ES2840750T3

ES2840750T3 - Métodos y composiciones para generar una respuesta inmune induciendo CD40 y adaptadores del receptor de reconocimiento de patrones

Info

Publication number: ES2840750T3
Application number: ES17169050T
Authority: ES
Inventors: David Spencer; Narayanan Priyadharshini
Original assignee: Baylor College of Medicine
Current assignee: Baylor College of Medicine
Priority date: 2008-09-22
Filing date: 2009-09-21
Publication date: 2021-07-07
Anticipated expiration: 2029-09-21
Also published as: DK2331680T3; US9976122B2; JP2015129192A; US20150111294A1; US20170002321A1; JP2014168479A; US20210009655A1; ES2633470T3; JP2018184471A; AU2009292996A1; CA2738031C; EP3238739B1; US20140087468A1; JP6133538B2; JP2012503019A; CA2738031A1; EP2331680A1; EP2331680A4; EP2331680B1; JP2017114911A

Abstract

Una composición que comprende un ácido nucleico, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína quimérica, o una célula transfectada o transducida con el ácido nucleico, en donde la proteína quimérica comprende (i) una región de direccionamiento a membrana, (ii) una región de unión al ligando FKBP, y (iii) un péptido MyD88 truncado que carece del dominio TIR.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones para generar una respuesta inmune induciendo CD40 y adaptadores del receptor de reconocimiento de patrones

Solicitudes de patente relacionadas

Se reivindica prioridad a la solicitud provisional de EE. UU. número de serie 61/181.562, presentada el 27 de mayo de 2009 y titulada “ Methods and Compositions for Generating an Immune Response by Inducing CD40 and Pattern Recognition Receptor Adapters;” , a la solicitud provisional de EE. UU. número de serie 61/153.562, presentada el 18 de febrero de 2009, y titulada “ Methods and Compositions for Generating an Immune Response by Inducing CD40 and Pattern Recognition Receptor Adapters” y a la solicitud provisional de los EE. UU. número de serie 61/099.163, presentada el 22 de septiembre de 2008, y titulada “ Methods and Compositions for Generating an Immune Response by Inducing CD40 and Pattern Recognition Receptor Adapters” .

Campo de la invención

La presente invención está definida por las reivindicaciones. La presente descripción se refiere, generalmente, al campo de la inmunología, y en particular, a métodos y composiciones para activar células presentadoras de antígenos y para inducir respuestas inmunes.

Declaración de investigación de patrocinado federal

Esta invención se realizó con apoyo gubernamental bajo el número de subvención NIH R01-CA120411. El gobierno puede tener determinados derechos sobre esta invención.

Antecedentes

Debido a su método único de procesamiento y presentación de antígenos y el potencial para la expresión de alto nivel de moléculas coestimuladoras y de citoquinas, las dendritic cells (células dendríticas - DC) son antigenpresenting cells (células presentadoras de antígenos - APDC) eficaces para el cebado y la activación de células T sin tratamiento previo (Banchereau J, Paczesny S, Blanco P y col. Dendritic cells: controllers of the immune system and a new promise for immunotherapy [células dendríticas: controladores del sistema inmunológico y una nueva promesa para la inmunoterapia]. Ann N Y Acad Sci. 2003; 987: 180-187). Esta propiedad ha llevado a su uso extendido como plataforma celular para la vacunación en un número de ensayos clínicos con resultados alentadores (O'Neill DW, Adams S, Bhardwaj N. Manipulating dendritic cell biology for the active immunotherapy of cancer [manipulación de la biología de células dendríticas para la inmunoterapia activa del cáncer]. Blood. 2004; 104: 2235 2246; Rosenberg SA. A new era for cancer immunotherapy based on the genes that encode cancer antigens [una nueva era para la inmunoterapia del cáncer basada en los genes que codifican los antígenos del cáncer]. Immunity.

1999; 10: 281-287). Sin embargo, la eficacia clínica de las vacunas de DC en pacientes con cáncer ha sido insatisfactoria, probablemente debido a una serie de deficiencias claves, que incluyen la activación subóptima, la migración limitada a los nódulos linfáticos de drenaje y un lapso de vida insuficiente para la activación óptima de células T en el entorno de los nódulos linfáticos.

Un parámetro en la optimización de vacunas contra el cáncer basadas en DC es la interacción de las DC con células efectoras inmunológicas, tales como las células T CD4+, CD8+ y las células T reguladoras (Treg). En estas interacciones, el estado de maduración de las DC es un factor clave para determinar las funciones efectoras resultantes (Steinman RM, Hawiger D, Nussenzweig MC. Tolerogenic dendritic cells [células dendríticas tolerogénicas]. Annu Rev Immunol. 2003; 21: 685-711). Para maximizar el cebado de las células T CD4+ y CD8+ minimizando la expansión de Treg, las DC deben estar completamente maduras, expresar altos niveles de moléculas coestimuladoras (como CD40, CD80 y CD86) y citoquinas proinflamatorias, como IL-12p70 e IL-6. Igualmente importante, las DC deben poder migrar de manera eficiente desde el sitio de vacunación a los nódulos linfáticos de drenaje para iniciar interacciones de células T (Vieweg J, Jackson A. Modulation of antitumor responses by dendritic cells [modulación de respuestas antitumorales por células dendríticas]. Springer Semin Immunopathol. 2005; 26: 329-341).

Para la maduración ex vivo de DC inmaduras derivadas de monocitos, la mayoría de los ensayos basados en DC han utilizado un cóctel de maturation cytokine (citoquinas de maduración - MC) estándar, que comprende TNF-alfa, IL-1beta, IL-6 y PGE2. La función principal de la prostaglandina E2 (PGE2) en el cóctel de maduración estándar es sensibilizar el receptor de quimioquinas CC 7 (CCR7) a sus ligandos, el ligando de quimioquinas CC 19 (CCL19) y CCL21 y, por lo tanto, mejorar la capacidad migratoria de las DC a los nódulos linfáticos de drenaje (Scandella E, Men Y, Gillessen S, Forster R, Groettrup M. Prostaglandin E2 is a key factor for CCR7 Surface expression and migration of monocyte- derived dendritic cells [la prostaglandina E2 es un factor clave para la expresión de superficie de CCR7 y la migración de células dendríticas derivadas de monocitos]. Blood. 2002; 100: 1354-1361; Luft T, Jefford M, Luetjens P, y col. Functionally distinct dendritic cell (DC) populations induced by physiologic stimuli: prostaglandin E(2) regulates the migratory capacity of specific DC subsets [poblaciones de dendritic cell (células dendríticas - DC) funcionalmente distintas inducidas por estímulos fisiológicos: la prostaglandina E(2) regula la capacidad migratoria de subconjuntos de DC específicos]. Blood. 2002; 100: 1362-1372). Sin embargo, también se ha informado que la PGE2 tiene numerosas propiedades que son potencialmente perjudiciales para la estimulación de una respuesta inmune, incluida la supresión de la proliferación de células T (Goodwin JS, Bankhurst AD, Messner RP. Suppression of human T-cell mitogenesis by prostaglandin. Existence of a prostaglandin-producing suppressor cell [supresión de la mitogénesis de la célula T humana por prostaglandina. Existencia de una célula supresora productora de prostaglandina]. J Exp Med. 1977; 146: 1719-1734; Goodwin JS. Immunomodulation by eicosanoids and antiinflammatory drugs [inmunomodulación por eicosanoides y fármacos antiinflamatorios]. CurrOpin Immunol. 1989; 2: 264-268), la inhibición de la producción de citoquina proinflamatoria (p. ej., IL 12p70 y TNF alfa [Kalinski P, Vieira PL, Schuitemaker JH, de Jong EC, Kapsenberg ML. Prostaglandin E(2) is a selective inducer of interleukin-12 p40 (IL-12p40) production and an inhibitor of bioactive IL-12p70 heterodimer (la prostaglandina E(2) es un inductor selectivo de la producción de interleucina-12 p40 (IL-12p40) y un inhibidor del heterodímero de IL-12p70 bioactivo). Blood.

2001; 97: 3466-3469; van der Pouw Kraan TC, Boeije LC, Smeenk RJ, Wijdenes J, Aarden LA. Prostaglandin-E2 is a potent inhibitor of human interleukin 12 production (la prostaglandina-E2 es un potente inhibidor de la producción de interleucina 12 humana). J Exp Med. 1995; 181: 775-779]), y la regulación negativa de la expresión superficial del major histocompatibility complex (complejo principal de histocompatibilidad - MHC) II (Snyder DS, Beller DI, Unanue ER. Prostaglandins modulate macrophage la expression [las prostaglandinas modulan la expresión de los macrófagos Ia]. Nature. 1982; 299: 163-165). Por lo tanto, es probable que los protocolos de maduración que pueden evitar la PGE2 mientras promueven la migración mejoren la eficacia terapéutica de las vacunas basadas en DC.

Un sistema de activación de DC basado en el control temporal dirigido de la vía de señalización de CD40 se ha desarrollado para ampliar el estado proestimulador de las DC dentro de los tejidos linfoides. La funcionalidad de DC se mejoró al aumentar tanto la amplitud como la duración de la señalización de CD40 (Hanks BA, Jiang J, Singh RA, y col. Re-engineered CD40 receptor enables potent pharmacological activation of dendritic-cell cancer vaccines in vivo [el receptor CD40 rediseñado permite una potente activación farmacológica de vacunas de cáncer de células dendríticas in vivo]. Nat Med. 2005; 11:130-137). Para lograrlo, el receptor CD40 se rediseñó de modo que el dominio citoplasmático de CD40 se fusionara con dominios de unión al ligando sintéticos junto con una secuencia de direccionamiento a la membrana. La administración de un fármaco dimerizador permeable a los lípidos, AP20187 (AP), llamado chemical inducer of dimerization (inductor químico de dimerización - CID) (Spencer d M, Wandless TJ, Schreiber SL, Crabtree GR. Controlling signal transduction with synthetic ligands [control de la transducción de señales con ligandos sintéticos]. Science. 1993: 262:1019-1024), condujo a la inducción in vivo de cascadas de señalización dependientes de CD40 en DC murinas. Esta estrategia de inducción mejoró significativamente la inmunogenicidad contra antígenos definidos y contra tumores in vivo más allá de la alcanzada con otras modalidades de activación (Hanks BA, y col., Nat Med. 2005; 11: 130-137). La robusta potencia de este CD40 inducible por ligando quimérico (llamado iCD40) en ratones sugirió que este método también podría mejorar la potencia de las vacunas de DC humanas. Lapteva y col. (“ Development of Novel CD4-independent iCD40-Dendritic Cell Vaccine for HIV-1 Immunotherapy” [“el desarrollo de novedosas vacunas de células dendríticas iCD40 independientes de CD4 para inmunoterapia contra el VIH-1 ” ]), Molecular Therapy, vol. 17, no.Suppl. 1, 1 de mayo de 2009) describe un receptor dimerizado de CD40 (iCD40) inducible por fármacos diseñado por ingeniería que permite la activación específica de DC controlada temporalmente, que incluye la combinación de iCD40 con una molécula de MyD88 inducible por fármacos dimerizada.

La señalización del Pattern recognition receptor (Receptor de reconocimiento de patrones - PRR), un ejemplo del cual es la señalización del Toll-like receptor (Receptor tipo Toll - TLR), también desempeña un papel crítico en la inducción de la maduración y activación de DC; las DC humanas expresan múltiples TLR distintos (Kadowaki N, Ho S, Antonenko S, y col. Subsets of human dendritic cell precursors express different toll-like receptors and respond to different microbial antigens [los subconjuntos de precursores de células dendríticas humanas expresan diferentes receptores tipo toll y responden a diferentes antígenos microbianos]. J Exp Med. 2001; 194: 863-869). Los once TLR de mamíferos responden a diversas macromoléculas derivadas de patógenos, lo que contribuye a la activación de respuestas inmunes innatas junto con el inicio de la inmunidad adaptativa. El lipopolisacárido (LPS) y un derivado clínicamente relevante, el monophosphoryl lipid (monofosforil lípido - MPL) A, se unen a los complejos TLR-4 de la superficie celular (Kadowaki N, Ho S, Antonenko S y col. Subsets of human dendritic cell precursors express different toll-like receptors and respond to different microbial antigens [los subconjuntos de precursores de células dendríticas humanas expresan diferentes receptores tipo toll y responden a diferentes antígenos microbianos]. J Exp Med. 2001; 194:863-869), lo que conduce a diversas vías de señalización que culminan en la inducción de factores de transcripción, tales como NF kappaB e IRF3, junto con las mitogenactivated protein kinases (proteína quinasas activadas por mitógeno - MAPK) p38 y las c-Jun kinase (Jun quinasa - JNK) (Ardeshna KM, Pizzey AR, Devereux S, Khwaja A. The PI3 kinase, p38 SAP kinase, and NF-kappaB signal transduction pathways are involved in the survival and maturation of lipopolysaccharide-stimulated human monocyte-derived dendritic cells [la PI3 quinasa, p38 SAP quinasa y las vías de transducción de señal NF-kappaB están implicadas en la supervivencia y la maduración de células dendríticas derivadas de monocitos humanos estimuladas por lipopolisacáridos]. Blood. 2000; 96: 1039-1046; Ismaili J, Rennesson J, Aksoy E y col. Monophosphoryl lipid A activates both human dendritic cells and T cells [el monofosforil lípido A activa tanto las células dendríticas humanas como las células T]. J Immunol. 2002; 168: 926-932). Durante este proceso, las DC maduran y regulan parcialmente positivamente las citoquinas proinflamatorias, como IL-6, IL-12 e interferones de tipo I (Rescigno M, Martino M, Sutherland CL, Gold MR, Ricciardi-Castagnoli P. Dendritic cell survival and maturation are regulated by different signaling pathways [la supervivencia y maduración de las células dendríticas están reguladas por vías de señalización diferentes]. J Exp Med. 1998; 188: 2175-2180). Se ha demostrado que la maduración inducida por LPS mejora la capacidad de las DC para estimular las respuestas de células T específicas de antígeno in vitro e in vivo (Lapointe R, Toso JF, Butts C, Young HA, Hwu P. Human dendritic cells require multiple activation signals for the efficient generation of tumor antigen-specific T lymphocytes [las células dendríticas humanas requieren múltiples señales de activación para la generación eficiente de linfocitos T específicos de antígeno tumoral]. Eur J Immunol. 2000; 30: 3291-3298). Los métodos para activar una célula presentadora de antígeno, que comprenden la transducción de la célula con un ácido nucleico que codifica un péptido CD40, se han descrito en la patente US-7.404.950 y los métodos para activar una célula presentadora de antígeno, que comprenden la transducción de la célula con un ácido nucleico que codifica una proteína quimérica que incluye un péptido CD40 inducible y un Receptor de reconocimiento de patrones, u otras proteínas corriente abajo en la vía se han descrito en la solicitud de patente internacional n.° PCT/US2007/081963, presentada el 19 de octubre de 2007, publicada como el documento WO 2008/049113.

Sumario

La presente invención está definida por las reivindicaciones. En un primer aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende un ácido nucleico, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína quimérica o una célula transfectada o transducida con el ácido nucleico, en donde la proteína quimérica comprende (i) una región de direccionamiento a membrana, (ii) una región de unión al ligando FKBP, y (iii) un péptido MyD88 truncado que carece del dominio TIR. En un segundo aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende un ácido nucleico, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína quimérica o una célula transfectada o transducida con el ácido nucleico, en donde la proteína quimérica comprende (i) una región de unión al ligando FKBP, y (ii) un péptido MyD88 truncado que carece del dominio TIR. En un tercer aspecto, la invención se refiere a una composición según el primer o el segundo aspecto de la invención, para usar en el tratamiento de una afección hiperproliferativa en un sujeto al mejorar una respuesta inmune. En: un cuarto aspecto, la invención se refiere a un método para activar una célula presentadora de antígeno in vitro, que comprende poner en contacto una célula según el primer, segundo o tercer aspecto de la invención con un FK506 dimérico o un análogo dimérico de FK506 que se une al dominio de unión al ligando:

Un sistema CD40 inducible (iCD40) se ha aplicado a dendritic cells (células dendríticas -DC) humanas y se ha demostrado que la combinación de la señalización iCD40 con la ligadura del adaptador del Pattern recognition receptor (Receptor de reconocimiento de patrones - PRR) provoca una activación persistente y robusta de las DC humanas. Estas características forman la base de las inmunoterapias contra el cáncer para tratar cánceres tales como el cáncer de próstata avanzado resistente a las hormonas, por ejemplo. En consecuencia, se ha descubierto que la combinación de inducir CD40 y un adaptador PRR inducible activa sinérgicamente las células presentadoras de antígenos e induce una respuesta inmune contra un antígeno. Los adaptadores PRR inducibles incluyen, por ejemplo, MyD88 y TRIF; además, los Receptores de reconocimiento de patrones inducibles, tales como, por ejemplo, los receptores tipo NOD, por ejemplo, NOD1 o NOD2, y helicasas tipo RIG, por ejemplo, RIG-1 o Mda-5 se pueden usar junto con CD40 inducible. En la presente memoria se proporcionan métodos para activar células presentadoras de antígenos, que comprenden transducir una célula presentadora de antígeno con un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína quimérica, en donde la proteína quimérica comprende (i) una región de direccionamiento a membrana, (ii) una región de unión al ligando (iii) una región de polipéptido CD40 citoplásmica y (iv) un péptido seleccionado del grupo que consiste en un péptido MyD88 truncado que carece del dominio TIR y un péptido TRIF; y poner en contacto la célula presentadora de antígeno con un ligando multimérico no proteico que se une a la región de unión al ligando; donde se activa la célula presentadora de antígeno.

Por lo tanto, en la presente memoria se proporcionan métodos para activar una célula presentadora de antígeno, que comprenden transfectar o transducir una célula presentadora de antígeno con un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína quimérica, en donde la proteína quimérica comprende una región de direccionamiento a membrana, una región de unión al ligando, una región de polipéptido CD40 citoplasmática y un péptido seleccionado grupo que consiste en un péptido MyD88, un péptido MyD88 truncado que carece del dominio TIR, un péptido NOD2, un péptido RIG-1 y un péptido TRIF; y poner en contacto la célula presentadora de antígeno con un ligando multimérico no proteico que se une a la región de unión al ligando; donde se activa la célula presentadora de antígeno. La región de polipéptido CD40 citoplásmica de los métodos y composiciones puede, por ejemplo, tener una secuencia peptídica de la región citoplásmica de la Id. de sec. n.°: 2 y puede, por ejemplo, ser codificada por una secuencia de polinucleótidos que codifica una región de polipéptido citoplasmática en la Id. de sec. n. °: 1.

Además se proporcionan métodos del método para activar una célula presentadora de antígeno, que comprenden transfectar o transducir una célula presentadora de antígeno con un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína quimérica, en donde la proteína quimérica comprende una región de direccionamiento a membrana, una región de unión al ligando y un péptido MyD88 truncado que carece del dominio TIR; y poner en contacto la célula presentadora de antígeno con un ligando multimérico no proteico que se une a la región de unión al ligando; donde se activa la célula presentadora de antígeno. La proteína quimérica puede también comprender una región polipeptídica CD40.

Además se proporcionan composiciones que comprenden un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína quimérica, en donde la proteína quimérica comprende una región de direccionamiento a membrana, una región de unión al ligando, una región de polipéptido CD40 citoplásmica y un péptido seleccionado del grupo que consiste en un péptido MyD88, un péptido MyD88 truncado que carece del dominio TIR, un péptido NOD2, un péptido RIG-1 y un péptido TRIF.

Una célula presentadora de antígeno se “activa” cuando una o más actividades asociadas con las células presentadoras de antígenos activadas pueden ser observadas y/o medidas por el experto en la técnica. Por ejemplo, una célula presentadora de antígeno se activa cuando tras el contacto con un vector de expresión presentado en la presente memoria, una actividad asociada con la activación se puede medir en la célula en contacto con el vector de expresión en comparación con una célula presentadora de antígeno que no ha sido contactada con el vector de expresión, o se ha puesto en contacto con un vector de control negativo. En un ejemplo, la mayor actividad puede estar a un nivel de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez veces, o más, que el de la célula sin contacto, o la célula contactada con el control negativo. Por ejemplo, una de las siguientes actividades puede mejorarse en una célula presentadora de antígeno que ha sido puesta en contacto con el vector de expresión: la expresión de la molécula coestimuladora en la célula presentadora de antígeno, la translocación nuclear de NF-kappaB en células presentadoras de antígenos, expresión de marcadores de maduración de DC, tales como, por ejemplo, expresión del receptor tipo toll o expresión de CCR7, respuestas de linfocitos T citotóxicos específicos, tales como, por ejemplo, la actividad lítica específica dirigida contra células tumorales, o la expresión de citoquinas (por ejemplo, IL-2) o de quimioquinas. Los métodos para ensayar la activación de células presentadoras de antígenos se presentan en la presente memoria por ejemplo, en los ejemplos 11 17.

Una cantidad de una composición que activa células presentadoras de antígenos que “ mejora” una respuesta inmune se refiere a una cantidad en la que se observa una respuesta inmune que es mayor o se intensifica o desvía de alguna manera con la adición de la composición cuando se comparara con la misma respuesta inmune medida sin la adición de la composición. Por ejemplo, la actividad lítica de las células T citotóxicas se puede medir, por ejemplo, usando un ensayo de liberación de 51Cr, con y sin la composición. Se dice que la cantidad de la sustancia a la que se mejora la actividad lítica de CTL en comparación con la actividad lítica de CTL sin la composición es una cantidad suficiente para mejorar la respuesta inmune del animal al antígeno. Por ejemplo, la respuesta inmune se puede mejorar por un factor de al menos aproximadamente 2, o, por ejemplo, mediante un factor de aproximadamente 3 o más. La cantidad de citoquinas secretadas también puede alterarse.

La respuesta inmune mejorada puede ser una respuesta inmune activa o pasiva. Alternativamente, la respuesta puede ser parte de un enfoque de inmunoterapia adaptativa en el que las células presentadoras de antígenos se obtienen de un sujeto (p. ej., un paciente), después de ser transducidos o transfectados con una composición que comprende el vector de expresión o el constructo presentado en la presente memoria. Las células presentadoras de antígenos se pueden obtener, por ejemplo, de la sangre del sujeto o de la médula ósea del sujeto. Las células presentadoras de antígenos se pueden administrar después al mismo animal o a un animal diferente, o al mismo sujeto o a un sujeto diferente (p. ej., donantes iguales o diferentes). En determinados casos, el sujeto (por ejemplo, un paciente) tiene o se sospecha que tiene un cáncer, tal como por ejemplo, cáncer de próstata, o tiene o se sospecha que tiene una enfermedad infecciosa. En otros casos, el método para mejorar la respuesta inmune se practica junto con una terapia de cáncer conocida o cualquier terapia conocida para tratar la enfermedad infecciosa.

Las etapas de los métodos proporcionados se pueden realizar utilizando cualquier método adecuado conocido y seleccionado por el experto en la técnica, estos métodos incluyen, sin limitarse a, métodos de transducción, transformación o de cualquier otra manera proporcionar ácido nucleico a la célula presentadora de antígeno, presentados en la presente memoria. En algunos casos, el péptido MyD88 truncado está codificado por la secuencia de nucleótidos de la Id. de sec. n.°: 5 (con o sin enlazadores de a DN). En otros casos, el péptido es un péptido TRIF. A menudo, el péptido está codificado por la secuencia de nucleótidos de la Id. de sec. n.°: 9 (con o sin enlazadores de ADN). En algunos casos, la región de polipéptido citoplasmática CD40 está codificada por una secuencia de polinucleótidos en la Id. de sec. n.°: 1. En algunos casos de los métodos o composiciones, el péptido tiene una secuencia de péptido seleccionada del grupo que consiste en la Id. de sec. n.°: 6, la Id. de sec. n.°: 10, la Id. de sec. n.°: 12, la Id. de sec. n.°: 14 y la Id. de sec. n.°: 16 o en donde el péptido está codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la Id. de sec. n.°: 9, la Id. de sec. n.°: 11, la Id. de sec. n.°: 13, y la Id. de sec. n.°: 15. En determinadas realizaciones, el MyD88 truncado tiene la secuencia peptídica de la Id. de sec. n.°: 6, y, por ejemplo, puede estar codificado por la secuencia de nucleótidos de la Id. de sec. n.°: 5. A menudo, el ácido nucleico comprende una secuencia promotora unida operativamente a la secuencia polinucleotídica. En general, el término “unido operativamente” pretende indicar que la secuencia promotora está funcionalmente unida a una segunda secuencia, en donde la secuencia promotora inicia y media la transcripción del ADN correspondiente a la segunda secuencia.

Los expertos en la técnica pueden seleccionar una secuencia promotora apropiada, que incluye, sin limitarse a, una secuencia promotora descrita en la presente memoria.

Los expertos en la técnica pueden seleccionar cualquier región de direccionamiento a membrana conocida apropiada, incluyendo, sin limitarse a, una región de direccionamiento a miristoilación, región de direccionamiento a palmitoilación, región de prenilación o región transmembrana del receptor. A menudo, la región de direccionamiento a membrana es una región de direccionamiento a miristoilación.

En determinados casos, la región de unión al ligando se selecciona del grupo que consiste en la región de unión al ligando de FKBP, la región de unión al ligando del receptor de ciclofilina, la región de unión al ligando del receptor de esteroides, la región de unión al ligando de los receptores de ciclofilina y la región de unión al ligando del receptor de tetraciclina. A menudo, la región de unión al ligando comprende una secuencia Fv'Fvls. A veces, la secuencia Fv'Fvls comprende además una secuencia Fv’ adicional.

En algunos casos, el ligando es una molécula pequeña. Los expertos en la técnica pueden seleccionar el ligando apropiado para la región de unión al ligando seleccionada. A menudo, el ligando es dimérico, a veces, el ligando es un FK506 dimérico o un análogo dimérico de FK506. En determinadas realizaciones, el ligando es AP1903. En determinadas realizaciones, el ligando es AP20187.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico está contenido dentro de un vector viral. Los expertos en la técnica pueden seleccionar el vector viral apropiado. En determinados casos, el vector viral es un vector adenoviral. Se entiende que en algunos casos, la célula presentadora de antígeno se pone en contacto con el vector viral ex vivo, y en algunos casos, la célula presentadora de antígeno se pone en contacto con el vector viral in vivo.

En algunos casos, la célula presentadora de antígeno es una célula dendrítica, por ejemplo, una célula dendrítica de mamífero. A menudo, la célula presentadora de antígeno es una célula dendrítica humana.

En algunos casos, la célula presentadora de antígeno también se pone en contacto con un antígeno. A menudo, la célula presentadora de antígeno se pone en contacto con el antígeno ex vivo. A veces, la célula presentadora de antígeno se pone en contacto con el antígeno in vivo. En algunos casos, la célula presentadora de antígeno está en un sujeto y se genera una respuesta inmune contra el antígeno. A veces, la respuesta inmune es una respuesta inmune de cytotoxic T-lymphocyte (linfocitos T citotóxicos - CTL). A veces, la respuesta inmune se genera contra un antígeno tumoral. En determinados casos, la célula presentadora de antígeno se activa sin la adición de un adyuvante.

En algunos casos, la célula presentadora de antígeno se transduce con el ácido nucleico ex vivo y se administra al sujeto mediante administración intradérmica. En algunos casos, la célula presentadora de antígeno se transduce con el ácido nucleico ex vivo y se administra al sujeto mediante administración subcutánea. A veces, la célula presentadora de antígeno se transduce con el ácido nucleico ex vivo. A veces, la célula presentadora de antígeno se transduce con el ácido nucleico in vivo.

Además se proporciona un método para inducir una respuesta inmune de cytotoxic T lymphocyte (linfocitos T citotóxicos - CTL) contra un antígeno, que comprende: poner en contacto una célula presentadora de antígeno humana sensibilizada con un antígeno con: (a) una molécula multimérica que tiene dos o más regiones que se unen a y multimerizan CD40 nativo, y (b) un adaptador PRR inducible, por ejemplo, MyD88, MyD88 truncado o TRIF; donde se induce una respuesta inmune CTL contra el antígeno. Por MyD88 se entiende el gen 88 de respuesta primaria de diferenciación mieloide, por ejemplo, aunque no de forma limitativa, la versión humana, citado como ncbi Gene ID 4615. Por TRIF se entiende el interferón beta inductor del adaptador que contiene el dominio TIR. Por “truncado” se entiende que la proteína no es de longitud completa y puede carecer, por ejemplo, de un dominio. Por ejemplo, un MyD88 truncado no es de longitud completa y puede carecer, por ejemplo, del dominio TIR. Un ejemplo de un MyD88 truncado se indica en la presente memoria como MyD88L, y también se presenta como las Id. de sec. n.° 5 (secuencia de ácido nucleico) y 6 (secuencia de péptido). La Id. de sec. n.°: 5 incluye los enlazadores añadidos durante la subclonación. Los expertos en la técnica reconocen que por una secuencia de ácido nucleico que codifica el “ MyD88 truncado” se entiende la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido MyD88 truncado, el término también puede referirse a la secuencia de ácido nucleico que incluye la parte que codifica cualquier aminoácido añadido como un artefacto de clonación, incluidos los aminoácidos codificados por los enlazadores. En dichos métodos, la molécula multimérica puede ser un anticuerpo que se une a un epítopo en el dominio extracelular de CD40 (p. ej., anticuerpo anti-CD40 humanizado; Tai y col., Cáncer Research 64, 2846-2852 (2004)), puede ser un ligando CD40 (p. ej., la patente US- 6.497.876 (Maraskovsky y col)) o puede ser otra molécula coestimuladora (p. ej., B7/CD28). Los expertos en la técnica entienden que las variaciones conservadoras en la secuencia, que no afectan a la función, como se analiza en la presente memoria, están dentro del alcance de la presente descripción.

Además en la presente memoria se proporcionan composiciones que comprenden un ácido nucleico que tiene una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína quimérica, en donde la proteína quimérica comprende (i) una región de direccionamiento a membrana, (ii) una región de unión al ligando (iii) una región de polipéptido CD40 citoplásmica, y (iv) un péptido seleccionado del grupo que consiste en un péptido MyD88 truncado que carece del dominio TIR y un péptido TRIF. En algunos casos, el péptido MyD88 truncado está codificado por la secuencia de nucleótidos de la Id. de sec. n.°: 5. En otros casos, el péptido es un péptido TRIF. A menudo, el péptido está codificado por la secuencia de nucleótidos de la Id. de sec. n.°: 9. En algunos casos, la región de polipéptido citoplasmática CD40 está codificada por una secuencia de polinucleótidos en la Id. de sec. n.°: 1. A menudo, el ácido nucleico comprende una secuencia promotora unida operativamente a la secuencia polinucleotídica. Los expertos en la técnica pueden seleccionar una secuencia promotora apropiada, que incluye, sin limitarse a, una secuencia promotora descrita en la presente memoria.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico está contenido dentro de un vector viral. Los expertos en la técnica pueden seleccionar el vector viral apropiado. En determinados casos, el vector viral es un vector adenoviral. Se entiende que en algunos casos, la célula presentadora de antígeno se pone en contacto con el vector viral ex vivo y, en algunos casos, la célula presentadora de antígeno se pone en contacto con el vector viral in vivo.;

En algunos casos, los métodos se proporcionan para activar una célula presentadora de antígeno, que comprenden transducir una célula presentadora de antígeno con un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína quimérica, en donde la proteína quimérica comprende (i) una región de direccionamiento a membrana, (ii) una región de unión al ligando y (iii) un péptido MyD88 o un péptido MyD88 truncado que carece del dominio TIR; y poner en contacto la célula presentadora de antígeno con un ligando multimérico no proteico que se une a la región de unión al ligando; donde se activa la célula presentadora de antígeno. A menudo, el péptido MyD88 está truncado, incluyendo, sin limitarse a, un péptido MyD88 truncado que está codificado por la secuencia de nucleótidos de la Id. de sec. n.°: 5. Las etapas de los métodos proporcionados se pueden realizar utilizando cualquier método adecuado conocido y seleccionado por el experto en la técnica, estos métodos incluyen, sin limitarse a, métodos de transducción, transformación o de cualquier otra manera proporcionar ácido nucleico a la célula presentadora de antígeno, presentados en la presente memoria. A menudo, el ácido nucleico comprende una secuencia promotora unida operativamente a la secuencia polinucleotídica. Los expertos en la técnica pueden seleccionar una secuencia promotora apropiada, que incluye, sin limitarse a, una secuencia promotora descrita en la presente memoria.

En determinados casos, la región de unión al ligando se selecciona del grupo que consiste en región de unión al ligando de FKBP, región de unión al ligando del receptor de ciclofilina, región de unión al ligando del receptor de esteroides, región de unión al ligando de los receptores de ciclofilina y la región de unión al ligando del receptor de tetraciclina. A menudo, la región de unión al ligando comprende una secuencia Fv'Fvls. A veces, la secuencia Fv'Fvls comprende además una secuencia Fv’ adicional.

Además en la presente memoria se proporcionan composiciones que pueden usarse, por ejemplo, en los métodos de la presente descripción. Por lo tanto, se proporcionan composiciones que comprenden un ácido nucleico que tiene una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína quimérica, en donde la proteína quimérica comprende (i) una región de direccionamiento a membrana, (ii) una región de unión al ligando (iii) una región de polipéptido CD40 citoplásmica, y (iv) un péptido MyD88 o un péptido MyD88 truncado que carece del dominio TIR. Según la invención, el péptido MyD88 está truncado, sin el dominio de TIR. A veces, el péptido MyD88 truncado está codificado por la secuencia de nucleótidos de la Id. de sec. n.°: 5. A menudo, el ácido nucleico comprende una secuencia promotora unida operativamente a la secuencia polinucleotídica. Los expertos en la técnica pueden seleccionar una secuencia promotora apropiada, que incluye, sin limitarse a, una secuencia promotora descrita en la presente memoria.

Los expertos en la técnica pueden seleccionar cualquier región de direccionamiento a membrana conocida apropiada, que incluye, sin limitarse a, una región de direccionamiento a miristoilación, región de direccionamiento a palmitoilación, región de prenilación o región transmembrana del receptor. A menudo, la región de direccionamiento a membrana es una región de direccionamiento a miristoilación:

Además, se proporcionan composiciones que comprenden una célula transducida con una composición de ácido nucleico de cualquiera de los casos presentados en la presente memoria. En algunas realizaciones, la célula es una célula presentadora de antígeno. A menudo, la célula es una célula dendrítica, que incluye, sin limitarse a, una célula de mamífero, por ejemplo, pero sin limitarse a, una célula dendrítica humana.

Además se proporciona el uso de una composición que comprende un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína quimérica, en donde la proteína quimérica comprende (i) una región de direccionamiento a membrana, (ii) una región de unión al ligando (iii) una región de polipéptido CD40 citoplásmica y (iv) un péptido seleccionado del grupo que consiste en un péptido MyD88, un péptido MyD88 truncado que carece del dominio TIR, un péptido NOD2, un péptido RIG-1 y un péptido TRIF, en la fabricación de un medicamento para la terapia de una afección mediante la activación de una respuesta inmune. En otro caso es el uso de una composición que comprende una célula transducida o transfectada con un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína quimérica, en donde la proteína quimérica comprende (i) una región de direccionamiento a membrana, (ii) una región de unión al ligando (iii) una región de polipéptido CD40 citoplásmica y (iv) un péptido seleccionado del grupo que consiste en un péptido MyD88, un péptido MyD88 truncado que carece del dominio TIR, un péptido NOD2, un péptido RIG-1 y un péptido TRIF, en la fabricación de un medicamento para la terapia de una afección mediante la activación de una respuesta inmune. La composición puede usarse, por ejemplo, para transfectar o transducir una célula presentadora de antígeno. El péptido puede ser, por ejemplo, un péptido MyD88 truncado. La afección puede ser, por ejemplo, una enfermedad hiperproliferativa o, por ejemplo, una enfermedad infecciosa.

En los métodos para inducir una respuesta inmune presentados en la presente memoria, la célula presentadora de antígeno se puede transducir ex vivo o in vivo con un ácido nucleico que codifica la proteína quimérica. La célula presentadora de antígeno puede sensibilizarse al antígeno al mismo tiempo que la célula presentadora de antígeno se pone en contacto con el ligando multimérico, o la célula presentadora de antígeno puede sensibilizarse previamente al antígeno antes de que la célula presentadora de antígeno se ponga en contacto con el ligando de multimerización. En algunos casos, la célula presentadora de antígeno se pone en contacto con el antígeno ex vivo. En determinados casos, la célula presentadora de antígeno se transduce con el ácido nucleico ex vivo y se administra al sujeto mediante la administración intradérmica, y a veces la célula presentadora de antígeno se transduce con el ácido nucleico ex vivo y se administra al sujeto mediante la administración subcutánea. El antígeno puede ser un antígeno tumoral y la respuesta inmune CTL puede inducirse mediante la migración de la célula presentadora de antígeno a un nódulo linfático de drenaje.

En los métodos de la presente memoria, la parte de CD40 inducible del péptido puede estar ubicada corriente arriba o corriente abajo de la parte proteica del adaptador de PRR inducible. Además, la parte de CD40 inducible y las partes proteicas del adaptador de PRR inducible pueden transfectarse o transducirse en las células en el mismo vector, en cis, o en vectores separados, en trans.

Además en la presente memoria se proporciona un método para evaluar la migración de una célula presentadora de antígeno a un nódulo linfático, que comprende: (a) inyectar en un sujeto una célula presentadora de antígeno que produce una proteína detectable, y (b) determinar la cantidad de la proteína detectable en el nódulo linfático del animal, donde la migración de la célula presentadora de antígeno al nódulo linfático se evalúa a partir de la cantidad de la proteína detectable en el nódulo linfático. En dichos métodos, el animal puede ser un roedor, tal como una rata o un ratón (p. ej., un ratón irradiado). En algunos casos, la proteína detectable es una proteína luciferasa, tal como una proteína luciferasa desplazada al rojo de un escarabajo de pollo (p. ej., Pyrophorus plagiophalamus). En determinados casos, la célula presentadora de antígeno se ha transducido con un ácido nucleico que tiene una secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína detectable. En determinados casos, el nódulo linfático es el nódulo linfático poplíteo o el nódulo linfático inguinal. La célula presentadora de antígeno puede ser una célula dendrítica, tal como una célula dendrítica humana. En determinados casos, el nódulo linfático se extrae del animal antes de que se determine la cantidad de proteína detectable y, a veces, se administra la D-luciferina al nódulo linfático extraído. La cantidad de la proteína detectable puede ser cualitativa (p. ej., cantidades relativas en comparación entre diferentes muestras) y puede ser cuantitativa (p. ej., una concentración). La cantidad de la proteína detectable se puede determinar detectando directamente la proteína. Por ejemplo, la proteína puede ser fluorescente (p. ej., proteína verde fluorescente o una versión desplazada al rojo o azul) o puede estar unida a un marcador fluorescente (p. ej., un anticuerpo unido a un fluoróforo). Alternativamente, la cantidad de la proteína detectable puede determinarse indirectamente administrando un sustrato al animal que la proteína convierte en un producto detectable y detectando el producto detectable. Por ejemplo, la cantidad de una proteína luciferasa se puede determinar administrando D-luciferina al animal y detectando el producto D-luciferina generado por la luciferasa producida en la célula presentadora de antígeno.

En determinadas realizaciones, la región de direccionamiento a membrana es una región de direccionamiento a miristoilación, aunque en determinados casos la región de direccionamiento a membrana puede seleccionarse de otros tipos de regiones de direccionamiento a transmembrana, tales como las regiones que se describen a continuación en la memoria. En algunos casos, el ligando es una molécula pequeña y, a veces, la molécula es dimérica. Los ejemplos de moléculas diméricas son FK506 dimérico y análogos diméricos de FK506. En determinadas realizaciones el ligando es AP1903 o AP20187. En algunos casos, la proteína quimérica incluye una o más regiones de unión al ligando, tales como dos o tres regiones de unión al ligando, por ejemplo. Las regiones de unión al ligando a menudo son en tándem.

El ácido nucleico, en determinadas realizaciones está contenido dentro de un vector viral, tal como un vector adenoviral, por ejemplo. La célula presentadora de antígeno en algunos casos se pone en contacto con un antígeno, a veces ex vivo. En determinados casos, la célula presentadora de antígeno está en un sujeto y se genera una respuesta inmune contra el antígeno, tal como una cytotoxic T-lymphocyte (respuesta inmune de linfocitos T citotóxicos - CTL). En determinados casos, se genera una respuesta inmune contra un antígeno tumoral (p. ej., PSMA). En algunos casos, el ácido nucleico se prepara ex vivo y se administra al sujeto mediante administración intradérmica o mediante administración subcutánea, por ejemplo. A veces, la célula presentadora de antígeno se transduce o transfecta con el ácido nucleico ex vivo o in vivo. En algunas realizaciones, el ácido nucleico comprende una secuencia promotora unida operativamente a la secuencia de polinucleótidos. Alternativamente, el ácido nucleico comprende un ARN transcrito ex vivo, que contiene la región codificante de proteína de la proteína quimérica.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Diagrama esquemático de iCD40 y expresión en DC humanas. A. El dominio citoplásmico de CD40 humano se puede subclonar corriente abajo de un dominio de direccionamiento a miristoilación (M) y dos dominios en tándem (Fv) (Clackson T, Yang W, Rozamus LW, y col. Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity [rediseño de una interfaz de ligando FKBP para generar dimerizadores químicos con novedosa especificidad]. Proc Natl Acad Sci USA. 1998; 95: 10437-10442). La expresión de la proteína quimérica M-Fv-Fv-CD40, denominada aquí como CD40 inducible (iCD40) puede estar bajo el control del promotor del citomegalovirus (CMV). B. La expresión de formas endógenas (eCD40) e inducibles recombinantes (iCD40) de CD40 evaluadas por transferencia Western. Carril 1, DC natural (control de CD40 endógeno); carril 2, DC estimuladas con 1 microgramo/ml de LPS; carriles 3 y 4, DC transducidas con 10.000 VP/célula (MOI-160) de Ad5/f35-iCD40 (iCD40-DC) con y sin fármaco dimerizador AP20187 respectivamente; carril 5, iCD40-DC estimuladas con LPS y AP20187; carril 6, DC estimuladas con CD40L (ligando CD40, una proteína miembro de la familia TNF) y LPS; carril 7, DC transducidas con Ad5/f35-GFP (GFP-DC) en MOI 160 y estimuladas con AP20187 y LPS; carril 8, GFP-DC estimuladas con AP20187; carril 9, células 293 T transducidas con Ad5/f35-iCD40 (control positivo para la forma inducible de CD40). Los niveles de expresión de la alfa-tubulina sirvieron como control interno.

Figura 2. Esquema de ÍCD40. La administración del fármaco dimerizador permeable a los lípidos, AP20187/AP1903¹1, conduce a la oligomerización del dominio citoplásmico de CD40, modificado para contener dominios de unión a AP20187 y una secuencia de direccionamiento a miristoilación.

La Figura 3 es un esquema de los TLR inducibles por CID.

La Figura 4 es un esquema de los inducible composite Toll-like receptors (receptores tipo toll inducibles - icTLR) por CID. La Figura 5 es un esquema de los TLR compuestos inducibles (icTLR) por CID/CD40.

Figura 6: las principales relaciones entre los Toll-like receptors (receptores tipo Toll - TLR), sus adaptadores, las proteína quinasas que están unidas a ellos y los efectos de señalización corriente abajo. Nature 430, 257-263 (8 de julio de 2004). Figura 7. iNod2 e iCD40 en células 293. Las células 293 se transfectaron conjuntamente transitoriamente a una velocidad de 1 millón de células/pocillo (de una placa de 6 pocillos) con 3 microgramos de plásmidos de expresión para iNod-2 quimérico y 1 microgramo de plásmido informador SEAP dependiente de NF-kappaB (indicado como R en la figura). El iCD40 se utilizó como control positivo.

Figura 8. IRIG 1 y iMyD88 en células RAW264.7. Las células RAW 264.7 se transfectaron conjuntamente transitoriamente con 3 microgramos de plásmidos de expresión para iRIG-1 y 1 microgramo de plásmido informador SEAP dependiente de IFNgamma; y 3 microgramos de iMyD88 con 1 microgramo de plásmido informador SEAP dependiente de NF-kappaB.

Figura 9. Esquema de los receptores de reconocimiento de patrones

Figura 10A. Esquema de un plásmido iPRR de ejemplo.

Figura 10B. Esquema de un plásmido iPRR de ejemplo.

Figura 10C. Esquema de un plásmido iPRR de ejemplo.

La Figura 11 es un gráfico de inducción del informador NF-kappa B SEAP en células 293 transfectadas con iRIG, iNOD2 e iCD40.

La Figura 12 es un gráfico de inducción del informador NF-kappa B SEAP en células 293 transfectadas con iRIG-I e iCD40.

La Figura 13 es un gráfico de inducción del informador NF-kappa B SEAP en células 293 transfectadas con iRIG, iCD40) e iRIG CD40.

La Figura 14 es un gráfico de inducción del informador NF-kappa B SEAP en células Jurkat Tag transfectadas con iRIG-I e iCD40.

La Figura 15A y 15B proporcionan mapas de plásmidos para pSH1-Sn-RIGI-Fv'-Fvls-E y pSH1-Sn-Fv'-Fvls-RIGI-E, respectivamente. El término “ Sn” representa “ S” con un sitio Ncol, añadido con fines de clonación. El término “ S” representa el término no dirigido.

La Figura 16 es un esquema de los receptores CD40 y MyD88 inducibles y la inducción de la actividad de NF-kappa B. La Figura 17 es un esquema de los receptores CD40/MyD88 quiméricos inducibles y la inducción de la actividad de NF-kappaB.

La Figura 18 es un gráfico de la activación de NF-kappa B en células 293 mediante receptores inducibles MyD88 y quiméricos MyD88-CD40. CD40T indica CD40 “turbo” , en donde el receptor incluye 3 copias del dominio FKBP12^v36(Fv'). La Figura 19 es un gráfico de la actividad de NF-kappa B mediante MyD88 truncado inducible (MyD88L) y MyD88/CD40 truncado inducible quimérico después de 3 horas de incubación con sustrato.

La Figura 20 es un gráfico de la actividad de NF-kappa B mediante MyD88 truncado inducible (MyD88L) y MyD88/CD40 truncado inducible quimérico después de 22 horas de incubación con sustrato. En este ensayo hay algo de saturación del ensayo.

La Figura 21 es una transferencia Western de la proteína HA, después de la transducción de células 293T con adenovirus-MyD88L.

La Figura 22 es una transferencia Western de la proteína HA, después de la transducción de células 293T con adenovirus-MyD88L-CD40.

La Figura 23 es un gráfico de un ensayo ELISA después de la infección por adenovirus de las DC derivadas de la médula ósea con los constructos CD40 y MyD88 inducibles indicados.

La Figura 24 es un gráfico de los resultados de un ensayo ELISA similar al de la Figura 23.

La Figura 25 es un gráfico de los resultados de un ensayo ELISA similar al de las Figuras 23 y 24, después de la infección con una mayor cantidad de adenovirus.

La Figura 26 es un gráfico de los resultados de un ensayo informador NF-kappaB SEAP en células transfectadas con iRIG-1 e iCD40.

La Figura 27 es un gráfico de los resultados de un ensayo informador de IFN-beta-SEAP en células transfectadas con iRIG-1 e iTRIF.

La Figura 28 es un gráfico que compara la activación de iTRIF de los informadores NF-kappa B e IFN-beta en células transfectadas.

La Figura 29 es un gráfico de la activación de iNOD2 de un informador NF-kappaB en células transfectadas.

La Figura 30 es un mapa de constructo de pShuttleX-iMyD88.

La Figura 31 es un mapa de constructo de pShuttleX-CD4-TLR4L3-E.

La Figura 32 es un mapa de constructo de pShuttleX-iMyD88E-CD40.

La Figura 33 es un gráfico de barras que representa los resultados de una inducción dependiente de la dosis de la expresión de IL-12p70 en monocyte-derived dendritic cells células dendríticas derivadas de monocitos - moDC) humanos transducidas con una multiplicidad diferente de infecciones de adenovirus que expresan un constructo compuesto inducible MyD88.CD40.

La Figura 34 es un gráfico de barras que representa los resultados de una inducción dependiente de fármacos de la expresión de IL-12p70 en células monocyte-derived dendritic cells (dendríticas derivadas de monocitos - moDC) humanos transducidas con adenovirus que expresan diferentes constructos inducibles.

La Figura 35 es un gráfico de barras que representa los niveles de IL-12p70 en células dendríticas transducidas antes de la vacunación.

La Figura 36(a) es un gráfico de la inhibición del crecimiento tumoral EG.7-OVA en ratones vacunados con células dendríticas transducidas; la Figura 36(b) presenta fotografías de ratones vacunados representativos; la Figura 36(c) es la gráfica de 36(a), incluidas las barras de error.

La Figura 37(a) es un gráfico de dispersión, y 37(b) es un gráfico de barras, que muestra la frecuencia mejorada de células T CD8+ específicas de Ag inducida por células dendríticas transducidas.

La Figura 38 es un gráfico de barras que muestra la frecuencia mejorada de células T IFN gamma+ CD8+ específicas de Ag y células T^h1 CD4+ inducidas por células dendríticas transducidas.

La Figura 39 presenta un esquema y los resultados de un ensayo de linfocitos citotóxicos in vivo.

La Figura 40 es un gráfico de barras que resume los datos de una actividad CTL mejorada in vivo inducida por células dendríticas.

La Figura 41 presenta los resultados representativos de un ensayo de CTL en ratones inducidos por células dendríticas transducidas.

La Figura 42 presenta los resultados de la tinción intracelular para células T^h2 productoras de IL-4 en ratones inoculados por células dendríticas transducidas.

La Figura 43 presenta los resultados de un ensayo de inhibición del crecimiento tumoral en ratones tratados con células transducidas con Ad5-iCD40.MyD88.

La Figura 44 presenta un ensayo de células T específicas de tumor en ratones tratados con células transducidas con Ad5-iCD40.MyD88.

La Figura 45 presenta los resultados de un ensayo de células asesinas naturales utilizando esplenocitos de los ratones tratados como efectores.

La Figura 46 presenta los resultados de un ensayo de linfocitos citotóxicos utilizando esplenocitos de los ratones tratados como efectores.

La Figura 47 presenta los resultados de un ensayo ELISPot de IFN-gamma utilizando células T cultivadas conjuntamente con células dendríticas transducidas con el vector indicado.

La Figura 48 presenta los resultados de un ensayo de regulación positiva de CCR7 utilizando células dendríticas transformadas con el vector indicado, con o sin LPS como adyuvante.

La Figura 49 presenta los resultados del ensayo de regulación positiva de CCR7 presentado en la Figura 48, con los datos de múltiples animales incluidos en un gráfico.

Descripción detallada

Como se utiliza en la presente memoria, el uso de la palabra “ un” o “ una” cuando se usa junto con el término “que comprende” en las reivindicaciones y/o la memoria descriptiva puede significar “ uno” , pero también es consistente con el significado de “ uno o más” , “ al menos uno” y “ uno o más de uno” . Más aún, los términos “que tiene” , “que incluye” , “que contiene” y “que comprende” son intercambiables y un experto en la técnica es consciente de que estos términos son términos abiertos.

El término “ alogénico” , como se utiliza en la presente memoria, se refiere a loci HLA o MHC que son antigénicamente distintos. Por lo tanto, las células o tejidos transferidos de la misma especie pueden ser antigénicamente distintos. Los ratones singénicos pueden diferir en uno o más loci (congénitos) y los ratones alogénicos pueden tener los mismos antecedentes.

El término “antígeno” , como se utiliza en la presente memoria, se define como una molécula que provoca una respuesta inmune. Esta respuesta inmune puede implicar la producción de anticuerpos o la activación de células inmunológicamente competentes específicas, o ambas. Un antígeno puede derivarse de organismos, subunidades de proteínas/antígenos, células completas muertas o inactivadas o lisados. Los organismos ejemplares incluyen, aunque no de forma limitativa, Helicobacters, Campylobacters, Clostridia, Corynebacterium diphtheriae, Bordetella pertussis, virus de la influenza, virus de la parainfluenza, virus respiratorio sincitial, Borrelia burgdorfei, Plasmodium, virus del herpes simple, virus de la inmunodeficiencia humana, virus del papiloma, Vibrio cholera, E. coli, virus del sarampión, rotavirus, shigella, Salmonella typhi, Neisseria gonorrhea. Por lo tanto, un experto en la materia se da cuenta de que cualquier macromolécula, incluyendo prácticamente todas las proteínas o péptidos, pueden servir como antígenos. Además, los antígenos pueden derivarse de ADN recombinante o genómico. Un experto en la materia se da cuenta de que cualquier ADN que contenga secuencias de nucleótidos o secuencias de nucleótidos parciales de un genoma patógeno o un gen o un fragmento de un gen para una proteína que provoque una respuesta inmune da como resultado la síntesis de un antígeno. Además, un experto en la técnica se da cuenta de que la presente descripción no se limita al uso de la secuencia completa de ácido nucleico de un gen o genoma. Es fácilmente inherente que la presente descripción incluya, pero no se limite a, el uso de secuencias parciales de ácido nucleico de más de un gen o genoma y que estas secuencias de ácido nucleico estén dispuestas en diversas combinaciones para provocar la respuesta inmune deseada.

El término “célula presentadora de antígeno” es cualquiera de una diversidad de células capaces de mostrar, adquirir o presentar al menos un antígeno o fragmento antigénico en (o por) su superficie celular. En general, el término “célula presentadora de antígeno” puede ser cualquier célula que logre el objetivo de la descripción al ayudar a mejorar una respuesta inmune (es decir, de los brazos de células T o células B del sistema inmunológico) contra un antígeno o composición antigénica. Dichas células pueden ser definidas por los expertos en la técnica, usando métodos descritos en la presente memoria y en la técnica. Tal cual entiende un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Kuby, 2000, Immunology, 4a edición, W.H. Freeman y compañía) y se utiliza en la presente memoria en determinados casos, una célula que muestra o presenta un antígeno normalmente o preferencialmente con una molécula de histocompatibilidad principal de clase II o complejo con una célula inmunológica es una “célula presentadora de antígeno” . En determinados aspectos, una célula (p. ej., una célula APC) puede fusionarse con otra célula, tal como una célula recombinante o una célula tumoral que expresa el antígeno deseado. Los métodos para preparar una fusión de dos o más células son bien conocidos en la técnica, tal como por ejemplo, los métodos descritos en Goding, JW, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, págs. 65-66, 71-74 (Academic Press, 1986); Campbell, en: Monoclonal Antibody Technology, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 13, Burden & Von Knippenberg, Amsterdam, Elseview, págs. 75 83, 1984; Kohler & Milstein, Nature, 256: 495-497, 1975; Kohler & Milstein, Eur. J. Immunol., 6: 511-519, 1976, Gefteretal., Somatic Cell Genet., 3: 231-236, 1977. En algunos casos, la célula inmunológica a la que una célula presentadora de antígeno muestra o presenta un antígeno es una célula TH CD4+. Las moléculas adicionales expresadas en la APC u otras células inmunológicas pueden ayudar o mejorar la mejora de una respuesta inmune. Las moléculas secretadas o solubles, tales como por ejemplo, citoquinas y adyuvantes, también pueden ayudar o mejorar la respuesta inmune contra un antígeno. Dichas moléculas son bien conocidas por el experto en la técnica, y en la presente memoria se describen diversos ejemplos.

El término “cáncer” como se utiliza en la presente memoria se define como una hiperproliferación de células cuyo rasgo único -la pérdida de los controles normales- da como resultado un crecimiento no regulado, falta de diferenciación, invasión local de tejidos y metástasis. Los ejemplos incluyen, aunque no de forma limitativa, melanoma, pulmón no microcítico, pulmón microcítico, pulmón, hepatocarcinoma, leucemia, retinoblastoma, astrocitoma, glioblastoma, encía, lengua, neuroblastoma, cabeza, cuello, mama, páncreas, próstata, riñón, óseo, testicular, ovárico, mesotelioma, cervical, gastrointestinal, linfoma, cerebro, colon, sarcoma o vejiga.

Los términos “célula” , “ línea celular” y “cultivo celular” como se utiliza en la presente memoria pueden usarse indistintamente. Todos estos términos también incluyen su progenie, que son todas y cada una de las generaciones posteriores. Se entiende que toda la progenie puede no ser idéntica debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas.

Como se utiliza en la presente memoria, el término “ molécula de iCD40” se define como un CD40 inducible. Este iCD40 puede evitar los mecanismos que extinguen la señalización de CD40 endógena. El término “ iCD40” abarca “ ácidos nucleicos iCD40” , “ polipéptidos iCD40” y/o vectores de expresión iCD40. Más aún, se entiende que la actividad de iCD40, como se utiliza en la presente memoria, está impulsada por CID.

Como se utiliza en la presente memoria, el término “ADNc” pretende hacer referencia al ADN preparado usando ARN mensajero (ARNm) como plantilla. La ventaja de usar un ADNc, en contraposición al ADN genómico o al ADN polimerizado a partir de una plantilla de ARN genómico, no procesado o parcialmente, es que el ADNc contiene principalmente secuencias codificantes de la proteína correspondiente. Hay ocasiones en las que se prefiere la secuencia genómica completa o parcial, tal como cuando se requieren regiones no codificantes para la expresión óptima o cuando las regiones no codificantes tal como los intrones deben dirigirse en una estrategia antisentido.

El término “dendritic cell (célula dendrítica- DC)” es una célula presentadora de antígeno que existe in vivo, in vitro, ex vivo o en un huésped o sujeto, o que puede derivarse de una célula madre hematopoyética o un monocito. Las células dendríticas y sus precursores se pueden aislar de una diversidad de órganos linfoides, p. ej., bazo, nódulos linfáticos, así como de la médula ósea y la sangre periférica. La DC tiene una morfología característica con láminas delgadas (lamelipodios) que se extienden en múltiples direcciones alejándose del cuerpo de la célula dendrítica. Típicamente, las células dendríticas expresan altos niveles de MHC y moléculas coestimuladoras (p. ej., B7-1 y B7-2). Las células dendríticas pueden inducir la diferenciación específica de antígenos de las células T in vitro y son capaces de iniciar respuestas primarias de células T in vitro e in vivo.

Como se utiliza en la presente memoria, el término “constructo de expresión” o “transgén” se define como cualquier tipo de constructo genético que contiene un ácido nucleico que codifica productos génicos en el que parte o toda la secuencia que codifica el ácido nucleico es capaz de transcribirse y puede insertarse en el vector. El transcrito se traduce en una proteína, pero no es necesario. En determinados casos, la expresión incluye tanto la transcripción de un gen como la traducción de ARNm en un producto génico. En otros casos, la expresión solo incluye la transcripción de los genes que codifican el ácido nucleico de interés. El término “constructo terapéutico” también puede usarse para referirse al constructo de expresión o transgén. Un experto en la técnica se da cuenta de que el constructo de expresión o transgén puede usarse, por ejemplo, como una terapia para tratar enfermedades o trastornos hiperproliferativos, tales como cáncer, por lo que el constructo de expresión o transgén es un constructo terapéutico o un constructo profiláctico.

Como se utiliza en la presente memoria, el término “vector de expresión” se refiere a un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos parte de un producto génico que se puede transcribir. En algunos casos, las moléculas de ARN se traducen a continuación en una proteína, polipéptido o péptido. En otros casos, estas secuencias no se traducen, por ejemplo, en la producción de moléculas antisentido o ribozimas. Los vectores de expresión pueden contener una diversidad de secuencias de control, que se refieren a secuencias de ácido nucleico necesarias para la transcripción y posiblemente la traducción de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped particular. Además de las secuencias de control que gobiernan la transcripción y traducción, los vectores y vectores de expresión pueden contener secuencias de ácido nucleico que también cumplen otras funciones y se describen más adelante.

Como se utiliza en la presente memoria, el término “ex vivo” se refiere a “fuera” del cuerpo. El experto en la técnica es consciente de que ex vivo e in vitro se pueden usar indistintamente.

Como se utiliza en la presente memoria, el término “funcionalmente equivalente” , como se utiliza en la presente memoria, cuando, por ejemplo, se refiere a un fragmento, variante o análogo de ácido nucleico de CD40, se refiere a un ácido nucleico que codifica un polipéptido de CD40 o un polipéptido de CD40, que estimula una respuesta inmune para destruir tumores o enfermedad hiperproliferativa. “ Funcionalmente equivalente” se refiere, por ejemplo, a un polipéptido CD40 que carece del dominio extracelular, pero es capaz de amplificar la respuesta de destrucción de tumores mediada por células T regulando positivamente la expresión de células dendríticas de moléculas de presentación de antígenos.

El término “enfermedad hiperproliferativa” se define como una enfermedad que resulta de una hiperproliferación de células. Las enfermedades hiperproliferativas ilustrativas, incluyen, aunque no de forma limitativa, cáncer o enfermedades autoinmunes. Otras enfermedades hiperproliferativas pueden incluir oclusión vascular, reestenosis, aterosclerosis o inflamación intestinal.

Como se utiliza en la presente memoria, el término “gen” se define como una proteína funcional, un polipéptido o una unidad que codifica un péptido. Como entenderán los expertos en la técnica, este término funcional incluye secuencias genómicas, secuencias de ADNc y segmentos génicos diseñados por ingeniería de tamaño más pequeño que expresan, o están adaptados para expresar, proteínas, polipéptidos, dominios, péptidos, proteínas de fusión y mutantes.

El término “composición inmunogénica” o “ inmunógeno” se refiere a una sustancia que es capaz de provocar una respuesta inmune. Los ejemplos de inmunógenos incluyen, p. ej., antígenos, autoantígenos que desempeñan un papel en la inducción de enfermedades autoinmunes y antígenos asociados a tumores expresados en células cancerosas.

El término “ inmunodeprimido” como se utiliza en la presente memoria se define como un sujeto que tiene un sistema inmunológico reducido o debilitado. La condición inmunodeprimida puede deberse a un defecto o disfunción del sistema inmunológico o a otros factores que aumentan la susceptibilidad a la infección y/o enfermedad. Aunque dicha categorización permite una base conceptual para la evaluación, los individuos inmunodeprimidos a menudo no encajan completamente en un grupo u otro. Más de un defecto en los mecanismos de defensa del organismo puede verse afectado. Por ejemplo, los individuos con un defecto específico de los linfocitos T causado por el VIH también pueden tener neutropenia causada por fármacos utilizados para la terapia antiviral o estar inmunodeprimidos debido a una ruptura de la integridad de la piel y las membranas mucosas. Un estado inmunodeprimido puede resultar de líneas centrales permanentes u otros tipos de deterioro debido al abuso de fármacos intravenosos; o estar provocado por una neoplasia maligna secundaria, desnutrición o haber sido infectado con otros agentes infecciosos tales como tuberculosis o enfermedades de transmisión sexual, p. ej., sífilis o hepatitis.

Como se utiliza en la presente memoria, el término “farmacéutica o farmacológicamente aceptable” se refiere a entidades y composiciones moleculares que no producen reacciones adversas, alérgicas u otras reacciones adversas cuando se administran a un animal o un ser humano.

Como se utiliza en la presente memoria, “ portador farmacéuticamente aceptable” incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y lo similar. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Salvo en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con los vectores o células presentados en la presente memoria, su uso se contempla en composiciones terapéuticas. Los ingredientes activos complementarios también se pueden incorporar en las composiciones.

Como se utiliza en la presente memoria, el término “polinucleótido” se define como una cadena de nucleótidos.

Además, los ácidos nucleicos son polímeros de nucleótidos. Por lo tanto, los ácidos nucleicos y polinucleótidos como se utilizan en la presente memoria son intercambiables. Un experto en la técnica tiene el conocimiento general de que los ácidos nucleicos son polinucleótidos, que pueden hidrolizarse en los “ nucleótidos” monoméricos. Los nucleótidos monoméricos se pueden hidrolizar en nucleósidos.

Como se utiliza en la presente memoria, los polinucleótidos incluyen, aunque no de forma limitativa, todas las secuencias de ácido nucleico que se obtienen por cualquier medio disponible en la técnica, que incluyen, sin limitarse a, medios recombinantes, es decir, la clonación de secuencias de ácido nucleico de una genoteca recombinante o un genoma celular, usando tecnología de clonación habitual y PCR™, y lo similar, y por medios sintéticos. Además, un experto en la técnica es consciente de que los polinucleótidos incluyen mutaciones de los polinucleótidos, incluyen, aunque no de forma limitativa, mutación de los nucleótidos o nucleósidos por métodos bien conocidos en la técnica.

Como se utiliza en la presente memoria, el término “polipéptido” se define como una cadena de residuos de aminoácidos, que normalmente tienen una secuencia definida. Como se utiliza en la presente memoria, el término polipéptido es intercambiable con los términos “péptidos” y “proteínas” .

Como se utiliza en la presente memoria, el término “ promotor” se define como una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria sintética de la célula, o maquinaria sintética introducida, necesaria para iniciar la transcripción específica de un gen.

Como se utiliza la presente memoria, el término “ regular una respuesta inmune” o “modular una respuesta inmune” se refiere a la capacidad de modificar la respuesta inmune. Por ejemplo, la composición es capaz de mejorar y/o activar la respuesta inmune. Más aún, la composición también es capaz de inhibir la respuesta inmune. La forma de regulación se determina mediante el ligando que se usa con la composición. Por ejemplo, un análogo dimérico de la sustancia química produce la dimerización del polipéptido coestimulador que conduce a la activación de las DC, sin embargo, un análogo monomérico de la sustancia química no produce la dimerización del polipéptido coestimulador, que no activaría las DC.

El término “transfección” y “transducción” son intercambiables y se refieren al proceso mediante el cual una secuencia de ADN exógena se introduce en una célula huésped eucariota. La transfección (o transducción) se puede lograr mediante cualquiera de una diversidad de medios que incluyen electroporación, microinyección, suministro de la pistola de genes, infección retroviral, lipofección, superfección y lo similar.

Como se utiliza en la presente memoria, el término “ singénico” se refiere a células, tejidos o animales que tienen genotipos que son idénticos o lo suficientemente estrechamente relacionados para permitir el trasplante de tejido, o que son inmunológicamente compatibles. Por ejemplo, gemelos idénticos o animales de la misma raza endogámica. Los singénicos e isogénicos se pueden utilizar de forma intercambiable.

El término “ sujeto” como se utiliza en la presente memoria incluye, aunque no de forma limitativa, un organismo o animal; un mamífero, que incluye, p. ej., un ser humano, un primate no humano (p. ej., un mono), un ratón, un cerdo, una vaca, una cabra, un conejo, una rata, un conejillo de indias, un hámster, un caballo, un mono, una oveja u otro mamífero no humano; un no mamífero, que incluye, p. ej., un vertebrado no mamífero, tal como un pájaro (p. ej., un pollo o un pato) o un pez, y un invertebrado no mamífero.

Como se utiliza en la presente memoria, el término “bajo control transcripcional” o “ unido operativamente” se define como que el promotor está en la ubicación y orientación correctas en relación con el ácido nucleico para controlar la iniciación de la ARN polimerasa y la expresión del gen.

Como se utiliza en la presente memoria, los términos “tratamiento” , “ tratar” , “ tratado” o “que trata” se refieren a profilaxis y/o terapia. Cuando se usa con respecto a una enfermedad infecciosa, por ejemplo, el término se refiere a un tratamiento profiláctico que aumenta la resistencia de un sujeto a la infección con un patógeno o, en otras palabras, disminuye la probabilidad de que el sujeto se infecte con el patógeno o muestre signos de enfermedad atribuibles a la infección, así como un tratamiento después de que el sujeto se haya infectado para combatir la infección, p. ej., reducir o eliminar la infección o evitar que empeore.

Como se utiliza en la presente memoria, el término “vacuna” se refiere a una formulación que contiene una composición presentada en la presente memoria que está en una forma que se puede administrar a un animal. Típicamente, la vacuna comprende una solución salina convencional o un medio de solución acuosa tamponada en el que la composición se suspende o se disuelve. En esta forma, la composición se puede usar convenientemente para prevenir, mejorar o tratar de cualquier otra manera una afección. Al introducirla en un sujeto, la vacuna puede provocar una respuesta inmune que incluye, aunque no de forma limitativa, la producción de anticuerpos, citoquinas y/u otras respuestas celulares.

Células dendríticas

El sistema inmunológico innato utiliza un conjunto de receptores codificados en línea germinal para el reconocimiento de patrones moleculares conservados presentes en microorganismos. Estos patrones moleculares se producen en determinados constituyentes de microorganismos que incluyen: lipopolisacáridos, peptidoglicanos, ácidos lipoteicoicos, fosfatidilcolinas, proteínas específicas de bacterias, incluidas lipoproteínas, ADN bacterianos, ARN virales monocatenarios y bicatenarios, ADN CpG no metilados, mananos y una diversidad de otros componentes de la pared celular bacteriana y fúngica. Dichos patrones moleculares también pueden producirse en otras moléculas, tales como los alcaloides vegetales. Estos objetivos de reconocimiento inmune innato se denominan Pathogen Associated Molecular Patterns (Patrones moleculares asociados a patógenos -PAMP), ya que son producidos por microorganismos y no por el organismo huésped infectado (Janeway y col. (1989) Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 54: 1-13; Medzhitov y col., Nature 388: 394-397, 1997).

Los receptores del sistema inmunológico innato que reconocen los PAMP se denominan Pattern Recognition Receptors (Receptores de reconocimiento de patrones - PRR) (Janeway y col., 1989; Medzhitov y col., 1997). Estos receptores varían en estructura y pertenecen a varias familias de proteínas diferentes. Algunos de estos receptores reconocen los PAMP directamente (p. ej., CD14, DEC205, colectinas), mientras que otros (p. ej., receptores del complemento) reconocen los productos generados por el reconocimiento de PAMP. Los miembros de estas familias de receptores pueden, en general, dividirse en tres tipos: 1) receptores humorales que circulan en el plasma; 2) receptores endocíticos expresados en la superficie de las células inmunes, y 3) receptores de señalización que pueden expresarse en la superficie celular o intracelularmente (Medzhitov y col., 1997; Fearon y col. (1996) Science 272: 50-3).

Los PRR celulares se expresan en las células efectoras del sistema inmunológico innato, incluidas las células que funcionan como antigen-presenting cells (células presentadoras de antígenos - APC) profesionales en la inmunidad adaptativa. Dichas células efectoras incluyen, aunque no de forma limitativa, macrófagos, células dendríticas, linfocitos B y epitelios de superficie. Este perfil de expresión permite a los PRR inducir directamente mecanismos efectores innatos y también alertar al organismo huésped de la presencia de agentes infecciosos al inducir la expresión de un conjunto de señales endógenas, tales como citoquinas y quimioquinas inflamatorias, según se describe a continuación. Esta última función permite la movilización eficiente de fuerzas efectoras para combatir a los invasores.

La función principal de las dendritic cells (células dendríticas - DC) es adquirir antígeno en los tejidos periféricos, viajar al tejido linfoide secundario y presentar el antígeno a las células T efectoras del sistema inmunológico (Banchereau, J., y col, Annu Rev Immunol, 2000,. 18: pág. 767-811; Banchereau, J., & Steinman, R.M. Dendritic cells and the control of immunity [células dendríticas y el control de la inmunidad]. Nature 392, 245-252 [1998]). A medida que las DC desempeñan su papel crucial en la respuesta inmune, experimentan cambios de maduración que les permiten realizar la función apropiada para cada entorno (Termeer, C.C., y col., J Immunol, 2000, 15 de agosto. 165: pág. 1863-70). Durante la maduración de las DC, el potencial de absorción de antígenos se pierde, la densidad de superficie de las moléculas del major histocompatibility complex (complejo principal de histocompatibilidad - MHC) de clase I y clase II aumenta de 10 a 100 veces y la expresión de moléculas de adhesión y coestimuladoras CD40 también aumenta considerablemente (Lanzavecchia, A. y F. Sallusto, Science, 2000. 290: pág. 92-96). Además, otras alteraciones genéticas permiten que las DC alberguen la paracorteza rica en células T de los nódulos linfáticos de drenaje y expresen quimioquinas de células T que atraen células T sin tratamiento previo y de memoria y ceban células TH0 sin tratamiento previo específicas de antígeno (Adema, G.J., y col., Nature, 1997, 12 de junio. 387: pág. 713-7). Durante esta etapa, las DC maduras presentan antígeno a través de sus moléculas MHC II a las células T auxiliares CD4+, lo que induce la regulación positiva del ligando CD40 de las células T (CD40L) que, a su vez, se acopla al receptor CD40 de las DC. Esta interacción de células DC: T induce la expresión rápida de moléculas de DC adicionales que son cruciales para el inicio de una potente respuesta de cytotoxic T lymphocyte (linfocitos T citotóxicos - CTL) CD8+, incluida una mayor regulación positiva de moléculas del MHC I y II, moléculas de adhesión, moléculas coestimuladoras (p. ej., B7.1, B7.2), citoquinas (p. ej., IL-12) y proteínas antiapoptóticas (p. ej., Bcl-2) (Anderson, D.M., y col., Nature, 1997, 13 de noviembre. 390: pág. 175-9; Ohshima, Y., y col., J Immunol, 1997, 15 de octubre. 159: pág. 3838-48; Sallusto, F., y col., Eur J Immunol, 1998, 28 de septiembre: pág. 2760- 9; Caux, C. Adv Exp Med Biol. 1997, 417: 21-5;). Las células T CD8+ salen de los nódulos linfáticos, vuelven a entrar en la circulación y se dirigen al sitio original de inflamación para destruir patógenos o células malignas.

Un parámetro clave que influye en la función de las DC es el receptor CD40, que actúa como “ interruptor de encendido” para las DC (Bennett, S.R., y col.,. Nature, 1998, 4 de junio. 393: pág. 478-80; Clarke, S.R., J Leukoc Biol, 2000, mayo 67: pág 607-14; Fernandez, N.C., y col.,. Nat Med, 1999, 5 de abril: pág. 405-11; Ridge, J.P., D.R.F, y P. Nature, 1998, 4 de junio. 393: pág. 474-8; Schoenberger, S.P., y col., Nature, 1998, 4 de junio. 393: pág. 480-3). CD40 es un miembro transmembrana de 48 kDa de la superfamilia de receptores de TNF) (McWhirter, S.M., y col., Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 20 de julio. 96: pág. 8408-13). La interacción CD40-CD40L induce la trimerización de CD40, necesaria para iniciar cascadas de señalización que involucran factores asociados al receptor de TNF (TRAF) (Ni, C., y col., PNAS, 2000, 97(19): 10395-10399; Pullen, S.S., y col., J Biol Chem, 1999, 14 de mayo. 274: pág. 14246-54). CD40 usa estas moléculas de señalización para activar varios factores de transcripción en las DC, incluyendo NF-kappa B, AP-1, STAT3 y p38MAPK (McWhirter, S.M., y col., 1999).

Se proporciona un novedoso sistema de activación de DC basado en el reclutamiento de moléculas de señalización o polipéptidos coestimuladores en la membrana plasmídica de las DC, lo que da como resultado una activación y/o supervivencia prolongada/aumentada en las DC. Los polipéptidos coestimuladores incluyen cualquier molécula o polipéptido que active la vía NF-kappaB, la vía Akt y/o la vía p38. El sistema de activación de DC se basa en la utilización de una molécula de señalización recombinante fusionada a dominios de unión al ligando (es decir, un dominio de unión a molécula pequeña) en el que el polipéptido coestimulador se activa y/o regula con un ligando que produce la oligomerización (es decir, un fármaco dimerizador orgánico permeable a los lípidos). Otros sistemas que pueden usarse para reticular o para oligomerizar polipéptidos coestimuladores incluyen anticuerpos, ligandos naturales, y/o ligandos sintéticos o de reacción cruzada artificiales. Más aún, otros sistemas de dimerización contemplados incluyen el sistema cumermicina/ADN girasa B.

Los polipéptidos coestimuladores que se pueden usar incluyen aquellos que activan NF-kappaB y otras cascadas de señalización variable, por ejemplo, la vía p38 y/o la vía Akt. Dichos polipéptidos coestimuladores incluyen, aunque no de forma limitativa, receptores de reconocimiento de patrones, receptores de proteína C reactiva (es decir, Nod1, Nod2, PtX3-R), receptores de TNF (es decir, CD40, RANK/TRANCE-R, OX40, 4-1 Bb ) y receptores de HSP (Lox-1 y Cd -91). Los receptores de reconocimiento de patrones incluyen, aunque no de forma limitativa, receptores de reconocimiento de patrones endocíticos (es decir, receptores de manosa, receptores depuradores (es decir, Mac-1, LRP, peptidoglicano, ácidos teicoicos, toxinas, CD11c/CR4)); receptores de reconocimiento de patrones de señales externas (receptores tipo Toll (TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLr6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10), proteína de reconocimiento de peptidoglicanos (los PGRP se unen al peptidoglicano bacteriano y CD14); receptores de reconocimiento de patrones de señales internas (es decir, receptores NOD 1 y 2), RIG1, y los PRR mostrados en la Figura 8. Los expertos en la técnica también conocen otros receptores de reconocimiento de patrones adecuados para los métodos y la composición presentes, incluidos los descritos, por ejemplo, en Werts C., y col., Cell Death and Differentiation (2006) 13: 798-815; Meylan, E. y col., Nature (2006) 442: 39-44; y Strober, W., y col., Nature Reviews (2006) 6: 9-20.

Constructos de expresión de diseño de ingeniería

Además se proporcionan constructos de expresión que codifican un polipéptido coestimulador y un dominio de unión al ligando, todos unidos operativamente. Más particularmente, más de un dominio de unión al ligando se usa en el constructo de expresión. Más aún, el constructo de expresión contiene una secuencia de direccionamiento a membrana. Un experto en la técnica se da cuenta de que los constructos de expresión apropiados pueden incluir un elemento polipeptídico coestimulador en cualquier lado de los elementos de unión al ligando de FKBP anteriores. El constructo de expresión puede insertarse en un vector, por ejemplo, un vector viral o plásmido.

A. Polipéptidos coestimuladores

Las moléculas de polipéptido coestimuladoras son capaces de amplificar la respuesta mediada por células T regulando positivamente la expresión de las células dendríticas de las moléculas de presentación de antígenos. Las proteínas coestimuladoras que se contemplan incluyen, por ejemplo, aunque no de forma limitativa, los miembros de la familia del tumor necrosis factor (factor de necrosis tumoral - TNF) (es decir, CD40, RANK/TRANCE-R, OX40, 4-1 B), receptores tipo Toll, receptores de proteína C reactiva, receptores de reconocimiento de patrones y receptores de HSP. Típicamente, los dominios citoplásmicos de estos polipéptidos coestimuladores se utilizan en el vector de expresión. El dominio citoplasmático de uno de los diversos polipéptidos coestimuladores, incluidos sus mutantes, donde la secuencia de reconocimiento implicada en el inicio de la transcripción asociada con el dominio citoplásmico se conoce o se conoce un gen que responde a dicha secuencia.

En casos específicos, la molécula de polipéptido coestimuladora es CD40. La molécula CD40 comprende una molécula de ácido nucleico que: (1) se hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que tiene la secuencia de un gen CD40 conocido y (2) codifica un polipéptido CD40.

El polipéptido CD40 puede, en determinados ejemplos, carecer del dominio extracelular. Las secuencias de polinucleótidos ilustrativas que codifican polipéptidos CD40 incluyen, aunque no de forma limitativa, la Id. de sec. n.°: 1 e isoformas CD40 de otras especies. Se contempla que otras variantes normales o mutantes de CD40 se pueden usar en los presentes métodos y composiciones. Por lo tanto, una región CD40 puede tener una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia nativa en una o más sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos. Por ejemplo, una o más regiones de unión al tumor necrosis factor (factor asociado al receptor de TNF - TRAF pueden eliminarse o eliminarse de manera efectiva (p. ej., una secuencia de aminoácidos de CD40 se elimina o altera de manera que una proteína TRAF no se une o se une con menor afinidad que la que se une a la secuencia de CD40 nativo). En casos particulares, una región de unión a TRAF 3 se elimina o altera de manera que se elimina o se elimina de manera efectiva (p. ej., los aminoácidos 250-254 se pueden alterar o eliminar; Hauer y col., PNAS 102(8): 2874-2879 (2005)).

En determinados casos, los presentes métodos implican la manipulación de material genético para producir constructos de expresión que codifican una forma inducible de CD40 (iCD40). Dichos métodos implican la generación de constructos de expresión que contienen, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica el dominio citoplásmico de CD40 y un medio para su expresión. El vector se puede replicar en una célula auxiliar apropiada, las partículas virales se pueden producir a partir del mismo y las células se pueden infectar con las partículas de virus recombinantes.

Por lo tanto, la molécula de CD40 presentada en la presente memoria puede, por ejemplo, carecer del dominio extracelular. En casos específicos, el dominio extracelular se trunca o se elimina. Se contempla además que el dominio extracelular se pueda mutar usando mutagénesis, inserciones, deleciones o sustituciones estándar para producir una molécula de CD40 que no tiene un dominio extracelular funcional. Un ácido nucleico CD40 puede tener la secuencia de ácido nucleico de la Id. de sec. n.°: 1. Los ácidos nucleicos CD40 también incluyen homólogos y alelos de un ácido nucleico que tiene la secuencia de la Id. de sec. n.°: 1, así como los fragmentos, variantes y análogos funcionalmente equivalentes de los ácidos nucleicos anteriores. Los métodos de construcción de un vector CD40 inducible se describen en, por ejemplo, la patente US-7.404.950, concedida el 29 julio, 2008.

En el contexto de la terapia génica, el gen será una secuencia de polinucleótidos heteróloga derivada de una fuente distinta del genoma viral, que proporciona la cadena principal del vector. El gen se deriva de una fuente procariota o eucariota, tal como una bacteria, un virus, levadura, un parásito, una planta o incluso un animal. El ADN heterólogo también se deriva de más de una fuente, es decir, un constructo multigénico o una proteína de fusión. El ADN heterólogo también puede incluir una secuencia reguladora, que se deriva de una fuente y el gen de una fuente diferente.

B. Regiones de unión al ligando

El dominio de unión al ligando (“dimerización” ) del constructo de expresión puede ser cualquier dominio conveniente que permita la inducción usando un ligando natural o no natural, por ejemplo, un ligando sintético no natural. El dominio de unión al ligando puede ser interno o externo a la membrana celular, dependiendo de la naturaleza del constructo y la elección del ligando. Se conoce una amplia diversidad de proteínas de unión al ligando, incluyendo receptores, que incluyen proteínas de unión al ligando asociadas con las regiones citoplasmáticas indicadas anteriormente. Como se utiliza en la presente memoria, el término “dominio de unión al ligando” puede ser intercambiable con el término “ receptor” . De particular interés son las proteínas de unión al ligando para las que se conocen ligandos (por ejemplo, ligandos orgánicos pequeños) o se pueden producir fácilmente. Estos dominios o receptores de unión al ligando incluyen los receptores de FKBP y ciclofilina, los receptores de esteroides, el receptor de tetraciclina, los otros receptores indicados anteriormente y lo similar, así como los receptores “ no naturales” , que se pueden obtener a partir de anticuerpos, especialmente la subunidad de cadena pesada o ligera, secuencias mutadas de las mismas, secuencias de aminoácidos aleatorias obtenidas mediante procedimientos estocásticos, síntesis combinatoria y lo similar. Los ejemplos incluyen, por ejemplo, los descritos en Kopytek, S.J., y col., Chemistry & Biology 7: 313-321 (2000) y en Gestwicki, J.E., y col., Combinatorial Chem. & High Throughput Screening 10: 667-675 (2007); Clackson T (2006) Chem Biol Drug Des 67: 440-2; Clackson, T. “ Controlling Protein-Protein Interactions Using Chemical Inducers and Disrupters of Dimerization” [Control de las interacciones proteína-proteína con inductores y disruptores químicos de dimerización] en Chemical Biology: From Small Molecules to Systems Biology and Drug Design (Schreiber, s., y col., eds., Wiley, 2007)).

En su mayor parte, los dominios de unión al ligando o los dominios receptores serán al menos aproximadamente 50 aminoácidos y menos de aproximadamente 350 aminoácidos, normalmente menos de 200 aminoácidos, ya sea como dominio natural o como parte activa truncada del mismo. El dominio de unión puede ser, por ejemplo, pequeño (< 25 kDa, para permitir una transfección eficaz en vectores virales), monomérico (esto descarta el sistema avidina-biotina), no inmunogénico y debe tener ligandos sintéticamente accesibles, permeables a las células y no tóxicos que se puedan configurar para dimerización.

El dominio del receptor puede ser intracelular o extracelular dependiendo del diseño del constructo de expresión y la disponibilidad de un ligando apropiado. Para los ligandos hidrófobos, el dominio de unión puede estar en cualquier lado de la membrana, pero para los ligandos hidrófilos, especialmente los ligandos de proteínas, el dominio de unión será normalmente externo a la membrana celular, a menos que haya un sistema de transporte para internalizar el ligando en una forma en el que está disponible para su unión. Para un receptor intracelular, el constructo puede codificar un péptido señal y un dominio transmembrana 5’ o 3' de la secuencia del dominio receptor o puede tener una secuencia señal de unión a lípidos 5’ de la secuencia del dominio receptor. Cuando el dominio del receptor se encuentra entre el péptido señal y el dominio transmembrana, el dominio del receptor será extracelular.

La parte del constructo de expresión que codifica el receptor puede someterse a mutagénesis por diversas razones. La proteína mutagenizada puede proporcionar una afinidad de unión más alta, permitir la discriminación por el ligando del receptor natural y el receptor mutagenizado, lo que proporciona oportunidades para diseñar un par receptor-ligando o lo similar. El cambio en el receptor puede implicar cambios en los aminoácidos que se sabe que están en el sitio de unión, mutagénesis aleatoria mediante técnicas combinatorias, donde los codones de los aminoácidos asociados con el sitio de unión u otros aminoácidos asociados con cambios conformacionales pueden estar sujetos a mutagénesis cambiando el(los) codón(es) del aminoácido en particular, ya sea con cambios conocidos o al azar, expresando las proteínas resultantes en un huésped procariota apropiado y después analizando las proteínas resultantes para la unión.

Los anticuerpos y subunidades de anticuerpos, p. ej., la cadena pesada o ligera, especialmente los fragmentos, más especialmente toda o parte de la región variable, o fusiones de cadena pesada y ligera para crear una unión de alta afinidad, pueden usarse como el dominio de unión. Los anticuerpos que se contemplan incluyen los que son un producto humano expresado de forma ectópica, tal como un dominio extracelular que no desencadenaría una respuesta inmune y generalmente no se expresa en la periferia (es decir, fuera del área del SNC/cerebro). Dichos ejemplos incluyen, aunque no de forma limitativa, el low affinity nerve growth factor receptor (receptor del factor de crecimiento del nervio de baja afinidad - LNGFR) y proteínas de la superficie embrionaria (es decir, antígeno carcinoembrionario).

Más aún, los anticuerpos se pueden preparar contra moléculas hapténicas, que son fisiológicamente aceptables, y las subunidades de anticuerpos individuales se pueden analizar para determinar la afinidad de unión. El ADNc que codifica las subunidades puede aislarse y modificarse por deleción de la región constante, partes de la región variable, mutagénesis de la región variable o similares, para obtener un dominio de proteína de unión que tenga la afinidad apropiada para el ligando. De esta forma, casi cualquier compuesto hapténico fisiológicamente aceptable se puede emplear como ligando o para proporcionar un epítopo para el ligando. En lugar de unidades de anticuerpo, los receptores naturales se pueden emplear, cuando se conoce el dominio de unión y hay un ligando útil para la unión.

C. Oligomerización

La señal transducida normalmente resultará de la oligomerización mediada por ligando de las moléculas de proteína quimérica, es decir, como resultado de la oligomerización después de la unión al ligando, aunque otros eventos de unión, por ejemplo, activación alostérica, se pueden emplear para iniciar una señal. El constructo de la proteína quimérica variará en función del orden de los diversos dominios y el número de repeticiones de un dominio individual.

Para la multimerización del receptor, el ligando para los dominios de unión al ligando/dominios de receptor de las proteínas de membrana de superficie quiméricas será nomalmente multimérico en el sentido de que tendrá al menos dos sitios de unión, con cada uno de los sitios de unión capaz de unirse al dominio del receptor de ligando. Deseablemente, los ligandos en cuestión serán un dímero o un oligómero de orden superior, normalmente no mayor que aproximadamente tetramérico, de pequeñas moléculas orgánicas sintéticas, siendo las moléculas individuales típicamente de al menos aproximadamente 150 Da y menos de aproximadamente 5 kDa, normalmente menos de aproximadamente 3 kDa. Puede emplearse una diversidad de pares de ligandos y receptores sintéticos. Por ejemplo, en los casos que implican receptores naturales, el FK506 dimérico se puede usar con un receptor FKBP12, la ciclosporina A dimerizada se puede usar con el receptor de ciclofilina, el estrógeno dimerizado con un receptor de estrógeno, los glucocorticoides dimerizados con un receptor de glucocorticoide, la tetraciclina dimerizada con el receptor de tetraciclina, la vitamina D dimerizada con el receptor de vitamina D y lo similar. Alternativamente, se pueden usar órdenes superiores de los ligandos, p. ej., trimérico. Para realizaciones que implican receptores no naturales, p. ej., subunidades de anticuerpos, subunidades de anticuerpos modificadas o receptores modificados, y lo similar, se puede usar cualquiera de una gran diversidad de compuestos. Una característica significativa de estas unidades de ligando es que cada sitio de unión es capaz de unirse al receptor con alta afinidad y pueden dimerizarse químicamente. Además, los expertos en la técnica conocen métodos para equilibrar la hidrofobicidad/hidrofilicidad de los ligandos de modo que puedan disolverse en suero a niveles funcionales y aún difundirse a través de las membranas de plasma para la mayoría de las aplicaciones.

En determinados casos, los presentes métodos utilizan la técnica de chemically induced dimerization (dimerización inducida químicamente - CID) para producir una proteína o polipéptido controlado condicionalmente. Además de que esta técnica es inducible, también es reversible, debido a la degradación del agente dimerizador lábil o la administración de un inhibidor competitivo monomérico.

El sistema CID utiliza ligandos bivalentes sintéticos para reticular rápidamente moléculas de señalización que se fusionan con dominios de unión al ligando. Este sistema se ha utilizado para desencadenar la oligomerización y activación de la superficie celular (Spencer, D.M., y col., Science, 1993. 262: pág. 1019-1024; Spencer D.M. y col., Curr Biol 1996, 6: 83 9-847; Blau, C.A. y col., Proc Natl Acad.Sci. USA 1997, 94: 3076-3081), o proteínas citosólicas (Luo, Z. y col., Nature 1996, 383: 181-185; MacCorkle, R.A. y col., Proc Natl Acad Sci u Sa 1998, 95: 3655-3660), el reclutamiento de factores de transcripción a elementos de ADN para modular la transcripción (Ho, S.N. y col., Nature 1996, 382: 822-826; Rivera, V.M. y col., Nat. Med. 1996, 2: 1028-1032) o el reclutamiento de moléculas de señalización a la membrana plasmática para estimular la señalización (Spencer D.M. y col., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 1995, 92: 9805 9809; Holsinger, L.J. y col., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 1995, 95: 9810 9814).

El sistema CID se basa en la noción de que la agregación de receptores de superficie activa de forma efectiva las cascadas de señalización corriente abajo. - En el caso más simple, el sistema CID usa un análogo dimérico del fármaco inmunosupresor permeable a los lípidos, FK506, que pierde su bioactividad normal mientras gana la capacidad de reticular moléculas fusionadas genéticamente con la proteína de unión a FK506, FKBP12. Al fusionar una o más FKBP y una secuencia de miristoilación al dominio de señalización citoplásmico de un receptor objetivo, se puede estimular la señalización de una manera dependiente del fármaco dimerizador, pero independiente del ligando y del ectodominio.

Esto proporciona al sistema control temporal, reversibilidad utilizando análogos de fármacos monoméricos y mayor especificidad. La alta afinidad de los AP20187/AP1903 CID de tercera generación por su dominio de unión, FKBP12 permite la activación específica del receptor recombinante in vivo sin la inducción de efectos secundarios no específicos a través de FKBP12 endógena. Además, los ligandos sintéticos son resistentes a la degradación de proteasas, lo que los hace más eficientes para activar receptores in vivo que la mayoría de los agentes proteicos suministrados.

Los ligandos usados son capaces de unirse a dos o más de los dominios de unión al ligando. Un experto en la técnica se da cuenta de que las proteínas quiméricas pueden unirse a más de un ligando cuando contienen más de un dominio de unión al ligando. El ligando es típicamente no proteico o químico. Los ligandos ilustrativos incluyen, aunque no de forma limitativa, FK506 dimérico (p. ej., FK1012).

Dado que el mecanismo de activación de CD40 se basa fundamentalmente en la trimerización, este receptor es especialmente susceptible al sistema CID. La regulación CID proporciona al sistema 1) control temporal, 2) reversibilidad mediante la adición de un monómero no activo ante signos de una reacción autoinmune y 3) potencial limitado de efectos secundarios inespecíficos. Además, la activación de CD40 de DC in vivo inducible evitaría el requisito de una segunda señal de “ peligro” normalmente requerida para la inducción completa de la señalización de CD40 y potencialmente promovería la supervivencia de DC in situ permitiendo un cebado de células T mejorado. Por lo tanto, la ingeniería de vacunas de DC para expresar iCD40 amplifica la respuesta de destrucción mediada por células T regulando positivamente la expresión de DC de moléculas de presentación de antígenos, moléculas de adhesión, citoquinas promotoras de TH1 y factores de pro-supervivencia.

Otros sistemas de dimerización contemplados incluyen el sistema cumermicina/ADN girasa B. La dimerización inducida por cumermicina activa una proteína Raf modificada y estimula la cascada de MAP quinasa. Véase Farrar y col., 1996.

D. Direccionamiento a membranas

Una secuencia de direccionamiento a membrana proporciona el transporte de la proteína quimérica a la membrana de la superficie celular, donde la misma u otras secuencias pueden codificar la unión de la proteína quimérica a la membrana de la superficie celular. Las moléculas en asociación con membranas celulares contienen determinadas regiones que facilitan la asociación de membranas, y dichas regiones pueden incorporarse en una molécula de proteína quimérica para generar moléculas dirigidas a la membrana. Por ejemplo, algunas proteínas contienen secuencias en el extremo N-terminal o C-terminal que están aciladas, y estos restos acilo facilitan la asociación de la membrana. Dichas secuencias son reconocidas por aciltransferasas y a menudo se ajustan a un motivo secuencial particular. Determinados motivos de acilación pueden modificarse con un solo resto acilo (a menudo seguido de varios residuos cargados positivamente (p. ej., c-Src humano: M-G-S-N-K-S-K-P-K-D-A-S-Q-R-R-R) para mejorar la asociación con los grupos principales de lípidos aniónicos) y otros pueden modificarse con múltiples restos acilo. Por ejemplo, la secuencia N-terminal de la proteína tirosina quinasa Src puede comprender un único resto miristoílo. Las regiones de acilación dual están ubicadas dentro de las regiones N-terminales de determinadas proteína quinasas, tales como un subconjunto de miembros de la familia Src (p. ej., Yes, Fyn, Lck) y subunidades alfa de proteína G. Dichas regiones de acilación dual a menudo se ubican dentro de los primeros dieciocho aminoácidos de dichas proteínas y se ajustan al motivo secuencial Met-Gly-Cys-Xaa-Cys, donde Met se escinde, Gly se N-acila y uno de los residuos Cys está acilado en S. El Gly a menudo está miristoilado y un Cys puede estar palmitoilado. Las regiones de acilación que se ajustan al motivo secuencial Cys-Ala-Ala-Xaa (las denominadas “cajas CAAX” ), que puede modificarse con restos isoprenilo C15 o C10, del extremo C-terminal de las subunidades gamma de la proteína G y otras proteínas (p. ej., la dirección de la World Wide Web ebi.ac.uk/interpro/DisplaylproEntry?ac=IPR001230) también se pueden utilizar. Estos y otros motivos de acilación son conocidos por la persona con experiencia en la técnica (p. ej., Gauthier-Campbell y col., Molecular Biology of the Cell 15: 2205-2217 (2004); Glabati y col., Biochem. J. 303: 697 700 (1994) y Zlakine y col., J. Cell Science 110: 673-679 (1997)), y se puede incorporar en moléculas quiméricas para inducir la localización de la membrana. En determinados casos, una secuencia nativa de una proteína que contiene un motivo de acilación se incorpora en una proteína quimérica. Por ejemplo, en algunos casos, una parte N-terminal de Lck, Fyn o Yes o una subunidad alfa de proteína G, tal como los primeros veinticinco aminoácidos N-terminales o menos de dichas proteínas (p. ej., de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 aminoácidos, de aproximadamente 10 a aproximadamente 19 aminoácidos, o de aproximadamente 15 a aproximadamente 19 aminoácidos de la secuencia nativa con mutaciones opcionales) se puede incorporar dentro del extremo N-terminal de una proteína quimérica. En determinados casos, una secuencia C-terminal de aproximadamente 25 aminoácidos o menos de una subunidad gamma de proteína G que contiene una secuencia de motivo de caja CAAX (p. ej., aproximadamente de 5 a aproximadamente 20 aminoácidos, de aproximadamente 10 a aproximadamente 18 aminoácidos, o de aproximadamente 15 a aproximadamente 18 aminoácidos de la secuencia nativa con mutaciones opcionales) puede estar unida al extremo C-terminal de una proteína quimérica.

En algunos casos, un resto acilo tiene un valor log p de 1 a 6, y a veces tiene un valor log p de 3 a 4,5. Los valores de log p son una medida de la hidrofobicidad y a menudo se derivan de estudios de partición octanol/agua, en los que las moléculas con mayor hidrofobicidad se reparten en octanol con mayor frecuencia y se caracterizan por tener un valor log p más alto. Los valores de log p se publican para una serie de moléculas lipófilas y los valores de log p se pueden calcular utilizando procesos de partición conocidos (p. ej., Chemical Reviews, vol. 71, cuestión 6, página 599, donde la entrada 4493 muestra el ácido láurico con un valor log p de 4,2). Cualquier resto acilo puede unirse a una composición peptídica descrita anteriormente y analizarse para determinar la actividad antimicrobiana usando métodos conocidos y los descritos a continuación en la memoria. El resto acilo a veces es un alquilo C1-C20, alquenilo C2-C20, alquinilo C2-C20, cicloalquilo C3-C6, haloalquilo C1-C4, ciclalquilalquilo C4-C12, arilo, arilo sustituido o arilo alquilo (C1-C4), por ejemplo. Cualquier resto que contenga acilo a veces es un ácido graso, y los ejemplos de restos de ácido graso son propilo (C3), butilo (C4), pentilo (C5), hexilo (C6), heptilo (C7), octilo (C8), nonilo (C9), decilo (C10), undecilo (C11), laurilo (C12), miristilo (C14), palmitilo (C16), estearilo (C18), araquidilo (C20), behenilo (C22) y restos de lignocerilo (C24), y cada resto puede contener 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 insaturaciones (es decir, dobles enlaces). Un resto acilo a veces es una molécula lipídica, tal como un fosfatidil lípido (p. ej., fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina), esfingolípido (p. ej., shingomielina, esfingosina, ceramida, gangliósido, cerebrósido) o versiones modificadas de los mismos. En determinados casos, uno, dos, tres, cuatro o cinco o más restos acilo están unidos a una región de asociación de membrana.

Una proteína quimérica en la presente memoria también puede incluir una secuencia transmembrana de paso único o de paso múltiple (p. ej., en el extremo N-terminal o C-terminal de la proteína quimérica). Las regiones transmembrana de un solo paso se encuentran en determinadas moléculas de CD, receptores de tirosina quinasa, receptores de serina/treonina quinasa, TGFbeta, BMP, activina y fosfatasas. Las regiones transmembrana de un solo paso incluyen a menudo una región de péptido señal y una región transmembrana de aproximadamente 20 a aproximadamente 25 aminoácidos, muchos de los cuales son aminoácidos hidrófobos y pueden formar una hélice alfa. Una pequeña pista de aminoácidos cargados positivamente a menudo sigue el tramo transmembrana para anclar la proteína en la membrana. Las proteínas de paso múltiple incluyen bombas de iones, canales de iones y transportadores, e incluyen dos o más hélices que atraviesan la membrana varias veces. A veces, toda o sustancialmente toda una proteína de paso múltiple se incorpora en una proteína quimérica. Las secuencias para las regiones transmembrana de un solo paso y de múltiples pasos son conocidas y pueden seleccionarse para su incorporación en una molécula de proteína quimérica por la persona con experiencia en la técnica.

Se puede emplear cualquier secuencia de direccionamiento a la membrana que sea funcional en el huésped y pueda, o no, estar asociada con uno de los otros dominios de la proteína quimérica. En algunas realizaciones, dichas secuencias incluyen, aunque no de forma limitativa, secuencia de direccionamiento a miristoilación, secuencia de direccionamiento a palmitoilación, secuencias de prenilación (es decir, farnesilación, geranilgeranilación, CAAX Box), o secuencias transmembrana (que utilizan péptidos señal) de los receptores. En otros casos, dichas secuencias incluyen motivos de interacción de proteína-proteína. Los ejemplos incluyen los descritos en, por ejemplo, ten Klooster JP y col, Biology of the Cell (2007) 99, 1-12, Vincent, S., y col., Nature Biotechnology 21: 936-40, 1098 (2003).

Existen dominios proteicos adicionales que pueden aumentar la retención de proteínas en diversas membranas. Por ejemplo, un dominio de pleckstrin homology (homología de pleckstrina - PH) de ~120 aminoácidos se encuentra en más de 200 proteínas humanas que típicamente están implicadas en la señalización intracelular. Los dominios PH pueden unirse a diversos lípidos de fosfatidilinositol (PI) dentro de las membranas (p. ej., PI (3,4,5)-P³, PI (3,4)-P², PI (4,5)-P²) y así desempeñar un papel clave en el reclutamiento de proteínas para diferentes compartimentos celulares o de membrana. A menudo, el estado de fosforilación de los lípidos PI está regulado, tal como, por la quinasa PI-3 o PTEN y, por lo tanto, la interacción de las membranas con los dominios PH no es tan estable como por los lípidos acilo.

E. Marcadores seleccionables

En determinados casos, los constructos de expresión contienen constructos de ácido nucleico cuya expresión se identifica in vitro o in vivo mediante la inclusión de un marcador en el constructo de expresión. Dichos marcadores conferirían un cambio identificable a la célula, lo que permitiría una fácil identificación de las células que contienen el constructo de expresión. Normalmente, la inclusión de un marcador de selección de fármacos ayuda en la clonación y en la selección de transformantes. Por ejemplo, los genes que confieren resistencia a la neomicina, puromicina, higromicina, DHFR, GPT, zeocina e histidinol son marcadores seleccionables útiles. Alternativamente, se emplean enzimas tales como la timidina quinasa (tk) del virus del herpes simple. Además, se pueden emplear marcadores inmunológicos de superficie que contengan los dominios extracelulares no señalizadores o diversas proteínas (p. ej., CD34, CD19, LNGFR), permitiendo un método sencillo para la clasificación mediada por anticuerpos magnéticos o de fluorescencia. No se cree que el marcador seleccionable empleado sea importante, siempre que sea capaz de expresarse simultáneamente con el ácido nucleico que codifica un producto génico. Un experto en la técnica conoce bien otros ejemplos de marcadores seleccionables e incluyen informadores tales como EGFP, beta-gal o cloranfenicol acetiltransferasa (CAT).

F. Regiones de control

1. Promotores

No se cree que el promotor particular empleado para controlar la expresión de una secuencia de polinucleótidos de interés sea importante, siempre que sea capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en la célula objetivo. Por lo tanto, cuando se dirige a una célula humana, puede ser preferible colocar la región codificante de la secuencia de polinucleótidos adyacente y bajo el control de un promotor que sea capaz de expresarse en una célula humana. En términos generales, dicho promotor podría incluir un promotor humano o viral.

En diversos casos, el promotor del gen temprano inmediato del citomegalovirus (CMV) humano, el promotor temprano de SV40, la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous, la 6-actina, el promotor de insulina de rata y la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa se pueden usar para obtener una expresión de alto nivel de la secuencia codificante de interés. El uso de otros promotores de fagos bacterianos o celulares virales o de mamíferos que son bien conocidos en la técnica para lograr la expresión de una secuencia codificante de interés, también se contempla, siempre que los niveles de expresión sean suficientes para una finalidad dada. Al emplear un promotor con propiedades bien conocidas, el nivel y patrón de expresión de la proteína de interés se puede optimizar después de la transfección o transformación.

La selección de un promotor regulado en respuesta a señales fisiológicas o sintéticas específicas puede permitir la expresión inducible del producto génico. Por ejemplo, en el caso en el que la expresión de un transgén, o transgenes cuando se utiliza un vector multicistrónico, es tóxica para las células en las que se produce el vector, se prefiere prohibir o reducir la expresión de uno o más de los transgenes. Los ejemplos de transgenes que son tóxicos para la línea celular productora son genes proapoptóticos y de citoquinas. Varios sistemas de promotores inducibles se encuentran disponibles para la producción de vectores virales donde los productos transgénicos son tóxicos (se añaden en promotores más inducibles).

El sistema de la ecdisona (Invitrogen, Carlsbad, CA) es uno de dichos sistemas. Este sistema está diseñado para permitir la expresión regulada de un gen de interés en células de mamíferos. Consiste en un mecanismo de expresión estrictamente regulado que prácticamente no permite la expresión de nivel basal del transgén, pero tiene una inducibilidad superior a 200 veces. El sistema se basa en el receptor de ecdisona heterodimérico de Drosophila, y cuando la ecdisona o un análogo tal como la muristerona A se une al receptor, el receptor activa un promotor para activar la expresión del transgén corriente abajo, se alcanzan niveles elevados de transcritos de ARNm. En este sistema, ambos monómeros del receptor heterodimérico se expresan constitutivamente a partir de un vector, mientras que el promotor sensible a la ecdisona, que dirige la expresión del gen de interés, está en otro plásmido. Por lo tanto, la ingeniería de este tipo de sistema en el vector de transferencia de genes de interés sería útil. La transfección conjunta de plásmidos que contienen el gen de interés y los monómeros del receptor en la línea celular productora permitiría después la producción del vector de transferencia génica sin la expresión de un transgén potencialmente tóxico. En el momento apropiado, la expresión del transgén podría activarse con ecdisona o muristerona A.

Otro sistema inducible que sería útil es el sistema Tet-Off™ o Tet-On™ (Clontech, Palo Alto, CA) desarrollado originalmente por Gossen y Bujard (Gossen y Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5547-5551, 1992; Gossen y col., Science, 268: 1766-1769, 1995). Este sistema también permite que se regulen altos niveles de expresión génica en respuesta a la tetraciclina o derivados de tetraciclina tal como la doxiciclina. En el sistema Tet-On™, la expresión génica se activa en presencia de doxiciclina, mientras que en el sistema Tet-Off™, la expresión génica se activa en ausencia de doxiciclina. Estos sistemas se basan en dos elementos reguladores derivados del operón de resistencia a tetraciclina de E. coli. La secuencia del operador de tetraciclina a la que el represor de tetraciclina se une y la proteína represora de tetraciclina. El gen de interés se clona en un plásmido detrás de un promotor que tiene elementos sensibles a la tetraciclina presentes. Un segundo plásmido contiene un elemento regulador llamado transactivador controlado por tetraciclina, que está compuesto, en el sistema Tet-Off™, del dominio VP16 del virus del herpes simple y el represor de tertraciclina natural. Por lo tanto, en ausencia de doxiciclina, la transcripción está activada constitutivamente. En el sistema Tet-On™, el represor de tetraciclina no es natural y en presencia de doxiciclina activa la transcripción. Para la producción de vectores de terapia génica, el sistema Tet-Off™ se puede utilizar para que las células productoras puedan cultivarse en presencia de tetraciclina o doxiciclina y evitar la expresión de un transgén potencialmente tóxico, pero cuando el vector se introduce en el paciente, la expresión génica estaría constitutivamente activada.

En algunas circunstancias, se prefiere regular la expresión de un transgén en un vector de terapia génica. Por ejemplo, se utilizan diferentes promotores virales con diferentes intensidades de actividad dependiendo del nivel de expresión deseado. En células de mamíferos, el promotor temprano inmediato de CMV se usa a menudo para proporcionar una fuerte activación transcripcional. El promotor de CMV se revisa en Donnelly, J.J., y col., 1997. Annu. Rev. Immunol. 15: 617-48.

Las versiones modificadas del promotor de CMV que son menos potentes también se han usado cuando se desean niveles reducidos de expresión del transgén. Cuando se desea la expresión de un transgén en células hematopoyéticas, a menudo se usan promotores retrovirales tales como los LTR de MLV o MMTV. Otros promotores virales que se utilizan dependiendo del efecto deseado incluyen SV40, RSV LTR, HIV-1 y HIV-2 LTR, promotores de adenovirus tales como los de la región E1A, E2A o MLP, AAV LTR, HSV-TK y virus de sarcoma aviar.

De forma similar, los promotores específicos de tejido se usan para efectuar la transcripción en tejidos o células específicos para reducir la toxicidad potencial o los efectos no deseables en tejidos no dirigidos. Estos promotores pueden dar como resultado una expresión reducida en comparación con un promotor más fuerte, tal como el promotor CMV, pero también pueden dar como resultado una expresión e inmunogenicidad más limitadas. (Bojak, A., y col., 2002. Vaccine. 20: 19 75-79; Cazeaux., N. y col., 2002. Vaccine 20:3322-31). Por ejemplo, los promotores específicos de tejido tales como el promotor asociado a PSA o la calicreína glandular específica de la próstata, o el gen de la creatina quinasa muscular pueden usarse cuando sea apropiado.

En determinadas indicaciones, se prefiere activar la transcripción en momentos específicos después de la administración del vector de terapia génica. Esto se hace con promotores tales como los que son regulables por hormonas o citoquinas. Los promotores sensibles a citoquinas y proteínas inflamatorias que se pueden usar incluyen el cininógeno K y T (Kageyama y col., (1987) J. Biol. Chem., 262, 2345-2351), c-fos, TNF-alfa, proteína C reactiva (Arcone, y col., (1988) Nucl. Acids Res., 16 (8), 3195-3207), haptoglobina (Oliviero y col., (1987) EMBO J., 6, 1905-1912), amiloide sérico A2, C/EBP alfa, IL-1, iL-6 (Poli y Cortese, (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USa , 86, 8202-8206), complemento C3 (Wilson y col., (1990) Mol. Cell. Biol., 6181-6191), IL-8, glicoproteína ácida alfa-1 (Prowse y Baumann, (1988) Mol Cell Biol, 8, 42-51), alfa-1 antitripsina, lipoproteína lipasa (Zechner y col., Mol. Cell. Biol., 2394-2401, 1988), angiotensinógeno (Ron, y col., (1991) Mol. Cell. Biol., 2887-2895), fibrinógeno, c-jun (inducible por ésteres de forbol, TNF-alfa, radiación UV, ácido retinoico y peróxido de hidrógeno), colagenasa (inducida por ésteres de forbol y ácido retinoico), metalotioneína (inducible por metales pesados y glucocorticoides), estromelisina (inducible por éster de forbol, interleucina-1 y EGF), alfa-2 macroglobulina y alfa-1 anti-quimotripsina. Otros promotores incluyen, por ejemplo, SV40, MMTV, virus de inmunodeficiencia humana (MV), virus de Moloney, ALV, virus de Epstein Barr, virus del sarcoma de Rous, actina humana, miosina, hemoglobina y creatina.

Se contempla que cualquiera de los promotores anteriores solo o junto con otro puede ser útil dependiendo de la acción deseada. Los promotores y otros elementos reguladores son seleccionados por el experto en la técnica de manera que sean funcionales en las células o tejidos deseados. Además, esta lista de promotores no debe interpretarse como exhaustiva o limitante, los expertos en la técnica conocerán otros promotores que se usan junto con los promotores y métodos descritos en este documento.

2. Potenciadores

Los potenciadores son elementos genéticos que aumentan la transcripción de un promotor ubicado en una posición distante en la misma molécula de ADN. Los primeros ejemplos incluyen los potenciadores asociados con inmunoglobulina y receptores de células T que flanquean la secuencia codificante y se producen dentro de varios intrones. Muchos promotores virales, tales como CMV, SV40 y LTR retrovirales, están estrechamente asociados con la actividad potenciadora y, a menudo, se tratan como elementos únicos. Los potenciadores se organizan de forma muy similar a los promotores. Es decir, están compuestos por muchos elementos individuales, cada uno de los cuales se une a una o más proteínas transcripcionales. La distinción básica entre potenciadores y promotores es operativa. Una región potenciadora en su conjunto debe poder estimular la transcripción a distancia y, a menudo, independiente de la orientación; esto no tiene por qué ser cierto para una región promotora o sus elementos componentes. Por otro lado, un promotor debe tener uno o más elementos que dirijan el inicio de la síntesis de ARN en un sitio particular y en una orientación particular, mientras que los potenciadores carecen de estas especificidades. Los promotores y potenciadores a menudo se superponen y son contiguos, y a menudo parecen tener una organización modular muy similar. Un subconjunto de potenciadores son las locus-control regions (regiones de control de locus - LCR) que no solo pueden aumentar la actividad transcripcional, sino que (junto con los elementos aislantes) también pueden ayudar a aislar el elemento transcripcional de las secuencias adyacentes cuando se integran en el genoma.

Cualquier combinación de promotor/potenciador (según la base de datos de promotores eucariotas EPDB) puede usarse para dirigir la expresión del gen, aunque muchos restringirán la expresión a un tipo de tejido particular o subconjunto de tejidos. (revisado en, por ejemplo, Kutzler, M.A., y Weiner, D.B., 2008. Nature Reviews Genetics 9: 776-88). Los ejemplos incluyen, aunque no de forma limitativa, potenciadores de la actina humana, miosina, hemoglobina, creatina quinasa muscular, secuencias y de virus CMV, RSV y EBV. Los expertos en la técnica podrán seleccionar potenciadores apropiados para aplicaciones particulares. Las células eucariotas pueden soportar la transcripción citoplasmática de determinados promotores bacterianos si se proporciona la polimerasa bacteriana apropiada, ya sea como parte del complejo de suministro o como un constructo de expresión genética adicional.

3. Señales de poliadenilación

Cuando se emplea un inserto de ADNc, típicamente se deseará incluir una señal de poliadenilación para efectuar la poliadenilación apropiada del transcrito del gen. No se cree que la naturaleza de la señal de poliadenilación sea crucial para la práctica satisfactoria de los presentes métodos, y se emplea cualquier secuencia tal como la hormona del crecimiento humana o bovina y las señales de poliadenilación de SV40 y las señales de poliadenilación de LTR. Un ejemplo no limitativo es la señal de poliadenilación de SV40 presente en el plásmido pCEP3 (Invitrogen, Carlsbad, California). Además como elemento del casete de expresión se contempla un terminador. Estos elementos pueden servir para mejorar los niveles de mensajes y minimizar la lectura del casete a otras secuencias. Las secuencias de señal de terminación o de poli(A) pueden ser, por ejemplo, colocadas aproximadamente 11 -30 nucleótidos corriente abajo de una secuencia conservada (AAUAAA) en el extremo 3’ del ARNm. (Montgomery, D.L. y col., 1993. DNA Cell Biol. 12: 777-83; Kutzler, M.A. y Weiner, D.B., 2008. Nature Rev. Gen. 9: 776-88).

4. Señales de iniciación y sitios de unión al ribosoma internos

Una señal de iniciación específica también puede ser necesaria para una traducción eficaz de las secuencias codificantes. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG o secuencias adyacentes. Puede ser necesario proporcionar señales de control de la traducción exógenas, incluido el codón de iniciación ATG. El experto en la técnica sería capaz de determinar fácilmente esto y proporcionar las señales necesarias. Es bien sabido que el codón de iniciación debe estar en marco con el marco de lectura de la secuencia codificante deseada para asegurar la traducción del inserto completo. Las señales de control de la traducción exógenas y los codones de iniciación pueden ser naturales o sintéticos. La eficacia de la expresión puede mejorarse mediante la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción apropiados.

En determinados casos, el uso de elementos de internal ribosome entry sites (sitios de entrada al ribosoma internos -IRES) se usa para crear mensajes multigénicos o policistrónicos. Los elementos IRES son capaces de evitar el modelo de análisis de ribosomas de la traducción dependiente del casquete metilado en 5’ y comenzar la traducción en los sitios internos (Pelletier y Sonenberg, Nature, 334: 320-325, 1988). Se han descrito elementos IRES de dos miembros de la familia de los picornavirus (polio y encefalomiocarditis) (Pelletier y Sonenberg, 1988), así como un IRES de un mensaje de mamífero (Macejak y Sarnow, Nature, 353: 90-94, 1991). Los elementos IRES se pueden unir a marcos de lectura abiertos heterólogos. Múltiples marcos de lectura abiertos se pueden transcribir entre sí, cada uno separado por un IRES, creando mensajes policistrónicos. En virtud del elemento IRES, cada marco de lectura abierto es accesible a los ribosomas para una traducción eficiente. Los múltiples genes pueden expresarse de manera eficiente usando un solo promotor/potenciador para transcribir un solo mensaje (véase las patentes US-5.925.565 y US-5.935.819).

G. Optimización de la secuencia

La producción de proteínas también se puede incrementar optimizando los codones en el transgén. Los cambios de codones específicos de la especie, conocidos por los expertos en la técnica, pueden usarse para aumentar la producción de proteínas. Además, los codones pueden optimizarse para producir un ARN optimizado, lo que puede resultar en una traducción más eficiente. Al optimizar los codones que se incorporarán en el ARN, elementos tales como los que dan como resultado una estructura secundaria que causa inestabilidad, estructuras de ARNm secundarias que pueden, por ejemplo, inhibir la unión ribosómica, o secuencias crípticas que pueden inhibir la exportación nuclear de ARNm se pueden eliminar. (Kutzler, M.A. y Weiner, D.B., 2008. Nature Rev. Gen. 9: 776-88; Yan., J. y col., 2007. Mol. Ther. 15: 411-21; Cheung, Y.K., y col., 2004. Vaccine 23: 629-38; Narum., D.L. y col., 2001. 69: 7250-55; Yadava, A. y Ockenhouse, C.F., 2003. Infect. Immun. 71: 4962-69; Smith., J.M. y col., 2004. AIDS Res. Hum. Retroviruses 20: 1335-47; Zhou, W. y col., 2002. Vet. Microbiol. 88: 127-51; Wu, X., y col., 2004. Biochem. Biophys. Res. Comun. 313: 89-96; Zhang, W. y col., 2006. Biochem. Biophys. Res. Comun. 349: 69-78; Demi, L.A. y col., 2001. J. Virol. 75: 1099-11001; Schneider, R.M. y col., 1997. J. Virol. 71: 4892-4903; Wang, S.D. y col., 2006. Vaccine 24: 4531-40; zur Megede. J.; y col., 2000. J. Virol. 74: 2628 2635).

H. Secuencias líder

Las secuencias líder, como saben los expertos en la técnica, se pueden añadir para mejorar la estabilidad del ARNm y dar como resultado una traducción más eficiente. La secuencia líder normalmente está involucrada en dirigir el ARNm al retículo endoplásmico. Los ejemplos incluyen, la secuencia señal para la glicoproteína de la envoltura del VIH-1 (Env), que retrasa su propia escisión, y la secuencia líder del gen IgE (Kutzler, M.A. y Weiner, D.B., 2008. Nature Rev. Gen. 9: 776 88; Li, V., y col., 2000. Virology 272: 417-28; Xu, Z.L., y col. 2001. Gene 272: 149-56; Malin, A.S., y col., 2000. Microbes Infect. 2: 1677-85; Kutzler, M.A., y col., 2005. J. Immunol. 175: 112-125; Yang., J.S. y col., 2002. Emerg. Infect. Dis. 8: 1379-84; Kumar., S. y col., 2006. DnA Cell Biol. 25: 383-92; Wang, S. y col., 2006. Vaccine 24: 4531 -40). El líder de IgE se puede usar para mejorar la inserción en el retículo endoplásmico (Tepler, I, y col. (1989) J. Biol. Chem. 264: 5912).

La expresión de los transgenes puede optimizarse y/o controlarse mediante la selección de métodos apropiados para optimizar la expresión, conocidos por los expertos en la técnica. Estos métodos incluyen, por ejemplo, la optimización de promotores, métodos de suministro y secuencias de genes (por ejemplo, como se presenta en Laddy, D.J., y col., 2008. PLoS.ONE 3 e2517; Kutzler, M.A. y Weiner, D.B., 2008. Nature Rev. Gen. 9: 776-88).

Métodos de transferencia génica

Para mediar el efecto de la expresión del transgén en una célula, será necesario transferir los constructos de expresión a una célula. Dicha transferencia puede emplear métodos de transferencia de genes virales o no virales. Esta sección proporciona una descripción de los métodos y composiciones de la transferencia de genes.

Una célula transformada que comprende un vector de expresión se genera introduciendo en la célula el vector de expresión. Los métodos adecuados para el suministro de polinucleótidos para la transformación de un orgánulo, una célula, un tejido u organismo para su uso con los métodos actuales incluyen prácticamente cualquier método mediante el cual un polinucleótido (p. ej., ADN) se pueda introducir en un orgánulo, una célula, un tejido o un organismo, como se describe en la presente memoria o como sería conocido para el experto en la técnica.

Una célula huésped puede utilizarse, y se ha utilizado, como receptora de vectores. Las células huésped pueden derivar de procariotas o eucariotas, dependiendo de si el resultado deseado es la replicación del vector o la expresión de parte o todas las secuencias de polinucleótidos codificadas por el vector. Numerosas líneas celulares y cultivos se encuentran disponibles para su uso como célula huésped, y pueden obtenerse a través de la American Type Culture Collection (ATCC), que es una organización que sirve como archivo de cultivos vivos y materiales genéticos. En casos específicos, la célula huésped es una célula dendrítica, que es una célula presentadora de antígeno.

Está dentro del conocimiento y la habilidad de un experto en la materia determinar un huésped apropiado. Generalmente esto se basa en la cadena principal del vector y el resultado deseado. Un plásmido o cósmido, por ejemplo, puede introducirse en una célula huésped procariota para la replicación de muchos vectores. Las células bacterianas utilizadas como células huésped para la replicación y/o expresión de vectores incluyen DH5alpha, JM109 y KC8, así como una serie de huéspedes bacterianos disponibles comercialmente tales como SURE® Competent Cells y SOLOPACK Gold Cells (STRAt Ag ENE®, La Jolla, c A). Alternativamente, las células bacterianas tales como E. coli LE392 podrían usarse como células huésped de virus fagos. Las células eucariotas que pueden usarse como células huésped incluyen, aunque no de forma limitativa, levadura, insectos y mamíferos. Los ejemplos de células huésped eucariotas de mamíferos para la replicación y/o expresión de un vector incluyen, aunque no de forma limitativa, HeLa, NIH3T3, Jurkat, 293, COS, CHO, Saos y PC12. Los ejemplos de cepas de levadura incluyen, aunque no de forma limitativa, YPH499, YPH500 e YPH501.

Las vacunas de ácido nucleico son conocidas por los expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, vectores de ADN no virales, ADN y ARN “desnudos” y vectores virales. Los métodos para transformar células con estas vacunas y para optimizar la expresión de genes incluidos en estas vacunas son conocidos y también se describen en la presente memoria.

A. Ejemplos de métodos de transferencia de ácidos nucleicos o vectores virales

1. Transformación ex vivo

Los métodos para transfectar células vasculares y tejidos extraídos de un organismo en un entorno ex vivo son conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las células endoteliales caninas se han alterado genéticamente mediante la transferencia de genes retrovirales in vitro y se han trasplantado a un canino (Wilson y col., Science, 244: 1344-1346, 1989) . En otro ejemplo, células endoteliales de minipig de Yucatán fueron transfectadas por retrovirus in vitro y trasplantadas a una arteria usando un catéter de doble balón (Nabel y col., Science, 244(4910): 1342-1344, 1989). Por lo tanto, se contempla que las células o tejidos se puedan extraer y transfectar ex vivo usando los polinucleótidos presentados en la presente memoria. En aspectos particulares, las células o tejidos trasplantados se pueden colocar en un organismo. Por lo tanto, está bien dentro del conocimiento del experto en la técnica aislar células dendríticas de un animal, transfectar las células con el vector de expresión y después administrar las células transfectadas o transformadas de nuevo al animal.

2. Inyección

En determinados casos, un polinucleótido se puede suministrar a un orgánulo, una célula, un tejido o un organismo mediante una o más inyecciones (es decir, una inyección con aguja), tal como, por ejemplo, por vía subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, etc. Los métodos de inyección de vacunas son bien conocidos por los expertos en la técnica (p. ej., inyección de una composición que comprende una solución salina). Otros casos incluyen la introducción de un polinucleótido mediante microinyección directa. La cantidad del vector de expresión utilizado puede variar según la naturaleza del antígeno, así como el orgánulo, célula, tejido u organismo utilizado.

Las inyecciones intradérmicas, intranodales o intralinfáticas son algunos de los métodos de administración de DC más comúnmente utilizados. La inyección intradérmica se caracteriza por una baja tasa de absorción en el torrente sanguíneo pero una rápida absorción en el sistema linfático. La presencia de un gran número de células dendríticas de Langerhans en la dermis transportará el antígeno intacto y procesado a los nódulos linfáticos de drenaje. Es necesaria una preparación adecuada del sitio para realizar esto correctamente (es decir, el vello se debe cortar para observar la colocación correcta de la aguja). La inyección intranodal permite el suministro directo de antígeno a los tejidos linfoides. La inyección intralinfática permite la administración directa de DC.

3. Electroporación

En determinados casos, un polinucleótido se introduce en un orgánulo, una célula, un tejido o un organismo mediante electroporación. La electroporación implica la exposición de una suspensión de células y ADN a una descarga eléctrica de alto voltaje. En algunas variantes de este método, determinadas enzimas que degradan la pared celular, tales como las enzimas que degradan la pectina, se emplean para hacer que las células receptoras objetivo sean más susceptibles a la transformación por electroporación que las células no tratadas (patente US-5.384.253).

La transfección de células eucariotas mediante electroporación ha tenido bastante éxito. Los linfocitos pre-B de ratón se han transfectado con genes de inmunoglobulina kappa humana (Potter y col., (1984) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 81, 7161-7165), y los hepatocitos de rata se han transfectado con el gen cloranfenicol acetiltransferasa (Tur-Kaspa y col., (1986) Mol. Cell Biol., 6, 716-718) de esta manera.

4. Fosfato de calcio

En otros casos, un polinucleótido se introduce en las células usando precipitación con fosfato de calcio. Las células KB humanas se han transfectado con ADN de adenovirus 5 (Graham y van der Eb, (1973) Virology, 52, 456-467) usando esta técnica. Además de esta manera, las células L(A9) de ratón, C127, CHO, CV-1, BHK, NIH3T3 y HeLa de ratón se transfectaron con un gen marcador de neomicina (Chen y Okayama, Mol. Cell Biol., 7(8): 2745-2752, 1987), y los hepatocitos de rata se transfectaron con una diversidad de genes marcadores (Rippe y col., Mol. Cell Biol., 10: 689-695, 1990) .

5. DEAE-dextrano

En otro caso, un polinucleótido se suministra a una célula usando DEAE-dextrano seguido de polietilenglicol. De esta manera, los plásmidos informadores se introdujeron en células de eritroleucemia y mieloma de ratón (Gopal, TV, Mol Cell Biol. 1985 May; 5(5): 1188-90).

6. Carga de sonicación

Los casos adicionales incluyen la introducción de un polinucleótido mediante carga sónica directa. Los fibroblastos de LTK se han transfectado con el gen de timidina quinasa mediante carga de sonicación (Fechheimer y col., (1987) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 84, 8463-8467).

7. Transfección mediada por liposomas

En un caso adicional, un polinucleótido puede estar atrapado en un complejo lipídico tal como, por ejemplo, un liposoma. Los liposomas son estructuras vesiculares caracterizadas por una membrana bicapa de fosfolípidos y un medio acuoso interno. Los liposomas multilaminares tienen múltiples capas lipídicas separadas por medio acuoso. Se forman espontáneamente cuando los fosfolípidos se suspenden en un exceso de solución acuosa. Los componentes lipídicos experimentan auto-redisposición antes de la formación de estructuras cerradas y atrapan el agua y los solutos disueltos entre las bicapas lipídicas (Ghosh y Bachhawat, (1991) en: Liver Diseases, Targeted Diagnosis and Therapy Using Specific Receptors and Ligands, págs. 8-104). Además se contempla un polinucleótido complejado con Lipofectamine (Gibco BRL) o Superfect (Qiagen).

8. Transfección mediada por receptores

Más aún, un polinucleótido puede suministrarse a una célula objetivo mediante vehículos de suministro mediados por receptor. Estos se aprovechan de la absorción selectiva de macromoléculas por endocitosis mediada por receptores que se producirá en una célula objetivo. En vista de la distribución específica de tipo celular de diversos receptores, este método de suministro añade otro grado de especificidad.

Determinados vehículos de direccionamiento a genes mediados por receptores comprenden un ligando específico de receptor celular y un agente de unión a polinucleótidos. Otros comprenden un ligando específico de receptor celular al que el polinucleótido a suministrar se ha unido operativamente. Varios ligandos se han utilizado para la transferencia de genes mediada por receptores (Wu y Wu, (1987) J. Biol. Chem., 262, 4429-4432; Wagner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87(9): 3410-3414, 1990; Perales y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 4086-4090, 1994; Myers, EPO 0273085), que establece la operabilidad de la técnica. El suministro específico se ha descrito en el contexto de otro tipo de células de mamífero (Wu y Wu, Adv. Drug Delivery Rev., 12: 159-167, 1993). En determinados aspectos, un ligando se elige para que corresponda a un receptor expresado específicamente en la población de células objetivo.

En otros casos, un componente de vehículo de suministro de polinucleótidos de un vehículo de direccionamiento a polinucleótidos específico de célula puede comprender un ligando de unión específico junto con un liposoma. El polinucleótido o polinucleótidos que se van a suministrar se aloja(n) dentro del liposoma y el ligando de unión específico se incorpora funcionalmente en la membrana del liposoma. Por lo tanto, el liposoma se unirá específicamente al receptor o receptores de una célula objetivo y suministrará el contenido a una célula. Se ha demostrado que dichos sistemas son funcionales usando sistemas en los que, por ejemplo, el epidermal growth factor (factor de crecimiento epidérmico - EGF) se usa en el suministro mediado por receptor de un polinucleótido a células que presentan regulación positiva del receptor de EGF.

En otros casos más, el componente de vehículo de suministro de polinucleótidos de un vehículo de suministro dirigido puede ser un liposoma en sí mismo, que puede comprender, por ejemplo, uno o más lípidos o glicoproteínas que dirigen la unión específica de células. Por ejemplo, lactosil-ceramida, un asialogangliósido terminal de galactosa se han incorporado a los liposomas, y se ha observado un aumento en la absorción del gen de insulina por los hepatocitos (Nicolau y col., (1987) Methods Enzymol., 149, 157-176). Se contempla que los constructos de transformación específicos de tejido se pueden suministrar específicamente en una célula objetivo de una manera similar.

9. Bombardeo con microproyectiles

Las técnicas de bombardeo con microproyectiles se pueden usar para introducir un polinucleótido en al menos un orgánulo, célula, tejido u organismo (patente US-5.550.318; patente US-5.538.880; patente US-5.610.042 y PCT WO 94/09699). Este método depende de la capacidad de acelerar microproyectiles recubiertos de ADN a una alta velocidad que les permita atravesar las membranas celulares y entrar en las células sin matarlas (Klein y col., (1987) Nature, 327, 70-73). Existe una amplia diversidad de técnicas de bombardeo con microproyectiles conocidas en la técnica, muchas de las cuales son aplicables a los presentes métodos.

En este bombardeo de microproyectiles, una o más partículas pueden recubrirse con al menos un polinucleótido y suministrarse a las células mediante una fuerza propulsora. Varios dispositivos para acelerar partículas pequeñas han sido desarrollados. Uno de estos dispositivos se basa en una descarga de alto voltaje para generar una corriente eléctrica, que a su vez proporciona la fuerza motriz (Yang y col., (1990) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 87, 9568-9572). Los microproyectiles utilizados han consistido en sustancias biológicamente inertes tales como tungsteno o partículas o perlas de oro. Las partículas ilustrativas incluyen aquellas que comprenden tungsteno, platino y, en determinados ejemplos, oro. Se contempla que, en algunos casos, la precipitación de ADN sobre partículas metálicas no sería necesaria para el suministro de ADN a una célula receptora usando bombardeo con microproyectiles. Sin embargo, se contempla que las partículas pueden contener ADN en lugar de estar recubiertas con ADN. Las partículas recubiertas de ADN pueden aumentar el nivel de suministro de ADN a través del bombardeo de partículas, pero no son, en sí mismas, necesarias.

B. Ejemplos de métodos de transferencia mediada por vectores virales

En determinadas realizaciones, un transgén se incorpora en una partícula viral para mediar en la transferencia de genes a una célula. Típicamente, el virus simplemente se expondrá a la célula huésped apropiada en condiciones fisiológicas, lo que permitirá la absorción del virus. Los presentes métodos se emplean de forma ventajosa usando* una diversidad de vectores virales, según se describe a continuación.

1. Adenovirus

El adenovirus es especialmente adecuado para usar como un vector de transferencia de genes debido a su genoma de ADN de tamaño medio, facilidad de manipulación, alta valoración, amplio rango de células objetivo y alta capacidad de infección. El genoma viral de aproximadamente 36 kb está limitado por inverted terminal repeats (repeticiones terminales invertidas - ITR) de 100-200 pares de bases (pb), en las que están contenidos los elementos que actúan en cis necesarios para la replicación y el empaquetamiento del ADN viral. Las regiones temprana (E) y tardía (L) del genoma que contienen diferentes unidades de transcripción se dividen por la presentación de la replicación del ADN viral.

La región E1 (E1A y E1 B) codifica proteínas responsables de la regulación de la transcripción del genoma viral y unos pocos genes celulares. La expresión de la región E2 (E2A y E2B) da como resultado la síntesis de proteínas para la replicación del ADN viral. Estas proteínas están involucradas en la replicación del ADN, la expresión tardía de genes y la interrupción de la célula huésped (Renan, MJ (1990) Radiother Oncol., 19, 197-218). Los productos de los genes tardíos (L1, L2, L3, L4 y L5), que incluyen la mayoría de las proteínas de la cápside viral, se expresan solo después de un procesamiento significativo de un único transcrito primario emitido por el major late promoter (promotor tardío principal -MLP). El MLP (ubicado en 16,8 unidades de mapa) es especialmente eficaz durante la fase tardía de la infección, y todos los ARNm emitidos por este promotor poseen una secuencia tripartite leader (líder tripartita - TL) 5', lo que los hace útiles para la traducción.

Para optimizar los adenovirus para la terapia génica, es necesario maximizar la capacidad de carga de modo que los grandes segmentos de ADN se puedan incluir. Además es muy deseable reducir la toxicidad y la reacción inmunológica asociadas con determinados productos adenovirales. Los dos objetivos son, en cierta medida, coincidentes en el sentido de que la eliminación de genes adenovirales sirve a ambos extremos. Mediante la práctica de los métodos presentes, es posible lograr ambos objetivos mientras se conserva la capacidad de manipular los constructos terapéuticos con relativa facilidad.

El gran desplazamiento del ADN es posible porque los elementos cis necesarios para la replicación del ADN viral se localizan en las inverted terminal repeats (repeticiones terminales invertidas - ITR) (100-200 pb) en cada extremo del genoma viral lineal. Los plásmidos que contienen ITR pueden replicarse en presencia de un adenovirus no defectuoso (Hay, R.T., y col., J Mol Biol. 5 de junio de 1984; 175(4): 493-510).

Por lo tanto, la inclusión de estos elementos en un vector de adenovirus debe permitir la replicación.

Además, la señal de empaquetamiento para la encapsulación viral se localiza entre 194-385 pb (0,5-1,1 unidades de mapa) en el extremo izquierdo del genoma viral (Hearing y col., J. (1987) Virol., 67, 2555-2558). Esta señal imita el sitio de reconocimiento de proteínas en el ADN del bacteriófago lambda, donde una secuencia específica cercana al extremo izquierdo, pero fuera de la secuencia del extremo cohesivo, media la unión a las proteínas necesarias para la inserción del ADN en la estructura principal. Los vectores de sustitución E1 de Ad han demostrado que un fragmento de 450 pb (0-1,25 unidades de mapa) en el extremo izquierdo del genoma viral podría dirigir el empaquetamiento en células 293 (Levrero y col., Gene, 101: 195-202, 1991).

Anteriormente, se ha demostrado que determinadas regiones del genoma adenoviral pueden incorporarse al genoma de células de mamíferos y los genes codificados expresarse de este modo. Estas líneas celulares son capaces de soportar la replicación de un vector de adenovirus que es deficiente en la función de adenovirus codificada por la línea celular. Además ha habido informes de complementación de vectores adenovirales deficientes en replicación mediante vectores “auxiliares” , p. ej., virus natural o mutantes condicionalmente defectuosos.

Los vectores adenovirales de replicación deficiente pueden complementarse, en trans, con virus auxiliares. Sin embargo, esta observación por sí sola no permite el aislamiento de los vectores de replicación deficiente, ya que la presencia del virus auxiliar, necesario para proporcionar funciones replicativas, contaminaría cualquier preparación. Por lo tanto, se necesitaba un elemento adicional que añadiera especificidad a la replicación y/o empaquetamiento del vector de replicación deficiente. Ese elemento se deriva de la función de empaquetamiento del adenovirus.

Se ha demostrado que existe una señal de empaquetamiento para adenovirus en el extremo izquierdo del mapa de adenovirus convencional (Tibbetts y col. (1977) Cell, 12, 243-249). Los estudios posteriores demostraron que un mutante con una deleción en la región E1A (194-358 pb) del genoma crecía mal incluso en una línea celular que complementaba la función temprana (E1A) (Hearing y Shenk, (1983) J. Mol. Biol. 167, 809-822). Cuando un ADN adenoviral de compensación (0-353 pb) se recombinó en el extremo derecho del mutante, el virus se empaquetó normalmente. Otro análisis de mutación identificó un elemento corto, repetido y dependiente de la posición en el extremo izquierdo del genoma de Ad5. Se encontró que una copia de la repetición era suficiente para un empaquetamiento eficiente si estaba presente en cualquier extremo del genoma, pero no cuando se movía hacia el interior de la molécula de ADN de Ad5 (Hearing y col., J. (1987) Virol., 67, 2555-2558).

Al usar versiones mutadas de la señal de empaquetado, es posible crear virus auxiliares que se empaquetan con diferentes eficiencias. Típicamente, las mutaciones son mutaciones puntuales o deleciones. Cuando los virus auxiliares con empaquetamiento de baja eficacia se cultivan en células auxiliares, el virus se empaqueta, aunque a tasas reducidas en comparación con el virus natural, lo que permite la propagación del auxiliar. Sin embargo, cuando estos virus auxiliares se cultivan en células junto con virus que contienen señales de empaquetamiento naturales, las señales de empaquetamiento naturales se reconocen preferiblemente sobre las versiones mutadas. Dada una cantidad limitativa de factor de empaquetamiento, el virus que contiene las señales naturales se empaqueta selectivamente en comparación con los auxiliares. Si la preferencia es lo suficientemente grande, se deben lograr valores próximos a la homogeneidad.

Para mejorar el tropismo de los constructos de ADV para tejidos o especies particulares, las secuencias de fibras de unión al receptor a menudo pueden sustituirse entre aislados adenovirales. Por ejemplo, el ligando del Coxsackieadenovirus receptor (Receptor de adenovirus de Coxsackie - CAR) que se encuentra en el adenovirus 5 puede sustituirse por la secuencia de fibras de unión a CD46 del adenovirus 35, lo que genera un virus con una afinidad de unión muy mejorada por las células hematopoyéticas humanas. El virus “pseudotipado” resultante, Ad5f35, ha sido la base de varios aislados virales desarrollados clínicamente. Además, existen diversos métodos bioquímicos para modificar la fibra y permitir el redireccionamiento del virus a las células objetivo, tales como las células dendríticas. Los métodos incluyen el uso de anticuerpos bifuncionales (con un extremo que se une al ligando CAR y un extremo que se une a la secuencia objetivo), y la biotinilación metabólica de la fibra para permitir la asociación con ligandos quiméricos personalizados basados en avidina. Alternativamente, se podrían unir ligandos (p. ej., anti-CD205 mediante enlazadores heterobifuncionales (p. ej., que contienen PEG) a la partícula de adenovirus.

2. Retrovirus

Los retrovirus son un grupo de virus de ARN monocatenario que se caracterizan por la capacidad de convertir su ARN en ADN bicatenario en células infectadas mediante un proceso de transcripción inversa (Coffin, (1990) en: Virology, ed., Nueva York: Raven Press, págs. 1437-1500). El ADN resultante se integra a continuación de manera estable en los cromosomas celulares como un provirus y dirige la síntesis de proteínas virales. La integración da como resultado la retención de las secuencias de genes virales en la célula receptora y sus descendientes. El genoma retroviral contiene tres genes, gag, pol y env, que codifican las proteínas de la cápside, la enzima polimerasa y los componentes de la envoltura, respectivamente. Una secuencia que se encuentra corriente arriba del gen gag, denominada psi, funciona como una señal para el empaquetamiento del genoma en viriones. Dos secuencias de long terminal repeat (repetición terminal larga - LTR) están presentes en los extremos 5’ y 3' del genoma viral. Estos contienen secuencias promotoras y potenciadoras fuertes y también son necesarias para la integración en el genoma de la célula huésped (Coffin, 1990).

Para construir un vector retroviral, un ácido nucleico que codifica un promotor se inserta en el genoma viral en lugar de determinadas secuencias virales para producir un virus que es de replicación defectuosa. Para producir viriones, se construye una línea celular de empaquetamiento que contiene los genes gag, pol y env pero sin los componentes LTR y psi (Mann y col., (1983) Cell, 33, 153-159). Cuando un plásmido recombinante que contiene un ADNc humano, junto con las secuencias retrovirales de LTR y psi se introduce en esta línea celular (por precipitación con fosfato de calcio por ejemplo), la secuencia psi permite empaquetar el transcrito de ARN del plásmido recombinante en partículas virales, que a continuación se secretan en los medios de cultivo (Nicolas, J.F. y Rubenstein, J.L.R., (1988) en: Vectors: a Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Rodriquez y Denhardt, Eds.). Nicolas y Rubenstein; Temin y col., (1986) en: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), Nueva York: Plenum Press, págs. 149-188; Mann y col., 1983). El medio que contiene los retrovirus recombinantes se recoge, opcionalmente se concentra y se usa para la transferencia génica. Los vectores retrovirales pueden infectar una amplia diversidad de tipos de células. Sin embargo, la integración y la expresión estable de muchos tipos de retrovirus requieren la división de las células huésped (Paskind y col., (1975) Virology, 67, 242-248).

Recientemente un enfoque diseñado para permitir el direccionamiento específico de vectores retrovirales basado en la modificación química de un retrovirus se desarrolló mediante la adición química de residuos de galactosa a la envoltura viral. Esta modificación podría permitir la infección específica de células tales como hepatocitos a través de receptores de asialoglicoproteína, si se deseara.

Se diseñó un enfoque diferente para el direccionamiento de retrovirus recombinantes en los que se usaron anticuerpos biotinilados contra una proteína de envoltura retroviral y contra un receptor celular específico. Los anticuerpos se acoplaron a través de los componentes de biotina usando estreptavidina (Roux y col., (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 86, 9079-9083). Con el uso de anticuerpos contra antígenos de clase I y clase II del complejo principal de histocompatibilidad, la infección de una diversidad de células humanas que portaban esos antígenos de superficie se demostró con un virus ecotrópico in vitro (Roux y col., 1989).

3. Virus adenoasociado

AAV utiliza un ADN monocatenario lineal de aproximadamente 4700 pares de bases. Las repeticiones terminales invertidas flanquean el genoma. Hay dos genes presentes dentro del genoma, lo que da lugar a varios productos génicos distintos. El primero, el gen cap, produce tres virion proteins (proteínas de virión - VP) diferentes, denominadas VP-1, VP-2 y VP-3. El segundo, el gen rep, codifica cuatro proteínas non- structural (no estructurales - NS). Uno o más de estos productos del gen rep es responsable de transactivar la transcripción de AAV.

Los tres promotores en AAV se designan por su ubicación, en unidades de mapa, en el genoma. Estos son, de izquierda a derecha, p5, p19 y p40. La transcripción da lugar a seis transcritos, dos iniciados en cada uno de los tres promotores, y uno de cada par que empalmará. El sitio de empalme, derivado de las unidades de mapa 42 46, es el mismo para cada transcrito. Las cuatro proteínas no estructurales aparentemente se derivan de los transcritos más largos, y las tres proteínas del virión surgen todas del transcrito más pequeño.

AVV no está asociado con ninguna patología en seres humanos. Curiosamente, para una replicación eficaz, AAV requiere funciones “ auxiliares” de virus tales como el virus del herpes simple I y II, el citomegalovirus, el virus de la pseudorrabia y, por supuesto, el adenovirus. El mejor caracterizado de los auxiliares es el adenovirus, y se ha demostrado que muchas funciones “tempranas” de este virus ayudan a la replicación del AAV. Se cree que la expresión de bajo nivel de las proteínas rep de AAV mantiene bajo control la expresión estructural de AAV, y se cree que la infección por el virus auxiliar elimina este bloqueo.

Las repeticiones terminales del vector de AAV se pueden obtener mediante digestión con endonucleasas de restricción de AAV o un plásmido tal como p201, que contiene un genoma de AAV modificado (Samulski y col., J. Virol., 61: 3096 3101 (1987)), o por otros métodos conocidos por el experto en la materia, que incluyen, aunque no de forma limitativa, síntesis química o enzimática de las repeticiones terminales basadas en la secuencia publicada de AAV. El experto en la materia puede determinar, mediante métodos bien conocidos tales como análisis de deleción, la secuencia mínima o parte de las ITR de AAV que se requiere para permitir la función, es decir, la integración estable y específica del sitio. El experto en la materia también puede determinar qué modificaciones menores de la secuencia pueden tolerarse mientras se mantiene la capacidad de las repeticiones terminales para dirigir la integración específica de sitio estable.

Los vectores basados en AAV han demostrado ser vehículos seguros y eficaces para el suministro de genes in vitro, y estos vectores se están desarrollando y probando en etapas preclínicas y clínicas para un amplio rango de aplicaciones en la terapia génica potencial, tanto ex vivo como in vivo (Carter y Flotte, (1995) Ann. NY. Acad. Sci., 770; 79-90; Chatteijee, y col., (1995) Ann. NY. Acad. Sci., 770,79-90; Ferrari y col., (1996) J. Virol., 70,3227-3234; Fisher y col., (1996) J. Virol., 70,520-532; Flotte y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 90, 10613-10617, (1993); Goodman y col. (1994), Blood, 84, 1492-1500; Kaplitt y col., (1994) Nat'l Genet., 8, 148-153; Kaplitt, M.G. y col., Ann Thorac Surg. diciembre de 1996; 62(6): 1669-76; Kessler y col., (1996) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 93, 14082-14087; Koeberl y col., (1997) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 94, 1426-1431; Mizukami y col., (1996) Virology, 217, 124-130).

La transferencia y expresión génica eficiente mediada por AAV en el pulmón ha llevado a ensayos clínicos para el tratamiento de la fibrosis quística (Carter y Flotte, 1995; Flotte y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 90, 10613-10617, (1993)). De forma similar, las perspectivas para el tratamiento de la distrofia muscular mediante el suministro del gen de la distrofina al músculo esquelético mediada por AAV, de la enfermedad de Parkinson mediante el suministro del gen de la tirosina hidroxilasa al cerebro, de la hemofilia B mediante el suministro del gen del factor IX al hígado, y potencialmente de infarto de miocardio por el gen del factor de crecimiento endotelial vascular en el corazón, parece prometedor ya que la expresión transgénica mediada por AAV en estos órganos ha demostrado recientemente ser altamente eficiente (Fisher y col., (1996) J. Virol., 70, 520-532; Flotte y col., 1993; Kaplitt y col., 1994; 1996; Koeberl y col., 1997; McCown y col., (1996) Brain Res., 713, 99-107; Ping y col., (1996) Microcirculation, 3, 225-228; Xiao y col., (1996) J. Virol., 70, 8098-8108).

4. Otros vectores virales

Otros vectores virales se emplean como constructos de expresión en los presentes métodos y composiciones. Se emplean los vectores derivados de virus tales como el virus vaccinia (Ridgeway, (1988) en: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, págs. 467-492; Baichwal y Sugden, (1986) en, Gene Transfer, págs. 117 148; Coupar y col., Gene, 68: 1-10, 1988), el virus canario y el virus del herpes. Estos virus ofrecen varias características para su uso en la transferencia de genes en diversas células de mamíferos.

Una vez que el constructo se ha suministrado en la célula, el ácido nucleico que codifica el transgén se coloca y expresa en diferentes sitios. En determinados casos, el ácido nucleico que codifica el transgén se integra de forma estable en el genoma de la célula. Esta integración se encuentra en la ubicación y orientación afines a través de la recombinación homóloga (reemplazo de genes) o se integra en una ubicación aleatoria no específica (aumento de genes). En otros casos más, el ácido nucleico se mantiene de forma estable en la célula como un segmento episómico separado de ADN. Dichos segmentos de ácido nucleico o “episomas” codifican secuencias suficientes para permitir el mantenimiento y la replicación independientemente o en sincronización con el ciclo de la célula huésped. Cómo el constructo de expresión se suministra en una célula y en qué lugar el ácido nucleico permanece en la célula depende del tipo de constructo de expresión empleado.

Mejora de una respuesta inmune

En determinados casos, se contempla una novedosa estrategia de activación de DC, que incorpora la manipulación de polipéptidos coestimuladores de señalización que activan las vías NF-kappaB, las vías Akt y/o las vías p38. Este sistema de activación de DC puede usarse junto con o sin vacunas estándar para mejorar la respuesta inmune, ya que reemplaza el requisito de ayuda de las células T CD4+ durante la activación de APC (Bennett, S.R., y col.,. Nature, 1998, 4 de junio. 393: pág. 478-80; Ridge, J.P., D.R.F y P. Nature, 1998, 4 de junio. 393: pág. 474-8; Schoenberger, S.P., y col., Nature, 1998, 4 de junio. 393: pág. 480-3). Por lo tanto, el sistema de activación de DC presentado en la presente memoria mejora las respuestas inmunes evitando la necesidad de generar péptidos específicos de MHC de clase II.

En casos específicos, la activación de DC se realiza mediante la activación de CD40. Por lo tanto, la activación de DC a través de interacciones CD40/CD40L endógenas puede estar sujeta a una regulación negativa debido a la retroalimentación negativa, lo que lleva rápidamente al “efecto de agotamiento de IL-12” . Dentro de las 7 a 10 horas posteriores a la activación de CD40, una isoforma de CD40 (tipo II) empalmada alternativamente se produce como factor secretable (Tone, M., y col., Proc Natl Acad Sci USA, 2001. 98(4): pág. 1751 -1756). El CD40 de tipo II puede actuar como un receptor negativo dominante, regulando negativamente la señalización a través de CD40L y limitando potencialmente la potencia de la respuesta inmune generada. Por lo tanto, los presentes métodos cooptan la regulación natural de CD40 creando una forma inducible de CD40 (iCD40), que carece del dominio extracelular y se activa en su lugar por ligandos dimerizadores sintéticos (Spencer, D.M. y col., Science, 1993. 262: pág. 1019 1024) a través de una tecnología denominada chemically induced dimerization (dimerización inducida químicamente - CID).

Los presentes métodos comprenden métodos para mejorar la respuesta inmune en un sujeto que comprenden la etapa de administrar al sujeto el vector de expresión, el constructo de expresión o las células presentadoras de antígenos transducidas. El vector de expresión codifica un polipéptido coestimulador, tal como iCD40.

En determinados casos, las células presentadoras de antígenos están comprendidas en un animal, tal como un ser humano, un primate no humano, una vaca, un caballo, un cerdo, una oveja, una cabra, un perro, un gato o un roedor. El sujeto puede ser, por ejemplo, un ser humano, por ejemplo, un paciente que padece una enfermedad infecciosa y/o un sujeto que está inmunodeprimido o que padece una enfermedad hiperproliferativa.

En otros casos, el constructo de expresión y/o vector de expresión se pueden utilizar como una composición o sustancia que activa las células presentadoras de antígenos. Una composición de este tipo que “activa las células presentadoras de antígenos” o “ mejora la actividad de las células presentadoras de antígenos” se refiere a la capacidad de estimular una o más actividades asociadas con las células presentadoras de antígenos. Dichas actividades son bien conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, una composición, tal como el constructo de expresión o el vector de los presentes métodos, puede estimular la regulación positiva de moléculas coestimuladoras en las células presentadoras de antígenos, inducir la translocación nuclear de NF-kappaB en las células presentadoras de antígenos, activar receptores de tipo toll en las células presentadoras de antígenos u otras actividades que implican citoquinas o quimioquinas.

El constructo de expresión, el vector de expresión y/o las células presentadoras de antígenos transducidas pueden mejorar o contribuir a la eficacia de una vacuna, por ejemplo, mejorando la inmunogenicidad de antígenos más débiles tales como antígenos altamente purificados o recombinantes, reduciendo la cantidad de antígeno requerida para una respuesta inmune, reduciendo la frecuencia de inmunización requerida para proporcionar inmunidad protectora, mejorando la eficacia de las vacunas en sujetos con respuestas inmunes reducidas o debilitadas, tales como recién nacidos, ancianos e individuos inmunodeprimidos, y mejorando la inmunidad en un tejido objetivo, tal como inmunidad de la mucosa, o promover la inmunidad humoral o mediada por células provocando un perfil de citoquinas particular.

Más aún, un individuo o sujeto inmunodeprimido es un sujeto que tiene una respuesta inmune reducida o debilitada. Dichos individuos también pueden incluir un sujeto que se haya sometido a quimioterapia o cualquier otra terapia que resulte en un sistema inmunológico debilitado, un receptor de trasplante, un sujeto que actualmente toma inmunosupresores, un individuo que envejece o cualquier individuo que tenga células T CD4 auxiliares reducidas y/o deterioradas. Se contempla que los presentes métodos se pueden utilizar para mejorar la cantidad y/o la actividad de las células auxiliares T CD4 en un sujeto inmunodeprimido.

En casos específicos, antes de administrar la célula presentadora de antígeno transducida, las células se desafían con antígenos (también denominados en la presente memoria “ antígenos objetivo” ). Después del desafío las células presentadoras de antígenos cargadas y transducidas se administran al sujeto por vía parenteral, intradérmica, intranodal o intralinfática. Las vías parenterales adicionales incluyen, aunque no de forma limitativa, técnicas subcutáneas, intramusculares, intraperitoneales, intravenosas, intraarteriales, intramiocárdicas, transendocárdicas, transepicárdicas, intratecales y de infusión.

El antígeno objetivo, como se utiliza en la presente memoria, es un antígeno o epítopo inmunológico en el antígeno, que es crucial en el reconocimiento inmunológico y la eliminación o control final del agente causante de la enfermedad o la patología en un mamífero. El reconocimiento inmunológico puede ser celular y/o humoral. En el caso de patógenos intracelulares y cáncer, el reconocimiento inmunológico puede ser, por ejemplo, una respuesta de linfocitos T.

El antígeno objetivo puede derivarse o aislarse de, por ejemplo, un microorganismo patógeno tal como virus que incluyen el VIH (Korber y col, eds HIV Molecular Immunology Database, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, N. Mex.

1977) influenza, Herpes simple, virus del papiloma humano (patente US-5.719.054), hepatitis B (patente US-5.780.036), hepatitis C (patente US-5.709.995), EBV, citomegalovirus (CMV) y lo similar. El antígeno objetivo puede derivarse o aislarse de bacterias patógenas tales como, por ejemplo, de Chlamydia (patente US-5.869.608), Mycobacteria, Legionella, Meningiococcus, Streptococcus del grupo A, Salmonella, Listeria, Hemophilus influenzae (patente US-5.955.596) y lo similar.

El antígeno objetivo puede derivarse o aislarse de, por ejemplo, levadura patógena que incluye Aspergillus, Candida invasora (patente US-5.645.992), Nocardia, Histoplasmosis, Cryptosporidium y lo similar. El antígeno objetivo puede derivarse o aislarse de, por ejemplo, un protozoo patógeno y parásitos patógenos que incluyen, aunque no de forma limitativa, Pneumocystis carinii, Trypanosoma, Leishmania (patente US-5.965.242), Plasmodio (patente US- 5.589.343) y Toxoplasma gondii.

El antígeno objetivo incluye un antígeno asociado con un estado preneoplásico o hiperplásico. El antígeno objetivo también puede estar asociado o ser causante de cáncer. Dicho antígeno objetivo puede ser, por ejemplo, antígeno específico de tumor, tumor associated antigen (antígeno asociado a tumor - TAA) o antígeno específico de tejido, epítopo del mismo y agonista de epítopo del mismo. Dichos antígenos objetivo incluyen, aunque no de forma limitativa, carcinoembryonic antigen (antígeno carcinoembrionario - CEA) y epítopos del mismo tales como CAP-1, CAP-1-6D y lo similar (n.° de acceso GenBank M29540), MART-1 (Kawakarni y col, J. Exp. Med. 180: 347-352, 1994), MAGE-1 (patente US- 5.750.395), MAGE-3, GAGE (patente US- 5.648.226), GP-100 (Kawakami y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91: 6458 6462, 1992), MUC-1, MUC-2, oncogén ras con mutación puntual, oncogenes p53 normales y con mutación puntual (Hollstein y col. Nucleic Acids Res. 22: 3551-3555, 1994), pSm A (Israeli y col Cancer Res. 53: 227-230, 1993), tirosinasa (Kwon y col PNAS 84: 7473-7477, 1987) TRP-1 (gp75) (Cohen y col. Nucleic Acid Res. 18: 2807-2808, 1990; la patente US-5.840.839), NY-ESO-1 (Chen y col PNAS 94: 1914-1918, 1997), TRP-2 (Jackson y col EMBOJ, 11: 527-535, 1992), TAG72, KSA, CA-125, Ps A, HER-2/neu/c-erb/B2, (patente US-5.550.214), BRC-I, b Rc -II, bcr-abl, pax3-fkhr, ews-fli-1, modificaciones de TAA y antígeno específico de tejido, variantes de corte y empalme de TAA, agonistas de epítopo y lo similar. Otros TAA se pueden identificar, aislar y clonar mediante métodos conocidos en la técnica tales como los descritos en la patente US-4.514.506. El antígeno objetivo también puede incluir uno o más factores de crecimiento y variantes de corte y empalme de cada uno.

Un antígeno puede expresarse con más frecuencia en células cancerosas que en células no cancerosas. El antígeno puede resultar del contacto de la célula dendrítica modificada con el prostate specific membrane antigen (antígeno de membrana específico de la próstata - PSMA) o un fragmento del mismo. En determinados casos, la célula dendrítica modificada se pone en contacto con un fragmento de PSMA que tiene la secuencia de aminoácidos de la Id. de sec. n.°: 4 (p. ej., codificada por la secuencia de nucleótidos de la Id. de sec. n.°: 3).

Para los organismos que contienen un genoma de ADN, un gen que codifica un antígeno objetivo o un epítopo inmunológico del mismo de interés se aísla del ADN genómico. Para los organismos con genomas de ARN, el gen deseado puede aislarse de copias de ADNc del genoma. Si están disponibles mapas de restricción del genoma, el fragmento de ADN que contiene el gen de interés se escinde mediante digestión con endonucleasas de restricción mediante métodos rutinarios en la técnica. En los casos en los que el gen deseado se haya clonado previamente, los genes se pueden obtener fácilmente a partir de los clones disponibles. Alternativamente, si se conoce la secuencia de ADN del gen, el gen puede sintetizarse mediante cualquiera de las técnicas convencionales para la síntesis de ácidos desoxirribonucleicos.

Los genes que codifican un antígeno de interés pueden amplificarse, por ejemplo, clonando el gen en un huésped bacteriano. Con este fin, se pueden usar diversos vectores de clonación procariotas. Los ejemplos son los plásmidos pBR322, pUC y pEMBL.

Los genes que codifican al menos un antígeno objetivo o un epítopo inmunológico del mismo pueden prepararse para la inserción en los vectores plasmídicos diseñados para la recombinación con un virus mediante técnicas estándar. Generalmente, los genes clonados pueden escindirse del vector de clonación procariota mediante digestión con enzimas de restricción. En la mayoría de los casos, el fragmento escindido contendrá la región codificante completa del gen. El fragmento de ADN que lleva el gen clonado puede modificarse según sea necesario, por ejemplo, para hacer que los extremos del fragmento sean compatibles con los sitios de inserción de los vectores de ADN utilizados para la recombinación con un virus, y a continuación purificarse antes de la inserción en los vectores en los sitios de escisión de endonucleasas de restricción (sitios de clonación).

La carga de antígenos de células dendríticas con antígenos se puede lograr, por ejemplo, incubando células dendríticas o células progenitoras con el polipéptido, ADN (desnudo o dentro de un vector plasmídico) o ARN; o con bacterias o virus recombinantes que expresan antígenos (p. ej., vectores de vaccinia, viruela aviar, adenovirus o lentivirus). Antes de la carga, el polipéptido se puede conjugar covalentemente con un compañero inmunológico que proporciona ayuda a las células T (p. ej., una molécula portadora). Alternativamente, una célula dendrítica puede pulsarse con un compañero inmunológico no conjugado, por separado o en presencia del polipéptido. Los antígenos de células o moléculas de MHC pueden obtenerse mediante elución ácida u otros métodos conocidos en la técnica (véase Zitvogel L, y col., J Exp Med 1996. 183: 87-97).

En otros casos, la célula presentadora de antígeno transducida se transfecta con ARNm de células tumorales. La célula presentadora de antígeno transducida transfectada se administra a un animal para efectuar la respuesta inmune de los linfocitos T citotóxicos y de los antígenos antitumorales de las células asesinas naturales y se regula utilizando FK506 dimérico y análogos diméricos de FK506. El ARNm de la célula tumoral puede ser, por ejemplo, ARNm de una célula tumoral de próstata.

Más aún, la célula presentadora de antígeno transducida se pulsa con lisados de células tumorales. Las células presentadoras de antígenos transducidas pulsadas se administran a un animal para efectuar la respuesta inmune de los linfocitos T citotóxicos y de los antígenos antitumorales de las células asesinas naturales y se regulan utilizando FK506 dimérico y análogos diméricos de FK506. El lisado de células tumorales puede ser, por ejemplo, un lisado de células tumorales de próstata.

Un experto en la técnica es plenamente consciente de que la activación de la molécula coestimuladora de la presente se basa en la oligomerización de los dominios de unión al ligando, por ejemplo CID, para inducir su actividad. En casos específicos, el ligando no es una proteína. Por ejemplo, el ligando puede ser un FK506 dimérico o análogos diméricos de FK506, que dan como resultado una mejora o regulación positiva de la respuesta inmune; el uso de FK506 monomérico o análogos monoméricos de FK506 da como resultado la inhibición o reducción de la respuesta inmune de forma negativa.

Los linfocitos T pueden activarse por contacto con la célula presentadora de antígeno que comprende el vector de expresión descrito en la presente memoria cuando la célula presentadora de antígeno se ha desafiado, transfectado, pulsado o electrofundido con un antígeno.

La electrofusión es un método para generar células híbridas. Existen varias ventajas en la producción de híbridos de células por electrofusión. Por ejemplo, los parámetros de fusión pueden controlarse electrónicamente de forma fácil y precisa según las condiciones que dependen de las células que se van a fusionar. Además, la electrofusión de células ha demostrado la capacidad de aumentar la eficiencia de la fusión sobre la de la fusión por medios químicos o mediante fusógenos biológicos. La electrofusión se realiza aplicando pulsos eléctricos a las células en suspensión. Al exponer las células a un campo eléctrico alternante, las células se acercan entre sí para formar cadenas de perlas en un proceso denominado alineación por dielectroforesis. Los pulsos de voltaje más altos posteriores hacen que las células entren en contacto más estrecho, se forman electróporos reversibles al permeabilizar reversiblemente y romper mecánicamente las membranas celulares, resultando en fusión.

Las células T expresan un receptor de unión a antígeno único en su membrana (receptor de células T), que solo puede reconocer el antígeno en asociación con moléculas del major histocompatibility complex (complejo principal de histocompatibilidad - MHC) en la superficie de otras células. Existen varias poblaciones de células T, tales como las células T auxiliares y las células T citotóxicas. Las células T auxiliares y las células T citotóxicas se distinguen principalmente por su presentación de las glicoproteínas CD4 y CD8 unidas a la membrana, respectivamente. Las células T auxiliares secretan diversas linfocinas, que son cruciales para la activación de las células B, células T citotóxicas, macrófagos y otras células del sistema inmunológico. Por el contrario, una célula T CD8 sin tratamiento previo que reconoce un complejo antígeno-MHC prolifera y se diferencia en una célula efectora llamada cytotoxic CD8 T lymphocyte (linfocito T CD8 citotóxico - CTL). Los CTL eliminan las células del cuerpo que muestran antígeno, tales como células infectadas con virus y células tumorales, produciendo sustancias que resultan en lisis celular.

La actividad de CTL puede evaluarse mediante métodos descritos en la presente memoria o como sabrá un experto en la técnica. Por ejemplo, los CTL se pueden evaluar en peripheral blood mononuclear cells (células mononucleares de sangre periférica - PBMC) recién aisladas, en una línea celular expandida de IL-2 estimulada por fitohemaglutinina establecida a partir de Pb MC (Bernard y col., AIDS, 12(16): 2125-2139, 1998) o por células T aisladas de un sujeto previamente inmunizado y reestimuladas durante 6 días con DC infectadas con un vector de adenovirus que contiene antígeno usando ensayos estándar de microtoxicidad de liberación de 51Cr de 4 horas. Un tipo de ensayo utiliza células T clonadas. La capacidad de las células T clonadas se ha probado para mediar en la destrucción dependiente del ligando Fas y de perforina en ensayos de citotoxicidad redirigida (Simpson y col., Gastroenterology, 115(4): 849-855, 1998). Los linfocitos T citotóxicos clonados mostraron destrucción dependiente de Fas y de perforina. Recientemente, se ha desarrollado un ensayo de liberación de deshidrogenasa in vitro que aprovecha un nuevo sistema de amplificación fluorescente (Page, B., y col., Anticancer Res. julio-agosto de 1998; 18(4A): 2313-6). Este enfoque es sensible, rápido y reproducible y puede usarse de forma ventajosa para la mixed lymphocyte reaction (reacción de linfocitos mixtos - MLR). Se podría automatizar más fácilmente para pruebas de citotoxicidad a gran escala utilizando la integridad de la membrana celular y, por lo tanto, se considera. En otro ensayo fluorométrico desarrollado para detectar citotoxicidad mediada por células, el fluoróforo utilizado es la molécula no tóxica AlamarBlue (Nociari y col., J. Immunol. Methods, 213(2): 157-167, 1998). El AlamarBlue se apaga de forma fluorescente (es decir, rendimiento cuántico bajo) hasta que se produce la reducción mitocondrial, que a continuación da como resultado un aumento espectacular en la intensidad de fluorescencia de AlamarBlue (es decir, aumento en el rendimiento cuántico). Se informa que este ensayo es extremadamente sensible, específico y requiere un número significativamente menor de células efectoras que el ensayo de liberación de 51Cr estándar.

Otras células inmunes inducidas por los presentes métodos incluyen las células natural killer (asesinas naturales - NK). Las NK son células linfoides que carecen de receptores específicos de antígeno y forman parte del sistema inmunológico innato. Típicamente, las células infectadas suelen ser destruidas por las células T alertadas por partículas extrañas unidas al MHC de la superficie celular. Sin embargo, las células infectadas por virus señalan la infección al expresar proteínas virales que son reconocidas por anticuerpos. Estas células pueden ser destruidas por NK. En las células tumorales, si las células tumorales pierden la expresión de las moléculas del MHC I, entonces pueden ser susceptibles a las NK.

Formulaciones y vías de administración a pacientes

Cuando se contemplen aplicaciones clínicas, será necesario preparar composiciones farmacéuticas -constructos de expresión, vectores de expresión, proteínas fusionadas, células transducidas, DC activadas, DC transducidas y cargadasen una forma apropiada para la aplicación pretendida. Generalmente, esto implicará preparar composiciones que estén prácticamente exentas de pirógenos, así como de otras impurezas que podrían ser dañinas para seres humanos o animales.

En general, se puede desear emplear sales y tampones apropiados para hacer que los vectores de suministro sean estables y permitan la absorción por las células objetivo. Los tampones también se pueden emplear cuando las células recombinantes se introducen en un paciente. Las composiciones acuosas comprenden una cantidad eficaz del vector para las células, disuelto o disperso en un portador o medio acuoso farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones también se denominan inóculos. La frase “farmacéutica o farmacológicamente aceptable” se refiere a entidades y composiciones moleculares que no producen reacciones adversas, alérgicas u otras reacciones adversas cuando se administran a un animal o a un ser humano. Un portador farmacéuticamente aceptable incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y lo similar. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Salvo en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con los vectores o células, su uso se contempla en composiciones terapéuticas. Los ingredientes activos complementarios también se pueden incorporar en las composiciones.

Las composiciones activas pueden incluir preparaciones farmacéuticas clásicas. La administración de estas composiciones será por cualquier vía común siempre que el tejido objetivo esté disponible por esa vía. Esto incluye, por ejemplo, oral, nasal, bucal, rectal, vaginal o tópica. Alternativamente, la administración puede ser por inyección ortotópica, intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa. Dichas composiciones normalmente se administrarían como composiciones farmacéuticamente aceptables, descritas en la presente memoria.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una fácil jeringabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse de la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y lo similar), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede conseguirse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y lo similar. En determinados ejemplos, pueden incluirse agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede producir mediante el uso en las composiciones de agentes que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Para la administración oral, las composiciones pueden incorporarse con excipientes y usarse en forma de colutorios y dentífricos que no se pueden ingerir. Un colutorio puede prepararse incorporando el ingrediente activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado, tal como una solución de borato de sodio (solución de Dobell). Alternativamente, el ingrediente activo puede incorporarse en un lavado antiséptico que contenga borato de sodio, glicerina y bicarbonato de potasio. El ingrediente activo también se puede dispersar en dentífricos, que incluyen, por ejemplo: geles, pastas, polvos y lechadas. El ingrediente activo puede añadirse en una cantidad terapéuticamente eficaz a un dentífrico en pasta que puede incluir, por ejemplo, agua, aglutinantes, abrasivos, agentes saborizantes, agentes espumantes y humectantes.

Las composiciones se pueden formular en forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que están formadas con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y lo similar. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivarse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y lo similar.

Tras la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una diversidad de formas de dosificación tales como soluciones inyectables, cápsulas de liberación de fármacos y lo similar. Para la administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debe tamponarse adecuadamente si es necesario y el diluyente líquido primero debe hacerse isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, los expertos en la técnica conocerán los medios acuosos estériles que pueden emplearse a la luz de la presente descripción. Por ejemplo, una dosificación se podría disolver en 1 ml de solución de NaCl isotónica y añadirse a 1000 ml de líquido hipodermoclisis o inyectarse al sitio de infusión propuesto (véase, por ejemplo, “ Remington's Pharmaceutical Sciences” 15a edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Alguna variación se producirá necesariamente en la dosificación dependiendo de la condición del sujeto que se esté tratando. La persona responsable de la administración, en cualquier caso, determinará la dosis apropiada para el sujeto individual. Además, para la administración humana, las preparaciones deben cumplir con los estándares de esterilidad, pirogenicidad y seguridad general y pureza requeridos por los estándares de la FDA Office of Biologies (Oficina de Biológicos de la FDA).

Métodos para tratar una enfermedad

Los presentes métodos también abarcan métodos de tratamiento o prevención de una enfermedad causada por microorganismos patógenos y/o una enfermedad hiperproliferativa.

Las enfermedades que pueden tratarse o prevenirse incluyen enfermedades causadas por virus, bacterias, levaduras, parásitos, protozoos, células cancerosas y lo similar. La composición farmacéutica (DC transducidas, vector de expresión, constructo de expresión, etc.) puede usarse como un potenciador inmunológico generalizado (composición o sistema activador de DC) y como tal tiene utilidad en el tratamiento de enfermedades. Las enfermedades ilustrativas que se pueden tratar y/o prevenir incluyen, aunque no de forma limitativa, infecciones de etiología viral tales como VIH, influenza, herpes, hepatitis viral, Epstein Bar, polio, encefalitis viral, sarampión, varicela, virus del papiloma, etc.; o infecciones de etiología bacteriana tales como neumonía, tuberculosis, sífilis, etc.; o infecciones de etiología parasítica tales como malaria, tripanosomiasis, leishmaniasis, tricomoniasis, amebiasis, etc.

Los estados preneoplásicos o hiperplásicos que pueden tratarse o prevenirse utilizando la composición farmacéutica (DC transducidas, vector de expresión, constructo de expresión, etc.) incluyen, aunque no de forma limitativa, estados preneoplásicos o hiperplásicos tales como pólipos de colon, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, lesiones mamarias y lo similar.

Los cánceres que pueden tratarse usando la composición farmacéutica incluyen, aunque no de forma limitativa, melanoma primario o metastásico, adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células adenoescamosas, timoma, linfoma, sarcoma, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, linfoma no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemias, cáncer de útero, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de colon, mieloma múltiple, neuroblastoma, NPC, cáncer de vejiga, cáncer de cuello uterino y lo similar.

Otras enfermedades hiperproliferativas que pueden tratarse usando el sistema de activación de DC presentado en la presente memoria incluyen, aunque no de forma limitativa, artritis reumatoide, inflamación intestinal, osteoartritis, leiomiomas, adenomas, lipomas, hemangiomas, fibromas, oclusión vascular, reestenosis, aterosclerosis, lesiones preneoplásicas (tales como hiperplasia adenomatosa y neoplasia intraepitelial prostática), carcinoma in situ, leucoplaquia pilosa oral o psoriasis.

En el método de tratamiento, la administración de la composición farmacéutica (constructo de expresión, vector de expresión, proteína fusionada, células transducidas, DC activadas, DC transducidas y cargadas) puede ser con fines “profilácticos” o “terapéuticos” . Cuando se proporciona de forma profiláctica, la composición farmacéutica se proporciona antes de cualquier síntoma. La administración profiláctica de la composición farmacéutica sirve para prevenir o mejorar cualquier infección o enfermedad posterior. Cuando se proporciona de forma terapéutica, la composición farmacéutica se proporciona en o después de la presentación de un síntoma de infección o enfermedad. Por lo tanto, las composiciones presentadas en la presente memoria pueden proporcionarse antes de la exposición anticipada a un agente o patología causante de enfermedad o después del inicio de la infección o enfermedad.

El término “dosis unitaria” en lo que se refiere al inóculo se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para mamíferos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de composición farmacéutica calculada para producir el efecto inmunogénico deseado en asociación con el diluyente requerido. Las especificaciones para la novedosa dosis unitaria de un inóculo están dictadas y dependen de las características únicas de la composición farmacéutica y del efecto inmunológico particular que se desea lograr.

Una cantidad eficaz de la composición farmacéutica sería la cantidad que logra este resultado seleccionado de mejorar la respuesta inmune, y tal cantidad podría ser determinada de forma rutinaria por una persona experta en la técnica. Por ejemplo, una cantidad eficaz para tratar una deficiencia del sistema inmunológico podría ser la cantidad necesaria para provocar la activación del sistema inmunológico, lo que resulta en el desarrollo de una respuesta inmune específica de antígeno tras la exposición al antígeno. - El término también es sinónimo de “cantidad suficiente” .

La cantidad eficaz para cualquier aplicación particular puede variar dependiendo de factores tales como la enfermedad o afección que se esté tratando, la composición particular que se administra, el tamaño del sujeto y/o la gravedad de la enfermedad o afección. El experto en la técnica puede determinar empíricamente la cantidad eficaz de una composición específica presentada en la presente memoria sin necesidad de experimentación excesiva.

A. Terapias de base genética

En determinados casos, a una célula se le proporciona un constructo de expresión capaz de proporcionar un polipéptido coestimulador, tal como CD40, a la célula, tal como una célula presentadora de antígeno y activar CD40. La extensa descripción de los vectores de expresión y los elementos genéticos empleados en ellos se incorpora en esta sección como referencia. En determinados ejemplos, los vectores de expresión pueden ser vectores virales, tales como adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes, virus vaccinia y retrovirus. En otro ejemplo, el vector puede ser un vector de expresión encapsulado en lisosoma.

Los expertos en la técnica saben bien cómo aplicar el suministro de genes a situaciones in vivo y ex vivo. Para los vectores virales, generalmente se preparará una reserva de vector viral. Los ejemplos de suministro de genes ex vivo mediado por vectores virales se presentan en la presente solicitud. Para el suministro in vivo, dependiendo delo tip 1o de v qirus y J la v 10aloración 1 a1lcanzable, 1 s2e suministrará, t por i eje implo, 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 1 0 , 1 x 10 , 1 x 10 , 1 x 10 o 1 x 10 partículas infecciosas al paciente. Las cifras similares pueden extrapolarse para formulaciones liposomales u otras formulaciones no virales comparando las eficiencias relativas de absorción. La formulación como una composición farmacéuticamente aceptable se describe a continuación.

B. Terapia de base celular

Otra terapia que se contempla es la administración de células presentadoras de antígenos transducidas. Las células presentadoras de antígenos se pueden transducir in vitro. La formulación como una composición farmacéuticamente aceptable se describe en la presente memoria.

En las terapias de base celular, las células presentadoras de antígenos transducidas pueden, por ejemplo, transfectarse con ácidos nucleicos de antígenos objetivo, tales como ARNm o ADN o proteínas; pulsarse con lisados celulares, proteínas o ácidos nucleicos; o electrofundirse con células. Las células, proteínas, lisados celulares o ácido nucleico pueden derivar de células, tales como células tumorales u otros microorganismos patógenos, por ejemplo, virus, bacterias, protozoos, etc.

C. Terapias de combinación

Para aumentar la eficacia de los vectores de expresión presentados en la presente memoria, puede ser deseable combinar estas composiciones y métodos con un agente eficaz en el tratamiento de la enfermedad.

En determinados casos, los agentes anticancerosos se pueden usar junto con los presentes métodos. Un agente “ anticanceroso” es capaz de afectar negativamente al cáncer en un sujeto, por ejemplo, matando una o más células cancerosas, induciendo apoptosis en una o más células cancerosas, reduciendo la tasa de crecimiento de una o más células cancerosas, reduciendo la incidencia o número de metástasis, reduciendo el tamaño de un tumor, inhibiendo el crecimiento de un tumor, reduciendo el suministro de sangre a un tumor o una o más células cancerosas, promoviendo una respuesta inmune contra una o más células cancerosas o un tumor, previniendo o inhibiendo la progresión de un cáncer o aumentando la esperanza de vida de un sujeto con cáncer. Los agentes contra el cáncer incluyen, por ejemplo, agentes de quimioterapia (quimioterapia), agentes de radioterapia (radioterapia), un procedimiento quirúrgico (cirugía), agentes de terapia inmune (inmunoterapia), agentes de terapia genética (terapia génica), terapia hormonal, otros agentes biológicos (bioterapia) y/o terapias alternativas.

En otros casos, los antibióticos se pueden usar junto con la composición farmacéutica para tratar y/o prevenir una enfermedad infecciosa. Dichos antibióticos incluyen, aunque no de forma limitativa, amikacina, aminoglucósidos (p. ej., gentamicina), amoxicilina, anfotericina B, ampicilina, antimoniales, estibogluconato sódico de atovacuona, azitromicina, capreomicina, cefotaxima, cefoxitina, ceftriaxona, clornmfenicol, claritromicina, clindamicina, clofazimina, cicloserina, dapsona, doxiciclina, etambutol, etionamida, fluconazol, fluoroquinolonas, isoniazida, itraconazol, kanamicina, ketoconazol, minociclina, ofloxacina), ácido para-aminosalicílico, pentamidina, polimixina definsinas, protionamida, pirazinamida, pirimetamina sulfadiazina, quinolonas (p. ej., ciprofloxacina), rifabutina, rifampicina, esparfloxacina, estreptomicina, sulfonamidas, tetraciclinas, tiacetazona, trimetaprim-sulfametoxazol, viomicina o combinaciones de los mismos.

Más generalmente, dicho agente se proporcionaría en una cantidad combinada con el vector de expresión eficaz para matar o inhibir la proliferación de una célula cancerosa y/o un microorganismo. Este proceso puede implicar poner en contacto la célula o células con un agente o agentes y la composición farmacéutica al mismo tiempo o dentro de un período de tiempo en donde la administración separada de la composición farmacéutica y un agente a una célula, tejido u organismo produce una ventaja terapéutica deseada. Esto se puede lograr poniendo en contacto la célula, tejido u organismo con una única composición o formulación farmacológica que incluya tanto la composición farmacéutica como uno o más agentes, o poniendo en contacto la célula con dos o más composiciones o formulaciones distintas, en donde una composición incluye la composición farmacéutica y la otra incluye uno o más agentes.

Los términos “contactado” y “expuesto” , cuando se aplican a una célula, tejido u organismo, se utilizan en la presente memoria para describir el proceso mediante el cual la composición farmacéutica y/u otro agente, tal como por ejemplo un agente quimioterapéutico o radioterapéutico, se suministran a una célula, tejido u organismo objetivo o se colocan en yuxtaposición directa con la célula, tejido u organismo objetivo. Para lograr la muerte o estasis celular, la composición farmacéutica y/o el agente o agentes adicionales se suministran a una o más células en una cantidad combinada eficaz para matar la célula o células o evitar que se dividan.

La administración de la composición farmacéutica puede preceder, ser co-actual y/o seguir al otro agente o agentes en intervalos que varían de minutos a semanas. En los casos en los que la composición farmacéutica y otro agente o agentes se aplican por separado a una célula, tejido u organismo, generalmente se aseguraría que un período de tiempo significativo no expira entre los momentos de cada suministro, de modo que la composición farmacéutica y el agente o agentes todavía podrían ejercer un efecto combinado ventajoso sobre la célula, tejido u organismo. Por ejemplo, en dichos casos, se contempla que se pueda poner en contacto la célula, tejido u organismo con dos, tres, cuatro o más modalidades sustancialmente de forma simultánea (es decir, en menos de aproximadamente un minuto) con la composición farmacéutica. En otros aspectos, uno o más agentes pueden administrarse dentro de sustancialmente simultáneamente, de aproximadamente 1 minuto, a aproximadamente 24 horas a aproximadamente 7 días a aproximadamente 1 a aproximadamente 8 semanas o más, y cualquier rango derivado en ellos, antes y/o después de administrar el vector de expresión. Más aún, se pueden emplear diversos regímenes de combinación de la composición farmacéutica presentada en la presente memoria y uno o más agentes.

Ejemplos

Los ejemplos que se exponen a continuación ilustran pero no limitan la invención.

Ejemplo 1: Materiales y métodos

A continuación en la memoria se describen materiales y métodos utilizados en los estudios descritos en los ejemplos posteriores.

Péptidos y líneas de células tumorales

Las líneas celulares NA-6-Mel, T2, SK-Mel-37 y LNCaP se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA). Los péptidos restringidos a HLA-A2 m Ag E-3 p271-279 (FLWGPr Al V), influenza matrix (matriz de influenza - iM) p58-66 (GILGFVFTL) y VIH-1 gag p77-85 (SLYNTVAt L) se utilizaron para analizar las respuestas de células T CD8+. En experimentos de polarización de células T auxiliares, se usó el péptido toxoide tetánico TTp30 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE. Todos los péptidos fueron sintetizados por Genemed Synthesis Inc (San Francisco, CA), con una pureza determinada por HPLC de > 95 %.

Adenovirus recombinante que codifica CD40 inducible humana

El dominio citoplásmico de CD40 humano era la polimerasa Pfu I (Stratagene, La Jolla, California) amplificada a partir de ADNc de DC derivado de monocitos humanos utilizando un cebador 5’ flanqueado por Xho I (5hCD40X), 5'-atatactcgagaaaaaggtggccaagaagccaacc-3' y un cebador 3’ flanqueado por Sal I (3hCD40S), 5'-atatagtcgactcactgtctctcctgcactgagatg-3'. El fragmento de PCR se subclonó en pSH1/M-FvFvls-E15 digerido con Sal I y se secuenció para crear pSH1/M-FvFvls-CD40-E. El CD40 inducible se subclonó posteriormente en un vector basado en Ad5/f35 con eliminación de E1 y E3 no replicante que expresaba el transgén bajo un promotor temprano/inmediato de citomegalovirus. La secuencia que codifica iCD40 se confirmó mediante digestión de restricción y secuenciación. La amplificación, purificación y valoración volumétrica de todos los adenovirus se llevaron a cabo en las instalaciones centrales de vectores virales de Baylor College of Medicine.

Transferencia Western

Los extractos celulares totales se prepararon con tampón RIPA que contenía un cóctel inhibidor de proteasa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y se cuantificaron usando un ensayo de concentración de proteína compatible con detergente (Bio-Rad, Hercules, CA). 10-15 microgramos de proteína total se separaron rutinariamente en geles de SDS-PAGE al 12 % y las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad). Las transferencias se hibridaron con Abs de cabra anti-CD40 (T-20, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) y de ratón anti-alfa-tubulina (Santa Cruz Biotechnology), seguidos de anti-cabra de burro y anti-IgG-HRP de cabra anti-ratón (Santa Cruz Biotechnology), respectivamente. Las transferencias se desarrollaron utilizando el sistema de sustrato SuperSignal West Dura Stable (Pierce, Rockford, Illinois).

Generación y estimulación de las DC humanas

Las Peripheral blood mononuclear cells (Células mononucleares de sangre periférica - PBMC) de donantes sanos se aislaron mediante centrifugación por densidad de sangre heparinizada en Lymphoprep (Nycomed, Oslo, Noruega). Las PBMC se lavaron con PBS, se resuspendieron en medio DC CellGenix (Freiburg, Alemania) y se dejaron adherir en placas de cultivo durante 2 horas a 37 0C y 5 % de CO2. Las células no adherentes se eliminaron mediante lavados extensos y los monocitos adherentes se cultivaron durante 5 días en presencia de 500 U/ml de hlL-4 y 800 U/ml de hGM-CSF (R&D Systems, Minneapolis, MN). Según la evaluación de morfología y análisis FACS, las DC inmaduras resultantes (imDC) eran MHC de clase I, Ilhi y expresaban CD40lo, CD80lo, CD83lo, CD86lo. Las imDC eran CD14neg y contenían < 3 % de células NK CQ3+ T, CD19+ B y CD16+ contaminantes.

Aproximadamente 2x106 células/ml se cultivaron en una placa de 24 pocillos y se transdujeron con adenovirus a 10.000 partículas virales (VP)/célula (~160 MOI) durante 90 min a 37 0C y 5 % de CO2. Inmediatamente después de la transducción, las DC se estimularon con Mp L, FSL-1, Pam3CSK4 (InvivoGen, San Diego, CA), LPS (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), AP20187 (amable obsequio de ARIAD Pharmaceuticals, Cambridge, MA) o maturation cocktail (cóctel de maduración - MC), que contiene 10 ng/ml de TNF-alfa, 10 ng/ml de IL-1beta, 150 ng/ml de IL-6 (R&D Systems, Minneapolis, MN) y 1 microgramo/ml de PGE2 (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI). En los ensayos de células T, las DC se pulsaron con 50 microgramos/ml de péptido PSMA o MAGE 3 24 horas antes y después de la transducción adenoviral.

Marcadores de superficie y producción de citoquinas

La tinción de la superficie celular se realizó con anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromo (BD Biosciences, San Diego, CA). Las células se analizaron en un citómetro FACSCalibur (BD Biosciences, San José, CA). Las citoquinas se midieron en sobrenadantes de cultivo usando kits de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas para IL-6 e IL-12p70 humanas (BD Biosciences).

Ensayo Q-PCR en tiempo real para SOCS1 humano

El ARN total se purificó y se sometió a transcripción inversa con hexámeros aleatorios usando SuperScript II RTase (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los niveles de ARNm se cuantificaron en las DC sometiendo el ADNc a un análisis de PCR TaqMan usando el sistema de detección de secuencias GeneAmp 5700 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Los reactivos de detección de secuencia previamente desarrollados (Applied Biosystems) específicos para ARNr SOCS1 y 18S humanos, incluidos cebadores directos e inversos, así como una sonda de hibridación marcada con TaqMan FAM fluorogénica, se suministraron como mezclas y se utilizaron a 1 microlitro/20 microlitros de PCR. Las muestras se realizaron en duplicados. El nivel de expresión de SOCS1 en cada muestra se normalizó al nivel de ARNr 18S de la misma muestra utilizando el método comparativo 2-delta delta CT (Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method [análisis de los datos de expresión génica relativa mediante el uso de PCR cuantitativa en tiempo real y el método 2 (-Delta Delta C(T)]). Methods. 2001; 25: 402 408).

Ensayo de migración de DC

La quimiotaxis de las DC se midió mediante la migración a través de un filtro de policarbonato con un tamaño de poro de 8 micrómetros en placas Fluoroblok HTS de 96 pocillos múltiples (BD Biosciences). El medio de ensayo (250 microlitros) que contenía 100 ng/ml de CCL19 (R&D Systems) o el medio de ensayo solo (como control para la migración espontánea) se cargaron en la cámara inferior. Las DC (50.000) se marcaron con rastreador de células Green-CMFDA (Invitrogen), sin estimular o estimuladas durante 48 h con los reactivos indicados, y se añadieron a la cámara superior en un volumen total de 50 microlitros durante 1 hora a 37 °C y 5 % de CO². La fluorescencia de las células, que habían migrado a través de la membrana microporosa, se midió usando el lector FLUOstar OPTIMA (BMG Labtech Inc., Durham, NC). La fluorescencia media de las células migradas espontáneamente se restó del número total de células migradas para cada condición.

Ensayo ELISPOT de IFN-gamma

Las DC de voluntarios sanos positivos para HLA-A2 se pulsaron con péptido MAGE-3 A2.1 (residuos 271-279; FLWGPRALV) el día 4 de cultivo, seguido de transducción con Ad-iCD40 y estimulación con diversos estímulos el día 5. Las células T autólogas se purificaron a partir de PBMC mediante selección negativa (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) y se mezclaron con DC en una relación de células T: DC 1: 3. Las células se incubaron en RPMI completo con 20 U/ml de hlL-2 (R&D Systems) y 25 microgramos/ml de péptido MAGE 3 A2.1. Las células T se reestimularon el día 7 y se analizaron el día 14 de cultivo.

Cuantificación ELI SPOT

Las placas de nitrocelulosa de 96 pocillos de fondo plano (MultiScreen-HA; Millipore, Bedford, MA) se recubrieron con mAb IFN-gamma (2 |ug/ml, 1-D1 K; Mabtech, Estocolmo, Suecia) y se incubaron durante la noche a 4 0C. Después de lavados con PBS que contenía TWEEN 20 al 0,05 %, las placas se bloquearon con RPMI completo durante 2 h a 37 0C. Un total de 1 x 105células efectoras T CD8+ presensibilizadas se añadieron a cada pocillo y se incubaron durante 20 h con 25 microgramos/ml de péptidos. A continuación, las placas se lavaron minuciosamente con PBS que contenía TWEEN 20 al 0,05 % y anti-IFN-mAb (0,2 microg ml, 7-B6-1-biotina; Mabtech) se añadió a cada pocillo. Después de la incubación durante 2 h a 37 0C, las placas se lavaron y se desarrollaron con estreptavidina-fosfatasa alcalina (1 microg/ml; Mabtech) durante 1 h a temperatura ambiente. Después del lavado, el sustrato (3-amino-9-etil-carbazol; Sigma-Aldrich) se añadió y se incubó durante 5 min. Las membranas de las placas mostraron manchas de color rosa oscuro que fueron escaneadas y analizadas por ZellNet Consulting Inc. (Fort Lee, NJ).

Ensayo de liberación de Cromo

El reconocimiento de antígenos se evaluó utilizando células objetivo marcadas con cromo 51 (Amersham) durante 1 hora a 37 0C y lavadas tres veces. A continuación, las células objetivo marcadas (5000 células en 50 microlitros) se añadieron a células efectoras (100 microlitros) a las relaciones indicadas de células efectoras: objetivo en placas de micropocillos con fondo en V a las concentraciones indicadas. Los sobrenadantes se recolectaron después de 6 horas de incubación a 37 °C y la liberación de cromo se midió usando un contador MicroBeta Trilux (Perkin-Elmer Inc, Torrance CA). Los ensayos que implicaban células LNCaP se realizaron durante 18 horas. El porcentaje de lisis específica se calculó como: 100 * [(experimental - liberación espontánea)/(máxima - liberación espontánea)].

Tinción de tetrámero

Los tetrámeros de HLA-A2 ensamblados con el péptido MAGE-3.A2 (FLWGPRALV) se obtuvieron de Baylor College of Medicine Tetramer Core Facility (Houston, TX). Las células T CD8+ presensibilizadas en 50 |ul de PBS que contenía FCS al 0,5 % se tiñeron con tetrámero marcado con PE durante 15 min en hielo antes de la adición de mAb FITC-CD8 (BD Biosciences). Después del lavado, los resultados se analizaron mediante citometría de flujo.

Polarización de las células T auxiliares sin tratamiento previo

Las células T CD4+ CD45RA+ sin tratamiento previo de donantes positivos para HLA-DR11.5 (genotipadas utilizando el kit de tipificación FASTYPE HLA-DNA SSP; BioSynthesis, Lewisville, TX) se aislaron mediante selección negativa utilizando un kit de aislamiento de células T CD4+ sin tratamiento previo (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Las células T se estimularon con DC autólogas pulsadas con toxoide tetánico (5 FU/ml) y se estimularon con diversos estímulos a una relación de estimulador a respondedor de 1: 10. Después de 7 días, las células T se reestimularon con DC autólogas pulsadas con el péptido auxiliar TTp30 restringido a HLA-DR11.5 y se transdujeron con el adenovector Ad-iCD40. Las células se tiñeron con PE-anti-CD4 Ab (BD Biosciences), se fijaron y se permeabilizaron usando el kit BD Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences), después se tiñeron con mAb hlFN-gamma (eBioscience, San Diego, CA) y se analizaron mediante citometría de flujo. Los sobrenadantes se analizaron con el uso de un conjunto Flex de matriz de perlas citométricas BD TH1/TH2 en el bioanalizador BD FACSArray (BD Biosciences).

Purificación de la proteína PSMA

El vector de transferencia de baculovirus, pAcGP67A (BD Biosciences) que contiene el ADNc de la parte extracelular de PSMA (residuos 44-750) fue amablemente proporcionado por la Dra. Pamela J. Bjorkman (Howard Hughes Medical Institute, California Institute of Technology [Instituto Médico Howard Hughes, Instituto de Tecnología de California], Pasadena, CA). PSMA se fusionó con una señal de secreción hidrófoba, un sitio de escisión del factor Xa y un marcador de afinidad 6x-His N-terminal. Baculovirus de alta valoración fue producido por la instalación central de baculovirus/anticuerpos monoclonales de Baylor College of Medicine. La proteína PSMA se produjo en células High 5 infectadas con virus recombinante y la proteína se purificó a partir de sobrenadantes celulares utilizando columnas de afinidad Ni-NTA (Qiagen, Chatsworth, CA) como se describió anteriormente (Cisco RM, Abdel-Wahab Z, Dannull J y col. Induction of human dendritic cell maturation using transfection with RNA encoding a dominant positive toll-like receptor 4 [inducción de la maduración de células dendríticas humanas mediante transfección con ARN que codifica un receptor 4 dominante positivo tipo toll]. J Immunol. 2004; 172: 7162-7168). Después de la purificación, la banda solitaria de -100 kDa de proteína PSMA se detectó mediante tinción con plata de geles de acrilamida.

Migración de DC humanas en el huésped de ratón

Para evaluar la migración de las DC humanas in vivo, se desarrolló el adenovector Ad5-CBR, que expresa luciferasa desplazada al rojo (pico de emisión = 613 nM) de los escarabajos clic Pyrophorus plagiophalamus (Promega, Madison, WI). Las DC humanas se transdujeron con ~50 MOI de Ad5-CBR y 160 MOI de Ad5f35-iCD40. A continuación, las DC se maduraron con MC o 1 microgramo/ml de LPS (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Las DC derivadas de médula ósea de ratón se obtuvieron como se ha descrito anteriormente 13 y se maduraron con 1 microgramos/ml de LPS. Aproximadamente 2x106 DC se inyectaron en las patas traseras izquierda y derecha de ratones Balb/c irradiados (250 rads) (ambas patas traseras de tres ratones por grupo, n = 6). A los ratones se les inyectó ip con D-luciferina (~1 mg/25 g de animal) y se obtuvieron imágenes durante varios días usando un sistema de formación de imágenes IVIS™ 100 (Xenogen Corp., Alameda, CA). La señal luminiscente se midió en 3 ratones por grupo, y los lymph nodes (nódulos linfáticos - NL) poplíteos e inguinales se extrajeron el día 2 después de la inoculación de DC. La señal de los LN se midió y se restó el fondo para cada grupo (n = 6).

Análisis de datos

Los resultados se expresan como la media ± error estándar. El tamaño de la muestra se determinó con una potencia de 0,8, con un nivel alfa unilateral de 0,05. Las diferencias entre los grupos experimentales se determinaron mediante la prueba t de Student.

Ejemplo 2: Expresión de iCD40 e inducción de la maduración de DC

Para investigar si la señalización de iCD40 puede mejorar las funciones inmunogénicas de las DC humanas, se generó adenovirus, Ad5/f35-ihCD40 (simplificado a Ad-iCD40), que expresa el receptor CD40 humano inducible, basado en el vector iCD40 de ratón descrito anteriormente 13 (Fig. 1). Los expertos en la técnica reconocerán que este es un ejemplo de un ensayo que puede usarse para examinar la maduración de las DC después de la transducción de una proteína iCD40 quimérica, tal como, por ejemplo, iCD40-MyD88, u otros ejemplos de quimeras de la presente memoria. El dominio de señalización citoplásmico de CD40 humano se clonó corriente abajo de un dominio de direccionamiento a miristoilación y dos dominios en tándem (de FKBP12 humano (V36), designado como “ Fv” ), que se unen al fármaco dimerizador AP20187 (Clackson T, Yang W, Rozamus LW, y col. Redesigning an FKBP- ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity [rediseño de una interfaz de ligando FKBP para generar dimerizadores químicos con novedosa especificidad)]. Proc Natl Acad Sci US A. 1998; 95: 10437-10442). Las DC inmaduras expresaron CD40 endógeno, que fue inducido por LPS y CD40L. La transducción de Ad-iCD40 condujo a la expresión del iCD40 de tamaño distinto, que no interfirió con la expresión de CD40 endógena. Curiosamente, la expresión de iCD40 también fue significativamente mejorada por la estimulación con LPS, probablemente debido a la inducibilidad de factores de transcripción ubicuos que se unen al promotor CMV “constitutivo” .

Uno de los problemas para el diseño de vacunas basadas en DC es obtener DC completamente maduras y activadas, ya que el estado de maduración está relacionado con la transición de un estado tolerogénico a uno inmunogénico activante (Steinman RM, y col., Annu Rev Immunol. 2003; 21: 685-711; Hanks BA, y col., Nat Med. 2005; 11: 130-137; Banchereau J, Steinman RM. Dendritic cells and the control of immunity [células dendríticas y el control de la inmunidad]. Nature. 1998; 392: 245-252). Se ha demostrado que la expresión de la variante de ratón Ad-iCD40 puede inducir la maduración de DC derivadas de la médula ósea murina (Hanks BA, y col., Nat Med. 2005; 11: 130-137). Para determinar si el ÍCD40 humanizado afecta la expresión de marcadores de maduración en las DC, las DC se transdujeron con Ad-iCD40 y se evaluó la expresión de los marcadores de maduración CD40, CD80, CD83 y CD86. TLR-4 signaling mediated by LPS or its derivative MPL is a potent inducer of DC maturation [la señalización de t LR-4 mediada por LPS o su derivado MPL es un potente inductor de la maduración de DC] (Ismaili J, y col., J Immunol. 2002; 168: 926-932; Cisco RM, y col., J Immunol.

2004; 172: 7162-7168; De Becker G, Moulin V, Pajak B, y col. The adjuvant monophosphoryl lipid A increases the function of antigen-presenting cells [el adyuvante monofosforil lípido A aumenta la función de las células presentadoras de antígenos]. Int Immunol. 2000; 12: 807-815; Granucci F, Ferrero E, Foti M, Aggujaro D, Vettoretto K, Ricciardi-Castagnoli P. Early events in dendritic cell maturation induced by LPS [eventos tempranos en la maduración de las células dendríticas inducida por LPS]. Microbes Infect. 1999; 1:1079-1084). Además se informó anteriormente que la señalización de CD40 endógena específicamente regula positivamente la expresión de CD83 en las DC humanas (Megiovanni AM, Sanchez F, Gluckman JC, Rosenzwajg M. Double-stranded RNA stimulation or CD40 ligation of monocyte-derived dendritic cells as models to study their activation and maturation process [estimulación de ARN bicatenario o ligadura de CD40 de células dendríticas derivadas de monocitos como modelos para estudiar su proceso de activación y maduración]. Eur Cytokine Netw. 2004; 15: 126-134). Según estos informes anteriores, los niveles de expresión de CD83 se regularon positivamente con la transducción de Ad-iCD40, y la expresión de CD83 se reguló aún más positivamente después de la adición de LPS o MPL.

Ejemplo 3: Ensayo de sinergia de la señalización de iCD40 y la ligadura de proteína adaptadora de PRR inducible

Los expertos en la técnica pueden modificar los ensayos presentados en este ejemplo para observar la sinergia entre la señalización de iCD40 y la ligadura de la proteína adaptadora PRR inducible.

La interleucina-12 (IL-12) activa las respuestas de las células T y NK e induce la producción de IFN-gamma. Además favorece la diferenciación de las células TH1 y es un vínculo vital entre la inmunidad innata y adaptativa (Banchereau J, y col., Ann NY Acad Sci. 2003; 987: 180-187; Puccetti P, Belladonna ML, Grohmann U. Effects of IL-12 and IL-23 on antigenpresenting cells at the interface between innate and adaptive immunity [efectos de IL-12 e IL-23 en células presentadoras de antígenos en la interfaz entre la inmunidad innata y adaptativa]. Crit Rev Immunol. 2002; 22: 373-390). Por lo tanto, la inducción del heterodímero de IL-12p70 biológicamente activo es probablemente crítica para las vacunas óptimas basadas en DC. No obstante, los protocolos actuales de vacunación contra DC que incluyen PGE2 producen solo IL-12 limitado (Lee AW, Truong T, Bickham K y col. A clinical grade cocktail of cytokines and PGE2 results in uniform maturation of human monocyte-derived dendritic cells: implications for immunotherapy [un cóctel de grado clínico de citoquinas y PGE2 da como resultado una maduración uniforme de células dendríticas derivadas de monocitos humanos: implicaciones para la inmunoterapia]. Vaccine. 2002; 20 Suppl 4: A8-A22). IL-12 es una citoquina heterodimérica que consiste en cadenas p40 y p35. Previamente, se informó que la señalización de CD40 inducible promueve la expresión de la subunidad p35 de IL-12p70 en DC derivadas de médula ósea de ratón (Hanks BA, y col., Nat Med. 2005; 11: 130-137). Además se informó que la ligadura de TLR-4 puede promover la expresión de p40 (Liu J, Cao S, Herman LM, Ma X. Differential regulation of interleukin (IL)-12 p35 and p40 gene expression and interferon (IFN)-gamma-primed IL-12 production by IFN regulatory factor 1 [regulación diferencial de la interleucina (IL)-12 p35 y expresión del gen p40 y producción de (IL)-12 cebada con (IFN)-gamma mediante el factor de regulación de IFN 1]. J Exp Med. 2003; 198: 1265-1276). Por lo tanto, las iCD40-DC se cultivaron en presencia de LPS o MPL y se analizaron los sobrenadantes mediante ELISA para la producción de IL-12p70.

Como era de esperar, al igual que las DC tratadas con MC estándar, las iCD40-DC no produjeron heterodímero de IL-12p70 detectable. Si la PGE2 se retuvo de la MC, las DC produjeron niveles detectables pero bajos de IL-12p70, lo que es consistente con un papel potencialmente perjudicial para la PGE2. Además, las DC cultivadas durante 12 h en presencia de LPS o MPL solo tampoco lograron producir IL-12 (< 30 pg/ml). Sin embargo, cuando las DC transducidas con Ad-iCD40 se cultivaron en presencia de MPL o LPS, produjeron niveles muy altos de IL-12p70 (16,4 ± 7,8 ng/ml para MPL). Este nivel de IL-12 fue aproximadamente 25 veces mayor que los niveles inducidos por MC estándar que carece de PGE2. Curiosamente, este sinergismo de iCD40 y TLR4 fue parcialmente independiente de la adición de AP20187, lo que implica que la señalización de iCD40 basal también puede sinergizar con la ligadura de TLR4. La producción de IL-12p70 en iCD40-DC también fue dependiente de la dosis como niveles de IL 12 relacionados con la dosis de partículas virales.

Dado que la señalización de CD40 normalmente está estrictamente restringida a un período de tiempo relativamente corto (Contin C, Pitard V, Itai T, Nagata S, Moreau JF, Dechanet-Merville J. Membrane-anchored CD40 is processed by the tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme. Implications for CD40 signaling [CD40 anclado en la membrana es procesado por la enzima convertidora del factor de necrosis tumoral alfa. Implicaciones para la señalización de CD40]. J Biol Chem. 2003; 278: 32801-32809; Tone M, Tone Y, Fairchild PJ, Wykes M, Waldmann H. Regulation of CD40 function by its isoforms generated through alternative splicing [la regulación de la función de CD40 por sus isoformas generadas mediante corte y empalme alternativo]. Proc Natl Acad Sci USA. 2001; 98: 1751 -1756), lo que potencialmente limita la inmunidad adaptativa, se determinó si iCD40 podría inducir no solo una expresión mejorada, sino también prolongada, de IL-12p70 en las DC estimuladas por TLR-4. Para evaluar la cinética de la expresión de IL-12, se compararon las iCD40-DC tratadas con LPS con las DC estimuladas con LPS y CD40L. Se observó que las iCD40-DC eran capaces de producir IL-12p70 durante más de 72 horas después de la estimulación en comparación con CD40L o las DC transducidas con vector de control en las que la expresión de IL-12p70 cesó cuando se eliminó la estimulación con LPS. Estos resultados indican que la señalización inducible de CD40 permite que las DC produzcan niveles aumentados de IL-12p70 de forma continua en respuesta a la estimulación de TLR-4.

Finalmente, se evaluó la inducción del suppressor of cytokine signaling (supresor de señalización de citoquinas -SOCS1). SOCS1 es un inhibidor de retroalimentación negativa de la activación de DC, que puede atenuar (Wesemann DR, Dong Y, O'Keefe GM, Nguyen VT, Benveniste EN. Suppressor of cytokine signaling 1 inhibits cytokine induction of CD40 expression in macrophages [el supresor de la señalización de citoquinas 1 inhibe la inducción de citoquinas de la expresión de CD40 en la capacidad de respuesta de los macrófagos]. J Immunol. 2002; 169: 2354-2360) la capacidad de respuesta a la estimulación de LPS y citoquinas (Evel-Kabler K, Song XT, Aldrich M, Huang XF, Chen SY. SOCS1 restricts dendritic cells' ability to break self tolerance and induce antitumor immunity by regulating IL-12 production and signaling [SOCS1 restringe la capacidad de las células dendríticas para romper la autotolerancia e inducir inmunidad antitumoral regulando la producción de IL-12 y la señalización]. J Clin Invest. 2006; 116:90-100). La estimulación de LPS aumentó la expresión de SOCS1 en las DC, como se informó anteriormente (Wesemann DR, y col., J Immunol.

2002; 169: 2354-2360). Sorprendentemente, sin embargo, en presencia de LPS, iCD40-DC expresaron niveles 3 veces más bajos de SOCS1 que las DC estimuladas con CD40L. Además, iCD40 no indujo SOCS1 por sí mismo, a diferencia de CD40L. Estos datos indican que iCD40 puede evitar parcialmente la inducción de SOCS1 en las DC humanas y puede explicar en parte la elevación sostenida observada de los niveles de IL-12 y los marcadores de maduración de las DC.

Además de IL-12, IL-6 desempeña un papel importante en la supervivencia celular y la resistencia a las células T reguladoras (Rescigno M, y col., J Exp Med. 1998; 188: 2175-2180; Pasare C, Medzhitov R. Toll pathwaydependent blockade of CD4+CD25+ T cell-mediated suppression by dendritic cells [bloqueo dependiente de la vía Toll de supresión mediada por células T CD4+ CD25+ por células dendríticas]. Science. 2003; 299: 1033-1036). Se observó que tras la transfección con Ad-iCD40, la expresión de IL-6 mejoró significativamente y aumentó aún más cuando las iCD40-DC se estimularon con fármaco dimerizador y ligandos TLR-4. Por lo tanto, la señalización de iCD40 es suficiente para la producción de algunas citoquinas proinflamatorias, pero requiere una señalización adicional de TLR para la producción de la citoquina TH1 clave, IL 12.

Ejemplo 4: Polarización de TH1 específica de antígeno

Los ensayos de polarización de TH1 específicos de antígeno se presentan en la presente memoria. Los expertos en la técnica pueden modificar los ejemplos presentados para analizar la polarización en el contexto de proteínas adaptadoras PRR y PRR inducibles.

Para investigar más a fondo si las iCD40-DC maduradas con ligandos TLR-4 pueden cebar eficazmente las células T auxiliares (TH) CD4+, se determinó si pueden aumentar las respuestas de las células T específicas de epítopo CD4+ in vitro. Las células T CD4+ CD45RA+ sin tratamiento previo se estimularon durante 7 días en presencia de DC Ad-iCD40 autólogas pulsadas con el antígeno modelo, toxoide tetánico. El día 7, las células T se estimularon con el epítopo de toxoide tetánico restringido a MHC de clase II, TTp30. La producción de IFN-gamma aumentó significativamente en las células T CD4+ cultivadas conjuntamente con iCD40-DC e iCD40-DC estimuladas con MPL o MC. La producción de IFN-gamma fue específica de iCD40, ya que no fue inducida por DC transducidas por Ad-GFP del virus de control o por estimulación con MPL o MC solo. Además, la polarización de las células T se analizó mediante la evaluación de los niveles de citoquinas TH1/TH2 en los sobrenadantes de las células T utilizando una matriz de perlas citométricas. Los niveles de citoquinas secretadas de IFN-gamma, TNF-alfa, IL-4 e IL-5 aumentaron en las células T auxiliares estimuladas por iCD40-DC, lo que indica la expansión de las células T polarizadas tanto en TH1 como en TH2. Sin embargo, los niveles de citoquinas TH1 fueron significativamente más altos que los de las citoquinas asociadas a TH2, lo que indica una expansión predominante de las células TH1. Por el contrario, la inducción de células auxiliares T CD4+ específicas de TT a partir de células CD4+ CD45RA+ sin tratamiento previo, utilizando DC maduradas con MC, condujo solo a un sesgo modesto en la diferenciación de TH1 específica del epítopo TT. Estos resultados sugieren que la señalización de iCD40 en las DC les permite inducir eficazmente la diferenciación de TH1 específica de antígeno, posiblemente debido a una mayor producción de IL-12.

Ejemplo 5: Ensayo de respuesta CTL específico de antígeno tumoral

Se determinó si iCD40 y MPL podrían mejorar las respuestas de los cytotoxic T lymphocyte (linfocitos T citotóxicos - CTL) al autoantígeno MAGE-3 de melanoma poco inmunogénico. Las iCD40-DC de donantes positivos para HLA-A2 se pulsaron con péptido inmunodominante derivado de MAGE3 restringido a HLA-A2.1 de clase I, FLWGPRALV, y se cultivaron conjuntamente con células T autólogas. Después de una serie de estimulaciones, la frecuencia de células T específicas de antígeno se evaluó mediante un ensayo ELISPOT específico de IFN-gamma. Las iCD40-DC estimuladas con MPL dieron lugar a un aumento del 50 % en las células T específicas de MAGE-3 en comparación con las iCD40-DC estimuladas con MC y aproximadamente un aumento de cinco veces en las células T específicas de antígeno en comparación con las DC de control no transducidas (WT).

Además se determinó si las iCD40-DC eran capaces de mejorar la destrucción de células tumorales mediada por CTL de una manera específica de antígeno. Las DC inmaduras de voluntarios positivos para HLA-A2 se transfectaron con Ad-iCD40, se pulsaron con proteína MAGE-3 y se usaron como estimuladores para generar CTL in vitro. Las células SK-MEL-37 (HLA-A2+, MAGE-3+) y las células T2 pulsadas con péptido MAGE-3 A2.1 (HLA-A2+, MAGE-3+) se utilizaron como objetivos. Las células NA-6-MEL (HLA A2-, MAGE-3+) y las células T2 (HLA-A2+) pulsadas con un péptido de matriz de influenza restringido a A2.1 irrelevante sirvieron como controles negativos. Los CTL inducidos por iCD40-DC fueron capaces de reconocer y lisar eficazmente sus objetivos afines (SK-MEL-37), y también las células T2 pulsadas con el péptido MAGE-3 A2.1, lo que indica la presencia de CTL específicos de MAGE-3. Por el contrario, los objetivos de control se lisaron a niveles significativamente más bajos. La actividad lítica mejorada se observó de manera consistente cuando las iCD40-DC tratadas con MPL o MC se utilizaron como estimuladores en comparación con las DC no transducidas tratadas con MPL o MC solo. Además, se observó una expansión significativa de CTL CD8+ positivos para tetrámeros específicos de MAGE-3/HLA-A2 por parte de iCD40-DC que se trataron con MPL.

De forma similar, para probar si las DC estimuladas con LPS y iCD40 podrían mejorar la actividad lítica de CTL, se examinó su capacidad para romper la tolerancia al prostate specific membrane antigen (antígeno de membrana específico de la próstata- PSMA). Las DC generadas a partir de voluntarios HLA-A2 sanos se pulsaron con proteína PSMA (Davis MI, Bennett MJ, Thomas LM, Bjorkman PJ. Crystal structure of prostate-specific membrane antigen, a tumor marker and peptidase [estructura cristalina del antígeno de membrana específico de la próstata, un marcador tumoral y peptidasa]. Proc Natl Acad Sci USA. 2005; 102: 5981-5986) o MAGE-3, se transdujeron con a D-ÍCD40 o Ad-Luc, y fueron cultivados conjuntamente con células T autólogas. Después de tres rondas de estimulación, la actividad CTL específica de antígeno se midió mediante un ensayo de liberación de cromo utilizando células LNCaP (HLA-A2+ PSMA+) como objetivos y SK-Mel-37 (HLA-A2+ PSMA-) como células de control para DC pulsadas con PSMA. Las células SK-Mel-37 (MAGE-3+) se usaron como objetivos cuando las DC del mismo donante se pulsaron con MAGE-3, y las células LNCaP (MAGE-3-) se usaron como controles negativos. En conjunto, estos datos indican que las DC transducidas con iCD40 son capaces de inducir respuestas CTL específicas de antígeno significativamente más potentes in vitro que las DC tratadas con MC. Los expertos en la técnica pueden modificar este ensayo para examinar las respuestas c Tl específicas del antígeno tumoral usando proteínas adaptadoras de PRR quiméricas inducibles por iCD40.

Ejemplo 6: CD40 inducible mejora la expresión de CCR7 y las capacidades migratorias de las DC sin PGE2

Además de otros marcadores de maduración, CCR7 se regula positivamente en las DC al madurar y es responsable de dirigir su migración a los nódulos linfáticos de drenaje (Cyster JG. Chemokines and cell migration in secondary lymphoid organs [quimioquinas y migración celular en órganos linfoides secundarios]. Science. 1999; 286: 2098-2102). Recientemente, varios informes han indicado que, además de la quimiotaxis, CCR7 también afecta la “citoarquitectura” de las DC, la tasa de endocitosis, supervivencia, velocidad migratoria y maduración (Sánchez-Sánchez N, Riol-Blanco L, Rodríguez-Fernández JL. The Multiple Personalities of the Chemokine Receptor CCR7 in Dendritic Cells [las múltiples personalidades del receptor de quimioquinas CCR7 en células dendríticas]. J Immunol. 2006; 176: 5153 5159). Junto con las moléculas coestimuladoras y las citoquinas TH1, iCD40 regula positivamente específicamente la expresión de CCR7 en las DC humanas. Además, la expresión de CCR7 se correlacionó con el aumento de la dosis viral de Ad-iCD40.

Debido a que los niveles de expresión de CCR7 se correlacionan con la migración mejorada hacia MIP-3 beta (CCL19), se determinó si las iCD40-DC humanas podrían migrar in vitro hacia MIP-3 beta en ensayos transwell. Las iCD40-DC tratadas con dimerizador AP20187 tienen niveles de migración comparables a los inducidos por MC. Además, la migración de iCD40-DC se incrementó aún más mediante la estimulación MPL o MC, incluso cuando no estaba presente PGE2. Estos datos fueron altamente reproducibles e indican que iCD40 es suficiente para inducir la expresión de CCR7 y la migración de DC in vitro en contraste con la creencia generalizada de que la PGE2 es esencial para la localización en los nódulos linfáticos de DC humanas.

Las quimioquinas y los receptores de quimioquinas comparten un alto grado de identidad de secuencia dentro de una especie y entre especies (De Vries IJ, Krooshoop DJ, Scharenborg NM, y col. Effective migration of antigen-pulsed dendritic cells to lymph nodes in melanoma patients is determined by their maturation state [la migración efectiva de células dendríticas pulsadas por antígeno a los nódulos linfáticos en pacientes con melanoma está determinada por su estado de maduración]. Cancer Res. 2003; 63: 12-17). Sobre la base de este conocimiento, un novedoso modelo de xenoinjerto se desarrolló para monitorear la migración de las DC humanas in vivo. Las DC humanas se transdujeron con iCD40 y se maduraron con LPS o MC, y las DC de ratón se maduraron con LPS. Dado que las DC se transdujeron conjuntamente con Ad5-CBR, la bioluminiscencia fue inmediatamente visible. Como se esperaba, las DC inmaduras no migraron a los nódulos linfáticos poplíteos de drenaje. Sin embargo, las ÍCD40-DC maduradas con LPS o MC fueron detectables en los nodulos linfáticos poplíteos xenogénicos en los 2 días posteriores a la inoculación. La migración de las iCD40-DC estimuladas con LPS fue significativamente (p = 0,036) mayor que la de DC no estimuladas y fue comparable a la migración de las DC de ratón. Además, en el día 2, las iCD40-DC se detectaron en los LN inguinales, mientras que las DC estimuladas con MC eran indetectables, lo que sugiere mayores capacidades migratorias de iCD40-DC que las estimuladas con MC. En conjunto, estos resultados indican que la señalización de iCD40 en las DC desempeña un papel crítico en el control de la expresión de CCR7 y es suficiente para la migración de las DC a los nódulos linfáticos. La migración de las iCD40-DC se mejora aún más cuando las células se estimulan con LPS, lo que se correlaciona con una mayor expresión de CCR7. Los expertos en la técnica pueden modificar este ensayo para analizar proteínas adaptadoras de PRR inducibles por iCD40 quiméricas.

Ejemplo 7: Resumen de las observaciones de los ensayos presentados en el Ejemplo 2 al Ejemplo 6 con iCD40 y PRR

La eficacia de las células dendríticas depende de muchas variables, especialmente el estado de maduración y la migración eficiente a los nódulos linfáticos. Varios ensayos clínicos en pacientes con cáncer mostraron la potencia de las DC para inducir inmunidad adaptativa a antígenos específicos de tumores (Nestle FO, Banchereau J, Hart D. Dendritic cells: On the move from bench to bedside [células dendríticas: en movimiento del banco a la cama]. Nat Med.

2001; 7: 76-765; Schuler G, Schuler-Thurner B, Steinman RM. The use of dendritic cells in cancer immunotherapy [el uso de células dendríticas en la inmunoterapia del cáncer]. Curr Opin Immunol. 2003; 15: 138-147; Cranmer LD, Trevor KT, Hersh EM. Clinical applications of dendritic cell vaccination in the treatment of cancer [aplicaciones clínicas de la vacunación con células dendríticas en el tratamiento del cáncer]. Cancer Immunol Immunother. 2004; 53: 275-306). Sin embargo, las respuestas clínicas fueron transitorias y justifican una mejora adicional en el diseño de la vacuna DC (Ridgway D. The first 1000 dendritic cell vaccines [las primeras 1000 vacunas de células dendríticas]. Cancer Invest.

2003; 21: 873-886; Dallal RM, Lotze MT. The dendritic cell and human cancer vaccines [la célula dendrítica y las vacunas contra el cáncer humano]. Curr Opin Immunol. 2000; 12: 583-588). La limitación de las vacunas basadas en DC actuales son el estado de activación transitorio dentro de tejidos linfoides, la inducción baja de la inmunidad de las células T CD 4+ y la capacidad deteriorada para migrar a los nódulos linfáticos de drenaje (Adema GJ, de Vries I J, Punt CJ, Figdor CG. Migration of dendritic cell based cancer vaccines: in vivo veritas? [Migración de células dendríticas base de las vacunas contra el cáncer: ¿verificación in vivo?] Curr Opin Immunol. 2005; 17: 170-174). Menos de 24 horas después de la exposición a LPS, las DC terminan la síntesis de la citoquina polarizante hacia TH1, IL-12, y se vuelven refractarias a estímulos adicionales (Langenkamp A, Messi M, Lanzavecchia A, Sallusto F. Kinetics of dendritic cell activation: impact on priming of TH1, TH2 and nonpolarized T cells [cinética de la activación de las células dendríticas: impacto en el cebado de las células TH1, TH2 y T no polarizadas]. Nat Immunol. 2000; 1: 311-316), lo que limita su capacidad para activar las células T auxiliares y los CTL. Otros estudios indican que menos del 5 % de las DC maduras administradas por vía intradérmica llegan a los nódulos linfáticos, lo que muestra una localización ineficiente39. Estos hallazgos subrayan la necesidad de prolongar el estado de activación y las capacidades migratorias de las DC y/o coordinar temporalmente la “ventana” de activación de las DC con la participación de las células T afines dentro de los nódulos linfáticos.

Se desarrolló un método para promover la función de las DC de ratón in vivo mediante la manipulación de un receptor CD40 inducible quimérico (Hanks BA, y col., Nat Med. 2005; 11: 130-137). Se ha observado que el enfoque de CD40 inducible también es eficaz para mejorar la función inmunoestimuladora de las DC humanas. Según los informes anteriores de la actividad sinérgica de la combinación de la señalización de TLR y CD40 para la secreción de IL-12p70, la señalización de iCD40 más TLR4 indujo secreción de IL-12 de alto nivel, maduración de DC, funciones estimuladoras de células T y capacidades migratorias extensas (Lapointe R, y col, Eur J Immunol. 2000; 30: 3291-3298; Napolitani G, Rinaldi A, Bertoni F, Sallusto F, Lanzavecchia A. Selected Toll-like receptor agonist combinations synergistically trigger a T helper type 1 -polarizing program in dendritic cells [las combinaciones seleccionadas de agonistas de receptores tipo Toll desencadenan sinérgicamente un programa de polarización de auxiliares T de tipo 1 en células dendríticas]. Nat Immunol. 2005; 6: 769-776).

Además se demostró que la secreción aumentada y prolongada de IL-12p70 en las DC podría romper la autotolerancia, lo que probablemente se atribuya en parte a anular la producción de SOCS1, que inhibe la señalización de IL-12 (Evel-Kabler K, y col., J Clin Invest. 2006; 116: 90-100). Se ha determinado que aunque la señalización de CD40 endógena estimulada por CD40L soluble conduce a una regulación positiva de SOCS1, iCD40 activa las DC sin una inducción significativa de SOCS1. Además, la señalización de iCD40 desencadena una expresión alta y prolongada de IL-12p70 en las DC, que presentan una potencia mejorada para estimular las células T CD4+ y los CTL.

La IL-6 está implicada en la supervivencia de muchos tipos de células diferentes mediante la activación de vías antiapoptóticas, tales como p38 MAPK, ERK1, 2 47 y PI3-quinasa (Bisping G, Kropff M, Wenning D, y col. Targeting receptor kinases by a novel indolinone derivative in multiple myeloma: abrogation of stroma-derived interleukin-6 secretion and induction of apoptosis in cytogenetically defined subgroups [direccionamiento del receptor de quinasas por un novedoso derivado de indolinona en mieloma múltiple: abrogación de la secreción de interleucina-6 derivada del estroma e inducción de apoptosis en subgrupos definidos citogenéticamente]. Blood. 2006; 107: 2079-2089). La inducción de la expresión de IL-6 por la señalización de iCD40 y TLR-4 en las DC también se identificó. Este hallazgo podría explicar en parte la supervivencia prolongada de las DC descritas anteriormente (Hanks BA, y col., Nat Med. 2005; 11: 130-137).

Además, la expresión de IL-6 es fundamental en la capacidad de las DC para inhibir la generación de células reguladoras T CD4+ CD25+ (Pasare C y Medzhitov R., Science. 2003; 299: 1033-1036). En este contexto, una vacuna basada en iCD40-DC podría potencialmente suprimir los represores in vivo, inhibiendo la tolerancia periférica a los antígenos de direccionamiento.

Un enfoque principal de la inmunoterapia del cáncer ha sido el diseño de vacunas para promover fuertes respuestas CTL específicas del antígeno tumoral en pacientes con cáncer (Rosenberg SA., Immunity. 1999; 10: 281-287). Sin embargo, la evidencia acumulada sugiere que las células T CD4+ también desempeñan un papel fundamental en la inmunidad antitumoral, ya que contribuyen a la inducción, persistencia y expansión de las células T CD8+ (Kalams SA, Walker BD. The critical need for CD4 help in maintaining effective cytotoxic T lymphocyte responses [la necesidad crítica de CD4 ayuda a mantener respuestas de linfocitos T citotóxicos efectivas]. J Exp Med. 1998; 188: 2199-2204). El estudio de los investigadores mostró que las iCD40-DC podrían cebar eficazmente las células T sin tratamiento previo y expandir eficazmente las células específicas de antígeno que representan ambos brazos de la respuesta inmune (es decir, CTL específicos de MAGE-3 y PSMA y células T CD4+ específicas de TT). Se demostró que las citoquinas TH1 (IFN-gamma y TNF-alfa) se producían predominantemente en el medio de las células T CD4+ estimuladas con iCD40-DC, lo que indica la expansión de las células TH1. Como era de esperar, estas citoquinas no se detectaron cuando las células T se estimularon con DC tratadas con MC, porque PGE2 (un componente clave de MC) es un poderoso supresor de las respuestas TH1 (Kalinski P, Hilkens CM, Snijders A, Snijdewint FG, Kapsenberg ML. Dendritic cells, obtained from peripheral blood precursors in the presence of PGE2, promote Th2 responses [las células dendríticas, obtenidas a partir de precursores de sangre periférica en presencia de PGE2, promueven respuestas Th2]. Adv Exp Med Biol. 1997; 417: 363-367; Mcllroy A, Caron G, Blanchard S y col. Histamine and prostaglandin E up-regulate the production of Th2-attracting chemokines (CCL17 and CCL22) and down-regulate IFN-gamma- induced CXCL10 production by immature human dendritic cells [la histamina y la prostaglandina E regulan positivamente la producción de quimioquinas que atraen Th2 (CCL17 y CCL22) y regulan negativamente la producción de CXCL10 inducida por IFN-gamma por células dendríticas humanas inmaduras]. Inmunology. 2006; 117: 507-516; Meyer F, Ramanujam KS, Gobert AP, James SP, Wilson KT. Cutting edge: cyclooxygenase-2 activation suppresses Th1 polarization in response to Helicobacter pylori [vanguardia: la activación de la ciclooxigenasa-2 suprime la polarización Th1 en respuesta a Helicobacter pylori]. J Immunol. 2003; 171: 3913 3917).

Estudios recientes en ratones han demostrado que la migración de DC se correlaciona directamente con la proliferación de células T (Martln-Fontecha A, Sebastiani S, Hopken UE, y col. Regulation of dendritic cell migration to the draining lymph node: impact on T lymphocyte traffic and priming [regulación de la migración de células dendríticas al nódulo linfático de drenaje: impacto en el tráfico y cebado de linfocitos T]. J Exp Med. 2003; 198: 615-621). Por lo tanto, el aumento de la migración debe mejorar la eficacia de las vacunas basadas en DC45. Los protocolos actuales de vacunas de DC incluyen el preacondicionamiento del sitio de inyección de la vacuna con citoquinas inflamatorias o la estimulación ex vivo de DC con ligandos de TLR y citoquinas proinflamatorias, que consisten principalmente en constituyentes de MC (Martln-Fontecha A, y col., J Exp Med. 2003; 198: 615-621; Prins RM, Craft N, Bruhn KW, y col. The TLR-7 agonist, imiquimod, enhances dendritic cell survival and promotes tumor antigen-specific T cell priming: relation to central nervous system antitumor immunity [el agonista de TLR-7, imiquimod, mejora la supervivencia de las células dendríticas y promueve el cebado de células T específicas de antígeno tumoral: relación con la inmunidad antitumoral del sistema nervioso central]. J Immunol. 2006; 176: 157 164). A pesar de sus numerosas funciones inmunosupresoras8-12, la PGE2 se ha utilizado durante los últimos años como un componente indispensable del cóctel de maduración de DC porque estimula la capacidad migratoria de las DC regulando positivamente tanto CCR7 como la sensibilización a sus ligandos. Los enfoques alternativos que mejoran la migración de las DC sin PGE2 deben ser beneficiosos para la mejora de las vacunas basadas en DC.

Los resultados de estos estudios muestran que la señalización de iCD40 no solo regula positivamente la expresión de CCR7 en las DC, sino que también estimula su quimiotaxis a CCL19 in vitro. Además, las DC inmaduras transducidas con iCD40 pudieron migrar tan eficientemente como las DC estimuladas con MC tanto in vitro como in vivo. Además, la migración de iCD40-DC se indujo aún más cuando las células se estimularon con ligandos de TLR-4. Recientemente se demostró que la estimulación de CCR7 aumenta la tasa migratoria de las DC, lo que indica que este receptor puede regular la locomoción y la motilidad de las DC (Riol-Blanco L, Sánchez-Sánchez N, Torres A, y col. The chemokine receptor CCR7 activates in dendritic cells two signaling modules that independently regulate chemotaxis and migratory speed [el receptor de quimioquinas CCR7 activa en células dendríticas dos módulos de señalización que regulan independientemente la quimiotaxis y la velocidad migratoria]. J Immunol. 2005; 174: 4070 4080; Palecek SP, Loftus JC, Ginsberg MH, Lauffenburger DA, Horwitz AF. Integrin-ligand-binding properties govern cell migration speed through cell-substratum adhesiveness [las propiedades de unión de integrina-ligando gobiernan la velocidad de migración celular a través de la adhesividad del sustrato celular]. Nature. 1997; 385: 537-540; Yanagawa Y, Onoe K. CCL19 induces rapid dendritic extension of murine dendritic cells [CCL19 induce una rápida extensión dendrítica de células dendríticas murinas]. Blood. 2002; 100: 1948-1956). Se ha demostrado que la estimulación de CCR7 mejora el fenotipo maduro de las DC58. Por lo tanto, mediante la transducción de DC con iCD40, la expresión de CCR7, la migración de DC y el estado de maduración se han mejorado, obviando la necesidad de PGE2.

Finalmente, la estimulación con ÍCD40 de las DC fue capaz de inducir una potente respuesta de células T citotóxicas al antígeno prostático específico, PSMA, que fue capaz de aumentar significativamente la destrucción de las células LNCaP objetivo. (Dudley ME, Wunderlich JR, Yang JC, y col. Adoptive cell transfer therapy following non-myeloablative but lymphodepleting chemotherapy for the treatment of patients with refractory metastatic melanoma [terapia de transferencia celular adoptiva después de una quimioterapia no mieloablativa pero que agota los linfoides para el tratamiento de pacientes con melanoma metastásico refractario]. De J Clin Oncol. 2005; 23:2346-2357; Morgan RA, Dudley ME, Wunderlich JR, y col. Cancer Regression in Patients After Transfer of Genetically Engineered Lymphocytes [regresión del cáncer en pacientes después de la transferencia de linfocitos modificados genéticamente]. Science. 2006). Otros documentos citados en la presente memoria se mencionan en la solicitud de patente de EE. UU. n.° 10/781.384, presentada el 18 de febrero de 2004, titulada “ Induced Activation In Dendritic Cells” y nombrando a Spencer y col. como inventores, ahora concedida como la patente US-7.404.950.

Ejemplo 8: CD40 inducible

El sistema inmunológico innato utiliza varias familias de receptores de reconocimiento de patrones PRR para detectar una infección o lesión patológica. Una familia de PRR son los Toll-like receptors (receptores tipo Toll - TLR) que ahora incluyen aproximadamente 11 miembros en mamíferos. Estos típicamente se unen a ligandos multivalentes a través de un leucine-rich motif (motivo rico en leucina - LRM). Los ligandos pueden provenir de bacterias, virus, hongos o células huésped y pueden unirse a los TLR en la superficie celular o dentro de las vesículas endocíticas (especialmente TLR 3, 7, 8 y 9). Dentro de sus dominios de señalización citoplásmica, comparten un dominio TIR (Toll/IL-1 R) conservado que se une a moléculas adaptadoras que contienen TIR corriente abajo, tales como MyD88 y T r IF/TICAM-1, y adaptadores TIRAM/TICAM-2 y MAL/TIRAP. Los PRR adicionales incluyen los receptores tipo NOD (p. ej., NOD1 y NOD2) y las helicasas tipo RIG, RIG-I y Mda-5. Muchos PRR se unen a los ligandos a través de LRM flexibles y se acoplan a moléculas de señalización corriente abajo a través de motivos de unión proteína-proteína, tales como los dominios TIR o CARD (dominio de reclutamiento de caspasas).

La estimulación a través de TLR-4 junto con la señalización a través de la molécula coestimuladora CD40 puede promover la maduración de alto nivel y las propiedades migratorias en monocyte-derived dendritic cells (células dendríticas derivadas de monocitos - MoDC) humanos. Según los datos publicados y no publicados2-7, este estado de activación prolongado y mejorado de las MoDC humanas in vitro y/o in vivo puede promover la activación y expansión de las células T autólogas específicas de tumor para la inmunoterapia adoptiva y superar los problemas de auto-limitación de las DC maduradas ex vivo para vacunación.

Hay diversos enfoques disponibles para evaluar el uso de diferentes PRR junto con CD40 inducible. Estos enfoques, y los métodos experimentales utilizados para realizar estas evaluaciones, también se pueden utilizar para estudiar CD40 inducible junto con proteínas adaptadoras PRR inducibles tales como, por ejemplo, MyD88 y TRIF.

Para reemplazar los cócteles de maduración de MoDC complejos y poco entendidos o combinaciones de adyuvantes y señalización de CD40, se desarrollan versiones inducibles por CID del receptor 4 tipo toll (llamado iTLR4) y otros iTLR (es decir, TLR3, 7, 8 y 9) y se analiza iTLR para determinar la sinergia con iCD40 en trans o en cis dentro de la misma cadena polipeptídica. La eficacia se basa en la inducción de factores de transcripción NF-kappaB e IRF3/7s, y la fosforilación de p38 y JNK en la línea DC, D2SC/1. El receptor inducible más potente se subclona en un adenovector para la transducción eficaz de MoDC.

Las dendritic cells (células dendríticas - DC) desempeñan un papel fundamental en el inicio y la regulación de la inmunidad adaptativa7,8. Tras la detección de “señales de peligro” , las DC se adaptan fisiológicamente a su microambiente mediante un programa de maduración genética6. Utilizando un amplio repertorio de presentación de antígenos y moléculas coestimuladoras, las DC son capaces de activar potentemente linfocitos T específicos de antígeno sin tratamiento previo y regular su fenotipo y función posteriores9. En la mayoría de los casos, el desarrollo de una sólida inmunidad de cytotoxic T lymphocyte (linfocitos T citotóxicos - CTL) por las DC requiere una señal “auxiliar” de las células T CD4+10. Esta señal comprende tanto citoquinas solubles, tal como IL-2, como de estimulación mediada por CD40L del receptor CD40 de superficie en la DC11-13. Un miembro de la superfamilia del tumor necrosis factor receptor (receptor del factor de necrosis tumoral - TNFR), CD40 desencadena diversas vías dentro de las DC que dan como resultado la regulación positiva de varios genes de presentación de antígenos, coestimuladores, citoquinas y pro-supervivencia, que en conjunto permiten que las DC induzcan la activación de CTL14-15.

Dado el papel preeminente de las DC como antigen-presenting cells (células presentadoras de antígenos - APC), pueden ser aprovechadas como adyuvantes naturales en protocolos de vacunación para el tratamiento de diversas neoplasias malignas 16,17 Las aplicaciones típicas incluyen la recolección de monocitos de sangre periférica a través de leucoféresis, la diferenciación en cultivo en GM-CSF e IL-4, y la carga de DC derivadas de monocitos inmaduros (o células precursoras CD34+) (MoDC) con antígenos tumorales mediante uno de varios métodos, tales como pulsado de DC inmaduras con lisados tumorales no fraccionados, péptidos eluidos por MHC, heat shock proteins (proteínas de choque térmico - HSP) derivadas de tumores, antígenos asociados a tumores (TAA (péptidos o proteínas)) o transfección de DC con ARNm tumoral masivo o ARNm que codifica TAA (revisado en 18,19). A continuación, las DC cargadas con antígeno se maduran típicamente ex vivo con citoquinas inflamatorias (p. ej., TNFalfa, IL1beta, IL6 y PGE 2) u otros adyuvantes (p. ej., LPS, oligonucleótidos CpG) y se inyectan en pacientes. En cada caso, las propiedades inmunoestimuladoras de las DC dependen de muchas variables, especialmente la capacidad para migrar a los nódulos linfáticos y el estado de maduración completa. Sin embargo, el éxito limitado de los ensayos clínicos recientes con inmunoterapia con DC ha sugerido que los protocolos actuales deben perfeccionarse si la inmunoterapia basada en DC se quiere incluir en el arsenal de tratamiento junto con modalidades más convencionales de terapia contra el cáncer 20,21 '

Dos limitaciones clave de las vacunas basadas en DC son el corto lapso de vida de las DC maduras y su estado de activación transitoria dentro de los tejidos linfoides. Menos de 24 horas después de la exposición al lipopolisacárido (LPS), las DC terminan la síntesis de la citoquina polarizante hacia T^h1, IL-12, y se vuelven refractarias a estímulos adicionales 22, lo que limita su capacidad para activar los cytotoxic T lymphocytes (linfocitos T citotóxicos - CTL). Otros estudios indican que la supervivencia de las DC pulsadas por antígenos dentro del lymph node (nódulo linfático - NL) de drenaje se limita a solo 48 horas después de su liberación, debido principalmente a la eliminación por CTL específicos de antígeno23. Estos hallazgos subrayan la necesidad de métodos mejorados para prolongar el estado de activación y el lapso de vida de las DC y/o coordinar temporalmente la “ventana” de activación de las DC con la participación de las células T afines dentro de los LN. Por lo tanto, mejorar la activación y supervivencia de las DC puede ser fundamental para promover la inmunidad contra los tumores.

La supervivencia de las DC está regulada, al menos en parte, por moléculas derivadas de patógenos que actúan a través de uno o más Toll-like receptors (receptores tipo Toll - TLR) conservados y moléculas coestimuladoras expresadas en células T (p. ej., CD40L y TRANCE), que dependen en parte de Bcl-2 y BcI-X^lpara la actividad antiapoptótica3,24-27. Aunque la importancia de la longevidad de las DC mediada por TLR, CD40 o Bcl-2 ha sido bien documentada, es probable que los mecanismos de retroalimentación homeostática también limiten la utilidad de los ligandos TLR o los miembros de la familia Bcl-2 para extender la longevidad de las DC en los protocolos de la vacuna tumoral. Estos incluyen la desensibilización o regulación negativa del receptor4,28,29, la expresión de reguladores negativos para TLR/IL-1 R, como IRAK-M30 y SOCS-15 y la inducción de moléculas proapoptóticas, como Bim31, lo que resulta en la neutralización de moléculas antiapoptóticas por señales de TLR.

Un objetivo atractivo para la manipulación es el receptor de la familia TNF, CD40. A diferencia de las citoquinas proinflamatorias o moléculas asociadas a patógenos de que las DC se encuentran en toda la periferia, el receptor CD40 expresado en DC es activado por las células T auxiliares CD4+dentro de la paracorteza LN a través de su ligando afín, c D40L12,13,37. Los estudios recientes han demostrado además que la estimulación con CD40 permite que las DC presenten de forma cruzada el antígeno38 y superen la tolerancia39 de las células T periféricas, lo que impulsó estudios terapéuticos basados en la estimulación con CD40. Las estrategias incluyeron el suministro sistémico de monoclonal antibodies (anticuerpos monoclonales - mAb) específicos de CD40 o de CD40L40 trimerizado, la utilización de vacunas basadas en DC cargadas con antígenos estimuladas con CD4041, y la administración de DC que expresan ligando CD40 (CD40L) genéticamente modificado42. A pesar de su gran potencial, varias propiedades de CD40 limitan su desarrollo terapéutico, incluida la expresión ubicua de CD40 por una diversidad de otros tipos de células, incluidas células B, macrófagos y células endoteliales14, lo que aumenta la probabilidad de efectos secundarios debido a la administración sistémica de estímulos de CD40. Además, varios mecanismos regulan la expresión de superficie de CD40 al dirigirse a su dominio extracelular, incluida la escisión inducida por CD40L por las enzimas metaloproteinasas de matriz29, la degradación por retroalimentación negativa por una isoforma28 de CD40 empalmada alternativamente y la endocitosis de CD40 mediada por CD40L.

Por lo tanto, se ha desarrollado un sistema de activación de DC basado en la vía de señalización de CD40 para extender el estado proestimulador de las DC dentro de los tejidos linfoides proporcionando funcionalidad dirigida a DC, control temporal y resistencia a los mecanismos reguladores de CD40. Este receptor recombinante diseñado por ingeniería comprende el dominio citoplásmico de CD40 fusionado a dominios de unión al ligando y una secuencia de direccionamiento a la membrana (Fig. 2). La administración de un fármaco dimerizador permeable a los lípidos por vía intraperitoneal condujo a la potente inducción de cascadas de señalización dependientes de CD40 y mejoró enormemente la inmunogenicidad contra antígenos definidos y tumores in vivo en relación con otras modalidades de activación4. Por tanto, el CD40 quimérico se denominó CD40 inducible (iCD40). La gran utilidad de las DC activadas con iCD40 en ratones sugirió que los métodos para estabilizar la señalización de CD40 endógena también podrían mejorar la potencia de las vacunas de DC.

Los TLR se unen a una diversidad de moléculas derivadas de virus y bacterias, que desencadenan la activación de las células objetivo, tales como las células T, los macrófagos y las células dendríticas. Aunque la mayoría de los aproximadamente 10 TLR de mamíferos utilizan una vía de señalización iniciada por la proteína adaptadora PRR inducible, MyD88, que conduce a la activación de NF-kappaB, TLR3 se basa en cambio en el adaptador PRR inducible TRIF, lo que conduce a la inducción de interferón de tipo I y de IRF3. En conjunto, estas vías de señalización pueden sinergizarse para producir altos niveles de la citoquina Th1, IL-1243. Curiosamente, TLR-4 puede utilizar ambas vías después de la unión del potente mitógeno, LPS o derivados. La estimulación a través de TLR-4 junto con la señalización a través de la molécula coestimuladora CD40 puede promover la maduración de alto nivel y las propiedades migratorias en las MoDC humanas.

Al igual que muchos receptores de la superficie celular que hacen un solo paso a través de la membrana plasmática, es probable que todos los TLR se activen por homo o heterodimerización u oligomerización. Existen informes de activación mediada por homodimerización de TLR-4 y activación mediada por heterodimerización de TLR2 con TLR1 y TLR644"48. Además, en un artículo reciente, Ian Wilson y sus colaboradores cristalizaron TLR-3 e identificaron regiones de dimerización dentro del dominio extracelular, lo que sugiere que señala como un homodímero seguido de la unión del ARNbc49. Por lo tanto, es probable que la dimerización inducida químicamente de TLR, especialmente TLR-4, conduzca a su inducción.

Consideraciones para el desarrollo de DC humanas “ mejoradas" derivadas de monocitos maduradas ex vivo. Los estudios publicados4 y no publicados han sugerido dos métodos potentes para mejorar la función de las DC in vivo, la expresión ectópica de un Akt constitutivo optimizado (MyrF-AAkt) y la manipulación de un CD40 inducible quimérico in vivo. Como complemento de este trabajo, Si-Yi Chen (Baylor College of Medicine, Houston, Texas) ha demostrado que reducir los niveles de SOCS-1 en las DC también puede mejorar la eficacia5. Si bien se han acumulado datos de apoyo significativos en ratones para iCD40, MyrF-AAkt y enfoques de SOCS-1, las MoDC humanas no son idénticas a las DC derivadas de la médula ósea murina. En particular, el protocolo de vacuna de DC humana más comúnmente utilizado implica la diferenciación de MoDC de los monocitos, antes del tratamiento con el cóctel de maduración proinflamatoria “estándar de oro” , que contiene TNF-alfa, IL-1-beta, IL-6 y PGE2. Aunque la PGE2 se considera necesaria para regular positivamente CCR7 y ganar capacidad de respuesta quimiotáctica a las quimioquinas derivadas de los nódulos linfáticos, CCL19 y CCL2150,51, la PGE2 también puede alterar la señalización de DC al suprimir la producción de IL12p70 bioactiva52. Si bien es poco probable que la supresión de IL12 sea permanente in vivo, dado el lento aumento de la tasa de éxito de las vacunas de DC7, será importante determinar antes de las aplicaciones clínicas cuál de los métodos descritos anteriormente puede superar mejor la supresión de IL12 mediada por PGE2 en las MoDC humanas sin interferir con la capacidad migratoria.

Aunque el éxito clínico de las vacunas basadas en DC ha sido modesto7,20, los efectos secundarios extremadamente bajos y una especificidad y sensibilidad potencialmente exquisitas hacen que esta modalidad sea atractiva. Debido a que es probable que se prolongue la interacción con las células T específicas de antígeno, es probable que estas DC mejoradas mejoren el resultado clínico de las vacunas de DC. El desarrollo de DC que expresan antígenos mejorados no solo tiene una aplicabilidad potencial para el tratamiento de la neoplasia maligna, sino que también debe ser aplicable al tratamiento de numerosos patógenos. Además, este enfoque de alto impacto debe complementar los esfuerzos previos de numerosos laboratorios, que han identificado antígenos tumorales.

Caracterización de la funcionalidad de iCD40 en DC primarias y desarrollo de una vacuna contra el cáncer de próstata basada en DC que expresa iCD40. Después de demostrar la funcionalidad de iCD40 en células D2SC/1 murinas (4 y no se muestra), que poseen muchas características de DC recién aisladas, se examinó la funcionalidad de iCD40 en bone marrow-derived DCs (DC derivadas de médula ósea - BMDC) primarias mediante la utilización de un adenovirus que expresa iCD40. Un vector adenoviral de tipo 5, AE1, AE3 dependiente de auxiliar, denominado Ad-iCD40-GFP, se diseñó por ingeniería para expresar tanto iCD40 como EGFP bajo el control del promotor/potenciador temprano/inmediato de CMV. Ad-iCD40-GFP transdujo y expresó con éxito el transgén iCD40, así como el marcador EGFP, en BMDC purificadas. La valoración volumétrica de Ad-iCD40-GFP mientras se midió la regulación positiva inducida por iCD40 de B7.2 (CD86) mostró que la activación máxima de iCD40 mediada por el fármaco se produjo en alrededor de 100 moi y procedió asintóticamente a la meseta en valoraciones virales más altas (datos no mostrados). Aunque los efectos fueron modestos, AP20187 indujo la expresión superficial de MHC clase I Kb, B7.2, así como CD40 endógeno en BMDC que expresan iCD40 a 100 moi pero no en DC no transducidas. Los efectos de Ad-iCD40-GFP en BMDC utilizando tinción intracelular de citoquinas para evaluar la expresión de DC de la citoquina polarizante hacia T^h1, IL-12 se investigó a continuación. Estos hallazgos confirmaron numerosos informes previos de que un vector adenoviral vacío puede contribuir a las lecturas de fluorescencia de fondo estimulando la producción de niveles bajos de esta citoquina53. Estos experimentos también revelaron que el transgén iCD40 podría generar un nivel significativo de señalización basal en estas valoraciones incluso en ausencia de CID. Sin embargo, la exposición AP20187 de estas DC que expresan iCD40 logró superar de manera reproducible estos efectos acumulativos para aumentar aún más el porcentaje de IL-12+ DC. Curiosamente, la estimulación de la síntesis de IL-12p70/p40 con LPS y CD40L alcanzó su punto máximo a las 8 horas y disminuyó a partir de entonces, mientras que el porcentaje de IL-12+ DC continuó aumentando hasta al menos 24 horas después de la transducción de Ad-iCD40-GFP. El trabajo anterior de Langenkamp y col. ha demostrado que el tratamiento prolongado de las DC con LPS agota su capacidad de producción de citoquinas54. Estos resultados implican que el vector Ad-iCD40-GFP, a diferencia de la señal de peligro de LPS, es capaz de promover y mantener una respuesta de IL-12 más duradera por las BMDC.

Además del estado de activación de DC, la longevidad de DC es otra variable crítica que influye en la generación de inmunidad dependiente de células T. De hecho, la destrucción de las DC mediada por CTL se considera un mecanismo significativo para modular las respuestas inmunes al tiempo que protege al huésped de patologías autoinmunes55,56. Otro trabajo ha establecido que la estimulación de CD40 de las DC prolonga su supervivencia mediante una diversidad de mecanismos, incluida la regulación positiva de la proteína anti-apoptótica bcl-Xi_ y el inhibidor de la granzima B, Spi-657,58. Los efectos de iCD40 en relación con CD40L sobre la supervivencia de DC se compararon en un ensayo de cultivo por inanición de suero in vitro. Al analizar el colorante vital (yoduro de propidio (PI)) - población de células positivas mediante citometría de flujo, se descubrió que las BMDC que expresan iCD40 presentan una mayor longevidad en estas condiciones en comparación con las DC no transducidas tratadas con CD40L. Este efecto fue dependiente de iCD40 ya que las DC transducidas con Ad-GFP no reflejaron una supervivencia mejorada en estas condiciones. Este trabajo también mostró que la exposición de las BMDC de iCD40 al fármaco dimerizador AP20187 mejoró aún más este efecto de supervivencia en relación con las BMDC no tratadas. Además, cuando las DC transducidas con Ad-iCD40 se tiñeron con CFSE y se inyectaron en las bases de las patas, un número significativamente mayor de DC se encontró en los nódulos linfáticos poplíteos después de las inyecciones ip de AP20187 en comparación con las DC iCD40 estimuladas in vitro o las DC tratadas con LPS/CD40L.

A pesar de las bien conocidas señales de maduración dependientes de Ad y los efectos de señalización basal de iCD40 en las BMDC primarias, una activación mejorada de DC se detectó en presencia de AP20187.

En general, estos datos sugieren que un receptor CD40 inducible diseñado para responder a un agente farmacológico es capaz de mantener las DC primarias en un estado sostenido de activación en comparación con los efectos más transitorios de la estimulación de CD40L y los efectos potencialmente más complejos de los anticuerpos anti-CD40. Este dato es consistente con hallazgos anteriores que describen solo modulación DC a corto plazo para estímulos que se dirigen a CD40 endógeno.

El interruptor de activación iCD40 funciona como un potente adyuvante para las vacunas de ADN antitumorales.

Los estudios anteriores han demostrado que las DC desempeñan un papel fundamental en el procesamiento y la presentación de vacunas de ADN a las células T que responden59. A continuación, se estudió la eficacia antitumoral in vivo de las vacunas basadas en DC iCD40, así como el papel in situ de las DC que expresan iCD40 en la inmunovigilancia tumoral. Para establecer un modelo de tumor terapéutico, los ratones C57BL/6 se inocularon por vía subcutánea con la línea tumoral de timoma EG.7-OVA y se dejó progresar hasta que los volúmenes tumorales alcanzaron aproximadamente 0,5 cm3. Estos ratones portadores de tumores se vacunaron con BMDC wt pulsado con SIINFEKL o iCD40. La vacunación con BMDC wt, sin tratar o estimuladas en cultivo con LPS y CD40L o in vivo con mAb anti-CD40, no consiguió ralentizar la tasa global de crecimiento del tumor. Sin embargo, la activación iCD40 de las vacunas BMDC mediada por fármacos in vivo dio como resultado disminuciones sostenidas del tamaño del tumor. Además, la tasa de respuesta a las vacunas de BMDC que expresan iCD40 activadas in vivo fue significativamente mayor que las tasas de respuesta a las BMDC naturales en todas las demás condiciones de vacunación (70 % frente al 30 %). Para confirmar la obtención de respuestas de células T específicas de antígenos tumorales en ratones portadores de tumores, se realizó un análisis de tetrámero H-2Kb OVA^257-264en células T CD8+ de sangre periférica. Este análisis verificó la presencia de una población expandida de células T CD8+ específicas de KbOVA^257-264exclusivamente en ratones vacunados con BMDC iCD40 activadas in vivo.

Aunque los modelos de tumores subcutáneos proporcionan una herramienta conveniente para aproximar el tamaño del tumor, su utilidad se limita típicamente a los tumores no ortotópicos que son razonablemente simétricos. Además la cuantificación de la metástasis requiere la eutanasia y se limita a una sola medición. Como mejora de este enfoque principal, se desarrollaron células tumorales que expresan de manera estable una luciferasa desplazada al rojo de los escarabajos clic del Caribe (Pyrophorus plagiophthalamus). La obtención de imágenes en ratones después de la administración del sustrato D-luciferina confirma la fácil detección mediante una cámara CCD enfriada (IVIS™ Imaging System, Xenogen Corp.) o calibradores estándar. Además, el indicador de luciferasa desplazado al rojo (emisión ~613 nM) debe permitir una cuantificación más lineal de la metástasis a distancia superficial.

Desarrollo de TLR inducibles por CID (iTLR): hay varios subgrupos de TLR basados en la sublocalización y las vías de señalización utilizadas. Independientemente de la localización subcelular normal de los dominios extracelulares que se unen al ligando, los dominios de señalización son citoplasmáticos y deben señalar correctamente en todos los casos si la homodimerización es el mecanismo de señalización normal. De forma análoga a iCD40, los dominios de señalización citoplásmica de TLR se amplificaron mediante PCR con sitios de restricción XhoI y Sa/I flanqueantes para la subclonación en el lado 5’ o 3' de dos dominios de unión a chemical inducers of dimerization (inductores químicos de dimerización - CID) (CBD), FKBP12V361. Los CBD-TLR quiméricos se localizaron en la membrana plasmática utilizando motivos de direccionamiento a miristoilación (Fig. 3).

Las pruebas iniciales de los TLR implicaron la transfección conjunta de vectores de expresión en células Jurkat-TAg o 293 junto con un plásmido indicador66 de SEAP (fosfatasa alcalina secretada) que responde a NF-kappaB. Curiosamente, los datos preliminares sugirieron que solo iTLR7 e iTLR8 funcionaban en las células Jurkat-TAg, pero no iTLR3, 4 y 9, independientemente de la posición relativa de los CBD y TLR. Las transfecciones adicionales en un panel de células se necesitarán para determinar si esto refleja diferencias de señalización fisiológicas específicas de tejido u otras idiosincrasias de estos constructos quiméricos.

Los expertos en la técnica reconocerán las modificaciones que se pueden realizar para el uso de proteínas adaptadoras en lugar de TLR en los siguientes métodos.

Desarrollo de TLR inducibles: los TLR quiméricos inducibles se pueden desarrollar para eludir el requisito de adyuvante derivado de patógenos (o sintético) en la activación de DC. Inicialmente, los iTLR 3, 4, 7, 8 y 9 quiméricos se desarrollaron clonando los dominios de señalización citoplásmica de los TLR 5’ (corriente arriba) o 3' (corriente abajo) de los dominios de unión a CID (Fig. 3). El análisis inicial en células Jurkat-TAG reveló que iTLR8 (y en menor medida iTLR7) desencadenaba la mayor inducción de NF-kappaB. Sin embargo, la fuerza relativa de diversos TLR puede ser un parámetro específico de tejido. Para abordar esto, estos constructos pueden probarse en la línea celular DC, D2SC/1 inicialmente con respecto a la activación de NF-kappaB usando un sistema informador NF-kappaB SEAP basado en la transfección transitoria de múltiples plásmidos de expresión en células objetivo. Las células 2DSC/1 representan un subconjunto raro de líneas de DC inmortalizadas que conservan tanto el fenotipo de DC inmaduras como la capacidad de madurar después de las señales de activación67. Dado que la inducción de NF-kappaB no es la única función de los TLR, la inducción de IRF3/7 también se puede analizar utilizando un plásmido informador de elemento de respuesta estimulado por interferón (IFN) (ISRE)-SEAP que se une a los IRF e induce la actividad informadora. Para desarrollar ISRE-SEAP, el promotor que contiene ISRE de ISRE-luc (Stratagene) puede reemplazar al promotor SRalpha en el plásmido indicador constitutivo pSH1/kSEAP. Como inducción secundaria de la señalización de TLR, la fosforilación de JNK y p38 se monitorizan mediante transferencia de Western usando anticuerpos específicos de fosforilación.

Dado que diversos TLR distintos pueden inducir diferencialmente IRF y NF-kappaB y pueden sinergizar en la activación de DC y la producción de IL-1243, la prueba inicial de TLR inducibles puede ir seguida de pruebas combinatorias por transfección conjunta de iTLR, dos a la vez. Aunque pueden producirse tanto la homodimerización normal como una heterodimerización más impredecible, este enfoque debe revelar sinergismo entre diferentes clases de TLR. La activación de pares de TLR sinérgicos debe conferir capacidades inmunoestimuladoras mejoradas a las DC. Si se puede detectar sinergismo, se prueba una nueva serie de constructos que comprenden dos TLR distintos (o idénticos) en tándem, llamados inducible composite TLRs (TLR compuestos inducibles - icTLR) (Fig. 4). En este caso, los dominios de señalización TLR flanqueados por Xhol-Sa/l citoplasmáticos anteriores se combinan en diversas disposiciones corriente arriba y corriente abajo de los CBD. Finalmente, los dos constructos más potentes se modifican para contener el dominio citoplásmico de CD40, previamente demostrado que está activado por CID (Fig. 5).

Aunque la transfección de las DC puede ser problemática, Vieweg y colaboradores describieron recientemente un método mejorado de electroporación68. En su enfoque, la supervivencia después de la electroporación (300 V, 150 mF (Gene Pulser II: Bio-Rad)) se mejora al resuspender las DC (4 x 107/ml) en tampón ViaSpan de iones de potasio alto (Barr Laboratories). De forma adicional, si la eficacia de la transfección sigue siendo demasiado baja, el vector de expresión pRSV-TAg, que contiene el antígeno T grande de SV40 para amplificar los vectores de expresión de los investigadores de la serie pSH1, que contienen todos el origen de replicación de SV40, se cotransfectará.

Desarrollo de un adenovector que expresa e l gen de activación unificado icTLR/CD40: aunque D2SC/1 es un modelo celular útil para estudios preclínicos, los genes inmunorreguladores se analizarán a continuación en DC primarias de ratón y humano antes de las aplicaciones clínicas. Para facilitar la transferencia de genes eficiente a las células primarias, el constructo o constructos más potentes se subclona(n) en el vector lanzadera de adenovirus, pShuttle-X o pDNR-CMV y se transfiere adicionalmete al vector Ad5, pAdeno-X (BD) o AdXLP (BD), respectivamente. Se lleva a cabo la preparación de virus de alta valoración. Como se ha logrado con Ad5/f35-iCD40 desarrollado previamente, este vector se prueba en DC tanto humanas como de ratón. Aunque los adenovectores pseudotipados de Ad5/f35 mejoran un poco la eficiencia de la transducción en las DC humanas, los adenovectores con envoltura de Ad5 “ puros” pueden usarse para permitir la transducción adicional de las DC murinas.

Para estudios en humanos, las MoDC se preparan mediante incubación estándar de precursores de DC de sangre periférica adherentes en GM-CSF e IL-4. Las DC inmaduras se transducen con el vector icTLR/CD40 y los vectores de control desarrollados (p. ej., Ad5/f35-iCD40 y Ad5/f35-EGFP). Los ensayos estándar de MoDC para la maduración y la actividad se describen en la presente memoria y también incluyen, por ejemplo, análisis de citometría de flujo de marcadores de maduración (p. ej., CD40, CD80, CD86, HLA clase I y II, CCR7), producción de IL-12, migración y activación de células T específicas de antígeno.

En el caso de que colocar dominios de señalización CD40 y TLR en tándem pueda interferir con las vías de señalización activadas por dominios aislados, los constructos pueden expresarse conjuntamente en vectores virales utilizando estrategias alternativas, tales como el uso de casetes de expresión bicistrónicos o la clonación en la región E3 de adenovetores deltaE1deltaE3. Además, es posible que los receptores quiméricos no emitan señales idénticas a las de las proteínas endógenas. Aunque se puede pensar que determinados PRR o adaptadores PRR son los TLR más potentes para la activación de las DC mieloides, las alternativas pueden funcionar mejor cuando se convierten en un receptor activado por CID. Además, el sinergismo entre diversos PRR inducibles y adaptadores PRR y Akt constitutivo, MF-deltaAkt o ARNip SOCS-1 puede resultar más potente. En e s to s ca s o s , d iv e rs a s c o m b in a c io n e s de g e n e s re g u la d o re s in m u n ita r io s se p u e d e n c o m b in a r en a d e n o v e c to re s m u ltic is tró n ic o s .

Métodos adicionales de ensayo de adaptadores inducibles por CID

Los e x p e rto s en la té c n ic a re co n o ce rá n las m o d ifica c io n e s q u e se p u e d e n re a liza r p a ra el uso de p ro te ín a s a d a p ta d o ra s en lu g a r de T L R en los s ig u ie n te s m é tod os.

D e b id o al p a p e l fu n d a m e n ta l q u e d e s e m p e ñ a n las DC en la re g u la c ió n d e la in m u n id a d a d a p ta tiv a , e x is te n m u c h o s m e c a n is m o s h o m e o s tá tic o s q u e re g u la n n e g a tiv a m e n te la a c tiv id a d d e las DC. No o b s ta n te , u n a m a y o r a c tiv a c ió n p u e d e s e r n e c e s a ria p a ra s u p e ra r los m e c a n is m o s to le ro g é n ic o s d e r iv a d o s de tu m o re s o v iru s . En la p re s e n te m e m o ria se d e s c rib e n v a rio s m é to d o s p a ra e lu d ir e s to s m e c a n is m o s h o m e o s tá tic o s . El C D 40 in d u c ib le p u e d e a c tiv a rs e in vivo d e n tro de l c o n te x to de u n a s in a p s is in m u n o ló g ic a y c a re c e de su d o m in io e x tra c e lu la r, e v ita n d o v a rio s m e c a n is m o s d e re tro a lim e n ta c ió n n e g a tiv a q u e se d ir ig e n a e s te d o m in io . A k t “ o p t im iz a d o ” , c o n s titu tiv a m e n te a c tivo , M F-d e lta A k t, se b a s a en la lo c a liz a c ió n e s p e c íf ic a de la b a ls a de líp id o s de un a le lo Akt1 tru n c a d o . La re d u c c ió n d e l in h ib id o r S O C S -1 co n te c n o lo g ía A R N ip a u m e n ta la s e ñ a liz a c ió n d e l re c e p to r de to ll y la p ro d u c c ió n d e in te rfe ró n t ip o I. P o r lo ta n to , los tre s m é to d o s t ie n e n la c a p a c id a d de m e jo ra r las M oD C D .

Preparación de MoDC: pa ra la m a yo ría de los exp e rim e n to s b a sad os en la o p tim izac ión de e n ha nce d DC s (DC m e jo rad as - eD C ), las DC d e rivad as de m on oc ito s se d ife ren c ian y en riqu ece n a pa rtir de cé lu las m on on uc le a res de san gre pe rifé rica ob te n id a s de l ba nco de san gre o de vo lun ta rios sanos. B revem en te , los p re cu rso res de DC se a ís lan m ed ian te técn ica s de dens id ad flo ta n te (H is to paq ue : S ig m a-A ld rich ) y a co n tinu ac ió n las cé lu la s ad he ren te s (y sem iad he ren te s) se cu ltivan du ran te 5 d ía s en m ed io X -V IV O 15 DC sin sue ro (C a m b re x B io S c ience ) en p re se n c ia de c itoq u in as G ^m-C S F (800 U /m l) e IL-4 (500 U /m l) (R & D S ystem s, M inneapo lis , MN). D espués de 5 d ía s de cu ltivo, las DC in m adu ras se incuban du ran te 24 horas m ás en p re sen c ia de ad en ove c to res qu e exp resa n iC D 40 (es decir, A d5 /f35 -iC D 40 ), A kt con s titu tivo (A d5 /f35 -M F -de lta A k t), A R N h c SO CS1 (A d5 -shS O C S 1 ), o A d 5 -iT L R /C D 40 a 10.000 v ira l pa rtic les (pa rtícu la s v ira les - vp ) p o r cé lu la . (N ota : los ve c to re s A d5 pueden a ñ ad irse a 20.000 vp pa ra c o m p e n s a r en pa rte la e fic ienc ia de transd ucc ión a lgo reducida). En un sub co n ju n to de m uestras, e l m on ofosfo ril líp ido A (M PL; 1 m g/m l) del ligando T LR 4 ad ic iona l o d im e riza d o r A P 20817 (100 nM ; so lo iC D 40-D C ) se a ñ ad irá pa ra un a m aduración com p le ta .

Determinación del estado de maduración de las MoDC: du ra n te la activac ión de las M oD C , se inducen va rias p ro te ín as de sup erfic ie (“ m a rca d o re s” ) inc lu idas C D 25, C D 40, C D 80, C D 83, C D 86, H LA c la se I y c lase II, C C R 7 y o tras. Los es tu d io s p re lim in a re s de m ostra ro n qu e la seña lizac ión de iC D 40 so la es su fic ien te pa ra reg u la r p o s itivam e n te C D 83 y C C R 7 en las M oD C (no se m uestra ). La señ a lizac ió n ad ic iona l de T LR 4 (a tra vé s de M PL) co n d u ce a la activación ad itiva (o s in érg ica) de to d o s los m arca do res de m adurac ión . P or lo tan to , a un núm ero de vp fijo , se eva lú a la inducción de m arca do res de m ad ura c ión (de te rm ina do s p o r c ito m e tría de flu jo ) p o r los cu a tro vec to re s v ira les so los o ju n to con M PL. La m ad ura c ión m ed ian te el m atura tion cockta il (cócte l de m adurac ión - M C) “ e s tá n d a r de o ro ” an terio r, que c o m p re n d e IL-1 a, IL-6, T N F a lp h a y P G E2, a c tú a com o con tro l positivo y las DC in m adu ras no tra tad as (s im u ladas) s irven co m o con tro le s nega tivos en estos y los s ig u ie n tes exp erim e n tos . A d e m á s de l aná lis is fe n o típ ic o de m arcadores de sup erfic ie ce lu la r, la p ro du cc ión de IL-12 y o tras c itoq u in as po la rizan te s hacia T ^h1 (p. ej., IL-23, T N F a lfa ) tam b ién son im portan tes pa ra una inm unidad an titum ora l óp tim a. Si b ien iC D 40 no es su fic ien te pa ra la p ro du cc ión de IL-12, las com b in a c io n e s de M PL e iC D 40 con du cen a un a po ten te p ro du cc ión s in é rg ica de IL-12. P or lo tan to , los sob ren ada n tes de l cu ltivo de DC, es tim u lad os co m o an te rio rm e n te , se reco lectan 24 y 48 horas d e spu és de la transd ucc ión y m adurac ión . Los n ive les de IL-12 p70, los d ím e ro s de IL-12 /IL -23 p40 y las con ce n tra c io n e s de T N F a lp h a se d e te rm ina n m ed ian te e n sayo s co lo rim é trico s de E L IS A tipo sándw ich (BD B iosc iences). A lte rn a tivam e n te , se pueden u s a r pe rlas m u ltip lex d e sa rro lla d a s p o r BD pa ra e n sa ya r s im u ltá ne am e nte m últip les c itoq u in as ad ic iona les (p. ej., IL-1, IL-6, IFN alfa, etc.)

Determinación de la capacidad de migración: a d ife re n c ia de las bone m arro w -de rived DC s (D C de rivad as de la m édu la ó s e a - B M D C ) m urina qu e son co m p e te n te s pa ra la m ig ración de LN, las M oD C in m adu ras son de fic ien te s en esta fun c ión crucia l. Si b ien la PG E2 se usa típ ica m e n te pa ra re g u la r p o s itivam e n te C C R 7 y la cap ac id ad m igra toria , la u tilidad de PG E2 se ve a te n u a d a p o r los e fe c to s noc ivos po tenc ia le s , que inc luyen la regu lac ión ne ga tiva de la seña lizac ión de C D 40 y la p ro du cc ión de IL-12 y la regu lac ión po s itiva de IL-1050,52,69. A de m ás, inc luso en p re se n c ia de PG E2, la m ig rac ión a LN es m od esta y a lre d e d o r de l 1-2 % de las cé lu las in yec tad as70. A u n qu e la exp res ió n de C C R 7 es p ro ba b le m en te un requ is ito previo pa ra la m ig rac ión a los nódu los lin fáticos, la cap ac id ad de resp ue s ta q u im io tá c tica a las qu im io q u in a s C C R 7 de riva d a s de LN, C C L19 y C C L21, es un a m ed ida m ás d irec ta de la p ro ba b le m ig ración a los nó du los lin fáticos. P or lo tan to , la m ig rac ión a C C L19 /M IP 3 b pued e c o m p a ra rse en un en sa yo de 2 cá m a ra s m od ificado.

Los e xp e rim e n to s p re lim inares d e m ue stra n el so rp ren den te resu ltado de qu e la señ a lizac ión de iC D 40 es sufic ien te pa ra la ca p a c id a d m ig ra to ria inc luso en a u sen c ia de P G E2. En este ensayo , las M oD C se tran sd u je ro n con A d5 /f35 -ihC D 40 y se m arca ron con tin te fluo resce n te , G re e n -C M F D A (M o lecu la r P robes). Las cé lu las se co loca ro n en la cám a ra su p e rio r de un a p laca de en sayo de 8 m m de 2 cám a ras y se cua n tificó la flu o re sce n c ia to ta l en la cá m a ra in fe rio r y se co m p a ró con la es tim u lac ión m ed iad a p o r P G E2. De fo rm a s im ilar, se pued e c o m p a ra r la cap ac id ad m ig ra to ria in vitro de iC D 40-TLR -, iC D 40- y A k t-M oD C , y M oD C de fic ie n te s en SO CS1 in d iv id ua lm en te y ju n to con y sin ligandos TLR 4.

Como segundo ensayo más directo para la capacidad de migración, la migración in vivo puede compararse inyectando eDC en la parte inferior de la pierna de ratones SCID inmunodeficientes no mieloablativamente irradiados. Es necesaria una radiación mínima (~250 rad) para suprimir la actividad de las células natural killer (asesinas naturales - NK) contra las células xenogénicas. A pesar de las diferencias de especie, las MoDC humanas pueden responder a las quimioquinas murinas y migrar a los LN de drenaje71. Para visualizar las MoDC migradas con éxito, las células se marcan con el tinte fluorescente, rastreador de células Green-CMFDA, que se cuantifica mediante citometría de flujo. En segundo lugar, además de la “ mejora” mediada por adenovectores, las MoDC se transducen con un adenovector, Ad5/f35-CBR, que expresa luciferasa de escarabajo clic desplazado al rojo (pico de excitación de 510 nm) (Pyrophorus plagiophthalamus) (Promega). El uso del alelo de luciferasa CBR debe permitir más fácilmente la detección de DC bioluminiscentes (utilizando el sistema de formación de imágenes IVIS® de los investigadores [Xenogen Corp, Alameda, CA]) tanto dentro del LN poplíteo de drenaje como en sitios más distantes y distales de la membrana.

Activación y polarización de células T autólogas: además de la maduración y la migración, la capacidad para activar una respuesta inmune específica de antígeno sesgado hacia T^h1 in vivo es la condición sine qua non de la vacunación DC contra tumores sólidos. Por lo tanto, puede evaluarse la capacidad de las eDC para estimular tanto la función T auxiliar como la citotóxica. Inicialmente, puede ensayarse la estimulación de la proliferación de células T CD4+ alogénicas. Las DC mejoradas se maduran y se activan usando las condiciones descritas anteriormente, se irradian (3000 rad) y se cultivan 1: 10 con células T CD4+ purificadas con perlas magnéticas alogénicas (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). La proliferación se evalúa 4 días después, después de 16 horas de incubación con [3H]-timidina. Para complementar estos estudios, se puede determinar la capacidad de polarización de TH1 (determinada por ensayos ELISpot para IL-4 e IFNgamma) mediante varios estándares o eDC. Para analizar más específicamente el estado de maduración de DC, la capacidad para estimular la función de CTL sin tratamiento previo se determina utilizando análisis de tetrámero restringido a HLA-A2 y ensayos de CTL. (Nota: varios portadores de HLA-A2 se han genotipado recientemente). Se compara la activación de células T autólogas en donantes sanos por diversas eDC que presentan 2 cócteles distintos de antígenos restringidos a HLA-A2, uno fuerte y otro débil. Los ensayos de CTL se basarán en la actividad lítica específica de antígeno de células T estimuladas con estándar o eDC como anteriormente. Estos 4 ensayos de células T deben proporcionar un análisis preclínico equilibrado de las DC mejoradas junto con un análisis funcional de los diversos enfoques.

Citaciones que se mencionan en este ejemplo y que proporcionan soporte técnico adicional

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Ejemplo 9: Pruebas y constructos de expresión

Los TLR 3, 4, 7, 8 y 9 se seleccionaron inicialmente para construir proteínas quiméricas inducibles ya que representan los TLR de las diferentes subfamilias que se sabe que desencadenan la citoquina Th1, IL-12, en las DC derivadas de monocitos. Además, se ha demostrado que TLR4 desencadena la señalización tras la reticulación de alelos de TLR4 quiméricos a través de dominios extracelulares heterólogos. Los dominios citoplasmáticos de cada uno (incluidos los TIR) se amplificaron por PCR y se colocaron adyacentes (5’ y 3') a dos (2) genes FKBP12 (V36) (v y Fv (oscilantes)), que se unieron a la membrana plasmática utilizando una secuencia de direccionamiento a miristoilación de c-Src. Las proteínas quiméricas que tienen un tercer gen FKBP se han desarrollado para mejorar la oligomerización.

De forma adicional, las versiones quiméricas de adaptadores PRR inducibles MyD88 y TRIF se han generado fusionando estas proteínas citoplásmicas con dos (2) FKBP. Finalmente, los dominios CARd en tándem de los PRR citoplásmicos, NOD2 y RIG-I, se han fusionado con FKBP en tándem.

Estos constructos y ensayos informadores se describen a continuación.

Constructos:

(i) iTLR inducibles: TLR3, 4, 7, 8 y 9 se amplificaron por PCR a partir de ADNc derivado de MoDC. Los cebadores de PCR estaban flanqueados por sitios de restricción XhoI y SalI para permitir la clonación 5’ y 3' de FKBP en tándem en los sitios Xho I y Sal I, respectivamente, de pSH1/M-Fv-Fvls-E 12. Los cebadores usados fueron (a) 5TLR3cX (5’-cgatcactcgagggctggaggatatctttttattgg-3') y 3TLR3cS (5'-tgatcggtcgacatgtacagagtttttggatccaagtg-3') para dar pSH1/M-TLR3-Fv’-Fvis-E y pSH1/M-Fv-Fv¡s-TLR3-E; (b) 5TLR4cX (5'-cgatcactcgagtataagttctattttcacctgatgcttc-3') y 3TLR4cS (5'-tgatcggtcgacgatagatgttgcttcctgccaattg-3') para dar pSH1/M-TLR4-Fv’-Fvis-E y pSH1/M-Fv’-Fvis-TLR4-E; (c) 5TLR7cS (5'-cgatcagtcgacgatgtgtggtatatttaccatttctg-3') y 3TLR7cS (5'- tgatcggtcgacgaccgtttccttgaacacctgac-3') para dar pSH1/M-TLR7-Fv-Fvis-E y pSH1/M-Fv’-Fvis-TLR7-E; (d) 5TLR8cX (5'-cgatcactcgaggatgtttggtttatatataatgtgtg-3') y 3TLR8cS (5'-tcggtcgacgtattgcttaatggbatcgacatac-3') para dar pSH1/M-TLR8-Fv’-Fvis-E y pSH1/M-Fv’-Fvis-TLR8-E; (e) 5TLR9cX (5'-cgatcactcgaggacctctggtactgcttccacc-3') y 3TLR9cS (5'-tgatctgtcgacttcggccgtgggtccctggc-3') para dar pSH1/M-TLR9-Fv’-Fvis-E y pSH1/M-Fv’-Fvis-TLR9-E. Todos los insertos se confirmaron mediante secuenciación y para el tamaño apropiado mediante transferencia Western al epítopo (E) de hemagluttinina (HA) 3'. M, secuencia de direccionamiento a miristoilación de c-Src (residuos 1-14). pSH1, vector de expresión. De forma adicional, un tercer dominio Fv’ ligado a XhoI/SalI se añadió a los sitios Xhol de pSH1/M-Fv-Fvls-TLR4-E y pSH1/M-Fv-Fvls-TLR8-E para obtener pSH1/M-Fv’2-Fvls-TLR4-E y pSH1/M-FvFvls-TLR8-E, respectivamente, para mejorar la oligomerización.

Para reflejar fielmente la señalización fisiológica de TLR4, el TLR4 de 2,5 kb de longitud completa se amplificó por PCR a partir de ADNc de TLR4 (del laboratorio de Medzhitov) utilizando los cebadores ligados a Sacll y XhoI 5hTLR4 (5'-aatctaccgcggccaccatgatgtctgcctcgcgcctg-3') y 3hTLR4 5'-tcagttctcgaggatagatgttgcttcctgccaattg-3'), respectivamente. El producto de PCR de 2546 pb se subclonó en pCR-Blunt-TOPO y se secuenció. El inserto de secuencia verificada fue digerido con Sadl/Xho y subclonado en SacII/XhoI digerido (y “ CIPped” ) pSH1/M-Fv-Fvls-E para dar pSH1/hTLR4-Fv’-Fvis-E. Un Fv’ adicional se añadió al sitio XhoI para dar pSH1/hTLR4-Fv’2-Fvis-E.

(ii) ÍTLR4-CD40 compuesto inducible: el dominio citoplásmico CD40 humano ligado a XhoI-Sa/l de 191 pb se amplificó por PCR con los cebadores hCD405X (5'-atatactcgagaaaaaggtggccaagaagccaacc-3') y hCD403Sns (5'-acatagtcgacctgtctctcctgcactgagatg-3') y se subclonó en el sitio Sa/I de pSH1/hTLR4-Fv-Fvls-E y pSH1/hTLR4-Fv’2-Fvls-E para obtener pSH1/hTLR4-Fv -Fvis-CD40-E y pSH1/hTLR4-Fv’2-Fvis-CD40-E.

(iii) iNOD2 inducible: el extremo amino terminal de ~800-pb del PRR NOD2 (que contiene dominios CARD en tándem) se amplificó por PCR con los cebadores ligados a XhoI/Sa/I 5NOD2X (5'-atagcactcgagatgggggaagagggtggttcag-3') y 3NOD2Sb (5'-cttcatgtcgacgacctccaggacattctctgtg-3') y se subclonó en los sitios XhoI/ y Sa/I de pSH1/MFv-Fvls-E para dar pSH1/M-NOD2-Fv’-Fvis-E y pSH1/M-Fv’-Fvis-NOD2-E=Fv’ NOD2.

(iv) iR IG-l inducible: el extremo amino terminal de ~650 pb de la helicasa de ARN RIG-I (que contiene dominios CARD en tándem) se amplificó por PCR con los cebadores ligados a XhoI/SalI 5RIGX (5'-atagcactcgagaccaccgagcagcgacgcag-3') y 3RIGS (5'-cttcatgtcgacaatctgtatgtcagaagtttccatc-3') y se subclonó en los sitios XhoI y Sa/I de pSH1/MFv-Fvls-E para dar pSH1/M-RIGI-Fv -Fvis-E y pSH1/M-Fv -Fvis-RIGI-E=Fv’RIG-l.

(v) iMyD88 inducible: el adaptador de PRR inducible que contiene TIR humano MyD88 (~900-pb) se amplificó por PCR a partir de ADNc 293 utilizando los cebadores ligados a XhoI/Sa/I 5MyD88S (5'-acatcaactcgagatggctgcaggaggtcccgg-3') y 3MyD88S 5'-actcatagtcgaccagggacaaggccttggcaag-3') y se subclonó en los sitios XhoI y Sa/ I de pSH1/M-Fv’-Fvls-E para dar pSH1/M-MyD88-Fv-Fvis-E y pSH1/M-Fv-Fvis-MyD88-E, respectivamente.

(vi) iTRIF inducible: el adaptador de PRR inducible que contiene TIR humano TRIF2 (~2150-pb) se amplificó por PCR a partir de ADNc 293 utilizando los cebadores ligados a XhoI/Sa/I 5TRIFX (5'-acatcaactcgagatggcctgcacaggcccatcac-3') y 3TRIFS (5'-actcatagtcgacttctgcctcctgcgtcttgtcc-3') y se subclonó en pSH1/M-Fv-Fvls-E digerido con Sail para dar pSH1/M-Fv’-Fvis-TRIF-E.

(vii) IFNb-SEAP: el promotor mínimo de IFNbi se amplificó por PCR a partir de ADN genómico humano utilizando los cebadores 5IFNbMI (5'-aactagacgcgtactactaaaatgtaaatgacataggaaaac-3') y 3IFNbH (5'-gacttgaagcttaacacgaacagtctac-3'). El fragmento digerido con MluI-HindIII se subclonó en un plásmido informador SEAP sin promotor.

Determinados constructos se dirigieron específicamente a balsas lipídicas de membrana plasmática utilizando secuencias de miristoilación de Fyn así como el dominio de direccionamiento a membrana PIP2 de TIRAP.(5) Ensayos de secreted alkaline phosphatase (fosfatasa alcalina secretada - SEAP): los ensayos de informadores se realizaron en células Jurkat-TAg (células T) o 293 (epiteliales embrionarias de riñón) o células RAW264.7 (macrófagos) murinas. Las células Jurkat-TAG (107) en el crecimiento de fase log se sometieron a electroporación (950 mF, 250 V) con 2 mg de plásmido de expresión y 2 mg de plásmido informador NF-kB-SEAP3 o IFNb-TA-SEAP (véase anteriormente). Las células 293 o RAW264.7 (~ 2 x 105 células por placa de 35 mm) en fase logarítmica se transfectaron con 6 ml de FuGENE-6 en medio de cultivo. Después de 24 h, las células transformadas se estimularon con CID. Después de 20 h adicionales, los sobrenadantes se ensayaron para determinar la actividad SEAP como se describió anteriormente 3.

Cultivo de tejidos: las células Jurkat-TAg y RAW264.7 se cultivaron en medio RPMI 1640, fetal bovine serum (suero fetal bovino - FBS) al 10 %, HEPES 10 mM (pH 7,14), penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 mg/ml). Las células 293 se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco, FBS al 10 % y pen-strep.

Análisis de transferencia Western: la expresión de proteínas se determinó mediante transferencia Western usando anticuerpos contra el marcador del epítopo (E) de hemagluttinina (HA) común.

Resultados

El iTLR4 quimérico con el motivo de direccionamiento a la membrana PIP2 se activa 2 veces. El constructo codificaba dos dominios de unión a ligando. Sin embargo, el resto de los iTLR no son inducidos a niveles sólidos por CID en células 293, RAW o D2SC1, como se observa en los ensayos de informador. Esto podría atribuirse a los diversos requisitos de direccionamiento a membrana de los iTLR. Por lo tanto, se desarrolló Nod2 y RIG-1 inducibles, que son PRR citoplasmáticos que no necesitan dirigirse a la membrana plasmática. Si bien iNod2 se activó 2 veces por el fármaco dimerizador en células 293, no se observa tal efecto en las células RAW 264.7. Con la adición de concentraciones crecientes de CID, la actividad de iNod2 disminuye en las células RAW. Además, el efecto de iNod2 e iCD40 juntos, sobre la activación de NF-kappaB, es aditivo en células 293 (Fig. 7). iRIG-1 se activa 2,5 veces (Fig. 8). Las versiones inducibles de las moléculas adaptadoras de PRR inducibles de longitud completa MyD88 y TRIF que son los principales mediadores de la señalización corriente abajo de los TLR se encuentran en el proceso de análisis.

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Ejemplo 10: Inducción dependiente de fármaco de la actividad de NF-Kappa B en células transfectadas con iRIG-I, iCD40 e iNOD2

Las células 293 se transfectaron con 1 microgramo de constructo informador NF-KappaB-SEAP 1 microgramo de constructo PRR inducible utilizando reactivo de transfección Fugene 6. Las transfecciones se realizaron en una placa de 6 pocillos a 1*106 células/pocillo o transfección.

Las células Jurkat TAg se transfectaron con 2 microgramos de constructo informador NF-kappa B-SEAP y 3 microgramos de constructo PRR inducible usando electroporación a 950 microF y 0,25 kV. Las células se transfectaron a 10*106 células/transfección.

24 horas después, las células se sembraron en una placa de 96 pocillos con 2 concentraciones diferentes de AP20187 (100 nM y 1000 nM). Después de una incubación adicional de 24 horas a 37 0C, 5 % de CO2, los sobrenadantes se recogieron y se analizaron para determinar la actividad de SEAP por incubación con sustrato SEAP, 4-methylumbilliferyl phosphate (metilumbeliferil fosfato - MUP). La fluorescencia se determinó a una excitación de 355 nm y una emisión de 460 nm usando un lector de placas FLUOstar Optima (BMG Labtech).

Para iNOD2 y experimentos de combinación, las transfecciones se normalizaron para el ADN total usando un vector de expresión “vacío” , pSH1/S-Fv'-Fvls-E.

Las Figuras 11-14 son gráficos que muestran la inducción dependiente de fármaco de la actividad de NF-kappaB y los recuentos informadores de SEAP. Cada gráfico es representativo de un experimento individual separado.

Para mayor claridad en los gráficos, algunos de los vectores fueron renombrados para las figuras.

Fv'RIG-l = pSH1-Fv'Fvls-RIG-l =pSH1/M-Fv'-Fvls-RIG-l

Fv'NOD2 = pSH1-Fv'Fvls-NOD2=pSH.1/M-Fv'-Fvls-NOD2-E

Fv'2NOD2 = pSH1-Fv'2Fvls-NOD2

Fv'NOD2+ = pSH1-Fv'Fvls-NOD2 (igual que la secuencia de Nunez NOD2)

Fv'CD40 = pSH1-Fv'Fvls-CD40

Ejemplo 11: MyD88 inducible y MyD88-CD40 compuesto activan NF kappaB en células 293

Un conjunto de constructos se diseñó para expresar receptores inducibles, incluida una versión truncada de MyD88, que carece del dominio TIR. Las células 293 se transfectaron conjuntamente con un indicador NF-kappaB y el ensayo del indicador SEAP se realizó esencialmente como se describe en Spencer, D.M., Wandless, T.J., Schreiber, S.L. & Crabtree, G.R. Controlling signal transduction with synthetic ligands (control de la transducción de señales con ligandos sintéticos). Science 262, 1019-1024 (1993). El vector originalmente diseñado fue pBJ5-M-MyD88L-Fv'Fvls-E. pShuttleX-M-MyD88L-Fv'Fvls se utilizó para fabricar el adenovirus. Ambos de estos vectores se probaron en ensayos SEAP. Después de 24 horas, se añadió AP20187 y, después de 20 horas adicionales, el sobrenadante celular se analizó para determinar la actividad SEAP. Los gráficos relacionados con estos constructos quiméricos y la activación se proporcionan en las Figuras 16 y 17. Los resultados se muestran en la Figura 18.

Constructos:

Control: transfectado solo con indicador NF-kappaB.

TLR4on: pShuttleX-CD4/TLR4-L3-E: CD4/TLR4L3-E es una versión constitutiva de TLR4 que contiene el dominio extracelular de CD4 de ratón junto con los dominios transmembrana y citoplasmático de TLR4 humano (como se describe en Medzhitov R. Preston-Hurlburt P, Janewav CA Jr. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity (un homólogo humano de la proteína Toll de Drosophila señala la activación de la inmunidad adaptativa). Nature. 24 de julio de 1997; 388 (6640): 394-7.) seguido de tres enlazadores de 6 aminoácidos y un epítopo HA.

iMyD88: contiene M-MyD88L-Fv'Fvls-E

íc D40: contiene M-Fv'-Fvls-CD40-E

iCD40T: contiene M-Fv'-Fv'-Fvls-CD40-E - iCD40T contiene un Fv' adicional (FKBP con oscilación en la valina) iMyD88: CD40: contiene M-MyD88L-CD40-Fv'Fvls-E

iMyD88: CD40T: contiene M-MyD88LCD40-Fv'Fv'Fvls-E - contiene un Fv' adicional en comparación con iMyD88: CD40.

Ejemplo 12: Inducible CD40-MvD88. CD40-RIG-1 y CD40.NOD2

Los siguientes constructos se diseñaron y ensayaron en el sistema indicador NF-kappaB. Las células 293 se transfectaron conjuntamente con un indicador NFkappaB y uno de los constructos. Después de 24 horas, se añadió AP20187 y después de 3 horas adicionales (Figura 19) o 22 horas (Figura 20), el sobrenadante celular se analizó para determinar la actividad SEAP. Aproximadamente 20-24 horas después de la transfección, las células se trataron con el fármaco dímero AP20187. Aproximadamente 20-24 horas después del tratamiento con fármaco dímero, las células se trataron con sustrato SEAP 4-methylumbelliferyl phosphate (metilumbeliferil fosfato - MUP). Después de una incubación durante la noche (entre 16 y 22 horas), los recuentos de SEAP se registraron en una máquina FLUOStar OPTIMA.

MyD88LFv'FvlsCD40: se preparó en la cadena principal pBJ5 con la secuencia de miristoilación corriente arriba de MyD88L

Fv'FvlsCD40MyD88L: se preparó en la cadena principal pBJ5 con la secuencia de miristoilación corriente arriba de Fv'. MyD88LCD40Fv'Fvls: se preparó en la cadena principal de 2 vectores (pBJ5) con la secuencia de miristoilación corriente arriba del MyD88L.

CD40Fv'FvlsMyD88L: se preparó en la cadena principal pBJ5 con la secuencia de miristoilación corriente arriba de CD40. Fv'2FvlsCD40stMyD88L: es un constructo en donde una secuencia de parada después de CD40 impidió que MyD88L se tradujera. Se le denomina también iCD40T'.

Fv'2Fvls incluye 2 copias de Fv', separadas por una secuencia gtcgag.

MyD88LFv'Fvls

Fv'FvlsMyD88L: se preparó en la cadena principal pBJ5 con la secuencia de miristoilación corriente arriba de Fv'. Fv'FvlsCD40: está disponible en pBJ5 y pShuttleX

CD40Fv'Fvls: está disponible en la cadena principal pBJ5 con la secuencia de miristoilación corriente arriba del CD40.

MFv'Fvls: : está disponible en la cadena principal pBJ5 con la secuencia de miristoilación indicada por M. Fv"FvlsNOD2: pBJ5-Sn-Fv'Fvls-NOD2-E en la cadena principal pBJ5 sin secuencia de miristoilación, contiene 2 FKBP seguidas de 2 dominios CARD de NOD2 y el epítopo HA.

Fv'FvlsRIG-1: pBJ5-Sn-Fv'Fvls-RIG-IE en la cadena principal pBJ5 sin secuencia de miristoilación, contiene 2 FKBP seguidas de 2 dominios CARD de RIG-I y el epítopo HA.

Los ejemplos de mapas de constructo se presentan para las versiones de pShuttleX utilizadas para la producción de adenovirus en las Figuras 30, 31 y 32. Los expertos en la técnica conocen los métodos para modificar estos constructos para producir otros constructos utilizados en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria.

Ejemplo 13: La transfección adenoviral MyD88L de células 293T da como resultado la expresión de proteínas

Los siguientes constructos pShuttleX se construyeron para la producción de adenovirus:

pShuttleX-MyD88L-Fv'Fvls-E

pShuttleX-MyD88LCD40-Fv’Fvls-E

pShuttleX-CD4/TLR4-L3-E

L3 indica tres enlazadores de 6 aminoácidos, que tienen la secuencia de ADN: GGAGGCGGAGGCAGCGGAGGTGGCGGTTCCGGAGGCGGAGGTTCT

Secuencia de proteínas: GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer

E es un epítopo HA.

El adenovirus recombinante se obtuvo usando métodos conocidos por los expertos en la técnica, y esencialmente como se describe en He, T.C., S. Zhou, y col. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(5): 2509-14.

Para cada uno de los ensayos de adenovirus, los lisados sin tratar de varias placas de virus se ensayaron para determinar la expresión de proteínas mediante transferencia Western. Las partículas virales se liberaron de los gránulos celulares suministrados por el Vector Core en Baylor College of Medicine (dirección de la world wide web de http://vich.bcm.tmc.edu/) por congelación descongelación de los gránulos tres veces. Las células 293T se sembraron en placas a razón de 1x106 células por pocillo de una placa de 6 pocillos. 24 horas después del cultivo, las células se lavaron dos veces con medio DMEM sin suero con antibiótico, seguido de la adición de 25 microlitros o 100 microlitros de lisado de virus a la monocapa celular en 500 microlitros de medio sin suero. 2 horas más tarde, 2,5 ml de DMEM suplementado con suero se añadieron a cada pocillo de la placa de 6 pocillos.

24-48 horas después, las células se recolectaron, se lavaron dos veces con 1X PBS y se resuspendieron en tampón de lisis RIPA (que contenía PMSF 100 micromolar) (comercializado, por ejemplo, por Millipore o Thermo Scientific). Las células se incubaron en hielo durante 30 minutos con mezcla cada 10 minutos, seguido de un centrifugado a 10.000 g durante 15 minutos a 4 °C. Los sobrenadantes se mezclaron con tampón SDS Laemmli más betamercaptoetanol en una relación de 1: 2, se incubaron a 100 0C durante 10 minutos, se cargó en un gel SDS y se sondeó en una membrana de nitrocelulosa usando un anticuerpo contra el epítopo HA. Los resultados se muestran en las Figuras 21 y 22. Los lisados celulares restantes se almacenaron a -80 0C para uso futuro. Las células se transdujeron por separado con cada uno de los virus, es decir, Ad5-iMyD88 y Ad5-TLRon por separado.

Ejemplo 14: Expresión de IL-12p70 en células transducidas con MyD88L adenoviral

Las Bone marrow-derived dendritic cells (Células dendríticas derivadas de médula ósea - BMDC) se sembraron en placas a razón de 0,25 x 106 células por pocillo de una placa de 48 pocillos después de lavar dos veces con medio RPMI sin suero con antibiótico. Las células se transdujeron con 6 microlitros de lisado de virus sin tratar en 125 microlitros de medio sin suero. 2 horas más tarde, 375 microlitros de RPMI suplementado con suero se añadieron a cada pocillo de la placa de 48 pocillos. 48 horas después, los sobrenadantes se recolectaron y analizaron con un kit ELISA de IL-12p70 de ratón (BD OptEIA (BD BioSciences, Nueva Jersey). Los ensayos se realizaron por duplicado para cada muestra, con o sin la adición de AP21087 100 nM. CD40-L es el ligando CD40, un miembro de la familia del TNF que se une al receptor CD40. LPS es lipopolisacárido. Los resultados se muestran en la Figura 23. Los resultados de una repetición del ensayo se muestran en la Figura 24, el lisado adenoviral sin tratar se añadió a 6,2 microlitros por 0,25 millones de células. La Figura 25 muestra los resultados de un ensayo adicional, en el que se utilizó más lisado viral, 12,5 microlitros por 0,25 millones de células para infectar las BMDC.

Ejemplo 15: Actividades de inducible IRIG 1, iNOD2 y iTRIF

Un microgramo de cada uno de pBJ5-Fv'Fvls-RIG-1 y pBJ5-Fv'Fvls-CD40 se transfectó en células 293 con un microgramo de indicador NF-kappaB-SEAP y las células se analizaron para determinar la actividad del indicador en el tratamiento con una dosis creciente de fármaco dímero AP20187. Además, se ensayó un constructo pBJ5-RIG-1-Fv'Fvls. Los resultados se muestran en la Figura 26. Los resultados muestran que iRIG-I podría funcionar potencialmente bien con iCD40, como lo demuestran los efectos aditivos observados en el ensayo indicador NF-kappaB cuando los constructos iRIG-1 e iCD40 se transfectaron en células 293.

Un microgramo de pBJ5-Fv'Fvls-RIG-1 se transfectó en células 293 con 1 microgramos de indicador IFNbeta-SEAP y las células se analizaron para determinar la actividad informadora en el tratamiento con diluciones semilogarítmicas del fármaco dímero AP20187. Simultáneamente, el constructo iTRIF (pBJ5-Fv'Fvls-TRIF) también se ensayó transfectando cantidades crecientes en células 293. pBJ5-M-Fv'Fvls-TRIF-E- se preparó en la cadena principal pBJ5 con una secuencia de miristoilación, 2 FKBP, TRIF de longitud completa y un epítopo HA. Los resultados se muestran en las Figuras 27 y 28. Los resultados demuestran que iTRIF activa constitutivamente NF-kappaB y, en mayor medida, los indicadores de IFNbeta en células 293.

Un ensayo similar se realizó utilizando iNOD2, como se muestra en la Figura 29. Los resultados muestran que iNOD2 activa NF-kappaB de una manera dependiente del fármaco. Esta activación de NF-kappa B aumenta con la adición de un tercer dominio FKBP a iNOD2 (iNOD2Turbo). pBJ5-Sn-Fv'Fv'Fvls-NOD2-E - se preparó en la cadena principal pBJ5 y contiene una secuencia de miristoilación, 3 FKBP, 2 dominios CARD de NOD2 y un epítopo HA.

Ejemplo 16: Expresión de IL-12p70 en células dendríticas derivadas de monocitos humanos transducidas con MyD88L adenoviral

Las células dendríticas derivadas de monocitos humanos (moDC) inmaduras se sembraron en placas a razón de 0,25 x 106 células por pocillo de una placa de 48 pocillos después de lavar dos veces con medio RPMI sin suero con antibiótico. Las células se transdujeron con diferentes multiplicity of infections (multiplicidad de infecciones - MOI) del adenovirus AD5-iMyD88.CD40 y se estimularon con el fármaco dímero AP20187 100 nM. El virus usado fue una versión optimizada del lisado viral usado en los Ejemplos 13 y 14. 48 horas más tarde, los sobrenadantes se recolectaron y ensayaron en un ensayo ELISA de IL12p70. La Figura 33 describe los resultados de esta valoración volumétrica.

Las MoDC humanas inmaduras se sembraron en placas a razón de 0,25 x 106 células por pocillo de una placa de 48 pocillos después de lavar dos veces con medio RPMI libre de suero con antibiótico. A continuación, las células se transdujeron con Ad5f35-iCD40 (10.000 VP/célula); Ad5-iMyD88.CD40 (100 MOI); Ad5.iMyD88 (100 MOI) o Ad5-TLR4on (100 MOI) y se estimularon con 1 microgramo/mililitro de LPS donde se indique y el fármaco dímero 100 nM AP20187 donde se indique en la Figura 34. 48 horas más tarde, los sobrenadantes se recolectaron y ensayaron en un ensayo ELISA de IL12p70.

El Ad5f35-iCD40 se produjo utilizando pShuttleX-ihCD40 (también conocido como M-Fv'-Fvls-hCD40; pShuttleX-M-Fv'-Fvls-hCD40). El MyD88, como se indica en las Figuras 33 y 34, es la misma versión truncada de MyD88 que la versión indicada en la presente memoria como MyD88L. El adenovirus indicado como Ad5.iMyD88 se produjo usando pShuttleX-MyD88L-Fv'Fvls-E. El adenovirus indicado como Ad5-iMyD88.Cd40 se produjo usando pShuttleX-MyD88LCD40-Fv'Fvls-E. El adenovirus indicado como Ad5-TLR40n se produjo usando pShuttleX-CD4/TLR4-L3-E.

Ejemplo 17: Transformación no viral de células dendríticas

Un vector plasmídico que comprende la secuencia iMyD88-CD40 se construye operativamente unido a la secuencia Fv'Fvls, tal como, por ejemplo, el inserto pShuttleX-MyD88LCD40-Fv'Fvls-E. El constructo de plásmido también incluye los siguientes elementos reguladores operativamente unidos a la secuencia MyD881CD40-Fv'Fvls-E: promotor, codón de iniciación, codón de terminación, señal de poliadenilación. El vector también puede comprender una secuencia potenciadora. Las secuencias MyD88L, CD40 y FvFvls también pueden modificarse usando técnicas sintéticas conocidas en la técnica para incluir codones optimizados.

Las monocyte-derived dendritic cells (células dendríticas derivadas de monocitos - MoDC) humanos inmaduras se siembran en placa a razón de 0,25 x 106 células por pocillo de una placa de 48 pocillos después de lavar dos veces con medio RPMI sin suero con antibiótico. Las células se transducen con el vector plasmídico usando cualquier método apropiado conocido por los expertos en la técnica tales como, por ejemplo, nucleofección usando kits AMAXA, electroporación, fosfato de calcio, DEAE-dextrano, carga de sonicación, transfección mediada por liposomas, transfección mediada por receptor o bombardeo de microproyectiles.

Las vacunas de ADN se describen, por ejemplo, en la publicación de patente de EE. UU. 20080274140, publicada el 6 de noviembre de 2008. La secuencia iMyD88-CD40 operativamente unida a la secuencia Fv'Fvls se inserta en un vector de vacuna de ADN, que también comprende, por ejemplo, elementos reguladores necesarios para la expresión de la proteína quimérica iMyD88-Cd40 Fv'Fvls en el tejido del huésped. Estos elementos reguladores incluyen, aunque no de forma limitativa, promotor, codón de iniciación, codón de terminación, señal de poliadenilación y potenciador, y los codones que codifican la proteína quimérica pueden optimizarse.

Ejemplo 18: Evaluación de las células dendríticas transformadas con MyD88CD40 in vivo usando un modelo de tumor de ratón

Las células dendríticas de médula ósea se trasdujeron usando vectores adenovirales como se presenta en los ejemplos de la presente memoria. Estas BMDC transducidas se probaron para determinar su capacidad para inhibir el crecimiento tumoral en un modelo EG.7-OVA. Las células EG.7-OVA (5x105células/100 ml) se inocularon en el flanco derecho de ratones hembra C57BL/6. Las BMDC de todos los grupos se pulsaron con 50 microgramos/ml de proteína de ovoalbúmina y se activaron como se ha descrito anteriormente. Aproximadamente 7 días después de la inoculación de las células tumorales, las BMDC se descongelaron y se inyectaron por vía subcutánea en las bases de las patas traseras de los ratones.

El crecimiento del tumor se monitorizó dos veces por semana en ratones de todos los grupos. La sangre periférica de ratones aleatorios de todos los grupos se analizó mediante tinción de tetrámero y mediante ensayos CTL in vivo. La tabla 1 presenta el diseño experimental, que incluye células dendríticas no transducidas (grupos 1 y 2), células dendríticas transducidas con un vector de adenovirus de control (grupo 3), células dendríticas transducidas con un vector que codifica la región citoplásmica CD40 (grupo 4), células dendríticas transducidas con un vector MyD88 truncado (grupos 5 y 6) y células dendríticas transducidas con el vector MyD88 quimérico truncado CD40 (grupos 7 y 8). Las células se estimularon con AP-1903, LPS o ligando CD40 como se indica.

Tabla 1

Antes de la vacunación de los ratones inoculados con tumor, los niveles de IL-12p70 de las células dendríticas transducidas se midieron in vitro. Los niveles de IL-12p70 se presentan en la Figura 35.

La Figura 36 muestra un gráfico de la inhibición del crecimiento tumoral observada en los ratones transducidos. La inoculación de las células dendríticas transducidas con MyD88 y tratadas con AP1903 dio como resultado una tasa de curación de 1/6, mientras que la inoculación de células dendríticas transducidas con MyD88-CD40 sin AP1903 dio como resultado una tasa de curación de 4/6, lo que indica un efecto potencial independiente del dimerizador. El a s te risco in d ica un a c o m p a ra c ió n de Luc LP S A P e iC D 40 M yD 88 LP S /- A P 1903. La F igu ra 36 ta m b ié n p ro p o rc io n a fo to g ra fía s de ra to n e s v a c u n a d o s re p re se n ta tivo s .

La F ig u ra 37 p re s e n ta un a n á lis is d e la fre c u e n c ia m e jo ra d a d e in d u c c ió n de c é lu la s T C D 8 e s p e c íf ic a s d e A g en ra to n e s tra ta d o s c o n c é lu la s d e n d r ít ic a s tra n s d u c id a s con iM y D 88 -C D 40. Las c é lu la s p e r ifé r ic a s de m é d u la ó s e a de ra to n e s tra ta d o s se re c o le c ta ro n d ie z d ía s d e s p u é s de la v a c u n a c ió n el d ía 7. Las P B M C se tiñ e ro n con a n tim C D 8 -F IT C y H 2 -K b-S IIN F E K L -te trá m e ro -P E y se a n a liz a ro n m e d ia n te c ito m e tr ía d e flu jo .

La F igura 38 p re sen ta la fre cu e n c ia m e jo rad a de cé lu la s T C D 8+ e sp e c ífica s de A g y cé lu las T ^h1 C D 4+ inducidas en ra tones d e sp u é s de l tra ta m ie n to con cé lu la s d e n d rítica s tra n sd u c id a s con iM yD 88-C D 40. T res ra tones de to d o s los g ru po s e xp erim e n ta les fue ro n sacrifica do s 18 d ía s d e spu és de la vacu na c ión . Los e sp len oc ito s de tre s ra tones po r g ru p o se “ ju n ta ro n ” y se ana lizaron m ed ian te el en sa yo E LIS P O T de IFN -gam m a. Las p lacas M illipo re M u ltiS cre en -H A se recubrie ron con 10 m ic ro g ram o s/m l de an ticue rpo A N 18 a n ti-IF N -g a m m a de ratón (M ab tech AB, Inc., N acka, ^{S uecia ). Los e sp le n o c ito s se añ ad ie ro n y cu ltiva ron du ran te 20 ho ras a 37 g ra do s C en 5 % de C O}2 ^{en m ed io E LISpot}co m p le to (R PM I, FBS al 10 % , pen ic ilina , es trep tom ic in a ). Los e sp len oc ito s se incubaron con 2 m ic ro g ram o s/m l de O T-1 (S IIN FE K L), O ^t-2 (IS Q A ^vH ^aA H A E IN E A ^gR) o pé p tido T R P -2 (pép tido de con tro l no d irig ido). D espués de los lavados, un se g un do an ticue rpo m onoc lona l b io tin ilad o co n tra IF N -gam m a de ratón (R 4-6A 2, M abtech A B ) se ap licó a los pocillos a un a co n cen tra c ión de 1 m icro gram o /m l, seg u id o de incubac ión con com p le jos de es tre p ta v id in a -fo s fa ta sa a lca lin a (V ec to r Laboratories, Ltd., B urlingam e, C A). A co n tinu ac ió n , las p lacas se reve laron con el sustra to de fo s fa ta sa a lca lina, 3 -a m ino -9 e tilca rbazo l (S igm a-A ld rich , Inc., St. Louis, M O ). Z e llN e t C o nsu lting , Inc. pu n tuó el núm ero de m an cha s en los pocillos con un s is tem a de le c tu ra E L IS P O T a u tom atiza do (Carl Z e iss, Inc, T ho rn w o od NY).

La F igu ra 39 p re s e n ta un e s q u e m a y los re su lta d o s de un e n s a y o de lin foc itos c ito tó x ic o s in v ivo . D ie c io ch o d ía s d e s p u é s de las v a c u n a c io n e s con DC se rea lizó un e n s a y o de C T L in v ivo . Los e sp le n o c ito s s in g é n ic o s sin tra ta m ie n to p re v io se u tiliza ro n co m o cé lu la s o b je tiv o in v ivo . S e m arca ron m ed ia n te in cuba c ió n d u ra n te 10 m in u to s a 37 g ra d o s C con C F S E 6 m ic ro m o la r (cé lu la s C F S E hi) o C F S E 0 ,6 m ic ro m o la r en m ed io C T L (cé lu la s C F S E 10). Las cé lu la s C F S E hi se pu lsa ro n con p é p tid o OT-1 S IIN F E K L , y las cé lu la s C F S E 10 se in cu b a ro n con p é p tid o de con tro l T R P 2. U n a m e zc la de 4 x 106 cé lu la s C F S E hi m ás 4 x 106 C F S E 10 se in ye c ta ro n p o r v ía in tra v e n o s a a tra v é s de la v e n a de la co la . D e spu és de 16 ho ras de in cu b a c ió n in v ivo , los e s p le n o c ito s se re co g ie ro n y las s u s p e n s io n e s de cé lu la s in d iv id u a le s se a n a liza ro n p a ra la d e te cc ió n y cu a n tif ic a c ió n de cé lu la s m a rca d a s con C F S E . La F igu ra 40 es un g rá fico q u e p re s e n ta la ac tiv id a d C T L m e jo ra d a in d u c id a p o r cé lu la s d e n d rític a s tra n s d u c id a s con iM yD 88 -C D 40 en los ra ton es in o cu la d o s . La F igu ra 41 m u e s tra los h is to g ra m a s de C T L s in p ro c e s a r p a ra m u e s tra s se le cc io n a d a s , lo qu e in d ica la ac tiv id a d C T L m e jo ra d a in v iv o in d u c id a p o r las cé lu la s d e n d rític a s tra n s d u c id a s con iM yD 88 -C D 40.

La F ig u ra 42 p re s e n ta los re s u lta d o s de la tin c ió n in tra c e lu la r p a ra c é lu la s T ^h2 p ro d u c to ra s de IL-4 en los ra to n e s v a c u n a d o s con las c é lu la s tra n s d u c id a s . Los e s p le n o c ito s de ra to n e s (c é lu la s a g ru p a d a s d e tre s ra to n e s ) se re c o n s titu y e ro n c o n 2 m ic ro g ra m o s /m l d e p é p tid o O T -2. La s c é lu la s se in c u b a ro n d u ra n te 6 h o ra s con 10 m ic ro g ra m o s /m l d e b re fe ld in a A p a ra s u p r im ir la s e c re c ió n . A c o n tin u a c ió n , las c é lu la s se f ija ro n y p e rm e a liz a ro n y se a n a liz a ro n m e d ia n te t in c ió n in tra c e lu la r c o n a n ti-m lL -4 -A P C y a n ti-m C D 4 -F IT C .

El v e c to r a d e n o v ira l q u e co m p re n d e la s e c u e n c ia iC D 40 -M yD 88 se e v a lu ó de nu evo p a ra d e te rm in a r su c a p a c id a d p a ra in h ib ir e l c re c im ie n to tu m o ra l en un m o d e lo de ratón . En el p r im e r e xp e rim e n to , la in h ib ic ió n de l c re c im ie n to tu m o ra l d e p e n d ie n te de fá rm a c o s se m id ió d e sp u é s de la in o cu la c ió n con cé lu la s d e n d rític a s m o d ifica d a s con el v e c to r in du c ib le de M yD 88 tru n c a d o con C D 40 (A d -iC D 40.M yD 88 ). Las cé lu la s d e n d rític a s d e riv a d a s de la m é d u la ó s e a de ra ton es C 57 B L /6 se pu lsa ro n con 10 m ic ro g ra m o s /m l de o v o a lb ú m in a y se tra n s d u je ro n con 20.000 p a rtíc u la s v ira le s /c é lu la (vp /c) de los c o n s tru c to s de a d e n o v iru s A d 5 -iC D 40.M y D 88 , A d 5 - iM yD 88 o A d 5 -L u c (con tro l). Las cé lu la s se ac tiva ro n con 2 m ic ro g ra m o s /m l de C D 40L , 200 ng /m l de LP S o fá rm a c o d im e riz a d o r de A P 1903 50 nM . 5 x 105 cé lu la s de tim o m a E .G 7 -O V A se in ocu la ro n en el lom o de ra ton es C 57 B L /6 (N = 6 /g ru po ). C u a n d o los tu m o re s a lca n za ro n ~5 m m de d iá m e tro (d ía 8 d e s p u é s de la in o cu la c ió n ), los ra ton es fu e ro n tra ta d o s con in ye cc io n e s su b cu tá n e a s de 2 x 106 B M D C . A l d ía s ig u ie n te , d e s p u é s de las v a c u n a c io n e s ce lu la re s , los ra ton es se tra ta ro n con in ye cc io n e s in tra p e rito n e a le s de 5 m g /kg de A P 1903. El c re c im ie n to de l tu m o r se c o n tro ló d o s ve ce s p o r sem a na . Los re su lta d o s se m u e stra n en la F igu ra 43 A . En o tro c o n ju n to de e x p e rim e n to s , los tu m o re s E .G 7 -O V A se e s ta b le c ie ro n co m o se ha d e sc rito a n te rio rm e n te . Los ra to n e s (N = 6 /g ru p o ) se tra ta ro n con 2 x 106 B M D C (o v o a lb ú m in a p u lsa d a ) y se tra n s d u je ro n con 20.000 o 1.250 V P /c de A d 5 -iC D 40.M y D 88. Las B M D C de los g ru p o s A P 1903 se tra ta ro n in v itro con A P 1903 50 nM. A l d ía s ig u ie n te , d e s p u é s de las v a c u n a c io n e s ce lu la re s , los ra ton es de los g ru p o s A P 1903 se tra ta ro n m ed ia n te in ye cc ió n in tra p e rito n e a l con 5 m g/kg de A P 1903. Los re su lta d o s se m u e s tra n en la F igu ra 43 B . La F igu ra 43 C re p re s e n ta los n ive le s re la tivo s de IL -12 p70 p ro d u c id o s d e s p u é s de l cu ltivo d u ra n te la no che de las d iv e rs a s cé lu la s de la v a c u n a an te s de la c r io c o n s e rv a c ió n . La IL -12 p70 se an a lizó m e d ia n te un e n s a y o E LIS A .

La s a n g re de los ra ton es in m u n iza d o s con las cé lu la s d e n d rític a s de la m é d u la ó s e a m o d ifica d a s se an a lizó pa ra d e te rm in a r la fre c u e n c ia y fu n c ió n de las cé lu la s T e s p e c ífic a s de l tu m o r u sa n d o tin c ió n de te trá m e ro . La F igu ra 44 A m u e s tra los re su lta d o s de un e x p e rim e n to en el qu e ra ton es (N = 3-5 ) fu e ro n in m u n iza d o s p o r v ía su b c u tá n e a con B M D C p u ls a d a s con o v o a lb ú m in a y a c tiva d a s co m o se d e s c rib e en la F igu ra 43. U n a se m a n a d e s p u é s de la va c u n a c ió n , las p e rip h e ra l b lood m o n o n u c le a r ce lls (cé lu la s m o n o n u c le a re s de sa n g re p e rifé rica - P B M C ) se tiñ e ro n con a n ti-m C D 8 -F IT C y S IIN F E K L -H 2 -K b-P E y se a n a liza ro n m e d ia n te c ito m e tr ía de flu jo . La F igu ra 44 B m u e s tra los resultados de un ensayo CTL in vivo que se realizó en ratones vacunados con BMDC como se ha descrito anteriormente. Dos semanas después de la inmunización con BMDC, los esplenocitos de ratones singénicos C57BL/6 se pulsaron con péptido de control TRP-2, SVYDFFVWL o péptido objetivo, objetivo SINFEKL, y se utilizaron como objetivos in vivo. La mitad de los esplenocitos se marcaron con CFSE 6 micromolar (células CFSEhi) 0 CFSE 0,6 micromolar (células CFSEb). Las células de CFSEhi se pulsaron con péptido OT-1 (Si INFEKL) y las células CFSEb se incubaron con péptido TRP-2 de control (SVYDFFVWL). Una mezcla de 4 x106 células CFSEhi más 4 x106 CFSE10 se inyectaron por vía intravenosa a través de la vena de la cola. Al día siguiente, los esplenocitos se recogieron y las suspensiones de células individuales se analizaron para la detección y cuantificación de células marcadas con CFSE. Las Figuras 44C y 44D muestran los resultados de un ensayo de IFN-gamma. Las peripheral blood mononuclear cells (células mononucleares de sangre periférica - PBMC) de ratones portadores de E.G7-OVA tratados como se describe en la Figura 43, se analizaron en ensayos ELISPOT de IFN-gamma con 1 microgramo/ml de péptido SIINFEKL (OT-1), ISQAVHAAHAEINEAGR (OT-2) y péptidos TRP-2 (restringido a H2-Kb irrelevante). El número de linfocitos productores de IFN-gamma se evaluó en pocillos por triplicado. Las células de tres ratones por grupo se combinaron y analizaron mediante ELISpot de IFN-gamma en pocillos por triplicado. Los ensayos se realizaron dos veces.

La Figura 45 presenta los resultados de un ensayo de células asesinas naturales realizado usando los esplenocitos de ratones tratados como se indica en este ejemplo. Los esplenocitos obtenidos de ratones (3 por grupo) se utilizaron como efectores (E). Las células Yac-1 se marcaron con 51Cr y se utilizaron como targets (objetivos - T). La línea celular EL-4 se utilizó como control irrelevante.

La Figura 46 presenta los resultados de un ensayo para la detección de linfocitos citotóxicos específicos de antígeno. Los esplenocitos obtenidos de ratones (3 por grupo) se utilizaron como efectores. Las células EG.7-Ova se marcaron con 51Cr y se utilizaron como targets (objetivos - T). La línea celular EL-4 se utilizó como control irrelevante.

La Figura 47 presenta los resultados de la activación de células humanas transducidas con el vector de adenovirus MyD88 inducible truncado con CD-40 (iCD40.MyDD). Las células dendríticas (día 5 de cultivo) de tres donantes de HLA-A2+ diferentes se purificaron mediante el método de adhesión al plástico y se transdujeron con 10.000 VP/célula de Ad5-iCD40.MyD88, Ad5-iMyD88 o Ad5-Luc. Las células se activaron con AP1903 100 nM o 0,5 microgramos/ml de CD40L y 250 ng/ml de LPS o maturation cocktail (cóctel de maduración - MC) estándar, que contenía TNF-alfa, IL-1beta, IL-6 y prostaglandina E2 (PGE2). Las células T CD8+ autólogas se purificaron mediante selección negativa usando microperlas y se cultivaron conjuntamente con DC pulsadas con 10 microgramos/ml de péptido FLWGPRALV MAGE-3 restringido a HLA-A2 a una relación 1: 5 (DC: T) durante 7 días. Cinco días después de la segunda ronda de estimulación con DC (el día 7), las células T se analizaron en el ensayo ELISpot de IFN-gamma estándar. Las células se pulsaron con 1 microgramos/ml de MAGE-3 o péptido de PSMA restringido a HLA-A2 irrelevante (PSMA-P2). Los experimentos se realizaron por triplicado.

Las Figuras 48 y 49 presentan los resultados de un ensayo de migración celular. Las mBMDC se transdujeron con 10.000 VP/célula de Ad5.Luciferase o Ad5.iMyD88.CD40 en presencia de Gene Jammer (Stratagene, San Diego, California) y se estimularon con AP1903 (AP) 100 nM o LPS (1 microgramo/ml) durante 48 horas. La expresión de CCR7 se analizó en la superficie de células dendríticas CD11c+ mediante tinción intracelular usando un anticuerpo conjugado PerCP.Cy5.5. La Figura 48 muestra los resultados del experimento, con cada ensayo presentado por separado; la Figura 49 proporciona los resultados en el mismo gráfico.

Ejemplo 19: Ejemplos de ácido nucleico particular y secuencias de aminoácidos

La Id. de sec. n.°: 1 (secuencia de ácido nucleico que codifica CD40 humano; n.° de acceso Genbank NM_001250; región citoplasmática indicada en negrita)

1 gccaaggctg gggcagggga gtcagcagag gcctcgctcg ggcgcccagt ggtcctgccg

61 cctggtctca cctcgctatg gttcgtctgc ctctgcagtg cgtcctctgg ggctgcttgc

121 tgaccgctgt ccatccagaa ccacccactg catgcagaga aaaacagtac ctaataaaca

181 gtcagtgctg ttctttgtgc cagccaggac agaaactggt gagtgactgc acagagttca

241 ctgaaacgga atgccttcct tgcggtgaaa gcgaattcct agacacctgg aacagagaga 301 cacactgcca ccagcacaaa tactgcgacc ccaacctagg gcttcgggtc cagcagaagg

361 gcacctcaga aacagacacc atctgcacct gtgaagaagg ctggcactgt acgagtgagg

421 cctgtgagag ctgtgtcctg caccgctcat gctcgcccgg ctttggggtc aagcagattg

481 ctacaggggt ttctgatacc atctgcgagc cctgcccagt cggcttcttc tccaatgtgt

541 catctgcttt cgaaaaatgt cacccttgga caagctgtga gaccaaagac ctggttgtgc

601 aacaggcagg cacaaacaag actgatgttg tctgtggtcc ccaggatcgg ctgagagccc

661 tggtggtgat ccccatcatc ttcgggatcc tgtttgccat cctcttggtg ctggtcttta

721 tcaaaaaggt ggccaagaag ccaaccaata aggcccccca ccccaagcag gaaccccagg 781 agatcaattt tcccgacgat c ttcc tg g c t ccaacactgc tgc tccag tg caggagactt

841 tacatggatg ccaaccggtc acccaggagg atggcaaaga gagtcgcatc tcagtgcagg

901 agagacagtg aggctgcacc cacccaggag tgtggccacg tgggcaaaca ggcagttggc

961 cagagagcct ggtgctgctg ctgctgtggc gtgagggtga ggggctggca ctgactgggc

1021 atagctcccc gcttctgcct gcacccctgc agtttgagac aggagacctg gcactggatg

1081 cagaaacagt tcaccttgaa gaacctctca cttcaccctg gagcccatcc agtctcccaa

1141 cttgtattaa agacagaggc agaagtttgg tggtggtggt gttggggtat ggtttagtaa

1201 tatccaccag accttccgat ccagcagttt ggtgcccaga gaggcatcat ggtggcttcc

1261 ctgcgcccag gaagccatat acacagatgc ccattgcagc attgtttgtg atagtgaaca

1321 actggaagct gcttaactgt ccatcagcag gagactggct aaataaaatt agaatatatt

1381 tatacaacag aatctcaaaa acactgttga gtaaggaaaa aaaggcatgc tgctgaatga

1441 tgggtaígga actttttaaa aaagtacatg cttttatgta tgtatattgc ctatggatat

1501 atgtataaat acaatatgca ícatatattg atataacaag ggttctggaa gggtacacag

1561 aaaacccaca gctcgaagag tggtgacgtc tggggtgggg aagaagggtc tggggg

La Id. de sec. n.°: 2 (secuencia de aminoácidos que codifica CD40 humano; región citoplasmática indicada en negrita)

MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPEPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPC GESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGWHCTSEACESCVLH RSCSPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCHPWTSCETKDLVVQQAGTNKTD WCGPQDRLRALWIPIIFGILFAILLVLVFIKKVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPDDLPGSNTA APVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQ

La Id. de sec. n.°: 3 (secuencia de nucleótidos que codifica PSMA)

gcggatccgcatcatcatcatcatcacagctccggaatcgagggacgtggtaaatcctccaatgaagctactaacattactccaaa gcataatatgaaagcatttttggatgaattgaaagctgagaacatcaagaagttcttatataattttacacagataccacatttagcag gaacagaacaaaactttcagcttgcaaagcaaattcaatcccagtggaaagaatttggcctggattctgttgagctagcacattatg atgtcctgttgtcctacccaaataágactcatcccaactacatctcaataattaatgaagatggaaatgagattttcaacacatcattatt tgaaccacctcctccaggatatgaaaatgtttcggatattgtaccacctttcagtgctttctctcctcaaggaatgccagagggcgatct agtgtatgttaactatgcacgaactgaagacttctttaaattggaacgggacatgaaaatcaattgctctgggaaaattgtaattgcca gatatgggaaagttttcagaggaaataaggftaaaaatgcccagctggcaggggccaaaggagtcattctctactccgaccctgct gactactttgctcctggggtgaagtcctatccagatggttggaatcttcctggaggtggtgtccagcgtggaaatatcctaaatctgaat ggtgcaggagaccctctcacaccaggttacccagcaaatgaatatgcttataggcgtggaattgcagaggctgttggtcttccaagt attcctgttcatccaattggatactatgatgcacagaagctcctagaaaaaatgggtggctcagcaccaccagatagcagctggag aggaagtctcaaagtgccctacaatgttggacctggctttactggaaacttttctacacaaaaagtcaagatgcacatccactctacc aatgaagtgacaagaatttacaatgtgataggtactctcagaggagcagtggaaccagacagatatgtcattctgggaggtcacc gggactcatgggtgtttggtggtattgaccctcagagtggagcagctgttgttcatgaaattgtgaggagctttggaacactgaaaaa ggaagggtggagacctagaagaacaattttgtttgcaagctgggatgcagaagaatttggtcttcttggttctactgagtgggcagag gagaattcaagactccttcaagagcgtggcgtggcttatattaatgctgactcatctatagaaggaaactacactctgagagttgattg tacaccgctgatgtacagcttggtacácaacctaacaaaagagctgaaaagccctgatgaaggctttgaaggcaaatctctttatg aaagttggactaaaaaaagtccttccccagagttcagtggcatgcccaggataagcaaattgggatctggaaatgattttgaggtgt tcttccaacgacttggaattgcttcaggcagagcacggtatactaaaaattgggaaacaaacaaattcagcggctatccactgtatc acagtgtctatgaaacatatgagttggtggaaaagttttatgatccaatgtttaaatatcacctcactgtggcccaggttcgaggaggg atggtgtttgagctagccaattccatagtgctcccttttgattgtcgagattatgctgtagttttaagaaagtatgctgacaaaatctacagt atttctatgaaacatccacaggaaatgaagacatacagtgtatcatttgattcacttttttctgcagtaaagaattttacagaaattgcttc caagttcagtgagagactccaggactttgacaaaagcaagcatgtcatctatgctccaagcagccacaacaagtatgcagggga gtcattcccaggaatttatgatgctctgtttgatattgaaagcaaagtggacccítccaaggcctggggagaagtgaagagacagat ttatgttgcagccttcacagtgcaggcagctgcagagactttgagtgaagtagcctaagcggccgcatagca

La Id. de sec. n.°: 4 (secuencia de aminoácidos de PSMA codificada por la Id. de sec. n.°: 3)

La Id. de sec. n.°: 5 (secuencia de nucleótidos de MyD88L con enlazadores Sail)

La Id. de sec. n.°: 6 (secuencia de aminoácidos de MYD88L) MAAGGPGAGSAAPVSSTSSLPLAALNMRVRRRLSLFLNVRTQVAADWTALAEEMDFEYLEIR QLETQADPTGRLLDAWQGRPGASVGRLLELLTKLGRDDVLLELGPSIEEDCQKYILK QQQEEAEKPLQVAAVDSSVPRTAELAGITTLDDPLGHMPERFDAFICYCPSDI

La Id. de sec. n.°: 7 (secuencia de Fv'Fvls con enlazadores Xhol/Sall, [codones oscilantes en minúsculas en Fv'])

ctcgagGGcGTcCAaGTcGAaACcATtagtCCcGGcGAtGGcaGaACaTTtCCtAAaaGgGGaCAaA CaTGtGTcGTcCAtTAtACaGGcATGtTgGAgGAcGGcAAaAAgGTgGAcagtagtaGaGAtcGc AAtAAaCCtTTcAAaTTcATGtTgGGaAAaCAaGAaGTcATtaGgGGaTGGGAgGAgGGcGT gGCtCAaATGtccGTcGGcCAacGcGCtAAgCTcACcATcagcCCcGAcTAcGCaTAcGGcGCt ACcGGaCAtCCcGGaATtATtCCcCCíCAcGCtACctTgGTgTTtGAcGTcGAaCTgtTgAAgCT cGAagtcgagggagtgcaggtggaaaccatctccccaggagacgggcgcaccttccccaagcgcggccagacctgc gtggtgcactacaccgggatgcttgaagatggaaagaaagttgattcctcccgggacagaaacaagccctttaagtttatgc taggcaagcaggaggtgatccgaggctgggaagaaggggttgcccagatgagtgtgggtcagagagccaaactgacta tatctccagattatgcctatggtgccactgggcacccaggcatcatcccaccacatgccactctcgtcttcgatgtggagcttct aaaactggaatctggcggtggatccggagtcgag

La Id. de sec. n.°: 8 (secuencia peptídica FV'FVLS)

GlyValGInValGluThrIleSerProGIyAspGIyArgThrPheProLysArgGlyGInThrCysValValHisTyrThr GlyMetLeuGluAspGlyLysLysValAspSerSerArgAspArgAsnLysProPheLysPheMetLeuGiyLysGI nGluVallleArgGlyTrpGluGluGlyValAlaGInMetSerValGIyGInArgAlaLysLeuThrIleSerProAspTyrA laTyrGIyAlaThrGIyHisProGlyllelleProProHisAlaThrLeuValPheAspValGIuLeuLeuLysLeuGlu (ValGlu)

GlyValGInValGluThrIleSerProGIyAspGIyArgThrPheProLysArgGlyGInThrCysValValHisTyrThr GlyMetLeuGluAspGlyLysLysValAspSerSerArgAspArgAsnLysProPheLysPheMetLeuGlyLysGI nGluVallleArgGlyTrpGluGluGlyValAlaGInMetSerValGIyGInArgAlaLysLeuThrlIeSerProAspTyrA laTyrGIyAlaThrGIyHisProGlyllelleProProHisAlaThrLeuValPheAspValGIuLeuLeuLysLeuGluSer GlyGlyGlySerGIy

La Id. de sec. n.°: 9 (secuencia de nucleótidos TRIF con enlazadores Xhol/Sall)

ctcgagatggcctgcacaggcccatcacttcctagcgccttcgacattctaggtgcagcaggccaggacaagctcttgtatctgaa gcacaaactgaagaccccacgcccaggctgccaggggcaggacctcctgcatgccatggttcícctgaagctgggccaggaaa ctgaggccaggatctctctagaggcattgaaggccgatgcggtggcccggctggtggcccgccagtgggctggcgtggacagca ccgaggacccagaggagcccccagatgtgtcctgggctgtggcccgcttgtaccacctgctggctgaggagaagctgtgccccg cctcgctgcgggacgtggcctaccaggaagccgtccgcaccctcagctccagggacgaccaccggctgggggaacttcaggat gaggcccgaaaccggtgtgggtgggacattgctggggatccagggagcatccggacgctccagtccaatctgggctgcctccca ccatcctcggctttgccctctgggaccaggagcctcccacgccccattgacggtgtttcggactggagccaagggtgctccctgcga tccactggcagccctgcctccctggccagcaacttggaaatcagccagtcccctaccatgcccttcctcagcctgcaccgcagccc acatgggcccagcaagctctgtgacgacccccaggccagcttggtgcccgagcctgtccccggtggctgccaggagcctgagga gatgagctggccgccatcgggggagattgccagcccaccagagctgccaagcagcccacctcctgggcttcccgaagtggccc cagatgcaacctccactggcctccctgatacccccgcagctccagaaaccagcaccaactacccagtggagtgcaccgagggg tctgcaggcccccagtctctccccttgcctattctggagccggtcaaaaacccctgctctgtcaaagaccagacgccactccaacttt ctgtagaagataccacctctccaaataccaagccgtgcccacctactcccaccaccccagaaacatcccctcctcctcctcctcctc ctccttcatctactccttgttcagctcacctgaccccctcctccctgttcccttcctccctggaatcatcatcggaacagaaattctataact ttgtgatcctccacgccagggcagacgaacacatcgccctgcgggttcgggagaagctggaggcccttggcgtgcccgacgggg ccaccttctgcgaggatttccaggtgccggggcgcggggagctgagctgcctgcaggacgccatagaccactcagctttcatcatc ctacttctcacctccaacttcgactgtcgcctgagcctgcaccaggtgaaccaagccatgatgagcaacctcacgcgacaggggtc gccagactgtgtcatccccttcctgcccctggagagctccccggcccagctcagctccgacacggccagcctgctctccgggctgg tgcggctggacgaacactcccagatcttcgccaggaaggtggccaacaccttcaagccccacaggcttcaggcccgaaaggcc atgtggaggaaggaacaggacacccgagccctgcgggaacagagccaacacctggacggtgagcggatgcaggcggcggc

actgaacgcagcctactcagcctacctccagagctacttgtcctaccaggcacagatggagcagctccaggtggcttttgggagcc acatgtcatttgggactggggcgccctatggggctcgaatgccctttgggggccaggtgcccctgggagccccgccaccctttccca cttggccggggtgcccgcagccgccacccctgcacgcatggcaggctggcacccccccaccgccctccccacagccagcagc ctttccacagtcactgcccttcccgcagtccccagccttccctacggcctcacccgcaccccctcagagcccagggctgcaacccct cattatccaccacgcacagatggtacagctggggctgaacaaccacatgtggaaccagagagggtcccaggcgcccgaggac aagacgcaggaggcagaagtcgac

La Id. de sec. n.°: 10 (secuencia del péptido TRIF) MetAlaCysThrGIyProSerLeuProSerAlaPheAsplleLeuGIyAlaAlaGlyGInAspLysLeuLeuTyrLeuLy sHisLysLeuLysThrProArgProGlyCysGlnGlyGInAspLeuLeuHisAlaMetValLeuLeuLysLeuGlyGIn GluThrGIuAlaArglIeSerLeuGíuAlaLeuLysAlaAspAlaValAlaArgLeuValAlaArgGInTrpAlaGlyValA spSerThrGIuAspProGluGluProProAspValSerTrpAlaValAlaArgLeuTyrHisLeuLeuAlaGluGluLys LeuCysProAlaSerLeuArgAspValAlaTyrGInGluAlaValArgThrLeuSerSerArgAspAspHisArgLeuG lyGluLeuGInAspGluAlaArgAsnArgCysGlyTrpAsplleAlaGIyAspProGlySerlIeArgThrLeuGInSerA snLeuGlyC

La Id. de sec. n.°: 11 (secuencia de nucleótidos RIG-I (dominios CARD subrayados) con enlazadores Xhol-Sall: Ctcqaqaccaccqaqcaqcqacqcaqcctqcaaqccttccaqqattatatccqqaaqaccctqqaccctacctacatcctqaq ctacatqqccccctqqtttaqqqaqqaaqaqqtqcaqtatattcaqqctqaqaaaaacaacaaqqqcccaatqqaqqctqcca cactttttctcaaqttcctqttqqaqctccaqqaqqaaqqctqqttccqtqqctttttqqatqccctaqaccatgcaggttattctqqacttt ataaaqccattqaaaqttqqqatttcaaaaaaattqaaaaqttqqaqqaqtataqattacttttaaaacqtttacaaccaqaatttaa aaccaqaattatcccaaccqatatcatttctqatctqtctqaatqtttaattaatcagqaatqtqaaqaaattctacaqatttqctctacta aqqqqatqatqqcaqqtqcaqaqaaattqqtqqaatqccttctcaqatcaqacaaqqaaaactqqcccaaaactttqaaacttq ctttqqaqaaaqaaaqqaacaaqttcaqtqaactqtqqattqtaqaqaaaqqtataaaagatgttgaaacagaaqatcttqagqa taagatggaaacttctgacatacagattgtcgac

La Id. de sec. n.°: 12 (secuencia del péptido RIG-1 [dominios CARD subrayados]) TTEQRRSLQAFQDYIRKTLDPTYiLSYMAPWFREEEVQYIQAEKIMNKGPMEAATLFLKFLLEL QEEGWFRGFLDALDHAGYSGLYEAIESWDFKKIEKLEEYRLLLKRLQPEFKTRIIPTDIISDLSE CLINQECEEILQICSTKGMMAGAEKLVECLLRSDKENWPKTLKLALEKERNKFSELWIVEKGIK DVETEDLEDKMETSDIGI

La Id. de sec. n.°: 13 (secuencia de nucleótidos NOD2 [dominios CARD subrayados] con enlazadores Xhol-Sall Ctcgagatgggggaagagggtggttcagcctctcacgatgaggaggaaagagcaagtgtcctcctcggacattctccgggttgtg aaatqtqctcqcaqqaqqcttttcaqqcacaqaqqaqccaqctqqtcqaqctqctqqtotcaqqqtccctqqaaqqcttcqaqaq tqtcctqqactqqctqctqtcctqqqaqqtcctctcctqqqaqqactacqaqqqcttccacctcctqqqccaqcctctctcccacttqq ccaqqcqccttctqqacaccqtctqqaataaqqqtacttqqqcctqtcaqaaqctcatcqcqqctqcccaaqaaqcccaqqccq acaqccaqtcccccaaqctqcatqqctqctqqqacccccactcqctccacccaqcccqaqacctqcaqaqtcaccqqccaqcc attqtcaqgaqqctccacaqccatqtqqaqaacatqctqqacctqqcatqqqaqcqqqqtttcqtcaqccaqtatqaatqtqatqa aatcaqqttqccqatcttcacaccqtcccaqaqqqcaaqaaqqctqcttqatcttqccacqqtqaaaqcqaatqqattqqctqcctt ccttctacaacatqttcaqqaattaccaqtcccattqqccctqcctttqgaaqctqccacatqcaaqaaqtatatqqccaaqctqaq gaccacggtgtctgctcagtctcgcttcctcagtacctatgatggagcagagacgctctgcctggaggacatatacacagagaatgt cctggaggtcgtcgac

La Id. de sec. n.°: 14 (secuencia del péptido NOD2 [dominios CARD subrayados]) MetGlyGluGluGlyGlySerAlaSerHisAspGluGluGluArgAlaSerValLeuLeuGlyHisSerProGlyCysGI uMetCvsSerGInGluAlaPheGInAlaGInArqSerGInLeuValGIuLeuLeuValSerGIySerLeuGluGIvPhe GluSerValLeuAspTrpLeuLeuSerTrpGluValLeuSerTrpGluAspTyrGIuGIvPheHisLeuLeuGIvGInP roLeuSerHisLeuAlaArqArqLeuLeuAspThrValTrpAsnLvsGlvThrTrpAlaCvsGlnLvsLeulleAlaAlaA laGInGluAlaGInAlaAspSerGInSerProLvsLeuHisGlvCvsTrpAspProHisSerLeuHisProAlaArqAsp LeuGInSerHisArqProAlalleValArqArqLeuHisSerHisValGIuAsnMetLeuAspLeuAlaTrpGíuArqGly PheValSerGInTvrGIuCvsAspGlulleArqLeuProllePheThrProSerGInArqAlaArqArqLeuLeüAspLe uAlaThrValLvsAlaAsnGIvLeuAlaAlaPheLeuLeuGInHisValGInGluLeuProValProLeuAlaLeuProL euGluAlaAlaThrCvsLvsLvsTvrMetAiaLvsLeuArqThrThrValSerAlaGInSerArgPheLeuSerThrTyr AspGIyAlaGluThrLeuCysLeuGluAsplleTyrThrGIuAsnValLeuGluVal

La Id. de sec. n.°: 15 (secuencia de nucleótidos MyD88)

La Id. de sec. n.°: 16 (secuencia del péptido MyD88)

M A A G G P G A G S A A P V S S T S S L P L A A L N M R V R R R L S L F L N V R T Q V A A D W T A L A E E M D F E Y L E I R Q L E T Q A D P T G R L L D A W Q G R P G A S V G R L L E L L T K L G R D D V L L E L G P S I E E D C Q K Y. l L K Q Q Q E E A E K P L Q V A A V D S S V P R T A E L A G I T T L D D P L G H M P E R F D A F I C Y C P S D I Q F V Q E M I R Q L E Q T N Y R L K L C V S D R D V L P G T C V W S I A S E L I E K R C R R M V V V V S D D Y L Q S K E C D F Q T K F A L S L S P G A H Q K R L I P I K Y K A M K K E F P S I L R F I T V C D Y T N P C T K S W F W T R L A K A L S L P

La mención de las anteriores patentes, solicitudes de patente, publicaciones y documentos no es una admisión de que cualquiera de las anteriores sea técnica anterior pertinente, ni constituye una admisión en cuanto al contenido o la fecha de estas publicaciones o documentos.

La invención descrita ilustrativamente en la presente memoria se puede poner en práctica de manera adecuada en ausencia de cualquier elemento o elementos no descrito(s) específicamente en la presente memoria. Así, por ejemplo, en cada caso de la presente memoria, cualquiera de los términos “que comprende” , “que consiste esencialmente en” y “que consiste en” puede reemplazarse con cualquiera de los otros dos términos. Los términos y expresiones que se han empleado se utilizan como términos de descripción y no de limitación, y el uso de dichos términos y expresiones no excluye ningún equivalente de las características mostradas y descritas o partes de las mismas, y son posibles diversas modificaciones. El término “un” o “ una” puede referirse a uno o una pluralidad de los elementos que modifica (p. ej., “un reactivo” puede significar uno o más reactivos) a menos que sea contextualmente claro que se describe uno de los elementos o más de uno de los elementos. El término “aproximadamente” como se utiliza en la presente memoria se refiere a un valor dentro del 10 % del parámetro subyacente (es decir, más o menos 10 %), y el uso del término “aproximadamente” al comienzo de una cadena de valores modifica cada uno de los valores (es decir, “aproximadamente 1, 2 y 3” es aproximadamente 1, aproximadamente 2 y aproximadamente 3). Por ejemplo, un peso de “aproximadamente 100 gramos” puede incluir pesos entre 90 gramos y 110 gramos.

Las realizaciones de la invención se exponen en las reivindicaciones que siguen.

Claims

REIVINDICACIONES

i . Una composición que comprende un ácido nucleico, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína quimérica, o una célula transfectada o transducida con el ácido nucleico, en donde la proteína quimérica comprende (i) una región de direccionamiento a membrana, (ii) una región de unión al ligando FKBP, y (iii) un péptido MyD88 truncado que carece del dominio TIR.
2. Una composición que comprende un ácido nucleico, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína quimérica, o una célula transfectada o transducida con el ácido nucleico, en donde la proteína quimérica comprende (i) una región de unión al ligando FKBP, y (ii) un péptido MyD88 truncado que carece del dominio TIR.
3. La composición de la reivindicación 2, en donde la proteína quimérica comprende una región de polipéptido CD40 citoplásmica que carece de un dominio extracelular.
4. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia promotora unida operativamente a la secuencia de nucleótidos.
5. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la región de unión al ligando FKBP comprende una región de unión al ligando FKBP12 que se une al ligando AP1903 o AP20187.
6. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la región de unión al ligando FKBP comprende FKBP12(V36).
7. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la región de unión al ligando FKBP comprende una secuencia de aminoácidos Fv’FvIs.
8. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4 a 7, en donde la región de direccionamiento a la membrana se selecciona del grupo que consiste en región de direccionamiento a miristoilación, región de direccionamiento a palmitoilación, región de prenilación, y región transmembrana del receptor.
9. La composición de la reivindicación 8, en donde la región de direccionamiento a membrana es una región de direccionamiento a miristoilación.
10. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el MyD88 truncado tiene la secuencia de aminoácidos de la Id. de sec. n. °: 6.
11. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en donde el ácido nucleico está contenido dentro de un vector viral o un vector plasmídico.
12. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la célula es una célula presentadora de antígeno.
13. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la célula es una célula humana.
14. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para usar en el tratamiento de una afección hiperproliferativa en un sujeto al mejorar una respuesta inmune.
15. La composición para usar según la reivindicación 14, en donde la afección hiperproliferativa es cáncer.
16. Un método para activar una célula presentadora de antígeno in vitro, que comprende poner en contacto una célula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 con FK506 dimérico o un análogo dimérico de FK506 que se une al dominio de unión al ligando.