ES2708948T3

ES2708948T3 - Elementos reguladores distales de bcl11a como dianas para la reinducción de la hemoglobina fetal

Info

Publication number: ES2708948T3
Application number: ES13858006T
Authority: ES
Inventors: Stuart H Orkin; Daniel E Bauer; Jian Xu
Original assignee: Boston Childrens Hospital
Current assignee: Boston Childrens Hospital
Priority date: 2012-11-27
Filing date: 2013-11-27
Publication date: 2019-04-12
Anticipated expiration: 2033-11-27
Also published as: SG10201704008RA; EP2925864B1; IL238949A0; JP2015536657A; US20230348887A1; JP2018085987A; AU2021218012B2; MX2015006528A; SG10202110062SA; CN104955943B; ES2884925T3; AU2018278850A1; US9822355B2; US20200087651A1; JP6633602B2; EP2925864A1; CN109554350A; PT3502240T; BR112015011995A2; EP2925864A4

Abstract

Un método para producir una célula progenitora hematopoyética que tiene disminución del ARNm o la expresión proteica de BCL11A, el método comprende poner en contacto ex vivo o in vitro una célula progenitora hematopoyética aislada con al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC), para reducir de este modo el ARNm o la expresión proteica de BCL11A.

Description

DESCRIPCION

Elementos reguladores distales de b c llla como dianas para la reinduccion de la hemoglobina fetal

Antecedentes de la invencion

La hemoglobina del adulto normal comprende cuatro protemas globinas, dos de las cuales son protemas alfa (a) y dos de las cuales son protemas beta (p). Durante el desarrollo fetal de los mairnferos, particularmente en seres humanos, el feto produce hemoglobina fetal, que comprende dos protemas gamma (y)-globinas en lugar de las dos protemas p-globinas. Durante el penodo neonatal, se produce un cambio de globinas, denominado el "cambio fetal", punto en el cual, los precursores eritroides cambian de producir predominantemente Y-globina a producir predominantemente p-globina. El cambio en el desarrollo de la produccion predominantemente de hemoglobina fetal o HbF (a2Y2) a la produccion de hemoglobina del adulto o HbA (a2p2) comienza aproximadamente de las 28 a 34 semanas de gestacion y continua brevemente despues del nacimiento hasta que la HbA se vuelve predominante. Este cambio es el resultado principalmente de la disminucion de la transcripcion de los genes de gamma-globinas y el aumento de la transcripcion de los genes de beta-globinas. Como promedio, la sangre de un adulto normal contiene menos de 1 % de HbF, aunque los niveles de HbF residual tienen una variacion de mas de 20 veces en adultos sanos y se controlan geneticamente.

Las hemoglobinopatfas abarcan una serie de anemias de origen genetico en las que existe una disminucion de la produccion y/o un aumento de la destruccion (hemolisis) de globulos rojos (RBC). Estas incluyen ademas defectos geneticos que dan como resultado la produccion de hemoglobinas anormales con una afectacion concomitante de la capacidad de mantener la concentracion de oxfgeno. Algunos de tales trastornos involucran la incapacidad de producir pglobina normal en cantidades suficientes, mientras que otros involucran la total incapacidad de producir p-globina normal. Estos trastornos asociados con la protema p-globina se denominan generalmente p-hemoglobinopatias. Porejemplo, las p-talasemias son el resultado de un defecto parcial o completo en la expresion del gen de p-globina, lo que conduce a la deficiencia o ausencia de HbA. La anemia drepanodtica es el resultado de una mutacion puntual en el gen estructural de la p-globina, que conduce a la produccion de una hemoglobina (HbS) anormal (drepanodtica). La HbS tiene tendencia a la polimerizacion, particularmente en condiciones de carencia de oxfgeno. Los RBC con HbS son mas fragiles que los RBC normales y experimentan hemolisis mas facilmente, lo que conduce eventualmente a la anemia.

Recientemente, la busqueda de un tratamiento orientado a la reduccion del desequilibrio de las cadenas de globinas o la predisposicion a la polimerizacion de la hemoglobina en pacientes con p-hemoglobinopatfas se ha centrado en la manipulacion farmacologica de la hemoglobina fetal (a2Y2; HbF). El potencial terapeutico de tales enfoques se sugiere por las observaciones del fenotipo moderado de individuos con herencia conjunta de p-talasemia homocigotica y persistencia hereditaria de hemoglobina fetal (HPFH), asf como por aquellos pacientes con p-talasemia homocigotica que no sintetizan hemoglobina del adulto, pero en los que se observa una reduccion de la necesidad de transfusiones en presencia de aumento de las concentraciones de hemoglobina fetal. Ademas, se ha observado que deltas poblaciones de pacientes adultos con anomalfas en la cadena p tienen niveles de hemoglobina fetal (HbF) mayores que los normales, y se ha observado que tienen un curso clmico de la enfermedad mas moderado que los pacientes con niveles de HbF normales en el adulto. Por ejemplo, un grupo de pacientes con anemia drepanodtica de Arabia Saudita que expresan 20 30 % de HbF solo tienen manifestaciones clmicas moderadas de la enfermedad. Ahora se acepta que los trastornos de la hemoglobina, tales como la anemia drepanoctica y las p-talasemias, se alivian con el aumento de la produccion de HbF.

Como se menciono antes, el cambio de hemoglobina fetal a hemoglobina del adulto (a2Y2; HbA) se produce normalmente dentro de los seis meses despues del parto. Sin embargo, en la mayona de los pacientes con p-hemoglobinopatfas, los genes de y globinas corriente arriba estan intactos y son completamente funcionales, de manera que si estos genes se reactivaran, podna mantenerse la smtesis de hemoglobina funcional durante la adultez, y por lo tanto aliviar la gravedad de la enfermedad. Desafortunadamente, los mecanismos moleculares in vivo subyacentes al cambio de globinas no se entienden bien.

La evidencia que soporta la factibilidad de la reactivacion de la produccion de hemoglobina fetal proviene de experimentos en los que se demostro que la sangre periferica, que contiene celulas clonogenicas, cuando reciben la combinacion adecuada de factores de crecimiento, producen colonias eritroides y proliferan en cultivo semisolido. Las celulas individuales en tales colonias pueden acumular hemoglobina fetal (HbF), hemoglobina del adulto (HbA) o una combinacion de ambas. En cultivos de sangre de adulto, los globulos rojos nucleados acumulan HbA (F-A+) solamente, o una combinacion de HbF y HbA (F+A+). Mas importante aun, las colonias individuales contienen tanto celulas F+ como F-, lo que indica que ambos tipos son progenie de las mismas celulas madre circulantes. Por lo tanto, durante las etapas tempranas del desarrollo en cultivo, las celulas ejecutan una opcion, a traves de mecanismos que actualmente se desconocen, de si expresar o no HbF. La proporcion de celulas F+ adultas que se desarrollan en cultivo no parece programarse previamente in vivo, sino que parece depender de las condiciones de cultivo: Una variacion en la ruta de expresion combinada de HbF y HbA, por ejemplo, puede lograrse in vitro mediante concentraciones sericas altas, debido a la actividad de un compuesto no identificado que puede absorberse en carbon activado.

En general, la identificacion de moleculas que desempenan un papel en el cambio de globinas es importante para el desarrollo de nuevas estrategias terapeuticas que interfieren con la hemoglobina del adulto e inducen la smtesis de hemoglobina fetal. Tales moleculas proporcionanan nuevas dianas para el desarrollo de intervenciones terapeuticas para una variedad de hemoglobinopatfas en las que la reactivacion de la smtesis de hemoglobina fetal aliviana significativamente la gravedad y la morbilidad de la enfermedad.

Resumen

En un primer aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo para producir una celula progenitora hematopoyetica que tiene disminucion del ARNm o la expresion proteica de BC LIlA , el metodo comprende poner en contacto ex vivo o in vitro una celula progenitora hematopoyetica aislada con al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genomico de la UCSC), para reducir de este modo el ARNm o la expresion proteica de BCL11A.

En un segundo aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo para producir una celula progenitora hematopoyetica humana modificada geneticamente aislada que tiene al menos una modificacion genetica que comprende poner en contacto ex vivo o in vitro una celula progenitora hematopoyetica aislada con una cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genomico de la celula progenitora hematopoyetica en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta.

En un tercer aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en una celula progenitora hematopoyetica, el metodo comprende las etapas de: poner en contacto ex vivo o in vitro una celula progenitora hematopoyetica aislada con una cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genomico de la celula progenitora hematopoyetica en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta, de manera que la expresion de hemoglobina fetal aumenta en dicha celula, o su progenie, con relacion a dicha celula antes de dicho contacto.

En un cuarto aspecto, la presente invencion se refiere a una celula humana modificada geneticamente aislada que tiene al menos una modificacion genetica en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2, en donde la celula puede obtenerse mediante el metodo del segundo aspecto.

En un quinto aspecto, la presente invencion se refiere a una composicion que comprende la celula humana modificada geneticamente aislada descrita anteriormente.

En un sexto aspecto, la presente invencion se refiere a una celula progenitora hematopoyetica aislada para el uso en el aumento de los niveles de hemoglobina fetal en un mairnfero que lo necesita, en donde la celula progenitora hematopoyetica aislada se ha puesto en contacto ex vivo o in vivo con una cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta.

En un septimo aspecto, la presente invencion se refiere a una celula humana modificada geneticamente aislada como se describio anteriormente o una composicion como se describio anteriormente para el uso en el aumento de los niveles de hemoglobina fetal en un marnffero que lo necesita.

En la presente descripcion se proporcionan metodos y composiciones para aumentar los niveles de p-globinas fetales en una celula mediante la interrupcion de la expresion de BCL11A a nivel genomico. En la presente descripcion se proporcionan ademas metodos y composiciones relacionadas con el tratamiento de hemoglobinopatfas por reinduccion de los niveles de p-globinas fetales.

En la presente descripcion se describe un metodo para producir una celula progenitora que tiene disminucion del ARNm o la expresion proteica de BCL11A, el metodo comprende poner en contacto una celula progenitora aislada con un agente que se une al ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genomico de la UCSC), para reducir de este modo el ARNm o la expresion proteica de BCL11A.

En la presente descripcion se describe ademas un metodo para producir una celula humana modificada geneticamente que tiene al menos una modificacion genetica que comprende poner en contacto una celula aislada con una cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta.

En la presente descripcion se proporciona ademas una celula humana modificada geneticamente aislada que tiene al menos una modificacion genetica en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2. En una modalidad, al menos una modificacion genetica es una delecion en el ADN genomico en la ubicacion especificada. En una modalidad, la celula humana modificada geneticamente aislada tiene reduccion o disminucion del ARNm o la expresion proteica de BCL11A en comparacion con una celula de control que no tiene una modificacion genetica en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2.

En la presente descripcion se describe ademas un uso de una celula humana modificada geneticamente aislada que tiene al menos una modificacion genetica en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 descrita en la presente descripcion para el proposito de aumentar los niveles de hemoglobina fetal en un mairnfero.

En la presente descripcion se describe ademas un uso de una celula humana modificada geneticamente aislada que tiene al menos una modificacion genetica en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 descrita en la presente descripcion para el tratamiento de una hemoglobinopatfa en un mamffero.

En la presente descripcion se describe ademas un uso de una celula humana modificada geneticamente aislada que tiene al menos una modificacion genetica en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 descrita en la presente descripcion para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de una hemoglobinopatfa en un mamffero de manera que los niveles de hemoglobina fetal en un mamffero aumentan.

En la presente descripcion se describe ademas una composicion que comprende celulas humanas modificadas geneticamente aisladas que tienen al menos una modificacion genetica en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2. En una modalidad, la composicion comprende ademas un portador farmaceuticamente aceptable.

En la presente descripcion se describe ademas un uso de una composicion que comprende celulas humanas modificadas geneticamente aisladas que tienen al menos una modificacion genetica en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 para el proposito de aumentar los niveles de hemoglobina fetal en un mamffero.

En la presente descripcion se describe ademas un uso de una composicion que comprende celulas humanas modificadas geneticamente aisladas que tienen al menos una modificacion genetica en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 para el tratamiento de una hemoglobinopatfa en un mamffero.

En la presente descripcion se describe adicionalmente un uso de una composicion que comprende celulas humanas modificadas geneticamente aisladas que tienen al menos una modificacion genetica en la ubicacion 60,716,189 60,728,612 del cromosoma 2 para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de una hemoglobinopatfa en un mamffero de manera que los niveles de hemoglobina fetal en un mamffero aumentan.

En la presente descripcion se describe ademas una composicion que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genomico de una celula humana en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta. En una modalidad, la composicion comprende ademas un portador farmaceuticamente aceptable.

En la presente descripcion se describe ademas un uso de una composicion que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genomico de una celula humana en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta para el proposito de aumentar los niveles de hemoglobina fetal en un mamffero.

En la presente descripcion se describe ademas un uso de una composicion que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genomico de una celula humana en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta para el tratamiento de una hemoglobinopatfa en un mamffero.

En la presente descripcion se describe ademas un uso de una composicion que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genomico de una celula humana en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de una hemoglobinopatfa en un mamffero de manera que los niveles de hemoglobina fetal en un mamffero aumentan.

En una modalidad, en la presente descripcion se proporciona un uso de un agente que se une al ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genomico de la UCSC) para aumentar la hemoglobina fetal en un mamffero o para el tratamiento de una hemoglobinopatfa en el mairnfero o para reducir el ARNm o la expresion de BCL11A, en donde el ARNm o la expresion proteica de BCL11A se reduce.

En una modalidad, en la presente descripcion se proporciona un uso de una cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN para aumentar la hemoglobina fetal en un mamffero o para el tratamiento de una hemoglobinopatfa en el mamffero o para reducir el ARNm o la expresion de BCL11A, en donde la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta.

En una modalidad, en la presente descripcion se proporciona un uso de una cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una enzima dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una enzima dirigida a ADN para aumentar la hemoglobina fetal en un mamffero o para el tratamiento de una hemoglobinopatfa en el mamffero o para reducir el ARNm o la expresion de BCL11A, en donde la enzima dirigida a ADN produce al menos una modificacion epigenetica en el ADN genomico de la celula en el cromosoma 2, para afectar de este modo el ARNm o la expresion de BCL11A. En una modalidad, al menos una modificacion epigenetica es en la ubicacion 60,716,189-60,728.612. En otra modalidad, el efecto de la una modificacion epigenetica es reducir el ARNm o la expresion proteica de BCL11A. En una modalidad, al menos una modificacion epigenetica en el ADN genomico de la celula en el cromosoma 2 afecta directa o indirectamente la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2.

En una modalidad, en la presente descripcion se proporciona un uso de cualquiera de las celulas aisladas descritas en la presente descripcion para aumentar la hemoglobina fetal en un mamffero o para el tratamiento de una hemoglobinopatfa en el mam^era.

En una modalidad, en la presente descripcion se proporciona un uso de una composicion que comprende celulas humanas modificadas geneticamente aisladas para aumentar la hemoglobina fetal en un mamffero o para el tratamiento de una hemoglobinopatfa en el mamffero, en donde las celulas tienen al menos una modificacion genetica en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genomico de la UCSC) producida mediante el proceso de poner en contacto las celulas con una cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genomico de la UCSC) lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta.

En una modalidad, en la presente descripcion se proporciona un uso de una composicion que comprende celulas humanas modificadas geneticamente aisladas para aumentar la hemoglobina fetal en un mamffero o para el tratamiento de una hemoglobinopatfa en el mamffero, en donde las celulas tienen al menos una modificacion epigenetica en el cromosoma 2. En una modalidad, al menos una modificacion epigenetica en el cromosoma 2 es en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genomico de la UCSC). En otra modalidad, al menos una modificacion epigenetica en el cromosoma 2 se produce mediante el proceso de poner en contacto las celulas con una cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una enzima dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una enzima dirigida a ADN de manera que la enzima dirigida a ADN produce al menos una modificacion epigenetica en el ADN genomico de la celula en el cromosoma 2 que afecta la ubicacion 60,716,189 60,728,612 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genomico de la UCSC).

En una modalidad, en la presente descripcion se proporciona un uso de cualquiera de las celulas aisladas descritas en la presente descripcion o cualquiera de las composiciones descritas en la presente descripcion para la fabricacion de un medicamento para aumentar la hemoglobina fetal en un mamffero que lo necesita o para el tratamiento de una hemoglobinopatfa en un mamffero.

En la presente descripcion se describe un metodo para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en una celula, el metodo comprende las etapas de: poner en contacto una celula aislada con una cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta, de manera que la expresion de hemoglobina fetal aumenta en dicha celula, o su progenie, con relacion a la celula antes del contacto.

En la presente descripcion se describe ademas un metodo para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en un mamffero que lo necesita, el metodo comprende las etapas de poner en contacto una celula progenitora hematopoyetica aislada en dicho mamffero con una cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta, de manera que la expresion de la hemoglobina fetal aumenta en dicho mamffero, con relacion a la expresion antes de dicho contacto.

En la presente descripcion se describe ademas un metodo para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en un mairnfero que lo necesita, el metodo comprende trasplantar una celula humana modificada geneticamente aislada que tiene al menos una modificacion genetica en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 en el marnffero.

En una modalidad, esta descripcion proporciona un metodo para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en un mamffero que lo necesita, el metodo comprende las etapas de proporcionar una poblacion aislada de celulas progenitoras hematopoyeticas o celulas madre hematopoyeticas del mamffero ex vivo, y poner en contacto la poblacion de celulas progenitoras o madre hematopoyeticas con una cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta, de manera que la expresion de hemoglobina fetal aumenta en el marnffero, con relacion a la expresion antes del contacto.

En una modalidad, esta descripcion proporciona un metodo para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en un mamffero que lo necesita, el metodo comprende las etapas de aislar una poblacion de celulas progenitoras hematopoyeticas o celulas madre hematopoyeticas del mamffero, y poner en contacto ex vivo la poblacion de celulas progenitoras o madre hematopoyeticas con una cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta, de manera que la expresion de hemoglobina fetal aumenta en el marnffero, con relacion a la expresion antes del contacto.

En una modalidad, esta descripcion proporciona un metodo para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en un mamffero que lo necesita, el metodo comprende las etapas de aislar una poblacion de celulas progenitoras hematopoyeticas o celulas madre hematopoyeticas del mamffero y eliminar el ADN genomico de las celulas en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta, de manera que la expresion de hemoglobina fetal aumenta en el mam^era, con relacion a la expresion antes del contacto.

En una modalidad, esta descripcion proporciona un metodo para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en un mamffero que lo necesita, el metodo comprende las etapas de aislar una poblacion de celulas progenitoras hematopoyeticas o celulas madre hematopoyeticas del mamffero y ex vivo eliminar el ADN genomico de las celulas en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta, de manera que la expresion de hemoglobina fetal aumenta en el m ai^ero , con relacion a la expresion antes del contacto.

En una modalidad, esta descripcion proporciona un metodo de tratamiento de una hemoglobinopatfa en un marnffero que comprende las etapas de:(a) proporcionar celulas progenitoras hematopoyeticas o celulas madre hematopoyeticas o iPSC; (b) poner en contacto las celulas ex vivo o in vitro con una cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189 60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta, de manera que la expresion de hemoglobina fetal aumenta en el marnffero, con relacion a la expresion antes del contacto; y (c) administrar las celulas de la etapa (b) en el mamffero.

En una modalidad, esta descripcion proporciona un metodo de tratamiento de una hemoglobinopatfa en un mamffero que comprende las etapas de:(a) aislar celulas progenitoras hematopoyeticas o celulas madre hematopoyeticas del mamffero; (b) poner en contacto las celulas ex vivo o in vitro con una cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta, de manera que la expresion de hemoglobina fetal aumenta en el mam^era, con relacion a la expresion antes del contacto; y (c) administrar las celulas de la etapa (b) en el mam^era.

En una modalidad, esta descripcion proporciona un metodo de tratamiento de una hemoglobinopatfa en un mamffero que comprende las etapas de: (a) proporcionar celulas progenitoras hematopoyeticas o celulas madre hematopoyeticas o iPSC; (b) ex vivo eliminar el ADN genomico de las celulas en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta, de manera que la expresion de hemoglobina fetal aumenta en el marnffero, con relacion a la expresion antes del contacto; y (c) administrar las celulas de la etapa (b) en el mamffero.

En una modalidad, esta descripcion proporciona un metodo de tratamiento de una hemoglobinopatfa en un mamffero que comprende las etapas de:(a) aislar celulas progenitoras hematopoyeticas o celulas madre hematopoyeticas del mamffero; (b) ex vivo eliminar el ADN genomico de las celulas en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta, de manera que la expresion de hemoglobina fetal aumenta en el marnffero, con relacion a la expresion antes del contacto; y (c) administrar las celulas de la etapa (b) en el mamffero.

En una modalidad, esta descripcion proporciona un metodo de tratamiento de una hemoglobinopatfa en un mamffero (por ejemplo un ser humano) que comprende introducir una composicion descrita en la presente descripcion que comprende celulas modificadas geneticamente aisladas que tienen al menos una modificacion genetica en la ubicacion 60,716,189 60,728,612 del cromosoma 2 de manera que la expresion de hemoglobina fetal aumenta en el mairnfero.

En una modalidad, esta descripcion proporciona un metodo de tratamiento de una hemoglobinopatfa en un mamffero (por ejemplo un ser humano) que comprende aumentar la expresion de hemoglobina fetal en el mamffero mediante el metodo descrito en la presente descripcion.

En una modalidad, la celula aislada o la poblacion aislada de celulas es/son celula(s) humana(s).

En una modalidad, la celula aislada o poblacion aislada de celulas es/son celula(s) progenitora(s).

En una modalidad, la celula humana es una celula progenitora hematopoyetica.

En una modalidad, la celula humana es una celula madre pluripotente inducida.

En una modalidad, la celula madre pluripotente inducida es una celula progenitora hematopoyetica.

En una modalidad, la progenitora hematopoyetica es una celula del linaje eritroide.

En una modalidad, la celula progenitora hematopoyetica o aislada se pone en contacto ex vivo o in vitro o in vivo.

En una modalidad, al menos una modificacion genetica es una delecion.

En una modalidad, la delecion elimina toda la region entre la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 o elimina una porcion de la region lo que da como resultado la interrupcion de uno o mas sitios hipersensibles a DNAsa 1 (DHS). En otra modalidad, la delecion comprende uno o mas de los sitios hipersensibles a DNAsa 1 (DHS) 62, 58, y 55 como se describe en la presente descripcion en la seccion de Ejemplos.

En otra modalidad, la delecion comprende uno o mas de los marcadores SNP descritos en la Tabla 2.

En otra modalidad, la delecion comprende uno o mas de los fragmentos enumerados en la Tabla 7.

En otra modalidad, la delecion elimina toda la region entre la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 o elimina una porcion de la region lo que da como resultado la interrupcion de uno o mas sitios hipersensibles a DNAsa 1 (DHS). En una modalidad, como se usa en la presente descripcion, el termino "porcion" en el contexto de delecion genomica es al menos 20 %-80 % de la region especificada.

En una modalidad adicional de cualquier metodo de tratamiento, el metodo comprende quimioterapia y/o terapia de radiacion para eliminar o reducir las celulas progenitoras o madre hematopoyeticas endogenas en el marnffero.

En una modalidad de cualquier metodo, las celulas en contacto que tienen al menos una modificacion genetica pueden crioconservarse y almacenarse hasta que las celulas sean necesarias para la administracion a un mamffero.

En una modalidad de cualquier metodo descrito, las celulas progenitoras o madre hematopoyeticas o celulas aisladas pueden sustituirse con unas iPSC descritas en la presente descripcion.

En una modalidad de cualquier metodo descrito, las celulas progenitoras o madre hematopoyeticas o iPSC o celulas aisladas son autologas para el mamffero, lo que significa que las celulas se derivan del mismo mamffero. En otra de las modalidades del metodo descrito, las celulas progenitoras o madre hematopoyeticas o iPSC o celulas aisladas no son autologas para el mamffero, lo que significa que las celulas no se derivan del mismo mamffero, sino de otro animal de la misma especie. Por ejemplo, el mamffero es un ser humano.

En una modalidad de cualquier metodo de tratamiento, el metodo comprende ademas seleccionar un mamffero que necesita un aumento de la expresion de hemoglobina fetal.

En una modalidad de cualquier metodo de tratamiento, el metodo comprende ademas seleccionar un mamffero que necesita tratamiento de una hemoglobinopatfa.

En cualquier modalidad de cualquier metodo de tratamiento descrito, la hemoglobinopatfa es una p-hemoglobinopatfa. En cualquier modalidad de cualquier metodo de tratamiento descrito, la hemoglobinopatfa es p-talasemia.

En cualquier modalidad de cualquier metodo de tratamiento descrito, la hemoglobinopatfa es anemia drepanocftica. Breve descripcion de las figuras

La Figura 1A muestra la distribucion de 636 SNP publicados previamente asociados con rasgos eritroides a P < 5 x 10-8 con respecto a secuencias promotoras, exonicas, intronicas, 3'UTR, e intergenicas. Para la comparacion, se muestra la distribucion genomica de estas regiones.

La Figura 1B es un grafico que representa la distribucion acumulada de las distancias de los 636 SNP asociados a rasgos eritroides con respecto al potenciador eritroide mas cercano. Los potenciadores eritroides se definieron por las secuencias a mas de 2 kb de los TSS de los genes anotados por Refseq con hipersensibilidad a DNAsa I, presencia de H3K4me1, ya sea H3K27ac o H3K9ac, y ausencia de H3K4me3 y H3K27me3. La distancia de la media ± SD de 50 conjuntos de 636 SNP asociados a rasgos no eritroides permutados aleatoriamente (de la base de datos de GWAS), SNP del arreglo de genotipificacion Affy 6.0, o SNP aleatorios tambien se representaron graficamente.

La Figura 2A muestra el analisis ChIP seguido de secuenciacion masiva en paralelo realizado a partir de precursores eritroides derivados de celulas CD34+ con anticuerpos para H3K27me3, H3K4me3, H3K4me1, H3K27ac, GATA1, TAL1, y PolII. Los nucleos aislados de precursores eritroides, cerebro fetal, y linfocitos B y T se sometieron a tratamiento con DNAsa I con determinacion de los sitios de escision mediante secuenciacion masiva en paralelo. Los SNP asociados a HbF incluyen los asociados con el nivel de HbF o el numero de celulas F a P < 5 x 10-8 y los SNP centinelas son aquellos con asociacion mas alta a HbF o al numero de celulas F en un analisis GWAS dado. Los tres DHS eritroides adyacentes se etiquetan como 62, 58, y 55 en base a la distancia en kb desde el TSS de BCL11A.

La Figura 2B muestra el analisis ChIP-qPCR de precursores eritroides humanos primarios en el intron 2 de BCL11A, normalizado a 1 % de cromatina inicial. Los DHS 62, 58, y 55 son de la Figura 2A sombreados. Se muestra el enriquecimiento en loci de control negativo (GAPDH, OCT4) y control positivo (LCR de p-globina HS3 y a-globina HS-40) para la comparacion.

La Figura 2C muestra la captura de la conformacion cromosomica realizada en precursores eritroides humanos primarios en el locus BCL11A con el uso del promotor de BCL11A como ancla. La frecuencia de interaccion se normaliza respecto a la interaccion LCR-HBB.

La Figura 3A muestra donantes anonimos sanos cuyas celulas madre/progenitoras hematopoyeticas estaban disponibles con genotipificacion en rs1427407 para identificar los individuos heterocigoticos. Se identificaron cinco donantes. Las celulas madre/progenitoras hematopoyeticas se sometieron a cultivo de diferenciacion eritroide. La cromatina se aislo a partir de eritroblastos, y se inmunoprecipito con GATA1 o TAL1. El ADN para ChIP o ADN inicial se sometio a una reaccion de pirosecuenciacion para cuantificar la abundancia relativa del alelo G de rs1427407.

La Figura 3B muestra los datos de donantes anonimos sanos cuyas celulas madre/progenitoras hematopoyeticas estaban disponibles con genotipificacion en rs1427407, rs7606173, y rs7569946 para identificar los individuos heterocigoticos para el haplotipo rs1427407-rs7606173 asf como rs7569946. Se identificaron tres donantes. El haplotipaje revelo que el alelo G de rs7569946 estaba en el mismo cromosoma que el alelo G de rs1427407 y el alelo C de rs7606173 en cada caso. Las celulas madre/progenitoras hematopoyeticas se sometieron a cultivo de diferenciacion eritroide. El ARN y el ADN genomico se aislaron, y el ADNc se produjo por transcripcion inversa. Las muestras de ADNg y ADNc pareadas se sometieron a una reaccion de pirosecuenciacion para cuantificar la abundancia relativa del alelo G de 7569946.

La Figura 3C muestra la media de HbF para los haplotipos rs1427407-rs7606173 en la cohorte CSSCD. El nivel medio de HbF fue 4,05 % (SD 3,10) en 213 individuos rs1427407-rs7606173 G-C, 7,08 % (SD 4,50) en 254 heterocigoticos rs1427407-rs7606173 T-G/G-C, y 11,21 % (SD 4,37) en 60 individuos rs1427407-rs7606173 T-G. Los valores de P corresponden a pruebas t de Student de una cola. Las frecuencias de los haplotipos en CSSCD son: TG: 24,5 %, TC 0,085 %, GC 42,3 %, GG 33,1 %.

Las figuras 4A-4C muestran los datos de un fragmento de 12,4 kb del intron 2 de BCL11A que abarca los DHS 62, 58 y 55 (que abarcan 52,0-64,4 kb desde el TSS) clonado corriente arriba de un promotor mmimo de Hsp68 y el gen reportero lacZ flanqueado por elementos aislantes de H19. Los embriones murinos transgenicos transitorios se generaron por inyeccion nuclear en la etapa de una celula.

La Figura 4A muestra un embrion transgenico transitorio E12,5 tenido con X-gal.

La Figura 4B muestra suspensiones celulares aisladas a partir de la sangre periferica y el hngado fetal de embriones transgenicos estables E12,5. Los centrifugados celulares se tineron con X-gal y la tincion de contraste se hizo con rojo nuclear.

La Figura 4C muestra los datos de eritroblastos de medula osea (CD71+/Ter119+) y linfocitos esplenicos (CD19+ para linfocitos B y CD3+ para linfocitos T) que se aislaron y se clasificaron a partir de transgenicos estables adultos jovenes. Las celulas se sometieron a tincion con X-gal o aislamiento de ARN seguido de RT-qPCR. La expresion genica se normalizo respecto a GAPDH, y se expreso con relacion a linfocitos T, que no expresan BCL11A ni lacZ.

Las figuras 5A-5C muestran celulas de eritroleucemia de raton (MEL) y celulas linfoides pro-B transfectadas con dos pares de TALEN cada una disenada para generar una DSB en cualquier extremo del potenciador eritroide ortologo de 10 kb del intron 2 de BCL11A de 50,4-+60,4 kb. Se aislaron los clones (denominados A50,4-60,4) con delecion bialelica del segmento de 10 kb.

La Figura 5A muestra la RT-qPCR de Bel11a realizada con pares de cebadores que reconocen las secuencias corriente arriba, que abarcan, y corriente abajo del intron 2.

La Figura 5B muestra una inmunotransferencia de A50,4-60,4 con anti-BCL11A.

La Figura 5C muestra la expresion genica de globinas en clones de MEL A50,4-60,4. Un par de cebadores comun reconoce las p-globinas p2 y p1 del adulto, mientras que cebadores independientes reconocen las p-globinas ey y pH1 embrionarias.

La Figura 6 muestra pronucleos de cigotos de raton inyectados con el constructo de reportero lacZ. Los embriones transgenicos se aislaron a E12,5. Los embriones se genotiparon por PCR de lacZ. Se informa la fraccion de embriones transgenicos con tincion por X-gal de tngado fetal.

La Figura 7 muestra fragmentos de secuencia de una a dos kb clonados en el constructo de potenciador con promotor mmimo de TK y GFP. Los constructos reporteros de potenciador se suministraron mediante vectores lentivirales a precursores eritroides humanos primarios. Las celulas transfectadas se seleccionaron por resistencia a puromicina. Se midio la intensidad de fluorescencia media de GFP.

La Figura 8 muestra los datos relacionados con el perfil de cromatina de celulas eritroides de raton que revela una firma de potenciador ortologo en el intron 2 de Bel11a. Las anotaciones en un sistema de coordenadas genomicas de raton se obtuvieron del perfil de cromatina eritroide de raton global publicado previamente, con modificaciones de histonas y escision por DNAsa-I y ChIP-seq de GATA1 y TAL1. El rectangulo de lmeas discontinuas limita la firma de potenciador ortologo que define el elemento A50,4-60,4 diana de la delecion mediada porTALEN.

La Figura 9A es una representacion esquematica de una estrategia de modificacion del genoma mediada por TALEN usada en la presente descripcion. Las TALEN son nucleasas espedficas de secuencia. Se modificaron geneticamente dos pares de TALEN para generar rupturas bicatenarias, una en Bcl11a 50,4 y la otra en 60,4. Se aislaron los clones que teman las dos DSB reparadas por NHEJ con escision del segmento de 10 kb intermedio. Los clones se tamizaron por PCR con cebadores 5', 3', internos y que abarcan la delecion de 10 kb.

La Figura 9B muestra la transferencia Southern de ADN genomico digerido con HindIII de clones A50,4-60,4 que corroboro que estos clones teman el alelo con la escision esperada y caredan de un alelo sin escision.

La Figura 9C muestra los clones A50,4-60,4 que tienen delecion bialelica del potenciador de BCL11A producida por NHEJ mediada porTALEN en celulas de eritroleucemia de raton (MEL) y celulas linfoides pro-B. Los histogramas muestran la amplificacion por PCR producida con el uso de los cebadores 5', 3', internos y que abarcan la delecion de 10 kb (ver los amplicones en la Figura 9A). Todos los clones A50,4-60,4 caredan de la amplificacion de Del-1 y Del-2, lo que indica la presencia de una delecion bialelica del potenciador eritroide de 10 kb del intron 2 de BCL11A de 50,4-+60,4 kb.

La Figura 10 muestra la secuenciacion de Sanger de los productos de PCR de los clones A50,4-60,4. Se muestra las secuencias de reconocimiento de TALEN izquierda y derecha de 5' (+50,4) y 3' (+60,4) con separadores intermedios. Algunos alelos mostraron evidencia de union de extremos directamente de cada secuencia de separador digerida mientras que otros alelos mostraron la perdida de cientos de nucleotidos adicionales. Solo un alelo de cada uno se aislo a partir del clon de MEL #1 y el clon de pro-B #2.

La Figura 11A muestra los datos de los genotipos obtenidos en 1.178 individuos de CSSCD para 38 variantes dentro de los DHS de BCL11A 62, 58 o 55. Asociaciones mas significativas con el nivel de HbF entre SNP (n = 10) comunes (MAF > 1 %) antes (rs1427407) o despues (rs7606173) del analisis condicional en rs1427407. Coordenadas de SNP cromosoma 2, construccion 19.

La Figura 11B los analisis de asociacion con HbF en BCL11A. Los datos de los genotipos se obtuvieron en 1.178 individuos de CSSCD para 38 variantes dentro de los DHS de BCL11A 62, 58 o 55. Los SNP centinelas son aquellos con la asociacion mas alta con el nivel de HbF o con el numero de celulas F en GWAS previos (7-12). Estos SNP se muestran con respecto al intron 2 de BCL11A con los 3 DHS 62, 58 y 55 indicados.

Descripcion Detallada

Los metodos y composiciones descritos en la presente descripcion se refieren, en parte, al descubrimiento de una region reguladora distal corriente arriba del gen de BCL11A que puede regular la expresion proteica BCL11A. La protema BCL11A actua como un regulador espedfico de etapa de la expresion de hemoglobina fetal mediante la represion de la induccion de Y-globina. Por consiguiente, los metodos y composiciones proporcionados en la presente descripcion son metodos nuevos para la regulacion de la expresion de Y-globina en celulas eritroides. Mas espedficamente, estas actividades pueden utilizarse en metodos para el tratamiento de p-hemoglobinopatfas mediante la induccion de Y-globina por medio de la inhibicion del producto del gen de BCL11A.

En una modalidad, en la presente descripcion se proporciona un metodo para producir una celula progenitora aislada que tiene disminucion del ARNm o la expresion proteica de BCL11A, el metodo comprende poner en contacto una celula progenitora aislada con un agente que se une al ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genomico de la UCSC), para reducir de este modo el ARNm o la expresion proteica de BCL11A.

En una modalidad, en la presente descripcion se proporciona un metodo para producir una celula progenitora aislada que tiene disminucion del ARNm o la expresion proteica de BCL11A, el metodo comprende proporcionar una celula progenitora aislada y poner en contacto la celula progenitora aislada con un agente que se une al ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genomico de la UCSC), para reducir de este modo el ARNm o la expresion proteica de BCL11A.

En una modalidad, en la presente descripcion se proporciona un metodo para producir una celula progenitora aislada que tiene disminucion del ARNm o la expresion proteica de BCL11A, el metodo comprende poner en contacto una celula progenitora aislada con un agente que produce una modificacion epigenetica en el ADN genomico de la celula en el cromosoma 2 para reducir de este modo el ARNm o la expresion proteica de BCL11A. En una modalidad, la modificacion epigenetica en el ADN genomico es en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genomico de la UCSC).

En una modalidad, en la presente descripcion se proporciona un metodo para producir una celula progenitora aislada que tiene disminucion del ARNm o la expresion proteica de BCL11A, el metodo comprende proporcionar una celula progenitora aislada y poner en contacto la celula progenitora aislada con un agente que produce una modificacion epigenetica en el ADN genomico de la celula en el cromosoma 2 para reducir de este modo el ARNm o la expresion proteica de BCL11A. En una modalidad, la modificacion epigenetica en el ADN genomico es en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genomico de la UCSC).

La descripcion descrita en la presente descripcion, en una modalidad preferida, no se refiere a un proceso para clonar seres humanos, a procesos para modificar la identidad genetica de la lmea germinal de seres humanos, a usos de embriones humanos para propositos industriales o comerciales o a procesos para modificar la identidad genetica de animales que probablemente les provoque sufrimiento sin ningun beneficio medico sustancial para el hombre o animal, y tambien animales que son el resultado de tales procesos.

En la presente descripcion se describe un metodo para producir una celula humana modificada geneticamente aislada que tiene al menos una modificacion genetica que comprende poner en contacto la celula con una cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genomico de la UCSC) lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta.

En la presente descripcion se proporciona un metodo para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en una celula aislada, el metodo comprende disminuir el ARNm o la expresion proteica de BCL11A en la celula. En una modalidad, la disminucion del ARNm o la expresion proteica de BCL11A se logra provocando al menos una modificacion genetica en el ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genomico de la UCSC). En otra modalidad, la disminucion del ARNm o la expresion proteica de BCL11A se logra provocando al menos una modificacion genetica en el ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 que da como resultado la modificacion epigenetica de la funcion genetica en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2. En esta modalidad, la actividad del potenciador de BCL11A ubicado dentro de esta ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 se reduce. Mediante la disminucion en esta modalidad, la actividad del potenciador en el aumento del ARNm o la expresion proteica de BCL11A en la celula es al menos 5 % menor es al menos 10 % menor, al menos 20 % menor, al menos 30 % menor, al menos 40 % menor, al menos 50 % menor, al menos 60 % menor, al menos 70 % menor, al menos 80 % menor, al menos 90 % menor, al menos 1 vez menor, al menos 2 veces menor, al menos 5 veces menor, al menos 10 veces menor, al menos 100 veces menor, al menos 1.000 veces menor, o mas en comparacion con una celula de control que no se trata en ningun metodo descrito en la presente descripcion. Por disminucion del ARNm o la expresion proteica de BCL11A en la celula se entiende que la expresion proteica es al menos 5 % menor es al menos 10 % menor, al menos 20 % menor, al menos 30 % menor, al menos 40 % menor, al menos 50 % menor, al menos 60 % menor, al menos 70 % menor, al menos 80 % menor, al menos 90 % menor, al menos 1 vez menor, al menos 2 veces menor, al menos 5 veces menor, al menos 10 veces menor, al menos 100 veces menor, al menos 1.000 veces menor, o mas en comparacion con una celula de control que no se trata en ningun metodo descrito en la presente descripcion.

En la presente descripcion se proporciona un metodo para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en una celula aislada, el metodo comprende proporcionar una celula humana o celula progenitora aislada y disminuir el ARNm o la expresion proteica de BCL11A en la celula.

En la presente descripcion se proporciona un metodo para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en una celula, el metodo comprende las etapas de: poner en contacto una celula humana aislada con una cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genomico de la UCSC) lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta, de manera que la expresion de hemoglobina fetal aumenta en la celula, o su progenie, con relacion a la celula antes del contacto.

En la presente descripcion se proporciona un metodo para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en una celula, el metodo comprende las etapas de proporcionar una celula humana o celula progenitora aislada, poner en contacto una celula humana o celula progenitora aislada con una cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genomico de la UCSC) lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta, de manera que la expresion de hemoglobina fetal aumenta en la celula, o su progenie, con relacion a la celula antes del contacto.

En la presente descripcion se describe un metodo para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en un mairnfero que lo necesita, el metodo comprende disminuir el ARNm o la expresion proteica de BCL11A en una celula progenitora hematopoyetica en el mamnfero. En una modalidad, la disminucion del ARNm o la expresion proteica de BCL11A se logra provocando al menos una modificacion genetica en el ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genomico de la UCSC). En otra modalidad, la disminucion del ARNm o la expresion proteica de BCL11A se logra provocando al menos una modificacion epigenetica en el ADN genomico de la celula en el cromosoma 2. En otra modalidad, la disminucion del ARNm o la expresion proteica de BCL11A se logra provocando al menos una modificacion epigenetica en el ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2.

En la presente descripcion se describe un metodo para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en un mairnfero que lo necesita, el metodo comprende proporcionar una celula humana o celula progenitora aislada de un mamnfero y disminuir el ARNm o la expresion proteica de BCL11A en la celula. En una modalidad, el metodo comprende ademas seleccionar un marnffero que necesita un aumento de los niveles de hemoglobina fetal.

En la presente descripcion se describe un metodo para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en un mamffero que lo necesita, el metodo comprende las etapas de poner en contacto una celula progenitora hematopoyetica en el mamffero con una cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genomico de la UCSC) lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta, de manera que la expresion de hemoglobina fetal aumenta en el mamnfero, con relacion a la expresion antes del contacto. En la presente descripcion se describe un metodo para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en un mamffero que lo necesita, el metodo comprende las etapas de proporcionar una celula humana o celula progenitora aislada o una poblacion aislada de celulas progenitoras hematopoyeticas de un mamffero poner en contacto la celula humana o celula progenitora o celula progenitora hematopoyetica con una cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genomico de la UCSC) lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta, de manera que la expresion de la hemoglobina fetal aumenta en dicho mamffero, con relacion a la expresion antes del contacto.

En la presente descripcion se proporciona un metodo para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en un mamffero que lo necesita, el metodo comprende trasplantar una celula humana modificada geneticamente como se describe en la presente descripcion en el mamffero.

En una modalidad, el metodo comprende ademas proporcionar una celula aislada o una celula progenitora aislada o una poblacion aislada de celulas que puede ser una celula progenitora o celula progenitora hematopoyetica.

En una modalidad, la celula aislada es una celula progenitora aislada.

En una modalidad, la celula progenitora aislada es una celula humana aislada.

En una modalidad, la celula humana aislada es una celula progenitora hematopoyetica.

En otra modalidad, la celula hematopoyetica es una celula del linaje eritroide. Los metodos para aislar celulas progenitoras hematopoyeticas se conocen bien en la tecnica, por ejemplo, mediante la purificacion por citometna de flujo de celulas CD34+ o CD133+, microesferas conjugadas con anticuerpos contra CD34 o CD133, marcadores de celula progenitora hematopoyetica. Se dispone ademas de kits comerciales, por ejemplo, el kit de microesferas para CD34, humano, y el kit CD34 MultiSort, humano, de MACS® Technology y el kit de enriquecimiento de celulas progenitoras hematopoyeticas de raton EasySep™ de STEMCELL™ Technology.

En otra modalidad, la celula humana es una celula madre pluripotente inducida (iPSC).

En otra modalidad, el contacto de cualquier celula descrita en la presente descripcion puede ser ex vivo o in vitro o in vivo. En otra modalidad, el contacto de cualquier celula descrita en la presente descripcion comprende poner en contacto con un agente que se une al ADN genomico de la celula en el cromosoma 2 y produce una modificacion epigenetica en el genoma de la celula en el cromosoma 2, para reducir de este modo el ARNm o la expresion proteica de BCL11A. En una modalidad, la modificacion epigenetica es en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genomico de la UCSC).

En una modalidad, al menos una modificacion epigenetica en el ADN genomico de la celula en el cromosoma 2 afecta directa o indirectamente la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2.

Como se usa en la presente descripcion, "que afecta indirectamente la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2" se refiere a efectos a larga distancia de la modificacion epigenetica en el ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2.

En otra modalidad, el contacto de cualquier celula descrita en la presente descripcion comprende el contacto con un agente que se une al ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genomico de la UCSC), y produce una modificacion epigenetica en el cromosoma 2, para reducir de este modo el ARNm o la expresion proteica de BCL11A.

En otra modalidad, el contacto de cualquier celula descrita en la presente descripcion comprende el contacto con una cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una enzima dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una enzima dirigida a ADN de manera que la enzima dirigida a ADN produce una modificacion epigenetica en el cromosoma 2, para reducir de este modo el ARNm o la expresion proteica de BCL11A.

En otra modalidad, el contacto de cualquier celula descrita en la presente descripcion comprende el contacto con una cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una enzima dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una enzima dirigida a ADN de manera que la enzima dirigida a ADN produce una modificacion epigenetica en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genomico de la UCSC) para reducir de este modo el ARNm o la expresion proteica de BCL11A. En una modalidad, la expresion de hemoglobina fetal aumenta en el mairnfero, con relacion a la expresion antes del contacto.

En otra modalidad, la celula progenitora hematopoyetica, la celula humana aislada, o la celula aislada se pone en contacto ex vivo o in vitro.

En otra modalidad, al menos una modificacion genetica es una delecion.

En otra modalidad, la delecion comprende uno o mas de los sitios hipersensibles a DNAsa 1 (DHS) 62, 58, y 55 como se describe en la presente descripcion en la seccion de Ejemplos. En otra modalidad, la delecion consiste esencialmente en uno o mas de los sitios hipersensibles a DNAsa 1 (DHS) 62, 58, y 55 como se describe en la presente descripcion en la seccion de Ejemplos. En otra modalidad, la delecion consiste en uno o mas de los sitios hipersensibles a DNAsa 1 (DHS) 62, 58, y 55 como se describe en la presente descripcion en la seccion de Ejemplos.

En otra modalidad, la modificacion epigenetica comprende o afecta uno o mas de los sitios hipersensibles a DNAsa 1 (DHS) 62, 58, y 55 como se describe en la presente descripcion en la seccion de Ejemplos. Como se usa en la presente descripcion, la frase "afecta uno o mas de los sitios hipersensibles a DNAsa 1" significa que la funcion natural de estos sitios hipersensibles a DNAsa 1 (DHS) 62, 58, y 55 se reduce, por ejemplo, el acceso a factores de transcripcion o enzimas de degradacion del ADN tales como DNAsa I. En general, los sitios hipersensibles a DNAsa I (DHS) son regiones de la cromatina que son sensibles a la escision por la enzima DNAsa I. En estas regiones espedficas del genoma, la cromatina ha perdido su estructura condensada, lo que expone el ADN, y lo hace accesible. Esto aumenta la disponibilidad del ADN para la degradacion por enzimas, como la DNAsa I. Estas zonas accesibles de la cromatina se relacionan funcionalmente con la actividad transcripcional, dado que este estado remodelado es necesario para la union de protemas tales como factores de transcripcion. Por consiguiente, la modificacion epigenetica contemplada en la presente descripcion da como resultado una reduccion del acceso a enzimas de degradacion del ADN que es al menos 5 % menor es al menos 10 % menor, al menos 20 % menor, al menos 30 % menor, al menos 40 % menor, al menos 50 % menor, al menos 60 % menor, al menos 70 % menor, al menos 80 % menor, al menos 90 % menor, al menos 1 vez menor, al menos 2 veces menor, al menos 5 veces menor, al menos 10 veces menor, al menos 100 veces menor, al menos 1.000 veces menor, o mas en comparacion con una celula de control que no se trata en ningun metodo descrito en la presente descripcion.

En otra modalidad, la delecion comprende uno o mas de los marcadores SNP descritos en la Tabla 2. En otra modalidad, la delecion consiste esencialmente en uno o mas de los marcadores SNP descritos en la Tabla 2. En otra modalidad, la delecion consiste en uno o mas de los marcadores SNP descritos en la Tabla 2.

En otra modalidad, la modificacion epigenetica comprende o afecta uno o mas de los marcadores SNP descritos en la Tabla 2. Como se usa en la presente descripcion, la frase "afecta uno o mas de los marcadores SNP" significa que la(s) funcion(ones) natural(es) de estos SNP se reduce(n), por ejemplo, el acceso a factores de transcripcion. Por ejemplo, la metilacion de estos SNP reducina la union de factores de transcripcion, lo que conduce a una reduccion del ARNm o la expresion proteica de BCL11A.

En otra modalidad, la delecion comprende uno o mas de los fragmentos enumerados en la Tabla 7. En otra modalidad, la delecion consiste esencialmente en uno o mas de los fragmentos enumerados en la Tabla 7. En otra modalidad, la delecion consiste en uno o mas de los fragmentos enumerados en la Tabla 7. En otra modalidad, la delecion es de 60,716,189 a 60,728,612, de 60,716,189 a 60,723,870, de 60,722,992 a 60,728,612, de 60,717,236 a 60,719,036, de 60,722,006 a 60,723,058, de 60,724,917 a 60,726,282, de 60,616,396 a 60,618,032, de 60,623,536 a 60,624,989, de 60,626,565 a 60,628,177, de 60,717,236 a 60,719,036, de 60,721,212 a 60,722,958, de 60,724,780 a 60,726,471, de 60,739,075 a 60,740,154, de 60,748,003 a 60,749,009, de 60,826,438 a 60,827,601, o de 60,831,589 a 60,833,556.

En otra modalidad, la modificacion epigenetica comprende o afecta uno o mas de los fragmentos enumerados en la Tabla 7. Como se usa en la presente descripcion, la frase "afecta uno o mas de los fragmentos enumerados en la Tabla 7" significa que la(s) funcion(ones) natural(es) de estos fragmentos se reduce, por ejemplo, el acceso a factores de transcripcion. Por ejemplo, la metilacion de estos fragmentos reducina la union de factores de transcripcion, lo que conduce a una reduccion del ARNm o la expresion proteica de BCL11A.

En otra modalidad, la modificacion epigenetica es de 60,716,189 a 60,728.612, de 60,716,189 a 60,723.870, de 60,722,992 a 60,728,612, de 60,717,236 a 60,719,036, de 60,722,006 a 60,723,058, de 60,724,917 a 60,726,282, de 60,616,396 a 60,.618,032, de 60,623,536 a 60,624,989, de 60,626,565 a 60,628,177, de 60,717,236 a 60,719,036, de 60,721,212 a 60,722,958, de 60,724,780 a 60,726,471, de 60,739,075 a 60,740,154, de 60,748,003 a 60,749,009, de 60,826,438 a 60,827,601, o de 60,831,589 a 60,833,556.

En otra modalidad, la delecion elimina toda la region entre la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 o elimina una porcion de la region lo que da como resultado la interrupcion de uno o mas sitios hipersensibles a DNAsa 1 (DHS). Como se usa en la presente descripcion, el termino "interrupcion" se refiere a una disminucion en la transcripcion eritroide de BCL11A en una celula que comprende una interrupcion de uno o mas sitios hipersensibles a DNAsa-1 en al menos 10 % (por ejemplo, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 % o incluso 100 % (es dear, transcripcion eritroide no detectable)) en comparacion con una celula que no tiene una interrupcion de este tipo. En una modalidad, la interrupcion comprende una incapacidad de un sitio hipersensible a DNAsa-1 modificado de unirse a sus factores de transcripcion nativos (por ejemplo, GATA1 y TAL1).

En otra modalidad, la modificacion epigenetica que interfiere con el establecimiento y/o mantenimiento de la firma epigenetica en la region potenciadora en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genomico de la UCSC) conduce de este modo a una reduccion del ARNm o la expresion proteica de BCL11A, y aumenta la expresion de hemoglobina fetal en el mairnfero.

En una modalidad, la modificacion epigenetica que interfiere con el establecimiento y/o mantenimiento de la firma epigenetica en la region potenciadora en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genomico de la UCSC) incluye pero no se limita a modificaciones epigeneticas que afectan la sensibilidad a DNAsa I, modificaciones epigeneticas que afectan las modificaciones a las histonas, modificaciones epigeneticas que afectan la union a GATA1/TAL1, y modificaciones epigeneticas que afectan la interaccion promotora de largo alcance del promotor de BCL11A.

Por ejemplo, una modificacion epigenetica que interfiere con el establecimiento y/o mantenimiento de la firma epigenetica en la region potenciadora en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 incluye pero no se limita a al menos una delecion dentro de la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 de modo que la funcion global de esta region se afecta de manera que el ARNm y la expresion de BCL11A se reduce o disminuye. Por ejemplo, la delecion es en las regiones de sensibilidad a DNAsal en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2, por ejemplo, 62, 58, y 55. La delecion podna ser en 62 o 58 o 55 o sus combinaciones. Por ejemplo, en 62 y 58, 58 y 55, 62 y 55, o en los tres 62, 58, y 55.

Como otro ejemplo, una modificacion epigenetica que interfiere con el establecimiento y/o mantenimiento de la firma epigenetica en la region potenciadora en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 incluye pero no se limita a cambios en las modificaciones a las histonas en el cromosoma 2 que no estan en la ubicacion 60,716,189-60,728.612, o cambios en las modificaciones a las histonas en el cromosoma 2 en la ubicacion 60,716,189-60,728.612, o tanto modificaciones a las histonas en el cromosoma 2 que no estan en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 asf como en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 de modo que la funcion global de esta region se afecta de manera que el ARNm y la expresion de BCL11A se reduce o disminuye.

En otra modalidad, una modificacion epigenetica que interfiere con el establecimiento y/o mantenimiento de la firma epigenetica en la region potenciadora en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 incluye pero no se limita a una insercion de al menos una secuencia espedfica de represor modificada geneticamente que cambia las caractensticas epigeneticas de los elementos no codificantes en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 y por lo tanto da como resultado la represion de la expresion del gen diana. Lo primero se centra espedficamente en reprimir epigeneticamente potenciadores individuales. En otras palabras, la insercion de secuencias espedficas de represor modificadas geneticamente en el cromosoma 2 podna posiblemente interferir con la modificacion epigenetica en el potenciador eritroide de BCL11A lo que eventualmente conduce a una reduccion de la expresion del gen de BCL11A.

Cualquiera de los metodos conocidos en la tecnica puede usarse para producir la modificacion epigenetica contemplada. Por ejemplo, como se describe en Mendenhall E. M. y otros, Nat. Biotechnol. 08 de septiembre de 2013, y Maeder ML y otros, Nat Biotechnol. 09 de octubre de 20132013.

En una modalidad, la insercion de al menos una secuencia espedfica de represor modificada geneticamente en cualquier ubicacion del cromosoma 2 da como resultado pero no se limita a la reduccion de regiones de sensibilidad a DNAsal en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2, por ejemplo, 62, 58, y 55; el aumento de las modificaciones a las histonas en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2; la reduccion de la union de factores de transcripcion al GATA1/TAL1 de la region potenciadora en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2; y reduccion o debilitamiento de la interaccion entre la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 con el promotor de BCL11A.

En una modalidad, el efecto global de la insercion de al menos una secuencia espedfica de represor modificada geneticamente en cualquier ubicacion del cromosoma 2 es la reduccion o disminucion del ARNm y la expresion de BCL11A.

En algunas modalidades, como se usa en el contexto del ARNm y la expresion de BCL11A, la interaccion entre la ubicacion 60.716.189- 60,728,612 del cromosoma 2 o potenciador de BCL11A con el promotor de BCL11A, y factores de transcripcion que se unen al GATA1/TAL1 de la region potenciadora, el termino "reduccion" o "disminucion" se refiere a al menos 5 % menor al menos 10 % menor, al menos 20 % menor, al menos 30 % menor, al menos 40 % menor, al menos 50 % menor, al menos 60 % menor, al menos 70 % menor, al menos 80 % menor, al menos 90 % menor, al menos 1 vez menor, al menos 2 veces menor, al menos 5 veces menor, al menos 10 veces menor, al menos 100 veces menor, al menos 1.000 veces menor, o mas en comparacion con la situacion de control que es la ausencia de la modificacion epigenetica o de la insercion de las secuencias modificadas geneticamente descritas en la presente descripcion. Por disminucion del ARNm o la expresion proteica de BCL11A en la celula se entiende que la expresion proteica es al menos 5 % menor es al menos 10 % menor, al menos 20 % menor, al menos 30 % menor, al menos 40 % menor, al menos 50 % menor, al menos 60 % menor, al menos 70 % menor, al menos 80 % menor, al menos 90 % menor, al menos 1 vez menor, al menos 2 veces menor, al menos 5 veces menor, al menos 10 veces menor, al menos 100 veces menor, al menos 1.000 veces menor, o mas en comparacion con una celula de control que no tiene la modificacion epigenetica o la insercion de las secuencias modificadas geneticamente descritas en la presente descripcion.

En una modalidad, la insercion de al menos una secuencia espedfica de represor modificada geneticamente se produce dentro de las regiones de sensibilidad a DNAsal de la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2, por ejemplo, 62, 58, y 55. La insercion podna ser en el extremo 5' de 62 o 58 o 55 o en el extremo 3' de 62 o 58 o 55, o entre 62 y 58, o entre 58 y 55, o entre 55 y 62.

En una modalidad, la insercion de al menos una secuencia espedfica de represor modificada geneticamente cambia las regiones de sensibilidad a DNAsal de la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2.

En una modalidad, las modificaciones epigeneticas cambian las regiones de sensibilidad a DNAsal de la ubicacion 60.716.189- 60,728,612 del cromosoma 2.

En una modalidad, las modificaciones epigeneticas cambian las modificaciones a las histonas en la ubicacion 60,716,189 60,728,612 del cromosoma 2.

En una modalidad, la insercion de al menos una secuencia espedfica de represor modificada geneticamente cambia las modificaciones a las histonas en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2.

En una modalidad, las modificaciones epigeneticas cambian la union a GATA1/TAL1 de la region potenciadora en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 de modo que la funcion global de esta region se afecta de manera que el ARNm y la expresion de BCL11A se reduce o disminuye. Por ejemplo, la union de factores de transcripcion al GATA1/TAL1.

En una modalidad, la insercion de al menos una secuencia espedfica de represor modificada geneticamente se produce dentro del GATA1/TAL1 como se describe en la presente descripcion. La insercion puede ser en el extremo 5' o el extremo 3' de GATA1 o TAL1. La insercion puede ser entre GATA1 y TAL1. La insercion cambia la union a GATA1/TAL1 de la region potenciadora en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 de modo que la funcion global de esta region se afecta de manera que el ARNm y la expresion de BCL11A se reduce o disminuye. Por ejemplo, la union de factores de transcripcion al GATA1/TAL1.

En una modalidad, la modificacion epigenetica cambia la interaccion entre el potenciador de BCL11A y el promotor de BCL11A. En una modalidad, la interaccion se reduce o se debilita de modo que la funcion global de esta region se afecta de manera que el ARNm y la expresion de BCL11A se reduce o disminuye.

En una modalidad, las modificaciones epigeneticas cambian la interaccion entre la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 con el promotor de BCL11A. En una modalidad, la interaccion se reduce o se debilita de modo que la funcion global de esta region se afecta de manera que el ARNm y la expresion de BCL11A se reduce o disminuye.

En la presente descripcion se proporciona ademas una celula humana modificada geneticamente aislada que tiene al menos una modificacion genetica en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genomico de la UCSC) producida mediante el proceso de poner en contacto la celula con una cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta.

En una modalidad, la celula humana modificada geneticamente aislada tiene al menos una modificacion epigenetica en el ADN genomico de la celula en el cromosoma 2. En otra modalidad, la celula humana modificada geneticamente aislada tiene al menos una modificacion epigenetica en el ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2.

En algunas modalidades de cualquiera de estas celulas humanas modificadas geneticamente aisladas que tienen al menos una modificacion epigenetica, las celulas se trasplantan en un mairnfero para el uso en el aumento de la hemoglobina fetal en el marnffero.

En una modalidad, la celula humana modificada geneticamente aislada que tiene al menos una modificacion genetica en el ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 se trasplanta en un mamffero para el uso en el aumento de la hemoglobina fetal en el mamffero.

En una modalidad, la celula humana modificada geneticamente aislada que tiene al menos una modificacion genetica en el ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 se almacena porcrioconservacion para su uso posterior.

En algunas modalidades de cualquiera de las celulas humanas modificadas geneticamente aisladas que tienen al menos una modificacion epigenetica, las celulas se almacenan por crioconservacion para su uso posterior.

En una modalidad, la celula humana modificada geneticamente aislada que tiene al menos una modificacion genetica en el ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 se crioconserva, se congela y se trasplanta en un mamffero para el uso en el aumento de la hemoglobina fetal en el mamffero.

En algunas modalidades de cualquiera de las celulas humanas modificadas geneticamente aisladas que tienen al menos una modificacion epigenetica, se crioconservan, se descongelan y se trasplantan en un mamffero para el uso en el aumento de la hemoglobina fetal en el mamffero.

Otra modalidad proporcionada en la presente descripcion se refiere a una composicion que comprende celulas humanas modificadas geneticamente aisladas, en donde las celulas tienen al menos una modificacion genetica en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genomico de la UCSC) producida mediante el proceso de poner en contacto las celulas con una cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genomico de la UCSC) lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta.

Otra modalidad proporcionada en la presente descripcion se refiere a una composicion que comprende celulas humanas modificadas geneticamente aisladas, en donde las celulas tienen al menos una modificacion epigenetica en el cromosoma 2. En una modalidad, al menos una modificacion epigenetica en el cromosoma 2 es en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genomico de la UCSC). En otra modalidad, al menos una modificacion epigenetica en el cromosoma 2 se produce mediante el proceso de poner en contacto las celulas con una cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una enzima dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una enzima dirigida a ADN de manera que la enzima dirigida a ADN produce al menos una modificacion epigenetica en el ADN genomico de la celula en el cromosoma 2 que afecta la ubicacion 60,716,189 60,728,612 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genomico de la UCSC).

En una modalidad, la composicion provoca un aumento en el ARNm o la expresion proteica de hemoglobina fetal en la celula en contacto.

En una modalidad, las celulas de cualquiera de las composiciones descritas son autologas, para el mamffero que es el receptor de las celulas en un procedimiento de trasplante, es decir, las celulas de la composicion se derivan o se cosechan del mamffero antes de cualquier modificacion descrita.

En una modalidad, las celulas de cualquiera de las composiciones descritas no son autologas para el mamffero que es el receptor de las celulas en un procedimiento de trasplante, es decir, las celulas de la composicion no se derivan o se cosechan del mamffero antes de cualquier modificacion descrita.

En una modalidad, las celulas de cualquiera de las composiciones descritas estan en el tipo de HLA mmimo coincidente con el mamffero que es el receptor de las celulas en un procedimiento de trasplante.

En una modalidad, las celulas de cualquiera de las composiciones descritas son celulas progenitoras aisladas antes de cualquier modificacion descrita.

En una modalidad, las celulas de cualquiera de las composiciones descritas son celulas progenitoras hematopoyeticas aisladas antes de cualquier modificacion descrita.

En una modalidad, las celulas de cualquiera de las composiciones descritas son celulas madre pluripotentes inducidas aisladas antes de cualquier modificacion descrita.

En otra modalidad, la delecion comprende uno o mas de los sitios hipersensibles a DNAsa 1 (DHS) 62, 58, y 55 como se describe en la presente descripcion en la seccion de Ejemplos. En otra modalidad, la delecion consiste esencialmente en uno o mas de los sitios hipersensibles a DNAsa 1 (DHS) 62, 58, y 55 como se describe en la presente descripcion en la seccion de Ejemplos. En otra modalidad, la delecion consiste en uno o mas de los sitios hipersensibles a DNAsa 1 (DHS) 62, 58, y 55 como se describe en la presente descripcion en la seccion de Ejemplos. En una modalidad, como se usa en la presente descripcion, el termino "porcion" en el contexto de delecion genomica es al menos 10 % a aproximadamente 100 % de la region especificada. En otras modalidades, la porcion eliminada es al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 % o incluso 100 % de la region especificada.

En otra modalidad, la delecion elimina toda la region entre la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genomico de la UCSC) o elimina una porcion de la region lo que da como resultado la interrupcion de uno o mas sitios hipersensibles a DNAsa 1 (DHS).

En una modalidad, el metodo comprende ademas seleccionar un mairnfero que necesita un aumento de hemoglobina fetal.

En una modalidad, el marnffero se ha diagnosticado con una hemoglobinopatfa.

En una modalidad, el mamffero que necesita un aumento de hemoglobina fetal se ha diagnosticado con una hemoglobinopatfa.

En una modalidad, la hemoglobinopatfa es una p-hemoglobinopatfa.

En una modalidad, la hemoglobinopatfa es la drepanocitosis.

En una modalidad, la hemoglobinopatfa es p-talasemia.

En una modalidad, la celula en contacto, la celula humana, la celula progenitora hematopoyetica o su progenie se administra al mamffero.

En una modalidad, esta descripcion proporciona un metodo para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en un mamffero que lo necesita, el metodo comprende las etapas de proporcionar una poblacion aislada de celulas progenitoras hematopoyeticas o celulas madre hematopoyeticas del mamffero ex vivo, y poner en contacto la poblacion de celulas progenitoras o madre hematopoyeticas con una cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta, de manera que la expresion de hemoglobina fetal aumenta en el marnffero, con relacion a la expresion antes del contacto. En una modalidad adicional de este metodo, la poblacion de celulas progenitoras o madre hematopoyeticas en contacto que tienen aumento de la expresion de hemoglobina fetal se crioconserva y se almacena o se reintroduce en el mamffero. En otra modalidad, la poblacion de celulas progenitoras o madre hematopoyeticas crioconservadas que tienen aumento de la expresion de hemoglobina fetal se descongela y despues se reintroduce en el mamffero. En una modalidad adicional de este metodo, el metodo comprende quimioterapia y/o terapia de radiacion para eliminar o reducir las celulas progenitoras o madre hematopoyeticas endogenas en el mamffero. En cualquiera de las modalidades del metodo descrito, las celulas progenitoras o madre hematopoyeticas pueden sustituirse con unas iPSC descritas en la presente descripcion.

En una modalidad, esta descripcion proporciona un metodo para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en un mamffero que lo necesita, el metodo comprende las etapas de aislar una poblacion de celulas progenitoras hematopoyeticas o celulas madre hematopoyeticas del mamffero, y poner en contacto ex vivo la poblacion de celulas progenitoras o madre hematopoyeticas con una cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta, de manera que la expresion de hemoglobina fetal aumenta en el mairnfero, con relacion a la expresion antes del contacto. En una modalidad adicional de este metodo, la poblacion de celulas progenitoras o madre hematopoyeticas en contacto ex vivo que tienen aumento de la expresion de hemoglobina fetal se crioconserva y se almacena o se reintroduce en el marnffero. En otra modalidad, la poblacion de celulas progenitoras o madre hematopoyeticas crioconservadas que tienen aumento de la expresion de hemoglobina fetal se descongela y despues se reintroduce en el mamffero. En una modalidad adicional de este metodo, el metodo comprende quimioterapia y/o terapia de radiacion para eliminar o reducir las celulas progenitoras o madre hematopoyeticas endogenas en el mamffero. En cualquiera de las modalidades del metodo descrito, las celulas progenitoras o madre hematopoyeticas pueden sustituirse con unas iPSC derivadas del mamffero. En cualquier modalidad del metodo, el metodo comprende ademas seleccionar un mamffero que necesita un aumento de la expresion de hemoglobina fetal.

En una modalidad, esta descripcion proporciona un metodo para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en un mamffero que lo necesita, el metodo comprende las etapas de aislar una poblacion de celulas progenitoras hematopoyeticas o celulas madre hematopoyeticas del mamffero y eliminar el ADN genomico de las celulas en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta, de manera que la expresion de la hemoglobina fetal aumenta en dicho mamffero, con relacion a la expresion antes de dicho contacto. En una modalidad adicional de este metodo, la poblacion de celulas progenitoras o madre hematopoyeticas con delecion de ADN genomico y que tienen aumento de la expresion de hemoglobina fetal se crioconserva y se almacena o se reintroduce en el mamffero. En otra modalidad, la poblacion de celulas progenitoras o madre hematopoyeticas con delecion de ADN genomico y que tienen aumento de la expresion de hemoglobina fetal se descongela y despues se reintroduce en el mamnfero. En una modalidad adicional de este metodo, el metodo comprende quimioterapia y/o terapia de radiacion para eliminar o reducir las celulas progenitoras o madre hematopoyeticas endogenas en el mamffero. En cualquiera de las modalidades del metodo descrito, las celulas progenitoras o madre hematopoyeticas pueden sustituirse con unas iPSC descritas en la presente descripcion. En cualquiera de las modalidades del metodo descrito, las celulas progenitoras o madre hematopoyeticas o iPSC son analogas para el mamffero, lo que significa que las celulas se derivan del mismo mamffero. En otra de las modalidades del metodo descrito, las celulas progenitoras o madre hematopoyeticas o iPSC no son analogas para el mamffero, lo que significa que las celulas no se derivan del mismo mamffero, sino de otro animal de la misma especie. Por ejemplo, el mamffero es un ser humano. En cualquier modalidad del metodo, el metodo comprende ademas seleccionar un mamffero que necesita un aumento de la expresion de hemoglobina fetal.

En una modalidad, esta descripcion proporciona un metodo para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en un mamffero que lo necesita, el metodo comprende las etapas de aislar una poblacion de celulas progenitoras hematopoyeticas o celulas madre hematopoyeticas del mamffero y ex vivo eliminar el ADN genomico de las celulas en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta, de manera que la expresion de la hemoglobina fetal aumenta en dicho marnffero, con relacion a la expresion antes de dicho contacto. En una modalidad adicional de este metodo, la poblacion de celulas progenitoras o madre hematopoyeticas con delecion de ADN genomico y que tienen aumento de la expresion de hemoglobina fetal se crioconserva y se almacena o se reintroduce en el mamnfero. En otra modalidad, la poblacion de celulas progenitoras o madre hematopoyeticas crioconservadas que tienen aumento de la expresion de hemoglobina fetal se descongela y despues se reintroduce en el mamffero. En una modalidad adicional de este metodo, el metodo comprende quimioterapia y/o terapia de radiacion para eliminar o reducir las celulas progenitoras o madre hematopoyeticas endogenas en el mamffero. En cualquiera de las modalidades del metodo descrito, las celulas progenitoras o madre hematopoyeticas pueden sustituirse con unas iPSC derivadas del mamffero. En cualquier modalidad del metodo, el metodo comprende ademas seleccionar un mamffero que necesita un aumento de la expresion de hemoglobina fetal.

En una modalidad de cualquier metodo descrito, el metodo comprende ademas seleccionar un mamffero que necesita un aumento de la expresion de hemoglobina fetal. Un mamffero ilustrativo que necesita un aumento de la expresion de hemoglobina fetal es uno que se ha diagnosticado con una hemoglobinopatfa.

En una modalidad, esta descripcion proporciona un metodo de tratamiento de una hemoglobinopatfa en un mamffero que comprende las etapas de:(a) proporcionar celulas progenitoras hematopoyeticas o celulas madre hematopoyeticas o iPSC; (b) poner en contacto las celulas ex vivo o in vitro con una cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189 60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta, de manera que la expresion de la hemoglobina fetal aumenta en dicho marnffero, con relacion a la expresion antes de dicho contacto; y (c) administrar las celulas de la etapa (b) en el mamffero.

En una modalidad de cualquier metodo, las celulas despues de la etapa (b) pueden crioconservarse hasta que sean necesarias para la administracion en el mamffero. En una modalidad adicional de este metodo, el metodo comprende quimioterapia y/o terapia de radiacion para eliminar o reducir las celulas progenitoras o madre hematopoyeticas endogenas en el mamffero. En cualquiera de las modalidades del metodo descrito, las celulas progenitoras o madre hematopoyeticas o iPSC son autologas para el mamffero, lo que significa que las celulas se derivan del mismo mamffero.

En otra de las modalidades del metodo descrito, las celulas progenitoras o madre hematopoyeticas o iPSC no son autologas para el mairnfero, lo que significa que las celulas no se derivan del mismo mam^fero, sino de otro animal de la misma especie. Por ejemplo, el mamnfero es un ser humano.

En una modalidad de cualquier metodo descrito, el metodo comprende ademas seleccionar un mamffero que necesita tratamiento de una hemoglobinopatfa.

En una modalidad, esta descripcion proporciona un metodo de tratamiento de una hemoglobinopatfa en un mamffero que comprende las etapas de:(a) aislar celulas progenitoras hematopoyeticas o celulas madre hematopoyeticas del mamffero^b) poner en contacto las celulas ex vivo o in vitro con una cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189 60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta, de manera que la expresion de hemoglobina fetal aumenta en el marnffero, con relacion a la expresion antes de dicho contacto; y (c) administrar las celulas de la etapa (b) en el mamffero.

En una modalidad, las celulas despues de la etapa (b) pueden crioconservarse hasta que sean necesarias para la administracion en el mamffero. En cualquier modalidad del metodo, el metodo comprende ademas seleccionar un mamffero que necesita tratamiento de una hemoglobinopatia.

En una modalidad, esta descripcion proporciona un metodo de tratamiento de una hemoglobinopatfa en un mamffero que comprende las etapas de: (a) proporcionar celulas progenitoras hematopoyeticas o celulas madre hematopoyeticas o iPSC; (b) ex vivo eliminar el ADN genomico de las celulas en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta, de manera que la expresion de la hemoglobina fetal aumenta en dicho marnffero, con relacion a la expresion antes de dicho contacto; y (c) administrar las celulas de la etapa (b) en el mamffero.

En una modalidad, las celulas despues de la etapa (b) pueden crioconservarse hasta que sean necesarias para la administracion en el mamffero. En una modalidad adicional de este metodo, el metodo comprende quimioterapia y/o terapia de radiacion para eliminar o reducir las celulas progenitoras o madre hematopoyeticas endogenas en el mamffero. En cualquiera de las modalidades del metodo descrito, las celulas progenitoras o madre hematopoyeticas o iPSC son analogas para el mamffero, lo que significa que las celulas se derivan del mismo mamffero. En otra de las modalidades del metodo descrito, las celulas progenitoras o madre hematopoyeticas o iPSC no son analogas para el mamffero, lo que significa que las celulas no se derivan del mismo mamffero, sino de otro animal de la misma especie. Por ejemplo, el mamffero es un ser humano. En cualquier modalidad del metodo, el metodo comprende ademas seleccionar un mamffero que necesita tratamiento de una hemoglobinopatfa.

En una modalidad, esta descripcion proporciona un metodo de tratamiento de una hemoglobinopatfa en un mamffero que comprende las etapas de: (a) aislar celulas progenitoras hematopoyeticas o celulas madre hematopoyeticas del mamffero; (b) ex vivo eliminar el ADN genomico de las celulas en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta, de manera que la expresion de hemoglobina fetal aumenta en el marnffero, con relacion a la expresion antes de dicho contacto; y (c) administrar las celulas de la etapa (b) en el mamffero.

En una modalidad, las celulas despues de la etapa (b) pueden crioconservarse hasta que sean necesarias para la administracion en el mamffero. En una modalidad adicional de este metodo, el metodo comprende quimioterapia y/o terapia de radiacion para eliminar o reducir las celulas progenitoras o madre hematopoyeticas endogenas en el mamffero. En cualquier modalidad del metodo, el metodo comprende ademas seleccionar un mamffero que necesita tratamiento de una hemoglobinopatia.

En una modalidad, esta descripcion proporciona un metodo de tratamiento de una hemoglobinopatfa en un mamffero (por ejemplo un ser humano) que comprende introducir una composicion descrita en la presente descripcion que comprende celulas modificadas geneticamente aisladas que tienen al menos una modificacion genetica en la ubicacion 60,716,189 60,728,612 del cromosoma 2 de manera que la expresion de hemoglobina fetal aumenta en el mamffero. En una modalidad adicional de este metodo, el metodo comprende quimioterapia y/o terapia de radiacion para eliminar o reducir las celulas progenitoras o madre hematopoyeticas endogenas en el mamffero. En cualquier modalidad del metodo, el metodo comprende ademas seleccionar un mamffero que necesita tratamiento de una hemoglobinopatfa.

En cualquier modalidad de cualquier metodo de tratamiento descrito, la hemoglobinopatfa es una p-hemoglobinopatfa.

En cualquier modalidad de cualquier metodo de tratamiento descrito, la hemoglobinopatfa es p-talasemia.

En cualquier modalidad de cualquier metodo de tratamiento descrito, la hemoglobinopatfa es anemia drepanocftica.

En una de las modalidades de cualquier metodo descrito, las celulas progenitoras o madre hematopoyeticas o iPSC son autologas para el mairnfero, lo que significa que las celulas se derivan del mismo m ai^ero . En otra de las modalidades de cualquier metodo descrito, las celulas progenitoras o madre hematopoyeticas o iPSC no son autologas para el marnffero, lo que significa que las celulas no se derivan del mismo mamffero, sino de otro animal de la misma especie. Por ejemplo, el mamffero es un ser humano.

En una de las modalidades de cualquier metodo descrito, el contacto de cualquier celula descrita en la presente descripcion puede ser ex vivo o in vitro o in vivo.

En otra modalidad de cualquier metodo descrito, el contacto de cualquier celula descrita en la presente descripcion comprende el contacto con un agente que se une al ADN genomico de la celula en el cromosoma 2 y produce una modificacion epigenetica en el genoma de la celula en el cromosoma 2, para reducir de este modo el ARNm o la expresion proteica de BCL11A. En una modalidad, la modificacion epigenetica es en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genomico de la UCSC).

En otra modalidad de cualquier metodo descrito, el contacto de cualquier celula descrita en la presente descripcion comprende el contacto con un agente que se une al ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genomico de la UCSC), y produce una modificacion epigenetica en el cromosoma 2, para reducir de este modo el ARNm o la expresion proteica de BCL11A.

En otra modalidad de cualquier metodo descrito, el contacto de cualquier celula descrita en la presente descripcion comprende el contacto con una cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una enzima dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una enzima dirigida a ADN de manera que la enzima dirigida a ADN produce una modificacion epigenetica en el cromosoma 2, para reducir de este modo el ARNm o la expresion proteica de BCL11A.

En otra modalidad de cualquier metodo descrito, el contacto de cualquier celula descrita en la presente descripcion comprende el contacto con una cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una enzima dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una enzima dirigida a ADN de manera que la enzima dirigida a ADN produce una modificacion epigenetica en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genomico de la UCSC) para reducir de este modo el ARNm o la expresion proteica de BCL11A. En una modalidad, la expresion de hemoglobina fetal aumenta en el marnffero, con relacion a la expresion antes del contacto.

En otra modalidad de cualquier metodo descrito, la celula progenitora hematopoyetica, la celula humana aislada, o la celula aislada se pone en contacto ex vivo o in vitro.

En otra modalidad de cualquier metodo descrito, al menos una modificacion genetica es una delecion. En otra modalidad, al menos una modificacion epigenetica es una delecion.

En una modalidad, en la presente descripcion se proporciona un uso de un agente que se une al ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genomico de la UCSC) para aumentar la hemoglobina fetal en un marnffero o para el tratamiento de una hemoglobinopatfa en el mamffero o para reducir el ARNm o la expresion de BCL11A, en donde el ARNm o la expresion proteica de BCL11A se reduce.

En una modalidad, en la presente descripcion se proporciona un uso de una cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una enzima dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una enzima dirigida a ADN para aumentar la hemoglobina fetal en un mamffero o para el tratamiento de una hemoglobinopatfa en el mamffero o para reducir el ARNm o la expresion de BCL11A, en donde la enzima dirigida a ADN produce al menos una modificacion epigenetica en el ADN genomico de la celula en el cromosoma 2, para afectar de este modo el ARNm o la expresion de BCL11A. En una modalidad, al menos una modificacion epigenetica es en la ubicacion 60,716,189-60,728.612. En otra modalidad, el efecto de la una modificacion epigenetica es reducir el ARNm o la expresion proteica de BCL11A.

En una modalidad, en la presente descripcion se proporciona un uso de una composicion que comprende celulas humanas modificadas geneticamente aisladas para aumentar la hemoglobina fetal en un mairnfero o para el tratamiento de una hemoglobinopatfa en el m ai^ero , en donde las celulas tienen al menos una modificacion genetica en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genomico de la UCSC) producida mediante el proceso de poner en contacto las celulas con una cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genomico de la UCSC) lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta.

En una modalidad, en la presente descripcion se proporciona un uso de cualquiera de las celulas aisladas descritas en la presente descripcion o cualquiera de las composiciones descritas en la presente descripcion para la fabricacion de un medicamento para aumentar la hemoglobina fetal en un mamffero o para el tratamiento de una hemoglobinopatfa en el mamffero.

En una modalidad de uso de la composicion descrita en la presente descripcion, la composicion provoca un aumento del ARNm o la expresion proteica de hemoglobina fetal en la celula en contacto.

En una modalidad de uso de la composicion descrita en la presente descripcion, las celulas de cualquiera de las composiciones descritas son autologas, para el mamffero que es el receptor de las celulas en un procedimiento de trasplante, es decir, las celulas de la composicion se derivan o se cosechan del mamffero antes de cualquier modificacion descrita.

En una modalidad de uso de la composicion descrita en la presente descripcion, las celulas de cualquiera de las composiciones descritas no son autologas para el mamffero que es el receptor de las celulas en un procedimiento de trasplante, es decir, las celulas de la composicion no se derivan o se cosechan del mamffero antes de cualquier modificacion descrita.

En una modalidad de uso de la composicion descrita en la presente descripcion, las celulas de cualquiera de las composiciones descritas estan en el tipo de HLA mmimo coincidente con el mamffero que es el receptor de las celulas en un procedimiento de trasplante.

En una modalidad de uso de la composicion descrita en la presente descripcion, las celulas de cualquiera de las composiciones descritas son celulas progenitoras aisladas antes de cualquier modificacion descrita.

En una modalidad de uso de la composicion descrita en la presente descripcion, las celulas de cualquiera de las composiciones descritas son celulas progenitoras hematopoyeticas aisladas antes de cualquier modificacion descrita.

En una modalidad de uso de la composicion descrita en la presente descripcion, las celulas de cualquiera de las composiciones descritas son celulas madre pluripotentes inducidas aisladas antes de cualquier modificacion descrita.

En una modalidad de uso de la composicion descrita en la presente descripcion, las celulas de cualquiera de las composiciones descritas se crioconservan antes del uso.

Se conoce que existen variaciones asociadas a HbF en BCL11A. Se han realizado seis GWAS del nivel de HbF (o el rasgo altamente correlacionado numero de celulas F) en individuos de ascendencia europea, africana y asiatica, cada uno identifica variantes asociadas al rasgo dentro de BCL11A (7-12). Las mismas variantes se asocian con la gravedad clmica de SCD y p-talasemia (9, 10, 50), consistente con HbF como modificador principal de estos trastornos. Se estima que la variacion en BCL11A explica ~15 % de la variacion del rasgo en el nivel de HbF (7, 12, 43). Se han identificado cuatro SNP diferentes como los mas altamente asociados con el rasgo (rs1427407 (7), rs11886868 (8), rs4671393 (9) y rs766432 (10-12)); estos SNP centinelas se agrupan dentro de 3 kb entre sf en el intron 2 de BCL11A (Figuras 2A y 11B). Los haplotipos que incluyen los SNP centinelas parecen explicar mejor la asociacion con HbF que cualquier SNP individual (12, 43). Cincuenta SNP en el locus de BCL11Ay veintisiete SNP dentro del intron 2 se han asociado con el nivel de HbF con significacion en el genoma completo (P < 5 x10-8). A pesar de los esfuerzos de resecuenciacion a gran escala, las variantes codificantes de BCL11A no se han descrito (43).

Previamente, los inventores usaron la CSSCD para el mapeo fino de la senal de asociacion con HbF en el locus de BCL11A e informaron una fuerte asociacion con rs4671393 (43). En ese estudio, se imputo rs1427407. Dos SNP adicionales, rs766432 y rs11886868 tambien se han identificado en estudios previos como SNP centinelas mas altamente asociados al rasgo (8, 10, 11, 51). En un subconjunto de individuos (n = 728) cuyos genotipos en los cuatro SNP centinelas estaban disponibles, el resultado de asociacion no fue significativo en rs4671393, rs766432 o rs11886868 despues del condicionamiento en los genotipos en rs1427407; por el contrario, la asociacion se mantuvo altamente significativa para rs1427407 tras el condicionamiento en rs4671393, rs766432 o rs11886868 (Tabla 4). Por lo tanto, rs1427407 es el SNP mas altamente asociado con el nivel de HbF dentro de los DHS eritroides y explica mejor la asociacion al rasgo que otros SNP centinelas descritos previamente.

El analisis condicional demostro asociaciones que se mantuvieron significativas despues del condicionamiento en rs1427407. La asociacion residual mas significativa fue para rs7606173 en DHS 55 (P = 9,66 x 10-11); rs7599488 en DHS 62, que se hada informado previamente (43), fue solo ligeramente menos significativa (P = 2,43 x 10-10) (Tabla 1). El analisis de variantes de secuencia de ADN raras dentro de los tres DHS no produjo senales asociadas a HbF independientes adicionales (Tabla 5).

Los inventores han descubierto que la union de factores de transcripcion (TF) espedfica de alelo interviene en la expresion de BCL11A. Se realizaron estudios bioqmmicos espedficos de alelo con el uso de heterocigoticos informativos para controlar las diferencias de accion en trans entre muestras y para garantizar la misma abundancia equitativa de ambos alelos, sustentado por la misma representacion de alelos en ADNg pareado (Figuras 2B y 2C). rs1427407 se encuentra directamente en el centro de un pico de union a GATA1 y TAL1 en el DHS 62 (Figura 2B). En los ensayos ChIP realizados, la cromatina se sometio a ultrasonido hasta fragmentos de aproximadamente 500 pb. Las cinco muestras de precursores eritroides humanos primarios heterocigoticos para rs1427407 usados para el ChIP-qPCR se secuenciaron por Sanger en los DHS eritroides. El unico SNP heterocigotico adicional dentro de 500 pb de rs1427407 en cualquiera de estas muestras fue rs7599488 (304 pb 3' de rs1427407) que era heterocigotico en solo dos de las cinco muestras. Este SNP no cae dentro de los motivos de union a GATA1 o TAL1. Por lo tanto parece poco probable que otro SNP dentro del DHS 62 pudiera explicar la union a TF espedfica de alelo observada.

Ademas, los inventores han descubierto que existe una asociacion entre la expresion de BCL11Ay el nivel de HbF. Los estudios de los inventores proporcionan un estimado del cambio en la expresion de BCL11A que puede dar como resultado un aumento clmicamente significativo en el nivel de HbF. Entre un conjunto limitado de lmeas de celulas linfoblastoides humanas se informo previamente la correlacion del alelo A de rs4671393 asociado a HbF alta con la reduccion de la expresion de BCL11A (13). La extension de estos experimentos a una coleccion mas grande de lmeas genotipadas no confirmo esta observacion. Por tanto, los inventores han descubierto que el haplotipo rs1427407-rs7606173 asociado a HbF influye en la expresion de BCL11A en un contexto eritroide espedfico, una posibilidad consistente con los hallazgos de sensibilidad a DNAsa I. La expresion del ARNm de BCL11A en precursores eritroides primarios difirio en 1,7 veces entre los haplotipos rs1427407-rs7606173 T-G de HbF alta y G-C de HbF baja (Figura 3B); de la misma manera, los niveles medios de HbF fueron 10,6 % y 3,1 % en homocigoticos T-G y G-C, respectivamente (Figura 3C). Cabe senalar que, los resultados que demuestran la expresion de BCL11A espedfica de alelo en celulas eritroides humanas primarias se observaron en celulas heterocigoticas para el haplotipo rs1427407-rs7606173, y por lo tanto los efectos modestos sobre la expresion de BCL11A reflejan los efectos combinados de todos los SNP funcionales dentro del haplotipo. Si bien la herencia de un haplotipo de BCL11A protector es clmicamente beneficiosa sobre una base poblacional (9, 10, 50), el nivel promedio de HbF en homocigoticos T-G se mantiene por debajo del requerido para prevenir la morbilidad de SCD. La sensibilidad del nivel de HbF a la expresion de BCL11A, sin embargo, predice que el alivio de la gravedad de la enfermedad pudiera requerir solamente una reduccion adicional modesta en la expresion de BCL11A.

Los inventores investigaron ademas la regulacion por el desarrollo de los genes de globinas y BCL11A. Durante el desarrollo humano, la £-globina derivada del saco vitelino se sustituye en el primer trimestre por la Y-globina derivada del hngado fetal. Despues del nacimiento, a medida que la eritropoyesis se transfiere del hngado a la medula osea, la Y-globina se silencia gradualmente y la p-globina predomina. Solo se produce un unico cambio en la expresion genica de globinas en la ontogenia del raton. Durante esta transicion, que se produce a la mitad de la gestacion, los eritrocitos primitivos circulantes derivados del saco vitelino expresan las globinas £y y pH1 de la etapa embrionaria, mientras que los eritroblastos definitivos del hngado fetal expresan las globinas p1 y p2 de la etapa adulta. En concordancia con este cambio en el desarrollo, BCL11A se expresa en el linaje eritroide definitivo pero no en el de la etapa primitiva y se requiere para el cambio en la expresion genica de globinas (16, 52).

En las lmeas reporteras transgenicas estables para BCL11A 52,0-64,4 a 10,5 dpc, la expresion de lacZ se observo solamente en el primordio del hngado fetal y no en la sangre circulante dentro del embrion, la placenta o el saco vitelino (Figura 6A). Estos resultados, acoplados con el hallazgo de la expresion de lacZ en los eritroblastos definitivos del hngado fetal a 12,5 dpc pero no en los eritrocitos circulantes primitivos derivados del saco vitelino (Figura 4B), demuestran que las secuencias potenciadoras compuestas de BCL11A dirigen la expresion en un patron espedfico del desarrollo en concordancia con el cambio de genes de globinas endogenos.

Una serie de mutantes de delecion se genero para refinar los elementos mmimos requeridos para la actividad del potenciador eritroide. Las secuencias que contienen el DHS central 58 fueron suficientes para la actividad del potenciador eritroide. Aquellas secuencias que contienen solamente los elementos que flanquean 62 o 55 no fueron capaces de dirigir la expresion genica eritroide (Figura 6B). Para probar la capacidad de los DHS de aumentar la expresion genica en precursores eritroides humanos primarios, se uso el suministro lentiviral de un sistema reportero de GFP como se describio previamente (39). De manera similar, el DHS 58 aumento la expresion genica en este ensayo reportero (Figura 7).

Los inventores decidieron generar lmeas celulares con una delecion del potenciador de Bcl11a para investigar la necesidad del potenciador para la expresion de BCL11A. Se generaron celulas eritroides estables con interrupcion del potenciador. Dado que no existen lmeas celulares eritroides humanas de la etapa adulta adecuadas, y como prueba de principio, los inventores volvieron al sistema murino. Las celulas de eritroleucemia de raton (MEL) dependen de BCL11A para un patron de la etapa adulta de la expresion genica de globinas (14). Los inventores identificaron un potenciador compuesto eritroide ortologo en el intron 2 de Bcl11a de raton. Al igual que el potenciador del intron 2 de BCL11A humano marcado por GWAS, estas secuencias posefan una serie de DHS eritroide espedficos. Ademas, estas secuencias estaban decoradas por H3K4me1 y H3K27ac, caredan de H3K4me3 y H3K27me3, y estaban ocupadas por GATA1 y TAL1 en la cromatina eritroide de raton (Figura 8). Se ha demostrado que los elementos reguladores compuestos que incluyen una serie de DHS adyacentes son cnticos para la expresion genica en numerosos loci, que incluyen entre otros la region de control del locus de p-globina, secuencias conservadas de a-globinas de multiples especies, y la region reguladora de IgH (53-55). Se observaron caractensticas unicas espedficas de la especie del potenciador compuesto. Por ejemplo, los inventores identificaron las secuencias de raton conservadas para cada uno de los tres DHS 62, 58 y 55 humanos, y encontraron hipersensibilidad a DNAsa I eritroide en las secuencias conservadas 62 y 55, sin embargo las secuencias conservadas 58 caredan de hipersensibilidad a DNAsa I.

Los analisis de PCR y transferencia Southern verificaron la escision del segmento intronico 50,4-60,4 kb de Bcl11a en tres clones de MEL unicos y dos clones de linfocitos pro-B unicos (Figura 9). Los puntos de ruptura secuenciados por Sanger eran caractensticos de la escision mediada por TALEN con posterior reparacion por NHEJ (Figura 10). Tras la delecion del segmento intronico, se observo una reduccion drastica en el transcrito de BCL11A en los clones de celulas MEL por RT-qPCR, con el uso de pares de cebadores que detectan las uniones de exones corriente arriba, que abarcan o corriente abajo de la delecion (Figura 5A).

Definiciones

Para conveniencia, ciertos terminos empleados en toda la solicitud (que incluye la especificacion, los ejemplos, y las reivindicaciones adjuntas) se recogen aqrn. A menos que se especifique lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientfficos que se usan en la presente descripcion tienen el mismo significado que el conocido comunmente por aquellos con experiencia en la tecnica a la que pertenece esta invencion.

Como se usa en la presente descripcion, la frase "agente que se une al ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2" se refiere a moleculas pequenas, acidos nucleicos, protemas, peptidos u oligonucleotidos que pueden unirse a la ubicacion dentro del ADN genomico (por ejemplo, la ubicacion 60,716,189 60,728,612 del cromosoma 2) y reprimen el ARNm o la expresion proteica de BCL11A en una celula en al menos 20 % en comparacion con el nivel de ARNm o protema de BCL11A en una celula no tratada con un agente de este tipo. En una modalidad, el agente "interfiere con las interacciones de BCL11A con parejas de union de BCL11A," como se usa esa frase en la presente descripcion.

Como se usa en la presente descripcion, el termino "molecula pequena" se refiere a un agente qmmico que incluye, pero no se limita a, peptidos, peptidomimeticos, aminoacidos, analogos de aminoacidos, polinucleotidos, analogos de polinucleotidos, aptameros, nucleotidos, analogos de nucleotidos, compuestos organicos o inorganicos (es decir, que incluyen compuestos heteroorganicos y organometalicos) que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 10.000 gramos por mol, compuestos organicos o inorganicos que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 5.000 gramos por mol, compuestos organicos o inorganicos que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 1.000 gramos por mol, compuestos organicos o inorganicos que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 500 gramos por mol, y sales, esteres, y otras formas farmaceuticamente aceptables de tales compuestos.

Un "acido nucleico", como se describe en la presente descripcion, puede ser ARN o ADN, y puede ser monocatenario o bicatenario, y puede seleccionarse, por ejemplo, de un grupo que incluye: acido nucleico que codifica una protema de interes, oligonucleotidos, analogos de acidos nucleicos, por ejemplo acido peptidonucleico (PNA), PNA pseudocomplementarios (pc-PNA), acido nucleico bloqueado (LNA) etcetera. Tales secuencias de acidos nucleicos incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, secuencia de acido nucleico que codifica protemas, por ejemplo que actuan como represores transcripcionales, moleculas antisentido, ribozimas, secuencias de acidos nucleicos inhibidoras pequenas, por ejemplo pero no se limitan a ARNi, ARNihp, ARNip, microARNi (miARN), oligonucleotidos antisentido etcetera.

Por "interfiere con las interacciones de BCL11A con parejas de union de BCL11A" se entiende que la cantidad de interaccion de BCL11A con la pareja de union de BCL11A es al menos 5 % menor en poblaciones tratadas con un inhibidor de BCL11A, que en una poblacion de control, comparable, en donde no esta presente el inhibidor de BCL11A. Se prefiere que la cantidad de interaccion de BCL11A con la pareja de union de BCL11A en una poblacion tratada con inhibidor de BCL11A sea al menos 10 % menor, al menos 20 % menor, al menos 30 % menor, al menos 40 % menor, al menos 50 % menor, al menos 60 % menor, al menos 70 % menor, al menos 80 % menor, al menos 90 % menor, al menos 1 vez menor, al menos 2 veces menor, al menos 5 veces menor, al menos 10 veces menor, al menos 100 veces menor, al menos 1.000 veces menor, o mas que en una poblacion tratada de control comparable en la que no se anade inhibidor de BCL11A. Como mmimo, la interaccion de BCL11A puede ensayarse mediante la determinacion de la cantidad de BCL11A que se une a la pareja de union de BCL11A con el uso de tecnicas estandares en la tecnica, que incluyen, pero no se limitan a, espectrometna de masas, inmunoprecipitacion, o ensayos de filtracion en gel. Alternativamente, o ademas, la actividad de BCL11A puede ensayarse mediante la medicion de la expresion de hemoglobina fetal a nivel del ARNm o la protema despues del tratamiento con un inhibidor de BCL11A candidato.

En una modalidad, la actividad de BCL11A es la interaccion de BCL11A con sus parejas de union: GATA-1, FOG-1, componentes del complejo NuRD, matrin-3, MTA2 y RBBP7. Por consiguiente, cualquier anticuerpo o fragmento de este, molecula pequena, sustancia qmmica o compuesto que pueda bloquear esta interaccion se considera un inhibidor de la actividad de BCL11A.

Como se usa en la presente descripcion, el termino "celula modificada geneticamente" se refiere a una celula que comprende al menos una modificacion genetica, como se usa ese termino en la presente descripcion.

Como se usa en la presente descripcion, el termino "modificacion genetica" se refiere a una interrupcion a nivel genomico que da como resultado una disminucion en la expresion o la actividad de BCL11A en una celula. Las modificaciones geneticas ilustrativas pueden incluir deleciones, mutaciones de desplazamiento del marco de lectura, mutaciones puntuales, eliminacion de exones, eliminacion de uno o mas sitios hipersensibles a DNAsa 1 (DHS) (por ejemplo, 2, 3, 4 o mas regiones DHS), etcetera.

Por "inhibe la expresion de BCL11A" se entiende que la cantidad de expresion de BCL11A es al menos 5 % menor en una celula o poblacion de celulas tratada con una endonucleasa dirigida a ADN, que en una celula o poblacion de celulas de control, comparable, en donde no esta presente la endonucleasa dirigida a ADN. Se prefiere que el porcentaje de expresion de BCL11A en una poblacion tratada sea al menos 10 % menor, al menos 20 % menor, al menos 30 % menor, al menos 40 % menor, al menos 50 % menor, al menos 60 % menor, al menos 70 % menor, al menos 80 % menor, al menos 90 % menor, al menos 1 vez menor, al menos 2 veces menor, al menos 5 veces menor, al menos 10 veces menor, al menos 100 veces menor, al menos 1.000 veces menor, o mas que en una poblacion tratada de control comparable en la que no se anade endonucleasa dirigida a ADN.

Por "inhibe la actividad de BCL11A" se entiende que la cantidad de actividad funcional de BCL11A es al menos 5 % menor en una celula o poblacion de celulas tratada con los metodos descritos en la presente descripcion, que en una celula o poblacion de control, comparable, en donde no esta presente la endonucleasa dirigida a ADN. Se prefiere que el porcentaje de actividad de BCL11A en una poblacion tratada con inhibidor de BCL11A sea al menos 10 % menor, al menos 20 % menor, al menos 30 % menor, al menos 40 % menor, al menos 50 % menor, al menos 60 % menor, al menos 70 % menor, al menos 80 % menor, al menos 90 % menor, al menos 1 vez menor, al menos 2 veces menor, al menos 5 veces menor, al menos 10 veces menor, al menos 100 veces menor, al menos 1.000 veces menor, o mas que en una poblacion tratada de control comparable en la que no se anade endonucleasa dirigida a ADN. Como mmimo, la actividad de BCL11A puede ensayarse mediante la determinacion de la cantidad de expresion de BCL11A a los niveles de protema o ARNm, con el uso de tecnicas estandares en la tecnica. Alternativamente, o ademas, la actividad de BCL11A puede determinarse con el uso de un constructo reportero, en donde el constructo reportero es sensible a la actividad de BCL11A. La secuencia del locus de Y-globina es reconocible por el motivo de union a acido nucleico del constructo de BCL11A.

En una modalidad, como se usa en la presente descripcion, el termino "endonucleasa dirigida a ADN" se refiere a una endonucleasa que genera una ruptura bicatenaria en una posicion deseada en el genoma (por ejemplo, la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2) sin producir rupturas bicatenarias no deseadas fuera de la diana. La endonucleasa dirigida a ADN puede ser una endonucleasa de origen natural (por ejemplo, una meganucleasa bacteriana) o puede generarse de manera artificial (por ejemplo, meganucleasas modificadas geneticamente, TALEN, o ZFN, entre otras).

En otra modalidad, como se usa en la presente descripcion, el termino "endonucleasa dirigida a ADN" se refiere a una endonucleasa que genera una ruptura monocatenaria o una "mella" o una ruptura en una cadena de la cadena principal de azucar fosfato del ADN en una posicion deseada en el genoma (por ejemplo, la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2) sin producir rupturas bicatenarias del ADN fuera de la diana.

Como se usa en la presente descripcion, el termino "vector" se refiere a una molecula de acido nucleico capaz de transportar otro acido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plasmido", que se refiere a un lazo de ADN bicatenario circular al que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde pueden ligarse segmentos de acido nucleico adicionales en el genoma viral. Determinados vectores son capaces de una replicacion autonoma en una celula huesped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicacion bacteriano y vectores episomales de mairnfero). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episomales de mairnfero) pueden integrarse en el genoma de una celula huesped tras la introduccion en la celula huesped, y de este modo se replican junto con el genoma del huesped. Ademas, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresion de genes a los cuales se unen operativamente. Tales vectores se denominan en la presente descripcion "vectores de expresion recombinante", o de manera mas simple "vectores de expresion." Generalmente, los vectores de expresion de utilidad en tecnicas de ADN recombinante estan frecuentemente en forma de plasmidos. En la presente especificacion, "plasmido" y "vector" pueden usarse indistintamente dado que el plasmido es la forma de vector de uso mas comun. Sin embargo, los metodos y composiciones descritos en la presente descripcion pueden incluir otras formas de vectores de expresion, tal como vectores virales (por ejemplo, retrovirus de replicacion defectuosa, adenovirus y virus adenoasociados), que sirven para funciones equivalentes.

Dentro de un vector de expresion, "unido operativamente" significa que la secuencia de nucleotidos de interes se une a la(s) secuencia(s) reguladora(s) de una manera que permite la expresion de la secuencia de nucleotidos (por ejemplo, en un sistema de transcripcion/traduccion in vitro o en una celula diana cuando el vector se introduce en la celula diana). El termino "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresion (por ejemplo, senales de poliadenilacion). Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresion constitutiva de una secuencia de nucleotidos en muchos tipos de celula huesped y aquellas que dirigen la expresion de la secuencia de nucleotidos solo en ciertas celulas huesped (por ejemplo, secuencias reguladoras espedficas de tejido). Ademas, la endonucleasa dirigida a ADN puede suministrarse por medio de un vector que comprende una secuencia reguladora para dirigir la smtesis de la endonucleasa dirigida a ADN a intervalos espedficos, o durante un penodo de tiempo espedfico. Se apreciara por aquellos con experiencia en la tecnica que el diseno del vector de expresion puede depender de factores tales como la eleccion de la celula diana, el nivel de expresion deseado, y similares.

Como se usa en la presente descripcion el termino "escinde" generalmente se refiere a la generacion de una ruptura bicatenaria en el genoma de ADN en una ubicacion deseada.

Como se usa en la presente descripcion, el termino "cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN" se refiere a una cantidad de una endonucleasa dirigida a ADN que produce actividad endonucleasa suficiente para generar una ruptura bicatenaria en la ubicacion deseada del genoma. En una modalidad, la cantidad eficaz de una endonucleasa dirigida a ADN genera una ruptura bicatenaria en el locus genetico deseado en al menos 20 % de las celulas en una poblacion en contacto con la composicion (por ejemplo, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 %, o incluso 100 % de las celulas en la poblacion comprenden una modificacion genetica producida por la composicion de endonucleasa dirigida a ADN).

Como se usa en la presente descripcion el termino "que aumenta los niveles de hemoglobina fetal" en una celula indica que la hemoglobina fetal es al menos 5 % mayor en poblaciones tratadas con un agente que interrumpe el ARNm o la expresion proteica de BCL11A (por ejemplo, una endonucleasa dirigida a ADN) mediante la union al ADN genomico en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2, que en una poblacion de control, comparable, en donde no esta presente el agente. Se prefiere que el porcentaje de expresion de hemoglobina fetal en una poblacion tratada con un agente de este tipo que se une al ADN genomico en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 sea al menos 10 % mayor, al menos 20 % mayor, al menos 30 % mayor, al menos 40 % mayor, al menos 50 % mayor, al menos 60 % mayor, al menos 70 % mayor, al menos 80 % mayor, al menos 90 % mayor, al menos 1 vez mayor, al menos 2 veces mayor, al menos 5 veces mayor, al menos 10 veces mayor, al menos 100 veces mayor, al menos 1.000 veces mayor, o mas que en una poblacion tratada de control de tamano y condiciones de cultivo comparables. El termino "poblacion tratada de control" se usa en la presente descripcion para describir una poblacion de celulas que se ha tratado con identicos medios, induccion viral, secuencias de acidos nucleicos, temperatura, confluencia, tamano del matraz, pH, etcetera, con la excepcion de la adicion del agente que se une al ADN genomico en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2. En una modalidad, cualquier metodo conocido en la tecnica puede usarse para medir un aumento en la expresion de hemoglobina fetal, por ejemplo el analisis de transferencia Western de la protema Y-globina fetal y la cuantificacion del ARNm de la Y-globina fetal.

El termino "celula aislada" como se usa en la presente descripcion se refiere a una celula que se ha extrafdo de un organismo en el que se encontraba originalmente, o un descendiente de una celula de este tipo. Opcionalmente la celula se ha cultivado in vitro, por ejemplo, en presencia de otras celulas. Opcionalmente la celula se introduce despues en un segundo organismo o se reintroduce en el organismo del cual se aislo (o la celula de la cual desciende).

El termino "poblacion aislada" con respecto a una poblacion aislada de celulas como se usa en la presente descripcion se refiere a una poblacion de celulas que se ha extrafdo y separado de una poblacion mixta o heterogenea de celulas. En algunas modalidades, una poblacion aislada es una poblacion de celulas sustancialmente pura en comparacion con la poblacion heterogenea a partir de la cual se aislaron o enriquecieron las celulas. En algunas modalidades, la poblacion aislada es una poblacion aislada de celulas progenitoras hematopoyeticas humanas, por ejemplo, una poblacion sustancialmente pura de celulas progenitoras hematopoyeticas humanas en comparacion con una poblacion heterogenea de celulas que comprende celulas progenitoras hematopoyeticas humanas y celulas de las que se derivan las celulas progenitoras hematopoyeticas humanas.

El termino "sustancialmente pura," con respecto a una poblacion de celulas particular, se refiere a una poblacion de celulas que es al menos aproximadamente 75 %, preferentemente al menos aproximadamente 85 %, con mayor preferencia al menos aproximadamente 90 %, y con la maxima preferencia al menos aproximadamente 95 % pura, con respecto a las celulas que componen una poblacion total de celulas. Es decir, los terminos "sustancialmente pura" o "esencialmente purificada," con respecto a una poblacion de celulas progenitoras hematopoyeticas, se refiere a una poblacion de celulas que contiene menos de aproximadamente 20 %, con mayor preferencia menos de aproximadamente 15 %, 10 %, 8 %, 7 %, con la maxima preferencia menos de aproximadamente 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, o menos de 1 %, de celulas que no son celulas progenitoras hematopoyeticas como se define por los terminos en la presente descripcion.

Como se usa en la presente descripcion, el termino "tratar" incluye reducir o aliviar al menos un efecto adverso o smtoma de una afeccion, enfermedad o trastorno. Por ejemplo, el termino "tratar" y "tratamiento" se refiere a administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una composicion, por ejemplo, una cantidad eficaz de una composicion que comprende una poblacion de celulas progenitoras hematopoyeticas de manera que el sujeto tiene una reduccion en al menos un smtoma de la enfermedad o una mejona en la enfermedad, por ejemplo, resultados clmicos beneficiosos o deseados. Para los propositos de esta descripcion, los resultados clmicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio de uno o mas smtomas, disminucion de la extension de la enfermedad, estabilizacion de la enfermedad (por ejemplo, no empeora), demora o disminucion del progreso de la enfermedad, alivio o atenuacion del estado patologico, y remision (ya sea parcial o total), ya sea detectable o no detectable. En algunas modalidades, tratar puede referirse a prolongar la supervivencia en comparacion con la supervivencia esperada de no recibir tratamiento. Por lo tanto, el experto en la tecnica se percata de que un tratamiento puede mejorar el estado de la enfermedad, pero puede no ser una cura completa de la enfermedad. En algunas modalidades, el tratamiento puede incluir la profilaxis. Sin embargo, en modalidades alternativas, el tratamiento no incluye la profilaxis.

La frase "farmaceuticamente aceptable" se emplea en la presente descripcion para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones, y/o formas de dosificacion que son, dentro del alcance del criterio medico sensato, adecuados para el uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad excesiva, irritacion, respuesta alergica, u otro problema o complicacion, acorde con una relacion razonable de beneficio/riesgo.

Como se usa en la presente descripcion, los terminos "farmaceuticamente aceptable", "fisiologicamente tolerable" y sus variaciones gramaticales, en la medida que se refieran a composiciones, portadores, diluyentes y reactivos, se usan indistintamente y representan que los materiales pueden administrarse a o en un mairnfero sin la produccion de efectos fisiologicos no deseados tales como nauseas, mareos, malestar estomacal y similares. Un portador farmaceuticamente aceptable no promovera el levantamiento de una respuesta inmunitaria a un agente con el que se mezcla, a menos que asf se desee. La preparacion de una composicion farmacologica que contiene ingredientes activos disueltos o dispersos en ella se entiende bien en la tecnica y no es necesario limitarla en base a la formulacion. Tfpicamente tales composiciones se preparan como inyectables ya sea como soluciones o suspensiones lfquidas, sin embargo, tambien pueden prepararse formas solidas adecuadas para solucion, o suspensiones, en lfquido antes del uso. La preparacion tambien puede emulsionarse o presentarse como una composicion de liposomas. El ingrediente activo puede mezclarse con excipientes que son farmaceuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo y en cantidades adecuadas para el uso en los metodos terapeuticos descritos en la presente descripcion. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solucion salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares o sus combinaciones. Ademas, si se desea, la composicion puede contener cantidades minoritarias de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes amortiguadores de pH y similares que aumentan la eficacia del ingrediente activo. La composicion terapeutica de la presente invencion puede incluir sales farmaceuticamente aceptables de sus componentes. Las sales farmaceuticamente aceptables incluyen las sales de adicion de acido (formadas con los grupos amino libres del polipeptido) que se forman con acidos inorganicos tales como, por ejemplo, acidos clortndrico o fosforico, o acidos organicos tales como acetico, tartarico oxalico, mandelico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres tambien pueden derivarse de bases inorganicas tales como, por ejemplo, hidroxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o ferrico, y bases organicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procama y similares. Los portadores fisiologicamente tolerables se conocen bien en la tecnica. Los portadores lfquidos ilustrativos son soluciones acuosas esteriles que no contienen materiales ademas de los ingredientes activos y agua, o contienen un amortiguador tal como fosfato de sodio a valor de pH fisiologico, solucion salina fisiologica o ambos, tales como solucion salina regulada por fosfato. Aun mas, los portadores acuosos pueden contener mas de una sal amortiguadora, asf como sales tales como cloruros de sodio y potasio, dextrosa, polietilenglicol y otros solutos. Las composiciones lfquidas tambien pueden contener fases lfquidas ademas de y para la exclusion del agua. Ejemplos de tales fases lfquidas adicionales son glicerina, aceites vegetales tales como aceite de semilla de algodon, y emulsiones de agua en aceite. La cantidad de un agente activo usado con los metodos descritos en la presente descripcion que sera eficaz en el tratamiento de un trastorno o afeccion particular dependera de la naturaleza del trastorno o afeccion, y puede determinarse mediante tecnicas clmicas estandares.

Como se usa en la presente descripcion, "prevencion" o "prevenir," cuando se usa en referencia a una enfermedad, trastorno o sus smtomas, se refiere a una reduccion en la probabilidad de que un individuo desarrolle una enfermedad o trastorno, por ejemplo, una hemoglobinopatfa. La probabilidad de desarrollar una enfermedad o trastorno se reduce, por ejemplo, cuando un individuo que tiene uno o mas factores de riesgo para una enfermedad o trastorno no desarrolla el trastorno o desarrolla tal enfermedad o trastorno en un momento posterior o con menos gravedad, estadfsticamente hablando, con relacion a una poblacion que tiene los mismos factores de riesgo y no recibe el tratamiento como se describe en la presente descripcion. El fallo en el desarrollo de smtomas de una enfermedad, o el desarrollo de smtomas reducidos (por ejemplo, en al menos 10 % en una escala clmicamente aceptada para esa enfermedad otrastorno) o demorados (por ejemplo, en dfas, semanas, meses o anos) se considera prevencion eficaz.

En relacion con el contacto de una celula con una endonucleasa dirigida a ADN para disminuir la expresion de BCL11A, la frase "que aumenta los niveles de hemoglobina fetal en una celula" indica que la hemoglobina fetal en una celula o poblacion de celulas es al menos 5 % mayor en la celula o poblacion de celulas tratada con la endonucleasa dirigida a ADN, que en una poblacion de control, comparable, en donde no esta presente la endonucleasa dirigida a ADN. Se prefiere que la expresion de hemoglobina fetal en una celula tratada con endonucleasa dirigida a ADN sea al menos 10 % mayor, al menos 20 % mayor, al menos 30 % mayor, al menos 40 % mayor, al menos 50 % mayor, al menos 60 % mayor, al menos 70 % mayor, al menos 80 % mayor, al menos 90 % mayor, al menos 1 vez mayor, al menos 2 veces mayor, al menos 5 veces mayor, al menos 10 veces mayor, al menos 100 veces mayor, al menos 1.000 veces mayor, o mas que en una poblacion tratada de control comparable. El termino "poblacion tratada de control" se usa en la presente descripcion para describir una poblacion de celulas que se ha tratado con identicos medios, induccion viral, secuencias de acidos nucleicos, temperatura, confluencia, tamano de matraz, pH, etcetera, con la excepcion de la adicion del inhibidor de BCL11A.

El termino "mairnfero" pretende abarcar un "mairnfero" en singular y "mairnferos," en plural e incluye, pero no se limita a seres humanos; primates tales como simios, monos, orangutanes, y chimpances; canidos tales como perros y lobos; felidos tales como gatos, leones, y tigres; equidos tales como caballos, asnos, y cebras; animales de cna tales como vacas, cerdos, y ovejas; ungulados tales como ciervos y jirafas; roedores tales como ratones, ratas, hamsteres y cobayas; y osos. En algunas modalidades preferidas, un marnffero es un ser humano.

Por consiguiente, en una modalidad, el marnffero se ha diagnosticado con una hemoglobinopatia. En una modalidad adicional, la hemoglobinopatfa es una p-hemoglobinopatia. En una modalidad preferida, la hemoglobinopatfa es una drepanocitosis. Como se usa en la presente descripcion, "drepanocitosis" puede ser anemia drepanodtica, drepanocitosis con hemoglobina C (HbSC), drepanocitosis con beta-mas-talasemia (HbS/p+), o drepanocitosis con beta-cero-talasemia (HbS/p0). En otra modalidad preferida, la hemoglobinopatfa es una p-talasemia.

Como se usa en la presente descripcion, el termino "hemoglobinopatfa" significa cualquier defecto en la estructura o funcion de cualquier hemoglobina de un individuo, e incluye defectos en la estructura primaria, secundaria, terciaria o cuaternaria de la hemoglobina provocados por cualquier mutacion, tales como mutaciones de delecion o mutaciones de sustitucion en las regiones codificantes del gen de p-globina, o mutaciones en, o deleciones de, los promotores o potenciadores de tales genes que provocan una reduccion en la cantidad de hemoglobina producida en comparacion con una condicion normal o estandar. El termino incluye ademas cualquier disminucion en la cantidad o la eficacia de la hemoglobina, ya sea normal o anormal, provocada porfactores externos tales como enfermedad, quimioterapia, toxinas, venenos, o similares.

En una modalidad, el termino "cantidad eficaz", como se usa en la presente descripcion, se refiere a la cantidad de una composicion de celulas que es segura y suficiente para tratar, reducir la probabilidad de, o demorar el desarrollo de una hemoglobinopatfa. Por lo tanto la cantidad puede curar o dar como resultado el alivio de los smtomas de la hemoglobinopatfa, enlentecer el curso de la progresion de la enfermedad hemoglobinopatica, enlentecer o inhibir un smtoma de una hemoglobinopatfa, enlentecer o inhibir el establecimiento de smtomas secundarios de una hemoglobinopatfa o inhibir el desarrollo de un smtoma secundario de una hemoglobinopatfa. La cantidad eficaz para el tratamiento de la hemoglobinopatfa depende del tipo de hemoglobinopatfa a tratar, la gravedad de los smtomas, el sujeto que se trata, la edad y condicion general del sujeto, el modo de administracion etcetera. Por lo tanto, no siempre es posible o prudente especificar una "cantidad eficaz" exacta. Sin embargo, para cualquier caso dado, una "cantidad eficaz" adecuada puede determinarse por un experto en la tecnica con el uso solamente de experimentacion de rutina.

Como se usa en la presente descripcion el termino "que comprende" o "comprende" se usa en referencia a composiciones, metodos, y sus componentes respectivos, que son esenciales para la invencion, aunque abiertos a la inclusion de elementos no especificados, ya sean esenciales o no.

Como se usa en la presente descripcion el termino "que consiste esencialmente en' se refiere a los elementos requeridos para una modalidad dada. El termino permite la presencia de elementos adicionales que no afectan materialmente la(s) caractenstica(s) basica(s) y nueva(s) o funcional(es) de esa modalidad de la invencion.

El termino "que consiste en' se refiere a composiciones, metodos, y sus componentes respectivos como se describe en la presente descripcion, que excluyen cualquier elemento no mencionado en esa descripcion de la modalidad.

Como se usa en esta especificacion y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un," "una," y "el/la" incluyen las referencias en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Asf por ejemplo, las referencias a "el metodo" incluyen uno o mas metodos, y/o etapas del tipo descrito en la presente descripcion y/o que resultaran evidentes para los expertos en la tecnica tras leer esta descripcion etcetera. Se entiende que la descripcion detallada anterior y los ejemplos siguientes son solamente ilustrativos y no deben tomarse como limitaciones del alcance de la invencion. Varios cambios y modificaciones a las modalidades descritas, que resultaran evidentes para los expertos en la tecnica, pueden realizarse sin apartarse del alcance de la presente invencion. Ademas, todas las patentes, solicitudes de patente, y publicaciones identificadas tienen el proposito de describir y divulgar, por ejemplo, las metodolog^as descritas en dichas publicaciones que podnan usarse en relacion con la presente invencion. Estas publicaciones se proporcionan unicamente para su divulgacion antes de la fecha de presentacion de la presente solicitud. Nada de la presente invencion debe interpretarse como una aceptacion de que los inventores no tienen derecho a antedatar tal descripcion en virtud de invencion anterior y por cualquier otra razon. Todas las declaraciones en cuanto a fecha o representacion de los contenidos de estos documentos se basan en la informacion disponible para los solicitantes y no constituyen admision alguna de la exactitud de las fechas o contenidos de estos documentos.

Hemoglobinopat^as

La hemoglobina fetal (HbF) es un tetramero de dos polipeptidos de a-globina del adulto y dos polipeptidos de Y-globina fetal tipo p. Durante la gestacion, los genes de Y-globinas duplicados constituyen los genes predominates transcritos a partir del locus de p-globina. Despues del nacimiento, la Y-globina se reemplaza progresivamente por la p-globina del adulto, un proceso denominado el "cambio fetal" (3). Los mecanismos moleculares subyacentes a este cambio se han mantenido en gran medida sin definir y han sido objeto de una intensa investigacion. El cambio en el desarrollo de la produccion predominantemente de hemoglobina fetal o HbF (a2Y2) a la produccion de hemoglobina del adulto o HbA (a2p2) comienza aproximadamente de las 28 a 34 semanas de gestacion y continua brevemente despues del nacimiento punto en el cual la HbA se vuelve predominante. Este cambio es el resultado principalmente de la disminucion de la transcripcion de los genes de gamma-globinas y el aumento de la transcripcion de los genes de beta-globinas. Como promedio, la sangre de un adulto normal contiene solo aproximadamente 2 % de HbF, aunque los niveles de HbF residual tienen una variacion de mas de 20 veces en adultos sanos (Atweh, Semin. Hematol. 38(4):367-73 (2001)).

Las hemoglobinopatfas abarcan una serie de anemias de origen genetico en las que existe una disminucion de la produccion y/o un aumento de la destruccion (hemolisis) de globulos rojos (RBC). Estos trastornos incluyen ademas defectos geneticos que dan como resultado la produccion de hemoglobinas anormales con una afectacion concomitante de la capacidad de mantener la concentracion de oxfgeno. Algunos de tales trastornos involucran la incapacidad de producir p-globina normal en cantidades suficientes, mientras que otros involucran la total incapacidad de producir pglobina normal. Estos trastornos asociados espedficamente con la protema p-globina se denominan generalmente phemoglobinopatfas. Por ejemplo, las p-talasemias son el resultado de un defecto parcial o completo en la expresion del gen de p-globina, lo que conduce a la deficiencia o ausencia de HbA. La anemia drepanodtica es el resultado de una mutacion puntual en el gen estructural de la p-globina, que conduce a la produccion de una hemoglobina (HbS) anormal (falciforme). Los RBC con HbS son mas fragiles que los RBC normales y experimentan hemolisis mas facilmente, lo que conduce eventualmente a la anemia (Atweh, Semin. Hematol. 38(4):367-73 (2001)). Por otra parte, la presencia de una variante genetica de BCL11A, la variacion HBS1L-MYB, alivia la gravedad clmica en la beta-talasemia. Se ha demostrado la asociacion de esta variante con los niveles de HbF. Se ha demostrado que existe una relacion de probabilidades de 5 para tener una forma menos grave de beta-talasemia con la variante de HbF alta (Galanello S. y otros, 2009, Blood, en prensa).

La busqueda de un tratamiento orientado a la reduccion del desequilibrio de las cadenas de globinas en pacientes con phemoglobinopatfas se ha centrado en la manipulacion farmacologica de la hemoglobina fetal (a2Y2; HbF). El potencial terapeutico importante de tales enfoques se sugiere por las observaciones del fenotipo moderado de individuos con herencia conjunta de p-talasemia homocigotica y persistencia hereditaria de hemoglobina fetal (HPFH), asf como por aquellos pacientes con p-talasemia homocigotica que no sintetizan hemoglobina del adulto, pero en los que se observa una reduccion de la necesidad de transfusiones en presencia de aumento de las concentraciones de hemoglobina fetal. Ademas, se ha observado que ciertas poblaciones de pacientes adultos con anomalfas en la cadena p tienen niveles de hemoglobina fetal (HbF) mayores que los normales, y se ha observado que tienen un curso clmico de la enfermedad mas moderado que los pacientes con niveles de HbF normales en el adulto. Por ejemplo, un grupo de pacientes con anemia drepanodtica de Arabia Saudita que expresan 20-30 % de HbF solo tienen manifestaciones clmicas moderadas de la enfermedad (Pembrey, y otros, Br. J. Haematol. 40: 415-429 (1978)). Ahora se acepta que las p-hemoglobinopatfas, tales como la anemia drepanodtica y las p-talasemias, se alivian con el aumento de la produccion de HbF. (Resenado en Jane y Cunningham Br. J. Haematol. 102: 415-422 (1998) y Bunn, N. Engl. J. Med. 328: 129-131 (1993)).

Si bien los mecanismos moleculares que controlan el cambio en el desarrollo in vivo de la expresion genica de y a pglobina actualmente se desconocen, existe evidencia acumulada de que factores externos pueden influir en la expresion genica de Y-globina. El primer grupo de compuestos descubiertos con actividad de reactivacion de HbF eran farmacos citotoxicos. La capacidad de provocar la smtesis de novo de HbF mediante manipulacion farmacologica se demostro primero con el uso de 5-azacitidina en animales de experimentacion (DeSimone, Proc Natl Acad Sci USA. 79(14):4428-31 (1982)). Estudios posteriores confirmaron la capacidad de la 5-azacitidina de aumentar la HbF en pacientes con ptalasemia y drepanocitosis (Ley, y otros, N. Engl. J. Medicine, 307: 1469-1475 (1982), y Ley, y otros, Blood 62: 370-380 (1983) ). Experimentos adicionales demostraron que babuinos tratados con dosis citotoxicas de arabinosilcitosina (ara-C) respondfan con elevaciones sorprendentes de F-reticulocitos (Papayannopoulou y otros, Science. 224(4649):617-9 (1984) ), y que el tratamiento con hidroxiurea conduda a la induccion de Y-globina en monos o babuinos (Letvin y otros, N Engl J Med. 310(14):869-73 (1984)).

El segundo grupo de compuestos investigado en cuanto a la capacidad de provocar actividad de reactivacion de HbF fue el de acidos grasos de cadena corta. La observacion inicial en celulas progenitoras de sangre de cordon umbilical fetal condujo al descubrimiento de que el acido Y-aminobutmico puede actuar como un inductor de hemoglobina fetal (Perrine y otros, Biochem Biophys Res Commun.148(2):694-700 (1987)). Estudios posteriores demostraron que el butirato estimulaba la produccion de globinas en babuinos adultos (Constantoulakis y otros, Blood. Dic; 72(6):196l-7 (1988)), e induda la Y-globina en progenitoras eritroides en animales adultos o pacientes con anemia drepanodtica (Perrine y otros, Blood. 74(1):454-9 (1989)). Derivados de acidos grasos de cadena corta tales como fenilbutirato (Dover y otros, Br J Haematol. 88(3):555-61 (1994)) y acido valproico (Liakopoulou y otros, 1: Blood. 186(8):3227-35 (1995)) tambien han demostrado inducir HbF in vivo. Dado el gran numero de analogos de acidos grasos de cadena corta o derivados de esta familia, existe una serie de compuestos potenciales de esta familia mas potentes que el butirato. Los acidos fenilacetico y fenilalquilo (Torkelson y otros, Blood Cells Mol Dis. 22(2):150-8. (1996)), que se descubrieron durante estudios posteriores, se consideraban inductores potenciales de HbF dado que pertenedan a esta familia de compuestos. En la actualidad, sin embargo, el uso de butirato o sus analogos en la anemia drepanodtica y la p-talasemia sigue siendo experimental y no puede recomendarse para el tratamiento fuera de ensayos clmicos.

Los ensayos clmicos orientados a la reactivacion de la smtesis de hemoglobina fetal en la anemia drepanodtica y la p -talasemia han incluido la administracion a corto plazo y a largo plazo de compuestos tales como 5-azacitidina, hidroxiurea, eritropoyetina humana recombinante, y analogos de acido butmico, asf como combinaciones de estos agentes. Siguiendo estos estudios, la hidroxiurea se uso para la induccion de HbF en seres humanos y posteriormente se convirtio en el primer y unico farmaco aprobado por la Administracion de Alimentos y Farmacos (FDA) para el tratamiento de hemoglobinopatias. Sin embargo, inconvenientes variables han contraindicado el uso a largo plazo de tales agentes o terapias, que incluyen efectos secundarios no deseados y variabilidad en las respuestas de los pacientes. Por ejemplo, si bien la hidroxiurea estimula la produccion de HbF y ha demostrado reducir clmicamente la crisis drepanodtica, se limita potencialmente por la mielotoxicidad y el riesgo de carcinogenesis. La carcinogenicidad a largo plazo potencial tambien existina en las terapias basadas en 5-azacitidina. Las terapias basadas en eritropoyetina no han demostrado ser consistentes entre una variedad de poblaciones de pacientes. Las vidas medias cortas del acido butmico in vivo se han percibido como un obstaculo potencial en la adaptacion de estos compuestos para el uso en intervenciones terapeuticas. Ademas, son necesarias dosis muy altas de acido butmico para inducir la expresion genica de Y-globina, que requieren cateterizacion para la infusion continua del compuesto. Por otra parte, estas dosis altas de acido butmico pueden asociarse con neurotoxicidad y dano a multiples organos (Blau, y otros, Blood 81: 529-537 (1993)). Si bien aumentos mmimos en los niveles de HbF son utiles en la drepanocitosis, las p-talasemias requieren un aumento mucho mayor que no se logra de manera confiable, o segura, mediante ninguno de los agentes usados actualmente (Olivieri, Seminars in Hematology 33: 24-42 (1996)).

La identificacion de los reguladores naturales de la induccion y produccion de HbF podna proporcionar un medio para crear intervenciones terapeuticas que superen los diversos inconvenientes de los compuestos descritos anteriormente. Estudios recientes de asociacion del genoma completo han producido conocimientos sobre la base genetica de numerosas enfermedades y rasgos complejos (McCarthy y otros, Nat Rev Genet 9, 356 (2008) y Manolio y otros J Clin Invest 118, 1590 (2008)). Sin embargo, en la gran mayona de los casos, el vinculo funcional entre una asociacion genetica y la fisiopatologfa subyacente sigue sin descubrirse. El nivel de hemoglobina fetal (HbF) se hereda como un rasgo cuantitativo y clmicamente importante, dado su papel mencionado anteriormente y bien caracterizado en el alivio de la gravedad de las principales p-hemoglobinopatias, la drepanocitosis y la p-talasemia (Nathan y otros, Nathan and Oski's hematology of infancy and childhood ed. 6ta, pp. 2 v. (xiv, 1864, xli p.) 2003)). Dos estudios de asociacion del genoma completo han identificado tres loci principales que contienen un conjunto de cinco polimorfismos de nucleotido simple (SNP) comunes que explican ~20 % de la variacion en los niveles de HbF (Lettre y otros, Proc Natl Acad Sci U S A (2008); Uda y otros, Proc Natl Acad Sci U S A 105, 1620 (2008); Menzel y otros, Nat Genet 39, 1197 (2007)). Por otra parte, varias de estas variantes parecen predecir la gravedad clmica de la drepanocitosis (Lettre y otros, Proc Natl Acad Sci U S A (2008)) y al menos uno de estos SNP tambien puede afectar el resultado clmico en la p-talasemia (Uda y otros, Proc Natl Acad Sci U S A 105, 1620 (2008)). El SNP con el tamano de efecto mas grande, que explica mas de 10 % de la variacion en HbF, se ubica en el segundo intron de un gen en el cromosoma 2, BCL11A. Mientras que BCL11A, un factor de transcripcion de dedos de zinc tipo C2H2, se ha investigado en cuanto a su papel en el desarrollo linfocitario (Liu y otros, Nat Immunol 4, 525 (2003) y Liu y otros, Mol Cancer 5, 18 (2006)), su papel en la produccion de globulos rojos o la regulacion de genes de globinas no se ha evaluado previamente.

Al inicio de la era del ADN recombinante, los estudios de la estructura de los genes de globinas proporcionaron una fuerte base molecular para interrogar el cambio de globinas fetal. Un esfuerzo considerable se ha centrado en delinear los elementos en cis dentro del locus de p-globina necesarios para la regulacion adecuada de los genes dentro del grupo de globinas tipo p. Estos estudios se basaron en mutaciones y deleciones de origen natural que influyen drasticamente en los niveles de HbF en adultos, y se han complementado mediante la generacion de ratones transgenicos que albergan porciones del grupo (Nathan y otros, Nathan and Oski's hematology of infancy and childhood ed. 6ta, pp. 2 v. (xiv, 1864, xli p.) 2003) y G. Stamatoyannopoulos, Exp Hematol 33, 259 (2005)). Aunque los elementos en cis precisos requeridos para el cambio de globinas se mantiene mal definido, los hallazgos en ratones transgenicos han indicado fuertemente que los genes de Y-globinas se silencian de manera autonoma en la etapa adulta, un hallazgo que es el mas compatible con la ausencia de activadores espedficos de la etapa fetal o la presencia de un represor espedfico de etapa. Los resultados de estudios de asociacion genetica recientes proporcionan genes candidatos para interrogar en cuanto a su participacion en el control de los genes de Y-globinas, tales como BCL11A.

Celulas progenitoras hematopoyeticas

En una modalidad, la celula progenitora hematopoyetica se pone en contacto ex vivo o in vitro. En una modalidad espedfica, la celula que se pone en contacto es una celula del linaje eritroide. En una modalidad, la composicion de celulas comprende celulas que tienen disminucion de la expresion de BCL11A.

"Celula progenitora hematopoyetica" como se usa el termino en la presente descripcion, se refiere a celulas de un linaje de celulas madre que dan lugar a todos los tipos de celulas sangumeas que incluyen los linajes mieloide (monocitos y macrofagos, neutrofilos, basofilos, eosinofilos, eritrocitos, megacariocitos/plaquetas, celulas dendnticas), y el linfoide (celulas T, celulas B, celulas NK). Una "celula del linaje eritroide" indica que la celula que se pone en contacto es una celula que experimenta eritropoyesis de modo que tras la diferenciacion final forma un eritrocito o globulo rojo (RBC). Tales celulas pertenecen a uno de tres linajes, eritroide, linfoide, y mieloide, que se originan de las celulas progenitoras hematopoyeticas de la medula osea. Tras la exposicion a factores de crecimiento espedficos y otros componentes del microambiente hematopoyetico, las celulas progenitoras hematopoyeticas pueden madurar a traves de una serie de tipos celulares de diferenciacion intermedia, todos los intermediarios del linaje eritroide, a RBC. Por lo tanto, las celulas del "linaje eritroide", como se usa el termino en la presente descripcion, comprenden celulas progenitoras hematopoyeticas, rubriblastos, prorrubricitos, eritroblastos, metarrubricitos, reticulocitos, y eritrocitos.

En alguna modalidad, la celula progenitora hematopoyetica tiene al menos uno de los marcadores de superficie celular caractensticos de las celulas progenitoras hematopoyeticas: CD34+, CD59+, Thy1/CD90+,CD38lo/-, y C-kit/CD117+. Preferentemente, las celulas progenitoras hematopoyeticas tienen varios de estos marcadores.

En algunas modalidades, las celulas progenitoras hematopoyeticas del linaje eritroide tienen los marcadores de superficie celular caractensticos del linaje eritroide: CD71 y Ter119.

Las celulas madre, tales como celulas progenitoras hematopoyeticas, son capaces de proliferary dar lugar a mas celulas progenitoras que tienen la capacidad de generar un gran numero de celulas madre que a su vez pueden dar lugar a celulas hijas diferenciadas o diferenciables. Las celulas hijas de por sf pueden inducirse para que proliferen y produzcan progenie que posteriormente se diferencia a uno o mas tipos de celulas maduras, mientras que tambien conserva una o mas celulas con el potencial de desarrollo de la progenitora. El termino "celula madre" se refiere entonces, a una celula con la capacidad o el potencial, en circunstancias particulares, de diferenciarse a un fenotipo mas especializado o diferenciado, y que conserva la capacidad, en ciertas circunstancias, de proliferar sin diferenciarse sustancialmente. En una modalidad, el termino progenitora o celula madre se refiere a una celula madre generalizada cuyos descendientes (progenie) se especializan, frecuentemente en diferentes direcciones, mediante la diferenciacion, por ejemplo, por adquisicion de caracteres completamente individuales, como se produce en la diversificacion progresiva de celulas y tejidos embrionarios. La diferenciacion celular es un proceso complejo que se produce tfpicamente a traves de muchas divisiones celulares. Una celula diferenciada puede derivarse de una celula multipotente que de por sf se deriva de una celula multipotente, y asf sucesivamente. Si bien cada una de estas celulas multipotentes puede considerarse celulas madre, la variedad de tipos celulares a los que cada una puede dar lugar puede variar considerablemente. Algunas celulas diferenciadas tambien tienen la capacidad de dar lugar a celulas de mayor potencial de desarrollo. Esta capacidad puede ser natural o puede inducirse de manera artificial tras el tratamiento con varios factores. En muchos ejemplos biologicos, las celulas madre tambien son "multipotentes" porque pueden producir progenie de mas de un tipo celular distinto, pero esto no se requiere para su "caracter indiferenciado." La autorrenovacion es la otra parte clasica de la definicion de celula madre, y es esencial como se usa en este documento. En teona, la autorrenovacion puede producirse por cualquiera de dos mecanismos principales. Las celulas madre pueden dividirse asimetricamente, con una hija que conserva el estado indiferenciado y la otra hija que expresa alguna otra funcion y fenotipo espedfico distinto. Alternativamente, algunas de las celulas madre en una poblacion pueden dividirse simetricamente en dos madres, lo que mantiene por lo tanto algunas celulas madre en la poblacion en su conjunto, mientras que otras celulas en la poblacion solo dan lugar a progenie diferenciada. Generalmente, las "celulas progenitoras" tienen un fenotipo celular que es mas primitivo (es decir, se encuentra en una etapa mas temprana en una ruta o progresion del desarrollo que una celula completamente diferenciada). Frecuentemente, las celulas progenitoras tambien tienen un potencial proliferativo significativo o muy alto. Las celulas progenitoras pueden dar lugar a multiples tipos de celulas diferenciadas distintos o un solo tipo de celula diferenciada, en dependencia de la ruta de desarrollo y del ambiente en el que las celulas se desarrollan y se diferencian.

En el contexto de la ontogenia celular, el adjetivo "diferenciado", o "en diferenciacion" es un termino relativo. Una "celula diferenciada" es una celula que ha progresado mas adelante en la ruta de desarrollo que la celula con la que se compara. Por lo tanto, las celulas madre pueden diferenciarse a celulas precursoras de linaje restringido (tales como una celula progenitora hematopoyetica), que a su vez pueden diferenciarse a otros tipos de celulas precursoras mas adelante en la ruta (tales como un precursor de eritrocitos), y despues a una celula diferenciada en etapa final, tal como un eritrocito, que desempena un papel caractenstico en un cierto tipo de tejido, y puede o no conservar la capacidad de proliferar mas.

Celulas madre pluripotentes inducidas

En algunas modalidades, las celulas humanas modificadas geneticamente descritas en la presente descripcion se derivan de celulas madre pluripotentes aisladas. Una ventaja de usar iPSC es que las celulas pueden derivarse del mismo sujeto al que las celulas progenitoras se administraran. Es dedr, una celula somatica puede obtenerse de un sujeto, reprogramarse a una celula madre pluripotente inducida, y despues rediferenciarse a una celula progenitora hematopoyetica que se administrara al sujeto (por ejemplo, celulas autologas). Dado que las progenitoras se derivan esencialmente de una fuente autologa, el riesgo de rechazo al injerto o de respuestas alergicas se reduce en comparacion con el uso de celulas de otro sujeto o grupo de sujetos. En algunas modalidades, las progenitoras hematopoyeticas se derivan de fuentes no autologas. Ademas, el uso de iPSC invalida la necesidad de celulas obtenidas de una fuente embrionaria. Por lo tanto, en una modalidad, las celulas madre usadas en los metodos descritos no son celulas madre embrionarias.

Aunque la diferenciacion es generalmente irreversible en contextos fisiologicos, recientemente se han desarrollado varios metodos para reprogramar celulas somaticas a celulas madre pluripotentes inducidas. Los metodos ilustrativos se conocen por los expertos en latecnica y se describen brevemente en la presente descripcion mas abajo.

Como se usa en la presente descripcion, el termino "reprogramacion" se refiere a un proceso que altera o invierte el estado de diferenciacion de una celula diferenciada (por ejemplo, una celula somatica). Dicho de otra manera, la reprogramacion se refiere a un proceso para dirigir la diferenciacion de una celula de vuelta a un tipo de celula indiferenciada o mas primitiva. Debe senalarse que colocar muchas celulas primarias en cultivo puede conducir a cierta perdida de las caractensticas completamente diferenciadas. Por lo tanto, el simple cultivo de tales celulas incluidas en el termino celulas diferenciadas no convierte a estas celulas en celulas no diferenciadas (por ejemplo, celulas indiferenciadas) o celulas pluripotentes. La transicion de una celula diferenciada a la pluripotencia requiere un estfmulo de reprogramacion mas alla de los estfmulos que conducen a la perdida parcial del caracter diferenciado en cultivo. Las celulas reprogramadas tambien tienen la caractenstica de ser capaces de someterse a pases prolongados sin perdida del potencial de crecimiento, con relacion a las celulas primarias progenitoras, que generalmente son capaces solamente de un numero limitado de divisiones en cultivo.

La celula a reprogramar puede estar parcialmente o terminalmente diferenciada antes de la reprogramacion. En algunas modalidades, la reprogramacion abarca la inversion completa del estado de diferenciacion de una celula diferenciada (por ejemplo, una celula somatica) a un estado pluripotente o un estado multipotente. En algunas modalidades, la reprogramacion abarca la inversion completa o parcial del estado de diferenciacion de una celula diferenciada (por ejemplo, una celula somatica) a una celula indiferenciada (porejemplo, una celula detipo embrionario). La reprogramacion puede dar como resultado la expresion de genes particulares por las celulas, cuya expresion contribuye aun mas a la reprogramacion. En ciertas modalidades descritas en la presente descripcion, la reprogramacion de una celula diferenciada (por ejemplo, una celula somatica) provoca que la celula diferenciada asuma un estado indiferenciado (por ejemplo, es una celula indiferenciada). Las celulas resultantes se denominan "celulas reprogramadas," o "celulas madre pluripotentes inducidas (iPSC o celulas iPS)."

La reprogramacion puede involucrarla alteracion, por ejemplo, inversion, de al menos algunos de los patrones hereditarios de modificacion de acidos nucleicos (por ejemplo, metilacion), condensacion de la cromatina, cambios epigeneticos, impronta genomica, etcetera, que se producen durante la diferenciacion celular. La reprogramacion es distinta al simple mantenimiento del estado indiferenciado existente de una celula que ya es pluripotente o al mantenimiento del estado menos de completamente diferenciado existente de una celula que ya es una celula multipotente (por ejemplo, una celula madre hematopoyetica). La reprogramacion tambien es distinta a la simple promocion de la autorrenovacion o la proliferacion de celulas que ya son pluripotentes o multipotentes, aunque las composiciones y metodos descritos en la presente descripcion tambien pueden ser utiles para tales propositos, en algunas modalidades.

El enfoque o metodo espedfico usado para generar celulas madre pluripotentes a partir de celulas somaticas (denominado de manera general "reprogramacion") no es cntico para la invencion reivindicada. Por lo tanto, cualquier metodo que reprograme una celula somatica al fenotipo pluripotente sera adecuado para el uso en los metodos descritos en la presente descripcion.

Las metodologfas de reprogramacion para generar celulas pluripotentes con el uso de combinaciones definidas de factores de transcripcion se ha descrito para celulas madre pluripotentes inducidas. Yamanaka y Takahashi convirtieron celulas somaticas de raton a celulas del tipo celulas ES con potencial de desarrollo ampliado mediante la transduccion directa de Oct4, Sox2, Klf4, y c-Myc (Takahashi y Yamanaka, 2006). Las iPSC se asemejan a las celulas ES dado que restablecen el circuito transcripcional asociado a la pluripotencia y gran parte de la arquitectura epigenetica. Ademas, las iPSC de raton satisfacen todos los ensayos estandares para pluripotencia: espedficamente, la diferenciacion in vitro a tipos celulares de las tres capas germinales, formacion de teratomas, contribucion a quimeras, transmision de la lmea germinal (Maherali y Hochedlinger, 2008), y complementacion tetraploide (Woltjen y otros, 2009).

Estudios posteriores han demostrado que pueden obtenerse celulas iPS humanas con el uso de metodos de transduccion similares (Lowry y otros, 2008; Park y otros, 2008; Takahashi y otros, 2007; Yu y otros, 2007b), y el tno de factores de transcripcion, OCT4, SOX2, y NANOg , se ha establecido como el conjunto central de factores de transcripcion que gobierna la pluripotencia (Jaenisch y Young, 2008). La produccion de celulas iPS puede lograrse mediante la introduccion de secuencias de acidos nucleicos que codifican genes asociados a celulas madre en una celula somatica, adulta, historicamente con el uso de vectores virales.

Las celulas iPS pueden generarse o derivarse de celulas somaticas terminalmente diferenciadas, as ^ como de celulas madre adultas, o celulas madre somaticas. Es decir, una celula progenitora no pluripotente puede volverse pluripotente o multipotente por reprogramacion. En tales casos, puede no ser necesario incluirtantos factores de reprogramacion como los requeridos para reprogramar una celula terminalmente diferenciada. Ademas, la reprogramacion puede inducirse mediante la introduccion no viral de factores de reprogramacion, por ejemplo, mediante la introduccion de las protemas en sf, o mediante la introduccion de acidos nucleicos que codifican los factores de reprogramacion, o mediante la introduccion de ARN mensajeros que tras la traduccion producen los factores de reprogramacion (ver por ejemplo, Warren y otros, Cell Stem Cell, 2010 Nov 5;7(5):618-30). La reprogramacion puede lograrse mediante la introduccion de una combinacion de acidos nucleicos que codifican genes asociados a celulas madre que incluyen, por ejemplo Oct-4 (tambien conocido como Oct-3/4 o Pouf51), Sox1, Sox2, Sox3, Sox 15, Sox 18, NANOG, , Klf1, Klf2, Klf4, Klf5, NR5A2, c-Myc, l-Myc, n-Myc, Rem2, Tert, y LIN28. En una modalidad, la reprogramacion con el uso de los metodos y composiciones descritos en la presente descripcion puede comprender ademas introducir uno o mas de Oct-3/4, un miembro de la familia Sox, un miembro de la familia Klf, y un miembro de la familia Myc a una celula somatica. En una modalidad, los metodos y composiciones descritos en la presente descripcion comprenden ademas introducir uno o mas de cada uno de Oct 4, Sox2, Nanog, c-MYC y Klf4 para la reprogramacion. Como se senalo anteriormente, el metodo exacto usado para la reprogramacion no es necesariamente cntico para los metodos y composiciones descritos en la presente descripcion. Sin embargo, cuando las celulas diferenciadas a partir de las celulas reprogramadas van a usarse, por ejemplo, en la terapia humana, en una modalidad la reprogramacion no se efectua mediante un metodo que altere el genoma. Por lo tanto, en tales modalidades, la reprogramacion se logra, por ejemplo, sin el uso de vectores virales o plasmfdicos.

La eficiencia de la reprogramacion (es decir, el numero de celulas reprogramadas) derivada de una poblacion de celulas de partida puede aumentarse mediante la adicion de varias moleculas pequenas como se muestra en Shi, Y., y otros (2008) Cell-Stem Cell 2:525-528, Huangfu, D., y otros (2008) Nature Biotechnology 26(7):795-797, y Marson, A., y otros (2008) Cell-Stem Cell 3:132-135. Por lo tanto, un agente o combinacion de agentes que aumentan la eficiencia o la tasa de produccion de celulas madre pluripotentes inducidas puede usarse en la produccion de iPSC espedficas del paciente o espedficas de la enfermedad. Algunos ejemplos no limitantes de agentes que aumentan la eficiencia de la reprogramacion incluyen Wnt soluble, medio acondicionado con Wnt, BIX-01294 (una histona metiltransferasa G9a), PD0325901 (un inhibidor de MEK), inhibidores de ADN metiltransferasa, inhibidores de histona deacetilasa (HDAC), acido valproico, 5'-azacitidina, dexametasona, acido suberoilanilidahidroxamico (SAHA), vitamina C, y tricostatina (TSA), entre otros.

Otros ejemplos no limitantes de agentes potenciadores de la reprogramacion incluyen: acido suberoilanilidahidroxamico (SAHA (por ejemplo, MK0683, vorinostat) y otros acidos hidroxamicos), BML-210, depudecina (por ejemplo, (-)-depudecina), toxina HC, Nullscript (4-(1,3-dioxo-1H,3H-benzo[de]isoquinolin-2-il)-N-hidroxibutanamida), fenilbutirato (por ejemplo, fenilbutirato de sodio) y acido valproico ((VPA) y otros acidos grasos de cadena corta), scriptaid, suramina sodica, tricostatina A (TSA), APHA compuesto 8, apicidina, butirato de sodio, pivaloiloximetil butirato (Pivanex, AN-9), trapoxina B, clamidocina, depsipeptido (tambien conocido como FR901228 o FK228), benzamidas (por ejemplo, CI-994 (por ejemplo, N-acetil dinalina) y MS-27-275), MGCD0103, NVP-LAQ-824, CBHA (acido m-carboxicinamico acido bishidroxamico), JNJ16241199, tubacina, A-161906, proxamida, oxamflatina, 3-Cl-UCHA (por ejemplo, acido 6-(3-clorofenilureido)caproico hidroxamico), AOE (acido 2-amino-8-oxo-9,10-epoxidecanoico), CHAP31 y CHAP 50. Otros agentes potenciadores de la reprogramacion incluyen, por ejemplo, formas negativas dominantes de las HDAC (por ejemplo, formas cataltticamente inactivas), ARNip inhibidores de las HDAC, y anticuerpos que se unen espedficamente a las HDAC. Tales inhibidores se comercializan, por ejemplo, por BIOMOL International, Fukasawa, Merck Biosciences, Novartis, Gloucester Pharmaceuticals, Aton Pharma, Titan Pharmaceuticals, Schering AG, Pharmion, MethylGene, y Sigma Aldrich.

Para confirmar la induccion de celulas madre pluripotentes para el uso con los metodos descritos en la presente descripcion, pueden probarse clones aislados en cuanto a la expresion de un marcador de celulas madre. Tal expresion en una celula derivada de una celula somatica identifica las celulas como celulas madre pluripotentes inducidas. Los marcadores de celulas madre pueden seleccionarse del grupo no limitante que incluye s Se a 3, SSEA4, CD9, Nanog, Fbx15, Ecat1, Esg1, Eras, Gdf3, Fgf4, Cripto, Dax1, Zpf296, Slc2a3, Rex1, Utf1, y Natl. En una modalidad, una celula que expresa Oct4 o Nanog se identifica como pluripotente. Los metodos para detectar la expresion de tales marcadores pueden incluir, por ejemplo, RT-PCR y metodos inmunologicos que detectan la presencia de los polipeptidos codificados, tales como analisis de transferencia Western o de citometna de flujo. En algunas modalidades, la deteccion no involucra solamente RT-PCR, sino que tambien incluye la deteccion de marcadores proteicos. Los marcadores intracelulares pueden identificarse mejor por medio de r T-PCR, mientras que los marcadores de superficie celular se identifican facilmente, por ejemplo, por inmunocitoqmmica.

El caracter de celula madre pluripotente de las celulas aisladas puede confirmarse por pruebas que evaluan la capacidad de las iPSC de diferenciarse a celulas de cada una de las tres capas germinales. Como un ejemplo, la formacion de teratomas en ratones desnudos puede usarse para evaluar el caracter pluripotente de los clones aislados. Las celulas se introducen en ratones desnudos y se realiza la histologfa y/o inmunohistoqmmica de un tumor que surge de las celulas. El crecimiento de un tumor que comprende celulas de las tres capas germinales, por ejemplo, indica ademas que las celulas son celulas madre pluripotentes.

Celulas somaticas para la reprogramacion

Las celulas somaticas, como se usa ese termino en la presente descripcion, se refiere a cualquiera de las celulas que forman el cuerpo de un organismo, con exclusion de las celulas de la lmea germinal. Cada tipo celular en el cuerpo de los mairnferos-aparte del esperma y los ovulos, las celulas a partir de las que se producen (gametocitos) y las celulas madre indiferenciadas-es una celula somatica diferenciada. Por ejemplo, los organos internos, la piel, huesos, sangre, y tejido conectivo estan formados por celulas somaticas diferenciadas.

Los tipos de celulas somaticas para el uso con las composiciones y metodos descritos en la presente descripcion incluyen: un fibroblasto (por ejemplo, un fibroblasto primario), una celula muscular (por ejemplo, un miocito), una celula del cumulo, una celula neuronal, una celula mamaria, un hepatocito y una celula de los islotes pancreaticos. En algunas modalidades, la celula somatica es una lmea celular primaria o es la progenie de una lmea celular primaria o secundaria. En algunas modalidades, la celula somatica se obtiene de una muestra humana, por ejemplo, un folmulo piloso, una muestra de sangre, una biopsia (por ejemplo, una biopsia de piel o una biopsia adiposa), una muestra de frotis (por ejemplo, una muestra de frotis oral), y por lo tanto es una celula somatica humana.

Algunos ejemplos no limitantes de celulas somaticas diferenciadas incluyen, pero no se limitan a, celulas epiteliales, endoteliales, neuronales, adiposas, cardfacas, de musculo esqueletico, celulas inmunitarias, hepaticas, esplenicas, de pulmon, celulas sangumeas circulantes, gastrointestinales, renales, de medula osea, y pancreaticas. En algunas modalidades, una celula somatica puede ser una celula primaria aislada a partir de cualquier tejido somatico que incluye, pero no se limita a cerebro, hugado, intestino, estomago, intestino, grasa, musculo, utero, piel, bazo, organo endocrino, hueso, etcetera. Ademas, la celula somatica puede ser de cualquier especie de marnffero, con ejemplos no limitantes que incluyen una celula murina, bovina, de simio, porcina, equina, ovina, o humana. En algunas modalidades, la celula somatica es una celula somatica humana.

Cuando las celulas reprogramadas se usan para la generacion de celulas progenitoras hematopoyeticas a usar en el tratamiento terapeutico de una enfermedad, es conveniente, pero no se requiere, usar celulas somaticas aisladas del paciente a tratar. Por ejemplo, pueden usarse las celulas somaticas involucradas en enfermedades, y celulas somaticas que participan en el tratamiento terapeutico de enfermedades y similares. En algunas modalidades, un metodo para seleccionar las celulas reprogramadas a partir de una poblacion heterogenea que comprende celulas reprogramadas y celulas somaticas de las que se derivaron o generaron puede realizarse por cualquiera de los medios conocidos. Por ejemplo, un gen de resistencia a farmaco o similar, tal como un gen marcador de seleccion puede usarse para aislar las celulas reprogramadas con el uso del marcador de seleccion como mdice.

Las celulas somaticas reprogramadas como se describe en la presente descripcion pueden expresar cualquier numero de marcadores de celulas pluripotentes, que incluyen: fosfatasa alcalina (AP); ABCG2; antfgeno embrionario-1 espedfico de etapa (SSEA-1); SSEA-3; SSEA-4; TRA-1-60; TRA-1-81; Tra-2-49/6E; ERas/ECAT5, E-caderina; p-III-tubulina; aactina de musculo liso (a-SMA); factor de crecimiento de fibroblastos 4 (Fgf4), Cripto, Dax1; protema de dedos de zinc 296 (Zfp296); N-acetiltransferasa-1 (Natl); (transcrito 1 asociado a celulas ES (ECAT1); ESG1/DPPA5/ECAT2; ECAT3; ECAT6; ECAT7; ECAT8; ECAT9; ECAT10; ECAT15-1; ECAT15-2; Fthl17; Sal14; factor de transcripcion de celulas embrionarias indiferenciadas (Utf1); Rex1; p53; G3PDH; telomerasa, que incluye TERT; genes del cromosoma X silente; Dnmt3a; Dnmt3b; TRIM28; protema 15 que contiene caja F (Fbx15); Nanog/ECAT4; Oct3/4; Sox2; Klf4; c-Myc; Esrrb; TDGF1; GABRB3; Zfp42, FoxD3; GDF3; CYP25A1; protema 2 del desarrollo asociada a la pluripotencia (DPpA2); punto de ruptura de linfoma de celulas T 1 (Tell); DPPA3/Stella; DPPA4; otros marcadores generales de pluripotencia, etcetera. Otros marcadores pueden incluir Dnmt3L; Sox15; Stat3; Grb2; p-catenina, y Bmi1. Tales celulas pueden caracterizarse ademas por la regulacion negativa de marcadores caractensticos de la celula somatica de la que se deriva la celula madre pluripotente inducida.

Edicion del genoma y endonucleasas dirigidas a ADN

Como se usa en la presente descripcion, el termino "edicion del genoma" se refiere a un metodo de genetica inversa que usa nucleasas modificadas geneticamente de manera artificial para cortar y crear rupturas bicatenarias espedficas en una(s) ubicacion(ones) deseada(s) en el genoma, que despues se reparan por procesos celulares endogenos tales como, recombinacion homologa (HR), reparacion dirigida por homologfa (HDR) y union de extremos no homologos (NHEJ). La NHEJ une directamente los extremos de ADN en una ruptura bicatenaria, mientras que la HDR utiliza una secuencia homologa como plantilla para regenerar la secuencia de ADN que falta en el punto de ruptura.

La edicion del genoma no puede realizarse con el uso de endonucleasas de restriccion tradicionales dado que la mayona de las enzimas de restriccion reconocen unos pocos pares de bases en el ADN como su diana y es muy alta la probabilidad de que la combinacion de pares de bases reconocida se encuentre en muchas ubicaciones en el genoma lo que da como resultado multiples cortes (es dear, no se limita a una ubicacion deseada). Para superar este reto y crear rupturas bicatenarias sitio espedficas, varias clases distintas de nucleasas se han descubierto y biomodificado hasta la fecha. Estas son las meganucleasas, nucleasas de dedos de zinc (ZFN), el sistema Cas9/CRISPR, y las nucleasas efectoras tipo activador de la transcripcion (TALEN).

Las meganucleasas se agrupan comunmente en cuatro familias: la familia LAGLIDADG (sec. con num. de ident.: 1), la familia GIY-YIG, la familia de caja His-Cys y la familia HNH. Estas familias se caracterizan por motivos estructurales, que afectan la actividad catalftica y la secuencia de reconocimiento. Por ejemplo, los miembros de la familia LAGLIDADG (sec. con num. de ident.: 1) se caracterizan portener una o dos copias del motivo conservado LAGLIDADG (sec. con num. de ident.: 1) (ver Chevalier y otros (2001), Nucleic Acids Res.29(18): 3757-3774). Las meganucleasas LAGLIDADG (sec. con num. de ident.: 1) con una sola copia del motivo LAGLIDADG (sec. con num. de ident.: 1) forman homodfmeros, mientras que los miembros con dos copias del LAGLIDADG (sec. con num. de ident.: 1) se encuentran como monomeros. De manera similar, los miembros de la familia GIY-YIG tienen un modulo GIY-YIG, que tiene 70-100 residuos de longitud e incluye cuatro o cinco motivos de secuencia conservados con cuatro residuos invariantes, dos de los cuales se requieren para la actividad (ver Van Roey y otros (2002), Nature Struct. Biol. 9: 806-811). Las meganucleasas de caja His-Cys se caracterizan por una serie altamente conservada de histidinas y cistemas en una region que abarca varios cientos de residuos de aminoacidos (ver Chevalier y otros (2001), Nucleic Acids Res. 29(18): 3757-3774). En el caso de la familia NHN, los miembros se definen por motivos que contienen dos pares de histidinas conservadas rodeadas por residuos de asparagina (ver Chevalier y otros (2001), Nucleic Acids Res. 29(18): 3757-3774). Las cuatro familias de meganucleasas se diferencian mucho entre sf con respecto a elementos estructurales conservados y, en consecuencia, a la especificidad de la secuencia de reconocimiento de ADN y la actividad catalftica.

Las meganucleasas se encuentran comunmente en especies microbianas y tienen la propiedad unica de tener secuencias de reconocimiento muy largas (>14 pb) lo que las hace por lo tanto naturalmente muy espedficas para el corte en una ubicacion deseada. Esto puede explotarse para producir rupturas bicatenarias sitio espedficas en la edicion del genoma. El experto en la tecnica puede usar estas meganucleasas de origen natural, sin embargo el numero de tales meganucleasas de origen natural es limitado. Para superar este reto, se han usado metodos de mutagenesis y tamizaje de alta productividad para crear variantes de meganucleasas que reconocen secuencias unicas. Por ejemplo, varias meganucleasas se han fusionado para crear enzimas tubridas que reconocen una secuencia nueva. Alternativamente, los aminoacidos de la meganucleasa que interactuan con el ADN pueden alterarse para disenar meganucleasas espedficas de secuencias (ver por ejemplo, la patente de Estados Unidos 8,021,867). Las meganucleasas pueden disenarse con el uso de los metodos descritos por ejemplo, en Certo, MT y otros Nature Methods (2012) 9:073-975; las patentes de Estados Unidos nums. 8,304,222; 8,021,867; 8,119,381; 8,124,369; 8,129,134; 8,133,697; 8,143,015; 8,143,016; 8,148,098; o 8,163,514. Alternativamente, las meganucleasas con caractensticas de corte sitio espedfico pueden obtenerse con el uso de tecnologfas disponibles en el mercado por ejemplo, la tecnolog^a de edicion del genoma Directed Nuclease Editor™ de Precision BioSciences.

La tecnologfa de endonucleasas de restriccion ZFN y TALEN utiliza una enzima de corte de ADN no espedfica unida a un(os) peptido(s) que reconoce(n) una secuencia de ADN espedfica tal(es) como dedos de zinc y efectores tipo activador de la transcripcion (TALE). Tfpicamente se selecciona una endonucleasa cuyo sitio de reconocimiento y su sitio de escision del ADN estan separados entre sf y su porcion de escision se separa y despues se une a un peptido de reconocimiento de secuencia, para producir de este modo una endonucleasa con una especificidad muy alta por una secuencia deseada. Una enzima de restriccion ilustrativa con tales propiedades es FokI. Adicionalmente FokI tiene la ventaja de requerir dimerizacion para tener actividad nucleasa y esto significa que la especificidad aumenta drasticamente dado que cada pareja de la nucleasa reconoce una secuencia de ADN unica. Para aumentar este efecto, se han modificado geneticamente nucleasas FokI que solo pueden funcionar como heterodfmeros y tienen mayor actividad catalftica. Las nucleasas que funcionan como heterodfmeros evitan la posibilidad de actividad de homodfmeros no deseada y por lo tanto aumenta la especificidad de la ruptura bicatenaria.

Aunque las porciones nucleasas tanto de ZFN como de TALEN tienen propiedades similares, la diferencia entre estas nucleasas modificadas geneticamente esta en su peptido de reconocimiento del ADN. Las ZFN se basan en dedos de zinc Cys2-His2 y las TALEN en los TALE. Ambos de estos dominios de peptido de reconocimiento del ADN tienen la caractenstica de encontrarse naturalmente en combinaciones en sus protemas. Los dedos de zinc Cys2-His2 aparecen tfpicamente en repeticiones separadas por 3 pb y se encuentran en diversas combinaciones en una variedad de protemas que interactuan con acidos nucleicos tales como factores de transcripcion. Los TALE por otra parte se encuentran en repeticiones con una relacion de reconocimiento uno a uno entre los aminoacidos y los pares de nucleotidos reconocidos. Dado que tanto los dedos de zinc como los TALE aparecen en patrones repetidos, pueden probarse diferentes combinaciones para crear una gran variedad de especificidades de secuencia. Los enfoques para producir endonucleasas con dedos de zinc sitio espedficas incluyen, por ejemplo, ensamblaje modular (donde los dedos de zinc correlacionados con una secuencia de triplete se unen consecutivamente para cubrir la secuencia requerida), OPEN (seleccion de bajo rigor de dominios peptfdicos vs. tripletes de nucleotidos seguido de selecciones de alto rigor de combinacion de peptidos vs. la diana final en sistemas bacterianos), y tamizaje en un hubrido bacteriano de bibliotecas de dedos de zinc, entre otros. Las ZFN para el uso con los metodos y composiciones descritos en la presente descripcion pueden obtenerse comercialmente de por ejemplo, Sangamo Biosciences™ (Richmond, CA).

Se contempla en la presente descripcion que el sistema Cas9/CRISPR de edicion del genoma se emplee con los metodos y composiciones descritos en la presente descripcion. Los sistemas de repeticiones palindromicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR)/asociado a CRISPR (Cas) son utiles para la edicion del genoma programable por ARN (ver por ejemplo, Jinek, M. y otros Science (2012) 337(6096):816-821).

Alternativamente, la edicion del genoma puede realizarse con el uso de modificacion del genoma basada en virus adenoasociado recombinante (rAAV), que es una plataforma de edicion del genoma centrada alrededor del uso de vectores rAAV que hace posible la insercion, delecion o sustitucion de secuencias de ADN en los genomas de celulas de mairnfero vivos. El genoma de rAAV es una molecula de acido desoxirribonucleico monocatenario (ADNmc), con sentido positivo o negativo, que tiene aproximadamente 4,7 kilobases de longitud. Estos vectores virales de ADN monocatenario tienen tasas de transduccion altas y tienen una propiedad unica de estimular la recombinacion homologa endogena en ausencia de rupturas bicatenarias del ADN en el genoma. El experto en la tecnica puede disenar un vector rAAV para dirigirlo a un locus genomico deseado y realizar alteraciones grandes y/o sutiles a los genes endogenos en una celula, tales como una delecion. La edicion del genoma por rAAV tiene la ventaja de que se dirige a un solo alelo y no da como resultado alteraciones genomicas fuera de la diana. La tecnologfa de edicion del genoma por rAAV esta disponible en el mercado, porejemplo, el sistema rAAV GENESIS™ de Horizon™ (Cambridge, Reino Unido).

Portadores farmaceuticamente aceptables

Los metodos para administrar progenitoras hematopoyeticas humanas a un sujeto como se describe en la presente descripcion involucran el uso de composiciones terapeuticas que comprenden celulas progenitoras hematopoyeticas. Las composiciones terapeuticas contienen un portador fisiologicamente tolerable junto con la composicion de celulas y opcionalmente al menos un agente bioactivo adicional como se describe en la presente descripcion, disuelto o disperso en esta como un ingrediente activo. En una modalidad preferida, la composicion terapeutica no es sustancialmente inmunogenica cuando se administra a un m a i^e ro o un paciente humano para propositos terapeuticos, a menos que asf se desee.

En general, las celulas progenitoras hematopoyeticas descritas en la presente descripcion se administran como una suspension con un portador farmaceuticamente aceptable. El experto en la tecnica reconocera que un portador farmaceuticamente aceptable a usar en una composicion de celulas no incluira amortiguadores, compuestos, agentes de crioconservacion, conservantes, u otros agentes en cantidades que interfieren sustancialmente con la viabilidad de las celulas a suministrar al sujeto. Una formulacion que comprende celulas puede incluir por ejemplo, amortiguadores osmoticos que permiten mantener la integridad de la membrana celular, y opcionalmente, nutrientes para mantener la viabilidad celular o aumentar el injerto tras la administracion. Tales formulaciones y suspensiones se conocen por los expertos en la tecnica y/o pueden adaptarse para el uso con las celulas progenitoras hematopoyeticas como se describe en la presente descripcion con el uso de experimentacion de rutina.

Una composicion de celulas tambien puede emulsionarse o presentarse como una composicion de liposomas, siempre y cuando el procedimiento de emulsificacion no afecte negativamente la viabilidad celular. Las celulas y cualquier otro ingrediente activo pueden mezclarse con excipientes que son farmaceuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo y en cantidades adecuadas para el uso en los metodos terapeuticos descritos en la presente descripcion.

Los agentes adicionales incluidos en una composicion de celulas como se describe en la presente descripcion pueden incluir sales farmaceuticamente aceptables de sus componentes. Las sales farmaceuticamente aceptables incluyen las sales de adicion de acido (formadas con los grupos amino libres del polipeptido) que se forman con acidos inorganicos tales como, por ejemplo, acidos clortndrico o fosforico, o acidos organicos tales como acetico, tartarico oxalico, mandelico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres tambien pueden derivarse de bases inorganicas tales como, por ejemplo, hidroxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o ferrico, y bases organicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procama y similares. Los portadores fisiologicamente tolerables se conocen bien en la tecnica. Los portadores lfquidos ilustrativos son soluciones acuosas esteriles que no contienen materiales ademas de los ingredientes activos y agua, o contienen un amortiguadortal como fosfato de sodio a valor de pH fisiologico, solucion salina fisiologica o ambos, tales como solucion salina regulada por fosfato. Aun mas, los portadores acuosos pueden contener mas de una sal amortiguadora, asf como sales tales como cloruros de sodio y potasio, dextrosa, polietilenglicol y otros solutos. Las composiciones lfquidas tambien pueden contener fases lfquidas ademas de y para la exclusion del agua. Ejemplos de tales fases lfquidas adicionales son glicerina, aceites vegetales tales como aceite de semilla de algodon, y emulsiones de agua en aceite. La cantidad de un compuesto activo usado en las composiciones celulares como se describe en la presente descripcion que es eficaz en el tratamiento de un trastorno o afeccion particular dependera de la naturaleza del trastorno o afeccion, y puede determinarse mediante tecnicas clmicas estandares.

Administracion & Eficacia

Como se usa en la presente descripcion, los terminos "administrar," "introducir" y "trasplantar" se usan indistintamente en el contexto de la colocacion de celulas, por ejemplo celulas progenitoras hematopoyeticas, como se describe en la presente descripcion en un sujeto, mediante un metodo o via que da como resultado la localizacion al menos parcial de las celulas introducidas en un sitio deseado, tal como un sitio de lesion o reparacion, de modo que se produce(n) un(os) efecto(s) deseado(s). Las celulas porejemplo celulas progenitoras hematopoyeticas, o su progenie diferenciada pueden administrarse por cualquier via adecuada que de como resultado el suministro a una ubicacion deseada en el sujeto donde al menos una porcion de las celulas implantadas o componentes de las celulas se mantiene viable. El penodo de viabilidad de las celulas despues de la administracion a un sujeto puede ser tan corto como unas pocas horas, por ejemplo, veinticuatro horas, hasta algunos dfas, hasta tan largo como varios anos, es decir, injerto a largo plazo. Por ejemplo, en algunas modalidades, una cantidad eficaz de celulas progenitoras hematopoyeticas se administra por medio de una via de administracion sistemica, tal como una via intraperitoneal o intravenosa.

Cuando se proporcionan profilacticamente, las celulas progenitoras hematopoyeticas descritas en la presente descripcion pueden administrarse a un sujeto antes de cualquier smtoma de una hemoglobinopatfa, porejemplo, antes del cambio de Y-globina fetal a predominantemente p-globina. Por consiguiente, la administracion profilactica de una poblacion de celulas progenitoras hematopoyeticas sirve para prevenir una hemoglobinopatia, como se describe en la presente descripcion.

Cuando se proporcionan terapeuticamente, las celulas progenitoras hematopoyeticas se proporcionan en (o despues de) la aparicion de un smtoma o indicio de una hemoglobinopatia, porejemplo, tras la aparicion de la drepanocitosis.

En algunas modalidades, la poblacion de celulas progenitoras hematopoyeticas que se administra de acuerdo con los metodos descritos en la presente descripcion comprende celulas progenitoras hematopoyeticas alogenicas obtenidas de uno o mas donantes. Como se usa en la presente descripcion, "alogenica" se refiere a una celula progenitora hematopoyetica o muestras biologicas que comprenden celulas progenitoras hematopoyeticas obtenidas de uno o mas donantes diferentes de la misma especie, donde los genes en uno o mas loci no son identicos. Por ejemplo, una poblacion de celulas progenitoras hematopoyeticas que se administra a un sujeto puede derivarse de sangre del cordon umbilical obtenida de uno o mas sujetos donantes no relacionados, o de uno o mas hermanos no identicos. En algunas modalidades, pueden usarse poblaciones de celulas progenitoras hematopoyeticas singenicas, tales como las obtenidas de animales geneticamente identicos, o de gemelos identicos. En otras modalidades, las celulas progenitoras hematopoyeticas son celulas autologas; es decir, las celulas progenitoras hematopoyeticas se obtienen o se afslan de un sujeto y se administran al mismo sujeto, es decir, el donante y el receptor son iguales.

Para el uso en las diversas modalidades descritas en la presente descripcion, una cantidad eficaz de celulas progenitoras hematopoyeticas, comprende al menos 102 celulas progenitoras hematopoyeticas, al menos 5 X 102 celulas progenitoras hematopoyeticas, al menos 103 celulas progenitoras hematopoyeticas, al menos 5 X 103 celulas progenitoras hematopoyeticas, al menos 104 celulas progenitoras hematopoyeticas, al menos 5 X 104 celulas progenitoras hematopoyeticas, al menos 105celulas progenitoras hematopoyeticas, al menos 2 X 105 celulas progenitoras hematopoyeticas, al menos 3 X 105 celulas progenitoras hematopoyeticas, al menos 4 X 105celulas progenitoras hematopoyeticas, al menos 5 X 105 celulas progenitoras hematopoyeticas, al menos 6 X 105 celulas progenitoras hematopoyeticas, al menos 7 X 105celulas progenitoras hematopoyeticas, al menos 8 X 105 celulas progenitoras hematopoyeticas, al menos 9 X 105 celulas progenitoras hematopoyeticas, al menos 1 X 106celulas progenitoras hematopoyeticas, al menos 2 X 106 celulas progenitoras hematopoyeticas, al menos 3 X 106 celulas progenitoras hematopoyeticas, al menos 4 X 106celulas progenitoras hematopoyeticas, al menos 5 X 106 celulas progenitoras hematopoyeticas, al menos 6 X 106 celulas progenitoras hematopoyeticas, al menos 7 X 106celulas progenitoras hematopoyeticas, al menos 8 X 106 celulas progenitoras hematopoyeticas, al menos 9 X 106 celulas progenitoras hematopoyeticas, o multiplos de estos. Las celulas progenitoras hematopoyeticas pueden derivarse de uno o mas donantes, o pueden obtenerse de una fuente autologa. En algunas modalidades, las celulas progenitoras hematopoyeticas se expanden en cultivo antes de la administracion a un sujeto que lo necesita.

En una modalidad, el termino "cantidad eficaz" como se usa en la presente descripcion se refiere a la cantidad de una poblacion de celulas progenitoras hematopoyeticas humanas o su progenie necesaria para aliviar al menos uno o mas smtomas de una hemoglobinopatfa, y se refiere a una cantidad suficiente de una composicion para proporcionar el efecto deseado, por ejemplo, tratar a un sujeto que tiene una hemoglobinopatfa. El termino "cantidad terapeuticamente eficaz" por lo tanto se refiere a un numero de celulas progenitoras hematopoyeticas o una composicion que comprende celulas progenitoras hematopoyeticas que es suficiente para promover un efecto particular cuando se administra a un sujeto tipico, tal como uno que tiene o con riesgo de tener una hemoglobinopatfa. Una cantidad eficaz como se usa en la presente descripcion tambien incluira una cantidad suficiente para prevenir o demorar el desarrollo de un smtoma de la enfermedad, alterar el curso de una enfermedad sintomatica (por ejemplo pero no se limita a, enlentecer la progresion de un smtoma de la enfermedad), o revertir un smtoma de la enfermedad. Se entiende que para cualquier caso dado, una "cantidad eficaz" adecuada puede determinarse por un experto en la tecnica con el uso de experimentacion de rutina.

Como se usa en la presente descripcion, "administrado" se refiere al suministro de una composicion de celulas madre hematopoyeticas como se describe en la presente descripcion a un sujeto mediante un metodo o via que da como resultado la localizacion al menos parcial de la composicion de celulas en un sitio deseado. Una composicion de celulas puede administrarse mediante cualquier via adecuada que de como resultado el tratamiento eficaz en el sujeto, es decir la administracion da como resultado el suministro a una ubicacion deseada en el sujeto donde al menos una porcion de la composicion suministrada, es decir al menos 1 x 104 celulas se suministra al sitio deseado durante un penodo de tiempo. Los modos de administracion incluyen inyeccion, infusion, instilacion, o ingestion. "Inyeccion" incluye, sin limitacion, inyeccion e infusion intravenosa, intramuscular, intrarterial, intratecal, intraventricular, intracapsular, intraorbital, intracardfaca, intradermica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutanea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, intracerebroespinal, e intraesternal. Para el suministro de celulas, generalmente se prefiere la administracion por inyeccion o infusion.

En una modalidad, las celulas como se describe en la presente descripcion se administran por via sistemica. Las frases "administracion sistemica," "administrado por via sistemica", "administracion periferica" y "administrado por via periferica" como se usa en la presente descripcion se refiere a la administracion de una poblacion de celulas progenitoras hematopoyeticas que no es directamente en un sitio, tejido, u organo diana, de modo que se introduce, en lugar de esto, en el sistema circulatorio del sujeto y, por lo tanto, esta sujeta al metabolismo y otros procesos similares.

La eficacia de un tratamiento que comprende una composicion como se describe en la presente descripcion para el tratamiento de una hemoglobinopatfa puede determinarse por el profesional medico de experiencia. Sin embargo, un tratamiento se considera "tratamiento eficaz," como se usa el termino en la presente descripcion, si cualquiera de uno o todos los signos o smtomas de, como un ejemplo, los niveles de p-globina fetal se alteran de manera beneficiosa, otros smtomas o marcadores de enfermedad clmicamente aceptados mejoran o se alivian, por ejemplo, en al menos 10 % despues del tratamiento con un inhibidor. La eficacia tambien puede medirse por el no agravamiento de un individuo evaluado por hospitalizacion o necesidad de intervenciones medicas (por ejemplo, la progresion de la enfermedad se detiene o al menos se enlentece). Los metodos para medir estos indicadores se conocen por los expertos en la tecnica y/o se describen en la presente descripcion. El tratamiento incluye cualquier tratamiento de una enfermedad en un individuo o un animal (algunos ejemplos no limitantes incluyen un ser humano, o un mairnfero) e incluye: (1) inhibir la enfermedad, por ejemplo, detener, o enlentecer la progresion de la sepsis; o (2) aliviar la enfermedad, por ejemplo, provocar la regresion de los smtomas; y (3) prevenir o reducir la probabilidad del desarrollo de infeccion o sepsis.

El tratamiento descrito en la presente descripcion alivia uno o mas smtomas asociados con un trastorno de p-globina mediante el aumento de la cantidad de hemoglobina fetal en el individuo. Los smtomas asociados tfpicamente con una hemoglobinopatfa, incluyen por ejemplo, anemia, hipoxia tisular, disfuncion de organos, valores de hematocrito anormales, eritropoyesis ineficaz, recuento anormal de reticulocitos (eritrocitos), carga anormal de hierro, la presencia de sideroblastos anillados, esplenomegalia, hepatomegalia, afectacion del flujo de sangre periferica, disnea, aumento de la hemolisis, ictericia, crisis de dolor anemico, smdrome de pecho agudo, secuestro esplenico, priapismo, ictus, smdrome de mano-pie, y dolor tal como angina de pecho.

En una modalidad, la celula progenitora hematopoyetica se pone en contacto e x v ivo o in v itro con una endonucleasa dirigida a ADN, y la celula o su progenie se administra al marnffero (p o r e jem p lo , un ser humano). En una modalidad adicional, la celula progenitora hematopoyetica es una celula del linaje eritroide. En una modalidad, una composicion comprende una celula progenitora hematopoyetica que se puso en contacto previamente con una endonucleasa dirigida a a Dn y un portador farmaceuticamente aceptable y se administra a un m ai^ero.

En una modalidad, cualquier metodo conocido en la tecnica puede usarse para medir un aumento en la expresion de hemoglobina fetal, p o r e jem p lo , analisis de transferencia Western de la protema hemoglobina fetal y cuantificacion del ARNm de la Y-globina fetal.

En una modalidad, la celula progenitora hematopoyetica se pone en contacto con una endonucleasa dirigida a ADN in vitro, o e x vivo. En una modalidad, la celula es de origen humano (p o r e jem p lo , una celula autologa o heterologa). En una modalidad, la composicion provoca un aumento de la expresion de hemoglobina fetal.

La presente descripcion puede describirse por cualquiera de los siguientes parrafos alfabetizados:

[A] Un metodo para producir una celula progenitora que tiene disminucion del ARNm o la expresion proteica de BCL11A, el metodo comprende poner en contacto una celula progenitora aislada con un agente que se une al ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genomico de la UCSC), para reducir de este modo el ARNm o la expresion proteica de BCL11A.

[B] Un metodo para producir una celula humana modificada geneticamente aislada que tiene al menos una modificacion genetica que comprende poner en contacto una celula aislada con una cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta.

[C] El metodo del parrafo [A] o [B], en donde la celula progenitora aislada o celula aislada es una celula progenitora hematopoyetica.

[D] El metodo del parrafo [C], en donde la progenitora hematopoyetica es una celula del linaje eritroide.

[E] El metodo del parrafo [A] o [B], en donde la celula progenitora aislada o celula aislada es una celula madre pluripotente inducida.

[F] El metodo del parrafo [C], en donde la celula progenitora hematopoyetica se pone en contacto e x v ivo o in vitro.

[G] El metodo de cualquiera de los parrafos [A]-[F], en donde al menos una modificacion genetica es una delecion.

[H] El metodo del parrafo [G], en donde la delecion elimina toda la region entre la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 o elimina una porcion de la region lo que da como resultado la interrupcion de uno o mas sitios hipersensibles a DNAsa 1 (DHS).

[I] Una celula humana modificada geneticamente aislada que tiene al menos una modificacion genetica en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 de acuerdo con los parrafos [B]-[H].

[J] Una composicion que comprende celulas humanas modificadas geneticamente aisladas del parrafo [I].

[K] Un metodo para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en una celula, el metodo comprende las etapas de: poner en contacto una celula aislada con una cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta, de manera que la expresion de hemoglobina fetal aumenta en dicha celula, o su progenie, con relacion a dicha celula antes de dicho contacto.

[L] El metodo del parrafo [K], en donde la celula aislada es una celula progenitora hematopoyetica.

[M] El metodo del parrafo [K] o [L], en donde la celula progenitora hematopoyetica es una celula del linaje eritroide.

[N] El metodo del parrafo [K], en donde la celula aislada es una celula madre pluripotente inducida.

[O] El metodo del parrafo [L] o [M], en donde la celula progenitora hematopoyetica se pone en contacto ex vivo o in vitro.

[P] El metodo de cualquiera de los parrafos [K]-[O], en donde al menos una modificacion genetica es una delecion.

[Q] El metodo del parrafo [P], en donde la delecion elimina toda la region entre la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 o elimina una porcion de la region lo que da como resultado la interrupcion de uno o mas sitios hipersensibles a DNAsa 1 (DHS).

[R] Un metodo para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en un mairnfero que lo necesita, el metodo comprende las etapas de poner en contacto una celula progenitora hematopoyetica aislada en dicho mamffero con una cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta, de manera que la expresion de la hemoglobina fetal aumenta en dicho mamffero, con relacion a la expresion antes del contacto.

Esta invencion se ilustra ademas por los siguientes ejemplos, los cuales no deben interpretarse como limitantes.

EJEMPLO

Los inventores han descubierto y caracterizado elementos reguladores del gen de BCL11A que son cnticos para su expresion en celulas de linaje eritroide. Las variantes geneticas comunes dentro de estas secuencias se asocian con el nivel de hemoglobina fetal y la gravedad del trastorno de beta-globina. Estas secuencias comprenden elementos reguladores distales con una firma de cromatina de potenciador, que posee cromatina accesible, marcas de histonas activas, y ocupacion por factores de transcripcion eritroides. Estos elementos interaction con el promotor de BCL11A y promueven la expresion genica en celulas eritroides pero no en otros linajes que expresan BCL11A tales como linfocitos B. Estos elementos reguladores pueden utilizarse como dianas para propositos terapeuticos para lograr la inhibicion de BCL11A y la reinduccion de la hemoglobina fetal. Esto puede lograrse por mecanismos que no se limitan a la edicion del genoma, la union a acidos nucleicos o proternas, y la modificacion epigenetica. Las ventajas de este metodo incluyen: interrupcion de un reguladorfisiologico del nivel de hemoglobina fetal que da como resultado el aumento de la produccion de gamma-globina y reduccion de la produccion de beta-globina; efecto mrnimo sobre la produccion de globina global o sobre la produccion o funcion de globulos rojos; limitacion del impacto sobre celulas fuera del linaje eritroide lo que reduce por lo tanto la toxicidad potencial.

Materiales y Metodos

Cultivo de celulas

Las celulas CD34+ humanas de sangre periferica movilizada de donantes sanos se obtuvieron de Centros de Excelencia en Hematologfa Molecular de la Universidad de Yale, New Haven, Connecticut y el Centro de Investigaciones del Cancer Fred Hutchinson, Seattle, Washington. Las celulas se sometieron a maduracion eritroide ex vivo con un protocolo de cultivo lfquido libre de suero en dos fases como se describio previamente (39). Las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) se obtuvieron de donantes sanos del Hospital Pediatrico de Boston. La diferenciacion eritroide a partir de las PBMC se realizo como se describio previamente (40). Las celulas de eritroleucemia de raton (MEL) y las celulas 293T se cultivaron como se describio previamente (39). Las celulas murinas de linfocitos pre-B con transformacion estable de v-Abl (obtenidas como se describio (41)) se cultivaron en RPMI mas 2 % de penicilina-estreptomicina, 15 % de FCS, 2 % de HEPES, 1 % de aminoacidos no esenciales, 1 % de piruvato de sodio, 1 % de L-glutamina y 100 pM de pmercaptoetanol.

ChIP y sensibilidad a DNAsa I

La inmunoprecipitacion de la cromatina y la secuenciacion masiva en paralelo se realizaron como se describio (39). Se usaron los siguientes anticuerpos: H3K27me3 (Millipore, 07-449), H3K4me3 (Millipore, 04-745), H3K4me1 (Abcam, ab8895), H3K27ac (Abcam, ab4729), ARN Polimerasa II (PolII, Santa Cruz, sc-899), GATA1 (Abcam, ab11852) y TAL1 (Santa Cruz, sc-12984). La densidad de escision por DNAsa I se realizo y se analizo como se describio previamente (42). Para el ChIP-qPCR, el enriquecimiento relativo se determino mediante la comparacion de la amplificacion del material de ChIP con 1 % de cromatina inicial por el metodo de ACt. Los loci previamente informados como ocupados y no ocupados por GATA1 y TAL1 se usaron como controles positivos y negativos respectivamente (39).

Captura de la conformacion cromosomica (3C)

El ensayo 3C se realizo como se describio previamente (39) excepto por lo siguiente. Los nucleos de los precursores eritroides humanos primarios reticulados con formaldetndo se digirieron con HindIII antes de la ligacion y la inversion de las reticulaciones. La PCR en tiempo real cuantitativa se realizo con el uso de la mezcla iQ SYBR Green Supermix (Bio Rad, 170-8880). Un fragmento que contiene el promotor de BCL11A se uso como la region de anclaje. Para corregir la eficiencia de amplificacion de diferentes cebadores, se preparo una plantilla de control mediante digestion y ligacion de una mezcla equimolar de dos cromosomas artificiales bacterianos (BAC) que comprenden el locus de B C L llA humano completo (RP11-606L8 y RP11-139C22) y uno el grupo de p-globinas humanas (CTD-3055E11). Una interaccion entre fragmentos en HS1/HS2 y HS3 de la region de control del locus (LCR) de p-globina humana sirvio como control positivo. La frecuencia de interaccion se expreso como la amplificacion con relacion a la interaccion de LCR conocida, normalizada respecto a la plantilla BAC de control.

Mapeo fino del locus de BCL11A

Los marcadores (todas las coordenadas son de hg19) se seleccionaron dentro de los tres DHS del intron 2 de BCL11A 62 (cro2:60,717.492-60,718.860), 58 (cro2:60,721.411-60,722.674) y 55 (cro2:60,724.802-60,726,084). Se identificaron 21 marcadores a partir de la base de datos del Proyecto 1000 Genomas con el uso de las poblaciones de referencia del norte europeo (CEU), nigeriana (YRI) y afroamericana (ASW) (Tabla S1). 38 variantes adicionales estaban presentes en dbSNP135 (Tabla 2). Los inventores secuenciaron mediante la qmmica de Sanger los tres intervalos de DHS en el ADN de 52 y 36 pacientes con drepanocitosis (SCD) de la cohorte CSSCD con niveles de HbF altos (> 8 %) y bajos (< 2 %), respectivamente. A partir de este esfuerzo de secuenciacion, se identificaron siete variantes de secuencia nuevas (Tabla 3). Debido a que la mayona de los marcadores se agrupan en intervalos genomicos pequenos, no fue posible disenar ensayos de genotipificacion para algunos de ellos. De las 66 variantes no redundantes identificadas en los tres DHS, se realizaron ensayos de genotipificacion de 40 marcadores en 1.263 participates de la CSSCD, una cohorte de SCD en afroamericanos cuyo ADN genomico (ADNg) esta disponible y los niveles de HbF se conocen (21). Los marcadores se genotiparon con el uso de la plataforma Sequenom iPLEx. Los individuos y las variantes de secuencia de ADN con una tasa de exito de genotipificacion < 90 % se excluyeron. La concordancia global de los genotipos estimada a partir de muestras triplicadas fue 100 %. Los SNP que pasan el control de calidad (QC; n = 38) se enumeran en las Tablas 2 y 3, y se muestran esquematicamente en las Figuras 11A y 11B debajo de los tres DHS. Una fraccion sustancial de los SNP genotipados son raros en las poblaciones de referencia asf que no es sorprendente que sean monomorficos en la CSSCD (n = 18). Despues del QC, se mantuvieron 1.178 individuos y 20 SNP polimorficos para el analisis. Los niveles de HbF se modelaron como se describio previamente (9, 43). Los analisis de asociacion y condicionales de variantes individuales (MAF > 1 %) se realizaron con PLINK (44) con el uso de regresion lineal bajo un modelo genetico aditivo. El analisis de las variantes comunes (MAF > 1 %) revelo que rs 1427407 en DHS 62 tema la asociacion mas fuerte con el nivel de HbF (P = 7,23 x 10-50; Figuras 11A y 3B). El analisis condicional demostro que despues del condicionamiento en rs1427407 y rs7606173, no mas SNP fueron significativos (Figura 3B). El ajuste para los componentes principales (PC) en 855 individuos, cuyos datos de genotipificacion del genoma completo estaban disponibles, para explicar la mezcla y otros factores de confusion produjo resultados similares.

Para variantes raras y de baja frecuencia (MAF < 5 %), los inventores realizaron analisis basados en conjuntos con el uso de cada uno de los tres DHS 62, 58 y 55 como la unidad de prueba. Para estos analisis, se uso el programa de prueba de asociacion de secuencia kernel (SKAT-O) (45) con los parametros predeterminados. Los inventores seleccionaron el umbral de 5 % para MAF para maximizar la potencia estadfstica dado el tamano de muestra limitado, pero notese que los marcadores con una MAF entre 1 % y 5 % tambien se analizaron en el analisis de variantes individuales presentado anteriormente. Esta superposicion de variantes se explica con el uso de analisis condicional con las variantes comunes asociadas independientemente con los niveles de HbF. Se encontraron dos conjuntos estadfsticamente significativos, espedficamente DHS 62 y DHS 55, pero despues del condicionamiento en rs1427407 y rs7606173, los resultados ya no fueron estadfsticamente significativos, lo que sugiere un LD debil entre las variantes raras/de baja frecuencia y los s Np comunes (Tabla 5). Los inventores no encontraron evidencia de que las variantes de secuencia raras y de baja frecuencia dentro de los DHS de BCL11A influyan en los niveles de HbF en sujetos con SCD, a pesar de la resecuenciacion de Sanger de estos DHS en 88 sujetos con fenotipo de HbF extremo.

Las frecuencias de los haplotipos rs1427407-rs7606173 en CSSCD son: T-G 24,5 %, T- C 0,085 %, G-C 42,3 %, G-G 33,1 %. El nivel medio de HbF es 4,05 % (SD 3,10) en 213 individuos rs1427407-rs7606173 G-C, 7,08 % (SD 4,50) en 254 rs1427407-rs7606173 T-G/G-C heterocigoticos y 11,21 % (SD 4,37) en 60 individuos rs1427407-rs7606173 T-G (Figura 3C). Para las comparaciones de los niveles de HbF entre genotipos, los valores de P se determinaron mediante pruebas t de Student de una cola.

Haplotipaje molecular

Para dos SNP heterocigoticos en el mismo cromosoma, existen dos fases posibles: A-B/a-b (modelo 1) y A-b/a-B (modelo 2). Para los SNP dentro del fragmento de 12 kb del intron 2 de BCL11A 52,0-64,4 kb, la fase se determino mediante clonacion de los productos de PCR y determinacion de la codistribucion de los alelos de SNP. Para determinar la fase de los alelos de rs7569946 y rs1427407 (separados por 30,1 kb en el cromosoma 2), se realizo PCR de fusion en emulsion como se describio previamente (24, 25) con una modificacion menor. La PCR de fusion une dos regiones de interes, de partes separadas del mismo cromosoma, en un solo producto. Al llevar a cabo la reaccion en emulsion con microgotas acuosas rodeadas de aceite, la mayona de los amplicones se derivan de una sola molecula plantilla. El ADN genomico de individuos conocidos por ser heterocigoticos dobles para rs7569946 y rs1427407 sirvio como plantilla en la siguiente reaccion de 100 pl (con las concentraciones finales enumeradas): ADN polimerasa KOD Hot Start (14 U, Novagen, 71086), amortiguador k Od (1X), MgSO4 (1,5 mM), dNTP (0,2 mM cada uno), cebadores rs7569946-F y rs1427407-R (1 pM cada uno), cebador rs7569946-R (30 nM), cebador interno conector rs7569946-R-revcomp-rs1427407-F (30 nM), ADNg (200 ng). La reaccion acuosa de 100 pl se anadio en forma de gotas con agitacion a 200 pl de fase oleosa para crear una emulsion. Dos alfcuotas de 125 pl de emulsion se amplificaron en las siguientes condiciones: 95 grados 2 minutos; 45 ciclos de 95 grados 20 segundos, 60 grados 10 segundos, 70 grados 30 segundos; 70 grados 2 minutos. El producto de PCR de fusion extrafdo con hexano se sometio a PCR anidada en 25 pl de la manera siguiente: ADN polimerasa KOD Hot Start (0,5 U), amortiguador KOD (1X), MgSO4 (1,5 mM), dNTP (0,2 mM cada uno), cebadores rs7569946-nested-F y rs1427407-nested-R (300 nM cada uno), producto de PCR de fusion extrafdo (75 nl); 95 grados 2 minutos; 35 ciclos de 95 grados 20 segundos, 60 grados 10 segundos, 70 grados 30 segundos; 70 grados 2 minutos. Mediante electroforesis en gel de agarosa se confirmo que el producto anidado constituye una sola banda del tamano esperado. El producto purificado se clono con el kit Zero Blunt PCR Cloning (Life Technologies, K2700-20). La secuenciacion de Sanger de los amplicones de fusion enumero clones de 4 secuencias posibles: A-B, a-b, A-b y a-B. La probabilidad de cada fase se calculo en base a una suposicion de distribucion multinomial (Tabla 6). La relacion de probabilidades para las dos configuraciones se calculo como una medida de la significacion estadfstica del ajuste de los datos del modelo de haplotipo 1 (en comparacion con el modelo 2). Una relacion que se aproxima al infinito sugiere el modelo 1, una relacion de 1 sugiere indeterminacion y una relacion que se aproxima a cero sugiere el modelo 2.

Pirosecuenciacion

Los donantes sanos de celulas CD34+ setamizaron para identificarcinco donantes heterocigoticos para rs1427407. Estas celulas CD34+ se sometieron a diferenciacion eritroide ex vivo. Se aislo la cromatina y se realizo ChIP con anticuerpos contra GATA1 y TAL1. La cromatina inicial en comparacion con el material precipitado con GATA1 o TAL1 se sometio a pirosecuenciacion para determinar el equilibrio alelico de rs1427407. Los donantes sanos de CD34+ se tamizaron para identificar tres donantes heterocigoticos para el haplotipo rs1427407-rs7606173 G-C/T-G. Estas celulas CD34+ se sometieron a diferenciacion eritroide ex vivo. El a Dn complementario (ADNc) y el ADNg se sometieron a pirosecuenciacion para determinar el equilibrio alelico de rs7569946.

Las condiciones de PCR fueron las siguientes: mezcla maestra HotStarTaq 2X (QIAGEN, 203443), MgCh (concentracion final 3 mM), ADN plantilla (0,1-1 ng) y cebadores biotinilados directos e inversos espedficos de SNP (200 nM cada uno). Las condiciones de termociclado de la PCR fueron: 94 °C 15 min; 45 ciclos de 94 °C 30 s; 60 °C 30 s; 72 °C 30 s; 72 °C 5 min. Un cebador de cada par estaba biotinilado. La cadena del producto de PCR que contiene el cebador biotinilado se unio a perlas de estreptavidina y se combino con un cebador de secuenciacion espedfico. El ADN monocatenario cebado se secuencio y el genotipo se analizo con el uso del sistema de pirosecuenciacion PSQ96 HS (pirosecuenciacion de QIAGEN) segun las instrucciones del fabricante.

Ratones transgenicos

El constructo reportero de potenciador pWHERE-Dest se obtuvo del Dr. William Pu. Modificado a partir de pWHERE (Invitrogen, pwhere) como se describio previamente (46), el constructo tiene elementos aislantes de H19 murino que flanquean una variante de lacZ libre de CpG dirigida por un promotor irnnimo de Hsp68 irnnimo con un casete de destino Gateway en el MCS corriente arriba. Los fragmentos de potenciador se amplificaron a partir de ADNg de raton, se recombinaron en el vector pDONR221 (Invitrogen, 12536-017) mediante BP clonasa (Invitrogen, 11789020) y se recombinaron en el vector pWHERE-Dest con LR clonasa (Invitrogen, 11791020). Los plasmidos se digirieron con PacI para eliminar la cadena principal del vector. Los fragmentos reporteros del potenciador de lacZ se purificaron por electroelucion en gel y despues se concentraron con el uso del sistema Wizard DNA Clean-Up (Promega, A7280). Los ratones transgenicos se generaron por inyeccion pronuclear a ovulos fertilizados FVB. Se uso aproximadamente 10 ng/pl de solucion de ADN para series de inyecciones. Las hembras CD-1 se usaron como receptores de los embriones inyectados. Los embriones de 10,5 a 14,5 dpc se diseccionaron de las madres sustitutas con montaje completo y tincion de tejidos con X-gal realizados como se describio previamente (47). Los centrifugados celulares tenidos con X-gal se sometieron a tincion de contraste con rojo nuclear rapido (Vector Laboratories, H-3403). Las colas se usaron para la genotipificacion por PCR. Los procedimientos en animales fueron aprobados por el Comite Institucional de Uso y Cuidado de Animales de Laboratorio del Hospital Pediatrico.

Ensayo de potenciador de precursor eritroide humano

Los fragmentos de ADN genomico que contienen elementes potenciadores putativos se clonaron en pLVX-Puro (Clontech, 632164) corriente arriba de un promotor mmimo de TK y el gen reportero GFP como se describio (39). Las celulas 293T se transfectaron con el reactivo FuGene 6 (Promega, E2691) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El medio se cambio despues de 24 horas a medio SFEM complementado con 2 % de penicilina-estreptomicina, y despues de 36 horas, el sobrenadante se recogio y se filtro. Los cultivos eritroides derivados de celulas CD34+ se transdujeron con lentivirus en los dfas 4 y 5 de la expansion por infeccion por centrifugacion como se describio previamente (39). Las celulas se resuspendieron en medio de diferenciacion eritroide 24 horas despues de la segunda infeccion. La seleccion con puromicina a 1 pg/ml comenzo 48 horas despues de la infeccion. Las celulas transducidas se analizaron por citometna de flujo despues de cinco dfas en medio de diferenciacion en cuanto a la intensidad de fluorescencia media de GFP.

Citometna de flujo

Las celulas vivas se separaron en portales por exclusion de 7-aminoactinomicina D (7-AAD, BD Pharmingen, 559925). Se aislaron suspensiones de medula osea (para eritroblasto) y bazo (para linfocito) de ratones transgenicos adultos jovenes. Despues de la lisis hipotonica de los globulos rojos maduros, las celulas vivas (7-AAD-) se clasificaron en base a la tincion con CD71-biotina (BD, 557416), estreptavidina-APC (BD, 554067), Ter-119-PE (BD, 553673), CD19-APC (BD, 550992) o CD3-PE (BD, 100308). Las poblaciones CD71+Ter119+, CD19+ y CD3+ clasificadas se usaron para obtener centrifugados celulares y el aislamiento de ARN.

Delecion cromosomica mediada por TALEN

Las nucleasas efectoras tipo activador de la transcripcion (TALEN) se disenaron para generar escisiones en el intron 2 de Bcl11a de raton en los sitios 50,4 kb (denominado sitio 5') y 60,4 kb (sitio 3') con relacion al TSS. Las TALEN reconocen las siguientes secuencias: CTTAAGGCAAGAATCACT (sec. con num. de ident.: 2) (5' izquierda), CCATGCCTTTCCCCCCCT (sec. con num. de ident.: 3) (5' derecha), GAGTTAAAATCAGAAATCT (sec. con num. de ident.: 4) (3' izquierda), CTGACTAATTGATCAT (sec. con num. de ident.: 5) (3' derecha). Las TALEN se sintetizaron con clonacion Golden Gate (48) con el uso de la Nn RVD para reconocer G. Los dominios de union a ADN sintetizados se clonaron en pcDNA3.1 (Invitrogen, V790-20) con el dominio nucleasa de FokI, el dominio A152 N-terminal y el dominio 63 C-terminal previamente descritos (49). Se suministraron 2,5 pg de cada uno de los cuatro plasmidos con TALEN con 0,5 pg de pmaxGFP (Lonza) a 2 x 106 celulas MEL o pre-B mediante electroporacion segun el protocolo del fabricante (Lonza, VCA-1005). Las celulas positivas para GFP se clasificaron por citometna de flujo despues de 48 horas. Las celulas se sembraron por dilucion limitante en placas de 96 pocillos para aislar clones individuales. Los clones se tamizaron por PCR de ADNg para detectar la amplificacion de un producto corto de corriente arriba del sitio 5' y corriente abajo del sitio 3' que indica delecion del segmento intermedio. Los clones con delecion monoalelica se sometieron a una segunda ronda de delecion mediada por TALEN para obtener clones con delecion bialelica. Los clones con delecion bialelica se identificaron mediante la deteccion de la ausencia de amplificacion dentro del fragmento eliminado. La frecuencia de delecion fue aproximadamente uno en 50 alelos. La delecion se valido con transferencia Southern. El ADN genomico se digirio con Bmtl; una sonda de 561 pb (amplificada a partir del ADNg corriente arriba del sitio 5') se hibrida a un fragmento de 3,6 kb del alelo de tipo silvestre y un fragmento de 8,9 kb del alelo con delecion de A50,4-60,4.

RT-qPCR e inmunotransferencia

El aislamiento de ARN con columnas RNeasy (Qiagen, 74106), la transcripcion inversa con el kit de smtesis de ADNc iScript (Bio-Rad, 170-8890), la qPCR con la mezcla iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, 170-8880) y la inmunotransferencia se realizaron como se describio (39). Para los genes del grupo de p-globinas, un par de cebadores comun reconoce las p-globinas p2 y p1 del adulto mientras que cebadores independientes reconocen las p-globinas ey y pH1 embrionarias. Los siguientes anticuerpos se usaron para la inmunotransferencia: BCL11A (Abcam, ab19487), GAPDH (Santa Cruz, sc-25778).

Resultados

Los estudios de asociacion del genoma completo (GWAS) han determinado numerosas variantes geneticas comunes asociadas con rasgos, frecuentemente localizadas en el ADN regulador. La hipotesis de que la variacion de la regulacion puede explicar la heredabilidad sustancial se ha sometido a poca evaluacion experimental. Aqu los inventores demuestran que una variacion genetica comun en BCL11A asociada con el nivel de hemoglobina fetal (HbF) indica secuencias no codificantes decoradas por una firma de cromatina de potenciador eritroide. El mapeo fino dentro de este ADN regulador putativo revela una variante comun de interrupcion de motivo asociada con la reduccion de la union de factores de transcripcion, la disminucion de la expresion de BCL11A, y la elevacion de HbF. Las secuencias circundantes funcionan in vivo como un potenciador de linaje restringido espedfico de la etapa del desarrollo. Mediante la modificacion del genoma, se demostro que este potenciador se requiere para la expresion eritroide de BCL11A no obstante es prescindible fuera del linaje eritroide. Estos resultados ilustran como GWAS puede resaltar variantes funcionales de impacto modesto dentro de elementos causales esenciales para la expresion genica adecuada. El potenciador de BCL11A marcado por GWAS representa una diana terapeutica favorable para los trastornos de las p-globinas.

El GWAS ha tenido un exito enorme en la identificacion de muchos cientos de polimorfismos de nucleotido simple (SNP) comunes asociados con rasgos y enfermedades humanas. Sin embargo el paso de la asociacion genetica a procesos biologicos causales frecuentemente ha sido diffcil. Los retos incluyen el gran numero de variantes correlacionadas que pueden asociarse con rasgos individuales (debido al desequilibrio de ligamiento (LD)), el tamano de efecto modesto de muchas asociaciones entre variante y rasgo, y la ubicacion de muchas variantes asociadas en el genoma no codificante. Estudios recientes de mapeo de la cromatina a escala genomica han resaltado el enriquecimiento de variantes de GWAS en elementos reguladores de ADN, lo que sugiere que muchas variantes causales pueden afectar la regulacion genica. No obstante, pocos ejemplos que confirman la significacion de variantes o elementos causales se han demostrado experimentalmente.

El GWAS del nivel de HbF ha sido particularmente sorprendente. La variacion genetica en solo tres loci (HBB, HBS1L-MYB, y BCL11A) explica hasta 50 % de la variacion hereditaria en el nivel de HbF. Las mismas variantes se asocian tambien con la gravedad clmica de las principales p-globinopatias, la drepanocitosis y la p-talasemia, quizas no es sorprendente dado que la HbF es el principal modificador de estos trastornos. El trabajo del laboratorio de los inventores y de otros han validado que BCL11A es un regulador directo de los niveles de HbF. B C L llA es un represortranscripcional que reside dentro de complejos multiproteicos que ocupan el grupo de genes de p-globinas. Si bien la deficiencia constitutiva de BCL11A da como resultado la letalidad embrionaria y la afectacion del desarrollo linfocitario, la deficiencia eritroide espedfica de BCL11A contrarresta el silenciamiento durante el desarrollo de genes de globinas embrionarias y fetales y es suficiente para rescatar las caractensticas hematologicas y patologicas de la drepanocitosis en modelos de raton. Por lo tanto BCL11A ha surgido como una nueva diana terapeutica para los trastornos de las p-globinas. Es imperativo entender las consecuencias de la afectacion de BCL11A. Las variantes codificantes humanas de BCL11A no se han descrito a pesar de los esfuerzos de resecuenciacion a gran escala. Las variantes de BCL11A asociadas con los niveles de HbF residen en regiones no codificantes de BCL11A. Para entender mas aun como la variacion genetica comun impacta a BCL11A, al nivel de HbF, y a la gravedad de los trastornos de las p-globinas, el papel de las variantes asociadas a HbF se investigo en detalle.

Variantes asociadas a rasgos cercanas a potenciadores eritroides

Se han realizado numerosos GWAS asf como estudios de seguimiento de mapeo fino de rasgos eritroides (que incluyen fenotipos tales como numero y volumen de eritrocitos, concentracion de hemoglobina, y nivel de HbF), con la identificacion de 636 SNP asociados a rasgos de significacion en el genoma completo (p<5e_8). Estos SNP estan enriquecidos en promotores y regiones codificantes en comparacion con SNP aleatorios (Figura 1). Aun asf la mayona de los SNP residen en otra parte en el genoma. Se realizo un perfil de cromatina global de precursores eritroides humanos primarios, que identifico un conjunto amplio de potenciadores eritroides distales definidos por modificaciones caractensticas a las histonas e hipersensibilidad a DNAsa I. Se observo una fuerte colocalizacion de SNP de GWAS eritroides con potenciadores en comparacion con SNP asociados a rasgos no eritroides, SNP encontrados en un arreglo de genotipificacion comun, o SNP permutados aleatoriamente. El 13,5 % de los SNP asociados a rasgos eritroides caen directamente en potenciadores eritroides, un enriquecimiento de 11,4 veces respecto a potenciadores permutados aleatoriamente (P < 1 x 10'4), en comparacion con 1,4 % de SNP asociados a rasgos no eritroides, que representan un enriquecimiento de 1,4 veces (P = 0,0013). Muchos de los SNP asociados a rasgos eritroides se encontraron en estrecha proximidad a potenciadores eritroides (Figura 1B). La distancia media al potenciador eritroide fue 16,0 kilobases (kb) para SNP asociados a rasgos eritroides, en comparacion con 238,0, 392,6, y 482,4 kb respectivamente para SNP asociados a rasgos no eritroides, de arreglo de genotipificacion, y permutados aleatoriamente. Estos resultados indican que una fraccion sustancial de variantes comunes asociadas con rasgos eritroides reside en o cerca de potenciadores eritroides, y son consistentes con la hipotesis de que las variantes causales frecuentemente influyen en la regulacion genica dependiente del contexto.

El GWAS de HbF marca una firma de potenciador eritroide

Se han realizado seis GWAS del nivel de HbF (o el rasgo altamente correlacionado numero de celulas F), que incluyen poblaciones de ascendencia europea, africana, y asiatica. Cada uno ha identificado variantes asociadas al rasgo dentro de BCL11A. Se estima que la variacion en BCL11A explica ~15 % de la variacion del rasgo. Cuatro SNP diferentes se han identificado como los mas altamente asociados con el rasgo (rs1427407, rs11886868, rs4671393, y rs766432; estos denominados SNP "centinelas" se agrupan dentro de 3 kb entre sf en el intron 2 de BCL11A (Figura 2A). Los haplotipos que incluyen los SNP centinelas parecen explicar mejor la asociacion con HbF que cualquier SNP individual. Cincuenta SNP en el locus BCL11A y veintisiete SNP dentro del intron 2 se han asociado con el nivel de HbF con significacion al menos en el genoma completo (P < 5 x 10'8).

La distribucion de los SNP asociados a HbF en BCL11A se comparo con la sensibilidad a DNAsa I, un indicadordel estado de la cromatina que sugiere el potencial regulador. En precursores eritroides humanos, se observaron tres picos de hipersensibilidad a DNAsa I en el intron 2, adyacentes a y superpuestos con las variantes asociadas a HbF (Figura 2A), denominados sitios hipersensibles a DNAsa I (DHS) 62, 58, y 55 en base a la distancia en kb del TSS de BCL11A. Cerebro y linfocitos B, dos tejidos que expresan altos niveles de BCL11A, y linfocitos T, que no expresan BCL11A apreciable, muestran patrones unicos de sensibilidad a DNAsa I en el locus BCL11A, con una escasez de superposicion de hipersensibilidad a DNAsa I con los SNP asociados a rasgos (Figura 2A).

La firma de cromatina alrededor del locus BCL11A se analizo ademas por inmunoprecipitacion de la cromatina con secuenciacion masiva en paralelo (ChIP-seq). El analisis ChIP-seq de precursores eritroides humanos primarios revelo modificaciones a las histonas con una firma de potenciador que se superpone con los SNP asociados a rasgos en el intron 2 de BCL11A, que incluye la presencia de las marcas H3K4me1 y H3K27ac y la ausencia de H3K4me3 y H3K27me3 (Figura 2A). Los factores de transcripcion eritroides maestros GATA1 y TAL1 ocupan esta region potenciadora (Figura 2A). Los experimentos de ChIP-qPCR demostraron tres picos discretos de union a GATA1 y TAL1 dentro del intron 2 de BCL11A, cada uno cae dentro de un DHS eritroide (Figura 2B).

Una caractenstica comun de los elementos reguladores distales es la interaccion de largo alcance con los promotores cuya expresion regulan. Se evaluaron las interacciones entre el promotor de BCL11A y fragmentos a 250 kb del locus BCL11A, que incluyen secuencias corriente arriba, corriente abajo, e intragenicas. La mayor interaccion con el promotor se observo dentro de la region del intron 2 que contiene el DHS eritroide y SNP asociados a rasgos (Figura 2C). Estos resultados indican que estas secuencias tienen potencial regulador.

Variantes reguladoras

Se planteo la hipotesis de que los SNP asociados a rasgos causales podnan funcionar mediante la modulacion de elementos reguladores en cis cnticos. Por lo tanto, se realizo la genotipificacion extensiva de SNP dentro de los tres DHS eritroides 62, 58, y 55 en 1.263 muestras de ADN del Estudio cooperativo de drepanocitosis (CSSCD), una cohorte de drepanocitosis en afroamericanos cuyo ADN genomico estaba disponible y los niveles de HbF se conocen. A partir de la dbSNP se identificaron 66 variantes de secuencia de ADN ubicadas en los tres DHS de las poblaciones de referencia CEU, YRI, y ASW dentro del Proyecto 1000 Genomas, y por secuenciacion de Sanger 88 individuos de la CSSCD con fenotipo de HbF extremo. No se pudo disenar el ensayo de genotipificacion de 26 marcadores y 18 eran monomorficos (Tablas 1 y 2). Despues del control de calidad, se mantuvieron 1.178 individuos y 20 SNP polimorficos para la prueba de asociacion. El analisis de variantes comunes (frecuencia del alelo menos comun (MAF) > 1 %) revelo que rs1427407 en DHS 62 tema la asociacion mas fuerte con el nivel de HbF (P = 7,23 x 10-50; Tabla 1).

Previamente, los inventores habfan usado la CSSCD para el mapeo fino de la senal de asociacion con HbF en el locus BCL11A e informaron una fuerte asociacion con rs4671393; en ese estudio, se imputo rs1427407. Dos SNP adicionales, rs766432 y rs11886868 tambien se habfan identificado en estudios previos como los SNP centinelas mas altamente asociados con el nivel de HbF (o numero de celulas F). En un subconjunto de individuos (N = 728) cuyos genotipos en los cuatro SNP centinelas se conocen, cuando se condicionaron en los genotipos a rs1427407, el resultado de asociacion no fue significativo en rs4671393, rs766432, o rs11886868; por el contrario, la asociacion se mantuvo altamente significativa para rs1427407 cuando se condiciono en rs4671393, rs766432, o rs11886868 (Tabla 3). Por lo tanto, rs1427407 es el SNP mas asociado con HbF dentro de los DHS eritroides y explica mejor la asociacion al rasgo que otros SNP centinelas descritos previamente.

Cuando se condiciono en rs1427407, se encontraron otras asociaciones con el nivel de HbF dentro de los tres DHS que no se perdieron completamente (Tabla 1). La asociacion mas significativa restante fue para rs7606173 en DHS 55 (P = 5,11 x 10-10); rs7599488 en DHS 58, que se informo previamente, solo fue ligeramente menos significativa (P = 1,71 x 10-9) en este analisis condicional. Despues del condicionamiento en rs1427407 y rs7606173, no mas SNP fueron significativos (Tabla 1). El ajuste para los componentes principales (PC) en 855 individuos, cuyos datos de genotipificacion del genoma completo estaban disponibles, para explicar la mezcla y otros factores de confusion produjo resultados similares (no se muestran los datos). El haplotipo rs1427407-rs7606173 T-G se definio como el mas altamente asociado con el nivel de HbF.

Las variantes raras y de baja frecuencia (MAF < 5 %) tambien se analizaron en cuanto a su asociacion con los niveles de HbF con el uso de cada uno de los tres DHS 62, 58, y 55 como conjunto de prueba. Se encontraron dos conjuntos significativos, espedficamente DHS 62 y DHS 55, pero despues del condicionamiento en rs1427407 y rs7606173, los resultados ya no fueron significativos, lo que indica un LD debil entre las variantes raras/de baja frecuencia y los SNP comunes (Tabla 4). Por lo tanto, no se encontro evidencia de que las variantes de secuencia raras y de baja frecuencia dentro de los DHS de BCL11A influyan en los niveles de HbF en pacientes con SCD, a pesar de la resecuenciacion de Sanger de 88 individuos de CSSCD con fenotipo HbF extremo.

El SNP rs1427407 cae dentro de un pico de union a GATA1 y TAL1 como se determina por ChIP-seq y ChIP-qPCR (Figuras 2A y 2B). El alelo T menos frecuente interrumpe el nucleotido G de un elemento de secuencia que se asemeja mucho a un motivo compuesto media-caja-E/GATA [CTG(n9)GATA (sec. con num. de ident.: 6)]. Se ha descubierto por experimentos de ChIP-seq que este motivo se encuentra altamente enriquecido en complejos de GATA1 y TAL1 en celulas eritroides. Se identificaron muestras de celulas eritroides primarias de individuos heterocigoticos en cuanto al alelo G mas frecuente y el alelo T menos frecuente en rs1427407 y estas muestras se sometieron a ChIP seguido de pirosecuenciacion. Los inventores identificaron un equilibrio uniforme de alelos en el ADN inicial. Sin embargo se observo union mas frecuente al alelo G en comparacion con el alelo T de aproximadamente 60:40 en las muestras de cromatina inmunoprecipitada con GATA1 y TAL1 (Figura 3A).

Se informo previamente que el alelo Ade rs4671393 asociado a HbF alta se asocio con la expresion de BCL11A en lmeas de celulas linfoblastoides humanas. Los inventores no pudieron reproducir una asociacion significativa entre el genotipo de BCL11A y el nivel de expresion mediante el analisis de un conjunto grande de lmeas de celulas linfoblastoides (no se muestran los datos). Se especulo que el haplotipo rs1427407-rs7606173 asociado a HbF alta influye en la expresion de BCL11A en un contexto eritroide espedfico. El SNP sinonimo comun rs7569946 cae dentro del exon 4 de BCL11A y puede servir como un marcador de expresion alelica. Se identificaron tres muestras de celulas eritroides humanas primarias heterocigoticas dobles para el haplotipo rs1427407-rs7606173 y rs7569946. Las muestras se sometieron a haplotipaje molecular mediante p Cr de fusion en emulsion. El haplotipaje demostro que para cada muestra el alelo G de rs7569946 mas frecuente estaba en fase con el haplotipo rs1427407-rs7606173 G-C asociado a HbF baja. El ADN genomico y el ADNc se ensayaron por pirosecuenciacion de rs7569946 para determinar el equilibrio alelico. Mientras que los alelos estaban equilibrados en el a Dn genomico, se observo un desequilibrio significativo en el ADNc que favorece el aumento de la expresion del alelo G de rs7569946 ligado a HbF baja (Figura 3B). Estos resultados indican que el alelo T de rs1427407 de HbF alta, que interrumpe el motivo media-caja-E/GATA, se asocia con la reduccion de la union de GATA1 y TAL1 y la reduccion de la expresion de BCL11A en precursores eritroides. El nivel medio de HbF en 60 individuos homocigoticos con haplotipo rsl427407-rs7606173 T-G de HbF alta fue 11,21 % en comparacion con 4,05 % en 213 individuos homocigoticos con haplotipo rs1427407-rs7606173 G-C de HbF baja (P = 2,5 x 10'19) (Figura 3C). En resumen, la evidencia siguiente indica que rs1427407 es un SNP causal para el nivel de HbF: tiene la asociacion mas alta con el fenotipo de cualquier variante conocida, explica las asociaciones observadas con SNP centinelas descritos previamente, impacta un motivo requerido para la union a GATA1 y TAL1, y se asocia con la union a GATA1 y TAL1 asf como con la expresion de BCL11A. Sin embargo, la variacion en esta posicion en el entorno de haplotipos comunes se asocia con una perturbacion solo modesta de la expresion de BCL11A.

Suficienda del potenciador para la expresion eritroide

Para entender el contexto dentro del cual estos SNP asociados a rasgos reguladores aparentes desempenan su papel, se exploro la funcion de los elementos reguladores en cis que los albergan. Los inventores clonaron ~12 kb (+52,0-64,4 kb de TSS) que conteman los tres DHS eritroides, y se ensayo el potencial potenciador en un ensayo reportero transgenico. En este ensayo las secuencias potenciadoras putativas se posicionan corriente arriba de un promotor mmimo (Hsp68) y un gen reportero (lacZ) delimitado por secuencias aislantes. Los constructos se introdujeron a cigotos murinos con control de la expresion del gen reportero en el desarrollo. El BCL11A endogeno de raton mostro expresion abundante en el desarrollo del sistema nervioso central con una expresion mucho menor observada en el hngado fetal. En contraste, se observo que la expresion del gen reportero en los embriones transgenicos se confina en gran medida al tngado fetal, el sitio de eritropoyesis definitiva, con menor expresion observada en el sistema nervioso central (Figura 4A).

Un elemento caractenstico de los genes de globinas es su regulacion por el desarrollo. Durante el desarrollo humano, la £-globina derivada del saco vitelino se sustituye en el primer trimestre por la Y-globina derivada del hngado fetal. Cerca del nacimiento, la Y-globina se silencia gradualmente y la p-globina se activa. Existe solamente un unico cambio en la expresion genica durante la ontogenia del raton. Durante esta transicion, que se produce a mitad de la gestacion, los eritrocitos primitivos circulantes derivados del saco vitelino expresan las globinas £y y pH1 de la etapa embrionaria mientras que los eritroblastos definitivos del hngado fetal expresan las globinas p1 y p2 de la etapa adulta. En concordancia con este cambio en el desarrollo, la expresion de BCL11A se expresa en el linaje eritroide definitivo pero no en etapa primitiva. Se obtuvieron lmeas transgenicas estables de los ratones reporteros de BCL11A+52,0-64,4. En estos ratones a E12,5 los eritrocitos circulantes no se tinen para X-gal mientras que los eritroblastos hepaticos se tinen positivos de manera robusta (Figura 4B). A E10,5 la expresion de lacZ se observa solamente en el primordio del hngado fetal y no en la sangre circulante dentro del embrion, la placenta, o el saco vitelino (Figura 6A). Estos resultados indican que las secuencias reguladoras del intron 2 de B C L llA marcadas por GWAS son suficientes para especificar la expresion genica adecuada durante el desarrollo.

Dentro del compartimento hematopoyetico, la expresion de BCL11A se encuentra en precursores eritroides y linfocitos B. Se aislaron precursores eritroides y linfocitos B de animales transgenicos adultos jovenes y se evaluo la expresion del reportero lacZ. El BCL11A endogeno se expreso a niveles 10,4 veces mas altos en linfocitos B esplenicos en comparacion con los precursores eritroides de medula osea. Sin embargo, la expresion de lacZ se restringio a los precursores eritroides y no se observo en linfocitos B (Figura 4C). Estos resultados indican la especificidad eritroide de estas secuencias reguladoras.

Una serie de mutantes de delecion se genero para refinar los elementos mmimos requeridos para la actividad del potenciador eritroide. Las secuencias que contienen el DHS central 58 fueron suficientes para la actividad del potenciador eritroide. Las secuencias que contienen solamente los elementos flanqueantes 62 o 55 no fueron capaces de dirigir la expresion genica eritroide (Figura 6B). Estos DHS tambien se probaron en cuanto a su capacidad de aumentar la expresion genica en precursores eritroides humanos primarios. Los inventores usaron el suministro lentiviral de un sistema reportero de GFP con un promotor mmimo de TK como se describio previamente. De manera similar, solamente el DHS 58 pero no el 55 o 62 fue capaz de aumentar la expresion genica en este ensayo reportero (Figura 7).

Necesidad del potenciador para la expresion eritroide

A continuacion los inventores eligieron determinar la necesidad de estas secuencias reguladoras para la expresion adecuada de los genes de BCL11A y globinas. La inspeccion del locus Bel11a en el perfil de cromatina global publicado previamente de celulas eritroides de raton revelo que esta region de intron 2 posee una firma de potenciador ortologo con presencia de H3K4me1 y H3K27ac, ausencia de H3K4me3 y H3K27me3, y ocupacion por GATAl y TAL1 (Figura 8). Por otra parte, se observo hipersensibilidad a DNAsa I eritroide espedfica en estas secuencias. En cada uno de los DHS eritroides humanos 62, 58, y 55, se observo evidencia de conservacion evolutiva de las secuencias, particularmente dentro de 62 y 55. Para determinar la necesidad de estas secuencias reguladoras ortologas para la expresion de BCL11A, se uso la lmea de celulas de eritroleucemia de raton (MEL). Estas celulas dependen de la expresion de BCL11A para un patron de expresion genica de globinas de la etapa adulta adecuado. Las nucleasas espedficas de secuencia pueden dar como resultado la produccion de pequenas deleciones cromosomicas. Las TALEN se modificaron geneticamente para introducir rupturas bicatenarias para flanquear las secuencias ortologas de 10 kb del intron 2 de Bcl11a que portan la firma de cromatina de potenciador eritroide. Los clones se tamizaron en cuanto a la reparacion mediada por NHEJ y se aislaron tres clones unicos que hadan experimentado escision bialelica. La PCR y la transferencia Southern verificaron la escision del segmento intronico dentro de los clones (Figura 9). Los puntos de ruptura secuenciados por Sanger eran caractensticos de la escision mediada por TALEN con posterior reparacion por NHEJ (Figura 10).

La expresion de BCL11Ase analizo en las celulas MEL con delecion intronica bialelica de 10 kb. Se observo una reduccion drastica de la expresion de BCL11A a ~3 % de los niveles basales (Figura 5A). Se observaron reducciones similares con pares de cebadores que detectan uniones de exones corriente arriba, que abarcan, o corriente abajo de la delecion. Por transferencia Western, la expresion de BCL11A no fue detectable en los clones con delecion del potenciador de 10 kb (Figura 5B). Las celulas MEL expresan tfpicamente niveles altos de los genes de globinas p1 y p2 del adulto y niveles bajos de los genes de globinas ey y pH1 embrionarias. En ausencia del potenciador de 10 kb para BCL11A, la expresion de genes de globinas del adulto disminuyo en ~2-5 veces, mientras que los genes de globinas embrionarias se desreprimieron considerablemente. La relacion de ey embrionaria respecto a p1/2 del adulto aumento en un promedio de 364 veces en los tres clones que carecen del potenciador eritroide ortologo de BCL11A (Figura 5C).

Para determinar si las secuencias intronicas 50,4-60,4 kb se requenan universalmente para la expresion de BCL11A, se evaluo su perdida en un contexto no eritroide. La misma estrategia de introduccion de dos pares de TALEN para obtener clones con la delecion de A50,4-60,4 mediada por NHEJ se empleo en una lmea celular de linfocitos pro-B. Se aislaron dos clones unicos A50,4-60,4, y se verificaron por PCR, transferencia Southern, y secuenciacion de Sanger (Figuras 9 y 10). A diferencia de las celulas eritroides, la expresion de BCL11A se conservo en los clones de celulas pro-B con delecion del potenciador A50,4-60,4 kb a ambos niveles de ARN y protema (Figuras 5A y 5B). Estos resultados indican que las secuencias potenciadoras eritroides ortologas no se requieren para la integridad de la transcripcion del locus Bcl11a sino que solo son esenciales para la expresion genica eritroide.

Una firma de cromatina de potenciador se encontro en el intron 2 de BCL11A, en superposicion directa con los SNP asociados a HbF. Esta region tema numerosas caractensticas bioqmmicas de un potenciador, que incluyen ocupacion por las marcas de histonas H3K4me1 y H3K27ac en ausencia de H3K4me3 y H3K27me3, union de los TF eritroides GATA1 y TAL1, sitios de hipersensibilidad a DNAsa-I eritroide espedficos, e interaccion promotora de largo alcance por 3C. Por otra parte, los inventores fueron capaces de realizar el mapeo fino de este locus, con el uso de los DHS como grna, para identificar el SNP rs1424707 como el mas altamente asociado con el rasgo, y explicartotalmente la asociacion al rasgo de los SNP centinelas descritos previamente y altamente ligados. Ademas, en la presente descripcion se demuestra que rs1427407 interrumpe un motivo media-caja-E/GATA ocupado por los factores de transcripcion GATA1 y TAL1 en precursores eritroides. Sin embargo, incluso despues del condicionamiento en rs1427407 se mantiene una asociacion con varios otros SNP en DHS adyacentes lo que indica un efecto del haplotipo. Se descubrio que los haplotipos que poseen una combinacion de genotipos de SNP en elementos adyacentes que modulan cada uno la funcion reguladora cooperan para proporcionar el fenotipo final de expresion de BCL11A. Con el uso de donantes heterocigoticos, se demostro un impacto modesto del haplotipo asociado a HbF alta sobre la union a TF y la expresion de BCL11A.

Estos estudios ayudan a estimar el cambio en la expresion de BCL11A requerido para dar como resultado un aumento clmicamente significativo en el nivel de HbF en pacientes con trastornos de las p-globinas. La diferencia en la expresion de BCL11A entre los haplotipos rs1427407-rs7606173 T-G de HbF alta y G-C de HbF baja fue 1,7 veces y los niveles de HbF de homocigoticos T-G y G-C fueron 11,2 % y 4,1 % (Figuras 3B y 3C). Se ha predicho que niveles de HbF de >20 % previenen las consecuencias adversas de la SCD. Una reduccion en la expresion de BCL11A de varias veces posiblemente se aproximana a este objetivo de HbF.

Este estudio identifica la variacion reguladora en BCL11A que impacta a un potenciador eritroide. Muchos SNP asociados a rasgos son no codificantes y tienen un tamano de efecto relativamente pequeno. Debido a estas caractensticas, estos SNP en ocasiones se consideran de importancia clmica insignificante. Este estudio ilustra que un tamano de efecto pequeno engendrado por una variante no codificante individual no descarta un tamano de efecto grande del elemento regulador subyacente. Por ejemplo, a pesar de un impacto relativamente modesto de los SNP funcionales sobre la expresion del gen diana BCL11A subyacente, los elementos reguladores causales son esenciales para la expresion de BCL11A y los genes de globinas en precursores eritroides de la etapa adulta. El mismo elemento regulador es prescindible para la expresion de BCL11A en un linaje no eritroide. Un objetivo del estudio de los alelos protectores es entender sus mecanismos moleculares subyacentes en un esfuerzo para reproducir su efecto biologico en individuos de alto riesgo.

Por lo tanto, muchos polimorfismos asociados a rasgos residiran en elementos reguladores cnticos espedficos del contexto cuya funcion puede iluminar aun mas la biolog â subyacente del rasgo mas alla de la simple identificacion del gen regulado. Por ejemplo, la perdida de BCL11A si bien da como resultado la afectacion del cambio de hemoglobinas tambien da como resultado la afectacion de la neurogenesis y la linfopoyesis y da como resultado la letalidad embrionaria. En ultima instancia una mejor comprension de los elementos reguladores causales y de las redes de regulacion asociadas subyacentes a estos rasgos podna identificar nuevas diana terapeuticas. El potenciador eritroide de BCL11A podna en sf mismo constituir una diana favorable para la edicion del genoma con fines terapeuticos dado que la ablacion podna impedir la expresion de BCL11A en precursores eritroides con la desrepresion de HbF resultante mientras se mantiene la expresion de BCL11Aen linajes no eritroides.

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38. Agradecimientos a A. Woo, A. Cantor, M. Kowalczyk, S. Burns, J. Wright, J. Snow, J. Trowbridge y los miembros del laboratorio Orkin, particularmente a C. Peng, P. Das, G. Guo, M. Kerenyi, y E. Baena, por los debates. C. Guo y F. Alt proporcionaron la lmea celular pre-B, A. He y W. Pu el constructo reportero pWHERE lacZ, C. Currie y M. Nguyen asistencia tecnica, D. Bates y T. Kutyavin su experticia con el analisis de secuencias, R.

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Tabla 1 Analisis de asociacion de SNP comunes en los DHS de BCL11A 62, 58, o 55

Condicional en Condicional en rs1427407 y rs1427407 rs7606173

DHS Marcador MAF P P P P P P

62 rs111575474 0,0153 0,2624 0,09762 -0,0851 0,5584 0,0486 0,7368

62 rs112105713 0,0115 0,3285 0,07755 -0,2137 0,2097 -0,0859 0,6107

62 rs74958177 0,0646 0,3614 2,79x10-6 -0,1838 0,01041 -0,0832 0,2518 62 rs1427407 0,2460 0,6634 7,23x10'50 - - - -

62 rs7599488 0,3148 0,0047 0,9116 0,2622 2,43x10-10 0,0915 0,3547

62 rs1896293 0,1089 0,2623 2,52x10-5 -0,1248 0,03098 0,0241 0,6952

58 rs6738440 0,2734 0,3820 1,25x10-18 -0,1935 5,64x10-6 -0,0223 0,6887

55 rs147910897 0,0132 0,3656 0,03294 -0,2586 0,09945 -0,1575 0,3101

55 rs148529953 0,0140 0,3521 0,04034 -0,1423 0,3668 -0,0098 0,9501

55 rs7606173 0,4238 0,4691 2,86x10-34 -0,2632 9,66x10-11 - -Analisis de asociacion de SNP comunes (MAF > 1 %) en los DHS de BCL11A +62, 58, o 55 a partir de 1,178 individuos de CSSCD disponibles para el analisis, DHS, sitio de hipersensibilidad a DNasa I, MAF, frecuencia del alelo menos comun,

Tabla 2 SNP dentro de los DHS de BCL11A +62, 58, o 55

Alelo

Marcador CRO POS ^Alelo

_{principal menor}DHS Genotipado MAF

rs149113684 2 60,717,544 C A 62 Monomorfico 0,0000 rs111575474 2 60,717,559 C T 62 SI 0,0157 rs148272134 2 60,717,643 C A 62 Diseno de ensayo fallido -rs182773253 2 60,717,676 A G 62 Monomorfico 0,0000 rs188706265 2 60,717,769 C T 62 Monomorfico 0,0000 rs74958177 2 60,717,776 A G 62 SI 0,0645

rs1427407 2 60,718,043 G T 62 SI 0,2460 rs35262352 2 60,718,076 A - 62 Diseno de ensayo fallido

rs79781583 2 60,718,077 A T 62 Diseno de ensayo fallido -rs201428515 2 60,718,088 G A 62 Monomorfico 0,0000 rs112105713 2 60,718,278 G A 62 SI 0,1145 rs7599488 2 60,718,347 C T 62 SI 0,3149 rs113636744 2 60,718,540 C T 62 SI 0,0042 rs35259900 2 60,718,555 C T 62 Diseno de ensayo fallido -rs111911554 2 60,718,569 A G 62 Diseno de ensayo fallido -rs137943695 2 60,718,574 G A 62 Monomorfico 0,0000 rs45579333 2 60,718,599 G A 62 Monomorfico 0,0000 rs77876582 2 60,718,639 C T 62 Diseno de ensayo fallido -rs112634025 2 60,718,708 G A 62 Diseno de ensayo fallido -rs45439602 2 60,718,721 G A 62 Diseno de ensayo fallido -rs112387548 2 60,718,762 C T 62 Diseno de ensayo fallido -rs191369155 2 60,718,781 G A 62 Diseno de ensayo fallido -rs6723022 2 60,718,807 A C 62 Monomorfico 0,0000 rs11422901 2 60,718,819 G A 62 Diseno de ensayo fallido -rs200632291 2 60,718,824 A G 62 Diseno de ensayo fallido -rs11387709 2 60,718,826 A - 62 Diseno de ensayo fallido -rs1896293 2 60,718,848 G T 62 SI 0,1088 rs71526487 2 60,721,587 T C 58 Diseno de ensayo fallido -rs185151573 2 60,721,639 G C 58 Monomorfico 0,0000 rs6721788 2 60,721,846 T C 58 SI 0,0025 rs76033449 2 60,721,900 G A 58 SI 0,0004 rs6706648 2 60,722,040 T C 58 Genotipificacion fallida -rs62142615 2 60,722,120 T C 58 SI 0,0081 rs35923541 2 60,722,197 T - 58 Monomorfico 0,0000 rs35815093 2 60,722,208 G - 58 Diseno de ensayo fallido -rsl47659683 2 60,722,219 G A 58 Diseno de ensayo fallido -rs6738440 2 60,722,241 A G 58 SI 0,2732 rs189178945 2 60,722,449 G A 58 Monomorfico 0,0000 rs140819321 2 60,722,465 G A 58 SI 0,0064 rs181895125 2 60,722,609 A G 58 Monomorfico 0,0000 rs144676401 2 60,722,634 C T 58 Monomorfico 0,0000 rs147910897 2 60,724,818 T C 55 SI 0,0132 rs34322220 2 60,724,831 T - 55 Monomorfico 0,0000 rsl48529953 2 60,724,967 A G 55 SI 0,0140 rsl88426060 2 I 60,724,989 T G 55 Diseno de ensayo fallido rs191734859 2 60,724,994 A G 55 Diseno de ensayo fallido -rs45442493 2 60,725,043 G C 55 Monomorfico 0,0000 rs59444712 2 60,725,047 T C 55 Diseno de ensayo fallido -rs35173197 2 60,725,052 G - | 55 Diseno de ensayo fallido -rs188151753 2 60,725,071 G A 55 Diseno de ensayo fallido -rs181041409 2 60,725,143 C A 55 Diseno de ensayo fallido -rs142174420 2 60,725,169 C A 55 Monomorfico 0,0000 rs187333125 2 60,725,342 C G 55 Monomorfico 0,0000 rs45566439 2 60,725,384 C T 55 Diseno de ensayo fallido -rs7606173 2 60,725,451 G C 55 SI 0,4235 rs190502487 2 60,725,499 C T 55 Diseno de ensayo fallido -rs151187913 2 60,725,714 G T 55 Monomorfico 0,0000 rs113798461 2 60,725,727 T C 55 Monomorfico 0,0000 rs181699714 2 60,726,054 G A 55 Genotipificacion fallida -SNP que caen dentro de los DHS de BCL11A +62, 58, o 55 y presentes en la dbSNP o en los datos de 1000 Genomas para las poblaciones de referencia YRI, CEU y ASW, Los SNP genotipados se identifican y se enumeran las MAF dentro de la CSSCD, Coordenadas genomicas de hg19,

Tabla 3 | Marcadores adicionales encontrados por resecuenciacion de Sanger

Marcador CRO POS ^AleloAlelo

_{principal menor}DHS Genotipado MAF ss711589103 2 60,717,561 T A 62 SI 0,00085

ss711589106 2 60,718,048 C G 62 ^{Diseno de ensayo} _fallido-ss711589108 2 60,722,056 G A 58 SI 0,00424 ss711589109 2 60,722,355 C T 58 SI 0,00085

ss711589110 2 60,722,358 C T 58 ^{Diseno de ensayo} _fallido-ss711589111 2 60,725,211 G T 55 SI 0,00509 ss711589113 2 60,725,564 C A 55 SI 0,00127 88 individuos de CSSCD con fenotipo de HbF extremo se sometieron a resecuenciacion de Sanger de los tres DHS dentro de BCL11A, Los nuevos marcadores identificados se enumeran, Los SNP genotipados se identifican y se enumeran las MAF dentro de la CSSCD, Coordenadas genomicas de hg19,

Tabla 5 Analisis de variantes raras y de baja frecuencia

Condicional en Condicional en rs1427407 rs1427407 y rs7606173 DHS Marcadores (n) P P P

62 4 0,001488515 0,06092413 0,59352715 58 6 0,065057555 0,03668287 0,07145516 55 4 0,006806853 0,35021761 0,75880018 ALL 14 0,000631176 0,1503518 0,6908852 Resultados del analisis de variantes raras y de baja frecuencia (MAF < 5 %), El analisis se realizo con el uso del algoritmo SKAT-O basado en conjuntos que usa los DHS 62, 58, y 55 individuales como tres conjuntos diferentes, La ultima fila "todo" muestra los resultados de las pruebas cuando las tres regiones se colapsaron entre sf,

Tabla 6 | Secuenciacion de la PCR de fusion en emulsion para haplotipaje

Num. del donante G-G A-T G-T A-G Relacion de probabilidades de la fase G-G/A-T

1 19 22 4 2 1,63x1029

2 22 14 2 3 3,78x1026

3 25 23 9 10 4,69x1011

Analisis por PCR de fusion en emulsion del haplotipo rs7569946-rs1427407, PCR de fusion realizada en emulsion de tres donantes individuales heterocigoticos dobles para rs7569946 y rs1427407, que genera un amplicon de fusion que abarca ambos SNP, El amplicon de fusion se clono, y los clones individuales se secuenciaron por Sanger, Se enumera el numero de clones de cada genotipo, Se calculo la relacion de probabilidades para la fase G-G/A-T en comparacion con la fase G-T/A-G,

Tabla 7 | Coordenadas de los fragmentos para ensayos reporteros

hg19, cro2 Distancia de TSS de

BCL11A (kb)

Reportero Nombre Inicio Final Inicio Final Longitud (pb) LacZ 52,0-64,4 60,716,189 60,728,612 64,444 52,021 12,423

56,8-64,4 60,716,189 60,723,870 64,444 56,763 7,681

52,0-57,6 60,722,992 60,728,612 57,641 52,021 5,620

62 60,717,236 60,719,036 63,397 61,597 1,800

58 60,722,006 60,723,058 58,627 57,575 1,052

55 60,724,917 60,726,282 55,716 54,351 1,365

GFP 164 60,616,396 60,618,032 164,237 162,601 1,636

156 60,623,536 60,624,989 157,097 155,644 1,453

153 60,626,565 60,628,177 154,068 152,456 1,612

62 60,717,236 60,719,036 63,397 61,597 1,800

58 60,721,212 60,722,958 59,421 57,675 1,746

55 60,724,780 60,726,471 55,853 54,162 1,691

41 60,739,075 60,740,154 41,558 40,479 1,079

32 60,748,003 60,749,009 32,630 31,624 1,006

-46 60,826,438 60,827,601 -45,805 -46,968 1,163

-52 60,831,589 60,833,556 -50,956 -52,923 1,967

Coordenadas de los fragmented potenciadores putativos clonados en los ensayos reporteros de potenciador, Las coordenadas del cromosoma 2 se enumeran en hg19 as ^como en referencia al TSS de BCL11A,

Tabla 8. Secuencias de oligonucleotidos,

Nombre Secuencia Ensayo

mBcl11a-5'-F AAAGAGCTGTCCGAAGTCCA PCR de la delecion por TALEN (sec.

con num. de ident.: 7) mBcl11a-5'-R GGGCACTTCCTAGTCCCTCT PCR de la delecion por TALEN (sec.

con num. de ident.: 8) mBcl11a-del1-F TTTGAGCAGGAGGGAATTTG PCR de la delecion por TALEN (sec.

con num. de ident.: 9) mBcl11a-del1-R ATGTTGTGGTCCCTGTGGTT PCR de la delecion por TALEN sec.

con num. de ident.: 10) mBcl11a-del2-F GCAAGGCAGGTACCAAACAT PCR de la delecion por TALEN sec.

con num. de ident.: 11) mBcl11a-del2-R TAGAGATTCCAGGCCCCTTT PCR de la delecion por TALEN sec.

con num. de ident.: 12) mBcl11a-3'-F AGCAAGGAAAGGTGAAGCAG PCR de la delecion por TALEN sec.

con num. de ident.: 13) mBcl11a-3'-R CCCAATGTCTTCCGAACTGT PCR de la delecion por TALEN sec.

con num. de ident.: 14)

m B cllla - AGGCTGGTCTTGGGATTTTT PCR de la delecion por TALEN sec. upstreamTALEN-F con num. de ident.: 15)

m B cllla - GCCTTTAACAAGGGTGTCCA PCR de la delecion por TALEN sec. downstreamTALEN- con num. de ident.: 16)

R

mBcl11a-5'probe-F CATAGACCTGGGTCCTGGAA Sonda 5' paratransferencia Southern sec. con num. de ident.: 17) mBcl11a-5'probe-R TTGCAGAGTGACTCCTGTGG Sonda 5' paratransferencia Southern sec. con num. de ident.: 18) hBCL11A-52,0-F CCAGCCATACCCAAAACAAA clonacion del reportero lacZ sec. con num. de ident.: 19)

hBCL11A-64,4-R CTTTCCCTCTTGCCACTCAG clonacion del reportero lacZ (sec.

con num. de ident.: 20) hBCL11A-56,8-F GGCAGAGAAGGCACAGTGA clonacion del reportero lacZ (sec.

con num. de ident.: 21) hBCL11A-57,6-R GGCTGTCCTGGCATGTAAGT clonacion del reportero lacZ (sec.

con num. de ident.: 22) hBCL11A-63,4-F AACAGACCCATGTGCTAGGC clonacion del reportero lacZ/GFP (sec. con num. de ident.: 23) hBCL11A-61,6-R TGTGTGGACTGCCTTTTCTG clonacion del reportero lacZ/GFP (sec. con num. de ident.: 24) hBCL11A-58,6-F GGGAAAAGGGAGAGGAAAAA clonacion del reportero lacZ (sec.

con num. de ident.: 25) hBCL11A-57,6-R CTCAGAAAAATGACAGCACCA clonacion del reportero lacZ (sec.

con num. de ident.: 26) hBCL11A-55,7-F GGACTCAGTGGCCTCTTTTG clonacion del reportero lacZ (sec.

con num. de ident.: 27) hBCL11A-54,4-R GAAGATAATGGCAGCCCAGA clonacion del reportero lacZ (sec.

con num. de ident.: 28) hBCL11A-164,2-F TGTGTGGCCAACCTGTAAAA clonacion del reportero GFP (sec.

con num. de ident.: 29) hBCL11A-162,6-R CTCGCTCTGTTTCCCAGTTC clonacion del reportero GFP (sec.

con num. de ident.: 30) hBCL11A-157,1-F CTCTCCGACGACCTCTTTTG clonacion del reportero GFP (sec.

con num. de ident.: 31) hBCL11A-155,6-R GTAGGGAAGGGGCTACTTGG clonacion del reportero GFP (sec.

con num. de ident.: 32) hBCL11A-154,1-F AGAGCCAAACTCCGTCTCAA clonacion del reportero GFP (sec.

con num. de ident.: 33) hBCL11A-152,5-R AAATACCACAGCCCAACAGC clonacion del reportero GFP (sec.

con num. de ident.: 34) hBCL11A-59,4-F GAACAGAGACCACTACTGGCAAT clonacion del reportero GFP (sec.

con num. de ident.: 35)

hBCL11A-57,7-R GGGGAAGGGGTATTGAATTG clonacion del reportero GFP (sec.

con num. de ident.: 36)

hBCL11A-55,9-F CTTCCACTGGATGGCACTTT clonacion del reportero GFP (sec.

con num. de ident.: 37)

hBCL11A-54,2-R ACTTCAGCCTCCAGCACTGT clonacion del reportero GFP (sec.

con num. de ident.: 38)

hBCL11A-41,6-F CCTCCCAGCAATGTAGGTGT clonacion del reportero GFP (sec.

con num. de ident.: 39)

hBCL11A-40,5-R TGGTGTGGTCCACTGTGACT clonacion del reportero GFP (sec.

con num. de ident.: 40)

hBCL11A-32,6-F GCAAGCTTAGCCCCTTCTTT clonacion del reportero GFP (sec.

con num. de ident.: 41)

hBCL11A-31,6-R TGAGGCAGAGTCAGATGTGG clonacion del reportero GFP (sec.

con num. de ident.: 42)

hBCL11A-n45,8-F CCCCGCTCAGAGTAAGTGAG clonacion del reportero GFP (sec.

con num. de ident.: 43)

hBCL11A-n47,0-R GGAAACTGCCTATCCCATGA clonacion del reportero GFP (sec.

con num. de ident.: 44)

hBCL11A-n51,0-F CAACACCCCGATTTCAGACT clonacion del reportero GFP (sec.

con num. de ident.: 45)

hBCL11A-n52,9-R GAATGGTCCCGATCTCTTGA clonacion del reportero GFP (sec.

con num. de ident.: 46)

mGapdh-RT-F TGGTGAAGGTCGGTGTGAAC RT-qPCR (Gapdh) (sec. con num.

de ident.: 47)

mGapdh-RT-R CCATGTAGTTGAGGTCAATGAAGG RT-qPCR (Gapdh) (sec. con num.

de ident.: 48)

mBcl11a-RT-e1e2- AACCCCAGCACTTAAGCAAA RT-qPCR (exon 1/2 de Bcl11a) (sec.

F con num. de ident.: 49)

mBcl11a-RT-e1e2- ACAGGTGAGAAGGTCGTGGT RT-qPCR (exon 1/2 de Bcl11a) (sec.

R con num. de ident.: 50)

mBcl11a-RT-e2e3- GCCCCAAACAGGAACACATA RT-qPCR (exon 2/3 de Bcl11a) (sec.

F con num. de ident.: 51)

mBcl11a-RT-e2e3- GGGGCATATTCTGCACTCAT RT-qPCR (exon 2/3 de Bcl11a) (sec.

R con num. de ident.: 52)

mBcl11a-RT-e4e4- ATGCGAGCTGTGCAACTATG RT-qPCR (exon 4/4 de Bcl11a, F isoforma XL) (sec. con num. de ident.: 53)

mBcl11a-RT-e4e4- GTAAACGTCCTTCCCCACCT RT-qPCR (exon 4/4 de Bcl11a, R isoforma XL) (sec. con num. de ident.: 54)

mBcl11a-RT-e4e5- CAGCTCAAAAGAGGGCAGAC RT-qPCR (exon 4/5 de Bcl11a, F isoforma L) (sec. con num. de ident.: 55)

mBcl11a-RT-e4e5- GAGCTTCCATCCGAAAACTG RT-qPCR (exon 4/5 de Bcl11a, R isoforma L) (sec. con num. de ident.: 56)

mHbby-RT-F TGGCCTGTGGAGTAAGGTCAA RT-qPCR (eY) (sec. con num. de ident.: 57)

mHbby-RT-R GAAGCAGAGGACAAGTTCCCA RT-qPCR (eY) (sec. con num. de ident.: 58)

mHbb-bh1-RT-F TGGACAACCTCAAGGAGACC RT-qPCR (bH1) (sec. con num. de ident.: 59)

mHbb-bh1-RT-R ACCTCTGGGGTGAATTCCTT RT-qPCR (bH1) (sec. con num. de ident.: 60)

mHbb-b1-RT-F TTTAACGATGGCCTGAATCACTT RT-qPCR (b1/b2) (sec. con num. de ident.: 61)

mHbb-b1-RT-R CAGCACAATCACGATCATATTGC RT-qPCR (b1/b2) (sec. con num. de ident.: 62)

lacZ-RT-F GCCAACATTGAGACACATGG RT-qPCR (lacZ) (sec. con num. de ident.: 63)

lacZ-RT-R TGTCTCTCTGCACCATCCTG RT-qPCR (lacZ) (sec. con num. de ident.: 64)

lacZ-F TTCAATGCTGTCAGGTGCTC Genotipificacion por PCR (lacZ) (sec.

con num. de ident.: 65)

lacZ-R GCCATGTGTCTCAATGTTGG Genotipificacion por PCR (lacZ) (sec.

con num. de ident.: 66) rs7569946-F GTCTGCCCTCTTTTGAGCTG PCR de fusion para haplotipaje (sec.

con num. de ident.: 67) rs7569946-R GACTCCAGACAATCGCCTTT PCR de fusion para haplotipaje (sec.

con num. de ident.: 68) rs7569946-R-rc- AAAGGCGATTGTCTGGAGTCAACCTT cebador conector, fusion para haplotipaje (sec. con num. de ident.: 69)

rs1427407-F CTTAGCACCCACAAAC PCR (sec. con num. de ident.: 70) rs1427407-R CATGTTACTGCAACTTGCTTTTT PCR de fusion para haplotipaje (sec.

con num. de ident.: 71) rs7569946-nested-F AGATCCCTCCGTCCAGCTC PCR de fusion para haplotipaje (sec.

con num. de ident.: 72) rs1427407-nested- TGAAAGTTCAAGTAGATATCAGAAGG PCR de fusion para haplotipaje (sec.

R con num. de ident.: 73)

3C-hBCL11A- AGCAAACCACACAGACTGAAGA 3C (sec. con num.

150,6-F de ident.: 74) 3C-hBCL11A- CCAGAGCCATTTACGTCACA 3C (sec. con num.

140,9-F de ident.: 75) 3C-hBCL11A- CAGAAGGGAATAAGGTACTCTGGA 3C (sec. con num.

114,1 -F de ident.: 76) 3C-hBCL11A- GTTTGGGCCTCAAGGTCTTT 3C (sec. con num.

111,5-F de ident.: 77) 3C-hBCL11A- GAGGTTGGGAGTAAGCATTCTG 3C (sec. con num.

109,1 -F de ident.: 78) 3C-hBCL11A- ACGCATCAGAATGCCCATAG 3C (sec. con num.

100,7-F de ident.: 79) 3C-hBCL11A-92,3- TTTTGAAAGAAAACGCTGACA 3C (sec. con num.

F de ident.: 80) 3C-hBCL11A-80,2- TTCCAGCTGGTTAAATTTAGGG 3C (sec. con num.

F de ident.: 81) 3C-hBCL11A-77,2- AGAAGGGGCCAGAAGAACAG 3C (sec. con num.

F de ident.: 82) 3C-hBCL11A-72,5- CCTTCTTTTTCTTTCTTGGTTGC 3C (sec. con num.

F de ident.: 83) 3C-hBCL11A-66,8- CCCTGCGTGCCATTAAAATA 3C (sec. con num.

F de ident.: 84) 3C-hBCL11A-61,2- AAAGGCCTTGGGAAGAAAGA 3C (sec. con num.

F de ident.: 85) 3C-hBCL11A-59,1- GCAAGTCAGTTGGGAACACA 3C (sec. con num.

F de ident.: 86) 3C-hBCL11A-57,1- GGACTCAGTGGCCTCTTTTG 3C (sec. con num.

F de ident.: 87) 3C-hBCL11A-52,2- CTGTCTCTGTCTCCCCCAAG 3C (sec. con num.

F de ident.: 88) 3C-hBCL11A-47-F CCAATGCTCCTGTAACAAAGG 3C (sec. con num.

de ident.: 89) 3C-hBCL11A-43,5- AATGCAGTAGGCAAAGAAGCA 3C (sec. con num.

F de ident.: 90) 3C-hBCL11A-38,6- GAAATTTGGAAGGCCACAGA 3C (sec. con num.

F de ident.: 91) 3C-hBCL11A-29,3- GCTTGCAACAATTAAAAGATGG 3C (sec. con num.

F de ident.: 92) 3C-hBCL11A-27,1- GGTGACAAGGGAGAACCACT 3C (sec. con num.

F de ident.: 93) 3C-hBCL11A-20,9- TGATTTCCTTGCAGCCTTTT 3C (sec. con num.

F de ident.: 94) 3C-hBCL11A-8,6-F CACACCCACAGCAACAAATG 3C (sec. con num.

de ident.: 95) 3C- TGCAGAGATCCCCCAAAGTA 3C (sec. con num. hBCL11Apromoter- de ident.: 96) R

3C-hBCL11A-n8,3- CTCAGGGAGCAAGGGAAATA 3C (sec. con num.

F de ident.: 97) 3C-hBCL11A- CCCTCCCAACAGGGATTTAT 3C (sec. con num. n12,6-F de ident.: 98) 3C-hBCL11A- CAAAATTGAACACCTATGGTCTGA 3C (sec. con num. n19,5-F de ident.: 99) 3C-hBCL11A- AGGAAGACTTTGGCCTCCAT 3C (sec. con num. n29,8-F de ident.: 100) 3C-hBCL11A- TTCCAAACAATTATACACCAACAAA 3C (sec. con num. n34,6-F de ident.: 101) 3C-hBCL11A-n54-F TTTCATGGGGAATAGCCAAC 3C (sec. con num.

de ident.: 102) 3C-hBCL11A- CCCTACTTGTTATTTGCTTCTGC 3C (sec. con num. n78,2-F de ident.: 103) 3C-hBCL11A- AGCTGAAGTTTCAGGGACCA 3C (sec, con num, n104,4-F de ident,:104) 3C-LCR-HS1-F CCACACCTGCCTTCCTTAGA 3C (sec. con num.

de ident.: 105) 3C-LCR-HS3-F TGCATATGATGGGGTAGCAG 3C (sec. con num.

de ident.: 106) ChIP-hBCL11A- AAGAGAAGGGGGAATTTGGA ChIP-qPCR (sec. con num.

68,7-F de ident.: 107) ChIP-hBCL11A- TGGTGATAAGGGCAGGAAAC ChIP-qPCR (sec. con num.

68,7-R de ident.: 108) ChIP-hBCL11A- AGGAAGCTGCAGAAAGGTGA ChIP-qPCR (sec. con num.

65,5-F de ident.: 109) ChIP-hBCL11A- TGCTTCCCCAGGTTTAGATG ChIP-qPCR (sec. con num.

65,5-R de ident.: 110) ChIP-hBCL11A- CCACTGCTACCCAAAACGAT ChIP-qPCR (sec. con num.

64,7-F de ident.: 111) ChIP-hBCL11A- CAAGAGCGAAACTCCACCTC ChIP-qPCR (sec. con num.

64,7-R de ident.: 112) ChIP-hBCL11A- ACTGTGTGCCAAGTGACCAG ChIP-qPCR (sec. con num.

63,9-F de ident.: 113) ChIP-hBCL11A- CAGCTTCCTTCAGGTGCTTC ChIP-qPCR (sec. con num.

63,9-R de ident.: 114) ChIP-hBCL11A- CATGCTGCCTTTGTCTTCTG ChIP-qPCR (sec. con num.

63,1-F de ident.: 115) ChIP-hBCL11A- TGTGGAGCTCTGGAATGATG ChIP-qPCR (sec. con num.

63,1-R de ident.: 116) ChIP-hBCL11A- GAGCTCCACAATCCAACTCC ChIP-qPCR (sec. con num.

63,0-F de ident.: 117) ChIP-hBCL11A- CCAGGAAGGAAATGAGAACG ChIP-qPCR (sec. con num.

63,0-R de ident.: 118) ChIP-hBCL11A- ACCCACAAACATTTCCCTTCT ChIP-qPCR (sec. con num.

62,5-F de ident.: 119) ChIP-hBCL11A- TTTGCTCTTCTCCAGGGTGT ChIP-qPCR (sec. con num.

62,5-R de ident.: 120) ChIP-hBCL11A- TTTAAACAGCCACCCCACAC ChIP-qPCR (sec. con num.

62,4-F de ident.: 121) ChIP-hBCL11A- ACCACGTAGTTGGGCTTCAC ChIP-qPCR (sec. con num.

62,4-R de ident.: 122) ChIP-hBCL11A- TTTCAACCATGGTCATCTGC ChIP-qPCR (sec. con num.

62,2-F de ident.: 123) ChIP-hBCL11A- CCCTCTGGCATCAAAATGAG ChIP-qPCR (sec. con num.

62,2-R de ident.: 124) ChIP-hBCL11A- GAACCTGGGAGGCAGAAGAT ChIP-qPCR (sec. con num.

61,8-F de ident.: 125) ChIP-hBCL11A- TTTTTGGTGAGACGGAGATTT ChIP-qPCR (sec. con num.

61,8-R de ident.: 126) ChIP-hBCL11A- CCGGGCAACAAGAGTAAATC ChIP-qPCR (sec. con num.

61,7-F de ident.: 127) ChIP-hBCL11A- ATGCCTAGGGTGTTTTGACG ChIP-qPCR (sec. con num.

61,7-R de ident.: 128) ChIP-hBCL11A- CTCCGTGTTGAGAGCCAAGT ChIP-qPCR (sec. con num.

61,5-F de ident.: 129) ChIP-hBCL11A- TGTGTGGACTGCCTTTTCTG ChIP-qPCR (sec. con num.

61,5-R de ident.: 130) ChIP-hBCL11A- CAGAAAAGGCAGTCCACACA ChIP-qPCR (sec. con num.

61,3-F de ident.: 131) ChIP-hBCL11A- CCTCTCCAGATTCCCTCTCA ChIP-qPCR (sec. con num.

61,3-R de ident.: 132) ChIP-hBCL11A- AGCGAGACCCTGTCTCAAAA ChIP-qPCR sec. con num. de 61,0-F ident.: 133) ChIP-hBCL11A- TCCAGCAGGCTTCAAAAAGT ChIP-qPCR sec. con num. de 61,0-R ident.: 134) ChIP-hBCL11A- GGTGGATAACCCCATCTCAG ChIP-qPCR sec. con num. de 60,8-F ident.: 135) ChIP-hBCL11A- GGAAATGAGAATGCCCTTTG ChIP-qPCR sec. con num. de 60,8-R ident.: 136) ChIP-hBCL11A- CAGTCTAGAAAGCCCCCTCA ChIP-qPCR sec. con num. de 60,5-F ident.: 137) ChIP-hBCL11A- GTGGGGGTTCAGTGGTTAGA ChIP-qPCR sec. con num. de 60,5-R ident.: 138) ChIP-hBCL11A- TCCATGGTGTGGAGTGTGTT ChIP-qPCR sec. con num. de 60,3-F ident.: 139) ChIP-hBCL11A- ACCCACATGGCAACCAATAG ChIP-qPCR sec. con num. de 60,3-R ident.: 140) ChIP-hBCL11A- CCATTCCCTGGAGAGTTCAA ChIP-qPCR sec. con num. de 60,0-F ident.: 141) ChIP-hBCL11A- GGGGTCTCTTCCCATCATTT ChIP-qPCR sec. con num. de 60,0-R ident.: 142) ChIP-hBCL11A- ATGGGAAGAGACCCCAAAAC ChIP-qPCR sec. con num. de 59,9-F ident.: 143) ChIP-hBCL11A- GGACTCCGAACACCACACTT ChIP-qPCR sec. con num. de 59,9-R ident.: 144) ChIP-hBCL11A- GGGATCAGAGGTGAACAGGA ChIP-qPCR sec. con num. de 59,5-F ident.: 145) ChIP-hBCL11A- TTTAATCAGCTTCCGCCACT ChIP-qPCR sec. con num. de 59,5-R ident.: 146) ChIP-hBCL11A- TGGGGAGAGAAGAGTGGAAA ChIP-qPCR sec. con num. de 59,0-F ident.: 147) ChIP-hBCL11A- TTGCCAATTGGAGATTAGGG ChIP-qPCR sec. con num. de 59,0-R ident.: 148)

ChIP-hBCL11A- TGCTCCGAGCTTGTGAACTA ChIP-qPCR sec. con num. de 58,7-F ident.: 149)

ChIP-hBCL11A- GGGAAAGGGCCTGATAACTT ChIP-qPCR sec. con num. de 58,7-R ident.: 150)

ChIP-hBCL11A- GAGAGTGCAGACAGGGGAAG ChIP-qPCR sec. con num. de 58,3-F ident.: 151)

ChIP-hBCL11A- CCTCTTTCGGAAGGCTCTCT ChIP-qPCR sec. con num. de 58,3-R ident.: 152)

ChIP-hBCL11A- TGGACTTTGCACTGGAATCA ChIP-qPCR sec. con num. de 58,0-F ident.: 153)

ChIP-hBCL11A- GATGGCTGAAAAGCGATACA ChIP-qPCR sec. con num. de 58,0-R ident.: 154)

ChIP-hBCL11A- GGGGAGATGATTGAAAGCAA ChIP-qPCR sec. con num. de 57,3-F ident.: 155)

ChIP-hBCL11A- AGAACTTTCCCGGTTCTGGT ChIP-qPCR sec. con num. de 57,3-R ident.: 156)

ChIP-hBCL11A- GCTCTGGACACACAGCAAAA ChIP-qPCR sec. con num. de 57,0-F ident.: 157)

ChIP-hBCL11A- TCAAATCCTTGCCTTGAACC ChIP-qPCR sec. con num. de 57,0-R ident.: 158)

ChIP-hBCL11A- CCTCAAATCTCCCTCACTGG ChIP-qPCR sec. con num. de 56,6-F ident.: 159)

ChIP-hBCL11A- GGGAAATGGGTCCTGCTTTA ChIP-qPCR sec. con num. de 56,6-R ident.: 160)

ChIP-hBCL11A- AGGGAGTACACCGCAGACAC ChIP-qPCR sec. con num. de 56,3-F ident.: 161)

ChIP-hBCL11A- AAGGAAGGCTGCAAGGAAAT ChIP-qPCR sec. con num. de 56,3-R ident.: 162)

ChIP-hBCL11A- GACTTAAACTGCCGCTCCTG ChIP-qPCR sec. con num. de 55,9-F ident.: 163)

ChIP-hBCL11A- TGACTGGTAAGAGCCGATTG ChIP-qPCR sec. con num. de 55,9-R ident.: 164)

ChIP-hBCL11A- GCTGGGGTGAGTCAAAAGTC ChIP-qPCR sec. con num. de 55,3-F ident.: 165)

ChIP-hBCL11A- GGTCACCTTAAGGAGCCACA ChIP-qPCR sec. con num. de 55,3-R ident.: 166)

ChIP-hBCL11A- GCACCTGCATTTGTTTTTCA ChIP-qPCR sec. con num. de 54,8-F ident.: 167)

ChIP-hBCL11A- GGGTCAGATCACCTCTGCTC ChIP-qPCR sec. con num. de 54,8-R ident.: 168)

ChIP-hBCL11A- AGGCATCCAAAGGGAAGAAT ChIP-qPCR sec. con num. de 54,4-F ident.: 169)

ChIP-hBCL11A- GAAGATAATGGCAGCCCAGA ChIP-qPCR sec. con num. de 54,4-R ident.: 170) ChIP-hBCL11A- TGGGAAAGGTTGCACATTCT ChIP-qPCR sec. con num. de 54,0-F ident.: 171)

ChIP-hBCL11A- GGGCCTCAGGCTCTTTATCT ChIP-qPCR sec. con num. de 54,0-R ident.: 172)

ChIP-hBCL11A- CCACTGCCAGGCTGTTTACT ChIP-qPCR sec. con num. de 53,4-F ident.: 173)

ChIP-hBCL11A- GACCGAAAGGAGGAGAGGAG ChIP-qPCR sec. con num. de 53,4-R ident.: 174)

ChIP-hBCL11A- CAGTTCCCCCATTATGCACT ChIP-qPCR sec. con num. de 53,1-F ident.: 175)

ChIP-hBCL11A- CCCTTCTCTGAAGGCACATC ChIP-qPCR sec. con num. de 53,1-R ident.: 176)

ChIP-hBCL11A- TTCAAGCCTTGGTGGATAGG ChIP-qPCR sec. con num. de 52,7-F ident.: 177)

ChIP-hBCL11A- GCCAGGAAATTGGTGGTAGA ChIP-qPCR sec. con num. de 52,7-R ident.: 178)

ChIP-hBCL11A- TGCCCACATGAGACATCTTT ChIP-qPCR sec. con num. de 52,3-F ident.: 179)

ChIP-hBCL11A- AAATTGGCTGCCATTGAATC ChIP-qPCR sec. con num. de 52,3-R ident.: 180)

ChIP-hBCL11A- CCACCAGAAGTCCTGGAAAA ChIP-qPCR sec. con num. de 51,3-F ident.: 181)

ChIP-hBCL11A- TTGGAGGGACCTGATCTCTG ChIP-qPCR sec. con num. de 51,3-R ident.: 182)

ChIP-hBCL11A- CCAAGATGGAGAAGCCACAT ChIP-qPCR sec. con num. de 50,2-F ident.: 183)

ChIP-hBCL11A- TCTGTCTTGGGTCTCCTGGT ChIP-qPCR sec. con num. de 50,2-R ident.: 184)

ChIP-hBCL11A- GAGAAGCCCTCAGCAAACAC ChIP-qPCR sec. con num. de 49,8-F ident.: 185)

ChIP-hBCL11A- GGTTGCATCTTGGCTCCTAA ChIP-qPCR sec. con num. de 49,8-R ident.: 186)

ChIP-hBCL11A- GAAATGCAGGAAAGGAACGA ChIP-qPCR sec. con num. de 49,5-F ident.: 187)

ChIP-hBCL11A- TCTAGCAGATGGGGTTTTGG ChIP-qPCR sec. con num. de 49,5-R ident.: 188)

ChIP-hOct4-prom-F AGTCTGGGCAACAAAGTGAGA ChIP-qPCR sec. con num. de ident.: 189)

ChIP-hOct4-prom-R AGAAACTGAGGAGAAGGATG ChIP-qPCR sec. con num. de ident.: 190)

ChIP-hHS3-F ATAGACCATGAGTAGAGGGCAGAC ChIP-qPCR sec. con num. de ident.: 191)

ChIP-hHS3-R TGATCCTGAAAACATAGGAGTCAA ChIP-qPCR sec. con num. de ident.: 192)

ChIP-hHS-40-F CAGATAACTGGGCCAACCAT ChIP-qPCR sec. con num. de ident.: 193) ChIP-hHS-40-R ATTCACCCCTTTCCCTTGTC ChIP-qPCR sec. con num. de ident.: 194)

ChIP-hGAPDH-F CGTAGCTCAGGCCTCAAGAC ChIP-qPCR sec. con num. de ident.: 195)

ChIP-hGAPDH-R CGAACAGGAGGAGCAGAGAG ChIP-qPCR sec. con num. de ident.: 196)

Oligonudeotidos usados en los experimentos indicados.

Claims

Reivindicaciones

1. Un metodo para producir una celula progenitora hematopoyetica que tiene disminucion del ARNm o la expresion proteica de BCL11A, el metodo comprende poner en contacto ex vivo o in vitro una celula progenitora hematopoyetica aislada con al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a a Dn escinde el ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genomico de la UCSC), para reducir de este modo el ARNm o la expresion proteica de BCL11A.

2. Un metodo para producir una celula progenitora hematopoyetica humana modificada geneticamente aislada que tiene al menos una modificacion genetica que comprende poner en contacto ex vivo o in vitro una celula progenitora hematopoyetica aislada con una cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genomico de la celula progenitora hematopoyetica en la ubicacion 60.716.189- 60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta.

3. Un metodo para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en una celula progenitora hematopoyetica, el metodo comprende las etapas de: poner en contacto ex vivo o in vitro una celula progenitora hematopoyetica aislada con una cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genomico de la celula progenitora hematopoyetica en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta, de manera que la expresion de hemoglobina fetal aumenta en dicha celula, o su progenie, con relacion a dicha celula antes de dicho contacto.

4. El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la progenitora hematopoyetica es una celula del linaje eritroide.

5. El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en donde al menos una modificacion genetica es una delecion.

6. El metodo de conformidad con la reivindicacion 5, en donde la delecion elimina toda la region entre la ubicacion 60.716.189- 60,728,612 del cromosoma 2 o elimina una porcion de la region lo que da como resultado la interrupcion de uno o mas sitios hipersensibles a DNAsa 1 (DHS).

7. Una celula humana modificada geneticamente aislada que tiene al menos una modificacion genetica en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2, en donde la celula puede obtenerse mediante el metodo de acuerdo con las reivindicaciones 2-6.

8. Una composicion que comprende una celula humana modificada geneticamente aislada de la reivindicacion 7.

9. Una celula progenitora hematopoyetica aislada para el uso en el aumento de los niveles de hemoglobina fetal en un mairnfero que lo necesita, en donde la celula progenitora hematopoyetica aislada se ha puesto en contacto ex vivo o in vivo con una cantidad eficaz de una composicion que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genomico de la celula en la ubicacion 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificacion genetica en esta.

10. Una celula humana modificada geneticamente aislada de conformidad con la reivindicacion 7 o una composicion de conformidad con la reivindicacion 8 para el uso en el aumento de los niveles de hemoglobina fetal en un marnffero que lo necesita.