ES2710973T3 - Análogos de las defensinas beta cíclicas para el tratamiento de infecciones - Google Patents

Abstract

Un péptido cíclico seleccionado del grupo que consiste en la SEQ. ID. No. 1, SEQ. ID. No. 2, SEQ. ID. No. 25.

Description

DESCRIPCION

Analogos de las defensinas beta dclicas para el tratamiento de infecciones.

La presente invencion se refiere a los analogos de las defensinas p dclicas, a su uso en el tratamiento de infecciones y composiciones farmaceuticas que los contienen.

Es bien sabido que existe una creciente resistencia a los antibioticos de los patogenos y que se necesitan nuevas estrategias para resolver este problema. Ademas, para algunos microorganismos, tal como las Pseudomonas, no hay disponibles agentes eficaces para el tratamiento.

Se considera que los peptidos antimicrobianos (AMP) proporcionan potencialmente estas nuevas herramientas terapeuticas necesarias en la lucha contra las enfermedades infecciosas.

Los AMP son moleculas de defensa presentes y producidas por todos los organismos, desde bacterias hasta vertebrados. Estos peptidos ejercen multiples actividades eficaces contra todos los microorganismos, incluyendo bacterias, hongos, virus y parasitos. En los humanos y otros mairnferos, los AMP son un componente clave de la defensa de la superficie epitelial, constituyendo un impedimento entre el entorno externo y el interno, interactuando con diversos microorganismos.

Las defensinas son AMP que muestran una naturaleza anfipatica caractenstica derivada de cargas positivas y residuos de aminoacidos hidrofobos que se organizan para asumir una estructura anfipatica tridimensional. Las defensinas se han clasificado en tres subfamilias: defensinas alfa, beta y teta. Seis residuos de cistema responsables de tres enlaces disulfuro intramoleculares combinados en diferentes patrones son caractensticas reconocidas de estos peptidos. El plegamiento de las defensinas se estabiliza principalmente por la presencia de estos tres enlaces disulfuro que determinan la distribucion de residuos cargados positivamente e hidrofobos que se correlaciona con su actividad.

Las defensinas pueden romper la estructura de la membrana de los microorganismos; ademas, pueden inhibir la smtesis del ADN y afectar la rotacion del metabolismo. Varios autores demostraron una actividad antimicrobiana de amplio espectro frente a varios microorganismos, como bacterias grampositivas y gramnegativas, hongos y virus. Por estas razones, las defensinas son candidatas de alta calidad, capaces de combatir enfermedades infecciosas. Las defensinas tienen tambien una serie de desventajas que restringen gravemente su uso clmico. Por ejemplo, pueden ejercer actividad hemolftica (6), su actividad se puede inhibir en presencia de una alta concentracion de sal (7) y se escinden rapidamente en fluidos humanos mediante proteasas. El correcto plegamiento de los enlaces disulfuro tambien representa un factor limitante para el uso terapeutico potencial de las defensinas. De hecho, la obtencion de una sola molecula con el patron correcto de enlaces disulfuro es extremadamente complicada y costosa.

En un intento por superar estas desventajas, las p-defensinas quimericas combinan la p-defensina 3 humana (hBD3) con la p-defensina 1 humana (hBD1) (el documento WO2009/083249; Scudiero O. et al. Antimicrob. Agents Chemother. 2010; 54: 2312-2322; Scudiero O. et al. Antimicrob. Ag. Chemother. 2013; 57: 1701-1708;) o pdefensina 2 humana (hBD2) (Jung S. et al. Antimicrob. Agents Chemother. 2011; 55: 954-960; Spudy B. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2012; 427: 207-211) se sintetizaron e investigaron por sus actividades antibacterianas, antivirales y quimiotacticas, asf como por su resistencia a la sal. Los analogos sinteticos han mostrado un aumento de las propiedades antibacterianas y una sensibilidad reducida a la sal.

A pesar de la optimizacion de los protocolos sinteticos (Liu S.. Pept. Sci. 2009; 15: 95-106), la preparacion de hDB3 y analogos es muy desafiante y no se presta facilmente a la produccion comercial a gran escala. Ademas, todavfa no se ha demostrado la farmacocinetica y la biodistribucion apropiadas para ningun candidato terapeutico de p-Defensina.

Ahora hemos identificado analogos de las defensinas p-dclicas con un perfil mas favorable en terminos de facilidad de smtesis, costo de los productos, estabilidad in vitro e in vivo, que mantienen tanto como sea posible el perfil biologico de hBD3 de longitud completa.

Los analogos de las defensinas p dclicas de la presente invencion mantienen la cola C-terminal de hBD3 y comprenden segmentos que forman parte de las secuencias de aminoacidos del anillo cerrado por el disulfuro nativo Cys3-Cys6 en las p-defensinas hBD1- hBD3.

El objeto de la presente invencion es un peptido dclico seleccionado del grupo que consiste en la SEQ. ID. No. 1, SEQ. ID. No. 2, SEQ. ID. No. 25.

SEQ. ID. No. 1 corresponde a la formula (I):

en la que:

X es -S-S-;

Xi es RRKK en el que los residuos de aminoacidos tienen configuracion L;

X² es LPKEEQIGK;

X³ es Ser y n es 1;

X⁴ es STRGRK y j es 1;

m es 0;

Xa es CH³-CO-NH- y p es 1.

SEQ. ID. No. 2 corresponde a la formula (I) en la que:

X es -S-S-;

Xi es RRKK en el que los residuos de aminoacidos tienen configuracion L;

X² es LPKQQQIGK;

X³ es Ser y n es 1;

X⁴ es STRGRK y j es 1;

m es 0;

Xa es CH³-CO-NH- y p es 1.

SEQ. ID. No. 25 corresponde a la formula (I) en el que:

X es -S-S-;

X ^I es la secuencia RRKK en la que los residuos de aminoacidos tienen configuracion L;

X² es PIFTKIQGT;

n es 0;

j es 0;

X⁵ es GG y m es 1;

Xa es NH²- y p es 1.

Los analogos de las p defensinas de la presente invencion se pueden administrar, si se desea, en forma de sales farmaceuticamente aceptables. Las sales se pueden preparar usando procedimientos estandar conocidos para los expertos en el arte de la qmmica organica sintetica.

Los analogos de las p defensinas de la presente invencion pueden estar lipidados (conjugados ya sea con colesterol o acidos grasos, tales como palmitoilacido) o PEGilados para mejorar el perfil farmacologico in vivo. El metodo para obtener estos derivados es bien conocido en la tecnica.

El analogo de p defensinas de formula (I) como se definio anteriormente se puede usar como agente antibacteriano y/o antiviral, en particular, se puede usar en el tratamiento de infecciones tal como la infeccion por el virus del herpes simple, el virus de la inmunodeficiencia humana, virus de la hepatitis C, virus de la influenza, citomegalovirus, virus del papiloma humano, virus de la parainfluenza humana, virus sincitial respiratorio, virus de la varicela zooster y virus de la vacuna (vease Wilson, S. S., M. E. Wiens, et al. (2013). "Antiviral mechanisms of human defensins." J. Mol. Biol. 425(24): 4965-4980).

Otro objeto de la presente invencion son las composiciones farmaceuticas que comprenden una cantidad terapeuticamente eficaz de un analogo de p defensinas de formula (I) como se definio anteriormente y al menos un excipiente y/o portador farmaceuticamente aceptable. Dicha composicion tambien puede comprender diluyentes, cargas, sales, soluciones reguladoras, estabilizantes, solubilizantes y otros materiales bien conocidos en la tecnica. La composicion farmaceutica puede estar en cualquier forma apropiada, dependiendo del metodo de administracion previsto. Puede ser, por ejemplo, en forma de comprimido, capsula o lfquido para administracion oral, o de una solucion o suspension para administracion por via parenteral.

La velocidad de dosificacion a la que se administra el compuesto, el derivado o la composicion dependera de la naturaleza del sujeto, la naturaleza y la gravedad de la afeccion, el metodo de administracion usado, etc. El medico capacitado puede seleccionar los valores apropiados. .

Los compuestos de la invencion se pueden administrar por cualquier via apropiada, incluyendo por via oral, intravenosa, cutanea, subcutanea, etc. Estos compuestos se pueden preparar por smtesis qmmica a partir de aminoacidos u oligopeptidos individuales, preferiblemente protegidos, y usando conocidos metodos de smtesis de peptidos tal como la qmmica estandar convencional de 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) a temperatura ambiente como se describe en Atherton, E. and R. C. Sheppard (1989). La smtesis de peptidos en fase solida, un enfoque practico. Oxford, IRL Press.

Ejemplos

Ejemplo 1: Smtesis de peptidos

Reactivos

Todos los aminoacidos Fmoc, diisopropiletilamina (DIPEA), piperidina, anhndrido acetico, acido trifluoroacetico (TFA), triisopropilsilano (TIS), etanoditiol (EDT) diclorometano (DCM), N, N-dimetilformamida (DMF), tert-butil metil eter, N, N'-dicicloexilcarbodiimida (DCC), acido 3-bromopropionico, agua de calidad para HPLC y acetonitrilo se obtuvieron de Sigma Aldrich (St. Louis, MO). El hidrato de 1-hidroxibenzotriazol (HOBT) y el hexafluorofosfato de O-(benzotriazol-1-il) -N,N,N’,N’-tetrametiluronio (HBTU) se obtuvieron de AnaSpec, Inc. (Fremont, CA). La resina Rinkamida-MBHA se obtuvo de Novabiochem (San Diego, CA).

Smtesis

Los peptidos se sintetizaron segun la qmmica convencional estandar de 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) a temperatura ambiente usando el instrumento Biotage Syro Wave o el sintetizador automatico Syro I MultiSynThec GmbH (Wullener, Alemania) en diferentes resinas segun el C-terminal para obtener (resina Rink Amide MBHA con 0.38 mmol/g de sustitucion o resina Wang con 1.0 mmol/g), en una escala de 50 |imol. La desproteccion de Fmoc con 30% de piperidina en DMF se realizo en dos etapas con una desproteccion inicial de 5 min seguida de 10 min a 25 °C.

Las soluciones de aminoacidos, HOBT/HBTU y DIEA se prepararon a la concentracion de 0.5 M, 0.45 M y 1 M en DMF, respectivamente.

Las reacciones de acoplamiento se realizaron con un exceso de 5 veces de Fmoc-AA-OH con AA/HOBT-HBTU/DIPEA 1:1:2 durante 30 min a 25 °C. Se realizo un doble acoplamiento a RT (cada uno de 30 min) para el Fmoc-Arg (Pbf)-OH impedido. La terminacion del peptido, al final de cada smtesis, se realizo con una solucion al 10% de antndrido acetico y 6% de DIPEA en DMF (doble acetilacion, cada una de 20 minutos). El antndrido simetrico del acido 3-bromopropionico se preparo usando una carga de 10 eq./resina de acido 3-bromopropionico y una carga de 5 eq./resina de ^d C^c en DCM. Para el acoplamiento, se anadio anhndrido 3-bromopropionico a la resina en presencia de una cantidad catalftica de DIPEA en d Mf , durante 1 hora a 25 °C.

La escision se realizo usando TFA/H²O/TIS/EDT 94.5:2.5:1:2.5 durante 3 horas a 25 °C. Despues de la escision, el peptido se precipito y se lavo en tert-butil metil eter.

La formacion de enlaces disulfuro o tioeter se realizo disolviendo 1 mg/ml del peptido en bruto en una solucion 0.1 M de bicarbonato de amonio, dejando la mezcla bajo agitacion en un recipiente abierto durante 24 horas. Las reacciones fueron controladas por LC/MS.

Analisis LC/MS de peptidos. La purificacion de peptidos y el analisis de LC/MS se realizaron usando un sistema combinado HPLC (Gilson)/Espectrometro de masas Flexar SQ 300 con ionizacion por electroaspersion (Perkin Elmer) o un ESI LC-MS (Thermo Electron Finnigan Surveyor MSQ single quadrupole). La cromatograffa lfquida analttica en fase inversa a alta presion (RP-HPLC) se realizo con una columna Jupiter Proteo 10 |im C18250x4.6 mm, controlando a 220 y 280 nm con un flujo de 1.3 mL/min usando un sistema de solvente H2O/0.1% de TFA (A) y CH3CN/0.1% de TFA (B) con un gradiente lineal 5 - 60% B durante 30 min. La purificacion del peptido se realizo mediante cromatograffa Kquida semipreparativa en fase inversa a alta presion (RP-HPLC). La cromatograffa semipreparativa utilizo una columna Jupiter Proteo 90 A C18 (10x250 mm, 10 |im) (Phenomenex) y un gradiente lineal del 5 al 60% de B durante 25 minutos, velocidad de flujo 10 mL/min. La identidad de los peptidos purificados se confirmo mediante cromatograffa lfquida de ionizacion por pulverizacion electronica - espectrometffa de masas (ESI LC-MS). La exploracion MS se realizo en el intervalo de masa de 200 a 3000 m/z.

Ejemplo 2: Actividad antibacteriana

Ensayo de actividad antibacteriana

Un ensayo de CFU de la actividad antibacteriana de los peptidos de la presente invencion contra Pseudomonas aeruginosa ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, EE. UU.) 27853, Enterococcus faecalis ATCC 29212 y Escherichia coli ATCC 25922 se realizo de la siguiente manera. Las cepas se cultivaron en condiciones aerobicas en caldo de soja tffptico (Difco Laboratories, Detroit, MI, EE. UU.) a 37 °C y se incubaron en presencia de hBD durante 2 horas a 37 °C. Se usan dos concentraciones de peptidos, esto es, 2.5 |iM y 12.5 |iM. Para el ensayo de dependencia de la sal, se incluyeron NaCl 0, 50, 100 y 200 mM en la solucion reguladora de incubacion como se describio anteriormente (1). Cada ensayo se realizo por triplicado. La actividad bactericida (media y SD de tres ensayos) se expresa como la proporcion entre las colonias contadas y el numero de colonias en una placa de control. La concentracion inhibitoria minima (MIC) del peptido de la SEQ ID No. 25 se determino con una version modificada del ensayo de dilucion de microcaldo de the National Committee for Clinical Laboratory Standards usando un inoculo final de 105 UFC/ml. Se usaron las siguientes concentraciones de peptidos: 100.0, 50.0, 25.0, 12.5, 6.25, 3.12 and 1.56 |iM.

El rendimiento de crecimiento de Pseudomonas aeruginosa ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) 27853, Enterococcus faecalis ATCC 29212 y Escherichia coli ATCC 25922 tambien se probaron.

Resultados

La actividad antibacteriana de la SEQ ID No. 25 se evaluo en comparacion con hBD1 y hBD3 como peptidos de referencia. Se analizaron dos concentraciones de cada peptido (2.5 y 12.5 |iM) y cuatro concentraciones de NaCl (0, 50, 100 y 200 mM) contra P. aeruginosa, E. coli y E. faecalis, y los resultados se presentan en la tabla 1. La SEQ ID No. 25, ensayada contra P. aeruginosa a 2,5 |iM, ejercio una actividad antibacteriana similar en comparacion con hBD3 a NaCl 200 mM; a 12.5 |iM, la SEQ ID No. 25 fue mas activa a NaCl 200 mM.

La actividad antibacteriana de la SEQ ID No. 25 frente a E. coli y E. faecalis fue similar a la hBD3 hasta la sal 100 mM tanto en el peptido 2.5 como en el 12.5 |iM. La SEQ ID No. 25 ejercio la mejor actividad antibacteriana a 12.5 |iM: fue mas eficaz que hBD3 en presencia de las concentraciones mas altas de sal (200 mM) (Fig. 2B, C). Su MIC oscilo entre 12.5-25.0 |iM para los microorganismos probados. hBD1, hBD3 y SEQ ID No.25 ejercieron un fuerte efecto antibacteriano contra P. aeruginosa, E. coli y E. faecalis (12.5 |iM).

Los resultados reportados muestran que la SEQ ID No. 25 tiene una actividad antibacteriana mejorada en comparacion con las hBD de tipo salvaje.

TABLA1

Se aplico el mismo metodo para probar la actividad antibacteriana de SEQ ID No.1 y SEQ ID No.2, en forma oxidada y reducida, usando hBD3 como peptido de referencia. Se analizaron dos concentraciones de cada peptido (2.5 y 12.5 pM) y cuatro concentraciones de NaCl (0, 50, 100 y 200 mM) contra P. aeruginosa, y E. coli. Los resultados se informan en la figura 1 (Actividad antibacteriana de la SEQ. N. 1 y 2 en E. coli) y en la figura 2 (Actividad antibacteriana de la SEQ. N. 1 y 2 en P. aeruginosa).

Ejemplo 3: actividad antiviral

Ensayo de actividad antiviral

Las celulas Vero se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero de ternera fetal al 10%. HSV-1 que porta un gen lacZ dirigido por el promotor IE-1 del citomegalovirus (CMV) para expresar beta-galactosidasa se propago como se describe en otro lugar (Galdiero S, Falanga A, Vitiello M, D'Isanto M, Cantisani M, Kampanaraki A, Benedetti E, Browne H, Galdiero M. Peptides. 2008 Sep;29(9):1461-71). Todos los experimentos se realizaron en paralelo con controles sin peptidos. Se evaluo el efecto de los peptidos sobre la inhibicion de la infectividad por HSV en monocapas celulares (Tarallo R, Carberry TP, Falanga A, Vitiello M, Galdiero S, Galdiero M, Week M., Int J Nanomedicine. 2013;8:521-34.) de la siguiente manera: i) Para los experimentos de "coexposicion", las celulas se incubaron con concentraciones crecientes de los peptidos (1, 5, 10.0, 20.0, 50.0, 100.0 y 150.0 pM) y con el inoculo viral durante 45 minutos a 37 °C. Los virus no penetrados se inactivaron con solucion reguladora de citrato a pH 3.0. Las monocapas se fijaron, se tineron con 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galactopiranosido (X-gal) y se anotaron los numeros de placa. Los experimentos se realizaron por triplicado y el porcentaje de inhibicion se calculo con respecto a los experimentos de control sin peptidos; ii) Para los experimentos de "preexposicion de virus", aproximadamente 2 x 104 PFU de HSV-1 se incubaron con 20 pM de peptidos durante 45 minutos a 37 °C, luego se titularon en monocapas de celulas Vero; iii) Para los experimentos de "preexposicion celular", las celulas Vero se incubaron con 20 pM de peptidos durante 30 minutos a 4 °C y se infectaron con diluciones en serie de HSV-1, durante 45 minutos a 37 °C; y iv) Para los experimentos de "postexposicion", las monocapas de celulas Vero se incubaron con virus, durante 45 minutos a 37 °C y posteriormente se anadio el peptido al inoculo seguido de un penodo de incubacion adicional de 30 minutos a 37 °C.

Resultados

La actividad antiviral de SEQ ID No.25 en forma oxidada y reducida, se evaluo y comparo con la actividad de hBD3, y los resultados se informan en la tabla 2.

La actividad antiviral se evaluo en experimentos de coexposicion (con celulas, virus y peptidos a tiempo cero), experimentos de preexposicion de virus (virus mas peptido antes de la infeccion celular), experimentos de preexposicion de celulas (celula mas peptido antes de la infeccion por virus) y postratamiento (celula mas virus antes de la adicion de peptidos) para evaluar en que fase, si corresponde, los peptidos podrian inhibir la infectividad del virus. La SEQ ID No.25 en su forma reducida siempre fue menos activa que la version oxidada, mientras que se informa que hBD3 oxidada y reducida mostro la misma actividad antiviral. Tanto en la coexposicion como en los experimentos de pretratamiento de virus, la SEQ. ID. No 25 oxidada fue capaz de reducir la infectividad del virus del 60% a 150 |iM, mientras que se obtuvo una reduccion de la infectividad del 30% en el experimento de pretratamiento celular, y no se observo ningun efecto en el experimento de postratamiento. Estos resultados indican que el nuevo peptido es capaz de interferir con la union y entrada viral. La SEQ.ID. No. 25 oxidada mostro una IC50 de 100 |iM, en comparacion con una IC50 de 10 |iM para hBD3.

TABLA 2

Se aplico el mismo metodo para probar la actividad antiviral de la SEQ ID No.1 a diferentes concentraciones (1, 5, 10.0, 20.0, 50.0, 100.0 y 150.0 |iM). Los resultados se presentan en la tabla 3.

TABLA 3

Infectividad viral residual de control} en las concentraciones y condiciones indicadas

Ejemplo 4: Estabilidad serica de SEQ ID No.1

La estabilidad serica de SEQ ID No. 1 se evaluo como se informo en Antcheva N, Morgera F, Creatti L, Vaccari L, Pag U, Pacor S, Shai Y, Sahl HG, Tossi A. 2009. La beta-defensina artificial basada en una plantilla de defensina minima. Biochem. J. 421:435-447. Se incubaron alfcuotas de SEQ ID No. 1 con suero humano al 20% (v/v) a 0, 0.5, 1, 2, 3, 6, 8, y 24 h, y luego se analizaron por LC/MS para determinar la integridad del peptido. La LC/MS se realizo en un sistema combinado constituido por una cromatograffa lfquida de alto rendimiento de fase inversa (Gilson, Middleton, EE. UU.) En interfaz con un espectrometro de masas Flexar SQ 300 con ionizacion por electroaspersion (Perkin Elmer, CA, USA). Los componentes se separaron usando una columna analftica Jupiter C-is de fase inversa (tamano de partfcula de 5 pm, tamano de poro de 300 A, 4.6 x 250 mm) (Phenomenex, Aschaffenburg, Alemania) con un gradiente lineal de 5 a 60% de acetonitrilo en agua acidificada (0.1 % de acido trifluoroacetico [TFA]), durante 30 min. La escision de peptidos en suero se evaluo mediante un analisis de espectrometna de masas de ionizacion por pulverizacion de electrones (ESI-MS). La exploracion MS se realizo en el intervalo de masa de 200 a 3000 m/z. Los resultados se presentan en la tabla 4. La SEQ ID No. 1 es completamente estable hasta 3 h de incubacion, y el peptido intacto sigue presente despues de 24 h. La hidrolisis del peptido procede del termino C, con escision progresiva hasta el primer residuo de cistema. La secuencia delimitada por el puente disulfuro permanece estable a partir de entonces, y representa el unico producto de degradacion identificado junto con el peptido intacto al final del penodo de incubacion.

Tabla 4

Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Un peptido dclico seleccionado del grupo que consiste en la SEQ. ID. No. 1, SEQ. ID. No. 2, SEQ. ID. No. 25.

2. Un peptido dclico segun la reivindicación 1 en forma lipidada o PEGilada.

3. Un peptido dclico segun la reivindicación 1 o 2 para uso como medicamento.

4. Un peptido dclico segun la reivindicación 1 o 2 para uso en el tratamiento de infecciones bacterianas o virales.

5. Una composicion farmaceutica que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de un peptido dclico segun la reivindicación 1 y al menos un excipiente y/o portador farmaceuticamente aceptable.