ES2727390T3 - Expresión de enzimas beta-xilosidasas recombinantes - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una célula hospedadora, preferiblemente una célula de Myceliophthora thermophila, que expresa enzimas recombinantes con actividad beta-xilosidasa, una composición enzimática que comprende dicha célula y/o la enzima recombinante con actividad beta-xilosidasa expresada por dicha célula, el uso de esta célula hospedadora, la enzima recombinante con actividad beta-xilosidasa expresada por dicha célula o la composición para la degradación de la biomasa y un procedimiento para producir bioproductos, preferiblemente bioetanol, que comprende el uso de dicha célula hospedadora, la enzima recombinante con actividad beta-xilosidasa expresada por dicha célula o dicha composición.

Description

DESCRIPCIÓN

Expresión de enzimas beta-xilosidasas recombinantes

La invención se refiere al campo de los bioproductos, preferiblemente biocombustibles, y particularmente, a la expresión de una enzima recombinante con actividad beta-xilosidasa en una célula hospedadora y a su uso en la producción de bioproductos, preferiblemente bioetanol, a partir de biomasa.

TÉCNICA ANTERIOR

En la actualidad se están realizando muchos esfuerzos para obtener fuentes de combustible menos costosas y renovables. Los biocombustibles suponen una alternativa atractiva a los combustibles basados en petróleo y se pueden obtener mediante la fermentación de azúcares monoméricos derivados del almidón o la celulosa. Sin embargo, la coyuntura económica actual no favorece el uso extendido de los biocombustibles debido a su elevado coste de generación.

La biomasa vegetal proporciona una fuente completa de energía potencial en forma de azúcares que se puede utilizar para numerosos procesos industriales y agrícolas, y es por tanto un recurso renovable significativo para la generación de azúcares fermentables que pueden dar como resultado productos finales comercialmente valiosos, tales como los biocombustibles. Sin embargo, la enorme energía potencial de estos hidratos de carbono está actualmente infrautilizada porque los azúcares forman parte de polímeros complejos y, por tanto, no están fácilmente accesibles para la fermentación (WO2012018691A2).

La madera, los restos agrícolas, cultivos herbáceos y residuos sólidos urbanos se han considerado como materias primas para la producción de etanol. Estos materiales consisten principalmente en celulosa, hemicelulosa, y/o lignina. Una vez que la celulosa se convierte en glucosa por medio de un proceso de hidrólisis enzimática, la glucosa es fácilmente fermentada por las levaduras a etanol. De esta manera, cuánto más cantidad de azúcares complejos permanezca al final del proceso hidrolítico, menor será el rendimiento de la producción de etanol al final del proceso de la fermentación. Por tanto, un área de investigación destinada a disminuir los costes y a potenciar el rendimiento de los procedimientos de producción de biocombustible se centra en la mejora de la eficacia técnica de las enzimas hidrolíticas que se pueden utilizar para generar azúcares fermentables a partir de biomasa.

Debido a la complejidad de la biomasa, su conversión en azúcares monoméricos implica la acción de diversos tipos de enzimas diferentes, que digieren la celulosa y la hemicelulosa, los principales polisacáridos comprendidos en los materiales celulósicos. Después de la celulosa, la hemicelulosa es la segunda fracción más abundante disponible en la naturaleza. Es un polímero de almacenamiento en semillas y constituye el componente estructural de las paredes celulares de las plantas leñosas. La clasificación de estas fracciones de hemicelulosa depende de los tipos de restos de azúcares presentes. Los principales monómeros presentes en la mayor parte de las hemicelulosas son D-xilosa, D-manosa, D-galactosa y L-arabinosa. Así, la hemicelulosa incluye xilano, manano, galactano y arabinano como heteropolímeros principales. De forma específica, el xilano contiene de 85 a 93% de D-xilosa, una cantidad pequeña de c-arabinosa y trazas de restos de ácido glucurónico. La cadena principal de xilano está compuesta por restos de p-xilopiranosa unidos en p-(1-4), y se ha descrito que están presentes algunas cadenas secundarias. Entre ellas, se encuentran de forma más usual xilopiranosa, ácido glucurónico y enlaces de arabinofuranosa, así como grupos acetilo (Bastawde, 1992, World Journal of Microbiology and Biotechnology (8) 353-368).

La presencia de lignina en la biomasa conduce a una barrera protectora que evita la hidrólisis enzimática adecuada del glucano y el xilano. De esta manera, se necesita un procedimiento de pretratamiento de la biomasa que aumente el acceso de las enzimas a sus sustratos y la consiguiente hidrólisis eficaz. El pretratamiento utiliza diversas técnicas, que incluyen la explosión de la fibra con amonio, el tratamiento químico o la explosión con vapor a temperaturas elevadas para alterar la estructura de la biomasa celulósica y volver la celulosa más accesible. La hemicelulosa puede hidrolizarse fácilmente en condiciones moderadas, pero se necesitan condiciones mucho más extremas para la hidrólisis de la celulosa. Por tanto, el material pretratado (sustrato para la hidrólisis enzimática) contiene normalmente una elevada concentración de xilosa, mientras que el contenido de glucosa es más bien bajo (Kumar y col, 2009. Ind. Eng. Chem. Res., 48 (8), 3713-3729).

Las enzimas individuales han demostrado digerir solo parcialmente la celulosa y la hemicelulosa y, por tanto, se necesita la acción concertada de distintos tipos de enzimas para completar su conversión a azúcares monoméricos. Se necesitan muchas más enzimas para digerir la hemicelulosa a monómeros de azúcar, entre las que se incluyen la xilanasa, xilosidasa, arabinofuranosidasa, mananasa, galactosidasa y glucuronidasa. Pueden estar implicadas también hidrolasas sin glicosilo tales como acetil xilano esterasa y esterasa del ácido ferúlico. Se ha descubierto un gran número de organismos naturales que realizan la hidrólisis enzimática de los materiales celulósicos para dar lugar a azúcares fermentables. Los organismos capaces de llevar a cabo una degradación completa de la celulosa y la hemicelulosa, que permita posteriormente una fermentación eficaz, potenciarían en gran medida el ahorro en los costes de producción de bioetanol.

La eficacia hidrolítica de un complejo multienzimático en el proceso de sacarificación celulósica (o hidrolisis) depende tanto de las propiedades de las enzimas individuales como de la relación de cada enzima en el complejo. Es por tanto deseable generar microorganismos que expresen enzimas celulolíticas que mejoren el rendimiento del proceso de degradación del material celulósico, aumentando la cantidad de azúcares fermentables liberados y mejorando de esta manera el rendimiento de la producción final del biocombustible. Por ejemplo, las células fúngicas huésped se han diseñado para que expresen beta-xilosidasa (documento WO 2012/125937). Así, algunos esfuerzos realizados para generar microorganismos que expresan enzimas celulolíticas mejoradas se han centrado en insertar un gen que codifica la enzima hidrolítica específica que se va a expresar bajo el control de fuertes señales de expresión, lo que da lugar a un aumento en la estabilidad del ARNm transcrito o a un aumento en el número de copias del gen en el organismo producido (US20080194005A1).

Se han dado a conocer en el estado de la técnica numerosas células hospedadoras utilizadas para la expresión de genes heterólogos, tales como la bacteria Escherichia coli, y sus procedimientos de transformación. En este contexto, se han desarrollado también numerosos sistemas de expresión fúngica, por ejemplo, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus nidulans, Trichoderma reesei y también Myceliophthora thermophila (por ejemplo, Segato et al, Enzyme Microb Technol. 2012 Jul 15;51(2):100-106 and Visser et al., Industrial Biotechnology July 2011, 7(3): 214-223). Sin embargo, por diversos motivos, muchos de estos microorganismos recombinantes no han encontrado amplia aceptación o uso. En términos generales, la célula hospedadora ideal debe cumplir un gran número de criterios, tales como, utilizar el medio eficientemente, producir el polipéptido o la proteína de interés con un elevado rendimiento, ser capaz de secretar la proteína o el polipéptido de forma eficiente, poder utilizar una amplia gama de elementos reguladores de la expresión asegurando de esta manera una fácil aplicación y versatilidad, permitir el uso de marcadores fácilmente detectables que sean baratos de usar, y producir transformantes estables.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a la expresión recombinante de una enzima beta-xilosidasa que comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4 en una célula hospedadora de Myceliophthora thermophila, preferiblemente, en la cepa C1 de Myceliophthora thermophila. Dicha expresión recombinante conduce a una célula con una eficacia mejorada de la hidrólisis de la biomasa en azúcares fermentables, más particularmente, la degradación de oligómeros de xilano a xilosa (véanse las figuras 7 y 8), en comparación con la célula de tipo silvestre que no expresa dicha beta-xilosidasa recombinante, siendo de esta manera útil en los procedimientos para producir bioproductos, preferiblemente biocombustible, a partir de biomasa.

La presente invención representa una solución a la necesidad de proporcionar un microorganismo que exprese una mezcla de enzimas celulolíticas que mejoren el rendimiento del proceso hidrolítico de la biomasa o sacarificación, aumentando la cantidad de azúcares fermentables liberados y mejorando de esta manera el rendimiento de los bioproductos, preferiblemente el biocombustible, obtenido tras el proceso fermentativo.

Un importante porcentaje de xilosa de los polisacáridos constituyentes de la biomasa no se libera en el proceso de la hidrólisis enzimática de la biomasa. La célula hospedadora de la invención expresa una enzima betaxilosidasa recombinante que es capaz de degradar los oligómeros de xilano a xilosa. De esta manera, esta célula hospedadora, y el cóctel enzimático producido por la misma, son útiles para la optimización de la etapa de hidrólisis de la biomasa en azúcares fermentables.

Los inventores han demostrado que la incorporación, y la posterior expresión satisfactoria, de una enzima betaxilosidasa recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4 en una célula hospedadora de Myceliophthora thermophila, aumenta la concentración de xilosa liberada a partir de biomasa cuando la célula transformada o el cóctel enzimático producido por dicha célula se utiliza en un proceso de hidrólisis de la biomasa. Esto representa un aumento en la concentración final de azúcares fermentables, y por tanto en el rendimiento global de los procesos de producción de bioproductos, preferiblemente biocombustible.

Por tanto, un primer aspecto de la presente invención está relacionado con una célula hospedadora de Myceliophthora thermophila que expresa una enzima beta-xilosidasa recombinante que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4, denominada desde ahora “célula hospedadora de la invención”.

El término “p-xilosidasa” se refiere a una proteína que hidroliza los 1,4-p-D-xilooligómeros cortos en xilosa. La “pxilosidasa recombinante” de la invención es una enzima beta-xilosidasa que se expresa naturalmente en un microorganismo diferente de la célula hospedadora de la invención, es decir, una p-xilosidasa heteróloga, cuya secuencia de aminoácidos no se ha modificado o se ha modificado preferiblemente por medio de una o más deleciones, inserciones, sustituciones, etc. En una realización preferida, la p-xilosidasa recombinante es una beta-xilosidasa que se produce naturalmente en un microorganismo diferente a la célula hospedadora de la invención, más preferiblemente, a partir de una célula de Fusarium, aún más preferiblemente, a partir de una célula de Fusarium oxysporum.

La p-xilosidasa recombinante a la que se hace referencia en la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70% idéntica a la SEQ ID NO: 3. Se pueden obtener p-xilosidasas recombinantes que comprenden secuencias de aminoácidos que son al menos un 70% idénticas a la SEQ ID NO: 3 a partir de un hongo filamentoso, tal como, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Gibberella, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, o Trichoderma. En una realización más preferida de la presente invención, la p-xilosidasa recombinante es una p-xilosidasa de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium pseudograminearum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Gibberella zeae, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride.

En una realización más preferida de la presente invención, la enzima beta-xilosidasa recombinante comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la SEQ ID NO: 3. Ejemplos de enzimas beta-xilosidasa que comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70% idéntica a la SEQ ID NO: 3 son la enzima FG11468.1 de Gibberella zeae (Número de Acceso al Gene Bank XP_391644.1) o la enzima FPSE_09342 de Fusarium pseudograminearum (Número de Acceso al Gene Bank EKJ70481.1).

En una realización más preferida de la presente invención, la enzima beta-xilosidasa recombinante comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. Esta SEQ ID NO: 3 corresponde a la enzima beta-xilosidasa madura procedente del hongo F. oxysporum, denominada FoSxI. Ejemplos de enzimas beta-xilosidasa que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 son el polipéptido de la SEQ ID NO: 2, que consiste en el péptido señal nativo de la beta-xilosidasa FoBxl de F. oxysporum que corresponde a los aminoácidos 1 a 20 de la SEQ ID NO: 2 unido a la SEQ ID NO: 3; o la SEQ ID NO: 4, que consiste en el péptido señal de la glucoamilasa de Aspergillus niger (glaA, número de acceso An03g06550) que corresponde a los aminoácidos 1 a 18 de la SEQ ID NO: 4 unido a la SEQ ID NO: 3. En una realización aún más preferida de la presente invención, la enzima beta-xilosidasa recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 es la SEQ ID NO: 4. Como se mostrará en los ejemplos más abajo, el rendimiento más elevado de xilosa y xilobiosa liberadas durante el proceso hidrolítico de la biomasa se obtuvo cuando la célula hospedadora de la invención expresó esta SEQ ID NO: 4 (véanse las Figuras 7 y 8 y la Tabla 1).

En otra realización preferida de la presente invención, la enzima beta-xilosidasa recombinante consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3.

El término “identidad” se refiere a la relación de residuos de ácidos nucleicos o aminoácidos que son idénticos entre dos secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos que se están comparando. Se puede determinar el grado de identidad mediante el método de Clustal, el método de Wilbur-Lipman, el programa GAG, que incluye GAP, BLAST o BLASTN, EMBOSS Needle y FASTA. Además, se puede utilizar el algoritmo de Smith Waterman con el fin de determinar el grado de identidad entre dos secuencias.

La “célula hospedadora”, tal como se usa aquí, incluye cualquier tipo de célula que es susceptible de transformación, transfección, transducción, y similares con una construcción de ácido nucleico o vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica para la enzima beta-xilosidasa recombinante citada anteriormente. La elección de una célula hospedadora dependerá en gran medida del gen que codifica el polipéptido y su fuente. La célula hospedadora puede ser eucariota, tal como una célula de mamífero, insecto, planta o de hongo. En una realización preferida de la presente invención, la célula hospedadora es una célula de hongo filamentoso. Los hongos filamentosos se caracterizan generalmente por presentar una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano, y otros polisacáridos complejos. En una realización más preferida de la presente invención, la célula hospedadora del hongo filamentoso es una célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, o Trichoderma. En una realización más preferida de la presente invención, la célula hospedadora de hongo filamentoso es una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae. En otra realización más preferida de la presente invención, la célula hospedadora de hongo filamentoso es una célula de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium pseudograminearum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, o Fusarium venenatum. En otra realización más preferida de la presente invención, la célula hospedadora de hongo filamentoso es una célula de Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Gibberella zeae, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride.

La célula hospedadora de la invención es cualquier cepa de la especie Myceliophthora thermophila. En una realización aún más preferida, la célula hospedadora de la invención es la cepa C1 de Myceliophthora thermophila.

Se entenderá que para las especies anteriormente mencionadas, la invención abarca los estados perfecto e imperfecto, y otros equivalentes taxonómicos, por ejemplo, los anamorfos, con respecto al nombre de la especie por el cual son conocidos. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente la identidad de los equivalentes adecuados. Por ejemplo, Myceliophthora thermophila es equivalente a Chrysosporium lucknowense.

Cuando la enzima beta-xilosidasa recombinante comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, la célula hospedadora no es Fusarium oxysporum.

En una realización aún más preferida de la presente invención, la célula hospedadora es Myceliophthora thermophila, más preferiblemente, la cepa C1 de Myceliophthora thermophila y la beta-xilosidasa recombinante expresada en la misma se selecciona de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, más preferiblemente, la beta-xilosidasa recombinante es la SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 3, aún más preferiblemente, la beta-xilosidasa recombinante es la SEQ ID NO: 4.

La célula hospedadora de la invención comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una betaxilosidasa recombinante que consiste en s Eq ID NO: 4 descrita aquí. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican estas beta-xilosidasas recombinantes pueden codificar el polipéptido maduro o una preproteína que consiste en un péptido señal unido a la enzima madura que tendrá que procesarse posteriormente. Se pueden incluir secuencias de ácidos nucleicos que codifican beta-xilosidasas en una construcción genética, preferiblemente en un vector de expresión. Dicha construcción genética puede comprender además una o más secuencias reguladoras de la expresión génica, tales como promotores, terminadores, etc.

De acuerdo con la presente invención, “secuencia de ácido nucleico” o “polinucleótido” es una molécula de ácido nucleico (polinucleótido) que se ha retirado de su medio natural (es decir, que se ha sometido a manipulación humana) y puede incluir ADN, ARN, o derivados tanto de ADN como de ARN, incluyendo ADNc. La secuencia de nucleótidos de la presente invención puede estar o no química o bioquímicamente modificada y puede producirse de forma artificial por medio de procedimientos de clonación y selección o mediante secuenciación.

El término “construcción de ácido nucleico” tal como se usa aquí se refiere a una molécula de ácido nucleico, tanto monocatenaria como bicatenaria, que está aislada de un gen que se produce de forma natural o que está modificada para contener segmentos de ácidos nucleicos de una manera que no podría existir en la naturaleza. El término construcción de ácido nucleico es sinónimo del término “casete de expresión” cuando la construcción de ácido nucleico contiene las secuencias control requeridas para la expresión de una secuencia que codifica para la beta-xilosidasa recombinante.

El término “secuencias control” se define aquí para incluir todos los componentes que son necesarios o ventajosos para la expresión de un polinucleótido que codifica la beta-xilosidasa recombinante de la presente invención. Cada secuencia control puede ser del mismo o distinto origen que la secuencia de nucleótidos que codifica la beta-xilosidasa recombinante. Dichas secuencias control incluyen, pero no se limitan a, una secuencia líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia propeptídica, un promotor, una secuencia del péptido señal, y una secuencia terminadora de la transcripción. Como mínimo, las secuencias control incluyen una secuencia del péptido señal, preferiblemente los aminoácidos 1 a 18 de la SEQ ID NO: 4, y preferiblemente un promotor, y señales de terminación de la transcripción y la traducción. Se pueden proporcionar secuencias control con enlazadores con el fin de introducir sitios de restricción específicos que facilitan la unión de las secuencias control con la región codificante de la secuencia de nucleótidos que codifica para la beta-xilosidasa recombinante. El término “unido operativamente” se refiere aquí a una configuración en la que una secuencia control se coloca en una posición adecuada con respecto a la secuencia codificante de la secuencia de polinucleótidos de tal manera que la secuencia control dirige la expresión de la secuencia codificante de la betaxilosidasa recombinante.

El término “vector de expresión” se define aquí como una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica para la beta-xilosidasa recombinante descrita aquí, y que se une de manera operativa a nucleótidos adicionales que se proporcionan para su expresión. Dicho vector que comprende un polinucleótido que codifica para la beta-xilosidasa recombinante, se introduce en la célula hospedadora de tal manera que el vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico autoreplicante.

La secuencia de nucleótidos que codifica la beta-xilosidasa descrita aquí puede expresarse insertando la secuencia de nucleótidos, o una construcción de ácido nucleico que comprende la secuencia, en un vector adecuado para la expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia codificante se localiza en el vector de tal manera que la secuencia codificante se une operativamente a las secuencias control adecuadas para la expresión. Los vectores de expresión a los que se hace referencia en la presente invención comprenden un polinucleótido que codifica para la beta-xilosidasa descrita aquí, un promotor, y señales de terminación de la transcripción y la traducción. Los diversos ácidos nucleicos y las secuencias control descritas aquí pueden unirse entre sí para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o la sustitución de la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima en dichos sitios.

El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que se puede someter de forma conveniente a un procedimiento de ADN recombinante y puede producir la expresión de la secuencia de nucleótidos. La elección del vector dependerá normalmente de la compatibilidad del vector con la célula hospedadora en la que se va a introducir el mismo.

Los vectores pueden ser plásmidos lineales o circulares cerrados. El vector puede ser un vector replicante de forma autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma, o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. De forma alternativa, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula hospedadora, se integra en el genoma y se replica junto con el(los) cromosoma(s) en el(los) que se ha integrado. Además, se puede usar un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que contienen conjuntamente el ADN total que se va a introducir en el genoma de la célula hospedadora, o un transposón. Los vectores utilizados en la presente invención contienen preferiblemente uno o más marcadores seleccionables que permiten una fácil selección de las células transformadas, transfectadas, transducidas, o similares. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia a biocidas o a virus, resistencia a metales pesados, prototrofia a auxótrofos y similares. Los marcadores seleccionables para uso en una célula hospedadora de hongo filamentoso incluyen, pero no se limitan a, amdS (acetamidasa), argB (ornitina carbamoiltransferasa), bar (fosfinotricin acetiltransferasa), hph (higromicin fosfotransferasa), niaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato decarboxilasa), pyr5, cysC (sulfato adeniltransferasa), y trpC (antranilato sintasa), así como sus equivalentes.

Los vectores utilizados en la presente invención contienen preferiblemente un(os) elemento(s) que permite(n) la integración del vector en el genoma de la célula hospedadora o la replicación autónoma del vector en la célula independientemente del genoma. Para la integración en el genoma de la célula hospedadora, el vector puede basarse en la secuencia del polinucleótido que codifica para la enzima beta-xilosidasa o en cualquier otro elemento del vector para la integración en el genoma mediante recombinación homóloga o no homóloga. De forma alternativa, el vector puede contener secuencias de nucleótidos adicionales para dirigir la integración mediante recombinación homóloga en el genoma de la célula hospedadora en una(s) localización(es) precisa(s) del(los) cromosoma(s).

Para la replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que permita al vector replicarse de forma autónoma en la célula hospedadora en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador plasmídico que medie en la replicación autónoma que funcione en una célula. El término “origen de replicación” o “replicador plasmídico” se define aquí como una secuencia de nucleótidos que permite a un plásmido o vector replicarse in vivo. Ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula de hongo filamentoso son AMAI y ANSI.

Se puede insertar más de una copia de un polinucleótido que codifica para la beta-xilosidasa de la presente invención en la célula hospedadora para aumentar la producción del producto génico. Se puede obtener un aumento en el número de copias del polinucleótido integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula hospedadora o incluyendo con el polinucleótido un gen marcador seleccionable amplificable, donde las células que contienen las copias amplificadas del gen marcador seleccionable, y por tanto, copias adicionales del polinucleótido, se pueden seleccionar cultivando las células en presencia del agente de selección adecuado. Los procedimientos utilizados para unir los elementos descritos anteriormente para construir los vectores de expresión recombinante referidos en la presente invención son bien conocidos por los expertos en la técnica.

El término “expresión” incluye cualquier etapa implicada en la producción de la beta-xilosidasa recombinante que incluye, pero no se limita a, transcripción, modificación post-transcripcional, traducción, modificación posttraduccional, y secreción.

La secuencia de ácido nucleico incluida en la célula hospedadora de la invención puede codificar la SEQ ID NO: 3, que es la beta-xilosidasa madura de Fusarium oxysporum, o puede codificar una preproteína que consiste en un péptido señal unido a dicha enzima madura. Esta preproteína tendrá que procesarse posteriormente en la célula hospedadora con el fin de producir la enzima beta-xilosidasa madura. Esta preproteína podría ser, pero sin limitarse, el polipéptido de la SEQ ID NO: 2, que consiste en el péptido señal nativo de la beta-xilosidasa FoBxI de F. oxysporum que corresponde a los aminoácidos 1 a 20 de la SEQ ID NO: 2 unidos a la SEQ ID NO:3; o la SEQ ID NO: 4, que consiste en el péptido señal del gen de la glucoamilasa de A. niger (glaA, número de acceso An03g06550) que corresponde a los aminoácidos 1 a 18 de la SEQ ID NO: 4 unidos a la SEQ ID NO: 3. La preproteína de la SEQ ID NO: 2 es la preproteína nativa expresada en Fusarium oxysporum. La célula hospedadora de la invención comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para la SEQ ID NO: 4, más preferiblemente, dicha secuencia de ácido nucleico es la SEQ ID NO: 5, y dicha célula expresa por tanto la preproteína de la SEQ ID NO: 4, que se procesará en dicha célula con el fin de expresar la enzima betaxilosidasa recombinante que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3.

Se conocen en la técnica las secuencias de ácido nucleico que codifican una beta-xilosidasa de Fusarium oxysporum o bien se pueden diseñar basándose en las secuencias de aminoácidos proporcionadas en el párrafo anterior. En una realización más preferida de la presente invención, la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO: 2 es la SEQ ID NO: 1. En otra realización preferida de la presente invención, la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO. 4 es la SEQ ID NO: 5. En otra realización preferida de la presente invención, la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO: 3 es la SEQ ID NO: 6.

La célula hospedadora de la invención expresa una enzima beta-xilosidasa recombinante funcional y es capaz de secretar la misma al medio extracelular. El término “funcional” significa que la enzima expresada retiene su capacidad de hidrolizar oligómeros de xilano a xilosa. Esta actividad puede medirse por medio de cualquier procedimiento adecuado conocido en el estado de la técnica para evaluar la actividad de la beta-xilosidasa, preferiblemente por medio del procedimiento descrito a continuación en los ejemplos de la presente invención (medido sobre pNXP como sustrato).

Se puede llevar a cabo la expresión de la beta-xilosidasa en la célula hospedadora de la invención por medio de cualquier procedimiento conocido en la técnica, tal como la transformación de una célula hospedadora adecuada con una secuencia de ácido nucleico que codifica para la beta-xilosidasa recombinante, o una construcción genética que comprende dicha secuencia de ácido nucleico, y el cultivo de la célula hospedadora transformada en condiciones que induzcan la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico con el fin de obtener la enzima secretada.

Se puede cultivar la célula hospedadora en un medio nutritivo adecuado para la producción de la beta-xilosidasa recombinante utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula se puede cultivar mediante cultivo en matraz con agitación, y fermentación a pequeña escala o a gran escala (que incluye las fermentaciones continua, discontinua o batch, de alimentación discontinua o fed-batch, o en estado sólido) llevada a cabo en un biorreactor de laboratorio o industrial en un medio adecuado y en condiciones que permitan expresar y/o aislar la beta-xilosidasa. El cultivo tiene lugar en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, utilizando los procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados están disponibles comercialmente o se pueden preparar de acuerdo con composiciones publicadas (por ejemplo, en catálogos de la American Type Culture Collection). Si se secreta la beta-xilosidasa en el medio nutritivo, se puede recuperar la beta-xilosidasa directamente del medio.

La beta-xilosidasa recombinante expresada se puede detectar utilizando procedimientos específicos para polipéptidos conocidos en la técnica. Estos procedimientos de detección pueden incluir el uso de anticuerpos específicos, la formación de un producto de la enzima, o la desaparición de un sustrato de la enzima.

La beta-xilosidasa resultante se puede recuperar utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la beta-xilosidasa se puede recuperar a partir del medio nutritivo mediante procedimientos convencionales que incluyen, pero no se limitan a, centrifugación, filtración, extracción, secado mediante pulverización, evaporación, o precipitación.

Las beta-xilosidasas producidas en la presente invención se pueden purificar mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, hidrófoba, cromatofocalización, y exclusión por tamaño), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, focalización isoeléctrica preparativa), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación en sulfato de amonio), SDS-PAGE, o extracción, con el fin de obtener una beta-xilosidasa sustancialmente pura que se pueda incluir en una composición enzimática junto con otras enzimas celulolíticas. De esta manera, un segundo aspecto de la invención se refiere a una enzima beta-xilosidasa recombinante expresada por la célula hospedadora de la invención. Preferiblemente, dicha enzima beta-xilosidasa recombinante consiste en la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, más preferiblemente la SEQ ID NO: 4.

Un tercer aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende la enzima beta-xilosidasa recombinante producida por medio de la célula hospedadora de la invención, preferiblemente la enzima consiste en la SEQ ID NO: 3. Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición que comprende la célula huésped de la invención, denominada a partir de ahora “composición de la invención”. Esta composición de la invención puede comprender además otras actividades enzimáticas, tales como aminopeptidasa, amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, tales como endoglucanasas, beta-glucosidasas y/o celobiohidrolasas; quitinasa, cutinasa, ciclodextrina glucosiltransferasa, desoxirribonucleasa, esterasa, alfagalactosidasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, haloperoxidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peptidoglutaminasa, peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa, enzima proteolítica, ribonucleasa, transglutaminasa, o xilanasa, o cualquiera de sus combinaciones. La(s) enzima(s) adicional(es) se puede(n) producir, por ejemplo, mediante un microorganismo que pertenece al género Aspergillus, tal como Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, o Aspergillus oryzae; Fusarium, tal como Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium pseudograminearum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sulphureum, Fusarium toruloseum, Fusarium trichothecioides, o Fusarium venenatum; Gibberella, tal como Gibberella zeae; Humicola, tal como Humicola insolens o Humicola lanuginosa; Trichoderma, tal como Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride; o Myceliophthora, tal como Myceliophthora thermophila.

En una realización preferida, la composición de la invención comprende además otras enzimas celulolíticas. El término “enzimas celulolíticas” también conocido como “celulasas”, se refiere a una clase de enzimas capaces de hidrolizar la celulosa (enlaces de p-1,4-glucano o p-D-glucosídicos) o la hemicelulosa a oligosacáridos más cortos, celobiosa y/o glucosa. Ejemplos de enzimas celulolíticas son, pero no se limitan a, endoglucanasas, betaglucosidasas, celobiohidrolasas o endoxilanasas. De esta manera, en una realización más preferida, estas enzimas celulolíticas se seleccionan a partir de la lista que consiste en endoglucanasas, beta-glucosidasas, celobiohidrolasas, endoxilanasas o cualquiera de sus combinaciones. Estas enzimas celulolíticas pueden derivar de la célula hospedadora de la invención o de otros microorganismos productores de enzimas celulolíticas diferentes de la célula hospedadora de la invención. Igualmente, se pueden producir de forma natural o recombinante.

Preferiblemente, la composición de la invención comprende la enzima beta-xilosidasa recombinante producida por medio de la célula hospedadora de la invención, preferiblemente la enzima que consiste en la SEQ ID NO: 3, y otras enzimas celulolíticas derivadas de la célula hospedadora de la invención. En una realización más preferida de la presente invención, la composición de la invención es una mezcla enzimática obtenida de la célula hospedadora de la invención. En una realización aún más preferida de la presente invención, la composición de la invención es una mezcla enzimática obtenida mediante la célula hospedadora de la invención, preferiblemente M. thermophila, donde dicha célula comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para la enzima beta-xilosidasa recombinante que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4. El término “endoglucanasa” o “EG” se refiere a un grupo de enzimas celulasas clasificado como E.C. 3.2.1.4. Estas enzimas hidrolizan los enlaces p-1,4 glucosídicos internos de la celulosa.

El término “celobiohidrolasa” se refiere a una proteína que cataliza la hidrólisis de la celulosa a celobiosa mediante una actividad exoglucanasa, liberando secuencialmente moléculas de celobiosa desde los extremos reductores o no reductores de la celulosa o los celooligosacáridos.

El término “beta-glucosidasa”, tal como se usa aquí, se refiere a una enzima que cataliza la hidrólisis de un dímero de azúcar, incluyendo, pero sin limitarse a celobiosa, con la liberación de un monómero de azúcar correspondiente, utilizada, pero sin limitarse, para la síntesis de etanol. La enzima beta-glucosidasa actúa sobre los puentes p1->4 que unen a dos moléculas de glucosa o glucosa sustituida (es decir, el disacárido celobiosa). Es una exocelulasa con especificidad por una variedad de sustratos de beta-D-glucósido. Cataliza la hidrólisis de residuos no reductores terminales en beta-D-glucósidos con liberación de glucosa.

El término “endoxilanasa” se refiere a una enzima que cataliza la endohidrólisis de enlaces 1,4-beta-D-xilosídicos en xilanos.

La composición de la invención se puede preparar de acuerdo con los procedimientos conocidos en la técnica y puede estar en forma líquida o de una composición seca. Por ejemplo, la composición puede estar en la forma de un granulado o un microgranulado. Las enzimas que se van a incluir en la composición pueden estabilizarse de acuerdo con los procedimientos conocidos en la técnica.

Tal como se ha indicado anteriormente, la célula hospedadora de la invención expresa una enzima betaxilosidasa recombinante que consiste en SEQ ID NO: 4, que es capaz de degradar oligómeros de xilano a xilosa cuando se secreta al medio extracelular. Esta célula hospedadora es capaz de secretar está enzima al medio junto con otras enzimas celulolíticas producidas de forma natural o recombinante, siendo de esta manera útil para la optimización de la etapa de hidrólisis de la biomasa en azúcares fermentables.

Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere al uso de la célula hospedadora de la invención o la composición de la invención, para la degradación de la biomasa.

El término “biomasa” significa la fracción biodegradable de los productos, residuos y restos de origen biológico procedentes de la agricultura (incluyendo sustancias vegetales, tales como residuos de cultivos, y sustancias animales), industrias forestales (tales como recursos madereros) e industrias relacionadas que incluyen pesquerías y acuicultura, así como la fracción biodegradable de los residuos industriales y urbanos, tales como residuos sólidos urbanos o residuos de papel. En una realización preferida, la biomasa es paja o la fracción orgánica de residuos sólidos urbanos. En una realización más preferida, la biomasa es biomasa vegetal, más preferiblemente seleccionada a partir de la lista que consiste en: biomasa rica en azúcares fermentables, tales como caña de azúcar, biomasa de almidón, por ejemplo, granos de trigo, o paja de maíz.

La enzima beta-xilosidasa recombinante producida por medio de la célula hospedadora de la invención, así como la célula hospedadora o la composición de la presente invención, se pueden utilizar en la producción de monosacáridos, disacáridos y polisacáridos como materias primas químicas o de la fermentación, a partir de biomasa para la producción de etanol, plásticos, u otros productos o intermedios.

La célula hospedadora de la presente invención se puede utilizar como una fuente del polipéptido que tiene actividad beta-xilosidasa, y otras enzimas celulolíticas, en un proceso de fermentación con la biomasa.

El polisacárido predominante en la pared celular primaria de la biomasa es celulosa, el segundo más abundante es hemicelulosa, y el tercero es pectina. La pared celular secundaria, producida después de que la célula haya detenido su crecimiento, contiene también polisacáridos y está reforzada mediante lignina polimérica covalentemente entrecruzada con hemicelulosa. La celulosa es un homopolímero de anhidrocelobiosa y de esta manera es un beta-(1-4)-D-glucano lineal, mientras que la hemicelulosa incluye una variedad de compuestos, tales como xilanos, xiloglucanos, arabinoxilanos, y mananos en estructuras ramificadas complejas con una gama de sustituyentes. Aunque generalmente polimorfa, la celulosa se encuentra en el tejido vegetal principalmente como una matriz insoluble cristalina de cadenas paralelas de glucano. Las hemicelulosas se unen normalmente mediante enlaces de hidrógeno a la celulosa, así como a otras hemicelulosas, lo que ayuda a estabilizar la matriz de la pared celular. Las enzimas beta-xilosidasas recombinantes producidas por la célula hospedadora de la invención pueden utilizarse junto con el resto de enzimas celulolíticas para degradar adicionalmente el componente de celulosa del sustrato de la biomasa.

La degradación o hidrólisis de la biomasa a azúcares fermentables, proceso conocido también como “sacarificación”, por medio de la enzima beta-xilosidasa recombinante expresada por la célula hospedadora de la invención, la célula hospedadora de la invención o la composición de la invención, puede ir seguida de un proceso de fermentación en el que los azúcares fermentables obtenidos se utilizan con el fin de obtener finalmente un bioproducto tal como bioetanol.

De esta manera, otra realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de la célula hospedadora de la invención o la composición de la invención, para la degradación de la biomasa en un proceso de producción de un bioproducto.

El término “bioproducto” o “productos biobasados” se refiere a aquellos materiales, productos químicos y energía derivados de recursos biológicos renovables. Ejemplos de estos bioproductos son, pero no se limitan a, compuestos de hidrocarburo en sus diferentes formas, tales como compuestos alifáticos (saturados, insaturados, cíclicos) o aromáticos, como alcanos, alquenos, alquinos, formas cíclicas de estos compuestos o hidrocarburos aromáticos; sustancias oxigenadas como alcoholes, éteres, aldehídos, cetonas o ácidos carboxílicos; sustancias nitrogenadas como aminas, amidas, nitrocompuestos o nitrilos; sustancias halogenadas como haluros. El término “bioproductos” incluye también cualquier combinación de los compuestos descritos anteriormente, compuestos derivados adicionalmente de los compuestos descritos anteriormente mediante cualquier tipo de tratamiento físico, químico o biológico, polímeros de los compuestos descritos anteriormente, compuestos descritos anteriormente sustituidos por cualquier grupo o elemento funcional en una más de sus formas unidas y ramificadas de los compuestos descritos anteriormente.

Se puede producir etanol mediante la degradación enzimática de la biomasa y la conversión de los sacáridos liberados en etanol. Este tipo de etanol se denomina a menudo bioetanol. Se puede usar como un aditivo de combustible o extensor en mezclas de menos del 1% hasta un 100% (un sustituto del combustible).

En una realización más preferida, el bioproducto es biocombustible. El término “biocombustible”, tal como se usa aquí, se refiere a un hidrocarburo, o a una de sus mezclas, que se puede utilizar como combustible y se obtiene utilizando la biomasa fermentable como material de partida. Ejemplos de biocombustibles incluyen, pero no se limitan a, etanol o bioetanol y biodiesel. En una realización más preferida, el biocombustible es bioetanol.

El término “bioetanol” se refiere a un alcohol preparado mediante fermentación, a menudo a partir de biomasa fermentable tal como los hidratos de carbono producidos en cultivos de azúcar o de almidón tales como maíz o caña de azúcar.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir azúcares fermentables, denominado aquí “primer procedimiento de la invención” que comprende:

a) Incubar biomasa, preferiblemente biomasa pretratada, con la célula hospedadora de la invención o con la composición de la invención, y

b) Recuperar los azúcares fermentables obtenidos después de la incubación de la etapa (a).

Frecuentemente se requiere un procedimiento de pretratamiento de la biomasa para aumentar el acceso de las enzimas a sus sustratos y la hidrólisis eficaz consiguiente. El pretratamiento utiliza diversas técnicas, que incluyen, pero no se limitan a explosión de la fibra con amonio, tratamiento químico y explosión con vapor a elevadas temperaturas para alterar la estructura de la biomasa celulósica y volver la celulosa más accesible. El uso de la célula hospedadora de la invención o la composición de la invención en los procedimientos de la presente invención es ventajosa debido a que no se requieren altas temperaturas en el proceso de pretratamiento de la biomasa.

El término “azúcar fermentable” tal como se usa aquí, se refiere a azúcares sencillos, tales como glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa, manosa, ramnosa, sacarosa o fructosa, entre otros.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para producir un bioproducto a partir de biomasa, denominado a partir de ahora “segundo procedimiento de la invención”, que comprende:

a) Incubar biomasa, preferiblemente biomasa pretratada, con la célula hospedadora de la invención o con la composición de la invención,

b) Fermentar los azúcares fermentables obtenidos después de la etapa de incubación (a) con al menos un microorganismo fermentador, y

c) Recuperar el bioproducto obtenido después de la fermentación de la etapa (b).

El término “fermentador o fermentación” tal como se usa aquí, se refiere a un proceso de transformación biológica producido por la actividad de algunos microorganismos en los que los azúcares tales como glucosa, fructosa, y sacarosa se convierten en etanol. Los microorganismos usados de este modo son microorganismos fermentadores que tienen capacidad de fermentación, tales como levaduras, preferiblemente S. cerevisiae. El término “recuperación” tal como se usa aquí, se refiere a la recogida de azúcares fermentables obtenidos después de la incubación de la etapa (a) del primer procedimiento de la invención o del bioproducto obtenido después de la fermentación de la etapa (b) del segundo procedimiento de la invención. Se puede realizar la recuperación mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, incluyendo los mecánicos o los manuales.

En una realización preferida del segundo procedimiento de la invención, el bioproducto es biocombustible, más preferiblemente bioetanol.

A no ser que se defina de otra forma, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente una persona experta en la técnica a la cual pertenece la invención. Procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos aquí se pueden usar en la práctica de la presente invención. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, no se pretende que la palabra “comprende” y sus variaciones excluyan otras características técnicas, aditivos, componentes, o etapas. Los objetos, ventajas y características adicionales de la invención serán evidentes a los expertos en la técnica tras el examen de la descripción o se pueden aprender mediante la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos, dibujos y el listado de secuencias se proporcionan a modo de ilustración y no se pretende que limiten la presente invención.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Fig. 1. Muestra el vector denominado pBASEI. Vector de expresión con Tcbhl como secuencia terminadora y pyr5 como marcador de selección. XbaI y BamHI fueron los sitios de restricción escogidos para la clonación del casete Pcbhl-fobxl.

Fig. 2. Muestra el vector denominado pABC341. Plásmido de expresión del ADNc de fobxl nativo de F. oxysporum.

Fig. 3. Muestra la actividad beta-xilosidasa (U/L) de algunos transformantes fobxl analizados utilizando pNXP como sustrato.

Fig. 4. Muestra el vector denominado pBASE5. Vector de expresión con Pcbhl como secuencia promotora, Tcbhl como secuencia terminadora y pyr5 como marcador de selección. NdeI y BamHI fueron los sitios de restricción escogidos para la clonación de la fusión genética SPGA-fobxl.

Fig. 5. Muestra el vector denominado pABC397. Plásmido de expresión que contiene la fusión genética SPGA-fobxl.

Fig. 6. Muestra la actividad beta-xilosidasa (U/L) de algunos transformantes SPGA-fobxl analizados utilizando pNXP como sustrato.

Fig. 7. Muestra los perfiles de producción de xilosa durante la hidrólisis enzimática de la biomasa por las mezclas enzimáticas producidas por M. thermophila C1 y los transformantes que expresan FoBxl o SPGA-FoBxl. Se calculó el rendimiento de xilosa como el porcentaje de xilosa liberada en comparación con el máximo (%) de acuerdo con el análisis del material pretratado. Muestra 72 h de proceso que corresponden a la fase 2 de la hidrólisis enzimática descrita en los ejemplos siguientes. Los datos representan el promedio de tres muestras independientes, y las barras indican la desviación estándar.

Fig. 8. Muestra los perfiles de consumo de xilobiosa durante la hidrólisis enzimática de la biomasa por las mezclas enzimáticas producidas por M. thermophila C1 y los transformantes que expresan FoBxl o SPGA-FoBxl. Se calculó el consumo de xilosa como el porcentaje de xilobiosa hidrolizada a partir del valor inicial al comienzo de la hidrólisis enzimática. Muestra 72 h de proceso que corresponde a la fase 2 de la hidrólisis enzimática descrita en los siguientes ejemplos. Los datos representan el promedio de tres muestras independientes, y las barras indican la desviación estándar.

EJEMPLOS

Ejemplo de referencia 1. Expresión de la beta-xilosidasa FoBxl de Fusarium oxysporum (cepa Fo5176) en M. thermophila C1. Construcción del vector de expresión y análisis de actividad beta-xilosidasa en transformantes de M. thermophila .

Se ha descrito a la cepa M. thermophila C1 como un sistema de transformación de buena calidad para la expresión y secreción de proteínas y polipéptidos heterólogos. El gen fobxl de la beta-xilosidasa (FOXB_13892 Número de acceso EGU75604) de F. oxysporum (Fo5176) fue la diana para expresar la enzima y analizar su calidad en la presente invención.

Se sintetizó in vitro la secuencia del ADNc de fobxl tras su optimización, lo que condujo a eliminar los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción más comunes sin alterar la secuencia de aminoácidos. En la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, respectivamente, se muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc de fobxl y la secuencia de aminoácidos deducida. La secuencia codificante tiene 1047 nt de longitud incluyendo el codón de terminación. La proteína prevista codificada tiene 348 aminoácidos de longitud con un peso molecular previsto de 40 KDa y un punto isoeléctrico de 9.02. Utilizando el programa Signal IP (Petersen y col., 2011, Signal IP 4.0, Nature Methods, 8:785-786), se previó un péptido señal de 20 residuos. La proteína madura prevista (SEQ ID NO: 3) contiene 328 aminoácidos con un peso molecular previsto de 37 KDa y un punto isoeléctrico de 8.81. Se sintetizó in vitro el gen fobxl junto con la secuencia promotora del gen de la celobiohidrolasa 1 (Pcbh1), que se corresponde con una región de 1796 pb aguas arriba del gen de la celebiohidrolasa 1 (cbh1, NBCI Número de acceso XP_003660789.1) de M. thermophila C1. Se sintetizó este casete (Pcbh1-fobxl) in vitro incluyendo la secuencia de las enzimas de restricción XbaI y BamHI en los extremos (extremos 5' y 3', respectivamente) a fin de clonarse en un vector de expresión denominado pBASE1. El vector de expresión pBASE1 contenía también la secuencia terminadora del gen de la celobiohidrolasa 1 de Myceliophthora thermophila C1 (Tcbhl, que corresponde con una región de 1014 pb aguas abajo de cbhl) y el gen pyr5 (NCBI Número de acceso XP_003660657.1) procedente de la misma cepa que el marcador de selección. El gen pyr5 codifica una orotatofosforibosil transferasa funcional y su expresión permite la complementación de la auxotrofia de la uridina en la cepa hospedadora M. thermophila C1 auxotrófica correspondiente (pyr5). En la Figura 1 se muestra el vector de expresión pBASE1.

El casete Pcbhl-fobxl se digirió con las enzimas de restricción Xbal y BamHI y se clonó en el pBASE1 previamente digerido con las mismas enzimas de restricción. El vector de expresión pBASE1 y el casete Pcbhlfobxl se ligaron y el producto de la unión se transformó en células electro competentes de de Escherichia coli XL1Blue MRF siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante (Stratagene) El plásmido recombinante obtenido se denominó pABC341 y se muestra en la Figura 2.

El plásmido pABC341 que contenía fobxl de F. oxysporum con la secuencia promotora de Pcbh1 y pyr5 como marcador de selección, se transformó en M. thermophila pyr5 (Verdoes y col., 2007, Ind. Biotechnol. 3 (1)), la cepa hospedadora auxotrófica utilizada anteriormente en otras selecciones de alto rendimiento en M. thermophila. Se introdujo el ADN en la cepa hospedadora utilizando un procedimiento de transformación de protoplastos (US7399627B2). Los transformantes se plaquearon en placas de agar sin suplemento de uridina. Después de 5 días de incubación a 35° C se analizaron los transformantes prototróficos resultantes (que expresan el gen pyr5).

Se inocularon los transformantes obtenidos en cultivos de placas de microtitulación de 96 pocillos (MTP) para llevar a cabo una selección de alto rendimiento (US7794962B2). El objetivo de la selección era identificar la actividad beta-xilosidasa en transformantes que expresan fobxl. Se midió la actividad hidrolítica sobre p-nitrofenilbeta-D-xilopiranósido (pNXP, Sigma N2132) como sustrato. El porcentaje de actividad beta-xilosidasa se midió mediante la liberación de p-nitrofenol (y el consiguiente aumento de A⁴¹⁰) en unidades por litro de cultivo (U/L). Se definió una unidad de actividad hidrolizante de pNXP como la cantidad de enzima necesaria para liberar 1 pmol de p-nitrofenol por minuto. Se evaluó la actividad de la beta-xilosidasa a partir de 50 pl de los sobrenadantes de cultivo de cada transformante con 200 mg/l de pNXP durante 10 minutos a 50° C en un volumen final de 100 pl. Se detuvo la reacción añadiendo 100 pl de carbonato 1 M a las mezclas de reacción. Se midió la capacidad hidrolítica mediante la liberación de p-nitrofenol (y el consiguiente aumento de A410).

Entre los transformantes ensayados, la mayor parte de los mismos mostró un aumento de la actividad de betaxilosidasa utilizando M. thermophila C1 como control negativo. En la Figura 3 se muestran los resultados de la actividad de la beta-xilosidasa. Todos los transformantes con actividad beta-xilosidasa se confirmaron en un segundo ensayo tal como se define en el documento US7794962B2. Algunos de los transformantes positivos se confirmaron mediante crecimiento en una producción a escala de matraz (Verdoes y col., 2007, Ind. Biotechnol. 3 (1); Visser y col., 2011, Ind. Biotechnol. 7 (3)) y se midió la actividad de la beta-xilosidasa a partir de los sobrenadantes del cultivo.

Ejemplo 2. Fusión genética del péptido señal de la glucoamilasa de A. niger con la secuencia de la proteína madura de la beta-xilosidasa FoBxl de F. oxysporum. Construcción de un vector de expresión y análisis de actividad beta-xilosidasa en transformantes de M. thermophila .

El péptido señal procedente de la proteína nativa de Fobxl se sustituyó para aumentar la secreción de la proteína madura Fobxl en M. thermophila. El péptido señal nativo procedente de Fobxl se sustituyó por el péptido señal de la glucoamilasa de Aspergillus niger (glaA, número de acceso An03g06550). La glucoamilasa es una enzima altamente secretada de forma natural y su péptido señal se utilizó para conseguir una secreción elevada de la proteína recombinante en el hongo filamentoso.

Para la sustitución del péptido señal nativo, el fragmento del gen fobxl que codifica para la proteína madura (excluyendo la secuencia que codifica el péptido señal nativo) se amplificó mediante la PCR utilizando los oligonucleótidos 1 y 2. El oligonucleótido 1 (s Eq ID NO: 7) incluye el sitio de restricción Ndel y la secuencia que codifica el péptido señal de la glucoamilasa (SPGA). El oligonucleótido 2 (SEQ ID NO: 8) incluye los sitios de restricción SmaI y BamHI e incluye el codón de terminación. La amplificación del oligonucleótido 1 permite la fusión genética del péptido señal de la glucoamilasa y la proteína madura de Fobxl (SPGA-Fobxl).

Oligonucleótido 1 (SEQ ID NO: 7): el sitio de restricción Ndel está subrayado. La secuencia correspondiente a SPGA está recuadrada. La secuencia del extremo 5' de la proteína madura FoBxl es el texto sombreado.

'- a t c c t c t t c c t c c c a Ta t t c t t c c a t c t c t t c t c c c c t a c

|

3'

Oligonucleótido 2 (SEQ ID NO: 8): los sitios de restricción SmaI y BamHI están subrayados. El codón de terminación está recuadrado.

5'-CCTGCAGCCCGGGGGATCClCTAlAGGACGGTGAAGCAAGATCTTGCC

GTTCTTGTC-3'

Se llevó a cabo la amplificación de la fusión genética SPGA-fobxl utilizando los oligonucleótidos 1 y 2 usando el ADN del plásmido pABC341 (descrito anteriormente en el ejemplo 1) como diana con la ADN Polimerasa iProof High-Fidelity (BioRad) y se programó para un ciclo a 95° C durante 2 minutos y 30 ciclos de 95° C durante 30 segundos, 60° C durante 30 segundos, 72° C durante 1 minuto y un ciclo de 72° C durante 10 minutos. El fragmento del ADN amplificado se digirió con las enzimas de restricción Ndel y BamHI y se clonó en pBASE5 previamente digerido con las mismas enzimas de restricción (se muestra en la Figura 4). pBASE5 procede de pBASE1 (descrito en el Ejemplo 1) en el que la secuencia promotora Pcbhl se clonó incluyendo el sitio de restricción Ndel. pBSAE5 contiene también Tchbl como secuencia terminadora y pyr5 como marcador de selección (descrito en el Ejemplo 1). El plásmido con SPGA-fobxl clonado bajo Pcbhl se denominó pABC397 y se muestra en la Figura 5.

El plásmido pABC397 que contenía la fusión genética SPGA-fobxl bajo la secuencia promotora de Pcbhl y pyr5 como marcador de selección, se transformó en M. thermophila pyr5- (Verdoes y col., 2007, Ind. Biotechnol. 3 (1)). Se introdujo el ADN en la cepa hospedadora utilizando un procedimiento de transformación de protoplastos (US7399627B2). Los transformantes se plaquearon en placas de agar sin suplemento de uridina. Después de 5 días de incubación a 35° C, se analizaron los transformantes prototróficos resultantes (que expresaban el gen pyr5).

Se llevó a cabo la selección de alto rendimiento de los transformantes obtenidos tal como se describe en el Ejemplo 1. El objetivo de la selección era identificar la actividad beta-xilosidasa en los transformantes que expresaban fobxl (tal como se describe en el Ejemplo 1).

Entre los transformantes ensayados, la mayor parte de los mismos mostró mayor actividad beta-xilosidasa que la observada con transformantes que expresaban fobxl con el péptido señal nativo. Se utilizó M. thermophila C1 como control negativo. En la Figura 6 se muestran los resultados de la actividad beta-xilosidasa. Todos los transformantes con mayor actividad beta-xilosidasa se confirmaron en un segundo ensayo en las MTPs y se llevó a cabo la fermentación en matraz tal como se describe en el Ejemplo 1. Se confirmó una mayor actividad betaxilosidasa en todos ellos.

Ejemplo 3. Determinación de la actividad beta-xilosidasa en mezclas enzimáticas producidas por M. thermophila C1 y en los transformantes que expresaban FoBxl o SPGA-FoBxl.

Producción de cócteles enzimáticos

Se llevó a cabo la producción de cócteles enzimáticos tal como se describe en Verdoes y col. (2007) and Visser y col., 2011, Ind. Biotechnol. 7 (3), utilizando la plataforma industrial para la expresión enzimas industriales basada en M. thermophila C1 y desarrollada por Dyadic Netherlands.

Se produjeron tres cócteles enzimáticos diferentes; un cóctel control, el cóctel FoBxl y el cóctel SPGA-FoBxl. El cóctel control consistió en la mezcla de enzimas extracelulares producidas por la cepa C1 de Myceliophthora thermophila en las condiciones de producción descritas en las referencias proporcionadas anteriormente. Los cócteles de enzimas FoBxl y SPGA-FoBxl consistieron en las mezclas de las enzimas producidas por esta cepa C1 que expresaba de forma satisfactoria las respectivas construcciones (descritas en los Ejemplos 1 y 2) en condiciones de producción idénticas.

Determinación de la actividad beta-xilosidasa

Las beta-xilosidasas (EC 3.2.1.27) son enzimas hidrolíticas que catalizan la escisión de las unidades de xilosa terminales procedentes del extremo no reductor de los oligómeros de xilosa cortos que se crean a partir de la actividad endoxilanasa (EC 3.2.1.8) hacia el xilano.

Se determinó la actividad beta-xilosidasa utilizando p-nitrofenil-beta-D-xilopiranósido (pNXP, Sigma N2132) como sustrato. Para este ensayo de pNXP, las mezclas de reacción enzimáticas (volumen final de 1 ml) que contenían 100 pmol de tampón de acetato de sodio (pH 5,0), 100 pg de pNXP (0,33 pmol) y una cantidad adecuada del cóctel enzimático respectivo se incubaron a 50° C durante 10 min. Se midió la cantidad de p-nitrofenol liberada a A410 (e410 = 15,2 mM'1cm'1) después de la adición de 100 pg de carbonato de sodio a las mezclas de reacción. Se definió una unidad de actividad hidrolizante del pNXP como la cantidad de enzima equivalente a liberar 1 pmol de p-nitrofenol por minuto. En la Tabla 1 se muestran las actividades específicas obtenidas.

Se determinó la proteína total de las mezclas enzimáticas mediante el procedimiento BCA (Applichem, A7787 0500).

Tabla 1. Actividad específica de las mezclas enzimáticas producidas por M. thermophila C1 y los transformantes que expresan FoBxl o SPGA-FoBxl. Se indican los errores como la desviación estándar (SD) de tres medidas ______________________________________ independientes.____________________________________ Cóctel enzimático Actividad BXL (U mg prot.-1) SD Cóctel control 11,47 0,04 Cóctel FoBxl 36,05 0,19 Cóctel SPGA-FoBxl 154,06 0,77

Ejemplo 4. Efecto del suplemento con el cóctel FoBxl y SPGA-FoBxl sobre la producción de xilosa durante la hidrólisis enzimática de biomasa que contiene xilano.

Experimentos de hidrólisis enzimática

Se utilizó bagazo de maíz pretratado sin lavar (PCS, de “Pretreated Corn Stover”) como sustrato para la hidrólisis enzimática. Se llevó a cabo el pretratamiento de la biomasa mediante una modificación del sistema de explosión con vapor descrito por Nguyen y col., 1998, Appl. Biochem. Biotechnol. 70-72, en el que no se aplicó tratamiento ácido para limitar la hidrólisis del xilano. Para evaluar el efecto de las actividades de FoBxl y SPGA-FoBxl era necesario que aún quedara xilosa por liberar del material pretratado.

Se llevó a cabo el análisis de la composición de este material de acuerdo con los Procedimientos Analíticos Normalizados de la Biomasa (http://www.nrel.gov/biomass/analytical_procedures.html), el cual desveló que contenía un 4,06% y un 11,11% (p/p, MS) de concentración de xilano y xilosa, respectivamente, y un 12,24% y un 3,61% (p/p, MS) de glucano y glucosa, respectivamente.

Las reacciones de hidrólisis se llevaron a cabo en dos fases. Se llevó a cabo una fase inicial mediante el cóctel enzimático control durante 24 horas con una concentración del 25% de materia seca (MS). Esta mezcla de reacción inicial contenía, en un peso total de 200 g: bagazo de maíz pretratado correspondiente a 50 g de MS; NaOH. 1,6 g; y un cóctel enzimático control con un contenido de 3 g de proteína total (medida tal como se ha descrito previamente).

Esta fase de hidrólisis inicial se llevó a cabo en matraces ISO de 2L para garantizar la licuefacción del PCS; posteriormente, la suspensión resultante se distribuyó en alícuotas en tubos de 10 ml (4 g por tubo), en los que se llevó a cabo una segunda fase de hidrólisis.

Se estudió de este modo el efecto de FoBxl y SPGA-FoBxl durante la segunda fase de hidrólisis, en la que se mezclaron 4 g de suspensión, bien con 1 g de agua (control experimental), o bien con 1 g de diluciones acuosas del cóctel correspondiente. De este modo, se ajustó la MS de la suspensión al 20% durante esta segunda fase de hidrólisis enzimática, que se llevó a cabo durante 72 h. La dosificación del cóctel enzimático se ajustó a 0,1% (p/p, proteína/MS) el equivalente a 8 mg de prot. g glucano-1. Ambas fases de hidrólisis enzimática se llevaron a cabo a 50° C en el interior de agitadores con un diámetro orbital de 25 mm a 150 rpm.

En la Figura 7 y la Figura 8 se muestran los perfiles de producción de xilosa e hidrólisis de xilobiosa obtenidos

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Una célula hospedadora de Myceliophthora thermophila que expresa una enzima beta-xilosidasa recombinante que consiste en una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4.

2. Una composición que comprende la célula hospedadora según reivindicación 1.

3. La composición de acuerdo con la reivindicación 10, que comprende además otras enzimas celulolíticas derivadas de la célula hospedadora de acuerdo a la reivindicación 1.

4. Uso de la célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 1 o la composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, para la degradación de la biomasa.

5. Uso de acuerdo con la reivindicación 4, para la degradación de la biomasa en un proceso de producción de un bioproducto.

6. Uso de acuerdo con la reivindicación 5, donde el bioproducto es biocombustible.

7. Uso de acuerdo con la reivindicación 6, donde el biocombustible es bioetanol.

8. Un procedimiento para producir azúcares fermentables que comprende:

a. Incubar biomasa con la célula hospedadora según reivindicación 1 o la composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, y

b. Recuperar los azúcares fermentables obtenidos después de la incubación en la etapa (a).

9. Un procedimiento para producir un bioproducto a partir de biomasa que comprende:

a. Incubar biomasa con la célula hospedadora según reivindicación 1 o la composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3,

b. Fermentar los azúcares fermentables obtenidos después de la incubación de la etapa (a) con al menos un microorganismo fermentador, y

c. Recuperar el bioproducto obtenido después de la fermentación en la etapa (b).

10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, donde el bioproducto es biocombustible.

11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, donde el biocombustible es bioetanol.