ES2715874T3

ES2715874T3 - Métodos de detección del cáncer de la vejiga

Info

Publication number: ES2715874T3
Application number: ES14717250T
Authority: ES
Inventors: Leena Mccann; Stacey Ellen Wallace; Edwin Wei-Lung Lai; Russell Higuchi; Chris Lykke
Original assignee: Cepheid
Current assignee: Cepheid
Priority date: 2013-03-06
Filing date: 2014-03-06
Publication date: 2019-06-06
Anticipated expiration: 2034-03-06
Also published as: WO2014138396A1; WO2014138396A8; US10329622B2; US20190382847A1; US20140309127A1; CA2903104A1; US12000001B2; EP2964786B1; US20240287618A1; JP2016513961A; US20250084483A1; EP2964786A1

Abstract

Un método para detectar la presencia de cáncer de vejiga en un sujeto que comprende detectar el nivel de cada marcador de un conjunto de marcadores de cáncer de vejiga en una muestra de lavado de orina o vejiga del sujeto, en el que el conjunto de marcadores de cáncer de vejiga comprende uroplakina 1B (UPK1B), o receptor de andrógenos (AR), o ambos UPK1B y AR, y en donde la detección de un nivel elevado de al menos un marcador seleccionado de UPK1B y AR indica la presencia de cáncer de vejiga en el sujeto.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos de detección del cáncer de la vejiga

1. CAMPO DE LA INVENCIÓN.

[0001] Se proporcionan las composiciones y métodos para detectar el cáncer de vejiga. En particular, se proporcionan marcadores de cáncer de vejiga y paneles de marcadores útiles en la detección del cáncer de vejiga.

2. ANTECEDENTES

[0002] 386.000 casos de cáncer de vejiga se diagnostican globalmente cada año, incluyendo 70.500 casos por año en los Estados Unidos. La incidencia de cáncer de vejiga es tres veces mayor en hombres que en mujeres. La mayor incidencia y prevalencia se encuentran en la Unión Europea, América del Norte, África del Norte y Oriente Medio.

[0003] El tabaquismo es el mayor factor de riesgo para el cáncer de vejiga. Los factores de riesgo adicionales incluyen la exposición química, la quimioterapia (como Cytoxan), el tratamiento de radiación y la infección crónica de vejiga.

[0004] Los tumores de vejiga incluyen tumores papilares, que son carcinomas uroteliales que crecen, las proyecciones en forma de dedos estrechos; y tumores no papilares (sésiles), como el carcinoma in situ, que son menos comunes pero tienen un alto riesgo de volverse invasivos.

[0005] Los síntomas de cáncer de vejiga pueden incluir dolor abdominal, sangre en la orina, dolor de huesos o sensibilidad, la fatiga, el dolor al orinar, micción frecuente, urgencia urinaria, incontinencia, y pérdida de peso. El diagnóstico generalmente se basa en imágenes, análisis de orina y/o biopsia.

[0006] El pronóstico para el cáncer de vejiga depende de la etapa del cáncer al momento del diagnóstico. El pronóstico para tumores tempranos es favorable, mientras que el pronóstico para tumores avanzados es malo. Se recomienda un seguimiento a largo plazo para detectar la recurrencia del cáncer, que ocurre en hasta el 70% de los cánceres de vejiga. Durante los primeros dos años, la cistoscopia y la citología de orina se recomiendan cada 3 a 4 meses, y luego en intervalos más largos en los años subsiguientes, a menudo durante la vida del paciente. Estos métodos son invasivos y costosos, por lo que el cáncer de vejiga es uno de los cánceres más caros de tratar desde el diagnóstico hasta la muerte.

[0007] Pruebas de diagnóstico no invasivas existentes incluyen ImmunoCyt™ (Scimedx, Denville, NJ) y UroVysion® (Abbott Molecular, Abbott Park, IL). ImmunoCyt™ es un ensayo de citología que utiliza un cóctel de tres anticuerpos monoclonales marcados con marcadores fluorescentes para detectar ciertos marcadores celulares de cáncer de vejiga en células exfoliadas aisladas de muestras de orina. ImmunoCyt™ se usa junto con la citología de orina estándar para mejorar la sensibilidad de la citología para detectar células tumorales. UroVysion® también es un ensayo basado en citología, que detecta aneupoloidía en ciertos cromosomas mediante hibridación in situ fluorescente (FISH). La determinación de los resultados se realiza enumerando las señales mediante un examen microscópico del núcleo de las células en la orina.

[0008] Se necesitan los métodos mejorados para la detección temprana de cáncer de vejiga. En particular, una prueba diagnóstica precisa basada en la orina que no se basa en la citología podría reducir la necesidad de realizar una cistoscopia costosa e invasiva, y los análisis de citología intensivos en trabajo y potencialmente subjetivos.

[0009] Olsburgh et al. THE JOURNAL OF PATHOLOGY, (2003) vol. 199 (1), páginas 41-49, se refiere a métodos para detectar la expresión del gen uroplakin en tejidos humanos normales y en cáncer de vejiga localmente avanzado.

[0010] Williams et al. MODERN PATHOLOGY, (2013) vol. 26 (Suplemento. 2), página 258A se refiere a la expresión del receptor de andrógenos en neoplasias genitourinarias.

[0011] Zheng et al. CANCER, (2011) vol. 18 (4), páginas 451-464, se relacionan con el efecto de la dihidrotestosterona en la expresión de EGFR y ERBB2 en células de cáncer de vejiga positivas para andrógenos.

3. RESUMEN

[0012] Se proporcionan composiciones y métodos, como se definen en las reivindicaciones, para detectar cáncer de vejiga. En particular, se proporcionan marcadores de cáncer de vejiga y paneles de marcadores útiles en la detección del cáncer de vejiga. En algunas realizaciones, los niveles de ARNm del receptor de andrógenos (AR) y/o uroplakin 1B (UPK1B), y opcionalmente, al menos un ARNm seleccionado de CRH, I^gF2, KRT20, ANXA10, ^uPK2, MGEA5 y PIK3A, son medidos, por ejemplo, mediante TA-PCR cuantitativa, y los resultados se pueden usar para determinar si un sujeto tiene cáncer de vejiga o no. En algunas realizaciones, los niveles de ARNm de AR y/o UPK1B, y opcionalmente al menos un ARNm seleccionado de CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 y PIK3A, se normalizan a un control endógeno. En algunas realizaciones, el control endógeno es ABL ARNm. En algunas realizaciones, se selecciona un control endógeno que se espera que se exprese a niveles similares en células uroteliales de vejiga de sujetos con y sin cáncer de vejiga. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de orina. En algunas realizaciones, los métodos actuales se usan para monitorear sujetos con antecedentes de cáncer de vejiga para la recurrencia del tumor. En algunas realizaciones, el sujeto ha sido tratado con Bacillus Calmette-Guerin (BCG) en los últimos tres meses. En algunas realizaciones, los métodos actuales se usan para detectar cáncer de vejiga en sujetos sin antecedentes de cáncer de vejiga. En algunas de tales realizaciones, los sujetos tienen síntomas de cáncer de vejiga. Los síntomas ejemplares no limitativos del cáncer de vejiga incluyen dolor abdominal, sangre en la orina, dolor o sensibilidad en los huesos, fatiga, micción dolorosa, micción frecuente, urgencia urinaria, incontinencia y pérdida de peso. En algunas realizaciones, el cáncer de vejiga es un cáncer de vejiga de bajo grado.

[0013] En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para detectar la presencia de cáncer de vejiga en un sujeto. El método comprende detectar los niveles de cada marcador de un conjunto de marcadores de cáncer de vejiga en una muestra del sujeto, en donde el conjunto de marcadores de cáncer de vejiga comprende receptor de andrógenos (AR) o uroplakina 1B (UPK1B), o tanto AR como UPK1B. La detección de un nivel elevado de AR y/o UPK1B indica la presencia de cáncer de vejiga en el sujeto.

[0014] En algunas realizaciones, están dentro de los métodos de monitorización de la terapia anti-andrógenos en un sujeto con cáncer de vejiga. Los métodos comprenden la detección de los niveles de cada marcador de un conjunto de marcadores de cáncer de vejiga en una muestra del sujeto en un primer momento, en donde el conjunto de marcadores de cáncer de vejiga comprende el receptor de andrógenos (AR) o uroplakina 1B (UPK1B), o tanto AR como UPK1B. Una disminución en el nivel de al menos un marcador en el primer punto de tiempo en relación con un segundo punto de tiempo indica que el sujeto está respondiendo a la terapia anti-andrógeno. En algunas realizaciones, los métodos comprenden comparar el nivel de al menos un marcador en el primer punto de tiempo con el nivel de al menos un marcador en el segundo punto de tiempo. En algunas realizaciones, el sujeto está recibiendo terapia anti-andrógeno en el primer punto de tiempo. En algunas realizaciones, el segundo punto de tiempo es antes de que el sujeto comience la terapia con antiandrógenos. En algunas realizaciones, el sujeto está recibiendo terapia anti-andrógeno en el segundo punto de tiempo.

[0015] En algunas realizaciones, el conjunto de marcadores de cáncer de vejiga comprende además al menos un marcador seleccionado de hormona liberadora de corticotropina (CRH), factor de crecimiento similar a la insulina 2 (IGF2), queratina 20 (KRT20) y anexina 10 (genes ANXA10). En algunas realizaciones, el conjunto de marcadores de cáncer de vejiga comprende: a) AR, CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10; b) AR, CRH, IGF2 y KRT20; c) UPK1B, CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10; d) UPK1B, CRH, IGF2 y KRT20; e) AR, UPK1B, CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10; f) AR, UPK1B, CRH, IGF2 y KRT20; g) UPK1B, CRH, IGF2 y ANXA10; o h) UPK1B, CRH, KRT20 y ANXA10.

[0016] De algunas realizaciones, un procedimiento comprende además la detección de un control endógeno. En algunas realizaciones, el control endógeno se selecciona de ABL, GUSB, GAPDH, TUBB y UPK1a. En algunas realizaciones, el control endógeno es ABL. En algunas realizaciones, un método comprende detectar un control exógeno. En algunas realizaciones, el control exógeno es un ARN. En algunas de estas realizaciones, el control exógeno es un RNA blindado. En algunas realizaciones, el método comprende detectar en una sola reacción múltiplex: a) AR, CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, un control endógeno y un control exógeno; b) AR, CRH, IGF2, KRT20, un control endógeno y un control exógeno; c) UPK1B, CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, un control endógeno y un control exógeno; d) UPK1B, CRH, IGF2, KRT20, un control endógeno y un control exógeno; e) AR, UPK1B, CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10; f) AR, UPK1B, CRH, IGF2, KRT20, un control endógeno y un control exógeno; g) UPK1B, CRH, IGF2, ANXA10, un control endógeno y un control exógeno; o h) UPK1B, CRH, KRT20, ANXA10, un control endógeno y un control exógeno. En algunas realizaciones, el método comprende detectar en una única reacción múltiplex: a) AR, CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, ABL y un control exógeno; b) AR, CRH, IGF2, KRT20, ABL y un control exógeno; c) UPK1B, CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, ABL y un control exógeno; d) UPK1B, CRH, IGF2, KRT20, ABL y un control exógeno; e) AR, UPK1B, CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10; f) AR, UPK1B, CRH, IGF2, KRT20, ABL y un control exógeno; g) UPK1B, CRH, IGF2, ANXA10, ABL y un control exógeno; o h) UPK1B, CRH, KRT20, ANXA10, ABL y un control exógeno.

[0017] En algunas realizaciones, la detección comprende TA-PCR. En algunas realizaciones, la detección comprende TA-PCR cuantitativa. En algunas realizaciones, un método comprende comparar un valor Ct o un valor ACt con un valor umbral Ct o un valor ACt. En algunas realizaciones, ACt es el valor de Ct para el control endógeno menos el valor de Ct para el marcador. En algunas realizaciones, la reacción de TA-PCR tarda menos de tres horas o menos de 2 horas desde un paso de desnaturalización inicial hasta un paso de extensión final.

[0018] En algunas realizaciones, un método comprende poner en contacto el ARN de la muestra con un conjunto de pares de cebadores de marcadores de cáncer de vejiga, en donde el conjunto de pares de cebadores de marcador del cáncer de vejiga comprende un primer par de cebadores para la detección de AR, o un primer par de cebadores para detectar UPK1B, o un primer par de cebadores para detectar AR y un segundo par de cebadores para detectar UPK1B. En algunas realizaciones, el conjunto de pares de cebadores marcadores de cáncer de vejiga comprende un tercer par de cebadores para detectar un marcador seleccionado entre CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 y PIK3A. En algunas realizaciones, el conjunto de pares de cebadores marcadores de cáncer de vejiga comprende un cuarto par de cebadores para detectar un marcador seleccionado entre CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 y PIK3A, en donde el tercer par de cebadores y el cuarto par de cebadores detectan diferentes marcadores. En algunas realizaciones, el conjunto de pares de cebadores marcadores de cáncer de vejiga comprende un quinto par de cebadores para detectar un marcador seleccionado entre CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 y PIK3A, en donde el tercer par de cebadores, el cuarto par de cebadores y el quinto par de cebadores detecta diferentes marcadores. En algunas realizaciones, el conjunto de pares de cebadores marcadores de cáncer de vejiga comprende un par de cebadores separado para detectar cada marcador en un conjunto de marcadores seleccionados de a) AR, CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10; b) AR, CRH, IGF2 y KRT20; c) UPK1B, CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10; d) UPK1B, CRH, IGF2 y KRT20; e) AR, UPK1B, CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10; f) AR, UPK1B, CRH, IGF2 y KRT20; g) UPK1B, CRH, IGF2 y ANXA10; o h) UPK1B, CRH, KRT20 y ANXA10. En algunas realizaciones, el conjunto de pares de cebadores marcadores de cáncer de vejiga comprende un par de cebadores separado para detectar cada marcador y control en un conjunto seleccionado de a) AR, CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, un control endógeno y un control exógeno; b) AR, CRH, IGF2, KRT20, un control endógeno y un control exógeno; c) UPK1B, CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, un control endógeno y un control exógeno; d) UPK1B, CRH, IGF2, KRT20, un control endógeno y un control exógeno; e) AR, UPK1B, CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10; f) AR, UPK1B, CRH, IGF2, KRT20, un control endógeno y un control exógeno; g) UPK1B, CRH, IGF2, ANXA10, un control endógeno y un control exógeno; o h) UPK1B, CRH, KRT20, ANXA10, un control endógeno y un control exógeno. En algunas realizaciones, el conjunto de pares de cebadores marcadores de cáncer de vejiga comprende un par de cebadores separado para detectar cada marcador y control en un conjunto seleccionado de: a) AR, CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, ABL y un control exógeno; b) AR, CRH, IGF2, KRT20, ABL y un control exógeno; c) UPK1B, CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, ABL y un control exógeno; d) UPK1B, CRH, IGF2, KRT20, ABL y un control exógeno; e) AR, UPK1B, CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10; f) AR, UPK1B, CRH, IGF2, KRT20, ABL y un control exógeno; g) UPK1B, CRH, IGF2, ANXA10, ABL y un control exógeno; o h) UPK1B, CRH, KRT20, ANXA10, ABL y un control exógeno.

[0019] En algunas realizaciones, en donde cada par de cebadores marcadores de cáncer de vejiga produce un amplicón que es de 50 a 500 nucleótidos de longitud, de 50 a 400 nucleótidos de longitud, de 50 a 300 nucleótidos de longitud, de 50 a 200 nucleótidos de longitud, o 50 a 150 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, al menos uno, al menos dos, o al menos tres pares de cebadores marcadores de cáncer de vejiga atraviesan un intrón en la secuencia genómica. En algunas realizaciones, cada par de cebadores de cáncer de vejiga abarca un intrón en la secuencia genómica.

[0020] En algunas realizaciones, el par de cebadores para la detección de AR comprende un primer cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de la SEQ ID NO: 54 y un segundo cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de la SEQ ID NO: 55, en donde cada cebador es menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, o menos de 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el par de cebadores para detectar UPK1B comprende un primer cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de la SEQ ID NO: 51 y un segundo cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de la SEQ ID NO: 52, en donde cada cebador es menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de largo.

[0021] En algunas realizaciones, un método comprende además poner en contacto el ARN de la muestra con un par de cebadores control endógeno. En algunas de tales realizaciones, el par de cebadores de control endógeno para detectar un control endógeno se selecciona de ABL, GUSB, GAPDH, TUBB y UPK1a. En algunas realizaciones, el par de cebadores de control endógeno es para detectar ABL. En algunas realizaciones, el par de cebadores de control endógeno comprende un primer cebador que comprende la SEQ ID NO: 8 y un segundo cebador que comprende la SEQ ID NO: 9, en donde cada cebador es menor que 50, menor que 45, menor que 40, menor que 35 o menor que 30 nucleótidos de largo. En algunas realizaciones, el par de cebadores de control endógeno comprende un primer cebador que comprende la SEQ ID NO: 41 y un segundo cebador que comprende la SEQ ID NO: 42, en donde cada cebador es menor que 50, menor que 45, menor que 40, menor que 35, o menor que 30 nucleótidos de largo. En algunas realizaciones, el par de cebadores de control endógeno comprende un primer cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 8 y un segundo cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de la SEQ ID NO: 9, en donde cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el par de cebadores de control endógeno comprende un primer cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de la SEQ ID NO: 41 y un segundo cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de la SEQ ID NO: 42, en donde cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de longitud.

[0022] En algunas realizaciones, el método comprende poner en contacto el ARN de la muestra con un par de cebadores de control exógeno. En algunas de tales realizaciones, el par de cebadores de control exógeno es para detectar un ARN exógeno. En algunas realizaciones, el par de cebadores de control exógeno comprende un primer cebador que comprende la SEQ ID NO: 23 y un segundo cebador que comprende la SEQ ID NO: 24, en donde cada cebador es menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de largo. En algunas realizaciones, el par de cebadores de control exógeno comprende un primer cebador que comprende la SEQ ID NO: 44 y un segundo cebador que comprende la SEQ ID NO: 45, en donde cada cebador es menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, o menos de 30 nucleótidos de largo. En algunas realizaciones, el par de cebadores de control exógeno comprende un primer cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de la SEQ ID NO: 23 y un segundo cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de la SEQ ID NO: 24, en donde cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el par de cebadores de control exógeno comprende un primer cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de la SEQ ID NO: 44 y un segundo cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, a al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de la SEQ ID NO: 45, en donde cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de longitud.

[0023] En algunas realizaciones, el método comprende la formación de un conjunto de amplicones marcador de cáncer de vejiga, en el que el conjunto de amplicones marcador de cáncer de vejiga comprende un amplicón AR, o un amplicón de UPK1B, o ambos un amplicón AR y un amplicón UPK1B, y poner en contacto los amplicones de marcadores de cáncer de vejiga con un conjunto de sondas de marcadores de cáncer de vejiga, en donde el conjunto de sondas de marcadores de cáncer de vejiga comprende una primera sonda para detectar el amplicón de AR, o una primera sonda para detectar el amplicón de UPK1B, o una primera sonda para detectar el amplicón de AR y una segunda sonda para detectar el amplicón UPK1B. En algunas realizaciones, el conjunto de amplicones marcadores de cáncer de vejiga comprende un tercer amplicón seleccionado de entre un amplicón CRH, un amplicón IGF2, un amplicón KRT20, un amplicón ANXA10, un amplicón UPK2, un amplicón MGEA5 y un amplicón PIK3A, y en donde el conjunto de las sondas de marcadores de cáncer de vejiga comprende una tercera sonda para detectar el tercer amplicón. En algunas realizaciones, el conjunto de amplicones marcadores de cáncer de vejiga comprende un cuarto amplicón seleccionado entre un amplicón CRH, un amplicón IGF2, un amplicón KRT20, un amplicón ANXA10, un amplicón UPK2, un amplicón MGEA5 y un amplicón PIK3A, en donde el conjunto de las sondas de marcadores de cáncer de vejiga comprenden una cuarta sonda para detectar el cuarto amplicón, y en el que el tercer amplicón y el cuarto amplicón son diferentes. En algunas realizaciones, el conjunto de amplicones marcadores de cáncer de vejiga comprende un quinto amplicón seleccionado de entre un amplicón CRH, un amplicón IGF2, un amplicón KRT20, un amplicón ANXA10, un amplicón UPK2, un amplicón MGEA5 y un amplicón PIK3A, en donde el conjunto de las sondas de marcadores de cáncer de vejiga comprenden una quinta sonda para detectar el quinto amplicón, y en donde el tercer amplicón, el cuarto amplicón y el quinto amplicón son diferentes.

[0024] En algunas realizaciones, la sonda para la detección de AR comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de la SEQ ID NO: 56, en donde la sonda tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la sonda para detectar UPK1B comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de la SEQ ID NO: 53, en donde la sonda tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, cada sonda de marcador de cáncer de vejiga comprende un colorante, y en el que cada colorante es detectable diferente de los otros tres marcadores. En algunas realizaciones, cada sonda de marcador de cáncer de vejiga comprende un tinte fluorescente y una molécula de extinción.

[0025] En algunas realizaciones, un procedimiento comprende la formación de un amplicón de control endógeno, y poner en contacto el amplicón de control endógeno con una sonda de control endógeno. En algunas realizaciones, la sonda de control endógeno comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de la SEQ ID NO: 10, 11, 12 o 43, en donde la sonda de control endógena tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la sonda de control endógena comprende un tinte que es detectable diferente de los tintes de las sondas marcadoras de cáncer de vejiga.

[0026] En algunas realizaciones, un procedimiento comprende la formación de un amplicón de control exógeno, y en contacto con el amplicón de control exógeno con una sonda de control exógena. En algunas realizaciones, la sonda de control exógena comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 25 o 46, en donde la sonda de control exógena tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la sonda de control exógena comprende un colorante que es detectable diferente de los colorantes de las sondas marcadoras de cáncer de vejiga y la sonda de control endógena.

[0027] En algunas realizaciones, el conjunto de marcadores de cáncer de vejiga son detectados en una única reacción multiplex. En algunas realizaciones, el método comprende utilizar un análisis discriminante lineal (ADL) para combinar dos o más de los niveles de marcadores de cáncer de vejiga en una puntuación combinada. En algunas realizaciones, la ADL se usa para combinar todos los niveles de marcadores de cáncer de vejiga en una puntuación combinada.

[0028] En algunas realizaciones, la muestra comprende células uroteliales. La muestra se selecciona de una muestra de orina y una muestra de lavado de vejiga. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un historial de cáncer de vejiga. En algunas realizaciones, el sujeto está siendo monitoreado para detectar la recurrencia del cáncer de vejiga.

[0029] En algunas realizaciones, se proporcionan las composiciones, como se define en la reivindicación 11. En algunas realizaciones, una composición comprende un conjunto de pares de cebadores marcadores de cáncer de vejiga, en donde el conjunto de pares de cebadores marcadores de cáncer de vejiga comprende un primer par de cebadores para detectar AR, o un primer par de cebadores para detectar UPK1B, o un primer par de cebadores para detectar AR y un segundo par de cebadores para detectar UPK1B. En algunas realizaciones, el conjunto de pares de cebadores marcadores de cáncer de vejiga comprende un tercer par de cebadores para detectar un marcador seleccionado entre CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, u Pk2, MGEA5 y PIK3A. En algunas realizaciones, el conjunto de pares de cebadores marcadores de cáncer de vejiga comprende un cuarto par de cebadores para detectar un marcador seleccionado entre CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 y PIK3A, en donde el tercer par de cebadores y el cuarto par de cebadores detectan diferentes marcadores. En algunas realizaciones, el conjunto de pares de cebadores marcadores de cáncer de vejiga comprende un quinto par de cebadores para detectar un marcador seleccionado entre CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, ^mG^eA5 y PIK3A, en donde el tercer par de cebadores, el cuarto par de cebadores y el quinto par de cebadores detecta diferentes marcadores.

[0030] En algunas realizaciones, cada par de cebadores marcadores de cáncer de vejiga produce un amplicón que es 50 a 500 nucleótidos de largo, 50 a 400 nucleótidos, 50 a 300 nucleótidos, 50 a 200 nucleótidos, o 50 a 150 nucleótidos. En algunas realizaciones, al menos uno, al menos dos, o al menos tres pares de cebadores marcadores de cáncer de vejiga atraviesan un intrón en la secuencia genómica. En algunas realizaciones, cada par de cebadores de cáncer de vejiga abarca un intrón en la secuencia genómica.

[0031] En algunas realizaciones, el par de cebadores para la detección de AR comprende una primera imprimación que comprende al menos 8, por lo menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de la SEQ ID NO: 54 y un segundo cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, a al menos 14, o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de la SEQ ID NO: 55, en donde cada cebador es menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, o menos de 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el par de cebadores para detectar UPK1B comprende un primer cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de la SEQ ID NO: 51 y un segundo cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de la SEQ ID NO: 52, en donde cada cebador es menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de largo.

[0032] En algunas realizaciones, la composición comprende además un conjunto de sondas marcadoras de cáncer de vejiga, en donde el conjunto de sondas marcadoras del cáncer de vejiga comprende una primera sonda para detectar un amplicón AR, o una primera sonda para detectar un amplicón UPK1B, o una primera sonda para detectar un amplicón AR y una segunda sonda para detectar un amplicón UPK1B. En algunas realizaciones, el conjunto de sondas de marcadores de cáncer de vejiga comprende una tercera sonda para detectar un tercer amplicón seleccionado entre un amplicón CRH, un amplicón ⁱGF2, un amplicón KRT20, un amplicón ANXA10, un amplicón UPK2, un amplicón MGK5 y un amplicón PIK3A. En algunas realizaciones, el conjunto de sondas de marcadores de cáncer de vejiga comprende una cuarta sonda para detectar un cuarto amplicón seleccionado entre un amplicón CRH, un amplicón IGF2, un amplicón KRT20, un amplicón ANXA10, un amplicón UPK2, un amplicón MGK5 y un amplicón PIK3A., en donde el tercer amplicón y el cuarto amplicón son diferentes. En algunas realizaciones, el conjunto de sondas de marcadores de cáncer de vejiga comprende una cuarta sonda para detectar un quinto amplicón seleccionado de un amplicón CRH, un amplicón IGF2, un amplicón KRT20, un amplicón ANXA10, un amplicón UPK2, un amplicón MGEA5 y un amplicón PIK3A. en donde el tercer amplicón, el cuarto amplicón y el quinto amplicón son diferentes.

[0033] En algunas realizaciones, la sonda para la detección de AR comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de la SEQ ID NO: 56, en donde la sonda tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de largo. En algunas realizaciones, la sonda para detectar UPK1B comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de la SEQ ID NO: 53, en donde la sonda tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, cada sonda de marcador de cáncer de vejiga comprende un colorante, y en el que cada colorante es detectable diferente de los otros tres marcadores. En algunas realizaciones, cada sonda de marcador de cáncer de vejiga comprende un tinte fluorescente y una molécula de extinción.

[0034] En algunas realizaciones, la composición comprende además un par de cebadores de control endógeno para la detección de un control endógeno. En algunas realizaciones, el control endógeno se selecciona de ABL, GUSB, GAPDH, TUBB y UPK1a. En algunas realizaciones, el control endógeno es ABL. En algunas realizaciones, el par de cebadores de control endógeno comprende un primer cebador que comprende la SEQ ID NO: 8 y un segundo cebador que comprende la SEQ ID NO: 9, en donde cada cebador es menor que 50, menor que 45, menor que 40, menor que 35 o menos de 30 nucleótidos de largo. En algunas realizaciones, el par de cebadores de control endógeno comprende un primer cebador que comprende la SEQ ID NO: 41 y un segundo cebador que comprende la SEQ ID NO: 42, en donde cada cebador es menor que 50, menor que 45, menor que 40, menor que 35, o menos de 30 nucleótidos de largo. En algunas realizaciones, el par de cebadores de control endógeno comprende un primer cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 8 y un segundo cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de la SEQ ID NO: 9, en donde cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el par de cebadores de control endógeno comprende un primer cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de la SEQ ID NO: 41 y un segundo cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de la SEQ ID NO: 42, en donde cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de longitud.

[0035] En algunas realizaciones, la composición comprende además una sonda de control endógeno para la detección de un amplicón de control endógeno. En algunas realizaciones, el control endógeno se selecciona de ABL, GUSB, GAPDH, TUBB y UPK1a. En algunas realizaciones, el control endógeno es ABL. En algunas realizaciones, la sonda de control endógeno comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de la SEQ ID NO: 10, 11, 12 o 43, en donde la sonda de control endógena tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la sonda de control endógeno comprende un colorante que es detectable diferente de los tintes de las sondas marcadoras de cáncer de vejiga

[0036] En algunas formas de realización, la composición es una composición liofilizada. En algunas realizaciones, la composición es una solución. En algunas realizaciones, la composición comprende además células uroteliales. En algunas realizaciones, las células uroteliales son de una muestra de orina.

[0037] A continuación se describen realizaciones adicionales y detalles de las invenciones.

4. DESCRIPCIÓN DETALLADA

4.1. Definiciones

[0038] Para facilitar la comprensión de la presente invención, una serie de términos y frases se definen a continuación:

[0039] Como se usa en el presente documento, los términos "detectar", "detectado" o "detección" pueden describir bien la regla general de descubrir o discernir o la observación específica de una composición marcada de forma detectable.

[0040] Tal como se utiliza aquí, el término "forma detectable diferente" se refiere a un conjunto de etiquetas (tales como colorantes) que pueden ser detectadas y distinguidas simultáneamente.

[0041] Como se usa en el presente documento, los términos "paciente" y "sujeto" se utilizan indistintamente para referirse a un ser humano. En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento pueden usarse en muestras de animales no humanos.

[0042] Como se usa en el presente documento, "cáncer de vejiga" es un tumor, como un carcinoma de células de transición, que surge del revestimiento de la vejiga, e incluye cánceres de vejiga de grado bajo y alto, así como cáncer de vejiga metastásico. El "cáncer de vejiga de bajo grado" se refiere a los tumores superficiales que se proyectan hacia el interior de la cavidad de la vejiga. Los cánceres de vejiga de bajo grado tienen una alta tasa de recurrencia. "Cáncer de vejiga de alto grado" se refiere a un tumor invasivo y de rápido crecimiento que invade la pared de la vejiga. Los cánceres de vejiga de alto grado tienen el potencial de propagarse (es decir, hacer metástasis) a otras áreas del cuerpo. El "cáncer de vejiga metastásico" se refiere al cáncer de vejiga invasivo que se ha diseminado a una o más ubicaciones en el cuerpo más allá de la vejiga.

[0043] Como se usa en el presente documento, los términos "oligonucleótido", "polinucleótido", "molécula de ácido nucleico", y similares, se refieren a moléculas que contienen ácido nucleico, incluyendo, pero no limitado a, ADN o ARN. El término abarca secuencias que incluyen cualquiera de los análogos de base conocidos de ADN y ARN que incluyen, entre otros, 4-acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosis, 5 (carboxihidroxilmetilo) uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometilo-2-tiouracilo, 5-carboximetilo-aminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1- metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metilo-adenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometilo-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, metiléster del ácido uracilo-5-oxiacético, ácido uracilo-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metilo-2- tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, metiléster del ácido N-uracilo-5-oxiacético, ácido uracilo-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina y 2,6-diaminopina.

[0044] Tal como se utiliza aquí, el término "oligonucleótido" se refiere a un polinucleótido monocatenario que tiene menos de 500 nucleótidos. En algunas realizaciones, un oligonucleótido es de 8 a 200, de 8 a 100, de 12 a 200, de 12 a 100, de 12 a 75 o de 12 a 50 nucleótidos. Los oligonucleótidos pueden referirse por su longitud, por ejemplo, un oligonucleótido de 24 residuos puede denominarse un "24-mer".

[0045] Tal como se utiliza aquí, el término "complementario" a un ARN diana (o región diana del mismo), y el porcentaje de "complementariedad" de la secuencia de la sonda a la de la secuencia de ARN diana es el porcentaje de "identidad" a la secuencia de ARN diana o al complemento inverso de la secuencia del ARN diana. Al determinar el grado de "complementariedad" entre las sondas utilizadas en las composiciones descritas en el presente documento (o sus regiones) y un ARN diana, como los descritos en el presente documento, el grado de "complementariedad" se expresa como el porcentaje de identidad entre la secuencia de la sonda (o región de la misma) y la secuencia del ARN diana o el complemento inverso de la secuencia del ARN diana que mejor se alinea con la misma. El porcentaje se calcula contando el número de bases alineadas que son idénticas entre las 2 secuencias, dividiendo por el número total de nucleótidos contiguos en la sonda y multiplicando por 100. Cuando se usa el término "complementario", el oligonucleótido en cuestión es al menos 90% complementario a la molécula diana, a menos que se indique lo contrario. En algunas realizaciones, el oligonucleótido sujeto es al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99%, o 100% complementario a la molécula diana.

[0046] Un "cebador" o "sonda" tal como se utiliza aquí, se refiere a un oligonucleótido que comprende una región que es complementaria a una secuencia de al menos 8 nucleótidos contiguos de una molécula de ácido nucleico diana, tal como un ARNm o un ADN transcrito inversamente de un ARNm. En algunas realizaciones, un cebador o sonda comprende una región que es complementaria a una secuencia de al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29, o al menos 30 nucleótidos contiguos de una molécula diana. Cuando un cebador o sonda comprende una región que es "complementaria a al menos x nucleótidos contiguos de una molécula diana", el cebador o la sonda es al menos 95% complementario a al menos x nucleótidos contiguos de la molécula diana. En algunas realizaciones, el cebador o la sonda es al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99%, o el 100% complementario a la molécula diana.

[0047] Una "muestra", como se usa aquí, incluye muestras de orina (incluyendo muestras derivadas de las muestras de orina), y otros tipos de muestras humanas. Como se usa en el presente documento, las muestras de orina incluyen, pero no se limitan a, orina completa, una muestra que comprende células de una muestra de orina, una muestra que comprende el sedimento celular aislado por centrifugación de una muestra de orina, una muestra que comprende células aisladas por filtración de una orina muestra, y similares. En algunas realizaciones, una muestra de orina comprende un conservante, tal como un conservante que causa daño, tal como lisis, de glóbulos rojos y/o blancos. En algunas realizaciones, una muestra es una muestra de lavado de vejiga.

[0048] Como se usa en este documento, "hormona liberadora de corticotropina" o "CRH" se refiere a un ARNm que codifica CRH, así como la proteína de CRH. En algunas realizaciones, CRH es CRH humana. Secuencias no limitantes de CRH de ARNm humanos ejemplares se encuentran en GenBank n° de acceso NM_000756, y en SEQ ID NO: 1.

[0049] Como se usa en este documento, "factor de crecimiento similar a la insulina 2" o "IGF2" se refiere a un ARNm que codifica IGF2, así como la proteína IGF2. En algunas realizaciones, IGF2 es IGF2 humano. Las secuencias de ARNm de IGF2 humano ejemplares no limitantes se muestran en las SEQ ID NO: 2 a 4.

[0050] Como se usa en este documento, "queratina 20" o "KRT20" se refiere a un ARNm que codifica KRT20, así como la proteína KRT20. En algunas realizaciones, KRT20 es KRT20 humano. Secuencias de KRT20 no limitantes de ARNm humanos ejemplares se encuentran en GenBank n° de acceso NM_019010, y en SEQ ID NO: 5.

[0051] Como se usa en este documento, "A10 anexina" o "genes ANXA10" se refiere a un ARNm que codifica genes ANXA10, así como la Proteína ANXA10. En algunas realizaciones, ANXA10 es ANXA10 humano. Se encuentran secuencias de ARNm de ANXA10 humano no limitativas a modo de ejemplo en el número de acceso de GenBank NM_007193 y en la SEQ ID NO: 6.

[0052] Como se usa en este documento, "receptor de andrógenos" o "AR" se refiere a un ARNm que codifica AR, así como la proteína de AR. En algunas realizaciones, AR es AR humana. Secuencias AR ARNm no limitantes ejemplares humanas se encuentran en GenBank números de acceso NM_000044 y NM_001011645, y en SEQ ID NOs:. 49 y 57.

[0053] Como se usa en este documento, "uroplakin 1B" o "UPK1B" se refiere a un ARNm que codifica UPK1B, así como la proteína UPK1B. En algunas realizaciones, UPK1B es UPK1B humano. Las secuencias de ARNm de UPK1B humanas ejemplares no limitantes se encuentran en el número de acceso de GenBank NM_006952 y en la SEQ ID NO: 50.

[0054] Como se usa en este documento, "uroplakin 2" o "UPK2" se refiere a un ARNm que codifica UPK2, así como la proteína UPK2. En algunas realizaciones, UPK2 es UPK2 humano. Secuencias no limitantes de UPK2 de ARNm humanos ejemplares se encuentran en GenBank Accession n° NM_006760,3. y en SEQ ID NO: 58.

[0055] Como se usa en este documento, "antígeno 5 que expresa meningioma" o "MGEA5" se refiere a un ARNm que codifica MGEA5, así como la proteína MGEA5. En algunas realizaciones, MGEA5 es MGEA5 humano. Se encuentran secuencias de ARNm de MGEA5 humanas no limitativas a modo de ejemplo en los números de acceso de GenBank NM_001142434.1 y NM_012215,3. y en las SEQ ID NO: 59 y 60.

[0056] Como se usa en este documento, "fosfatidilinositol-4,5-bifosfato 3-quinasa, subunidad catalítica alfa" o "PIK3CA" se refiere a un ARNm que codifica PIK3CA, así como la proteína PIK3CA. En algunas realizaciones, PIK3CA es PIK3CA humano. Las secuencias de ARNm de PIK3CA humanas no limitantes ejemplares se encuentran en el número de acceso de GenBank NM_006218.2, y en la SEQ ID NO: 61.

[0057] Un "control endógeno," tal como se utiliza aquí, se refiere a un resto que está naturalmente presente en la muestra a ser utilizado para la detección, y que se puede utilizar para normalizar los niveles de los marcadores de cáncer de vejiga descritas en este documento (incluyendo, pero no limitado a, AR, UPK1B, CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10). Por lo tanto, un control endógeno es típicamente un resto que está presente en niveles similares de célula a célula, y en niveles similares en células de sujetos con cáncer de vejiga y células de sujetos sin cáncer de vejiga. En algunas realizaciones, un control endógeno es un ARN (tal como un ARNm, ARNt, ARN ribosómico, etc.). Los controles endógenos ejemplares no limitativos incluyen ARNm de ABL, ARNm de GUSB, ARNm de GAPDH, ARNm de TUBB y ARNm de UPK1a. Se encuentran secuencias de ARNm ABL humanas ejemplares no limitantes en el número de acceso de GenBank NM_007313, y en la SEQ ID NO: 7. En algunas realizaciones, se selecciona un control endógeno que puede detectarse de la misma manera que se detectan los marcadores de cáncer de vejiga y, en Algunas realizaciones, simultáneamente con los marcadores de cáncer de vejiga. En algunas realizaciones, además de ser un control endógeno indicativo de suficiencia de la muestra (es decir, indicativo de un número suficiente de células en una muestra para detectar niveles de los marcadores de cáncer de vejiga), un control endógeno también puede indicar niveles elevados de células uroteliales en una muestra, que en sí misma puede ser un indicador de cáncer de vejiga.

[0058] Un "control exógeno", como se usa aquí, se refiere a un resto que se añade a una muestra para ser utilizado para la detección. Normalmente, se selecciona un control exógeno que no se espera que esté presente en la muestra para ser utilizado para la detección, o está presente en niveles muy bajos en la muestra, de modo que la cantidad del resto naturalmente presente en la muestra es indetectable o es detectable a un nivel mucho más bajo que la cantidad agregada a la muestra como un control exógeno. En algunas realizaciones, un control exógeno comprende una secuencia de nucleótidos que no se espera que esté presente en el tipo de muestra utilizada para la detección de los marcadores de cáncer de vejiga. En algunas realizaciones, un control exógeno comprende una secuencia de nucleótidos que no se sabe que esté presente en la especie de la que se toma la muestra. En algunas realizaciones, un control exógeno comprende una secuencia de nucleótidos de una especie diferente a la del sujeto de quien se tomó la muestra. En algunas realizaciones, un control exógeno comprende una secuencia de nucleótidos que no se sabe que esté presente en ninguna especie. En algunas realizaciones, se selecciona un control exógeno que puede detectarse de la misma manera que se detectan los marcadores de cáncer de vejiga y, en algunas realizaciones, simultáneamente con los marcadores de cáncer de vejiga. En algunas realizaciones, un control exógeno es un ARN. En algunas realizaciones, un ARN es un ARN blindado, que comprende ARN empaquetado en una capa protectora de bacteriófagos. Véase, por ejemplo, WalkerPeach et al., Clin. Chem. 45:12: 2079-2085 (1999).

[0059] En las secuencias de la presente memoria, "U" y "T" se usan de forma intercambiable, de tal manera que ambas letras indican un uracilo o timina en esa posición. Un experto en la materia entenderá por el contexto y/o el uso previsto si un uracilo o timina está destinado y/o debe usarse en esa posición en la secuencia. Por ejemplo, un experto en la técnica entendería que las moléculas de ARN nativas incluyen típicamente uracilo, mientras que las moléculas de ADN nativas incluyen típicamente timina. Por lo tanto, cuando una secuencia de ARN incluye "T", un experto en la técnica entendería que esa posición en el ARN nativo es probablemente un uracilo.

[0060] En la presente descripción, "una secuencia seleccionada de" abarca tanto "una secuencia seleccionada de" como "una o más secuencias seleccionadas de". Por lo tanto, cuando se usa "una secuencia seleccionada de", se debe entender que se puede elegir una o más de las secuencias enumeradas.

[0061] En la presente descripción, un método que comprende la detección de un "conjunto de marcadores de cáncer de vejiga que consisten en" implica la detección de sólo los marcadores de cáncer de vejiga del conjunto, y ningunos marcadores adicionales de cáncer de vejiga. El método puede comprender componentes o pasos adicionales, sin embargo, como la detección de controles endógenos y/o exógenos. De manera similar, un método o composición que comprende "un conjunto de pares de cebadores marcadores de cáncer de vejiga" y/o "un conjunto de sondas de marcadores de cáncer de vejiga" puede incluir pares de cebadores y/o sondas solo para los marcadores de cáncer de vejiga del conjunto, y no para cualquier otro marcador de cáncer de vejiga. El método o composición puede comprender componentes adicionales, sin embargo, tales como uno o más pares de cebadores de control endógenos y/o uno o más pares de cebadores de control exógenos.

4.2. Detección de cáncer de vejiga

[0062] Los presentes inventores han desarrollado un ensayo para la detección de cáncer de vejiga que implica la detección del receptor de andrógenos (AR) y/o uroplakin 1B (UPK1B), y opcionalmente, al menos un marcador seleccionado de ^cR^h, IGF2, KRT20 ANXA10, UPK2, MGEA5, y PIK3A. Los ensayos descritos actualmente tienen varias ventajas sobre los diagnósticos existentes y previamente descritos para el cáncer de vejiga. Por ejemplo, los ensayos actuales no se basan en la citología, que puede ser costosa y requiere de citólogos capacitados para una interpretación precisa de los resultados. En su lugar, los ensayos actuales se basan en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se pueden llevar a cabo de manera sustancialmente automatizada, por ejemplo, utilizando el sistema GeneXpert® (Cepheid, Sunnyvale, CA). Los ensayos actuales se pueden completar en menos de 3 horas, y en algunas realizaciones, en menos de 2 horas, utilizando un sistema automatizado, por ejemplo, el sistema GeneXpert®. Las pruebas existentes pueden requerir varios días para que un laboratorio complete y envíe los resultados. Además, el presente ensayo puede llevarse a cabo en volúmenes mucho más pequeños de orina (en algunas realizaciones, 5 ml o menos). Por lo tanto, los ensayos actuales, que se basan en la PCR en lugar de la citología, permiten una reacción rápida en un solo recipiente para el diagnóstico del cáncer de vejiga, que en muchos casos se puede realizar en el punto de atención utilizando un sistema automatizado como GeneXpert®.

4.2.1. Metodos generales

[0063] Se proporcionan composiciones y métodos como se definen en las reivindicaciones, para detectar cáncer de vejiga. En algunas realizaciones, se proporcionan composiciones y métodos para detectar cáncer de vejiga de bajo grado. En algunas realizaciones, se proporcionan composiciones y métodos para detectar cáncer de vejiga de alto grado. En algunas realizaciones, se proporcionan composiciones y métodos para controlar la recurrencia del cáncer de vejiga.

[0064] En algunas realizaciones, un método para detectar el cáncer de vejiga comprende detectar el nivel de AR en una muestra. En algunas realizaciones, un método para detectar cáncer de vejiga comprende detectar el nivel de UPK1B en una muestra. En algunas realizaciones, un método para detectar cáncer de vejiga comprende detectar el nivel de AR y UPK1B en una muestra. En algunas realizaciones, un método para detectar cáncer de vejiga comprende detectar el nivel de al menos un marcador adicional seleccionado de CRH, IGF2, KRT20 ANXA10, UPK2, MGEA5 y PIK3A. En algunas realizaciones, un método para detectar cáncer de vejiga comprende detectar los niveles de un conjunto de marcadores de cáncer de vejiga que comprenden, o consisten en, AR, CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10; o UPK1B, CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10; o AR, CRH, IGF2 y KRT20; o UPK1B, CRH, IGF2 y KRT20; o UPK1B, CRH, IGF2 y ANXA10.

[0065] En algunas realizaciones, un método de detección de cáncer de vejiga comprende además detectar el nivel de al menos un control endógeno. En algunas realizaciones, un método para detectar cáncer de vejiga comprende además detectar el nivel de al menos un control exógeno. En algunas realizaciones, un método para detectar cáncer de vejiga comprende además detectar los niveles de al menos un control endógeno y al menos un control exógeno.

[0066] En algunas realizaciones, un método para detectar el cáncer de vejiga comprende detectar el nivel de AR ARNm en una muestra. En algunas realizaciones, un método para detectar cáncer de vejiga comprende detectar el nivel de ARNm de UPK1B en una muestra. En algunas realizaciones, un método para detectar cáncer de vejiga comprende detectar el nivel de ARNm de AR y ARNm de UPK1B en una muestra. En algunas realizaciones, un método para detectar cáncer de vejiga comprende detectar el nivel de al menos un marcador adicional seleccionado de ARNm de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10. En algunas realizaciones, un método para detectar cáncer de vejiga comprende detectar los niveles de un conjunto de marcadores de cáncer de vejiga que comprenden, o consisten en, ARN de AR, CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10; o UPK1B, CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10 ARNm; o ARN de AR, CRH, IGF2 y KRT20; o UPK1B, CRH, IGF2 y KRT20 ARNm; o UPK1B, CRH, IGF2 y ANXA10 ARNm.

[0067] En algunas realizaciones, un método de detección de cáncer de vejiga comprende además detectar el nivel de al menos un ARN de control endógeno. En algunas realizaciones, un método para detectar cáncer de vejiga comprende además detectar el nivel de al menos un ARN de control exógeno. En algunas realizaciones, un método para detectar cáncer de vejiga comprende además detectar los niveles de al menos un ARN de control endógeno y al menos un ARN de control exógeno.

[0068] En la presente descripción, el término "ARN diana" se usa por conveniencia para referirse a AR y UPK1B, y también para otros ARN diana, tales como CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5, y PIK3A mRNAs y ARN de control exógenos y/o endógenos. Por lo tanto, se debe entender que cuando se presenta una discusión en términos de un ARN diana, esa discusión se destina específicamente a abarcar AR, UPK1B, CRH, IGF2, KRT20 ANXA10, UPK2, MGEA5 y PIK3A, y/u otros ARNs diana.

[0069] En algunas realizaciones, el nivel de uno o más ARN diana se detecta en una muestra de orina. En algunas realizaciones, el nivel de uno o más ARN diana se determina en una muestra de orina que se ha conservado de una manera que causa daño, como lisis, a glóbulos rojos y/o glóbulos blancos. En algunas realizaciones, el nivel de uno o más ARN diana se detecta en células uroteliales aisladas de una muestra de orina, con o sin tratamiento conservante. En algunas realizaciones, las células uroteliales se aíslan por filtración.

[0070] La detección de un nivel elevado de ARNm de AR en una muestra de un sujeto indica la presencia de cáncer de vejiga en el sujeto. La detección de un nivel elevado de UPK1B en una muestra de un sujeto indica la presencia de cáncer de vejiga en el sujeto. En algunas realizaciones, la detección de un nivel elevado de uno o más ARN diana seleccionados de CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 y PIK3A en la muestra de un sujeto indica la presencia de cáncer de vejiga en el sujeto. La detección se puede hacer cuantitativamente. La detección se puede hacer cualitativamente. En algunas realizaciones, la detección de un ARN diana comprende la formación de un complejo que comprende un polinucleótido y un ácido nucleico seleccionado de un ARN diana, un amplicón de ADN de un Ar N diana y un complemento de un ARN diana. En algunas realizaciones, la detección de un ARN diana comprende TA-PCR. En algunas realizaciones, la detección de un ARN diana comprende TA-PCT cuantitativa. En algunas realizaciones, el nivel del ARN diana se compara con un nivel normal o de control del ARN diana.

[0071] En algunas realizaciones, los niveles de ARN diana, como AR, UPK1B, CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5, y ARNm PIK3A, se puede medir en muestras recogidas en una o más veces de un paciente a controlar el estado o la progresión del cáncer de vejiga en el paciente. En algunas realizaciones, un paciente con un historial de cáncer de vejiga, como un historial de cáncer de vejiga de bajo grado o un historial de cáncer de vejiga de alto grado, se monitorea detectando los niveles de AR y/o ARNm de UPK1B, y opcionalmente al menos uno ARNm seleccionado de CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 y PIK3A, a intervalos regulares o semi-regulares. En algunas de tales realizaciones, el paciente es monitoreado detectando los niveles de los ARN diana al menos una vez al mes, al menos una vez cada dos meses, al menos una vez cada tres meses, al menos una vez cada cuatro meses, al menos una vez cada cinco meses, al menos una vez cada seis meses, al menos una vez cada nueve meses, al menos una vez al año o al menos una vez cada dos años.

[0072] En algunas realizaciones, los niveles de ARN diana, como UPK1B, CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5, y ARNm PIK3A, se pueden medir en muestras recogidas en una o más veces de un paciente para monitorizar la respuesta a la terapia anti-andrógenos. Los agentes antiandrógenos ejemplares no limitativos incluyen flutamida (Eulexin®), bicalutamida (Casodex®) y nilutamida (Nilandron®). En algunas realizaciones, un paciente sometido a terapia con antiandrógenos para el cáncer de vejiga se monitoriza detectando los niveles de ARNm de AR y/o UPK1B, y opcionalmente al menos un ARNm seleccionado de CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 y PIK3A, a intervalos regulares o semi-regulares. En algunas de tales realizaciones, el paciente es monitoreado detectando los niveles de los ARN diana al menos una vez al mes, al menos una vez cada dos meses, al menos una vez cada tres meses, al menos una vez cada cuatro meses, al menos una vez cada cinco meses, al menos una vez cada seis meses, al menos una vez cada nueve meses, al menos una vez al año o al menos una vez cada dos años. Una reducción en el nivel de AR y/o UPK1B durante el tratamiento indica que el cáncer de vejiga está respondiendo a la terapia antiandrogénica.

[0073] En algunas realizaciones, una muestra a ensayar es una muestra de orina (p. ej., una muestra de orina evacuada), o se deriva de una muestra de orina. En algunas realizaciones, se agrega un conservante a la muestra de orina, por ejemplo, para dañar (p. ej., lisar) los glóbulos rojos y/o blancos presentes en la muestra de orina. Dañando o lisando los glóbulos rojos y/o blancos antes del aislamiento de las células uroteliales, se puede reducir la contaminación por los glóbulos rojos y/o blancos. En algunas realizaciones, la muestra de orina se centrifuga para concentrar las células uroteliales. En algunas realizaciones, la muestra de orina se filtra para aislar las células uroteliales de otros materiales de orina y conservantes. En algunas de estas realizaciones, el filtro es parte de un cartucho GeneXpert (Cepheid, Sunnyvale, CA).

[0074] En algunas realizaciones, se utilizan menos de 5 ml, menos de 4 ml, menos de 3 ml, o menos de 2 ml de orina en los métodos actuales. En algunas realizaciones, la muestra de orina se analiza sin un paso de centrifugación. Así, en algunas realizaciones, los presentes métodos se llevan a cabo en ausencia de centrifugación. En algunas realizaciones, se puede usar un mayor volumen de orina, y en algunas de tales realizaciones, se puede usar una etapa de centrifugación para concentrar las células uroteliales antes del análisis.

[0075] Se da a conocer que la muestra a ensayarse es otro fluido corporal, tal como sangre, esputo, mucosidad, saliva, semen, etc. Por ejemplo sangre, tal como sangre entera, células sanguíneas, plasma o suero.

[0076] La muestra clínica a ensayarse, en algunas realizaciones, es fresca (es decir, nunca congelada). En otras realizaciones, la muestra es una muestra congelada. Se divulga que la muestra es una muestra de tejido, como una muestra incluida en parafina fijada con formalina o la muestra es una muestra de citología líquida.

[0077] En algunas realizaciones, los métodos descritos aquí se utilizan para la detección temprana de cáncer de vejiga en una muestra de células uroteliales, tales como las obtenidas de la orina evacuada. En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento se utilizan para controlar la recurrencia del cáncer de vejiga utilizando una muestra de células uroteliales, como las obtenidas a partir de orina evacuada.

[0078] En algunas realizaciones, la muestra a ensayarse se obtiene de un individuo que tiene uno o más de los siguientes factores de riesgo: historia de tabaquismo, hematuria, la historia de la vejiga o de otros tipos de cáncer, y la exposición a carcinógenos conocidos, tales como benceno. En algunas realizaciones, la muestra se obtiene de un individuo que tiene signos de diagnóstico o síntomas clínicos que pueden estar asociados con cáncer de vejiga, como sangre en la orina, micción frecuente, urgencia urinaria, incontinencia, dificultad para orinar, dolor abdominal, pérdida de peso inexplicable y/o pérdida de apetito. En algunas realizaciones, la muestra a analizar se obtiene de un individuo que previamente ha sido diagnosticado con cáncer de vejiga de grado bajo o grado alto. En algunas de tales realizaciones, se monitoriza al individuo para detectar la recurrencia del cáncer de vejiga.

[0079] El cáncer de vejiga se puede dividir en etapas, que indican la estructura de crecimiento del tumor principal. La tabla A muestra las etapas del cáncer de vejiga según el American Joint Committee on Cancer (AJCC). Las etapas mostradas cubren solo la porción "T" del sistema "TNM". La porción "T" se refiere al tumor primario, mientras que "N" se refiere a la propagación del cáncer a los ganglios linfáticos, y la "M" se refiere a si el cáncer se ha metastatizado a sitios distantes.

Tabla A: Etapas del cáncer de vejiga

[0080] En algunas realizaciones, los métodos descritos en este documento pueden utilizarse para el cribado de rutina de los individuos sanos sin factores de riesgo. En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento se utilizan para seleccionar individuos asintomáticos que tienen uno o más de los factores de riesgo descritos anteriormente.

[0081] En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento se pueden usar para detectar el cáncer de vejiga de bajo grado. En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para detectar cáncer de vejiga de alto grado. En algunas realizaciones, los métodos descritos en este documento detectan al menos el 15%, al menos el 17%, al menos el 20%, al menos el 22%, al menos el 25%, al menos el 27%, al menos el 30%, al menos el 31%, a al menos el 32%, al menos el 33%, al menos el 34% o al menos el 35% de los cánceres de vejiga de bajo grado. En algunas realizaciones, los métodos descritos en este documento detectan al menos el 85%, al menos el 87%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, a al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% de cánceres de vejiga de alto grado.

[0082] En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para evaluar la eficacia de un tratamiento para el cáncer de vejiga en un paciente. En algunas realizaciones, los niveles de ARN diana, tales como los niveles de ARNm de AR y/o UPK1B, y opcionalmente, se determinan al menos un ARNm seleccionado de CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, ^uP^k2, MGEA5 y PIK3A, en varias veces durante el tratamiento, y se comparan con los niveles de ARN diana de una muestra de archivo tomada del paciente antes del inicio del tratamiento. En algunas realizaciones, los niveles de ARN diana se comparan con los niveles de ARN diana de una muestra normal de archivo tomada del paciente. Idealmente, los niveles de ARN diana en la muestra normal no evidencian cambios aberrantes en los niveles de ARN diana.

[0083] En algunas realizaciones, el uso de los niveles de AR y/o ARNm UPK1B, y opcionalmente, al menos un ARNm seleccionado de CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPk2, MGEA5, y PIK3A, para el seguimiento de la recurrencia de cáncer de vejiga es previsto. En algunas realizaciones, un nivel elevado de uno o más, dos o más, tres o más, o cuatro o más, cinco o más, o los seis ARNm indican que el cáncer de vejiga ha recurrido en el paciente.

[0084] En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, los niveles de ARN se pueden detectar al mismo tiempo o simultáneamente en las mismas o separadas reacciones de ensayo. En algunas realizaciones, los niveles de ARN se detectan en diferentes momentos, por ejemplo, en reacciones de ensayo en serie.

[0085] En algunas realizaciones, un método comprende la detección de los niveles de AR y/o ARNm UPK1B, y opcionalmente, al menos un ARNm seleccionado de CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5, y PIK3A en una muestra de un sujeto en donde la detección de un nivel de cualquiera de los ARNm que es mayor que un nivel normal del ARN indica la presencia de cáncer de vejiga en el sujeto. En algunas realizaciones, la detección de niveles elevados de dos, tres, cuatro, cinco o seis ARNm marcadores de cáncer de vejiga indica la presencia de cáncer de vejiga en el sujeto. En algunas realizaciones, la detección de niveles elevados de al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco de los ARNm marcadores de cáncer de vejiga indica un mayor riesgo de cáncer de vejiga de alto grado.

[0086] En algunas realizaciones, se proporciona un método para facilitar el diagnóstico de cáncer de vejiga en un sujeto. Dichos métodos comprenden la detección del nivel de ARNm de AR y/o UPK1B y, opcionalmente, al menos un ARNm seleccionado de CrH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 y PIK3A en una muestra del sujeto. En algunas realizaciones, la información concerniente a los niveles de ARNm de AR y/o UPK1B y, opcionalmente, al menos un ARNm seleccionado de CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 y PIK3A en la muestra del sujeto se comunica a un médico facultativo. Un "profesional médico", como se usa en este documento, se refiere a un individuo o entidad que diagnostica y/o trata a pacientes, como un hospital, una clínica, un consultorio médico, un médico, una enfermera o un agente de cualquiera de las mencionadas entidades y particulares. En algunas realizaciones, la detección de los niveles de ARNm de AR y/o UPK1B y, opcionalmente, al menos un ARNm seleccionado de CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 y PIK3A se lleva a cabo en un laboratorio que ha recibido la muestra del sujeto del médico o agente del médico. El laboratorio lleva a cabo la detección por cualquier método, incluidos los descritos en este documento, y luego comunica los resultados al médico. Un resultado se "comunica", como se usa en este documento, cuando se proporciona por cualquier medio al médico. Dicha comunicación puede ser oral o escrita, puede ser por teléfono, en persona, por correo electrónico, por correo o por otro servicio de mensajería, o puede realizarse depositando directamente la información en, por ejemplo, una base de datos accesible por el médico, incluidas las bases de datos no controladas por el médico. La información puede ser mantenida en formato electrónico. La información se puede almacenar en una memoria u otro medio legible por computadora, como RAM, ROM, EEPROM, memoria flash, chips de computadora, discos de video digital (DVD), discos compactos (CD), unidades de disco duro (HDD), cinta magnética, etc.

[0087] Se proporcionan métodos de detección de la presencia del cáncer de vejiga. En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para diagnosticar el cáncer de vejiga. En algunas realizaciones, el método comprende obtener una muestra de un sujeto y proporcionar la muestra a un laboratorio para la detección de niveles de ARNm de AR y/o UPK1B, y opcionalmente, al menos un ARNm seleccionado de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10 en la muestra. En algunas realizaciones, el método comprende además recibir una comunicación del laboratorio que indica el nivel de ARNm de AR y/o UPK1B, y opcionalmente, al menos un ARNm seleccionado de CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 y PIK3A en la muestra. El cáncer de vejiga puede estar presente si el nivel de cualquiera de los cuatro ARNm es mayor que el nivel normal o de control del ARNm. Un "laboratorio", como se usa en este documento, es cualquier instalación que detecta los niveles de ARN diana en una muestra por cualquier método, incluidos los métodos descritos en este documento, y que comunica el nivel a un médico. El laboratorio puede estar bajo el control de un médico. El laboratorio no puede estar bajo el control del médico.

[0088] Cuando un laboratorio comunica el nivel de un ARN diana a un médico el laboratorio puede comunicar un valor numérico que representa el nivel del ARN en la muestra, con o sin proporcionar un valor numérico para un nivel normal. El laboratorio puede comunicar el nivel del ARN proporcionando un valor cualitativo, como "alto", "bajo", "elevado", "disminuido", "positivo" (como "AR positivo" o "AR y CRH positivo"), etc. El laboratorio puede comunicar un diagnóstico sugerido, como "cáncer de vejiga positivo" o "positivo para el cáncer" y similares; o simplemente "cáncer positivo" o "cáncer negativo".

[0089] Como se usa en el presente documento, cuando un método se refiere a la detección de cáncer de vejiga, determinar la presencia de cáncer de vejiga, el seguimiento para el cáncer de vejiga, y/o el diagnóstico de cáncer de vejiga, el método incluye actividades en las que las etapas del procedimiento se llevan a cabo, pero el resultado es negativo por la presencia de cáncer de vejiga. Es decir, detectar, determinar, monitorear y diagnósticar el cáncer de vejiga incluyen casos de llevar a cabo los métodos que dan resultados positivos o negativos.

[0090] En algunas realizaciones, más de un ARN se detecta simultáneamente en una sola reacción. En algunas realizaciones, el ARNm de AR y al menos un ARNm seleccionado de CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 y PIK3A se detectan simultáneamente en una sola reacción. En algunas realizaciones, el ARNm de UPK1B y al menos un ARNm seleccionado de CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 y PIK3A se detectan simultáneamente en una sola reacción. En algunas realizaciones, el ARNm de AR y UPK1B y al menos un ARNm seleccionado de CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 y PIK3A se detectan simultáneamente en una sola reacción. En algunas realizaciones, al menos un control endógeno y/o al menos un control exógeno se detectan simultáneamente con los marcadores de cáncer de vejiga en una sola reacción.

4.2.2. Controles ejemplares

[0091] En algunas realizaciones, un nivel normal (un "control") de un ARN diana, tal como AR y/o ARNm UPK1B, y opcionalmente, por lo menos un ARNm seleccionado de CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5, y PIK3A, se puede determinar como un nivel o rango promedio que es característico de las células uroteliales normales u otro material de referencia, contra el cual se puede comparar el nivel medido en la muestra. El promedio o rango determinado de un ARN diana en sujetos normales puede usarse como punto de referencia para detectar niveles superiores al normal del ARN diana que son indicativos de cáncer de vejiga. En algunas realizaciones, los niveles normales de un ARN diana se pueden determinar utilizando muestras individuales o combinadas que contienen ARN de uno o más individuos, como a partir de células uroteliales normales aisladas de la orina de individuos sanos.

[0092] En algunas realizaciones, la determinación de un nivel normal de un ARN diana comprende detectar un complejo que comprende un polinucleótido para la detección hibridado a un ácido nucleico seleccionado de un ARN diana, un amplicón de ADN del ARN diana, y un complemento del ARN diana. Es decir, en algunas realizaciones, un nivel normal puede determinarse detectando un amplificador de ADN del ARN diana, o un complemento del ARN diana en lugar del propio ARN diana. En algunas realizaciones, un nivel normal de tal complejo se determina y se usa como control. El nivel normal del complejo, en algunas realizaciones, se correlaciona con el nivel normal del ARN diana. Por lo tanto, cuando se discute un nivel normal de un objetivo en el presente documento, ese nivel puede, en algunas realizaciones, determinarse detectando tal complejo.

[0093] En algunas realizaciones, un nivel normal de un ARN diana es, o ha sido, determinado por el mismo método que el nivel del ARN diana de una muestra de paciente. En algunas de tales realizaciones, el método es TA-PCR (tal como TA-PCR en tiempo real, TA-PCR cuantitativa, etc.).

[0094] En algunas realizaciones, un control comprende ARN de las células de un solo individuo, por ejemplo, a partir de células uroteliales normales aislados de la orina de un individuo sano. En algunas realizaciones, un control comprende ARN de sangre, tal como sangre entera o suero, de un solo individuo. En algunas realizaciones, un control comprende ARN de un conjunto de células de múltiples individuos. En algunas realizaciones, un control comprende ARN de un conjunto de orina de múltiples individuos. En algunas realizaciones, un control comprende ARN humano disponible comercialmente (véase, por ejemplo, Ambion). En algunas realizaciones, un nivel normal o un rango normal ya se ha predeterminado antes de ensayar una muestra para un nivel elevado.

[0095] En algunas realizaciones, el nivel normal de un ARN diana puede determinarse a partir de una o más líneas celulares continuas, típicamente líneas celulares demostradas previamente para tener niveles de ARN que se aproximan a los niveles en las células uroteliales normales.

[0096] En algunas realizaciones, la cuantificación de los niveles de ARN diana requiere que se hagan deducciones sobre el ARN total por célula y el grado de pérdida de la muestra durante la preparación de la muestra. Para corregir las diferencias entre diferentes muestras o entre muestras que se preparan en diferentes condiciones, las cantidades de ARN diana en algunas realizaciones se normalizan a los niveles de al menos un control endógeno y/o al menos un control exógeno.

[0097] En algunas realizaciones, un ARN de control es un ARN de control endógeno. Un ARN de control endógeno puede ser cualquier ARN adecuado para el propósito, por ejemplo, los ARN que están presentes en niveles aproximadamente constantes de célula a célula y en células uroteliales de pacientes con cáncer de vejiga y con cáncer no vesical. Los ARN de control endógeno ejemplares no limitativos incluyen ABL, GUSB, GAPDH, TUBB y UPK1a. En algunas realizaciones, un control endógeno se usa para la normalización. En algunas realizaciones, se usa más de un control endógeno para la normalización. En algunas realizaciones, un control endógeno también puede indicar niveles elevados de células uroteliales en una muestra, lo que puede ser un indicador de cáncer de vejiga. Por lo tanto, en algunas realizaciones, un control endógeno puede no solo indicar la suficiencia de la muestra, sino que también puede indicar un número elevado de células en una muestra de orina, que en sí misma es un indicador de cáncer de vejiga.

[0098] En algunas realizaciones, un ARN de control es un ARN de control exógeno. En algunas de tales realizaciones, el ARN de control exógeno es un Armored RNA®, que está protegido por un revestimiento de bacteriófagos. Se puede usar un ARN de control exógeno, en algunas realizaciones, para determinar si la reacción del ensayo de detección ha fallado y, por lo tanto, los resultados no son significativos. Por ejemplo, si un ARN de control exógeno no se amplifica en la reacción de ensayo, es probable que un resultado negativo para los ARN diana no sea significativo porque los niveles reflejan la falla de la reacción en lugar de que los niveles de ARN diana sean bajos. La falla de la reacción puede ocurrir por varios motivos, entre los que se incluyen, entre otros, la presencia de un inhibidor de la reacción en la muestra (una "muestra inhibitoria"), reactivos comprometidos, la presencia de una RNAsa, etc. Un control de RNA exógeno se puede agregar en cualquier etapa de la recolección y análisis de la muestra. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el ARN de control exógeno se agrega a la muestra en el momento en que se agrega el conservante, se agrega a la muestra cuando es recibido por el laboratorio de diagnóstico, se agrega a la muestra inmediatamente antes del análisis o se agrega a la muestra durante el análisis (como ejemplo no limitativo, durante o después de la lisis de las células uroteliales pero antes de la adición de los reactivos de amplificación).

[0099] En algunas realizaciones, el nivel de un ARN diana, tal como AR, UPK1B, CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5, o ARNm PIK3A, se compara con un nivel de referencia, por ejemplo, de un confirmado cáncer de vejiga. En algunas de estas realizaciones, un nivel similar de un ARN diana en relación con la muestra de referencia indica cáncer de vejiga.

[0100] En algunas realizaciones, un nivel de un ARN diana, tal como AR, UPK1B, CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5, o ARNm PIK3A, que es al menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% más que un nivel normal del respectivo ARN diana indica la presencia de cáncer de vejiga. En algunas realizaciones, un nivel de un ARN diana, como AR, UPK1B, CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 o PIK3A, que es al menos aproximadamente el doble, al menos aproximadamente el triple al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 6 veces, al menos aproximadamente 7 veces, al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 9 veces, o al menos aproximadamente 10 veces mayor que Un nivel normal del respectivo ARN diana indica la presencia de cáncer de vejiga.

[0101] En algunas realizaciones, un nivel de control de un ARN diana, como AR, UPK1B, CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 o PIK3A, se determina simultáneamente, como en el mismo ensayo o lote de ensayos, como el nivel del ARN diana en una muestra. En algunas realizaciones, un nivel de control de un ARN diana no se determina simultáneamente como el nivel del ARN diana en una muestra. En algunas de tales realizaciones, el nivel de control se ha determinado previamente.

[0102] En algunas realizaciones, el nivel de un control endógeno y/o un control exógeno se determina de manera constante, como en el mismo ensayo o lote de ensayos, como el nivel del ARN diana en una muestra. En algunas realizaciones, un ensayo comprende reactivos para determinar los niveles de ARNm de AR y/o UPK1B, y opcionalmente, al menos un ARNm seleccionado de CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 y PIK3A, y un control endógeno simultáneamente en la misma reacción de ensayo. En algunas realizaciones, un ensayo comprende reactivos para determinar los niveles de ARNm de AR y/o UPK1B, y opcionalmente, al menos un ARNm seleccionado de CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 y PIK3A, y un control exógeno simultáneamente en la misma reacción de ensayo. En algunas realizaciones, un ensayo comprende reactivos para determinar los niveles de ARNm de AR y/o UpK1B, y opcionalmente, al menos un ARNm seleccionado de CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 y PIK3A, un control endógeno y un control exógeno simultáneamente en la misma reacción de ensayo. En algunas de tales realizaciones, por ejemplo, una reacción de ensayo comprende conjuntos de cebadores para amplificar AR y/o UPK1B, y opcionalmente, al menos un ARNm seleccionado de CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 y PIK3A un conjunto de cebadores para la amplificación de un control endógeno y/o un conjunto de cebadores para amplificar un control exógeno, y sondas marcadas detectables de manera detectable para detectar los productos de amplificación (como, por ejemplo, sondas TaqMan® con colorantes detectables de manera diferente para cada amplicón diferente a detectar).

[0103] En algunas realizaciones, el nivel de un ARN diana no está en comparación con un nivel de control, por ejemplo, cuando se sabe que el ARN diana está presente en niveles muy bajos, o nada en absoluto, en células normales. En tales realizaciones, la detección de un alto nivel del ARN diana en una muestra es indicativo de cáncer de vejiga.

4.2.3. Preparación ejemplar de la muestra.

4.2.3.1. Conservantes ejemplares de orina.

[0104] En algunas realizaciones, se añade un conservante para la muestra de orina. En algunas realizaciones, el conservante se agrega dentro de una hora, dos horas, tres horas o seis horas del momento en que se recogió la muestra de orina (p. ej., se anuló). En algunas realizaciones, se agrega un conservante a la muestra de orina dentro de una hora, dos horas, tres horas o seis horas antes de que la muestra se analice mediante los métodos descritos en este documento.

[0105] En algunas realizaciones, un conservante causa daño, como lisis, de glóbulos rojos y/o glóbulos blancos, pero no daña las células uroteliales. Los glóbulos rojos y/o glóbulos blancos pueden estar presentes en la orina como resultado de un tumor y/o infección. En algunas de tales realizaciones, la adición del conservante permite un enriquecimiento mejorado de las células uroteliales, por ejemplo, mediante filtración. En algunas realizaciones, un conservante disminuye el pH de la muestra de orina y mejora la solubilidad de las sales de orina. En algunas de tales realizaciones, el conservante facilita el paso de las sales a través de un filtro en una etapa de filtración. Un pH deseable de la orina conservada para pasar a través de un filtro es entre aproximadamente 2,5 y 4. En algunas realizaciones, un pH deseable de la orina conservada está entre aproximadamente 2,7 y 3,7. En algunas realizaciones, un pH deseable de orina conservada está entre aproximadamente 3 y 3,5. En algunas realizaciones, un pH deseable de orina conservada es aproximadamente 3,2.

[0106] En algunas realizaciones, se agrega un conservante de tal manera que la muestra de orina/conservante comprende clorhidrato de guanidina 0,875M a 2,625M, 0,25% a 0,75% de N-acetilo-L-cisteína, 6,25 a 18,75 mM de citrato de sodio y 0,625% de 1,875% de Tween-20, y tiene un pH de 3 a 3,5. En algunas realizaciones, se agrega un conservante de manera que la muestra de orina/conservante comprende aproximadamente 1,75 M de clorhidrato de guanidina, aproximadamente 0,5% de N-acetilo-L-cisteína, aproximadamente 12,5 mM de citrato de sodio, y aproximadamente el 1,25% de Tween-20, y tiene un pH de aproximadamente 3,2.

[0107] Un conservante comercial ejemplar no limitante es PreservCyt (Hologic, Bedford, MA).

4.2.3.2. Enriquecimiento de células ejemplar

[0108] En algunas realizaciones, las células uroteliales se enriquecen mediante centrifugación. En algunas de tales realizaciones, el sedimento celular se resuspende en el sobrenadante y/o un conservante. La resuspensión del sedimento celular se puede usar para ajustar la concentración de células en solución. El sedimento celular resuspendido se puede usar (p. ej., con lisis) en los métodos descritos en el presente documento, o se puede someter a una etapa de enriquecimiento adicional, como la filtración.

[0109] En algunas realizaciones, las células uroteliales se enriquecen por filtración. Los tamaños de poros de filtro ejemplares no limitativos que pueden ser adecuados para capturar células uroteliales incluyen 0,8 pM, 2 pM, 8 pM, y 10 pM. En algunas realizaciones, se selecciona un tamaño de poro de filtro que permite el paso o los glóbulos rojos y/o los glóbulos blancos, mientras que retiene la mayoría de las células uroteliales. En algunas realizaciones, un filtro está ubicado dentro de un cartucho GeneXpert diseñado para llevar a cabo un ensayo de diagnóstico de cáncer de vejiga descrito aquí.

4.2.3.3. Ejemplo de preparación de ARNm

[0110] ARN diana se puede preparar por cualquier método apropiado. El ARN total se puede aislar por cualquier método, incluidos, entre otros, los protocolos establecidos en Wilkinson, M. (1988) Nucl. Acidos Res. 16 (22): 10,933; y Wilkinson, M. (1988) Nucl. Acidos Res. 16 (22): 10934, o utilizando kits o reactivos disponibles en el mercado, como el reactivo TRIzol® (Invitrogen), el kit de extracción de ARN total (iNtRON Biotechnology), el kit de purificación de ARN total (Norgen Biotek Corp.), RNAqueous™ (Ambion), MagMAX™ (Ambion), RecoverAll™ (Ambion), RNeasy (Qiagen), etc.

[0111] En algunas realizaciones, los niveles de ARN se miden en una muestra en la que el ARN primero no se ha purificado a partir de las células. En algunas de tales realizaciones, las células se someten a una etapa de lisis para liberar el ARN. Los métodos de lisis ejemplares no limitativos incluyen la sonicación (p. ej., durante 2-15 segundos, 8-18 pM a 36 kHz); lisis química, por ejemplo, usando un detergente; y diversos reactivos de lisis disponibles comercialmente (como el tampón de lisis Rneasy, Qiagen). En algunas realizaciones, los niveles de ARN se miden en una muestra en la que se ha aislado ARN.

[0112] En algunas realizaciones, el ARN se modifica antes de un ARN diana, tal como AR, UPK1B, CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5, o ARNm PIK3A, se detecta. En algunas realizaciones, todo el ARN en la muestra se modifica. En algunas realizaciones, solo los ARN diana particulares a analizar se modifican, por ejemplo, de una manera específica de secuencia. En algunas realizaciones, el ARN se transcribe inversamente. En algunas de estas realizaciones, el ARN se transcribe de forma inversa utilizando la transcriptasa inversa MMLV. Las condiciones ejemplares no limitantes para la transcripción inversa de ARN usando la transcriptasa inversa MMLV incluyen la incubación de 5 a 20 minutos a 40°C a 50°C.

[0113] Cuando un ARN diana se transcribe a la inversa, se forma un complemento de ADN del ARN diana. En algunas realizaciones, el complemento de un ARN diana se detecta en lugar de un ARN diana en sí mismo (o una copia de ADN del propio ARN). Por lo tanto, cuando los métodos descritos en este documento indican que se detecta un ARN diana, o se determina el nivel de un ARN diana, dicha detección o determinación se puede llevar a cabo en un complemento de un ARN diana en lugar de, o además de, el ARN diana en sí mismo. En algunas realizaciones, cuando se detecta el complemento de un ARN diana en lugar del ARN diana, se usa un polinucleótido para la detección que es complementario al complemento del ARN diana. En algunas de estas realizaciones, un polinucleótido para detección comprende al menos una porción que es idéntica en secuencia al ARN diana, aunque puede contener timidina en lugar de uridina y/o comprender otros nucleótidos modificados.

4.2.4. Métodos analíticos ejemplares

[0114] Como se describió anteriormente, los métodos se presentan para detectar cáncer de vejiga. Los métodos comprenden la detección de un panel de marcadores de cáncer de vejiga que comprende Ar y/o UPK1B, y opcionalmente, al menos un marcador seleccionado de CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEa5 y PIK3A. En algunas realizaciones, el método comprende además detectar al menos un control endógeno y/o al menos un control exógeno. En algunas realizaciones, la detección de un nivel elevado de al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, o seis marcadores de cáncer de vejiga indica la presencia de cáncer de vejiga. En algunas realizaciones, el cáncer de vejiga es un cáncer de vejiga de bajo grado. En algunas realizaciones, el cáncer de vejiga es un cáncer de vejiga de alto grado. En algunas realizaciones, el cáncer de vejiga es una recurrencia del cáncer de vejiga en un paciente con antecedentes de cáncer de vejiga.

[0115] Cualquier procedimiento analítico capaz de permitir la detección específica y cuantificable (o semicuantificable) de un ARN diana, como AR, UPK1B, CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 y PIK3A, se puede usar en los métodos aquí presentados. Dichos procedimientos analíticos incluyen, pero no se limitan a, métodos de TA-PCR y otros métodos conocidos por los expertos en la técnica.

[0116] En algunas realizaciones, el método de detección de un ARN diana, tal como AR, UPK1B, CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5, o ARNm PIK3A, comprende la amplificación de ADNc complementario al ARN diana. Tal ejemplificación se puede lograr por cualquier método. Los métodos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, PCR en tiempo real, PCR de punto final y amplificación usando polimerasa T7 de un promotor T7 recocido a un ADNc, tal como lo proporciona el kit SenseAmp Plus™ disponible en Implen, Alemania.

[0117] Cuando se amplifica un ARN diana o un ADNc complementario a un ARN diana, en algunas realizaciones, se forma un amplicón de ADN del ARN diana. Un amplicón de ADN puede ser monocatenario o bicatenario. En algunas realizaciones, cuando un amplicón de ADN es monocatenario, la secuencia del amplicón de ADN está relacionada con el ARN diana en sentido sentido o antisentido. En algunas realizaciones, se detecta un amplicón de ADN de un ARN diana en lugar del propio ARN diana. Por lo tanto, cuando los métodos descritos en este documento indican que se detecta un ARN diana, o se determina el nivel de un ARN diana, dicha detección o determinación puede llevarse a cabo en un amplicón de ADN del ARN diana en lugar de, o además de, el ARN diana en sí mismo. En algunas realizaciones, cuando se detecta el amplicón de ADN del ARN diana en lugar del ARN diana, se usa un polinucleótido para la detección que es complementario al complemento del ARN diana. En algunas realizaciones, cuando se detecta el amplicón de ADN del ARN diana en lugar del ARN diana, se usa un polinucleótido para la detección que es complementario al ARN diana. Además, en algunas realizaciones, se pueden usar múltiples polinucleótidos para la detección, y algunos polinucleótidos pueden ser complementarios al ARN diana y algunos polinucleótidos pueden ser complementarios al complemento del ARN diana.

[0118] En algunas realizaciones, el método de detección de uno o más ARN diana, tales como el ARNm de AR y/o UPK1B, y opcionalmente, al menos un ARNm seleccionado de CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 o PIK3A, comprende TA-PCR, como se describe a continuación. En algunas realizaciones, la detección de uno o más ARN diana comprende la monitorización en tiempo real de una reacción de TA-PCR, que se puede lograr mediante cualquier método. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, el uso de TaqMan®, Baliza Molecular o sondas de Scorpion (es decir, sondas de transferencia de energía (ET), como las sondas de FRET) y el uso de tintes intercalantes, como SYBR verde, EvaGreen, tiazol naranja, YO-PRO, TO-PRO, etc.

[0119] Las condiciones ejemplares no limitantes para amplificar el ADNc que se ha transcrito de forma inversa a partir de los ARN diana son las siguientes. Un ciclo ejemplar comprende una desnaturalización inicial de 90°C a 100°C durante 2 a 5 minutos, seguido de un ciclo que comprende una desnaturalización de 90°C a 100°C durante 1 a 10 segundos, recocido a una temperatura de 60°C a 70°C durante 10 a 30 segundos, y extensión entre 60°C y 75°C durante 10 a 40 segundos. En algunas realizaciones, para el primer ciclo que sigue a la etapa de desnaturalización inicial, se omite la etapa de desnaturalización del ciclo. En algunas realizaciones, la polimerasa Taq se usa para la amplificación. En algunas realizaciones, el ciclo se lleva a cabo al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 30 veces, al menos 35 veces o al menos 45 veces. En algunas de estas realizaciones, Taq se utiliza con una función de arranque en caliente. En algunas realizaciones, la reacción de amplificación se produce en un cartucho GeneXpert, y la amplificación de los cuatro ARN diana marcadores de cáncer de vejiga se produce en la misma reacción. En algunas realizaciones, la detección de ARNm de AR y/o UPK1B, y opcionalmente, al menos un ARNm seleccionado de CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 y PIK3A se produce en menos de 3 horas, menos de 2,5 horas o menos de 2 horas, desde la desnaturalización inicial hasta la última extensión.

[0120] En algunas realizaciones, la detección de un ARN diana comprende la formación de un complejo que comprende un polinucleótido que es complementario a un ARN diana o a un complemento de la misma, y un ácido nucleico seleccionado de entre el ARN diana, un amplicón de ADN del ARN diana, y un complemento del ARN diana. De este modo, en algunas realizaciones, el polinucleótido forma un complejo con un ARN diana. En algunas realizaciones, el polinucleótido forma un complejo con un complemento del ARN diana, tal como un ADNc que se ha transcrito de forma inversa a partir del ARN diana. En algunas realizaciones, el polinucleótido forma un complejo con un amplicón de ADN del ARN diana. Cuando un amplicón de ADN de doble cadena es parte de un complejo, como se usa en este documento, el complejo puede comprender una o ambas cadenas del amplicón de ADN. Por lo tanto, en algunas realizaciones, un complejo comprende solo una hebra del amplicón de ADN. En algunas realizaciones, un complejo es un triplex y comprende el polinucleótido y ambas cadenas del amplicón de ADN. En algunas realizaciones, el complejo se forma por hibridación entre el polinucleótido y el ARN diana, complemento del ARN diana, o amplicón de ADN del ARN diana. El polinucleótido, en algunas realizaciones, es un cebador o sonda.

[0121] En algunas realizaciones, un método comprende detectar el complejo. En algunas realizaciones, el complejo no tiene que estar asociado en el momento de la detección. Es decir, en algunas realizaciones, se forma un complejo, el complejo se disocia o destruye de alguna manera, y se detectan los componentes del complejo. Un ejemplo de dicho sistema es un ensayo TaqMan®. En algunas realizaciones, cuando el polinucleótido es un cebador, la detección del complejo puede comprender la amplificación del ARN diana, un complemento del ARN diana o un amplicón de ADN de un ARN diana.

[0122] En algunas realizaciones, el método analítico utilizado para detectar al menos un ARN diana en los métodos expuestos en el presente documento incluye TA-PCR cuantitativa en tiempo real. En algunas realizaciones, el método analítico utilizado para detectar al menos un ARN diana incluye el uso de una sonda TaqMan®. El ensayo utiliza transferencia de energía ("ET"), como la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia ("FRET"), para detectar y cuantificar el producto de PCR sintetizado. Normalmente, la sonda TaqMan® comprende una molécula de tinte fluorescente acoplada al extremo 5' y una molécula de extinción acoplada al extremo 3', de modo que el tinte y el extintor están muy cerca, lo que permite que el extintor suprima la señal de fluorescencia del tinte a través de ^fR^eT. Cuando la polimerasa replica el molde de amplicón quimérico al que está unida la sonda TaqMan®, la 5'-nucleasa de la polimerasa corta la sonda, desacoplando el tinte y el extintor para que se detecte la señal del tinte (como la fluorescencia). La señal (como la fluorescencia) aumenta con cada ciclo de TA-PCR proporcionalmente a la cantidad de sonda que se escinde.

[0123] En algunas realizaciones, la cuantificación de los resultados de ensayos de TA-PCR en tiempo real se realiza mediante la construcción de una curva estándar a partir de un ácido nucleico de concentración conocida y, a continuación extrapolando información cuantitativa para ARN diana de concentración desconocida. En algunas realizaciones, el ácido nucleico usado para generar una curva estándar es un ARN (p. ej., un control endógeno o un control exógeno). En algunas realizaciones, el ácido nucleico usado para generar una curva estándar es un ADN plasmídico bicatenario purificado o un ADN monocatenario generado in vitro.

[0124] En algunas realizaciones, donde las eficiencias de amplificación de los ácidos nucleicos diana y la referencia endógena son aproximadamente iguales, la cuantificación se logra mediante el método Ct comparativo (umbral de ciclo, por ejemplo, el número de ciclos de PCR necesarios para que la señal de fluorescencia aumente por encima del fondo). Los valores de Ct son inversamente proporcionales a la cantidad de ácido nucleico diana en una muestra. En algunas realizaciones, los valores de Ct de un ARN diana se pueden comparar con un control o calibrador, como un ARN de control exógeno. En algunas realizaciones, los valores de Ct del control exógeno y el ARN diana se normalizan a un control endógeno apropiado. Los controles endógenos ejemplares no limitativos se discuten aquí.

[0125] En algunas realizaciones, un valor umbral Ct (o un "valor de corte Ct") para un ARN diana, por debajo del cual se indica el cáncer de vejiga, se ha determinado previamente. En tales realizaciones, una muestra de control no puede analizarse simultáneamente con la muestra de prueba. En algunas realizaciones, como se discutió en este documento, se determinó previamente un valor de umbral de ACt, por encima del cual se indica el cáncer de vejiga.

[0126] Además de los ensayos TaqMan®, otras químicas de TA-PCR en tiempo real útiles para detectar y cuantificar productos de PCR en los métodos presentados aquí incluyen, pero no se limitan a, balizas moleculares, sondas de Scorpion y colorantes intercalantes, tales como sYb R Green, EvaGreen, thiazole orange, YO-PRO, TO-PRO, etc., que se describen a continuación.

[0127] En diversas realizaciones, la detección de TA-PCR en tiempo real se utiliza para detectar, en una única reacción multiplex, cuatro marcadores de cáncer de vejiga del panel descritos en el presente documento, y opcionalmente, al menos un control endógeno y/o al menos un control exógeno. En diversas realizaciones, la detección de TA-PCR en tiempo real se utiliza para detectar, en una única reacción multiplexada, cinco marcadores de cáncer de vejiga del panel descrito aquí, y opcionalmente, al menos un control endógeno y/o al menos un control exógeno. En algunas realizaciones múltiplex, se usa una pluralidad de sondas, como las sondas TaqMan®, cada una específica para una diana de ARN diferente. En algunas realizaciones, cada sonda específica de ARN diana se puede distinguir espectralmente de las otras sondas utilizadas en la misma reacción múltiplex. Un sistema múltiplex de siete colores ejemplar no limitativo se describe, por ejemplo, en Lee et al., BioTechniques, 27: 342-349.

[0128] En algunas realizaciones, la cuantificación de productos de PCR TA de tiempo real se realiza usando un colorante que se une a los productos de doble cadena de ADN, tales como SYBR Green, EvaGreen, naranja de tiazol, YO-PRO, TO-PRO, etc. En algunas realizaciones, el ensayo es el ensayo QuantiTect SYBR Green PCR de Qiagen. En este ensayo, el ARN total se aísla primero de una muestra. Posteriormente, el ARN total es poliadenilado en el extremo 3' y se transcribe a la inversa utilizando un cebador universal con poli -dT en el extremo 5'. En algunas realizaciones, una única reacción de transcripción inversa es suficiente para analizar múltiples ARN diana. La TA-PCR en tiempo real se lleva a cabo utilizando cebadores específicos de ARN diana y un cebador universal miScript, que comprende una secuencia poli-dT en el extremo 5'. El colorante SYBR Green se une no específicamente al ADN de doble cadena y, tras la excitación, emite luz. En algunas realizaciones, se pueden usar condiciones de tampón que promueven el recocido altamente específico de los cebadores a la plantilla de PCR (p. ej., disponible en el kit de ^pC^rQuantiTect SYBR Green de Qiagen) para evitar la formación de dúplex de ADN no específicos y dímeros de cebador que se unen a SYBR Green y afectan negativamente a la cuantificación. Por lo tanto, a medida que se acumula el producto de PCR, la señal de SYBR Green aumenta, lo que permite la cuantificación de productos específicos.

[0129] La TA-PCR en tiempo real se realiza utilizando cualquier instrumentación de TA-PCR disponible en la técnica. Por lo general, la instrumentación utilizada en la recolección y análisis de datos TA-PCR en tiempo real comprende un termociclador, la óptica para la excitación de fluorescencia y la recolección de emisiones, y opcionalmente una computadora y un software de adquisición y análisis de datos.

[0130] En algunas realizaciones, el método analítico utilizado en los métodos descritos en el presente documento es un ensayo de DASL® (recocido, selección, extensión, y ligadura mediados por ADNc). En algunas realizaciones, el ARN total se aísla de una muestra para ser analizada por cualquier método. El ARN total puede ser poliadenilado (> 18 A se agregan residuos a los extremos 3' de los ARN en la mezcla de reacción). El ARN se transcribe a la inversa utilizando un cebador de ADN marcado con biotina que comprende desde el extremo 5' hasta el extremo 3', una secuencia que incluye un sitio de cebador de PCR y una región poli-dT que se une a la cola poli-dA del ARN de muestra. Los transcritos de ADNc biotinilados resultantes luego se hibridan a un soporte sólido a través de una interacción biotina-estreptavidina y se ponen en contacto con uno o más polinucleótidos específicos de ARN diana. Los polinucleótidos específicos de ARN diana comprenden, desde el extremo 5' hasta el extremo 3', una región que comprende un sitio de cebador de PCR, región que comprende una secuencia de dirección y una secuencia específica de ARN diana.

[0131] En algunas realizaciones de DASL®, la secuencia de ARN diana específico comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 nucleótidos contiguos que tienen una secuencia que es igual o complementaria a, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 nucleótidos contiguos de un ARN diana marcador de cáncer de vejiga, un ARN de control endógeno, o un ARN de control exógeno.

[0132] Después de la hibridación, el polinucleótido específico del ARN diana se extiende, y los productos extendidos luego se eluyen de la matriz de ADNc inmovilizada. Una segunda reacción de PCR que utiliza un cebador universal marcado con fluorescencia genera un ADN marcado con fluorescencia que comprende la secuencia específica de ARN diana. Los productos de PCR marcados se hibridan luego con una matriz de microperlas para la detección y cuantificación.

[0133] En algunas realizaciones, el método analítico utilizado para detectar y cuantificar los niveles de la al menos una ARN diana en los procedimientos descritos en el presente documento es un ensayo de citometría de flujo basado en perlas. Ver Lu J. et al. (2005) Nature 435: 834-838. Un ejemplo de un ensayo de citometría de flujo basado en perlas es la tecnología xMAP® de Luminex, Inc. (Consulte http: //www.luminexcorp.com/technology/index.html). En algunas realizaciones, el ARN total se aísla de una muestra y luego se marca con biotina. El ARN marcado se hibrida luego a las sondas de captura específicas de ARN (p. ej., los productos FlexmiR™ vendidos por Luminex, Inc. en www.luminexcorp.com/products/assays/index.html) que se unen covalentemente a microperlas, cada una de las cuales es marcada con 2 tintes que tienen diferentes intensidades de fluorescencia. Una molécula reportera unida a la estreptavidina (p. ej., la estreptavidina-ficoeritrina, también conocida como "SAPE") se une al ARN diana capturado y la señal única de cada perla se lee mediante citometría de flujo. En algunas realizaciones, la muestra de ARN se poliadenila primero y luego se marca con un dendrímero 3DNATM biotinilado (es decir, un ADN de múltiples brazos con numerosas moléculas de biotina unidas a él), utilizando un polinucleótido puente que es complementario al extremo 3' de la cola poli-dA del ARN de muestra y al extremo 5' del polinucleótido unido al dendrímero biotinilado. La molécula informadora unida a estreptavidina se une luego al dendrímero biotinilado antes del análisis por citometría de flujo. En algunas realizaciones, el ARN marcado con biotina se expone primero a SAPE, y el complejo de ARN/SAPE se expone posteriormente a un anticuerpo antificoeritrina unido a un dendrímero de a Dn , que puede unirse a tantas como 900 moléculas de biotina. Esto permite que múltiples moléculas de SAPE se unan al dendrímero biotinilado a través de la interacción biotina-estreptavidina, lo que aumenta la señal del ensayo.

[0134] En algunas realizaciones, el método analítico usado para detectar y cuantificar los niveles de al menos un ARN diana en los métodos descritos aquí es por electroforesis en gel y detección con sondas marcadas (p. ej., sondas marcadas con una etiqueta radioactiva o quimioluminiscente), como por Northern blotting. En algunas realizaciones, el ARN total se aísla de la muestra, y luego se separa por tamaño mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS. El ARN separado se transfiere luego a una membrana y se hibrida con sondas complementarias radiomarcadas. En algunas realizaciones, las sondas ejemplares contienen uno o más análogos de nucleótidos que mejoran la afinidad como se analiza a continuación, tales como análogos de ácido nucleico bloqueado ("LNA"), que contienen un resto de azúcar bicíclico en lugar de azúcares de desoxirribosa o ribosa. Ver, por ejemplo, Várallyay, E. et al. (2008) Nature Protocols 3 (2): 190-196.

[0135] En algunas realizaciones, la detección y cuantificación de uno o más ARN diana se logra utilizando micro dispositivos fluídicos y la detección de una sola molécula. En algunas realizaciones, los ARN diana en una muestra de ARN total aislado se hibridan con dos sondas, una que es complementaria a los ácidos nucleicos en el extremo 5' del ARN diana y la segunda que es complementaria al extremo 3' del ARN diana. Cada sonda comprende, en algunas realizaciones, uno o más análogos de nucleótidos que aumentan la afinidad, tales como análogos de nucleótidos de LNA y cada uno está marcado con un colorante fluorescente diferente que tiene espectros de emisión de fluorescencia diferentes (es decir, colorantes detectables de manera diferente). A continuación, la muestra fluye a través de un capilar microfluídico en el que múltiples láseres excitan las sondas fluorescentes, de modo que una única ráfaga de fotones coincidentes identifica un ARN diana particular, y el número de ráfagas de fotones coincidentes únicas particulares se puede contar para cuantificar la cantidad del ARN diana en la muestra. En algunas realizaciones alternativas, una sonda específica de ARN diana puede marcarse con 3 o más etiquetas distintas seleccionadas de, por ejemplo, fluoróforos, etiquetas de espín de electrones, etc., y luego hibridar con una muestra de ARN.

[0136] Opcionalmente, el ARN de la muestra se modifica antes de la hibridación. El dúplex de sonda/ARN diana se pasa luego a través de los canales en un dispositivo microfluídico y comprende detectores que registran la señal única de las 3 etiquetas. De esta manera, las moléculas individuales se detectan por su señal única y se cuentan. Véanse las patentes de EE.UU. Nos 7.402.422 y 7.351.538 de Fuchs et al., U.S. Genomics, Inc.

4.2.5. Ejemplar de automatización y sistemas

[0137] En algunas realizaciones, la expresión génica se detecta utilizando una plataforma automatizada de manejo y/o análisis de muestras. En algunas realizaciones, se utilizan plataformas de análisis automatizadas disponibles comercialmente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se utiliza el sistema GeneXpert® (Cepheid, Sunnyvale, CA).

[0138] La presente invención se ilustra para su uso con el sistema GeneXpert. Los métodos de análisis y preparación de muestras ejemplares se describen a continuación. Sin embargo, la presente invención no se limita a un método de detección o plataforma de análisis particular. Un experto en la técnica reconoce que puede utilizarse cualquier número de plataformas y métodos.

[0139] El GeneXpert® utiliza un cartucho de un solo uso, autocontenido. La extracción, amplificación y detección de muestras pueden llevarse a cabo dentro de este "laboratorio en un cartucho" autocontenido. (Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses 5.958.349, 6.403.037, 6.440.725, 6.783.736, 6.818.185).

[0140] Los componentes del cartucho incluyen, pero no se limitan a, cámaras de procesamiento que contienen reactivos, filtros y tecnologías de captura útiles para extraer, purificar y amplificar ácidos nucleicos diana. Una válvula permite la transferencia de fluidos de cámara a cámara y contiene componentes de lisis y filtración de ácidos nucleicos. Una ventana óptica permite la detección óptica en tiempo real. Un tubo de reacción permite un ciclo térmico muy rápido.

[0141] En algunas realizaciones, el sistema GenXpert® incluye una pluralidad de módulos para la escalabilidad. Cada módulo incluye una pluralidad de cartuchos, junto con componentes de análisis y manejo de muestras.

[0142] En algunas realizaciones, el método de preparación de muestras GeneXpert® utiliza la filtración para capturar y concentrar las células de la orina. En algunas realizaciones, se utiliza un tamaño de poro de filtro de 0,8 pM. Este tamaño facilita la captura de todas las células en la orina. En otras realizaciones, se utilizan tamaños de poros de 0,5 a 10 pM, 0,5 a 5 pM, 0,8 a 10 pM, 0,8 a 5 pM, 0,8 a 2 pM, 2 a 5 pM, 2 a 10 pM, 2 a 8 pM, 5 a 8 pM, o 5 a 10 pM. Ciertos filtros (como 5 pM, 8 pM y 10 pM) permiten la eliminación de la mayoría de los glóbulos rojos y blancos de la muestra mientras que capturan las células uroteliales más grandes, que son las células diana del ensayo. En algunas realizaciones, este método de preparación de muestras mejora la especificidad del ensayo al eliminar los glóbulos blancos que pueden estar presentes debido a una infección o inflamación. En algunos casos, los métodos de preparación de muestras, como la centrifugación de toda la orina seguida por el aislamiento del ARN del sedimento de orina, no permiten la eliminación de glóbulos blancos. En algunas realizaciones, la eficiencia de la captura de células por filtración es mayor en comparación con la centrifugación, y puede proporcionar resultados más consistentes.

[0143] Después de que las células de la orina se capturan en el filtro, en algunas realizaciones, se lavan y luego se lisan con sonicación (2-15 segundos, 8-16 pM a 36 kHz). El lisado celular se recoge y se utiliza para reconstituir los reactivos de TA-PCR, que están presentes en el cartucho como partículas liofilizadas.

[0144] En algunas realizaciones, TA-PCR se utiliza para amplificar y analizar la presencia o los niveles de expresión de los marcadores de cáncer de vejiga. En algunas realizaciones, la transcripción inversa utiliza la enzima MMLV TA y una incubación de 5 a 20 minutos a 40°C a 50°C. En algunas realizaciones, la PCR usa polimerasa Taq con función de arranque en caliente, como AptaTaq (Roche). En algunas realizaciones, la desnaturalización inicial es de 90°C a 100°C durante 2 a 5 minutos; la temperatura de desnaturalización del ciclo es de 90°C a 100°C durante 1 a 10 segundos; la temperatura del recocido de ciclo es de 60°C a 70°C durante 10 a 30 segundos; y la temperatura de extensión del ciclo es de 60°C a 75°C durante 10 a 40 segundos; y se realizan hasta 50 ciclos.

[0145] La presente invención no se limita a secuencias de cebador particular y/o sonda. Ejemplos de cebadores de amplificación y sondas de detección se describen en los Ejemplos.

[0146] En algunas realizaciones, una centrifugación fuera de línea se utiliza para mejorar los resultados del ensayo con muestras con bajo contenido celular. La muestra, con o sin el conservante agregado, se centrifuga y el sobrenadante se elimina. El sedimento se resuspende luego en un volumen menor de sobrenadante o conservante.

El sedimento resuspendido se agrega luego a un cartucho GeneXpert® como se describió anteriormente.

4.2.6. Análisis ejemplar de datos

[0147] En algunas realizaciones, el nivel de un ARN diana, como el ARNm de AR y/o UPK1B, y opcionalmente, al menos uno de los ARNm de CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 y PIK3A, se normaliza a un ARN de control endógeno. La normalización puede comprender, por ejemplo, la determinación de la diferencia del nivel del

ARN diana con el nivel del ARN de control endógeno. En algunas de tales realizaciones, el nivel de los ARN se representa por un valor de Ct obtenido de la PCR cuantitativa. En algunas de estas realizaciones, la diferencia se expresa como ACt. ACt se puede calcular como Ct[ARN diana]-Ct[control endógeno] o Ct[control endógeno]-Ct[ARN

diana]. En ciertas realizaciones, ACt = Ct[control endógeno]- Ct[marcador]. En alg unas realizaci ones, s e establece

un valor umbral ACt, por encima o por debajo del cual está indicado el cáncer de vejiga. En algunas de tales realizaciones, el umbral de ACt se establece como el valor de ACt por debajo del cual el 95% de las muestras normales se caracterizan correctamente. En algunas de tales realizaciones, un valor de ACt que es más alto que el valor de umbral ACt es indicativo de cáncer de vejiga.

[0148] En algunas realizaciones, se utiliza el análisis discriminante lineal (ADL), por ejemplo, para combinar dos o más de los marcadores en una única puntuación combinada. En algunas de tales realizaciones, se utiliza un único valor de umbral para los marcadores incluidos en el ADL. En algunas realizaciones, el Ct o ACt de cada marcador está ponderado en la ecuación ADL. En algunas realizaciones, al menos dos marcadores tienen diferentes factores de ponderación en la ecuación. En algunas realizaciones, a cada marcador se le asigna un factor de ponderación diferente en la ecuación. En algunas realizaciones, los factores de ponderación se determinan de modo que la ecuación ADL dé como resultado una sensibilidad y/o especificidad seleccionadas, por ejemplo, a lo largo de una

curva ROC, para un conjunto de datos de muestra. En algunas realizaciones, se usa una ecuación ADL estandarizada. En algunas de estas realizaciones, mediante el uso del análisis de discriminación lineal, las clasificaciones erróneas (como falsos negativos y falsos positivos) se reducen y/o minimizan. Una ecuación de ADL estandarizada no limitativa puede tener la siguiente forma: ADL = p⁰+ p¹X¹+ p²x²+ p3x3 p4x4 p5X5, (control endógeno Ct - p)/P, x²= (marcador 1 ACt - q)/Q, x3 = (marcador 2 ACt - r)/R, x4 = (marcador 3 ACt - s)/S, X5

= (marcador 4 ACt - t)/T; en donde ACt = control endógeno Ct - marcador Ct; y en donde p¹, p², p3, p4 y p¹son factores de ponderación; p⁰es el intercepto; p, q, r, s, y t son los valores medios de Ct o ACt para el control endógeno, marcador 1, marcador 2, marcador 3 y marcador 4, respectivamente, de un conjunto de datos de muestra; y P, Q, R, S y T son la desviación estándar de los valores Ct o ACt para el control endógeno, el marcador 1, el marcador 2, el marcador 3 y el marcador 4, respectivamente, del conjunto de datos de la muestra. En algunas realizaciones, p²da cuenta condicionalmente de p¹, etc., a través de la regresión. En algunas realizaciones, un corte

de ADL se establece de tal manera que una muestra se considera positiva si el ADL es menor o igual que el corte.

En algunas realizaciones, un corte de ADL se establece de tal manera que una muestra se considera positiva si el

ADL es menor que el corte. En algunas realizaciones, un límite de ADL se establece de tal manera que una muestra

se considera positiva si la ADL es mayor o igual que el corte. En algunas realizaciones, un corte de ADL se establece de tal manera que una muestra se considera positiva si el ADL es mayor que el corte.

[0149] Una ecuación de ADL ejemplar no limitante para una combinación de cuatro marcadores de KRT20, ANXA10, CRH e IGF2, es como sigue:

en donde X¹= (ABL Ct - 31,7)/2,6, X²= (ANXA10 ACt - (-7,8))/5,2, X3 = (KRT20 ACt - (-3,2))/4,6, X4 = (CRH ACt - (-9,4))/5,3, y X⁵= (IGF2 ACt - (-6,2))/6,3. Para la ecuación anterior, en algunas realizaciones, una muestra se clasifica

como positiva si ADL < -2, Con este corte, en algunas realizaciones, las especificidades correspondientes del 90-95% producen sensibilidades del 74%-85%.

[0150] Una ecuación ADL ejemplar no limitante para una combinación de cuatro marcador de UPK1B, ANXA10, CRH, y IGF2, es como sigue:

en donde X¹= (ABL Ct - 31,7)/2,6, X²= (ANXA10 ACt - (-9,14))/4,9, xa = (UPK1B ACt - (-10,1 ))/4,6, X4 = (CRH ACt - (

10,1 ))/4,7, y X⁵= (IGF2 ACt - (-8,2))/6,0. Para la ecuación anterior, en algunas realizaciones, una muestra se clasifica

como positiva si ADL < 2. Con este límite, en algunas realizaciones, las especificidades correspondientes de 90-95% producen sensibilidades de hasta el 89%.

[0151] En algunas realizaciones, un programa de análisis basado en ordenador se utiliza para traducir los datos en

bruto generados por el ensayo de detección (por ejemplo., El nivel de expresión de los marcadores de cáncer de vejiga descritos en este documento) en datos de valor predictivo para un clínico. El médico puede acceder a los datos predictivos utilizando cualquier medio adecuado. Por lo tanto, la presente invención beneficia aún más al clínico, que probablemente no esté capacitado en genética o biología molecular, y no necesita entender los datos en bruto. Los datos se presentan directamente al médico en su forma más útil. El clínico puede utilizar inmediatamente la información para optimizar el cuidado del sujeto.

[0152] Se puede usar cualquier método capaz de recibir, procesar y transmitir la información hacia y desde los laboratorios que llevan a cabo los ensayos, la información, el personal médico y los sujetos. Por ejemplo, una muestra (p. ej., una biopsia o una muestra de suero o de orina) puede obtenerse de un sujeto y enviarse a un servicio de perfiles (p. ej., un laboratorio clínico en un centro médico, un negocio de perfiles genómicos, etc.), ubicado en cualquier parte del mundo (p. ej., en un país diferente al país donde reside el sujeto o donde se usa la información en última instancia) para generar datos sin procesar. Cuando la muestra comprende un tejido u otra muestra biológica, el sujeto puede visitar un centro médico para obtener la muestra y enviarla al centro de perfilado, o los sujetos pueden recolectar la muestra ellos mismos (p. ej., una muestra de orina) y enviarla directamente a un centro de perfilado. Cuando la muestra comprende información biológica previamente determinada, la información puede ser enviada directamente al servicio de perfiles por el sujeto (p. ej., una tarjeta de información que contiene la información puede ser escaneada por una computadora y los datos transmitidos a una computadora del centro de perfiles utilizando sistemas de comunicación electrónica). Una vez recibida por el servicio de perfiles, la muestra se procesa y se produce un perfil (es decir, datos de expresión), específico para la información de diagnóstico o pronóstico deseada para el sujeto.

[0153] Los datos del perfil se preparan luego en un formato adecuado para la interpretación por un médico tratante. Por ejemplo, en lugar de proporcionar datos crudos de expresión, el formato preparado puede representar un diagnóstico o evaluación de riesgo (p. ej., el nivel de expresión de los marcadores de cáncer de vejiga descritos aquí o el diagnóstico de cáncer de vejiga) para el sujeto, junto con recomendaciones para opciones de tratamiento particulares. Los datos pueden ser mostrados al médico por cualquier método adecuado. Por ejemplo, el servicio de creación de perfiles puede generar un informe que se puede imprimir para el médico (p. ej., en el punto de atención) o mostrarse al médico en un monitor de computadora.

[0154] La información se puede analizar primero en el punto de atención o en una instalación regional. Luego, los datos sin procesar se envían a un centro de procesamiento central para un análisis adicional y/o para convertir los datos sin procesar en información útil para un médico o paciente. La instalación de procesamiento central proporciona la ventaja de la privacidad (todos los datos se almacenan en una instalación central con protocolos de seguridad uniformes), la velocidad y la uniformidad del análisis de los datos. La instalación de procesamiento central puede entonces controlar el destino de los datos tras el tratamiento del sujeto. Por ejemplo, al utilizar un sistema de comunicación electrónico, la instalación central puede proporcionar datos al clínico, al sujeto o a los investigadores.

[0155] El sujeto puede ser capaz de acceder directamente a los datos utilizando el sistema de comunicación electrónico. El sujeto puede elegir una intervención adicional o asesoramiento basado en los resultados. Los datos pueden ser utilizados para uso de investigación. Por ejemplo, los datos se pueden utilizar para optimizar aún más la inclusión o eliminación de marcadores como indicadores útiles de una condición o etapa particular de la enfermedad o como un diagnóstico complementario para determinar el curso de acción del tratamiento.

4.2.7. Ejemplares de polinucleótidos

[0156] En el presente documento se describen polinucleótidos. En el presente documento también se describen polinucleótidos sintéticos. Los polinucleótidos sintéticos, como se usan en este documento, se refieren a polinucleótidos que se han sintetizado in vitro químicamente o enzimáticamente. La síntesis química de polinucleótidos incluye, pero no se limita a, la síntesis que usa sintetizadores de polinucleótidos, como OligoPilot (GE Healthcare), ABI 3900 DNA Synthesizer (Applied Biosystems), y similares. La síntesis enzimática incluye, pero no se limita, a producir polinucleótidos mediante amplificación enzimática, por ejemplo, PCR. Un polinucleótido puede comprender uno o más análogos de nucleótidos (es decir, nucleótidos modificados) discutidos en este documento.

[0157] Un polinucleótido que se da a conocer que comprende una región que es idéntica, o complementaria a, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29, o al menos 30 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada de AR, UPK1B, CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 y PIK3A ARNm. Se describe un polinucleótido que comprende una región que es idéntica o complementaria a un intervalo de 6 a 100, 8 a 100, 8 a 75, 8 a 50, 8 a 40 u 8 a 30 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada de AR, UPK1B, CRH, IGF2, KRT20, ARNm ANXA10, UPK2, MGEA5 y PIK3A. Los polinucleótidos ejemplares no limitativos se muestran en las Tablas 1 y 6.

[0158] En diversas realizaciones, un polinucleótido que comprende menos de 500, menos de 300, menos de 200, menos de 150, menos de 100, menos de 75, menos de 50, menos de 40, o menos de 30 nucleótidos. En varias realizaciones, un polinucleótido está entre 6 y 200, entre 8 y 200, entre 8 y 150, entre 8 y 100, entre 8 y 75, entre 8 y 50, entre 8 y 40, o entre 8 y 30 nucleótidos de largo.

[0159] En algunas realizaciones, el polinucleótido es un cebador. En algunas realizaciones, el cebador se marca con un resto detectable. En algunas realizaciones, un cebador no está marcado. Un cebador, como se usa en este documento, es un polinucleótido que es capaz de hibridar específicamente con un ARN diana o con un ADNc transcrito a la inversa del ARN diana o con un amplicón que ha sido amplificado de un ARN diana o un ADNc (colectivamente denominado "plantilla"), y, en presencia de la plantilla, una polimerasa y los tampones y reactivos adecuados, se pueden extender para formar un producto de extensión de imprimación.

[0160] En algunas realizaciones, el polinucleótido es una sonda. En algunas realizaciones, la sonda está marcada con un resto detectable. Un resto detectable, como se usa en este documento, incluye tanto restos detectables directamente, tales como colorantes fluorescentes, como restos detectables indirectamente, tales como miembros de pares de unión. Cuando el resto detectable es un miembro de un par de unión, en algunas realizaciones, la sonda puede detectarse incubando la sonda con una etiqueta detectable unida al segundo miembro del par de unión. En algunas realizaciones, una sonda no está etiquetada, como cuando una sonda es una sonda de captura, por ejemplo, en una micromatriz o perla. En algunas realizaciones, una sonda no es extensible, por ejemplo, por una polimerasa. En otras realizaciones, una sonda es extensible.

[0161] En algunas realizaciones, el polinucleótido es una sonda FRET que en algunas realizaciones se marcó en el extremo 5' con un colorante fluorescente (donante) y en el extremo 3' con un extintor (aceptor), un grupo químico que absorbe (es decir, suprime) la emisión de fluorescencia del colorante cuando los grupos están muy cerca (es decir, unidos a la misma sonda). En otras realizaciones, el tinte y el extintor no están en los extremos de la sonda FRET. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el espectro de emisión del colorante debería solaparse considerablemente con el espectro de absorción del extintor.

4.2.7.1. Modificaciones de polinucleótidos ejemplares

[0162] En algunas realizaciones, los métodos para detectar al menos un ARN diana descrito en el presente documento emplean uno o más polinucleótidos que se han modificado, tales como polinucleótidos que comprenden uno o más análogos de nucleótidos que mejoran la afinidad. Los polinucleótidos modificados útiles en los métodos descritos en el presente documento incluyen cebadores para la transcripción inversa, cebadores de amplificación por PCR y sondas. En algunas realizaciones, la incorporación de nucleótidos que aumentan la afinidad incrementa la afinidad de unión y la especificidad de un polinucleótido por su ácido nucleico diana en comparación con los polinucleótidos que contienen solo desoxirribonucleótidos, y permite el uso de polinucleótidos más cortos o regiones más cortas de complementariedad entre el polinucleótido y el ácido nucleico diana.

[0163] En algunas realizaciones, los análogos de nucleótidos de afinidad de mejora incluyen nucleótidos que comprenden una o más modificaciones de bases, modificaciones de azúcar y/o modificaciones del esqueleto.

[0164] En algunas realizaciones, las bases modificadas para su uso en análogos de nucleótidos de mejora de afinidad incluyen 5-metilcitosina, isocitosina, pseudoisocitosina, 5-bromouracilo, 5-propiniluracilo, 6-aminopurina, 2-aminopurina, inosina, diaminopurina, 2-cloro-6-aminopurina, xantina e hipoxantina.

[0165] En algunas realizaciones, los análogos de nucleótidos que mejoran la afinidad incluyen nucleótidos que tienen azúcares modificados tales como azúcares sustituidos en 2', tales como azúcares en 2'-O-alquilo-ribosa, azúcares en 2'-amino-desoxirribosa, azúcares en 2'-fluoro azúcares de desoxirribosa, azúcares 2'-fluoro-arabinosa y azúcares 2-O-metoxietilo-ribosa (2'MOE). En algunas realizaciones, los azúcares modificados son azúcares de arabinosa, o azúcares de d-arabino-hexitol.

[0166] En algunas realizaciones, los análogos de nucleótidos que mejoran la afinidad incluyen modificaciones del esqueleto tales como el uso de ácidos nucleicos peptídicos (PNA; por ejemplo, un oligómero que incluye nucleobases unidas entre sí por un esqueleto de aminoácidos). Otras modificaciones de la red troncal incluyen enlaces de fosforotioato, ácidos nucleicos modificados con fosfodiéster, combinaciones de ácido nucleico de fosfodiéster y fosforotioato, metilfosfonato, alquilfosfonatos, ésteres de fosfato, alquilfonotioatos, fosforamidatos, carbamatos, carbonatos, triésteres de fosfato, acetamidatos, ésteres de carboximetilo, metilfosforotioato, fosforoditioato, p-etoxi, y combinaciones de los mismos.

[0167] En algunas realizaciones, un polinucleótido incluye al menos un análogo de nucleótido que mejora la afinidad que tiene una base modificada, al menos nucleótido (que puede ser el mismo nucleótido) que tiene un azúcar modificado, y/o al menos un enlace internucleótido que no es natural

[0168] En algunas realizaciones, un análogo de nucleótido que mejora la afinidad contiene un azúcar de ácido nucleico bloqueado ("LNA"), que es un azúcar bicíclico. En algunas realizaciones, un polinucleótido para uso en los métodos descritos en el presente documento comprende uno o más nucleótidos que tienen un azúcar LNA. En algunas realizaciones, un polinucleótido contiene una o más regiones que consisten en nucleótidos con azúcares LNA. En otras realizaciones, un polinucleótido contiene nucleótidos con azúcares de LNA entremezclados con desoxirribonucleótidos. Ver, por ejemplo, Frieden, M. et al. (2008) Curr. Farmacéutico Des. 14 (11): 1138-1142.

4.2.7.2. Cebadores ejemplares

[0169] En el presente documento se describe un cebador. En el presente documento se describe que un cebador es idéntico o complementario a al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, a al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29, o al menos 30 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada de AR, UPK1B, CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 y PIK3A. En este documento se describe un cebador que comprende una región que es idéntica o complementaria a un intervalo de 6 a 100, 8 a 100, 8 a 75, 8 a 50, 8 a 40 u 8 a 30 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada de ARNm de AR, UPK1B, CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 y PIK3A. Los cebadores ejemplares no limitativos se muestran en las Tablas 1 y 6. En algunas realizaciones, un cebador también puede comprender porciones o regiones que no son idénticas o complementarias al ARN diana. En algunas realizaciones, una región de un cebador que es idéntica o complementaria a un ARN diana es contigua, de manera que cualquier región de un cebador que no sea idéntica o complementaria al ARN diana no interrumpe la región idéntica o complementaria.

[0170] En algunas realizaciones, un cebador comprende una parte que es idéntica presente en un ARN diana. En algunas de tales realizaciones, un cebador que comprende una región que está presente de manera idéntica en el ARN diana es capaz de hibridar selectivamente a un ADNc que se ha transcrito de forma inversa del ARN, o a un amplicón que se ha producido mediante la amplificación del ARN diana. o ADNc. En algunas realizaciones, el cebador es complementario a una porción suficiente del ADNc o amplicón, de modo que se hibrida selectivamente al ADNc o amplicón en las condiciones del ensayo particular que se está utilizando.

[0171] Como se usa en este documento, "hibridan selectivamente" significa que un polinucleótido, tal como un cebador o sonda, se hibridará con un ácido nucleico particular en una muestra con al menos 5 veces mayor afinidad de lo que se hibridará con otro ácido nucleico presente en la misma muestra que tiene una secuencia de nucleótidos diferente en la región de hibridación. Las condiciones de hibridación ejemplares se discuten en este documento, por ejemplo, en el contexto de una reacción de transcripción inversa o una reacción de amplificación por PCR. En algunas realizaciones, un polinucleótido se hibridará con un ácido nucleico particular en una muestra con al menos 10 veces mayor afinidad que hibridará con otro ácido nucleico presente en la misma muestra que tiene una secuencia de nucleótidos diferente en la región de hibridación.

[0172] En algunas realizaciones, un cebador se utiliza para transcribir a la inversa un ARN diana, por ejemplo, como se discute aquí. En algunas realizaciones, se usa un cebador para amplificar un ARN diana o un ADNc transcrito a la inversa del mismo. Dicha amplificación, en algunas realizaciones, es una PCR cuantitativa, por ejemplo, como se discute aquí. En algunas realizaciones, un cebador comprende un resto detectable.

[0173] En el presente documento se describen pares de cebadores. Dichos pares de cebadores están diseñados para amplificar una parte de un ARNm diana, como el ARN de AR, UPK1B, CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 o PIK3A, o un ARN de control endógeno o un ARN de control exógeno. En el presente documento se describe un par de cebadores diseñado para producir un amplicón que tiene una longitud de 50 a 1500 nucleótidos, 50 a 1000 nucleótidos, 50 a 750 nucleótidos, 50 a 500 nucleótidos, 50 a 400 nucleótidos, 50 a 300 nucleótidos, 50 a 200 nucleótidos de largo, 50 a 150 nucleótidos de largo, o 50 a 100 nucleótidos de largo. Los pares de cebadores ejemplares no limitativos se muestran en las Tablas 1 y 6. En algunas realizaciones, se diseña un par de cebadores que abarca un intrón en la secuencia genómica de modo que el ARNm, sin el intrón, se amplifique más preferiblemente que la secuencia genómica. Por "se extiende un intrón" se entiende que un cebador del par de cebadores es complementario a una secuencia en el ARNm o un ADNc transcrito a la inversa del ARNm que se encuentra al menos parcialmente 5' a un intrón en la secuencia genómica y un cebador del par de cebadores es complementario a una secuencia en el ARNm o un ADNc transcrito a la inversa del ARNm que se encuentra al menos parcialmente en 3' al mismo intrón en la secuencia genómica. Un cebador del par de cebadores puede ser complementario a una secuencia en el ARNm o un ADNc transcrito a la inversa del ARNm que se ubica en 5' a un intrón en la secuencia genómica y un cebador del par de cebadores puede ser complementario a una secuencia en el ARNm o un ADNc transcrito a la inversa desde el ARNm que se encuentra en 3' hasta el mismo intrón en la secuencia genómica. Uno de los cebadores en el par de cebadores puede ser complementario a una secuencia en el ARNm o un ADNc transcrito a la inversa del ARNm que se empalma cuando se elimina el intrón, de modo que la secuencia complementaria contigua no se encuentra en la secuencia genómica. Todavía se considera que un par de cebadores que comprende dicho cebador abarca un intrón.

4.2.7.3. Sondas ejemplares

[0174] En diversas realizaciones, los métodos para detectar la presencia de cáncer de vejiga comprenden la hibridización de ácidos nucleicos de una muestra con una sonda. En algunas realizaciones, la sonda comprende una porción que es complementaria a un ARN diana, tal como AR, UPK1B, CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, Up K2, MGEA5 o PIK3A. En algunas realizaciones, la sonda comprende una porción que está presente de manera idéntica en el ARN diana. En algunas de tales realizaciones, una sonda que es complementaria a un ARN diana es complementaria a una porción suficiente del ARN diana, de modo que se hibrida selectivamente con el ARN diana en las condiciones del ensayo particular que se está utilizando. En algunas realizaciones, una sonda que es complementaria a un ARN diana comprende una región que es complementaria a al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29 o al menos 30 nucleótidos contiguos del ARN diana, tales como ARNm de CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 o PIK3A. Las sondas ejemplares no limitativas se muestran en las Tablas 1 y 6. Una sonda que es complementaria a un ARN diana también puede comprender porciones o regiones que no son complementarias al ARN diana. En algunas realizaciones, una región de una sonda que es complementaria a un ARN diana es contigua, de manera que cualquier región de una sonda que no sea complementaria al ARN diana no interrumpe la región complementaria.

[0175] La sonda puede comprender una parte que es idéntica presente en el ARN diana, tal como AR, UPK1B, CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5, o ARNm PIK3A. Una sonda que comprende una región que está presente de manera idéntica en el ARN diana puede ser capaz de hibridarse selectivamente con un ADNc que se ha transcrito de forma inversa a partir del ARN, o con un amplicón que se ha producido mediante la amplificación del ARN o ADNc diana. La sonda puede ser complementaria a una porción suficiente del ADNc o del amplicón, de modo que se hibride selectivamente con el ADNc o el amplicón en las condiciones del ensayo particular que se está utilizando. Una sonda que es complementaria a un ADNc o amplicón puede comprender una región que es complementaria a al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29, o al menos 30 nucleótidos contiguos del ADNc o amplicón. Una sonda que es complementaria a un ADNc o amplicón también puede comprender porciones o regiones que no son complementarias al ADNc o amplicón. Una región de una sonda que es complementaria a un ADNc o un amplicón puede ser contigua, de manera que cualquier región de una sonda que no sea complementaria al ADNc o un amplicón no interrumpa la región complementaria.

[0176] En algunas realizaciones, el método de cuantificación de manera detectable de uno o más ARN diana comprende: (a) transcripción inversa de un ARN diana para producir un ADNc que es complementario al ARN diana; (b) amplificar el ADNc de (a); y (c) detectar la cantidad de un ARN diana mediante TA-PCR en tiempo real y una sonda de detección (que puede ser simultánea con la etapa de amplificación (b)).

[0177] Como se describió anteriormente, en algunas realizaciones, la detección de TA-PCR en tiempo real se puede realizar usando una sonda FRET, que incluye, pero no está limitada a, una sonda TaqMan®, una sonda de baliza molecular y una sonda Scorpion. En algunas realizaciones, la detección y cuantificación de TA-PCR en tiempo real se realiza con una sonda TaqMan®, es decir, una sonda lineal que típicamente tiene un colorante fluorescente unido covalentemente en un extremo del ADN y una molécula inhibidora unida covalentemente en otro lugar, como en el otro extremo de, el ADN. La sonda FRET comprende una secuencia que es complementaria a una región del ADNc de modo que, cuando la sonda FRET se hibrida con el ADNc, la fluorescencia del tinte se apaga, y cuando la sonda se digiere durante la amplificación del ADNc, se libera el tinte De la sonda y produce una señal de fluorescencia. En tales realizaciones, la cantidad de ARN diana en la muestra es proporcional a la cantidad de fluorescencia medida durante la amplificación de ADNc.

[0178] La sonda TaqMan® comprende típicamente una región de nucleótidos contiguos que tiene una secuencia que es complementaria a una región de un ARN diana o su ADNc complementario que se transcribe a la inversa de la plantilla de ARN diana (es decir, la secuencia de la región de la sonda es complementaria o está presente de manera idéntica en el ARN diana que se va a detectar, de manera que la sonda se puede hibridar específicamente al amplicón de PCR resultante. En algunas realizaciones, la sonda comprende una región de al menos 6 nucleótidos contiguos que tienen una secuencia que es completamente complementaria o está presente de manera idéntica en una región de un ADNc que se ha transcrito de manera inversa desde una plantilla de ARN diana, como la que comprende una región de al menos 8 nucleótidos contiguos, al menos 10 nucleótidos contiguos, al menos 12 nucleótidos contiguos, al menos 14 nucleótidos contiguos, o al menos 16 nucleótidos contiguos que tienen una secuencia que es complementaria o está presente de manera idéntica en una región de un ADNc transcrito a la inversa de un ARN diana a detectar.

[0179] En algunas realizaciones, la región del ADNc que tiene una secuencia que es complementaria a la secuencia de la sonda TaqMan® está en o cerca del centro de la molécula de ADNc. En algunas realizaciones, hay independientemente al menos 2 nucleótidos, tales como al menos 3 nucleótidos, tales como al menos 4 nucleótidos, tales como al menos 5 nucleótidos del ADNc en el extremo 5' y en el extremo 3' de la región de complementariedad.

[0180] En algunas realizaciones, balizas moleculares se pueden utilizar para detectar y cuantificar los productos de PCR. Como sondas de TaqMan®, las Balizas Moleculares utilizan FRET para detectar y cuantificar un producto de PCR a través de una sonda que tiene un tinte fluorescente y un extintor conectado a los extremos de la sonda. A diferencia de las sondas TaqMan®, las Balizas Moleculares permanecen intactas durante los ciclos de PCR. Las sondas de baliza molecular forman una estructura de tallo-bucle cuando están libres en solución, lo que permite que el tinte y el extintor estén lo suficientemente cerca como para causar la extinción de la fluorescencia. Cuando la Baliza Molecular hibrida con una diana, la estructura tallo-bucle se suprime, de modo que el tinte y el extintor se separan en el espacio y el tinte se vuelve fluorescente. Las balizas moleculares están disponibles, por ejemplo, en Gene LinkTM (consulte http://www.genelink.com/newsite/productos/mbintro.asp).

[0181] En algunas realizaciones, las sondas Scorpion se pueden utilizar como cebadores específicos de secuencia y para la detección de producto de PCR y la cuantificación. Al igual que las Balizas Moleculares, las sondas Scorpion forman una estructura de tallo-bucle cuando no se hibridan con un ácido nucleico diana. Sin embargo, a diferencia de Balizas Moleculares, una sonda Scorpion logra tanto cebado específico de secuencia como detección de producto de PCR. Una molécula de tinte fluorescente está unida al extremo 5' de la sonda Scorpion, y un extintor está unido en otro lugar, como en el extremo 3'. La porción 3' de la sonda es complementaria al producto de extensión del cebador de PCR, y esta porción complementaria está unida al extremo 5' de la sonda por un resto no amplificable. Después de extender el cebador Scorpion, la secuencia específica de la diana de la sonda se une a su complemento dentro del amplicón extendido, abriendo así la estructura tallo-bucle y permitiendo que el colorante en el extremo 5' emita fluorescencia y genere una señal. Las sondas Scorpion están disponibles en, po r ejemplo, Premier Biosoft International (consulte http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/Scorpion.html).

[0182] En algunas realizaciones, las etiquetas que se pueden usar en las sondas FRET incluyen colorantes fluorescentes y colorimétricos, tales como colorantes Alexa Fluor, colorantes BODIPY, tales como BODIPY FL; Cascada Azúl; Cascade Yellow; cumarina y sus derivados, tales como 7-amino-4-metilcumarina, aminocumarina e hidroxicumarina; tintes de cianina, tales como Cy3 y Cy5; eosinas y eritrosinas; fluoresceína y sus derivados, tales como isotiocianato de fluoresceína; quelatos macrocíclicos de iones lantánidos, tales como Quantum DyeTM; Marina Blue; Oregon Verde; colorantes de rodamina, tales como rojo de rodamina, tetrametilrodamina y rodamina 6G; Téjas Rojo; colorantes de transferencia de energía fluorescentes, tales como heterodímero de tiazol naranja-etidio; y, TOTAB.

[0183] Los ejemplos específicos de colorantes incluyen, pero no se limitan a, los identificados anteriormente y los siguientes: Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 500. Alexa Fluor 514, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 610, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700 y Alexa Fluor 750; colorantes BODIPY reactivos con aminas, como BODIPY 493/503, BODIPY 530/550, BODIPY 558/568, BODIPY 564/570, BODIPY 576/589, BODIPY 581/591, BODIPY 630/650, BODIPY 650/655, BIPIPY FL, BODIPY R6G, BODIPY TMR y BODIPY-TR; Cy3, Cy5, 6-FAM, isotiocianato de fluoresceína, HEX, 6-JOE, Oregon Verde 488, Oregon Verde 500, Oregon Verde 514, azul de Pacífico, REG, Rodamina verde, Rodamina rojo, Renografina, ROX, SYPRO, TAMRA, 2', 4', 5',7'-tetrabromosulfonafluoresceína y TET.

[0184] Los ejemplos de pares de colorante/inhibidor (es decir, pares de donante/aceptor) incluyen, pero no se limitan a, fluoresceína/tetrametilrodamina; IAEDANS/fluoresceína; EDANS/dabcilo; fluoresceína/fluoresceína; BODIPY FL/BODIPY FL; tintes de fluoresceína/QSY 7 o QSY 9. Cuando el donante y el aceptor son iguales, la FRET puede detectarse, en algunas realizaciones, por despolarización de fluorescencia. Ciertos ejemplos específicos de pares de tinte/inactivador (es decir, pares de donante/aceptor) incluyen, pero no se limitan a, Alexa Fluor 350/Alexa Fluor488; Alexa Fluor 488/Alexa Fluor 546; Alexa Fluor 488/Alexa Fluor 555; Alexa Fluor 488/Alexa Fluor 568; Alexa Fluor 488/Alexa Fluor 594; Alexa Fluor 488/Alexa Fluor 647; Alexa Fluor 546/Alexa Fluor 568; Alexa Fluor 546/Alexa Fluor 594; Alexa Fluor 546/Alexa Fluor 647; Alexa Fluor 555/Alexa Fluor 594; Alexa Fluor 555/Alexa Fluor 647; Alexa Fluor 568/Alexa Fluor 647; Alexa Fluor 594/Alexa Fluor 647; Alexa Fluor 350/QSY35; Alexa Fluor 350/dabcilo; Alexa Fluor 488/QSY 35; Alexa Fluor 488/dabcilo; Alexa Fluor 488/QSY 7 o QSY 9; Alexa Fluor 555/QSY 7 o QSY9; Alexa Fluor 568/QSY 7 o QSY 9; Alexa Fluor 568/QSY 21; Alexa Fluor 594/QSY 21; y Alexa Fluor 647/QSY 21. En algunos casos, el mismo extintor se puede usar para múltiples tintes, por ejemplo, un extintor de amplio espectro, como un extintor Iowa Black® (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) o un agujero negro Quencher™ (BHQTM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

[0185] En algunas realizaciones, por ejemplo, en una reacción múltiplexada en la que dos o más restos (como los amplicones) se detectan simultáneamente, cada sonda comprende un colorante de forma detectable diferente de modo que los tintes se pueden distinguir cuando se detectan simultáneamente en la misma reacción. Un experto en la técnica puede seleccionar un conjunto de tintes detectables diferentes para usar en una reacción múltiplex.

[0186] Los ejemplos específicos de ribonucleótidos marcados con fluorescencia útiles en la preparación de sondas de TA-PCR para su uso en algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento están disponibles de Molecular Probes (Invitrogen), y éstos incluyen, Alexa Fluor 488-5-UTP, fluoresceína -12-UTP, BODIPY FL-14-UTP, BODIPY TMR-14-UTP, Tetrametilrodamina-6-UTP, Alexa Fluor 546-14-UTP, Téjas Rojo-5-UTP y BODIPY TR-14-UTP. Otros ribonucleótidos fluorescentes están disponibles en Amersham Biosciences (GE Healthcare), como Cy3-UTP y Cy5-UTP.

[0187] Los ejemplos de desoxirribonucleótidos marcados con fluorescencia útiles en la preparación de sondas de TA-PCR para uso en los métodos descritos en el presente documento incluyen dinitrofenilo (DNP)-1'-dUTP, Cascada Azúl-7-dUTP, Alexa Fluor 488-5-dUTP, Fluoresceína-12-dUTP, Oregon Verde 488-5-dUTP, BODIPY FL-14-dUTP, Rodamina Verde-5-dUTP, Alexa Fluor 532-5-dUTP, BODIPY TMR-14-dUTP, Tetrametilrodamina-6-dUTP, Alexa Fluor 546-14-dUTP, Alexa Fluor 568-5-dUTP, Téjas Rojo-12-dUTP, Téjas Rojo-5-dUTP, BODIPY TR-14-dUTP, Alexa Fluor 594-5-dUTP, BODIPY 630/650-14-dUTP, BODIPY 650/665-14-dUTP; Alexa Fluor 488-7-OBEA-dCTP, Alexa Fluor 546-16-OBEA-dCTP, Alexa Fluor 594-7- OBEA-dCTP, Alexa Fluor 647-12-OBEA-dCTP. Los nucleótidos marcados por fluorescencia están disponibles comercialmente y se pueden comprar en, por ejemplo, Invitrogen.

[0188] En algunas realizaciones, tintes y otros restos, tales como desactivadores, se introducen en polinucleótido usado en los métodos descritos en el presente documento, tales como sondas FRET, a través de los nucleótidos modificados. Un "nucleótido modificado" se refiere a un nucleótido que ha sido modificado químicamente, pero aún funciona como un nucleótido. En algunas realizaciones, el nucleótido modificado tiene un resto químico, tal como un tinte o extintor, unido covalentemente, y puede introducirse en un polinucleótido, por ejemplo, mediante la síntesis en fase sólida del polinucleótido. En otras realizaciones, el nucleótido modificado incluye uno o más grupos reactivos que pueden reaccionar con un tinte o extintor antes, durante o después de la incorporación del nucleótido modificado en el ácido nucleico. En realizaciones específicas, el nucleótido modificado es un nucleótido modificado con amina, es decir, un nucleótido que se ha modificado para tener un grupo amino reactivo. En algunas realizaciones, el nucleótido modificado comprende un resto de base modificado, tal como uridina, adenosina, guanosina y/o citosina. En realizaciones específicas, el nucleótido modificado con amina se selecciona de 5-(3-aminoalilo)-UTP; 8-[(4-amino)butilo]-amino-ATP y 8-[(6-amino)butilo]-amino-ATP; N6-(4-amino)butilo-ATP, N6-(6-amino)butilo-ATP, N4-[2,2-oxi-bis-(etilamina)]-CTP; N6-(6-amino)hexilo-ATP; 8-[(6-Amino)hexilo]-amino-ATP; 5-propargilamino-CTP, 5-propargilamino-UTP. En algunas realizaciones, los nucleótidos con diferentes restos de nucleobases se modifican de manera similar, por ejemplo, 5-(3-aminoalilo)-GTP en lugar de 5-(3-aminoalilo)-UTP. Muchos nucleótidos modificados con aminas están disponibles comercialmente en, por ejemplo, Applied Biosystems, Sigma, Jena Bioscience y TriLink.

[0189] Los restos detectables ejemplares también incluyen, pero no se limitan a, miembros de pares de unión. En algunas de tales realizaciones, un primer miembro de un par de unión está unido a un polinucleótido. El segundo miembro del par de unión está vinculado a una etiqueta detectable, como una etiqueta fluorescente. Cuando el polinucleótido unido al primer miembro del par de unión se incuba con el segundo miembro del par de unión vinculado al marcador detectable, el primer y el segundo miembro del par de unión asociados y el polinucleótido pueden detectarse. Los pares de unión ejemplares incluyen, pero no se limitan a, biotina y estreptavidina, anticuerpos y antígenos, etc.

[0190] En algunas realizaciones, se detectan múltiples ARN diana en una única reacción múltiplex. En algunas de estas realizaciones, cada sonda que está dirigida a un ADNc único se puede distinguir espectralmente cuando se libera de la sonda. Por lo tanto, cada ARN diana se detecta mediante una señal de fluorescencia única.

[0191] Un experto en la técnica puede seleccionar un método de detección adecuado para un ensayo seleccionado, por ejemplo, un ensayo de TA-PCR en tiempo real. El método de detección seleccionado no necesita ser un método descrito anteriormente, y puede ser cualquier método.

4.3. Composiciones y kits ejemplares.

[0192] En otro aspecto, las composiciones, como se define en las reivindicaciones, para su uso en los métodos descritos aquí se proporcionan.

[0193] Se describen composiciones que comprenden al menos un cebador específico de ARN diana. El término "cebador específico de ARN diana" abarca los cebadores que tienen una región de nucleótidos contiguos que tienen una secuencia que está (i) idénticamente presente en un ARN diana, como AR, UPK1B, CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 o PIK3A ARNm, o ii) complementario a la secuencia de una región de nucleótidos contiguos que se encuentran en un ARN diana, como Ar, UPK1B, CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 o PIK3A. Se proporciona una composición que comprende pares de cebadores específicos de ARN diana, como se define en las reivindicaciones. El término "par de cebadores específicos de ARN diana" abarca pares de cebadores que son adecuados para amplificar una región definida de un ARN diana, como AR, UPK1B, CRH, IGF2, KRT20, ARNm ANXA10, UpK2, MGEA5 o PIK3A. Un par de cebadores específicos de ARN diana típicamente comprende un primer cebador que comprende una secuencia que es idéntica a la secuencia de una región de un ARN diana (aunque el cebador típicamente comprenderá ADN o modificado) nucleósidos en lugar de ARN) y un segundo cebador que comprende una secuela una vez que es complementaria a una región de un ARN diana. Un par de cebadores es típicamente adecuado para amplificar una región de un ARNm diana que tiene una longitud de 50 a 1500 nucleótidos, una longitud de 50 a 1000 nucleótidos, una longitud de 50 a 750 nucleótidos, una longitud de 50 a 500 nucleótidos, una longitud de 50 a 400 nucleótidos, 50 a 300 nucleótidos largos, 50 a 200 nucleótidos largos, 50 a 150 nucleótidos largos, o 50 a 100 nucleótidos largos. Los cebadores ejemplares y los pares de cebadores no limitativos se muestran en las Tablas 1 y 6.

[0194] En algunas realizaciones, la composición comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, o seis pares de cebadores de ARN específico diana, un par para amplificar cada uno de AR y/o el ARNm de UPK1B y al menos un ARNm seleccionado de CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 y PIK3A, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, la composición comprende adicionalmente un par de cebadores específicos de ARN diana para amplificar un ARN de control endógeno y/o un par de cebadores específicos de ARN diana para amplificar un ARN de control exógeno.

[0195] En algunas realizaciones, la composición comprende al menos una sonda de ARN específico diana. El término "sonda específica de ARN diana" abarca sondas que tienen una región de nucleótidos contiguos que tienen una secuencia que está (i) idénticamente presente en un ARN diana, como AR, UPK1B, CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5, o ARNm de PIK3A, o (ii) complementario a la secuencia de una región de nucleótidos contiguos encontrados en un ARN diana, como AR, UPK1B, CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 o PIK3A ARNm. Sondas específicas diana ejemplares no limitantes se muestran en las Tablas 1 y 6.

[0196] En algunas realizaciones, la composición (incluyendo una composición descrita anteriormente que comprende uno o más pares de cebadores de ARN específico diana) comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o seis sondas, una sonda para detectar cada una de AR y/o UPK1B, y al menos un ARNm seleccionado de CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 y PIK3A. En algunas realizaciones, la composición comprende adicionalmente una sonda para detectar un ARN de control endógeno y/o una sonda para detectar un ARN de control exógeno.

[0197] En algunas realizaciones, la composición es una composición acuosa. En algunas realizaciones, la composición acuosa comprende un componente de tamponamiento, tal como fosfato, tris, HEPES, etc., y/o componentes adicionales, como se describe a continuación. En algunas realizaciones, la composición es seca, por ejemplo, liofilizada, y adecuada para la reconstitución mediante la adición de fluido. Una composición seca puede incluir uno o más componentes tamponadores y/o componentes adicionales.

[0198] En algunas realizaciones, la composición comprende además uno o más componentes adicionales. Los componentes adicionales incluyen, pero no se limitan a, sales, tales como NaCl, KCl, y MgCh; polimerasas, incluyendo polimerasas termoestables tales como Taq; dNTPs; transcriptasas inversas, tales como transcriptasa inversa MMLV; inhibidores de la ARNasa; albúmina de suero bovino (BSA) y similares; agentes reductores, tales como p-mercaptoetanol; EDTA y similares; un experto en la técnica puede seleccionar componentes de composición adecuados dependiendo del uso previsto de la composición.

[0199] Se describen composiciones que comprenden al menos un polinucleótido para la detección de al menos un ARN diana. El polinucleótido se puede usar como cebador para una reacción de transcriptasa inversa. El polinucleótido se puede usar como cebador para la amplificación. El polinucleótido se puede usar como cebador para la TA-PCR. El polinucleótido se puede usar como una sonda para detectar al menos un ARN diana. El polinucleótido puede estar marcado de forma detectable. El polinucleótido puede ser una sonda FRET. El polinucleótido puede ser una sonda TaqMan®, una Baliza Molecular o una sonda Scorpion.

[0200] En el presente documento se describe una composición que comprende al menos una sonda FRET que tiene una secuencia que está presente de manera idéntica o complementaria a una región de ARNm de CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 o PIK3A. La sonda FRET puede estar marcada con un par donador/aceptor, de modo que cuando la sonda se digiere durante la reacción de PCR, produce una emisión de fluorescencia única que se asocia con un ARN diana específico. Cuando una composición comprende múltiples sondas FRET, cada sonda puede marcarse con un par donante/aceptor diferente, de modo que cuando la sonda se digiere durante la reacción de PCR, cada uno produce una emisión de fluorescencia única que se asocia con una secuencia de sonda específica y/o ARN diana. La secuencia de la sonda FRET puede ser complementaria a una región diana de un ARN diana. La sonda FRET puede tener una secuencia que comprende uno o más desajustes de base cuando se compara con la secuencia de la región diana mejor alineada de un ARN diana.

[0201] En este documento se describe una composición que comprende una sonda FRET que consta de al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, o al menos 25 nucleótidos, en donde al menos una parte de la secuencia está presente de manera idéntica o complementaria a una región de ARN AR, UPK1B, CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 o PIK3A. Al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24 o al menos 25 nucleótidos de la sonda FRET pueden estar presentes de manera idéntica o complementaria a una región de ARNm AR, UPK1B, CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5, o PIK3A. La sonda FRET puede tener una secuencia con uno, dos o tres desapareamientos de bases cuando se compara con la secuencia o el complemento de ARNm AR, UPK1B, CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 o PIK3A.

[0202] En el presente documento se describe un kit que comprende un polinucleótido descrito anteriormente. Un kit puede comprender al menos un cebador y/o sonda discutidos anteriormente. Un kit puede comprender al menos una polimerasa, tal como una polimerasa termoestable. Un kit puede comprender dNTPs. Los kits para uso en los métodos de TA-PCR en tiempo real descritos en el presente documento pueden comprender una o más sondas FRET específicas de ARN diana y/o uno o más cebadores para la transcripción inversa de los ARN diana y/o uno o más cebadores para la amplificación de los ARN diana o los ADNcs se transcriben a la inversa.

[0203] En algunas realizaciones, uno o más de los cebadores y/o sondas son "lineales". Un cebador "lineal" se refiere a un polinucleótido que es una molécula monocatenaria, y típicamente no comprende una región corta de, por ejemplo, al menos 3, 4 o 5 nucleótidos contiguos, que son complementarios a otra región dentro del mismo polinucleótido tal como que el cebador forma un dúplex interno. En algunas realizaciones, los cebadores para uso en transcripción inversa comprenden una región de al menos 4, como al menos 5, como al menos 6, como al menos 7 o más nucleótidos contiguos en el extremo 3' que tiene una secuencia que es complementaria a la región de al menos 4, tal como al menos 5, tal como al menos 6, tal como al menos 7 o más nucleótidos contiguos en el extremo 5' de un ARN diana.

[0204] Un kit como se describe en el presente documento puede comprender uno o más pares de cebadores lineales (un "cebador directo" y un "cebador inverso") para la amplificación de un ADNc transcrito a la inversa de un ARN diana, como AR, UPK1B, CRH, ARNm de IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 o PIK3A. Por consiguiente, un primer cebador puede comprender una región de al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24 o al menos 25 nucleótidos contiguos que tienen una secuencia que es idéntica a la secuencia de una región de al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, a al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24 o al menos 25 nucleótidos contiguos en una primera ubicación en el ARNm. Además, un segundo cebador puede comprende una región de al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24 o al menos 25 nucleótidos contiguos que tienen una secuencia que es complementaria a la secuencia de una región de al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, o al menos 25 nucleótidos contiguos en una segunda ubicación en el ARNm, de modo que una reacción de PCR que utiliza los dos cebadores produce un amplicón que se extiende desde la primera ubicación del ARNm hasta la segunda ubicación del ARNm.

[0205] El kit puede comprender al menos dos, al menos tres, o al menos cuatro conjuntos de cebadores, cada uno de los cuales es para la amplificación de un ADNc que se transcribe de forma inversa a partir de un ARN diana diferente, incluyendo ARNm de AR, UPK1B, CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, UPK2, MGEA5 y PIK3A. El kit puede comprender además al menos un conjunto de cebadores para amplificar un ARN de control, tal como un control endógeno y/o un control exógeno.

[0206] Las sondas y/o cebadores para uso en las composiciones descritas en este documento pueden comprender desoxirribonucleótidos. Las sondas y/o cebadores para uso en las composiciones descritas en el presente documento pueden comprender desoxirribonucleótidos y uno o más análogos de nucleótidos, tales como análogos de LNA u otros análogos de nucleótidos estabilizantes dúplex descritos anteriormente. Las sondas y/o cebadores para uso en las composiciones descritas en este documento pueden comprender todos los análogos de nucleótidos. Las sondas y/o cebadores pueden comprender uno o más análogos de nucleótidos estabilizadores de dúplex, tales como análogos de LNA, en la región de complementariedad.

[0207] Los kits para uso métodos de TA-PCR en tiempo real descritos en este documento pueden comprender además reactivos para su uso en la transcripción y la amplificación de reacciones inversas. Los kits pueden comprender enzimas como la transcriptasa inversa y una ADN polimerasa estable al calor, como la polimerasa Taq. Los kits pueden comprender además trifosfatos de desoxirribonucleótidos (dNTP) para uso en transcripción inversa y amplificación. Los kits pueden comprender tampones optimizados para la hibridación específica de las sondas y cebadores.

[0208] Los siguientes ejemplos son solo para fines ilustrativos, y no pretenden ser limitativos de ninguna manera.

5. EJEMPLOS

5.1. Ejemplo 1: Detección de cáncer de vejiga de grado alto y bajo

[0209] Se evaluaron más de 30 marcadores de ARNm y 20 marcadores de microARN en muestras de orina y tejido de vejiga para determinar el panel más preciso para la detección del cáncer de vejiga. Basado en los resultados de más de 200 muestras de orina que utilizan ocho marcadores y el sistema GeneXpert (Cepheid, Sunnyvale, CA), se seleccionó un panel que consta de marcadores de ARNm de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10 (con o sin al menos un control endógeno y/o al menos exógeno.

[0210] Varias composiciones de reacción fueron diseñadas para su uso en el sistema GeneXpert®, para la detección de diversas combinaciones de ARNm de CRH, IGF2, KRT20, y ANXA10. La Tabla 1 muestra las secuencias de los cebadores y las sondas utilizadas para detectar cada uno de los ARN diana mediante TA-PCR cuantitativa en las diversas composiciones de reacción.

Tabla 1: Secuencias de cebadores y sondas

[0211] Las composiciones de cebadores y sondas finales de tres composiciones de reacción diferentes se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2: Cebadores y sondas en TSR CL3, CL4 y CL1

[0212] Cada reacción contenía 50-90 mM de KCl, 3-5 mM de MgCÍ², 400 a 825 pM de dNTP, Tris 20 mM, pH 8,5, 0,01% de azida de sodio, y 0,9 unidades/pl de inhibidor de RNasa. La transcriptasa inversa MMLV (0,375 unidades/pl) y AptaTaq (0,25 unidades/pl; Roche) se utilizaron para la transcripción inversa y la amplificación, respectivamente. TSR CL1 incluyó un control exógeno Armored RNA® (SEQ ID NO: 47; Asuragen, Austin, TX).

[0213] Para cada muestra a ensayar, se añadió 5 mL de orina evacuada a 5 ml conservante (3,5 M de guanidina HCl, 1% de N-acetilo-L-cisteína, citrato de sodio 25 mM, y 2,5% de Tween-20, pH 3.2), preferiblemente dentro de 1 hora de la recolección de la muestra. Las muestras conservadas se transportaron en hielo y se almacenaron a 4°C. La información clínica para cada muestra fue proporcionada por los sitios de recolección. El número de glóbulos rojos por mililitro se determinó mediante evaluación microscópica.

[0214] Antes de su uso, la orina conservada se invirtió tres veces para mezclar. Se cargaron 1,2 ml de orina conservada en un cartucho GeneXpert para su análisis. El cartucho contenía un filtro de 0,8 pM para capturar las células uroteliales. Las células capturadas se lavaron y se lisaron utilizando sonicación (2-15 segundos, 8-16 pM a 36 kHz) dentro del cartucho. El lisado se usó luego para reconstituir los reactivos utilizados para la TA-PCR en tiempo real (descrito anteriormente). El ciclo de reacción utilizado fue: 10 minutos a 45°C, seguido de 2 minutos a 95°C y luego 45 ciclos de (a) 5 segundos a 95°C, 20 segundos a 60°C y 20 segundos a 72°C, utilizando un cartucho GeneXpert® en un sistema GeneXpert®. Delta Ct (ACt) se calculó como Ct (ABL)-Ct (marcador). El límite de ACt se estableció como el ACt que dio al menos una especificidad del 95% con muestras de pacientes que no se esperaba que tuvieran cáncer de vejiga (datos no mostrados). Un ACt por encima del límite de ACt para cualquiera de los marcadores se consideró un resultado positivo, indicativo de la presencia de cáncer de vejiga.

[0215] Algunas muestras también se analizaron utilizando UroVysion® (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Los resultados de ese experimento se muestran en la Tabla 3 (cáncer de vejiga de alto grado) y en la Tabla 4 (cáncer de vejiga de bajo grado). Se resaltan ACts por encima del umbral, que indican un resultado positivo. Cada uno de los tres lotes de TSR, CL3, CL4 y CL1, detectó el 100% de las muestras de cáncer de vejiga de alto grado, al igual que UroVysion®.

[0216] Para el cáncer de vejiga de bajo grado, la tasa de detección fue del 37% (7/19), en comparación con solo el 16% (3/19) para UroVysion®.

Tabla 3: Detección de cáncer de vejiga de alto grado Tabla 4: Detección de cáncer de vejiga de bajo grado

[0217] Un resumen de la sensibilidad para el cáncer de alto grado de la vejiga y el cáncer de vejiga de bajo grado, y la especificidad en los pacientes con un bajo riesgo de cáncer de vejiga, se muestra en la Tabla 5 para cada uno de los marcadores individuales ensayados en las Tablas 3 y 4.

Tabla 5: Resumen de sensibilidad y especificidad de marcadores individuales

[0218] Los cebadores y sondas alternativas ejemplares para detectar los cuatro marcadores, KRT20, IGF2, CRH y ANXA10, se muestran en la Tabla ⁶. La Tabla ⁶también muestra un conjunto ejemplar de cebadores y sondas para detectar un control exógeno y un control endógeno, ABL. Los tintes y los inhibidores que se muestran en la Tabla ⁶son genéricos, y dos o más de los inhibidores Q1 a Q⁶pueden ser los mismos (Q1 es dabcilo, como se indica en la secuencia). Un experto en la técnica podría seleccionar un conjunto adecuado, por ejemplo, un conjunto de tintes detectables diferentes para uso en un ensayo múltiplex. También se muestra la longitud de amplicón predicha para cada conjunto de cebadores, así como la longitud de cualquier intrón interviniente entre los sitios del cebador en la copia genómica del objetivo.

Tabla 6: Secuencias de cebadores y sondas

(continúa)

5.2. Ejemplo 2: sensibilidad del ensayo para detectar el cáncer de vejiga utilizando el panel marcador KRT20, IGF2, CRH y ANXA10 en una cohorte más grande

[0219] Las muestras de orina se recogieron de los sujetos en siete sitios diferentes. Los criterios de elegibilidad para la inclusión en el estudio incluyeron:

• 18 años o más;

• Consentimiento informado documentado según lo exija el IRB o HREC que lo revisa, y un proyecto de ley firmado de derechos de los pacientes para sujetos experimentales en California;

• Al menos uno de los siguientes criterios:

◦ Una historia o recurrencia de cáncer de vejiga;

◦ Una referencia para la evaluación de la cistoscopia debido a hematuria microscópica o macroscópica en la orina;

◦ Una referencia para la evaluación de urología, pero sin antecedentes de cáncer de vejiga o evidencia clínica de cáncer de vejiga;

• El consentimiento para proporcionar al menos 15 ml de orina evacuada además de la requerida para el estándar de atención;

• Consentimiento para permitir resultados patológicos para cualquier muestra de biopsia tomada durante el procedimiento de cistoscopia y otros registros médicos a ser reportados.

Los criterios de exclusión incluyeron solo los menores de 18 años y la primera orina evacuada. Los pacientes actualmente o previamente tratados con Bacillus Calmette-Guerin (BCG) y los pacientes actualmente o previamente tratados con terapia intravesical o resección transuretral de vejiga o radioterapia para el cáncer de vejiga fueron elegibles para el estudio. Además, también se permitió la inscripción repetida durante el curso del estudio.

[0220] Dos de los sitios de recolección proporcionaron los resultados del análisis UroVysion® en las muestras de orina. Para cada muestra a analizar, se agregaron 15 ml de orina vaciada a 15 ml de conservante (guanidina HCl 3,5 M, N-acetilo-L-cisteína al 1%, citrato de sodio 25 mM y Tween-20 al 2,5%, pH 3,2). Preferiblemente dentro de 1 hora de la recolección de la muestra. Las muestras conservadas se transportaron en hielo y se almacenaron a 4°C. La información clínica para cada muestra fue proporcionada por los sitios de recolección.

[0221] Antes de su uso, la orina conservada se invirtió tres veces para mezclar. Se cargaron 4 ml de orina conservada en un cartucho GeneXpert para su análisis. El cartucho contenía un filtro de 0,8 pM para capturar las células uroteliales. Las células capturadas se lavaron y se lisaron utilizando sonicación (2-15 segundos, 8-16 pM a 36 kHz) dentro del cartucho. El lisado se usó luego para reconstituir los reactivos utilizados para la TA-PCR en tiempo real (descrito anteriormente). El ciclo de reacción utilizado fue: 10 minutos a 45°C, seguido de 2 minutos a 95°C y luego 45 ciclos de (a) 5 segundos a 95°C, ²⁰segundos a 60°C y ^{2 0}segundos a 72°C, utilizando un cartucho GeneXpert® en un sistema GeneXpert®. Para genes ANXA10, KRT20 y IGF2, delta Ct (ACt) se calculó como Ct (ABL)-Ct (marcador). El límite de ACt se estableció como el ACt que dio una alta especificidad (> 90%) con muestras de pacientes que no se espera que tengan cáncer de vejiga (datos no mostrados). Un ACt por encima del límite de ACt para cualquiera de los marcadores se consideró un resultado positivo, indicativo de la presencia de cáncer de vejiga. Para ^cR^h, se usaron valores de Ct en lugar de ACt para determinar la positividad para el marcador CRH. Un valor de CRH Ct <45 se consideró un resultado positivo, indicativo de la presencia de cáncer de vejiga. Además de los cuatro marcadores de cáncer de vejiga (KRT20, IGF2, CRH y ANXA10), el ensayo de cáncer de vejiga GeneXpert® incluyó dos controles: cebadores y sonda para detectar ARNm de ABL en las muestras, y cebadores y sonda para detectar un ARN de control exógeno de Armored RNA®.

[0222] En el primer análisis, 132 muestras recogidas de pacientes que tuvieron resultados cistoscopia positivos para cáncer de vejiga fueron probados con el ensayo de cáncer de vejiga GeneXpert®. Sesenta de esas muestras también se habían analizado con UroVysion®. La tabla 7 muestra los resultados para esas 132 muestras.

Tabla 7: Sensibilidad del ensayo por estadio y grado de cáncer de vejiga

[0223] Como se muestra en la Tabla 7, para estas muestras, el ensayo de cáncer de vejiga GeneXpert® tenía una sensibilidad de 54,1% para el cáncer de vejiga de bajo grado y una sensibilidad del 89,7% para el cáncer de vejiga de alto grado. En contraste, UroVysion® tenía una sensibilidad de solo el 24% para el cáncer de vejiga de bajo grado y una sensibilidad del 76,6% para el cáncer de vejiga de alto grado. Además, el ensayo de cáncer de vejiga GeneXpert® fue capaz de detectar todos los grados y etapas del cáncer de vejiga.

[0224] El mismo conjunto de datos se divide entonces en función de tres grupos de pacientes: (A) pacientes con un historial de cáncer de vejiga que en la actualidad se está supervisando para la recurrencia de cáncer de vejiga, (B) pacientes que habían sido tratados con Bacillus Calmette-Guerin (BCG) dentro de los tres meses anteriores a la toma de la muestra, y (C) pacientes que presentaban síntomas de cáncer de vejiga y no tenían antecedentes de cáncer de vejiga. Los resultados para esos grupos de pacientes se muestran en la Tabla ⁸.

Tabla 8: Sensibilidad del ensayo por población de pacientes

(continúa)

[0225] Como se muestra en la Tabla 8, el ensayo de cáncer de vejiga GeneXpert® tuvo una sensibilidad similar para el cáncer de vejiga de grado bajo y de grado alto en pacientes controlados por cáncer de vejiga y en pacientes que eran sintomáticos de cáncer de vejiga como en el grupo de pacientes como un entero (ver tabla 7). En pacientes que habían sido tratados con BCG en los últimos tres meses, el ensayo de cáncer de vejiga GeneXpert® tenía una sensibilidad del 66,7%, aunque el tamaño de la muestra era demasiado pequeño (6 muestras) para extraer conclusiones de ese resultado.

[0226] Con el fin de tener una comparación directa del ensayo de cáncer de vejiga GeneXpert® y UroVysion®, se seleccionó un conjunto de datos que incluía solo muestras que se habían analizado con ambos ensayos. La Tabla 9 muestra los resultados para ese conjunto de datos, con los pacientes separados en dos grupos: (A&B) pacientes con antecedentes de cáncer de vejiga que actualmente estaban siendo monitoreados para detectar la recurrencia del cáncer de vejiga, combinados con pacientes que habían sido tratados con Bacillus Calmette-Guerin (BCG) dentro de los tres meses previos a la recolección de la muestra (estos grupos se combinaron porque solo una muestra de un paciente tratado con BCG se había analizado con ambos análisis), y pacientes con síntomas de cáncer de vejiga y sin antecedentes de cáncer de vejiga.

Tabla 9: Sensibilidad de ensayo para muestras analizadas con GeneXpert® y UroVysion®

(continúa)

[0227] Como se muestra en la Tabla 9, para las muestras que se analizaron con el ensayo de cáncer de vejiga GeneXpert® y UroVysion®, el ensayo de cáncer de vejiga GeneXpert® mostró mayor sensibilidad que UroVysion® para detectar cáncer de grado bajo y grado alto en ambos grupos de pacientes.

[0228] A continuación, el conjunto de datos se dividió en muestras que se habían archivado, lo que significa que se analizaron más de una semana después de la recolección (las muestras iban desde los ⁸días hasta los nueve meses), y las muestras eran nuevas, lo que significa que fueron ensayadas dentro de una semana de recogida. Los resultados de ese análisis se muestran en la Tabla 10.

Tabla 10: Sensibilidad de ensayo en muestras archivadas y frescas.

[0229] Como se muestra en la Tabla 10, el ensayo de cáncer de vejiga GeneXpert® tenían una sensibilidad similar para la detección de bajo grado y el cáncer de vejiga de alto grado en muestras frescas y archivadas.

5.3. Ejemplo 3: Especificidad del ensayo para detectar el cáncer de vejiga utilizando el panel marcador KRT20, IGF2, CRH y ANXA10 en una cohorte más grande

[0230] Además de las muestras de pacientes con resultados de cistoscopia positivos para el cáncer de vejiga, se tomaron muestras de orina en los siete sitios de pacientes con resultados de cistoscopia negativos para el cáncer de vejiga, pero que estaban siendo monitoreadas para detectar la recurrencia del cáncer de vejiga, habían recibido BCG dentro de los tres meses anteriores a la recolección de la muestra, y que parecían ser sintomáticos para el cáncer de vejiga pero no tenían antecedentes de cáncer de vejiga. Además, se tomaron muestras de orina de pacientes con referencias urológicas para otras afecciones sospechosas, como cálculos renales. Finalmente, se tomaron muestras de orina de individuos sanos. Las muestras de orina se conservaron y analizaron utilizando el ensayo de cáncer de vejiga GeneXpert® como se describe en el Ejemplo 2.

[0231] Para las muestras de pacientes con resultados negativos de cistoscopia para cáncer de vejiga, los resultados del ensayo fueron divididos de acuerdo con los tres grupos de pacientes: (A) pacientes con antecedentes de cáncer de vejiga que actualmente estaban siendo monitoreados para la recurrencia del cáncer de vejiga, (B) pacientes que habían sido tratados con Bacillus Calmette-Guerin (BCG) dentro de los tres meses anteriores a la toma de muestras, y (C) pacientes que presentaban síntomas de cáncer de vejiga y no tenían antecedentes de cáncer de vejiga. Los resultados para esos grupos de pacientes se muestran en la Tabla 11.

Tabla 11: Especificidad del ensayo en pacientes con cistoscopia negativa por población

[0232] Como se muestra en la Tabla 11, el ensayo de cáncer de vejiga GeneXpert® tenía una especificidad del 73,9%, 85,7% y 84,3% para los grupos de pacientes (A), (B) y (C), respectivamente.

[0233] A continuación, la especificidad del ensayo de cáncer de vejiga en pacientes GeneXpert® que eran sospechosos de tener otras afecciones urológicas, pero no el cáncer de vejiga, se determinó. Se recogieron setenta muestras de pacientes en esta categoría. Los resultados con el ensayo de cáncer de vejiga GeneXpert® fueron 14 positivos, 50 negativos y ⁶resultados no válidos. La especificidad del ensayo de cáncer de vejiga GeneXpert® para esta población de pacientes fue, por lo tanto, del 78,1%.

[0234] Por último, se determinó la especificidad del ensayo de cáncer de vejiga GeneXpert® en individuos sanos. Se tomaron cincuenta y cinco muestras en esta categoría. Los resultados fueron 4 positivos y 51 negativos, lo que indica una especificidad del 92,7% para esta categoría de materias.

5.4. Ejemplo 4: Detección de cáncer de vejiga en muestras que fueron débilmente positivas o falsas negativas utilizando el panel marcador KRT20, IGF2, CRH y ANXA10

[0235] Se analizaron utilizando dos marcadores adicionales, receptor de andrógenos (AR) y una colección de muestras, incluyendo muchas muestras que eran débilmente positivo o falso negativo de las cohortes anteriores, uroplakin 1B (UPK1B).

[0236] Dos mililitros de orina conservada se cargaron en un cartucho de GeneXpert® y la orina se pasó a través del filtro. Las células atrapadas en el filtro se eliminaron utilizando un tiocianato de guanidinio 3M y sarcosilo al 0,1%. El ARN de las células se purificó utilizando un mini kit RNeasy (Qiagen). Las muestras de ARN luego se analizaron en un SmartCycler® (Cepheid, Sunnyvale, CA). Cada reacción contenía 5 pl de ARN purificado, cebador directo 400 nM para ABL, cebador delantero 400 nM para cada ARN diana (AR y/o UPK1B), cebador inverso 400 nM para ABL, cebador inverso 400 nM para cada ARN diana, 200 sonda nM Ab L, y 300 nM de sonda para cada ARN diana, KCl 50-90 mM, MgCl²3-5 mM, 400-825 pM dNTPs, Tris 20 mM, pH 8,5, azida de sodio 0,01%, y 0,125 unidades/pl del inhibidor de la ARNasa. La transcriptasa inversa MMLV (0,375 unidades/pl) y AptaTaq (0,25 unidades/pl; Roche) se utilizaron para la transcripción inversa y la amplificación, respectivamente. El ciclo utilizado fue de 45°C durante 600 segundos, 95°C durante 120 segundos y 45 ciclos de: 95°C durante cinco segundos, 60°C durante 20 segundos y 72°C durante 20 segundos. Las secuencias de cebadores y sondas para detectar AR y UPK1B se muestran en la Tabla 12.

Tabla 12: Cebadores y sondas

[0237] Si el ABL Ct era mayor que 39, la muestra se retiró del análisis. Delta Ct (ACt) se calculó como Ct (ABL) - Ct (marcador). El límite _ACt para AR se estableció como -4,5 y el punto de corte ACt para UPK1B se fijó en 1,5. Un ACt por encima del límite de ACt para cualquiera de los marcadores se consideró un resultado positivo, indicativo de la presencia de cáncer de vejiga. Si no se detectó ningún objetivo en la muestra, el Ct se estableció en 0 y el ACt se estableció en -20. Los resultados del experimento se muestran en la Tabla 13.

Tabla 13: Detección de cáncer de vejiga mediante AR y UPK1B

(continúa)

[0238] Utilizando cualquiera de AR o UPK1B como un marcador de cáncer de vejiga, al menos seis muestras fueron identificados como positivos para cáncer de vejiga que había sido previamente identificado como falsos negativos utilizando el panel de cuatro marcador descrito anteriormente.

[0239] La sensibilidad y la especificidad para detectar el cáncer de vejiga con AR o UPK1B se muestran en la Tabla 14.

Tabla 14: Sensibilidad y especificidad.

[0240] Veintitrés muestras de cáncer de vejiga de grado alto y bajo se analizaron con AR y UPK1B. La sensibilidad de la combinación de AR y UPK1B (considerando tanto los positivos únicos como los dobles positivos como resultados positivos) para las muestras analizadas es del 87%.

[0241] Algunas de las muestras tenían niveles más bajos ABL, lo que indica que puede haber un bajo número de células en la muestra. En muestras con un ABL Ct de menos de 36, la sensibilidad de ambos marcadores aumenta, como se muestra en la Tabla 15.

Tabla 15: Sensibilidad y especificidad en muestras con ABL Ct <36

5.5. Ejemplo 5: Detección de cáncer de vejiga usando marcadores adicionales

[0242] Para determinar la combinación de marcadores que daría la mejor sensibilidad para el cáncer de vejiga mientras que se mantiene la especificidad con muestras normales en un 95% como razonable, el ensayo de vejiga Xpert se adaptó para evaluar los niveles de expresión de marcadores adicionales. Se formuló una nueva perla de reactivo que contenía cebadores y sondas para AR, ABL, PIK3CA, UPK1B, UPK2 y MGEA5 y se ensamblaron los cartuchos para que cada muestra de orina pudiera analizarse en cada uno de los dos ensayos y se recogió información de expresión sobre un total de ¹⁰marcadores.

[0243] Las secuencias de cebador y sonda se muestran en la Tabla 16,

Tabla 16: Secuencias de cebadores y sondas

[0244] Cada reacción contenía 50-90 mM de KCl, 3-5 mM de MgCl², 400 a 825 pM de dNTP, 20 mM de Tris, pH 8,5, 0,01% de azida de sodio, y 0,9 unidades/pl de inhibidor de RNasa. La transcriptasa inversa MMLV (0,375 unidades/pl) y AptaTaq (0,25 unidades/pl; Roche) se utilizaron para la transcripción inversa y la amplificación, respectivamente.

[0245] Para cada muestra a analizar, se agregaron 4,5 ml de orina vaciada a 4,5 ml de conservante (3,5M guanidina HCl, 1% N-acetilo-L-cisteína, 25 mM de citrato de sodio y 2.5% de Tween-20, pH 3.2), preferiblemente dentro de 1 hora de la recolección de la muestra. El contenedor se invirtió tres veces para mezclar. Las muestras conservadas se transportaron en hielo y se almacenaron a 2-8°C. La información clínica para cada muestra fue proporcionada por los sitios de recolección.

[0246] Un resumen de las muestras ensayadas se muestra en la Tabla 17.

Tabla 17: Resumen de muestras

[0247] Antes de su uso, la orina conservada se invirtió tres veces para mezclar. Se cargaron 4 ml de orina conservada en un cartucho GeneXpert para su análisis. El cartucho contenía un filtro de 0,8 pM para capturar las células uroteliales. Las células capturadas se lavaron y se lisaron utilizando sonicación (2-15 segundos, 8-16 pM a 36 kHz) dentro del cartucho. El lisado se usó luego para reconstituir los reactivos utilizados para la TA-PCR en tiempo real (descrito anteriormente). El ciclo de reacción utilizado fue: 10 minutos a 45°C, seguido de 2 minutos a 95°C y luego 45 ciclos de (a) 5 segundos a 95°C, 20 segundos a 60°C y 20 segundos a 72°C, usando un cartucho GeneXpert® en un sistema GeneXpert®. Delta Ct (ACt) se calculó como Ct (ABL) - Ct (marcador). El límite de ACt se estableció como el ACt que dio al menos una especificidad del 95% con muestras de pacientes que no se espera que tengan cáncer de vejiga. Un ACt por encima del límite de ACt para cualquiera de los marcadores se consideró un resultado positivo, indicativo de la presencia de cáncer de vejiga.

[0248] ABL Ct > 36 en el ensayo de cuatro marcadores que se muestra en la Tabla 20 se excluyeron del estudio. ABL Ct > 37 en el ensayo de cinco marcadores que se muestra en la Tabla 21 y en el ensayo de cuatro marcadores que se muestra en la Tabla 22 se excluyeron del estudio. Los valores de corte para la positividad se eligieron para permitir aproximadamente el 95% de especificidad con las muestras normales. Para MGEA5, una célula positiva es un valor diana delta Ct que es menor que el valor de corte, ya que se encontró que este marcador estaba regulado en forma descendente en muestras de orina de pacientes con cáncer de vejiga.

[0249] Se encontró que UPK2 tenía un patrón de expresión similar como ABL, lo que indica que podría ser utilizado como un control endógeno en lugar de ABL (datos no mostrados). Dado que UPK2 es principalmente específico de células uroteliales, las muestras con pocas o ninguna célula urotelial deben tener niveles bajos de ARN de UPK2, por lo que debería ser un control útil de la suficiencia de la muestra.

[0250] La Tabla 18 resume la sensibilidad y la especificidad para cada uno de los nueve marcadores y la Tabla 19 indica cuántas muestras fueron positivas solo por un marcador.

Tabla 18: Sensibilidad y especificidad por marcador individual.

Tabla 19: Número de muestras positivas por un solo marcador

[0251] La Tabla 20 resume las sensibilidades y especificidades para un ensayo de combinación de cuatro marcadores utilizando KRT20, ANXA10, CRH e IGF2. La Tabla 21 resume las sensibilidades y especificidades para un ensayo de combinación de cinco marcadores utilizando KRT20, ANXA10, CRH, IGF2 y UPK1B. La Tabla 22 resume las sensibilidades y especificidades para un ensayo de combinación de cuatro marcadores utilizando UPK1B, ANXA10, CRH e IGF2.

Tabla 20: Sensibilidad y especificidad de la combinación de 4 marcadores de KRT20, ANXA10, CRH e IGF2

Tabla 21: Sensibilidad y especificidad de la combinación de 5 marcadores de KRT20, ANXA10, CRH, IGF2 y UPK1B

Tabla 22: Sensibilidad y especificidad 4 combinación de marcadores de ANXA10, CRH, IGF2 y UPK1B

[0252] La adición de UPK1B, o sustitución de KRT20 con UPK1B, mejoró la sensibilidad del ensayo para un bajo grado y CIS. El reemplazo de KRT20 con UPK1B también mejoró la especificidad con pacientes con cistoscopias negativas de 67% a 69% en comparación con el ensayo de combinación de 4 marcadores con KRT20.

TABLA DE CIERTAS SECUENCIAS

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para detectar la presencia de cáncer de vejiga en un sujeto que comprende detectar el nivel de cada marcador de un conjunto de marcadores de cáncer de vejiga en una muestra de lavado de orina o vejiga del sujeto, en el que el conjunto de marcadores de cáncer de vejiga comprende uroplakina 1B (UPK1B), o receptor de andrógenos (AR), o ambos UPK1B y AR, y en donde la detección de un nivel elevado de al menos un marcador seleccionado de UPK1B y AR indica la presencia de cáncer de vejiga en el sujeto.

2. Un método para monitorear la terapia con anti-andrógenos en un sujeto con cáncer de vejiga que comprende detectar el nivel de cada marcador de un conjunto de marcadores de cáncer de vejiga en una muestra de lavado de orina o vejiga del sujeto en un primer momento, en donde el conjunto de marcadores de cáncer de vejiga comprende uroplakina 1B (UPK1B), o receptor de andrógenos (AR), o tanto UPK1B como AR, y en donde una disminución en el nivel de al menos un marcador en el primer punto de tiempo con relación a un segundo punto de tiempo indica que el sujeto está respondiendo a la terapia anti-andrógena.

3. El método de la reivindicación 2, en el que el sujeto está sometido a una terapia anti-andrógena en el primer punto de tiempo y en el que el segundo punto de tiempo es antes de que el sujeto comience la terapia anti-andrógena.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que:

a) el método comprende además la detección de un control endógeno, opcionalmente en el que el control endógeno se selecciona entre ABL, GUSB, GAPDH, TUBB y UPK1a; y/o

b) el método comprende además detectar un control exógeno, opcionalmente en el que el control exógeno es un ARN.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la detección comprende TA-PCR, opcionalmente en el que el método comprende TA-PCR cuantitativa, y opcionalmente en el que el método comprende la comparación de un valor de Ct o una A valor Ct a un valor Ct umbral o A Valor Ct.

⁶ . El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el método comprende poner en contacto el ARN de la muestra con un conjunto de pares de cebadores marcadores de cáncer de vejiga, en el que el conjunto de pares de cebadores marcadores de cáncer de vejiga comprende un primer par de cebadores para detectar AR, o un primer par de cebadores para detectar UPK1B, o un primer par de cebadores para detectar Ar y un segundo par de cebadores para detectar UPK1B, y opcionalmente, en donde cada par de cebadores marcadores de cáncer de vejiga produce un amplicón de 50 a 500 nucleótidos, 50 a 400 nucleótidos, 50 a 300 nucleótidos de largo, 50 a 200 nucleótidos de largo, o 50 a 150 nucleótidos de largo.

7. El método de la reivindicación 6, en el que el conjunto de pares de cebadores marcadores de cáncer de vejiga comprende:

a) un tercer par de cebadores para detectar un marcador seleccionado de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10; b) un tercer par de cebadores para detectar un marcador seleccionado entre CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10, y un cuarto par de cebadores para detectar un marcador seleccionado entre CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10, en donde el tercer par de cebadores y el cuarto cebador par detectar diferentes marcadores; o

c) un tercer par de cebadores para detectar un marcador seleccionado entre CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10, y un cuarto par de cebadores para detectar un marcador seleccionado entre CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10, y un quinto par de cebadores para detectar un marcador seleccionado de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10, en donde el tercer par de cebadores, el cuarto par de cebadores y el quinto par de cebadores detectan diferentes marcadores.

⁸ . El método de la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en el que el método comprende además formar un conjunto de amplicones marcadores de cáncer de vejiga, en el que el conjunto de amplicones marcadores de cáncer de vejiga comprende un amplicón AR, o un amplicón UPK1B, o tanto un amplicón AR como un amplicón UPK1B, y poniendo en contacto los amplicones marcadores de cáncer de vejiga con un conjunto de sondas de marcadores de cáncer de vejiga, en donde el conjunto de sondas de marcadores de cáncer de vejiga comprende una primera sonda para detectar el amplicón AR, o una primera sonda para detectar el amplicón UPK1B, o una primera sonda para Detectar el amplicón AR y una segunda sonda para detectar el amplicón UPK1B.

9. El método de la reivindicación 8, en el que:

a) el conjunto de amplicones marcadores de cáncer de vejiga comprende un tercer amplicón seleccionado de un amplicón CRH, un amplicón IGF2, un amplicón KRT20 y un amplicón ANXA10, y en el que el conjunto de sondas de marcadores de cáncer de vejiga comprende una tercera sonda para detectar el tercer amplicón;

b) el conjunto de amplicones marcadores de cáncer de vejiga comprende un tercer amplicón seleccionado entre un amplicón CRH, un amplicón IGF2, un amplicón KRT20 y un amplicón ANXA10, y un cuarto amplicón seleccionado entre un amplicón CRH, un amplicón IGF2, un amplicón KRT20, y un amplicón ANXA10, en el que el conjunto de sondas de marcadores de cáncer de vejiga comprende una tercera sonda para detectar el tercer amplicón y una cuarta sonda para detectar el cuarto amplicón, y en la que el tercer amplicón y el cuarto amplicón son diferentes; o

c) el conjunto de amplicones marcadores de cáncer de vejiga comprende un tercer amplicón seleccionado de entre un amplicón CRH, un amplicón IGF2, un amplicón KRT20 y un amplicón ANXA10, y un cuarto amplicón seleccionado entre un amplicón CRH, un amplicón IGF2, un amplicón KRT20 y un amplicón ANXA10 y un quinto amplicón seleccionados de un amplicón CRH, un amplicón IGF2, un amplicón KRT20 y un amplicón ANXA10, en donde el conjunto de sondas de marcadores de cáncer de vejiga comprende una tercera sonda para detectar el tercer amplicón y una cuarta sonda para detectar el cuarto amplicón y una quinta sonda para detectar el quinto amplicón, y en el que el tercer amplicón, el cuarto amplicón y el quinto amplicón son diferentes.

10. El método de la reivindicación ⁸o la reivindicación 9, en el que cada sonda de marcador de cáncer de vejiga comprende un tinte, y en el que cada tinte es notablemente diferente de los otros tintes; opcionalmente, en el que cada sonda comprende un tinte fluorescente y una molécula de extinción.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que:

a) el conjunto de marcadores de cáncer de vejiga se detecta en una única reacción múltiplex; y/o

b) el método comprende el uso del análisis discriminante lineal (ADL) para combinar dos o más de los niveles de marcadores de cáncer de vejiga en una puntuación combinada, opcionalmente en donde ADL se usa para combinar todos los niveles de marcadores de cáncer de vejiga en una puntuación combinada.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que:

a) el sujeto tiene al menos un síntoma de cáncer de vejiga, el síntoma opcionalmente seleccionado de dolor abdominal, sangre en la orina, micción dolorosa, micción frecuente, urgencia urinaria e incontinencia;

b) el sujeto tiene antecedentes de cáncer de vejiga y, opcionalmente, se está monitoreando la recurrencia del cáncer de vejiga y/o se ha tratado con Bacillus Calmette-Guerin (BCG) en los últimos tres meses; y/o c) el cáncer de vejiga es un cáncer de vejiga de bajo grado.

13. El uso de una composición que comprende un conjunto de pares de cebadores marcadores de cáncer de vejiga para detectar los niveles de cada marcador de un conjunto de marcadores de cáncer de vejiga en una muestra de lavado de orina o vejiga, en donde el conjunto de pares de cebadores marcadores de cáncer de vejiga comprende un primer par de cebadores para detección de AR, o un primer par de cebadores para detectar UPK1B, o un primer par de cebadores para detectar AR y un segundo par de cebadores para detectar UPK1B.

14. El método o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el conjunto de marcadores de cáncer de vejiga comprende además al menos un marcador seleccionado de hormona liberadora de corticotropina (C^rH), factor de crecimiento de tipo insulínico 2 (IGF2), queratina 20 (KRT20) y anexina 10 (ANXA10).

15. El método o uso de la reivindicación 14, en el que el conjunto de marcadores de cáncer de vejiga comprende a) AR, CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10;

b) AR, CRH, IGF2 y KRT20;

c) UPK1B, CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10;

d) UPK1B, CRH, IGF2 y KRT20;

e) AR, UPK1B, CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10;

f) AR, UPK1B, CRH, IGF2 y KRT20;

g) UPK1B, CRH, IGF2 y ANXA10; o

h) UPK1B, CRH, KRT20 y ANXA10.

16. Una composición que comprende un conjunto de pares de cebadores marcadores de cáncer de vejiga, en donde el conjunto de pares de cebadores marcadores de cáncer de vejiga comprende:

a) un primer par de cebadores para detectar AR o UPK1B, y un par de cebadores para detectar un marcador seleccionado entre CRH, IGF2, KrT20 y ANXA10; o

b) un primer par de cebadores para detectar AR y un segundo par de cebadores para detectar UPK1B.

17. La composición de la reivindicación 16, en la que el conjunto de pares de cebadores marcadores de cáncer de vejiga comprende:

a) un tercer par de cebadores para detectar un marcador seleccionado de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10; b) un tercer par de cebadores para detectar un marcador seleccionado entre CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10 y un cuarto par de cebadores para detectar un marcador seleccionado entre CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10, en donde el tercer par de cebadores y el cuarto par de cebadores detectan diferentes marcadores;

c) un tercer par de cebadores para detectar un marcador seleccionado de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10; un cuarto par de cebadores para detectar un marcador seleccionado de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10; y un quinto par de cebadores para detectar un marcador seleccionado de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10, en donde el tercer par de cebadores, el cuarto par de cebadores y el quinto par de cebadores detectan marcadores diferentes; d) un primer par de cebadores para detectar AR, un segundo par de cebadores para detectar CRH, un tercer par de cebadores para detectar IGF², un cuarto par de cebadores para detectar KRT^{2 0}y un quinto par de cebadores para detectar ANXA^{1 0};

e) un primer par de cebadores para detectar AR, un segundo par de cebadores para detectar CRH, un tercer par de cebadores para detectar IGF2 y un cuarto par de cebadores para detectar KRT20;

f) un primer par de cebadores para detectar UPK1B, un segundo par de cebadores para detectar CRH, un tercer par de cebadores para detectar IGF2, un cuarto par de cebadores para detectar KRT20 y un quinto par de cebadores para detectar ANXA10;

g) un primer par de cebadores para detectar UPK1B, un segundo par de cebadores para detectar CRH, un tercer par de cebadores para detectar IGF2 y un cuarto par de cebadores para detectar KRT20;

h) un primer par de cebadores para detectar AR, un segundo par de cebadores para detectar UPK1B, un tercer par de cebadores para detectar CRH, un cuarto par de cebadores para detectar IGF2, un quinto par de cebadores para detectar KRT20 y un sexto par de cebadores para la detección de ANXA10;

i) un primer par de cebadores para detectar AR, un segundo par de cebadores para detectar UPK1B, un tercer par de cebadores para detectar CRH, un cuarto par de cebadores para detectar IGF2 y un quinto par de cebadores para detectar KRT20;

j) un primer par de cebadores para detectar UPK1B, un segundo par de cebadores para detectar CRH, un tercer par de cebadores para detectar IGF2 y un cuarto par de cebadores para detectar ANXA10; o

k) un primer par de cebadores para detectar UPK1B, un segundo par de cebadores para detectar CRH, un tercer par de cebadores para detectar KRT20 y un cuarto par de cebadores para detectar ANXA10.

18. La composición de la reivindicación 16 o la reivindicación 17, en la que: la composición comprende además un conjunto de sondas marcadoras de cáncer de vejiga, en la que la serie de sondas marcadoras de cáncer de vejiga comprende:

a) una primera sonda para detectar un amplicón AR, o una primera sonda para detectar un amplicón UPK1B, o una primera sonda para detectar un amplicón AR y una segunda sonda para detectar un amplicón UPK1B, y opcionalmente:

A) una tercera sonda para detectar un tercer amplicón seleccionado de un amplicón CRH, un amplicón IGF2, un amplicón KRT20 y un amplicón ANXA10;

B) sondas tercera y cuarta para detectar amplicones tercero y cuarto seleccionados de un amplicón CRH, un amplicón IGF2, un amplicón KRT20 y un amplicón ANXA10, en donde el tercer amplicón y el cuarto amplicón son diferentes; o

C) sondas tercera, cuarta y quinta para detectar los amplicones tercero, cuarto y quinto seleccionados de un amplicón CRH, un amplicón IGF2, un amplicón KRT20 y un amplicón ANXA10, en donde el tercer amplicón, el cuarto amplicón y el quinto amplicón son diferentes;

b) una primera sonda para detectar el amplicón AR, una segunda sonda para detectar el amplicón CRH, una tercera sonda para detectar el amplicón IGF2, una cuarta sonda para detectar el amplicón KRT20 y una quinta sonda para detectar el amplicón ANXA^{1 0};

c) una primera sonda para detectar el amplicón AR, una segunda sonda para detectar el amplicón CRH, una tercera sonda para detectar el amplicón IGF2 y una cuarta sonda para detectar el amplicón KRT20;

d) una primera sonda para detectar el amplicón UPK1B, una segunda sonda para detectar el amplicón CRH, una tercera sonda para detectar el amplicón IGF2, una cuarta sonda para detectar el amplicón KRT20 y una quinta sonda para detectar el amplicón ANXA^{1 0};

e) una primera sonda para detectar el amplicón UPK1B, una segunda sonda para detectar el amplicón CRH, una tercera sonda para detectar el amplicón iGF2 y una cuarta sonda para detectar el amplicón KRT20;

f) una primera sonda para detectar el amplicón AR, una segunda sonda para detectar el amplicón UPK1B, una tercera sonda para detectar el amplicón CRH, una cuarta sonda para detectar el amplicón IGF2 y una quinta sonda para detectar el amplicón KRT20, y sexta sonda para detectar el amplicón ANXA10;

g) una primera sonda para detectar el amplicón AR, una segunda sonda para detectar el amplicón UPK1B, una tercera sonda para detectar el amplicón CRH, una cuarta sonda para detectar el amplicón IGF2 y una quinta sonda para detectar el amplicón KRT20;

h) una primera sonda para detectar el amplicón UPK1B, una segunda sonda para detectar el amplicón CRH, una tercera sonda para detectar el amplicón IGF2 y una cuarta sonda para detectar el amplicón ANXA10; o i) una primera sonda para detectar el amplicón UPK1B, una segunda sonda para detectar el amplicón CRH, una tercera sonda para detectar el amplicón KRT20 y una cuarta sonda para detectar el amplicón ANXA10.

19. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, comprende además un par de control endógeno, y además comprende opcionalmente una sonda de control endógena para detectar un amplicón de control endógeno, opcionalmente en donde el control endógeno es ABL.

20. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, en la que la composición es una composición liofilizada o en la que la composición es una solución.

21. La composición de la reivindicación 16, en la que el primer par de cánceres primarios presenta un primer par de cebadores para detectar UPK1B, un segundo par de cebadores para detectar CRH, un tercer par de cebadores para detectar IGF2 y un cuarto par de cebadores para detectar ANXA10; y en el que la composición comprende además una primera sonda para detectar el amplicón UPK1B, una segunda sonda para detectar el amplicón CRH, una tercera sonda para detectar el amplicón IGF2 y una cuarta sonda para detectar el amplicón ANXA10; y en el que la composición comprende opcionalmente un par de cebadores de control endógeno y una sonda de control endógena.

22. El método de una cualquiera de las reivindicaciones ⁶a 10, o la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a ^{2 0}, en donde:

a) cada par de cebadores marcadores de cáncer de vejiga produce un amplicón que tiene una longitud de 50 a 500 nucleótidos, 50 a 400 nucleótidos, 50 a 300 nucleótidos, 50 a 200 nucleótidos, o 50 a 150 nucleótidos; b) al menos uno, al menos dos, o al menos tres pares de cebadores marcadores de cáncer de vejiga abarcan un intrón en la secuencia genómica; y/o

c) cada par de cebadores de cáncer de vejiga abarca un intrón en la secuencia genómica.

23. El método de una cualquiera de las reivindicaciones ⁶a 10, o la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a ^{2 1}, o la composición o método de la reivindicación ^{2 2}, en donde:

a) el par de cebadores para detectar AR comprende un primer cebador que comprende al menos ⁸, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 54 y un segundo cebador que comprende al menos ⁸, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de la SEQ ID NO: 55, en donde cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, o menos de 30 nucleótidos de longitud; y/o

b) el par de cebadores para detectar UPK1B comprende un primer cebador que comprende al menos ⁸, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 51 y un segundo cebador que comprende al menos ⁸, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de la SEQ ID NO: 52, en donde cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de longitud.

24. El método de una cualquiera de las reivindicaciones ⁸a 10, o la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, o la composición o método de la reivindicación 22, en donde:

a) la sonda para detectar AR comprende al menos ⁸, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de la SEQ ID NO: 56, en donde la sonda tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de longitud; y/o

b) la sonda para detectar UPK1B comprende al menos ⁸, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de la SEQ ID NO: 53, en donde la sonda tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de longitud.