ES2733958T3

ES2733958T3 - Inhibidores de TFPI y métodos de uso

Info

Publication number: ES2733958T3
Application number: ES13703505T
Authority: ES
Inventors: Michael Dockal; Rudolf Hartmann; Friedrich Scheiflinger; Frank Osterkamp; Thomas Polakowski; Ulrich Reineke
Original assignee: Baxalta GmbH; Baxalta Inc
Current assignee: Baxalta GmbH; Baxalta Inc
Priority date: 2012-03-21
Filing date: 2013-01-31
Publication date: 2019-12-03
Anticipated expiration: 2033-01-31
Also published as: EP2827883B1; AU2017221855B2; WO2013141965A1; AU2013235741A1; KR20140143191A; KR102263685B1; US20170174727A1; JP2019108360A; CN104302306B; US20180155399A1; US10800816B2; KR20200014448A; HUE046572T2; CN109134614A; CN104302306A; JP7303640B2; CA2867363C; HRP20191160T1; EP2827883A1; BR112014022435A2

Abstract

Un complejo peptídico de unión a TFPI que comprende un primer péptido y un segundo péptido, en el que (a) el primer péptido comprende la estructura de fórmula (XIII): en donde X6001 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, L, M, Y, 1Ni, Thi, Bta, Dopa, Bhf, C, D, G, H, I, K, N, Nmf, Q, R, T, V y W; en donde X6002 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q, G y K; en donde X6003 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en C, D, E, M, Q, R, S, T, Ede (O), Cmc, A, Aib, Bhs, F, G, H, I, K, L, N, P, V, W e Y; en donde X6004 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Aib, E, G, I, K, L, M, P, R, W, Y, A, Bhk, C, D, F, H, k, N, Nmk, Q, S, T y V; en donde X6005 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en a, A, Aib, C, D, d, E, G, H, K, K, M, N, Nmg, p, Q, R, NpropilG, aze, pip, tic, oic, hyp, nma, Ncg, Abg, Apg, thz, dtc, Bal, F, L, S, T, V, W e Y; en donde X6006 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, C(NEM), D, E, G, H, K, M, N, Q, R, S, V, Cit, C (Acm), Nle, I, Ede (O), Cmc, Ecl, Eea, Eec, Eef, Nif, Eew, Aib, Btq, F, L, T, W e Y; en donde X6007 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, V, T, Chg, Phg, Tie, A, F, G, K, L, Nmv, P, Q, S, W e Y; en donde X6008 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, H, 1Ni, 2Ni, Pmy, Y y W; en donde X6009 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Aib, V, Chg, Phg, Abu, Cpg, Tie, L-2- amino-4,4,4-trifluorobutírico, A, f, I, K, S, T y V; en donde X6010 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, D, d, E, F, H, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y, Nmd, C(NEM), Aib, G, I, L y Nmf; en donde X6011 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, a, G, p, Sar, c, hcy, Aib, C, K y Nmg; en donde X6012 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Y, Tym, Pty, Dopa y Pmy; en donde X6013 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Aib, C, F, 1Ni, Thi, Bta, A, E, G, H, K, L, M, Q, R, W e Y; en donde X6014 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, Aib, C, C(NEM), D, E, K, L, M, N, Q, R, T, V, Hcy, Bhe, F, G, H, I, P, S, W e Y; en donde X6015 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R, (omega-metil)-R, D, E y K; en donde X6016 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L, Hcy, Hle y Aml; en donde X6017 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, a, Aib, C, C, Cha, Dab, Eag, Eew, H, Har, Hci, Hle, I, K, L, M, Nle, Nva, Opa, Orn, R, S, Deg, Ebc, Eca, Egz, Aic, Apc, Egt, (omega-metil)-R, Bhr, Cit, D, Dap, E, F, G, N, Q, T, V, W e Y; en donde X6018 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, Aib, Hcy, hcy, C, c, L, Nle, M, N, R, Bal, D, E, F, G, H, I, K, Q, S, T, V, W e Y; en donde X6019 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K, R, Har, Bhk y V; y en donde X6020 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K, L, Hcy, Aml, Aib, Bhl, C, F, G, H, I, Nml, Q, R, S, T, V, W e Y y (b) el segundo péptido comprende la estructura de fórmula (XIV):**Fórmula** en donde X7001 está presente o ausente, por lo que en el caso de que X7001 esté presente, es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, C(NEM), D, E, F, G, H, I, K, L, P, R, S, T, V y W; en donde X7002 está presente o ausente, por lo que en el caso de que X7002 esté presente, es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, C(NEM), D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W e Y; en donde X7003 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, F, I, K, L, R, S, T, V, W e Y; en donde X7004 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, G, I, K, L, R, S, T, V y W; en donde X7005 es R o W; en donde X7006 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, H, I, K, L, R, V y W; en donde X7007 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Orn, homoK, C, Hcy, Dap y K, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en C y Hcy; en donde X7008 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, G, R, S y T; en donde X7009 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en a, A, I, K, L, M, m, Moo, Nle, p, R, Sem y V; en donde X7010 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, G, I, K, L, P, R, S, T y V; en donde X7011 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, E, G, S y T; en donde X7012 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, a, D, d, E, e, F, f, G, I, K, K, L, M, m, Moo, Nle, nle, P, p, R, r, S, s, Sem, T, t, V, v, W y w; en donde X7013 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, C(NEM), Con, Con(Meox), D, d, E, e, Eag, F, G, I, K, L, N, R, S, s, T, V y W; en donde X7014 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, G, I, K, L, M, R, S, T, V y W; en donde X7015 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, G, I, K, L, M, Nle, R, S, T, V y W; en donde X7016 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, I, K, L, M, Moo, Nle, R, S, Sem, T, V, W e Y; en donde X7017 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, G, I, K, L, R, S, T, V, W y Y; en donde X7018 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en C y D, preferiblemente C; en donde X7019 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, F, I, L, S, T, V y W; en donde X7020 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F y W; en donde X7021 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, L y V; en donde X7022 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, G, I, K, L, P, R, S, T, V y W; en donde X7023 está presente o ausente, por lo que en el caso de que X7023 esté presente, es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, C(NEM), Con, Con(Meox), D, E, Eag, F, G, I, K, L, R, S, T, V, W e Y; en donde el péptido comprende como una estructura cíclica generada por un enlace entre X7007 y X7018; en donde el término C del primer péptido está unido al término N del segundo péptido a través de un resto enlazador; en donde el primer péptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o 100% idéntico a la SEQ ID NO: 178 o SEQ ID NO: 4261; y en donde el segundo péptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o 100% idéntico a la SEQ ID NO: 1044.

Description

DESCRIPCIÓN

Inhibidores de TFPI y métodos de uso

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

[0001] La invención se refiere generalmente a péptidos que se unen al inhibidor de ruta del factor de tejido (TFPI) y usos de los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] La hemostasia se basa en la cascada de coagulación compleja, en la que una serie de eventos mediados por factores de coagulación sanguínea conducen a la conversión de protrombina en trombina. La activación del factor X (FX) es el evento central de las vías intrínseca y extrínseca de la cascada de coagulación. La vía extrínseca se ha propuesto como el activador primario de la cascada de coagulación (Mackman et al., Arterioscler. Thromb. Casc. Biol., 27, 1687-1693 (2007)). El factor tisular circulante (TF) y el factor VII activado (FVIIa) interactúan para formar el "complejo extrínseco", que media la activación de FX. La cascada de coagulación se amplifica por la vía intrínseca, durante la cual la activación sucesiva de los factores XII, XI, IX y VIII da como resultado la formación del complejo FIXa-FVIIIa "intrínseco" que también media en la activación de FX. El FX activado promueve la formación de trombina, que se requiere para que el cuerpo cree fibrina y frene eficazmente el sangrado.

[0003] Trastornos hemorrágicos graves, tales como la hemofilia, el resultado de la interrupción de la cascada de coagulación de la sangre. La hemofilia A, el tipo más común de hemofilia, se debe a una deficiencia en el factor VIII, mientras que la hemofilia B se asocia con deficiencias en el Factor IX (FIX). La hemofilia C es causada por una deficiencia en el Factor XI (FXI) (Cawthern et al., Blood, 91 (12), 4581-4592 (1998)). Actualmente no hay cura para la hemofilia y otras enfermedades de la coagulación. La terapia de reemplazo de factor es el tratamiento más común para los trastornos de la coagulación de la sangre. Sin embargo, los factores de coagulación de la sangre generalmente se eliminan del torrente sanguíneo poco después de la administración. Para ser efectivo, un paciente debe recibir infusiones intravenosas frecuentes de concentrados de factor derivados de plasma o recombinantes, lo cual es incómodo, requiere ajustes clínicos, es costoso y consume mucho tiempo. Además, la eficacia terapéutica de la terapia de reemplazo de factor puede disminuir drásticamente tras la formación de anticuerpos inhibidores. Aproximadamente el 30% de los pacientes con hemofilia A grave desarrollan anticuerpos inhibidores que neutralizan el Factor VIII (FVIII) (Peerlinck y Hermans, Haemophilia, 12, 579-590 (2006)). Existen pocas opciones terapéuticas para pacientes con anticuerpos antifactor.

[0004] Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de composiciones y métodos para tratar trastornos de la coagulación de la sangre. La invención proporciona tales composiciones y métodos.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0005] La invención proporciona un complejo de péptido de unión a TFPI que comprende un primer péptido y un segundo péptido, donde el primer péptido comprende la estructura de fórmula (XIII): X6001-X6002-X6003-X6004-X6005-X6006-X6007-X6008-X6009-X6010-X6011-X6012-X6013-X6014-X6015-X6016-X6017-X6018-X6019-X6020 (XIII) (SEQ ID NO: 3153); en donde X6001 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, L, M, Y, 1Ni, Thi, Bta, Dopa, Bhf, C, D, G, H, I, K, N, Nmf, Q, R, T, V y W; en donde X6002 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q, G y K; en donde X6003 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en C, D, E, M, Q, R, S, T, Ede (O), Cmc, A, Aib, Bhs, F, G, H, I, K, L, N, P, V, W e Y; en donde X6004 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Aib, E, G, I, K, L, M, P, R, W, Y, A, Bhk, C, D, F, H, k, N, Nmk, Q, S, T y V; en donde X6005 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en a, A, Aib, C, D, d, E, G, H, K, K, M, N, Nmg, p, Q, R, NpropilG, aze, pip, tic, oic, hyp, nma, Ncg, Abg, Apg, thz, dtc, Bal, F, L, S, T, V, W e Y; en donde X6006 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, C (NEM), D, E, G, H, K, M, N, Q, R, S, V, Cit, C (Acm), Nle, I, Ede (O), Cmc, Ecl, Eea, Eec, Eef, Nif, Eew, Aib, Btq, F, L, T, W e Y; en donde X6007 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, V, T, Chg, Phg, Tie, A, F, G, K, L, Nmv, P, Q, S, W e Y; en donde X6008 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, H, 1Ni, 2Ni, Pmy, Y y W; en donde X6009 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Aib, V, Chg, Phg, Abu, Cpg, Tie, L-2-amino-4,4,4-ácido trifluorobutírico, A, f, I, K, S, T y V; donde X6010 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, D, d, E, F, H, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y, Nmd, C (NEM), Aib, G, I, L y Nmf; en donde X6011 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, a, G, p, Sar, c, hcy, Aib, C, K y Nmg; en donde X6012 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Y, Tym, Pty, Dopa y Pmy; en donde X6013 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Aib, C, F, 1Ni, Thi, Bta, A, E, G, H, K, L, M, Q, R, W e Y; en donde X6014 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, Aib, C, C (NEM), D, E, K, L, M, N, Q, R, T, V, Hcy, Bhe, F, G, H, I, P, S, W e Y; en donde X6015 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R, (omega-metilo)- R, D, E y K; en donde X6016 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L, Hcy, Hle y Aml; en donde X6017 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, a, Aib, C, C, Cha, Dab, Eag, Eew, H, Har, Hci, Hle, I, K, L, M, Nle, Nva, Opa, Orn, R, S, Deg, Ebc, Eca, Egz, Aic, Apc, Egt, (omega-metil)-R, Bhr, Cit, D, Dap, E, F, G, N, Q, T, V, W e Y; donde X6018 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, Aib, Hcy, hcy, C, c, L, Nle, M, N, R, Bal, D, E, F, G, H, I, K, Q, S, T, V, W e Y; en donde X6019 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K, R, Har, Bhk y V; y en donde X6020 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K, L, Hcy, Aml, Aib, Bhl, C, F, G, H, I, Nml, Q, R, S, T, V, W e Y; y el segundo péptido comprende la estructura de la fórmula (XIV): X7001-X7002-X7003-X7004-X7005-X7006-[X7007-X7008-X7009-X7010-X7011-X7013-X7014-X7015-X7016-X7016-X7016-X7016-X7016-X7016-X7015-X7015-X7016-X7015-X7016-X7015-X7016-X7015-X7016-X7015-X7016-X7015-X7016-X7015-X7016-X7016-X7015-X7016-X7016-X7015-X7016-X7016-X7016-X7015-X7016-X7016-X7016 -X7019-X7020- X7021-X7022-X7023 (XIV) (SEQ ID NO: 3154), en donde X7001 está presente o ausente, por lo que en el caso de que X7001 esté presente, es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, C (NEM), D, E, F, G, H, I, K, L, P, R, S, T, V y W; en donde X7002 está presente o ausente, por lo que en el caso de que X7002 esté presente, es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, C (NEM), D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W e Y; en donde X7003 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, F, I, K, L, R, S, T, V, W e Y; en donde X7004 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, G, I, K, L, R, S, T, V y W; en donde X7005 es R o W; en donde X7006 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, H, I, K, L, R, V y W; en donde X7007 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Orn, homoK, C, Hcy, Dap y K, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en C y Hcy; en donde X7008 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, G, R, S y T; en donde X7009 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en a, A, I, K, L, M, m, Moo, Nle, p, R, Sem y V; en donde X7010 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, G, I, K, L, P, R, S, T y V; en donde X7011 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, E, G, S y T; en donde X7012 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, a, D, d, E, e, F, f, G, I, K, L, I, M, m, Moo, Nle, nle, P, p, R, r, S, s, Sem, T, t, V, v, W y w; en donde X7013 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, C (NEM), Con, Con (Meox), D, d, E, e, Eag, F, G, I, K, L, N, R, S, s, T, V y W; en donde X7014 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, G, I, K, L, M, R, S, T, V y W; en donde X7015 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, G, I, K, L, M, Nle, R, S, T, V y W; en donde X7016 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, I, K, L, M, Moo, Nle, R, S, Sem, T, V, W e Y; en donde X7017 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, G, I, K, L, R, S, T, V, W e Y; en donde X7018 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en C y D, preferiblemente C; en donde X7019 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, F, I, L, S, T, V y W; en donde X7020 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F y W; en donde X7021 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, L y V; en donde X7022 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, G, I, K, L, P, R, S, T, V y W; donde X7023 está presente o ausente, por lo que en el caso de que X7023 esté presente, es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, C (NEM), Con, Con (Meox), D, E, Eag, F, G, I, K, L, R, S, T, V, W e Y; en donde el péptido comprende como una estructura cíclica generada por un enlace entre X7007 y X7018; en el que el término C del primer péptido está unido al término N del segundo péptido a través de un resto enlazador; en donde el primer péptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o 100% idéntico a la SEQ ID NO: 178 o SEQ ID NO: 4261; y en donde el segundo péptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o 100% idéntico a la SEQ ID NO: 1044.

[0006] La invención también proporciona un complejo peptídico de la invención, para uso en un método para el tratamiento de un sujeto.

[0007] La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un complejo peptídico de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente que comprende además un agente farmacéuticamente eficaz adicional.

[0008] . En diversas realizaciones, el complejo peptídico se une a al menos dos epítopos de TFPI diferentes y, opcionalmente, inhibe al menos dos funciones de TFPI. En algunas realizaciones, el complejo peptídico de la invención se une a TFPI-1 (por ejemplo, TFPI-1a) y, opcionalmente, mejora la generación de trombina regulada por TFPI en ausencia de FVIII, FIX y/o FXI. También se proporciona una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) que comprende el complejo peptídico.

[0009] La invención proporciona un método in vitro de inhibición de un TFPI comprende poner en contacto el TFPI con un complejo péptido como se describe en el presente documento. La invención también proporciona un complejo peptídico, para uso en un método para mejorar la formación de trombina en un sujeto deficiente en factor de coagulación, para uso en un método para aumentar la formación de coágulos sanguíneos en un sujeto, y para uso en un método para tratar una coagulación sanguínea. El desorden en un sujeto. Los métodos comprenden administrar al sujeto un complejo peptídico como se proporciona en el presente documento en una cantidad efectiva para lograr un efecto deseado, por ejemplo, una cantidad efectiva para mejorar la formación de trombina, una cantidad eficaz para mejorar la formación de coágulos sanguíneos, o una cantidad eficaz para tratar el trastorno de coagulación de la sangre en el sujeto. Otros aspectos de la invención incluyen el uso del complejo peptídico de la invención, para la fabricación de un medicamento, un método in vitro para dirigirse a una célula que muestra TFPI, para uso en un método para tratar o diagnosticar a un sujeto que padece una enfermedad o riesgo de padecer una enfermedad, un método para purificar TFPI y un método para identificar un compuesto de unión a TFPI. A menos que se indique explícitamente lo contrario, la descripción proporcionada en este documento con respecto a un complejo peptídico de la invención o método de la invención se aplica a todos y cada uno de los complejos peptídicos de la invención y al método de la invención, respectivamente.

[0010] Los siguientes párrafos numerados definen cada uno sucintamente uno o más ejemplos de variaciones de la invención:

1. Un complejo péptido que comprende un primer péptido y un segundo péptido, en donde

(a) el primer péptido comprende la estructura de fórmula (XIII):

X6001-X6002-X6003-X6004-X6005-X6006-X6007-X6008-X6009-X6010-X6011-X6012

X6013-X6014-X6015-X6016-X6017-X6018-X6019-X6020 (X III) (SEQ ID NO: 3153);

en donde X6001 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, L, M, Y, 1Ni, Thi, Bta, Dopa, Bhf, C, D, G, H, I, K, N, Nmf, Q, R, T, V y W; en donde X6002 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q, G y K; en donde X6003 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en C, D, E, M, Q, R, S, T, Ede (O), Cmc, A, Aib, Bhs, F, G, H, I, K, L, N, P, V, W e Y; en donde X6004 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Aib, E, G, I, K, L, M, P, R, W, Y, A, Bhk, C, D, F, H, k, N, Nmk, Q, S, T y V; en donde X6005 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en a, A, Aib, C, D, d, E, G, H, K, K, M, N, Nmg, p, Q, R, NpropilG, aze, pip, tic, oic, hyp, nma, Ncg, Abg, Apg, thz, dtc, Bal, F, L, S, T, V, W e Y; en donde X6006 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, C (NEM), D, E, G, H, K, M, N, Q, R, S, V, Cit, C (Acm), Nle, I, Ede (O), Cmc, Ecl, Eea, Eec, Eef, Nif, Eew, Aib, Btq, F, L, T, W e Y; en donde X6007 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, V, T, Chg, Phg, Tie, A, F, G, K, L, Nmv, P, Q, S, W e Y; en donde X6008 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, H, 1Ni, 2Ni, Pmy, Y y W; en donde X6009 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Aib, V, Chg, Phg, Abu, Cpg, Tie, L-2-amino-4,4,4-trifluorobututyric acid, A, f, I, K, S y T; donde X6010 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, D, d, E, F, H, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y, Nmd, C (NEM), Aib, G, I, L y Nmf; en donde X6011 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, a, G, p, Sar, c, hcy, Aib, C, K, G y Nmg; en donde X6012 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Y, Tym, Pty, Dopa y Pmy; en donde X6013 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Aib, C, F, 1Ni, Thi, Bta, A, E, G, H, K, L, M, Q, R, W e Y; en donde X6014 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, Aib, C, C (NEM), D, E, K, L, M, N, Q, R, T, V, Hcy, Bhe, F, G, H, I, P, S, W e Y; en donde X6015 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R, (omega-metil)-R, D, E y K; en donde X6016 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L, Hcy, Hle y Aml; en donde X6017 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, a, Aib, C, C, Cha, Dab, Eag, Eew, H, Har, Hci, Hle, I, K, L, M, Nle, Nva, Opa, Orn, R, S, Deg, Ebc, Eca, Egz, Aic, Apc, Egt, (omega-metil)-R, Bhr, Cit, D, Dap, E, F, G, N, Q, T, V, W e Y; donde X6018 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, Aib, Hcy, hcy, C, c, L, Nle, M, N, R, Bal, D, E, F, G, H, I, K, Q, S, T, V, W e Y; en donde X6019 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K, R, Har, Bhk y V; y en donde X6020 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K, L, Hcy, Aml, Aib, Bhl, C, F, G, H, I, Nml, Q, R, S, T, V, W e Y y

(b) el segundo péptido comprende la estructura de fórmula (XIV):

X7001 -X7002-X7003-X7004-X7005-X7006-[X7007-X7008-X7009-X7010-X7011 -

X7012-X7013-X7014-X7015-X7016-X7017-X7018]-X7019-X7020-X7021-X7022-X7023

(XIV) (SEQ ID NO: 3154),

en donde X7001 está presente o ausente, por lo que en el caso de que X7001 esté presente, es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, C (NEM), D, E, F, G, H, I, K, L, P, R, S, T, V y W; en donde X7002 está presente o ausente, por lo que en el caso de que X7002 esté presente, es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, C (NEM), D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W e Y; en donde X7003 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, F, I, K, L, R, S, T, V, W e Y; en donde X7004 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, G, I, K, L, R, S, T, V y W; en donde X7005 es R o W; en donde X7006 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, H, I, K, L, R, V y W; en donde X7007 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Orn, homoK, C, Hcy, Dap y K, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en C y Hcy; en donde X7008 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, G, R, S y T; en donde X7009 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en a, A, I, K, L, M, m, Moo, Nle, p, R, Sem y V; en donde X7010 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, G, I, K, L, P, R, S, T y V; en donde X7011 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, E, G, S y T; en donde X7012 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, a, D, d, E, e, F, f, G, I, K, K, L, 1, M, m, Moo, Nle, nle, P, p, R, r, S, s, Sem, T, t, V, v, W y w; en donde X7013 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, C (NEM), Con, Con (Meox), D, d, E, e, Eag, F, G, I, K, L, N, R, S, s, T, V y W; en donde X7014 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, G, I, K, L, M, R, S, T, V y W; en donde X7015 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, G, I, K, L, M, Nle, R, S, T, V y W; en donde X7016 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, I, K, L, M, Moo, Nle, R, S, Sem, T, V, W e Y; en donde X7017 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, G, I, K, L, R, S, T, V, W e Y; en donde X7018 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en C y D, preferiblemente C; en donde X7019 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, F, I, L, S, T, V y W; en donde X7020 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F y W; en donde X7021 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, L y V; en donde X7022 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, G, I, K, L, P, R, S, T, V y W; donde X7023 está presente o ausente, por lo que en el caso de que X7023 esté presente, es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, C (NEM), Con, Con (Meox), D, E, Eag, F, G, I, K, L, R, S, T, V, W e Y; y en donde el péptido comprende como una estructura cíclica generada por un enlace entre X7007 y X7018; en el que el término C del primer péptido está unido al término N del segundo péptido a través de un resto enlazador; en donde el primer péptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o 100% idéntico a la SEQ ID NO: 178 o SEQ ID NO: 4261; y en donde el segundo péptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o 100% idéntico a la SEQ ID NO: 1044.

2. El complejo peptídico del apartado 1,

en donde X6001 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en 1Ni, Bta, Dopa, F, L, Y y M; en donde X6002 es Q; en donde X6003 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, E, S, M, Q, R, T y C; en donde X6004 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K, Aib, L, P, R, E, G, I, Y, M y W; en donde X6005 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en p, Nmg, NpropilG, aze, pip, tic, oic, hyp, a, Aib, D, d, G, H, K, K, N, Q, R, A, E, C y M; en donde X6006 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en C, E, K, R, S, V, C (Acm), Nle, C (NEM), I, Cit, A, D, G, H, N, Q y M; en donde X6007 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tie, V e I; en donde X6008 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en H, 1Ni, 2Ni, Pmy, F e Y; en donde X6009 es V, Abu o Tle; en donde X6010 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, P, C, T, A, E, K, M, N, Q, R, F, H, S, V, W e Y; en donde X6011 es G, a, c, hcy o Sar; en donde X6012 es Y; en donde X6013 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, 1Ni, Bta y C; en donde X6014 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Aib, C, E, Hcy, A, D, K, L, M, N, Q, R, T, V y Aib; en la que X6015 es R; en donde X6016 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L, Aml, Hle y Hcy; en donde X6017 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, Aib, C, c, Aic, Eca, Deg, Cha, Dab, Dap, Eag, Eew, H, Har, Hci, Hle, K, Nle, Nva, Opa, Orn, R, I, L, S y M; en donde X6018 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, Aib, C, c, L, Hcy, N, M y R; en donde X6019 es K; y en donde X6020 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L, Aml, Hcy y K.

3. El complejo peptídico del párrafo 1 o el párrafo 2, en el que el primer péptido y/o el segundo péptido comprenden además uno o más aminoácidos N-terminales y/o restos unidos a X6001 y/o X7001 y seleccionados del grupo que consiste en FAM-Ttds, PE, Palm, 2-fenil acetilo, 3-fenil propionilo, 2-(naft-2-il) acetilo, hexanoilo, 2-metilpropionilo, 3-metil butanoilo, 2-naftilsulfonilo, 1-naftilsulfonilo, acetilo, Con, Con(Meox), AOA, Oxme-AOA, Meox-Lev, ácido levulínico (Lev) y ácido pentinoico (Pyn).

4. El complejo peptídico de uno cualquiera de los párrafos 1-3, en el que el primer péptido y/o el segundo péptido comprende además X6021 unido a X6020 o X7024 unido a X7023, respectivamente, en donde X6021 y/o X7024 comprende aminoácido(s) C-terminal(es) y/o grupos seleccionados del grupo que consiste en Hly, K, Orn, Dab, Eag, Dap, Hcy, Pen, C, C, C (NEM), Con, Con(Meox), K (Ttds-maleimidopropionyl (EtSH), K (Tdts-maleimid), K (AOA), K (Myr), K (Ttds-Myr), K (Ttds-Palm), K (Ttds-Ac), K (Ttds-yGlu-Myr), K (AlbuTag), K (4PBSA), Cea y amida.

5. El complejo peptídico de cualquiera de los párrafos 1-4,

en donde X7001 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, F, G, H, K, L y S; en donde X7002 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en H, F, M y R; en donde X7003 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F e Y; en donde X7004 es K; en donde X7005 es W; en donde X7006 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F y H; en donde X7007 es C; en donde X7008 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, G y S; en donde X7009 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en M, Sem y V; en donde X7010 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K, P y R; en la que X7011 es D; en donde X7012 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, L, 1, M y Sem; en donde X7013 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, G, K y S; en la que X7014 es G; en donde X7015 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I y T; en donde X7016 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, F, M, Sem e Y; en donde X7017 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S y T; en la que X7018 es C; en donde X7019 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A y V; en donde X7020 es W; en donde X7021 es V; en donde X7022 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, L, K, R, P y W; en donde X7023 está presente o ausente, por lo que en caso de que X7023 esté presente, es una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en A, D, F, M, S e Y; y en donde el péptido comprende como una estructura cíclica generada por un enlace entre X7007 y X7018. 6. El complejo peptídico de uno cualquiera de los párrafos 2-5, en el que el primer péptido y el segundo péptido están unidos por un resto enlazador, preferiblemente de aproximadamente 1-100 A de longitud. 7. El complejo peptídico del párrafo 6, en el que el resto enlazador tiene una longitud de aproximadamente 5 50 A.

8. El complejo peptídico del párrafo 7, en el que el resto enlazador tiene una longitud de aproximadamente 10-30 A.

9. El complejo peptídico de uno cualquiera de los párrafos 6-8, en el que el resto enlazador comprende la estructura Z1-20, en donde Z es un aminoácido, hidroxiácido, etilenglicol, propilenglicol o una combinación de cualquiera de los anteriores.

10. El complejo peptídico del párrafo 9, en el que Z es G, s, S, a, A, Bal, Gaba, Ahx, Ttds, o una combinación de cualquiera de los anteriores.

11. El complejo peptídico de uno cualquiera de los párrafos 6-10, en el que el resto enlazante está unido al primer péptido y/o al segundo péptido a través de una oxima, una hidrazida, una succinimida, un tioéter, un triazol, una amina secundaria, una amida, o un disulfuro.

12. El complejo peptídico de uno cualquiera de los párrafos 6-11, en el que el extremo C del primer péptido está unido al extremo N del segundo péptido a través del resto enlazador.

13. El complejo peptídico de uno cualquiera de los párrafos 6-12, en el que el primer péptido comprende la estructura de fórmula (XIII), y el resto enlazador se une al primer péptido en el extremo N, en el extremo C, o en el lado cadenas de X6001, X6004, X6006, X6010, X6014 o X6020,

14. El complejo peptídico del párrafo 1 o el párrafo 2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4260.

15. El complejo peptídico de uno cualquiera de los párrafos 1-13, en el que el complejo peptídico se conjuga con un resto de polietilenglicol (PEG), albúmina de suero humano (HSA), un dominio de unión a HSA, un anticuerpo o fragmento del mismo, almidón droxietil, un multímero prolina-alanina-serina (PASylation), un ácido graso C12-C18, o ácido polisiálico.

16. Un complejo de péptidos de cualquiera de los párrafos 1-15 para uso en un método para el tratamiento de un sujeto.

17. El péptido complejo párrafo 16, en el que el método es para el tratamiento de un trastorno de la coagulación de la sangre.

18. Uso del complejo de péptidos de cualquiera de los párrafos 1-15 para la fabricación de un medicamento.

19. Uso del complejo de péptidos de cualquiera de los párrafos 1-15 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno de la coagulación de la sangre.

20. Una composición farmacéutica que comprende el complejo peptídico de uno cualquiera de los párrafos 1-15 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

21. La composición farmacéutica del párrafo 20, en la que la composición comprende un agente farmacéuticamente eficaz adicional.

22. La composición farmacéutica del párrafo 21, en donde la composición farmacéutica es para uso en un método para tratar un trastorno de coagulación de la sangre.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

[0011]

La Figura 1 es una ilustración de la cascada de coagulación de la sangre.

La Figura 2 es una ilustración de la estructura secundaria del inhibidor de la ruta del factor tisular-1.

La Figura 3 es una ilustración de la formación de un complejo cuaternario que comprende factor tisular, factor Xa (FXa), factor VIIa (FVIIa) y TFPI.

La Figura 4 es una lista de secuencias de aminoácidos de diversos péptidos de unión a TFPI (por ejemplo, péptidos inhibidores de TFPI) que indican sustituciones de aminoácidos (en negrita y subrayadas) en referencia al péptido JBT0293.

La Figura 5 es una ilustración de la selección de presentación de ARNm de péptidos de unión a TFPI (por ejemplo, péptidos inhibidores de TFPI).

La Figura 6A es una ilustración del ELISA de unión a CE50 y la Figura 6B es una ilustración del ELISA de CI50 descrito en el Ejemplo 1.

La Figura 7 es una curva ELISA de unión que compara el % DO (eje y) y la concentración [nM] (eje x) para el péptido JBT0132 biotinilado.

Las Figuras 8A-8D son curvas ELISA de competición que comparan el % DO (eje y) y la concentración [nM] (eje x) para péptidos ejemplares de la invención.

Las Figuras 9A y 9B son diagramas de sensaciones que representan el RU (eje y) frente al tiempo en segundos (eje x) para los péptidos JBT0120 y JBT0132.

Las Figuras 10A y 10B son diagramas de sensaciones que representan el RU (eje y) frente al tiempo en segundos (eje x) para la interacción del péptido JBT0120 con el inhibidor de la vía del factor tisular 1 y el inhibidor de vía de factor tisular 2.

Las Figuras 11A y 11B son gráficos que comparan la cantidad de trombina generada (nM) (eje y) y el tiempo en minutos (eje x) para el péptido JBT0120 y el péptido JBT0132 en un ensayo basado en plasma.

Las Figuras 12-18 son tablas que enumeran las secuencias de aminoácidos de varios péptidos de unión a TFPI; CE50 y el porcentaje de inhibición de TFPI observados en el ensayo de inhibición de FXa; CE50 y el porcentaje de inhibición de TFPI observados en el ensayo de inhibición de la tenasa extrínseca; y FEIBA, Factor VIII (FVIII) Inmunato, o Factor IX (FIX) actividades equivalentes (mU/mL) en ensayos basados en plasma. "*" denota controles negativos.

Las Figuras 19-21 son tablas que enumeran los resultados del análisis BIAcore de varios péptidos de unión a TFPI. "*" denota controles negativos.

Las Figuras 22-30 son tablas que enumeran las secuencias de aminoácidos de varios péptidos de unión a TFPI; CE50 y el porcentaje de inhibición de TFPI observados en el ensayo de inhibición de FXa; CE50 y el porcentaje de inhibición de TFPI observados en el ensayo de inhibición de la tenasa extrínseca; y FEIBA, FVIII Inmunato, o FIX actividades equivalentes (mU/mL) en ensayos basados en plasma. "*" denota controles negativos.

La Figura 31 es una gráfica que compara una característica farmacocinética (concentración de péptido (eje y) con respecto al tiempo después de la administración (eje x)) de un péptido de unión a TFPI PEGilado con la característica farmacocinética del mismo péptido que carece de p Eg . Los péptidos se administraron por vía intravenosa a ratones C57Bl6 a una dosis de 10 mg/kg. Se analizaron tres muestras biológicas para detectar la presencia de péptidos en cada momento.

Las Figuras 32-39 son tablas que enumeran las secuencias de aminoácidos y los valores de CI50 o CE50 de diversos péptidos de la invención. "*" denota controles negativos.

La Figura 40 es un gráfico que ilustra una característica farmacocinética (concentración de péptido (nM) (eje y) en función del tiempo después de la administración (minutos) (eje x) de un péptido de unión a TFPI PEGilado después de la administración subcutánea a ratones a una dosis de 10 mg/kg.

La Figura 41 es un gráfico que correlaciona la cantidad de trombina generada (nM) (eje y) con el tiempo (minutos) (eje x) para el péptido JBT1855 en un ensayo basado en plasma de hemofilia A plasma de paciente. La Figura 42 es un gráfico que ilustra la cantidad de pérdida de sangre (pl; eje y) observada después de un clavo-clip en ratones tratados con JBT-1855 (administración intravenosa o subcutánea), anticuerpo anti-TFPI (administración intravenosa), o vehículo (administración intravenosa) (eje x).

La Figura 43 es un gráfico que representa el residuo de aminoácido TFPI160 (eje x) frente a las diferencias de desplazamiento químico de las señales HSQC para TFPI160 libre y TFPI160 unidos a JBT0303 (eje y). La Figura 44 es un modelo de cinta de la estructura secundaria de TFPI que ilustra regiones de cambios de cambio químico de señales HSQC cuando TFPI160 está complejado con JBT0303 en comparación con TFPI160 sin complejos (libre).

La Figura 45 es un gráfico que representa el residuo de aminoácido TFPI160 (eje x) frente a las diferencias de desplazamiento químico de las señales HSQC para TFPI160 libre y TFPI160 unidos a JBT0122 (eje y). La Figura 46 es un modelo de cinta de la estructura secundaria de la proteína TFPI que ilustra las regiones de cambios de cambio químico de señales HSQC cuando TFPI160 está complejado con JBT0122 en comparación con TFPI160 sin complejos (libre).

La Figura 47 es una tabla que contiene las asignaciones para el carbono carbonilo (C), el carbono alfa (CA), el carbono beta (CB), el protón amida (H) y el nitrógeno amídico (N) de JBT0788 basado en espectros HSQC, HNCACB, HNCA, HNCO y HNN.

La Figura 48 es un modelo de cinta de la estructura secundaria de JBT0788 libre.

La Figura 49 es una tabla que contiene las asignaciones para el carbono carbonílico (C), el carbono alfa (CA), el carbono beta (CB), el protón amida (H) y el nitrógeno amídico (N) de JBT0788 complejados con TFPI160 basado en Espectros de HSQC, HNCACB, HNCA, HCCOCA y HNCO.

La Figura 50 es un modelo de cinta de la estructura secundaria de JBT0788 cuando está complejado con TFPI160.

La Figura 51 es una tabla que contiene las asignaciones para el carbono carbonílico (C), el carbono alfa (CA), el carbono beta (CB), el protón amida (H) y el nitrógeno amídico (N) de JBT0616 basado en espectros HSQC, HNCACB y HNN.

La Figura 52 es un modelo de cinta de la estructura secundaria de JBT0616 libre.

La Figura 53 es una tabla que contiene las asignaciones para el carbono carbonílico (C), el carbono alfa (CA), el carbono beta (CB), el protón amida (H) y el nitrógeno amídico (N) de JBT0616 complejado con TFPI basado en espectros de HSQC, HNCO, HNCA y HNCOCA.

La Figura 54 es un modelo de cinta de la estructura secundaria de JBT0616 cuando está complejado con TFPI160,

La Figura 55 es una estructura de cinta del mejor modelo energéticamente minimizado de KD1 (residuos 22 79) en complejo con JBT0303 con residuos propuestos para impulsar la interacción proteína-proteína mostrada como barras. Los residuos en cursiva y subrayados pertenecen a JBT0303; los residuos restantes pertenecen a KD1 de TFPI.

La Figura 56 es un tromboelastograma rotacional que correlaciona la elasticidad de la muestra (mm) con el tiempo en segundos para JBT2317.

La Figura 57 es un tromboelastograma rotatorio que correlaciona la elasticidad de la muestra (mm) con el tiempo en segundos(s) para JBT2329.

La Figura 58 es una ilustración de un dispositivo informático.

La Figura 59 es una ilustración

un modelo tridimensional (3D) de una proteína KD1. La Figura 60 es una ilustración

un modelo 3D de un péptido de unión a TFPI.

La Figura 61 es una ilustración de un método para modelar la interacción de proteínas y péptidos. La Figura 62 es una tabla que enumera las secuencias de aminoácidos y valores CI50 o CE50 de diversos péptidos de la invención. La designación "na" no se analiza. Los datos de la curva de progresión se obtuvieron utilizando el ensayo de inhibición de FXa descrito en el Ejemplo 3 con TFPI de longitud completa humana recombinante. La concentración de ensayo de la curva de progresión fue de 0,0025% (Tween80 al 0,1% usado en tampón de dilución de péptidos).

La Figura 63 es un gráfico que correlaciona la concentración de péptidos JBT2325-JBT2329 (nM) (eje y) con el tiempo después de la administración intravenosa (horas) (eje x). Los péptidos que comprenden restos de PEG de mayor peso mostraron una vida media in vivo prolongada en ratones. Cada punto de tiempo está representado por la media de tres muestras independientes cuantificadas por ELISA.

La Figura 64A-64C son gráficas que correlacionan la concentración de los péptidos JBT2401, JBT2404 y JBT2410 (nM) (eje y) con el tiempo después de la administración intravenosa (horas) (eje x). Cada punto de tiempo está representado por la media de tres muestras independientes cuantificadas por ELISA. Los círculos sólidos simbolizan datos intravenosos, los triángulos sólidos simbolizan datos subcutáneos.

La Figura 65 es una tabla que enumera las secuencias de aminoácidos de varios péptidos de la invención.

Las Figuras 66A y 66B representan curvas CI50 de péptidos de unión a TFPI JBT1837 (SEQ ID NO: 1044) y JBT1857 (SEQ iD NO: 178) y complejo peptídico JBT2547 (SEQ ID NO: 4260) usando dos marcadores: JBT2271 (SEQ ID NO: 4033), un derivado biotinilado de JBT1857 (Figura 66A), y JBT2316 (SEQ ID NO: 1313), un derivado biotinilado de JBT1837 (Figura 66B).

La Figura 67 es un gráfico de barras que ilustra los resultados de un ensayo de Kapagado con JBT2547 (SEQ ID NO: 4260) y JBT1857 (SEQ ID NO: 178) (eje X) presentado como % de inhibición de la unión de Tf Pi por el péptido trazador, JBT2271 (SEQ ID NO: 4033) (eje Y).

Las Figuras 68A-F ilustran los resultados de los ensayos de inhibición de FXa utilizando un complejo peptídico de unión a TFPI. Las Figuras 68A-68D son gráficas que correlacionan la concentración de JBT1837 (triángulos; SEQ ID NO: 1044), JBT1857 (círculos; SEQ ID NO: 178), JBT2547 (diamantes; SEQ ID NO: 4260) y JBT1837 JBT1857 (cuadrados) (pM) (eje X) con porcentaje de inhibición de TFPI en un ensayo de inhibición de FXa realizado con TFPI humano de longitud completa 0,5 nM (Figura 68A), TFPI 1-160 humano 0,5 nM (Figura 68B), TFPI 1-160 murino 0,5 nM (Figura 68C), o 0,5 nM mono cynomologus TFPI 1-160 (Figura 68D). La Figura 68E ilustra la inhibición de TFPI por JBT2547 a concentraciones crecientes de TFPI (de 0,1 a 10 nM de izquierda a derecha) en un ensayo de inhibición de FXa. Los puntos de datos se ajustaron mediante una ecuación de respuesta a la dosis sigmoidal que resultó en CE50 s (nM) y máxima inhibición (%). La Figura 68F es una gráfica que correlaciona la inhibición de TFPI (%) por JBT2547 (diamantes), JBT2548 (círculos), JBT1837 (triángulos) y una combinación de JBT1837 y JBT1857 (cuadrados) (péptido 1 pm) en presencia de concentraciones en aumento de TFPI humanos de longitud completa.

La Figura 69 ilustra los resultados de los ensayos de inhibición de la tenasa extrínseca utilizando un complejo peptídico de unión a TFPI. La Figura 69A es un gráfico que correlaciona la concentración de JBT1837 (triángulos; SEQ ID NO: 1044), JBT1857 (círculos; SEQ ID NO: 178), JBT2547 (diamantes; SEQ ID NO: 4260) y JBT1837 JBT1857 (cuadrados) (pM) (eje X) con porcentaje de inhibición de TFPI en un ensayo de inhibición de tenasa extrínseca realizado con TFPI humano de longitud completa de 0,063 nM. La Figura 69B ilustra la inhibición de TFPI por JBT2547 al aumentar las concentraciones de TFPI (de 0,031 a 10 nM de izquierda a derecha) en un ensayo de inhibición de la tenasa extrínseca. Los puntos de datos se ajustaron mediante una ecuación de respuesta a la dosis sigmoidal que resultó en CE50s (nM) y máxima inhibición (%). La Figura 69C es una gráfica que relaciona el porcentaje de inhibición máxima de TFPI (eje Y) mediada por JBT1837 (triángulos; SEQ ID NO: 1044), JBT2548 (círculos; SEQ ID NO: 4261), JBT2547 (diamantes); SEQ ID NO: 4260) y JBT1837 JBT1857 (cuadrados) (1 pm) con concentración de TFPI humano de longitud completa utilizado en el ensayo de inhibición de la tenasa extrínseca. La Figura 69D es una gráfica que correlaciona la CE50 de JBT1837 (triángulos; SEQ ID NO: 1044), JBT2548 (círculos; SEQ ID NO: 4261), JBT2547 (diamantes); SEQ ID NO: 4260 y JBT1837 JBT1857 (cuadrados) (1 pm) con concentración (nM) de TFPI humano de longitud completa usado en el ensayo de inhibición de la tenasa extrínseca. Las CE50 se calcularon ajustando la respuesta de las concentraciones de péptidos al aumentar las concentraciones de TFPI frente a las concentraciones de TFPI de longitud completa.

Las Figuras 70A-70C ilustran los resultados de un ensayo de generación de trombina realizado en plasma inhibido por FVIII. Las cifras relacionan la generación pico de Factor lia (trombina) (nM) (eje Y) con la concentración (nM) de JBT1837 (triángulo), JBT1857 (círculo), una combinación de JBT1837 JBT1857 (cuadrado) y j Bt 2547 (rombo) (eje X) en presencia de 1,25 nM flTFPI (Figura 70A), 3,75 nM flTFPI (Figura 70B) y 10 nM flTFPI (Figura 70C). Línea de puntos: plasma normal agrupado (PNP); línea continua - plasma inhibido por FVIII (PNP aFVIII).

Las Figuras 71A-71B son gráficas que correlacionan el porcentaje de inhibición de TFPI (eje Y) alcanzado a diversas concentraciones (eje X) de JBT2547, JBT1837 y 1857 (Figura 71A) o JBT2547 (diamantes), JBT1837 (triángulos), JBT1837 JBT1857 (cuadrados) y JBT2548 (círculos) (Figura 71B) en un ensayo de tenasa extrínseca basado en células.

Las Figuras 72A-72C ilustran el efecto procoagulante de concentraciones crecientes (10, 100, 1000 nM) de JBT2547 (Figura 72A), JBT1837 (Figura 72B) o JBT1857 (Figura 72C) en sangre completa inhibida por FVIII en ausencia de humanos externos adicionales. TFPI de longitud completa (círculos abiertos) y presencia de cantidades crecientes de TFPI de longitud completa externa (2 nM, triángulos cerrados; 10 nM, cuadrados cerrados). Los tiempos de coagulación de la sangre completa inhibida por FVIII y la sangre normal normal se dan como referencia. = tiempo de coagulación no alcanzado.

La Figura 73 es un cuadro que enumera ejemplos no limitativos de grupos reactivos nucleófilos o electrófilos para el enlace peptídico.

La Figura 74 es una alineación de secuencia de TFPI KD1-KD2 de diferentes especies. Residuos con una superficie de contacto de 10-25 A2 = 41, 56, 59, 60, 67, 71,74, 96, 106, 130, 132, 133, 136, 137, 142; residuos con una superficie de contacto de 26-60 A2 = 75, 80, 82, 84, 85, 87, 145; residuos con una superficie de contacto de 61-100 A2 = 63, 65, 131, 146; residuos con una superficie de contacto superior a 100 A2 = 83, 134.

La Figura 75 es una estructura de cinta de un modelo de KD1-KD2 en complejo con JBT1857 y JBT1837.

La Figura 76A-76D es una tabla que enumera las secuencias de aminoácidos de varios péptidos de la invención.

La Figura 77 es una tabla que enumera las secuencias de aminoácidos de varios péptidos de la invención.

Las Figuras 78A-78AA son una tabla que enumera las secuencias de aminoácidos de varios péptidos de la invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0012] La invención proporciona complejos de péptido. El complejo peptídico se une al inhibidor de la ruta del factor tisular-1 y, en algunos casos, bloquea la actividad inhibidora del inhibidor de la ruta del factor tisular-1 (denominado aquí TFPI) dentro de la cascada de coagulación de la sangre. Tras la lesión vascular, el Factor Tisular (FT) se forma con el Factor VIIa para formar el "complejo extrínseco" o el "complejo de tenasa extrínseca", que activa los Factores IX y X (Figura 1). TFPI es el principal regulador natural de la actividad del complejo extrínseco TF/FVIIa y, por extensión, desempeña un papel en el control de la generación de trombina (Panteleev et al., Eur. J. Biochem., 249, 2016-2031 (2002)). TFPI es un inhibidor de la serina proteasa de 43 kDa que comprende tres dominios inhibidores de tipo Kunitz (Figura 2). El dominio Kunitz 1 de TFPI se une a FVIIa y el dominio Kunitz 2 une FXa, permitiendo que el inhibidor forme un complejo cuaternario de FXa-TFPI-FVIIa-TF que bloquea la actividad del complejo extrínseco de TF/FVIIa (Figura 3). La unión TFPI de FXa también regula a la baja la vía común de la cascada de coagulación, durante la cual FXa convierte la protrombina en trombina (Audu et al., Anesth. Analg., 103 (4), 841-845 (2006)). La invención proporciona, por ejemplo, complejos peptídicos inhibidores de TFPI que bloquean la acción inhibidora de TFPI en la cascada de coagulación de la sangre, mejorando así la formación de trombina.

[0013] Las secuencias de aminoácidos de varios péptidos de unión a TFPI están dentro de la presente memoria. Los aminoácidos convencionales se identifican de acuerdo con sus códigos estándar, de una letra o de tres letras, como se establece en la Tabla 1.

TABLA 1

[0014] Los ejemplos de aminoácidos no convencionales y bloques de construcción de péptidos adicionales se identifican de acuerdo con un código de tres letras (con la excepción de Ttds y Dopa, que son abreviaturas de cuatro letras comunes) que se encuentran en la Tabla 2, Bloques de construcción adicionales designados por tres, cuatro o siete números/letras, las designaciones o abreviaturas también se enumeran en la Tabla 2. Las estructuras de algunos bloques de construcción se representan con un reactivo ejemplar para introducir el bloque de construcción en un péptido (por ejemplo, la estructura proporcionada para 2-naftilsulfonilo comprende un cloruro).

TABLA 2

CONTINUACIÓN

CONTINUACIÓN

CONTINUACIÓN

CONTINUACIÓN

CONTINUACIÓN

CONTINUACIÓN

Ċ

CONTINUACIÓN

CONTINUACIÓN

Ċ

CONTINUACIÓN

CONTINUADO

[0015] Las secuencias de aminoácidos de los péptidos proporcionados en este documento se representan en formato de secuencia peptídica típica, como se entendería por el experto en la técnica ordinaria. Por ejemplo, el código de tres letras o el código de una letra de un aminoácido convencional, o los bloques de construcción adicionales del código de tres, cuatro o siete números/letras, indica la presencia del aminoácido o bloque de construcción en una posición especificada dentro de la secuencia peptídica. El código para cada aminoácido o bloque de construcción no convencional está conectado al código para el siguiente o anterior aminoácido o bloque de construcción en la secuencia mediante un guión. Los aminoácidos adyacentes están conectados por un enlace químico (típicamente un enlace amida). La formación del enlace químico elimina un grupo hidroxilo del grupo 1-carboxilo del aminoácido cuando está ubicado a la izquierda del aminoácido adyacente (por ejemplo, aminoácido adyacente Hle), y elimina un hidrógeno del grupo del aminoácido cuando se encuentra a la derecha del aminoácido adyacente (por ejemplo, aminoácido adyacente Hle). Se entiende que ambas modificaciones pueden aplicarse al mismo aminoácido y aplicarse a aminoácidos convencionales adyacentes presentes en secuencias de aminoácidos sin guiones explícitamente ilustrados. Cuando un aminoácido contiene más de un grupo amino y/o carboxi en la cadena lateral del aminoácido, el grupo 2 o 3-amino y/o el grupo 1-carboxi generalmente se usan para la formación de enlaces peptídicos. Para los aminoácidos no convencionales, se usó un código de 3 letras donde la primera letra indica la estereoquímica del átomo C-a. Por ejemplo, una primera letra mayúscula indica que la forma L del aminoácido está presente en la secuencia peptídica, mientras que una primera letra minúscula indica que la forma D del aminoácido correspondiente está presente en la secuencia peptídica. Cuando se usa el código de una letra, una letra minúscula representa un D-aminoácido, mientras que una letra mayúscula representa un L-aminoácido. A menos que se indique lo contrario, las secuencias de aminoácidos se presentan aquí en la dirección del extremo N al C.

[0016] Los C-terminales de varias secuencias de péptidos de unión a TFPI descritos en este documento se ilustran explícitamente por inclusión de un OH, NH2, o una abreviatura de una amina de terminación específica en relación con el código de aminoácidos C-terminal a través de un guión. Los extremos N de varios péptidos descritos en el presente documento se ilustran explícitamente mediante la inclusión de un hidrógeno (para un extremo N libre), o una abreviatura para un ácido carboxílico de terminación específica u otro grupo químico vinculado al código de aminoácidos del terminal N mediante un guión.

[0017] Opcionalmente, el complejo de péptido de la invención comprende una o más sustituciones de aminoácidos (con referencia a cualquiera de las secuencias de aminoácidos proporcionadas en la presente memoria) que no destruyen la capacidad del péptido de unirse y/o inhibir TFPI.

[0018] Las sustituciones de aminoácidos incluyen, pero no se limitan a, aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteolisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran las afinidades de unión, y/o (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales sobre un péptido. En un aspecto, la sustitución es una sustitución conservativa, en la que un residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido dentro de la técnica, e incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina e histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico y ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (p.ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina y cisteína), cadenas laterales no polares (p.ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina y triptófano), cadenas laterales ramificadas (p.ej., treonina, valina e isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p.ej., tirosina, fenilalanina, triptófano e histidina). Sin embargo, se apreciará que un profesional no está limitado a crear sustituciones conservativas siempre que el péptido resultante retenga la capacidad de regular a la baja, en todo o en parte, la actividad de TFPI. La invención también abarca péptidos de unión a TFPI (por ejemplo, péptidos inhibidores de TFPI) que comprenden aminoácidos atípicos, no naturales, que son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos de aminoácidos no naturales incluyen ornitina, citrulina, hidroxiprolina, homoserina, fenilglicina, taurina, yodo-rosina, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido a-amino isobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido 2-amino butírico, y ácido amino butírico, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiónico, norleucina, norvalina, sarcosina, homocitrulina, ácido cisteico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, p-alanina, un fluoro-aminoácido, un aminoácido 3-metilo, aminoácido a-C-metilo, aminoácidos N-metilo, ácido 2-amino-isobutírico, ácido p-homoglutamático, p-homofenilalanina, p-homolisina, phomoleucina, p-homoasparagina, p-homoglutamina, p-homoarginina, p-homoserina, p-homotirosina, ácido phomoaspártico, p-homovalina, p-homoasparagina, (S)-ciclohexilalanina, (S)-citrulina, ácido (S)-2,4-diaminobutírico, ácido (S)-2,4-diaminobutírico, ácido (S)-diaminopropiónico, (S)-2-propargilglicina, (S)-N (omega)-nitro-arginina, L-homofenilalanina, S)-homo-arginina, (S)-homo-citrulina, (S)-homo-cisteína, ácido (S)-2-amino-5-metil-hexanoico, (S)-homo-lisina, (S)-norleucina, (S)-N-metilalanina, ácido (S)-N-metil-aspártico, ácido (S)-N-metil-glutámico, (S)-N-metilfenilalanina, N-metil-glicina, (S)-N-metil-lisina, (S)-N-metil-leucina, (S)-N-metil-arginina, (S)-N-metil-serina, (S)-N-metilvalina, (S)-N-metil-tirosina, ácido (S)-2-amino-pentanoico, (S)-2-piridil-alanina, (S)-ornitina, L-fenilglicina, ácido 4-fenilbutírico y selenometionina. Los aminoácidos individuales pueden tener estereoquímica L o D cuando sea apropiado, aunque la estereoquímica L se emplea típicamente para todos los aminoácidos en el péptido.

[0019] La invención incluye además péptido de unión a TFPI (por ejemplo, péptido inhibidor de TFPI) variantes en un complejo que comprende uno o más aminoácidos insertados dentro de una secuencia de aminoácidos proporcionada en la presente memoria y/o unidos al N-terminal o C-terminal. En un aspecto, el péptido comprende además uno o más aminoácidos que facilitan la síntesis, el manejo o el uso del péptido, incluidos, entre otros, una o dos lisinas en el extremo N y/o en el extremo C para aumentar la solubilidad del péptido. Las proteínas de fusión adecuadas incluyen, pero no se limitan a, proteínas que comprenden un péptido de unión a TFPI (p.ej., péptido inhibidor de TFPI) unido a uno o más polipéptidos, fragmentos de polipéptidos o aminoácidos que generalmente no se reconocen como parte de la secuencia de la proteína. En un aspecto, un péptido de fusión comprende todas las secuencias de aminoácido de dos o más péptidos o, alternativamente, comprenden porciones (fragmentos) de dos o más péptidos. Además de la totalidad o parte de los péptidos de unión a TFPI (por ejemplo, péptidos inhibidores de TFPI) descritos en el presente documento, una proteína de fusión incluye opcionalmente todo o parte de cualquier péptido adecuado que comprende una actividad/función biológica deseada. De hecho, en algunos aspectos, un péptido de unión a TFPI (p.ej., péptido inhibidor de TFPI) está unido operativamente a, por ejemplo, uno o más de los siguientes: un péptido con vida media circulante larga, una proteína marcadora, un péptido que facilita purificación del péptido de unión a TFPI (por ejemplo, péptido inhibidor de TFPI), una secuencia peptídica que promueve la formación de proteínas multiméricas, o un fragmento de cualquiera de los anteriores. Los pares de fusión adecuados incluyen, entre otros, una etiqueta His, una etiqueta FLAG, una etiqueta strep y una etiqueta myc. Opcionalmente, el péptido de unión a TFPI (por ejemplo, péptido inhibidor de TFPI) se fusiona con una o más entidades que mejoran la vida media del péptido. La vida media se puede aumentar, por ejemplo, aumentando el peso molecular del péptido de unión a TFPI para evitar el aclaramiento renal y/o incorporando un ligando para la vía de reciclaje mediada por el receptor nFc. En una realización, el péptido de unión a TFPI se fusiona o se conjuga químicamente con (como se describe más adelante) un polipéptido de albúmina o un fragmento del mismo (por ejemplo, albúmina de suero humano (HSA) o albúmina de suero bovino (BSA)). El fragmento de albúmina comprende 10%, 25%, 50% o 75% de la proteína albúmina de longitud completa. Alternativamente o además, el péptido de unión a TFPI comprende un dominio de unión a albúmina o ácido graso que se une a la albúmina cuando se administra in vivo. Un ejemplo de un dominio de unión a la albúmina es "albu-tag", un resto derivado del ácido 4-(p-yodofenil)-butanoico (Dumelin et al., Angew Chem Int Ed. Engl 47: 3196-3201 (2008)). Otras parejas de fusión adecuadas incluyen, pero no se limitan a, un multímero de prolina-alanina-serina (PASilación) y un anticuerpo o fragmento del mismo (por ejemplo, una porción Fc de un anticuerpo).

[0020] Dos o más péptidos de unión a TFPI se fusionan juntos, unidos por un dominio de multimerización, o unidos a través de enlace químico para generar un péptido de unión a TFPI (por ejemplo, péptido inhibidor de TFPI) complejo. La invención proporciona un hetero-dímero (es decir, un dímero que comprende dos péptidos de unión a TFPI diferentes) y un hetero-multímero (es decir, un complejo que comprende tres o más péptidos de unión a TFPI, en donde al menos dos de los péptidos de unión a TFPI son diferentes), unidos opcionalmente por uno o más enlazadores.

[0021] A este respecto, la invención proporciona un complejo de péptido que comprende un primer péptido y un segundo péptido. En algunos, el primer péptido y el segundo péptido pueden unirse a diferentes regiones (epítopos) de TFPI humano y, opcionalmente, el complejo peptídico inhibe dos o más funciones de TFPI, tales como, sin limitación, la unión de TFPI a FXa y la unión de TFPI a FVIIa. El nivel de inhibición de al menos un TFPI (por ejemplo, TFPI-1) mediado por el complejo peptídico es mayor que el nivel de inhibición alcanzado por el primer péptido o el segundo péptido, solo o en combinación, en diversas realizaciones de la invención. Las diferentes regiones (epítopos) en TFPI pueden estar en el mismo polipéptido TFPI, o en diferentes polipéptidos TFPI. Las características funcionales y las aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico de los péptidos de unión a TFPI monoméricos descritos en este documento también son aplicables a los complejos peptídicos descritos en este documento. De manera similar, las descripciones de modificaciones a péptidos de unión a TFPI monoméricos también se relacionan con complejos peptídicos.

[0022] La invención proporciona un complejo de péptido que comprende un primer péptido que comprende la estructura de fórmula (XIII): X6001-X6002-X6003-X6004-X6005-X6006-X6007-X6008-X6009-X6010-X6011-X6012-X6013-X6014-X6015-X6016-X6017-X6018-X6019-X6020 (XIII) (SEQ ID NO: 3153). En la fórmula (XIII),

X6001 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, L, M, Y, 1Ni, Thi, Bta, Dopa, Bhf, C, D, G, H, I, K, N, Nmf, Q, R, T, V y W, tales como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en 1Ni, Bta, Dopa, F, L, Y y M;

X6002 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q, G y K, como Q;

X6003 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en C, D, E, M, Q, R, S, T, Ede (O), Cmc, A, Aib, Bhs, F, G, H, I, K, L, N, P, V, W e Y, tal como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, E, S, M, Q, R, T y C;

X6004 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Aib, E, G, I, K, L, M, P, R, W, Y, A, Bhk, C, D, F, H, k, N, Nmk, Q, S, T y V, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K, Aib, L, P, R, E, G, I, Y, M y W;

X6005 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en a, A, Aib, C, D, d, E, G, H, K, K, M, N, Nmg, p, Q, R, NpropilG, aze, pip, tic, oic, hyp, nma, Ncg, Abg, Apg, thz, dtc, Bal, F, L, S, T, V, W e Y, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en p, Nmg, NpropilG, aze, pip, tic, oic, hyp, a, Aib, D, d, G, H, K, K, N, Q, R, A, E, C y M;

X6006 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, C (NEM), D, E, G, H, K, M, N, Q, R, S, V, Cit, C (Acm), Nle, I, Ede (O), Cmc, Ecl, Eea, Eec, Eef, Nif, Eew, Aib, Btq, F, I, L, T, W e Y, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en C, E, K, R, S, V, C (Acm), Nle, C (NEM), I, Cit, A, D, G, H, N, Q y M;

X6007 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, V, T, Chg, Phg, Tie, A, F, G, I, K, L, Nmv, P, Q, S, W e Y, como Tie, V o I;

X6008 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, H, 1Ni, 2Ni, Pmy, Y y W, tal como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en H, 1Ni, 2Ni, Pmy, F e Y;

X6009 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Aib, V, Chg, Phg, Abu, Cpg, Tie, L-2-amino-4,4,4-ácido trifluorobutírico, A, f, I, K, S, T y V, como V, Abu o Tle;

X6010 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, D, d, E, F, H, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y, Nmd, C (NEM), Aib, G, I, L y Nmf, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, P, C, T, A, E, K, M, N, Q, R, F, H, S, V, W e Y;

X6011 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, a, G, p, Sar, c, hcy, Aib, C, K, G y Nmg, tales como G, a, c, hcy o Sar;

X6012 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste

n Y, Tym, Pty, Dopa y Pmy, tales como X6013 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Aib, C, F, 1Ni, Thi, Bta, A, E, G, H, K, Q, R, W e Y, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, 1Ni, Bta y C;

X6014 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, Aib, C, C (NEM), D, E, K, L, M, N, Q, R, T, V, Hcy, Bhe, F, G, H, I, P, S, W e Y, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Aib, C, E, Hcy, A, D, K, L, M, N, Q, R, T, V y Aib;

X6015 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R, (omega-metilo)-R, D, E y K, tales como

R;

X6016 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L, Hcy, Hle y Aml, tal como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L, Aml, Hle y Hcy;

X6017 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, a, Aib, C, c, Cha, Dab, Eag, Eew, H, Har, Hci, Hle, I, K, L, M, Nle, Nva, Opa, Orn, R, S, Deg, Ebc, Eca, Egz, Aic, Apc, Egt, (omega-metil)-R, Bhr, Cit, D, Dap, E, F, G, N, Q, T, V, W e Y, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, Aib, C, c, Aic, Eca, Deg, Cha, Dab, Dap, Eag, Eew, H, Har, Hci, Hle, K, Nle, Nva, Opa, Orn, R, I, L, S y M;

X6018 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, Aib, Hcy, hcy, C, c, L, Nle, M, N, R, Bal, D, E, F, G, H, I, K, Q, S, T, V, W e Y, tal como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, Aib, C, C, L, Hcy, N, M y R;

X6019 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K, R, Har, Bhk y V, tales como K; y

X6020 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K, L, Hcy, Aml, Aib, Bhl, C, F, G, H, I, Nml, Q, R, S, T, V, W e Y, tales como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L, Aml, Hcy y K.

[0023] El primer péptido, en diversas realizaciones descritas en la presente, comprende (o consiste en) una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8-978, 4022, 4024, 4032, 4036-4047, 4049-4078, 4086-4097, 4100-4127, 4129-4170, 4173-4195, 4200-4214, 4217-4225, 4228, 4230, 4231,4239, 4002, 4013, 4021,4023, 4025-4031,4033-4035, 4048, 4079-4085, 4098, 4099, 4128, 4171, 4172, 4196-4199, 4215, 4216, 4226, 4277, 4229, 4232 y 4233,

[0024] El segundo péptido, en un aspecto, comprende la estructura de fórmula (XIV): X7001-X7002-X7003-X7004-X7005-X7006-[X7007-X7008-X7009-X7010-X7011 -X7012-X7013-X7014-X7015-X7016-X7017-X7018]-X7019-X7020-X7021-X7022-X7023 (XIV) (SEQ ID NO: 3154). En la fórmula (XIV),

X7001 está presente o ausente, por lo que en el caso de que X7001 esté presente, es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, C(NEM), D, E, F, G, H, I, K, L, P, R, S, T, V y W, tales como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, F, G, H, K, L y S;

X7002 está presente o ausente, por lo que en el caso de que X7002 esté presente, es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, C(NEM), D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W e Y, tal como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en H, F, M y R;

X7003 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, F, I, K, L, R, S, T, V, W e Y, tal como F o Y;

X7004 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, G, I, K, L, R, S, T, V y W, tales como K;

X7005 es R o W, como W;

X7006 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, H, I, K, L, R, V y W, tales como F o H; X7007 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Orn, homoK, C, Hcy, Dap y K, tales como C o Hcy;

X7008 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, G, R, S y T, tal como A, G o S;

X7009 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en a, A, I, K, L, M, m, Moo, Nle, p, R, Sem y V, como M, Sem o V;

X7010 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, G, I, K, L, P, R, S, T y V, tales como K, P o R;

X7011 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, E, G,

S y T, tal como D;

X7012 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, a, D, d, E, e, F, f, G, I, K, L, 1, M, m, Moo, Nle, nle, P, p, R, r, S, s, Sem, T, t, V, v, W y w, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, L, l, M y Sem;

X7013 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, C(NEM), Con, Con(Meox), D, d, E, e, Eag, F, G, I, K, L, N, R, S, s, T, V y W, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, G, K y S;

X7014 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, G, I, K, L, M, R, S, T, V y W, tales como G;

X7015 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, G, I, K, L, M, Nle, R, S, T, V y W, como I o T;

X7016 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, I, K, L, M, Moo, Nle, R, S, Sem, T, V, W e Y, como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, F, M, Sem e Y;

X7017 es un aminoácido seleccionado del grupo que consta de A, D, E, F, G, I, K, L, R, S, T, V, WandY, tales como SORTE; X7018 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en C y D, como C;

X7019 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, F, I, L, S, T, V y W, tales como A o V; X7020 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F y W, como W;

X7021 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, L y V, como V;

X7022 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, G, I, K, L, P, R, S, T, V y W, tal como el grupo que consiste en F, L, K, R, P y W;

X7023 está presente o ausente, por lo que, en el caso de que X7023 esté presente, es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, C(NEM), Con, Con(Meox), D, E, Eag, F, G, I, K, L, R, S, T, V, W e Y, tal como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, F, M, S e Y; y el péptido comprende como una estructura cíclica generada por un enlace entre X7007 y X7018;

en donde el C-terminal del primer péptido está unido al N-terminal del segundo péptido a través de un resto enlazador;

en donde el primer péptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o 100% idéntico a la SEQ ID NO: 178 o SEQ ID NO: 4261; y

en donde el segundo péptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o 100% idéntico a la SEQ ID NO: 1044.

[0025] El segundo péptido, en algunas realizaciones descritas en este documento, comprende (o consiste en) una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1001-1336.

[0026] Los ejemplos de péptidos de unión a TFPI que se unen a diferentes epítopos de TFPI incluyen JBT1857, un ejemplo de la clase de péptidos JBT0047 (representados, por ejemplo, fórmulas (I)-(IV) y (XI) y ejemplos de los cuales se exponen en las Figuras 32, 62 y 65), y JBT1837, un ejemplo de la clase de péptidos JBT0120 (representados, por ejemplo, fórmulas (V)-(VII) y cuyos ejemplos se exponen en la Figura 34). Por lo tanto, la invención proporciona un complejo peptídico que comprende una subunidad peptídica (por ejemplo, un primer péptido) que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o 100% idéntico a la SEQ ID NO: 178 (JBT1857) o SEQ ID NO: 4261 (JBT2548). Además, la invención proporciona un complejo peptídico que comprende una subunidad peptídica (por ejemplo, un segundo péptido) que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o 100% idéntico a la SEQ ID NO: 1044 (JBT1837). Los dímeros peptídicos de unión al TFPI ejemplares incluyen JBT2496 (SEQ ID NO: 4211), JBT2547 (Se Q ID NO: 4260), JBT2521 (SEQ ID NO: 4242), JBT2522 (SEQ ID NO: 4243), JBT2523 (SEQ ID NO: 4244), y JBT2533 (SEQ ID NO: 4250).

[0027] El primer péptido y el segundo péptido (y péptidos opcionalmente adicionales) están unidos por un resto enlazador. Cualquier resto enlazador es adecuado para su uso en el contexto del complejo peptídico. El resto enlazador, en algunos aspectos de la invención, une una distancia de aproximadamente 1 A a aproximadamente 100 A, por ejemplo, aproximadamente 5 A a aproximadamente 80 A (aproximadamente 5 A a aproximadamente 50A), aproximadamente 10 A a aproximadamente 70 A (aproximadamente 10 A a aproximadamente 60 A, aproximadamente 10 A a aproximadamente 50 A, aproximadamente 10 A a aproximadamente 40 A, o aproximadamente 10 A a aproximadamente 30 A), en una de sus conformaciones. Por lo tanto, el enlazador es opcionalmente de aproximadamente 1 A a aproximadamente 100 A de longitud, por ejemplo, de aproximadamente 5 A a aproximadamente 50A o de aproximadamente 10 A a aproximadamente 30 A de longitud en una de sus conformaciones. También se contemplan enlazadores de mayor longitud (mayores de aproximadamente 100 A). Por ejemplo, los polímeros biocompatibles, que tienen opcionalmente un peso molecular de aproximadamente 2 kDa a aproximadamente 60 kDa, también se contemplan para uso en el complejo peptídico. Los ejemplos de polímeros biocompatibles incluyen, pero no se limitan a, p Eg , PSA, multímetro de prolina-alanina-serina y almidón de hidroxietil.

[0028] En un ejemplo no limitativo, el resto enlazador es una molécula con al menos dos grupos reactivos (antes de la conjugación a los péptidos primero y segundo) capaces de reaccionar con cada uno del primer péptido y el segundo péptido. En algunas realizaciones, el resto enlazador tiene solo dos grupos reactivos y es bifuncional. Los grupos reactivos son tanto nucleófilos como electrófilos o una combinación de grupos reactivos nucleófilos y electrófilos. Combinaciones no limitativas de grupos reactivos se muestran en la Figura 73. El resto enlazador puede contener elementos estructurales resultantes de una ligación química, como, por ejemplo, cisteína, oxima, hidrazida, succinimida, tioéter, triazol, amina secundaria, amida, disulfuro. En diversas realizaciones, el resto enlazador está unido al primer péptido y/o al segundo péptido a través de una oxima, una hidrazida, una succinimida, un tioéter, un triazol, una amina secundaria, una amida o un disulfuro. En la publicación de patente internacional n° WO 2011/143209 se proporciona una descripción adicional de los grupos enlazadores y los grupos reactivos.

[0029] Enlazadores hidrófobos también son adecuados para uso en el contexto de la invención. Los enlazadores hidrófobos son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Técnicas de Bioconjugado, GT Hermanson (Academic Press, San Diego, CA, 1996). Los restos enlazadores hidrófobos adecuados incluyen, por ejemplo, ácido 8-hidroxioctanoico y ácido 8-mercaptooctanoico. Los restos de enlaces hidrófilos tales como, por ejemplo, polialquilenglicol, también son adecuados para su uso en el contexto de la invención. En algunas realizaciones, el resto enlazador comprende una cadena de átomos de aproximadamente 1 a aproximadamente 60 átomos de longitud. En algunas realizaciones, los átomos de la cadena son todos átomos de carbono. En algunas realizaciones, los átomos de cadena en el esqueleto del enlazador se seleccionan del grupo que consiste en C, O, N y S. Los átomos de cadena y los enlazadores pueden seleccionarse de acuerdo con su solubilidad esperada (hidrofilicidad) para proporcionar un mayor complejo peptídico soluble.

[0030] En un aspecto, el resto enlazador comprende la estructura Z1-20, en el que Z es un bloque de construcción de oligómeros. Los ejemplos de bloques de construcción de oligómeros incluyen, pero no se limitan a, un aminoácido, hidroxiácido, etilenglicol, propilenglicol, o una combinación de cualquiera de los anteriores. Por ejemplo, el resto enlazador es opcionalmente un aminoácido, un dipéptido, un tripéptido o un polipéptido que comprende 4-20 aminoácidos. En algunas realizaciones, Z es G, s, S, a, A, Bal, Gaba, Ahx, Ttds, o una combinación de cualquiera de los anteriores (como el péptido ten-mer que comprende A, S, o una combinación de A y S). Si se desea, el resto de unión comprende una amina, éter, tioéter, maleimida, disulfuro, amida, éster, alqueno, cicloalqueno, alquino, tricoilo, carbamato, carbonato, catepsina B escindible o hidrazona.

[0031] Los términos "primer péptido" y "segundo péptido" no significan implicar un orden físico particular de los péptidos, sino simplemente para distinguir diferentes subunidades del complejo péptido. Las subunidades del complejo peptídico pueden unirse en cualquiera de varias configuraciones siempre que el primer péptido y el segundo péptido interactúen con el TFPI. Por ejemplo, el término C del primer péptido está conectado al término N del segundo péptido, el término N del primer péptido está conectado al término C del segundo péptido, el extremo N o C del primer (o segundo) péptido está conectado a un punto de unión interno en el segundo (o primer) péptido, o los péptidos primero y segundo están conectados a través de puntos de unión internos (es decir, puntos de unión ubicados dentro de la secuencia de aminoácidos del péptido y no en el extremo N o C). Los puntos de unión ejemplares para un resto de enlace en el primer péptido de fórmula (XIII) son el grupo amino N-terminal, el ácido carboxílico C-terminal, X6004, X6006, X60010 o X60014 a través de un grupo funcional apropiado en la cadena lateral de aminoácido, tales como, pero no limitados a, amina, ácido carboxílico, tiol, alqueno, alquino, azida, carbonilo, aminooxi, hidrazina y halógenos. Se puede usar más de un enlazador, por ejemplo, un primer resto de enlace está unido en el extremo N del primer péptido y el término C del segundo péptido, y un segundo resto de enlace (que puede ser el mismo tipo de resto o un tipo diferente de resto) se unen al término C del primer péptido y se unen al término N del segundo péptido. Si bien el análisis de las posibles configuraciones se refiere a los péptidos primero y segundo, se apreciará que los péptidos adicionales se pueden enlazar con los péptidos primero y segundo como se describe en el presente documento.

[0032] Los "derivados" están incluidos en la invención e incluyen complejos peptídicos de unión a TFPI que se han modificado químicamente de alguna manera distinta de la adición, eliminación o sustitución de aminoácidos. A este respecto, un péptido de la invención proporcionado en el presente documento está unido químicamente con polímeros, lípidos, otros restos orgánicos y/o restos inorgánicos. Ejemplos de modificaciones de péptidos y proteínas se dan en Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, (1996). Los péptidos de unión a TFPI descritos en el presente documento comprenden opcionalmente un grupo funcional que facilita la conjugación con otro resto (por ejemplo, un resto peptídico). Los grupos funcionales ejemplares incluyen, pero no se limitan a, isotiananato, isocianato, acil azida, NHS éster, cloruro de sulfonilo, aldehído, epóxido, oxirano, carbonato, agente de arilación, imidoéster, carbodiimida, anhídrido, derivados de haluro de alquilo (p.ej., derivados de haloacetilo), maleimida, aziridina, derivados de acriloilo, agentes de arilación, reactivos de intercambio de tiol-disulfuro (p.ej., piridil disulfuros o TNB tiol), diazoalcano, carboildiimadazol, N,N'-Disuccinil carbonato, N-Hidroxisuccinimidil cloroformato. El maleimido es útil, por ejemplo, para generar un complejo peptídico de unión a TFPI que se une con albúmina in vivo.

[0033] Los derivados se preparan en algunas situaciones para aumentar la solubilidad, la estabilidad, la absorción o la vida media en circulación. Varias modificaciones químicas eliminan o atenúan cualquier efecto secundario indeseable del agente. En un aspecto, la invención incluye péptidos de unión a TFPI modificados covalentemente para incluir una o más uniones de polímero solubles en agua. Un polímero soluble en agua (u otro resto químico) está unido a cualquier residuo de aminoácido, aunque en algunas realizaciones se prefiere la unión al extremo N o C. Opcionalmente, un polímero se une al péptido a través de uno o más aminoácidos o bloques de construcción que ofrecen grupos funcionales que facilitan la unión del polímero. Por ejemplo, JBT2315 comprende una cisteína C-terminal (posición X4021 con respecto a la fórmula (XI)), que facilita la adición de, por ejemplo, un polietilenglicol de maleimida (PEG). Los polímeros útiles incluyen, pero no se limitan a, PEG (por ejemplo, p Eg de aproximadamente 40 kD, 30 kD, 20 kD, 10, kD, 5 kD, o 1 kD de tamaño), polioxietilenglicol, polipropilenglicol, monometoxi-polietilenglicol, dextrano, hidroxietil almidón, celulosa, poli-(N-vinilpirrolidona)-polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, un copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, ácido polisialico (PSA), polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol) y alcohol polivinílico, así como mezclas de cualquiera de los anteriores. En un aspecto, el péptido de la invención es un péptido PEGilado. Los restos de PEG están disponibles en diferentes formas, por ejemplo, lineales o ramificadas. Para una discusión más detallada de los ajuntos de polímeros solubles en agua, véanse las patentes de EE.UU. 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192; y 4,179,337. Otros restos útiles para mejorar la vida media o la estabilidad del péptido se describen en el presente documento e incluyen, por ejemplo, albúmina (opcionalmente modificada para permitir la conjugación con el péptido de la invención), cadenas de ácido graso (por ejemplo, ácido graso C12-C18, como un ácido graso C14), un anticuerpo o fragmento del mismo (por ejemplo, una porción Fc de un anticuerpo), y multímeros de prolina-alanina-serina.

[0034] En otro aspecto, un derivado peptídico incluye un resto de direccionamiento específico para un determinado tipo de célula, tejido y/u órgano. Alternativamente, el péptido está unido a uno o más restos químicos que facilitan la purificación, detección, multimerización, unión con una pareja de interacción y caracterización de la actividad peptídica. Un resto químico ejemplar es la biotina. Otros restos adecuados para la conjugación con el complejo peptídico de unión a TFPI de la invención incluyen, entre otros, un fotosensibilizador, un colorante, un colorante de fluorescencia, un radionúclido, un complejo que contiene radionúclidos, una enzima, una toxina y agente citotóxico. Los fotosensibilizadores incluyen, por ejemplo, Photofrin, Visudyne, Levulan, Foscan, Metvix, Hexvix®, Cysview™, Laserphyrin, Antrin, Photoclor, Photosens, Photrex, Lumacan, Cevira, Visonac, BF-200 ALA y Amphinex. Si se desea, una etiqueta His, una etiqueta FLAG, una etiqueta estreptocócica o una etiqueta myc se conjugan con el péptido.

[0035] Además, en un aspecto, los complejos de péptidos de la invención se acilan en el aminoácido N-terminal del péptido. En otro aspecto, los complejos peptídicos de la invención están amidados en el aminoácido C-terminal del péptido. En otro aspecto adicional, los complejos peptídicos de la invención se acilan en el aminoácido N-terminal del péptido y se amidan en el aminoácido C-terminal del péptido.

[0036] Los derivados también incluyen péptidos que comprenden aminoácidos modificados o no proteinogénicos o un grupo enlazador modificado (véase, por ejemplo, Grant, Péptidos sintéticos: Guía del usuario, Oxford University Press (1992)). Los aminoácidos modificados incluyen, por ejemplo, aminoácidos en los que el grupo amino y/o carboxilo se reemplaza por otro grupo. Los ejemplos no limitantes incluyen aminoácidos modificados que incorporan tioamidas, ureas, tioureas, acilhidracidas, ésteres, olefinas, sulfonamidas, amidas de ácido fosfórico, cetonas, alcoholes, amidas de ácido borónico, benzodiazepinas y otros heterociclos aromáticos o no aromáticos (ver Estiarte et al., Burgers Medicinal Chemistry, 6a edición, Volumen 1, Parte 4, John Wiley & Sons, Nueva York (2002)). Los aminoácidos modificados a menudo se conectan al péptido con al menos uno de los grupos funcionales mencionados anteriormente en lugar de un enlace amida. Los aminoácidos no proteinogénicos incluyen, pero no se limitan a, p-alanina (Bal), norvalina (Nva), norleucina (Nle), ácido 4-aminobutírico (Y-Abu), ácido 2-aminoisobutírico (Aib), ácido 6-aminohexanoico (£-Ahx), ornitina (Orn), hidroxiprolina (Hyper), taurina, sarcosina, citrulina (Cit), ácido cisteico (Coh), ciclohexilalanina (Cha), metioninasulfóxido (Meo), metioninasulfona (Moo)), homoserina metilester (Hsm), proparglilglicina (Eag), 5-fluorotriptofan (5Fw), 6-fluorotriptofan (6Fw), 3',4'-dimetoxifenil-alanina (Ear), 3',4'-difluorofenilalanina (Dff), 4'-fluorofenil-alanina (Pff), 1-naftil-alanina (1Ni), 1-metiltriptófano (1Mw), penicilamina (Pen), homoserina (Hse), t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina (Phg), benzotienilalanina (Bta), L-homo-cisteína (Hcy), N-metil-fenilalanina (Nmf), 2-tienilalanina (Thi), 3,3-difenilalanina (Ebw), homofenilalanina (Hfe) y S-bencil-L-cisteína (Ece). Las estructuras de muchos de los aminoácidos no proteogénicos se proporcionan en la Tabla 2, Estos y otros aminoácidos no proteogénicos pueden existir como isómeros D o L. Los ejemplos de enlazadores modificados incluyen, pero no están limitados al enlazador flexible 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanodiamina (Ttds), glicina, ácido 6-aminohexanoico, beta-alanina (Bal), ácido pentinoico (Pyn), y combinaciones de Ttds, glicina, ácido 6-aminohexanoico y Bal.

[0037] Los homólogos de los aminoácidos que constituyen los péptidos de la invención pueden ser los que se exponen en la Tabla 3. En cualquier realización, uno o más aminoácidos del complejo de péptido de unión a TFPI están sustituidos con un homólogo.

TABLA 3

[0038] Los derivados también incluyen péptidos que comprenden aminoácidos que tienen sustituyentes modificados, tales como aminoácidos modificados por halogenación con, por ejemplo, flúor, cloro, yodo o bromo. En algunas realizaciones, el complejo de péptido de unión a TFPI comprende un aminoácido aromático halogenado, tal como fenilalanina.

[0039] En algunas realizaciones, los enlaces de péptido (CO-NH) que unen los aminoácidos dentro del péptido de la invención se invierten para crear un péptido "retro-modificado", es decir, residuos de aminoácido que comprenden péptido reunidos en la dirección opuesta (enlaces NH-CO) en comparación con el péptido de referencia. El péptido retro-modificado comprende la misma quiralidad de aminoácidos que el péptido de referencia. Un péptido "inversomodificado" es un péptido de la invención que comprende residuos de aminoácidos ensamblados en la misma dirección que un péptido de referencia, pero la quiralidad de los aminoácidos está invertida. Por lo tanto, cuando el péptido de referencia comprende L-aminoácidos, el péptido "inverso-modificado" comprende D-aminoácidos, y viceversa. Los péptidos modificados inversamente comprenden enlaces péptido CO-NH. Un péptido "retro-inverso modificado" se refiere a un péptido que comprende residuos de aminoácidos ensamblados en la dirección opuesta y que tienen quiralidad invertida. Un análogo retro-inverso ha invertido los extremos y la dirección invertida de los enlaces peptídicos (es decir, NH-CO), mientras mantiene aproximadamente la topología de la cadena lateral encontrada en el péptido de referencia. Los peptidomiméticos retroinversos se fabrican utilizando métodos estándar, incluidos los métodos descritos en Meziere et al, J. Immunol., 159, 3230-3237 (1997). Los péptidos retroinversores parciales son péptidos en los que solo una parte de la secuencia de aminoácidos se invierte y se reemplaza con residuos de aminoácidos enantioméricos.

[0040] Los péptidos de unión a TFPI de la invención (incluidos los péptidos inhibidores de TFPI) se fabrican de diversas formas. En un aspecto, los péptidos se sintetizan mediante técnicas de síntesis en fase sólida que incluyen las descritas en Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85, 2149 (1963); Davis et al., Biochem. Intl., 10, 394-414 (1985); Larsen y otros, J. Am. Chem. Soc., 115, 6247 (1993); Smith y col., J. Peptide Protein Res., 44, 183 (1994); O'Donnell y otros, J. Am. Chem. Soc., 118, 6070 (1996); Stewart and Young, Síntesis de péptidos en fase sólida, Freeman (1969); Finn et al., The Proteins, 3a ed., Vol. 2, pp. 105-253 (1976); y Erickson et al., The Proteins, 3a ed., vol. 2, pp. 257-527 (1976). Alternativamente, el péptido de unión a TFPI (por ejemplo, el péptido inhibidor de TFPI) se expresa de forma recombinante introduciendo un ácido nucleico que codifica un péptido de unión a TFPI (por ejemplo, un péptido inhibidor de TFPI) en células huésped, que se cultivan para expresar el péptido. Dichos péptidos se purifican del cultivo celular utilizando técnicas estándar de purificación de proteínas.

[0041] Cualquiera de los complejos de péptidos de la invención o ácidos nucleicos que codifican los péptidos también se proporciona en una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica). A este respecto, el complejo peptídico se formula con un vehículo, tampón, excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable (es decir, farmacológicamente aceptable), como se describe más adelante en este documento. Opcionalmente, el péptido está en forma de una sal fisiológicamente aceptable, que está incluida en la invención. "Sales fisiológicamente aceptables" significa cualquier sal que sea farmacéuticamente aceptable. Algunos ejemplos de sales apropiadas incluyen acetato, clorhidrato, bromhidrato, sulfato, citrato, tartrato, glicolato y oxalato. Si se desea, la composición comprende uno o más agentes farmacéuticamente efectivos adicionales.

[0042] El complejo de péptido proporcionada en este documento, opcionalmente, inhibe al menos un TFPI-1 (por ejemplo, TFPI-1a o TFPI-1p actividad) tales como, pero no limitado a, una actividad que regula a la baja la cascada de coagulación de la sangre. Sin estar limitado por ningún mecanismo específico de acción, un mecanismo de inhibición propuesto puede implicar la prevención de la formación del complejo cuaternario TF-FVIIA-FXA-TFPI. El péptido puede inhibir la unión (competitiva o alostérica) de TFPI a FXa (por ejemplo, inhibir la unión del dominio 2 de TFPI Kunitz al Factor Xa o interrumpir la unión del dominio 1 de TFPI Kunitz a un exosito del Factor Xa), el complejo TF/FVIIa (por ejemplo, inhibir la unión del dominio 1 de TFPI Kunitz al complejo TF/FVIIa), TF solo y/o FVIIa solo. Con la disminución de la actividad de TFPI, TF y FVIIa son libres de activar Fx que, a su vez, mejora la conversión de protrombina en trombina. Sorprendentemente, en una realización, el péptido de la invención que se une al dominio 1 de Kunitz interfiere con la inhibición de FXa mediada por TFPI. Por lo tanto, la invención proporciona un método para, por ejemplo, inhibir la regulación descendente mediada por TFPI de la vía extrínseca y/o común de la cascada de coagulación y/o mejorar la conversión mediada por FXa de protrombina a trombina, administrando a un sujeto un complejo de péptidos descrito en la presente memoria que se une Kunitz dominio 1.

[0043] En un aspecto, el complejo de péptido de la invención exhibe actividad antagonista de TFPI en los sistemas y/o modelos plasmáticos. Un sistema modelo ejemplar para determinar la actividad inhibidora de TFPI es el ensayo de tenasa extrínseca, que prueba la capacidad de los péptidos candidatos para restaurar la activación de FX mediada por el complejo extrínseco en presencia de TFPI (que es un inhibidor natural de la reacción de activación de FX) (ver, por ejemplo, Lindhout et al., Thromb. Haemost., 74, 910-915 (1995)). Otro sistema modelo para caracterizar la actividad inhibidora de TFPI es el ensayo de inhibición de FXa, en el que la actividad de FXa se mide en presencia de TFPI (véase Sprecher et al., PNAS, 91, 3353-3357 (1994)). El ensayo de tenasa extrínseca y el ensayo de inhibición de FXa se describen más detalladamente en el Ejemplo 3. Opcionalmente, el complejo peptídico de la invención aumenta la activación de FX en presencia de TFPI con una concentración media efectiva máxima (CE50) menor o igual a 1 x 10'4 M, menos que o igual a 1 x 10'5 M, menos que o igual a 1 x 10'6 M, o menos que o igual a 1 x 10'7 M.

[0044] en un aspecto, la actividad TFPI-antagonista se caracteriza en un ensayo basado en plasma. La formación de trombina se activa en el plasma que carece sustancialmente de actividad de FVIII o FIX (por ejemplo, la actividad del factor de coagulación residual es inferior al 1%) en presencia de un péptido candidato. La formación de trombina se puede detectar utilizando un sustrato fluorogénico o cromogénico, como se describe en el Ejemplo 4. Trombinoscopio BV proporciona un sistema para medir la actividad de la trombina (Maastricht, Países Bajos). La conversión de protrombina se mide utilizando, por ejemplo, un Thrombograph™ (Thermo Scientific, Waltham, MA), y los datos resultantes se compilan en un Trombograma Automático Calibrado generado por el software Thrombinoscope™ disponible en Thrombinoscope BV. En ciertas realizaciones, el complejo de péptidos inhibidores de TFPI aumenta la cantidad de trombina pico generada durante el ensayo y/o disminuye el tiempo requerido para lograr la formación máxima de trombina. Por ejemplo, el complejo peptídico mejora la generación de trombina regulada por TFPI en ausencia de FVIII (por ejemplo, en plasma empobrecido en FVIII) a al menos el 1% del nivel de generación de trombina dependiente de TFPI en plasma normal. En general, el plasma normal (no afligido) contiene de aproximadamente 0,5 U/ml a aproximadamente 2 U/ml de Factor VIII. Por consiguiente, en algunos casos, un complejo de péptido de unión a TFPI (por ejemplo, péptido inhibidor de TFPI) potenciará la formación de trombina en ausencia de FVIII a al menos aproximadamente el 1% del observado en presencia de 0,5 U/mL a 2 U/mL FVIII. En realizaciones adicionales, el péptido aumenta la formación de trombina en ausencia del Factor VIII a al menos aproximadamente el 2%, al menos aproximadamente el 3%, al menos aproximadamente el 5%, al menos aproximadamente el 7%, o al menos aproximadamente el 10% del nivel de formación de trombina en plasma normal, es decir, en presencia de niveles fisiológicos de Factor VIII. En diversos aspectos, el péptido se administra a un modelo animal de deficiencia de trombina o hemofilia para caracterizar la actividad inhibidora de TFPI in vivo. Tales modelos in vivo son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, ratones a los que se les administraron anticuerpos anti-FVIII para inducir la hemofilia A (Tranholm et al., Blood, 102, 3615-3620 (2003)); modelos de eliminación del factor de coagulación como, entre otros, ratones eliminados con FVIII (Bi et al., Nat. Genet., 10 (1), 119-121 (1995)) y ratones eliminados con FIX (Wang et al., PNAS, 94 (21), 11563-66 (1997)); hemofilia-A inducida en conejos (Shen et al., Blood, 42 (4), 509-521 (1973)); y los perros de Chapel Hill HA (Lozier et al., PNAS, 99, 12991-12996 (2002)).

[0045] Varios péptidos se unen TFPI de cualquier fuente incluyendo, pero sin limitarse a, ratón, rata, conejo, perro, gato, vaca, caballo, cerdo, conejillo de indias, y primates. En una realización, el complejo peptídico se une a TFPI humano. Opcionalmente, el complejo péptido de unión a TFPI (p.ej., péptido inhibidor de TFPI) se une a TFPI de más de una especie (es decir, el péptido tiene reactividad cruzada entre múltiples especies). En ciertos aspectos, el péptido se une a TFPI con una constante de disociación (Kd) menor o igual que 1 x 10'4 M, menor o igual que 1 x 10'5 M, menor o igual que 1 x 10'6 M, o menor que o igual a 1 x 10'7 M. La afinidad se puede determinar usando, por ejemplo, y sin limitación, una, dos o más de una variedad de técnicas, como el ensayo de afinidad de ELISA, un ensayo de ELISA competitivo y/o un ensayo de resonancia de plasmón de superficie (BIAcore™). Cuando se caracteriza usando un ensayo ELISA competitivo (CI50), el péptido de la invención demuestra opcionalmente un CI50 menor o igual a aproximadamente 50.000 nM. Por ejemplo, el péptido demuestra una CI50 menor o igual a aproximadamente 10.000 nM, tal como una CI50 menor o igual a aproximadamente 5.000 nM, menor o igual a aproximadamente 1.000 nM, o menor o igual a aproximadamente 500 nM. En un aspecto, el péptido demuestra una CI50 menor o igual a aproximadamente 250 nM, menor o igual a aproximadamente 100 nM, menor o igual a aproximadamente 50 nM, o menor o igual a aproximadamente 10 nM. Los péptidos ejemplares y sus valores de CI50 se proporcionan en las Figuras 32-39; en algunos casos, los péptidos se clasifican en los Grupos A, B, C, D, E, F y G (consulte la Tabla 4 en el Ejemplo 1) en función de sus valores de CI50, En diversos aspectos, la invención proporciona péptidos que pertenecen a los Grupos A, B, C, D, E, F y/o G como se define en la Tabla 4, La afinidad también puede determinarse mediante un método cinético o un método de equilibrio/solución. Tales métodos se describen con más detalle en el presente documento o se conocen en la técnica.

[0046] Otro ensayo adecuado para la caracterización de los péptidos de la invención es un ensayo kapagado, que examina la liberación de un péptido de TFPI. El resultado del ensayo Kapagado no es la constante de velocidad de disociación, pero un porcentaje de péptido competidor bloqueado de TFPI de unión por un péptido de prueba después de un periodo de incubación con TFPI. Un ensayo Kapagado ejemplar incluye los siguientes pasos: 1) incubación de una placa de microtitulación recubierta con TFPI con una cantidad de péptido de prueba que resulta en aproximadamente el 90% de ocupación de TFPI; 2) eliminación del péptido de ensayo no unido; 3) adición de un péptido trazador biotinilado (es decir, competidor) que compite con el péptido de ensayo para unirse al TFPI; 4) incubación durante un período de tiempo durante el cual los sitios de unión liberados por el péptido de ensayo están ocupados por el marcador; 5) eliminación del trazador no unido y del péptido de ensayo; y 6) detección del trazador unido mediante una reacción cromogénica usando un conjugado de peroxidasa estreptavidina-rábano picante. La señal resultante es indicativa de los sitios de unión liberados por el péptido de ensayo. Un péptido de ensayo que no se disocia del TFPI durante el período de incubación produce una señal más débil en comparación con un analito que se disocia completamente.

[0047] Al igual que con todos los agentes de unión y ensayos de unión, un experto en la técnica reconoce que los diversos restos a los que un agente de unión debe unirse no de forma detectable con el fin de ser biológicamente (por ejemplo, terapéuticamente) eficaces serían exhaustivos y sería poco prácticos enumerarlos. Por lo tanto, el término "se une específicamente" se refiere a la capacidad de un péptido para unirse a TFPI con mayor afinidad que a una proteína de control no relacionada que no es TFPI. Por ejemplo, el péptido puede unirse a TFPI con una afinidad que es al menos 5, 10, 15, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000 o 10.000 veces mayor que la afinidad por una proteína de control. En algunas realizaciones, el péptido se une al TFPI con mayor afinidad que a una "anti-diana", una proteína u otra sustancia natural en los humanos a la que la unión del péptido podría conducir a efectos adversos. Varias clases de péptidos o proteínas son posibles anti-dianas. Debido a que los péptidos inhibidores de TFPI ejercen su actividad en el torrente sanguíneo y/o en el endotelio, las proteínas plasmáticas representan posibles anti-dianas. Las proteínas que contienen dominios Kunitz (Kd) son potenciales antipirales porque las kD de diferentes proteínas comparten una similitud significativa. El inhibidor de la ruta del factor tisular-2 (TFPI-2) es muy similar al TFPI-1a y, al igual que el TFPI-1a, contiene kD (Sprecher et al., PNAS, 91, 3353-3357 (1994)). Por lo tanto, en un aspecto, el péptido de la invención se une al TFPI con una afinidad que es al menos 5, 10, 15, 25 o 50 veces mayor que la afinidad por una anti-diana, como el TFPI-2.

[0048] Opcionalmente, el complejo de péptido de unión a TFPI demuestra una o más características deseadas descritas en este documento, y la secuencia de aminoácidos de un péptido se puede modificar para optimizar la unión, estabilidad y/o actividad, si se desea. Un ejemplo de complejo peptídico de unión a TFPI se une a TFPI con una kD menor o igual a 20 nM y/o exhibe una afinidad de unión por TFPI que es al menos 100 veces mayor que la afinidad de unión por una anti-diana. Alternativamente o además, el complejo peptídico de unión a TFPI mejora la activación de FX en presencia de TFPI con un CE50 (medido usando cualquier ensayo adecuado, como los ensayos descritos aquí) de menos de o igual a 50 nM y/o mejora la formación de trombina en ausencia de Factor VIII a al menos aproximadamente el 20% (por ejemplo, 40%) del nivel de formación de trombina en plasma que contiene niveles fisiológicos de Factor VIII. Alternativamente o además, el complejo de péptidos de unión a TFPI logra un nivel deseado de estabilidad en plasma (por ejemplo, el 50% o más de una dosis permanece en plasma después de 12 horas) y/o demuestra una vida media deseada in vivo (por ejemplo, al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez horas). Alternativamente o además, el complejo peptídico de unión a TFPI exhibe un nivel deseado de biodisponibilidad, tal como un nivel deseado de biodisponibilidad después de la administración subcutánea (por ejemplo, mayor o igual al 5%, 10%, 15%, 20%, 25%), 30%, o 50%) y/o demuestra un nivel deseado de actividad inhibidora de TFPI a una dosis dada in vivo.

[0049] La invención incluye además un método de inhibición in vitro de TFPI-1. El método comprende poner en contacto TFPI con un complejo peptídico de unión a TFPI como se describe en el presente documento. Se contempla cualquier grado de inhibición de la actividad de TFPI. Por ejemplo, un complejo de péptido de unión a TFPI (por ejemplo, péptido inhibidor de TFPI) reduce la inhibición de TFPI de la vía extrínseca al menos aproximadamente el 5% (por ejemplo, al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 25% o al menos aproximadamente el 30%). En algunas realizaciones, el complejo de péptido de unión a TFPI (por ejemplo, péptido inhibidor de TFPI) reduce la actividad de TFPI dentro de la ruta extrínseca al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 75%, o al menos aproximadamente el 90% en comparación con la actividad del TFPI en ausencia del péptido.

[0050] En un aspecto de la invención, complejos de péptido de unión a TFPI se utilizan para detectar y/o cuantificar TFPI in vitro. Un método ejemplar para detectar y/o cuantificar TFPI en una muestra comprende (a) poner en contacto una muestra con un complejo peptídico de unión a TFPI de la invención, y (b) detectar la unión del complejo peptídico de unión a TFPI a TFPI.

[0051] La invención incluye además un método in vitro para dirigir estructuras biológicas (incluyendo, pero no limitado a las superficies celulares y revestimiento endotelial) donde se encuentra TFPI. El método comprende poner en contacto la estructura biológica (por ejemplo, incluyendo, sin limitación, una célula que muestra TFPI en la superficie celular) con un complejo peptídico de unión a TFPI descrito en el presente documento, opcionalmente conjugado a un resto que añade funcionalidad adicional al péptido. El resto puede ser un colorante (como un colorante de fluorescencia), un radionúclido o un complejo que contiene radionúclidos, una proteína (por ejemplo, una enzima, una toxina o un anticuerpo) o un agente citotóxico. Por ejemplo, el péptido está unido o conjugado a un resto efector que facilita la detección y/o purificación de péptidos y/o comprende propiedades terapéuticas. En un aspecto, el complejo peptídico de unión a TFPI o el conjugado de complejo peptídico se usa en un método in vivo, y se administra a un mamífero para dirigirse a una célula que presenta TFPI dentro del mamífero. Opcionalmente, el método comprende además detectar la unión del complejo peptídico de unión a TFPI a TFPI. El método es útil para la terapia y el diagnóstico de enfermedades donde el TFPI es un marcador de diagnóstico adecuado o las células que expresan el TFPI son una diana para un enfoque terapéutico.

[0052] Complejos de péptido-TFPI se detectan directamente o indirectamente in vitro. Los restos de detección se usan ampliamente en la técnica para identificar sustancias biológicas e incluyen, por ejemplo, colorantes (por ejemplo, colorantes fluorescentes), radionúclidos y complejos que contienen radionúclidos y enzimas. En algunos aspectos, la unión péptido-TFPI se detecta indirectamente. A este respecto, el péptido se pone en contacto opcionalmente con una pareja de interacción que se une al péptido de la invención sin interferir significativamente con la unión del péptido-TFPI, y se detecta la pareja de interacción. Las parejas de interacción ejemplares incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno, anticalinas y miméticos de anticuerpos, aptámeros, estreptavidina, avidina, neutravidina y spiegelmers. Opcionalmente, el compañero de interacción comprende un resto de detección para facilitar la detección de un complejo péptido de pareja de interacción. El complejo peptídico de unión a TFPI se modifica, en algunas realizaciones, para facilitar la unión de una pareja de interacción. Por ejemplo, en un aspecto, el complejo peptídico de unión a TFPI se conjuga con biotina, que está unida por una pareja de interacción que comprende estreptavidina. Una pareja de interacción ejemplar comprende estrepavidina fusionada con peroxidasa de rábano picante, que se detecta en, por ejemplo, un ensayo similar a ELISA. Alternativamente, el complejo peptídico de unión a TFPI se modifica para incluir un epítopo de anticuerpo, y se detecta la unión del anticuerpo correspondiente al complejo péptido-TFPI. Los métodos de detección, por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de los mismos, son bien conocidos en la técnica.

[0053] Complejos de péptido-TFPI y complejos de interacción pareja-péptido se identifican mediante cualquiera de una serie de métodos, tales como, pero no limitado a, ensayos bioquímicos (por ejemplo, ensayos enzimáticos), espectroscopía (por ejemplo, la detección basada en la densidad óptica, fluorescencia, FRET, BRET, TR-FRET, polarización de fluorescencia, electroquimioluminiscencia o RMN), tomografía por emisión de positrones (PET) y tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT). Los restos detectables que facilitan la detección de fluorescencia de complejos péptido-TFPI o complejos de interacción péptido-pareja incluyen, pero no se limitan a, fluoresceína, Alexa Fluor® 350, Marina BlueTM, Cascade Yellow™, Alexa Fluor® 405, Pacific BlueTM, Pacific Orange™, Alexa Fluor® 430, Alexa Fluor® 488, Oregon Green® 488, Alexa Fluor® 500, Oregon Green® 514, Alexa Fluor® 514, Alexa Fluor® 532, Alexa Fluor® 555, TetrametilRodamina, Alexa Fluor® 546, Rodamina B, Rodamina RedTM-X, Alexa Fluor® 568, Alexa Fluor® 594, Texas Red®, Texas Red®-X, Alexa Fluor® 610, Alexa Fluor® 633, Alexa Fluor® 635, Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 660 Alexa Fluor® 680, Alexa Fluor® 700, Alexa Fluor® 750, B-Ficoeritrina, R-Ficoeritrina, Aloficocuanina, BODIPY®, Cy3, Cy5, TAMRA, y proteínas fluorescentes (GFP y derivados de las mismas).

Un ejemplo de un péptido de unión a TFPI que comprende un resto de detección fluorescente es JBT2454 (FAM-Ttds-FQSKpNVHVDGYFERL-Aib-AKL-NH2 (SEQ ID NO: 4171)), que está marcado con 5,6-carboxifluoresceína.

[0054] Los marcadores radiactivos también se utilizan para detectar materiales biológicos (por ejemplo, TFPI, péptidos de unión a TFPI, o complejos péptido-TFPI de unión a TFPI), y, en algunos casos, se unen a péptidos o parejas de interacción utilizando un quelante, como (pero no limitado a) EDTA (ácido etilendiaminotetraacético), d TpA (ácido pentaacético dietilentriamina), CDTA (ciclohexil 1,2-diamina ácido tetra-acético), EGTA (etilenglicol-O,O'-bis(2-aminoetil)-N,N,N',N'-tetraacético), HBED (N,N-bis("hidroxibencil)-etilendiamina-N,N'-ácido diacético), Tt Ha (trietilentetramina ácido hexaacético), DOTA (1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N”,N”“-tetra-ácido acético), HEDTA (ácido triacético de hidroxietildiamina), o TETA (1,4,8,11-tetra-azaciclotetradecano-N,N',N”,N”“-ácido tetra-acético). Ejemplos de marcadores radiactivos incluir 99mTc, 203Pb, 66Ga, 67Ga, 68Ga, 72As, 111In, 113mIn, 114mIn, 97Ru, 62Cu, 64Cu, 52Fe, 52mMn, 51Cr, 186Re, 188Re, 77As, 90Y, 67Cu, 169Er, 117mSn, 121Sn, 127Te, 142Pr, 143Pr, 198Au, 199Au, 149Tb, 161Tb, 109Pd, 165Dy, 149Pm, 151Pm, 153Sm, 157Gd, 166Ho, 172TM, 169Yb, 175Yb, 177Lu, 105Rh y 111Ag. Los metales paramagnéticos también son restos detectables que son adecuados para unirse a péptidos de unión a TFPI o parejas de interacción, opcionalmente a través de un complejo quelante. Los ejemplos de metales paramagnéticos incluyen, por ejemplo, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Pr, Nd, Sm, Yb, Gd, Tb, Dy, Ho y Er.

[0055] Los complejos peptídicos de unión a TFPI, en sí mismos, se modifican, en algunos aspectos, para incluir uno o más aminoácidos con sustituyentes o nucleidos detectables. A este respecto, en una realización, el complejo peptídico de unión a TFPI comprende al menos un aminoácido que comprende un isótopo detectable (por ejemplo, 13C, 14C, 35S, 3H, 18O o 15N), y/o aminoácido halogenado con, por ejemplo, 123I, 124I, 125I, 1311,75Br, 76Br, 77Br o 82Br. Los aminoácidos adecuados para la halogenación incluyen, pero no se limitan a tirosina y triptófano.

[0056] La invención proporciona también complejos de péptido de unión a TFPI para uso en un método para el diagnóstico de un sujeto que padece una enfermedad o trastorno, o está en riesgo de padecer una enfermedad o trastorno, en el que la enfermedad o trastorno está asociado con o causado por actividad aberrante de TFPI. El método comprende administrar al sujeto el complejo de péptido de unión a TFPI y detectar el complejo de péptido de TFPI. En algunos casos, el péptido se conjuga con un resto detectable, y el método comprende detectar el resto detectable. Los restos detectables ejemplares se describen en este documento. En otros casos, el método comprende administrar al sujeto una pareja de interacción del complejo péptido de unión a TFPI que se une al péptido de unión a TFPI, y detectar la pareja de interacción. Si se desea, la pareja de interacción comprende o se conjuga con un resto detectable, y se detecta el resto detectable. La presencia del resto detectable indica la presencia de TFPI, lo que permite el diagnóstico de una enfermedad o trastorno asociado con TFPI (por ejemplo, una enfermedad o trastorno que (i) puede tratarse mediante la inhibición de TFPI o (ii) comprende síntomas que pueden mejorarse o prevenirse por inhibición de TFPI). Si no se desea la administración del péptido al sujeto, se obtiene una muestra biológica del sujeto, se pone en contacto con el complejo peptídico de unión a TFPI como se describe en el presente documento, y se detectan complejos de péptido de TFPI.

[0057] Los péptidos de la invención se unen a TFPI y, por lo tanto, son útiles para purificación de TFPI o TFPI recombinante a partir de una muestra biológica (por ejemplo, un fluido biológico, tal como suero), extracto de fermentación, preparaciones de tejido, medio de cultivo, y similares. La invención incluye métodos para usar el complejo peptídico de unión a TFPI en la producción comercial de TFPI o en un método para caracterizar moléculas de TFPI. Por ejemplo, la invención incluye un método para purificar TFPI. El método comprende poner en contacto una muestra que contiene TFPI con un péptido como se define en el presente documento en condiciones apropiadas para formar un complejo entre el TFPI y el péptido; retirar el complejo de la muestra; y, opcionalmente, disociar el complejo para liberar TFPI. Las condiciones ejemplares apropiadas para formar un complejo entre el TFPI y el péptido se describen en los Ejemplos, y tales condiciones pueden modificarse fácilmente para disociar el complejo TFPI-péptido. En algunas realizaciones, el péptido se inmoviliza en un soporte, por ejemplo, un soporte sólido, para facilitar la recuperación de TFPI. Por ejemplo, en una realización, el péptido se inmoviliza a la fase estacionaria de cromatografía (por ejemplo, sílice, perlas de cromatografía de afinidad o resinas de cromatografía), una muestra que comprende TFPI se aplica a la fase estacionaria de manera que se forman complejos de péptidos TFPI, el resto de la muestra se retira de la fase estacionaria y el TFPI se eluye de la fase estacionaria. A este respecto, los péptidos de la invención son, en un aspecto, adecuados para uso en técnicas de cromatografía de afinidad.

[0058] La invención proporciona también complejos de péptido de unión a TFPI para su uso en un método para mejorar la formación de trombina en un sujeto con déficit de factores de coagulación. El método comprende administrar al sujeto un péptido proporcionado en el presente documento en condiciones eficaces para inhibir el TFPI. A este respecto, el complejo peptídico de unión a TFPI se administra en una cantidad y en condiciones eficaces para potenciar la formación de trombina en el sujeto. Por "deficiencia del factor de coagulación" se entiende que el sujeto padece una deficiencia en uno o más factores sanguíneos necesarios para la formación de trombina, como FVIII, FIX o FXI. De hecho, en una realización, el sujeto es deficiente en FVIII. Alternativamente o además, el sujeto es deficiente en Factor IX. Las deficiencias del factor de coagulación se identifican al examinar la cantidad de factor en una muestra clínica. Los profesionales clasifican la hemofilia según la magnitud de la deficiencia del factor de coagulación. Los sujetos que padecen hemofilia leve tienen aproximadamente del 5% al 30% de la cantidad normal (1 U/ml) de Factor VIII o Factor IX. La hemofilia moderada se caracteriza por aproximadamente del 1% al 5% de los niveles normales de Factor VIII, Factor IX o Factor XI, mientras que los sujetos que padecen hemofilia grave tienen menos del 1% de la cantidad normal de Factor VIII, Factor IX o Factor XI. Las deficiencias se pueden identificar indirectamente mediante la prueba del tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT). La prueba APTT mide el tiempo requerido para que se forme un coágulo de sangre, que es más largo para los pacientes con Deficiencia del Factor VIII (hemofilia A), Deficiencia del Factor IX (hemofilia B) y Deficiencia del Factor X i (hemofilia C) en comparación con pacientes con niveles normales de factor de coagulación. Casi el 100% de los pacientes con deficiencia grave y moderada de Factor VIII pueden ser diagnosticados con un APTT. La invención incluye, además, potenciar la formación de trombina en un sujeto que no sufre una deficiencia de factor de coagulación. El método comprende administrar a un sujeto (por ejemplo, un sujeto que comprende niveles normales, fisiológicos de factor de coagulación) un péptido proporcionado en el presente documento en condiciones efectivas para mejorar la formación de trombina.

[0059] En un aspecto, el complejo de péptido de unión a TFPI se utiliza para incrementar la formación de coágulos de sangre en un sujeto. El método para aumentar la formación de coágulos sanguíneos comprende administrar al sujeto un péptido descrito en el presente documento en una cantidad y en condiciones eficaces para aumentar la formación de coágulos sanguíneos. Se apreciará que el método no necesita restaurar completamente la cascada de coagulación para lograr un efecto beneficioso (por ejemplo, terapéutico). Se contempla cualquier aumento o incremento de la trombina o la formación de coágulos sanguíneos que reduzca la aparición o la gravedad de los síntomas asociados con las deficiencias del factor de coagulación. Los métodos para determinar la eficacia del método para promover la formación de trombina y la coagulación sanguínea son conocidos en la técnica y se describen en el presente documento.

[0060] La invención proporciona además complejos de péptido de unión a TFPI para uso en un método de tratamiento de un trastorno de sangre coagulada en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto uno o más complejos de péptidos de unión a TFPI, tales como uno cualquiera o más de los complejos peptídicos descritos en el presente documento, en una cantidad y en condiciones eficaces para tratar el trastorno de coagulación de la sangre en el sujeto. En un aspecto, el complejo peptídico es un complejo peptídico recombinante o sintético que inhibe la actividad de TFPI. Los "trastornos de la coagulación" incluyen trastornos hemorrágicos causados por una actividad deficiente del factor de coagulación de la sangre y una actividad plaquetaria deficiente. Los factores de coagulación de la sangre incluyen, entre otros, Factor V (FV), FVII, FVIII, FIX, fX, FXI, FXIII, FII (responsable de la hipoprotrombinemia) y el factor de von Willebrand. Las deficiencias de factores son causadas por, por ejemplo, una vida media del factor acortada in vivo, propiedades de unión alteradas del factor, defectos genéticos del factor y una concentración plasmática reducida del factor. Los trastornos de la coagulación pueden ser congénitos o adquiridos. Los defectos genéticos potenciales incluyen deleciones, adiciones y/o sustitución dentro de una secuencia de nucleótidos que codifica un factor de coagulación cuya ausencia, presencia y/o sustitución, respectivamente, tiene un impacto negativo en la actividad del factor de coagulación. Los trastornos de la coagulación también se derivan del desarrollo de inhibidores o autoinmunidad (por ejemplo, anticuerpos) contra los factores de coagulación. En un ejemplo, el trastorno de la coagulación es la hemofilia A. Alternativamente, el trastorno de la coagulación es la hemofilia B o la hemofilia C.

[0061] Los trastornos plaquetarios son causados por una función plaquetaria deficiente o un número de plaquetas anormalmente bajo en circulación. El bajo recuento de plaquetas puede deberse, por ejemplo, a la subproducción, el secuestro de plaquetas o la destrucción descontrolada de patentes. La trombocitopenia (deficiencia de plaquetas) puede estar presente por varios motivos, entre los que se incluyen la quimioterapia y otras terapias con medicamentos, radioterapia, cirugía, pérdida accidental de sangre y otras afecciones de la enfermedad. Las afecciones patológicas ejemplares que implican trombocitopenia son: anemia aplásica; trombocitopenia idiopática o inmune (PTI), incluida la púrpura trombocitopénica idiopática asociada con cáncer de mama; PTI asociada al VIH y púrpura trombocitopénica trombótica relacionada con el VIH; tumores metastásicos que dan lugar a trombocitopenia; lupus eritematoso sistémico, incluyendo esplenomegalia de síndrome de lupus neonatal; síndrome de Fanconi; deficiencia de vitamina B12; deficiencia de ácido fólico; anomalía de May-Hegglin; síndrome de Wiskott-Aldrich; enfermedad cronica del higado; síndrome mielodisplásico asociado a trombocitopenia; hemoglobinuria nocturna paroxística; trombocitopenia profunda aguda después de la terapia con Fab C7E3 (Abciximab); trombocitopenia aloinmune, incluyendo trombocitopenia aloinmune materna; trombocitopenia asociada con anticuerpos antifosfolipídicos y trombosis; trombocitopenia autoinmune; trombocitopenia inmune inducida por fármacos, incluyendo trombocitopenia inducida por carboplatino y trombocitopenia inducida por heparina; trombocitopenia fetal; trombocitopenia gestacional; síndrome de Hughes; trombocitopenia lupoidea; pérdida de sangre accidental y/o masiva; trastornos mieloproliferativos; trombocitopenia en pacientes con neoplasias malignas; trombocitopenia púrpura trombótica, incluida la microangiopatía trombótica que se manifiesta como púrpura trombocitopénica trombótica/síndrome urémico hemolítico en pacientes con cáncer; púrpura postransfusión (PTP); anemia hemolítica autoinmune; perforación del divertículo yeyunal oculto; aplasia pura de glóbulos rojos; trombocitopenia autoinmune; nefropatia epidemica; insuficiencia renal aguda asociada a rifampicina; trombocitopenia de París-Trousseau; trombocitopenia aloinmune neonatal; hemoglobinuria paroxística nocturna; cambios hematológicos en el cáncer de estómago; síndromes urémicos hemolíticos (p.ej., afecciones urémicas en la infancia); y manifestaciones hematológicas relacionadas con la infección viral, incluido el virus de la hepatitis A y la trombocitopenia asociada a CMV. Los trastornos plaquetarios también incluyen, entre otros, la enfermedad de Von Willebrand, la disfunción plaquetaria paraneoplásica, la trombastenia de Glanzman y la enfermedad de Bernard-Soulier. Los trastornos hemorrágicos adicionales susceptibles de tratamiento con un complejo de péptido de unión a TFPI (por ejemplo, péptido inhibidor de TFPI) incluyen, entre otros, afecciones hemorrágicas inducidas por traumatismo; una deficiencia en uno o más factores de contacto, como FXI, FXII, precalicreína y cininógeno de alto peso molecular (HMWK); deficiencia de vitamina K; un trastorno de fibrinógeno, que incluye afibrinogenemia, hipofibrinogenemia y disfibrinogenemia; y deficiencia de alfa2-antiplasmina. En una realización, el complejo péptido de unión a TFPI (p.ej., péptido inhibidor de TFPI) se usa para tratar el sangrado excesivo, tal como el sangrado excesivo causado por cirugía, traumatismo, hemorragia intracerebral, enfermedad hepática, enfermedad renal, trombocitopenia, disfunción plaquetaria, hematomas, hemorragia interna, hemartrosis, hipotermia, menstruación, embarazo y dengue hemorrágico. Todo lo anterior se considera "trastornos de la coagulación sanguínea" en el contexto de la divulgación.

[0062] En un aspecto, el complejo de péptido de unión a TFPI (por ejemplo, péptido inhibidor de TFPI) de la invención se utiliza para revertir los efectos (en todo o en parte) de uno o más anticoagulantes en un sujeto. Numerosos anticoagulantes son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, heparina; derivados de cumarina, tales como warfarina o dicumarol; TFPI; AT III; lupus anticoagulante; péptido anticoagulante nematodo (NAPc2); inhibidores de FVIIa; sitio activo bloqueado FVIIa (FVIIai); sitio activo bloqueado FIXa (FIXai); inhibidores de FIXa; inhibidores de FXa, incluidos fondaparinux, idraparinux, DX-9065a y razaxaban (DPC906); sitio activo bloqueado FXa (FXai); inhibidores de FVa o FVIIIa, incluyendo la proteína C activada (APC) y la trombomodulina soluble; inhibidores de trombina, que incluyen hirudina, bivalirudina, argatroban y ximelagatrán; y anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen a un factor de coagulación (por ejemplo, FV, FVII, FVIII, FIX, FX, FXIII, FII, FXI, FXII, factor de von Willebrand, precalicreína o cininógeno de alto peso molecular (HMWK)).

[0063] Como se usa en el presente documento, "tratar" y "tratamiento" se refiere a cualquier reducción en la severidad y/o aparición de síntomas asociados con un trastorno de la coagulación de la sangre. Por consiguiente, "tratar" y "tratamiento" incluye medidas terapéuticas y profilácticas. Un experto en la técnica apreciará que cualquier grado de protección o mejora de un trastorno de coagulación de la sangre o síntoma asociado con él es beneficioso para un sujeto, tal como un paciente humano. La calidad de vida de un paciente se mejora al reducir en algún grado la gravedad de los síntomas en un sujeto y/o retrasar la aparición de los síntomas. En consecuencia, el método en un aspecto se realiza tan pronto como sea posible después de que se haya determinado que un sujeto está en riesgo de desarrollar un trastorno de coagulación de la sangre (por ejemplo, una deficiencia en un factor de coagulación (por ejemplo, FVIII, FIX o FXI) es detectado) o tan pronto como sea posible después de que se detecte un trastorno de la coagulación de la sangre (por ejemplo, hemofilia A, hemofilia B o hemofilia C). En un aspecto adicional, el péptido se administra para proteger, en todo o en parte, contra la pérdida excesiva de sangre durante una lesión o cirugía.

[0064] En vista de lo anterior, la invención proporciona un complejo de péptido para uso en un método para el tratamiento de un sujeto, tal como un método para el tratamiento de una enfermedad en la que la inhibición de TFPI es beneficiosa. En un aspecto, la enfermedad o trastorno es un trastorno de la coagulación de la sangre. El sujeto sufre una enfermedad o trastorno o corre el riesgo de padecer una enfermedad o trastorno (o evento biológico adverso, como una pérdida excesiva de sangre). El método comprende administrar al sujeto el complejo peptídico de la invención en una cantidad y en condiciones eficaces para tratar o prevenir, en todo o en parte, la enfermedad o trastorno. La invención proporciona además un complejo peptídico para uso en la fabricación de un medicamento. Por ejemplo, el complejo peptídico se puede usar en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno de la coagulación de la sangre, como se describe en detalle en el presente documento.

[0065] En algunas realizaciones, es ventajoso administrar a un sujeto un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un complejo de péptido (por ejemplo, péptido de unión a TFPI, péptido inhibidor de TFPI) de la invención. Dicho ácido nucleico, en un aspecto, se proporciona en lugar de, o además de, un complejo peptídico (por ejemplo, unión a TFPI, péptido inhibidor de TFPI). Los vectores de expresión, las secuencias reguladoras de ácido nucleico, los métodos de administración, y similares, se describen adicionalmente en este documento y en la publicación de Patente de EE.UU. N° 20030045498,

[0066] Un régimen de administración particular para un sujeto particular dependerá, en parte, en el complejo de péptido inhibidor de TFPI de la invención usado, la cantidad de complejo de péptido de unión a TFPI (por ejemplo, péptido inhibidor de TFPI) administrado, la vía de administración, la dolencia particular que se trata, las consideraciones relevantes para el receptor y la causa y el alcance de los efectos secundarios. La cantidad de complejo peptídico administrado a un sujeto (por ejemplo, un mamífero, como un ser humano) y las condiciones de administración (por ejemplo, el momento de la administración, la vía de administración, el régimen de dosificación) son suficientes para afectar la respuesta biológica deseada durante un período razonable de tiempo. La dosis depende típicamente de una variedad de factores, incluido el complejo péptido de unión a TFPI particular (por ejemplo, el péptido inhibidor de TFPI) empleado, la edad y el peso corporal del sujeto, así como la existencia y gravedad de cualquier enfermedad o trastorno en el sujeto. El tamaño de la dosis también estará determinado por la ruta, el tiempo y la frecuencia de administración. En consecuencia, el clínico puede titular la dosis y modificar la vía de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo, y los expertos en la técnica conocen las técnicas convencionales de búsqueda de rango. Simplemente a modo de ilustración, en un aspecto, el método comprende administrar, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 pg/kg a aproximadamente 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. En otras realizaciones, la dosis puede variar desde 1 pg/kg hasta aproximadamente 75 mg/kg; o 5 pg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg; o 10 pg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis comprende aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg (por ejemplo, aproximadamente 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,3 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg). kg, 3,5 mg/kg, 4 mg/kg, 4,5 mg/kg, 5 mg/kg, 5,5 mg/kg, 6 mg/kg, 6,5 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, o 10 mg/kg) de péptido. Dada la naturaleza crónica de muchos trastornos de la coagulación sanguínea, se prevé que un sujeto recibirá el complejo péptido de unión a TFPI (p.ej., péptido inhibidor de TFPI) durante un curso de tratamiento que dura semanas, meses o años, y puede requerir una o más dosis diarias o semanales. En otras realizaciones, el complejo péptido de unión a TFPI (p.ej., péptido inhibidor de TFPI) se administra para tratar una afección aguda (p.ej., sangrado causado por cirugía o trauma, o inhibidor del factor/episodios autoinmunes en sujetos que reciben terapia de reemplazo de coagulación) durante un período de tratamiento relativamente corto, por ejemplo, de uno a 14 días.

[0067] Los métodos adecuados de administración de una composición fisiológicamente aceptable, tal como una composición farmacéutica que comprende un péptido descrito en el presente documento, son bien conocidos en la técnica. Aunque se puede usar más de una vía para administrar un péptido, una vía particular puede proporcionar una reacción más inmediata y más efectiva que otra vía. Dependiendo de las circunstancias, una composición farmacéutica se aplica o instila en cavidades corporales, se absorbe a través de la piel o las membranas mucosas, se ingiere, se inhala y/o se introduce en la circulación. En un aspecto, una composición que comprende un complejo de péptido de unión a TFPI (por ejemplo, péptido inhibidor de TFPI) se administra por vía intravenosa, intraarterial o intraperitoneal para introducir el péptido de la invención en circulación. La administración no intravenosa también es apropiada, particularmente con respecto a los productos terapéuticos de bajo peso molecular. En ciertas circunstancias, es deseable administrar una composición farmacéutica que comprende el complejo péptido de unión a TFPI (por ejemplo, péptido inhibidor de TFPI) por vía oral, tópica, sublingual, vaginal, rectal, pulmonar; mediante inyección por medios intracerebrales (intraparenquimatosos), intracerebroventriculares, intramusculares, intraoculares, intraportales, intralesionales, intramedulares, intratecales, intraventriculares, transexuales, subcutáneos, intranasales, uretrales o enterales; por sistemas de liberación sostenida; o por dispositivos de implantación. Si se desea, el complejo péptido de unión a TFPI (p.ej., péptido inhibidor de TFPI) se administra regionalmente mediante administración intraarterial o intravenosa que alimenta una región de interés, p.ej., a través de la arteria femoral para el suministro a la pierna. En una realización, el péptido se incorpora en una micropartícula como se describe en, por ejemplo, las patentes de EE.UU. 5,439,686 y 5,498,421, y las publicaciones de patente de EE.UU. 2003/0059474, 2003/0064033, 2004/0043077, 2005/0048127, 2005/0170005, 2005/0142205, 2005/142201, 2005/0233945, 2005/0147689, 2005/0142206, 2006/0024379, 2006/0260777, 2007/0207210, 2007/0092452, 2007/0281031 y 2008/0026068. Alternativamente, la composición se administra a través de la implantación de una membrana, esponja u otro material apropiado sobre el cual la molécula deseada ha sido absorbida o encapsulada. Cuando se usa un dispositivo de implantación, el dispositivo en un aspecto se implanta en cualquier tejido adecuado, y el suministro de la molécula deseada se realiza en varios aspectos mediante difusión, bolo de liberación programada o administración continua. En otros aspectos, el péptido inhibidor de TFPI se administra directamente al tejido expuesto durante los procedimientos quirúrgicos o el tratamiento de una lesión, o se administra mediante procedimientos de transfusión de sangre. El experto en la técnica conoce bien los enfoques de administración terapéutica, algunos de los cuales se describen con más detalle, por ejemplo, en la patente de EE.UU. N° 5,399,363.

[0068] Para facilitar la administración, el complejo de péptido de unión a TFPI (por ejemplo, péptido inhibidor de TFPI) en una realización se formula en una composición fisiológicamente aceptable que comprende un vehículo (es decir, vehículo, adyuvante, tampón, o diluyente). El portador particular empleado está limitado solo por consideraciones físico-químicas, tales como la solubilidad y la falta de reactividad con el péptido, y por la vía de administración. Los portadores fisiológicamente aceptables son bien conocidos en la técnica. Las formas farmacéuticas ilustrativas adecuadas para uso inyectable incluyen, sin limitación, soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles (por ejemplo, consulte la Patente de EE.UU. N° 5,466,468). Las formulaciones inyectables se describen adicionalmente en, por ejemplo, Pharmaceutics and Pharmacy Practice, JB Lippincott CO, Filadelfia. Pa., Banquero y Chalmers. eds., páginas 238-250 (1982) y ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4a ed., páginas 622-630 (1986)). Una composición farmacéutica que comprende un péptido proporcionado en el presente documento se coloca opcionalmente dentro de recipientes, junto con material de embalaje que proporciona instrucciones con respecto al uso de tales composiciones farmacéuticas. En general, tales instrucciones incluyen una expresión tangible que describe la concentración de reactivo, así como, en ciertas realizaciones, cantidades relativas de ingredientes o diluyentes excipientes que pueden ser necesarias para reconstituir la composición farmacéutica.

[0069] Cuando sea apropiado, el complejo de péptido de unión a TFPI (por ejemplo, péptido inhibidor de TFPI) de la invención se administra en combinación con otras sustancias y/o otras modalidades terapéuticas para alcanzar un efecto biológico adicional o aumentado. Los co-tratamientos incluyen, pero no se limitan a, factores de coagulación recombinantes o derivados de plasma, tratamientos de profilaxis de hemofilia, inmunosupresores, antagonistas de anticuerpos inhibidores del factor plasmático (es decir, anti-inhibidores), antifibrinolíticos, antibióticos, terapia hormonal, agentes antiinflamatorios (p.ej., medicamentos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) o sustancias antiinflamatorias esteroides), procoagulantes y analgésicos. En un aspecto, el método es una terapia complementaria a los regímenes tradicionales de tratamiento con factor de reemplazo que involucran la administración de, por ejemplo, FXIII, FXII, FXI (por ejemplo, HEMOLEVEN® (Laboratoire francais du Fractionnement et des Biotechnologies, Les Ulis, Francia) y el concentrado de FXI (BioProducts Laboratory, Elstree, Hertfordshire, Reino Unido), FX, FIX (por ejemplo, BENEFIX® Coagulation Factor IX (Wyeth, Madison, NJ); ALFANINE® SD (Grifols, Los Angeles, Ca ); MONONINE® (CSL Behring, King of Prusia, PA); BEBULIN-VH™ (Baxter, Deerfield, IL); PROFILNINE® SD (Grifols, Los Angeles, CA); o PROPLEXT™ (Baxter, Deerfieldfield, IL)), FVIII (por ejemplo, ADVATETM (Baxter, Deerfield, IL); HELIXATE® FS (CSL Behring, King of Prussia, PA); REFACTO® (Wyeth, Madison, NJ), XYNTHA™ (Wyeth, Madison, NJ), KOGENATE® y KOGENATE® FS (Bayer, Pittsburgh, PA ALFANATE® (Grifols, Los Ángeles, CA); HEMOPHIL MTM (Baxter, Deerfield, IL); KOATE®-d V i (Talecris Biotherapeutics-USA, Research Triangle Park, NC) o MONARC-MTM (Baxter, Deerfi eld, IL)), FVIIa (por ejemplo, NOVOSEVEN® FVIIa (Novo Nordisk, Princeton, NJ) y concentrado de FVII (Baxter Bioscience, Viena, Austria, o BioProducts Laboratory, Elstree, Hertfordshire, Reino Unido)), FV, FVa, FII, y/o FIII, a un sujeto. En algunos casos, el sujeto también recibe FEIBA VH Immuno™ (Baxter BioScience, Viena, Austria), que es una fracción plasmática estéril liofilizada con actividad de derivación del inhibidor del factor VIII. FEIBA VH Im ^{iT i}uno™ contiene aproximadamente unidades iguales de actividad de bypass del inhibidor del factor VIII y factores del complejo de protrombina (factores II, VII, IX y X y proteína C). Otros co-tratamientos ejemplares incluyen, entre otros, precalicreína, quininógeno de alto peso molecular (HMWK), factor de Von Willebrand, factor tisular y trombina. Alternativamente o además, el complejo péptido de unión a TFPI (por ejemplo, péptido inhibidor de TFPI) se formula conjuntamente con uno o más complejos de péptido de unión a TFPI diferentes (por ejemplo, péptido inhibidor de TFPI). En un aspecto, la administración del péptido de unión a TFPI permite una reducción en la dosis de coterapéutica requerida para lograr una respuesta biológica deseada.

[0070] La invención así incluye un complejo de péptido de unión a TFPI (por ejemplo, péptido inhibidor de TFPI) para uso en terapia, que comprende administrar el complejo a un sujeto, en combinación con una o más sustancias adicionalmente adecuadas, administrándose cada una de acuerdo a un régimen adecuado para ese medicamento. Las estrategias de administración incluyen administración concurrente (es decir, administración sustancialmente simultánea) y administración no concurrente (es decir, administración en diferentes momentos, en cualquier orden, ya sea superpuesto o no) del complejo péptido de unión a TFPI (por ejemplo, péptido inhibidor de TFPI) y uno o más agentes adecuados adicionales. Se apreciará que diferentes componentes se administran opcionalmente en las mismas composiciones o en composiciones separadas, y por las mismas o diferentes vías de administración.

[0071] En algunas realizaciones, el péptido de la invención se conjuga a un resto, por ejemplo, un resto terapéutico o de diagnóstico, tales como los restos de detección y parejas de tratamientos descritos anteriormente. Alternativamente o además, el péptido se administra en combinación con una pareja de interacción (por ejemplo, un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, anticalina, aptámero o spiegelmer) que (a) se une al péptido y (b) es terapéuticamente activo y/o está vinculado a un grupo que proporciona funcionalidad adicional a la pareja de interacción (por ejemplo, un agente terapéutico, de diagnóstico o de detección). Los restos adecuados incluyen, pero no se limitan a, fotosensibilizadores, colorantes, radionúclidos, complejos que contienen radionúclidos, enzimas, toxinas, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y agentes citotóxicos y, en algunos casos, el resto posee actividad terapéutica (es decir, logra un efecto biológico ventajoso o deseado). Los conjugados peptídicos o el par de parejas de interacción peptídica son adecuados para su uso en cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, como los métodos para tratar a un sujeto que padece una enfermedad o trastorno o corre el riesgo de sufrir una enfermedad o trastorno.

[0072] La invención proporciona además un método in vitro para inhibir la degradación de TFPI por una serina proteasa. La degradación de la proteasa puede complicar el manejo de TFPI en entornos de investigación. Además, aunque con la inhibición de TFPI se desea mejorar varias afecciones médicas (por ejemplo, la hemofilia), el TFPI puede desearse en otras realizaciones clínicas para, por ejemplo, reducir la coagulación. Por "inhibir" se entiende la protección, en parte en su totalidad, de la degradación o escisión por una proteasa. Las proteasas de serina están bien caracterizadas e incluyen, por ejemplo, elastasa, trombina, plasmina, FXa o quimasa. El método comprende poner en contacto el TFPI con un péptido que comprende un péptido que comprende la estructura de fórmula (XIV):

X7001 -X7002-X7003-X7004-X7005-X7006-[X7007-X7008-X7009-X7010-X7011 -

X7012-X7013-X7014-X7015-X7016-X7017-X7018]-X7019-X7020-X7021-X7022-X7023

(XIV) (SEQ ID NO: 3154),

en donde X7001 está presente o ausente, por lo que en el caso de que X7001 esté presente, es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, C(NEM), D, E, F, G, H, I, K, L, P, R, S, T, V y W;

en donde X7002 está presente o ausente, por lo que en el caso de que X7002 esté presente, es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, C(NEM), D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W e Y;

en donde X7003 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, F, I, K, L, R, S, T, V, W e Y;

en donde X7004 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, G, I, K, L, R, S, T, V y W;

en donde X7005 es R o W;

en donde X7006 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, H, I, K, L, R, V y W;

en donde X7007 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Orn, homoK, C, Hcy, Dap y K, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en C y Hcy;

en donde X7008 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, G, R, S y T;

en donde X7009 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en a, A, I, K, L, M, m, Moo, Nle, p, R, Sem y V;

en donde X7010 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, G, I, K, L, P, R, S, T y V; en donde X7011 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, E, G, S y T;

en donde X7012 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, a, D, d, E, e, F, f, G, I, K, K, L, 1, M, m, Moo, Nle, nle, P, p, R, r, S, s, Sem, T, t, V, v, W y w;

en donde X7013 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, C(NEM), Con, Con(Meox), D, d, E, e, Eag, F, G, I, K, L, N, R, S, s, T, V y W;

en donde X7014 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, G, I, K, L, M, R, S, T, V y W;

en donde X7015 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, G, I, K, L, M, Nle, R, S, T, V y W;

en donde X7016 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, I, K, L, M, Moo, Nle, R, S, Sem, T, V, W e Y;

en donde X7017 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, G, I, K, L, R, S, T, V, W e Y; en donde X7018 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en C y D, preferiblemente C; en donde X7019 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, F, I, L, S, T, V y W;

en donde X7020 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F y W;

en donde X7021 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, L y V;

en donde X7022 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, G, I, K, L, P, R, S, T, V y W;

donde X7023 está presente o ausente, por lo que en el caso de que X7023 esté presente, es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, C(NEM), Con, Con(Meox), D, E, Eag, F, G, I, K, L, R, S, T, V, W e Y; y

en donde el péptido comprende como una estructura cíclica generada por un enlace entre X7007 y X7018, por lo que se inhibe la degradación de TFPI por la serina proteasa.

[0073] Opcionalmente, X7001 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, F, G, H, K, L y S; X7002 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en H, F, M y R; X7003 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F e Y; X7004 es K; X7005 es W; X7006 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F y H; X7007 es C; X7008 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, G y S; X7009 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en M, Sem y V; X7010 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K, P y R; X7011 es D; en donde X7012 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, L, 1, M y Sem; en donde X7013 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, G, K y S; en la que X7014 es G; en donde X7015 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I y T; en donde X7016 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, F, M, Sem e Y; en donde X7017 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S y T; en la que X7018 es C; en donde X7019 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A y V; en donde X7020 es W; en donde X7021 es V; en donde X7022 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, L, K, R, P y W; en donde X7023 está presente o ausente, por lo que en el caso de que X7023 esté presente, es una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en A, D, F, M, S e Y; y en donde el péptido comprende como una estructura cíclica generada por un enlace entre X7007 y X7018, El "contacto" se puede realizar in vitro. Las consideraciones de dosificación y vía de administración descritas en este documento son aplicables al método de inhibición de la degradación proteolítica.

[0074] El péptido es parte de un complejo de péptido que comprende además un péptido que comprende la estructura de fórmula (XIII):

X6001-X6002-X6003-X6004-X6005-X6006-X6007-X6008-X6009-X 6010-X6011-X6012-X6013-X6014-X6015-X6016-X6017-X6018-X6019-X6020 (XIII) (SEQ ID NO: 3153);

en donde X6001 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, L, M, Y, 1Ni, Thi, Bta, Dopa, Bhf, C, D, G, H, I, K, N, Nmf, Q, R, T, V y W;

en donde X6002 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q, G y K;

en donde X6003 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en C, D, E, M, Q, R, S, T, Ede (O), Cmc, A, Aib, Bhs, F, G, H, I, K, L, N, P, V, W e Y;

en donde X6004 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Aib, E, G, I, K, L, M, P, R, W, Y, A, Bhk, C, D, F, H, k, N, Nmk, Q, S, T y V;

en donde X6005 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en a, A, Aib, C, D, d, E, G, H, K, K, M, N, Nmg, p, Q, R, NpropilG, aze, pip, tic, oic, hyp, nma, Ncg, Abg, Apg, thz, dtc, Bal, F, L, S, T, V, W e Y; en donde X6006 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, C(NEM), D, E, G, H, K, M, N, Q, R, S, V, Cit, C (Acm), Nle, I, Ede (O), Cmc, Ecl, Eea, Eec, Eef, Nif, Eew, Aib, Btq, F, I, L, T, W e Y; en donde X6007 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, V, T, Chg, Phg, Tie, A, F, G, I, K, L, Nmv, P, Q, S, W e Y;

en donde X6008 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, H, 1Ni, 2Ni, Pmy, Y y W; en donde X6009 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Aib, V, Chg, Phg, Abu, Cpg, Tie, L-2-amino-4,4,4-ácido trifluorobutírico, A, f, I, K, S, T y V;

donde X6010 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, D, d, E, F, H, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y, Nmd, C(NEM), Aib, G, I, L y Nmf;

en donde X6011 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, a, G, p, Sar, c, hcy, Aib, C, K, G y Nmg;

en donde X6012 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Y, Tym, Pty, Dopa y Pmy;

en donde X6013 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Aib, C, F, 1Ni, Thi, Bta, A, E, G, H, K, L, M, Q, R, W e Y;

en donde X6014 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, Aib, C, C(NEM), D, E, K, L, M, N, Q, R, T, V, Hcy, Bhe, F, G, H, I, P, S, W e Y;

en donde X6015 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R, (omega-metil)-R, D, E y K; en donde X6016 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L, Hcy, Hle y Aml;

en donde X6017 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, a, Aib, C, C, Cha, Dab, Eag, Eew, H, Har, Hci, Hle, I, K, L, M, Nle, Nva, Opa, Orn, R, S, Deg, Ebc, Eca, Egz, Aic, Apc, Egt, (omega-metil)-R, Bhr, Cit, D, Dap, E, F, G, N, Q, T, V, W e Y;

en donde X6018 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, Aib, Hcy, hcy, C, c, L, Nle, M, N, R, Bal, D, E, F, G, H, I, K, Q, S, T, V, W e Y;

en donde X6019 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K, R, Har, Bhk y V; y en donde X6020 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K, L, Hcy, Aml, Aib, Bhl, C, F, G, H, I, Nml, Q, R, S, T, V, W e Y;

en donde el término C del primer péptido está unido al término N del segundo péptido a través de un resto enlazador;

[0075] La invención proporciona además un método para identificar un compuesto de unión a TFPI, tal como un péptido TFPI vinculante. En un aspecto, el método comprende (a) poner en contacto un péptido que comprende el dominio 1 de TFPI Kunitz (KD1) con un complejo peptídico de unión a TFPI descrito aquí y un compuesto de prueba en condiciones que permiten la formación de complejos peptídicos de unión a KD1-TFPI. El método comprende además (b) medir los complejos peptídicos de unión a KD1-TFPI formados en el paso (a), y (c) comparar el número de complejos peptídicos de unión a KD1-TFPI formados en presencia del compuesto de prueba con el número de complejos peptídicos de unión a KD1-TFPI formados en ausencia del compuesto de prueba. Una reducción en el número de complejos de péptidos de unión a KD1-TFPI formados en presencia del compuesto de prueba en comparación con el número de complejos de péptidos de unión a KD1-TFPI formados en ausencia del compuesto de prueba indica que el compuesto de prueba es un compuesto de unión a TFPI. En un aspecto, el método comprende además la formación de complejos de unión a KD1-TFPI en ausencia del compuesto de prueba para comparación en el paso (c), aunque esto no es necesario ya que la información se puede obtener por separado (por ejemplo, de normas de referencia preparadas previamente).

[0076] KD1, el péptido de unión a TFPI, y el compuesto de ensayo se combinan simultáneamente o secuencialmente, opcionalmente con etapas de lavado antes y/o después de la adición del péptido de unión a TFPI y/o el compuesto de ensayo. En una realización, el péptido que comprende KD1 se pone en contacto con un péptido de unión a TFPI descrito en este documento en condiciones que permiten la formación de complejos de péptido de unión a KD1-TFPI, se elimina el péptido de unión a TFPI no unido, y los complejos de péptido kD restantes se ponen en contacto con un compuesto de prueba. Se detecta el desplazamiento del péptido de unión a TFPI de los complejos de péptido de TFPI, e indica que el compuesto de prueba es un compuesto de unión a TFPI. El desplazamiento se detecta, por ejemplo, midiendo el número de complejos peptídicos de unión a KD1-TFPI antes y después de la exposición al compuesto de prueba.

[0077] Los complejos peptídicos de unión a KPI-TFPI se detectan y/o se miden (cuantifican) utilizando cualquier medio de detección adecuado, incluidos los medios de detección conocidos en la técnica para detectar péptidos en una muestra. Por ejemplo, en una realización de la invención, el péptido de unión a TFPI comprende una etiqueta que genera una señal. Las etiquetas ejemplares se describen en el presente documento e incluyen, por ejemplo, radionúclidos, colorantes fluorescentes, isótopos, sustratos enzimáticos y enzimas. El método comprende medir la señal generada por los complejos de péptidos de unión a KD1-TFPI y comparar la señal generada por los complejos de péptidos de unión a KD1-TFPI formados en presencia del compuesto de ensayo con la señal generada por los complejos de péptidos de unión a KD1-TFPI formados en ausencia del compuesto de ensayo. Una reducción en la señal de una muestra que comprende complejos peptídicos de unión a KD1-TFPI expuestos al compuesto de ensayo (en comparación con la señal generada por una muestra similar de complejos peptídicos de unión a KD1-TFPI no expuestos al compuesto de prueba) indica que se ha inhibido la formación de complejos o interrumpido, y que el compuesto de prueba es un compuesto de unión a TFPI.

[0078] El documento completo está destinado a ser relacionado como una divulgación unificada, y debe entenderse que se contemplan todas las combinaciones de características descritas en el presente documento, incluso si la combinación de características no se encuentran juntas en la misma frase o párrafo, o sección de este documento. Por ejemplo, cuando se describe la terapia con proteínas, se contemplan específicamente las realizaciones que involucran la terapia con polinucleótidos (que utilizan polinucleótidos/vectores que codifican la proteína), y lo contrario también es cierto. La invención incluye, por ejemplo, todas las realizaciones de la invención de alcance más estrecho en cualquier forma que las variaciones específicamente mencionadas anteriormente. Con respecto a los aspectos de la invención descritos como un género, todas las especies individuales se consideran individualmente aspectos separados de la invención. Con respecto a los aspectos de la invención descritos o reivindicados con "un" o "una", debe entenderse que estos términos significan "uno o más" a menos que el contexto requiera un significado más restringido sin ambigüedades. Con respecto a los elementos descritos como uno o más dentro de un conjunto, debe entenderse que todas las combinaciones dentro del conjunto están contempladas.

EJEMPLOS

[0079] La invención, así descrita en general, se entenderá más fácilmente por referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden limitar la invención.

Ejemplo 1

[0080] El siguiente ejemplo describe la producción, identificación y cribado de péptidos para la unión a TFPI.

[0081] Péptidos candidatos se obtuvieron de proveedores comerciales (por ejemplo, PolyPeptide Laboratories SAS (Estrasburgo, Francia) y JPT Peptide Technologies GmbH (Berlín, Alemania)). Los métodos para sintetizar péptidos candidatos se proporcionan anteriormente. Los péptidos candidatos se sintetizaron como sales de trifluoroacetato (TFA) con una pureza >90% o >60%. Todos los péptidos se resolvieron en DMSO a una concentración de reserva de 10 mM. Las secuencias peptídicas de unión a t Fp I se identificaron usando una biblioteca de presentación de ARNm. La tecnología de visualización de ARNm es superior a otras técnicas de selección de bibliotecas para permitir una diversidad de 1014 secuencias diferentes dentro de un grupo de partida y evitar, por ejemplo, los pasos in vivo requeridos para la visualización de fagos. En resumen, la tecnología implica unir directamente el ARNm a su péptido candidato codificado a través de una molécula de puromicina (Figura 5). El método de presentación de ARNm se describe adicionalmente en la publicación de patente internacional n° WO 2005/051985 y Liu et al., Methods in Enzymology, 318, 268-293 (2000). El TFPI se inmovilizó en un soporte sólido a través de biotina y se expuso a complejos péptido-ARN candidatos. Se aislaron complejos péptido-ARN candidatos unidos a TFPI, y el ARN se transcribió de manera inversa para obtener el ADN codificante. Se obtuvieron aglutinantes de alta afinidad después de seis a diez rondas de selección utilizando una estrategia de elusión competitiva. Muchos de los péptidos candidatos tenían una longitud de 31 aminoácidos (27 aminoácidos aleatorizados y 2 aminoácidos que flanquean ambos extremos).

[0082] Los péptidos seleccionados fueron sintetizados y sometidos a optimización de péptido usando un análisis de exploración basado en micromatrices para identificar fragmentos peptídicos de retención de afinidad TFPI vinculante. Por ejemplo, un escaneo basado en micromatrices de JBT0047 se realizó utilizando una serie de 20 fragmentos de aminoácidos del péptido, cuyas secuencias se superponen con 19 aminoácidos. Brevemente, los péptidos modificados con aminooxiacetato en el extremo N se imprimieron en portaobjetos de vidrio de epóxido de Corning. Después de lavar y secarse, los portaobjetos se trataron en una estación de incubación TECAN HS400TM Los portaobjetos se lavaron durante dos minutos en solución salina tamponada con Tris con 0,1% de Tween 20® (TBST), y se bloquearon durante 30 minutos en a base de Tris, tampón de T-20 Super- Block™ (5 mM CaCh) (Pierce). Después del bloqueo, los portaobjetos se lavaron durante 2,5 minutos en TBST. Los portaobjetos se incubaron posteriormente con TFPI DYUGHT™ 649 marcado con (1 pg/ml en basa-Tris, tampón T-20 SuperBlock™ (5 mM CaCh) durante 45 minutos, y se lavó dos veces con TBST flujo continuo durante diez minutos. Los portaobjetos se sometieron a un lavado final con solución salina-tampón de citrato de sodio durante dos minutos y se secaron al aire durante cuatro minutos. Las diapositivas se escanearon en un escáner Axon GenePix® 4000B, y las exploraciones se analizaron utilizando el software GenePix® Pro. El análisis de truncamiento N y C-terminal complementó el análisis de exploración. Los resultados de la exploración de micromatrices demostraron que el péptido JBT0293 se unía a TFPI con la afinidad más alta. Se generó una serie de mutantes de sustitución basados en la secuencia de aminoácidos de JBT0293 y se ensayaron las propiedades de unión de TFPI.

[0083] La afinidad de un subconjunto de péptidos para TFPI se demostró mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) (unión (CE50) ELISA) realizado con los péptidos biotinilados. Noventa y seis placas de pocillos MaxiSorp (Nunc) se recubrieron con 3 pg/ml de TFPI en tampón de recubrimiento (15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9,6) durante la noche. Las placas se lavaron tres veces con 350 ml de tampón de lavado (HNaT: 175 mM NaCl, 25 mM HEPES, 5 mM CaCl2, 0,1% de Tween 80, pH 7,35) y posteriormente se bloquearon con 200 pl de extracto de levadura al 2% en HNaT para 2 horas. Las placas se lavaron tres veces con 350 pl de HNaT. Los péptidos candidatos biotinilados se diluyeron a partir de una reserva de DMSO 1/200 en HNaT. La concentración de péptido inicial fue de 50 pm si no apareció ningún precipitado durante la dilución 1/200 de la solución madre de péptido 10 mM. Se realizaron prediluciones de la reserva de péptidos en DMSO si se formaban precipitados. Los péptidos diluidos se aplicaron a las placas Maxisorp, se generaron diluciones en serie (1/3) y las diluciones se incubaron durante 1,5 horas a temperatura ambiente. La incubación fue seguida por tres etapas de lavado (350 pl de HNaT). El péptido unido se detectó mediante incubación con estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante (1 hora), seguido de tres etapas de lavado con HNaT y una posterior conversión cromogénica de TMB (3,3'5,5'-tetrametilbencidina añadida). El ensayo se ilustra en la Figura 6A.

[0084] En general, la unión a TFPI inmovilizado péptido fue significativamente por encima del fondo. Los valores de CE50 para péptidos biotinilados se dan en las Figuras 32-39, La curva de unión de un péptido de unión a TFPI, JBT0132, se representa en la Figura 7. Se calculó que la CE50 de JBT0132 era de aproximadamente 2,2 nM.

[0085] Además, una competición (CI50) ELISA se realizó utilizando péptidos de unión a TFPI biotinilados como "trazadores" para competir por TFPI vinculante con péptidos candidatos no biotinilados. El principio de ensayo se representa en la Figura 6B. Noventa y seis placas de pocillos MaxiSorp (Nunc) se recubrieron con 3 pg/ml de TFPI en tampón de recubrimiento (15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9,6) durante la noche. La concentración de TFPI puede alterarse dependiendo de las condiciones particulares del ensayo; en otros ensayos ELISA de CI50 mencionados en el presente documento, el tampón de recubrimiento contenía 0,05 pg/ml de TFPI. Las placas se lavaron tres veces con 350 pl de tampón de lavado (HNaT: 175 mM NaCl, 25 mM He Pe S, 5 mM CaCl2, 0,1% de Tween 80, pH 7,35) y se bloquearon con 200 pl de extracto de levadura al 2% en HNaT para 2 horas Las placas se lavaron tres veces con 350 pl de HNaT. Los péptidos trazadores biotinilados se aplicaron a una concentración correspondiente a sus respectivos valores de CE90 determinados en el ELISA de unión (mediana si n >2). Una solución madre de péptido (10 mM) competidora se diluyó 1/33,3 en HNaT sin HSA, y se preparó una dilución 1/3 en serie con HNaT con DMSO al 3%. La estrategia de dilución empleada en un ensayo particular dependerá de la afinidad de los péptidos. La dilución se diluyó adicionalmente con el péptido trazador biotinilado en una proporción de 1:6 (20 |jl de dilución competidora y 100 j l de péptido trazador). La mezcla de competidor y péptido trazador se aplicó a la placa de microtitulación recubierta con TFPI y se incubó durante 1,5 horas. Las placas se lavaron tres veces con 350 j l de HNaT. La unión del péptido-TFPI se detectó aplicando estreptavidina conjugada con HRP a la placa de microtitulación, incubando la mezcla durante una hora, lavando la placa tres veces con 350 j l de HNaT, aplicando TMB (3,3'5,5'-tetrametilbencidina), y detectar la posterior conversión cromogénica de TMB por HRP. Los gráficos de CI50 para péptidos no biotinilados representativos se proporcionan en las Figuras 8A-8D. Las mediciones de CI50 de los péptidos JBT0303, JBT0120 y JBT0224 se exponen en la Tabla 3.

TABLA 3

[0086] Además del ensayo de competición ELISA (CI50), se empleó un ensayo de cribado para medir un mayor número de péptidos en paralelo. El ELISA de detección es similar al ELISA CI50 de competición con la excepción de que solo se emplearon tres concentraciones diferentes del competidor (300 nM, 100 nM y 33,3 nM para la clase JBT0047, y 50000 nM, 16667 nM y 5556 nM para la clase JBT0122). En algunos casos, los resultados de selección se expresaron como porcentaje de inhibición de la señal del trazador en relación con un péptido competitivo (péptido competitivo JBT0477 para la familia JBT0047, y péptido competitivo JBT1697 para la familia JBT0122). Los resultados del ensayo de competición de CI50 y los resultados del ensayo de selección de péptidos preparados y seleccionados de acuerdo con los métodos expuestos en este documento se proporcionan en las Figuras 32-39. La media de valores CI50 presentados en las Figuras 32-39 se basan en un mayor número de ensayos que los valores presentados en la Tabla 3 y, por tanto, los valores pueden variar ligeramente. Los resultados del ELISA de selección se presentan como porcentaje de inhibición de la unión del péptido JBT0131 trazador. Varios péptidos que se analizaron utilizando el ELISA CI50 se clasifican en las Figuras 32-39 de acuerdo con su afinidad de unión como se muestra en la Tabla 4.

TABLA 4

[0087] Los péptidos de unión a TFPI ejemplares identificados usando los métodos descritos en este documento se presentan en la Tabla 5. Algunos péptidos se biotinilaron, y muchos comprenden lisinas de terminales N y C para promover la solubilidad. Varios péptidos exhibieron actividad inhibitoria de TFPI en sistemas de ensayo modelo y/o plasmáticos, como se describe a continuación.

TABLA 5

[0088] Este ejemplo proporciona métodos ejemplares de la generación y caracterización de péptidos de unión a TFPI (péptidos, por ejemplo, péptidos inhibidores de TFPI). Se encontró que todos los péptidos en la Tabla 5 se unen a TFpI-1a humano. El análisis de mutación demostró que al menos un aminoácido en un péptido de unión a TFPI puede sustituirse mientras se mantiene la afinidad por TFpI. Los péptidos de la Tabla 5 ensayados en ensayos ELISA se unieron a TFPI-la con una CE5o de menos de 10 pm (1 x 10-5 M) y una CI5o de menos de 50 pm.

Ejemplo 2

[0089] Los péptidos de unión a TFPI seleccionados se caracterizaron adicionalmente en términos de "anti-diana" de unión. Este ejemplo demuestra que los péptidos de unión a TFPI exhiben una afinidad reducida por las proteínas que no son TFPI-1.

[0090] Se seleccionó TFPI-2 como anti-diana debido a su similitud con TFPI-1. La cinética de unión de péptidos de unión a TFPI a TFPI-1 humano (residuos 29-282 fusionados en el extremo C a una etiqueta de 10 His; MW 41 kDa (R&D Systems, Minneapolis, MN; Catálogo n° 2974-PI)) murina TFPI-1 (residuos 29-289 fusionados en el extremo C-terminal con una etiqueta de 10 His; MW 41kDa (R&D Systems; Catálogo n° 2975-PI)), y TFPI-2 (R&D Systems, Minneapolis, MN) se estudiaron usando un ensayo de resonancia de plasmón de superficie BIAcore 3000TM (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, Reino Unido). Las proteínas TFPI se inmovilizaron en un chip C1 (GE Healthcare, Código de pedido: BR-1005-40) mediante química de acoplamiento de amina con el objetivo de 500 RU. Se emplearon varios péptidos de unión a TFPI como analitos para interactuar con las proteínas TFPI inmovilizadas. Se utilizaron un caudal de 30 pl/min. Después de 180 segundos, se inyectaron 180 pl de solución peptídica a seis concentraciones diferentes que oscilaron entre 3,84 nM y 656,25 nM, seguido de un tiempo de disociación de 480 segundos. El chip se regeneró con 45 pl de NaOH 10 mM. Cada experimento de unión fue precedido y seguido por cuatro mediciones con tampón HBS-P (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, P20 al 0,005%) más DMSO al 1% y P80 al 0,8%. El software BIAevaluation® versión 4,1 (GE Healthcare) se empleó para analizar los datos. Sensogramas se ajustaron a una curva de unión Langmuir 1:1 para determinar kencendido y kapagado y calcular Kd.

[0091] Ciertos péptidos ensayados, por ejemplo, JBT0050, JBT0121, JBT0205 y JBT0211, unidos a la célula en blanco y constantes de unión de los sensogramas no pudieron determinarse. JBT0133 mostró una unión débil a TFPI-1, Sensorgramos de otros péptidos dieron constantes de unión confiables. Los resultados del análisis BIAcore de varios péptidos de unión a TFPI se proporcionan en la Tabla 6 y en las Figuras 19-21, Cada uno de los péptidos enumerados en la Tabla 6 presentó una ko de menos de 10 pm. Además de los péptidos enumerados a continuación, JBT0375 y JBT0477, mutantes de sustitución de JBT0293 en la posición del aminoácido 5 (JBT0375) o posiciones del aminoácido 5 y 10 (JBT0477), también exhibió una ko de menos de 10 pm. JBT1837 (SEQ ID NO: 1044) también demostró una ko de menos de 10 pm (Kd = 0,5 nM; kencendido = 8 x 1031/Ms; Kapagado = 1,3 x 10'61/s). Los diagramas de sensibilidad de dos de los péptidos se proporcionan como las Figuras 9A y 9B.

TABLA 6

[0092] La interacción con el anti-diana TFPI-2 también se examinó. La señal máxima generada a partir de la interacción del péptido candidato con TFPI-2 humano fue mucho menor que las señales obtenidas con TFPI-1 como pareja de interacción. El análisis cinético de las señales de unión a TFPI-2 bajo fue propenso a error; por lo tanto, se usó la comparación visual de sensogramas para estimar la afinidad de unión. Un diagrama de sensaciones que ilustra la unión de JBT0120 a TFPI-1 y TFPI-2 se proporciona como las Figuras 10A y 10B. JBT0120 se une a Tf P i-2 con una afinidad 10 veces menor en comparación con su afinidad de unión por TFPI-1, También se encontró que JBT0132 exhibía una afinidad al menos 10 veces mayor para TFPI-1 que para TFPI-2.

[0093] Los datos proporcionados por este ejemplo confirman que los péptidos de unión a TFPI se unen específicamente TFPI-1.

Ejemplo 3

[0094] El siguiente ejemplo describe la caracterización de la actividad inhibidora de TFPI de seleccionar péptidos identificados en el Ejemplo 1 utilizando la inhibición de FXa y ensayos de inhibición de tenasa extrínsecos. Ambos ensayos son predictivos de actividad en sistemas plasmáticos. El ensayo de tenasa extrínseca proporciona información sobre la influencia de los péptidos en (a) la interacción de FXa y TFPI y (b) la interacción del complejo FXa-TFPI con el complejo TF-FVIIa. El ensayo de inhibición de FXa mide la influencia de un péptido en la interacción de FXa y TFPI solamente.

[0095] El complejo tenasa extrínseco es responsable de FX y la activación de FIX al inicio del proceso de coagulación. El complejo extrínseco está compuesto por FVIIa, factor tisular (TF) y sustrato FX. Para determinar la influencia de los péptidos en la inhibición mediada por TFPI del complejo de tenasa extrínseca, se estableció un ensayo enzimático acoplado. Los péptidos se diluyeron 1/6,25 a partir de reservas 10 mM (en DMSO) y se diluyeron adicionalmente mediante diluciones seriadas de 1/4 en tampón o DMSO para evitar la precipitación no deseada. El TFPI se diluyó en HNaCa-HSA o BSA (HEPES 25 mM; NaCl 175 mM; CaCl25 mM; HSA o BSA al 0,1%; pH 7,35). FVIIa, TF lipidado, vesículas de fosfolípidos (DOPC/POPS 80/20) y sustrato cromogénico específico para FXa (S-2222 (disponible de DiaPharma, West Chester, OH)), todos diluidos en HNaCa-HSA, se agregaron a placas después de un período de incubación, se agregaron TFPI y diluciones de péptidos, dando como resultado una concentración final de DMSO al 2,5% (si está presente en la reserva de péptidos). La activación de FX se inició al agregar FX a los pocillos. La conversión del sustrato cromogénico mediada por FXa se determinó observando un aumento en la absorbancia utilizando un lector de microplacas. La cantidad de FXa generada en ciertos puntos de tiempo se calculó a partir de las lecturas de DO. FXa generado a los 20 minutos del inicio de la reacción se consideró para el cálculo de CE50 a partir de gráficos de concentración de péptido frente a la inhibición de TFPI (%).

[0096] La inhibición funcional de TFPI también se examinó usando un ensayo de inhibición de FXa. Un sustrato cromogénico específico de FXa (S-2222) y TFPI, ambos diluidos en HNaCa-HSA, se agregaron a placas de 96 pocillos. Los péptidos se diluyeron 1/6,25 a partir de reservas 10 mM (en DMSO o Aqua-Dest) y se diluyeron adicionalmente mediante diluciones en serie de 1/4 en tampón o DMSO para evitar la precipitación no deseada. Las diluciones de péptidos (2,5 |jl) se agregaron a las placas de 96 pocillos, dando como resultado una concentración final de DMSO al 2,5% (si está presente en la reserva de péptidos). La conversión del sustrato cromogénico se desencadenó mediante la adición de FXa, y la cinética de la conversión se midió en un lector de microplacas. Debido a que el TFPI inhibe el FXa lentamente, las lecturas de DO después de 115 minutos se consideraron para el cálculo de la CE50 a partir de los gráficos de la concentración de péptido frente a la inhibición del TFPI (%).

[0097] Los resultados del ensayo de tenasa extrínseco y el ensayo de inhibición de FXa se proporcionan en la Tabla 7 y en las Figuras 22-27.

TABLA 7

[0098] Con referencia a la Tabla 7, JBT0120, JBT0132 y JBT0224 se restauró la activación de FX mediada por complejos extrínsecos en la presencia de TFPI-1 con una CE50 de <2 jm , lo que resulta en una inhibición de aproximadamente 20% a aproximadamente 60% de la actividad de TFPI. j Bt 0047 (CE50 = 1,4 jm ), JBT0131 (CE50 = 2,2 jm ) y JBT0293 (CE50 = 2,9 jm ) también restauraron la actividad del complejo extrínseco en presencia de TFPI-1, Además, JBT0120, JBT0132, JBT0224 y JBT0303 restauraron la actividad de FXa en presencia de TFPI-1 con una CE50 de <5 jm , lo que resultó en una inhibición de 5% a aproximadamente 50% de la actividad de TFPI, en el ensayo de inhibición Fxa. JBT0047 (CE50 = 0,7 jm ), JBT0131 (CE50 = 8,2 jm ), JBT0293 (CE50 = 1,3 jm ), JBT0297 (CE50 = 0,6 jm ) y JBT0305 (CE50 = 2,3 jm ) También se restauró la actividad de FXa en presencia de TFPI-1 en el ensayo de inhibición de FXa. Este ejemplo confirma que los péptidos de la invención son antagonistas de TFPI.

Ejemplo 4

[0099] En este ejemplo, la actividad inhibidora de los péptidos TFPI se establece utilizando un ensayo basado en plasma.

[0100] La influencia de los péptidos sobre la generación de trombina se midió por duplicado a través de trombografía automatizada calibradaen un lector Fluoroskan Ascent® (Thermo Labsystems, Helsinki, Finlandia; filtros de excitación a 390 nm y 460 nm) después de la lenta escisión del sustrato fluorogénico específico de trombina Z-Gly-Gly-Arg-AMC (Hemker, Pathofisiol. Hemost. Thromb., 33, 4-15 (2003)). El plasma de pacientes con deficiencia de FVIII o FIX (George King Bio-Medical Inc., Overland Park, KN) se obtuvo para la prueba. La actividad del factor de coagulación residual para cada uno de los plasmas fue inferior al 1%. Como modelo para la deficiencia de FVIII mediada por anticuerpos, se incubó plasma congelado agrupado normal (George King Bio-Medical Inc., Overland Park, KN) con plasma antihumano FVIII de alto título, inactivado por calor, criado en cabra (4490 BU/ml; Baxter BioScience, Viena, Austria) dando lugar a 50 BU/mL. Los plasmas se mezclaron con el inhibidor de la tripsina de maíz (CTI) (Hematologic Technologies, Inc., Essex Junction, VT) para inhibir la contaminación del Factor XIIa, lo que dio como resultado una concentración final de 40 jg/ml.

[0101] Plasma precalentado (37°C) (80 j L) se añadió a cada pocilio de una placa de micro-96 (Immulon 2HB, fondo claro de U; Thermo Electron, Waltham, MA). Para desencadenar la generación de trombina por factor tisular, 10 j L de reactivo bajo de PPP que contiene cantidades bajas (12 pM) de factor tisular humano recombinante y vesículas de fosfolípidos compuestas de fosfatilserina, fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina (48 jm ) (Thrombinoscope BV, Maastricht, Los Países Bajos fueron añadidos. Los péptidos se diluyeron 1/7,5 de las reservas 10 mM con DMSO, y se diluyeron adicionalmente 1/8,33 con Aqua-Dest dando como resultado una concentración de DMSO del 12%, proporcionando una concentración de DMSO del 0,5% en la mezcla de ensayo final. Justo antes de colocar la placa en el lector precalentado (37°C), 5 j L de solución salina tamponada con HEpES con 5 mg/ml de albúmina de suero humano (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, Missouri, EE.UU.) o DMSO al 12% en Aqua-Dest se añadió, seguido de la adición de las diluciones de péptidos o proteínas de referencia (estándar de referencia FVIII Immunate (Baxter BioScience, Viena, Austria); Factor VIII By-Passing Pass-Passing Activity (FEIBA) (Baxter BioScience, Vienna, Austria); NovoSeven (Novo Nordisk, Dinamarca) y FIX de plasma humano purificado (Enzyme Research Laboratories, South Bend, IL)). La generación de trombina se inició mediante la dispensación en cada pocillo 20 j l de reactivo fluca (Thrombinoscope BV, Maastricht, Países Bajos), que contiene un sustrato fluorogénico y tamponado con HEPES CaCl2 (100 mM). La intensidad de la fluorescencia se registró a 37°C.

[0102] Los parámetros de las curvas de generación de trombina resultantes se calcularon utilizando software Thrombinoscope™ (Thrombinoscope BV, Maastricht, Países Bajos) y el calibrador de trombina para corregir de filtro interior y efectos de consumo de sustrato (Hemker, Pathophysiol. Haemost. Thromb., 33, 4 -15 (2003)). Para calcular la actividad generadora de trombina de ciertas concentraciones peptídicas equivalentes a las proteínas de referencia (p.ej., El estándar de referencia FVIII Immunate®, el estándar de referencia FEIBA), las cantidades de trombina en el pico de cada curva de generación de trombina (pico de trombina, nM) se representaron frente a concentraciones estándar, y ajustadas por un algoritmo no lineal. Sobre la base de esta calibración, se calcularon las actividades equivalentes de FVIII Immunate, FIX, FEIBA o NovoSeven. Los resultados para varios péptidos se proporcionan en las Figuras 12-18 y 28-30. En la Tabla 8 se proporcionan resultados representativos (*indica que el plasma deficiente en FVIII se obtuvo de un donante diferente).

TABLA 8

[0103] Con referencia a la Tabla 8, JBT0120, JBT0132, JBT0224 y JBT0303 mejoraron la generación de trombina dependiente de TFPI en plasma con FVIII agotado a niveles superiores al 1% del nivel de generación de trombina en plasma que contiene FVIII (% de actividad de FVIII-equivalente). Los péptidos ensayados exhibieron aproximadamente 5%-40% de actividad equivalente a FVIII en plasma deficiente en FVIII. JBT0120 y JBT0132 mejoraron la trombina pico y el tiempo pico, dependiendo de la dosis, como se ilustra en las Figuras 11A y 11B.

[0104] Mutantes de sustitución en base a la secuencia de aminoácidos de JBT0293 también se ensayaron en un ensayo basado en plasma, así como la inhibición de FXa y ensayo de inhibición de tenasa extrínseca descrito en el Ejemplo 3. Los resultados representativos se proporcionan en la Tabla 9.

TABLA 9

[0105] Además, JBT0477, que comprende la secuencia de aminoácidos de JBT0293 pero para las sustituciones en las posiciones de aminoácidos 5 y 10 de la secuencia de JBT0293, mejora la generación de trombina equivalente a 413 mU/ml de FVIII (a 1 pm de péptido) en plasma deficiente en FVIII. La mutación por sustitución de JBT0293 dio como resultado péptidos altamente optimizados con respecto a la afinidad por el TFPI y una actividad mejorada en la inhibición de FXa, inhibición de la tenasa extrínseca y ensayos basados en plasma.

Ejemplo 5

[0106] El siguiente ejemplo demuestra que los péptidos de la invención pueden ser modificados por la adición de restos que mejoran fisicoquímicas o propiedades farmacocinéticas de los péptidos. Como se ilustra a continuación, la adición de PEG de 40 kDa a los péptidos aquí descritos mejoró dramáticamente el comportamiento farmacocinético de los péptidos. El ejemplo también describe la optimización de un péptido de unión a TFPI, JBT1857, para reducir la susceptibilidad a la proteólisis.

[0107] Los métodos para conjugar restos químicos o biológicos con péptidos son conocidos en la técnica. Para agregar PEG (polietilenglicol) a los péptidos descritos en el presente documento, se agregó un grupo funcional (AOA = acetato de aminooxi) al extremo N de los péptidos para acoplamiento a aldehídos y cetonas. Alternativamente, se añadió una cisteína a la parte C-terminal del péptido para el acoplamiento con maleimid (Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996)). Los péptidos (JBT1586) AOA-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2 (SEQ ID NO: 166) y (JBT1587) Ac-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKLC-NH2 (SEQ ID NO: 167) se usaron para N-terminal del terminal de servicio. Modificación terminal con PEG, respectivamente. AOAFQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2 (SEQ ID NO: 166) y Ac-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKLC-NH2 (SEQ ID NO: 167) se incubaron con un exceso de 40 kDa mPEG-Propionaldehyde (S/N/C) Japón) y 40 kDa mPEG-maleimida (SUNBRIGHT ME-400MA, NOF, Japón), respectivamente. Los péptidos PEGilados resultantes, JBT1852 y JBT1855, muestran afinidades similares en comparación con la estructura de partida Ac-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2 (JBT0740) (SEQ ID NO: 66 ).

[0108] Los péptidos PEGilados resultantes demostrado aumentado significativamente la estabilidad del plasma y vida media de plasma prolongada en ratones. La Figura 31 ilustra los resultados de un análisis farmacocinético del péptido libre JBT0740 (Ac-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2) (SEQ ID NO: 66 ) en comparación con el péptido JBT1855 PEG-PQ-C-terminal PEGilado PEG (40 kD))-NH2) (SEQ ID NO: 252) después de la administración intravenosa a ratones. En contraste con el péptido no PEGilado, el péptido PEGilado está presente en altas concentraciones en plasma de ratón a los 100 minutos después de la administración. El péptido no PEGilado se elimina rápidamente del plasma. La Figura 40 ilustra los resultados de un análisis farmacocinético de JBT1855 después de la inyección subcutánea. JBT1855 también mejoró fuertemente la generación de trombina en el ensayo descrito en el Ejemplo 4 (Figura 41).

[0109] El JBT1852 y JBT1855 péptidos se caracterizaron también en los ensayos descritos en los Ejemplos 1-4 y en comparación con JBT0740 y otros péptidos de la familia JBT0047, Los resultados representativos se proporcionan en la Tabla 10 que se presenta a continuación.

TABLA 10

[0110] Los péptidos enumerados en la Tabla 10 también se sometieron a ensayo para la interacción con anti-diana TFPI-2, y generaron señales demasiado bajas para la medición de afinidad fiable. Los datos sugieren que la PEGilación no anula la actividad inhibitoria de los péptidos de la invención ni afecta negativamente a la selectividad para TFPI-1.

Ensayo de tenasa extrínseca a base de células

[0111] La capacidad de los péptidos de unión a TFPI descritos anteriormente para restaurar conversión mediada por complejo de tenasa extrínseca de las FX a FXa también se determinó usando un ensayo de tenasa extrínseca basado en células. El ensayo de tenasa extrínseca basado en células también se empleó para explorar la influencia de la PEGilación en un ejemplo de péptido de unión a TFPI de la invención, JBT0740. Se contaron las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) y se sembraron en medio de crecimiento completo en una placa de 96 pocillos (negro plano con fondo transparente) a una densidad de 1,5 x 104 células por pocillo. Las células se cultivaron durante la noche (durante aproximadamente 16 a 18 horas), se lavaron dos veces con medio basal precalentado, se estimularon con 1 ng/ml de TNFa recombinante (Sigma Aldrich (Cat. N° T6674)) en 200 pl de medio basal durante cuatro horas a 37°C, y se lavó dos veces con 200 pl de tampón de cultivo celular precalentado. Buffer (50 pl) que contiene FVIIa (Enzyme Research Laboratories), péptidos (disueltos en DMSO o Hepes solución salina tamponada con o sin 0,1% de Tween-80), o unión a TFPI alfa anticuerpos TFPI se aplicaron a las células y se incubaron durante 20 minutos a 37°C, permitiendo la formación del complejo FVIIa/TF y la unión de antagonistas de TFPI a TFPI. Después del período de incubación, se aplicaron 50 pl de tampón de cultivo celular que contenía FX y un sustrato específico de FXa (Fluophen FXa (HYPHEn BioMed)), dando como resultado un volumen final de 100 pl de mezcla de tampón de cultivo celular en las células. Las concentraciones finales fueron: 39 pM FVIIa; 170 nM FX; Fluophen FXa 250 pm y DMSO al 2,5% (cuando los péptidos se disolvieron en DMSO).

[0112] La placa de 96 pocillos se transfirió a un lector de fluorescencia pre-calentado (37°C) para la detección de conversión de sustrato fluorogénico específico a Fxa por FXa, que se genera por el complejo TF/FVIIa en la superficie de HUVEC estimuladas. Las lecturas tomadas después de nueve minutos de incubación se utilizaron para el cálculo del efecto inhibidor de TFPI de los péptidos o anticuerpos de unión a TFPI. El porcentaje aproximado de inhibición de TFPI observado a diversas concentraciones de los siguientes péptidos (pertenecientes a la familia JBT0047) se establece en la Tabla 11: JBT0717 (Ac-FQSK-Nmg-NVFVDGY-FERLRAKL-NH2) (SEQ ID NO: 61), JBT0740 (Ac-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2) (SEQ ID NO: 66), JBT1584 (Ac-FQSK-Nmg-NVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2) (SEQ ID NO: 164), y JBT188 Ac-FQSKpNVHVDGYFERL-Aib-AKL-NH2) (SEQ ID NO: 178).

TABLA 11

[0113] Los péptidos PEGilados también se ensayaron usando el ensayo de tenasa extrínseca basado en células. JBT0740 (Se Q ID NO: 66) se conjugó con un resto PEG de 1 kD en el extremo N para producir JBT1853 o en el extremo C para producir JBT1854, JBT1853 y JBT1854 inhibieron el TFPI en un 20% o menos dependiendo de la cantidad de péptido utilizado en el ensayo. JBT1855, que comprende un resto de PEG de 40 kD en el extremo C (péptido parental, JBT0740) se desempeñó mejor en el ensayo basado en células que JBT1852, que comprende un resto de PEG de 40 kD en el extremo N. JBT1855 medió 20-30% de inhibición de TFPI, mientras que JBT1852 inhibió la actividad de TFPI en un 10% o menos.

[0114] Los péptidos de la familia JBT0120, JBT0120, JBT0415, JBT0444, JBT1426, y JBT1837, también se ensayaron en el ensayo de tenasa extrínseca basada en células y se encontró que inhiben TFPI en un grado menor en comparación con péptidos de la familia JBT0047. La actividad inhibitoria reducida o parcial puede desearse en algunas realizaciones de la invención. Similarmente a los péptidos de la familia JBT0047, la optimización de péptidos incrementó la actividad inhibidora de TFPI de los péptidos de la familia JBT0120.

[0115] En el curso del examen de la estabilidad y la actividad inhibidora de JBT1857, se determinó que la secuencia de aminoácidos del péptido contenía un sitio de escisión de proteasa entre val9 y Asp10. La sustitución de Tle en la posición 9 (generando JBT2431) y la sustitución de Pro en la posición 10 (generando JBT2432) bloqueó la escisión del péptido y mejoró la estabilidad plasmática del péptido en aproximadamente el triple del 27% (JBT1857) al 82% (JBT2431) y 76% (JBT2432). Se identificó un sitio de escisión putativo adicional entre GlY11 y TyR12. Una sustitución G11a (que genera JBT2414) mejoró aún más la estabilidad del péptido al 100%. Todas las estabilidades se determinaron mediante ELISA cuantitativo después de 24 horas de incubación en plasma humano.

[0116] Los resultados descritos anteriormente demuestran que la optimización de los péptidos de unión a TFPI descritos en la presente memoria utilizando inhibición TFPI mejorada por aminoácidos no convencionales y la estabilidad del plasma. Además, los péptidos PEGilados de la invención inhiben la actividad de TFPI en un ensayo de tenasa extrínseca basado en células, con péptidos PEGilados C-terminales que funcionan mejor que los péptidos PEGilados N-terminales. Los péptidos de unión a TFPI de la invención inhiben la actividad tanto de TFPI libre como de TFPI unido a células.

Ejemplo 6

[0117] El siguiente ejemplo ilustra la capacidad de los péptidos descritos en el presente documento para reducir el sangrado en un modelo animal.

[0118] Los ratones C57B1/6NCR1 de diez semanas de edad se alojaron durante dos semanas antes del estudio. Treinta minutos antes del corte de uñas, a los animales se les administró (a) JBT1855 (10 mg/kg) por vía intravenosa (i.v.) a través de la vena de la cola o por vía subcutánea (s.c.) en la región del cuello, (b) anticuerpo anti-TFPI (18 mg/kg; i.v.), o (c) vehículo (NaCl 175 mM, HEPES 25 mM, pH 7,35; 10 ml/kg; i.v.). Los animales se anestesiaron con 80 mg/kg de pentobarbital diez minutos antes del corte de uñas. Para lograr el sangrado, se retiró la uña del dedo pequeño de la pata trasera derecha. La pata se sumergió en una solución de NaCl al 0,9% para la extracción de sangre durante un período de 60 minutos. La pérdida de sangre se cuantificó después de la lisis por espectrofotometría. La temperatura se mantuvo constante a 37°C durante el transcurso del experimento. Los resultados del estudio se ilustran en la Figura 42 y se resumen en la Tabla 12.

TABLA 12

[0119] La administración intravenosa o subcutánea de JBT1855, un péptido PEGilado de la invención, la reducción de la pérdida de sangre en ratones en comparación con el tratamiento con vehículo solo.

Ejemplo 7

[0120] El siguiente ejemplo describe la caracterización de las interacciones de péptid de TFPI a través de resonancia magnética nuclear y cristalografía de rayos x. En particular, el sitio de unión de TFPI de los péptidos antagonistas JBT0303, JBT0122 y JBT0415; los residuos de JBT0303, JBT0122 y JBT0415 que interactúan con TFPI160; y la estructura secundaria de JBT0303 complejado y libre, JBT0122 y JBT0415 se investigaron a nivel molecular utilizando espectros 2D 15N-heteronucleares de coherencia cuántica única (HSQC). La interacción de JBT1857 y KD1 de TFPI se examinó utilizando cristalografía de rayos X, y se mapearon los residuos de TFPI KD1 que median la unión a JBT1857.

Identificación del sitio de enlace de JBT0303 en TFPI160

[0121] Una preparación etiquetada con 15N de TFPI160 se utilizó para experimentos de titulación de TFPI160 con JBT0303. Los espectros HSQC de una muestra de ~ 500 pm 15N-TFPI160 sin y con cantidades crecientes de péptido se registraron a 30°C en un espectrómetro Varian de 600 MHz. La interacción péptido-proteína mostró un comportamiento de intercambio lento (kex << Au>), lo que significa que cada residuo de TFPl produce una señal definida para la proteína libre y el complejo proteína-péptido. A diferencia del comportamiento de intercambio rápido (kex >>Au>), donde una mezcla produce solo un pico con una posición promedia según la población de la especie, el comportamiento de intercambio lento no permite el seguimiento de las señales sobre la unión del péptido. Por lo tanto, para ubicar el sitio de enlace, los picos desplazados del complejo TFPI160-JBT0303 debían asignarse. Esto requirió la preparación de una muestra de 13C/15N-TFPI160 y JBT0303.

[0122] Inicialmente, se preparó una muestra con 992 pm 13C/15N-TFPI160 y 1190 pm JBT0303. Sin embargo, la muestra de RMN dio como resultado espectros de baja calidad que no permitieron la asignación del complejo. La muestra se gelificó, probablemente debido a la formación de agregados de alto peso molecular. Por lo tanto, los datos de RMN adquiridos mostraron predominantemente señales que surgen de las partes más flexibles del TFPI160 marcado con isótopos. Por lo tanto, las condiciones de la muestra se volvieron a investigar para experimentos adicionales. A partir de una serie de experimentos 15N-HSQC realizados en el complejo TFPI160-JBT0303, se concluyó que la formación de geles podría evitarse mediante la dilución de la muestra y la adquisición de datos a temperatura elevada. La concentración final de 13C/15N-TFP1160 fue de 331 pm y la de JBT0303 fue de 397 pm. La calidad del espectro mejoró. Debido a la menor concentración y la reducción de la relación señal/ruido, la asignación tuvo que realizarse en base a los experimentos HNCA, HNCO y HNCOCA.

[0123] Excepto por cuatro residuos asignados previamente, todos los residuos que podrían asignarse en el apo TFPI160 podrían asignarse en el complejo TFPI160-JBT0303. La asignación de algunos residuos fue ambigua debido a la falta de picos en los espectros 3D. Además, los picos de tres residuos solo eran visibles en el espectro HSQC del experimento de titulación original. Sin embargo, todos los picos en la vecindad se asignaron de manera inequívoca y, por lo tanto, la asignación de estos residuos probablemente sea correcta.

[0124] Cambios de desplazamiento químico de las señales de HSQC de 15N-TFPI160 unido a JBT0303 comparado con TFPI160 libre se ilustra en la Figura 43. Los residuos sometidos al desplazamiento químico más fuerte eran exclusivamente en el Dominio Kunitz 1, desplazamientos químicos de los residuos F25, F28, D32, A37, T48 e Y56 son los que más se desplazan (>2 ppm). Los residuos I38, I46, F47 y F54 también cambiaron más de 1,5 ppm. No está claro si los residuos N-terminal de F25 están implicados en la interacción con JBT0303 porque los residuos 20-24 no están asignados. L19 muestra un cambio de desplazamiento químico que asciende a ~ 0,6 ppm. Por lo tanto, a diferencia de las creencias previas de que los aminoácidos en los residuos 1-18 de TFPI están involucrados en la unión a péptidos, los datos actuales sugieren que hay poca, si existe, unión de péptidos a la cola N-terminal de TFPI. En la Figura 44 se muestra un modelo de cinta de la estructura secundaria de la proteína TFPI que ilustra las regiones de cambios de cambio químico de las señales HSQC de TFPI160 unidas a JBT0303 en comparación con el TFPI160 libre.

[0125] Para identificar más particularmente el sitio de unión de JBT0303 en TFPI160, se determinaron los tipos de cambio de amida de 15N-TFPI160 y 15N-TFPI160 JBT0303. El experimento de intercambio de amida detecta principalmente cambios en el medio ambiente del esqueleto peptídico midiendo el intercambio de H de los grupos amida. La frecuencia de H2O se irradia con una potencia lo suficientemente alta como para no disiparse por la relajación, lo que resulta en una saturación completa y la supresión de la señal de H2O. Un efecto secundario de este método de supresión de señal de H2O es que la supresión se transfiere a NHs de amida intercambiable que intercambian con disolvente (intercambio H/H). La transferencia de saturación depende del tipo de cambio H/H que es semicuantitativo. El efecto se reduce para grupos NH más protegidos (es decir, los NH no protegidos se atenúan más que los NH protegidos). Si un NH protegido se encuentra cerca de H-alfas de un ligando, se observa una tasa de cambio más alta en comparación con la forma apo. De manera similar, los intercambios de H pueden ser mediados por los grupos OH de Ser, Thr o Tyr.

[0126] Se registraron los espectros HSQC sin y con supresión con agua de apo 15N-TFPI160 y el complejo 15N-TFPI160-JBT0303. La tasa de cambio relativa de cada residuo de TFPI160 se determinó calculando la relación de las intensidades máximas en los espectros de HSQC con y sin supresión de agua. Una comparación de los conjuntos de datos de 15N-TFPI160 y 15N-TFPI160 JBT0303 reveló que los residuos de TFPI 25, 26, 36, 62, 63, 127, 132 y 152 mostraron una tasa de cambio amida disminuida en más del 10% en el complejo, mientras que los residuos 29, 30, 42, 45, 49, 50, 56, 66 y 98 mostraron una tasa de cambio mayor al 10%.

[0127] Se incluyeron restricciones derivadas del experimento de cambio de amida para el cálculo de modelos HADDOCK refinados: (a) los ángulos de torsión se toman de los cálculos de TALOS para K4, K5, V7, F8 , Y12-A18 de JBT0303 (experimentos de desplazamiento químico); (b) los residuos de KD1 con cambios de cambios químicos de más de 1,5 ppm están involucrados en la unión JBT0303: F25, F28, D32, A37, I38, I46, F47, T48, F54 y Y56 (experimentos de cambio químico); (c) el lado hidrofóbico de la hélice anfipática de JBT0303 está unido a KD1: Y12 o L16 o L20 de JBT0303 se unen a D32 o A37 o 138 o F54 o Y56 de KD1 (experimentos de cambio químico); (d) R15 o K19 de JBT0303 se unen a D31 o D32 o E60 de KD1 (experimentos de cambio químico); (e) F8 o V9 de j Bt 0303 se unen a F25 o F28 de KD1 (experimentos de cambio químico); (f) Y12 o F13 de JBT0303 se unen a 146 o F47 o T48 de KD1 (experimentos de cambio químico); (g) Q2 de JBT0303 se une a Y56 de KD1 (experimentos de cambio químico); (h) F1 de JBT0303 se une a M39 o F66 de KD1 (experimentos de intercambio de amidas); (i) S3 o K4 o K5 de JBT0303 se unen a F66 (experimentos de intercambio de amidas); (j) V7 o F8 o V9 de JBT0303 se unen a F25 o C26 o N62 o Q63 de KD1 (experimentos de intercambio de amidas); (k) V9 o D10 o G11 o R15 de JBT0303 se unen a F28 o K29 o A30 de KD1 (experimentos de intercambio de amidas); (1 ) Y12 o F13 de JBT0303 se unen a N45 de KD1 (experimentos de intercambio de amidas); (m) Y12 o F13 o E14 o R15 se unen a R49 o Q50 de KD1 (experimentos de intercambio de amidas); y (n) L20 de JBT0303 se une a K36 de KD1 (experimentos de intercambio de amidas). Los datos convergieron esencialmente a un modelo del complejo KD1 JBT0303.

Identificación del sitio de enlace de JBT0122 en TFPI160

[0128] Al igual que con el complejo 13C/15N-TFPI160 JBT0303, la muestra 13C/15N-TFPI160 JBT0122 RMN resultó en espectros de mala calidad debido a la formación de un gel. La concentración de 723 pm 13C/15N-TFPI160 JBT0122 condujo a la formación de agregados de orden superior. La muestra se diluyó a 361,5 pm y los espectros se registraron a 37°C, lo que resultó en una mejor calidad de los espectros. Se adquirieron los espectros HNCO, HNCA y HNCOCA. Excepto por cinco residuos, todos los picos previamente asignados de apo-TFPI160 podrían asignarse en el complejo TFPI160-JBT0122. Los residuos que experimentan los cambios químicos más fuertes y que probablemente interactúen con el péptido a menudo no producen picos en los espectros 3D. Sin embargo, los picos en la región enlazadora entre el dominio 1 de Kunitz (KD1) y el dominio 2 de Kunitz (KD2) también mostraron bajas intensidades. Por lo tanto, la asignación de estos picos es ambigua. Algunos picos solo fueron visibles en e1HSQC del experimento de titulación original. Su asignación fue en la mayoría de los casos cierta, ya que los picos se superponían en los espectros TFPI160 y TFPI160 JBT0122 HSCQ.

[0129] Cambios de desplazamiento químico de las señales de HSQC de 15N-TFPI160 unidos a JBT0122 en comparación con TFPI160 libre se ilustran en la Figura 45. Los cambios de desplazamiento químico significativos se encontraron exclusivamente para residuos de KD2. En general, la extensión de los cambios químicos causados por la unión de JBT0122 a TFPI160 fue menos pronunciada que la de JBT0303. Los residuos con la perturbación más fuerte del cambio químico fueron F96, G128, G129, G132, N133 y N136, C97, E101, T111, F114, N135 y F137 fueron perturbados, exhibiendo cambios químicos de cambio de más de 0,5 ppm. En la Figura 46 se muestra un modelo de cinta de la estructura secundaria de la proteína TFPI que ilustra las regiones de cambios de cambio químico de las señales HSQC de TFPI160 unidas a JBT0122 en comparación con el TFPI160 libre.

Residuos de identificación de JBT0122 que interactúan con TFPI160

[0130] Para la asignación secuencial de la señal del esqueleto de JBT0122, el péptido marcado con 13C/15N se produjo de forma recurrente. Brevemente, el péptido se expresó como una proteína de fusión con tiorredoxina en E. coli. El péptido marcado con 13C/15N se preparó usando medio M9 que contenía 3,0 g/l de 13C-glucosa y 1,0 g/l de 15NH4Cl. La proteína de fusión se purificó por afinidad utilizando una columna quelante de Ni y una etiqueta de poli-histidina. El péptido fue escindido por la trombina. La tiorredoxina/his-tag y la trombina se eliminaron utilizando una columna quelante de Ni y una columna de benzamidina, respectivamente. El péptido se purificó luego por cromatografía de fase inversa. La pureza, la integridad y la identidad se verificaron mediante SDS-PAGE, RP-HPLC y espectrometría de masas. El JBT0122 recombinante se denominó JBT0788 y tenía dos residuos adicionales en su extremo N, glicina y serina, que representan los restos del sitio de escisión de la trombina.

[0131] La asignación de JBT0788 se hizo sobre la base de HSQC, HNCACB, HNCA, HNCO y espectros HNN registrado a 10°C en un espectrómetro Varian 600 MHz y asignado usando el software SPARKY. La temperatura se redujo en comparación con los experimentos de RMN con TFPI160 para mejorar la calidad del espectro. De los espectros registrados, se asignaron el carbono carbonílico (C), el carbono alfa (CA), el carbono beta (CB), el protón amida (H) y el nitrógeno amídico (N) de la mayoría de los residuos. La asignación para los residuos H13 y R17 fue ambigua. Un HNCOCA condujo a una asignación inequívoca para estos residuos.

[0132] Una tabla de asignación para JBT0788 se proporciona en la Figura 47. Dos conjuntos de señales para los residuos 4-12 fueron observados en los espectros de JBT0788. Teniendo en cuenta que la estructura primaria de JBT0788 no está comprometida, los dos conjuntos de señales probablemente resulten de una isomerización cis/trans del enlace peptídico entre F6 y P7. Se determinó una relación de 76:24 para conformación mayor: menor basada en las intensidades de las señales correspondientes en el espectro de HSQC. Como se juzga a partir del cambio C a de la prolina, la conformación mayoritaria es probablemente trans, ya que su valor C a de 63,16 ppm es mayor que el de la conformación menor (62,49 ppm).

[0133] Uno de los propósitos de la asignación era extraer la estructura secundaria del péptido de desplazamientos químicos de Ca. Los desplazamientos químicos de Ca están influenciados por los ángulos 9 y 9 y, por lo tanto, por la estructura secundaria del péptido. En las cadenas p, Ca generalmente se desplaza a ppm más bajas; en las hélices a, Ca generalmente se desplaza a ppm más altas. Al restar el valor de Camedido de un valor de bobina aleatorio tabulado, los valores negativos se calculan para los residuos en cadenas p y los valores positivos para los residuos en hélices a. Por lo tanto, un lote de valores negativos consecutivos indica una cadena p, mientras que un lote de valores positivos consecutivos indica una hélice a.

[0134] JBT0788 exhibieron una amplia parche de un aumento de valores Ca (A8 (Ca) = Camedido-Caespiral aleatoria) que indica una a-hélice que comprende los restos 8 a 26, valores AS(Ca) para a-hélices estables dentro de estructuras terciarias de proteínas nativas están típicamente entre 3-4 ppm. Los valores de AS(Ca) de la hélice a de JBT0788 aumentan hasta alrededor de 1,7 ppm, lo que indica más flexibilidad que una hélice promedio dentro de una proteína. Otra característica de JBT0788 es la prolina en la posición 7, directamente N-terminal a la hélice a, que se adapta bien a las hélices a en las proteínas con frecuencia terminadas por una prolina en el extremo N. El residuo 6 tiene un fuerte valor negativo, que es causado por la prolina vecina que se sabe que fuerza a su vecino N-terminal en una conformación similar a una cadena p. El fuerte valor positivo del residuo C-terminal 31 también es típico de los residuos sin un C-terminal vecino. El enlace peptídico entre f6 y P7 en JBT0788 adopta dos conformaciones, una conformación trans (76%) y una cis (24%). La conformación en esta posición impacta la conformación de los residuos consecutivos. En la isoforma trans, la hélice a comienza inmediatamente después de P7; La hélice a de la isoforma cis no comienza hasta el residuo L12. En la Figura 48 se muestra un modelo de cinta que ilustra la estructura secundaria de JBT0788 libre.

[0135] Los desplazamientos químicos dentro de JBT0788 también se pueden emplear para calcular los ángulos de torsión utilizando software TALOS. TALOS es un sistema de base de datos para la predicción empírica de ángulos de torsión del eje Phi y Psi utilizando una combinación de cinco tipos (HA, CA, CB, CO, N) de las asignaciones de desplazamiento químico para una secuencia de proteína o péptido dado. El enfoque TALOS es una extensión de la observación de que muchos tipos de cambios químicos secundarios (es decir, las diferencias entre los cambios químicos y sus correspondientes valores aleatorios de la bobina) se correlacionan con aspectos de la estructura secundaria de la proteína. El objetivo de TALOS es utilizar información secundaria de desplazamiento y secuencia para realizar predicciones cuantitativas para los ángulos de la estructura de la proteína 9 y 9 , y proporcionar una medida de las incertidumbres en estas predicciones. TALOS usa los desplazamientos secundarios de un residuo dado para predecir los ángulos 9 y 9 para ese residuo. TALOS también incluye la información de los residuos siguientes y anteriores al hacer predicciones para un residuo dado. La idea detrás de TALOS es que si uno puede encontrar un triplete de residuos en una proteína de estructura conocida con cambios secundarios similares y la secuencia de un triplete en una proteína diana, entonces los ángulos 9 y 9 en la estructura conocida serán predictores útiles para la ángulos en el objetivo. En la práctica, TALOS busca en la base de datos las 10 mejores coincidencias con un triplete dado en la proteína objetivo.

[0136] Con el fin de asignar el espectro HSQC de JBT0788 complejado con TFPI160, se preparó una muestra que consiste en 400 pm 13C/15N-JBT0788 y 400 pm TFPI160. Al igual que con las muestras anteriores de RMN de péptido y TFPI160, la muestra se gelificó. La muestra se diluyó y el sedimento se disolvió en DMSO deuterado, dando como resultado una concentración final de ~ 300 pm 13c /15N-JBT0788 TFPI160 y 5% de DMSO. Las mediciones se realizaron a 40°C. Esto mejoró la calidad de los espectros adquiridos. Los experimentos se adquirieron en el modo TROSY para tener en cuenta las propiedades de relajación de una muestra parcialmente agregada. Se empleó la tecnología de crio-sonda en el espectrómetro Varian 600 MHz debido a la baja concentración del complejo proteínapéptido en la muestra. La calidad de los datos resultante fue suficiente para obtener los cambios de la red troncal de JBT0788 cuando se utiliza la tecnología de crio-sonda y se adquieren los experimentos de triple resonancia por duplicado. La asignación de JBT0788 en complejo con TFPI160 se realizó sobre la base de los espectros HNCa , HNCOCA y HNCO. A partir de los espectros registrados, se asignaron el carbono carbonílico (CO), el carbono alfa (CA), el protón amida (H) y el nitrógeno amídico (N) de la mayoría de los residuos. En la Figura 49 se proporciona una tabla de asignación para JBT0788 complejada con TFPI160.

[0137] Una característica de apo-JBT0788 fue la presencia de dos conjuntos de señales para los residuos de aminoácidos 4-12, probablemente como resultado de un cis/trans isomerización del enlace peptídico entre F6 y P7, En el complejo JBT0788-TFPI160, solo se observa un conjunto de picos, lo que implica que solo una de las conformaciones se une a TFPI160, Apo-JBT0788 también mostró un amplio parche de valores incrementados de Ca (AS (Ca) = Camedido - Caespiral aleatoria = positiva) que indica una hélice a que va desde el residuo 8 hasta el residuo 26. Como se mencionó anteriormente, AS (Los valores de Ca) para los hélices a estables dentro de las estructuras terciarias de las proteínas nativas están típicamente entre 3-4 ppm. Los valores de AS (Ca) de la hélice a de apo-JBT0788 aumentan a aproximadamente 1,7 ppm, lo que indica más flexibilidad que una hélice promedio dentro de una proteína. Cuando se complejaron con TFpI, los residuos 8 a 26 mostraron valores de entre 3-5 ppm, lo que indica la formación de una hélice a estable o hélices. Un modelo de cinta que ilustra la estructura secundaria de JBT0788 cuando se complejan con TFPI160 se muestra en la Figura 50. Los grandes cambios químicos producidos por JBT0788 provocados por la unión con TFPI160 se distribuyen uniformemente a lo largo del péptido. Los residuos que experimentaron la mayor perturbación del cambio químico fueron los residuos S5, A9, Q11, Y28 y K29 con más de 4 ppm. Los residuos Y3, A4, V10, L12, S15, M21, A22, L23 y A24 fueron perturbados por más de 3 ppm.

Identificación de residuos de JBT0303 que interactúan con TFPI160

[0138] El JBT0303 se produjo de forma recombinante utilizando el mismo procedimiento descrito anteriormente para JBT0122 y se marcó con isótopos con 13C y 15N. El JBT0303 recombinante se denominó JBT0616 y tenía una glicina y serina adicionales en su extremo N-terminal. La asignación de JBT0616 se realizó sobre la base de los espectros HSQC, HNCACB y HNN, que se registraron a 10°C en un espectrómetro Varian de 500 MHz y se asignaron utilizando el software SPARKY. La calidad de los espectros de JBT0616 fue mejor que la de JBT0788, aunque las condiciones experimentales con respecto al tampón, la temperatura, el tubo de RMN y los parámetros de RMN fueron idénticas. Se asignaron el carbono alfa (CA), el carbono beta (CB), el protón amida (H) y el nitrógeno amídico (N) de la mayoría de los residuos. La asignación se basó principalmente en el HNCACB menos sensible pero más informativo en lugar del HNCA. En combinación con el espectro HNN, esto dio lugar a una asignación inequívoca de todos los residuos derivados de JBT0303.

[0139] Se proporciona una tabla de asignación para JBT0616 en la Figura 51. La estructura secundaria se extrajo de los cambios químicos de Ca y se determinó mediante TALOS utilizando las asignaciones de H, CA, CB, CO y N. Como JBT0788, JBT0616 exhibió un parche de Valores positivos de AS (Ca) indicativos de conformación helicoidal a. La hélice estaba ubicada en la parte C-terminal del péptido y comprendía los residuos 10-18, En cuanto a JBT0788, se calcularon valores de AS (Ca) de hasta aproximadamente 1,8 ppm, calificando esta hélice como relativamente estable para un péptido tan corto. En la Figura 52 se muestra un modelo de cinta que ilustra la estructura secundaria de JBT0616, El fuerte valor positivo del residuo C-terminal 20 es, como el residuo 31 en JBT0788, típico de los residuos sin un vecino C-terminal. Los residuos N-terminales 1-9 de JBT0616 exhibieron valores de A y (Ca) ligeramente positivos, lo que sugiere una preferencia por una estructura helicoidal a.

[0140] La asignación de JBT0616 en complejo con TFPI160 se realizó con una muestra de péptido etiquetada con 13C/15N con un exceso de TFPI160 no marcado. Los espectros HSQC, HNCA, HNCOCA y Hn Co se registraron en un espectrómetro Varian de 800 MHz y se asignaron utilizando el software SPARKY. Los espectros se registraron a 30°C. Usando estos espectros, se asignaron el carbono alfa (CA), el carbono beta (CO), el protón amida (H) y el nitrógeno amídico (N) de la mayoría de los residuos, como se muestra en la tabla de la Figura 53. La estructura de JBT0616 en complejo con TFPI160 se extrajo de los desplazamientos químicos de Ca y se calculó mediante TALOS. Al igual que el péptido libre, JBT0616 en complejo con TFPI160 exhibió un parche C-terminal de valores positivos de AS (Ca) indicativos de conformación helicoidal a. La estabilidad de la hélice a aumenta con la formación de complejos. Este hallazgo sugiere que la región C-terminal de JBT0616 es el motivo de unión al núcleo. Los valores de AS (Ca) para los residuos N-terminales también cambiaron, pero en menor medida. La estructura secundaria de JBT0616 cuando está en complejo con TFPI se ilustra en el modelo de cinta en la Figura 54.

[0141] Se observaron los cambios más significativos de los desplazamientos químicos sobre la formación de complejos para los residuos de Q2, K5, F8, V9 y A18 de JBT0616 con más de 7 ppm. Los residuos F13, R17, K19 y L20 también se perturbaron y demostraron cambios químicos de más de 4 ppm. Los fuertes cambios químicos de los cambios en los residuos en el extremo N indicaron que no es solo la hélice a C-terminal anfipática la que impulsa la unión del péptido al TFPI160.

[0142] Los resultados de los experimentos de RMN en combinación con el análisis de las sustituciones de JBT0477 se usaron para crear un modelo de KD1 en complejo con JBT0303 utilizando el software HADDOCK (DOCKING de proteína-proteína impulsada por la alta ambigüedad). HADDOCK es un enfoque de acoplamiento flexible impulsado por la información para el modelado de complejos biomoleculares. HADDOCK se distingue de los métodos de acoplamiento ab-initio en el hecho de que codifica información de interfaces de proteínas identificadas o predichas en restricciones de interacción ambiguas (AIR) para impulsar el proceso de acoplamiento. La identificación del sitio de unión en TFPI160 y los péptidos según lo revelado por los datos de desplazamiento químico, los ángulos de torsión de los péptidos determinados por el software TALOS y el análisis de sustitución de JBT0477 proporcionan las restricciones para el cálculo de los modelos.

[0143] Para el cálculo de los modelos KD1-JBT0303 eglefino, se emplearon los siguientes restricciones: (a) los ángulos de torsión se tomaron de los cálculos de TALOS para K4, K5, V7, F8, Y12-A18 de JBT0303; (b) los residuos de KD1 con cambios químicos de más de 1,5 ppm están involucrados en la unión a JBT0303: F25, F28, D32, A37, I38, I46, F47, T48, F54 y Y56; (c) el lado hidrófobo de la hélice anfipática de JBT0303 está unido a KD1: Y12 o L16 o L20 de JBT0303 se unen a D32 o A37 o 138 o F54 o Y56 de KD1; (d) R15 o K19 de JBT0303 se une a D31 o D32 o E60 de KD1; (e) F8 o V9 de JBT0303 se une a F25 o F28 de KD1; (f) Y12 o F13 de JBT0303 se une a 146 o F47 o T48 de KD1; y (g) Q2 de JBT0303 se une a Y56 de KD1, La interacción Q2 JBT0303- Y56 KD1 también se tomó como una restricción para el cálculo del modelo.

[0144] Se observaron cambios de desplazamiento químico fuertes para K5 de JBT0303 sobre la formación del complejo. Para los residuos restantes de JBT0303 considerados para impulsar la interacción péptido-proteína, los modelos están de acuerdo con los datos. El modelo de KD1-JBT0303 con la energía más baja coloca a F8 de JBT0303 cerca de F25 y F28 de TFPI, explicando los cambios químicos observados y los datos del análisis de sustitución. V9 de JBT0303 interactúa con el parche hidrofóbico del KD1 incluido F54, Y12, F13, L16 y L20 de JBT0303 también se enfrentan al parche hidrófobo del KD1. La proximidad de Y12 a F28, I46, T48 de F13 a F47, T48, de L16 a F54 y de L20 a A37, l38 provoca las perturbaciones observadas del cambio químico de RMN de esos residuos en el complejo; la conservación de Y12 y L l6 puede deberse a las interacciones extensas de estos residuos con la proteína. K l9 de JBT0303 está en una posición que permite la interacción con D32 de KD1. El papel de R15 de JBT0303 parece ser una interacción con el parche hidrófobo de KD1, así como con D32. Además, el modelo explica por qué se prefiere un aspartato cargado negativamente en la posición 10 de JBT0303; puede interactuar con el K29 cargado positivamente de KD1. Una glicina en la posición 11 de JBT0303 está presente debido a las restricciones estéricas y conformacionales en esta posición. En la Figura 55 se proporciona un modelo HADDOCK de KD1 (residuos de TFPI 22-79 que comprenden KD1) en complejo con JBT0303.

Modelos de JBT0740 y JBT1857 unidos a KD1

[0145] Los péptidos JBT0740 y JBT1857 (FQSK-DP-NBHBDGYFERL-Aib-AKL (SEQ ID NO: 178)), ambos derivados de JBT0303, demuestran valores CE50 mejorados significativamente en el ensayo de inhibición de FXa-TFPI (0,11 pm y 0,0023 pm, respectivamente) y Kd más bajos según lo determinado por Biacore. Los modelos de JBT0740 y JBT1857 en complejo con TFPI KD1 (residuos 22-79 de TFPI160) fueron calculados por HADDOCK usando restricciones similares a las de JBT0303: (a) las restricciones para los ángulos de torsión de los residuos 4 y 5 de JBT0740 y JBT1857 se modificaron para tener en cuenta las sustituciones en la posición 5 de los derivados JBT0303; (b) los ángulos de torsión se tomaron de los cálculos de TALOS para V7, F8, Y12-A18 de JBT0303 y, a diferencia de JBT0303, no se dieron valores fijos para Phi y Psi para K4 y para NmetG5/dP5; (c) NmetG5 y dP5 están en la conformación cis; (d) los residuos de k D1 con cambios químicos de más de 1,5 ppm están involucrados en la unión a JBT0303: F25, F28, D32, A37, I38, I46, F47, T48, F54 y Y56; (e) el lado hidrófobo de la hélice anfipática de JBT0303 está unido a KD1; (f) Y12 o L16 o L20 de JBT0303 se unen a D32 o A37 o 138 o F54 o Y56 de KD1; (g) los residuos R15 o K19 de JBT0303 se unen a D31 o D32 o E60 de KD1; (h) los residuos F8 o V9 de JBT0303 se unen a F25 o F28 de KD1; (i) los residuos Y12 o F13 de JBT0303 se unen a 146 o F47 o T48 de KD1; y (j) el residuo Q2 de JBT0303 se une a Y56 de KD1.

[0146] Los modelos ABADEJOS energéticamente más favorables de JBT0740 y JBT1857 ilustran un modo diferente de la unión en comparación con JBT0303. Las diferencias más obvias se encontraron en la región de los residuos 5 a 11. Se observaron desviaciones menos dramáticas en el extremo N y en el extremo C de los péptidos. Sin embargo, la unión diferente de los términos también podría contribuir a la unión optimizada de los derivados JBT0303 a TFPI.

Estructura cristalina de rayos X d e JBT1857 unido a KD1

[0147] La estructura cristalina de KD1 en complejo con un péptido de unión KD1, JBT1857, se determinó. El TFPI se expresó de forma recombinante en E. coli y se replegó oxidativamente a partir de cuerpos de inclusión. Aminoácidos 1-150 de TFPI que comprende un sitio de escisión de trombina dentro de la secuencia de engarce TFPI unirse a KD1 y KD2 (TFPI1-150-trombina (MADSEEDEEHTIITDTELPPLKLMHSFCAFKADDGPCKAIMKRFFFNIFTRQCEEFI YGGCEGNQNRFESLEECKKMCTRDNANRLVPRGSQQEKPDFCFLEEDPGICRGYI TRYFYNNQTKQCERFKYGGCLGNMNNFETLEECKNICEDG (SEQ ID NO: 4235)) fue clonado en un vector de expresión de E. coli (pET19b). La secuencia TFPI 1-150-Trombina comprende dos aminoácidos en el extremo N que son artefactos de la expresión recombinante y no son parte de la secuencia de aminoácidos TFPI de tipo silvestre. Las secuencias que codifican Los dominios Kunitz 1 y 2 están en negrita. E. coli (BL21 (DE3) pLysS) se cultivó en MagicMedia™ y TFPI 1-150-Trombina se expresó como cuerpos de inclusión insolubles. Los cuerpos de inclusión se recogieron mediante lisis de E. coli mediante incubación con BugBuster Master Mix y se purificaron después de lavarse con Tris/HCl 50 mM, pH 8, Tween 20 al 0,1%. Los cuerpos de inclusión se disolvieron en urea 8M, Tris/HCl 50 mM, pH 8,0 y TFPI 1-150-trombina se redujo al Además de 20 mM de TDT. El replegamiento oxidativo se realizó mediante una dilución rápida de 1/10 en un tampón que contenía Tris/HCl 50 mM, pH 10 y glutatión oxidado 1,1 mM, seguido de diálisis excesiva contra Tris/HCh0 mM, pH 7. Se purificó TFPI1-150-trombina replegada. protocolo de purificación secuencial utilizando un medio de intercambio de aniones Q Sepharose FF y un medio de afinidad peptídica (JBT131). TFPI1-150-TFPI purificada se digerió proteolíticamente por incubación con trombina (1U trombina/mg TFPI1-150-trombina, sitio de escisión, LVPr /GS) que resulta en la generación de Nterm KD1-trombina (MADSEEDEEHTIITDTELPPLKLMHSFCAFKADDGPCKAIMKRFFFNIFTRQCEEFI GGCEGNQNRFESLEECKKMCTRDNANRLVPR (SEQ ID NO: 4236)) y KD2-trombina (GSQQEKPDFCFLEEDPGICRGYITRYFYNNQTKQCERFKYGGCLGNMNNFNFLEXEQUETE ECKNICEDG (SEQ ID NO: 4237)). Nterm KD1-Trombina se purificó a partir de la mezcla de digestión utilizando benzamidina sefarosa para la eliminación de trombina, seguida de una columna de afinidad del péptido JBT131. Se usó Nterm KD1-Trombina purificada para la formación de complejos con JBT1857 y posterior cristalización.

[0148] El péptido antagonista, JBT1857, se preparó por síntesis en fase sólida. La co-cristalización exitosa de complejos equimolares se obtuvo bajo MES 100 mM, pH 6,5, PEG 4000 al 20%, NaCl 600 mM. Los cristales difractaron a una resolución mejor que 2,5 A, aunque con algunos hermanamientos no merohédricos. Los datos de difracción se procesaron con iMosflm y SCALA del paquete del programa CCP4, revelando una forma de cristal monoclínico con células unitarias con dimensiones de a = 113,67 A, b = 69,32 A, c = 42,37 A, a = 90,0 °, p = 92,97 °, y = 90,0 °, spacegroup C2 (Leslie, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 62 (Pt 1), 48-57 (2006) Evans, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 62 (Pt 1), 72-82 (2006)). Los cálculos de autorrotación indicaron una simetría no cristalográfica aproximadamente el doble. De acuerdo con esto, dos moléculas se localizaron en la unidad asimétrica relacionada por una rotación de 170°. La búsqueda de Patterson se llevó a cabo utilizando el programa PHASER y un conjunto de estructuras de las estructuras cristalinas Kunitz dominio 2 disponibles como modelo de búsqueda (McCoy et al., J Appl Crystallogr, 40 (Pt 4), 658-674 (2007)). La célula unitaria contenía aproximadamente un 64% de disolvente. Los promedios de densidad electrónica no cristalográfica y la construcción de modelos y el refinamiento de modelos se llevaron a cabo con los programas Coot, Refmac, MAIN y CNS. El modelo actual se definió completamente para ambas copias del péptido JBT1857 y la interacción con la proteína con la corriente R = 0,257, Rfree = 0,298, desviación de la geometría ideal rms (enlace) = 0,008 A, rms (ángulo) = 1,8°.

[0149] Estructura JBT1857: La estructura de JBT1857 puede segmentarse en (i) el anclaje N-terminal que consiste en acetilada Phe1AP-GlN2AP; (ii) un bucle en forma de O que comprende Ser3AP-Asn6AP; (iii) un segmento intermedio construido a partir de Val7AP y Hís8ap; (iv) un estrecho circuito de glicina que contiene Val9AP-GlY11AP; y (v) la hélice a C-terminal que comprende Tyr12AP-Leu20Ap. Como se usa en este documento, el subíndice ap indica la secuencia de numeración en el "péptido antagonista" JBT1857, La conformación de la hélice a se estabiliza por una a-metil alanina no natural colocada en el centro de la hélice (posición 17ap); una amida C-terminal que completa el patrón de enlaces de hidrógeno 1-4 de la hélice a; y un grupo apilado por las cadenas laterales aromáticas de Hís8ap, Tyr12AP y Phe13Ap. Estos efectos cooperan para estabilizar la hélice a C-terminal espontáneamente en solución, de acuerdo con los datos de dicroísmo circular sobre el péptido. El apilamiento de la cadena lateral aromática observado (H ís8ap, Tyr12AP, Phe13Ap) impone un giro cerrado que solo se puede lograr con glicina en la posición 11ap. Esta restricción estructural se refleja en pérdidas dramáticas en la afinidad de unión al reemplazar GIY11ap por cualquier otro aminoácido. La conformación del segmento del bucle N-terminal está parcialmente estabilizada por una D-prolina, conocida por inducir una conformación de giro cerrado, y un enlace de hidrógeno 1-4 por el carbonil oxígeno de Ser3AP con el nitrógeno amida de Asn6Ap. Todas las cadenas del lado del anillo (Tyr1AP, Pro5AP, Hís8ap, Tyr12AP, Phe13Ap) apuntan hacia la misma dirección, lo que les permite interactuar con el dominio KD1 de TFPI.

[0150] La interacción de JBT1857 y KD1: Se determinaron Las interacciones entre JBT1857 y KD1. Los contactos hidrófobos son interacciones que tienen una distancia intermolecular de < 4 A, mientras que los enlaces de hidrógeno tienen una distancia entre 2,6 - 3,2 A. Phe1AP interactúa no específicamente con TFPI haciendo contactos con Phe2 y Ala27, En contraste, GlN2AP se pone en contacto con un bolsillo de TFPI profundamente enterrado y crea interacciones hidrófobas con Phe28, Lys29, Ile46 y Phe47. Además, el grupo amida de GIN2ap forma tres enlaces H con Phe28-CO, Phe44-CO e Ile46-NH. El bucle O de JBT1857, que comprende Ser3AP-Asn6AP, media interacciones hidrófobas bastante limitadas con la proteína; Ser3AP, Pro5AP y Asn6AP interactúan con Lys29 y Phe47, Val7AP del segmento intermedio de JBT1857 también se une a Lys29 y Phe47, H ís8ap contribuye principalmente a las interacciones de apilamiento aromático intramolecular con Tyr12AP y en parte con Phel3AP, y muestra una interacción hidrofóbica con Ala30 de TFPI. Del mismo modo, la glicina-loop val9AP-GlY1lAP contribuye pocos contactos con el dominio Kunitz. Val9AP interactúa directamente con KD1 formando un enlace de hidrógeno con el grupo carbonilo de Ala30 y una interacción hidrófoba con Asp32, Tyr12AP media un enlace de hidrógeno a través de su grupo hidroxilo con el nitrógeno amida de Ile55 y una interacción hidrófoba con Asp30, Leu16AP es parte de un contacto hidrofóbico con Ile55, Además de las interacciones en gran parte hidrófobas de la hélice C-terminal del péptido con la proteína, hay interacciones electrostáticas entre Arg15AP y Asp32, Además, Lys19AP contribuye a la unión con TFPI formando un enlace de hidrógeno al grupo carbonilo de Ala37 y en contacto con Lys36 e Ile38, La superficie de contacto TFPI tiene un carácter hidrofóbico general con algunos puntos calientes registrados, y una fuerza impulsora de formación de complejos con JBT1857 es la complementariedad de la superficie estérica.

[0151] Este ejemplo describe la caracterización de la estructura secundaria de péptidos ejemplares de la invención y correlaciona la estructura con la función inhibidora de los péptidos. El ejemplo también identifica los residuos de aminoácidos de TFPI que interactúan con JBT1857, un péptido de unión a TFPI que inhibe la actividad de TFPI.

Ejemplo 8

[0152] El siguiente ejemplo describe péptidos adicionales de unión a TFPI modificados por la adición de restos que mejoran fisicoquímicas o propiedades farmacocinéticas de los péptidos. El ejemplo describe además un método para evaluar la formación de coágulos en sangre completa mediante la tromboelastografía de rotación.

[0153] Se conjugó JBT1857 (familia de péptidos JBT0047) a diferentes restos de PEG, y se examinaron la afinidad de unión y la actividad inhibidora de TFPI de los péptidos PEGilados. JBT1857 se modificó mediante la adición de una cisteína C-terminal para producir JBT2315 (Ac-FQSKpNVHVDGYFERL-Aib-AKLC-NH2 (SEQ ID NO: 4077)), que se conjugó en el extremo C-terminal con restos de PEG de maleimida lineal de tamaño creciente: 5 kD, 12 kD, 20 kD, 30 ko y 40 kD, utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 5. Los péptidos PEGilados resultantes se designaron como sigue:

TABLA 13

Estabilidad, afinidad de unión y actividad inhibidora de TFPI de péptidos PEGilados

[0154] Los péptidos PEGilados demostraron estabilidad de plasma significativamente aumentada en plasma de ratón y humano. Los péptidos se añadieron a muestras de ratón o plasma humano, y el porcentaje de la cantidad inicial de péptido restante en el plasma 24 horas después de la adición se midió por CI50 ELISA en placas Maxisorp revestidas con 0,05 mg/ml de TFpI (2,26 péptido trazador nM JBT2271). Menos de aproximadamente el 10% de la cantidad inicial de JBT1857 y JBT2317 permanecieron en plasma, mientras que el 40% o más de la cantidad inicial de los péptidos de unión a TFPI PEGilados permanecieron después de 24 horas. Se detectó aproximadamente el 60% o más de JBT2327 y JBT2329. Los péptidos PEGilados también son significativamente más estables en el plasma humano en comparación con los péptidos no modificados. Aproximadamente el 60% o más del péptido PEGilado permaneció después de 24 horas. Los péptidos no modificados fueron más estables en plasma humano que en plasma de ratón; aproximadamente el 20% o más de la cantidad inicial permaneció después de 24 horas de incubación.

[0155] Los péptidos PEGilados se caracterizaron también en los ensayos descritos en los Ejemplos 1-4 y en comparación con JBT1857. Los resultados representativos se proporcionan en la Tabla 14 que se muestra a continuación. El ensayo de generación de trombina se realizó como se describe en el Ejemplo 4, y los resultados se proporcionan como CE50, que corresponde a la concentración de péptido que mejoró el pico máximo de trombina (nM) en la mitad.

TABLA 14

[0156] La adición de la cisteína C-terminal bloqueada con NEM no influyó significativamente en la afinidad de unión de JBT2317 o la actividad del péptido en la inhibición de FXa, ensayo de tenasa extrínseca o ensayo de generación de trombina en comparación con JBT1857. El tamaño de PEG no afectó significativamente la capacidad de los péptidos de unión a TFPI para restaurar la actividad de FXa en presencia de TFPI-1, En el ensayo de tenasa extrínseca del Ejemplo 3, la actividad inhibitoria aumentó con restos de PEG de peso molecular más alto hasta 20 kD de PEG. La actividad no mejoró aún más para restos de PEG de 30 kD o 40 kD. En el ensayo de generación de trombina del Ejemplo 4 utilizando plasma humano, la CE50 disminuyó con el tamaño de PEG, y la inhibición máxima de TFPI (medida por el pico FIIa (nM)) aumentó con el tamaño de PEG. En el plasma de ratón, la unión de 40 kD de PEG a un péptido de unión a TFPI incrementó la inhibición máxima de TFPI.

[0157] La capacidad de los péptidos PEGilados TFPI vinculante para restaurar la actividad del complejo de tenasa extrínseca para la conversión de FX a FXa también se determinó usando un ensayo de tenasa extrínseca basado en células usando el método del Ejemplo 5. La adición de la cisteína C-terminal bloqueada con NEM no influyó significativamente en la actividad de JBT2317 en el ensayo de tenasa extrínseca basado en células en comparación con JBT1857. La conjugación de los restos de PEG (5 kD, 20 kD, 30 kD o 40 kD) con JBT2317 aumentó la actividad inhibidora de TFPI en un 5-20%.

Tromboelastografía rotacional

[0158] La evaluación visco-elástica continua de la formación de coágulos de sangre entera humana y la firmeza se realizó mediante tromboelastografía de rotación con las preparaciones de sangre completa en la presencia o ausencia de péptidos. Las muestras de sangre de un individuo sano se extrajeron en Sarstedt Mono S citratado (0,106 M o 3,2% (p/v) de citrato de Na) (5 ml), mezclando una parte de citrato con nueve partes de sangre, utilizando una aguja de mariposa de calibre 21. Una porción de las muestras de sangre se incubó con un antisuero anti-FVIII anti-humano inactivado por calor de alto título criado en cabra (3876 BU/ml; Baxter BioScience, Viena, Austria), lo que dio como resultado 51 BU/ml. Las muestras de prueba se prepararon disolviendo cantidades de péptidos en solución salina tamponada con DMSO o HEPES (con o sin Tween 80 al 0,1%).

[0159] Las grabaciones se realizaron utilizando un analizador de coagulación por tromboelastografía ROTEM (Pentapharm, Munich, Alemania) a 37°C. Brevemente, la sangre se agrega a una cubeta desechable en un soporte de cubeta calentado. Un pasador desechable (sensor) se fija en la punta de un eje giratorio. El eje está guiado por un sistema de rodamientos de bolas de alta precisión y gira hacia adelante y hacia atrás. El eje está conectado con un resorte para la medición de la elasticidad. La posición exacta del eje se detecta por el reflejo de la luz en un espejo pequeño en el eje. La pérdida de elasticidad cuando la muestra se coagula conduce a un cambio en la rotación del eje. Los datos obtenidos se analizan por computadora y se visualizan en un tromboelastograma. El tromboelastograma muestra elasticidad (mm) en función del tiempo. Se observa una elasticidad de aproximadamente cero antes de que comience la formación de coágulos. Las trazas de la imagen especular por encima y por debajo de la línea cero indican el efecto de la formación de coágulos en la rotación del eje.

[0160] Antes de comenzar cada experimento, la sangre entera citrada se mezcló con el inhibidor de la tripsina de maíz (CTI) (Hematologic Technologies, Inc., Essex Junction, VT, EE.UU.) proporcionando una concentración final de 62 |jg/ml para la inhibición específica de FXIIa, para inhibir la activación de contacto mediada por FXIIa. La configuración analítica fue la siguiente: a 20 j l de muestra de prueba o control, se agregaron 300 j l de sangre entera citrada tratada con CTI precalentada (37°C), seguido de 20 j l de una dilución 1:15 del reactivo TF PRP que contiene factor tisular humano recombinante (rTF, 3 pM) (TS40, Thrombinoscope BV, Maastricht, Países Bajos). La coagulación se inició mediante la adición de 20 j l 200 mM de CaCl2 (star-TEM®, Pentapharm, Munich, Alemania) y se permitió que las grabaciones continuaran durante al menos 120 minutos. La concentración final de rTF en el ensayo fue de 11 o 44 fM.

[0161] Los parámetros tromboelastográficos del tiempo de coagulación (TC), el tiempo de formación del coágulo (CFT) y firmeza máxima de coagulación (MCF) se registraron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La TC se define como el tiempo desde el inicio de la medición hasta el inicio de la formación del coágulo. CFT se define como el tiempo desde el inicio de la formación del coágulo hasta que se alcanza una amplitud de 20 mm. MCF es la diferencia máxima en amplitud entre las dos trazas durante el ensayo. El primer derivado de los datos del tromboelastograma se representa para obtener un gráfico de la velocidad (mm/s) en función del tiempo. A partir de este gráfico, se determina la velocidad máxima (maxV). También se determina el tiempo en el que se obtiene la velocidad máxima (maxV-t).

[0162] Los resultados ejemplares se ilustran en las Figuras 56 y 57, JBT1857 y JBT2317 restauraron los parámetros de coagulación en la sangre de HemA. El péptido de unión a TFPI PEGilado (40 kD) JBT2329 también restauró los parámetros de coagulación prolongados en la sangre de Hem A, como se ilustra en la Figura 57. La PEGilación de JBT2317 reduce el tiempo de coagulación y el tiempo de formación de coágulos.

Estudio de corte de uñas

[0163] También se estudió el efecto de JBT2329 en la pérdida de sangre en ratones sin tratamiento previo. A los ratones C57BL6 se les administró un vehículo, 1 mg/kg de JBT2329 o 0,1 mg/kg de JBT2329 (N = 19 o 20 para cada grupo) por vía intravenosa 30 minutos antes del corte de uña a 10 ml/kg. Los animales se anestesiaron 10 minutos antes del corte de uñas con 80 mg/kg de pentobarbital (i.p.). En el momento = 0 minutos, el clavo del dedo pequeño de la pata trasera derecha se cortó justo antes del lecho del clavo. La pata se transfirió a un vial precargado con una solución de NaCl al 0,9%. Las muestras de sangre se recolectaron para su análisis durante los primeros 30 minutos después del corte de uña y los siguientes 30 minutos más tarde, y se calculó y comparó el volumen medio recolectado para los grupos. La pérdida de sangre media en los ratones tratados con vehículo fue de aproximadamente 30,5 j l durante los primeros 30 minutos, 52,1 j l durante el segundo período de 30 minutos, lo que resultó en aproximadamente 82,6 j l de pérdida de sangre durante 60 minutos. En contraste, la administración de 0,1 mg/kg de JBT2329 redujo la pérdida de sangre en aproximadamente un 50% durante los primeros 30 minutos (16,0 j l) y aproximadamente el 64% durante el segundo período de 30 minutos (18,7 jl), lo que resultó en una reducción de aproximadamente el 60% de la pérdida total de sangre durante 60 minutos (34,7 jl) en comparación con los ratones tratados con vehículo. El aumento de la dosis de JBT2329 a 1,0 mg/kg redujo aún más la pérdida de sangre en al menos aproximadamente el 10%; se recogieron 12,2 j l durante los primeros 30 minutos, se recogieron 10,6 ml durante el segundo período de 30 minutos, lo que resultó en 22,8 ml recolectados durante todo el período de recolección de 60 minutos. JBT2329 también redujo eficazmente el sangrado cuando se administró por vía subcutánea en comparación con los ratones no tratados con vehículo; la inyección subcutánea de 10 mg/kg de JBT2329 redujo la pérdida de sangre durante los 60 minutos posteriores al corte de uña en aproximadamente un 58% en comparación con los sujetos tratados con vehículo.

[0164] Los resultados descritos anteriormente se generaron utilizando un derivado JBT1857 que comprende un resto lineal de PEG unida al extremo C-terminal del péptido y un derivado de JBT1586 comprende un resto de PEG en el extremo N-terminal. También se generaron péptidos que comprenden un sitio de conjugación alternativo o un resto químico alternativo. Un resto de PEG lineal de 40 kD se conjugó con el residuo 14 de JBT1857 para generar JBT2404. El resto PEG lineal de 40 kD de JBT2329 se reemplazó con un resto PEG ramificado de 40 kD para generar JBT2401. JBT1857 también se modificó para comprender K (Ttds-maleimido-propionil) (JBT2374) en el extremo C-terminal. JBT2374 se utilizó para generar JBT2410, un conjugado HSA de JBT2374. JBT2375, un derivado que comprende K (AOA) de JBT1857, se usó para acoplar aldehído de PSA al péptido JBT1857, dando como resultado JBT2430. JBT2401, JBT2404, JBT2410 y JBT2430 se caracterizaron utilizando los ensayos descritos anteriormente. Los resultados representativos se resumen en la Tabla 15:

TABLA 15

[0165] Este ejemplo demuestra que un ejemplar péptido de unión a TFPI de la invención, JBT1857, es un potente inhibidor de TFPI y se puede funcionalizar y conjugar con PEG sin pérdida de actividad. La PEGilación incrementó la actividad inhibitoria de TFPI en varios ensayos funcionales. Sorprendentemente, los péptidos conjugados con restos de PEG de mayor peso demostraron una actividad inhibidora de TFPI aumentada. JBT2329, que comprende un resto de PEG lineal de 40 kD, redujo significativamente la pérdida de sangre en un modelo animal clínicamente relevante. La conjugación de PEG dentro de la secuencia de aminoácidos de JBT1857, el uso de un resto de PEG ramificado y la unión de HSA y PSA no destruyeron la actividad del péptido.

Ejemplo 9

[0166] El siguiente ejemplo describe la caracterización de dos péptidos de unión a TFPI de la invención, JBT1837 y JBT1857, JBT1837 (Ac-SYYKWH [CAMRDMKGTMTC] VWVKF-NH) (SEQ ID NO: 1044) es un péptido cíclico de la familia JBT0120 que se une a KD1 y KD2 de TFPI. JBT1857 (Ac-FQSKpNVHVDGYFERL-Aib-AKL-NH2) (SEQ ID NO: 178) es un péptido lineal de la familia JBT0047 que se une a KD1 de TFPI. La afinidad y la actividad inhibidora de TFPI de JBT1837 y JBT1857 se examinaron usando los ensayos descritos en los Ejemplos 1-4, cuyos resultados se resumen en la Tabla 16.

TABLA 16

[0167] La afinidad de los péptidos al TFPI humano medida mediante BiaCore fue inferior a 1 nM. La afinidad medida por ELISA (CI50) fue 4,8 nM para JBT1837 y 2,5 nM para JBT1857. JBT1837 se disoció del TFPI humano más lentamente que JBT1857 (es decir, JBT1837 permaneció unido al TFPI humano durante un período de tiempo más largo en comparación con JBT1857). Se realizó un ensayo de inhibición de FXa utilizando TFPI humano de longitud completa ("flTFPI") y TFPI humano truncado (254 aminoácidos "R&D TFPI") (FXa 0,1 nM, TFPI 0,5 nM, DMSO al 0,25%). La actividad del TFPI truncado fue completamente inhibida tanto por JBT1837 como por JBT1857 a 0,5 nM TFPI, mientras que el TFPI de longitud completa fue inhibido en un 85% y 95% por JBT1857 y JBT1837, respectivamente. A concentraciones más altas de flTFPI (por ejemplo, flTFPI 10 nM), JBT1837 inhibió completamente la actividad de TFPI, mientras que JBT1857 inhibió parcialmente la actividad de TFPI. Las CE50 también fueron mayores cuando se utilizó flTFPI en el estudio de inhibición de FXa.

[0168] En el ensayo de tenasa extrínseca, aproximadamente el 85% de truncado TFPI fue inhibido por ambos péptidos. La actividad de TFPI de longitud completa se inhibió alrededor del 56% y 48% por JBT1837 y JBT1857, respectivamente. Sorprendentemente, en el ensayo de tenasa extrínseca basado en células, JBT1837 inhibió la actividad del TFPI asociado a la célula en aproximadamente un 50%, mientras que JBT1857 inhibió casi completamente la actividad del TFPI unido a la célula. En el ensayo funcional basado en plasma, JBT1837 inhibió TFPI de manera más eficiente que JBT1857 en plasma inhibido por FVIII humano y plasma deficiente en FIX. Los parámetros de coagulación sanguínea corregidos por JBT1837 en sangre inhibida por FVIII en el ensayo ROTEM descrito en el Ejemplo 8, JBT1857 también impactaron positivamente los parámetros de coagulación sanguínea, pero tuvieron un desempeño menos eficiente que el JBT1837 en el ensayo.

[0169] Este ejemplo comparó la afinidad y la actividad inhibitoria de TFPI de péptidos de unión a TFPI cíclicos y lineales que se dirigen a diferentes regiones de la proteína TFPI. JBT1837 (un péptido cíclico que pertenece a la familia JBT0120) y JBT1857 (un péptido lineal que pertenece a la familia JBT0047) se unen eficazmente al TFPI humano con afinidades menores de 1 nM y son inhibidores potentes. La interacción de FXa-TFPI está completamente bloqueada a bajas concentraciones de TFPI por ambos péptidos, mientras que la inhibición de TFPI por JBT1857 se reduce en presencia de concentraciones más altas de TFPI. Ambos péptidos inhiben parcialmente la actividad de TFPI de longitud completa en el ensayo de tenasa extrínseca, y JBT1857 inhibe la actividad de TFPI en mayor grado en el ensayo de tenasa extrínseca basado en células en comparación con JBT1837. En comparación con JBT1857, JBT1837 inhibe más eficazmente el TFPI en plasma deficiente en FVIII. Ambos péptidos mejoran los parámetros de coagulación de la sangre humana inhibida por FVIII al reducir el tiempo de coagulación, mientras que JBT1857 mejora la velocidad de formación de coágulos en un grado menor en comparación con JBT1837.

Ejemplo 10

[0170] Este ejemplo ilustra la actividad in vivo de los péptidos de la invención unión a TFPI en un modelo animal clínicamente relevante. Como se describe a continuación, un péptido de unión a TFPI ejemplar redujo significativamente la pérdida de sangre en un animal cuando se administró con dosis subóptimas de FVIII y FIX.

[0171] JBT2329, un péptido de unión a TFPI PEGilado (40 kD) (familia JBT0047) que reacciona de forma cruzada con TFPI humano y murino, fue ensayado en el modelo de sangrado punta de la cola en ratones knock-out FVIII y ratones knock-out FIX. Los ratones knock-out del FVIII reflejan fielmente la condición de los pacientes con hemofilia A, y el modelo de sangrado de la punta de la cola se usa ampliamente en la investigación para evaluar la eficacia de los medicamentos midiendo, por ejemplo, el tiempo de sangrado, la pérdida de sangre o la supervivencia. ADVATE, un rFVIII disponible comercialmente, sirvió como referencia, y los animales tratados con tampón ADVATE sirvieron como controles negativos. Cada grupo contenía 16 ratones knock-out para FVIII (8 hembras 8 machos). JBT2329 (1 mg/kg o 0,1 mg/kg) o anticuerpo anti-TFPI (maTFPI; 18 mg/kg) se administró 30 minutos antes de cortar la punta de la cola. ADVATE (10 UI/kg o 50 UI mg/kg) o el tampón ADVATE se administraron cinco minutos antes de que se cortara la cola. Las sustancias de prueba y control se administraron como un bolo intravenoso a través de una inyección lateral de la vena de la cola. Los animales se anestesiaron mediante una inyección intraperitoneal de 100 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilazina. Aproximadamente 10 minutos más tarde, se cortaron 2 mm de la punta de la cola. Las puntas de la cola se colocaron en solución salina caliente (aproximadamente 37°C) y la sangre se recogió durante un período de observación de 60 minutos. La cantidad de sangre se determinó gravimétricamente. Al final del período de observación de 60 minutos, los animales fueron sacrificados humanamente por dislocación cervical antes de la recuperación de la anestesia.

[0172] La pérdida total de sangre mediana en los animales tratados con tampón era 930 mg. La pérdida de sangre total media en sujetos tratados con anticuerpo anti-TFPI murino (maTFPI) fue de 724 mg. La reducción en la pérdida total de sangre media fue más pronunciada cuando a los sujetos se les administró maTFPI con ADVATE. Una combinación de maTFPI 10 UI/kg ADVATE condujo a una pérdida de sangre total mediana de 136 mg, los animales tratados con maTFPI 50 UI/kg ADVATE experimentaron una pérdida de sangre total mediana de 13 mg. Las pérdidas medianas de sangre de los animales tratados con 10 o 50 UI/kg ADVATE solo experimentaron una pérdida mediana de sangre de 798 y 364 mg, respectivamente. La superioridad del tratamiento de combinación de maTFPI ADVATE sobre ADVATE solo se demostró estadísticamente para maTFPI 50 UI/kg ADVATE versus 50 UI/kg ADVATE (p = 0,0010). Aunque no fue estadísticamente significativamente superior, la pérdida de sangre en animales tratados con maTFPI 10 UI/kg ADVATE fue claramente menor que en animales tratados con 10 UI/kg ADVATE solo.

[0173] La eficacia, definida como una superioridad estadísticamente significativa sobre el tampón a un nivel de 2,5%, se demostró para JBT2329 dosificado a 1 mg/kg en combinación con 10 y 50 UI/kg ADVATE y se dosificó a 0,1 mg/kg en combinación con 50 UI./kg ADVATE (p <0,0004). Los animales tratados con JBT2329 en combinación con ADVATE mostraron una reducción clínicamente relevante en la pérdida de sangre, aunque los resultados no fueron estadísticamente significativos (p > 0,0506). La administración de 1 mg/kg de JBT2329 sin ADVATE no redujo la pérdida de sangre total mediana en comparación con la observada en animales tratados con tampón (930 mg).

[0174] JBT2329 también se ensayó en un modelo FIX knock-out con sangrado de la punta de la cola, que es un modelo clínicamente relevante para pacientes humanos con hemofilia B. La metodología fue sustancialmente similar a la descrita anteriormente con respecto al modelo de eliminación de FVIII. En lugar de ADVATE, un FIX recombinante (rFIX) sirvió como referencia. La pérdida de sangre total mediana en animales tratados con tampón fue de 935 mg. La pérdida de sangre total mediana en animales tratados con un anticuerpo anti-TFPI murino (maTFPI) fue de 774 mg. La pérdida total de sangre en la mediana se redujo aún más cuando los animales recibieron tratamiento combinado de maTFPI y rFIX. Una combinación de maTFPI 10 UI/kg rFIX condujo a una pérdida de sangre total mediana de 25 mg, mientras que los animales tratados con maTFPI 50 UI/kg rFIX mostraron una pérdida de sangre total mediana de 10 mg. La pérdida de sangre mediana de los animales tratados con 10 o 25 UI/kg de rFIX solo experimentó una pérdida de sangre mediana de 888 y 774 mg, respectivamente.

[0175] La eficacia, definida como una superioridad estadísticamente significativa sobre el tampón a un nivel de 2,5%, se demostró para JBT2329 cuando se dosificó a 1 mg/kg en combinación con 10 UI/kg rFIX y a 0,1 mg/kg en combinación con 10 UI/kg rFIX. Se observó la superioridad de JBT2329 en combinación con rFIX sobre la administración de rFIX solo (p <0,0172), mientras que el tratamiento con 1 mg/kg de JBT2329 solo no produjo una reducción significativa en la pérdida de sangre total mediana en comparación con los animales tratados con tampón (p = 0,321).

[0176] En resumen, JBT2329 promovió una reducción clínicamente relevante de la pérdida de sangre cuando se administró conjuntamente con dosis subóptimas de FVIII y rFIX en todas las dosis ensayadas. Además, la administración intravenosa de JBT2329 fue bien tolerada en todos los sujetos en todos los grupos de tratamiento sin ningún signo de toxicidad aguda.

Ejemplo 11

[0177] Los péptidos de unión a TFPI-descritos en este documento son adecuados para la detección de TFPI en una muestra, tal como muestra biológica. Este ejemplo describe un método para detectar TFPI usando los péptidos de la invención en un formato de ensayo similar a ELISA.

[0178] La secuencia del péptido de JBT1857 era N-terminal modificado por la adición de un resto de biotinil-TTDs para generar JBT2271 (biotinil-TTDs-FQSKpNVHVDGYFERL-Aib-AKL-NH2 (SEQ ID NO: 4033)). Una placa de microtitulación de 96 pocillos (Maxisorp, Nunc) se recubrió con 50 pl por tampón de recubrimiento de pocillo (15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9,3) que contiene un intervalo de concentraciones de TFPI (0-3 pg/ml, TFPI recombinante humano, R&D Systems) durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó tres veces con 350 pl/pocillo de tampón de lavado (NaCl 175 mM, CaCl 5 mm2, HEPES 25 mM, 0,1% de Tween 80, pH 7,35). A continuación, la placa se bloqueó con 100 pl de tampón de bloqueo (2% de extracto de levadura, NaCl 175 mM, CaCl2 5 mM, HEPES 25 mM, 0,1% de Tween 80, pH 7,35) durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó luego tres veces con 350 pl de tampón de lavado. Se añadieron cincuenta pl de soluciones de JBT2271 de concentración diferente en tampón de lavado (100-0 nM) a cada pocillo. La placa se incubó durante 1 hora y se lavó tres veces con 350 ml de tampón de lavado. A cada pocillo, se agregan 50 pl de estreptavidina-conjugado de peroxidasa de rábano picante (R&D Systems, 1:200 en tampón de lavado). Después de un período de incubación de 1 hora a temperatura ambiente, la placa se lavó tres veces con tampón de lavado. Se añadieron cincuenta pl de solución TMB (SeramunBlau fast, Seramun) a cada pocillo. Después de una incubación de 1,5 minutos a temperatura ambiente, la reacción se detuvo agregando 50 pl de 1 M H2SO4 por pocillo. La absorbancia se midió en un fotómetro (Molecular Devices Spectramax M5) a 450 y 620 nm.

[0179] JBT2271 permitió la detección de tan solo 4,1 x 10'14 moles de TFPI por pocillo. Los resultados del ensayo descrito anteriormente ilustran que los péptidos de la invención son herramientas poderosas para identificar y/o cuantificar TFPI en una muestra.

Ejemplo 12

[0180] Este ejemplo describe las condiciones para un ensayo Kapagado ejemplar para caracterizar péptidos de unión a TFPI.

[0181] Los pocillos de una placa de microtitulación (96 pocillos, Maxisorp, Nunc) se recubren con TFPI 1,6 nM en tampón de recubrimiento (15 mM) Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9,3) durante dos horas a temperatura ambiente. A continuación, la placa se lava tres veces con 350 pl de tampón de lavado (NaCl 175 mM, CaC^5 mM, HEPES 25 mM, 0,1% de Tween 80, pH 7,35), y los pocillos se bloquean con 100 pl tampón de bloqueo (2% de levadura extracto, NaCl 175 mM, CaC^5 mM, HEPES 25 mM, 0,1% de Tween 80, pH 7,35). Si se emplea un período de incubación de 24 horas, los pocillos se bloquean durante al menos una hora. Los pocillos de control utilizados durante un período de incubación de 15 minutos se bloquean durante 23,5 horas adicionales.

[0182] Durante un período de incubación de 24 horas, los pocillos se lavan tres veces con 350 pl de tampón de lavado y se incuban con 50 pl de péptido de ensayo en tampón de lavado. La concentración del péptido de ensayo depende de la concentración de CI90 individual determinada, por ejemplo, en el ensayo ELISA TFP i CI50 descrito aquí. Los pocillos recubiertos con TFPI se exponen al péptido de ensayo durante aproximadamente 15 minutos. Los pocillos se lavan posteriormente tres veces con 350 pl de tampón de lavado y se agregan 50 pl de péptido trazador (competidor). Un ejemplo de péptido trazador es JBT2271 (1,13 nM en tampón de lavado). Los pocillos de control (señal máxima) se incuban solo con el marcador. Los pocillos en blanco que carecen de TFPI se incuban solo con marcador. La adición del péptido trazador comienza el período de incubación de 24 horas.

[0183] Un período de incubación de 15 minutos se emplea como control si la concentración CI90 del péptido de ensayo conduce a una reducción del 90% de la señal máxima. Los pozos bloqueados durante 23,5 horas adicionales se lavan tres veces con 350 pl de tampón de lavado para eliminar el tampón de bloqueo. Posteriormente, se añaden 50 pl de analito en el tampón de lavado y los pocilios se incuban durante 15 minutos. La concentración del péptido de ensayo utilizado depende de la concentración de CI90 del péptido determinada utilizando, por ejemplo, un ensayo ELISA TFPI CI 50. La incubación de 15 minutos es seguida por tres lavados con 350 pl de tampón de lavado y la adición de 50 pl de péptido trazador. Los pocillos de control (señal máxima) se incuban solo con el marcador. Los pocillos en blanco que carecen de TFPI también se incuban solo con el marcador.

[0184] La placa se lava tres veces con 350 pl de tampón de lavado, y 50 pl de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante conjugado (R&D Systems, 1:200 en tampón de lavado) se añade a cada pocillo. Después de un período de incubación de una hora a temperatura ambiente, la placa se lava tres veces con tampón de lavado. Solución de TMB (50 pl por pocillo; SeramunBlau rápido, Seramun) se agrega. Después de una incubación de 1,5 minutos a temperatura ambiente, la reacción se detiene mediante la adición de 50 pl de 1 M H2SO4 por pocillo. La absorbancia se mide utilizando un fotómetro (Spectramax M5, Molecular Devices) a 450 y 620 nm. Los resultados del ensayo se presentan como un porcentaje de la densidad óptica corregida (OD450-OD620) de los pocillos expuestos al péptido de ensayo y al péptido trazador en relación con los pocillos recubiertos con TFPI expuestos solo al trazador.

Ejemplo 13

[0185] El TFPI inhibe la actividad de FVIIa/TF uniéndose a FVIIa a través del dominio 1 de Kunitz (KD1). Este ejemplo describe un método ejemplar para evaluar la influencia de los péptidos de unión a TFPI en la inhibición de TFPI de FVIIa/TFPI.

[0186] Las mediciones cinéticas se realizaron en HEPES 25 mM, NaCl 175 mM, CaCl25 mM, BSA al 0,1%, pH 7,3 a 25°C en placas de microtitulación de 96 pocillos. Veinte pl de factor tisular soluble (residuos 33-251; Creative Biomart) y 20 pl de FVIIa (ERL) en concentraciones finales de 100 nM y 5 nM, respectivamente, se mezclaron y se incubaron durante 15 minutos. Se añadieron veinte pl de péptido de unión a TFPI en concentraciones finales variables (0-2 pm) a la mezcla y se incubaron durante 15 minutos más. Para medir la actividad residual del complejo FVIIa/sTF, la mezcla de reacción se incubó durante 60 minutos con 20 pl de TFPI (200 nM). La reacción se inició mediante la adición de un sustrato cromogénico, ChromozymtPA (Roche) (1 mM). El cambio en la absorbancia a 405 nm se controló utilizando un Labsystems iEMS ELISA Reader durante 30 minutos. La actividad FVIIa/sTF medida en ausencia de TFPI se consideró "actividad del 100%" en el contexto del ensayo. Al representar la concentración de péptido frente a la actividad residual, se determinaron los valores de CE50.

[0187] JBT1857 y JBT1837 se examinaron frente a TFPI160, TFPI1-150-Trombina, NTermKD1, KD1 y KD2 (control negativo). JBT1857 demostró una CE50 de aproximadamente 0,21-0,23 pm para TFPI160, TFPI1-150-Trombina, NTermKD1 y KD1, JBT1837, que se une a KD1 y KD2, demostró una CE50 de aproximadamente 0,17-0,19 pm para TFPI160 y TFPI1-150-Trombina, mientras que la actividad en ensayos con NTermKD1 y KD1 fue aproximadamente de fondo.

[0188] Los resultados descritos anteriormente demuestran que los péptidos de unión a TFPI inhiben eficazmente la interacción de TFPI-FVIIa/TF. JBT1857 inhibió eficazmente los fragmentos TFPI que contenían KD1 como una entidad funcional mínima. Por lo tanto, este ensayo enzimático confirma los datos cristalográficos de rayos X que colocan el sitio de unión de JBT1857 dentro de KD1. JBT1837 inhibió los fragmentos de TFPI que contenían los dos primeros dominios Kunitz, lo que sugiere que el (los) sitio(s) de unión de JBT1837 está(n) ubicado(s) dentro de la región KD1-enlazador-KD2 de TFPI. Una combinación de dominios Kunitz y fragmentos de un TFPI escindido con trombina (1 150) no restableció la actividad inhibitoria de JBT1837 en el ensayo cromogénico. El ensayo enzimático descrito aquí es un sustituto adecuado para detectar la unión de un péptido de unión a TFPI (o un compuesto de prueba) a TFPI, y es útil para examinar el efecto inhibidor de TFPI de los compuestos de unión a TFPI.

Ejemplo 14

[0189] Este ejemplo describe la influencia de PEG y HSA conjugación en ejemplares péptidos de unión a TFPI in vivo.

[0190] Para el análisis farmacocinético, los ratones C57B16 fueron tratados con diversos péptidos de unión a TFPI conjugados con PEG de diferente peso molecular y HSA. La dosis de los conjugados péptido-PEG y péptido-HSA se normalizó a 1 mg/kg (contenido de péptido). La normalización asegura la comparabilidad entre los conjugados de diferente peso molecular. Los conjugados peptídicos se disolvieron en NaCl 175 mM, HEPES 25 mM, pH 7,35 y se administraron por vía intravenosa a través de la vena de la cola o por vía subcutánea en la región del cuello. Se extrajeron muestras de sangre de tres animales (retro bulbar) y se recolectaron en viales heparinizados en varios puntos de tiempo después de la administración. Las muestras se centrifugaron y el contenido de conjugado de péptido en plasma se cuantificó mediante ELISA.

[0191] La Figura 63 ilustra la concentración de péptidos TFPI PEGilados detectados en plasma en varios puntos de tiempo después de la administración, y la Tabla 17 proporciona información detallada sobre la vida media terminal y la biodisponibilidad de JBT2325-JBT2329, JBT2401, JBT2404 y JBT2410.

TABLA 17

[0192] JBT2329, JBT2401 y JBT2404 son péptidos conjugados a 40 kDa lineal PEG (JBT2329 y JBT2404) o 40 kDa PEG ramificado (JBT2401). Los conjugados de 40 kDa exhibieron una vida media terminal más larga (HL_A_z) en comparación con los péptidos conjugados con PEG más pequeños después de la administración intravenosa. El área bajo la curva (AUC) de la curva de tiempo de concentración resultante de la administración subcutánea de los péptidos se comparó con el AUC generado después de la administración intravenosa para calcular la biodisponibilidad de los péptidos. Los resultados se muestran en la Tabla 16. Los datos demuestran que la conjugación de péptidos de unión a TFPI a moléculas de peso molecular más alto permite una biodisponibilidad subcutánea de más del 30%.

[0193] Las Figuras 64A-C ilustran el perfil farmacocinético de JBT2401, JBT2404, y JBT2410 resultante de sub cutánea y la administración intravenosa de los péptidos a los ratones. JBT2404 comprende un PEG conjugado con cisteína en la posición X4014 en relación con la fórmula (XI). JBT2401 comprende un PEG ramificado, y JBT2410 está conjugado con HSA. La Figura 64A demuestra que la fusión de una molécula de mayor peso molecular con un péptido de unión a TFPI en una posición interna aumenta la vida media. La vida media también aumenta si se usa PEG ramificado (JBT2401) y h Sa , que aumenta la vida media in vivo de JBT2410 en comparación con los conjugados que tienen PEG de tamaño más pequeño (p.ej., JBT2325) o péptido libre (ver Figura 31).

[0194] Este ejemplo ilustra que las propiedades in vivo de varios péptidos descritos en el presente documento se pueden mejorar mediante la conjugación con moléculas de mayor peso molecular (como PEG) y/o con ligandos nFcR (como HSA).

Ejemplo 15

[0195] El siguiente ejemplo describe la caracterización de la interacción del JBT1837 con KD1-KD2 de TFPI, solo y en presencia de JBT1857, a través de la cristalografía de rayos X.

PAGE nativa

[0196] La PAGE nativa se realizó para confirmar que los péptidos de unión a TFPI que se unen a diferentes regiones de TFPI podrían unirse a TFPI KD1-KD2 simultáneamente. Se usaron geles de poliacrilamida al quince por ciento (sin SDS) para la electroforesis en gel nativo en muestras que comprenden (1) un fragmento TFPI que comprende KD1-KD2, (2) KD1-KD2 y JBT1857, (3) KD1-KD2 y JBT1837, y (4) KD1-KD2 con JBT1857 y JBT1837. Se añadieron glicerina y rojo de Ponceau a las muestras de proteínas. El tampón de ánodo se obtuvo disolviendo imidazol 25 mM en 1 litro de agua y ajustando el pH a 7 con HCl. El tampón de cátodo claro se preparó disolviendo imidazol 7,5 mM y tricina 50 mM en un litro de agua. Se añadió agua a cada solución para alcanzar un volumen final de dos litros. Se añadió Serva Blue G (0,02% p/v final) a dos litros de tampón de cátodo para generar un tampón de cátodo azul 10X (stock azul de 10X). Los geles se corrieron durante 30 minutos a 80 V, luego durante aproximadamente tres horas a 250 V. Los geles se tiñeron y se decoloraron como se describe en Chakavarti et al., J Vis Exp., 12; (16) (2008).

[0197] KD1-KD2 se visualizó en el gel como una única banda. Las muestras que comprenden K1-K2 en combinación JBT1857 y/o JBT1837 dieron como resultado un cambio de la banda inicial de KD1-KD2 a una relación de mayor peso molecular a carga. Después de mezclar KD1-KD2 y JBT1837, se observó una precipitación parcial, lo que indica una disminución en la solubilidad después de la formación del complejo. JBT1857 cambió la banda KD1-KD2 completa, mientras que JBT1837 cambió aproximadamente 1/3 de la banda inicial. Además, en presencia de JBT1837 y JBT1857, la banda KD1-KD2 se desplaza a la relación peso-peso molecular más alta, lo que indica la formación de un complejo ternario que consiste en KD1-KD2, JBT1837 y JBT1857. Por lo tanto, JBT1837 y JBT1857 pueden unirse a TFPI simultáneamente.

Materiales y métodos: interacción de JBT1837 con KD1-KD2

[0198] El crecimiento de cristal: cristales iniciales se forman a 20°C por mezcla de 0,4 pl de un complejo 1:1 (1,5 mg/ml; Tris 10 mM/8,0, NaCl 100 mM) con 0,2 pl precipitante (20% p/v PEG 6000, imidazol 50 mM, pH 8,0). Los cristales se reproducieron a 20°C mezclando 1 pl de proteína con 0,5 pl de precipitante (20% p/v de PEG 6000, 50 mM de imidazol, pH 8,0). Se añadió un crioprotector (30% p/v de PEG 6000, 34% de glicerol) a la gota de cristal (concentración final de 25% de glicerol) para proteger los cristales resultantes del trastorno y la formación de hielo durante el enfriamiento instantáneo con nitrógeno líquido.

[0199] Tratamiento de datos: Los datos de difracción se recogieron de 87,26Á a 1,95Á y se evaluaron utilizando los paquetes MOSFLM y iMOSFLM (Leslie, (2006) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 62, 48-57), seguido por la fusión y la ampliación utilizando CCP4 suite (McCoy et al., (2007) J Appl Crystallogr 40, 658-674). Los cristales pertenecen al grupo espacial ortorrómbico P 2 i2 i2 i con dimensiones de célula unitaria de a = 42,35 A, b = 44,13 A, c = 174,53 A, a = p = y = 90,0° y 2 complejos en la unidad asimétrica. La búsqueda de Patterson se llevó a cabo utilizando el programa PHASER (McCoy, supra) y dos conjuntos de búsqueda, una estructura cristalina de KD2 (1TFX) (Burgering et al. (1997) J Mol Biol 269, 395-407) y una estructura cristalina KD1 previamente resuelta. La célula unitaria contenía aproximadamente 54% de solvente. El promedio de la densidad electrónica no cristalográfica, la construcción del modelo y el refinamiento del modelo se llevaron a cabo con los programas Coot y Refmac (McCoy, supra; Murshudov et al, (1997) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 53, 240-55). El modelo actual está completamente definido para ambas copias del péptido JBT1837 (23AA) y la interacción con la proteína con la corriente R = 0,213, Rlibre = 0,245, desviación de la geometría ideal rms (enlace) = 0,0098 A, rms (ángulo) = 1,28°.

[0200] Análisis de la superficie de interacción: la superficie de interacción de KD1-KD2 y JBT1837 se analizó con PDBePISA. El impacto de los aminoácidos individuales se ponderó mediante la reducción total de su área accesible al solvente después de la formación del complejo (área accesible del solvente enterrado BSAA) y se consideró al generar una matriz de interacción 2D.

Materiales y métodos: Interacción de KD1-KD2 con JBT1837 y JBT1857

[0201] Crecimiento de cristales: Cristales iniciales se formaron a 20°C por mezcla de 0,4 pl de un complejo 1:1:1 (1,5 mg/ml; Tris 10 mM/8,0, NaCl 100 mM) con 0,2 pl precipitante (2M (NH4)2SO4, PEG 400 al 5%, MES 100 mM pH 6,5). Los cristales se reprodujeron y optimizaron a 20°C mezclando 1 ml de proteína con 0,5 pl de precipitante (1,5 M (NH4)2SO4, PEG 400 al 5%, MES 100 mM pH 6,5). Se añadió paso a paso a la gota de cristal un crioprotector (2M (NH4)2SO4, 25% de glicerol) (concentración final de 2,3M (NH4)2SO4 y 20% de glicerol) para proteger los cristales resultantes de los trastornos y formación de hielo durante el enfriamiento instantáneo con nitrógeno líquido. La gota se cubrió con aceite criogénico y se recogieron los cristales.

[0202] Tratamiento de datos: Los datos de difracción se recogieron a partir de 74,3A a 2,7A y se evaluaron utilizando los paquetes MOSFLM y iMOSFLM, seguido de la fusión y la ampliación utilizando CCP4 suite (Leslie, (2006) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 62, 48-57; Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50, 760-3 (1994)). Los cristales pertenecen al grupo espacial tetragonal P 43212 con dimensiones de célula unitaria de a = 79,07 A, b = 79,07 A, c = 218,17 A, a = p = y = 90,0°.

Resultados de la cristalografía de rayos X

[0203] La estructura de KD1-KD2 se define en la densidad de electrones de L21 a través E148; Aunque están presentes químicamente, los residuos D149 y G150 se desordenan conformacionalmente en dos copias cristalográficamente independientes de la molécula.

[0204] Ambos dominios muestran una estructura de tipo Kunitz. Solo ~ 1/3 de la estructura está involucrada en elementos de estructura secundaria; estos son dos elementos helicoidales a cortos en S24-A27(KD1)/D95-F98(KD2) (a1/a3) y L69-M75/L140-E148 (a2/a4) y una hoja p bicatenaria que comprende M39-N45/I110-N116 (P1/p3) y R49-I55/K120-K126 (p2/p4). Estos elementos forman el marco topológico que se estabiliza por los tres enlaces disulfuro canónicos que involucran C26-C76, C35-C59 y C51-C72 en KD1 y C95-C147, C106-C130 y C122-C143 en KD2.

[0205] Esta es la primera estructura de TFPI que consiste en KD1, KD2 y su engarce elucidado por cristalografía de rayos X. Cabe destacar que JBT1837 bloquea KD1-KD2 en un estado conformacional distinto en el que ambos dominios Kunitz están relacionados a través de una simetría doble. Además, la conformación de TFPI se estabiliza intrínsecamente por dos vueltas, una vuelta p (t p) de T77-A81 y una vuelta y (tY) de Q90-K93, tp está estabilizado por tres enlaces de hidrógeno (O K74-N N82, O N80-NZ K74, O N 82-N H23) y conduce a un acortamiento de a2 en KD1 por dos residuos en comparación con los dominios homólogos de Kunitz y la estructura cristalina de KD1 solo, tY se estabiliza mediante cuatro enlaces de hidrógeno (O T88-N D95, O Q90-N K93, O K93-N Q90, Oy T88-O8 D95).

[0206] El péptido 23mero JBT1837 asume una estructura de tipo p-horquilla que puede ser segmentado en (i) el pasador, una hoja p bicatenaria que comprende Y2ap-A8ap y T17ap-F23ap; (ii) y el ojo de la aguja, un giro p que comprende D11ap-T15ap. (El subíndice ap indica la secuencia de la secuencia en el péptido antagonista (JBT1837). La hoja p se estabiliza mediante un puente disulfuro (C7ap y C18ap) y una cremallera hidrófoba que comprende las cadenas laterales de Y3ap, W5ap y W20ap.

[0207] El análisis de la interacción entre KD1-KD2 y JBT1837 con el servidor PISA dio como resultado una superficie de interacción total de 1340A2. Más de 2/3 de la superficie de interacción consiste en un anclaje hidrofóbico en JBT1837 que interactúa con los residuos diseminados sobre TFPI, incluyendo KD1, KD2, y el enlazador, como se ilustra mediante una matriz de interacción, cuyo resumen se proporciona en la Tabla 18, y Figura 74.

TABLA 18

[0208] Además de los contactos hidrófobos, la matriz identifica interacciones polares que estabilizan el complejo TFPI-JBT1837, por ejemplo, mediante enlaces de hidrógeno entre la cadena lateral de H6ap con el carbonil oxígeno de M134 y Ne de W5ap con el carbonilo oxígeno de Q63, así como una hebra p corta que comprende M16ap-C18ap y R83-I85. Además, NZ de K4ap está coordinado equidistantemente por las cadenas laterales de E67 y E142.

[0209] Además de su papel en la estabilización JBT1837, el puente disulfuro de C7-ap-C18ap encaja perfectamente en una cavidad hidrófoba formada por E71, M75, N82, y 184, jugando así un papel importante en la estabilización del complejo TFPI-JBT1837.

[0210] Aunque el TFPI se conserva principalmente a través de diferentes especies, los residuos clave dentro del enlazador y KD2 (M134, I146) solo son compartidos por parientes cercanos a la especie humana (Figura 74). Además, la sustitución de A81V en macaco desestabiliza el giro p del enlazador por impedimento estérico, lo que dificulta la interacción posterior del enlazador con JBT1837.

[0211] El KD1 del complejo KD1 JBT1857 previamente resuelto se superpuso al complejo KD1-KD2+JBT1837 para proporcionar un modelo de la disposición de la estructura ternaria. El modelo sugirió que JBT1837 y JBT1857 se unen a sitios opuestos de KD1. El extremo C de JBT1857 y el extremo N de JBT1837 estaban separados por 20 A; por lo tanto, un resto enlazador de aproximadamente 20 A de longitud, correspondiente a aproximadamente 10 aminoácidos, conectaría JBT1857 y JBT1837 y permitiría la unión a los sitios de unión respectivos de las subunidades en TFPI.

[0212] Los cristales KD1-KD2+JBT1837+JBT1857 pertenecen al grupo espacial tetragonal P 4s2-i2 y difractan a una resolución máxima de 2,7 A. Los ejes de los tornillos se confirmaron mediante extinciones axiales y el análisis del contenido celular indicó una masa de 72 kDa en la unidad asimétrica. Suponiendo que el complejo ternario cristalizó, esto corresponde a tres (62 kDa; 61% de solvens) o cuatro (82 kDa; 46% de solvens) copias en la unidad asimétrica. Sin embargo, la estructura no pudo resolverse completamente, posiblemente debido a la flexibilidad inherente de la estructura de la molécula KD1-KD2. El análisis de las interacciones entre TFPI y JBT1837, así como la conformación de TFPI inducida por péptidos, sugiere que JBT1837 puede no unirse al TFPI de especies distintas a las humanas. La alta selectividad de JBT1837 es ventajosa ya que minimiza la reactividad cruzada y, por lo tanto, los efectos secundarios no deseados. JBT1857 se une a TFPI en un sitio diferente, y la PAGE nativa demostró que ambos péptidos pueden unirse a TFPI al mismo tiempo. Este análisis se confirma aún más mediante un modelo basado en la estructura cristalina de KD1-KD2+JBT1837+JBT1857 (Figura 75). El extremo C de JBT1857 y el extremo N de JBT1837 se encuentran a solo 20 A de separación, y un enlazador de, por ejemplo, diez Ala (o Ser) permitiría la unión de JBT1837 y JBT1857 a sus sitios de unión dentro del TFPI.

Ejemplo 16

[0213] El siguiente ejemplo describe la caracterización de un complejo de péptido que se une el TFPI.

[0214] Los péptidos de unión a TFPI se produjeron como se describe en el presente documento. Los péptidos se sintetizaron como sales de trifluoroacetato (TFA) con una pureza >90%, y se resuelven en DMSO a una concentración de reserva de 10 mM.

[0215] Los ELISA de competición (CI50) se realizaron utilizando péptidos de unión a TFPI biotinilados como "marcadores" para competir por la unión de TFPI con péptidos candidatos no biotinilados. El principio de ensayo se representa en la Figura 6B. Noventa y seis placas de pocillos Maxisorp (Nunc) se recubrieron con 0,05 pg/ml de TFPI en tampón de recubrimiento (15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9,6) durante la noche. Las placas se lavaron tres veces con 350 pl de tampón de lavado (HNaT: 175 mM NaCl, 25 mM HEPES, 5 mM CaCl2, 0,1% de Tween 80, pH 7,35) y se bloquearon con 200 ml de extracto de levadura al 2% en HNaT para dos horas Las placas se lavaron tres veces con 350 pl de HNaT. Los péptidos trazadores biotinilados se aplicaron a una concentración correspondiente a sus respectivos valores de CE90 determinados en un ELISA de unión (valor medio si n >2). Una solución madre competidora de péptido candidato (10 mM o prediluida en DMSO) se diluyó 1/33,3 en HNaT, y se preparó una dilución serial 1/3 con HNaT con DMSO al 3%. La estrategia de dilución empleada en un ensayo particular se ajustó en función de la afinidad del péptido. La dilución se diluyó adicionalmente con el péptido trazador biotinilado en una proporción de 1:6 (20 ml de dilución competidora y 100 pl de péptido trazador). La mezcla de competidor y péptido trazador se aplicó a la placa de microtitulación recubierta con TFPI y se incubó durante 1,5 horas. Las placas se lavaron tres veces con 350 pl de HNaT. La unión del péptido-TFPI se detectó aplicando estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) a la placa de microtitulación, incubando la mezcla durante una hora, lavando la placa tres veces con 350 pl de HNaT, aplicando TMB (3,3'5,5'-Tetrametilbenzidina), y la detección de la posterior conversión cromogénica de TMB por HRP. Gráficos de CI50 para los péptidos representativos JBT1857 (SEQ ID NO: 178), JBT1837 (SEQ ID NO: 1044) y el complejo peptídico JBT2547 (Ac-FQSKpNVHVDGYFERL-AibAKLSSSSSSSSSSSYYKWH[CAMRDMKGTMTC]VWVKF-NH2 (SEQ ID NO: 4260)) se representan en las Figuras 66A y 66B.

[0216] El complejo peptídico inhibidor de TFPI JBT2547, que comprende dos péptidos de unión a TFPI diferentes (JBT1857 y JBT1837) que se unen dos sitios diferentes dentro de TFPI, demostraron una CI50de 1,33x10-9 M (trazador JBT2271) y un CI50 de 5,57X10-10 M (trazador JBT2316), que fue comparable o inferior a la CI50 de las subunidades peptídicas.

[0217] Además, la unión a TFPI de longitud completa JBT2547 se caracterizó en un ensayo de resonancia de plasmón superficial (BIAcore T200TM, GE Healthcare, Chalfont St Giles, RU). El TFPI-1 de longitud completa recombinante se inmovilizó en un chip CM5 con el objetivo de 500 RU. El péptido se inyectó a una velocidad de flujo de 30 pl/minuto a concentraciones que oscilan entre 1 y 16 nM en tampón HBS-P, pH 7,4, DMSO al 0,1%. Posteriormente, el péptido se disoció durante 600 segundos. El software de evaluación BIAcore T200TM se utilizó para analizar los datos, lo que reveló que JBT2547 se une estrechamente al TFPI de longitud completa con una constante de enlace <1 nM. Se calculó que la kD era de 7,49 x 10-12 M.

Ejemplo 17

[0218] Este ejemplo describe un método ejemplar para la caracterización de la afinidad de unión de un complejo de péptido de unión a TFPI usando un ensayo Kapagado.

[0219] Pocillos de una placa de microtitulación (96 pocillos, Maxisorp, Nunc) se recubrieron con 1,6 nM TFPI en tampón de recubrimiento (15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9,3) durante dos horas a temperatura ambiente. A continuación, la placa se lavó tres veces con 350 pl de tampón de lavado (NaCl mM 175, 5 mM CaCl2, HEPES 25 mM, 0,1% de Tween 80, pH 7,35), y los pocillos se bloquearon con 100 pl tampón de bloqueo (2% extracto de levadura, 175 mM NaCl, 5 mM CaCl2, h Ep ES 25 mM, 0,1% de Tween 80, pH 7,35). Si se empleó un período de incubación de 24 horas, los pocillos se bloquearon durante al menos una hora. Los pocillos de control utilizados durante un período de incubación de 15 minutos se bloquearon durante 23,5 horas adicionales.

[0220] Para un período de incubación de 24 horas, los pocillos se lavaron tres veces con 350 pl de tampón de lavado y se incubaron con péptido de ensayo de 50 pl (JBT2547 (SEQ ID NO: 4260) o JBT1857 (SEQ ID NO: 178)) en tampón de lavado. La concentración del péptido de ensayo se ajustó en función de la concentración de CI90 individual determinada, por ejemplo, en el ensayo ELISA TFPI CI50 descrito aquí. Los pocilios recubiertos con TFPI se expusieron al péptido de ensayo durante aproximadamente 15 minutos. Los pocilios se lavaron posteriormente tres veces con 350 |j| de tampón de lavado y se agregaron 50 j l de péptido trazador (competidor) (JBT2271 (SEQ ID NO: 4033)). Los pocillos de control (señal máxima) se incubaron solo con el marcador. Los pocillos en blanco que carecen de recubrimiento con TFPI se incubaron con un marcador solamente. La adición del péptido trazador comenzó el período de incubación de 24 horas.

[0221 ] Un período de incubación de 15 minutos se empleó como control si la concentración CI90 del péptido de ensayo dio lugar a una reducción del 90% de la señal máxima. Los pocillos bloqueados durante 23,5 horas adicionales se lavaron tres veces con 350 j l de tampón de lavado para eliminar el tampón de bloqueo. Posteriormente, se agregaron 50 j l de analito en el tampón de lavado y los pocillos se incubaron durante 15 minutos. La concentración del péptido de ensayo utilizado se ajustó en función de la concentración de CI90 del péptido determinada utilizando, por ejemplo, un ensayo ELISA TFPI CI50, La incubación de 15 minutos fue seguida por tres etapas de lavado con 350 j l de tampón de lavado y la adición de 50 j l de péptido trazador. Los pocillos de control (señal máxima) se incubaron solo con el marcador. Los pocillos en blanco que carecen de TFPI también se incubaron con trazador solamente.

[0222] La placa se lavó tres veces con 350 j l de tampón de lavado, y 50 j l conjugado con HRP estreptavidina (R&D Systems, 1:200 en tampón de lavado) se añadió a cada pocillo. Después de un período de incubación de una hora a temperatura ambiente, la placa se lavó tres veces con tampón de lavado. Se añadió solución TMB (50 j l por pocillo; SeramunBlau fast, Seramun). Después de una incubación de 1,5 minutos a temperatura ambiente, la reacción se detuvo mediante la adición de 50 j l de 1 M H2SO4 por pocillo. La absorbancia se midió utilizando un fotómetro (Spectramax M5, Molecular Devices) a 450 nm y 620 nm.

[0223] Los resultados del ensayo se presentan en la Figura 67 como un porcentaje de la densidad óptica corregida (OD450-DO620) de pocillos expuestos para ensayar el péptido y péptido de trazador en relación con pocillos recubiertos con TFPI expuestos solamente a trazador. Después de 24 horas, el complejo peptídico de unión a TFPI continuó bloqueando la unión del trazador a TFPI. En contraste, JBT1857 se disoció de TFPI durante el período de incubación de 24 horas. Por lo tanto, JBT2547 se disociaba significativamente más lento de TFPI que uno de su subunidad peptídica, JBT1857.

[0224] La afinidad de JBT2528 para TFPI también se determinó utilizando los métodos descritos en el presente documento: kD = 1,6 nM; kencendido = 6,5 x 1051/Ms; kapagado = 9,7 x 10-41/s. JBT2528 se une a TFPI KD1.

Ejemplo 18

[0225] Este ejemplo describe la estabilidad del plasma del TFPI-complejo de unión péptido JBT-2547 en el ratón y el plasma humano. JBT2547 (SEQ ID NO: 4260) y JBT1857 (SEQ ID NO: 178) se agregaron a muestras de plasma de ratón o humano y se incubaron durante 24 horas a 37°C. El porcentaje de la cantidad inicial de péptido restante después de la incubación se determinó por CI50 ELISA en placas Maxisorp revestidas con 0,05 mg/ml de TFPI (2,26 nM de trazador péptido JBT2271). Menos del 5% de la cantidad inicial de JBT1857 permaneció en el plasma del ratón después del período de incubación, mientras que el 15% de la cantidad inicial de JBT-2547 permaneció después del mismo período de incubación. De manera similar, JBT2547 fue más estable en plasma humano en comparación con JBT1857 y JBT1837; el 27% de la cantidad original de JBT1857 y el 46% de JBT1837 permanecieron después de 24 horas, mientras que el 54% de la cantidad original de JBT2547 se detectó. Por lo tanto, el complejo de JBT1857 y JBT1837 aumentó la estabilidad y la resistencia a las proteasas plasmáticas. JBT2528 (Hex-FQSKp-C(Acm)-VH-Tle-DaYFERL-Aib-AKL-NH2 (SEQ ID NO: 4246)) también mostró una estabilidad mejorada: el 93% de la cantidad original permaneció después de 24 horas en plasma humano, y el 35% de la cantidad original permaneció después de 24 horas en plasma de ratón.

Ejemplo 19

[0226] El siguiente ejemplo describe la caracterización de la actividad inhibidora de TFPI de un dcomplejo de unión de péptido a TFPI y monómeros peptídicos de unión a TFPI utilizando la inhibición de FXa y ensayos de inhibición de tenasa extrínseca descritos en el Ejemplo 3.

[0227] Los péptidos se diluyeron en 1,25X tampón de reacción 0,1% Tween-80 (HEPES 31,25 mM; NaCl 218,75 mM; CaCl26,25 mM; 0,125% de BSA, pH 7,35) a partir de reservas de 1 o 10 mM (en DMSO). TFPI, FVIIa y TF lipidado se diluyeron en tampón de reacción 1,25X. Las vesículas de fosfolípidos (DOPC/POPS 80/20) y el sustrato cromogénico específico para FXa (S-2222 (disponible de DiaPharma, West Chester, OH)), todos diluidos en agua destilada, se agregaron a las placas de 96 pocillos. Después de un período de incubación, se agregaron TFPI y diluciones de péptidos. La concentración de TFPI en el ensayo de inhibición de la tenasa extrínseca fue de 0,0625 nM. La activación de FX se inició al agregar FX a los pocillos. La conversión del sustrato cromogénico mediada por FXa se determinó observando un aumento en la absorbancia utilizando un lector de microplacas. La cantidad de FXa generada en ciertos puntos de tiempo se calculó a partir de las lecturas de DO. La FXa generada a los 20 minutos después del inicio de la reacción se consideró para el cálculo de CE50 a partir de gráficos de la concentración de péptido frente a la inhibición de TFPI (%).

[0228] La inhibición funcional de TFPI también se examinó usando un ensayo de inhibición de FXa. Un sustrato cromogénico específico para FXa (S-2222) y vesículas de fosfolípidos (DOPC/POPS 80/20), ambos diluidos en agua destilada, y proteínas TFPI (TFPI humano de longitud completa, TFPI 1-160 humano, TFPI 1-160 murino, y cynomolgus TFPI 1-160) diluido en tampón de reacción 1,25X, se añadieron a placas de 96 pocillos. La concentración de TFPI en el ensayo de inhibición de FXa fue de 0,5 nM. Los péptidos se diluyeron a partir de reservas 1 o 10 mM (en DMSO) en 1,25 x tampón de reacción Tween-80 al 0,1%. Las diluciones de péptidos (2,5 jl) se agregaron a las placas de 96 pocillos. La conversión de sustrato cromogénico se desencadenó mediante la adición de FXa, y la cinética de la conversión se midió en un lector de microplacas. Se consideraron las lecturas de DO después de 115 minutos para el cálculo de la CE50 a partir de gráficos de concentración de péptido frente a la inhibición de TFPI.

[0229] Resultados del ensayo de inhibición de FXa y el ensayo de tenasa extrínseca se proporcionan en la Tabla 19 y en las Figuras 68A y 68B.

TABLA 19

[0230] JBT1837, JBT2547, JBT2528, y la combinación de JBT1837 y JBT1857 inhibió de manera muy eficiente 0,5 nM de longitud completa y C-terminal truncado TFPI 1-160 (Tabla 19 y Figuras 68A y 68B) en el ensayo de inhibición de FXa. JBT1857 inhibió con menos eficiencia ambos TFPI con CE50s de 4,3 y 3,1 nM, respectivamente. A concentraciones superiores a 100 nM, JBT1837, JBT2547 y la combinación de JBT1837 y JBT1857 bloquearon completamente la actividad de TFPI, como lo indica una inhibición máxima de casi el 100%. JBT1857 (y JBT2528) es un inhibidor parcial de TFPI y demostró cierta actividad inhibitoria residual de TFPI a concentraciones altas y saturantes. La inhibición de los TFPI tanto de longitud completa como truncados en el extremo C confirma que los epítopos de unión de los péptidos están dentro de los Dominios Kunitz 1 y 2, y que la región C-terminal de TFPI no es necesaria para una inhibición eficaz de la actividad de TFPI.

[0231] Los péptidos candidatos también se analizaron para la inhibición de murino y de mono cynomolgus TFPI. Las proteínas TFPI murinas y de mono truncadas en el extremo C (TFPI 1-160) se usaron en un ensayo de inhibición de FXa realizado como se describe en este documento. Los resultados se resumen en la Tabla 20 y en las Figuras 68C y 68D.

TABLA 20

[0232] JBT1837 no inhibió el ratón TFPI 1-160 hasta 10 jm (Figura 68C). TFPI de mono cynomolgus se inhibió sólo débilmente en concentraciones de jM , probablemente debido a diferencias de secuencia inter-especies que son incompatibles con la unión de JBT1837 (Figura 68D). JBT1857 inhibió eficazmente el TFPI del ratón, lo que dio como resultado una CE50 de 7,2 nM, que es comparable a la inhibición del TFPI humano. El TFPI de mono Cynomolgus fue inhibido ineficientemente por JBT1857, probablemente debido a una sustitución Ala a Pro dentro del sitio de unión de JBT1857.

[0233] JBT2547 inhibió más eficazmente el TFPI de ratón y de mono cynomolgus. JBT2547 medió una reducción de aproximadamente 50 veces y 10 veces mayor de CE50 s en comparación con JBT1857 y la combinación de JBT1837 y JBT1857. Esto indica además que la fusión molecular de las dos entidades peptídicas aumenta su actividad inhibidora de TFPI.

[0234] Para demostrar que el complejo de péptido inhibe de manera eficaz grandes concentraciones de TFPI, los péptidos se titularon a concentraciones crecientes de TFPI humanos. JBT2547 inhibió estequiométrica y completamente (100%) la actividad de TFPI en todas las concentraciones analizadas (hasta 10 nM) (Figuras 68E y 68F). En contraste, los péptidos JBT1837 y JBT2548 (un derivado de JBT1857) son inhibidores parciales de TFPI a altas concentraciones (Figura 68D). La unión de péptidos inhibidores de TFPI para formar un complejo peptídico potencia la inhibición de la actividad de TFPI.

[0235] En el ensayo de tenasa extrínseca, JBT2547 restaurado extrínseco complejo mediado por la activación de FX en la presencia de TFPI con un CE50 de 0,3 nM, lo que resulta en una inhibición casi 100% de la actividad TFPI a baja concentración TFPI (0,063 nM). JBT1837, JBT1857 y la combinación de JBT1837 JBT1857 inhibieron menos eficientemente TFPI, como se indica por el aumento de CE50 y la reducción de la inhibición máxima (Figura 69A). Para demostrar que el complejo peptídico inhibe eficientemente altas concentraciones de TFPI, se tituló JBT2547 a concentraciones crecientes de TFPI. JBT2547 inhibió de manera eficiente la actividad de TFPI en todas las concentraciones ensayadas (hasta 10 nM) con las CE50 más bajas de los péptidos ensayados (Figuras 69B-69D). Por el contrario, los péptidos JBT1837, JBT2548 y la combinación de los péptidos JBT1837 JBT1857 inhibieron parcialmente el TFPI a altas concentraciones (Figuras 69C-69D) con mayor CE50 en comparación con JBT2547.

[0236] Actividades antagonistas TFPI de JBT1837, JBT1857, también se determinó en sistemas de reacciones de una mezcla de JBT1837 y JBT1857, y JBT2547 en donde FXa fue inhibida por TFPI en presencia de Ca2+, fosfolípido (PL) Ca2+, y PL Ca2++ proteína S. La efectividad por la cual los péptidos bloquean la actividad de TFPI aumenta en el orden JBT1857, JBT1837, la mezcla de JBT1837 y JBT1857, y JBT2547. JBT1837 y JBT1857 no bloquearon completamente el TFPI, particularmente no en presencia de cofactor proteína S. Una mezcla de JBT1837 y JBT1857 fue más potente como antagonista de TFPI que los péptidos individuales. El péptido de fusión JBT2547 fue el mejor antagonista de TFPI; a una concentración de 50 nM, el complejo peptídico bloqueó casi completamente el TFPI incluso en presencia de PL Ca2+ proteína S.

[0237] Este ejemplo demuestra que el enlace de dos péptidos de unión a TFPI de la invención, por ejemplo, fusión molecular, mejora la actividad inhibitoria de TFPI. JBT1837 previene la formación del complejo TFPI-FXa primario (complejo de encuentro) y en altas concentraciones puede bloquear completamente la inhibición de TFPI por TFPI. JBT1857 evita la transición del encuentro débil al complejo TFPI-FXa estrecho e inhibe parcialmente el TFPI, ya que en presencia de JBT1857 todavía es posible formar el complejo primario TFPI-FXa (complejo de encuentro). Una fusión molecular de los dos péptidos de unión a TFPI demostró un gran grado de actividad inhibitoria que cada péptido solo y una mezcla de las subunidades peptídicas (es decir, el efecto fue mayor que el del aditivo).

Ejemplo 20

[0238] En este ejemplo, la actividad inhibidora de TFPI de un complejo péptido de unión a TFPI se caracteriza usando ensayo basado en el plasma del Ejemplo 4. Péptidos de unión a TFPI se ensayaron en condiciones fisiológicas (~ 0,2 nM de longitud completa del TFPI) como las condiciones del pocillo imitando los niveles plasmáticos elevados de TFPI de longitud completa (hasta 10 nM de TFPI de longitud completa).

[0239] La influencia de los péptidos en la generación de trombina en ausencia o en presencia de flTFPI exógena se midió por duplicado mediante trombografía automatizada calibrada en un lector Fluoroskan Ascent® (Thermo Labsystems, Helsinki, Finlandia; filtros de excitación de 390 nm y 460 nm de emisión) después de la lenta escisión de un sustrato fluorogénico específico de trombina (Hemker, Pathophysiol. Haemost. Thromb., 33, 4-15 (2003)). Como modelo para la deficiencia de FVIII mediada por anticuerpos, se incubó plasma congelado agrupado normal (George King BioMedical Inc., Overland Park, KN) con plasma de FVIII antihumano de alto título inactivado por calor criado en cabra (4490 BU/ml; Baxter BioScience, Viena, Austria) dando lugar a 50 BU/mL. Los ensayos también se realizaron con plasma de mono cynomolgus y mono tití. Los plasmas se mezclaron con el inhibidor de la tripsina de maíz (CTI) (Hematologic Technologies, Inc., Essex Junction, VT) para inhibir la contaminación del Factor XIIa, lo que dio como resultado una concentración final de 40 pg/ml.

[0240] El plasma precalentado (37°C) (80 pL) se añadió a cada pocillo de una placa de micro-96 (Immulon 2HB, fondo U claro; Thermo Electron, Waltham, MA). Para desencadenar la generación de trombina por factor tisular, 10 pL de reactivo bajo de PPP que contiene factor tisular humano recombinante (12 pM) y vesículas de fosfolípidos compuestas de fosfatidilserina, fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina (48 pm) (Thrombinoscope BV, Maastricht, Países Bajos) fueron agregados. Justo antes de colocar la placa en el lector precalentado (37°C), se agregaron 5 pl de soluciones de péptidos, lo que dio como resultado concentraciones plasmáticas de 1-100 nM. Finalmente, 5 p1HEPES solución salina tamponada con 5 mg/ml albúmina de suero bovino (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, Missouri, EE.UU.) o se añadieron dilución de 5 pl de longitud completa TFPI (flTFPI). La proteína flTFPI (3557 nM) se había expresado en células SK Hep y se había purificado. Las concentraciones plasmáticas de flTFPI variaron entre 0,31 y 10 nM, lo que equivale a un aumento de aproximadamente 2 a 50 veces en la concentración plasmática de flTFPI endógena. La generación de trombina se inició por adición de 20 pl de reactivo fluca (Thrombinoscope BV, Maastricht, Países Bajos), que contiene un sustrato fluorogénico y se tamponó con HEPES CaCl2 (100 mM). La intensidad de la fluorescencia se registró a 37°C. Los parámetros de las curvas de generación de trombina resultantes se calcularon utilizando el software Thrombinoscope™ (Thrombinoscope BV, Maastricht, Países Bajos) y el calibrador de trombina para corregir los efectos del filtro interno y del consumo de sustrato (Hemker, Pathophysiol. Haemost. Thromb., 33, 4-15 (2003)). La dilución de plasma final, la concentración de TF y la temperatura de ensayo para el ensayo de plasma humano fue 1:1,5, 1 pM y 37°C, respectivamente. La dilución de plasma final, la concentración de TF y la temperatura de ensayo para el ensayo de plasma C57B16 de ratón y el ensayo de plasma FVII'/_ de ratón fue de 1:2,4, 0,4 pM y 33°C, respectivamente. La dilución de plasma final, la concentración de TF y la temperatura de ensayo para los ensayos de plasma de mono cinomolgous y tití fue de 1:1,5, 0,6 pM y 37°C, respectivamente.

[0241] Los resultados representativos para la mejora de la generación de trombina de plasma inhibido por FVIII humano se proporcionan en la Tabla 21.

TABLA 21

[0242] JBT1837, JBT1857, una mezcla de JBT1837 JBT1857, y el complejo de JBT1837 y JBT1857 (JBT2547) mejoraron la generación de trombina del plasma inhibido por FVIII con CE50s similar. La eficacia máxima en relación con un anticuerpo policlonal anti-TFPI fue máxima para JBT2547, lo que demuestra que la fusión de dos péptidos de unión a TFPI descritos en el presente documento aumenta la inhibición de la actividad de TFPI en plasma.

[0243] Las Figuras 70A-70C ilustran la actividad inhibidora de 1-100 nM del péptido de fusión JBT2547 (diamante) hacia niveles elevados de los niveles plasmáticos flTFPI (1,25, 3,75 y 10 nM) en el ensayo de generación de trombina. En comparación con JBT1837 (triángulo) y JBT1857 (círculo), JBT2547 muestra una capacidad sustancialmente mayor para aumentar el pico de trombina incluso en presencia de niveles plasmáticos de flTFPI muy altos. Aunque la combinación de JBT1837 y JBT1857 (cuadrada) mejoró la respuesta sobre cada péptido monomérico solo, la combinación de monómeros no alcanzó el nivel de activación alcanzado por el complejo peptídico. El potencial antagonista de TFPI de JBT2547 también se ensayó en presencia de un amplio rango de concentración de f1TFPI de hasta 10 nM, que es equivalente a 50 veces más que la concentración plasmática fisiológica de flTFPI. Las concentraciones de JBT2547 50-100 nM compensaron completamente el efecto anticoagulante de flTFPI 10 nM, y los valores máximos de trombina alcanzaron niveles plasmáticos normales o superiores. Las concentraciones de JBT2547 por debajo de 50 nM mejoraron la generación de trombina del plasma inhibido por FVIII de una manera dependiente de flTFPI.

[0244] Los resultados de los experimentos de generación de trombina con varios plasmas animales se resumen en las Tablas 22 y 23.

TABLA 22

TABLA 23

[0245] JBT1837 no inhibió el TFPI de ratón y mono tití en concentraciones relevantes. Cynomolgus mono TFPI está poco inhibido sólo a concentraciones de |jm. JBT1857 inhibió eficazmente los TFPI de ratones y monos tití, mientras que el TFPI de mono cynomolgus fue inhibido de manera menos eficiente por JBT1857, probablemente debido a una sustitución de aminoácidos de Ala a Pro dentro del sitio de unión de JBT1857 que se conserva como Ala en TFPI humanos, ratones y monos tití. El TFPI del mono Cynomolgus se inhibe de la manera más eficiente por el péptido de fusión JBT2547.

Ejemplo 21

[0246] Este ejemplo describe la capacidad de los péptidos de unión a TFPI descritos anteriormente para restaurar la conversión de FX a FXa mediada por el complejo de la tenasa extrínseca en un ensayo de tenasa extrínseca basado en células. El ensayo se realizó como se describe en el Ejemplo 5. Las concentraciones de FXa obtenidas después de nueve minutos de reacción en presencia de anticuerpo policlonal anti-humano TFPI 100 nM (R&D Systems, AF2974) se ajustaron al 100%, y las muestras que no fueron expuestas al anticuerpo se establecieron en un 0% de efecto inhibitorio de TFPI, lo que permite la evaluación de la actividad inhibitoria del péptido. Los resultados del ensayo se ilustran en las Figuras 71A y 71B. JBT2547 demostró una inhibición mejorada de HUVEC TFPI en comparación con JBT1837, JBT1857, JBT2548 y una mezcla de JBT1857 y JBT1837. La inhibición completa de TFPI se logró en concentraciones tan bajas como aproximadamente 10 nM.

Ejemplo 22

[0247] Este ejemplo describe un método para evaluar la formación de coágulos en sangre total utilizando tromboelastografía de rotación (ROTEM). El ensayo se realizó como se describe en el Ejemplo 8, La configuración analítica fue la siguiente: se agregaron 300 j l de sangre entera citrada tratada con CTI precalentada (37°C) a una muestra de péptidos (10, 100, 1000 nM de concentración final de ensayo) o un control, seguido de la adición de una dilución 1:15 de reactivo TF PRP que contiene factor tisular humano recombinante (rTF, 3 pM) (TS40, Thrombinoscope BV, Maastricht, Países Bajos). En ciertos experimentos, se agregó TFPI de longitud completa exógena (flTFPI) a concentraciones finales de 2 o 10 nM para simular niveles plasmáticos de flTFPI de hasta 50 veces más que lo normal. La coagulación se inició mediante la adición de 20 j l 200 mM de CaCl2 (star-TEM®, Pentapharm, Munich, Alemania) y se permitió que las grabaciones continuaran durante al menos 120 minutos. La concentración final de rTF en el ensayo fue de 44 fM. Los parámetros tromboelastográficos de tiempo de coagulación (CT), tiempo de formación de coágulos (CFT) y máxima firmeza de coágulos (MCF) se registraron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La TC se define como el tiempo desde el inicio de la medición hasta el inicio de la formación del coágulo. CFT se define como el tiempo desde el inicio de la formación del coágulo hasta que se alcanza una amplitud de 20 mm. MCF es la diferencia máxima en amplitud entre las dos trazas durante el ensayo.

[0248] La adición de TFPI de longitud completa a la sangre completa inhibida por FVIII en ausencia de péptidos inhibidores de TFPI inhibió sustancialmente la coagulación como se indica por un aumento marcado en el tiempo de coagulación (Figuras 72A-72C). JBT2528 y JBT1837 mejoraron los parámetros hemostáticos globales del plasma inhibido por FVIII (CE50 = 11 nM y 4 nM, respectivamente). JBT1837 y JBT2548 mejoraron la coagulación al reducir el tiempo de coagulación a niveles normales de una manera dependiente de la concentración (Figuras 72B y 72C; círculos abiertos). Estos péptidos no lograron alcanzar los tiempos de coagulación de la sangre inhibida por FVIII a concentraciones aumentadas de TFPI (por ejemplo, 10 nM). En contraste, las concentraciones de JBT2547 por encima de 100 nM restablecieron completamente la coagulación normal de la sangre completa inhibida por FVIII a la que se agregaron TFPI de longitud completa 2 nM y 10 nM.

[0249] Este ejemplo confirma además que los complejos peptídicos de unión a TFPI neutralizan eficazmente el TFPI y restauran la coagulación normal incluso a concentraciones aumentadas de TFPI.

Ejemplo 23

[0250] Las plaquetas contienen longitud completa TFPI, que se libera al plasma tras la activación de las plaquetas y los resultados en una concentración de TFPI de plaquetas en el plasma que se aproxima a 50-75% de la TFPI de longitud completa en el plasma en los sitios de lesión. Este ejemplo demuestra la inhibición del TFPI plaquetario por los péptidos de la invención.

[0251] Recolección de sangre y preparación de plasma: Se recogieron muestras de sangre de varios donantes diferentes. Se extrajeron nueve volúmenes de sangre venosa por punción venosa en 1 volumen de 1,09 citrato de trisodio con o sin 500 pg/ml de CTI y se centrifugaron a 250 x g durante 15 minutos para la preparación de plasma rico en plaquetas (PRP) o a 2860 x g para la preparación de plasma pobre en plaquetas (PPA). El PPP se dividió en partes alícuotas, se congeló instantáneamente y se almacenó a -80°C hasta su uso. En experimentos en los que se utilizó un grupo de plasma normal (NP), la sangre recogida de más de 25 individuos sanos se centrifugó a 2000 x g durante 15 minutos para separar el plasma de las células sanguíneas, y nuevamente a 11,000 x g durante 5 min para obtener plasma pobre en plaquetas.

[0252] Aislamiento de plaquetas: Se recogió sangre (45 ml) sobre 7,5 ml de citrato de ácido/dextrosa (ACD, citrato de trisodio 80 mM, ácido cítrico 52 mM, glucosa 183 mM) y se centrifugó durante 15 min a 248 x g. Para eliminar los eritrocitos residuales, el sobrenadante (plasma rico en plaquetas, PRP) se centrifugó durante 5 minutos adicionales a 248xg. El PRP se centrifugó posteriormente durante 15 minutos a 2760 rpm (1360 x g) para hacer girar las plaquetas. El sedimento de plaquetas se lavó dos veces resuspendiendo en 20 ml (primer lavado) y 15 ml (segundo lavado) de tampón plaquetario (HEPES 10 mM, NaCl 136 mM, KCl 2,7 mM, MgCh 2,0 mM, albúmina sérica bovina al 0,5% y 0,2% de glucosa, pH 6,6), seguido de centrifugación durante 15 minutos a 2760 rpm (1360xg). Después de la segunda etapa de lavado, las plaquetas se resuspendieron en 3,5 ml de tampón plaquetario (pH 7,5) y la concentración de plaquetas se determinó en un contador Coulter. Finalmente, la suspensión de plaquetas se diluyó a la concentración de plaquetas requerida por dilución con tampón de plaquetas (pH 7,5) y se agregaron 40 pl de una solución de 25 mg/ml del péptido sintético Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS) por 3,5 ml de suspensión de plaquetas para inhibir la agregación plaquetaria durante el almacenamiento a temperatura ambiente.

[0253] Caracterización funcional de las plaquetas TFPI: TFPI fue liberado de plaquetas aisladas mediante la activación de las plaquetas a 37°C durante 15 min con 100 ng/ml convulxina. Las plaquetas se centrifugaron por centrifugación (15 min a 2800 x g) en un tubo de centrífuga Eppendorf, y el sobrenadante se recogió como fuente de TFPI plaquetario. El TFPI plaquetario se cuantificó con un ELISA de TFPI de longitud completa utilizando TFPI recombinante como estándar. La actividad funcional del TFPI plaquetario se comparó con la actividad del TFPI recombinante en dos sistemas de ensayo: 1) inhibición de la activación de FX catalizada por FVIIa en un sistema modelo e 2) inhibición de la generación de trombina en plasma deficiente de TFPI.

[0254] En el ensayo de modelo de sistema, el efecto de concentraciones variables recombinantes o TFPI plaquetarias en TF-FVIIa catalizada de activación de FX se determinó a 37°C en un HEPES 25 mM (pH 7,7), NaCl 175 mM, 5 mg/ml de tampón de suero bovino de albúmina (BSA) que contiene FVIIa 2 pM, TF 5 nM, FX 100 nM y Fluophen FXa 400 uM. En este ensayo, FVIIa, TF, TFPI y Fluophen FXa se preincubaron durante 7 minutos a 37°C en el tampón HEPES y se inició la activación de FX mediante la adición de FX. Las curvas de progreso de la conversión de Fluophen FXa por el FXa generado se determinaron en lector Fluoroskan Ascent® (Thermo Labsystems, Helsinki, Finlandia) y se corrigieron para el consumo de Fluophen FXa y los llamados efectos de filtro interno (Udenfriend S, Ensayo de fluorescencia en biología y medicina. Nueva York, Academic Press, 1996, vol 1, pp13, 118, vol 2, pp182-185) por la metodología que también se utiliza para la corrección de las curvas de generación de trombina para el consumo de sustrato (Hemker et al., Pathophysiol Haemost Thromb, 32, 249-53 (2002)). Los cursos de tiempo de la generación de FXa y los efectos de TFPI en el mismo se obtuvieron al tomar el primer derivado de las curvas de progreso corregidas de la conversión de Fluophen FXa. Alternativamente, el efecto de TFPI en la activación de FX catalizada por TF-FVIIa también fue seguido por un sustrato cromogénico específico de FXa, por ejemplo, 125 pm CS-11(65).

[0255] En el ensayo de generación de trombina, plasma empobrecido en TFPI se reconstituyó con cantidades variables de TFPI recombinante o TFPI derivado de plaquetas, y la generación de trombina se determinó usando el método de calibrado automatizado Trombograma (CAT) descrito por Hemker et al., Supra. La generación de trombina se inició en plasma mediante la adición de concentraciones variables de TF recombinante (0,1-10 pM), CaCh 16 mM, 30 pM de vesículas de fosfolípidos (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoserina/1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina/1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina, 20/20/60, M/M/M) y 30-50 pg/ml de inhibidor de la tripsina de maíz (CTI). En experimentos en PRP, no se agregaron vesículas de fosfolípidos al plasma. La actividad de la trombina en plasma se controló de forma continua con el sustrato fluorogénico Z-Gly-Gly-Arg-AMC (BACHEM, Bubendorf, Suiza). La fluorescencia se leyó en un lector Fluoroskan Ascent® (Thermo Labsystems, Helsinki, Finlandia) y las curvas de generación de trombina se calcularon utilizando el software Thrombinoscope™ (Thrombinoscope, Maastricht, Países Bajos).

[0256] Análisis del efecto de los péptidos de la invención sobre TFPI recombinante, de plasma, y de plaquetas: Los efectos de péptidos de unión a TFPI en la actividad anticoagulante del TFPI se ensayó en sistemas modelo (inhibición de activación de FX catalizada por FXa y TF-FVIIa por TFPI) y en plasma (NP, PPP, PRP o plasma agotado de TFPI reconstituido con TFPI recombinante o de placa o plaquetas). El efecto de los péptidos sobre la inhibición de FXa por TFPI se siguió en un tampón HNBSA (HEPES 50 mM, pH 7,7, NaCl 175 mM, 5 mg/ml BSA) que contenía 125 pm Cs -11 (65), EDTA 1 mM o CaCl23 mM y, si están presentes, concentraciones variables de péptido y TFPI, 80 nM de proteína S y/o vesículas de 30 mM de fosfolípidos (20:60:20 DOPS/DOPC/DOPE), que se preincubó durante 10 minutos a 37°C. Se agregó hFXa y se siguió el aumento de la absorbancia a 405 nm en un Ultra Microplate Reader (Bio-Tek, Burlington, VT, EE.UU.) hasta que se alcanzó una tasa de conversión de sustrato cromogénico en estado estable (~ 60 min). Las curvas de progreso de la conversión del sustrato cromogénico se ajustaron a la ecuación de velocidad integrada para la inhibición de la unión de compresión lenta (Huang et al., J Biol Chem, 268, 26950-55 (1993)):

At = Ao ⁺ (v5.t) ⁺ (vo - vs).(l ^- ^{cxp {-ko b s.t))/k0bs}

en donde At es la absorbancia a 405 nm en el tiempo t; A0 es la absorbancia inicial a 405 nm; Vs es la velocidad final de estado estable; vo es la velocidad inicial; koí>s es una constante de velocidad aparente para la transición de vo a Vs (FXa-TFPI a FXa-TFPI*). Los valores vo y Vs relativos a las tasas de conversión de sustrato cromogénico por FXa en ausencia de TFPI, representan el grado de formación del complejo FXa-TFPI suelto y ajustado.

[0257] Se determinó el efecto de los péptidos sobre la inhibición de la activación de FX catalizada por TF-FVIIa por TFPI a 37°C en un HEPES 25 mM (pH 7,7), NaCl mM 175, 5 mg/ml de albúmina de suero bovino (BSA) tampón que contiene FVIIa 2 pM, TF 5 nM, FX 100 nM, Fluophen FXa 400 pm y cantidades variables de péptido y TFPI (derivados de plaquetas o recombinantes). En este ensayo, se preincubaron FVIIa, TF, TFPI, péptido y Fluophen FXa durante 7 minutos a 37°C en el tampón HEPES, y la activación de FX se inició agregando FX. Las curvas de progreso de la conversión de Fluophen FXa por el FXa generado se determinaron en el lector Fluoroskan Ascent® (Thermo Labsystems, Helsinki, Finlandia) y se corrigieron para el consumo de Fluophen FXa y los llamados efectos de filtro interno mediante la metodología que también se utiliza para la corrección de curvas de generación de trombina para sustrato. Los cursos de tiempo de la generación de FXa y los efectos de TFPI en el mismo se obtuvieron al tomar el primer derivado de las curvas de progreso corregidas de la conversión de Fluophen FXa. Alternativamente, el efecto de TFPI en la activación de FX catalizada por TF-FVIIa también fue seguido por un sustrato cromogénico específico de FXa, por ejemplo, 125 pm CS-11(65).

[0258] El efecto de los péptidos sobre TFPI plasma y las plaquetas se evaluó mediante la medición de sus efectos sobre la generación de trombina determina como se describe a continuación en la NP, PPP, PRP o en plasma empobrecido en TFPI reconstituido con TFPI recombinantes o de plaquetas o plaquetas. En experimentos en PRP o en plasma agotado de TFPI reconstituido con plaquetas, las plaquetas no se activaron o se activaron con convulxina 80 ng/ml o colágeno Horm 40 ug/ml (concentraciones finales en el pocillo). Para simular el plasma de hemofilia, se realizaron experimentos de generación de trombina en presencia de un plasma inhibidor de cabra, del cual se agregaron 1 pl a 80 pl de plasma para neutralizar el FVIII.

[0259] En los experimentos de generación de trombina, se añadió el plasma a la placa de microtitulación y, si está presente, se mezcla con cantidades adecuadas de fosfolípidos, plaquetas, TFPI, anti-FVIII, anticuerpos anti-TFPI, péptido y se incubaron durante 7 minutos a 37°C. Después de esta preincubación, se agregaron de inmediato TF y el activador de plaquetas (si está presente), seguido de una mezcla de sustrato fluorogénico/CaCh (FluCa) que inicia la generación de trombina.

[0260] Resultados: El sobrenadante de plaquetas TFPI inhibió inactivación FX catalizada por TF-FVIIa de una manera dependiente de concentración. La inhibición por el sobrenadante de plaquetas se evitó mediante un cóctel de anticuerpos anti-TFPI, lo que subraya que era TFPI en el sobrenadante de plaquetas que es el inhibidor de la activación de FX catalizada por TF-FVIIa. Sin embargo, las tasas de activación de FX en presencia de sobrenadante de plaquetas y anti-TFPI fue mayor que la tasa de activación de FX sin sobrenadante de plaquetas, lo que sugiere que el sobrenadante de plaquetas contenía una pequeña cantidad de un activador de FX, por ejemplo, FVIIa. Esto sugiere que los datos son una subestimación de la concentración de TFPI de plaquetas debido al hecho de que se debe inhibir más FVIIa cuando el sobrenadante de plaquetas está presente en la mezcla de ensayo que en la mezcla de ensayo en la que se realiza la curva de calibración con TFPI recombinante en tampón.

[0261] La actividad funcional de las plaquetas TFPI también se ensayó en plasma deficiente en TFPI y se comparó con la actividad de la recombinante TFPI no glicosilada. Las concentraciones de TFPI plaquetario de diferentes donantes se determinaron con un ELISA en el que se utilizó como calibrador el TFPI no glicosilado recombinante. Aunque no se realizaron valoraciones con las diferentes preparaciones de TFPI en plasma deficiente en TFPI, la inspección de los efectos del TFPI plaquetario y recombinante en la generación de trombina mostró que, en una base de concentración, el TFPI plaquetario y recombinante exhibe actividades anticoagulantes similares.

[0262] JBT1837, JBT1857, JBT1837 JBT1857, y JBT2547 (50 nM) bloquearon la capacidad de las plaquetas TFPI para inhibir la activación de FX catalizada por TF-FVIIa. El péptido de fusión fue más efectivo y bloqueó completamente la actividad anticoagulante de TFPI. JBT1857 fue el menos efectivo seguido de JBT1837 y la mezcla de JBT1837 y JBT1857. La valoración con JBT2547 demostró que una concentración de 10 nM inhibía casi completamente la actividad del TFPI plaquetario.

[0263] Se realizó un estudio adicional para aclarar más los efectos del TFPI en plasma y plaquetas sobre la inhibición de la generación de trombina en plasma rico en plaquetas (PRP) y en plasma pobre en plaquetas (PPP). Para discriminar entre la regulación descendente de la generación de trombina por TFPI plaquetario y TFPI derivado de plasma, se realizaron experimentos en plasma empobrecido en TFPI suplementado con plaquetas (fuente de TFPI plaquetario) y/o cantidades variables de TFPI purificado agregado (simulación de la variación de niveles de TFPI de plasma). Un experimento preliminar en plasma agotado de TFPI suplementado con plaquetas activadas por convulxina mostró que los anticuerpos anti-TFPI aumentaban la generación de trombina, lo que indicaba que el TFPI liberado de las plaquetas inhibe la generación de trombina.

[0264] Parece que la generación de trombina en PRP requería TF. En la PRP sin CTI y en la PRP a la que se agregó CTI más adelante, la altura del pico de ETP y trombina apenas se vio afectada por la concentración de TF (no se requirió TF) y solo se redujo el tiempo de retraso al aumentar la TF. Cuando el PRP se preparó a partir de la sangre que se recolectó en citrato más CTI, tanto el tiempo de retraso como el pico de trombina se vieron afectados por la concentración de TF, lo que indica que los experimentos realizados en PRP requieren que la sangre se recolecte en CTI.

[0265] En los experimentos descritos anteriormente, el plasma se preactiva con convulxina para promover la liberación de TFPI de plaquetas antes de iniciar la generación de trombina con TF plus Ca2+. Dado que la convulxina no es un desencadenante fisiológico, se realizó una comparación de la generación de trombina en PRP con plaquetas no activadas y plaquetas preactivadas con convulxina, colágeno y ionóforo de Ca. Parece que la capacidad de generación de trombina de las plaquetas aumentó en el orden de no activador = ionóforo < colágeno < convulxina.

[0266] Además, en los experimentos descritos anteriormente, las plaquetas se incubaron previamente con el activador (pre-activado) durante 7 minutos en presencia de TF, y la generación de trombina se inició con una mezcla de sustrato fluorogénico/Ca2+. Cuando el activador de plaquetas convulxina se agrega a la PRP 10-15 segundos antes de iniciar la generación de trombina con la mezcla de sustrato fluorogénico/Ca2+, se genera sustancialmente menos trombina que en PRP en la que las plaquetas se preactivaron con convulxina antes de empezarse la generación de trombina. En vista de estos resultados, los estudios futuros no incluirán la activación previa de plaquetas, y el colágeno o ningún activador se utilizará principalmente en experimentos en PRP.

[0267] Los efectos de los antagonistas del TFPI se ensayaron inicialmente en PRP preparado a partir de sangre recogida en CTI. La generación de trombina activada en PRP con 0,1 pM de colágeno t F se mejoró sustancialmente con un cóctel anti-TFPI y JBT2547. Esto muestra que el TFPI es un regulador importante de la generación de trombina en las plaquetas, y que el JBT2547 es tan efectivo como un cóctel anti-TFPI para neutralizar la actividad anticoagulante del TFPI. TFPI apenas reguló a la baja la generación de trombina en PRP activada con una alta cantidad (10 pM) de TF.

[0268] La mayor parte de la trombina generada en PRP a baja TF (13:00) apareció ser formada a través de la Xasa intrínseca y, por lo tanto, requiere FVIII. Tanto JBT2547 como un cóctel anti-TFPI aumentaron sustancialmente la generación de trombina en p Rp en donde el FVIII se neutralizó con anti-FVIII, una afección representativa del plasma de hemofilia. JBT2547 también mejoró la generación de trombina en plasma agotado de TFPI suplementado con plaquetas que no se activaron o que se activaron con colágeno.

[0269] Los experimentos con JBT2547 se llevaron a cabo con péptido de 4 pM, que, teniendo en cuenta la afinidad de JBT2547 para TFPI (rango sub-nM), probablemente es un gran exceso. De hecho, tanto en PPP como en PRP, 5 10 nM JBT2547 fue suficiente para inhibir completamente el TFPI.

[0270] Para ensayar si TFPI en el plasma, ya sea plasma o derivado de plaquetas, está totalmente inhibida por el cóctel de anticuerpos TFPI o JBT2547. una titulación de TFPI se realizó en PPP y en PRP en ausencia y en presencia de un cóctel de anticuerpos TFPI. El aumento de las concentraciones de TFPI en la parte superior del TFPI que está presente en el plasma más lo que se libera de las plaquetas inhibe gradualmente la generación de trombina. En presencia de un cóctel de anticuerpos TFPI, todas las curvas de generación de trombina fueron las mismas, lo que indica que el cóctel de anticuerpos TFPI no es un inhibidor parcial de TFPI pero neutraliza completamente el TFPI.

[0271] En PPP, las concentraciones bajas de TFPI agregadas (0,05 - 0,5 nM) inhibieron sustancialmente la generación de trombina y los gráficos de los parámetros de generación de trombina (tiempo de retraso de registro o en ETP) como una función del TFPI total (plasma TFPI TFPI añadido) podrían ajustarse a una línea recta suponiendo que el plasma contenía ~ 0,3 nM TFPI. Esto indicó que la actividad anticoagulante del TFPI agregado es similar a la del TFPI que está presente en el plasma. En PRP, se requerían cantidades mucho mayores de TFPI agregado para inhibir la generación de trombina.

[0272] El complejo de péptido JBT2547 mejoró la generación de trombina 3-4 veces en la PPP con una concentración eficaz (CE50) de 2 nM y una mayor generación de trombina de 2 veces en PRP con un CE50 de 8 nM. La generación de trombina en PRP a la que se añadió un anticuerpo inhibidor de FVIII para simular el PRP de un paciente con hemofilia se multiplicó por 3 veces por el complejo peptídico. Los datos descritos en el presente documento establecen que los péptidos de la invención se unen a TFpI derivado de plasma, recombinante y derivado de plaquetas, y potencian la generación de trombina mediante el bloqueo de los efectos anticoagulantes de TFPI de plaquetas y plasma.

Ejemplo 24

[0273] Este ejemplo describe el efecto hemostático de los péptidos de la invención en un modelo murino de hemorragia articular hemofílica.

[0274] El objetivo del estudio fue evaluar el efecto de un péptido PEGilado ejemplar de la invención en hemartrosis inducida por perforaciones en un modelo murino de la hemofilia A. El péptido JBT2329 se administró a una dosis de 1 mg/kg a ratones deficientes en FVIII con hemofilia grave (E16 FVIII B6; 129S4-F8 tm l kaz/J) mediante inyección intravenosa en la vena de la cola. También se administraron varias dosis de FVIII recombinante (ADVATE; 10, 50 y 100 UI/kg) solos o en combinación con JBT2329. Después de la administración de cada producto, se punzó la cápsula de la articulación de la rodilla derecha con una aguja de calibre 30 para inducir una hemorragia. Los animales se sacrificaron tres días después de la lesión, y el sangrado se evaluó mediante métodos histológicos y generales. El modelo animal y los métodos para evaluar el sangrado se describen con más detalle en Hakobyan et al., Haemophilia, 14, 804-809 (2008). Las puntuaciones de sangrado de resumen (SBS), que incluyen las puntuaciones de sangrado visual e histológico, se asignaron a cada articulación. La administración de un péptido PEGilado de la invención antes de la lesión redujo significativamente el sangrado articular. El efecto protector de 1 mg/kg de JBT2329 fue significativamente mayor que el efecto de 10 UI/kg ADVATE, pero menos de 100 UI/kg ADVATE, según lo determinado por SBS. No hubo diferencia significativa en el efecto protector conferido por 1 mg/kg de JBT2329 y 50 UI/kg de ADVATE. Los resultados descritos en este documento confirman además que los péptidos de la invención proporcionan un efecto profiláctico o protector contra el sangrado en un modelo in vivo de hemofilia A.

Ejemplo 25

[0275] Este ejemplo describe el impacto de péptidos de la invención en la capacidad de TFPI para unirse a receptores que median aclaramiento y la degradación celular. También se describe la farmacocinética de TFPI unido a péptido.

[0276] La longitud total de unión a TFPI (fl-TFPI) a la proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LRP) se estudió usando un ensayo de resonancia de plasmón de superficie BIAcore T200TM (GE Healthcare, Chalfont St Giles, Reino Unido) a 37°C. LRP fue biotinilado utilizando un kit de biotinilación de acuerdo con el protocolo del fabricante (Thermo Scientific). Después de la inmovilización de Neutravidina (2500 RU) en un chip sensor Serie S C1 (GE Healthcare) usando una química de acoplamiento de amina estándar de acuerdo con los protocolos del fabricante, la proteína quimérica l RP-1 Cluster II Fc humana recombinante biotinilada (R&D Systems) se unió a la superficie mediante biotina - Interacciones NeutrAvidin resultando en 450 RUs. Después de la inmovilización, se inyectó fl-TFPI a una velocidad de flujo de 30 pl/min en una concentración única de 10 nM diluida en tampón de funcionamiento (HBS-N, P80 al 0,1%, CaC^5 mM). fl-TFPI se disoció posteriormente cambiando el flujo a condiciones de tampón en ejecución. Cuando se estudió la interacción de fl-TFPI y LRP en presencia de péptidos (JBT1837, JBT1857, JBT2329 (JBT1857 40 kD PEG) o JBT2547 (JBT1837 JBT1857)) o polietilenglicol (40 kD), 1 pm de concentración final del péptido o PEG se añadió a fl-TFPI.

[0277] El TFPI interactuó eficazmente con LRP inmovilizado con velocidades rápidas de activación y desactivación. El TFPI truncado carece del dominio kunitz 3 (KD3) y el extremo C no interactúa con el LRP. Por inspección visual, fue evidente que fl-TFPI unido a JBT1837, JBT1857 o JBT2329 todavía interactúa con LRP. El TFPI complejado con el péptido de fusión JBT2547 dio como resultado una respuesta mayor que la observada para el TFPI complejado con péptidos únicos. La cinética de asociación y disociación inalterada de la interacción LRP-fl-TFPI en presencia y ausencia de un complejo peptídico (JBT2547) sugiere que los resultados diferentes están asociados con el aumento del peso molecular del complejo fl-TFPI-JBT2547 y la potencial unión de LRP y péptido a fl-TFPI por JBT2547. Se observó una ligera disminución en la interacción fl-TFPI LRP cuando el TFPI se unió a JBT2329 (JBT1857 PEGilado), mientras que un PEG de 40 kD solo no influye en el sistema de ensayo, lo que sugiere que un péptido unido a PEG altamente hidratado interfiere ligeramente con interacción de fl-TFPI LRP.

[0278] La interacción de TFPI con el receptor de asialoglicoproteína (ASGPR) también se evaluó utilizando un ensayo de resonancia de plasmón de superficie BIAcore 3000TM (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, Reino Unido) a 25°C. Después de la inmovilización de ASGPR (Novus Biologicals, 470 RU) en un chip sensor de la Serie S CM5 (GE Healthcare) utilizando química de acoplamiento de amina estándar según los protocolos del fabricante, fl-TFPI se inyectó a una velocidad de flujo de 30 pl/min en el único modo de análisis de ciclo en concentraciones que varían de 3,84 nM a 150 nM diluidos en tampón de funcionamiento (HBS pH 7,4, P80 al 0,1%, CaCl25 mM). fl-TFPI se disoció posteriormente cambiando el flujo a condiciones de búfer en ejecución. Cuando la interacción de fl-TFPI y ASGPR fue estudiada en la presencia de JBT1837, JBT1857, JBT2329, o JBT2547. Se añadió 1 pM de concentración final de péptido a la fl-TFPI.

[0279] El Fl-TFPI interactuó eficazmente con ASGPR inmovilizado con velocidades de activación y desactivación rápidas. El TFPI truncado en el extremo C no interactúa con ASGPR. Fue evidente a partir de la inspección visual que el fl-TFPI unido a JBT1857 o JBT2547 interactuó con ASGPR. Al igual que el LRP, el TFPI se complejó con el péptido de fusión JBT2547 generado en una respuesta más alta. También similarmente a la interacción de fl-TFPI con LRP, JBT2329 disminuyó la interacción ASGPR-fl-TFPI, mientras que un PEG de 40 kDa solo no influyó en el sistema de ensayo. Los datos sugieren que los péptidos ligados a PEG altamente hidratados de la invención interfieren con la interacción de TFPI-ASGPR a través de un impedimento estérico.

[0280] Para estudiar el impacto de los péptidos de unión a TFPI en la farmacocinética de TFPI in vivo, se trataron grupos de ratones (C57B16, macho, 20 -25 g) con fl-TFPI humano (775 nM, 5 ml/kg). i.v.), fl-TFPI humano complejado a un exceso molar de 10 veces de JBT2528 (775 nM hu fl-TFPI, 7752 nM JBT2528, 5 ml/kg, i.v.) o fl-TFPI humano complejado a un exceso molar de 10 veces JBT2534 (775 nM hu fl-TFPI, 7752 nM JBT2534, 5 ml/kg, i.v.). JBT2528 tiene la misma secuencia peptídica que JBT2534, pero carece de la modificación de 40 kD PEG. Como tal, JBT2528 sirve como control para un posible impacto de la PEGilación en el ensayo. En diversos momentos, se sacrificaron tres ratones, se extrajo sangre por punción del corazón y se aisló el plasma y se almacenó congelado (<-60°C) para un análisis adicional. Los puntos de tiempo de muestreo fueron los siguientes: fl-TFPI, 0,5, 1,2 minutos; fl-TFPI-JBT2528, 0,5, 1, 2, 3, 5, 8 minutos; y fl-TFPI-JBT2534, 1, 2, 5, 10, 20, 35 minutos.

[0281] Se analizaron muestras de plasma para TFPI humano con un ELISA que es específico para TFPI humano. Para la cuantificación, los pocillos de una placa de microtitulación (NunCmaxisorp) se recubrieron con 1 pg/ml de un anticuerpo TFPI monoclonal anti-humano KD2 específico (Sanquin, marca blanca; MW1845) durante la noche a 4°C, seguido de tres ciclos de lavado con TBS que contiene 0,1% de Tween 20 (TBST). Los pocillos se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente con TBS que contenía 2% de leche seca sin grasa (BioRad). Se aplicaron 100 pl de muestra diluida a los pocillos y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de lavarse con TBST (5x), los pocillos se incubaron durante 1 hora con 0,5 pg/ml de un anticuerpo policlonal de conejo anti hTFPI (ADG72; American Diagnostica), se lavaron 5 veces con TBST y se incubaron durante 1 hora más con 0,2 pg/mL de un anticuerpo marcado con HRP de conejo de cabra (A0545; Sigma). El color se desarrolló mediante la adición de 100 pl de sustrato (SureBlue TMP, KLP) y se detuvo con 50 pl de 1M HCl. La absorbancia a 450 nm se midió con un lector de placas de microtitulación (Thermo Appliskan Reader). Se utilizó fl-TFPI endógeno purificado, expresado por células SKHep, como proteína estándar a concentraciones de 0,25-16 ng/ml para la cuantificación (Baxter Innovations GmbH). Las muestras de plasma se diluyeron de 1/20 a 1/800 dependiendo de la concentración de TFPI humana esperada.

[0282] El fl-TFPI humano tuvo una vida media muy corta y una recuperación in vivo muy pobre. En el momento más temprano (0,5 min), solo se observó una décima parte del nivel de TFPI esperado. La recuperación y la vida media de fl-TFPI se mantuvieron sin cambios cuando fl-TFPI se complejó con los péptidos ensayados. Este experimento indica que la PEGilación de un péptido de unión a TFPI probablemente no confiere una vida media más larga a fl-TFPI y no afecta la eliminación de TFPI.

[0283] Este ejemplo demuestra que los péptidos representativos de la invención no disminuyen significativamente la interacción de TFPI con los receptores de aclaramiento y no aumentan la vida media de TFPI in vivo.

Ejemplo 26

[0284] Este ejemplo demuestra la capacidad de los péptidos de la invención para inhibir la degradación proteolítica de TFPI.

[0285] El TFPI está inactivado proteolíticamente por varias enzimas, que incluyen elastasa, trombina, plasmina, FXa y quimasa. Ver, por ejemplo, Hamuro et al., FEBS Journal, 274, 3056-3077 (2007). Se estudió el impacto de la proteína de fusión JBT2547. así como las subunidades peptídicas individuales JBT1837 y JBT1857, sobre la degradación proteolítica de fl-TFPI por la elastasa de neutrófilos. La elastasa de neutrófilos es una proteasa representativa que divide el TFPI dentro de Lys86 y Gln90 ubicado entre los dominios Kunitz 1 y Kunitz 2.

[0286] Para la digestión proteolítica de fl-TFPI, se incubaron 5 nM de fl-TFPI con elastasa de neutrófilos 5 nM (purificada de neutrófilos humanos, Calbiochem) en un tampón de reacción (Tris 50 mM, NaCl 300 mM, CaCl210 mM, pH 7,5) a 37°C. La reacción se realizó con y sin 1 pm de JBT1837, JBT1857 o JBT2547. La proteólisis se controló mediante análisis de transferencia Western. Se tomaron partes alícuotas de la mezcla de reacción después de 0, 5, 15, 30 y 60 minutos y se calentaron inmediatamente a 96°C durante 5 minutos en tampón de carga de SDS en condiciones reductoras. Las muestras se separaron en un gel de SDS-poliacrilamida con Tris-glicina al 4-20%, y las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF. Después de bloquear la membrana con leche seca no grasa, se detectaron proteínas TFPI con un anticuerpo policlonal de conejo contra TFPI humano (AF2974, R&D Systems) y un anticuerpo secundario conjugado anti-conejo-HRP (Sigma). Se aplicó el sustrato quimioluminiscente SuperSignal West Femto (Thermo Scientific) para desarrollar una señal quimioluminiscente que se capturó en la película. Las bandas desarrolladas se cuantificaron por densitometría.

[0287] En ausencia de péptidos, se observó degradación gradual de fl-TFPI por la elastasa de neutrófilos dentro de 1 hora. La banda de ~43 kD visualizada en transferencia western correspondiente a fl-TFPI intacto desapareció casi por completo, mientras que se formaron dos productos de escisión por escisión del enlace peptídico T87-T88. Cuando JBT2547 estuvo presente, la proteesis de fl-TFPI se bloqueó durante el tiempo controlado, lo que indica que JBT2547 protege fl-TFPI de la degradación por elastasa in vitro. Las subunidades peptídicas individuales mediaron diferentes efectos sobre la escisión de fl-TFPI. fl-TFPI protegido por JBT1837 de proteolisis durante una hora, similar a los resultados observados para JBT2547. En contraste, JBT1857 tuvo solo un efecto menor o nulo en la escisión de la elastasa.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un complejo peptídico de unión a TFPI que comprende un primer péptido y un segundo péptido, en el que

(a) el primer péptido comprende la estructura de fórmula (XIII):

X6001-X6002-X6003-X6004-X6005-X6006-X6007-X6008-X6009-X6010-X6011-X6012-X6013-

X6014-X6015-X6016-X6017-X6018-X6019-X6020 (XIII) (SEQ ID NO: 3153);

en donde X6001 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, L, M, Y, 1Ni, Thi, Bta, Dopa, Bhf, C, D, G, H, I, K, N, Nmf, Q, R, T, V y W;

en donde X6002 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q, G y K;

en donde X6003 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en C, D, E, M, Q, R, S, T, Ede (O), Cmc, A, Aib, Bhs, F, G, H, I, K, L, N, P, V, W e Y;

en donde X6004 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Aib, E, G, I, K, L, M, P, R, W, Y, A, Bhk, C, D, F, H, k, N, Nmk, Q, S, T y V;

en donde X6005 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en a, A, Aib, C, D, d, E, G, H, K, K, M, N, Nmg, p, Q, R, NpropilG, aze, pip, tic, oic, hyp, nma, Ncg, Abg, Apg, thz, dtc, Bal, F, L, S, T, V, W e Y;

en donde X6006 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, C(NEM), D, E, G, H, K, M, N, Q, R, S, V, Cit, C (Acm), Nle, I, Ede (O), Cmc, Ecl, Eea, Eec, Eef, Nif, Eew, Aib, Btq, F, L, T, W e Y;

en donde X6007 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, V, T, Chg, Phg, Tie, A, F, G, K, L, Nmv, P, Q, S, W e Y;

en donde X6008 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, H, 1Ni, 2Ni, Pmy, Y y W;

en donde X6009 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Aib, V, Chg, Phg, Abu, Cpg, Tie, L-2-amino-4,4,4-trifluorobutírico, A, f, I, K, S, T y V;

en donde X6010 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, D, d, E, F, H, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y, Nmd, C(NEM), Aib, G, I, L y Nmf;

en donde X6011 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, a, G, p, Sar, c, hcy, Aib, C, K y Nmg; en donde X6012 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Y, Tym, Pty, Dopa y Pmy;

en donde X6013 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Aib, C, F, 1Ni, Thi, Bta, A, E, G, H, K, L, M, Q, R, W e Y;

en donde X6014 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, Aib, C, C(NEM), D, E, K, L, M, N, Q, R, T, V, Hcy, Bhe, F, G, H, I, P, S, W e Y;

en donde X6015 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R, (omega-metil)-R, D, E y K;

en donde X6016 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L, Hcy, Hle y Aml;

en donde X6017 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, a, Aib, C, C, Cha, Dab, Eag, Eew, H, Har, Hci, Hle, I, K, L, M, Nle, Nva, Opa, Orn, R, S, Deg, Ebc, Eca, Egz, Aic, Apc, Egt, (omega-metil)-R, Bhr, Cit, D, Dap, E, F, G, N, Q, T, V, W e Y;

en donde X6018 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, Aib, Hcy, hcy, C, c, L, Nle, M, N, R, Bal, D, E, F, G, H, I, K, Q, S, T, V, W e Y;

en donde X6019 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K, R, Har, Bhk y V; y

en donde X6020 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K, L, Hcy, Aml, Aib, Bhl, C, F, G, H, I, Nml, Q, R, S, T, V, W e Y

y

(b) el segundo péptido comprende la estructura de fórmula (XIV):

X7001-X7002-X7003-X7004-X7005-X7006-[X7007-X7008-X7009-X7010-X7011-X7012-

X7013-X7014-X7015-X7016-X7017-X7018]-X7019-X7020-X7021-X7022-X7023 (XIV)

(SEQ ID NO: 3154),

en donde X7001 está presente o ausente, por lo que en el caso de que X7001 esté presente, es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, C(Ne M), D, E, F, G, H, I, K, L, P, R, S, T, V y W;

en donde X7002 está presente o ausente, por lo que en el caso de que X7002 esté presente, es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, C(Ne M), D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W e Y;

en donde X7003 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, F, I, K, L, R, S, T, V, W e Y;

en donde X7004 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, G, I, K, L, R, S, T, V y W; en donde X7005 es R o W;

en donde X7006 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, H, I, K, L, R, V y W;

en donde X7007 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Orn, homoK, C, Hcy, Dap y K, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en C y Hcy;

en donde X7008 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, G, R, S y T;

en donde X7009 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en a, A, I, K, L, M, m, Moo, Nle, p, R, Sem y V;

en donde X7010 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, G, I, K, L, P, R, S, T y V;

en donde X7011 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, E, G, S y T;

en donde X7012 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, a, D, d, E, e, F, f, G, I, K, K, L, M, m, Moo, Nle, nle, P, p, R, r, S, s, Sem, T, t, V, v, W y w;

en donde X7013 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, C(NEM), Con, Con(Meox), D, d, E, e, Eag, F, G, I, K, L, N, R, S, s, T, V y W;

en donde X7014 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, G, I, K, L, M, R, S, T, V y W; en donde X7015 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, G, I, K, L, M, Nle, R, S, T, V y W;

en donde X7016 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, I, K, L, M, Moo, Nle, R, S, Sem, T, V, W e Y;

en donde X7017 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, G, I, K, L, R, S, T, V, W y Y; en donde X7018 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en C y D, preferiblemente C;

en donde X7019 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, F, I, L, S, T, V y W;

en donde X7020 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F y W;

en donde X7021 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, L y V;

en donde X7022 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, G, I, K, L, P, R, S, T, V y W; en donde X7023 está presente o ausente, por lo que en el caso de que X7023 esté presente, es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, C(Ne M), Con, Con(Meox), D, E, Eag, F, G, I, K, L, R, S, T, V, W e Y; en donde el péptido comprende como una estructura cíclica generada por un enlace entre X7007 y X7018;

en donde el término C del primer péptido está unido al término N del segundo péptido a través de un resto enlazador; en donde el primer péptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o 100% idéntico a la SEQ ID NO: 178 o SEQ ID NO: 4261; y en donde el segundo péptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o 100% idéntico a la SEQ ID NO: 1044.

2. El complejo peptídico de la reivindicación 1,

en donde X6001 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en 1Ni, Bta, Dopa, F, L, Y y M;

en donde X6002 es Q;

en donde X6003 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, E, S, M, Q, R, T y C;

en donde X6004 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K, Aib, L, P, R, E, G, I, Y, M y W; en donde X6005 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en p, Nmg, NpropilG, aze, pip, tic, oic, hyp, a, Aib, D, d, G, H, K, K, N, Q, R, A, E, C y M;

en donde X6006 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en C, E, K, R, S, V, C (Acm), Nle, C(NEM), I, Cit, A, D, G, H, Q y M;

en donde X6007 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tle, V e I; en donde X6008 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en H, 1Ni, 2Ni, Pmy,

F e Y;

en donde X6009 es V, Abu o Tle;

en donde X 6010 es un aminoácido seleccionado del grupo que consta de D, P, C, T, A, E, K, M, N, Q, R, F, H, S, V, WandY;

en donde X6011 es G, a, c, hcy o Sar;

en donde X6012 es Y;

en donde X6013 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, 1Ni, Bta y C;

en donde X6014 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Aib, C, E, Hcy, A, D, K, L, M, N, Q, R, T, V y Aib;

en donde X6015 es R;

en donde X6016 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L, Aml, Hle y Hcy;

en donde X6017 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, Aib, C, c, Aic, Eca, Deg, Cha, Dab, Dap, Eag, Eew, H, Har, Hci, Hle, K, Nle, Nva, Opa, Orn, R, I, L, S y M; en donde X6018 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, Aib, C, c, L, Hcy, N, M y R;

en donde X6019 es K; y

en donde X6020 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L, Aml, Hcy y K.

3. El complejo peptídico de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el primer péptido y/o el segundo péptido comprenden además uno o más aminoácidos N-terminales y/o restos unidos a X6001 y/o X7001 y seleccionados del grupo que consiste en FAM-Ttds, PE, palma, 2-fenil acetilo, 3-fenil propionilo, 2-(naft-2-il) acetilo, hexanoílo, 2-metilpropionilo, 3-metil butanoílo, 2-naftilsulfonilo, 1 -naftilsulfonilo, acetilo, Con Con(Meox), AOA, Oxme-AOA, Meox-Lev, ácido leucínico (Lev) y ácido pentinoico (Pyn).

4. El complejo peptídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el primer péptido y/o el segundo péptido comprende además X6021 unido a X6020 o X7024 unido a X7023, respectivamente, en el que X6021 y/o X7024 comprenden aminoácido(s) C-terminales y/o restos seleccionados del grupo que consiste en Hly, K, Orn, Dab, Dap, Eag, Hcy, Pen, C, C, C(NEM), Con, Con(Meox), K (Ttds-maleimidopropionilo(EtSH)), K(Tdts-maleimid), K(AOA), K(Myr), K(Ttds-Myr), K(Ttds-Palm), K(Ttds-Ac), K(Ttds-yGlu-Myr), K(AlbuTag), K(4PBSA), Cea y amida.

5. El complejo peptídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4,

en donde X7001 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, F, G, H, K, L y S;

en donde X7002 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en H, F, M y R;

en donde X7003 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F e Y;

en donde X7004 es K;

en donde X7005 es W;

en donde X7006 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F y H;

en donde X7007 es C;

en donde X7008 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, G y S;

en donde X7009 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en M, Sem y V;

en donde X7010 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K, P y R;

en donde X7011 es D;

en donde X7012 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, L, I, M y Sem;

en donde X7013 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, G, K y S;

en donde X7014 es G;

en donde X7015 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I y T;

en donde X7016 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, F, M, Sem e Y;

en donde X7017 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S y T;

en la que X7018 es C;

en donde X7019 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A y V;

en donde X7020 es W;

en donde X7021 es V;

en donde X7022 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, L, K, R, P y W;

en donde X7023 está presente o ausente, por lo que en el caso de que X7023 esté presente, se selecciona una secuencia de aminoácidos del grupo que consiste en A, D, F, M, S e Y; y

en donde el péptido comprende una estructura cíclica generada por un enlace entre X7007 y X7018.

6. El complejo peptídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el resto enlazador tiene una longitud de 1-100 A, una longitud de 5-50 A o una longitud de 10-30 A.

7. El complejo peptídico de la reivindicación 6, en el que el resto enlazador comprende la estructura Z1-20, en donde Z es un aminoácido, hidroxiácido, etilenglicol, propilenglicol o una combinación de cualquiera de los anteriores.

8. El complejo peptídico de la reivindicación 7, en el que Z es G, s, S, a, A, Bal, Gaba, Ahx, Ttds, o una combinación de cualquiera de los anteriores.

9. El complejo peptídico de la reivindicación 1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4260.

10. El complejo peptídico de la reivindicación 1, en el que el segundo péptido comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SeQ ID NO: 1334.

11. El complejo peptídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que el complejo peptídico está conjugado a un resto de polietilenglicol (PEG), albúmina de suero humano (HSA), un dominio de unión a HSA, un anticuerpo o fragmento del mismo, hidroxietil almidón, un prolina-alanina-serina multímero (PASilación), un ácido graso C12-C18, o ácido polisialico.

12. Un complejo peptídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para uso en un método para el tratamiento de un sujeto.

13. El complejo peptídico para su uso según la reivindicación 12, en el que el método es para el tratamiento de un trastorno de coagulación sanguínea.

14. Una composición farmacéutica que comprende el complejo peptídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y un vehículo farmacéuticamente aceptable, y que opcionalmente comprende además un agente farmacéuticamente eficaz adicional.