ES2709123T3

ES2709123T3 - Método y dispositivo para lisis magnética

Info

Publication number: ES2709123T3
Application number: ES16166269T
Authority: ES
Inventors: Phillip Belgrader; Benjamin Hindson
Original assignee: Bio Rad Laboratories Inc; Akonni Biosystems Inc
Current assignee: Bio Rad Laboratories Inc; Akonni Biosystems Inc
Priority date: 2009-09-21
Filing date: 2010-09-20
Publication date: 2019-04-15
Anticipated expiration: 2030-09-20
Also published as: WO2011034621A3; CN102686306A; CA3041540A1; EP2480324A4; US10138458B2; IN2012DN03431A; US9217174B2; US20120003654A2; EP3067112B1; CA2811872C; EP3067112A1; CN105969761A; US11118156B2; US8399190B2; CA3041540C; US20190024039A1; CA2811872A1; CN102686306B; US20130157274A1; JP2013505018A

Abstract

Un método para lisar una o más células, que comprende: colocar una pluralidad de cámaras en una superficie, donde cada cámara comprende una o más células de interés, uno o más elementos de agitación magnética, y una pluralidad de perlas; y rotar un imán entre 1000 y 6000 rpm durante 90 a 120 segundos alrededor de un eje para producir un campo magnético de rotación, donde el eje es paralelo a la superficie sobre la cual residen las cámaras, la rotación del imán hace que uno o más agitadores magnéticos en las cámaras roten, lo que a su vez dirige el movimiento de las perlas, una o más células y el medio líquido y lisa las células dentro de las cámaras.

Description

DESCRIPCION

Metodo y dispositivo para lisis magnetica

SOLICITUDES RELEVANTES

La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional de patente de Estados Unidos No. 61/272,396, presentada el 21 de septiembre de 2009.

CAMPO TECNICO

El campo tecnico es la biotecnologla y, mas especlficamente, los metodos y el aparato para el lisado de celulas.

ANTECEDENTES

La lisis celular es la destruction o la ruptura de una membrana o pared celular que libera la celula y expone su contenido. Hay muchas tecnicas disponibles para la rotura de celulas que incluye la perturbation flsica, qulmica (por ejemplo, metodos a base de detergente, sales caotropicas) y bioqulmica (por ejemplo, enzimas como lisozima). La lisis mecanica, como el tratamiento con vortex y bead-beating, es una forma de lisis flsica. La sonicacion es otra forma de lisis flsica, que utiliza ondas sonoras de frecuencia alta pulsadas para agitar y lisar celulas, bacterias, esporas y tejido finamente cortado. Sin embargo, estos enfoques no son compatibles inmediatamente con un sistema de analisis de lisis celular/ acido nucleico de bajo costo. Los metodos a base de detergente suelen ser mas faciles de utilizar con protocolos mas eficientes que los metodos flsicos. Igualmente, la presencia de detergente puede interferir con reacciones corriente abajo en un sistema integrado y puede proporcionar diferentes eficiencias de lisis para bacterias y esporas mas resistentes y requiere etapas de incubation largas y/o tratamiento termico. Por lo tanto, existe una necesidad de metodos para lisis celular que sean economicos, eficientes y compatibles con un sistema de lisis celular/analisis integrado.

SUMARIO

Se divulga un metodo para el lisado de celulas, partlculas de virus y esporas. El metodo comprende agitar celulas con un elemento agitador magnetico en un contenedor en presencia de una pluralidad de perlas de lisis celular, donde el elemento de agitation rota a una velocidad suficiente y con una duration para lisar celulas. En algunas realizaciones, las perlas de lisis celular se seleccionan del grupo que consiste de perlas polimericas, perlas de vidrio, perlas de ceramica y perlas metalicas. En algunas realizaciones, las perlas de lisis celular tienen diametros dentro del espectro de 10 a 1000 pm. En algunas realizaciones, se agrega entre 1 mg y 10 g de perlas de lisis celular en la camara de lisis. En algunas realizaciones, se agrega entre 1 ul y 10ml de un llquido acuoso en la camara de lisis. En algunas realizaciones, solo se agrega una muestra o especimen directamente en la camara de lisis En algunas realizaciones, se agrega directamente una muestra en la camara de lisis junto con un llquido acuoso (por ejemplo, un especimen solido que se homogeniza y lisa en forma acuosa). En algunas realizaciones, el elemento de agitacion magnetico tiene forma rectangular, forma trapezoide, una forma de diapason doble, una forma de varilla y una forma de barra. En algunas realizaciones, las celulas son celulas eucariotas, celulas procariotas, endoesporas o una combination de estos, y se suspenden en un medio llquido a una concentration que oscila entre 1 y 1x1010 celulas/ml. En algunas realizaciones, las celulas son partlculas de virus y se suspenden en un medio llquido a una concentracion que oscila entre 1 y 1x1013 partlculas/ml.

Tambien se divulga un metodo para lisar celulas y partlculas de virus. El metodo comprende suspender celulas o partlculas de virus en un medio llquido para formar una suspension y agitar la suspension con un elemento de agitacion magnetico a alta velocidad, entre 1000 y 5000 rpm, preferentemente mas cerca de 5000 rpm, en presencia de una pluralidad de perlas de lisis celular durante un plazo entre 1 y 600 segundos, preferentemente entre aproximadamente 90 y 120 segundos.

Tambien se divulga un dispositivo para lisar celulas y partlculas de virus. El dispositivo incluye una camara que tiene uno o mas elementos de agitacion magnetica y una pluralidad de perlas de lisis celular all! dispuestas. La camara tiene dimensiones que permiten la rotation de uno o mas elementos de agitacion magnetica dentro de la camara. En algunas realizaciones, el dispositivo incluye un agitador magnetico que produce un campo magnetico de rotacion, donde los elementos de agitacion magnetica rotan dentro de la camara cuando se colocan en el espectro operativo del campo de rotacion magnetica. En algunas realizaciones, el dispositivo tambien incluye un soporte de camara configurado para sostener la camara en el campo magnetico de rotacion producido por el agitador magnetico.

Tambien se divulga un metodo para purificar acido nucleico de una celula. El metodo comprende aplicar un campo magnetico en un recipiente que contiene una celula, un elemento de agitacion y una pluralidad de perlas, donde el campo magnetico hace que el elemento de agitacion choque con la pluralidad de perlas y produzca un lisado celular; y aislar el acido nucleico del lisado celular.

Tambien se divulga un metodo para amplificar un polinucleotido de una celula. El metodo comprende aplicar un campo magnetico en un recipiente que contiene una celula, un elemento de agitacion, y una pluralidad de perlas, donde el campo magnetico hace que el elemento de agitacion choque con la pluralidad de perlas y produzca un lisado celular, y amplie un polinucleotido del lisado celular.

Tambien se divulga un metodo para detectar un polinucleotido de una celula. El metodo comprende aplicar un campo magnetico en un recipiente que contiene una celula, un elemento de agitacion y una pluralidad de perlas, donde el campo magnetico hace que el elemento de agitacion choque con la pluralidad de perlas y produzca un lisado celular, y detectar un polinucleotido del lisado celular. En algunas realizaciones, la etapa de deteccion comprende aislar acidos nucleicos del lisado celular, ampliar el polinucleotido de los acidos nucleicos aislados y detectar el polinucleotido ampliado.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

La description detallada se referira a los siguientes dibujos, donde:

La Figura 1 es un organigrama que muestra una realization de un metodo para lisar celulas.

La Figura 2 es un organigrama que muestra otra realizacion de un metodo para lisar celulas.

La Figura 3 es un grafico que muestra las posiciones relativas de un iman y una camara de lisis.

La Figura 4 es un grafico que muestra una ampliation por PCR en tiempo real de una region genomica especifica a partir de celulas de E. coli no lisadas, celulas de E. coli lisadas mediante un agitador de perlas durante 2 minutos (agitacion durante 2m), y celulas de E. coli lisadas mediante perlas/agitador durante 30 segundos (mezcla 30 segundos) o 2 minutos (mezcla 2 min.).

La Figura 5 es un grafico que muestra una ampliacion por PCR en tiempo real de una region genomica especifica a partir de celulas E. coli no lisadas (no lisado), celulas de E. coli lisadas mediante un agitador de perlas durante 2 minutos (agitacion 2m), y celulas de E. coli lisadas mediante perlas/agitador durante 1 minuto (mezcla 1m.) o 2 minutos (mezcla 2m.).

La Figura 6 es un grafico que muestra una ampliacion por PCR en tiempo real de una region genomica especifica a partir de esporas Bacillus thuringiensis no lisadas, esporas Bacillus thuringiensis lisadas mediante un agitador de perlas durante 2 minutos (agitacion durante 2m), y esporas Bacillus thuringiensis lisadas mediante perlas/agitador durante 2 minutos (mezcla 2 min.).

La Figura 7 es un grafico que muestra una ampliacion por PCR en tiempo real de una region genomica especifica a partir de esporas Bacillus thuringiensis no lisadas (no lisado), esporas Bacillus thuringiensis lisadas mediante un agitador de perlas durante 2 minutos (agitacion 2m), y esporas Bacillus thuringiensis lisadas mediante perlas/agitador durante 1,5 minutos (mezcla 1,5m.) o 2 minutos (mezcla 2m.).

La Figura 8 es un grafico que muestra una ampliacion por PCR en tiempo real de una region genomica especifica a partir de esporas Bacillus thuringiensis no lisadas, esporas Bacillus thuringiensis lisadas mediante un agitador de perlas durante 2 minutos (agitacion durante 2m), y esporas Bacillus thuringiensis lisadas mediante perlas/agitador durante 1,5 minutos (mezcla 1,5 min.).

La Figura 9 es un grafico que muestra el efecto del tiempo de lisis y la velocidad del mezclador de perlas en la respuesta de PCR en tiempo real para celulas Staphylococcus aureus. La lisis eficiente de celulas S. aureus se logro en 2 minutos cuando el mezclador de perlas funciono a alta velocidad. Las velocidades mas lentas necesitaron de tiempos de lisis mas extensos. Las esporas sin lisiar tienen niveles bajos de ADN extracelular que son detectables sin lisis (0 min.). Una cantidad pequena de ADN libre se une a las perlas de vidrio. La velocidad del mezclador de perlas de 100 corresponde a 5000 rpm.

La Figura 10 es un grafico que muestra el efecto del tiempo de lisis y la velocidad del mezclador de perlas en la respuesta de PCR en tiempo real para esporas Bacillus thuringiensis. La lisis eficiente de esporas Bacillus thuringiensis se logro en 2 minutos cuando el mezclador de perlas funciono a alta velocidad. Las velocidades mas lentas necesitaron de tiempos de lisis mas extensos. Las esporas sin lisiar tienen niveles bajos de ADN extracelular que son detectables sin lisis (0 min.). Una cantidad pequena de ADN libre se une a las perlas de vidrio. La velocidad del mezclador de perlas de 100 corresponde a 5000 rpm.

DESCRIPCION DETALLADA

Al describir realizaciones preferidas de la presente invention, se emplea terminologia especifica a los efectos de la claridad. Sin embargo, no se pretende limitar la invencion a la terminologia especifica seleccionada.

Se divulgan realizaciones de un metodo para lisar celulas. Respecto de la figura 1, en algunas realizaciones, el metodo 100 incluye agregar una muestra celular en una camara (etapa 110), agregar una pluralidad de perlas de lisis celular en el contenedor (etapa 120), agregar un elemento de agitacion magnetica en el contenedor (etapa 130), y agitar la muestra celular con el elemento de agitacion magnetica a una velocidad de rotation (entre 1000 y 5000 rpm) suficiente para lisar las celulas (etapa 140). Respecto de la Figura 2, en otras realizaciones, el metodo 200 incluye formar una mezcla que incluye celulas, un medio llquido, perlas de lisis celular, y un elemento de agitacion magnetica (etapa 210) y un movimiento de conduction del elemento de agitacion magnetica en la mezcla mediante el uso de un campo magnetico para lisar las celulas (etapa 220).

Como se utiliza en la presente, el termino «celulas» hace referencia a celulas eucariotas, procariotas, virus, endoesporas o cualquier combination de estos. Las celulas pueden incluir bacterias, esporas bacterianas, hongos, partlculas de virus, organismos eucariotas unicelulares (por ejemplo, protozoos, levadura, etc.), celulas aisladas o acumuladas de organismos multicelulares (por ejemplo, celulas primarias, celulas cultivadas, tejidos, organismos enteros, etc.), o una combinacion de estos, entre otros.

El termino «muestra celular» hace referencia a muestras que contienen celulas. Como se utiliza en la presente, las muestras celulares incluyen especlmenes de origen humano, vegetal, animal, alimenticio, agricola o ambiental como hisopado nasal, muestras de sangre, heces, plasma, tejido, hojas, agua y suelo. Preferentemente, las muestras celulares contienen celulas suspendidas en un medio llquido a una concentration que no interfiere con el movimiento del elemento de agitacion magnetico.

El termino «lisar» respecto de las celulas significa la afectacion de la integridad de al menos una fraction de las celulas para liberar componentes intracelulares, como acidos nucleicos y protelnas, de celulas rotas.

El termino «homogeneizar» respecto de la mezcla (diferentes elementos, por ejemplo, heces, tejido, esputo, saliva) en una mezcla uniforme.

Las celulas eucariotas, las celulas procariotas, y/o virus se pueden suspender en cualquier concentracion adecuada. En algunas realizaciones, las celulas eucariotas y/o las celulas procariotas se suspenden en una concentracion que oscila entre 1 y 1x1010 celulas/ml, 1 y 1x105 celulas/ml, o 1x103 y 1x104 celulas/ml, entre otros. En algunas realizaciones, las partlculas de virus se suspenden en una concentracion que oscila entre 1 y 1x1013 partlculas/ml, 1 y 1x1010 partlculas/ml, o 1x105 y 1x107 partlculas/ml.

El medio llquido puede ser isotonico, hipotonico o hipertonico. En algunas realizaciones, el medio llquido es acuoso. En algunas realizaciones, el medio llquido contiene un tampon y/o al menos una sal o una combinacion de sales. En algunas realizaciones, el pH del medio llquido oscila entre aproximadamente 5 y aproximadamente 8, entre aproximadamente 6 y 8, o entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente 8,5. Se puede utilizar una variedad de tampones de pH para alcanzar el pH deseado. Los tampones adecuados incluyen, a modo no taxativo, Tris, MES, Bis-Tris, ADA, ACES, PIPES, MOPSO, Bis-Tris propano, BES, MOPS, TES, HEPES, DIPSO, MOBS, TAPSO, HEPPSO, POPSO, TEA, HEPPS, Tricina, Gli-Gli, Bicina, y un tampon fosfato (por ejemplo, fosfato de sodio o un fosfato de sodio y potasio, entre otros). El medio llquido puede comprender entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 100 mM de tampon, entre 25 mM y aproximadamente 75 mM de tampon, o entre aproximadamente 40 mM y aproximadamente 60 mM de tampon entre otros. El tipo y la cantidad de tampon utilizado en el medio llquido pueden variar de aplicacion en aplicacion. En algunas realizaciones, el medio llquido tiene un pH de aproximadamente 7,4, el cual se puede alcanzar utilizando aproximadamente 50 mM de tampon Tris. En algunas realizaciones, el medio llquido es agua.

La camara puede ser un contenedor de cualquier material, tamano y forma adecuados. En algunas realizaciones, la camara es un contenedor plastico. La camara puede, por ejemplo, tener la forma de un tubo de microcentrlfuga (por ejemplo, un tubo Eppendorf), un tubo centrlfugo, un vial o placa de micropocillos. La camara solo puede definir un compartimento/una camara para mantener celulas, perlas, y un elemento de agitacion, o una pluralidad de compartimentos/camaras (por ejemplo, un conjunto de pocillos) para mantener mezclas (celulas, perlas, y elementos de agitacion) en aislamiento entre si. La camara puede ser un contenedor sellado o sellable, como un contenedor con una tapa, un tapon, o una cubierta. La superficie interior puede ser qulmicamente inerte para conservar la integridad del analito de interes.

Las perlas de lisis celular pueden ser cualquier estructura del tipo partlcula y/o perla que tiene una dureza mayor que la dureza de las celulas. Las perlas de lisis celular pueden ser de plastico, vidrio, ceramica, metal y/o de cualquier otro material adecuado. En algunas realizaciones, las perlas de lisis celular pueden ser de materiales no magneticos. En algunas realizaciones, las perlas de lisis celular pueden ser rotativamente simetricas alrededor de al menos un eje (por ejemplo, partlculas esfericas, redondeadas, ovales, ellpticas, en forma de huevo, y de gotas). En otras realizaciones, las perlas de lisis celular tienen formas de poliedro. En algunas realizaciones, las perlas de lisis celular son partlculas con forma irregular. En algunas realizaciones, las perlas de lisis celular son partlculas con protuberancias. En algunas realizaciones, la cantidad de perlas agregadas a cada contenedor de lisis oscila entre 1 y 10.000 mg, 1 y 1000 mg y 1 y 10 mg, entre otros.

En algunas realizaciones, las perlas de lisis celular tienen diametros que oscilan entre 10 a 1000 pm, 20 y 400 pm, o 50 y 200 pm, entre otros.

El elemento de agitacion magnetica puede tener cualquier forma y podrla ser suficientemente pequeno para ser colocado en el contenedor y para moverse o girar o mezclar en el contenedor. El elemento de agitacion magnetico puede ser un elemento de agitacion en forma de barra, de cilindro, de cruz, de V, triangular, rectangular, de varilla o disco, entre otros. En algunas realizaciones, el elemento de agitacion magnetico tiene una forma rectangular. En algunas realizaciones, el agitador magnetico tiene una forma de diapason doble. En algunas realizaciones, el agitador magnetico tiene una forma de V. En algunas realizaciones, el agitador magnetico tiene una forma trapezoide. En algunas realizaciones, la dimension mas larga del elemento de agitacion es ligeramente menor que el diametro del contenedor (por ejemplo, aproximadamente entre un 75 y un 95% del diametro del contenedor). En algunas realizaciones, el elemento de agitacion magnetico esta revestido con un material qulmicamente inerte como, por ejemplo, un pollmero, vidrio, o ceramica (por ejemplo, porcelana). En algunas realizaciones, el pollmero es un pollmero biocompatible como PTFE y parileno.

La suspension celular, las perlas de lisis celular y el elemento de agitacion magnetica se pueden colocar en la camara en cualquier orden. En algunas realizaciones, la suspension celular se agrega en la camara antes que las perlas de lisis celular y el elemento de agitacion magnetica. En otras realizaciones, las perlas de lisis celular y/o el elemento de agitacion magnetica se colocan en la camara antes que las celulas (por ejemplo, antes que una suspension celular).

La camara, y particularmente las celulas, perlas y el elemento de agitacion magnetica, se ubican en un espectro operativo de un campo magnetico variable. Por ejemplo, la camara se puede ubicar con un espectro operativo de un campo magnetico rotatorio (por ejemplo, mediante la colocacion del contenedor en el agitador magnetico o adyacente a el). El campo magnetico variable dirige el movimiento del elemento de agitacion, como el movimiento rotatorio, la reciprocidad, o una combinacion de ellos, entre otros, el cual a su vez dirige el movimiento de las perlas, las celulas y el medio llquido. En algunas realizaciones, la suspension celular se agita con el elemento de agitacion magnetica a una velocidad de rotacion y durante tiempos suficientes para lisar las celulas dentro del contenedor. La velocidad de rotacion adecuada y la duracion dependen de la aplicacion y un entendido en la tecnica puede determinarlas en forma emplrica. En general, la velocidad de rotacion suficiente para lisar las celulas es determinada por factores como el tipo de celulas, la concentracion de la suspension celular, el volumen de la suspension celular, el tamano y la forma del elemento de agitacion magnetica, la cantidad/numero, el tamano, la forma y la dureza de las perlas de lisis celular y el tamano y la forma de la camara.

El elemento de agitacion magnetica rota a una velocidad entre 1000 y 6000 rpm, preferentemente, aproximadamente 5000 rpm, durante un perlodo entre 1 y 600 segundos, preferentemente entre aproximadamente 90 y 120 segundos. En algunas realizaciones, se coloca una camara (por ejemplo, en la forma de tubo de ensayo o tubo de microcentrlfuga) en un estante en un agitador magnetico (por ejemplo, un agitador magnetico rotatorio VP 710C1, 5000 RPM, una cubierta de agitacion utilizable de 14cm de largo, con carcasa del motor y soporte de placa, microplacas con 2 pocillos profundos o 6 microplacas estandar -115 Volts AC - 60 Hz, V&P Scientific) y se agita a la velocidad mas alta (>1000 rpm). En otras realizaciones, la camara es un pocillo en una microplaca, como una placa ELISA. En otras realizaciones, la camara es una camara en forma de cilindro con una entrada y una salida de celulas. El campo magnetico variable es generado mediante la rotacion de un iman, preferentemente un iman permanente, en la proximidad del elemento de agitacion magnetico. El iman puede rotar por encima, por debajo o por el costado de la camara de lisis alrededor de un eje que pasa a traves del centro del iman. Las camaras se colocan en una posicion que es vertical a la superficie sobre la que se encuentran una o mas camaras y el iman rota alrededor de un eje que es paralelo a la superficie sobre la cual se encuentran una o mas camaras. En otras realizaciones, el iman tambien tiene una forma elongada y rota alrededor de un eje que se extiende a lo largo de la dimension del iman.

La Figura 3 muestra las posiciones relativas de un iman en forma de cilindro 301 y una camara de lisis 303. El iman 301 rota alrededor de un eje A y hace que el elemento de agitacion magnetico 305 en la camara 303 rote en la misma direccion a lo largo de un eje B. El elemento de agitacion magnetica rotatorio 305 choca con las perlas 307 y las celulas de lisis 309 en el proceso. El iman 301 se puede colocar a lo largo de la camara 303, por encima, debajo o en diagonal a ella. En esta realizacion, la camara 303 tiene una entrada 311 y una salida 313 para facilitar la carga y la descarga de la camara.

En algunas realizaciones, la velocidad de rotacion del elemento agitador aumenta para incrementar la eficiencia de la lisis y reduce el tiempo necesario para lograr la lisis. En algunas otras realizaciones, la velocidad de rotacion es regulada para que solo algunos tipos de celulas sean lisadas. Por ejemplo, en una suspension celular que contiene multiples tipos de celulas, el elemento agitador puede rotar a una primera velocidad para lisar un primer conjunto de celulas y posteriormente, rotar a una segunda velocidad para lisar un segundo conjunto de celulas. En otras realizaciones, el contenedor se acopla a un modulo de regulacion de temperatura que controla la temperatura de la suspension celular antes, durante y/o despues del proceso de lisado. En algunas realizaciones, la temperatura de la suspension celular se mantiene a 8-2°C.

En algunas realizaciones, se puede facilitar el lisado de tipos particulares de celulas mediante la incorporacion de aditivos en la suspension celular antes y/o durante de la etapa de agitacion. Los ejemplos de aditivos incluyen enzimas, detergentes, tensioactivos y otros qulmicos como bases y acidos. Se ha descubierto que las condiciones alcalinas (por ejemplo, 10 mM de NaOH) pueden mejorar la eficiencia de la lisis durante la agitacion para algunos tipos de celulas. La suspension celular tambien o alternativamente se puede calentar durante agitacion para mejorar la eficiencia de la lisis. Sin embargo, los aditivos pueden danar las etapas de procesamiento corriente abajo que incluyen la ampliation y la detection del acido nucleico. Se desea eliminar la necesidad de aditivos para lograr una lisis eficiente dado que el procesamiento de especlmenes se puede simplificar en gran medida.

La combinacion de agitador/perlas brinda muchas ventajas respecto de los metodos de lisado convencionales. El metodo de agitador/perlas es mucho mas rapido que los enfoques qulmico y enzimatico y brinda mejor lisis celular o de virus respecto de muchos otros tipos de metodos de lisis flsica. El metodo de agitador/perlas tambien es susceptible de automatizacion mediante el uso de robotica y/o microfluidos. La fuente magnetica se puede reutilizar y no requiere una alineacion precisa con el recipiente; puede dirigir una pluralidad de camaras. El elemento de agitacion magnetica es economico lo permite que sea desechable despues de un solo uso.

Tambien se divulga un dispositivo para lisar celulas. El dispositivo incluye una camara que tiene un elemento de agitacion magnetica y una pluralidad de perlas de lisis celular all! dispuestas. Un usuario puede simplemente agregar una suspension celular en la camara, colocar la camara en un agitador magnetico, y agitar la suspension celular con el elemento de agitacion magnetica a una velocidad suficiente para lisar las celulas.

Tambien se divulga un sistema para lisar celulas. El sistema incluye una camara que tiene un elemento de agitacion magnetica y una pluralidad de perlas de lisis celular all! dispuestas, y un agitador magnetico que produce un campo magnetico de rotacion, donde el elemento de agitacion magnetica rota dentro de la camara cuando se coloca en un espectro operativo del campo magnetico de rotacion.

El sistema tambien contiene un estante configurado para sostener la camara. El estante se puede configurar para sostener multiples camaras y se puede colocar en una superficie de soporte de un agitador magnetico para el proceso simultaneo de multiples camaras. El estante tambien se puede utilizar como soporte de la camara a los efectos del almacenamiento. Por ejemplo, se pueden colocar multiples camaras en el soporte y almacenar en un refrigerador o congelador para otro analisis. La camara puede estar interconectada con un instrumento externo (por ejemplo, un robot de manejo de llquidos, un dispositivo de microfluidos, un instrumento analltico).

Tambien se divulga un metodo para amplificar un polinucleotido de una celula. El metodo comprende aplicar un campo magnetico en un recipiente que contiene una celula, un elemento de agitacion, y una pluralidad de perlas, donde el campo magnetico hace que el elemento de agitacion choque con la pluralidad de perlas y produzca un lisado celular, y amplle un polinucleotido del lisado celular.

Tambien se divulga un metodo para detectar un polinucleotido de una celula. El metodo comprende aplicar un campo magnetico en un recipiente que contiene una celula, un elemento de agitacion y una pluralidad de perlas, donde el campo magnetico hace que el elemento de agitacion choque con la pluralidad de perlas y produzca un lisado celular, y detectar un polinucleotido del lisado celular. La etapa de deteccion comprende aislar acidos nucleicos del lisado celular, ampliar el polinucleotido de los acidos nucleicos aislados y detectar el polinucleotido ampliado.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Lisis de celulas de E.coli

Se suspendieron celulas de E. coli en un tampon de Tris-EDTA a una concentracion de 104 celulas/ml. Se agrego un millmetro de la suspension celular en una camara (2 ml de vial plastico, Wheaton) que contiene 800 mg de perlas de vidrio (106 pm o mas finas, Sigma G8893) y un disco de agitacion magnetica (Disco de super agitacion VP-7195, V&P Scientific).

El vial plastico se coloco posteriormente en un agitador magnetico (Agitador magnetico rotatorio VP 710C1,5000 RPM, V&P Scientific) y se agito a 5000 rpm durante 30 segundos, 1 minuto o 2 minutos. Las muestras de control positivas se procesaron utilizando un agitador de perlas (mini agitador de perlas-1, Biospec), de conformidad con las instrucciones del fabricante durante 2 minutos a 4800 rpm. Las suspensiones celulares sin procesar se utilizaron como controles. Las celulas lisadas y los controles se sometieron a una ampliacion por PCR en tiempo real de un gen especlfico utilizando Roche LightCycler 480. Las condiciones de ampliacion fueron las siguientes: 95°C durante 250 seg.; posteriormente 45 ciclos a 95°C durante 10 seg., 60°C durante 20 seg., y 72°C durante 10 seg.; y 40°C durante 10 seg. en el ciclo final.

Como se muestra en las Figuras 4 y 5, el metodo de perlas/agitador (mezcla durante 30 segundos, mezcla durante 1 minuto y mezcla durante 2 minutos) genera una mejor lisis que el metodo de agitacion de perlas (agitacion durante 2 minutos).

Ejemplo 2: Lisis de esporas Bacillus thuringiensis

Las esporas Bacillus thuringiensis se suspendieron en agua a una concentracion de 104 celulas/ml. Se agregaron 500 pl de la suspension celular en una camara plastica de 2 ml (Wheaton) que contiene 800 mg de perlas de vidrio (106 pm o mas finas, Sigma) y un disco de agitacion magnetica (Disco de super agitacion VP-7195, V&P Scientific).

El vial plastico se coloco posteriormente en un agitador magnetico (Agitador magnetico rotatorio VP 710C1,5000 RPM; V&P Scientific) y se agito a 5000 rpm durante 1,5 minuto o 2 minutos. Las muestras de control positivas se procesaron utilizando un agitador de perlas (mini agitador de perlas-1, Biospec), de conformidad con las instrucciones del fabricante durante 2 minutos. Las suspensiones celulares sin procesar se utilizaron como controles. Las celulas lisadas y los controles se sometieron a una ampliacion por PCR en tiempo real de un gen B. Thuringiensis especlfico utilizando Roche LightCycler 480 en condiciones descritas en el Ejemplo 1.

Como se muestra en las Figuras 3 a 6, el metodo de perlas/agitador (mezcla durante 1,5 min. y mezcla durante 2 minutos) genera una mejor lisis que el metodo de agitacion de perlas (agitacion durante 2 minutos).

Ejemplo 3: Efecto del tiempo de lisis y velocidad del mezclador de perlas en la respuesta de PCR en tiempo real para celulas Staphylococcus aureus

Las celulas Staphylococcus aureus se suspendieron y lisaron a varias velocidades del mezclador durante distintos perlodos de tiempo utilizando el mismo equipo y mismos procedimientos descritos en el Ejemplo 2.

Ejemplo 4: Efecto del tiempo de lisis y velocidad del mezclador de perlas en la respuesta de PCR en tiempo real para esporas Bacillus thuringiensis

Las esporas Bacillus thuringiensis se suspendieron y lisaron a varias velocidades del mezclador durante distintos perlodos de tiempo utilizando el mismo equipo y mismos procedimientos descritos en el Ejemplo 2.

La presente invencion ha sido descrita en terminos de realizaciones especlficas que incorporan detalles para facilitar el entendimiento de los principios de construccion y funcionamiento de la invencion. Dicha referencia a realizaciones especlficas y sus detalles no pretende limitar el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un metodo para lisar una o mas celulas, que comprende:

colocar una pluralidad de camaras en una superficie, donde cada camara comprende una o mas celulas de interes, uno o mas elementos de agitacion magnetica, y una pluralidad de perlas; y

rotar un iman entre 1000 y 6000 rpm durante 90 a 120 segundos alrededor de un eje para producir un campo magnetico de rotacion, donde el eje es paralelo a la superficie sobre la cual residen las camaras, la rotacion del iman hace que uno o mas agitadores magneticos en las camaras roten, lo que a su vez dirige el movimiento de las perlas, una o mas celulas y el medio llquido y lisa las celulas dentro de las camaras.

2. El metodo de la reivindicacion 1, donde el eje pasa a traves del centro del iman.

3. El metodo de la reivindicacion 1 o de la reivindicacion 2, donde:

a. las perlas comprenden un material seleccionado del grupo que consiste de plastico, vidrio, ceramica y metales; b. las perlas comprenden perlas de vidrio, de plastico, de ceramica, de metal o una mezcla de estas;

c. las perlas son perlas de sllice;

d. las perlas tienen diametros dentro del espectro de 10 a 1000 pm;

e. el agitador magnetico comprende un metal o una aleacion;

f. el agitador magnetico comprende acero inoxidable;

g. el agitador magnetico comprende un centro de aleacion revestido con un pollmero; y/o

h. un agitador magnetico tiene una forma seleccionada del grupo que consiste de forma circular, forma cuadrada, forma rectangular, forma de varilla curva, forma rectangular transversal, forma de disco, forma de varilla, forma anular, forma de media luna, forma trapezoide y forma de diapason doble.

4. El metodo de la reivindicacion 3 (g), donde el nucleo de la aleacion comprende neodimio, hierro y boro o samariocobalto y/o donde el pollmero es un pollmero biocompatible, opcionalmente PTFE o parileno.

5. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde:

a. el iman es un iman permanente;

b. el iman rotatorio hace que uno o mas agitadores magneticos en la camara roten a una velocidad entre 1000 y 6000 rpm durante entre 1 y 600 segundos; y

c. la camara tiene una forma seleccionada del grupo que consiste de tubos de microcentrlfuga, tubos centrlfugos, tubos de ensayo, viales y pocillos en una microplaca.

6. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la camara contiene dos o mas tipos de celulas y donde la etapa de rotacion comprende la rotacion del iman a una primera velocidad que causa la lisis de un primer tipo de celulas.

7. El metodo de la reivindicacion 6, donde la etapa de rotacion comprende rotar el iman a una segunda velocidad que causa la lisis de un segundo tipo de celulas

8. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde:

a. una o mas celulas son celulas eucariotas o procariotas y donde la suspension llquida contiene las celulas a una concentracion que oscila entre 1 y 1x1010 celulas/ml; o

b. las celulas son partlculas de virus y donde la suspension llquida contiene partlculas de virus a una concentracion que oscila entre 1 y 1 x 1013 partlculas/ml.

9. El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8:

a. para purificar acido nucleico de una celula, que comprende realizar el metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para obtener un lisado celular y aislar el acido nucleico del lisado celular;

b. para ampliar un polinucleotido de una celula, que comprende realizar el metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para obtener un lisado celular y ampliar el polinucleotido del lisado celular; o

c. para detectar un polinucleotido de una celula, que comprende realizar el metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para obtener un lisado celular y detectar el acido nucleico del polinucleotido del lisado celular.

10. El metodo de la reivindicacion 9, donde la etapa de deteccion comprende: aislar acidos nucleicos del lisado celular, ampliar el polinucleotido de los acidos nucleicos aislados y detectar polinucleotidos ampliados.

11. Un dispositivo para lisar celulas, que comprende:

una pluralidad de camaras que comprenden uno o mas elementos de agitacion magnetica y una pluralidad de perlas no magneticas all! dispuestas, donde las camaras estan dimensionadas para permitir la rotacion del elemento de agitacion magnetica dentro de las camaras, donde las camaras yacen sobre una superficie;

un iman que rota alrededor de un eje paralelo a la superficie donde residen las camaras en entre 1000 y 6000 rpm durante 90 a 120 segundos para producir un campo magnetico rotatorio,

donde la rotacion del iman hace que uno o mas elementos de agitacion magnetica en las camaras roten para lisar celulas.

12. El dispositivo de la reivindicacion 11, donde:

las perlas comprenden perlas de vidrio, de plastico, de ceramica, o una mezcla de estas,

y/o

el iman es capaz de rotar alrededor de un eje que pasa el centro del iman.

13. El dispositivo de la reivindicacion 11 o la reivindicacion 12, que comprende: un modulo de control de temperatura que controla la temperatura de la camara.

14. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, construido y dispuesto para operar el proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.