ES2704411T3 - Proteínas de fusión inmunomoduladoras y procedimientos de fabricación de las mismas - Google Patents

Abstract

Procedimiento de preparación de una proteína de fusión terapéuticamente activa, en el que la proteína de fusión comprende un resto dirigido al tumor y al menos una molécula inmunomoduladora que contrarresta la tolerancia inmune de una célula cancerosa, en el que el resto dirigido al tumor es un anticuerpo que se une a EGFR1 o CTLA 4 y en el que la proteína de fusión se prepara mediante las siguientes etapas: preparar una secuencia de nucleótidos optimizada en codones que codifica la proteína de fusión para la expresión en células CHO, siendo la secuencia de nucleótidos optimizada en codones modificada para aumentar las secuencias de CG, y en la que la secuencia de nucleótidos optimizada en codones es SEQ ID NO: 1 o 5 para la cadena pesada del anticuerpo, SEQ ID NO: 2 o 6 para la cadena ligera del anticuerpo, SEQ ID NO: 3 o 7 para la molécula inmunomoduladora, en la que la secuencia de nucleótidos optimizada en codones SEQ ID NO: 1 o 5 para la cadena pesada del anticuerpo que se une a EGFR1 o CTLA-4, respectivamente, carece de nucleótidos para la expresión de una lisina en el extremo C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo; clonar la secuencia optimizada de dicha proteína de fusión en las células CHO capaces de expresión transitoria o estable; cultivar las células CHO en un medio en condiciones adecuadas para el cultivo y permitir que la célula huésped exprese la proteína de fusión; y recoger proteínas de fusión secretadas y opcionalmente para purificación adicional.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas de fusión inmunomoduladoras y procedimientos de fabricación de las mismas

Antecedentes de la invención

Campo técnico

La presente invención se refiere en general al campo de la generación de proteínas de fusión quiméricas recombinantes para uso en la terapia contra el cáncer, y más específicamente, a moléculas de fusión de Anti-EGFR1-TGFpRII, Anti-EGFR1-PD1 y Anti-CTLA4-PD1 y a procedimientos para generar las mismas, en la que los procedimientos reducen los costes de producción y aumentan la homogeneidad de las proteínas de fusión quiméricas recombinantes.

Técnica relacionada

A pesar de los numerosos avances en la investigación médica, el cáncer sigue siendo la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos. Los modos tradicionales de atención clínica, tales como la resección quirúrgica, la radioterapia y la quimioterapia, tienen un índice de fracaso significativo, especialmente para tumores sólidos. El fracaso se produce bien porque el tumor inicial no responde, bien por recurrencia debido a un nuevo crecimiento en el sitio original o a metástasis. El cáncer sigue siendo un tema prioritario para la investigación y el desarrollo médico. La inmunoterapia contra el cáncer se ha explorado durante más de un siglo, pero solo en la última década se han introducido diversos productos basados en anticuerpos en el tratamiento de pacientes con diversas formas de cáncer. En la actualidad, esta es una de las áreas más activas de la investigación clínica, con numerosos productos terapéuticos de anticuerpos ya aprobados en oncología.

El uso de anticuerpos específicos como agentes terapéuticos ofrece ventajas sobre las terapias no dirigidas, como la quimioterapia sistémica mediante la administración oral o intravenosa de fármacos o la radioterapia. Existen dos tipos de terapias basadas en anticuerpos. El tipo más común consiste en identificar un antígeno tumoral (es decir, una proteína expresada en tumores y células cancerosas y no en tejidos normales) y desarrollar un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo monoclonal (mAb) dirigido al antígeno tumoral. Luego se puede conjugar cualquier agente terapéutico, como un agente quimioterapéutico, un radionúclido, una toxina modificada, etc., a este anticuerpo para lograr una terapia dirigida por el agente terapéutico al tumor. El otro tipo de terapia basada en anticuerpos consiste en proporcionar un anticuerpo que en sí mismo tenga propiedades terapéuticas contra las células tumorales/cancerosas a las que se dirige. La ventaja añadida de esta segunda forma de terapia basada en anticuerpos es que se puede conjugar adicionalmente otro agente terapéutico con el anticuerpo terapéutico para lograr un tratamiento más eficaz. La principal ventaja de cualquier terapia dirigida por anticuerpos y de la terapia con anticuerpos monoclonales (mAb) en particular, es la capacidad de administrar dosis mayores de un agente terapéutico a un tumor, ahorrando más tejido normal de los efectos secundarios del agente terapéutico.

El documento WO 2011/109789 A1 menciona el desarrollo de terapias basadas en anticuerpos basadas en el desarrollo de proteínas de fusión que comprenden un resto de direccionamiento y un resto inmunomodulador. El documento proporciona estrategias para contrarrestar la tolerancia inmune inducida por el tumor y mejorar la eficacia antitumoral de la quimioterapia mediante la activación y el aprovechamiento de la inmunidad antitumoral adaptativa mediada por células T contra células cancerosas resistentes o diseminadas.

A pesar de la identificación de varios anticuerpos para terapias contra el cáncer, todavía existe la necesidad de identificar productos terapéuticos nuevos y más eficaces para superar la tolerancia inmune y activar las respuestas de las células T. Además, a pesar de que la ingeniería molecular ha mejorado las perspectivas de dichos productos terapéuticos basados en anticuerpos, siguen existiendo problemas en relación con la continuidad de los productos recombinantes generados.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento de síntesis novedoso y consistente para generar moléculas inmunomoduladoras de fusión recombinantes homogéneas y, más específicamente, polipéptidos quiméricos recombinantes que incluyen anticuerpos de direccionamiento vinculados a proteínas inmunomoduladoras.

Por lo tanto, en un primer aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para preparar una proteína de fusión terapéuticamente activa, en el que la proteína de fusión comprende un resto dirigido al tumor y al menos una molécula inmunomoduladora que contrarresta la tolerancia inmune de una célula cancerosa, en el que el resto dirigido al tumor es una anticuerpo que se une a EGFR1 o CTLA-4 y en el que la proteína de fusión se prepara mediante las siguientes etapas:

preparar una secuencia de nucleótidos optimizada en codones que codifica la proteína de fusión para su expresión en células CHO, en la que la secuencia de nucleótidos optimizada en codones se modifica para aumentar las secuencias CG, y en la que la secuencia de nucleótidos optimizada en codones es SEQ ID NO: 1 o 5 para la cadena pesada del anticuerpo, SEQ ID NO: 2 o 6 para la cadena ligera del anticuerpo, SEQ ID NO: 3 o 7 para la molécula inmunomoduladora, en la que la secuencia de nucleótidos optimizada en codones SEQ ID NO: 1 o 5 para la cadena pesada del anticuerpo que se une a EGFR1 o CTLA-4, respectivamente, carece de nucleótidos para la expresión de una lisina en el extremo C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo; clonar la secuencia optimizada de dicha proteína de fusión en las células CHO capaces de expresión transitoria o estable;

cultivar las células CHO en un medio en condiciones adecuadas para el cultivo y que permita que la célula huésped exprese la proteína de fusión; y

recoger proteínas de fusión secretadas y opcionalmente para purificación adicional.

En un segundo aspecto, la invención se refiere a una preparación que comprende proteínas de fusión homogéneas terapéuticamente activas, en la que las proteínas de fusión comprenden un resto dirigido al tumor y al menos una molécula inmunomoduladora, en la que el resto dirigido al tumor es un anticuerpo que se une a EGFR1 o CTLA-4 y en la que las proteínas de fusión se preparan de acuerdo con el primer aspecto de la invención, en la que la proteína de fusión tiene una secuencia de nucleótidos optimizada en codones que codifica la proteína de fusión para la expresión en células CHO, en la que la secuencia de nucleótidos optimizada en codones se modifica para aumentar las secuencias de CG y en la que la secuencia de nucleótidos optimizada en codones es SEQ ID NO: 1 o 5 para la cadena pesada del anticuerpo, SEQ ID NO: 2 o 6 para la cadena ligera del anticuerpo, SEQ ID NO: 3 o 7 para la molécula inmunomoduladora, en la que la secuencia de nucleótidos optimizada en codones SEQ ID NO: 1 o 5 para la cadena pesada del anticuerpo que se une a EGFR1 o CTLA-4, respectivamente, carece de nucleótidos para la expresión de una lisina en el extremo C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo.

En un tercer aspecto, la invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión quimérica de acuerdo con el primer aspecto de la invención, en el que la cadena pesada y la cadena ligera es SEQ ID NO: 1 y 2 o SEQ ID NO: 5 y 6, en el que el resto diana inmunomodulador es SEQ ID NO: 3 o 7.

En un último aspecto, la invención se refiere a un vector que comprende las secuencias de ácido nucleico del tercer aspecto de la invención.

Para mediar una respuesta inmune contra el cáncer, la activación de las células T y la coestimulación son importantes. La coestimulación de las células T está mediada principalmente por el acoplamiento de CD28 con sus ligandos de la familia B7 en células presentadoras de antígenos (ApC). Sin embargo, después de la activación, las células T expresan una molécula llamada antígeno linfocítico T citotóxico 4 (CTLA-4), que se une a los ligandos B7 con mucha más afinidad que CD28 y dicha unión modula a la baja la actividad de las células T. Por lo tanto, incluir un anticuerpo que se una al receptor CTLA-4 bloquearía la interacción con los ligandos de la familia B7 y mejoraría la respuesta antitumoral.

El ligando de muerte programada 1 (PDL1), uno de los ligandos B7 analizados anteriormente, obstruye la inmunidad antitumoral (i) tolerando las células T reactivas a tumores mediante la unión a su receptor PD1 (CD279) en las células T; (ii) haciendo que las células tumorales sean resistentes a las células T CD8 y a la lisis mediada por FasL por medio de la señalización de PD-1 a través de PDL1 expresada en células tumorales; y (iii) promoviendo el desarrollo y mantenimiento de células T reguladoras inducidas. Por lo tanto, PDL1 es un obstáculo importante para la inmunidad antitumoral natural y para las inmunoterapias contra el cáncer que requieren la activación de la inmunidad antitumoral mediada por células T del huésped. Este concepto está respaldado por estudios que demuestran que el bloqueo de anticuerpos de las interacciones PDL1-PD1 mejora la activación de las células T y reduce la progresión del tumor. Aunque los anticuerpos contra PDL1 o PD1 han mostrado eficacia terapéutica en un subconjunto de pacientes con cáncer, la mayoría de los pacientes no se benefician del tratamiento con anticuerpos. Por lo tanto, se necesita un mecanismo para regular la función de PD-L1 que conduzca a un nuevo tratamiento de aplicación universal para minimizar la supresión inmune mediada por PD-L1 en pacientes con cáncer y que sea más eficaz que los mAb disponibles actualmente para PD-1 o PD L1.

Una característica de muchos cánceres epiteliales, tales como los cánceres de colon, cabeza y cuello, mama, ovario, pulmón de células no pequeñas (NSCL, por sus siglas en inglés) y páncreas, son los niveles anormalmente altos del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) en la superficie de las células cancerosas. La familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFR; HER1, HER2/neu, HER3 y HER4) incluye receptores de membrana celular con actividad intrínseca de tirosina quinasa que desencadena una cascada de reacciones de señalización biofisiológica en respuesta a la unión de diferentes ligandos. Estos receptores desempeñan un papel clave en el comportamiento de las células malignas en una variedad de tumores humanos, induciendo un aumento de la proliferación, disminuyendo la apoptosis y mejorando la motilidad de las células tumorales y la angiogénesis. Por lo tanto, la presente divulgación incluye anticuerpos dirigidos a miembros de la familia EGFR.

La presente descripción proporciona además procedimientos para reducir el crecimiento de células cancerosas contrarrestando la tolerancia inmune de las células cancerosas, en las que las células T permanecen activas e inhiben el reclutamiento de T reguladores que se sabe que suprimen la respuesta del sistema inmunitario al tumor. Por lo tanto, los polipéptidos quiméricos generados por las secuencias de polinucleótidos de la presente invención son útiles para tratar el cáncer debido a la fusión expresada o polipéptidos quiméricos.

En un aspecto, la presente invención proporciona una preparación que comprende polipéptidos quiméricos que contienen al menos un resto de direccionamiento para dirigirse a una célula cancerosa y al menos un resto inmunomodulador que contrarresta la tolerancia inmune de una célula cancerosa, en la que el resto de direccionamiento y el resto inmunomodulador están unidos por un espaciador de aminoácidos de una longitud suficiente de residuos de aminoácidos para que ambos grupos puedan unirse con éxito a su diana individual. Como alternativa, el resto de direccionamiento y el resto inmunomodulador que contrarrestan la tolerancia inmune de las células cancerosas pueden unirse directamente entre sí. Los polipéptidos quiméricos/de fusión de la invención son útiles para unirse a un receptor de células cancerosas y reducir la capacidad de las células cancerosas para evitar una respuesta inmune.

El resto de direccionamiento es un anticuerpo que tiene afinidad de unión con CTLA-4 o EGFR1, en el que el anticuerpo se transcribe a partir de una secuencia de polinucleótidos que carece de nucleótidos para la expresión de la lisina C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo expresado. Se ha descubierto que al eliminar la lisina C-terminal de la cadena pesada de un anticuerpo durante la transcripción, el producto final exhibe una mayor homogeneidad, lo que reduce los costes y la necesidad de una purificación adicional.

Se sabe que durante el procedimiento de transcripción y traducción de una molécula de IgG en células CHO, se expresará la lisina (K) en el extremo C-terminal de la cadena pesada. En el producto comercial, tales lisinas expresadas deben eliminarse para aumentar la pureza. Hay mucha heterogeneidad en el producto producido, tal como se muestra en la Figura 1. Esto ocurre porque la célula CHO tiene una enzima endógena carboxipeptidasa B (CPB) que escindirá la lisina C-terminal siempre que el anticuerpo expresado todavía esté disponible intracelularmente. Sin embargo, esta enzima no escindirá la lisina una vez que el anticuerpo se secrete en el medio. Por lo tanto, la eficiencia de escisión de este CPB endógeno se basa en la disponibilidad dentro de la célula. Como tal, algunos de los anticuerpos se secretarán con la lisina y otros no, y tal combinación causará una heterogeneidad significativa en el producto secretado, habiendo algunos anticuerpos con la lisina C-terminal y otros sin ella. Como el producto recombinante se está utilizando para el uso terapéutico, es necesario purificar hasta la homogeneidad. Por lo tanto, los productos recombinantes del estado de la técnica requieren etapas de purificación adicionales en donde el producto recombinante necesita ser tratado con la enzima CPB primero y purificado una vez más usando una etapa adicional para eliminar cualquier lisina y la enzima CPB del producto final. Estas etapas adicionales agregan un coste significativo al procedimiento de fabricación.

La presente invención evita los inconvenientes de los procedimientos anteriores de sintetizar anticuerpos recombinantes anti-CTLA-4 y anti-EGFR1 al transcribir una proteína expresada a partir de una secuencia de polinucleótidos que carece de nucleótidos para la expresión de la lisina C-terminal en la cadena pesada del anticuerpo expresado.

La presente invención se basa en la preparación de proteínas quiméricas/de fusión mediante la expresión de polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión que contrarrestan o revierten la tolerancia inmune de las células cancerosas. Las células cancerosas pueden escapar a la eliminación mediante agentes quimioterapéuticos o anticuerpos dirigidos al tumor a través de mecanismos inmunosupresores específicos en el microentorno del tumor y dicha capacidad de las células cancerosas se reconoce como tolerancia inmune. Dichos mecanismos inmunosupresores incluyen citocinas inmunosupresoras (por ejemplo, el factor de crecimiento transformante beta (TGF-p)) y las células T reguladoras y/o células dendríticas mieloides inmunosupresoras (DC). Al contrarrestar la tolerancia inmune inducida por el tumor, la presente divulgación proporciona composiciones y procedimientos eficaces para el tratamiento del cáncer, opcionales en combinación con otro tratamiento del cáncer existente. El presente documento proporciona estrategias para contrarrestar la tolerancia inmune inducida por tumores y mejorar la eficacia antitumoral de la quimioterapia al activar y potenciar el antitumor adaptativo mediado por células T contra las células cancerosas resistentes o diseminadas.

La presente invención proporciona una preparación que comprende una molécula que incluye al menos un resto de direccionamiento fusionado con al menos un resto inmunomodulador. El resto de direccionamiento se une específicamente a una molécula diana tumoral, y el resto inmunomodulador se une específicamente a una de las siguientes moléculas: (i) Factor de crecimiento transformante beta (TGF-p) y (ii) ligando 1 de muerte programada-1 (PD-L1).

El resto de direccionamiento incluye un anticuerpo, que incluye tanto cadenas pesadas como cadenas ligeras, en las que el anticuerpo se une específicamente a un componente de una célula tumoral, antígeno tumoral, vasculatura tumoral, microentorno tumoral o célula inmune infiltrante de tumor. En particular, la cadena pesada y/o la cadena ligera pueden estar enlazadas individualmente a un resto inmunomodulador del mismo tipo o un resto inmunomodulador separado y distinto. Además, una cadena pesada o ligera de un resto dirigido al anticuerpo puede unirse a un resto inmunomodulador que, a su vez, puede unirse adicionalmente a un segundo resto inmunomodulador en el que haya un enlazador entre los dos restos inmunomoduladores.

En un aspecto adicional, se proporciona un polipéptido quimérico que comprende un resto dirigido al tumor y un resto inmunomodulador que comprende una molécula que se une al factor de crecimiento transformante beta (TGF-p), en el que el resto dirigido al tumor es un anticuerpo que se une a EGFR1, en el que el anticuerpo puede ser el anticuerpo completo, la cadena pesada o la cadena ligera.

En otra descripción, el resto dirigido al tumor puede incluir anticuerpos monoclonales que se dirigen a una célula cancerosa, incluyendo, pero sin limitarse a, cetuximab, trastuzumab, ritubximab, ipilimumab, tremelimumab, muromonab-CD3, abciximab, daclizumab, basiliximab, palivizumab, infliximab. gemtuzumab ozogamicin, alemtuzumab, ibritumomab tiuxetan, adalimumab, omalizumab, tositumomab, 1-131 tositumomab, efalizumab, bevacizumab, panitumumab, pertuzumab, natalizumab, etanercept, IGN101 (Aphton), volociximab (Biogen Idec y PDL BioPharm), Anti-CD80 mAb (Biogen Idec), Anti-CD23 mAb (Biogen Idel), CAT-3888 (Cambridge Antibody Technology), CDP-791 (Imclone), eraptuzumab (Immunomedics), ^m D^x -010 (Medarex y BMS), MDX-060 (Medarex), MDX-070 (Medarex), matuzumab (Merck), CP-675,206 (Pfizer), CAL (Roche), SGN-30 (Seattle Genetics), zanolimumab (Serono y Genmab), adecatumumab (Sereno), oregovomab (United Therapeutics), nimotuzumab (YM Bioscience), A^bT-874 (Abbott Laboratories), denosumab (Amgen), AM 108 (Amgen), AMG 714 (Amgen), fontolizumab (Biogen Idec y PDL BioPharm), daclizumab (Biogent Idec y PDL BioPharm), golimumab (Centocor y Schering-Plough), CNTO 1275 (Centocor), ocrelizumab (Genetech y Roche), HuMax-CD20 (Genmab), belimumab (HGS y GSK), epratuzumab (Immunomedics), MLN1202 (Millennium Pharmaceuticals), visilizumab (PDL BioPharm), tocilizumab (Roche), ocrerlizumab (Roche), certolizumab pegol (UCB, anteriormente Celltech), eculizumab (Alexion Pharmaceuticals), pexelizumab (Alexion Pharmaceuticals y Procter & Gamble), abciximab (Centocor), ranibizimumab (Genetech), mepolizumab (GSK), TNX-355 (Tanox) o MYO-029 (Wyeth).

En otra divulgación, el resto dirigido al tumor es un anticuerpo monoclonal que se une a CTLA-4 o EGFR1 generado por los procedimientos de la presente divulgación, en el que el procedimiento comprende las siguientes etapas: a. preparar una secuencia de nucleótidos optimizada en codones que codifica la proteína de fusión, en la que la secuencia optimizada en codones para el anticuerpo carece de nucleótidos para la expresión de una lisina en el extremo C-terminal de las cadenas pesadas del anticuerpo;

b. clonar la secuencia optimizada de dicha proteína de fusión en una célula huésped capaz de expresión transitoria o continua;

c. cultivar la célula huésped en un medio en condiciones adecuadas para el cultivo y permitir que la célula huésped exprese la proteína de fusión; y

e. recoger las proteínas de fusión secretadas.

En otro aspecto más, el resto inmunomodulador incluye una molécula que se une a TGF-p e inhibe la función del mismo. Específicamente, el resto inmunomodulador incluye un dominio de unión a ligandos extracelulares del receptor del factor de crecimiento transformante TGF-pRII, TGF-pRIIb o TGF-pRIII. En otro aspecto, el resto inmunomodulador incluye un dominio de unión a ligando extracelular (ECD) de TGF-pRII.

En una divulgación adicional, el resto de direccionamiento incluye un anticuerpo que se une específicamente a HER2/neu, EGFR1, CD20 o al antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA-4) y en el que el resto inmunomodulador incluye un dominio de unión a ligando extracelular de TGF-pRII.

En otro aspecto más, el resto inmunomodulador incluye una molécula que se une específicamente e inhibe la actividad del ligando 1 de muerte programada 1 (PD-L 1).

En una divulgación adicional, el resto de direccionamiento incluye un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o polipéptido que se une específicamente a HER2/neu, EGFR1, CD20, antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), CD25 (1L-2a receptor; IL-2aR) o CD4 y en en el que el resto inmunomodulador incluye un dominio de unión a ligando extracelular o ectodominio de muerte programada-1 (PD-1).

En un aspecto adicional, el resto de direccionamiento incluye un anticuerpo que se une específicamente a EGFR1 y CTLA-4, y el resto inmunomodulador incluye una secuencia de interacciones con el factor de crecimiento transformante p (TGF-p).

En un aspecto, la presente divulgación proporciona genes optimizados que codifican un polipéptido de fusión que comprende al menos un resto de direccionamiento y al menos un resto inmunomodulador para tratar el cáncer en un sujeto humano en el que los genes se han optimizado para aumentar la expresión en un sujeto humano y/o en células.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un vector que comprende genes optimizados para el tratamiento del cáncer en un sujeto humano en el que los genes optimizados se han modificado para aumentar las secuencias de CG. Preferiblemente, el vector incluye secuencias de nucleótidos para codificar al menos un resto de direccionamiento, al menos un resto inmunomodulador y un resto de enlace, en donde las secuencias de nucleótidos optimizadas se seleccionan de SEQ ID NO: 1 a 7, tal como se muestra en la Figura 2.

En otro aspecto más, la presente divulgación proporciona un procedimiento para el tratamiento del cáncer en un sujeto, comprendiendo el procedimiento:

proporcionar al menos un vector recombinante que comprende secuencias de nucleótidos que codifican al menos un resto de direccionamiento, al menos un resto inmunomodulador y un resto de enlace situado entre el resto de direccionamiento y el resto inmunomodulador, en el que las secuencias de nucleótidos se seleccionan de SEQ ID NO: 1 a 7; y

administrar el vector recombinante al sujeto en condiciones tales que dichas secuencias de nucleótidos se expresen a un nivel que produzca una cantidad terapéuticamente eficaz de las proteínas de fusión codificadas en el sujeto.

En otro aspecto más, la presente divulgación proporciona una célula huésped recombinante transfectada con una secuencia de polinucleótidos que codifica un péptido de proteína de fusión de la presente divulgación, en el que las secuencias de polinucleótidos se seleccionan de SEQ ID NO: 1 a 7.

En otro aspecto adicional, la presente divulgación contempla un procedimiento de preparación de una proteína de fusión quimérica del presente documento que comprende:

transfectar una célula huésped con una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína de fusión quimérica para producir una célula huésped transformada, en la que la secuencia de polinucleótidos codifica al menos un resto de direccionamiento y al menos un resto inmunomodulador, en la que la secuencia de polinucleótidos comprende una combinación de secuencias seleccionadas de SEQ ID NO: 1 a 7; y mantener la célula huésped transformada en condiciones biológicas suficientes para la expresión de la proteína de fusión quimérica.

En otro aspecto, se divulga el uso de una proteína de fusión quimérica, en la que la proteína de fusión quimérica comprende el enlazador PD1 anti-EGFRI (SEQ ID NO: 8, 9, 10 y 11); anti-EGFR1-enlazador-TGFpRII (SEQ ID NO: 8, 9, 10 y 12); Anti-CTLA-4-enblazador-PD1 (SEQ ID NO: 13, 14, 10 y 11), tal como se muestra en las Figuras 3, 4 y 5, respectivamente, en el uso de un medicamento para el tratamiento del cáncer. Preferiblemente, la proteína de fusión se expresa en una célula huésped y tales proteínas expresadas se administran en una cantidad terapéutica para reducir los efectos del cáncer en un sujeto que lo necesite.

En otro aspecto adicional, se divulga un procedimiento para el tratamiento de una enfermedad neoplásica. El procedimiento incluye la administración a un sujeto que lo necesite de una o más proteínas de fusión del presente documento, en diversos aspectos, al sujeto se le administra una o más proteínas de fusión del presente documento en combinación con otra terapia contra el cáncer. En un aspecto, la terapia contra el cáncer incluye una molécula quimioterapéutica, un anticuerpo, un inhibidor de quinasa de molécula pequeña, un agente hormonal o un agente citotóxico. La terapia contra el cáncer también puede incluir radiación ionizante, radiación ultravioleta, crioablación, ablación térmica o ablación por radiofrecuencia.

Las proteínas de fusión de anticuerpo-péptido terapéuticamente activas de la invención son un anticuerpo dirigido fusionado a uno o más restos inmunomoduladores que contrarrestan la tolerancia inmune de una célula cancerosa. En un aspecto, el resto inmunomodulador puede estar unido por un espaciador de aminoácidos de longitud suficiente para permitir la unión biespecífica de la molécula. El resto inmunomodulador puede estar unido al extremo N o al extremo C de la cadena pesada o al extremo N o al extremo C de la cadena ligera del anticuerpo.

El procedimiento de la presente divulgación proporciona secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas de fusión de anticuerpo-péptido terapéuticamente activas y dicha expresión se puede llevar a cabo en una línea celular transitoria o una línea celular estable. La expresión transitoria se realiza mediante la transfección o transformación de la célula huésped con vectores que portan las proteínas de fusión codificadas a células huésped de mamíferos. Una vez expresados los péptidos de fusión, se someten preferiblemente a purificación y a pruebas in vitro para comprobar su biespecificidad, es decir, comprobar que tienen la capacidad de unirse tanto al resto diana como al resto inmunomodulador. Dichas pruebas pueden incluir pruebas in vitro tales como ELISA o ensayos de unión a células NK/T para validar la unión de dianas bifuncionales o la estimulación de células inmunitarias.

En particular, una vez que los péptidos de fusión específicos divulgados demuestran la biespecificidad deseada, las secuencias de polinucleótidos que codifican dichos péptidos de fusión se seleccionan para subclonarse en una línea celular estable para su expresión y purificación a mayor escala. Tales líneas celulares estables se describen previamente, tales como una línea celular de mamífero, que incluye, pero no se limita a, HEK293, CHO o NSO. En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un procedimiento para inhibir y/o reducir la unión de PDL1 a PD1, aumentando así la respuesta inmune contra las células tumorales, comprendiendo el procedimiento:

a. proporcionar un polipéptido quimérico que comprende PD1 y un anticuerpo anti-EGFR1 o anti-CTLA-4; y b. poner en contacto una célula tumoral con el polipéptido quimérico en el que el polipéptido quimérico se une con al menos PDL1 de la célula tumoral.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar proteínas de fusión de anticuerpo-péptido terapéuticamente activas, en el que la proteína de fusión comprende un resto dirigido al tumor y al menos una molécula inmunomoduladora que contrarresta la tolerancia inmune de una célula cancerosa, en el que el resto dirigido al tumor es un anticuerpo que se une a EGFR1 o CTLA-4 y en el que la proteína de fusión se prepara mediante las siguientes etapas:

a. preparar una secuencia de nucleótidos optimizada en codones que codifica la proteína de fusión para su expresión en células CHO, en la que la secuencia de nucleótidos optimizada en codones se modifica para aumentar las secuencias CG, y en la que la secuencia de nucleótido optimizada en codones es SEQ ID NO: 1 o 5 para la cadena pesada del anticuerpo, SEQ ID NO: 2 o 6 para la cadena ligera del anticuerpo, SEQ ID NO: 3 o 7 para la molécula inmunomoduladora, en la que la secuencia de nucleótidos optimizada en codones SEQ ID NO: 1 o 5 para la cadena pesada del anticuerpo que se une a EGFR1 o CTLA-4, respectivamente, carece de nucleótidos para la expresión de una lisina en el extremo C-terminal de las cadenas pesadas del anticuerpo; b. clonar la secuencia optimizada de dicha proteína de fusión en las células CHO capaces de expresión transitoria o estable;

c. cultivar las células CHO en un medio en condiciones adecuadas para el cultivo y permitir que la célula huésped exprese la proteína de fusión; y

d. recoger proteínas de fusión secretadas.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión quimérica de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la proteína de fusión quimérica comprende al menos un resto de direccionamiento que tiene afinidad por una célula cancerosa y al menos un resto inmunomodulador que contrarresta la tolerancia inmune de la célula cancerosa, en la que el resto un resto de direccionamiento es un anticuerpo y la secuencia de ácido nucleico del resto un resto de direccionamiento carece de nucleótidos para la expresión de una lisina en el extremo C-terminal de las cadenas pesadas del anticuerpo. La secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena pesada del anticuerpo incluye preferiblemente SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 5. La secuencia de ácido nucleico que codifica las proteínas de fusión quiméricas comprende preferiblemente una secuencia seleccionada del grupo que consiste SEQ ID NO: 1, 2, 4 y 7; SEQ ID NO: 1, 2, 3 y 4; y SEQ ID NO: 5, 6, 3 y 4.

En otro aspecto adicional, la presente divulgación proporciona un procedimiento para el tratamiento del cáncer en un sujeto, comprendiendo el procedimiento:

a) preparar una proteína de fusión terapéuticamente activa, en la que la proteína de fusión comprende un resto dirigido al tumor y al menos una molécula inmunomoduladora, en el que el resto dirigido al tumor es un anticuerpo que se une a EGFR1 o CTLA-4 y en el que la proteína de fusión se prepara por las siguientes etapas: preparar una secuencia de nucleótidos optimizada en codones que codifica la proteína de fusión, en la que la secuencia de nucleótidos optimizada en codones para el anticuerpo carece de nucleótidos para la expresión de una lisina en el extremo C-terminal de las cadenas pesadas del anticuerpo;

a) ii) clonar la secuencia optimizada de dicha proteína de fusión en una célula huésped capaz de expresión transitoria o continua;

b) iii) hacer crecer la célula huésped en un medio en condiciones adecuadas para el crecimiento y permitir que la célula huésped exprese la proteína de fusión; y

c) iv) recoger proteínas de fusión secretadas;

b. b) administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente activa de las proteínas de fusión secretadas.

La proteína de fusión se selecciona del grupo de secuencias de aminoácidos que consiste en las SEQ ID NO: 15 y 9; SEQ ID NO: 8 y 16; SEQ ID NO: 17 y 9; SEQ ID NO: 8 y 18; SEQ ID NO: 27 y 9; SEQ ID NO: 8 y 28; SEQ ID NO: 29 y 9; SEQ ID NO: 8 y 30; SEQ ID NO: 31 y 28; SEQ ID NO: 31 y 30; SEQ ID NO: 29 y 28; SEQ ID NO: 29 y 30; SEQ ID NO: 32 y 14; SEQ ID NO: 13 y 33; SEQ ID NO: 34 y 14; SEQ ID NO: 13 y 35; SEQ ID NO: 32 y 33; SEQ ID NO: 32 y 35; SEQ ID NO: 34 y 33 y SEQ ID NO: 34 y 35.

En otro aspecto, se divulga un procedimiento para el tratamiento de una enfermedad neoplásica, comprendiendo el procedimiento la administración a un sujeto que lo necesite de una o más proteínas de fusión codificadas por al menos una secuencia de polinucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 2, 4 y 7; s Eq ID NO: 1, 2, 3 y 4 y SEQ ID NO: 5, 6, 7 y 4. En particular, al usar las secuencias de polinucleótidos definidas anteriormente, se puede expresar la siguiente combinación de proteínas de fusión, incluido el enlazador anti-EGFR1 PD1 (SEQ ID NO: 8, 9, 10 y 11); anti-EGFR1-enlazador-TGFpRII (SEQ ID NO: 8, 9, 10 y 12); y Anti-CTLA-4-enlazador-PD1 (SEQ ID NO: 13, 14, 10 y 11).

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, dibujos y reivindicaciones,

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra las diferentes posibilidades de colocación de la lisina en una cadena pesada y la necesidad de proporcionar purificación que causa dicha heterogeneidad.

La Figura 2 muestra las secuencias de nucleótidos optimizadas en codones utilizadas para la expresión de las proteínas de fusión anticuerpo-péptido de la presente invención, incluida la cadena pesada Anti-EGFR1 (SEQ ID NO: 1); cadena ligera anti-EGFR1 (SEQ ID NO: 2); PD1 (SEQ ID NO: 7); enlazador (SEQ ID NO: 4); cadena pesada anti-CTLA-4 (SEQ ID NO: 5); cadena ligera anti-CTLA-4 (SEQ ID NO: 6) y TGFpRII (SEQ ID NO: 3).' La Figura 3 muestra los residuos de aminoácidos para el constructo de PD1 de enlazador anti-EGFRI (SEQ ID NO: 8, 9, 10 y 11).

La Figura 4 muestra los residuos de aminoácidos para el constructo anti-EGFR1-enlazador-TGFpRII (SEQ ID NO: 8, 9, 10 y 12).

La Figura 5 muestra los residuos de aminoácidos para el anti-CTLA-4-enlazador-PD1 (SEQ ID NO: 13, 14, 10 y 11).

La Figura 6 muestra las diferentes posibilidades de colocación de la molécula PD1 en el anticuerpo anti-EGFR1 para FMab5, FMab6, FMab7 y FMab8.

La Figura 7 muestra las secuencias de aminoácidos para Anti-EGFR1 HC-PD1 Anti-EGFR1 LC en las que la molécula PD1 está conectada al extremo C de la cadena pesada separada por un enlazador e incluyendo SEQ ID NO: 15 y 9.

La Figura 8 muestra las secuencias de aminoácidos para Anti-EGFR1 HC Anti-EGFR1 LC-PD1 en donde la molécula PD1 está conectada al extremo C de la cadena ligera separada por un enlazador e incluyendo SEQ ID NO: 8 y 16.

La Figura 9 muestra las secuencias de aminoácidos para Anti-EGFR1 HC Anti-EGFR1 LC -PD1 en las que la molécula PD1 está conectada al extremo N de la cadena pesada separada por un enlazador e incluyendo SEQ ID NO: 17 y 9.

La Figura 10 muestra las secuencias de aminoácidos para Anti-EGFR1 HC PD1-Anti-EGFR1 LC en las que la molécula PD1 está conectada al extremo N de la cadena ligera separada por un enlazador e incluyendo SEQ ID NO: 8 y 18.

La Figura 11 muestra los constructos de expresión desarrolladas utilizando los ADNc como se establece en SEQ ID NO: 1,2 y 7.

La Figura 12 muestra las diferentes posibilidades de colocación de la molécula TGFpRII en el anticuerpo anti-EGFR1, FMab1, FMab2, FMab3, FMab4, FMab9, FMab10, FMab11 y FMab12.

La Figura 13 muestra las secuencias de aminoácidos para Anti-EGFR1 HC-TGFpRII Anti-EGFR1 LC en las que la molécula de TGFpRII está conectada al extremo C de la cadena pesada separada por un enlazador e incluyendo SEQ ID NO: 27 y 9.

La Figura 14 muestra las secuencias de aminoácidos para Anti-EGFR1 HC Anti-EGFR1 LC -TGFpRII en las que la molécula de TGFpRII está conectada al extremo C de la cadena ligera separada por un enlazador e incluyendo SEQ ID NO: 8 y 28.

La Figura 15 muestra las secuencias de aminoácidos para TGFpRII-Anti-EGFR1 HC Anti-EGFR1 LC en las que la molécula de TGFpRII está conectada al extremo N de la cadena pesada separada por un enlazador e incluyendo SEQ ID NO: 29 y 9.

La Figura 16 muestra las secuencias de aminoácidos para Anti-EGFR1 HC TGFpRII-Anti-EGFR1 LC en las que la molécula de TGFpRII está conectada al extremo N de la cadena ligera separada por un enlazador e incluyendo SEQ ID NO: 8 y 30.

La Figura 17 muestra las secuencias de aminoácidos para Anti-EGFR1 HC-TGFpRII Anti-EGFR1 LC -TGFpRII en las que la molécula de TGFpRII está conectada al extremo C de la cadena pesada y ligera separada por un enlazador e incluyendo SEQ ID NO: 31 y 28.

La Figura 18 muestra las secuencias de aminoácidos para Anti-EGFR1 HC-TGFpRII TGFpRII-Anti-EGFR1 LC en las que la molécula de TGFpRII está conectada al extremo C de la cadena pesada y al extremo N de la cadena ligera separada por un enlazador e incluyendo SEQ ID NO: 31 y 30.

La Figura 19 muestra las secuencias de aminoácidos para TGFpRII-Anti-EGFR1 HC Anti-EGFRI LC -TGFpRII en las que la molécula de TGFpRN está conectada al extremo N de la cadena pesada y al extremo C de la cadena ligera separada por un enlazador e incluyendo SEQ ID NO: 29 y 28.

La Figura 20 muestra las secuencias de aminoácidos para TGFpRII-Anti-EGFR1 HC TGFpRII-Anti-EGFR1 LC en las que la molécula de TGFpRIl está conectada al extremo N de la cadena pesada y al extremo N de la cadena ligera separada por un enlazador e incluyendo SEQ ID NO: 29 y 30.

La Figura 21 muestra constructos de expresión desarrolladas utilizando los ADNc como se establece en SEQ ID NO: 1, 2 y 3.

La Figura 22 muestra las muestras purificadas con ProteinA analizadas en SDS-PAGE reductora al 12 %.

La Figura 23 muestra muestras purificadas con ProteinA analizadas en SDS-PAGE no reductora al 6 %.

La Figura 24 muestra las diferentes posibilidades de colocación de la molécula PD1 en el anticuerpo anti-CTLA4. La Figura 25 muestra las secuencias de aminoácidos para Anti-CTLA4 HC-PD1 Anti-CTLA4 LC en las que la molécula PD1 está conectada al extremo C de la cadena pesada separada por un enlazador e incluyendo SEQ ID NO: 32 y 14.

La Figura 26 muestra las secuencias de aminoácidos para Anti-CTLA4 HC Anti-CTLA4 LC-PD1 en las que la molécula PD1 está conectada al extremo C de la cadena ligera separada por un enlazador e incluyendo ^s E^q ID NO: 13 y 33.

La Figura 27 muestra las secuencias de aminoácidos para PD1-Anti-CTLA4 HC Anti-CTLA4 LC en las que la molécula PD1 está conectada al extremo N de la cadena pesada separada por un enlazador e incluyendo SEQ ID NO: 34 y 14.

La Figura 28 muestra las secuencias de aminoácidos para Anti-CTLA4 HC PD1-Anti-CTLA4 LC en las que la molécula PD1 está conectada al extremo N de la cadena ligera separada por un enlazador e incluyendo ^s E^q ID NO: 13 y 35.

La Figura 29 muestra las secuencias de aminoácidos para Anti-CTLA4 HC-PD1 Anti-CTLA4 LC-PD1 en las que la molécula PD1 está conectada al extremo C de la cadena pesada y la cadena ligera separadas por un enlazador e incluyendo SEQ ID NO: 32 y 33.

La Figura 30 muestra las secuencias de aminoácidos para Anti-CTLA4 HC-PD1 PD1-Anti-CTLA4 LC en las que la molécula PD1 está conectada al extremo C de la cadena pesada separada por un enlazador y al extremo N de la cadena ligera, incluyendo SEQ ID NO: 32 y 35.

La Figura 31 muestra las secuencias de aminoácidos para PD1-Anti-CTLA4 HC Anti-CTLA4 LC-PD1 en las que la molécula PD1 está conectada al extremo N de la cadena pesada separada por un enlazador y al extremo C de la cadena ligera, incluyendo SEQ ID NO: 34 y 33.

La Figura 32 muestra las secuencias de aminoácidos para PD1-Anti-CTLA4 HC PD1-Anti-CTLA4 LC en las que la molécula PD1 está conectada al extremo N de la cadena pesada separada por un enlazador y al extremo N de la cadena ligera, incluyendo SEQ ID NO: 34 y 35.

La Figura 33 muestra las constructos de expresión desarrolladas utilizando los ADNc como se establece en SEQ ID NO: 7, 5 y 6.

La Figura 34 muestra el ELISA de unión a diana de EGFR1. Mab de fusión anti-EGFR1 HC-TGFpRII LC anti-EGFR1 se une a su diana EGFR1 inmovilizada.

La Figura 35 muestra el ELISA de unión a diana de TGFp. Mab de fusión anti-EGFR1 HC-TGFpRII LC anti-EGFR1 se une a su TGFp diana.

La Figura 36 muestra ELISA bifuncional. El Mab de fusión anti-EGFR1 HC-TGFpRII Anti-EGFR1 LC se une a su diana EGFR1 y TGFp al mismo tiempo.

La Figura 37 muestra el análisis citométrico de flujo de la unión del Mab de fusión anti-EGFR1 HC-TGFpRII Anti-EGFR1 LC a células A431 que expresan EGFR1.

La Figura 38 muestra ADCC contra células A-431 que expresan EGFR1. Mab de fusión anti-EGFR1 HC-TGFpRII + Anti-EGFR1 LC media la ADCC contra las células A-431 que expresan EGFR1 y el efecto depende de la dosis. La Figura 39 muestra el ensayo de inhibición de la proliferación. Mab de fusión anti-EGFR1 HC-TGFpRII Anti-EGFR1 LC inhibe la proliferación de células A-431 que expresan EGFR1.

La Figura 40 muestra el ELISA de unión a diana EGFR1. Mab de fusión anti-EGFRI HC Anti-EGFRI LC-TGFpRII se une a su diana EGFR1 inmovilizada.

La Figura 41 muestra el ELISA de unión a diana de TGFp. Mab de fusión anti-EGFRI HC Anti-EGFRI LC -TGFpRIl se une a su diana TGFp.

La Figura 42 muestra ELISA bifuncional. Mab de fusión anti-EGFRI HC Anti-EGFRI LC-TGFpRII se une a su diana EGFR1 y TGFp al mismo tiempo.

La Figura 43 muestra el ensayo de inhibición de la proliferación. Mab de fusión anti-EGFRI HC Anti-EGFRI LC -TGFpRIl inhibe la proliferación de las células A-431 que expresan EGFR1.

La Figura 44 muestra ELISA de unión a diana EGFR1. Mb de fusión TGFpRII-Anti-EGFR1 HC Anti-EGFRI LC se une a su diana inmovilizada EGFR1.

La Figura 45 muestra el ELISA de unión a diana de TGFp. Mab de fusión TGFpRII-anti-EGFR1 HC anti-EGFRI LC se une a su diana TGFp.

La Figura 46 muestra ELISA bifuncional. Mab de fusión TGFpRII-Anti-EGFR1 HC Anti-EGFRI LC se une a su diana EGFR1 y TGFp al mismo tiempo.

La Figura 47 muestra el ensayo de inhibición de la proliferación. Mab de fusión TGFpRII-Anti-EGFR1 HC Anti-EGFRI LC inhibe la proliferación de EGFR1 que expresan las células A-431.

La Figura 48 muestra el ELISA de unión a diana EGFR1. Mab de fusión anti-EGFR1 HC TGFpRII-Anti-EGFR1 LC se une a su diana inmovilizada EGFR1.

La Figura 49 muestra el ELISA de unión a diana de TGFp. Mab de fusión anti-EGFR1 HC TGFpRII-Anti-EGFR1 LC se une a su diana TGFp.

La Figura 50 muestra ELISA bifuncional. Mab de fusión Anti-EGFR1 HC TGFpRII-Anti-EGFR1 LC se une a su diana EGFR1 y TGFp al mismo tiempo.

La Figura 51 muestra el análisis por citometría de flujo de la unión del Mab de fusión Anti-EGFR1 HC TGFpRII-Anti-EGFR1 LC a células A431 que expresan EGFR1.

La Figura 52 muestra el ELISA de unión a diana EGFR1. Mab de fusión anti-EGFR1 HC-TGFpRII TGFpRII-Anti-EGFR1 se une a su diana inmovilizada EGFR1.

La Figura 53 muestra el ELISA de unión a diana de TGFp. Mab de fusión anti-EGFR1 HC-TGFpRII TGFpRII-Anti-EGFR1 se une a su diana TGFp.

La Figura 54 muestra ELISA bifuncional. Mab de fusión Anti-EGFR1 HC-TGFpRII TGFpRII-Anti-EGFR1 LC se une a su diana EGFR1 y TGFp al mismo tiempo.

La Figura 55 muestra el ELISA de unión a diana EGFR1. Mab de fusión TGFpRII-Anti-EGFR1 HC TGFpRII-Anti-EGFR1 LC se une a su diana inmovilizada EGFR1.

La Figura 56 muestra el ELISA de unión a diana de TGFp. Mab de fusión TGFpRII-Anti-EGFR1 HC TGFpRII-Anti-EGFR1 LC se une a su diana TGFp.

La Figura 57 muestra ELISA bifuncional. Mab de fusión TGFpRII-Anti-EGFR1 HC TGFpRII-Anti-EGFR1 LC se une a su diana EGFR1 y TGFp al mismo tiempo.

La Figura 58 muestra ELISA bifuncional. Mab de fusión Anti-CTLA4 HC-PD1 Anti-CTLA4 LC se une a su diana CTLA4 y PDL1 al mismo tiempo.

La Figura 59 muestra ELISA bifuncional. Mab de fusión Anti-CTLA4 HC Anti-CTLA4 LC-PD1 se une a su diana CTLA4 y PDL1 al mismo tiempo.

La Figura 60 muestra ELISA bifuncional. Mab de fusión PD1-Anti-CTLA4 HC Anti-CTLA4 LC se une a su diana CTLA4 y PDL1 al mismo tiempo.

La Figura 61 muestra ELISA bifuncional. Los Mab de fusión Anti-CTLA4 HC-PD1 PD1-Anti-CTLA4 LC-PD1, Anti-CTLA4 HC-PD1 Anti-CTLA4 LC-PD1 y Anti-CTLA4 HC-PD1 PD1-Anti-CTLA4 LC se unen a sus dianas CTLA4 y PDL1 al mismo tiempo.

La Figura 62 muestra ELISA bifuncional. Los Mab de fusión PD1-Anti-CTLA4 HC Anti-CTLA4 LC-PD1 y PD1-Anti-CTLA4 HC PD1-Anti-CTLA4 LC se unen a sus dianas CTLA4 y PDL1 al mismo tiempo.

La Figura 63 muestra ELISA bifuncional. Mab de fusión Anti-EGFR1 HC-PD1 Anti-EGFR1 LC se une a su diana EGFR y PDL1 al mismo tiempo.

La Figura 64 muestra ELISA bifuncional. Mab de fusión Anti-EGFR1 HC Anti-EGFR1 LC-PD1 se une a su diana EGFR y PDL1 al mismo tiempo.

Descripción detallada de la invención

Con el fin de facilitar la revisión de las diversas realizaciones de la invención y proporcionar una comprensión de los diversos elementos y constituyentes utilizados en la fabricación y el uso de la presente invención, los siguientes términos usados en la descripción tienen los siguientes significados.

Tal como se usa en el presente documento, los términos “polipéptido”, “proteína” y “péptido” se usan indistintamente para denotar una secuencia de polímero de al menos dos aminoácidos unidos covalentemente por un enlace amida, independientemente de la longitud o la modificación postraduccional (por ejemplo, glicosilación, fosforilación, lipidación, miristilación, ubiquitinación, etc.). También se incluyen los aminoácidos D y L, y las mezclas de los aminoácidos D y L.

El término polipéptido quimérico se refiere a una secuencia de aminoácidos que tiene dos o más partes que generalmente no se encuentran juntas en una secuencia de aminoácidos en la naturaleza.

El término “espaciador/enlazador”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula que conecta dos unidades de proteínas monoméricas para formar una molécula quimérica y todavía permite la unión de las partes a los receptores deseados. Los ejemplos particulares de espaciadores/enlazadores pueden incluir un espaciador de aminoácidos, en el que la secuencia de aminoácidos puede ser esencialmente de cualquier longitud, por ejemplo, tan poco como 5 o tanto como 200 o más preferiblemente de aproximadamente 5 a 30 residuos de aminoácidos.

El término “terapéutico”, tal como se usa en el presente documento, significa un tratamiento administrado a un sujeto que muestra signos de patología con el propósito de disminuir o eliminar esos signos.

El término “cantidad terapéuticamente eficaz”, tal como se usa en el presente documento, significa una cantidad de la proteína quimérica que es suficiente para proporcionar un efecto beneficioso para el sujeto al que se administra la proteína quimérica.

Otro ejemplo de una modificación es la adición de un dominio heterólogo que imparte una funcionalidad distinta sobre el polipéptido quimérico. Un dominio heterólogo puede ser cualquier molécula pequeña inorgánica u orgánica o macromolécula, siempre que imparta una función adicional. Ejemplos particulares de dominios heterólogos que imparten una función distinta incluyen una secuencia de aminoácidos que imparte direccionamiento (por ejemplo, ligando receptor, anticuerpo, etc.), función inmunopotenciadora (por ejemplo, inmunoglobulina, un adyuvante), permite la purificación, aislamiento o detección (por ejemplo, myc, etiqueta T7, polihistidina, avidina, biotina, lectinas, etc.).

Tal como se ejemplifica en el presente documento, las secuencias polipeptídicas pueden incluir sustituciones, variaciones o derivatizaciones de la secuencia de aminoácidos de una o ambas secuencias polipeptídicas que comprenden el polipéptido quimérico, siempre que el polipéptido quimérico modificado tenga sustancialmente la misma actividad o función que el polipéptido quimérico no modificado.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “sustancialmente la misma actividad o función”, cuando se usa en referencia a un polipéptido quimérico así modificado, significa que el polipéptido conserva la mayor parte, toda o más de la actividad asociada con el polipéptido no modificado, tal como se describe en el presente documento o se conoce en la técnica.

Los polipéptidos quiméricos modificados que son “activos” o “funcionales” incluidos en el presente documento pueden identificarse mediante un ensayo funcional de rutina. Por ejemplo, al usar ensayos de unión de anticuerpos o ensayos de unión de co-receptores, se puede determinar fácilmente si el polipéptido quimérico modificado tiene actividad. Como los polipéptidos quiméricos modificados conservarán la actividad o función asociada con un polipéptido quimérico no modificado, los polipéptidos quiméricos modificados generalmente tendrán una secuencia de aminoácidos “sustancialmente idéntica” o “sustancialmente homóloga” con la secuencia de aminoácidos del polipéptido no modificado.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “sustancialmente idéntico” o “sustancialmente homólogo”, cuando se usa en referencia a una secuencia polipeptídica, significa que una secuencia del polipéptido es al menos un 50 % idéntica a una secuencia de referencia. Los polipéptidos modificados y polipéptidos sustancialmente idénticos tendrán generalmente al menos un 70 %, alternativamente un 85 %, más probablemente un 90 %, y más probablemente un 95 % de homología con un polipéptido de referencia.

Tal como se expone en el presente documento, los polipéptidos sustancialmente idénticos u homólogos incluyen adiciones, truncamientos, deleciones o inserciones internas, sustituciones conservativas y no conservativas, u otras modificaciones localizadas en posiciones de la secuencia de aminoácidos que no destruyen la función del polipéptido quimérico (según se determina mediante ensayos funcionales, por ejemplo, tal como se describe en el presente documento). Un ejemplo particular de una sustitución es cuando uno o más aminoácidos son reemplazados por otro residuo químicamente o biológicamente similar. Tal como se usa en el presente documento, el término “sustitución conservativa” se refiere a una sustitución de un residuo con un residuo químicamente o biológicamente similar. Ejemplos de sustituciones conservativas incluyen la sustitución de un residuo hidrófobo, como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro, la sustitución de un residuo polar por otro, tal como la sustitución de arginina por lisina, el ácido aspártico por glutámico o la asparagina por glutamina, y similares. Los expertos en la materia reconocerán los numerosos aminoácidos que pueden modificarse o sustituirse con otros residuos químicamente similares sin alterar sustancialmente la actividad.

Los polipéptidos modificados incluyen además “derivados químicos”, en los que uno o más de los aminoácidos que contienen tienen una cadena lateral químicamente alterada o derivatizada. Tales polipéptidos derivatizados incluyen, por ejemplo, aminoácidos en los que los grupos amino libres forman hidrocloruros de amina, grupos p-tolueno sulfonilo, grupos carobenzoxi; los grupos carboxi libres forman sales, metil y etil ésteres; los grupos hidroxilo libres forman derivados O-acilo u O-alquilo, así como derivados de aminoácidos de origen natural, por ejemplo, 4-hidroxiprolina para la prolina, 5-hidroxilisina para la lisina, homoserina para la serina, ornitina para la lisina, etc. También se incluyen D-aminoácidos y derivados de aminoácidos que pueden alterar el enlace covalente, por ejemplo, el enlace disulfuro que se forma entre dos residuos de cisteína que produce un polipéptido ciclado.

Tal como se usa en el presente documento, los términos “aislado” o “sustancialmente puro”, cuando se usan como modificadores de polipéptidos quiméricos, fragmentos de secuencia de los mismos y polinucleótidos, significa que se producen por intervención humana y se separan de su .

entorno celular in vivo nativo. En general, los polipéptidos y polinucleótidos así separados están sustancialmente libres de otras proteínas, ácidos nucleicos, lípidos, carbohidratos u otros materiales con los que están asociados de forma natural.

Los polipéptidos de la presente divulgación pueden prepararse mediante técnicas estándar bien conocidas por los expertos en la materia. Tales técnicas incluyen, pero no se limitan a, aislamiento y purificación de tejidos que se sabe que contienen ese polipéptido, y expresión de ADN clonado que codifica dicho polipéptido utilizando células transformadas. Los polipéptidos quiméricos pueden obtenerse mediante la expresión de un polinucleótido que codifica el polipéptido en una célula huésped, tal como una bacteria, una levadura o una célula de mamífero, y purificando el polipéptido quimérico expresado mediante purificación utilizando procedimientos bioquímicos habituales (por ejemplo, purificación por inmunoafinidad, purificación en gel, detección de expresión, etc.). Otros procedimientos bien conocidos se describen en Deutscher y col., 1990. De manera alternativa, el polipéptido quimérico puede sintetizarse químicamente. La pureza se puede medir mediante cualquier procedimiento apropiado, por ejemplo, electroforesis en gel de poliacrilamida y posterior tinción del gel (por ejemplo, tinción con plata) o mediante análisis por HPLC.

La presente divulgación proporciona, además, secuencias de polinucleótidos que codifican polipéptidos quiméricos, fragmentos de los mismos y secuencias complementarias. Tal como se usa en el presente documento, los términos “ácido nucleico”, “polinucleótido”, “oligonucleótido” y “cebador” se usan indistintamente para referirse al ácido desoxirribonucleico (ADN) o ribonucleico (ARN), ya sea de cadena doble o simple, lineal o circular. El ARN puede ser ARNm, ARNr, ARNt o ARNi antisentido sin empalmes o empalmados. El a Dn puede ser ADN complementario (ADNc), ADN genómico o un antisentido. Se incluyen específicamente análogos y derivados de nucleótidos, tales como aquellos que son resistentes a la degradación de las nucleasas, que pueden funcionar para codificar un polipéptido quimérico de la invención. Los oligonucleótidos y polinucleótidos resistentes a las nucleasas son particularmente útiles para las vacunas de ácido nucleico descritas en el presente documento.

Un polinucleótido “aislado” o “sustancialmente puro” significa que el ácido nucleico no es inmediatamente contiguo a las secuencias codificantes con el extremo 5' o el extremo 3' con los que es inmediatamente contiguo en el genoma natural del organismo del que se deriva. Por lo tanto, el término incluye, por ejemplo, un ADN recombinante (por ejemplo, un ADNc o un fragmento de ADN genómico producido por PCR o el tratamiento de endonucleasa de restricción producido durante la clonación), así como un ADN recombinante incorporado en un vector, un plásmido o virus de replicación autónoma, o un ADN genómico de un procariota o eucariota.

Las secuencias de polinucleótidos de la presente invención se pueden obtener usando técnicas estándar conocidas en la materia (por ejemplo, clonación molecular, síntesis química) y la pureza se puede determinar mediante electroforesis en gel de poliacrilamida o agarosa, análisis de secuenciación y similares. Los polinucleótidos también pueden aislarse utilizando técnicas de hibridación o basadas en ordenador que son bien conocidas en la materia. Tales técnicas incluyen, pero no se limitan a: (1) hibridación de bibliotecas de ADN genómico o ADNc con sondas para detectar secuencias de nucleótidos homólogos; (2) detección de anticuerpos de polipéptidos expresados por secuencias de ADN (por ejemplo, utilizando una biblioteca de expresión); (3) reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de ADN genómico o ADNc usando cebadores capaces de hibridar con una secuencia de ácido nucleico de interés; (4) búsquedas por ordenador de bases de datos de secuencias para secuencias relacionadas; y (5) selección diferencial de una biblioteca de ácidos nucleicos sustraída.

La invención también incluye polinucleótidos sustancialmente homólogos. Tal como se usa en el presente documento, el término “homólogo”, cuando se usa en referencia a una molécula de ácido nucleico, se refiere a la similitud entre dos secuencias de nucleótidos. Cuando una posición de nucleótido en ambas moléculas está ocupada por nucleótidos idénticos, entonces son homólogos en esa posición. Las secuencias de ácido nucleico “sustancialmente homólogas” son al menos un 50 % homólogas, más probablemente al menos un 75 % homólogas y muy probablemente un 90 % o más homólogas. Al igual que con los polipéptidos quiméricos sustancialmente homólogos, los polinucleótidos sustancialmente homólogos de los polinucleótidos que codifican polipéptidos quiméricos, codifican polipéptidos que retienen la mayor parte o la totalidad de la actividad o función asociada con la secuencia con la que es homólogo. Para los polinucleótidos, la duración de la comparación entre secuencias generalmente será de al menos 30 nucleótidos, alternativamente al menos 50 nucleótidos, más probablemente al menos 75 nucleótidos, y muy probablemente 110 nucleótidos o más. Los algoritmos para identificar secuencias homólogas que tienen en cuenta los vacíos/brechas en la secuencia de polinucleótidos y oligonucleótidos no coincidentes son conocidos en la técnica, como BLAST (véase Altschul, 1990).

Los polinucleótidos de la presente invención pueden, si se desea: estar desnudos o estar en un portador adecuado para pasar a través de una membrana celular (por ejemplo, complejo de polinucleótido-liposoma o un sistema de dispersión coloidal), contenido en un vector (por ejemplo, vector de retrovirus, vectores adenovirales, y similares), unidos a perlas inertes u otros dominios heterólogos (por ejemplo, anticuerpos, ligandos, biotina, estreptavidina, lectinas y similares), u otras composiciones apropiadas divulgadas en el presente documento o conocidas en la técnica. Por lo tanto, se pueden lograr, y se contemplan, medios virales y no virales de administración de polinucleótidos. Los polinucleótidos de la presente invención también pueden contener secuencias de ácido nucleico adicionales unidas a los mismos que codifican un polipéptido que tiene una funcionalidad distinta, tal como los diversos dominios heterólogos expuestos en el presente documento.

Los polinucleótidos de la presente invención también pueden modificarse, por ejemplo, para ser resistentes a las nucleasas y mejorar su estabilidad en una formulación farmacéutica. Los polinucleótidos descritos son útiles para codificar polipéptidos quiméricos de la presente invención, especialmente cuando dichos polinucleótidos se incorporan a sistemas de expresión descritos en el presente documento o conocidos en la técnica. Por consiguiente, también se incluyen polinucleótidos que incluyen un vector de expresión.

Para la propagación o expresión en células, los polinucleótidos descritos en el presente documento pueden insertarse en un vector. El término “vector” se refiere a un plásmido, virus u otro vehículo conocido en la técnica que puede manipularse mediante la inserción o incorporación de un ácido nucleico. Dichos vectores pueden usarse para manipulación genética (es decir, “vectores de clonación”) o pueden usarse para transcribir o traducir el polinucleótido insertado (es decir, “vectores de expresión”). Un vector generalmente contiene al menos un origen de replicación para la propagación en una célula y un promotor. Se incluyen elementos de control, incluidos los promotores presentes en un vector de expresión, para facilitar la transcripción y la traducción adecuadas (por ejemplo, la señal de empalme para los intrones, el mantenimiento del marco de lectura correcto del gen para permitir la traducción en el marco del ARNm y los codones de parada). La expresión in vivo o in vitro de los polinucleótidos descritos en el presente documento puede ser conferida por un promotor unido operativamente al ácido nucleico.

“Promotor” se refiere a una secuencia mínima de ácido nucleico suficiente para dirigir la transcripción del ácido nucleico al que el promotor está unido operativamente (véase Bitter 1987). Los promotores pueden realizar la transcripción de forma constitutiva directa, pueden ser específicos de tejido o pueden realizar transcripción inducible o reprimible; dichos elementos generalmente se ubican en las regiones 5' o 3' del gen así regulado.

Tal como se usa en el presente documento, el término “unido operativamente” significa que un polinucleótido seleccionado (por ejemplo, codificando un polipéptido quimérico) y una secuencia o varias secuencias reguladoras se conectan de tal manera que permiten la transcripción cuando las moléculas apropiadas (por ejemplo, las proteínas activadoras de la transcripción) están unidas a la(s) secuencia(s) reguladora(s). Normalmente, un promotor está ubicado en el extremo 5' del polinucleótido y puede estar muy cerca del sitio de inicio de la transcripción para permitir que el promotor regule la expresión del polinucleótido.

Cuando se clona en sistemas bacterianos, se pueden usar promotores constitutivos, como T7 y similares, así como promotores inducibles, tales como pL de bacteriófago gamma, plac, ptrp, ptac. Cuando se clona en sistemas de células de mamíferos, se pueden usar promotores constitutivos, como SV40, RSV y similares, o promotores inducibles derivados del genoma de células de mamíferos (por ejemplo, el promotor de metalotioneína) o de virus de mamíferos (por ejemplo, la repetición terminal prolongada del virus del tumor mamario del ratón, el promotor tardío del adenovirus). También se pueden usar promotores producidos por ADN recombinante o técnicas sintéticas para proporcionar la transcripción de las secuencias de ácido nucleico de la invención.

Pueden diseñarse sistemas de expresión de mamíferos que utilizan virus elementos virales recombinantes para dirigir la expresión. Por ejemplo, cuando se usan vectores de expresión de adenovirus, la secuencia de ácido nucleico puede ligarse a un complejo de control de transcripción/traducción de adenovirus, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Alternativamente, se puede usar el promotor 7.5K del virus Vaccinia (véase Mackett 1982; Mackett 1984; Panicali 1982).

Para la expresión de levadura, se pueden usar varios vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles (véase Ausubel 1988; Grant 1987; Glover 1986; Bitter 1987; y Strathem 1982). Los polinucleótidos pueden insertarse en un vector de expresión para la expresión in vitro (por ejemplo, utilizando kits de transcripción/traducción in vitro, que están disponibles comercialmente), o pueden insertarse en un vector de expresión que contiene una secuencia promotora que facilita la expresión en procariotas o eucariotas mediante la transferencia de un ácido nucleico apropiado a una célula, órgano, tejido u organismo adecuado in vivo.

Tal como se usa en el presente documento, un “transgén” es cualquier pieza de un polinucleótido insertada por artificio en una célula huésped, y se convierte en parte del organismo que se desarrolla a partir de esa célula. Un transgén puede incluir uno o más promotores y cualquier otro ADN, como los intrones, necesarios para la expresión del ADN seleccionado, todos ellos operativamente unidos al ADN seleccionado, y puede incluir una secuencia potenciadora. Un transgén puede incluir un polinucleótido que es parcial o totalmente heterólogo (es decir, extraño) al organismo transgénico, o puede representar un gen homólogo de un gen endógeno del organismo. Los transgenes pueden integrarse en el genoma de la célula huésped o mantenerse como un plásmido autorreplicante. Tal como se usa en el presente documento, una “célula huésped” es una célula en la que se introduce un polinucleótido que puede propagarse, transcribirse o codificarse como polipéptido expresado. El término también incluye cualquier progenie de la célula huésped del sujeto. Se entiende que toda la progenie puede no ser idéntica a la célula parental, ya que puede haber mutaciones que ocurren durante la replicación. Las células huésped incluyen, pero no se limitan a, células de bacterias, levaduras, insectos y mamíferos. Por ejemplo, bacterias transformadas con polinucleótidos de bacteriófagos recombinantes, ácido nucleico plasmídico o vectores de expresión de ácido nucleico cósmido; levaduras transformadas con vectores de expresión de levaduras recombinantes; sistemas de células vegetales infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV), o transformados con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, plásmidos Ti), sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus), o sistemas celulares animales infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, retrovirus, adenovirus, virus vaccinia) o sistemas celulares de animales transformados diseñados para una expresión estable.

Tal como se usa en el presente documento, el término “transformación” significa un cambio genético en una célula después de la incorporación de un polinucleótido (por ejemplo, un transgén) exógeno a la célula. Por lo tanto, una “célula transformada” es una célula en la cual, o una progenie de la cual, un polinucleótido se ha introducido mediante técnicas recombinantes. La transformación de una célula huésped se puede llevar a cabo mediante técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia. Cuando la célula huésped es un eucariota, los procedimientos de transformación del ADN incluyen, por ejemplo, fosfato de calcio, microinyección, electroporación, liposomas y vectores virales. Las células eucariotas también pueden cotransformarse con las secuencias de polinucleótidos de la invención o fragmentos de las mismas, y una segunda molécula de ADN que codifica un marcador seleccionable, como se describe en el presente documento o se conoce de otro modo en la técnica. Otro procedimiento consiste en usar un vector viral eucariótico, como el virus de simio 40 (SV40) o el virus del papiloma bovino, para infectar o transformar transitoriamente las células eucariotas y expresar la proteína (véase Gluzman 1982). Cuando el huésped es procariótico (por ejemplo, E. coli), las células competentes que son capaces de absorber ADN pueden prepararse a partir de células recogidas después de la fase de crecimiento exponencial y, posteriormente, tratarse mediante el método de CaCl2 usando procedimientos bien conocidos en la técnica. La transformación de procariotas también se puede realizar por fusión de protoplastos de la célula huésped.

Los polipéptidos quiméricos, polinucleótidos y vectores de expresión que contienen los mismos de la presente invención pueden encapsularse dentro de liposomas usando técnicas estándar e introducirse en células u organismos completos. Los liposomas catiónicos son preferidos para la administración de polinucleótidos. El uso de liposomas para introducir diversas composiciones in vitro o in vivo, incluyendo proteínas y polinucleótidos, es conocido por los expertos en la materia.

Los liposomas pueden dirigirse a un tipo celular o tejido de interés mediante la adición a la preparación de liposomas de un ligando, tal como un polipéptido, para el cual se ha identificado un receptor celular correspondiente. Los anticuerpos monoclonales también pueden usarse para la selección; muchos de estos anticuerpos específicos para una amplia variedad de proteínas de la superficie celular son conocidos por los expertos en la materia y están disponibles. El ligando seleccionado se conjuga covalentemente con un anclaje lipídico en liposomas preformados o se incorpora durante la preparación de liposomas (véase Lee 1994 y Lee 1995).

Como los polipéptidos o polinucleótidos quiméricos de la presente invención se administrarán a seres humanos, el presente documento también proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden los polipéptidos o polinucleótidos quiméricos descritos. Las composiciones administradas a un sujeto, por lo tanto, estarán en una formulación “farmacéuticamente aceptable” o “fisiológicamente aceptable”.

Tal como se usa en el presente documento, los términos “farmacéuticamente aceptable” y “fisiológicamente aceptable” se refieren a portadores, diluyentes, excipientes y similares que pueden administrarse a un sujeto, preferiblemente sin efectos secundarios adversos excesivos (por ejemplo, náuseas, dolores de cabeza, etc.). Tales preparaciones para la administración incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, que incluyen medios salinos y tampones. Los vehículos incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer con lactato o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen rellenos de líquidos y nutrientes, rellenos de electrolitos (como los basados en la dextrosa de Ringer) y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y similares. Varias formulaciones farmacéuticas apropiadas para la administración a un sujeto y conocidas en la técnica se pueden aplicar en los procedimientos de la presente divulgación (por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990) y The Merck Index, 12a ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ (1996)).

El control de la duración de la acción o el suministro controlado de una composición administrada se puede lograr incorporando la composición en partículas o en una sustancia polimérica, como poliésteres, ácidos de poliamina, hidrogel, polivinilpirrolidona, etileno-acetato de vinilo, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, sulfato de protamina o copolímeros de lactida/glicólido, copolímeros de polilactida/glicólido, o copolímeros de etilenvinilacetato. La velocidad de liberación de la composición puede controlarse alterando la concentración o composición de tales macromoléculas. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos, incluyendo emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas.

Las composiciones administradas mediante un procedimiento del presente documento pueden administrarse por vía parenteral mediante inyección, mediante perfusión gradual a lo largo del tiempo, mediante administración de bolos o mediante un dispositivo implantable microfabricado. La composición se puede administrar por inhalación, por vía intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intracavitaria (por ejemplo, vaginal o anal), por vía transdérmica, tópica o intravascular. Las composiciones pueden administrarse en dosis múltiples. Los expertos en la materia pueden determinar fácilmente una cantidad eficaz.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la materia a la que pertenece la presente invención. Aunque los procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento se pueden usar en la práctica o el ensayo de la presente invención, los procedimientos y materiales adecuados se describen a continuación. Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones. La invención se describe con más detalle en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la(s) invención(es) descrita(s) en las reivindicaciones.

Ejemplos

1. Constructos de proteínas de fusión anti-EGFR1-PD1 para dianas de cáncer

El anti-EGFR (Cetuximab) ha sido aprobado para el cáncer escamoso de cabeza y cuello (local o regionalmente avanzado en combinación con radioterapia y metástasis después de la terapia basada en platino) y EGFR que expresa cáncer colorrectal metastásico (monoterapia en pacientes después del fracaso de oxaliplatino y quimioterapia basada en irinotecán o en pacientes intolerantes a la quimioterapia basada en irinotecán). No aplicable para pacientes con cáncer colorrectal (CCR) que tienen mutaciones K-RAS.

En varios estudios, alrededor del 55-60 % de los pacientes con mCRC responden al cetuximab en la configuración de primera línea, sin embargo, esta respuesta también es transitoria (ventaja de supervivencia libre de progresión (SLP) de 1.5-2 meses) (EPAR). Un número significativo de pacientes no responde al cetuximab o se vuelven resistentes al tratamiento. En el cáncer metastásico recurrente de cabeza y cuello, solo el 35 % de los pacientes responden al cetuximab con quimioterapia con una ventaja de supervivencia global (SG) y (PFS) de solo 2-3 meses.

Claramente, existe una importante necesidad no satisfecha de mejorar la eficacia de la terapia con cetuximab en estas dos indicaciones. Además, el EGFR también se expresa en el cáncer gástrico, el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y los cánceres de páncreas. Sin embargo, el cetuximab no ha demostrado ningún beneficio significativo en estas indicaciones sobre el estándar de atención. Por lo tanto, la presente invención proporciona mejoras al combinar cetuximab con una terapia inmunomoduladora.

La muerte programada-1 (PD-1) es un receptor inhibitorio expresado en células T después de la activación. Se ha demostrado que regula a la baja la actividad de las células T al unir su ligando PD-L1 a las APC. Muchos tumores expresan constitutivamente PD-L1 y su sobreexpresión se ha asociado con inmunidad tumoral deteriorada, enfermedad más agresiva y disminución de la supervivencia (véase Thompson 2004). Hasta la fecha, se ha demostrado que la expresión de PD-L1 se correlaciona con un mal pronóstico en pacientes con carcinoma de células renales (CCR), cáncer de ovario y melanoma. El análisis inmunohistoquímico de muestras de tumores recién aisladas de pacientes con cáncer de ovario, pulmón y mama, carcinoma de células renales, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, carcinoma de esófago, glioblastoma, timoma, carcinoma de colon, páncreas y melanoma reveló que la gran mayoría expresa B7-H1 (véase Flies 2011; Nomi 2007). Varios estudios preclínicos han demostrado un mayor rechazo del tumor al bloquear la interacción PD1-PDL1. Recientemente, las terapias basadas en anti-PD1 y PD-L1 han demostrado una actividad considerable en el melanoma y en algunos otros tumores sólidos que confirman su aplicación como una de las terapias contra el cáncer más prometedoras.

La terapia basada en cetuximab puede mejorarse combinándola con inmunomodulación para eliminar el entorno inmunosupresor o retrasar el desarrollo de resistencia. Además, los pacientes que desarrollan resistencia al cetuximab debido a mutaciones en las vías posteriores pueden seguir beneficiándose de Anti-EGFR1-PD-1 ya que la proteína de fusión de la presente invención se une al receptor EGFR y niega la PD-L1 expresada por los tumores, permitiendo a las células T montar una respuesta antitumoral. Por consiguiente, las proteínas de fusión de la presente invención pueden unirse a EGFR y PD-L1 en la superficie de las células tumorales.

Los constructos de proteínas de fusión anti-EGFR1-PD1 de la presente invención se pueden usar en cáncer colorrectal, cáncer escamoso de cabeza y cuello, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer gástrico y cáncer de páncreas.

Diseño y selección de las moléculas:

Las moléculas de fusión de anticuerpos de la presente invención tienen propiedades terapéuticas duales. Por un lado, la molécula retiene toda la actividad del Anti-EGFR1 (Cetuximab) y, en paralelo, tiene la actividad de unión al receptor PD-L1 en el entorno del tumor. Las nuevas moléculas de las proteínas de fusión Anti-EGFR1-PD1 que se desarrollaron para las terapias contra el cáncer en el presente documento carecen del aminoácido lisina 'K' del extremo C de la cadena pesada por las razones descritas anteriormente. El objetivo principal del diseño de la proteína de fusión es mantener la molécula anti-EGFR1 intacta junto con su función no afectada y permite la fusión de la molécula PD1 con la ubicación diferente en el anticuerpo anti-EGFR1. Es decir, la fusión con el extremo C de HC, el extremo C de LC, el extremo N de HC y/o el extremo N de LC y las fusiones dobles en ambas cadenas como se muestra en la Figura 6.

Se diseñaron los siguientes constructos.

Tabla 1

Expresión de los constructos de fusión anteriores en células CHO:

Las secuencias de nucleótidos optimizadas en codones de los dominios individuales Anti-EGFR1-PD1 se optimizaron para la expresión en células CHO. Tales secuencias optimizadas (SEQ ID NO: 1, 2, 7 y 4) se ensamblaron en un vector de expresión de mamífero con ayuda de los cebadores descritos en la Tabla 2:

Tabla 2

FMAB7FP1 AGA TAT CGC CAC CAT GAT GTC CTT CGT G SEQ ID NO: 19

FMAB7FP2 GGC GGC GGA GGC TCT CAG GTG CAG CTG AAG CAG TC SEQ ID NO: 20 FMAB7RP1 AGT ATA CTC AGC CGG GGG ACA GAG A SEQ ID NO: 21

FMAB7RP2 TTC AGC TGC ACC TGA GAG CCT CCG CCG CCA CTT C SEQ ID NO: 22

FMAB7LCRP ATT AAT TAA TCA ACA CTC GCC CCG GTT GAA GGA CT SEQ ID NO: 23

FMAB6FP2 CTC TGT CCC CCG GCG GCG GCG GAG GAT CTG GCG GA SEQ ID NO: 24

FMAB6RP2 GAT CCT CCG CCG CCG CCG GGG GAC AGA GAC AGG GA SEQ ID NO: 25

FMAB6RP1 AGT ATA CTC ACA CCA GGG TCT GGAAC SEQ ID NO: 26

Usando el conjunto de cebadores de ADNc que se muestra arriba, los constructos se ensamblaron como se muestra en la Figura 11

2. Proteínas de fusión anti-EGFR1-TGFpRII para el tratamiento contra el cáncer

Los niveles altos de TGFp son producidos por muchos tipos de tumores, incluidos los melanomas y los cánceres de mama, colon, esófago, estómago, hígado, pulmón, páncreas y próstata, así como tumores malignos hematológicos (véase Teicher 2001; Dong 2006). Se sabe que el TGFp es inmunosupresor de células T y células NK mediante el bloqueo de la IL-2 y otros mecanismos, incluida la generación de T-regs. Varias líneas de evidencia sugieren que negar la actividad del TGFp puede aumentar los efectos antitumorales de las células T (Wrzesinski 2007). Además, el TGFp puede fomentar el crecimiento tumoral a través de la transición epitelial a mesenquimal y promover la angiogénesis. La expresión de TGFp también se asocia con un mal pronóstico en los pacientes y una recurrencia más temprana. Sin embargo, considerando los efectos pleotrópicos de TGFp en el control de la respuesta inmune, se ha demostrado que el bloqueo generalizado de la actividad de TGFp puede dar como resultado una actividad autoinflamatoria generalizada. Por lo tanto, el agotamiento localizado de TGFp en la vecindad del tumor puede ser una forma alternativa de modular el entorno inmunosupresor. La proteína de fusión anti-EGFR1-TGFpRII de la presente invención se une a EGFR en las células tumorales y une el TGFp alrededor del tumor para mejorar la respuesta inmune contra las células tumorales.

Diseño y selección de las moléculas:

El objetivo es diseñar las moléculas de fusión de anticuerpos que tienen propiedades terapéuticas duales. Por un lado, la molécula debe conservar la actividad completa del Anti-EGFR1 (cetuximab) y en paralelo debe tener la actividad de unión a TGFp en el ambiente del tumor. La secuencia de aminoácidos de la molécula de IgG anti-EGFR1 se mantuvo, excepto que la lisina no se expresó en el extremo C de la cadena pesada. Tanto la fusión simple como la doble y los niveles de expresión se muestran en la Tabla 3, en la que TGFpRII se fusionó con Anti-EGFR1.

Tabla 3

Expresión de los constructos de fusión anteriores en células CHO:

Las secuencias de nucleótidos optimizadas en codones de los dominios individuales Anti-EGFR1-TGFpRII se optimizaron para la expresión en células CHO. Dichas secuencias (SEQ ID NO: 1, 2, 4 y 3) se ensamblaron en un vector de expresión de mamífero. Los constructos de expresión se exponen en la Figura 21.

Transfección de la combinación de vectores anterior para obtener la línea celular deseada:

Los constructos de expresión desarrolladas anteriormente se transfectaron con la siguiente combinación, como se expone en la Tabla 4, en células CHO para producir las siguientes proteínas de fusión usando los constructos definidas en la Figura 21.

Tabla 4

Purificación de los sobrenadantes de Mab de fusión utilizando la columna de proteína A:

Los anticuerpos monoclonales de fusión (Mab) que utilizan proteínas recombinantes producen el sobrenadante del cultivo de células CHO.

Procedimiento:

El procedimiento describe en detalle el procedimiento de purificación a pequeña escala de IgG utilizando una columna C10/10 o XK26 y utilizando una resina de afinidad Mab Select Xtra. Las muestras generadas por este protocolo se pueden utilizar para varios análisis.

Flujo del procedimiento:

El sobrenadante de cultivo secretado a partir de la línea celular recombinante que produce anticuerpos monoclonales o anticuerpos monoclonales de fusión en condiciones estériles se sometió a pruebas de detección de títulos y endotoxinas;

La cromatografía de afinidad que usa resina Mab Select Xtra Protein A se lavó y se equilibró con tampón de unión;

El pH del sobrenadante se ajustó utilizando fosfato 0,5 M al mismo pH que tiene la columna;

Se dejó que el sobrenadante se uniera a la columna/pasara a través de la columna a una velocidad de flujo de 0,5 ml/minuto para lograr la máxima unión;

Todos los Mab de fusión se unen a través de la región Fc y el resto de las impurezas pasaron a través de ella como flujo;

La columna se lavó con tampón de equilibrado;

Los Mab de fusión unidos se eluyeron utilizando 0,1 M de glicina de pH 3,0;

Las proteínas eluidas se ajustaron de nuevo a pH neutro o al pH de la formulación estable;

Las proteínas purificadas se almacenaron a -20 °C o a 2-8 °C dependiendo de la estabilidad.

Análisis de Mab de Fusión purificados de Proteína A usando SDS PAGE:

Los sobrenadantes transfectados obtenidos se purificaron usando una columna de afinidad de proteinA. Posteriormente, se analizaron en SDS-PAGE reductor y no reductor para descubrir la integridad de la molécula, tal como se muestra en la Figura 22, donde en proteinA se analizaron muestras purificadas en SDS-PAGE reductor al 12 %. Como se esperaba, todos los socios de fusión dan el patrón esperado en SDS-PAGE. La fusión de LC y HC se lleva a cabo muy cerca, pero las bandas están separadas. Esta movilidad más alta puede deberse a los 8 sitios de N-glicosilación (T^g BRII 3 * 2 = 6 2 en LC).

La figura 23 muestra los resultados de las muestras purificadas con ProteinA que se analizaron en un 6 % de SDS-PAGE no reductor y aunque la composición de aminoácidos es la misma, existe una diferencia en la movilidad. Puede deberse a los niveles variables del patrón de glicosilación basado en la posición TGFpRII y el acceso en la molécula.

3. Constructos de proteínas de fusión anti-CTLA4-PD1 para dianas de cáncer

El análisis inmunohistoquímico de muestras de tumores recién aisladas de pacientes con cáncer de ovario, pulmón y mama, carcinoma de células renales, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, carcinoma esofágico, glioblastoma, timoma, carcinoma de colon, páncreas y melanoma encontró que la gran mayoría expresa B7-H1 (véase Flies 2011; Nomi 2007). Varios estudios preclínicos han demostrado un aumento del rechazo del tumor al bloquear la interacción PD1-PDL1. Recientemente, las terapias basadas en anti-PD1 y PD-L1 han demostrado una actividad considerable en el melanoma y en otros tumores sólidos que confirman su aplicación como una de las terapias contra el cáncer más prometedoras.

Aunque el anti-CTLA4 puede permitir la coestimulación de las células T, aún pueden ser inhibidas por la interacción PD-L1-PD-1. Esta puede ser una de las razones por las cuales solo una minoría de pacientes responde al anticuerpo anti-CTLA4. El anticuerpo de fusión tanto de anti-CTLA4 como de PD1 es más eficaz que cualquiera de los dos agentes por sí mismo, ya que el anti-CTLA4 permite la coestimulación de las células T, mientras que PD1 se une a la PD-L1 en las células tumorales para anular la inmunosupresión de las células T en el microentorno tumoral. Esto incluso puede ser más seguro que el anti-CTLA4 porque el uso solitario de anti-CTLA4 ha provocado eventos adversos de avance inmune.

Diseño y selección de las moléculas:

El objetivo es diseñar las moléculas de fusión de anticuerpos que tienen propiedades terapéuticas duales. Por un lado, la molécula debe conservar la actividad completa del anti-CTLA4 (Ipilimumab) y, en paralelo, debe tener la actividad de unión al receptor PD L1 en el entorno del tumor. Se utilizó la secuencia de aminoácidos completa de la molécula de IgG anti-CTLA4, excepto por la eliminación de la lisina en el extremo C de la cadena pesada. Se colocó un enlazador de 15 aminoácidos entre el PD1 y el Anti-CTLA4. Las siguientes combinaciones de constructos, como se establece en la Tabla 5, se diseñaron como se muestra en la Figura 24. Los detalles de los constructos de proteínas de fusión anteriores se dan a continuación.

Tabla 5

Expresión de los constructos de fusión anteriores en células CHO:

La secuencia de nucleótidos completa de los dominios individuales Anti-CTLA4-PD1 se optimizó mediante codones para la expresión en células CHO (SEQ ID NO: 7, 4, 5 y 6). Los ADNc fueron sintetizados. Los constructos se ensamblaron en vectores de expresión de mamíferos. La expresión de proteínas de fusión anti-CTLA4-PD1 usando los constructos que se exponen en la Figura 33.

Los constructos de expresión desarrolladas y mostradas en la Figura 33 se transfectaron en la siguiente combinación en células CHO (Tabla 6) para producir las siguientes proteínas de fusión. El título obtenido para cada constructo se menciona en la última columna.

Tabla 6

Purificación y caracterización de proteínas de fusión:

El procedimiento describe el uso del procedimiento de purificación a pequeña escala de IgG utilizando la columna C10/10 o XK26 y utilizando la resina de afinidad Mab Select Xtra. Las muestras generadas por este protocolo se pueden utilizar para varios análisis.

Flujo del procedimiento:

El sobrenadante de cultivo secretado a partir de la línea celular recombinante que produce anticuerpos monoclonales o anticuerpos monoclonales de fusión en condiciones estériles se probó para determinar el título y las endotoxinas;

La cromatografía de afinidad utilizando resina Mab Select Xtra ProteinA se lavó y se equilibró con un tampón de unión;

El pH del sobrenadante se ajustó utilizando fosfato 0,5 M al mismo pH que tiene la columna;

Se dejó que el sobrenadante se uniera a la columna/pasara a través de la columna a una velocidad de flujo de 0,5 ml/minuto para lograr la unión máxima;

Todos los Mab de fusión se unen a través de la región Fc y el resto de las impurezas pasaron a través del flujo; La columna se lavó con tampón de equilibrado;

Los Mab de fusión unidos se eluyeron utilizando glicina 0,1 M, pH 3,0;

Las proteínas eluidas se ajustaron de nuevo a pH neutro o al pH de la formulación estable; y

Las proteínas purificadas se almacenan a -20 °C o a 2-8 °C dependiendo de la estabilidad.

4. Anti-EGFR1 HC-TGFpRII Anti-EGFR1 LC (Fmab 1)

Procedimiento-ELISA de unión:

El Mab de fusión se probó para determinar su capacidad para unirse a sus dianas en tres ELISA diferentes: 1) ELISA de unión a diana EGFR1, 2) ELISA de unión a diana TGFp y 3) ELISA bifuncional.

Para los ELISA de unión a diana, las dianas (quimera rhEGFR-Fc o TGFp) se recubrieron en placas NUNC maxisorb durante la noche a 4 °C. Las placas se lavaron y luego se bloquearon con superbloque a temperatura ambiente durante 2 horas. Se añadieron diferentes diluciones del Mab de fusión o del anticuerpo de control negativo a la placa. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. La unión del Mab de fusión se detectó mediante la adición de un anticuerpo secundario anti-IgG F(ab)² biotinilado, seguido de una incubación de 1 hora con estreptavidina conjugada con peroxidasa a temperatura ambiente. Se añadió solución de sustrato TMB y la reacción se detuvo con H²SO⁴1N. La absorbancia se midió a 450 nm en un lector BioTek Synergy H4 Hybrid.

Para el ELISA bifuncional, la quimera rhEGFR-Fc se recubrió sobre placas NUNC maxisorb durante la noche a 4 °C. Las placas se lavaron y luego se bloquearon con superbloque a temperatura ambiente durante 2 horas. Se añadieron diferentes diluciones del Mab de fusión o del anticuerpo de control negativo a la placa. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. Después del lavado, se añadió TGFp y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. La placa se lavó y se añadió anti-TGFp-biotina y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. La placa se lavó y se añadió estreptavidina-HRP y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. Después del lavado, se añadió solución de sustrato TMB y la reacción se detuvo con H²SO⁴ 1N. La absorbancia se midió a 450 nm en un lector BioTek Synergy H4 Hybrid.

Resultados:

La unión del Mab de fusión anti-EGFR1 HC-TGFpRII Anti-EGFR1 LC a ambas dianas EGFR1 (Figura 34) y TGFp (Figura 35) fue comparable con anti-EGFR1-TGFpRII. El Mab de fusión anti-EGFR1 HC-TGFpRII LC anti-EGFR1 también se probó en un ELISA bifuncional para determinar si los dominios anti-EGFR1 y TGFpRII del Mab se pueden unir a sus respectivas dianas sin interferir entre sí. Como se ve en la Figura 36, el Mab de fusión anti-EGFR1 HC-TGFpRII LC anti-EGFR1 se une a sus dos dianas, lo que sugiere que no hay interferencia en la unión de ninguna de las dianas a la constructo del Mab de fusión.

Unión a células que expresan EGFR1:

Procedimiento:

Las células A-431 se cultivaron en matraces hasta que alcanzaron una confluencia del 70-80 %. Las células se tripsinizaron y se recogieron. Las células se tiñeron con diferentes diluciones del Mab de fusión anti-EGFR1 HC-TGFpRII Anti-EGFR1 LC o Ig control a 2 - 8 °C durante 30 minutos. Las células se lavaron y se incubaron con conjugado anti-IgG humana - FITC a 2 - 8 °C durante 30 minutos. Después del lavado, las células se analizaron en un citómetro de flujo. Las células vivas se activaron en función de sus perfiles FSC frente a SSC. Se registró el total de IMF para la población cerrada.

Resultados:

La fusión de anti-EGFR1 HC-TGFpRII Anti-EGFR1 LC se une a las células A-431 que expresan EGFR de una manera dependiente de la dosis (Figura 37). La unión de anti-EGFR1 HC-TGFpRII Anti-EGFR1 LC es comparable a la unión de anti-EGFR1-TGFpRII.

Actividad de citotoxicidad dependiente de anticuerpos

Procedimiento:

Las células A-431 se cultivaron en matraces hasta que alcanzaron una confluencia del 70-80 %. Las células se tripsinizaron, se recogieron y se colocaron en placas de 96 pocillos. Las células se marcaron con diferentes diluciones del Mab de fusión anti-EGFR1 HC-TGFpRII Anti-EGFR1 LC o Ig control a 2 - 8 °C durante 30 minutos. Las células marcadas se incubaron conjuntamente con PBMC humanas recién aisladas a 37 °C, 5 % de CO² durante 24 horas. La citotoxicidad se midió utilizando los kits de ensayo de citotoxicidad Cyto-Tox-Glo.

Resultados:

La fusión anti-EGFRI HC-TGFpRII Anti-EGFRI LC media la ADCC de células A-431 que expresan EGFR por células efectoras de PBMC humanas. La ADCC es dependiente de la dosis (Figura 38). Estos resultados sugieren que la porción Fc del Mab de fusión está intacta y funcional.

Inhibición de la proliferación

Procedimiento:

Las células A-431 se cultivaron en matraces hasta que alcanzaron una confluencia del 70-80 %. Las células se tripsinizaron, se recogieron y se colocaron en placas de 96 pocillos. Se añadieron a las células diferentes diluciones del Mab de fusión anti-EGFRl HC-TGFpRII Anti-EGFRI Le o Ig control. Las placas se incubaron a 37 °C, 5 % de CO² durante tres días. En el tercer día, la proliferación celular se midió mediante el método AlamarBlue.

Resultados:

Se sabe que los anticuerpos anti-EGFR tales como Cetuximab inhiben la proliferación de células que expresan EGFR1. Como se ve en la Figura 39, la porción anti-EGFR del Mab de fusión anti-EGFRI HC-TGFpRII Anti-EGFRI LC está intacta y tiene actividad antiproliferativa.

5. Anti-EGFR1 HC Anti-EGFR1 LC -TGFPRII (Fmab2)

ELISA de unión: Procedimiento:

El Mab de fusión anti-EGFRI HC Anti-EGFRI LC -TGFpRII se probó para determinar su capacidad para unirse a sus dianas en tres ELISA diferentes: 1) ELISA de unión a diana eGfRI, 2) ELISA de unión a diana TGFp y 3) ELISA bifuncional.

Para los ELISA de unión a diana, las dianas (quimera rhEGFR-Fc o TGFp) se recubrieron en placas NUNC maxisorb durante la noche a 4 °C. Las placas se lavaron y luego se bloquearon con superbloque a temperatura ambiente durante 2 horas. Se añadieron diferentes diluciones del Mab de fusión o del anticuerpo de control negativo a la placa. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. La unión del Mab de fusión se detectó mediante la adición de un anticuerpo secundario anti-IgG F(ab)² biotinilado, seguido de una incubación de 1 hora con estreptavidina conjugada con peroxidasa a temperatura ambiente. Se añadió solución de sustrato TMB y la reacción se detuvo con H²SO⁴1N. La absorbancia se midió a 450 nm en un lector BioTek Synergy H4 Hybrid.

Para el ELISA bifuncional, la quimera rhEGFR-Fc se recubrió sobre placas NUNC maxisorb durante la noche a 4 °C. Las placas se lavaron y luego se bloquearon con superbloque a temperatura ambiente durante 2 horas. Se añadieron diferentes diluciones del Mab de fusión o del anticuerpo de control negativo a la placa. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. Después del lavado, se añadió TGFp y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. La placa se lavó y se añadió anti-TGFp-biotina y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. La placa se lavó y se añadió estreptavidina-HRP y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. Después del lavado, se añadió solución de sustrato TMB y la reacción se detuvo con H²SO⁴ 1N. La absorbancia se midió a 450 nm en un lector BioTek Synergy H4 Hybrid.

Resultados:

La unión del Mab de fusión anti-EGFR1 HC Anti-EGFR1 LC -TGFpRII a ambas dianas EGFR1 (Figura 40) y TGFp (Figura 41) fue comparable a anti-EGFR1-TGFpRII. El Mab de fusión anti-EGFR1 HC Anti-EGFR1 LC -TGFpRII también se probó en un ELISA bifuncional para determinar si los dominios anti-EGFR1 y TGFpRII del Mab pueden unirse a sus respectivas dianas sin interferir entre sí. Como se ve en la Figura 42, el Mab de fusión anti-EGFR1 HC Anti-EGFR1 LC - TGFpRII se une a sus dos dianas, lo que sugiere que no hay interferencia en la unión de ninguna de las dianas debido al constructo del Mab de fusión.

Inhibición de la proliferación

Procedimiento:

Las células A-431 se cultivaron en matraces hasta que alcanzaron una confluencia del 70-80 %. Las células se tripsinizaron, se recogieron y se colocaron en placas de 96 pocillos. Se añadieron a las células diferentes diluciones del Mab de fusión anti-EGFR1 HC Anti-EGFR1 LC -TGFpRII o Ig de control. Las placas se incubaron a 37 °C, 5 % de CO² durante tres días. En el tercer día, la proliferación celular se midió mediante el método AlamarBlue.

Resultados:

Se sabe que los anticuerpos anti-EGFR tales como Cetuximab inhiben la proliferación de células que expresan EGFR1. Como se ve en la Figura 43, la porción anti-EGFR del anti-EGFR1 HC Anti-EGFR1 LC -TGFpRII Mab de fusión está intacta y tiene actividad antiproliferativa.

6. TGFpRII-Anti-EGFR1 HC Anti-EGFR1 LC (Fmab 3)

ELISA de unión: Procedimiento:

El Mab de fusión se probó para determinar su capacidad para unirse a sus dianas en tres ELISA diferentes: 1) ELISA de unión a diana EGFR1, 2) ELISA de unión a diana TGFp y 3) ELISA bifuncional.

Para los ELISA de unión a diana, las dianas (quimera rhEGFR-Fc o TGFp) se recubrieron sobre placas NUNC maxisorb durante la noche a 4 °C. Las placas se lavaron y luego se bloquearon con superbloque a temperatura ambiente durante 2 horas. Se añadieron diferentes diluciones del Mab de fusión o del anticuerpo de control negativo a la placa. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. La unión del Mab de fusión se detectó mediante la adición de un anticuerpo secundario anti-IgG F(ab)² biotinilado, seguido de una incubación de 1 hora con estreptavidina conjugada con peroxidasa a temperatura ambiente. Se añadió solución de sustrato TMB y la reacción se detuvo con H²SO⁴1N. La absorbancia se midió a 450 nm en un lector BioTek Synergy H4 Hybrid.

Para el ELISA bifuncional, la quimera rhEGFR-Fc se recubrió sobre placas NUNC maxisorb durante la noche a 4 °C. Las placas se lavaron y luego se bloquearon con superbloque a temperatura ambiente durante 2 horas. Se añadieron diferentes diluciones del Mab de fusión o del anticuerpo de control negativo a la placa. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. Después del lavado, se añadió TGFp y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. La placa se lavó y se añadió anti-TGFp-biotina y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. La placa se lavó y se añadió estreptavidina-HRP y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. Después del lavado, se añadió solución de sustrato TMB y la reacción se detuvo con H²SO⁴ 1N. La absorbancia se midió a 450 nm en un lector híbrido BioTek Synergy H4.

Resultados:

La unión del Mab de fusión TGFpRII-Anti-EGFR1 HC Anti-EGFR1 LC a las dianas EGFR1 (Figura 44) y TGFp (Figura 45) fue comparable a la anti-EGFR1-TGFpRII. El Mab de fusión TGFpRII-Anti-EGFR1 HC Anti-EGFR1 LC también se probó en un ELISA bifuncional para determinar si los dominios anti-EGFR1 y TGFpRII del Mab se pueden unir a sus respectivas dianas sin interferir entre sí. Como se ve en la Figura 46, la unión del Mab de fusión TGFpRII-Anti-EGFR1 HC Anti-EGFR1 LC se reduce en comparación con el anti-EGFR1-TGFpRII, lo que sugiere que existe cierta interferencia en la unión a cualquiera de las dianas debido al constructo del Mab de fusión.

Unión a células que expresan EGFR1:

Procedimiento:

Las células A-431 se cultivaron en matraces hasta que alcanzaron una confluencia del 70-80 %. Las células se tripsinizaron y se recogieron. Las células se tiñeron con diferentes diluciones del Mab de fusión TGFpRII-Anti-EGFR1 HC Anti-EGFR1 LC o Ig control a 2 - 8 °C durante 30 minutos. Las células se lavaron y se incubaron con conjugado anti-IgG humana - FITC a 2 - 8 °C durante 30 minutos. Después del lavado, las células se analizaron en un citómetro de flujo. Las células vivas se activaron en función de sus perfiles FSC frente a SSC. Se registró el total de IMF para la población cerrada.

Resultados:

La fusión TGFpRII-Anti-EGFR1 HC Anti-EGFR1 LC se une a las células A-431 que expresan EGFR de una manera dependiente de la dosis. La unión de TGFpRII-Anti-EGFR1 HC Anti-EGFR1 LC es comparable a la unión de anti-EGFR1-TGFpRII.

Inhibición de la proliferación

Procedimiento:

Las células A-431 se cultivaron en matraces hasta que alcanzaron una confluencia del 70-80 %. Las células se tripsinizaron, se recogieron y se colocaron en placas de 96 pocillos. Se añadieron a las células diferentes diluciones de la fusión de TGFpRII-Anti-EGFR1 HC Anti-EGFR1 LC o Ig de control. Las placas se incubaron a 37 °C, 5 % de CO² durante tres días. En el tercer día, la proliferación celular se midió mediante el método AlamarBlue.

Resultados:

Se sabe que los anticuerpos anti-EGFR tales como Cetuximab inhiben la proliferación de células que expresan EGFR1. Como se ve en la Figura 47, la porción anti-EGFR del Mab de fusión LC TGFpRII-Anti-EGFR1 HC Anti-EGFR1 está intacta y tiene actividad antiproliferativa.

7. Anti-EGFR1 HC TGFpRII-Anti-EGFR1 LC (Fmab 4)

ELISA de unión: Procedimiento:

El Mab de fusión se probó para determinar su capacidad para unirse a sus dianas en tres ELISA diferentes: 1) ELISA de unión a diana EGFR1, 2) ELISA de unión a diana TGFp y 3) ELISA bifuncional.

Para los ELISA de unión a diana, las dianas (quimera rhEGFR-Fc o TGFp) se recubrieron en placas NUNC maxisorb durante la noche a 4 °C. Las placas se lavaron y luego se bloquearon con superbloque a temperatura ambiente durante 2 horas. Se añadieron diferentes diluciones del Mab de fusión o del anticuerpo de control negativo a la placa. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. La unión del Mab de fusión se detectó mediante la adición de un anticuerpo secundario anti-IgG F(ab)² biotinilado, seguido de una incubación de 1 hora con estreptavidina conjugada con peroxidasa a temperatura ambiente. Se añadió solución de sustrato TMB y la reacción se detuvo con H²SO⁴1N. La absorbancia se midió a 450 nm en un lector BioTek Synergy H4 Hybrid.

Para el ELISA bifuncional, la quimera rhEGFR-Fc se recubrió sobre placas NUNC maxisorb durante la noche a 4 °C. Las placas se lavaron y luego se bloquearon con superbloque a temperatura ambiente durante 2 horas. Se añadieron diferentes diluciones del Mab de fusión o del anticuerpo de control negativo a la placa. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. Después del lavado, se añadió TGFp y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. La placa se lavó y se añadió anti-TGFp-biotina y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. La placa se lavó y se añadió estreptavidina-HRP y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. Después del lavado, se añadió solución de sustrato TMB y la reacción se detuvo con H²SO⁴ 1N. La absorbancia se midió a 450 nm en un lector híbrido BioTek Synergy H4.

Resultados:

La unión del Mab de fusión Anti-EGFR1 HC TGFpRII-Anti-EGFR1 LC a ambas dianas EGFR1 (Figura 48) y TGFp (Figura 49) fue comparable con anti-EGFRp-TGFpRII. El Mab de fusión Anti-EGFR1 HC TGFpRII-Anti-EGFR1 ^lC también se probó en un ELISA bifuncional para determinar si los dominios anti-EGFR1 y TGFpRII del Mab pueden unirse a sus respectivas dianas sin interferir entre sí. Como se ve en la Figura 50, la unión del Mab de fusión Anti-EGFR1 HC TGFpRII-Anti-EGFR1 LC se reduce en comparación con el anti-EGFR1-TGFpRII, lo que sugiere que existe cierta interferencia en la unión a cualquiera de las dianas debido al constructo del Mab de fusión.

Unión a células que expresan EGFR1:

Procedimiento:

Las células A-431 se cultivaron en matraces hasta que alcanzaron una confluencia del 70-80 %. Las células se tripsinizaron y se recogieron. Las células se tiñeron con diferentes diluciones de anti-EGFR1 HC TGFpRII-Anti-EGFR1 LC Mab de fusión o Ig control a 2 - 8 °C durante 30 minutos. Las células se lavaron y se incubaron con conjugado anti-IgG humana - FITC a 2 - 8 °C durante 30 minutos. Después del lavado, las células se analizaron en un citómetro de flujo. Las células vivas se activaron en función de sus perfiles FSC frente a SSC. Se registró el total de IMF para la población cerrada.

Resultados:

La fusión anti-EGFR1 HC TGFpRII-Anti-EGFR1 LC se une a las células A-431 que expresan EGFR de una manera dependiente de la dosis (Figura 51). La unión de Anti-EGFR1 HC TGFpRII-Anti-EGFR1 LC se reduce en comparación con la unión de anti-EGFR1-TGFpRII.

8. Anti-EGFR1 HC-TGFpRII TGFpRII-Anti-EGFR1 LC (Fmab 10)

ELISA de unión: Procedimiento:

El Mab de fusión se probó para determinar su capacidad para unirse a sus dianas en tres ELISA diferentes: 1) ELISA de unión a diana EGFR1, 2) ELISA de unión a diana TGFp y 3) ELISA bifuncional.

Para los ELISA de unión a diana, las dianas (quimera rhEGFR-Fc o TGFp) se recubrieron sobre placas NUNC maxisorb durante la noche a 4 °C. Las placas se lavaron y luego se bloquearon con superbloque a temperatura ambiente durante 2 horas. Se añadieron diferentes diluciones del Mab de fusión o del anticuerpo de control negativo a la placa. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. La unión del Mab de fusión se detectó mediante la adición de un anticuerpo secundario anti-IgG F(ab)² biotinilado, seguido de una incubación de 1 hora con estreptavidina conjugada con peroxidasa a temperatura ambiente. Se añadió solución de sustrato TMB y la reacción se detuvo con H²SO⁴1N. La absorbancia se midió a 450 nm en un lector BioTek Synergy H4 Hybrid.

Para el ELISA bifuncional, la quimera rhEGFR-Fc se recubrió sobre placas NUNC maxisorb durante la noche a 4 °C. Las placas se lavaron y luego se bloquearon con superbloque a temperatura ambiente durante 2 horas. Se añadieron diferentes diluciones del Mab de fusión o del anticuerpo de control negativo a la placa. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. Después del lavado, se añadió TGFp y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. La placa se lavó y se añadió anti-TGFp-biotina y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. La placa se lavó y se añadió estreptavidina-HRP y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. Después del lavado, se añadió solución de sustrato TMB y la reacción se detuvo con H2SO4 1N. La absorbancia se midió a 450 nm en un lector híbrido BioTek Synergy H4.

Resultados:

La unión del Mab anti-EGFR1 HC-TGFpRII TGFpRII-Anti-EGFR1 LC a la diana EGFR1 se redujo ligeramente (Figura 52) pero fue mayor para TGFp (Figura 53) en comparación con la unión de anti-EGFR1 -TGFpRII. El Mab de fusión Anti-EGFR1-TGFpRII TGFpRII-Anti-EGFR1 también se probó en un ELISA bifuncional para determinar si los dominios anti-EGFR1 y TGFpRII del Mab se pueden unir a sus respectivas dianas sin interferir entre sí. Como se ve en la Figura 54, la unión del Mab de fusión anti-EGFR1 HC-TGFpRII TGFpRII-Anti-EGFR1 es comparable a la anti-EGFR1-TGFpRII, lo que sugiere que no hay interferencia en la unión a ninguno de las dianas debido al constructo del Mab de fusión.

9. TGFpRII-Anti-EGFR1 HC TGFpRII-Anti-EGFR1 LC (Fmab 12)

ELISA de unión: Procedimiento:

El Mab de fusión se probó para determinar su capacidad para unirse a sus dianas en tres ELISA diferentes: 1) ELISA de unión a diana EGFR1, 2) ELISA de unión a diana TGFp y 3) ELISA bifuncional.

Para los ELISA de unión a diana, las dianas (quimera rhEGFR-Fc o TGFp) se recubrieron con placas NUNC maxisorb durante la noche a 4 °C. Las placas se lavaron y luego se bloquearon con superbloque a temperatura ambiente durante 2 horas. Se añadieron diferentes diluciones del Mab de fusión o del anticuerpo de control negativo a la placa. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. La unión del Mab de fusión se detectó mediante la adición de un anticuerpo secundario anti-IgG F(ab)² biotinilado, seguido de una incubación de 1 hora con estreptavidina conjugada con peroxidasa a temperatura ambiente. Se añadió solución de sustrato TMB y la reacción se detuvo con H²SO⁴1N. La absorbancia se midió a 450 nm en un lector BioTek Synergy H4 Hybrid.

Para el ELISA bifuncional, la quimera rhEGFR-Fc se recubrió sobre placas NUNC maxisorb durante la noche a 4 °C. Las placas se lavaron y luego se bloquearon con superbloque a temperatura ambiente durante 2 horas. Se añadieron diferentes diluciones del Mab de fusión o del anticuerpo de control negativo a la placa. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. Después del lavado, se añadió TGFp y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. La placa se lavó y se añadió anti-TGFp-biotina y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. La placa se lavó y se añadió estreptavidina-HRP y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. Después del lavado, se añadió solución de sustrato TMB y la reacción se detuvo con H²SO⁴ 1N. La absorbancia se midió a 450 nm en un lector híbrido BioTek Synergy H4.

Resultados:

La unión del Mab de TGFpRII-Anti-EGFR1 HC TGFpRII-Anti-EGFR1 a la diana EGFR1 se redujo ligeramente (Figura 53) pero fue mayor para TGFp (Figura 56) en comparación con la unión de anti-EGFR1-TGFpRII. El Mab de fusión TGFpRII-Anti-EGFR1 HC TGFpRII-Anti-EGFR1 también se probó en un ELISA bifuncional para determinar si los dominios anti-EGFR1 y TGFpRII del Mab se pueden unir a sus respectivas dianas sin interferir entre sí. Como se ve en la Figura 57, la unión del Mab de fusión TGFpRII-Anti-EGFR1 HC TGFpRII-Anti-EGFR1 se reduce en comparación con el anti-EGFR1-TGFpRII, lo que sugiere que existe una interferencia en la unión a cualquier diana debido al constructo del Mab de fusión.

Referencias

Altschul, y col., 1990, Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol. 15:403-10.

Ausubel, y col., (ed), 1998, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ch. 13, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience.

Bitter, y col., 1987, Expression and Secretion Vectors for Yeast; Methods in Enzymology, 153:516-544.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento de preparación de una proteína de fusión terapéuticamente activa, en el que la proteína de fusión comprende un resto dirigido al tumor y al menos una molécula inmunomoduladora que contrarresta la tolerancia inmune de una célula cancerosa, en el que el resto dirigido al tumor es un anticuerpo que se une a EGFR1 o CTLA 4 y en el que la proteína de fusión se prepara mediante las siguientes etapas:

preparar una secuencia de nucleótidos optimizada en codones que codifica la proteína de fusión para la expresión en células CHO, siendo la secuencia de nucleótidos optimizada en codones modificada para aumentar las secuencias de CG, y en la que la secuencia de nucleótidos optimizada en codones es SEQ ID NO: 1 o 5 para la cadena pesada del anticuerpo, SEQ ID NO: 2 o 6 para la cadena ligera del anticuerpo, SEQ ID NO: 3 o 7 para la molécula inmunomoduladora, en la que la secuencia de nucleótidos optimizada en codones SEQ ID NO: 1 o 5 para la cadena pesada del anticuerpo que se une a EGFR1 o CTLA-4, respectivamente, carece de nucleótidos para la expresión de una lisina en el extremo C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo;

clonar la secuencia optimizada de dicha proteína de fusión en las células CHO capaces de expresión transitoria o estable;

cultivar las células CHO en un medio en condiciones adecuadas para el cultivo y permitir que la célula huésped exprese la proteína de fusión; y

recoger proteínas de fusión secretadas y opcionalmente para purificación adicional.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la molécula inmunomoduladora está unida al anticuerpo por una secuencia de aminoácidos expresada por SEQ ID NO: 4 de longitud suficiente para permitir la unión biespecífica de la proteína de fusión y está unida directamente o a través de un enlazador a la cadena pesada del anticuerpo, a la cadena ligera del anticuerpo o a ambas cadenas.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la molécula inmunomoduladora está unida directamente o a través de un enlazador expresado por SEQ ID NO: 4 al extremo N o C de la cadena pesada del anticuerpo, el extremo N o C de la cadena ligera del anticuerpo o ambos extremos N y C de ambas cadenas.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las secuencias de nucleótidos optimizadas en codones comprenden SEQ ID NO: 1, 2, 4 y 7.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las secuencias de nucleótidos optimizadas en codones comprenden SEQ ID NO: 1, 2, 3 y 4.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las secuencias de nucleótidos optimizadas en codones comprenden SEQ ID NO: 5, 6, 7 y 4.

7. Una preparación que comprende proteínas de fusión terapéuticamente activas homogéneas, en la que las proteínas de fusión comprenden un resto dirigido al tumor y al menos una molécula inmunomoduladora, siendo el resto dirigido al tumor un anticuerpo que se une a EGFR1 o CTLA-4 y preparándose las proteínas de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la proteína de fusión tiene una secuencia de nucleótidos optimizada en codones que codifica la proteína de fusión para la expresión en células CHO, en la que la secuencia de nucleótidos optimizada en codones se modifica para aumentar las secuencias CG, y en la que la secuencia de nucleótidos optimizada en codones es SEQ ID NO: 1 o 5 para la cadena pesada del anticuerpo, SEQ ID NO: 2 o 6 para la cadena ligera del anticuerpo, SEQ ID NO: 3 o 7 para la molécula inmunomoduladora, en la que la secuencia de nucleótidos optimizada en codones SEQ ID NO: 1 o 5 para la cadena pesada del anticuerpo que se une a EGFR1 o CTLA-4, respectivamente, carece de nucleótidos para la expresión de una lisina en el extremo C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo.

8. Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión quimérica de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la cadena pesada y la cadena ligera es SEQ ID NO: 1 y 2 o SEQ ID NO: 5 y 6, en la que el resto diana inmunomodulador es SEQ ID NO: 3 o 7.

9. Un vector que comprende las secuencias de ácido nucleico de la reivindicación 8.

10. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la proteína de fusión comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y una de SEQ ID NO: 15, 17, 27 o 29.

11. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la proteína de fusión comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y una de SEQ ID NO: 16, 18, 28 o 30.

12. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la proteína de fusión comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y una de SEQ ID NO: 28 o 30.

13. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la proteína de fusión comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 y una de SEQ ID NO: 28 o 30.

14. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la proteína de fusión comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 y una de SEQ ID NO: 14, 33 o 35.

15. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la proteína de fusión comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 y una de SEQ ID NO: 33 o 35.

16. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la proteína de fusión comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 y una de SEQ ID NO: 14, 33 o 35.