ES2709996T3 - Nuevo anticuerpo biespecífico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo biespecífico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano, que comprende: 1) una región variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano que comprende la CDR1 que consiste en la secuencia de aminoácidos de los números de aminoácidos 31 a 35 de la SEQ ID NO: 4, la CDR2 que consiste en la secuencia de aminoácidos de los números de aminoácidos 50 a 66 de la SEQ ID NO: 4 y la CDR3 que consiste en la secuencia de aminoácidos de los números de aminoácidos 99 a 109 de la SEQ ID NO: 4, y una región variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que comprende la CDR1 que consiste en la secuencia de aminoácidos de los números de aminoácidos 24 a 39 de la SEQ ID NO: 6, la CDR2 que consiste en la secuencia de aminoácidos de los números de aminoácidos 55 a 61 de la SEQ ID NO: 6 y la CDR3 que consiste en la secuencia de aminoácidos de los números de aminoácidos 94 a 102 de la SEQ ID NO: 6; y 2) una región variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR4 humano que comprende la CDR1 que consiste en la secuencia de aminoácidos de los números de aminoácidos 521 a 525 de la SEQ ID NO: 4, la CDR2 que consiste en la secuencia de aminoácidos de los números de aminoácidos 540 a 556 de la SEQ ID NO: 4 y la CDR3 que consiste en la secuencia de aminoácidos de los números de aminoácidos 589 a 598 de la SEQ ID NO: 4, y una región variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR4 humano que comprende la CDR1 que consiste en la secuencia de aminoácidos de los números de aminoácidos 648 a 658 de la SEQ ID NO: 4, la CDR2 que consiste en la secuencia de aminoácidos de los números de aminoácidos 674 a 680 de la SEQ ID NO: 4 y la CDR3 que consiste en la secuencia de aminoácidos de los números de aminoácidos 713 a 721 de la SEQ ID NO: 4.
Description
DESCRIPCION
Nuevo anticuerpo biespecifico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano
Campo tecnico
La presente invention se refiere a un nuevo anticuerpo biespecifico que se une al TLR2 humano y TLR4 humano.
Antecedentes de la tecnica
El receptor tipo Toll 2 (TLR2, de sus siglas en ingles) y el receptor tipo Toll 4 (TLR4, de sus siglas en ingles) son protelnas transmembrana unicas que se expresan en un amplio espectro de celulas y tejidos que incluyen celulas inmunocompetentes tales como macrofagos y neutrofilos, celulas endoteliales vasculares y celulas intrlnsecas renales tales como celulas epiteliales tubulares renales (Folia Biol (Praha)., 2005, Vol. 51, n.° 6, pags. 188-197). El TLR2 forma un complejo con el TLR1 o TLR6, y reacciona con componentes bacterianos tales como peptidoglicanos o lipoprotelnas. Mientras tanto, el TLR4 forma un complejo con una protelna del factor de diferenciacion mieloide 2 (MD2, de sus siglas en ingles), una protelna CD14 o similar, y reacciona con componentes bacterianos tales como lipopolisacaridos tipificados por lipopolisacaridos (LPS). Ademas, estos receptores se activan al unirse a los patrones moleculares asociados al dano (DAMP, de sus siglas en ingles), que son un factor de dano tisular endogeno, y transmiten senales a las celulas. La activation del TLR2 y el TLR4 induce la expresion de citocinas inflamatorias tales como el factor de necrosis tumoral a (TNFa, de sus siglas en ingles) y la interleucina 6 (IL-6) y provoca una respuesta inflamatoria, por ejemplo, a traves de la activacion de un factor nuclear kB (NF-kB, de sus siglas en ingles) que es un factor de transcription (Nat. Immunol., 2010, Vol. 11, n.° 5, pags. 373-384).
Se sabe que dicha activacion mediada por el TLR2 y el TLR4 de diversas celulas esta implicada en enfermedades inflamatorias inmunitarias tales como sepsis, insuficiencia renal aguda, enfermedad renal cronica, slndrome de la dificultad respiratoria aguda, esclerodermia, pancreatitis aguda y enfermedad pulmonar obstructiva cronica.
En asociacion con la sepsis, se ha informado que animales geneticamente deficientes en TLR2 (ratones knock-out) en un modelo de infection por Salmonella, que es un modelo de sepsis, muestran una mejora en la tasa de supervivencia, los ratones deficientes en TLR4 en un modelo de infeccion por Escherichia coli muestran una mejora en la tasa de supervivencia, y los ratones con una doble deficiencia en TLR2 y TLR4 en cada modelo muestran una tasa de supervivencia significativamente mejorada en comparacion con los ratones con una unica deficiencia en TLR2 o t Lr4 (J. Exp. Med., 2008, Vol. 205, pags. 1747-1754). Ademas, se ha informado que la tasa de supervivencia no mejora con la administration de un anticuerpo anti-TLR2 (T2.5) o un anticuerpo anti-TLR4 (1A6) solo en los dos modelos anteriores, mientras que la tasa de supervivencia mejora con la administracion combinada de ambos anticuerpos (J. Exp. Med., 2008, Vol. 205, pags. 1747-1754).
En asociacion con la pancreatitis aguda, se ha informado de que los ratones deficientes en TLR4 en un modelo de pancreatitis inducida por taurocolato muestran disminucion de la amilasa sangulnea, mieloperoxidasa pancreatica y dano en tejido pancreatico (Inflamm. Res., 2011, Vol. 60, pags. 1093-1098). Ademas, se ha informado de que el nivel de expresion de TLR2 y TLR4 en el pancreas aumenta en un modelo de pancreatitis inducida por caerulelna (Pancreas, 2013, Vol. 42, pags. 114-122).
Como un anticuerpo que se une al TLR2 humano, se han informado un anticuerpo T2.5 monoclonal de raton (Documento de patente 1), un anticuerpo 11G7 monoclonal de raton (Documento de patente 2) y un anticuerpo OPN305 monoclonal humanizado (Documento de patente 3) de T2.5. Entre ellos, 11G7 inhibe las senales TLR2/TLR1 pero no inhibe las senales TLR2/TLR6, mientras que OPN305 se ha informado que inhibe ambas senales. Especlficamente, se ha informado de que en experimentos que utilizan una celula THP-1 que es una celula monocltica humana, OPN305 tiene una actividad neutralizante contra la estimulacion de Pam3CSK4 (agonista de TLR2/TLR1) y la estimulacion de FSL-1 (agonista de TLR2/TLR6), e inhibe la elevation de una concentration de citocinas inflamatorias en suero de raton inducida por la administracion de Pam3CSK4 (Documento de patente 3).
Como un anticuerpo que se une al TLR4 humano, se han informado un anticuerpo HTA125 monoclonal de raton (Documento no de patente 1), los anticuerpos 18H10, 16G7, 15C1 y 7E3 monoclonales de raton (Documento de patente 4), un anticuerpo hu15C1 de 15C1 monoclonal humanizado (Documento de patente 5), y los anticuerpos 1A6 y 1E11.C2E3 monoclonales humanizados y similares descubiertos por mutaciones aleatorias en la region determinante de complementariedad de hu15C1 (Documento de Patente 6). Entre ellos, con respecto a los anticuerpos monoclonales de raton, se ha demostrado que 15C1 tiene la mayor actividad neutralizante de los resultados experimentales con sangre humana (Documento de patente 4), y se ha confirmado que el anticuerpo hu15C1 de 15C1 monoclonal humanizado tiene una actividad neutralizante mediante experimentos con la misma sangre humana (Documento de patente 5). Ademas, se ha informado que el anticuerpo 1E11.C2E3 monoclonal humanizado tiene una actividad neutralizante superior a la hu15C1 en experimentos con sangre humana (Documento de patente 6).
Ademas, se ha informado que, en un sistema de evaluation de la production de IL-6 para la estimulacion de
Escherichia coli, Pseudomonas y Klebsiella sometidas a un tratamiento termico con sangre humana, el anticuerpo anti-TLR2 humano (T2.5) inhibe debilmente la produccion de IL-6 y el anticuerpo anti-TLR4 humano (15C1) inhibe aproximadamente el 50 % de la produccion de IL-6, mientras que la adicion combinada de ambos anticuerpos inhibe casi completamente la produccion de IL-6 (Documento de patente 7).
Sin embargo, hasta el momento no se ha informado de un anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y TLR4 humano.
Tecnica anterior
Documento de patente
Documento de patente 1: Documento WO 2005/028509
Documento de patente 2: Documento WO 2005/019431
Documento de patente 3: Documento WO 2011/003925
Documento de patente 4: Documento WO 2005/065015
Documento de patente 5: Documento WO 2007/110678
Documento de patente 6: Documento WO 2013/149111
Documento de patente 7: Documento WO 2006/077471
Documento no de patente
Documento no de patente 1: "The Journal of Experimental Medicine", (EE.UU.), 1999, Vol. 189, n.° 11, pags. 1777 1782
Divulgacion de la invencion
Problemas que deben resolverse por la invencion
Un objetivo de la presente invencion es proporcionar un anticuerpo biespeclfico para prevenir o tratar una enfermedad inflamatoria inmunitaria mediante la union tanto al TLR2 humano como al TLR4 humano para inhibir los efectos inflamatorios inmunitarios mediados por el TLR2 humano y el TLR4 humano.
Medios para resolver los problemas
Los presentes inventores han llevado a cabo estudios inventivos de manera extensiva y repetida sobre la preparacion de un anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano. Como consecuencia, los presentes inventores han preparado un anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano, que comprende 1) una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 120 de la SEQ ID NO: 4, y una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 113 de la SEQ ID NO: 6; y 2) una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 609 de la SEQ ID NO: 4, y una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 625 a 732 de la SEQ ID NO: 4 (Ejemplos 1 a 8), y han encontrado que el anticuerpo biespeclfico inhibe la produccion de TNFa, que es una citocina proinflamatoria inducida por una bacteria termoinactivada de la PAO-I de Pseudomonas aeruginosa que procede de aislado cllnico (en lo sucesivo denominada bacteria inactivada) que responde al TLR2 y al TLR4 (Ejemplo 10). Se ha proporcionado el anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano y la presente invencion se ha completado basandose en estos resultados. Ademas, los presentes inventores han encontrado que el anticuerpo biespeclfico tambien inhibe la produccion del TNFa inducido por una bacteria inactivada de 21006 de Escherichia coli que procede de aislado cllnico (Ejemplo 11).
Es decir, la presente invencion incluye la siguiente invencion como un material o un metodo que es aplicable medica o industrialmente.
[1] Un anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano, que se selecciona de los siguientes (1) o (2):
(1) un anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano, que comprende
1) una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 120 de la SEQ ID NO: 4, y una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 113 de la SEQ ID NO: 6, y
2) una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la
secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 609 de la SEQ ID NO: 4, y una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 625 a 732 de la SEQ ID NO: 4; o
(2) un anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano, que es un anticuerpo biespeclfico que procede de una modificacion postraduccional del anticuerpo biespeclfico de (1).
[2] El anticuerpo biespeclfico de acuerdo con [1], que se selecciona de los siguientes (1) o (2):
(1) un anticuerpo biespeclfico que comprende un anticuerpo anti-TLR2 humano y un fragmento de anticuerpo anti-TLR4 humano, en donde
el anticuerpo anti-TLR2 humano es un anticuerpo IgG y comprende una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 120 de la SEQ ID NO: 4, y una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 113 de la SEQ ID NO: 6, y
el fragmento de anticuerpo anti-TLR4 humano es un fragmento de region variable de cadena unica (scFv) y comprende una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 609 de la SEQ ID NO: 4, y una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 625 a 732 de la SEQ ID NO: 4; o
(2) un anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano, que es un anticuerpo biespeclfico que procede de una modificacion postraduccional del anticuerpo biespeclfico de (1).
[3] El anticuerpo biespeclfico de acuerdo con [2], en el que el anticuerpo biespeclfico comprende un anticuerpo anti-TLR2 humano y un fragmento de anticuerpo anti-TLR4 humano,
siendo el anticuerpo anti-TLR2 humano un anticuerpo IgG y comprendiendo una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 120 de la SEQ ID NO: 4, y una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 113 de la SEQ ID NO: 6, y
siendo el fragmento de anticuerpo anti-TLR4 humano un scFv y comprendiendo una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 609 de la SEQ ID NO: 4, y una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 625 a 732 de la SEQ ID NO: 4.
[4] El anticuerpo biespeclfico de acuerdo con [2], en el que la modificacion postraduccional es piroglutamilacion en el extremo amino (extremo N) de la region variable de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano, eliminacion de lisina en el extremo carboxilo de la cadena pesada (extremo C) del anticuerpo anti-TLR2 humano, y/o piroglutamilacion en el extremo N de la region variable de cadena pesada del fragmento de anticuerpo anti-TLR4 humano.
[5] El anticuerpo biespeclfico de acuerdo con uno cualquiera de [2] a [4], en el que el anticuerpo anti-TLR2 humano comprende una region constante de cadena pesada que es una region constante de IgY1 humana.
[6] El anticuerpo biespeclfico de acuerdo con [5], en el que la region constante de IgY1 humana es una region constante de Igyl humana que tiene mutaciones de aminoacidos de L234A y L235A o mutaciones de aminoacidos de L234A, L235A y I253A.
[7] El anticuerpo biespeclfico de acuerdo con uno cualquiera de [2] a [4], en el que el anticuerpo anti-TLR2 humano comprende una region constante de cadena ligera que es una region constante de IgK humana.
[8] El anticuerpo biespeclfico de acuerdo con uno cualquiera de [2] a [4], en el que el anticuerpo anti-TLR2 humano comprende una region constante de cadena pesada que es una region constante de IgY1 humana y una region constante de cadena ligera que es una region constante de IgK humana.
[9] El anticuerpo biespeclfico de acuerdo con [8], en el que la region constante de IgY1 humana es una region constante de IgY1 humana que tiene mutaciones de aminoacidos de L234A y L235A o mutaciones de aminoacidos de L234A, L235A y I253A.
[10] El anticuerpo biespeclfico de acuerdo con [2] o [3], en el que el anticuerpo anti-TLR2 humano comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 450 de la SEQ ID NO: 4 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6.
[11] El anticuerpo biespeclfico de acuerdo con uno cualquiera de [2] a [10], en el que el fragmento de anticuerpo anti-TLR4 humano es un scFv que tiene una estructura en la que el extremo N de la region variable de cadena ligera esta conectado a traves de un conector al extremo C de la region variable de cadena pesada.
[12] El anticuerpo biespeclfico de acuerdo con uno cualquiera de [2] a [11], en el que el fragmento de anticuerpo anti-TLR4 humano es un scFv que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 732 de la SEQ ID NO: 4.
[13] El anticuerpo biespeclfico de acuerdo con [2] o [3], en el que el anticuerpo anti-TLR2 humano comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 450 de la SEQ ID NO: 4 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6, y el
fragmento de anticuerpo anti-TLR4 humano es un scFv que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 732 de la SEQ ID NO: 4.
[14] El anticuerpo biespeclfico de acuerdo con uno cualquiera de [2] a [13], en el que el extremo N del fragmento de anticuerpo anti-TLR4 humano esta conectado a traves de un conector al extremo C de cada cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano.
[15] El anticuerpo biespeclfico de acuerdo con [14], en el que el conector que conecta la cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano y el fragmento del anticuerpo anti-TLR4 humano consiste en un conector GS.
[16] El anticuerpo biespeclfico de acuerdo con [15], en el que el conector GS consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 9.
[17] El anticuerpo biespeclfico de acuerdo con [2] o [3], en el que el anticuerpo anti-TLR2 humano comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 450 de la SEQ ID NO: 4 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6, el fragmento de anticuerpo anti-TLR4 humano es un scFv que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 732 de la SEQ ID NO: 4, y el extremo N del fragmento de anticuerpo anti-TLR4 humano esta conectado a traves de un conector al extremo C de cada cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano.
[18] El anticuerpo biespeclfico de acuerdo con [17], en el que el conector que conecta la cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano y el fragmento del anticuerpo anti-TLR4 humano consiste en un conector GS.
[19] El anticuerpo biespeclfico de acuerdo con [18], en el que el conector GS consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 9.
[20] Un anticuerpo biespeclfico que procede de una modificacion postraduccional del anticuerpo biespeclfico de acuerdo con uno cualquiera de [17] a [19].
[21] Un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la region variable de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano, la region variable de cadena ligera del anticuerpo anti-TLR2 humano, la region variable de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR4 humano y/o la region variable de cadena ligera del anticuerpo anti-TLR4 humano del anticuerpo biespeclfico de acuerdo con [1].
[22] Un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una fusion en la que el extremo N del fragmento de anticuerpo anti-TLR4 humano esta conectado a traves de un conector al extremo C de la cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano del anticuerpo biespeclfico de acuerdo con uno cualquiera de [17] a [19].
[23] El polinucleotido de acuerdo con [22], que comprende una secuencia de bases que codifica la fusion que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4.
[24] Un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena ligera del anticuerpo anti-TLR2 humano del anticuerpo biespeclfico de acuerdo con uno cualquiera de [17] a [19].
[25] Un vector de expresion que comprende el polinucleotido de acuerdo con [21].
[26] Un vector de expresion que comprende el polinucleotido de acuerdo con [22], [23] y/o [24].
[27] Una celula hospedadora transformada con el vector de expresion de acuerdo con [25], seleccionada entre el grupo que consiste en los siguientes (a) a (d):
(a) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 120 de la SEQ ID NO: 4, un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 609 de la SEQ ID NO: 4, y un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 625 a 732 de la SEQ ID NO: 4, y un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 113 de la SEQ ID NO: 6;
(b) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 120 de la SEQ ID NO: 4, un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 609 de la SEQ ID NO: 4, un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 625 a 732 de la SEQ ID NO: 4, y un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena ligera de una anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 113 de la SEQ ID NO: 6;
(c) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 120 de la SEQ ID NO: 4, un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los
numeros de aminoacidos 491 a 609 de la SEQ ID NO: 4, y un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 625 a 732 de la SEQ ID NO: 4; y
(d) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 113 de la SEQ ID NO: 6.
[28] Una celula hospedadora transformada con el vector de expresion de acuerdo con [25], seleccionada entre el grupo que consiste en los siguientes (a) a (d):
(a) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende el polinucleotido de acuerdo con [22] o [23] y un vector de expresion que comprende el polinucleotido de acuerdo con [24];
(b) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende el polinucleotido de acuerdo con [22] o [23] y el polinucleotido de acuerdo con [24];
(c) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende el polinucleotido de acuerdo con [22] o [23]; y
(d) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende el polinucleotido de acuerdo con la reivindicacion [24].
[29] Un metodo para producir un anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano, que comprende cultivar celulas hospedadoras seleccionadas del grupo que consiste en lo siguiente (a) a (c) para expresar el anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al t LR4 humano:
(a) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 120 de la SEQ ID NO: 4, un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 609 de la SEQ ID NO: 4, y un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 625 a 732 de la SEQ ID NO: 4, y un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 113 de la SEQ ID NO: 6;
(b) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 120 de la SEQ ID NO: 4, un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 609 de la SEQ ID NO: 4, un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 625 a 732 de la SEQ ID NO: 4, y un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena ligera de una anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 113 de la SEQ ID NO: 6; y
(c) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 120 de la SEQ ID NO: 4, un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 609 de la SEQ ID NO: 4, y un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 625 a 732 de la SEQ ID NO: 4, y una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 113 de la SEQ ID NO: 6.
[30] Un metodo para producir un anticuerpo biespeclfico que se une al anti-TLR2 humano y al TLR4 humano, que comprende cultivar celulas hospedadoras seleccionadas del grupo que consiste en lo siguiente (a) a (c) para expresar un anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano:
(a) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende el polinucleotido de acuerdo con [22] o [23] y un vector de expresion que comprende el polinucleotido de acuerdo con [24];
(b) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende el polinucleotido de acuerdo con [22] o [23] y el polinucleotido de acuerdo con [24]; y
(c) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende el polinucleotido de acuerdo con [22] o [23] y una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende el polinucleotido de acuerdo con [24].
[31] Un anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano, producido mediante el metodo de acuerdo con [29].
[32] Un anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano, producido mediante el metodo de acuerdo con [30].
[33] Una composition farmaceutica que comprende el anticuerpo biespeclfico de acuerdo con uno cualquiera de [ l] a [20], [31] y [32] y un excipiente farmaceuticamente aceptable.
[34] La composicion farmaceutica de acuerdo con [33], que es una composicion farmaceutica para prevenir o tratar enfermedades inflamatorias inmunitarias.
[35] La composicion farmaceutica de acuerdo con [34], en la que la enfermedad inflamatoria inmunitaria es sepsis o pancreatitis aguda.
[36] Un metodo para prevenir o tratar una enfermedad inflamatoria inmunitaria, que comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz del anticuerpo biespeclfico segun uno cualquiera de [1] a [20], [31] y [32].
[37] El metodo para prevenir o tratar de acuerdo con [36], en la que la enfermedad inflamatoria inmunitaria es sepsis o pancreatitis aguda.
[38] El anticuerpo biespeclfico de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [20], [31] y [32] para su uso en la prevention y tratamiento de una enfermedad inflamatoria inmunitaria.
[39] El anticuerpo biespeclfico de acuerdo con [38], en la que la enfermedad inflamatoria inmunitaria es sepsis o pancreatitis aguda.
[40] Uso del anticuerpo biespeclfico de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [20], [31] y [32] en la fabrication de una composicion farmaceutica para prevenir o tratar una enfermedad inflamatoria inmunitaria.
[41] El uso del anticuerpo biespeclfico de acuerdo con [40], en la que la enfermedad inflamatoria inmunitaria es sepsis o pancreatitis aguda.
[42] Un anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano, que comprende:
1) una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano que comprende la CDR1 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 31 a 35 de la SEQ ID NO: 4, la CDR2 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 50 a 66 de la SEQ ID NO: 4 y la CDR3 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 99 a 109 de la SEQ ID NO: 4, y una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que comprende la CDR1 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 24 a 39 de la SEQ ID NO: 6, la CDR2 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 55 a 61 de la SEQ ID NO: 6 y la CDR3 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 94 a 102 de la SEQ ID NO: 6; y
2) una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR4 humano que comprende la CDR1 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 521 a 525 de la SEQ ID NO: 4, la CDR2 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 540 a 556 de la SEQ ID NO: 4 y la CDR3 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 589 a 598 de la SEQ ID NO: 4, y una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR4 humano que comprende la CDR1 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 648 a 658 de la SEQ ID NO: 4, la CDR2 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 674 a 680 de la SEQ ID NO: 4 y la CDR3 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 713 a 721 de la SEQ ID NO: 4.
[43] El anticuerpo anti-TLR2 humano, o el fragmento de union a antlgeno del mismo de acuerdo con [42], que comprende una region variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 120 de la SEQ ID NO: 8 y una region variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 113 de la SEQ ID NO: 6.
[44] El anticuerpo anti-TLR2 humano, o el fragmento de union a antlgeno del mismo de acuerdo con [42], que es un anticuerpo o un fragmento de union a antlgeno del mismo que procede de una modification postraduccional de un anticuerpo anti-TLR2 humano o un fragmento de union a antlgeno del mismo que comprende una region variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 120 de la SEQ ID NO: 8 y una region variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 113 de la SEQ ID NO: 6.
[45] El anticuerpo anti-TLR2 humano, o el fragmento de union a antlgeno del mismo de acuerdo con [42] o [44], en el que la modificacion postraduccional es piroglutamilacion en el extremo N de la region variable de cadena pesada y/o elimination de lisina en el extremo C de la cadena pesada.
[46] El anticuerpo anti-TLR2 humano, o el fragmento de union a antlgeno del mismo de acuerdo con uno cualquiera de [42] a [45], que comprende una region constante de cadena pesada que es una region constante de IgY1 humana.
[47] El anticuerpo anti-TLR2 humano, o el fragmento de union a antlgeno del mismo de acuerdo con [46], en el que la region constante de IgY1 humana es una region constante de IgY1 humana que tiene mutaciones de aminoacidos de L234A y L235A o mutaciones de aminoacidos de L234A, l235A y I253A.
[48] El anticuerpo anti-TLR2 humano, o el fragmento de union a antlgeno del mismo de acuerdo con uno cualquiera de [42] a [45], que comprende una region constante de cadena ligera que es una region constante de IgK humana.
[49] El anticuerpo anti-TLR2 humano, o el fragmento de union a antlgeno del mismo de acuerdo con uno cualquiera de [42] a [44], que comprende una region constante de cadena pesada que es una region constante de IgYl humana y una region constante de cadena ligera que es una region constante de IgK humana.
[50] El anticuerpo anti-TLR2 humano, o el fragmento de union a antlgeno del mismo de acuerdo con [49], en el que la region constante de IgYl humana es una region constante de IgYl humana que tiene mutaciones de aminoacidos de L234A y L235A o mutaciones de aminoacidos de L234A, l235A y I253A.
[51] El anticuerpo anti-TLR2 humano de acuerdo con [42] o [43], que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 450 de la SEQ ID NO: 8 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6.
[52] El fragmento de union a antlgeno de acuerdo con uno cualquiera de [42] a [50], que es un fragmento de region variable de cadena unica, Fab, Fab', o F(ab')2.
[53] Un anticuerpo anti-TLR2 humano que es un anticuerpo que procede de una modificacion post-traduccional del anticuerpo anti-TLR2 humano de acuerdo con [51].
[54] El anticuerpo anti-TLR2 humano de acuerdo con [53], en el que la modificacion postraduccional es piroglutamilacion en el extremo N de la region variable de cadena pesada y/o eliminacion de lisina en el extremo C de la cadena pesada.
[55] El anticuerpo anti-TLR2 humano de acuerdo con [42] o [44], que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 449 de la SEQ ID NO: 8 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6.
[56] Un metodo para producir un anticuerpo anti-TLR2 humano o un fragmento de union a antlgeno del mismo, que comprende cultivar celulas hospedadoras seleccionadas del grupo que consiste en lo siguiente (a) a (c) para expresar el anticuerpo anti-TLR2 humano o el fragmento de union a antlgeno del mismo:
(a) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano o el fragmento de union a antlgeno del mismo de acuerdo con [43], y un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena ligera del anticuerpo anti-TLR2 humano o el fragmento de union a antlgeno del mismo de acuerdo con [43];
(b) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano o el fragmento de union a antlgeno del mismo de acuerdo con [43], y un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena ligera del anticuerpo anti-TLR2 humano o el fragmento de union a antlgeno del mismo de acuerdo con [43]; y
(c) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano o el fragmento de union a antlgeno del mismo de acuerdo con [43], y una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena ligera del anticuerpo anti-TLR2 humano o el fragmento de union a antlgeno del mismo de acuerdo con [43].
[57] Un metodo para producir un anticuerpo anti-TLR2 humano, que comprende cultivar celulas hospedadoras seleccionadas del grupo que consiste en lo siguiente (a) a (c) para expresar el anticuerpo anti-TLR2 humano:
(a) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano de acuerdo con [51], y un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una cadena ligera del anticuerpo anti-TLR2 humano de acuerdo con [51];
(b) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano de acuerdo con [51], y un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una cadena ligera del anticuerpo anti-TLR2 humano de acuerdo con [51]; y
(c) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano de acuerdo con [51], y una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una cadena ligera del anticuerpo anti-TLR2 humano de acuerdo con [51].
[58] Un anticuerpo anti-TLR2 humano, o un fragmento de union a antlgeno del mismo producido mediante el metodo de acuerdo con [56].
[59] Un anticuerpo anti-TLR2 humano producido mediante el metodo de acuerdo con [57].
[60] Una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo anti-TLR2 humano, o el fragmento de union a antlgeno del mismo de acuerdo con uno cualquiera de [42] a [55], [58] y [59] y un excipiente farmaceuticamente
aceptable.
[61] Una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo anti-TLR2 humano, o el fragmento de union a antlgeno del mismo de acuerdo con [43], el anticuerpo anti-TLR2 humano o el fragmento de union a antlgeno del mismo de acuerdo con [44], y un excipiente farmaceuticamente aceptable.
[62] Una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo anti-TLR2 humano de acuerdo con [51], el anticuerpo anti-TLR2 humano de acuerdo con [55], y un excipiente farmaceuticamente aceptable.
[63] La composicion farmaceutica de acuerdo con uno cualquiera de [60] a [62], que es una composicion farmaceutica para prevenir o tratar cancer.
[64] Un metodo para prevenir o tratar cancer, que comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz del anticuerpo anti-TLR2 humano, o el fragmento de union a antlgeno del mismo de acuerdo con uno cualquiera de [42] a [55], [58] y [59].
[65] El anticuerpo anti-TLR2 humano, o el fragmento de union a antlgeno del mismo de acuerdo con uno cualquiera de [42] a [55], [58] y [59] para su uso en la prevencion y tratamiento de cancer.
[66] Uso del anti-TLR2 humano, o el fragmento de union a antlgeno del mismo de acuerdo con uno cualquiera de [42] a [55], [58] y [59] en la fabricacion de una composicion farmaceutica para prevenir o tratar cancer.
El anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano y el anticuerpo anti-TLR2 humano y los fragmentos de union a antlgeno del mismo tambien incluyen una fusion del anticuerpo o el fragmento de union a antlgeno del mismo con otro peptido o protelna, y una modification que tiene un agente de modification vinculado al mismo.
Efectos de la invencion
Un anticuerpo biespeclfico de la presente invencion tiene una potente actividad inflamatoria antiinmunitaria mediante la inhibition funcional del TLR2 humano y el TLR4 humano y puede utilizarse como un agente para prevenir o tratar una enfermedad inflamatoria inmunitaria.
Breve descripcion de los dibujos
La Fig. 1 muestra un ejemplo de una estructura de un anticuerpo biespeclfico de la presente invencion en el que el extremo N de un anticuerpo scFv anti-TLR4 humano esta conectado a traves de un conector al extremo C de cada cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano que es un anticuerpo IgG.
La Fig. 2 muestra un efecto inhibidor de cada anticuerpo anti-TLR2 humano en la production de fosfatasa alcalina (FA) inducida por Pam2CSK4 (agonista de TLR2/6) para celulas THP1-xBlue.
La Fig. 3 muestra un efecto inhibidor de cada anticuerpo biespeclfico sobre la produccion de TNFa inducida por Escherichia coli inactivada para celulas mononucleares de sangre periferica humana normal.
Realizaciones para llevar a cabo la invencion
A partir de ahora en el presente documento, la presente invencion se describira con detalle.
Hay cinco clases principales de IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE en un anticuerpo. La estructura basica de una molecula de anticuerpo esta configurada de cadenas pesadas que tienen un peso molecular de 50000 a 70000 y cadenas ligeras que tienen un peso molecular de 20000 a 30000 en cada una de las clases en comun. La cadena pesada generalmente consiste en una cadena polipeptldica que comprende aproximadamente 440 aminoacidos, tiene una estructura distintiva para cada una de las clases y se denomina IgY, Igp, Iga , Ig5 e Ige correspondientes a IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE, respectivamente. Ademas, cuatro subclases de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 estan presentes en la IgG, y las cadenas pesadas correspondientes a ellas se denominan respectivamente IgY1, IgY2, IgY3 e IgY4. La cadena ligera generalmente consiste en una cadena polipeptldica que comprende aproximadamente 220 aminoacidos, de los cuales dos tipos, tipo L y tipo K, son conocidos, y se denominan IgA e IgK. En una configuration peptldica de la estructura basica de moleculas de anticuerpo, dos cadenas pesadas homologas y dos cadenas ligeras homologas estan unidas mediante enlaces disulfuro (enlace S-S) y enlaces no covalentes, y el peso molecular de la misma es 150000 a 190000. Se pueden emparejar dos tipos de cadenas ligeras con cualquier cadena pesada. Las respectivas moleculas de anticuerpos consisten normalmente en dos cadenas ligeras identicas y dos cadenas pesadas identicas.
Con respecto a los enlaces S-S intracadena, cuatro de los enlaces S-S estan presentes en la cadena pesada (cinco en Igp e Ige) y dos de ellos estan presentes en la cadena ligera; se forma un bucle por cada 100 a 110 restos de aminoacidos, y esta estructura esterica es similar entre los bucles y se conoce como unidad estructural o dominio. El dominio ubicado en el lado N terminal tanto de la cadena pesada como de la cadena ligera, cuya secuencia de aminoacidos no es constante incluso en el caso de una muestra de la misma clase (subclase) del mismo tipo de animal, se conoce como region variable, y los respectivos dominios se denominan region variable de cadena pesada (Vh) y region variable de cadena ligera (Vl). La secuencia de aminoacidos del lado C terminal de la region variable es casi constante en cada clase o subclase y se conoce como region constante (cada uno de los dominios se llama Ch1, Ch2, Ch3 y Cl, respectivamente).
Un sitio determinants antigenico de un anticuerpo esta configurado de VH y VL, y la especificidad de union depende de la secuencia de aminoacidos de este sitio. Por otro lado, las actividades biologicas como la union a complementos y diversas celulas reflejan diferencias en las estructuras de la region constante entre cada clase de Ig. Se entiende que la variabilidad de las regiones variables de las cadenas ligeras y las cadenas pesadas se limita principalmente a tres pequenas regiones hipervariables presentes en ambas cadenas y estas regiones se denominan regiones determinantes de complementariedad (CDR: CDR1, CDR2 y CDR3 desde el extremo N terminal). La porcion restante de la region variable se conoce como region marco (FR, de sus siglas en ingles) y es relativamente constante.
Ademas, varios tipos de fragmentos de anticuerpos que comprenden Vh y Vl de un anticuerpo tambien tienen una actividad de union a antlgeno. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo tlpicos incluyen un fragmento de region variable de cadena unica (scFv), Fab, Fab' y F(ab')2. Un Fab es un fragmento de anticuerpo monovalente que esta constituido por un fragmento de cadena ligera y de cadena pesada que incluye un dominio Vh, un dominio Ch1 y una parte de la region bisagra. Un Fab' es un fragmento de anticuerpo monovalente que esta constituido por un fragmento de cadena ligera y de cadena pesada que incluye un dominio Vh, un dominio Ch1 , y una parte de la region bisagra, y los restos de cistelna que constituyen el enlace S-S entre cadenas pesadas estan incluidos en la parte de la region bisagra. Un fragmento F(ab')2 es un fragmento de anticuerpo bivalente en el que dos fragmentos Fab' se unen entre si a traves del enlace S-S entre cadenas pesadas en la region bisagra. Un scFv es un fragmento de anticuerpo monovalente que esta constituido por una Vh y un Vl conectadas con un conector (por ejemplo, un conector peptldico).
Un anticuerpo biespeclfico es un anticuerpo que comprende regiones variables de cadena pesada y regiones variables de cadena ligera de dos anticuerpos que reconocen dos antlgenos diferentes y se unen a cada antlgeno. Con respecto al anticuerpo biespeclfico, se han informado varios formatos (estructuras) (Expert Rev. Clin. Pharmacol., 2010, Vol. 3, n.° 4, pags. 491-508). Por ejemplo, se ha informado de un anticuerpo biespeclfico tetravalente en el que los extremos C de la region variable de cadena pesada y la region variable de cadena ligera del otro anticuerpo se conectan respectivamente mediante conectores a los extremos N de la region variable de cadena pesada y la region variable de cadena ligera de un anticuerpo, un anticuerpo bivalente biespeclfico en el que la cadena pesada y la cadena ligera de cada anticuerpo se unen a traves de CH3 mediante una tecnologla de pomos en agujeros, y un anticuerpo biespeclfico tetravalente en el que el extremo C del otro anticuerpo scFv esta conectado a traves de un conector al extremo N de la cadena pesada o la cadena ligera de un anticuerpo, o el extremo N del otro anticuerpo scFv esta conectado a traves de un conector al extremo C de la cadena pesada o la ligera de un anticuerpo (Nature Biotech., 1997, Vol. 15, pags. 159-163).
<Anticuerpo biespeclfico de la presente invencion>
La expresion "anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano" como se utiliza en el presente documento se refiere a un anticuerpo biespeclfico que tiene una actividad de union al TLR2 humano y una actividad de union al TLR4 humano. Especlficamente, el anticuerpo biespeclfico de la presente invention incluye un anticuerpo biespeclfico que tiene las siguientes caracterlsticas:
Un anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano, que comprende:
1) una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 120 de la SEQ ID NO: 4, y una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 113 de la SEQ ID NO: 6; y
2) una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 609 de la SEQ ID NO: 4, y una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 625 a 732 de la SEQ ID NO: 4.
Como se utiliza en el presente documento, la expresion "anticuerpo anti-TLR2 humano" se refiere a un anticuerpo que se une al TLR2 humano, y la expresion "anticuerpo anti-TLR4 humano" se refiere a un anticuerpo que se une al TLR4 humano. El anticuerpo biespeclfico de la presente invencion puede tener regiones variables de cadena pesada y regiones variables de cadena ligera de cada uno del anticuerpo anti-TLR2 humano y el anticuerpo anti-TLR4 humano, por ejemplo, puede tener una estructura de cualquier anticuerpo biespeclfico que comprenda un fragmento de anticuerpo anti-TLR2 humano que tiene una actividad de union a un anticuerpo anti-TLR2 humano o TLR2 humano, y un fragmento de anticuerpo anti-TLR4 humano que tiene una actividad de union a un anticuerpo anti-TLR4 humano o TLR4 humano. Ejemplos de dichas estructuras incluyen un anticuerpo biespeclfico (DVD-Ig) en el que los extremos C de la region variable de cadena pesada y la region variable de cadena ligera del otro anticuerpo se conectan respectivamente a traves de conectores a los extremos N de la region variable de cadena pesada y la region variable de cadena ligera de un anticuerpo, un anticuerpo biespeclfico en el que la cadena pesada y la cadena ligera de cada anticuerpo se unen a traves de CH3 mediante una tecnologla de pomos en agujeros, y un anticuerpo biespeclfico tetravalente en el que el extremo C del otro anticuerpo scFv esta conectado a traves de un conector al extremo N de la cadena pesada o cadena ligera de un anticuerpo, o el extremo N del otro anticuerpo scFv esta conectado a traves de un conector al extremo C de la cadena pesada o cadena ligera de un anticuerpo.
Preferentemente, el anticuerpo biespecifico de la presente invencion es un anticuerpo biespeclfico tetravalente que comprende un anticuerpo anti-TLR2 humano y un fragmento de anticuerpo anti-humano TLR4 en el que el anticuerpo anti-TLR2 humano es un anticuerpo IgG, y el fragmento de anticuerpo anti-TLR4 humano es un scFv. A partir de ahora en el presente documento, el anticuerpo biespeclfico tetravalente que tiene esta estructura tambien se conoce como IgG(TLR2)-scFv(TLR4).
En el caso de que el anticuerpo biespeclfico de la presente invencion sea un IgG(TLR2)-scFv(TLR4), las regiones constantes de cualquier subclase (por ejemplo, regiones constantes de IgYl, IgY2, IgY3 o IgY4 como la cadena pesada, e IgA o IgK como la cadena ligera) pueden seleccionarse como la region constante del anticuerpo anti-TLR2 humano, pero se prefiere una region constante de IgYl humana como la region constante de cadena pesada y se prefiere una region constante de IgK humana como la region constante de cadena ligera.
La region constante de IgYl humana utilizada como la region constante de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano puede ser, por ejemplo, una secuencia de aminoacidos que consiste en los numeros de aminoacidos 121 a 450 de la SEQ ID NO: 8.
En el caso de utilizar una region constante de IgY1 humana como la region constante de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano, una region constante de IgY1 humana con la introduccion de una mutacion de aminoacido como L234A (sustitucion de leucina por alanina en la posicion de aminoacido 234 de acuerdo con el Indice EU de Kabat et al.) o L235A (sustitucion de leucina por alanina en la posicion de aminoacido 235 de acuerdo con el Indice de la EU de Kabat et al.) tambien se puede utilizar para reducir la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo y la actividad citotoxica dependiente de complemento del anticuerpo (Mol. Immunol., 1992, Vol. 29, n.° 5, pags. 633-639). Desde el punto de vista de la farmacocinetica in vivo, una region constante de Igyl humana con la introduccion de una mutacion de aminoacido como I253A (sustitucion de isoleucina por alanina en la posicion de aminoacido 253 de acuerdo con el Indice EU de Kabat et al.) tambien se puede utilizar para eliminar rapidamente los anticuerpos de la sangre (J. Immunol., 1997, Vol. 158, pags. 2211-2217). La numeracion de los restos en el contexto de la introduccion de una mutacion de aminoacido en una region constante de un anticuerpo utilizado en esta especificacion es segun el Indice EU (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edicion, United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda).
Preferentemente, la region constante de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano es una region constante de Igyl humana que tiene mutaciones de aminoacidos de L234A y L235A o una region constante de IgY1 humana que tiene mutaciones de aminoacidos de L234A, L235A e I253A. Mas preferentemente, la region constante de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano es una region constante de IgY1 humana que tiene mutaciones de aminoacidos de L234A, L235A y I253A, y dicha region constante de IgY1 humana puede ser, por ejemplo, una secuencia de aminoacidos que consiste en los numeros de aminoacidos 121 a 450 de la SEQ ID NO: 4.
La region constante de IgK humana utilizada como la region constante de cadena ligera del anticuerpo anti-TLR2 humano puede ser, por ejemplo, una secuencia de aminoacidos que consiste en los numeros de aminoacidos 114 a 219 de la SEQ ID NO: 6.
Preferentemente, el anticuerpo anti-TLR2 humano es un anticuerpo anti-TLR2 humano que comprende una region constante de cadena pesada que es una region constante de IgY1 humana y una region constante de cadena ligera que es una region constante de IgK humana, y mas preferentemente la region constante de IgY1 humana es una region constante de IgY1 humana que tiene mutaciones de aminoacidos de L234A, L235A e I253A.
Por ejemplo, el anticuerpo anti-TLR2 humano puede ser un anticuerpo anti-TLR2 humano comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 450 de la SEQ ID NO: 4 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6.
En el caso de que el anticuerpo biespeclfico de la presente invencion sea un IgG(TLR2)-scFv(TLR4), el fragmento de anticuerpo anti-TLR4 humano puede ser uno cualquiera de un scFv que tenga una estructura en la que el extremo N de la region variable de cadena ligera esta conectado a traves de un conector al extremo C de la region variable de cadena pesada (region variable de cadena pesada-conector-region variable de cadena ligera), y un scFv que tiene una estructura en la que el extremo N de la region variable de cadena pesada esta conectado a traves de un conector al extremo C de la region variable de cadena ligera (region variable de cadena ligera-conector-region variable de cadena pesada), y es preferentemente un scFv que tiene una estructura de region variable de cadena pesada-conector-region variable de cadena ligera. El "conector" en el scFv es un peptido (conector peptldico) de cualquier longitud que conecta la region variable de cadena pesada y la region variable de cadena ligera. El conector peptldico es un peptido que tiene preferentemente al menos 5 aminoacidos, mas preferentemente al menos 10 aminoacidos, y aun mas preferentemente de 15 a 50 aminoacidos. El conector peptldico preferido es un conector peptldico que comprende la secuencia de aminoacidos GlyGlyGlyGlySer (tambien denominado (Gly)4Ser) (denominado aqul "conector GS"), preferentemente una pluralidad de (Gly)4Ser, y mas preferentemente de tres a cinco (Gly)4Ser.
Por ejemplo, el fragmento de anticuerpo anti-TLR4 humano puede ser un fragmento de anticuerpo anti-TLR4
humano que es un scFv que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 732 de la SEQ ID NO: 4.
En una realizacion, el anticuerpo biespeclfico de la presente invencion que es un IgG(TLR2)-scFv(TLR4) es un anticuerpo biespeclfico en el que el anticuerpo anti-TLR2 humano comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 450 de la SEQ ID NO: 4 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6, y el fragmento de anticuerpo anti-TLR4 humano es un scFv que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 732 de la SEQ ID NO: 4.
Preferentemente, el extremo N del fragmento de anticuerpo anti-TLR4 humano esta conectado traves de un conector al extremo C de cada cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano en el anticuerpo biespeclfico de la presente invencion que es un IgG(TLR2)-scFv(TLR4). La estructura de dicho anticuerpo especlfico se muestra en la Fig. 1.
El conector que conecta el extremo N del fragmento de anticuerpo anti-TLR4 humano al extremo C de cada cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano es un peptido (conector peptldico) de cualquier longitud que conecta dos extremos. El conector peptldico es un peptido que tiene preferentemente al menos 5 aminoacidos, mas preferentemente al menos 10 aminoacidos, y aun mas preferentemente de 15 a 50 aminoacidos. El conector peptldico preferido es un conector GS y comprende preferentemente una pluralidad de (Gly)4Ser, mas preferentemente de cinco a diez (Gly)4Ser. Dicho conector puede ser, por ejemplo, un conector peptldico que consiste en la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO: 9.
En una realizacion, el anticuerpo biespeclfico de la presente invencion que es un IgG(TLR2)-scFv(TLR4) es un anticuerpo biespeclfico en el que el anticuerpo anti-TLR2 humano comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 450 de la SEQ ID NO: 4 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6, el fragmento de anticuerpo anti-TLR4 humano es un scFv que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 732 de la SEQ ID NO: 4, y el extremo N del fragmento de anticuerpo anti-TLR4 humano esta conectado traves de un conector al extremo C de cada cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano. La fusion en la que el extremo N del fragmento de anticuerpo anti-TLR4 humano esta conectado a traves del conector al extremo C de la cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano tambien se conoce como "fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano-anticuerpo scFv anti-TLR4 humano". Preferentemente, en el anticuerpo biespeclfico, el conector que conecta la cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano y el fragmento de anticuerpo anti-TLR4 humano es un conector GS. Mas preferentemente, el conector GS consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 9. Dicho anticuerpo biespeclfico de la presente invencion puede ser, por ejemplo, un anticuerpo biespeclfico que comprende una fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano-anticuerpo scFv anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4, y una cadena ligera del anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6.
En general, se sabe que cuando un anticuerpo se expresa en celulas, el anticuerpo se modifica despues de la traduccion. Los ejemplos de la modificacion postraduccional incluyen la escision de lisina en el extremo C de la cadena pesada mediante una carboxipeptidasa; y modificacion de glutamina o acido glutamico en el extremo N de la cadena pesada y la cadena ligera a acido piroglutamico mediante piroglutamilacion; y se sabe que la eliminacion de lisina en el extremo C de la cadena pesada y la modificacion de la mayor parte de la glutamina en el extremo N de la cadena pesada y la cadena ligera a acido piroglutamico se producen en varios anticuerpos (Journal of Pharmaceutical Sciences, 2008, Vol. 97, pags. 2426-2447).
El anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano de la presente invencion tambien incluye un anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano y se somete a modificacion postraduccional. Por ejemplo, el anticuerpo biespeclfico de la presente invencion tambien incluye no solo un anticuerpo biespeclfico que tiene una cadena pesada de longitud completa, sino tambien un anticuerpo biespeclfico que tiene una cadena pesada que carece de lisina en el extremo C. Tambien se incluye un anticuerpo biespeclfico sometido a modificacion de glutamina o acido glutamico en el extremo N a acido piroglutamico mediante piroglutamilacion. Se sabe en la materia que dicha modificacion postraduccional debida a la piroglutamilacion en el extremo N y la eliminacion de lisina en el extremo C no tiene ningun efecto sobre la actividad del anticuerpo (Analytical Biochemistry, 2006, Vol. 348, pags. 24-39).
En una realizacion, el anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano de la presente invencion tambien incluye un anticuerpo biespeclfico descrito a continuacion.
Un anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano, que comprende una fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano-anticuerpo scFv anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la s Eq ID NO: 4 y que tiene una modificacion de acido glutamico del numero de aminoacido 1 de la SEQ ID NO: 4 a acido piroglutamico, y una cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6.
La presente invencion tambien incluye un anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 y al TLR4 humanos y tiene las
siguientes caracterlsticas.
Un anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano, que comprende
1) una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano que comprende la CDR1 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 31 a 35 de la SEQ ID NO: 4, la CDR2 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 50 a 66 de la SEQ ID NO: 4 y la CDR3 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 99 a 109 de la SEQ ID NO: 4, y una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que comprende la CDR1 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 24 a 39 de la SEQ ID NO: 6, la CDR2 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 55 a 61 de la SEQ ID NO: 6 y la CDR3 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 94 a 102 de la SEQ ID NO: 6; y
2) una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR4 humano que comprende la CDR1 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 521 a 525 de la SEQ ID NO: 4, la CDR2 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 540 a 556 de la SEQ ID NO: 4 y la CDR3 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 589 a 598 de la SEQ ID NO: 4, y una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR4 humano que comprende la CDR1 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 648 a 658 de la SEQ ID NO: 4, la CDR2 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 674 a 680 de la SEQ ID NO: 4 y la CDR3 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 713 a 721 de la SEQ ID NO: 4.
El metodo para evaluar una actividad del anticuerpo biespeclfico de la presente invencion puede incluir un metodo para evaluar una actividad de union y una actividad neutralizante para t LR2 humano y/o TLR4 humano.
Ya sea que tenga o no una actividad de union a TLR2 humano o TLR4 humano puede confirmarse mediante un metodo de medicion conocido en la materia. Dicho metodo de medicion puede incluir, por ejemplo, metodos como el analisis de resonancia de plasmon de superficie (SPR, de sus siglas en ingles) y un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA, de sus siglas en ingles). Por ejemplo, en el caso de realizar un analisis de SPR para una actividad de union al TLR2 humano, se puede utilizar Biacore T200 (GE Healthcare Japan). En este caso, la actividad de union de un anticuerpo de prueba al TLR2 humano puede evaluarse mediante la inmovilizacion de la protelna humana TLR2 (R&D Systems) en la superficie de un chip sensor, la adicion del anticuerpo de prueba a una ruta de flujo y el analisis de la constante de disociacion del anticuerpo de prueba con la protelna humana TLR2 (KD). Como ejemplo de un metodo de evaluacion especlfico, se puede utilizar el metodo que se describe en el Ejemplo 5 a continuacion. Como otro ejemplo, en el caso de evaluar una actividad de union al TLR4 humano utilizando ELISA, la actividad de union de un anticuerpo de prueba al TLR4 humano puede evaluarse mediante la inmovilizacion de un complejo de TLR4 humano y MD2 (en lo sucesivo, protelna TLR4 humano/MD2) en una placa ELISA, la adicion de un anticuerpo de prueba a la misma, seguido de la reaccion, lo que permite reaccionar con un anticuerpo secundario tal como el anticuerpo anti-IgG marcado con una enzima tal como la peroxidasa de rabano picante (HRP, de sus siglas en ingles), el lavado y luego la medicion de la actividad utilizando un reactivo de deteccion de actividad (por ejemplo, en el caso del etiquetado HRP, 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB; MOS) para identificar la union del anticuerpo secundario. Como ejemplo de un metodo de evaluacion especlfico, se puede utilizar el metodo que se describe en el Ejemplo 9 a continuacion.
La expresion "actividad neutralizante del anticuerpo contra TLR2 humano" se refiere a una actividad que inhibe cualquier actividad biologica que es provocada por el TLR2 humano a traves de la union al TLR2 humano, y puede evaluarse una o una pluralidad de actividades biologicas como un indicador. Por ejemplo, dicha actividad neutralizante contra el TLR2 humano puede ser una actividad que inhibe la produccion de FA inducida por Pam2CSK4 en una celula THP1-xBlue que es una celula monocltica humana. Como un metodo especlfico para evaluar la actividad, por ejemplo, se puede utilizar el metodo que se describe en el Ejemplo 6 a continuacion.
La expresion "actividad neutralizante del anticuerpo contra TLR4 humano" se refiere a una actividad que inhibe cualquier actividad biologica que es provocada por el TLR4 humano a traves de la union al TLR4 humano, y puede evaluarse una o una pluralidad de actividades biologicas como un indicador. Por ejemplo, dicha actividad neutralizante contra el TLR4 humano puede ser una actividad que inhibe la produccion de IL-6 inducida por LPS en una celula U937 que es una llnea celular monocltica humana.
El anticuerpo biespeclfico de la presente invencion tiene una actividad neutralizante contra el TLR2 humano y el TLR4 humano. La frase "tiene una actividad neutralizante contra el TLR2 humano y el TLR4 humano" se refiere a tener una actividad neutralizante contra el TLR2 humano y una actividad neutralizante contra el TLR4 humano. Ya sea que tenga o no una actividad neutralizante contra el TLR2 humano y el TLR4 humano puede ser evaluado mediante la utilizacion de cada uno de los metodos de evaluacion mencionados anteriormente de una actividad neutralizante contra el TLR2 humano o el TLR4 humano, y una actividad de inhibicion de una o una pluralidad de actividades biologicas de la celula mediada por el TLR2 humano y el TLR4 humano puede evaluarse mediante la utilizacion de una celula que exprese tanto el TLR2 humano como el TLR4 humano. Un ejemplo del ultimo metodo
de evaluacion puede ser una evaluacion de una actividad que inhibe la produccion de TNFa inducida por la PAO-1 de Pseudomonas aeruginosa (por ejemplo, ATCC: BAA-47) que es el agente causal de la sepsis en una celula mononuclear de sangre periferica humana que expresa el TLR2 humano y el TLR4 humano. El anticuerpo que tiene dicha actividad puede determinarse como un anticuerpo que tiene una actividad neutralizante contra el TLR2 humano y el TLR4 humano. Como metodo de evaluacion especlfico, se puede utilizar el metodo que se describe en el Ejemplo 10 a continuacion.
El anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano de la presente invention puede ser preparado facilmente por los expertos en la materia utilizando un metodo conocido en la materia, basado en la information de secuencia de la region variable de cadena pesada y la region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano, y la region variable de cadena pesada y la region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR4 humano incluido en el anticuerpo biespeclfico de la presente invencion, que se desvelan en la presente memoria descriptiva. El anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano de la presente invencion no esta particularmente limitado, pero se puede producir de acuerdo con, por ejemplo, el metodo descrito en la section de <Metodo para producir anticuerpo biespeclfico de la presente invencion, y anticuerpo biespeclfico producido por el mismo metodo> descrito a continuacion.
El anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano de la presente invencion se purifica ademas si se desea y se formula de acuerdo con un metodo convencional, y luego se puede utilizar para la prevention o el tratamiento de enfermedades en las que el TLR2 humano y el TLR4 humano estan implicados en la patogenesis de la misma, que incluye enfermedades inflamatorias inmunitarias, como sepsis, insuficiencia renal aguda, enfermedad renal cronica, slndrome de la dificultad respiratoria aguda, esclerodermia, pancreatitis aguda, enfermedad pulmonar obstructiva cronica.
<Polinucleotido de la presente invencion>
El polinucleotido de la presente invencion incluye un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la region variable de cadena pesada (que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 120 de la SEQ ID NO: 4) de un anticuerpo anti-TLR2 humano incluido en el anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano de la presente invencion, un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la region variable de cadena ligera (que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 113 de la SEQ ID NO: 6) de un anticuerpo anti-TLR2 humano incluido en el anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano de la presente invencion, un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la region variable de cadena pesada (que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 609 de la SEQ ID NO: 4) de un anticuerpo anti-TLR4 humano incluido en el anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano de la presente invencion, y un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la region variable de cadena ligera (que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 625 a 732 de la SEQ ID NO: 4) de un anticuerpo anti-TLR4 humano incluido en el anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano del presente invencion.
El polinucleotido de la presente invencion no esta particularmente limitado siempre que sea un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano incluido en el anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano de la presente invencion, un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano incluido en el anticuerpo biespeclfico, un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR4 humano incluido en el anticuerpo biespeclfico, o un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR4 humano incluido en el anticuerpo biespeclfico. Por ejemplo, el polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la region variable de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano puede ser un polinucleotido que comprende una secuencia de bases de los numeros de bases 1 a 360 de la SEQ ID NO: 3, el polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la region variable de cadena ligera del anticuerpo anti-TLR2 humano puede ser un polinucleotido que comprende una secuencia de bases de los numeros de bases 1 a 339 de la SEQ ID NO: 5, el polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la region variable de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR4 humano puede ser un polinucleotido que comprende una secuencia de bases de los numeros de bases 1471 a 1827 de la s Eq ID NO: 3, y el polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la region variable de cadena ligera del anticuerpo anti-TLR4 humano puede ser un polinucleotido que comprende una secuencia de bases de los numeros de bases 1873 a 2196 de la SEQ ID NO: 3.
Los ejemplos preferidos del polinucleotido de la presente invencion incluyen un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano-anticuerpo scFv anti-TLR4 humano en la que el extremo N de un fragmento de anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 732 de la SEQ ID NO: 4 esta conectado a traves de un conector al extremo C de la cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 450 de la SEQ ID NO: 4, y un polinucleotido que comprende
una secuencia de bases que codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6, donde el anticuerpo biespeclfico de la presente invention es un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica IgG(TLR2)-scFv(TLR4). El polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una fusion cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humanoanticuerpo scFv anti-TLR4 humano es preferentemente un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la fusion que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4.
En una realization, el polinucleotido que codifica una fusion cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humanoanticuerpo scFv anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4 puede ser un polinucleotido que consiste en la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 3 y el polinucleotido de la cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6 puede ser un polinucleotido que consiste en la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 5.
El polinucleotido de la presente invencion puede prepararse facilmente por los expertos en la materia utilizando un metodo conocido en la materia basado en la secuencia de bases. Por ejemplo, el polinucleotido de la presente invencion se puede sintetizar utilizando un metodo de slntesis de genes conocido en la materia. Se pueden utilizar diversos metodos, tales como un metodo de slntesis de genes de anticuerpos descritos en el documento WO90/07861, conocido por los expertos en la materia, como metodo de slntesis de genes. Una vez que se obtiene el polinucleotido de la presente invencion, tambien es posible obtener otros polinucleotidos de la presente invencion mediante la introduction de una mutation en un sitio predeterminado de este polinucleotido. El metodo de mutagenesis que se puede utilizar incluye varios metodos conocidos por los expertos en la materia, como la mutagenesis especlfica del sitio (Current Protocols in Molecular Biology edit., 1987, John Wiley&Sons Section 8.1 8.5).
<Vector de expresion de la presente invencion>
El vector de expresion de la presente invencion incluye un vector que es un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano incluido en el anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano de la presente invencion, un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano incluido en el anticuerpo biespeclfico, un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR4 humano incluido en el anticuerpo biespeclfico, y/o un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR4 humano incluido en el anticuerpo biespeclfico, y se puede utilizar en la production de un anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano de la presente invencion. Los anticuerpos biespeclficos de diversos formatos y sus metodos de produccion son conocidos en la materia. El vector de expresion de la presente invencion se puede construir facilmente de acuerdo con estos metodos de produccion por los expertos en la materia de acuerdo con el formato de un anticuerpo biespeclfico a expresar.
Por ejemplo, el vector de expresion utilizado para producir el anticuerpo biespeclfico de la presente invencion que es IgG(TLR2)-scFv(TLR4) es preferentemente un vector de expresion que comprende uno o ambos polinucleotidos que comprenden una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano incluido en el anticuerpo biespeclfico, una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR4 humano incluido en el anticuerpo biespeclfico, y una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR4 humano incluido en el anticuerpo biespeclfico, y un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano incluido en el anticuerpo biespeclfico.
Mas preferentemente, el vector de expresion utilizado para producir el anticuerpo biespeclfico de la presente invencion que es IgG(TLR2)-scFv(TLR4) es un vector de expresion que comprende uno o ambos de un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano-anticuerpo scFv anti-TLR4 humano en la que el extremo N de un fragmento de anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 732 de la SEQ ID NO: 4 esta conectado a traves de un conector al extremo C de la cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 450 de la SEQ ID NO: 4, y un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6.
Aun mas preferentemente, el vector de expresion utilizado para producir el anticuerpo biespeclfico de la presente invencion que es IgG(TLR2)-scFv(TLR4) es un vector de expresion que comprende uno o ambos de un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano-anticuerpo scFv anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4, y un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6.
El vector de expresion utilizado para expresar polinucleotidos no esta particularmente limitado siempre que sea un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano incluido en el anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano de la presente invencion, un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano incluido en el anticuerpo biespeclfico, un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR4 humano incluido en el anticuerpo biespeclfico, y/o un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR4 humano incluido en el anticuerpo biespeclfico se puede expresar en diversas celulas hospedadoras de celulas eucariotas (por ejemplo, celulas animales, celulas de insecto, celulas vegetales, y levadura) y/o celulas procariotas (por ejemplo, Escherichia coli), y pueden producirse los polipeptidos codificados por estos polinucleotidos. Los ejemplos del vector de expresion incluyen un vector plasmido y un vector viral (por ejemplo, adenovirus o retrovirus). Preferentemente, pueden utilizarse pEE6.4 o pEE12.4 (Lonza, Inc.). Ademas, un gen de anticuerpo puede expresarse mediante la introduccion de un fragmento de gen de region variable en un vector de expresion que comprende un gen de region constante de Ig humana tal como AG-y1 o AG-k (por ejemplo, vease el documento WO94/20632) por adelantado.
En el caso en que se use una celula animal, una celula de insecto o una levadura como celula hospedadora, el vector de expresion de la presente invencion puede comprender un codon de inicio y un codon de terminacion. En este caso, el vector de expresion de la presente invencion puede comprender una secuencia potenciadora, una region no traducida en el lado 5' y el lado 3' de los genes que codifican el anticuerpo biespeclfico de la presente invencion o la region variable de cadena pesada o la region variable de cadena ligera del mismo, una secuencia senal secretora, una union de empalme, un sitio de poliadenilacion o un replicon. En los casos en los que se utiliza Escherichia coli como celula hospedadora, el vector de expresion de la presente invencion puede comprender un codon de inicio, un codon de terminacion, una region de terminacion y un replicon. Ademas, el vector de expresion de la presente invencion puede comprender un marcador de seleccion (por ejemplo, un gen de resistencia a la tetraciclina, un gen de resistencia a la ampicilina, un gen de resistencia a la kanamicina, un gen de resistencia a la neomicina o un gen de la dihidrofolato reductasa) que se utiliza comunmente segun la necesidad.
El vector de expresion de la presente invencion puede incluir un promotor que esta unido operativamente al polinucleotido. Los ejemplos del promotor para expresar el polinucleotido de la presente invencion en una celula animal incluyen un promotor que procede de virus tal como CMV, RSV o SV40, un promotor de actina, un promotor 1a del factor de alargamiento (EF, de sus siglas en ingles) y un promotor de choque termico. En el caso de que la celula hospedadora sea Escherichia coli (por ejemplo, las bacterias que pertenecen al genero Escherichia), los ejemplos de los promotores para la expresion incluyen un promotor trp, un promotor lac, un promotor APL y un promotor tac. Ademas, los ejemplos de los promotores para la expresion en levaduras incluyen un promotor de GAL1, un promotor de GAL10, un promotor de PH05, un promotor de PGK, un promotor de gAp y un promotor de ADH.
<Celula hospedadora transformada de la presente invencion>
La celula hospedadora transformada de la presente invencion no esta particularmente limitada siempre que se transforme con el vector de expresion de la presente invencion, y un ejemplo de la misma es la celula hospedadora transformada de la presente invencion utilizada para producir el anticuerpo biespeclfico de la presente invencion que es IgG(TLR2)-scFv(TLR4) e incluye una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende uno o ambos de un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano incluido en el anticuerpo biespeclfico, una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR4 humano incluido en el anticuerpo biespeclfico, y una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR4 humano incluido en el anticuerpo biespeclfico, y un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano incluido en el anticuerpo biespeclfico.
La celula hospedadora transformada de la presente invencion que es IgG(TLR2)-scFv(TLR4) incluye una celula hospedadora transformada con el vector de expresion de la presente invencion, que se selecciona del grupo que consiste en lo siguiente (a) a (d):
(a) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 120 de la SEQ ID NO: 4, un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 609 de la SEQ ID NO: 4, y un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 625 a 732 de la SEQ ID NO: 4, y un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 113 de la SEQ ID NO: 6;
(b) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 120 de la SEQ ID NO: 4, un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 609 de la SEQ ID NO: 4, un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 625 a 732 de la SEQ ID NO: 4, y un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena ligera de una anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 113 de la SEQ ID NO: 6;
(c) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 120 de la SEQ ID NO: 4, un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 609 de la SEQ ID NO: 4, y un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 625 a 732 de la SEQ ID NO: 4; y
(d) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 113 de la SEQ ID NO: 6.
En una realizacion, la celula hospedadora transformada de la presente invention es una celula hospedadora transformada con el vector de expresion de la presente invencion, que se selecciona del grupo que consiste en lo siguiente (a) a (d):
(a) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano-anticuerpo scFv anti-TLR4 humano en la que el extremo N de un fragmento de anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 732 de la SEQ ID NO: 4 esta conectado a traves de un conector al extremo C de la cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 450 de la SEQ ID NO: 4, y un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6;
(b) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano-anticuerpo scFv anti-TLR4 humano en la que el extremo N de un fragmento de anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 732 de la SEQ ID NO: 4 esta conectado a traves de un conector al extremo C de la cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 450 de la SEQ ID NO: 4, y un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6.
(c) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano-anticuerpo scFv anti-TLR4 humano en la que el extremo N de un fragmento de anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 732 de la SEQ ID NO: 4 esta conectado a traves de un conector al extremo C de la cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 450 de la SEQ ID NO: 4; y
(d) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6.
En una realizacion, la celula hospedadora transformada de la presente invencion es una celula hospedadora transformada con el vector de expresion de la presente invencion, que se selecciona del grupo que consiste en lo siguiente (a) a (d):
(a) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano-anticuerpo scFv anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4, y un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6;
(b) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano-anticuerpo scFv anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4, y un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6;
(c) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humanos-anticuerpo scFv anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4; y
(d) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6.
Los ejemplos preferidos de la celula hospedadora transformada de la presente invencion que es IgG(TLR2)-scFv(TLR4) incluyen una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano-anticuerpo scFv anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4, y un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6, y una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano-anticuerpo scFv anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4 y un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6.
El metodo para producir IgG(TLR2)-scFv(TLR4) de la presente invencion no esta particularmente limitado siempre que incluya una etapa de cultivo de la celula hospedadora transformada de la presente invencion para expresar IgG(TLR2)-scFv(TLR4). Los ejemplos de la celula hospedadora preferida para su uso en el metodo incluyen las celulas hospedadoras transformadas preferidas anteriores de la presente invencion.
La celula hospedadora a transformar no esta particularmente limitada siempre que la celula hospedadora sea apropiada para el vector de expresion que se esta utilizando, se transforme con el vector de expresion y pueda expresar un anticuerpo. Los ejemplos de la celula hospedadora a transformar incluyen varias celulas tales como celulas naturales o celulas establecidas artificialmente que se utilizan convencionalmente en la materia a la que pertenece la presente invencion (por ejemplo, celulas animales (por ejemplo, celulas CHO-K1SV), celulas de insecto (por ejemplo, Sf9), Escherichia coli (por ejemplo, bacterias que pertenecen al genero Escherichia), levadura (por ejemplo, el genero Saccharomyces o Pichia) y similares). Preferentemente, se pueden utilizar celulas cultivadas de celulas CHO-K1SV, celulas CHO-DG44, celulas 293, celulas NS0 o similares.
El metodo de transformacion de una celula hospedadora no esta particularmente limitado, pero, por ejemplo, se puede utilizar un metodo de fosfato de calcio o un metodo de electroporacion.
<Metodo para producir anticuerpo biespeclfico de la presente invencion, y anticuerpo biespeclfico producido por el mismo metodo>
El metodo para producir el anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano de la presente invencion no esta particularmente limitado siempre que incluya una etapa de cultivo de la celula hospedadora transformada de la presente invencion para expresar el anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano. Los ejemplos de la celula hospedadora preferida para su uso en el metodo incluyen las celulas hospedadoras transformadas preferidas anteriores de la presente invencion.
En una realizacion, el metodo para producir el anticuerpo biespeclfico de la presente invencion que es IgG(TLR2)-scFv(TLR4) incluye un metodo para producir un anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano, que comprende cultivar celulas hospedadoras seleccionadas del grupo que consiste en lo siguiente (a) a (c) para expresar el anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano:
(a) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 120 de la SEQ ID NO: 4, un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 609 de la SEQ ID NO: 4, y un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 625 a 732 de la SEQ ID NO: 4, y un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros
de aminoacidos 1 a 113 de la SEQ ID NO: 6;
(b) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 120 de la SEQ ID NO: 4, un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 609 de la SEQ ID NO: 4, un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 625 a 732 de la SEQ ID NO: 4, y un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena ligera de una anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 113 de la SEQ ID NO: 6; y
(c) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 120 de la SEQ ID NO: 4, un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 609 de la SEQ ID NO: 4, y un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 625 a 732 de la SEQ ID NO: 4, y una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 113 de la SEQ ID NO: 6.
En una realizacion, el metodo para producir el anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano de la presente invencion incluye un metodo para producir un anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al t LR4 humano, que comprende cultivar celulas hospedadoras seleccionadas del grupo que consiste en lo siguiente (a) a (c) para expresar el anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano:
(a) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano-anticuerpo scFv anti-TLR4 humano en la que el extremo N de un fragmento de anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 732 de la SEQ ID NO: 4 esta conectado a traves de un conector al extremo C de la cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 450 de la SEQ ID NO: 4, y un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6;
(b) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano-anticuerpo scFv anti-TLR4 humano en la que el extremo N de un fragmento de anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 732 de la SEQ ID NO: 4 esta conectado a traves de un conector al extremo C de la cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 450 de la SEQ ID NO: 4, y un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6; y
(c) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano-anticuerpo scFv anti-TLR4 humano en la que el extremo N de un fragmento de anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 732 de la SEQ ID NO: 4 esta conectado a traves de un conector al extremo C de la cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 450 de la SEQ ID NO: 4, y una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6.
En una realizacion, el metodo para producir el anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano de la presente invencion incluye un metodo para producir un anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al t LR4 humano, que comprende cultivar celulas hospedadoras seleccionadas del grupo que consiste en lo siguiente (a) a (c) para expresar el anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano:
(a) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano-anticuerpo scFv anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4, y un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID
NO: 6;
(b) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano-anticuerpo scFv anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4, y un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6; y
(c) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano-anticuerpo scFv anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4, y una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6.
La celula hospedadora transformada se puede cultivar mediante un metodo conocido. Las condiciones de cultivo, por ejemplo, la temperatura, el pH del medio y el tiempo de cultivo se seleccionan apropiadamente. En el caso donde la celula hospedadora es una celula animal, los ejemplos del medio incluyen un medio MEM que contiene aproximadamente del 5 al 20 % de suero bovino fetal (Science, 1959, Vol. 130, n.° 3373, pags. 432 a 7), un medio DMEM (Virology, 1959, Vol. 8, pag. 396), y un medio RPMI1640 (J. Am. Med. Assoc., 1967, Vol. 199, pag. 519), un medio 199 (Exp. Biol. Med., 1950, Vol. 73, pags. 1 a 8). El pH del medio es preferentemente de aproximadamente 6 a 8, y el cultivo generalmente se lleva a cabo a aproximadamente de 30 a 40 °C durante aproximadamente 15 a 72 horas con aireacion y agitacion si es necesario. En el caso donde la celula hospedadora es una celula de insecto, por ejemplo, puede utilizarse como medio un medio de Grace (Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 1985, Vol. 82, pag.
8404) que contiene suero bovino fetal. El pH del medio es preferentemente de aproximadamente 5 a 8, y el cultivo generalmente se lleva a cabo a aproximadamente de 20 a 40 °C durante aproximadamente 15 a 100 horas con aireacion y agitacion si es necesario. En el caso donde la celula hospedadora es Escherichia coli o levadura, por ejemplo, un medio llquido que contiene una fuente de nutrientes es adecuado como medio. Se prefiere que el medio nutriente contenga una fuente de carbono, una fuente de nitrogeno inorganico o una fuente de nitrogeno organico necesaria para el crecimiento de la celula hospedadora transformada. Los ejemplos de la fuente de carbono incluyen glucosa, dextrano, almidon y sacarosa solubles, y los ejemplos de la fuente de nitrogeno inorganico o la fuente de nitrogeno organico incluyen sales de amonio, sales de nitrato, aminoacidos, licor de malz, peptona, caselna, extracto de carne, harina de soja y extracto de patata. Se pueden incluir otros nutrientes (por ejemplo, sales inorganicas (por ejemplo, cloruro de calcio, dihidrogenofosfato de sodio y cloruro de magnesio), vitaminas) y antibioticos (por ejemplo, tetraciclina, neomicina, ampicilina y kanamicina), segun se desee. El pH del medio es preferentemente de aproximadamente 5 a 8. En el caso donde la celula hospedadora es Escherichia coli, los ejemplos preferidos del medio que se puede utilizar incluyen un medio LB y un medio M9 (Mol. Clo., Cold Spring Harbor Laboratory, Vol. 3, A2.2). El cultivo generalmente se lleva a cabo a aproximadamente 14 a 39 °C durante aproximadamente 3 a 24 horas con aireacion y agitacion si es necesario. En el caso donde la celula hospedadora es una levadura, por ejemplo, se puede utilizar como medio un medio mlnimo de Burkholder (Proc. Natl. Acad, Sci, EE.UU., 1980, Vol. 77, pag. 4505). El cultivo generalmente se lleva a cabo a aproximadamente 20 a 35 °C durante aproximadamente 14 a 144 horas con aireacion y agitacion si es necesario. Al llevar a cabo el cultivo de la manera descrita anteriormente, es posible expresar el anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano de la presente invencion.
El metodo para producir el anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano de la presente invencion puede incluir ademas recuperar, preferentemente aislar o purificar el anticuerpo biespeclfico de la presente invencion de la celula hospedadora transformada ademas de cultivar la celula hospedadora transformada para expresar el anticuerpo biespeclfico de la presente invencion como se describe anteriormente. Los ejemplos del metodo de aislamiento o purificacion incluyen metodos que utilizan solubilidad, como la precipitacion salina y un metodo de precipitacion con solventes, metodos que utilizan la diferencia de peso molecular, como la dialisis, la ultrafiltracion y la filtracion en gel, metodos que utilizan una carga electrica como la cromatografla de intercambio ionico y la cromatografla de hidroxilapatita, metodos que utilizan afinidad especlfica, como la cromatografla de afinidad, metodos que utilizan la diferencia de hidrofobia, como la cromatografla llquida de alto rendimiento en fase inversa, y metodos que utilizan la diferencia de punto isoelectrico, como la electroforesis de punto isoelectrico. Preferentemente, el anticuerpo acumulado en un sobrenadante de cultivo se puede purificar mediante diversas cromatograflas, por ejemplo, diversas cromatograflas en columna que utilizan una columna de Protelna A o una columna de Protelna G.
<Composicion farmaceutica de la presente invencion>
La composicion farmaceutica de la presente invencion incluye una composition farmaceutica que comprende el anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano de la presente invencion y un excipiente farmaceuticamente aceptable. La composicion farmaceutica de la presente invencion se puede preparar mediante un metodo utilizado convencionalmente que utiliza excipientes, es decir, excipientes farmaceuticos o vehlculos farmaceuticos comunmente utilizados en la materia. Los ejemplos de formas de dosificacion de las composiciones farmaceuticas incluyen preparaciones parenterales tales como una inyeccion y una infusion por goteo, que pueden administrarse mediante administration intravenosa, administration subcutanea o similares. En la preparation de
productos farmaceuticos, los vehlcuios y aditivos de acuerdo con las formas de dosificacion se pueden utilizar dentro del intervalo farmaceuticamente aceptable.
La composicion farmaceutica de la presente invencion puede incluir varios tipos de anticuerpos biespeclficos que se unen al TLR2 humano y al TLR4 humano de la presente invencion. Por ejemplo, la presente invencion tambien incluye una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo no sometido a modificacion postraduccional y un anticuerpo o un fragmento de union a antlgeno del mismo que procede de una modificacion postraduccional del anticuerpo.
En una realization, la composicion farmaceutica de la presente invencion que comprende un anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano tambien incluye una composicion farmaceutica descrita a continuacion.
Una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano que es un anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano, que comprende 1) una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 120 de la SEQ ID NO: 4, y una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 113 de la SEQ ID NO: 6, y
2) una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 609 de la SEQ ID NO: 4, y una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 625 a 732 de la SEQ ID NO: 4, y
un anticuerpo biespeclfico que procede de una modificacion postraduccional del anticuerpo biespeclfico anterior. La composicion farmaceutica de la presente invencion tambien incluye una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo biespeclfico que tiene la elimination de la lisina C-terminal de la cadena pesada, un anticuerpo biespeclfico que tiene la modificacion postraduccional N terminal, un anticuerpo biespeclfico que tiene la eliminacion de la lisina C-terminal de la cadena pesada y la modificacion postraduccional N terminal, y/o un anticuerpo biespeclfico que tiene lisina del extremo C de la cadena pesada y que no tiene la modificacion postraduccional N terminal.
En una realizacion, la presente invencion tambien incluye una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano de los siguientes (1) y (2).
(1) un anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano, que comprende una fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano-anticuerpo scFv anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4 y que tiene una modificacion de acido glutamico del numero de aminoacido 1 a acido piroglutamico, y una cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6.
(2) un anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano, que comprende una fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano-anticuerpo scFv anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4, y una cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6.
En otra realizacion mas, la composicion farmaceutica de la presente invencion que comprende un anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano tambien incluye una composicion farmaceutica descrita a continuation.
Una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano, que comprende una fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano-anticuerpo scFv anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO: 4 y una cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO: 6, y un excipiente farmaceuticamente aceptable.
La cantidad de adicion del anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano de la presente invencion en una formulation varla dependiendo de la gravedad y la edad de los pacientes, una forma de dosificacion de la formulacion de farmaco a utilizar, el tltulo de union del anticuerpo y similares. Por ejemplo, el anticuerpo biespeclfico se puede utilizar en una cantidad de aproximadamente 0,001 mg/kg a 100 mg/kg.
La composicion farmaceutica de la presente invencion se puede utilizar como un agente para prevenir o tratar enfermedades inflamatorias inmunitarias en las cuales los TLR2 y TLR4 humanos estan implicados en la patogenesis de las mismas, tal como sepsis, insuficiencia renal aguda, enfermedad renal cronica, slndrome de la dificultad respiratoria aguda, esclerodermia, pancreatitis aguda y enfermedad pulmonar obstructiva cronica.
La presente invention incluye una composition farmaceutica para prevenir o tratar enfermedades inflamatorias inmunitarias, que comprende el anticuerpo biespecifico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano de la presente invencion. Ademas, la presente invencion incluye un metodo para prevenir o tratar una enfermedad inflamatoria inmunitaria, que comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz del anticuerpo biespecifico. Ademas, la presente invencion incluye el anticuerpo biespecifico de la presente invencion para su uso en la prevention o el tratamiento de una enfermedad inflamatoria inmunitaria. Ademas, la presente invencion incluye el uso del anticuerpo biespecifico de la presente invencion en la fabrication de una composicion farmaceutica para prevenir o tratar una enfermedad inflamatoria inmunitaria.
<Anticuerpo anti-TLR2 humano de la presente invencion y composicion farmaceutica que comprende el mismo anticuerpo>
La presente invencion incluye un anticuerpo anti-TLR2 humano o un fragmento de union a antigeno del mismo, que comprende una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano que comprende la CDR1 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 31 a 35 de la SEQ ID NO: 8, la CDR2 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 50 a 66 de la SEQ ID NO: 8 y la CDR3 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 99 a 109 de la SEQ ID NO: 8, y una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que comprende la CDR1 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 24 a 39 de la SEQ ID NO: 6, la CDR2 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 55 a 61 de la SEQ ID NO: 6 y la CDR3 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 94 a 102 de la SEQ ID NO: 6.
Ademas, la presente invencion tambien incluye un anticuerpo anti-TLR2 humano o un fragmento de union a antigeno del mismo que comprende una region variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 120 de la SEQ ID NO: 8 y una region variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 113 de la SEQ ID NO: 6, y un anticuerpo o un fragmento de union a antigeno del mismo que procede de una modification postraduccional del anticuerpo o del fragmento de union a antigeno del mismo. Los ejemplos de la modificacion postraduccional incluyen piroglutamilacion en el extremo N de la region variable de cadena pesada y/o elimination de lisina en el extremo C de la cadena pesada. La region constante de cadena pesada y la region constante de cadena ligera preferidas en el anticuerpo anti-TLR2 humano o el fragmento de union a antigeno del mismo de la presente invencion son los mismos que los descritos para el anticuerpo anti-TLR2 humano en la section <Anticuerpo biespecifico de la presente invencion> descrito anteriormente.
En una realization, el anticuerpo anti-TLR2 humano de la presente invencion es un anticuerpo anti-TLR2 humano que tiene las siguientes caracteristicas.
Un anticuerpo anti-TLR2 humano que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 450 de la SEQ ID NO: 8 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6.
En otra realizacion mas, el anticuerpo anti-TLR2 humano de la presente invencion es un anticuerpo anti-TLR2 humano que tiene las siguientes caracteristicas.
Un anticuerpo anti-TLR2 humano que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 449 de la SEQ ID NO: 8 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6.
Los expertos en la materia pueden preparar facilmente el anticuerpo anti-TLR2 humano o el fragmento de union a antigeno del mismo de la presente invencion utilizando un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica cada una de la region variable de cadena pesada y la region variable de cadena ligera del anticuerpo anti-TLR2 humano incluido en el anticuerpo biespecifico de la presente invencion descrito anteriormente, y con referencia a la description de <Vector de expresion de la presente invencion>, <Celula hospedadora transformada de la presente invencion> y <Metodo para producir anticuerpo biespecifico de la presente invencion y anticuerpo biespecifico producido por el mismo metodo> descrito anteriormente.
La presente invencion tambien incluye una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo anti-TLR2 humano o el fragmento de union a antigeno del mismo de la presente invencion y un excipiente farmaceuticamente aceptable. La composicion farmaceutica de la presente invencion se puede preparar mediante un metodo utilizado convencionalmente que utiliza excipientes, es decir, excipientes farmaceuticos o vehiculos farmaceuticos comunmente utilizados en la materia. Los ejemplos de formas de dosificacion de las composiciones farmaceuticas incluyen preparaciones parenterales tales como una inyeccion y una infusion por goteo, que pueden administrarse mediante administration intravenosa, administration subcutanea o similares. En la preparation de productos farmaceuticos, los excipientes, vehiculos y aditivos de acuerdo con las formas de dosificacion se pueden utilizar dentro del intervalo farmaceuticamente aceptable.
La composicion farmaceutica de la presente invencion puede incluir varios tipos de anticuerpos anti-TLR2 humano o los fragmentos de union a antigeno de los mismos de la presente invencion. Por ejemplo, la presente invencion tambien incluye una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo o un fragmento de union a antigeno del mismo no sometido a modification postraduccional y un anticuerpo o un fragmento de union a antigeno del mismo que procede de una modificacion postraduccional del anticuerpo o del fragmento de union a antigeno del mismo.
En una realization, la composicion farmaceutica de la presente invencion que comprende un anticuerpo anti-TLR2 humano o un fragmento de union a antigeno del mismo tambien incluye una composicion farmaceutica descrita a continuacion.
Una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo anti-TLR2 humano o un fragmento de union a antigeno del mismo que comprende una region variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 120 de la SEQ ID NO: 8 y una region variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 113 de la SEQ ID NO: 6, y un anticuerpo anti-TLR2 humano o un fragmento de union a antigeno del mismo que es un anticuerpo o un fragmento de union a antigeno del mismo que procede de una modificacion postraduccional del anticuerpo o del fragmento de union a antigeno del mismo.
En una realizacion, la composicion farmaceutica de la presente invencion que comprende un anticuerpo anti-TLR2 humano tambien incluye una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo que se une al TLR2 humano de los siguientes (1) a (4).
(1) un anticuerpo anti-TLR2 humano que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 449 de la SEQ ID NO: 8 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO: 6.
(2) un anticuerpo anti-TLR2 humano que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO: 8 y que tiene una modificacion de acido glutamico del numero de aminoacido 1 a acido piroglutamico, y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO: 6.
(3) un anticuerpo anti-TLR2 humano que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 449 de la SEQ ID NO: 8 y que tiene una modificacion de acido glutamico del numero de aminoacido 1 a acido piroglutamico y, una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO: 6.
(4) un anticuerpo anti-TLR2 humano que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO: 8 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO: 6.
En otra realizacion mas, la composicion farmaceutica de la presente invencion que comprende un anticuerpo anti-TLR2 humano tambien incluye la siguiente composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo que se une al TLR2.
Una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo anti-TLR2 humano que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 450 de la SEQ ID NO: 8 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6, un anticuerpo anti-TLR2 humano que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 449 de la SEQ ID NO: 8 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6, y un excipiente farmaceuticamente aceptable.
La cantidad de adicion del anticuerpo anti-TLR2 humano o el fragmento de union a antigeno del mismo de la presente invencion en una formulation varia dependiendo de la gravedad y la edad de los pacientes, una forma de dosificacion de la formulacion de farmaco a utilizar, el titulo de union del anticuerpo y similares. Por ejemplo, el anticuerpo anti-TLR2 humano o el fragmento de union a antigeno del mismo se puede utilizar en una cantidad de aproximadamente 0,001 mg/kg a 100 mg/kg.
El anticuerpo anti-TLR2 humano o el fragmento de union a antigeno del mismo de la presente invencion se purifica adicionalmente si es necesario y se formula de acuerdo con un metodo convencional, y luego se puede utilizar en el tratamiento de una enfermedad en la que el TLR2 humano esta involucrado en la patogenesis de la misma, tal como sepsis o cancer.
<Anticuerpo de fusion y anticuerpo modificado>
Los expertos en la materia pueden preparar un anticuerpo de fusion de un anticuerpo biespecifico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano, un anticuerpo anti-TLR2 humano o un fragmento de union a antigeno del mismo con otro peptido o proteina y tambien pueden preparar un anticuerpo modificado que tenga un agente de modificacion unido al mismo, utilizando metodos conocidos en la materia. El anticuerpo biespecifico que se une al
TLR2 humano y al TLR4 humano, el anticuerpo anti-TLR2 humano o el fragmento de union a antlgeno del mismo de la presente invencion tambien incluyen un anticuerpo y un fragmento de union a antlgeno del mismo en forma de dicha fusion o modificacion. El otro peptido o protelna que puede utilizarse para la fusion no esta particularmente limitado, siempre que el anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano de la presente invencion como el anticuerpo de fusion tenga una actividad de union al TLR2 humano y al TLR4 humano o el anticuerpo anti-TLR2 humano o el fragmento de union a antlgeno del mismo de la presente invencion como el anticuerpo de fusion tenga una actividad de union al TLR2 humano; ejemplos de los mismos incluyen albumina de suero humano, varios peptidos marcadores, peptidos con motivos de helices artificiales, protelnas de union a maltosa, glutation S transferasa, varias toxinas, otros peptidos o protelnas capaces de promover la multimerizacion, y similares. El agente de modificacion que puede utilizarse para la modificacion no esta particularmente limitado, siempre que el anticuerpo biespeclfico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano de la presente invencion como el anticuerpo de fusion tenga una actividad de union al TLR2 humano y al TLR4 humano o el anticuerpo anti-TLR2 humano o el fragmento de union a antlgeno del mismo de la presente invencion como el anticuerpo de modificacion tenga una actividad de union al TLR2 humano; ejemplos de los mismos incluyen polietilenglicol, cadenas de azucar, fosfollpidos, liposomas, compuesto de bajo peso molecular y similares.
La presente invencion se ha descrito y se proporcionaran ejemplos especlficos a los que se hace referencia para una mejor comprension, pero estos son simplemente ejemplos y la presente invencion no se limita a ellos.
Ejemplos
Con respecto a las partes que utilizan kits o reactivos disponibles en el mercado, los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con el protocolo adjunto, a menos que se indique lo contrario. Por razones de conveniencia, se expresa la concentration mol/l como M. Por ejemplo, una solution acuosa de hidroxido de sodio 1 M se refiere a una solution acuosa de hidroxido de sodio de 1 mol/l.
(Ejemplo 1: Preparacion de hibridoma productor de anticuerpo anti-TLR2 humano)
Se preparo un anticuerpo anti-TLR2 humano utilizando ratones con tecnologla de desarrollo de anticuerpos monoclonales humanos "VelocImmune" (VelocImmune antibody technology: Regeneron, Inc. (Patente de EE.UU. N.° 6596541)). Se inmunizo una protelna TLR2 humana (R&D Systems, 2616-TR-050) en ratones VelocImmune, junto con un adyuvante que provoca una reaction inmunitaria. De acuerdo con un metodo convencional, se extrajo el bazo o el ganglio linfatico de los ratones inmunizados y se recogieron los linfocitos y se fusionaron con celulas de celulas de mieloma de raton SP2/0 (ATCC: CRL-1581) para preparar un hibridoma. El hibridoma se sometio a monoclonizacion y se cultivo en un medio de hibridoma CD (Life Technologies) que es un medio sin suero. El anticuerpo se purifico del sobrenadante de cultivo resultante utilizando una columna de protelna G (GE Healthcare Japan). Dado que la tecnologla VelocImmune emplea ratones transgenicos en los que las regiones variables de cadena pesada y ligera de la inmunoglobulina endogena se reemplazan con las regiones variables humanas correspondientes, el anticuerpo obtenido es un anticuerpo que tiene regiones variables del anticuerpo humano y regiones constantes del anticuerpo de raton (tambien referido como anticuerpo quimerico).
(Ejemplo 2: Evaluacion de la actividad neutralizante del anticuerpo anti-TLR2 humano)
Con el fin de evaluar una actividad neutralizante del anticuerpo anti-TLR2 humano identificado en el Ejemplo 1, se llevo a cabo un ensayo para la inhibition de la production de fosfatasa alcalina (FA) inducida por Pam2CSK4 agonista de TLR2/6 utilizando una celula THP1-xBlue que es una celula monocltica humana que expresa endogenamente TLR2 humano.
Como resultado, se demostro que el anticuerpo anti-TLR2 humano (anticuerpo quimerico) designado 31-5F5-2F3 inhibe la produccion de FA y tiene una actividad neutralizante contra el TLR2 humano.
(Ejemplo 3: Secuenciacion del anticuerpo anti-TLR2 humano y preparacion de la variante)
La secuencia de los genes que codifican la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo se analizo y se secuencio a partir de un hibridoma que produce el anticuerpo anti-TLR2 humano 31-5F5-2F3.
Con el fin de mejorar las propiedades flsicas y la estabilidad del anticuerpo despues de la secuenciacion del anticuerpo, las fR de la cadena pesada y la cadena ligera del 31-5F5-2F3 se reemplazaron con las FR de un anticuerpo humano diferente para preparar un anticuerpo anti-TLR2 humano 31-5F5-2F3.m1
(Ejemplo 4: Preparacion del anticuerpo anti-TLR2 humano completamente humano)
El anticuerpo preparado en el Ejemplo 3 es un anticuerpo en el que la region variable procede de seres humanos y la region constante procede de raton. Por consiguiente, utilizando un vector GS (Lonza, Inc.) que es un vector de expresion de celulas de mamlferos, se construyo un vector de expresion que comprende ambos genes de la cadena pesada y la cadena ligera para producir as! un anticuerpo completamente humano. Especlficamente, un gen que
codifica una secuencia senal (Nigel Whittle et al., Protein Engineering, 1987, Vol. 1, n.° 6, pags. 499-505) se conecto al lado 5' del gen de la region variable de cadena pesada del anticuerpo 31-5F5-2F3.m1 y un gen de region constante de IgY1 humana (que consiste en la secuencia de bases de los numeros de base 361 a 1350 de la SEQ ID NO: 7) se conecto al lado 3' del mismo, y luego este gen de la cadena pesada se inserto en un vector GS pEE6.4. Ademas, se conecto un gen que codifica una secuencia senal (Nigel Whittle, et al., supra) al lado 5' del gen de la region variable de cadena ligera y un gen de la region constante de la cadena k humana (que consiste en la secuencia de bases de los numeros de aminoacidos 340 a 657 de la SEQ ID NO: 5) se conecto al lado 3' del mismo, y luego este gen de la cadena ligera se inserto en un vector GS pEE12.4.
La secuencia del gen de la cadena pesada de un anticuerpo insertado en pEE6.4 y la secuencia del gen de la cadena ligera de un anticuerpo insertado en pEE12.4 se analizaron utilizando un secuenciador y, a partir de la secuencia de aminoacidos resultante, se determinaron las secuencias de CDR con referencia a la base de datos de Kabat et al ("Sequences of Proteins of Immunological Interest", Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, Oficina de Impresion del Gobierno de los Estados Unidos).
La secuencia de bases de la cadena pesada del anticuerpo completamente humano (31-5F5-2F3.m1 completamente humano) del 31-5F5-2F3.m1 preparado se expone en la SEQ ID NO: 7, la secuencia de aminoacidos codificada por la secuencia de bases se expone en la SEQ ID NO: 8, la secuencia de bases de la cadena ligera del anticuerpo se expone en la SEQ ID NO: 5, y la secuencia de aminoacidos codificada por la secuencia de bases se expone en la SEQ ID NO: 6.
La region variable de cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO: 8 consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 120 de la SEQ ID NO: 8, y la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la cadena pesada consisten cada una en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 31 a 35, 50 a 66 y 99 a 109 de la SEQ ID NO: 8. La region variable de la cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 6 consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 113 de la SEQ ID NO: 6, y la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la cadena ligera consisten cada una en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 24 a 39, 55 a 61 y 94 a 102 de la SEQ ID NO: 6.
Utilizando los vectores GS descritos anteriormente en los que se insertaron respectivamente los genes de la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo, se llevo a cabo la expresion del anticuerpo de dos maneras de expresion transitoria y expresion constitutiva. Para la expresion transitoria, ambos vectores de expresion de la cadena pesada y la cadena ligera descritos anteriormente se transfectaron en celulas FreeStyle 293 (Life Technologies) cultivadas a aproximadamente 1x106 celulas/ml en un medio de expresion FreeStyle 293 (Life Technologies) utilizando un reactivo de transfeccion 293fectin (Life Technologies), y cultivadas durante 7 dlas. Como alternativa, ambos vectores de expresion de la cadena pesada y la cadena ligera descritos anteriormente se transfectaron en celulas Expi293 (Life Technologies) cultivadas a aproximadamente 3x106 celulas/ml en un medio de expresion Expi293 (Life Technologies) utilizando un reactivo de transfeccion ExpiFectamine293 (Life Technologies), y cultivadas durante 7 dlas. Como alternativa, ambos vectores de expresion de la cadena pesada y la cadena ligera descritos anteriormente se transfectaron en celulas CHO-K1 SV (Lonza, Inc.) cultivadas a aproximadamente 1x107 celulas/ml en un medio CD-CHO (Life Technologies) utilizando un metodo de electroporacion y cultivadas durante 7 dlas. El sobrenadante de cultivo se purifico utilizando columnas de protelna A o protelna G (ambas estan disponibles en GE Healthcare Japan) para dar un anticuerpo purificado del anticuerpo completamente humano. Para la expresion constitutiva, los vectores GS descritos anteriormente, en los que los genes de la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo se insertaron respectivamente, se dividieron con las enzimas de restriccion NotI y PvuI y se ligaron entre si utilizando el kit de conveniencia-ligadura (NIPPONGENE) que es un kit de ligadura o alta ligadura (TOYOBO) que es un reactivo de ligadura, construyendo as! vectores GS en los que se insertaron ambos genes de la cadena pesada y la cadena ligera. Los vectores de expresion codifican una cadena pesada y una cadena ligera de longitud completa y una glutamina sintetasa, y los anticuerpos se expresaron mediante transfeccion de los mismos en celulas CHO-K1SV. El sobrenadante de cultivo se purifico utilizando una columna de protelna A o una columna de protelna G para obtener un anticuerpo purificado del anticuerpo completamente humano.
(Ejemplo 5: Evaluacion de la actividad de union del anticuerpo anti-TLR2 humano completamente humano)
Para evaluar una actividad de union del 31-5F5-2F3.m1 completamente humano preparado en el Ejemplo 4 para TLR2 humano, se llevo a cabo un analisis de SPR.
En el analisis de SPR, se utilizo Biacore T200 (GE Healthcare Japan) para llevar a cabo el analisis. Se inmovilizo una IgG anti-His (incluida en el kit His Capture) en un chip sensor CM5 (GE Healthcare Japan, BR-1005-30) utilizando un kit His Capture (GE Healthcare Japan, 28-9950-56) y un kit de acoplamiento de amina (GE Healthcare Japan, BR-1000-50). La ruta de flujo N.° 1 se conoce como referencia, a la que no se unio la protelna TLR2 humana. En cada una de las otras rutas de flujo (N.° 2, N.° 3 y N.° 4), una protelna TLR2 humana (R&D Systems, 2616-TR-050) diluida a 0,66 pg/ml en tampon HBS-EP+ (GE Healthcare Japan, BR-1006-69) se anadio a una velocidad de flujo de 5 pl/minuto durante 2 minutos y luego se inmovilizo. Posteriormente, se anadio una solucion de 31-5F5-2F3.ml completamente humano diluido a 200 nM en tampon HBS-EP+ a una velocidad de flujo de 50 pl/minuto durante 2 minutos, y se midio la union del anticuerpo completamente humano-TLR2 humano. A continuacion, se
anadio tampon HBS-EP+ a una velocidad de flujo de 50 pl/minuto durante 5 minutos y se midio la disociacion del anticuerpo completamente humano y el TLR2 humano. El modelo de analito bivalente y el Rmax se analizaron mediante ajuste local para calcular la constante de velocidad de asociacion (ka) y la constante de velocidad de disociacion (kd), y se calculo la constante de asociacion-disociacion (KD) mediante la division de kd por ka.
Como resultado, se demostro que KD es 88,5 pM, y el 31-5F5-2F3.ml completamente humano tiene una actividad de union al TLR2 humano.
(Ejemplo 6: Evaluacion de la actividad neutralizante del anticuerpo anti-TLR2 humano completamente humano)
Con el fin de evaluar una actividad neutralizante del 31-5F5-2F3.m1 completamente humano preparado en el Ejemplo 4 contra el TLR2 humano, se realizo un ensayo para la inhibicion de la produccion de FA inducida por Pam2cSK4 utilizando celulas THP1-xBlue. Se sembraron celulas THP1-xBlue (Invivogen Inc., thpx-sp) en un medio RPMI1640 (Life Technologies) en 5x104celulas/pocillo en una placa de 96 pocillos (Becton, Dickinson and Company) a 75 pl/pocillo. Inmediatamente despues de la siembra celular, se anadieron 25 pl de 31-5F5-2F3.m1 completamente humano diluido en 9 pasos en un intervalo de 855 nM a 2,19 pM con un medio RPMI1640 y se incubaron durante 30 minutos en condiciones de 37 °C y CO2 al 5 %. Ademas, se anadieron 25 pl de Pam2CSK4 (Invivogen, tlrl-pm2s; una concentracion final de 100 ng/ml) diluido con un medio RPMI1640. Como control, se prepararon respectivamente un pocillo al que se habla anadido un medio RPMI1640 en lugar de un anticuerpo, y un pocillo al que se habla anadido un medio RPMI1640 en lugar de Pam2CSK4. Despues de cultivar durante la noche en condiciones de 37 °C y CO2 al 5 %, se recogio el sobrenadante de cultivo y se midio la concentracion de FA en el sobrenadante de cultivo utilizando un Quanti-Blue disponible comercialmente (Invivogen). Ademas, se calculo un valor de IC50 del anticuerpo contra la produccion de FA inducida por Pam2CSK4. En relacion con el calculo de un valor de IC50, el pocillo al que se habla anadido un medio RPMI1640 en lugar de un anticuerpo se expuso como control de inhibicion al 0 %, y el pocillo al que se habla anadido un medio RPMI1640 en lugar de Pam2CSK4 se expuso como control de inhibicion al 100 %. El valor de IC50 se calculo mediante el ajuste de curva loglstica de cuatro parametros.
Como resultado, el 31-5F5-2F3.ml completamente humano inhibio la produccion de FA y tuvo un valor de IC50 de 97,7 pM. Se encontro que el 31-5F5-2F3.m1 completamente humano tiene una actividad neutralizante contra el TLR2 humano.
(Ejemplo 7: Evaluacion de la actividad neutralizante del anticuerpo anti-TLR2 humano completamente humano (2))
Con el fin de evaluar una actividad neutralizante del 31-5F5-2F3.m1 completamente humano preparado en el Ejemplo 4 contra el TLR2 humano, se llevo a cabo un ensayo para la inhibicion de la produccion de fA inducida por Pam2CSK4 utilizando celulas THPI-xBlue. Se utilizaron T2.5 (Documento de patente 1) y OPN305 (Documento de patente 3), que son un anticuerpo anti-TLR2 humano, como anticuerpos comparativos.
Se llevo a cabo el mismo experimento que en el Ejemplo 6 para tres tipos de anticuerpos, 31-5F5-2F3.m1 completamente humano (dilucion en 9 pasos en un intervalo de 855 nM a 2,19 pM en un medio RPMI1640), T2.5 (dilucion en 9 pasos en un intervalo de 833 nM a 2,13 pM en un medio RPMI1640), y OPN305 (dilucion en 9 pasos en un intervalo de 861 nM a 2,20 pM en un medio RPMI1640). Los valores de IC50 se calcularon mediante el ajuste de curva loglstica de cuatro parametros.
Como resultado, el 31-5F5-2F3.ml completamente humano inhibio completamente la produccion de FA inducida por Pam2CSK4 y tuvo un valor de IC50 de 130 pM. Por otro lado, la inhibicion de la produccion de FA inducida por Pam2CSK4 de T2.5 y OPN305 fue parcial (Fig. 2).
(Ejemplo 8: Preparacion del anticuerpo biespecffico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano)
Se prepararon dos anticuerpos biespeclficos anti-TLR2 humano y anti-TLR4 humano que comprenden un anticuerpo anti-TLR2 humano (anticuerpo IgG) y un fragmento de region variable de cadena unica del anticuerpo anti-TLR4 humano (scFv). El anticuerpo biespeclfico preparado en este Ejemplo es un anticuerpo biespeclfico del tipo IgG(TLR2)-scFv(TLR4) mencionado anteriormente, y tiene una estructura en la que el extremo N del anticuerpo scFv anti-TLR4 humano esta conectado a traves de un conector al extremo C de cada cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano (Figura 1).
Se preparo el gen que codifica una fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano-anticuerpo scFv anti-TLR4 humano en el que el gen que codifica un conector GS (SEQ ID NO: 9) se conecto al extremo 3' del gen de la cadena pesada del 31-5F5-2F3.miI completamente humano preparado en el Ejemplo 4 utilizando un metodo de PCR, el gen que codifica un anticuerpo scFv anti-TLR4 humano se conecto al extremo 3' del gen que codifica un conector GS utilizando un metodo de PCR y el extremo C de la cadena pesada del 31-5F5-2F3 completamente humano y el extremo N de un anticuerpo scFv anti-TLR4 humano se conectaron mediante el conector GS. El
anticuerpo scFv anti-TLR4 humano incluido en la fusion codificada por este gen tiene una estructura en la que se conecto el extremo N de la region variable de cadena ligera, que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 625 a 732 de la SEQ ID NO: 4, a traves de un conector GS (SEQ ID NO: 10) al extremo C de la region variable de cadena pesada, que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 732 de la SEQ ID NO: 4 y que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 609 de la SEQ ID NO: 4. La fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humanoanticuerpo scFv anti-TLR4 humano as! preparada se denomina como cadena pesada ICU-1-IgY1. El gen que codifica una secuencia senal (Nigel Whittle et al., supra) se conecto al lado 5' del gen de la cadena pesada ICU-1-IgY1, que luego se inserto en un vector pEE6.4.
Ademas, el gen de una cadena pesada ICU-1-IgY1 modificada con la introduction de mutaciones de aminoacidos de L234A, L235A e I253A en la region constante de cadena pesada de Igyl humana de la cadena pesada ICU-1-IgY1 (denominada cadena pesada ICU-1-IgY1-LAsh) se preparo y el gen se inserto en un vector pEE6.4.
Se prepararon dos tipos de anticuerpos biespeclficos que se unen al TLR2 humano y al TLR4 humano mediante la combination del vector pEE6.4 con la insertion del gen de la cadena pesada ICU-1-IgY1 o el gen de la cadena pesada ICU-1-IgY1-LAsh y pEE12.4 con insercion del gen de la cadena ligera del 31-5F5-2F3.m1 completamente humano preparado en el Ejemplo 4, y mediante la utilization del mismo metodo que el metodo de expresion y purification de los anticuerpos descritos en el Ejemplo 4.
El anticuerpo biespeclfico que comprende la cadena pesada ICU-1-IgY1 y la cadena ligera del 31-5F5-2F3.m1 completamente humano se denomina ICU-1-IgY1 completamente humano, y el anticuerpo biespeclfico que comprende la cadena pesada ICU-1-IgY1-LAsh y la cadena ligera del 31-5F5-2F3.m1 completamente humano se denomina ICU-1-IgY1-LAsh completamente humano.
La secuencia de bases de la cadena pesada ICU-1-IgY1 del ICU-1-IgY1 completamente humano se expone en la SEQ ID NO: 1, y la secuencia de aminoacidos codificada por la secuencia de bases se expone en la SEQ ID NO: 2. La secuencia de bases de la cadena pesada ICU-1-IgY1-LAsh del ICU-1-IgY1-LAsh completamente humano se expone en la SEQ ID NO: 3, y la secuencia de aminoacidos codificada por la secuencia de bases se expone en la SEQ ID NO: 4.
La cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano incluida en la fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano-anticuerpo scFv anti-TLR4 humano expuesta en la SEQ ID NO: 2 consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 450 de la SEQ ID NO: 2.
La cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano incluida en la fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano-anticuerpo scFv anti-TLR4 humano expuesta en la SEQ ID NO: 4 consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 450 de la SEQ ID NO: 4.
La region variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano incluida en las dos fusiones anteriores de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano-anticuerpo scFv anti-TLR4 humano expuestas en la SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4 es comun entre ellas y consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 120 de la SEQ ID NO: 4, y la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la region variable de cadena pesada consisten cada una en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 31 a 35, 50 a 66, y 99 a 109 de la SEQ ID NO: 4. El anticuerpo scFv anti-TLR4 humano incluido en las dos fusiones anteriores de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano-anticuerpo scFv anti-TLR4 humano expuesto en la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 4 es comun entre ellas y consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 732 de la SEQ ID NO: 4, y la region variable de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR4 humano que constituye el anticuerpo scFv anti-TLR4 humano consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 609 de la SEQ ID NO: 4, y la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la region variable de cadena pesada consisten cada una en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 521 a 525, 540 a 556, y 589 a 598 de la SEQ ID NO: 4. La region variable de cadena ligera del anticuerpo anti-TLR4 humano que constituye el anticuerpo scFv anti-TLR4 humano consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 625 a 732 de la SEQ ID NO: 4, y la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la region variable de cadena ligera consisten cada una en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 648 a 658, 674 a 680, y 713 a 721 de la SEQ ID NO: 4.
La secuencia de bases de la cadena ligera del ICU-1-IgY1 completamente humano y del ICU-1-IgY1-LAsh completamente humano es comun entre ellas y, la secuencia de bases se expone en la SEQ ID NO: 5, y la secuencia de aminoacidos codificada por la secuencia de bases se expone en la SEQ ID NO: 6. La region variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-TLR2 humano expuesta en la SEQ ID NO: 6 consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 113 de la SEQ ID NO: 6, y la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la region variable de cadena ligera consisten cada una en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 24 a 39, 55 a 61, y 94 a 102 de la SEQ ID NO: 6.
(Ejemplo 9: Evaluacion de la actividad de union del anticuerpo biespecffico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano)
Con el fin de evaluar la actividad de union de cada uno de los dos anticuerpos biespeclficos preparados en el Ejemplo 8 para el TLR2 humano y el TLR4 humano, se llevo a cabo un ELISA utilizando una protelna TLR2 humana y una protelna TLR4/MD2 humana. Se anadieron 15 pl/pocillo de una protelna TLR2 humana (R&D Systems, 2616-TR-050) diluida a una concentracion de 10 pg/ml en PBS (Life Technologies, 10010-023) a una placa MaxiSorp de 384 pocillos transparente (Thermo Fisher Scientific Inc.), seguido de inmovilizacion a temperatura ambiente durante 1 hora. De forma similar, se anadieron 15 pl/pocillo de una protelna TLR4/MD2 humana (R&D Systems, 3146-TM / CF) a 10 pg/ml, seguido de inmovilizacion a temperatura ambiente durante 1 hora. Despues de 1 hora, los pocillos se lavaron tres veces con una solucion de lavado (solucion salina tamponada con Tris (TB) que contenla Tween-20 al 0,05 %) y se anadio 100 pl/pocillo de Blocking One (NACALAI TESQUE, INC., 03953-95), seguido de bloqueo a temperatura ambiente durante 1 hora. Los pocillos se lavaron de nuevo tres veces con una solucion de lavado, se anadieron 15 pl/pocillo de dos anticuerpos biespeclficos preparados en el Ejemplo 8 al pocillo en el que se inmovilizo la protelna t Lr2 humana y al pocillo en el que se inmovilizo la protelna TLR4/MD2 humana. La dilucion de estos anticuerpos se llevo a cabo utilizando un tampon de reaccion donde se mezclaron PBS y Blocking One en cantidades iguales. Los anticuerpos se diluyeron en 13 pasos en un intervalo de 75,0 nM a 4,47 fM. Despues de dejar reposar a temperatura ambiente durante 1 hora, los pocillos se lavaron tres veces con una solucion de lavado. Se anadieron 15 pl/pocillo de anticuerpo de adsorcion cruzada de cadena ligera y pesada de IgG humana (BETHYL, A80-219P) diluido 4000 veces en tampon de reaccion, y luego se dejo reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Los pocillos se lavaron tres veces con una solucion de lavado y se anadieron 15 pl/pocillo de ELISA DE SUSTRAt O DE PEROXIDASA TMB (MOSS, #TMBE-500). Despues de 15 minutos, se detuvo la reaccion mediante la adicion de 15 pl/pocillo de acido sulfurico 1 M (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 198-09595) a los pocillos en los que se inmovilizo la protelna TLR2 humana. Despues de 5 minutos, se detuvo la reaccion mediante la adicion de 15 pl/pocillo de acido sulfurico 1 M a los pocillos en los que se inmovilizo la protelna TLR4/MD2 humana. Se midio una absorbancia a 450 nm mediante la utilizacion de Safire2 (TECAN), y se calculo un valor de EC50 de cada anticuerpo para la protelna TLR2 humana y la protelna TLR4/MD2 humana. En relacion con el calculo de un valor de EC50, a partir de la forma de la curva sigmoidal en el grafico que representa el valor de medicion en un eje vertical y el valor de concentracion de anticuerpo en un eje horizontal, el valor maximo de los valores de medicion de cada anticuerpo puede determinar que el valor de medicion de acuerdo con un aumento en la concentracion de anticuerpos ha alcanzado un valor de convergencia establecido en 100 %, y el valor mlnimo de los valores de medicion de cada anticuerpo puede determinar que el valor de medicion de acuerdo con una disminucion en la concentracion de anticuerpos ha alcanzado un valor de convergencia que establecido en 0 %. Los valores de EC50 calculados por el ajuste de curva loglstica de cuatro parametros se muestran a continuacion (Tablas 1 y 2).
Tabla 1: Actividad de union a la protelna TLR2 humana
Tabla 2: Actividad de union contra la protelna TLR4/MD2 humana
T l 21
Como resultado, se demostro que el ICU-1-IgY1 completamente humano y el ICU-1-IgY1-LAsh completamente humano se unen tanto a la protelna TLR2 humana como a la protelna TLR4/MD2 humana.
(Ejemplo 10: Ensayo de la inhibicion de la produccion de TNFa inducida por Pseudomonas aeruginosa inactivada del anticuerpo biespecffico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano en celulas mononucleares de sangre periferica humana normal)
Con el fin de evaluar una actividad neutralizante del anticuerpo biespecffico preparado en el Ejemplo 8, se llevo a cabo un ensayo de inhibicion de la produccion de TNFa inducida por Pseudomonas aeruginosa inactivada utilizando celulas mononucleares de sangre periferica humana que expresan endogenamente TLR2 humano y TLR4/MD2 humano. Pseudomonas aeruginosa es una de las bacterias causales de la sepsis y se sabe que estimula el TLR2 y
el TLR4 en celulas mononucleares de sangre periferica humana para producir TNFa (Scand. J. Immunol., 2008, Vol.
67, n.° 2, pags. 193-203).
Se sembraron 30 pl/pocillo de celulas mononucleares de sangre periferica humana normal (Lonza, Inc., CC-2702) a 1,875x104 celulas/pocillo en una placa de 384 pocillos (Nunc Inc.), utilizando un medio RPMI1640 (Life Technologies) que contenla suero humano (Lonza, Inc., 14-490E) preparado adecuadamente a una concentracion final del 10 al 30 %. De forma inmediatamente posterior, 10 pl del anticuerpo purificado ICU-1-IgY1 completamente humano diluido en 12 pasos en un intervalo de 375 nM a 7,680 fM con un medio RPMI1640 o ICU-1-IgY1-LAsh completamente humano diluido en 13 pasos en un intervalo de 500 nM a 10,24 fM con un medio RPMM640 se anadio e incubo en condiciones de 37 °C y CO2 al 5 % durante 30 minutos. Ademas, se diluyo la PAO-I de Pseudomonas aeruginosa termoinactivada de aislados cllnicos con un medio RPMI1640 y se anadieron 10 pl del mismo a una concentracion final de 1x106 UFC (unidad formadora de colonias)/ml. Como control, se prepararon respectivamente un pocillo al que se habla anadido un medio RPMI1640 en lugar de un anticuerpo, y un pocillo al que se habla anadido un medio RPMI1640 en lugar de Pseudomonas aeruginosa inactivada. Despues de cultivar durante la noche en condiciones de 37 °C y CO2 al 5 %, se recogio el sobrenadante de cultivo y se midio la concentracion de TNF-a en el sobrenadante de cultivo utilizando un kit AlphaLISA TNFa disponible comercialmente (PerkinElmer Co., Ltd., AL208C). Ademas, se calcularon los valores de IC50 de cada anticuerpo para la produccion de TNFa inducida por Pseudomonas aeruginosa inactivada. En relacion con el calculo de un valor de IC50, el pocillo al que se habla anadido un medio RPMI1640 en lugar de un anticuerpo se expuso como control de inhibicion al 0 %, y el pocillo al que se habla anadido un medio RPMI1640 en lugar de Pseudomonas aeruginosa inactivada se expuso como control de inhibicion al 100 %. Los valores de IC50 calculados por el ajuste de curva loglstica de cuatro parametros se muestran a continuacion (Tabla 3).
Tabla 3: Actividad inhibidora contra la produccion de TNFa inducida por Pseudomonas aeruginosa inactivada en celulas mononucleares de sangre periferica humana normal
Como resultado, se demostro que el ICU-1-IgY1 completamente humano y el ICU-1-IgY1-LAsh completamente humano inhiben la produccion de TNFa y tienen una actividad neutralizante contra el t LR2 humano y el TLR4 humano.
(Ejemplo 11: Ensayo de inhibicion de la produccion de TNFa inducida por Escherichia coli inactivada en celulas mononucleares de sangre periferica humana normal)
Se sembraron 30 pl/pocillo de celulas mononucleares de sangre periferica humana normal (Lonza, Inc., CC-2702) a 1x104 celulas/pocillo en una placa de 384 pocillos (Nunc Inc.), utilizando un medio RPMI1640 (Life Technologies) que contenla suero humano (Lonza, Inc., 14-490E) preparado adecuadamente a una concentracion final del 10 %. De forma inmediatamente posterior, se anadieron 10 pl de ICU-1-IgY1 completamente humano purificado o ICU-1-IgY1-LAsh completamente humano diluido en 12 pasos en un intervalo de 2,500 pM a 20,00 fM con un medio RPMI1640. Como anticuerpo comparativo, se anadio 10 pl de una solucion mixta de un anticuerpo 1E11.C2E3 anti-TLR4 humano purificado (Documento de patente 6) y un anticuerpo OPN305 anti-TLR2 humano (Documento de patente 3) diluidos en 13 pasos en un intervalo de 7,758 pM a 52,96 fM con un medio RPMI1640. A esto le siguio una incubacion en condiciones de 37 °C y CO2 al 5 % durante 30 minutos. Ademas, se diluyo Escherichia coli (21006) termoinactivada de aislados cllnicos con un medio RPMI1640 y se anadieron 10 pl del mismo a una concentracion final de 1x106 UFC/ml. Como control, se prepararon respectivamente un pocillo al que se habla anadido un medio RPMI1640 en lugar de un anticuerpo, y un pocillo al que se habla anadido un medio RPMI1640 en lugar de Escherichia coli inactivada. Despues de cultivar durante la noche en condiciones de 37 °C y CO2 al 5 %, se recogio el sobrenadante de cultivo y se midio la concentracion de TNF-a en el sobrenadante de cultivo utilizando un kit AlphaLISA TNFa disponible comercialmente (PerkinElmer Co., Ltd., AL208C). Ademas, se calcularon los valores de IC50 de cada anticuerpo para la produccion de TNFa inducida por Escherichia coli inactivada. En relacion con el calculo de un valor de IC50, el pocillo al que se habla anadido un medio RPMI1640 en lugar de un anticuerpo se expuso como control de inhibicion al 0 %, y el pocillo al que se habla anadido un medio RPMI1640 en lugar de Escherichia coli inactivada se expuso como control de inhibicion al 100 %. Los valores de IC50 calculados por el ajuste de curva loglstica de cuatro parametros se muestran a continuacion (Tabla 4 y Fig. 3).
Tabla 4: Actividad inhibidora contra la produccion de TNFa inducida por Escherichia coli inactivada en celulas mononucleares de sangre periferica humana normal
Claims (14)
1. Un anticuerpo biespecifico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano, que comprende:
1) una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano que comprende la CDR1 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 31 a 35 de la SEQ ID NO: 4, la CDR2 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 50 a 66 de la SEQ ID NO: 4 y la CDR3 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 99 a 109 de la SEQ ID NO: 4, y una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que comprende la CDR1 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 24 a 39 de la SEQ ID NO: 6, la CDR2 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 55 a 61 de la SEQ ID NO: 6 y la CDR3 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 94 a 102 de la SEQ ID NO: 6; y
2) una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR4 humano que comprende la CDR1 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 521 a 525 de la SEQ ID NO: 4, la CDR2 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 540 a 556 de la SEQ ID NO: 4 y la CDR3 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 589 a 598 de la SEQ ID NO: 4, y una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR4 humano que comprende la CDR1 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 648 a 658 de la SEQ ID NO: 4, la CDR2 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 674 a 680 de la SEQ ID NO: 4 y la CDR3 que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 713 a 721 de la SEQ ID NO: 4.
2. El anticuerpo biespecifico de acuerdo con la reivindicacion 1, que se selecciona de los siguientes (1) o (2):
(1) un anticuerpo biespecifico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano, que comprende
1) una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 120 de la SEQ ID NO: 4, y una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 113 de la SEQ ID NO: 6, y
2) una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 609 de la SEQ ID NO: 4, y una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 625 a 732 de la SEQ ID NO: 4; o
(2) un anticuerpo biespecifico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano, que es un anticuerpo biespecifico que procede de una modificacion postraduccional del anticuerpo biespecifico de (1).
3. El anticuerpo biespecifico de acuerdo con la reivindicacion 2, que se selecciona de los siguientes (1) o (2):
(1) un anticuerpo biespecifico que comprende un anticuerpo anti-TLR2 humano y un fragmento de anticuerpo anti-TLR4 humano, en donde
el anticuerpo anti-TLR2 humano es un anticuerpo IgG y comprende una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 120 de la SEQ ID NO: 4, y una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 113 de la SEQ ID NO: 6, y
el fragmento de anticuerpo anti-TLR4 humano es un fragmento de region variable de cadena unica (scFv) y comprende una region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 609 de la SEQ ID NO: 4, y una region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 625 a 732 de la SEQ ID NO: 4; o
(2) un anticuerpo biespecifico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano, que es un anticuerpo biespecifico que procede de una modificacion postraduccional del anticuerpo biespecifico de (1).
4. El anticuerpo biespecifico de acuerdo con la reivindicacion 3, que se selecciona de los siguientes (1) o (2):
(1) un anticuerpo biespecifico que comprende una fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humanoanticuerpo scFv anti-TLR4 humano en la que el extremo N de un fragmento de anticuerpo anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 491 a 732 de la SEQ ID NO: 4 esta conectado a traves de un conector al extremo C de la cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de los numeros de aminoacidos 1 a 450 de la SEQ ID NO: 4, y una cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la s Eq ID NO: 6; o
(2) un anticuerpo biespecifico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano, que es un anticuerpo biespecifico que procede de una modificacion postraduccional del anticuerpo biespecifico de (1).
5. El anticuerpo biespecifico de acuerdo con la reivindicacion 4, que comprende una fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano-anticuerpo scFv anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4, y una cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la s Eq ID NO: 6.
6. El anticuerpo biespecifico de acuerdo con la reivindicacion 4, que comprende una fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano-anticuerpo scFv anti-TLR4 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4 y que tiene una modificacion de acido glutamico del numero de aminoacido 1 de la SEQ ID NO: 4 a acido piroglutamico, y una cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6.
7. Un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TLR2 humano, la region variable de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR4 humano, y la region variable de cadena ligera del anticuerpo anti-TLR4 humano del anticuerpo biespecifico de acuerdo con la reivindicacion 2, y un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la region variable de cadena ligera del anticuerpo anti-TLR2 humano del anticuerpo biespecifico de acuerdo con la reivindicacion 2.
8. Un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano-anticuerpo scFv anti-TLR4 humano del anticuerpo biespecifico de acuerdo con la reivindicacion 4 y un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena ligera del anticuerpo anti-TLR2 humano del anticuerpo biespecifico de acuerdo con la reivindicacion 4.
9. Un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humano-anticuerpo scFv anti-TLR4 humano del anticuerpo biespecifico de acuerdo con la reivindicacion 5 y un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena ligera del anticuerpo anti-TLR2 humano del anticuerpo biespecifico de acuerdo con la reivindicacion 5.
10. Una celula hospedadora seleccionada del grupo que consiste en los siguientes (a) o (b):
(a) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humanoanticuerpo scFv anti-TLR4 humano del anticuerpo biespecifico de acuerdo con la reivindicacion 4, y un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano del anticuerpo biespecifico de acuerdo con la reivindicacion 4; o (b) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humanoanticuerpo scFv anti-TLR4 humano del anticuerpo biespecifico de acuerdo con la reivindicacion 4, y un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-TLR2 humano del anticuerpo biespecifico de acuerdo con la reivindicacion 4.
11. Una celula hospedadora seleccionada del grupo que consiste en los siguientes (a) o (b):
(a) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humanoanticuerpo scFv anti-TLR4 humano del anticuerpo biespecifico de acuerdo con la reivindicacion 5, y un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena ligera del anticuerpo anti-TLR2 humano del anticuerpo biespecifico de acuerdo con la reivindicacion 5; o (b) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humanoanticuerpo scFv anti-TLR4 humano del anticuerpo biespecifico de acuerdo con la reivindicacion 5, y un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica una cadena ligera del anticuerpo anti-TLR2 humano del anticuerpo biespecifico de acuerdo con la reivindicacion 5.
12. Un metodo para producir un anticuerpo biespecifico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano, que comprende cultivar una(s) celula(s) hospedadora(s) seleccionada(s) del grupo que consiste en los siguientes (a) a (c) para expresar el anticuerpo biespecifico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano:
(a) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humanoanticuerpo scFv anti-TLR4 humano del anticuerpo biespecifico de acuerdo con la reivindicacion 4, y un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena ligera del anticuerpo anti-TLR2 humano del anticuerpo biespecifico de acuerdo con la reivindicacion 4;
(b) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que
comprende una secuencia de bases que codifica la fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humanoanticuerpo scFv anti-TLR4 humano del anticuerpo biespecifico de acuerdo con la reivindicacion 4, y un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena ligera del anticuerpo anti-TLR2 humano del anticuerpo biespecifico de acuerdo con la reivindicacion 4; y
(c) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humanoanticuerpo scFv anti-TLR4 humano del anticuerpo biespecifico de acuerdo con la reivindicacion 4, y una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena ligera del anticuerpo anti-TLR2 humano del anticuerpo biespecifico de acuerdo con la reivindicacion 4.
13. Un metodo para producir un anticuerpo biespecifico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano, que comprende cultivar una(s) celula(s) hospedadora(s) seleccionada(s) del grupo que consiste en los siguientes (a) a (c) para expresar el anticuerpo biespecifico que se une al TLR2 humano y al TLR4 humano:
(a) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humanoanticuerpo scFv anti-TLR4 humano del anticuerpo biespecifico de acuerdo con la reivindicacion 5, y un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena ligera del anticuerpo anti-TLR2 humano del anticuerpo biespecifico de acuerdo con la reivindicacion 5;
(b) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humanoanticuerpo scFv anti-TLR4 humano del anticuerpo biespecifico de acuerdo con la reivindicacion 5, y un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena ligera del anticuerpo anti-TLR2 humano del anticuerpo biespecifico de acuerdo con la reivindicacion 5; y
(c) una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la fusion de cadena pesada del anticuerpo anti-TLR2 humanoanticuerpo scFv anti-TLR4 humano del anticuerpo biespecifico de acuerdo con la reivindicacion 5, y una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena ligera del anticuerpo anti-TLR2 humano del anticuerpo biespecifico de acuerdo con la reivindicacion 5.
14. Una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo biespecifico de acuerdo con la reivindicacion 5 y/o el anticuerpo biespecifico de acuerdo con la reivindicacion 6, y un excipiente farmaceuticamente aceptable.
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