incluye una sustitución en F125, esta sustitución no será con alanina si está mutado solamente F125, aunque puede ser alanina si un aminoácido adicional que aparezca enumerado en (b) está sustituido, por ejemplo, si ambos residuos F125 y S154 están mutados. Idealmente, F125 no muta espontáneamente, y así, una secuencia de aminoácidos fHbp v3 mutante con una sustitución en F125 también debe incluir una sustitución en un segundo residuo. Cuando está sustituido F125 se prefiere que S154 también esté sustituido, por ejemplo, ambos están sustituidos con cisteína, para permitir la formación de un puente disulfuro.
Cuando la secuencia de aminoácidos fHbp v3 mutante incluye una sustitución en L126, esta sustitución puede ser alanina si los residuos L126 y S32 están mutados. La sustitución con arginina es preferente. Cuando está sustituido L126, S32 también está sustituido, y opcionalmente también S128 está sustituido.
También se describe en este documento la secuencia de aminoácidos fHbp v3 mutante que incluye una sustitución en V127, se prefiere que esta sustitución no sea con alanina si está mutado solamente V127, aunque puede ser alanina si un aminoácido adicional que aparezca enumerado en (b) está sustituido, por ejemplo si uno o más de los residuos 126-131 también están mutados. Si V127 muta espontáneamente, se prefiere la sustitución con isoleucina. Idealmente, sin embargo, V127 no muta espontáneamente, y así, una secuencia de aminoácidos fHbp v3 mutante con una sustitución en V127 también debe incluir una sustitución en un segundo residuo. Cuando está sustituido V127 se prefiere que uno o más de los residuos 127-131 estén sustituidos también.
También se describe en este documento la secuencia de aminoácidos fHbp v3 mutante que incluye una sustitución en L130, se prefiere que esta sustitución no sea con alanina aunque solo L130 está mutado, aunque puede ser alanina si un aminoácido adicional que aparezca enumerado en (b) está sustituido, por ejemplo si uno o más de los residuos 126-131 también están mutados. Si L130 muta espontáneamente, se prefiere la sustitución con isoleucina. Idealmente, sin embargo, L130 no muta espontáneamente, y así, una secuencia de aminoácidos fHbp v3 mutante con una sustitución en L130 también debe incluir una sustitución en un segundo residuo. Cuando está sustituido L130 se prefiere que uno o más de los residuos 127-131 estén sustituidos también.
La secuencia de aminoácidos fHbp v3 mutante incluye una sustitución en S32. Sustitución con valina. Idealmente, sin embargo, S32 no muta espontáneamente, y así, una secuencia de aminoácidos fHbp v3 mutante con una
sustitución en S32 también debe incluir una sustitución en un segundo residuo. Cuando está sustituido S32, se prefiere que (i) L126 también esté sustituido, y adicionalmente S128 puede estar sustituido.
También se describe en este documento la secuencia de aminoácidos fHbp v3 mutante que incluye una sustitución en T113, esta sustitución no será con alanina si está mutado solamente T113, aunque puede ser alanina si un aminoácido adicional que aparezca en (b) está sustituido. Si T113 muta espontáneamente, se prefiere la sustitución con serina.
También se describe en este documento la secuencia de aminoácidos mutante fHbp v3 que incluye una sustitución en I33, esta preferentemente no es con valina. También se describe en este documento una secuencia de aminoácidos mutante fHbp v3 que incluye una sustitución en T116, esta preferentemente no es con isoleucina. También se describe en este documento una secuencia de aminoácidos mutante fHbp v3 que incluye una sustitución en G129, esta preferentemente no es con serina. También se describe en este documento una secuencia de aminoácidos mutante fHbp v3 que incluye una sustitución tanto en H242 como en E243, esta preferentemente no es R242 ni Q243.
La divulgación describe secuencias de aminoácidos de fHbp v3 mutante donde se realiza más de una sustitución, estas pueden seleccionarse de los grupos 3A a 30 del siguiente modo:
3A: los residuos 242 y 243.
3B: los residuos 32 y 126.
3C: los residuos 128 y 129.
3D: los residuos 103, 128 y 129.
3E: los residuos 33 y 39.
3F: los residuos 41 y 72.
3G: los residuos 125 y 154.
3H: los residuos 103, 128, 129, 242 y 243.
3I: los residuos 32 y 128.
3J: los residuos 32, 126 y 128.
3K: los residuos 33 y 39, ambos sustituidos por Cys.
3L: residuos 41 y 72, ambos sustituidos por Cys.
3M: los residuos 125 y 154, ambos sustituidos por Cys.
3N: los residuos 126, 127, 128, 129, 130 y 131.
3O: los residuos 32, 126, 127, 128, 129, 130 y 131.
El grupo 3B proporciona las mutaciones más preferentes, y particularmente S32V y L126R (por ejemplo, que comprende la SEQ ID NO: 44). El grupo 30 es otra mutación preferente, que combina 3B, 3C y otras tres mutaciones (por ejemplo, para generar la SEQ ID NO: 61).
Los residuos aminoacídicos indicados para la mutación en una secuencia de v3 están numerados en relación con la SEQ ID NO: 17, que es de la cepa M1239. Los correspondientes residuos de aminoácidos en una fHbp v3 de cualquier otra cepa pueden identificarse fácilmente por alineamiento de secuencias, por ejemplo siendo el aminoácido que, cuando se alinean con la SEQ ID NO: 17 utilizando un algoritmo de alineamiento por pares (por ejemplo, el algoritmo de alineamiento global de Needleman-Wunsch, como se detalla a continuación), se alinea con el aminoácido mencionado en el presente documento. A menudo, el aminoácido será el mismo que se observa en SEQ ID NO: 17 (por ejemplo, residuos 32 será serina), pero el alineamiento identificará fácilmente si este no es el caso.
Además de la(s) mutación(es) indicada(s) anteriormente, que tiene(n) como objetivo aumentar la estabilidad, un polipéptido de la invención puede incluir una o más mutaciones por ejemplo para interrumpir la interacción del polipéptido con sideróforos o, más preferentemente, para interrumpir la capacidad del polipéptido para unirse a fH. La referencia 24 los informa de que la interacción entre HF y fHbp v3 puede interrumpirse por mutaciones en los residuos Q107, I147, L156, A157, L195, V196, V272, E283, T286, T304, V311, E313 y E283 T304 (doble mutación). Numerado de acuerdo con la SEQ ID NO: 17, estos residuos son: P35, I78, L87, A88, L126, V127, V202, E213, T216, T234, V241, E243 y E213 T234. Las sustituciones específicas estudiadas en la referencia 24 usaron
alanina (a excepción de A157E y T231E), y estas sustituciones pueden ser adecuadas para su uso de acuerdo con la invención. Los residuos T216 y E243 también se presentan en la referencia 23 . La referencia 36 informa de que la interacción entre fH y fHbp v3 puede interrumpirse por mutaciones en los residuos H288 y G318 (H218 y G248 numerados de acuerdo con la SEQ ID NO: 17), y estas sustituciones pueden ser adecuadas para su uso de acuerdo con la invención, por ejemplo H218R, G248D.
La referencia 24 informa de que ciertas sustituciones en v3 pueden aumentar la afinidad por fH, y estas deben evitarse si la intención es interrumpir la unión a fH por ejemplo P44 en la SEQ ID NO: 17 (el residuo 106 en la referencia 24).
Los residuos que interaccionan con sideróforos pueden mutarse, utilizando la guía de las referencias 16 y 34 por ejemplo, mediante el alineamiento de la SEQ ID NO: 5 en el presente documento con la SEQ ID NO: 4 de la referencia 16 para identificar los residuos que pueden interactuar con sideróforos por ejemplo, con catecolatos, hidroxamatos o carboxilatos.
El polipéptido v3 modificado de la invención puede comprender la SEQ ID NO: 44. Teniendo en cuenta la posibilidad de nuevas mutaciones puntuales (por ejemplo, para interrumpir las interacciones con sideróforos y/o fH) el polipéptido del primer modo de realización puede comprender cualquiera la SEQ ID NO: 44 pero modificado con hasta 5 cambios de aminoácidos individuales (es decir, 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones, deleciones o inserciones individuales de aminoácidos), siempre que la secuencia modificada pueda, después de su administración a un animal huésped, producir anticuerpos que se unan a un polipéptido fHbp meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. Dichos cambios de aminoácidos no deben invertir las mutaciones en estas secuencias respecto a la secuencia de tipo silvestre por ejemplo, SEQ ID NO: 44 no debe mutarse en el residuo V32 ni R126.
Polipéptidos
Los polipéptidos de la invención se pueden preparar por diversos medios, por ejemplo por síntesis química (al menos en parte), por digestión de polipéptidos más largos utilizando proteasas, por la traducción de ARN, por purificación a partir de cultivo celular (por ejemplo, de expresión recombinante o de cultivos de N. meningitidis), etc. La expresión heteróloga en un E. coli es una ruta de expresión preferente.
Los polipéptidos de la invención son idealmente de al menos 100 aminoácidos de longitud, por ejemplo 150 aa, 175 aa, 200 aa, 225 aa, o más. Incluyen una secuencia de aminoácidos de los mutantes fHbp v2 y/o la v3, y la secuencia de aminoácidos mutante fHbp v2 o v3 de manera similar deben ser de al menos 100 aminoácidos de longitud por ejemplo, 150 aa, 175 aa, 200 aa, 225 aa, o más.
El fHbp es de manera natural una lipoproteína de N. meningitidis. También se ha descubierto que se lipida cuando se expresa en E. coli con su secuencia líder nativa o con secuencias líderes heterólogas. Los polipéptidos de la invención pueden tener un residuo de cisteína en el extremo N-terminal, que puede ser lipidado por ejemplo, que comprende un grupo palmitoilo, por lo general formando tripalmitoil-S-gliceril-cisteína. En otros casos, los polipéptidos no se lipidan.
Los polipéptidos se preparan preferentemente en forma sustancialmente pura o sustancialmente aislada (es decir, sustancialmente libre de otros polipéptidos de células de Neisseria o de la célula huésped). En general, los polipéptidos se proporcionan en un entorno no natural, por ejemplo, están separados de su entorno natural. En ciertos casos, el polipéptido está presente en una composición que está enriquecida con el polipéptido en comparación con un material de partida. De este modo se puede proporcionar el polipéptido purificado, en el que purificado significa que el polipéptido está presente en una composición que está sustancialmente libre de otros polipéptidos expresados, con lo que sustancialmente libre se quiere decir que más del 50 % (por ejemplo, > 75 %, > 80 %, > 90 %, > 95 %, o > 99 %) del polipéptido total de la composición es un polipéptido de la invención.
Los polipéptidos pueden adoptar diversas formas (por ejemplo, nativa, fusiones, glicosilados, no glicosilados, lipidados, puentes disulfuro, etc.).
Las SEQ ID NOs 4, 5, 17 y 40 no incluyen una metionina en el extremo N-terminal. Si un polipéptido de la invención se produce por la traducción en un huésped biológico entonces se requiere un codón de inicio, que proporcione una metionina en el extremo N-terminal en la mayoría de los huéspedes. Por lo tanto un polipéptido de la invención, al menos en una etapa inicial, incluye un residuo de metionina en el extremo N-terminal de dicha secuencia SEQ ID NO.
La escisión de las secuencias iniciales significa que la secuencia de aminoácidos fHbp mutante v2 o v3 pueden proporcionar por sí mismas el extremo N-terminal del polipéptido. En otros casos, sin embargo, un polipéptido de la invención puede incluir una secuencia N-terminal hacia el extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos fHbp mutante v2 o v3. En algunos casos el polipéptido puede tener una única metionina en el extremo N-terminal seguida inmediatamente por la secuencia de aminoácidos fHbp mutante v2 o v3; en otros casos se puede usar una secuencia en el extremo N-terminal' más larga. Dicha secuencia hacia el extremo N-terminal puede ser corta (por ejemplo, 40 aminoácidos o menos, es decir, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21,
20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos incluyen secuencias líder para dirigir el tráfico de proteínas, o secuencias peptídicas cortas que faciliten la clonación o purificación (por ejemplo, una etiqueta de histidina es decir, Hisn en la que n = 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más). Otras secuencias de aminoácidos N -terminal adecuadas serán evidentes para los expertos en la técnica, por ejemplo, las secuencias hacia el extremo N-terminal nativas presentes en la Se Q ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3.
Un polipéptido de la invención también puede incluir aminoácidos en el extremo C-terminal del final de la secuencia de aminoácidos fHbp mutante v2 o v3. Dichas extensiones del extremo C-terminal pueden ser cortas (por ejemplo, 40 aminoácidos o menos, es decir, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos incluyen secuencias para dirigir el tráfico de proteínas, secuencias peptídicas cortas que facilitan la clonación o purificación (por ejemplo, que comprenden una etiqueta de histidina, es decir, Hisn en la que n = 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más), o secuencias que potencian la estabilidad del polipéptido. Otras secuencias de aminoácidos del extremo C-terminal serán evidentes para los expertos en la técnica.
En algunos casos la invención puede excluir polipéptidos que incluyan una etiqueta de histidina (consulte las referencias 24 y 25 ), y, particularmente, una etiqueta de hexahistidina en el extremo C-terminal.
El término "polipéptido" se refiere a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados, y puede estar interrumpido por elementos no aminoacídicos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que ha sido modificado naturalmente o mediante alguna intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, como la conjugación con un componente de etiquetado. También se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Los polipéptidos pueden aparecer como cadenas sencillas o como cadenas asociadas.
Los polipéptidos de la invención pueden estar unidos o inmovilizados a un soporte sólido.
Los polipéptidos de la invención pueden comprender un marcador detectable, por ejemplo, un marcador radiactivo, un marcador fluorescente o un marcador de biotina. Esto es particularmente útil en técnicas de inmunoensayo. Como se describe en la referencia 164, fHbp puede dividirse en tres dominios, denominados A, B y C. En la SEQ ID NO: 1, los tres dominios son (A) 1 a 119, (B) 120 a 183 y (C) 184 a 274:
MNRTAFCCL£LTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLA AQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYF:QSHSALTAFQTEQIQDS EHSG kmvakrQf r iGd ia Ge h tS fd k lp eGGRAT yrGt a f GS dd AGGKLTVTIDF'AAKQGNGKlEHLX EPELNVDLAAADIKPDGKRHAVIEGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGEALVETVNGIREIGLAA KQ
La forma madura del dominio "A", desde la Cys -20 de su extremo N -terminal hasta la Lys -119, se llama "Amaduro". Se conocen múltiples secuencias fHbp y estas pueden alienarse fácilmente utilizando métodos estándar. Mediante dichos alineamientos, los expertos en la técnica pueden identificar (a) dominios 'A' (y 'Amaduro")," B "y" C "en cualquier secuencia fHbp dada, por la comparación con las coordenadas de la secuencia MC58, y (b) residuos individuales en múltiples secuencias fHbp por ejemplo, para la identificación de sustituciones. Sin embargo, para que sirva de referencia, los dominios se definen a continuación:
-Dominio 'A' en una secuencia fHbp dada es el fragmento de esa secuencia que, cuando se alinea con la SEQ ID NO: 1 utilizando un algoritmo de alineamiento por pares, se inicia con el aminoácido alineado con Met-1 de la SEQ ID NO: 1) y termina con el aminoácido alineado con Lys-119 de la SEQ ID NO: 1.
- Dominio 'Amaduro' en una secuencia fHbp dada es el fragmento de esa secuencia que, cuando se alinea con la SEQ ID NO: 1 utilizando un algoritmo de alineamiento por pares, se inicia con el aminoácido alineado con Cys-20 de SEQ ID NO: 1) y termina con el aminoácido alineado con Lys-119 de la SEQ ID NO: 1.
-Dominio 'B' en una secuencia fHbp dada es el fragmento de esa secuencia que, cuando se alinean con la SEQ ID NO: 1 utilizando un algoritmo de alineamiento por pares, se inicia con el aminoácido alineado con Gln-120 de la SEQ ID NO: 1) y termina con el aminoácido alineado con Gly-183 de la SEQ ID NO: 1.
-Dominio 'C' en una secuencia fHbp dada es el fragmento de esa secuencia que, cuando se alinean con la SEQ ID NO: 1 utilizando un algoritmo de alineamiento por pares, se inicia con el aminoácido alineado con Lys-184 de SEQ ID NO: 1) y termina con el aminoácido alineado con Gln-274 de la SEQ ID NO: 1.
El algoritmo de alineamiento de pares preferente para la definición de los dominios es el algoritmo de alineamiento global Needleman-Wunsch [158], utilizando parámetros por defecto (por ejemplo, con una penalización por introducir espacios = 10,0, y con la penalización por extensión de espacios = 0,5; utilizando la matriz de puntuación EBLOSUM62). Este algoritmo está convenientemente incluido en la herramienta de aguja (needle) del paquete EMBOSS [159].
En algunos casos, una secuencia de aminoácidos fHbp mutante v2 o v3 de la invención se trunca para eliminar su dominio A. En general, sin embargo, se prefiere que la secuencia de aminoácidos fHbp mutante v2 o v3 deben incluir tanto un N-terminal p-barril y una p-barril C-terminal.
En algunos casos, un polipéptido puede comprender una secuencia de aminoácidos como se describe anteriormente, excepto que hasta 10 aminoácidos (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) en el extremo N-terminal y/o hasta 10 aminoácidos (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) en el extremo C -terminal se pueden eliminar.
Los polipéptidos de la invención típicamente consisten en una secuencia de aminoácidos artificial, es decir, una secuencia que no está presente en ningún meningococos de manera natural.
La afinidad por el factor H se puede evaluar cuantitativamente usando resonancia de plasmones superficiales, por ejemplo como se describe en las referencias 18 y 21 - 24 con fH humano inmovilizado. Las mutaciones que proporcionan una reducción de la afinidad (es decir, un aumento de la constante de disociación, Kd) de al menos 10 veces, e idealmente al menos 100 veces, son preferentes (cuando se mide en las mismas condiciones experimentales en relación con el mismo polipéptido pero sin la mutación).
Ácidos nucleicos
La invención proporciona ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de la invención como se define anteriormente.
Los ácidos nucleicos de la invención se pueden preparar de muchas maneras, por ejemplo por síntesis química (por ejemplo, la síntesis fosforamidita de ADN) en su totalidad o en parte, mediante digestión de ácidos nucleicos más largos usando nucleasas (por ejemplo, enzimas de restricción), por unión a ácidos nucleicos o nucleótidos más cortos (por ejemplo, utilizando ligasas o polimerasas), a partir de librerías genómicas o de ADNc, etc.
Los ácidos nucleicos de la invención pueden adoptar diversas formas, por ejemplo, de cadena sencilla, de cadena doble, vectores, cebadores, sondas marcadas y sin marcar, etc.
Los ácidos nucleicos de la invención están preferentemente en forma aislada o sustancialmente aislada.
El término "ácido nucleico" incluye ADN y ARN, y también sus análogos, como los que contienen estructuras modificadas, y también ácidos nucleicos peptídicos (PNA), etc.
El ácido nucleico de acuerdo con la invención se puede marcar por ejemplo, con un marcador radiactivo o fluorescente.
La invención también proporciona vectores (como plásmidos) que comprenden las secuencias de nucleótidos de la invención (por ejemplo, vectores de clonación o expresión, como los que son adecuados para la inmunización con ácido nucleico) y células huésped transformadas con dichos vectores.
Respuestas bactericidas
Los polipéptidos preferentes de la invención pueden producir respuestas bactericidas de los anticuerpos contra los meningococos. Las respuestas bactericidas de los anticuerpos se miden convenientemente en ratones y son un indicador del nivel de eficacia de la vacuna (por ejemplo, véase la anotación 14 de la referencia.37 ; también la referencia 38).
Los polipéptidos del primer aspecto de la invención pueden producir preferentemente una respuesta bactericida de anticuerpos contra una cepa de N. meningitidis que expresa una secuencia fHbp v2, por ejemplo, una o más de las cepas 961-5945, 2996, 96217, 312294, 11327, a22, gb013 (= M01-240013), e32, M1090, m4287, 860,800, 599, 95N477, 90 a 18311, c11, m986, m2671, 1000, m1096, m3279, bz232, dk353, m3697, ngh38, y/o L93 / 4286. Las respuestas bactericidas pueden evaluarse por ejemplo contra la cepa M2091 var2 (ATCC 13091).
Los polipéptidos preferentes del primer aspecto de la invención pueden producir anticuerpos en un ratón que son bactericidas contra la cepa M2091 en un ensayo bactericida en suero.
Los polipéptidos del segundo aspecto de la invención pueden producir preferentemente una respuesta de anticuerpos que es bactericida contra una cepa de N. meningitidis que expresa una secuencia fHbp v3, por ejemplo, una o más de las cepas M1239, 16889, gb355 (= M01-240355), m3369, m3813, ngp165. Las respuestas bactericidas pueden evaluarse por ejemplo contra la cepa var3 M01-240355, que es una cepa de referencia de
Neisseria MLST (ID 19265 en la referencia 39) que ha sido secuenciado completamente (véase EMBL ID CP002422 [40])
Los polipéptidos preferentes del segundo aspecto de la invención pueden producir anticuerpos en un ratón que son bactericidas contra la cepa M01-240355 en un ensayo bactericida en suero.
Por ejemplo, una composición inmunogénica que comprende estos polipéptidos puede proporcionar un título bactericida en suero de > 1:4 utilizando el ensayo de Goldschneider con complemento humano [41 - 43], y/o proporcionar un título bactericida en suero de >1:128 usando complemento de cría de conejo.
Inmunización
Los polipéptidos de la invención se pueden usar como principio activo de composiciones inmunogénicas, y así la invención proporciona una composición inmunogénica (por ejemplo, una vacuna) que comprende un polipéptido de la invención.
La divulgación también proporciona un procedimiento para aumentar una respuesta de anticuerpos en un mamífero, que comprende la administración de una composición inmunogénica de la invención al mamífero. La respuesta de anticuerpos es preferentemente una respuesta protectora y/o bactericida del anticuerpo. La invención proporciona composiciones inmunogénicas que comprenden polipéptidos de la invención para su uso en un método para generar una respuesta de anticuerpos en un mamífero.
La divulgación también proporciona un procedimiento para proteger a un mamífero contra una infección de Neisseria (por ejemplo meningocócica), que comprende la administración al mamífero de una composición inmunogénica de la invención.
La divulgación también proporciona polipéptidos de la invención para su uso como medicamentos (por ejemplo, como composiciones inmunogénicas o como vacunas) o como reactivos de diagnóstico. La divulgación también proporciona el uso de un ácido nucleico o polipéptido de la invención en la fabricación de un medicamento para la prevención de una infección por Neisseria (por ejemplo meningocócica) en un mamífero.
El mamífero puede ser preferentemente un ser humano. El humano puede ser un adulto o, preferentemente, un niño. Cuando la vacuna es para uso profiláctico, el ser humano es preferentemente un niño (por ejemplo, un niño pequeño o bebé); cuando la vacuna es para uso terapéutico, el ser humano es preferentemente un adulto. Una vacuna destinada a niños también se puede administrar a adultos por ejemplo, para evaluar la seguridad, dosificación, inmunogenicidad, etc.
Los usos y procedimientos pueden ser particularmente útiles para la prevención/ tratamiento de enfermedades incluyendo, pero sin limitarse a, meningitis (especialmente bacteriana, como meningocócica, meningitis) y bacteriemia. Por ejemplo, son adecuados para la inmunización activa de las personas contra la enfermedad meningocócica invasiva causada por N. meningitidis (por ejemplo, en el serogrupo B).
La eficacia del tratamiento terapéutico se puede probar mediante el control de la infección de Neisseria después de su administración de la composición de la invención. La eficacia del tratamiento profiláctico puede probarse mediante el control de las respuestas inmunitarias contra fHbp después de su administración de la composición. La inmunogenicidad de las composiciones de la invención se puede determinar mediante la administración a los sujetos de prueba (por ejemplo, niños de 12-16 meses de edad, o modelos animales) y luego la determinación de los parámetros estándar, incluyendo anticuerpos bactericidas en suero (SBA) y títulos de pruebas ELISA (GMT). Estas respuestas inmunitarias se determinarán en general alrededor de 4 semanas después de su administración de la composición, y se compararán con los valores determinados antes de la administración de la composición. Es preferente un aumento del ABF de al menos 4 - veces u 8 - veces. Si se administra más de una dosis de la composición, puede hacerse más de una determinación posterior a la administración.
Las composiciones preferentes de la invención pueden conferir un título de anticuerpos en un paciente que sea superior al criterio de seroprotección para cada componente antigénico para un porcentaje aceptable de sujetos humanos. Se conocen muy bien los antígenos con un título de anticuerpos asociado por encima del cual se considera un huésped va a sufrir una seroconversión contra el antígeno, y dichos títulos son publicados por organizaciones como la OMS. Preferentemente más del 80% de una muestra estadísticamente significativa de sujetos se seroconvirtieron, más preferentemente más del 90%, aún más preferentemente más del 93% y más preferentemente del 96 al 100%.
Las composiciones de la invención en general pueden administrarse directamente a un paciente. La administración directa puede llevarse a cabo mediante inyección parenteral (por ejemplo, subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular o en el espacio intersticial de un tejido), o por vía rectal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intranasal, ocular, aural, pulmonar u otra administración vía mucosa. Es preferente la administración intramuscular en el muslo o el brazo superior. La inyección puede ser mediante una aguja (por ejemplo, una aguja hipodérmica), pero la inyección sin aguja puede utilizarse como alternativa. Una dosis típica intramuscular es de aproximadamente 0,5 ml.
La invención puede utilizarse para provocar inmunidad sistémica y/o mucosa.
El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa de dosis múltiple. Las dosis múltiples pueden utilizarse en un programa de inmunización primaria y/o en un calendario de inmunización de refuerzo. Un programa de dosis primaria puede ser seguido por un programa de dosis de refuerzo. El tiempo adecuado entre las dosis de estimulación (por ejemplo, entre 4 - 16 semanas), y entre la dosis de estimulación y la de refuerzo, se pueden determinar de forma rutinaria.
La composición inmunógena de la invención en general puede incluir un vehículo farmacéuticamente aceptable, que puede ser cualquier principio que por sí mismo no induzca la producción de anticuerpos perjudiciales para la persona que recibe la composición, y que se puede administrar sin demasiada toxicidad. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden incluir líquidos como agua, solución salina, glicerol y etanol. Las sustancias auxiliares, como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes del pH, y similares, también pueden estar presentes en dichos vehículos. Existe una discusión minuciosa sobre los vehículos adecuados en la referencia 44.
Las infecciones por Neisseria afectan a diversas áreas del cuerpo y por lo tanto las composiciones de la invención pueden prepararse de diversas formas. Por ejemplo, las composiciones pueden prepararse como inyectables, ya sea como soluciones líquidas o suspensiones. También pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución, o suspensión, vehículos líquidos previos a la inyección. La composición puede prepararse para administración tópica, por ejemplo como un ungüento, crema o polvo. La composición se prepara para administración oral, por ejemplo como un comprimido o cápsula, o como un jarabe (opcionalmente aromatizado). La composición puede prepararse para la administración pulmonar, por ejemplo, como un inhalador, usando un polvo fino o un pulverizador. La composición puede prepararse como un supositorio o pesario. La composición puede prepararse para administración nasal, aural u ocular, por ejemplo, en forma de gotas. Las composiciones más preferentes pueden ser las adecuadas para inyección parenteral.
La composición es preferentemente estéril. Es preferentemente libre de pirógenos. Se tampona preferentemente, por ejemplo, entre pH 6 y pH 8, en general alrededor de pH 7. Cuando una composición comprende una sal de hidróxido de aluminio, se prefiere utilizar un tampón de histidina [45]. Las composiciones de la invención pueden ser isotónicas con respecto a los seres humanos.
Las composiciones inmunógenas comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de inmunógeno, así como cualquier otro de los componentes especificados, según sea necesario. Por 'cantidad inmunológicamente eficaz', se quiere decir que la administración de esa cantidad a un individuo, ya sea en una dosis única o como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento o la prevención. El término "prevención" significa que la progresión de la enfermedad se reduce y/o elimina, o que el inicio de la enfermedad se elimina. Por ejemplo, el sistema inmunitario de un sujeto puede estimularse (por ejemplo por vacunación) para que desencadene una respuesta inmunitaria y repeler la infección de manera que se elimine la aparición de la enfermedad. De este modo, un sujeto vacunado puede infectarse pero es más capaz de repeler la infección que un sujeto de control. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y condición física del individuo a tratar, edad, grupo taxonómico de los individuos a tratar (por ejemplo, humano no primate, primate, etc.), la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación del médico tratante de la situación médica, y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad recaiga en un intervalo relativamente amplio que puede determinarse mediante ensayos de rutina. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa de dosis múltiple (por ejemplo, incluyendo dosis de refuerzo). La composición se puede administrar junto con otros agentes inmunorreguladores.
Los adyuvantes que se pueden usar en composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, sales de metales insolubles, emulsiones de aceite en agua (por ejemplo MF59 o AS03, contiendo ambos escualeno), saponinas, no derivados tóxicas de LPS (como monofosforil lípido A o MPL 3-O-desacilado), oligonucleótidos inmunoestimulantes, toxinas bacterianas destoxificadas de ribosilación de ADP, micropartículas, liposomas, imidazoquinolones, o mezclas de los mismos. Otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes se describen en el capítulo 7 de la referencia 46.
El uso de un adyuvante como hidróxido de aluminio y/o fosfato de aluminio es particularmente preferente, y los polipéptidos en general se adsorben en estas sales. Estas sales incluyen oxihidróxidos e hidroxifosfatos (por ejemplo, véanse los capítulos 8 y 9 de la referencia 46). Las sales pueden adoptar cualquier forma adecuada (por ejemplo, gel, cristalina, amorfa, etc.).
Otros componentes antigénicos
Las composiciones de la invención incluyen secuencias mutantes fHbp v2 y/o v3. Puede ser es útil si la composición no incluye mezclas complejas o no definidas de antígenos, por ejemplo, se puede preferir no incluir vesículas de la membrana externa en la composición. Los polipéptidos de la invención se expresan preferentemente de forma recombinante en un huésped heterólogo y luego se purifican.
Además de incluir un polipéptido fHbp, una composición de la invención también puede incluir uno o más inmunógenos de Neisseria, como una vacuna dirigida contra más de un inmunógeno por bacteria que disminuya la posibilidad de seleccionar mutantes de escape. Por lo tanto, una composición puede incluir un segundo polipéptido que, cuando se administra a un mamífero, provoca una respuesta de anticuerpos que es bactericida contra el meningococo. El segundo polipéptido puede ser un fHbp meningocócico, pero a menudo puede no ser un fHbp por ejemplo, puede ser una secuencia NHBa , una secuencia NadA, etc.
Cualquier inmunógeno adicional de Neisseria puede estar presente como un polipéptido independiente para el mutante fHbp v2 o v3 de la invención o puede estar presente como un polipéptido de fusión con el fHbp modificado. Por ejemplo, se conoce la fusión del polipéptido meningocócico 936 con polipéptidos y fHbp [55, 56]. Las proteínas de fusión que comprenden las SEQ ID NO:22; 44 y/o SEQ ID NO: 45 pueden ser particularmente preferentes, opcionalmente en la que las SEQ ID NO: 44 y/o 45 son modificados por hasta 5 cambios de un solo aminoácido (es decir, 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones individuales de aminoácidos, deleciones y/o inserciones) como se describe en el presente documento.
Una composición de la invención puede incluir un antígeno NHBA. El antígeno NHBA fue incluido en la secuencia del genoma publicada para la cepa meningocócica MC58 del serogrupo B [47] como el gen NMB2132 (número de acceso GenBank GI: 7227388; SEQ ID NO: 6 en el presente documento). Las secuencias del antígeno NHBA de muchas cepas ya han sido publicadas desde entonces. Por ejemplo, formas alélicas de NHBA se pueden ver en las figuras 5 y 15 de la referencia 48, y en el ejemplo 13 y la figura 21 de la referencia 1 (SEQ ID de 3179 a 3184 de las mismas). También se han descrito varios fragmentos inmunogénicos del antígeno NHBA. Los 287 antígenos preferentes para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) con un 50% o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70%, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 6; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 6, en la que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 6. Los antígenos NHBA más útiles de la invención pueden generar anticuerpos que, después de su administración a un sujeto, se pueden unir a un polipéptido meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6. De forma ventajosa los antígenos NHBA para su uso con la invención pueden generar anticuerpos anti-meningocócicos bactericidas después de su administración a un sujeto.
Una composición de la invención puede incluir un antígeno NadA. El antígeno NadA se incluyó en la secuencia del genoma publicada para la cepa MC58 meningocócica del serogrupo B [47] como gen NMB1994 (número de acceso GenBank GI: 7227256; SEQ ID NO: 7 en el presente documento). Desde entonces, se han publicado las secuencias del antígeno NadA de muchas cepas, y la actividad de la proteína como una adhesina de Neisseria, está ampliamente documentada. También se han descrito varios fragmentos inmunogénicos de NadA. Los antígenos NadA preferentes para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) con un 50% o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70%, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 7; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 7, en la que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 7. Los antígenos NadA más útiles de la invención pueden generar anticuerpos que, después de su administración a un sujeto, se pueden unir a un polipéptido meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7. De forma ventajosa los antígenos NadA para su uso con la invención pueden generar anticuerpos anti-meningocócicos bactericidas después de su administración a un sujeto. SEQ ID NO. 15 es uno de dichos fragmentos.
Una composición de la invención puede incluir un antígeno NspA. El antígeno NspA se incluyó en la secuencia del genoma publicada para la cepa meningocócica MC58 del serogrupo B [47] como gen NMB0663 (número de acceso GenBank GI: 7225888; SEQ ID NO: 8 en el presente documento). El antígeno se conoce previamente a partir de las referencias 49 y 50 . Desde entonces se han publicado las secuencias del antígeno NspA de muchas cepas d. También se han descrito varios fragmentos inmunogénicos de NspA. Los antígenos NspA preferentes para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) con un 50% o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70%, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 8; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 8, en la que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 8. Los antígenos NspA más útiles de la invención pueden generar anticuerpos que, después de su administración a un sujeto, se pueden unir a un polipéptido meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8. De forma ventajosa, los antígenos NspA para su uso con la invención puede generar anticuerpos anti-meningocócicos bactericidas después de su administración a un sujeto.
Las composiciones de la invención pueden incluir un antígeno HmbR meningocócico. La secuencia de HmbR de longitud completa se incluyó en la secuencia del genoma publicado para la cepa MC58 del meningococo del serogrupo B [] como gen NMB1668 (SEQ ID NO: 9 en el presente documento). La divulgación puede utilizar un polipéptido que comprende una secuencia de HmbR de longitud completa, pero a menudo utilizará un polipéptido que comprende una secuencia de HmbR parcial. Por lo tanto, en algunos modos de realización una secuencia
HmbR utilizada de acuerdo con la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un i % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9, en la que el valor de i es 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 o más. En otros modos de realización una secuencia HmbR utilizada según la invención puede comprender un fragmento de al menos j aminoácidos consecutivo de la SEQ ID NO: 9, en la que el valor de j es 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más. En otros modos de realización una secuencia HmbR utilizada de acuerdo con la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos (i) que tiene al menos un i % de identidad con la secuencia de SEQ ID NO: 9 y/o (ii) que comprende un fragmento de al menos j aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 9. Los fragmentos preferentes de j aminoácidos comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 9. Dichos epítopos en general comprenden aminoácidos que se encuentran en la superficie de HmbR. Los epítopos útiles incluyen aquellos con aminoácidos implicados en la unión de HmbR a hemoglobina, de este modo los anticuerpos que se unen a estos epítopos pueden bloquear la capacidad de una bacteria para unirse a la hemoglobina del huésped. La topología de HmbR, y sus residuos funcionales críticos, se investigaron en la referencia 51 . Los antígenos HmbR más útiles de la invención pueden generar anticuerpos que, después de su administración a un sujeto, se pueden unir a un polipéptido meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9. De forma ventajosa, los antígenos HmbR para su uso con la invención pueden generar anticuerpos anti-meningocócicos bactericidas después de su administración a un sujeto.
Una composición de la invención puede incluir un antígeno NhhA. El antígeno NhhA fue incluido en la secuencia del genoma publicada para la cepa meningocócica MC58 del serogrupo B [47] como gen NMB0992 (número de acceso GenBank GI: 7226232; SEQ ID NO: 10 en el presente documento). Las secuencias de antígeno NhhA de muchas cepas se han publicado como por ejemplo, en las referencias 48 y 52, se ha descrito diversos fragmentos inmunogénicos de NhhA. También se conoce como Hsf. Los antígenos NhhA preferentes para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) con un 50% o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70%, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 10; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 10, en la que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 10. Los antígenos NhhA más útiles de la invención pueden generar anticuerpos que, después de su administración a un sujeto, se pueden unir a un polipéptido meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 10. De forma ventajosa los antígenos NhhA para su uso con la invención pueden generar anticuerpos anti-meningocócicos bactericidas después de su administración a un sujeto.
Una composición de la invención puede incluir un antígeno App. El antígeno App fue incluido en la secuencia del genoma publicada para la cepa meningocócica MC58 del serogrupo B [47] como gen NMB1985 (número de acceso GenBank GI: 7227246; SEQ ID NO: 11 en el presente documento). Desde entonces se han publicado las secuencias del antígeno App de muchas cepas. También se han descrito varios fragmentos inmunogénicos de App. Los antígenos App preferentes para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) con un 50% o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70%, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 11; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ iD NO: 11, en la que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 11. Los antígenos App más útiles de la invención pueden generar anticuerpos que, después de su administración a un sujeto, se pueden unir a un polipéptido meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 11. De forma ventajosa, los antígenos App para su uso con la invención pueden generar anticuerpos anti-meningocócicos bactericidas después de su administración a un sujeto.
Una composición de la invención puede incluir un antígeno Omp85. El antígeno Omp85 estaba incluido en la secuencia del genoma publicada para la cepa meningocócica MC58 del serogrupo B [47] como gen NMB0182 (número de acceso GenBank GI: 7225401; s Eq ID NO: 12 en el presente documento). Las secuencias de antígeno Omp85 de muchas cepas se han publicado desde entonces. Para más información sobre Omp85 consulte las referencias 53 y 54 . También se han descrito varios fragmentos inmunogénicos de Omp85. Los antígenos Omp85 preferentes para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) con un 50% o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70%, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 12; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 12, en la que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 12. Los antígenos OMP85 más útiles de la invención pueden generar anticuerpos que, después de su administración a un sujeto, se pueden unir a un polipéptido meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 12. De forma ventajosa Omp85 para uso con la invención pueden generar anticuerpos anti-meningocócicos bactericidas después de su administración a un sujeto.
Una composición de la invención puede incluir un antígeno 936. El antígeno 936 se incluyó en la secuencia del genoma publicada para la cepa meningocócica MC58 del serogrupo B [47] como NMB2091 gen (SEQ ID NO: 13 en el presente documento). Los 936 antígenos preferentes para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) con un 50% o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70%, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 13; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 13, en la que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8,
10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 13. Los antígenos 936 más útiles de la invención pueden generar anticuerpos que, después de su administración a un sujeto, se pueden unir a un polipéptido meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13. El antígeno 936 es un buen coadyuvante de la fusión de fHbp (por ejemplo, véanse las referencias 55 y 56 ).
Una composición puede comprender: un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 14; un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 15; y un polipéptido de la invención que comprende una secuencia de aminoácidos mutante fHbp v2 y SEQ ID NO: 13 (consulte las referencias 55 y 56).
Una composición puede comprender: un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 14; un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 15; y un polipéptido de la invención que comprende una secuencia de aminoácidos mutante fHbp v3 y SEQ ID NO: 13 (consulte las referencias 55 y 56).
En algunos casos, un polipéptido de la invención se puede combinar adicionalmente con una secuencia fHbp meningocócica. Particularmente, un polipéptido v2 se puede combinar con un polipéptido v1 y/o v3 para aumentar el espectro de la cobertura de la cepa [162]. Por lo tanto, una composición puede comprender: (I) un polipéptido de la invención que comprende una secuencia de aminoácidos mutante fHbp v2; y (ii) un polipéptido fHbp v1 y/o un polipéptido fHbp v3. En otros modos de realización, un polipéptido de la invención puede comprender (i) una secuencia de aminoácidos mutante fHbp v2 y (ii) una secuencia de aminoácidos fHbp v1 y/o una secuencia de aminoácidos fHbp v3. Por lo tanto las secuencias v1 y/o v3 se pueden combinar con la secuencia mutante v2 como entidades independientes en una composición, o en un polipéptido de fusión.
Del mismo modo, un polipéptido v3 se puede combinar con un v1 y/o un polipéptido v2 para aumentar el espectro de la cobertura de la cepa [162]. Por lo tanto, una composición puede comprender: (I) un polipéptido de la invención que comprende una secuencia de aminoácidos mutante fHbp v3; y (ii) un polipéptido fHbp v1 y/o un polipéptido fHbp v2. En otros modos de realización, un polipéptido de la invención puede comprender (i) una secuencia de aminoácidos mutante fHbp v3 y (ii) una secuencia de aminoácidos fHbp v1 y/o una secuencia de aminoácidos fHbp v2. Por lo tanto las secuencias v1 y/o v2 se pueden combinar con la secuencia mutante v3 como entidades independientes en una composición, o en un polipéptido de fusión.
Además, los polipéptidos mutantes v2 y v3 se pueden combinar entre sí para aumentar la cobertura de la cepa. Por lo tanto, una composición puede comprender: (I) un polipéptido de la invención que comprende una secuencia de aminoácidos mutante fHbp v2; (ii) un polipéptido de la invención que comprende una secuencia de aminoácidos fHbp v3 mutante; y (iii) un polipéptido fHbp v1. Alternativamente, un polipéptido de la invención puede comprender (i) una secuencia de aminoácidos mutante fHbp v2 (ii) una secuencia de aminoácidos mutante fHbp v3 y (iii) una secuencia de aminoácidos fHbp v1. Por lo tanto las secuencias mutantes v2 y v3 se pueden combinar con una secuencia v1 como entidades independientes en una composición, o en un polipéptido de fusión. La secuencia v1 puede ser una secuencia de tipo silvestre o una secuencia mutante.
Un fHbp v1 puede comprender (a) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un k % de identidad con la SEQ ID NO: 16, y/o (b) un fragmento de SEQ ID NO: 16. La información sobre 'k' y los fragmentos se han indicado anteriormente. El fragmento incluirá típicamente al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 16, y el polipéptido fHbp v1 incluirá al menos un epítopo que no está presente en la secuencia de aminoácidos v2 o v3 de la invención, de tal manera que los anticuerpos producidos por el fHbp v1 pueden reconocer cepas v1. Idealmente, el fHbp v1 puede generar anticuerpos que son bactericidas contra cepas v1 por ejemplo, contra la cepa MC58 (disponible en la ATCC como 'BAA-335'). El fHbp v1 puede incluir una mutación aminoacídica que interrumpe su capacidad para unirse a fH. Un fHbp v2 puede comprender (a) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un k % de identidad con la SEQ ID NO: 16, y/o (b) un fragmento de SEQ ID NO: 5. La información sobre 'k' y los fragmentos se han indicado anteriormente. El fragmento incluirá típicamente al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 5, y el polipéptido fHbp v2 incluirá al menos un epítopo que no está presente en la secuencia de aminoácidos v3 de la invención, de tal manera que los anticuerpos producidos por el fHbp v2 pueden reconocer cepas v2. Idealmente, el fHbp v2 puede generar anticuerpos que son bactericidas contra cepas v2 por ejemplo, contra la cepa M2091 (ATCC 13091). El fHbp v2 puede ser un polipéptido del primer modo de realización.
Un fHbp v3 puede comprender (a) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un k % de identidad con la SEQ ID NO: 16, y/o (b) un fragmento de SEQ ID NO: 17. La información sobre 'k' y los fragmentos se han indicado anteriormente. El fragmento incluirá típicamente al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 17, y el polipéptido fHbp v3 incluirá al menos un epítopo que no está presente en la secuencia de aminoácidos v2 de la invención, de tal manera que los anticuerpos producidos por el fHbp v3 pueden reconocer cepas v3. Idealmente, el fHbp v3 puede generar anticuerpos que son bactericidas contra cepas v3 por ejemplo, contra la cepa M01-240355. El fHbp v3 puede ser un polipéptido del segundo modo de realización.
Por lo tanto, por ejemplo, la divulgación puede proporcionar un polipéptido que comprende, dentro de una sola cadena de polipéptido, cada una de: (I) la secuencia de aminoácidos de un fHbp v1; (ii) una secuencia de aminoácidos mutante fHbp v2; y (iii) una secuencia de aminoácidos fHbp v3 mutante. El polipéptido puede, después
de su administración a un animal huésped, genera anticuerpos que se unen a cada uno de: un polipéptido fHbp meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 46; un polipéptido fHbp meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4; y un polipéptido fHbp meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. La secuencia de (i) puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un k % de identidad con la SEQ ID NO: 16. La secuencia de (ii) puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un k % de identidad con la SEQ ID NO: 5, pero diferente de la SEQ ID NO: 5 en le residuo S32 por la sustitución S32V y opcionalmente en uno o más de los residuos siguientes: V33, L39, L41, F69, V100, I113, F122, L123, V124, S125, G126, L127, G128, S151, H239, y/o E240. La secuencia de (iii) puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un k % de identidad con la SEQ ID NO: 17, pero diferente de la SEQ ID NO: 17 en el residuo S32 por la sustitución S32V y opcionalmente en uno o más de los residuos siguientes: I33, L39, L41, F72, V103, T116, f 125, L126, V127, S128, G129, L130, G131, S154, H242, y/o E243. Preferentemente: la secuencia de (i) comprende la SEQ ID NO: 16, opcionalmente modificadas por hasta 5 cambios de un solo aminoácido (es decir, 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones individuales de aminoácidos, deleciones y/o inserciones); la secuencia de (ii) comprende la SEQ ID NO: 45, opcionalmente modificadas por hasta 5 cambios de un solo aminoácido (es decir, 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones de un solo aminoácido, deleciones y/o inserciones), siempre y cuando dichos cambios de aminoácidos no reviertan las mutaciones en estas secuencias relación a la secuencia de tipo silvestre; y la secuencia de (iii) comprende la SEQ ID NO: 44, opcionalmente modificadas por hasta 5 cambios de un solo aminoácido, dichos cambios aminoacídicos proporcionados no revierten las mutaciones en estas secuencias en relación a la secuencia de tipo silvestre. Las secuencias de aminoácidos (i), (ii) y (iii) se pueden organizar en cualquier orden a partir de los extremos N-terminal a C-terminal en el polipéptido, pero están preferentemente en el orden de (ii), después (iii), después (i). Por ejemplo, la divulgación proporciona un polipéptido de fórmula -A-B-C- en la que: A comprende la SEQ ID NO:22; 45, opcionalmente modificada por hasta 3 sustituciones de aminoácidos individuales; B comprende la SEQ ID NO: 44, opcionalmente modificada por hasta 3 sustituciones de aminoácidos individuales; y C comprende la SEQ ID NO: 16, opcionalmente modificada por hasta 3 sustituciones de un solo aminoácido (por ejemplo, sustitución(ones) para interrumpir la unión a fH). A comprende la SEQ ID NO: 49, en la que el residuo Arg-34 está mutado a Ser como se describe para la mutación 'R41S' en la referencia 21.
Un polipéptido particularmente preferente comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47. Esta secuencia incluye, desde el extremo N-terminal al C-terminal: el mutante v2 (SEQ ID NO: 45); el mutante v3 (SEQ ID NO: 44); y el mutante v1 (SEQ ID NO: 49). Entre estas tres secuencias mutantes fHbp hay en cada caso una secuencia conectora, SEQ ID NO: 50. En un caso, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 48, que tiene una metionina en el extremo N-terminal, y a continuación la SEQ ID NO: 37 y después la SEQ ID NO: 47.
SEQ ID NO. 47 (sola o con SEQ ID NO: 48) opcionalmente puede modificarse por hasta 5 cambios de aminoácidos individuales (es decir, 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones de un solo aminoácido, deleciones y/o inserciones), siempre y cuando dichos cambios de aminoácidos no reviertan las mutaciones en las secuencias v1, v2, v3 y en relación a la secuencia de tipo silvestre, es decir, los residuos aminoacídicos V32, R123, V285, R379 y S543 de SEQ ID NO: 47 no deberían mutarse a S32, L123, S285, L379 ni R543.
La fusión mutante puede idealmente generar anticuerpos que se unen a cada uno de: un polipéptido fHbp meningocócico de tipo silvestre v1 que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 46; un polipéptido fHbp meningocócico de tipo silvestre v2 que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4; y un polipéptido fHbp meningocócico de tipo silvestre v3 que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 40.
Además de antígenos polipéptidos de Neisseria, la composición puede incluir antígenos para inmunizar contra otras enfermedades o infecciones. Por ejemplo, la composición puede incluir uno o más de los siguientes antígenos adicionales:
- un antígeno sacárido de N. meningitidis serogrupo A, C, W135 y/o Y, como el sacárido divulgado en la referencia 57 del serogrupo C (véase también referencia 58) O en la referencia 59.
- un antígeno sacárido de Streptococcus pneumoniae [por ejemplo, 60,61 , 62].
- un antígeno del virus de la hepatitis A, como virus inactivado [por ejemplo, 63,64].
- un antígeno de virus de la hepatitis B, como los antígenos de superficie y/o nucleares [por ejemplo, 64, 65].
- un antígeno de difteria, como un toxoide de la difteria [por ejemplo, capítulo 3 de la referencia 66] por ejemplo el mutante CRM197 [por ejemplo, 67].
- un antígeno del tétanos, como un toxoide del tétanos (por ejemplo, capítulo 4 de la referencia 66).
- un antígeno de Bordetella pertussis, como holotoxina pertussis (PT) y hemaglutinina filamentosa (FHA) de B. pertussis, opcionalmente también en combinación con pertactina y/o aglutinógenos 2 y 3 (por ejemplo, refs. 68 y 69 ).
- un antígeno sacárido de Haemophilus influenzae B [por ejemplo, 58].
- antígeno(s) de la polio [por ejemplo, 70, 71] como IPV.
- antígenos de sarampión, las paperas y/o rubéola (por ejemplo, los capítulos 9, 10 y 11 de la referencia 66). - antígeno(s) de la gripe (s) (porejemplo, el capítulo 19 de la referencia 66), como las proteínas hemaglutinina y/o neuraminidasa de la superficie.
- un antígeno de Moraxella catarrhalis [por ejemplo, 72].
- un antígeno proteico de Streptococcus agalactiae (estreptococo del grupo B) [por ejemplo, 73,74].
- un antígeno sacárido de Streptococcus agalactiae (estreptococo del grupo B).
- un antígeno de Streptococcus pyogenes (estreptococo del grupo A) [por ejemplo, 7475,76].
- un antígeno de Staphylococcus aureus [por ejemplo, 77].
La composición puede comprender uno o más de estos antígenos adicionales.
Los antígenos de proteínas tóxicas pueden ser desintoxicados cuando sea necesario (por ejemplo detoxificación de toxina de pertussis por medios genéticos y/o químicos [69]).
Cuando un antígeno de difteria está incluido en la composición se prefiere incluir también el antígeno del tétanos y antígenos de pertussis. De manera similar, cuando se incluye un antígeno del tétanos se prefiere incluir también antígenos de difteria y de pertussis. De manera similar, cuando se incluye un antígeno de pertussis se prefiere también incluir antígenos de difteria y tétanos. Por lo tanto se prefieren combinaciones de DTP.
Los antígenos sacáridos están preferentemente en forma de conjugados. Las proteínas transportadoras de los conjugados se analizan con más detalle a continuación.
Los antígenos en la composición típicamente estarán presentes a una concentración de al menos 1|jg/ml cada uno. En general, la concentración de cualquier antígeno dado será suficiente para provocar una respuesta inmunitaria contra ese antígeno.
Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden utilizarse terapéuticamente (es decir, para tratar una infección existente) o profilácticamente (es decir, para prevenir una futura infección).
Como alternativa al uso de antígenos proteicos, en las composiciones inmunogénicas de la invención, se puede usar ácido nucleico (que podría ser ARN, como un ARN autorreplicante, o ADN, como un plásmido) que codifique el antígeno.
En algunos casos una composición de la invención puede comprender, además de la secuencia de fHbp, los antígenos sacáridos capsulares conjugados de 1, 2, 3 o 4 de los serogrupos de meningococos A, C, W135 e Y. En otro caso una composición de la invención puede comprender, además de la secuencia de fHbp, al menos un antígeno sacárido capsular neumocócico conjugado.
Serogrupos de meningococo Y, W135, C y A
Las vacunas actuales del serogrupo C (Menjugate™ [57, 78], Meningitec ™ y NeisVac - C™) incluyen sacáridos conjugados. Menjugate™ y Meningitec™ tienen antígenos oligosacáridos conjugados con un vehículo CRM197, mientras que NeisVac -C™ utiliza el polisacárido completo (de -O - acetilado) conjugado a un vehículo de toxoide del tétanos. La vacuna Menactra™ contiene antígenos sacáridos capsulares conjugados de cada uno de los serogrupos Y, W135, C y A.
Las composiciones de la presente invención pueden incluir antígenos de sacáridos capsulares de uno o más de los serogrupos de meningococos Y, W135, C y A, en las que los antígenos están conjugados a proteína(s) transportadoras y/o son oligosacáridos. Por ejemplo, la composición puede incluir un antígeno sacárido capsular de: serogrupo C; serogrupos A y C; serogrupos A, C y W135; serogrupos A, C y Y; serogrupos C, W135 e Y; o a partir de los cuatro de los serogrupos A, C, W135 e Y.
Una cantidad típica de cada antígeno sacárido meningocócico por dosis es entre 1 jg y 20 |jg, por ejemplo, aproximadamente 1 jg, sobre 2,5 jg, sobre 4 jg, sobre 5 jg, o aproximadamente 10 jg (expresado como sacárido). Cuando una mezcla comprende sacáridos capsulares de ambos serogrupos A y C, la relación (p/p) de sacárido MenA: sacárido MenC puede ser mayor que 1 (por ejemplo, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 o superior). Cuando una mezcla comprende sacáridos capsulares del serogrupo Y y uno o ambos de los serogrupos C y W135, la relación (p/p) de sacárido MenY: sacárido MenW135 puede ser mayor que 1 (por ejemplo, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 o superior) y/o que la relación (p/p) de sacárido MenY: sacárido MenC puede ser inferior a 1 (por ejemplo, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, o inferior).
Las proporciones preferentes (p/p) para los sacáridos de los serogrupos A:C:W135:Y son: 1:1:1:1; 1:1:1:2; 2:1:1:1; 4:2:1:1; 8:4:2:1; 4:2:1:2; 8:4:1:2; 4:2:2:1; 2:2:1:1; 4:4:2:1; 2:2:1:2; 4:4:1:2; y 2:2:2:1. Las relaciones preferentes (p/p) de sacáridos de los serogrupos C:W135:Y son: 1:1:1; 1:1:2; 1:1:1; 2:1:1; 4:2:1; 2:1:2; 4:1:2; 2:2:1; y 2:1:1. Se prefiere el uso de una masa sustancialmente igual de cada sacárido.
Los sacáridos capsulares se pueden usar en la forma de oligosacáridos. Estos se forman convenientemente por la fragmentación del polisacárido capsular purificado (porejemplo, mediante hidrólisis), que normalmente está seguida de la purificación de los fragmentos del tamaño deseado.
La fragmentación de polisacáridos se realiza preferentemente para generar un grado medio final de polimerización (DP) en el oligosacárido de menos de 30 (por ejemplo, entre 10 y 20, preferentemente alrededor de 10 para el serogrupo A; entre 15 y 25 para los serogrupos W135 e Y, preferentemente alrededor de 15 - 20; entre 12 y 22 para el serogrupo C; etc.). El Dp se puede medir convenientemente por cromatografía de intercambio iónico o por ensayos colorimétricos [79].
Si se realiza hidrólisis, el hidrolizado en general se elegirán por tamaños para eliminar los - oligosacáridos de longitud corta [58]. Esto se puede lograr de varias maneras, como ultrafiltración seguida de cromatografía de intercambio iónico. Los oligosacáridos con un grado de polimerización de menos que o igual a aproximadamente 6 se eliminan preferentemente para el serogrupo A, y aquellos de menos de alrededor de 4 se eliminan preferentemente para los serogrupos W135 e Y.
Los antígenos sacáridos MenC preferentes se describen en la referencia 78, tal como se utiliza en Menjugate™. El antígeno sacárido puede modificarse químicamente. Esto es particularmente útil para reducir la hidrólisis para el serogrupo A [80]. Se puede realizar una des-O-acetilación de los sacáridos meningocócicos. Para los oligosacáridos, la modificación puede tener lugar antes o después de la despolimerización.
Cuando una composición de la invención incluye un antígeno sacárido MenA, el antígeno es preferentemente un sacárido modificado en el que uno o más de los grupos hidroxilo del sacárido nativo ha(han) sido sustituido(s) por un grupo de bloqueo [80]. Esta modificación mejora la resistencia a la hidrólisis.
Conjugación covalente
Los sacáridos capsulares en las composiciones de la invención en general pueden conjugarse a proteína(s) portadora(s). En general, la conjugación potencia la inmunogenicidad de los sacáridos, ya que los transforma de antígenos independientes de T a antígenos dependientes de T, permitiendo de este modo la estimulación de la memoria inmunológica. La conjugación es particularmente útil para vacunas pediátricas y es una técnica muy conocida.
Las proteínas transportadoras típicas son toxinas bacterianas, como la difteria o el tétanos, toxinas o toxoides o mutantes de los mismos. La toxina mutante de la difteria CRM197 a [81] es útil, y es el vehículo en el producto PREVENAR™. Otras proteínas transportadoras adecuadas incluyen el complejo de proteínas de la membrana externa de N. meningitidis 82], péptidos sintéticos [83, 84], proteínas de choque térmico [85, 86], proteínas de tos ferina [87, 88], citoquinas [89], linfoquinas [89], hormonas [ 89], factores de crecimiento [ 89], proteínas artificiales que comprenden múltiples epítopos de linfocitos T CD4 humanos de diversos antígenos derivados de patógenos [90] como N19 [91], la proteína D de H. influenzae [ 92-94], neumolisina [95] o sus derivados no tóxicos [96], proteína de superficie neumocócica PspA [97], proteínas de captación de hierro [98], toxina A o B de C. difficile [99], exoproteína A recombinante (rEPA) de P. aeruginosa [100], etc.
Cualquier reacción de conjugación adecuada se puede utilizar, con cualquier conector adecuado cuando sea necesario.
El sacárido será típicamente activado o funcionalizado antes de la conjugación. La activación puede implicar, por ejemplo, reactivos de cianilación como CDAP (por ejemplo, 1-ciano-4-dimetilamino piridinio tetrafluoroborato [101, 102, etc.]). Otras técnicas adecuadas usan carbodiimidas, hidrazidas, ésteres activos, norborano, ácido pnitrobenzoico, N-hidroxisuccinimida, S-NHS, EDC, TSTU.
Las uniones a través de un grupo conector se pueden hacer utilizando cualquier procedimiento conocido, por ejemplo, los procedimientos descritos en las referencias 103 y 104 . Un tipo de enlace implica la aminación reductora del polisacárido, acoplamiento del grupo amino resultante con un extremo de un grupo enlazador de ácido adípico, y después el acoplamiento de una proteína al otro extremo del grupo conector de ácido adípico [105, 106]. Otros conectores incluyen B-propionamido [107], nitrofenil-etilamina [108], haluros de haloacilo [109], enlaces glicosídicos [110], ácido 6-aminocaproico [111], ADH [112], residuos C4 a C12 [113], etc. Como alternativa al uso de un conector, puede utilizarse un enlace directo. Los enlaces directos a la proteína pueden comprender oxidación del polisacárido seguido de aminación reductora con la proteína, como se describe en, por ejemplo, las referencias 114 y 115.
Un procedimiento que implica la introducción de grupos amino en el sacárido (por ejemplo, reemplazando grupos =O terminales con -NH2), seguido de la derivatización con un diéster adípico (por ejemplo, es preferente ácido adípico
diéster N- hidroxisuccinimido) y reacción con la proteína transportadora Otra reacción preferente utiliza la activación CDAP con una proteína D transportadora, por ejemplo para MenA o MenC.
Vesículas de membrana externa
Algunas composiciones de la invención pueden no incluir mezclas complejas o indefinidas de antígenos, que son características típicas de las VME. Sin embargo, la invención puede utilizarse junto con las VME, ya que se ha descubierto que fHbp mejora su eficacia [4], particularmente por sobreexpresión de los polipéptidos de la invención en las cepas utilizadas para la preparación de VME. Véase también a continuación.
Esta estrategia puede utilizarse en general para mejorar las preparaciones de N. meningitidis del serogrupo B [microvesículas 116], [ 'VME nativas " 117 ], protuberancias o vesículas de la membrana externa [por ejemplo, refs.
118 a 123, etc.]. Estas se pueden preparar a partir de bacterias que han sido manipuladas genéticamente 124 -127] por ejemplo, para aumentar la inmunogenicidad (por ejemplo hiperexpresar inmunógenos), para reducir la toxicidad, para inhibir la síntesis de polisacárido capsular, para regular a la baja la expresión de PorA, etc. Se pueden preparar a partir de cepas con hiperzeiosis [128 - 131]. Las vesículas de Neisseria no patógena pueden incluirse [132]. Las VME se pueden preparar sin el uso de detergentes [ 133 , 134]. expresar proteínas que nos de Neisseria en su superficie [135]. Pueden estar empobrecidas en LPS. Pueden mezclarse con antígenos recombinantes 118 , 136]. Pueden usarse vesículas de bacterias con diferentes subtipos de proteínas de membrana externa de clase I, por ejemplo seis subtipos diferentes [137, 138] utilizando dos poblaciones de vesículas genéticamente modificadas que muestran cada una tres subtipos, o nueve subtipos diferentes usando tres poblaciones diferentes de vesículas genéticamente modificadas que muestran cada una tres subtipos, etc. Los subtipos útiles incluyen: P1.7,16; P1.5 -1,2-2; P1.19,15-1; P1.5-2,10; P1.12-1,13; P1.7-2,4; P1.22,14; P1.7-1,1; P1.18 -1,3,6.
Células huésped
La invención proporciona una célula huésped transfectada con un plásmido que codifica el polipéptido mutante v2 o v3 de la invención. Cuando la célula huésped es una bacteria, ésta puede ser un meningococo o una E.coli. La célula huésped puede expresar constitutivamente el polipéptido, pero en algunos casos la expresión puede estar bajo el control de un promotor inducible. La bacteria puede hiperexpresar el polipéptido (consulte ref.139). La expresión del polipéptido idealmente no depende de la fase.
La invención también proporciona vesículas de membrana externa preparadas a partir de una bacteria de la invención (particularmente de un meningococo). La divulgación también puede proporcionar un procedimiento para producir vesículas de una bacteria de la invención. Las vesículas preparadas a partir de estas cepas incluyen preferentemente el polipéptido de la invención, que debe estar en una forma inmunoaccessible en las vesículas, es decir, un anticuerpo que puede unirse a un polipéptido purificado de la invención también debe ser capaz de unirse al polipéptido que está presente en las vesículas.
Estas vesículas de la membrana externa incluyen cualquier vesícula proteoliposómica obtenida por interrupción o zeiosis a partir de una membrana externa meningocócica para formar vesículas de los mismos que incluyen componentes de las proteínas de la membrana externa. Por lo tanto, el término incluye las VME (a veces conocido como "protuberancias"), microvesículas (MV [116]) y VME “nativas” (“VMEN” [117]).
Las MV y VMEN son vesículas de membrana de origen natural que se forman espontáneamente durante el crecimiento bacteriano y se liberan en el medio de cultivo. Las MV pueden obtenerse cultivando Neisseria en un medio de cultivo, separando las células completas de las MV más pequeñas en el medio de cultivo (por ejemplo, por filtración o por centrifugación a baja velocidad para sedimentar solamente las células y no las vesículas más pequeñas), y luego recoger las MV desde el medio sin células (por ejemplo, por filtración, por precipitación diferencial o agregación de MV, por centrifugación a alta velocidad para sedimentar las MV). Las cepas para uso en la producción de MV pueden seleccionarse en general en función de la cantidad de MV producidas en el cultivo por ejemplo, refs. 130 y 131 describen Neisseria con una elevada producción de MV.
Las VME se preparan artificialmente a partir de bacterias, y se pueden preparar mediante un tratamiento con detergente (por ejemplo, con desoxicolato), o sin medios con detergentes (por ejemplo, véase la referencia 134 ). Las técnicas para formar las VME incluyen el tratamiento de bacterias con un detergente derivador de una sal de ácido biliar (por ejemplo, sales de ácido litocólico, ácido quenodesoxicólico, ácido ursodesoxicólico, ácido desoxicólico, ácido cólico, ácido ursocólico, etc., con desoxicolato de sodio [140y 141] siendo preferente para el tratamiento de Neisseria) a un pH suficientemente alto como para no precipitar el detergente [142]. Otras técnicas pueden llevarse a cabo sustancialmente en ausencia de detergente [134] usando técnicas como sonicación, homogeneización, microfluidización, cavitación, choque osmótico, trituración, prensa francesa, mezclado, etc. Los procedimientos que utilizan nada o poco detergente pueden retener los antígenos útiles, como NspA y fHbp [134]. Por lo tanto, un procedimiento puede utilizar un tampón de extracción de VME con aproximadamente 0,5 % de desoxicolato o menos, por ejemplo de aproximadamente 0,2 %, aproximadamente 0,1 %, <0,05 % o cero.
Un procedimiento útil para la preparación de VME se describe en la referencia 143 e implica ultrafiltración sobre las VME en crudo, en lugar de una centrifugación a alta velocidad. El proceso puede implicar una etapa de
ultracentrifugación después de realizar la ultrafiltración. Las VME también pueden purificarse mediante el proceso de filtración por tamaño de dos etapas descrito en la referencia 154.
Las vesículas para su uso con la invención se pueden preparar a partir de cualquier cepa meningocócica. Las vesículas suelen ser de una cepa del serogrupo B, pero es posible prepararlas a partir de serogrupos distintos de B (por ejemplo, la referencia 142 desvela un procedimiento para el serogrupo A), como A, C, W135 o Y. La cepa puede ser de cualquier serotipo (por ejemplo, 1, 2a, 2b, 4, 14, 15, 16, etc.), cualquier serosubtipo, y cualquier inmunotipo (por ejemplo, L1; L2; L3; l3,3,7; L10; etc.). El meningococo puede ser de cualquier línea adecuada, incluyendo líneas hiperinvasivas e hipervirulentas, por ejemplo, cualquiera de las siguientes siete líneas hipervirulentas: subgrupo I; subgrupo III; subgrupo IV -1; complejo ET - 5; complejo ET - 37; clúster A4; línea 3. La célula huésped de la invención pueden, además de codificar un polipéptido de la invención, tener una o más modificaciones adicionales. Por ejemplo, pueden tener un gen fur modificado [144]. La expresión de nspA puede ser regulada al alza en un espécimen sin porA ni cps (knockout). Otros mutantes knockout de N. meningitidis para la producción de VME se divulgan por ejemplo, en la referencia 150. La referencia 145 divulga la construcción de vesículas de cepas modificadas para expresar seis subtipos diferentes de PorA. También puede usarse una Neisseria mutante con bajos niveles de endotoxina, que se logra eliminando los genes (knockout) que codifican enzimas implicadas en la biosíntesis de LPS [146, 147]. Con la invención también puede usarse una Neisseria mutante diseñada para reducir o apagar la expresión de al menos un gen implicado en hacer tóxica la parte del lípido A de LPS, particularmente del gen lpxl1, [148]. Del mismo modo, con la invención puede usarse una Neisseria mutante diseñada para reducir o apagar la expresión de al menos un gen implicado en la síntesis o exportación de polisacárido capsular, particularmente de los genes synX y/o ctrA. Todos estos u otros mutantes se pueden utilizar con la invención.
Por lo tanto, una cepa utilizada con la invención puede por ejemplo expresar más de un subtipo de PorA. Ya se han construido previamente cepas hexavalentes y nonavalentes PorA. La cepa puede expresar 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 de subtipos de PorA: P1.7,16; P1.5-1,2-2; P1.19,15-1; P1.5-2,10; P1.12 - 1,13; P1.7-2,4; P1.22,14; P1.7-1,1 y/o P1.18-1,3,6. Alternativamente, una cepa puede haberse regulado a la baja para la expresión de PorA, por ejemplo, en el que la cantidad de PorA se ha reducido en al menos 20 % (por ejemplo, > 30%, > 40%,> 50%, > 60%, > 70%,> 80%,> 90%, > 95%, etc.), o incluso eliminado, en relación con los niveles del tipo silvestre (porejemplo, relativos a la cepa H44/76).
En algunos casos, una cepa puede hiperexpresar (en relación con la cepa de tipo silvestre correspondiente) ciertas proteínas. Por ejemplo, las cepas pueden hiper expresar NspA, la proteína 287 [118], fHbp [139 ] (incluyendo fHbp de la invención), TbpA y/o TbpB [136], Cu, Zn-superóxido dismutasa, HmbR, etc.
Un gen que codifica un polipéptido de la invención puede integrarse en el cromosoma bacteriano o puede estar presente en forma episomal, por ejemplo, dentro de un plásmido.
De forma ventajosa para la producción de vesículas, un meningococo puede diseñarse genéticamente para garantizar que la expresión del polipéptido no dependa de la variación de fase. Los procedimientos para reducir o eliminar la variabilidad fase de la expresión génica en meningococo se describen en la referencia 149 . Por ejemplo, un gen se puede someter al control de un promotor constitutivo o inducible, o mediante la eliminación o sustitución del motivo de ADN que es responsable de su variabilidad de fase.
En algunos casos una cepa puede incluir uno o más de los knockout y/o hiper mutaciones de expresión dados a conocer en las referencias 122 , 124, 128 y 150 . Por ejemplo, siguiendo la orientación y la nomenclatura de estos cuatro documentos, genes útiles para la regulación a la baja y/o knockout incluyen: (a) Cps, CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, y/o TbpB; (b) CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PhoP, PilC, PmrE, PmrF, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, y/o TbpB ; (c) ExbB, ExbD, rmpM, CtrA, CtrB, CtrD, GalE, LbpA, LpbB, Opa, Opc, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, y/o TbpB; or (d) CtrA, CtrB, CtrD, FrpB, OpA, OpC, PilC, PorB, SiaD, SynA, SynB, SynX y/o SynC.
Cuando se utiliza una cepa mutante, en algunos casos puede tener una o más, o todas, de las siguientes características: (I) Eliminación (knocked-out) o regulación a l baja de LGTB y/o GalE para truncar el LOS meningococo; (ii) TbpA regulado al alza; (iii) Nhha regulado al alza; (iv) Omp85 regulado al alza; (v) LbpA regulado al alza; (vi) NspA regulado al alza; (vii) PorA eliminado; (viii) FrpB regulado a la baja o eliminado; (ix) Opa regulado a la baja o eliminado; (x) Opc regulado a la baja o eliminado; (xii) eliminación del complejo de genes cps. Un LOS truncado puede ser uno que no incluya un epítopo sialil-lacto-N-neotetraosa, por ejemplo, podría ser un LOS deficiente en galactosa-. El LOS puede no tener ninguna cadena a.
Dependiendo de la cepa meningocócica utilizada para la preparación de las vesículas, pueden incluir o no el antígeno de la cepa nativa fHbp [151].
En un caso preferente, un meningococo no expresa una proteína MltA funcional. Como se discute en las referencias.
152 y 153, la eliminación (knockout) de MltA (la transglicosilasa lítica unida a membrana, también conocida como GNA33) en meningococo proporciona bacterias que liberan de manera espontánea grandes cantidades de vesículas
de membrana en el medio de cultivo, del que se pueden purificar fácilmente. Por ejemplo, las vesículas se pueden purificar utilizando el procedimiento de filtración por tamaño en dos etapas de referencia 154, que comprende: (i) una primera etapa de filtración en la que las vesículas se separan de la bacteria en base a sus diferentes tamaños, las vesículas pasan al filtrado; y (ii) una segunda etapa de filtración en la que las vesículas se retienen en el retenido. La mutación MltA (regulación a la baja o knockout) se ha utilizado en las vacunas 'MGAM' [155], y convenientemente se puede combinar con la regulación a la baja o eliminación (knockout) de, particularmente, al menos un gen implicado en hacer tóxica la parte de lípido A de LPS, particularmente de lpxl1 y/o de al menos un gen implicado en la síntesis capsular o exportación del polisacárido, sobre todo de genes synX y/o ctrA. Los MGAM (Módulos Generalizados para Antígenos de Membrana) son VME genéticamente destoxificadas que se producen a partir de cepas de meningococo que han sido diseñadas para liberar MGAM con una reducción de la reactogenicidad y un aumento de la inmunogenicidad. MGAM induce la producción de citoquinas menos proinflamatorias que VME cuando se analizan en ensayos de activación de monocitos (MAT).
Una cepa meningocócica preferente para la vacuna de un 'MGAM' utilizando esta estrategia puede expresar un fHbp v2 mutante y/o un fHbp v3 mutante de la invención, y la expresión puede estar impulsada por promotores potentes. Las vesículas liberadas por esta cepa pueden incluir las proteínas fHbp v2 y/o v3 mutantes en forma inmunogénica, y la administración de las vesículas puede proporcionar una respuesta de anticuerpos bactericidas como se explica en la referencia 155. La cepa también puede expresar un fHbp v1, o un fHbp v1, en su lugar se puede proporcionar como una proteína recombinante independiente en forma soluble (y el fHbp v1 puede ser de tipo silvestre o una secuencia mutante, por ejemplo, mutada para alterar su capacidad para unirse a fH, como se analiza anteriormente). La invención puede proporcionar dichas cepas, y también proporciona las vesículas que estas cepas liberan, por ejemplo, como purificadas a partir de medios de cultivo después del crecimiento de las cepas. Un mutante v2 preferente para la expresión en estas cepas tiene una mutación en S32V y adicionalmente L123 como se analiza en el presente documento, y un mutante v3 preferente para la expresión en estas cepas tiene una mutación en S32 y adicionalmente L126 como se analiza en el presente documento. Por lo tanto, las vesículas preparadas a partir de meningococos que expresan estas secuencias mutantes fHbp v2 y v3 son inmunógenos particularmente preferentes para su uso en vacunas de la invención. Una secuencia v2 de tipo silvestre útil para la mutagénesis de esta manera puede comprender la SEQ ID NO: 51 o la SEQ ID NO: 54 (que comprende AG de la SEQ ID NO: 55), y una secuencia v3 de tipo silvestre útil para la mutagénesis de esta manera puede comprender la SEQ ID NO: 52.
Los promotores útiles para su uso en dichas cepas incluyen los divulgados en las referencias 156 y 157. Por ejemplo, el promotor puede ser: (a) el promotor de un gen de la porina, preferentemente porA o porB, particularmente de N. meningitidis, o (b) un promotor del gen rRNA (como un gen rRNA 16S), particularmente de N. meningitidis. Cuando se usa un promotor de porina meningocócica, es preferentemente de porA, y aún más particularmente una región -10 de un promotor del gen porA meningocócico, y/o una región -35 de un promotor del gen porA meningocócico (preferentemente en el que la región -10 y la región -35 están separados por una secuencia intermedia de 12-20 nucleótidos, y en el que la secuencia de intervención o bien no contiene ninguna secuencia de poli-G o incluye una secuencia de poli-G que tiene no más de ocho nucleótidos G consecutivos). Cuando se usa un promotor del gen rRNA, puede comprender más particularmente (i) una región -10 de un promotor del gen rRNA meningocócico y/o (ii) una región de -35 a partir de un promotor del gen de rRNA meningocócico. También es posible utilizar un híbrido de (a) y (b), por ejemplo, para tener una región -10 de un promotor de porA y una región -35 de un promotor de rRNA (que puede ser una región consenso -35). Un promotor útil puede pues ser un promotor que incluya o bien (i) una región -10 de un gen rRNA (particularmente meningocócico) y una región -35 de un gen porA (particularmente meningocócico), o (ii) una región -10 de un gen porA (particularmente meningocócico) y una región -35 de un gen rRNA (particularmente meningocócico).
Si LOS está presente en una vesícula, es posible tratar la vesícula para unir sus componentes LOS y componentes proteicos (conjugación "intraprotuberancias" [150]).
General
El término "que comprende" abarca "que incluye" así como "que consiste en", por ejemplo una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional por ejemplo X Y. Las referencias a "que comprende" (o "comprende", etc.) pueden opcionalmente sustituirse por referencias a "que consiste en" (o "consiste en", etc.). Como se usa en el presente documento, la expresión "que consiste esencialmente en" limita el alcance de una reivindicación a los materiales o etapas especificados y a aquellos que no afectan materialmente a la(s) característica(s) básica(s) y novedosa(s) de la invención reivindicada.
El término "aproximadamente" en relación con un valor numérico x es opcional y significa, por ejemplo, x 10 %. La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente" por ejemplo, una composición que está "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra "sustancialmente" puede omitirse de la definición de la invención.
"Identidad de secuencia" se puede determinar por el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman ya implementado en el programa MPSRCH (Oxford Molecular), usando una búsqueda de espacios afines con una penalización por introducir espacios = 12 y una penalización por extensión de espacios = 1, pero se determina
preferentemente con el algoritmo de alineamiento global Needleman-Wunsch [158], utilizando los parámetros por defecto (por ejemplo, penalización por introducir espacios = 10,0, y penalización por extensión de espacios = 0,5; utilizando la matriz de puntuación EBLOSUM62). [Este algoritmo está convenientemente incluido en la herramienta de aguja (needle) del paquete EMBOSS159]. Cuando la solicitud se refiere a una identidad de secuencia respecto a una SEQ ID particular, la identidad debe calcularse en toda la longitud de dicha SEQ ID.
El término "fragmento", en referencia a las secuencias polipeptídicas significa que el polipéptido es una fracción de una proteína de longitud completa. Dichos fragmentos pueden poseer una actividad biológica cualitativa en común con la proteína de longitud completa, por ejemplo, un fragmento puede contener o codificar uno o más epítopos, como los epítopos inmunodominantes, que permiten que un aumento de la respuesta inmunitaria similar entre el fragmento y la secuencia de longitud completa. Los fragmentos de polipéptidos en general, tienen una porción amino (N) terminal y/o una porción carboxi (C) terminal suprimida en comparación con la proteína nativa, pero en la que la secuencia de aminoácidos restante del fragmento es idéntica a la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa. Los fragmentos de polipéptidos pueden contener, por ejemplo: cerca de 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 24, 26, 28, 40, 45, 50, 55, 60,70, 80, 90, 100, 150, 200, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258 , 259, 260, 261, 262 aminoácidos contiguos, incluyendo todos los números enteros intermedios, de una secuencia de polipéptido de referencia, por ejemplo entre 50 y 260, 50 y 255, 50 y 250, 50 y 200, 50 y 150 aminoácidos contiguos de una secuencia de polipéptido de referencia. El término fragmento excluye explícitamente polipéptidos fHbp de longitud completa y lipoproteínas maduras de los mismos. Después del serogrupo, la clasificación meningocócica incluye serotipo, serosubtipo y luego inmunotipo, y las listas de nomenclatura estándar de serogrupo, serotipo, serosubtipo, y inmunotipo, separado cada uno por dos puntos, por ejemplo B:4:P1.15:L3,7,9. Dentro del serogrupo B, algunas líneas causan enfermedad a menudo (hiperinvasivas), algunas líneas causan formas más graves de la enfermedad que otros (hipervirulentas), y otras, rara vez causan enfermedad en absoluto. Se conocen siete líneas hipervirulentas, es decir, los subgrupos I, III y IV -1, complejo ET -5, complejo ET -37 compleja, clúster A4 y línea 3. Estos se han definido mediante electroforesis enzimática multilocus (MLEE), pero el genotipado de la secuencia multilocus (MLST) también se ha utilizado para clasificar los meningococos. Los cuatro principales grupos hipervirulentos son los complejos ST32, ST44, ST11 y ST8.
En general, la divulgación no abarca las diversas secuencias fHbp específicamente divulgadas en las referencias 2, 3, 5, 6, 7, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166 y 167 .
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra la diferente sensibilidad de las variantes fHbp frente al corte con quimiotripsina. La flecha indica la ubicación de las proteínas fHbp de cadena completa.
La figura 2 muestra el análisis de bandas Western de los mutantes v2. Las calles son: (1 & 2) v2 recombinante purificada de tipo silvestre; (4) lisado v2 de tipo silvestre; (5) mutante No. l; (6) mutante No. 2; (7) mutante No. 4; (8) mutante No. 5; (9) mutante No. 7; (10) mutante No. 8; (11) mutante No. 12; (12) mutante No. 14 (13) mutante No. 15; (14) control fHbp var2 NAG-trx, es decir proteína v2 en la que la secuencia del extremo N-terminal GPd Sd RlQQRR (SEQ ID NO: 37, está remplazada por GSKDISS (SEQ ID NO: 38). Las calles 2-14 incluyen quimiotripsina. M son los marcadores moleculares.
La figura 3 muestra un nuevo análisis de bandas Western de mutantes v2. Las calles son: (1 y 2) mutante No. 3; (3 y 4) mutante No. 6; (5 y 6) mutante No. 9; (7 y 8) mutante No. 10; (9 y 10) mutante No. 13; (11 y 12) Agono; (13 y 14) tipo silvestre v2; (15 y 16) mutante No. 22. Las calles impares son las proteínas que se incubaron sin quimiotripsina, mientras que las calles pares fueron proteínas incubadas con quimiotripsina. La proteína 'Agono' es una v2 recombinante, en la que la secuencia N-terminal (SEQ ID NO: 37) se ha eliminado.
La figura 4 muestra un nuevo análisis de bandas Western de mutantes v2. Las calles son: (1 y 2) mutante No. 11; (3 y 4) N-trx; (5-7) mutante No. 19; (8 y 9) mutante No. 20; (10 y 11) mutante No. 21. Las calles 2, 4, 7, 9 y 11 son proteínas que se incubaron con la quimiotripsina, mientras que las otras calles no tenían quimiotripsina. La proteína 'N-trx' es una v2 recombinante, en la que la secuencia N-terminal (SEQ ID NO: 37, está remplazada por la SEQ ID NO: 39.
La Figura 5 muestra los resultados de la DSC para la fHbp v2 de tipo silvestre y mutante S58V/L149R. El dominio C-terminal no se ha visto afectado por la mutación, pero la Tm del dominio N-terminal aumentó en > 20 °C (marcado con la flecha). El eje y muestra Cp (kcal/mol/°C), y el eje x muestra la temperatura (°C). La figura 6 muestra la respuesta de SPR de la fHbp v2 del tipo silvestre (barra continua) y mutante (barra discontinua).
La figura 7 muestra la respuesta de SPR de fHbp v3, ya sea de tipo silvestre (parte superior) o con varias mutaciones.
La figura 8 muestra los resultados de DSC para la proteína de triple fusión de SEQ ID NO: 48. Los ejes son como en la fig.5.
Modos para llevar a cabo la invención
Mutaciones fHbp
El fHbp v2 es reconocido como inestable. Para analizar las razones estructurales subyacentes de esta propiedad indeseable, con miras a la ingeniería de la secuencia para mejorar la estabilidad, los inventores analizaron la secuencia de alineaciones y estructuras 3D de polipéptidos fHbp. Un área de particular interés fue el punto de contacto estructural entre los dominios N-terminal y C-terminal [168].
Los inventores identificaron las mutaciones explicadas en la tabla 1. Tres de las posiciones identificadas para la mutación se superponen con las referencias 24 y 25, pero la invención no abarca los polipéptidos descritos en la técnica anterior es decir, en la que los polipéptidos incluyen sustituciones únicamente en estas posiciones por alanina. Por ejemplo, la divulgación describe polipéptidos donde E240 puede sustituirse con histidina para que coincida con v1, e idealmente se hace junto con la sustitución en el residuo H239 (mutantes No. 1 y No. 11). Del mismo modo, si F122 se sustituye, entonces preferentemente se hace junto con la sustitución en S151, ambos con cisteína para permitir la formación de un puente disulfuro (mutante No. 10). Además, si L123 se sustituye entonces se puede sustituirse con arginina (en lugar de alanina), o se puede combinar con la sustitución en otros residuos, por ejemplo en S32 (véase mutante No. 3), en S125 (véanse mutantes No. 20 y No. 22), o con sustitución en los residuos 124-128 (véase mutante No. 12).
Estudios de estabilidad
Las proteínas inestables tienden a plegarse menos y por esta razón son propensas a la escisión y la degradación por proteasas. La figura 1 muestra que fHbp v2 es más sensible a la degradación por quimiotripsina que v1 y v3, por lo que esta prueba puede utilizarse para evaluar la estabilidad de las proteínas mutantes.
Para la figura 1, se prepararon fHbp de tipo silvestre v1, v2 y v3 a 0,5 mg/pl en Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 8. La quimiotripsina se añadió a una proporción de 1:100 (p/p). Las muestras se incubaron a 24 °C, 50 ml de volumen, sin agitación. Las muestras se extrajeron y se hirvieron durante 0, 1, 3, o 6 horas; a continuación, se corrieron en un gel bis-Tris al 12% (tampón MES). La calle de la izquierda, marcado con *, indica una muestra incubada durante 6 horas sin proteasa.
Los lisados celulares de E. coli que expresan las proteínas recombinantes se incubaron con una v de quimitripsina1:100 p/p durante 3 horas a 25 °C. El patrón de degradación se analizó mediante bandas Western después de la incubación con un suero policlonal inmune generado en conejo contra las tres variantes de fHbp. La presencia de productos de escisión de menor peso molecular aparente (figuras 2-4) se interpreta como una indicación de la inestabilidad, mientras que la persistencia de una banda correspondiente a un peso molecular aparente de ~ 30 kDa se interpreta como una indicación de una mayor estabilidad. Los mutantes No. 1-6, No. 12 y No. 22 mostraron todos una mayor resistencia a la escisión por quimiotripsina en comparación con el tipo silvestre v2.
Se ha utilizado DSC como una estrategia independiente para evaluar los efectos de las mutaciones sobre la estabilidad de las proteínas fHbp v2 recombinantes purificadas. La Tm (temperatura de fusión) medida por DSC se corresponde con la temperatura a la que la proteína analizada se encuentra en el estado plegado en un 50 % y en el estado desplegado en un 50 %. Los cambios que estabilizan la conformación de una proteína aumentarán la Tm, mientras que los cambios desestabilizadores disminuirán la Tm. Como se ve en la figura 3D de la referencia 24, el perfil de DSC de fHbp v2 tipo silvestre muestra dos valores de Tm: Tm1 a ~ 40 °C, que corresponde a la temperatura de fusión del dominio N-terminal, y Tm2 a ~ 80 °C que corresponde a la temperatura de fusión del dominio C-terminal. Los valores de Tm1 y Tm2 para los mutantes analizados se muestran en la tabla 1. Los mutantes No. 2, No. 4, No. 5, No. 12, No. 19 y No. 21 mostraron un aumento de la Tm del dominio N-terminal con respecto a la proteína de tipo silvestre, y este efecto fue más marcado para los mutantes No. 2, No. 4 y No. 12.
Se usó cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) para evaluar el porcentaje de proteína monomérica, y los resultados también se muestran en la tabla 1.
Mutantes No. 2, No. 3 y No. 4
El mutante No. 3 (grupo 2B) dio los mejores resultados globales en los estudios de estabilidad de v2. Esta proteína (SEQ ID NO: 20) incluye mutaciones en Ser-58 (S32 en la SEQ ID NO: 5) y Leu-149 (L123 en la SEQ ID NO: 5), con las sustituciones por Val y Arg, respectivamente. La proteína mutante (s Eq ID NO: 20, que comprende la SEQ ID NO: 45) se analizó mediante DSC y, en comparación con la secuencia de tipo silvestre, la Tm de su dominio N-es > 20 °C más alto (figura 5).
En un ensayo bactericida en suero este mutante v2 podría competir por la unión a los anticuerpos humanos que se habían generado utilizando una secuencia v2 de tipo silvestre.
Aunque las mutaciones S58V y L149R se habían introducido para mejorar la estabilidad, y, efectivamente, lograron este objetivo, la figura 6 muestra que el polipéptido v2 mutante (línea punteada) mostró una sorprendente reducción de su unión a fH en comparación con la secuencia v2 de tipo silvestre (línea continua) cuando se mide por resonancia de plasmones superficiales contra fH inmovilizado. La mutación S58V por sí sola tuvo poco impacto sobre la unión a fH, y el doble mutante S58V/L149R mostró una mayor unión a fH que fHbp con solo el mutante L149R.
Cuando el mutante No. 3 se combinó además con la mutación 'E313A' en v2 hubo una pérdida completa de unión a fH según la evaluación por SPR.
Las mutaciones equivalentes se introdujeron en una secuencia v3 (SEQ ID NO: 17), para generar el mutante v3 de SEQ ID NO: 44. Se estudiaron en v3 los efectos de las mutaciones individuales S58V y L149R sobre la unión a fH (es decir, los equivalentes v3 de los mutantes v2 No. 2 y No. 4). Por lo tanto, numerados de acuerdo con la SEQ ID NO: 17, la mutación S32V o L126R se introdujo en la secuencia de v3. Estos dos mutantes se compararon con dos secuencias v3 de tipo silvestre diferentes, y también con el mutante 'E313A' que se sabe que interrumpe la unión con fH en v3 [23].
Como se muestra en la figura 7, v3 de tipo silvestre se une a fH (dos líneas superiores). La mutación S58V, que fue diseñada para mejorar la estabilidad, redujo el valor de pico SPR aproximadamente a la mitad. Lo más sorprendente es que la mutación L149R (de nuevo, diseñada para mejorar la estabilidad) redujo la afinidad por fH a un nivel similar del conocido mutante E313A (dos líneas inferiores).
Las mutaciones S58V y L149R en v3 también fueron estudiadas por DSC, y se observó que aumentaban la Tm del dominio N -terminal en 5,5 °C (S58V) o 6,7 °C (L149R) con respecto al de tipo silvestre. La Tm de ambos mutantes fue mayor que la observada en el mutante doble v2 (63,5 °C, véase tabla 1). El mutante v3 L149R también mostró un valor más alto de Tm para su dominio C-terminal, mientras que no hubo casi ningún cambio aquí para el mutante v3 S58V. Los valores s Pr mostraron que la afinidad por fH del mutante No. 2 fH se redujo alrededor de a la mitad, pero la del mutante No. 4 e redujo a un nivel similar al del mutante E313A conocido (como también se observa con v2). Cuando las dos mutaciones se combinaron (es decir, mutante No. 3) La Tm aumentó en comparación con los de tipo silvestre, fue de 11,2 °C. Cuando se añadió la mutación 'E313A' al mutante No. 3 la unión a fH fue eliminada casi por completo, aunque la Tm del dominio N-terminal también disminuyó en 2,9 °C, en comparación con el mutante No. 3 (aunque permaneció siendo 8,3 °C más alta que la del v3 de tipo silvestre). La mutación 'E313A' sola fue mucho menos estable que el tipo silvestre, que muestra una reducción de la Tm de 6,3 °C.
Por lo tanto la mutación No. 2 se puede usar sola, o en combinación con el mutante #4 (es decir, el mutante No. 3), opcionalmente con mutaciones adicionales, para estabilizar fHbp v2 o v3 sino también para interrumpir la afinidad porfH.
Se utilizó un ensayo bactericida en suero para evaluar la eficacia inmunogénica de los mutantes No. 3 y No. 4 en v2 y v3. Además, el mutante 'E313A también se probó en v2 y v3, o solo o en combinación con las mutaciones No. 3. Se analizaron también las fHbp v2 y v3 de tipo silvestre también compararlas. Las proteínas se administraron a 20 pg/dosis con un adyuvante de hidróxido de aluminio y los sueros resultantes se ensayaron para determinar la actividad bactericida contra un panel de siete cepas (cuatro cepas v2, tres cepas v3) incluidas las cepas que expresan el mismo fHbp como la de tipo silvestre a partir secuencias fHbp (es decir, secuencia v22.16 y secuencia v33.42).
^ * =
Combinación de mutantes No. 2 y No. 12
Cada uno de los mutantes No. 2 y No. 12 mostró mejoras en la estabilidad de v2, por lo que estos dos mutantes fueron combinados en una sola fHbp (SEQ ID NO: 58, forma AG). En comparación con el mutante No. 12 la Tm del dominio N-terminal de este mutante combinado aumentó 4,2 °C adicionales, ofreciendo la Tm más alta de cualquiera de las proteínas v2 mutantes ensayadas. Además, mostró una unión a fH fuertemente reducida (valor de pico SPR reducido aproximadamente 8 veces).
Proteína de fusión mutante
Las secuencias v2 y v3 mutantes se fusionan a través de un conector GSGGGG (SEQ ID NO: 50), también con una secuencia mutante v1, para generar SEQ ID NO: 48. Esta secuencia incluye las mutaciones S58V y L149R tanto para v2 como para v3, y la mutación R41S [21] para v1. SEQ ID NO. 47 incluye, desde el extremo N-terminal al C-terminal: el mutante v2 No. 3 (SEQ ID NO: 45); mutante v3 No. 3 (SEQ ID NO: 44); y el mutante v i 'R41S' (SEQ ID NO: 49), conectado por la secuencia conectora rica en glicina, SEQ ID NO: 50. La proteína de fusión puede expresarse convenientemente mediante la adición de una secuencia N-terminal de Met- [SEQ ID NO: 37] -, lo que proporciona una proteína madura, SEQ ID NO: 48.
Esta proteína de fusión tiene por lo tanto la ventaja observada de que el mutante No. 3 proporciona tanto para v2 como para v3 un gran aumento en la estabilidad (Tm) y una gran disminución en la afinidad por fH. Para v i la mutación R41S tiene poco efecto sobre la estabilidad térmica, pero reduce fuertemente la unión a fH.
Los estudios de DSC de la proteína de triple fusión (figura 8) muestran que las tres transiciones N-terminal recaen juntas en un pico ancho centrado a 68 °C. Las tres transiciones C- terminal también recaen juntas. Un ensayo UPLC mostró que la proteína era 94,9 % pura, y el análisis HPLC mostró < 1,5 % de oligómeros.
Proteínas mutantes expresados en vesículas de membrana "MGAM"
Se preparó una cepa meningocócica v1 eliminando (knockouts) mltA, lpxL1 y synX para proporcionar una referencia genética v2 y v3 que hiperexpresará lipoproteínas fHbp bajo el control del promotor de la 'ST2' [157] en una vacuna 'MGAM'. Los genes v2 se integraron en el genoma en el locus lpxL1 eliminado mientras que los genes v3 se integraron en el locus Synx. Además, el gen fHbp v1 nativo se eliminó de manera que v3 y v2 podrían estudiarse sin interferencias.
Los mutantes No. 3 y No. 4 se analizó para v2, y el mutante No. 4 fue analizado para v3. Además, se preparó una cepa con ambos mutantes No. 4 v2 y v3. Para estas bacterias la expresión de fHbp y la unión a fH fueron evaluados por FACS.
Para las cepas que expresan solo fHbp v2, el análisis citométrico FACS mostró que las diversas proteínas se expresaron en niveles similares, a 2 niveles logarítmicos más que la cepa de referencia Afhbp. En términos de unión a fH, sin embargo, los mutantes No. 3 y No. 4 mostraron una unión mucho menor, siendo la unión en el mutante No.
4 solo ligeramente por encima de la de referencia. Estos resultados reflejan los datos SRP obtenidos con las proteínas v2 recombinantes.
Para la cepa que expresa el mutante v3 No. 4, el FACS mostró una expresión completa de fHbp, pero perdió su capacidad de unión a fH (igualando la unión a fH observada con la mutación del 'H222R' [19, 25]).
Para la cepa mutante que expresa el mutante No. 4 de v2 y v3, ambas proteínas fHbp pudieron detectarse por FACS pero la unión a fH fue solo ligeramente superior a la observada en la cepa de referencia Afhbp.
Se utilizó el análisis de bandas Western para analizar la estabilidad de la expresión de fHbp en estas bacterias al crecer en medio cultivo líquido durante 6 días. La expresión de proteínas mutantes v2 permaneció estable a través del tiempo, incluso cuando se coexpresaba v3. La expresión de proteínas v3 mutantes también se mantuvo estable, excepto en la cepa que expresa tanto la v2 como la v3 mutantes, en la que la expresión de v3 disminuyó con el tiempo.
LISTADO DE SECUENCIAS
SEQ ID NO: 1 [MC58, v1] MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGN GDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEH TSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQ AEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ
>SEQ ID NO: 2 [2996, v2] MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGN GDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHT AFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEE KGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 3 [M1239, v3] MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAE KTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFLV SGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILG DTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 4 [2996 madura] CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFD FIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFS SDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAG SATVKIGEKVHEIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 5 [2996 AG] VAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVD GQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGK LTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGE KVHEIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 6 [NHBA] MFKRSVIAMACIFALSACGGGGGGSPDVKSADTLSKPAAPVVSEKETEAKEDAPQAGSQGQGAPSAQGSQDMAAV SEENTGNGGAVTADNPKNEDEVAQNDMPQNAAGTDSSTPNHTPDPNMLAGNMENQATDAGESSQPANQPDMANA ADGMQGDDPSAGGQNAGNTAAQGANQAGNNQAAGSSDPIPASNPAPANGGSNFGRVDLANGVLIDGPSQNITLTH CKGDSCSGNNFLDEEVQLKSEFEKLSDADKISNYKKDGKNDKFVGLVADSVQMKGINQYIIFYKPKPTSFARFRRSAR SRRSLPAEMPLIPVNQADTLIVDGEAVSLTGHSGNIFAPEGNYRYLTYGAEKLPGGSYALRVQGEPAKGEMLAGAAVY NGEVLHFHTENGRPYPTRGRFAAKVDFGSKSVDGIIDSGDDLHMGTQKFKAAIDGNGFKGTWTENGSGDVSGKFYG PAGEEVAGKYSYRPTDAEKGGFGVFAGKKEQD
>SEQ ID NO: 7 [NadA] MSMKHFPSKVLTTAILATFCSGALAATSDDDVKKAATVAIVAAYNNGQEINGFKAGETIYDIGEDGTITQKDATAADVEA DDFKGLGLKKVVTNLTKTVNENKQNVDAKVKAAESEIEKLTTKLADTDAALADTDAALDETTNALNKLGENITTFAEET KTNIVKIDEKLEAVADTVDKHAEAFNDIADSLDETNTKADEAVKTANEAKQTAEETKQNVDAKVKAAETAAGKAEAAA GTANTAADKAEAVAAKVTDIKADIATNKADIAKNSARIDSLDKNVANLRKETRQGLAEQAALSGLFQPYNVGRFNVTAA VGGYKSESAVAIGTGFRFTENFAAKAGVAVGTSSGSSAAYHVGVNYEW
>SEQ ID NO: 8 [NspA] MKKALATLIALALPAAALAEGASGFYVQADAAHAKASSSLGSAKGFSPRISAGYRINDLRFAVDYTRYKNYKAPSTDFK LYSIGASAIYDFDTQSPVKPYLGARLSLNRASVDLGGSDSFSQTSIGLGVLTGVSYAVTPNVDLDAGYRYNYIGKVNTV KNVRSGELSAGVRVKF
>SEQ ID NO: 9 [HmbR] MKPLQMLPIAALVGSIFGNPVLAADEAATETTPVKAEIKAVRVKGQRNAPAAVERVNLNRIKQEMIRDNKDLVRYSTDV GLSDSGRHQKGFAVRGVEGNRVGVSIDGVNLPDSEENSLYARYGNFNSSRLSIDPELVRNIEIVKGADSFNTGSGAL GGGVNYQTLQGRDLLLDDRQFGVMMKNGYSTRNREWTNTLGFGVSNDRVDAALLYSQRRGHETESAGNRGYAVE GEGSGANIRGSARGIPDSSKHKYNHHALGKIAYQINDNHRIGASLNGQQGHNYTVEESYNLTASSWREADDVNRRRN ANLFYEWMPDSNWLSSLKADFDYQKTKVAAVNNKGSFPMDYSTWTRNYNQKDLDEIYNRSMDTRFKRFTLRLDSHP LQLGGGRHRLSFKTFVSRRDFENLNRDDYYFSGRVVRTTSSIQHPVKTTNYGFSLSDQIQWNDVFSSRAGIRYDHTK
MTPQELNAECHACDKTPPAANTYKGWSGFVGLAAQLNQAWRVGYDITSGYRVPNASEVYFTYNHGSGNWLPNPNL KAERSTTHTLSLQGRSEKGMLDANLYQSNYRNFLSEEQKLTTSGTPGCTEENAYYGICSDPYKEKLDWQMKNIDKAR IRGIELTGRLNVDKVASFVPEGWKLFGSLGYAKSKLSGDNSLLSTQPLKVIAGIDYESPSEKWGVFSRLTYLGAKKVKD AQYTVYENKGWGTPLQKKVKDYPWLNKSAYVFDMYGFYKPAKNLTLRAGVYNLFNRKYTTWDSLRGLYSYSTTNAV DRDGKGLDRYRAPGRNYAVSLEWKF
>SEQ ID NO: 10 [NhhA] MNKIYRIIWNSALNAWVVVSELTRNHTKRASATVKTAVLATLLFATVQASANNEEQEEDLYLDPVQRTVAVLIVNSDKE GTGEKEKVEENSDWAVYFNEKGVLTAREITLKAGDNLKIKQNGTNFTYSLKKDLTDLTSVGTEKLSFSANGNKVNITS DTKGLNFAKETAGTNGDTTVHLNGIGSTLTDTLLNTGATTNVTNDNVTDDEKKRAASVKDVLNAGWNIKGVKPGTTAS DNVDFVRTYDTVEFLSADTKTTTVNVESKDNGKKTEVKIGAKTSVIKEKDGKLVTGKDKGENGSSTDEGEGLVTAKEV IDAVNKAGWRMKTTTANGQTGQADKFETVTSGTNVTFASGKGTTATVSKDDQGNITVMYDVNVGDALNVNQLQNSG WNLDSKAVAGSSGKVISGNVSPSKGKMDETVNINAGNNIEITRNGKNIDIATSMTPQFSSVSLGAGADAPTLSVDGDA LNVGSKKDNKPVRITNVAPGVKEGDVTNVAQLKGVAQNLNNRIDNVDGNARAGIAQAIATAGLVQAYLPGKSMMAIG GGTYRGEAGYAIGYSSISDGGNWIIKGTASGNSRGHFGASASVGYQW
>SEQ ID NO: 11 [App] MKTTDKRTTETHRKAPKTGRIRFSPAYLAICLSFGILPQAWAGHTYFGINYQYYRDFAENKGKFAVGAKDIEVYNKKGE LVGKSMTKAPMIDFSVVSRNGVAALVGDQYIVSVAHNGGYNNVDFGAEGRNPDQHRFTYKIVKRNNYKAGTKGHPY GGDYHMPRLHKFVTDAEPVEMTSYMDGRKYIDQNNYPDRVRIGAGRQYWRSDEDEPNNRESSYHIASAYSWLVGG NTFAQNGSGGGTVNLGSEKIKHSPYGFLPTGGSFGDSGSPMFIYDAQKQKWLINGVLQTGNPYIGKSNGFQLVRKD WFYDEIFAGDTHSVFYEPRQNGKYSFNDDNNGTGKINAKHEHNSLPNRLKTRTVQLFNVSLSETAREPVYHAAGGVN SYRPRLNNGENISFIDEGKGELILTSNINQGAGGLYFQGDFTVSPENNETWQGAGVHISEDSTVTWKVNGVANDRLS KIGKGTLHVQAKGENQGSISVGDGTVILDQQADDKGKKQAFSEIGLVSGRGTVQLNADNQFNPDKLYFGFRGGRLDL NGHSLSFHRIQNTDEGAMIVNHNQDKESTVTITGNKDIATTGNNNSLDSKKEIAYNGWFGEKDTTKTNGRLNLVYQPA AEDRTLLLSGGTNLNGNITQTNGKLFFSGRPTPHAYNHLNDHWSQKEGIPRGEIVWDNDWINRTFKAENFQIKGGQA VVSRNVAKVKGDWHLSNHAQAVFGVAPHQSHTICTRSDWTGLTNCVEKTITDDKVIASLTKTDISGNVDLADHAHLNL TGLATLNGNLSANGDTRYTVSHNATQNGNLSLVGNAQATFNQATLNGNTSASGNASFNLSDHAVQNGSLTLSGNAK ANVSHSALNGNVSLADKAVFHFESSRFTGQISGGKDTALHLKDSEWTLPSGTELGNLNLDNATITLNSAYRHDAAGA QTGSATDAPRRRSRRSRRSLLSVTPPTSVESRFNTLTVNGKLNGQGTFRFMSELFGYRSDKLKLAESSEGTYTLAVN NTGNEPASLEQLTVVEGKDNKPLSENLNFTLQNEHVDAGAWRYQLIRKDGEFRLHNPVKEQELSDKLGKAEAKKQAE KDNAQSLDALIAAGRDAVEKTESVAEPARQAGGENVGIMQAEEEKKRVQADKDTALAKQREAETRPATTAFPRARRA RRDLPQLQPQPQPQPQRDLISRYANSGLSEFSATLNSVFAVQDELDRVFAEDRRNAVWTSGIRDTKHYRSQDFRAY RQQTDLRQIGMQKNLGSGRVGILFSHNRTENTFDDGIGNSARLAHGAVFGQYGIDRFYIGISAGAGFSSGSLSDGIGG KIRRRVLHYGIQARYRAGFGGFGIEPHIGATRYFVQKADYRYENVNIATPGLAFNRYRAGIKADYSFKPAQHISITPYLS LSYTDAASGKVRTRVNTAVLAQDFGKTRSAEWGVNAEIKGFTLSLHAAAAKGPQLEAQHSAGIKLGYRW
>SEQ ID NO: 12 [Omp85] MKLKQIASALMMLGISPLALADFTIQDIRVEGLQRTEPSTVFNYLPVKVGDTYNDTHGSAIIKSLYATGFFDDVRVETAD GQLLLTVIERPTIGSLNITGAKMLQNDAIKKNLESFGLAQSQYFNQATLNQAVAGLKEEYLGRGKLNIQITPKVTKLARN RVDIDITIDEGKSAKITDIEFEGNQVYSDRKLMRQMSLTEGGIWTWLTRSNQFNEQKFAQDMEKVTDFYQNNGYFDFR ILDTDIQTNEDKTKQTIKITVHEGGRFRWGKVSIEGDTNEVPKAELEKLLTMKPGKWYERQQMTAVLGEIQNRMGSAG YAYSEISVQPLPNAETKTVDFVLHIEPGRKIYVNEIHITGNNKTRDEVVRRELRQMESAPYDTSKLQRSKERVELLGYF DNVQFDAVPLAGTPDKVDLNMSLTERSTGSLDLSAGWVQDTGLVMSAGVSQDNLFGTGKSAALRASRSKTTLNGSL SFTDPYFTADGVSLGYDVYGKAFDPRKASTSIKQYKTTTAGAGIRMSVPVTEYDRVNFGLVAEHLTVNTYNKAPKHYA DFIKKYGKTDGTDGSFKGWLYKGTVGWGRNKTDSALWPTRGYLTGVNAEIALPGSKLQYYSATHNQTWFFPLSKTF TLMLGGEVGIAGGYGRTKEIPFFENFYGGGLGSVRGYESGTLGPKVYDEYGEKISYGGNKKANVSAELLFPMPGAKD ARTVRLSLFADAGSVWDGKTYDDNSSSATGGRVQNIYGAGNTHKSTFTNELRYSAGGAVTWLSPLGPMKFSYAYPL KKKPEDEIQRFQFQLGTTF
>SEQ ID NO: 13 [NMB2091] MVSAVIGSAAVGAKSAVDRRTTGAQTDDNVMALRIETTARSYLRQNNQTKGYTPQISVVGYDRHLLLLGQVATEGEK QFVGQIARSEQAAEGVYNYITVASLPRTAGDIAGDTWNTSKVRATLLGISPATRARVKIVTYGNVTYVMGILTPEEQAQI TQKVSTTVGVQKVITLYQNYVQR
>SEQ ID NO: 14 [fusión NHBA] MASPDVKSADTLSKPAAPVVSEKETEAKEDAPQAGSQGQGAPSAQGGQDMAAVSEENTGNGGAAATDKPKNEDE GAQNDMPQNAADTDSLTPNHTPASNMPAGNMENQAPDAGESEQPANQPDMANTADGMQGDDPSAGGENAGNTA AQGTNQAENNQTAGSQNPASSTNPSATNSGGDFGRTNVGNSVVIDGPSQNITLTHCKGDSCSGNNFLDEEVQLKSE FEKLSDADKISNYKKDGKNDGKNDKFVGLVADSVQMKGINQYIIFYKPKPTSFARFRRSARSRRSLPAEMPLIPVNQA DTLIVDGEAVSLTGHSGNIFAPEGNYRYLTYGAEKLPGGSYALRVQGEPSKGEMLAGTAVYNGEVLHFHTENGRPSP SRGRFAAKVDFGSKSVDGIIDSGDGLHMGTQKFKAAIDGNGFKGTWTENGGGDVSGKFYGPAGEEVAGKYSYRPTD AEKGGFGVFAGKKEQDGSGGGGATYKVDEYHANARFAIDHFNTSTNVGGFYGLTGSVEFDQAKRDGKIDITIPVANL
QSGSQHFTDHLKSADIFDAAQYPDIRFVSTKFNFNGKKLVSVDGNLTMHGKTAPVKLKAEKFNCYQSPMAKTEVCGG DFSTTIDRTKWGVDYLVNVGMTKSVRIDIQIEAAKQ
>SEQ ID NO: 15 [fragmento NadA] ATNDDDVKKAATVAIAAAYNNGQEINGFKAGETIYDIDEDGTITKKDATAADVEADDFKGLGLKKVVTNLTKTVNENKQ NVDAKVKAAESEIEKLTTKLADTDAALADTDAALDATTNALNKLGENITTFAEETKTNIVKIDEKLEAVADTVDKHAEAFN DIADSLDETNTKADEAVKTANEAKQTAEETKQNVDAKVKAAETAAGKAEAAAGTANTAADKAEAVAAKVTDIKADIAT NKDN AKKANSADVYTREESDSKFVR DGLNATTEKLDTRLASAEKS ADHDTRLNGLDKTVSDLRKETRQGLAEQAAL SGLFQPYNVG
>SEQ ID NO: 16 [MC58, A G] VAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVD GQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDA GGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVK TVNGIRHIGLAAKQ
>SEQ ID NO: 17 [M1239, AG] VAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIE VDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDP NGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVK IGEKVHEIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 18 [MUTANTE No. 1] MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGN GDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHT AFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEE KGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVRHIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 19 [MUTANTE No. 2] MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGN GDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHT AFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEE KGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVRHIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 20 [MUTANTE No. 3] MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGN GDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFRVSGLGGEHT AFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEE KGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 21 [MUTANTE No. 4]
MNRTAFCCLSLTAAL I LTACSSGGGGVAAD I GAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGN GDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFRVSGLGGEHT AFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEE KGTYHLALFGDRAQE AGSATVK GEKVHE G AGKQ
>SEQ ID NO: 22 [MUTANTE No. 5] MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGN GDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVGDLGGEHT AFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEE KGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 23 [MUTANTE No. 6] MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGN GDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVTALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVGDLGGEHT AFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEE KGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 24 [MUTANTE No. 7]
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGN GDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKSDSLINQRSFLVSGLGGEHT AFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEE KGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 25 [MUTANTE No. 8]
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSCRKNEKCKLAAQGAEKTYGN GDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHT AFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEE KGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 26 [MUTANTE No. 9]
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKCAAQGAEKTYGN GDSLNTGKLKNDKVSRCDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHT AFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEE KGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 27 [MUTANTE No. 10]
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGN GDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSCLVSGLGGEHT AFNQLPDGKAEYHGKAFSCDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEE KGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 28 [MUTANTE No. 11]
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGN GDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVTALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVGDLGGEHT AFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEE KGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVRHIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 29 [MUTANTE No. 12]
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGN GDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFRIGDIAGEHTA FNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEK GTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 30 [MUTANTE No. 13]
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGN GDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVTALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTA FNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEK GTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 31 [MUTANT #14]
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKCAAQGAEKTYGN GDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHT AFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEE KGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 32 [MUTANTE No. 5]
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGN GDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSCLVSGLGGEHT AFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEE KGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 33 [MUTANTE No. 9]
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGN GDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVTGLGGEHTA FNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEK GTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 34 [MUTANTE No. 20]
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGN GDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFRVTGLGGEHT AFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEE KGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 35 [MUTANTE No. 21]
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGN GDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVGGLGGEHT AFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEE KGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 36 [MUTANTE No. 22]
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGN GDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFRVGGLGGEHT AFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEE KGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 37
GPDSDRLQQRR
>SEQ ID NO: 38
GSKDISS
>SEQ ID NO: 39
GSKDISSGGGG
>SEQ ID NO: 40 [M1239, madura]
CSSGGGGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLK NDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGKA EYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFG DRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 41 [v3(M1239), E243A, AG]
VAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIE VDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDP NGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVK IGEKVHAIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 42 [v3(M1239), S32V+E243A, AG]
VAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDV IPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIE VDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDP NGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVK IGEKVHAIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 43 [v3(M1239), S32V+L126R+E243A, AG]
VAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDV IPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIE VDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDP NGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVK IGEKVHAIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 44 [v3, S32V L126R, AG]
VAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDV IPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIE VDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDP NGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVK IGEKVHEIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 45 [v2 MUTANTE No. 3 S32V L123R, AG]
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQ V VRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVD GQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSF R VSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGK LTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGE KVHEIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 46 [MC58, v1, madura] CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRF DFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGT AFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQE VAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ
>SEQ ID NO: 47 [v2-v3-v-1 mutante de fusión]
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQ V VRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVD GQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSF R VSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGK LTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGE KVHEIGIAGKQGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLED V IPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNT GKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSF R VSGLGGEHTAFNQLP GGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHL ALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQGSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSV S KNEKLKLA AQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKR QFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRH AVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ
>SEQ ID NO: 48 [v2-v3-v-1 mutante de fusión, con líder] MGPDSDRLQQRRVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKND KVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEY HGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDR AQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDVIPQNGTLTLSAQGAEK TFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFRVS GLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGD TRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQGSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLT LDQSVSKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQI QDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNV DLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ
>SEQ ID NO: 49 [MC58, AG, mutación ‘R41S’] VAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVSKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVD GQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDA GGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVK TVNGIRHIGLAAKQ
>SEQ ID NO: 50 [conector]
GSGGGG
>SEQ ID NO: 51 [secuencia v2 de tipo s i lv e s tre , p o r e je m p lo , para la estrategia MGAM] VAADIGARLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVD GQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGK LTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGE KVHEIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 52 [secuencia v3 de tipo s i lv e s tre , p o r e je m p lo , para la estrategia MGAM] VAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVD GKLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQDSEDSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPKGGSATYRGTAFGSDDA GGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVELATAELKADEKSHAVILGDTRYGGEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVK IREKVHEIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 53 [m1239, mutación L126R] VAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIE VDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDP
NGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVK IGEKVHEIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 54 [v2, cepa 8047, de tipo silvestre]
MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGARLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGN GDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHT AFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEE KGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 55 [v2, cepa 8047, AG]
VAADIGARLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVD GQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGK LTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGE KVHEIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 56[v2, mutante ‘E313A’, AG]
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVD GQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGK LTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGE KVHAIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 57[v2, mutante No. 3 ‘E313A’, AG]
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVD GQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGK LTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGE KVHAIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 58 [MUTANTE No. 2 No. 12]
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVD GQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFRIGDIAGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKL TYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEK VHEIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 59 [v2, cepa 8047, mutante No. 4, madura]
CSSGGGGVAADIGARLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFD FIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFS SDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAG SATVKIGEKVHEIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 60 [v2, cepa 8047, mutante No. 3, madura]
CSSGGGGVAADIGARLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFD FIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFS SDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAG SATVKIGEKVHEIGIAGKQ
>SEQ ID NO: 61 [v3, mutante No. 2 No. 12, AG]
VAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDV IPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIE VDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFRIGDIAGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPN GRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKI GEKVHEIGIAGKQ.
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TABLA 1
Claims (10)
- R E IV IN D IC A C IO N E S1. Un mutante fHbp v3 o v2 que es:(A) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos mutante fHbp v2, en la que:(i) la secuencia de aminoácidos tiene al menos el 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 5 y/o comprende un fragmento de SEQ ID NO: 5 que tiene al menos 7 aminoácidos de longitud e incluye un residuo correspondiente al residuo 32 de la SEQ ID NO: 5, pero(ii) la secuencia de aminoácidos difiere de la SEQ ID NO: 5 en el residuo 32 por la ssutitución S32Ven el que el polipéptido puede provocar anticuerpos que pueden reconocer un polipéptido meningocócico de tipo salvaje que consta de SEQ ID NO. 4o(B) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos mutante fHbp v3, en el que:(i) la secuencia de aminoácidos tiene al menos el 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 17 y/o comprende un fragmento de SEQ ID NO: 17 que es al menos 7 aminoácidos de longitud e incluye un residuo correspondiente al residuo 32 de SEQ ID NO: 17, pero(ii) la secuencia de aminoácidos difiere de la SEQ ID NO: 17 en el residuo 32, por la sustitución S32V.en el que el polipéptido puede provocar anticuerpos que pueden reconocer un polipéptido meningocócico de tipo salvaje que consta de SEQ ID NO.40.
- 2. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que:(A) la secuencia de aminoácidos difiere además de la SEQ ID NO: 5 por sustitución en uno o más de L123, V124, S125, G126, L127, G128por ejemplo, en la que la(s) sustitución(ones) se selecciona(n) del grupo que consiste en: L123R; V124I; S125G o S125T; G126D; L127I; G128A; o(B) la secuencia de aminoácidos además difiere de la SEQ ID NO: 17 por sustitución en L126 donde la sustitución es L126R.
- 3. El polipéptido de cualquier reivindicación precedente, incluyendo además una o más mutaciones que interrumpir (s) la capacidad del polipéptido para unirse a factor H humano; por ejemplo, en v2 incluyendo una sustitución en uno o más de los residuos R73, D203, E210, G228, S121, F122, A192, E194, V199, I200, L201, T213, H215, F219, T231, y E240, o en v3 incluyendo una sustitución en uno o más de los residuos de Q35, I178, L87, A88, V127, V202, E213, T216, H218, T234, V241, E243, y G248.
- 4. Un polipéptido que comprende:(i) una secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 45, opcionalmente con 1, 2, 3, 4, o 5 sustituciones de aminoácidos individuales, deleciones y/o inserciones, en la que el polipéptido puede generar anticuerpos que se unen a un polipéptido fHbp meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 (por ejemplo, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 con 1, 2, o 3 sustituciones individuales de aminoácidos), pero no mutado en los residuos V32 ni R123; y/o(ii) una secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 44, opcionalmente con 1, 2, 3, 4, o 5 sustituciones de aminoácidos individuales, deleciones y/o inserciones, en la que el polipéptido puede generar anticuerpos que se unen a un polipéptido fHbp meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40 (por ejemplo, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 con 1, 2, o 3 sustituciones individuales de aminoácidos), pero no mutada en los residuos V32 ni R126.
- 5. El polipéptido de acuerdo a la reivindicación 4 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45.
- 6. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 4 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44
- 7. Un plásmido u otro ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
- 8. Una célula huésped transformada con el plásmido de la reivindicación 9; por ejemplo, en la que la célula es una bacteria meningocócica, como una bacteria meningocócica que tiene una regulación a la baja o eliminado (knockout) mltA y también opcionalmente tiene una regulación a la baja o eliminado (knockout): (i) al menos un gen implicado en hacer tóxica la parte de lípido A de LPS, particularmente de lpxl1; y/o (ii) al menos un gen implicado en la síntesis o en la exportación del polisacárido capsular, particularmente de synXy/o ctrA..
- 9. Las vesículas de membrana preparadas a partir de la célula huésped de la reivindicación 8, en la que las vesículas se componen de un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
- 10. Una composición inmunógena que comprende un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o una vesícula de la reivindicación 9.11. La composición de la reivindicación 10, que comprende además un segundo polipéptido que, cuando se administra a un mamífero, provoca una respuesta de anticuerpos que es bactericida contra el meningococo.12. La composición de la reivindicación 10 o la reivindicación 11, que comprende además (i) un sacárido capsular conjugado de N. meningitidis serogrupo A, C, W135 y/o Y y/o (ii) un sacárido capsular conjugado de S. pneumoniae.13. La composición inmunogénica de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 para su uso en un método para generar una respuesta de anticuerpos en un mamífero.
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