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ES2703814T3 - Terapia génica para la enfermedad de Fabry - Google Patents

Terapia génica para la enfermedad de Fabry Download PDF

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ES2703814T3
ES2703814T3 ES16721916T ES16721916T ES2703814T3 ES 2703814 T3 ES2703814 T3 ES 2703814T3 ES 16721916 T ES16721916 T ES 16721916T ES 16721916 T ES16721916 T ES 16721916T ES 2703814 T3 ES2703814 T3 ES 2703814T3
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galactosidase
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Deepak Raj
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UCL Business Ltd
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Abstract

Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos con optimización de codones que codifica una proteína α-galactosidasa A funcional en la que la secuencia de nucleótidos tiene al menos un 95 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO. 1, en la que los codones de la secuencia de nucleótidos se han seleccionado basándose en los codones usados para las proteínas que se expresan a un alto nivel en el hígado.

Description

DESCRIPCIÓN
Terapia génica para la enfermedad de Fabry
Campo de la invención
La invención se refiere a un nuevo enfoque de terapia génica para tratar la enfermedad de Fabry.
Antecedentes de la invención
La enfermedad de Fabry es un raro trastorno de almacenamiento lisosómico multisistémico hereditario ligado al cromosoma X, con una prevalencia estimada de aproximadamente 1:40.000. Es causada por una deficiencia de la enzima a-galactosidasa A que da como resultado la acumulación de glucoesfingolípidos neutros en los lisosomas de diversos órganos, incluyendo las células endoteliales y musculares lisas de los vasos sanguíneos. Esta acumulación causa un deterioro de la función del órgano que causa una nefropatía terminal, complicaciones cardíacas y accidente cerebrovascular, asociados con una esperanza de vida reducida de aproximadamente 58 años.
El trasplante de células madre hematopoyéticas ha demostrado un beneficio clínico en la enfermedad de Fabry, pero se asocia con una alta morbilidad y mortalidad. En 2002, la Agencia Europea de Medicamentos aprobó dos enzimas recombinantes: agalsidasa alfa (Shire HGT, Boston MA, EE. UU.) Y agalsidasa beta (Genzyme Inc, Boston MA, EE. UU.), que representan el único tratamiento específico disponible actualmente para la enfermedad de Fabry. La terapia enzimática sustitutiva (TES) es un enfoque razonable y prometedor para el tratamiento de la enfermedad de Fabry, pero no representa una cura, requiriendo una administración intravenosa semanal durante el tiempo de vida de los pacientes a un coste estimado para el Servicio Nacional de Salud británico de aproximadamente 200 mil libras/año. Adicionalmente, una proporción significativa de pacientes (55-88 %) desarrollan anticuerpos neutralizantes contra la a-galactosidasa A, lo que hace que la TES sea ineficaz.
Por el contrario, la terapia génica para la enfermedad de Fabry ofrece el potencial de una cura a través de la producción endógena persistente de a-galactosidasa A después de la transferencia de una copia normal del gen de agalactosidasa A a un paciente afectado.
Los inventores han desarrollado un enfoque de terapia génica usando vectores virales adenoasociados (AAV) para mediar la transferencia y la expresión del gen de a-galactosidasa A. Como la enfermedad de Fabry surge de un defecto en un solo gen, los niveles relativamente bajos de corrección enzimática reducirán el almacenamiento de glucoesfingolípidos. Adicionalmente, la corrección de un pequeño número de células posiblemente también corregirá las células distantes como resultado de los mecanismos de corrección cruzada metabólica, en los que las células corregidas secretan a-galactosidasa A que puede corregir las células no implicadas. Por último, el enfoque del inventor conlleva la expresión mediada por el hígado de la a-galactosidasa A después de la transferencia génica de hepatocitos mediada por AAV in-vivo, que da como resultado tolerancia a la proteína transgénica, reduciendo de este modo el riesgo de desarrollar anticuerpos neutralizantes para la a-galactosidasa A.
Sumario de la invención
En un primer aspecto de la invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína a-galactosidasa A funcional en la que la secuencia de nucleótidos se ha sometido a optimización de codones para la expresión en el hígado y tiene al menos un 95 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO. 1, en la que los codones de la secuencia de nucleótidos se han seleccionado basándose en los codones usados para las proteínas que se expresan a un alto nivel en el hígado.
Los inventores han descubierto sorprendentemente que la nueva secuencia con optimización de codones de la SEQ ID NO. 1 da como resultado un aumento de la expresión de la proteína a-galactosidasa A en hepatocitos transducidos con un vector de AAV bajo el control de un promotor específico del hígado, frente a una construcción idéntica que contiene el ADNc de a-galactosidasa de tipo silvestre.
La secuencia de nucleótidos tiene al menos un 95 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO. 1. En algunas divulgaciones, la secuencia de nucleótidos tiene al menos un 86 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO. 1. En otras divulgaciones, la secuencia de nucleótidos tiene al menos un 87 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO. 1. En divulgaciones particulares, la secuencia de nucleótidos tiene al menos un 88 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO. 1. En divulgaciones adicionales, la secuencia de nucleótidos tiene al menos un 89 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO. 1. En algunas divulgaciones, la secuencia de nucleótidos tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO. 1. En otras divulgaciones, la secuencia de nucleótidos tiene al menos un 91 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO. 1. En divulgaciones particulares, la secuencia de nucleótidos tiene al menos un 92 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO. 1. En divulgaciones adicionales, la secuencia de nucleótidos tiene al menos un 93 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO. 1. En algunas divulgaciones, la secuencia de nucleótidos tiene al menos un 94 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO. 1. La secuencia de nucleótidos tiene al menos un 95 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO. 1. En realizaciones particulares, la secuencia de nucleótidos tiene al menos un 96 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO. 1. En realizaciones adicionales, la secuencia de nucleótidos tiene al menos un 97 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO. 1. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos tiene al menos un 98 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO. 1. En otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos tiene al menos un 99 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO. 1. En realizaciones particulares, la secuencia de nucleótidos tiene la secuencia de la SEQ ID NO. 1.
La secuencia de nucleótidos codifica una proteína a-galactosidasa A funcional. Una proteína a-galactosidasa A funcional hidroliza los restos alfa-galactosilo terminales de glucolípidos y glucoproteínas. Los métodos adecuados para ensayar la actividad de la a-galactosidasa A son bien conocidos por los expertos en la materia. Preferentemente, la secuencia de nucleótidos codifica la proteína a-galactosidasa A que tiene la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre. Esta secuencia es bien conocida por los expertos en la materia. Por ejemplo, esta información se puede encontrar en la base de datos GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) con el número de registro CAA29232.1 (GI: 757912). Se puede encontrar más información sobre esta proteína en la secuencia de referencia NCBI: NP_000160.1 (GI: 4504009). La secuencia de proteínas de tipo silvestre tiene 429 aminoácidos.
En un segundo aspecto de la invención, se proporciona un vector para expresar la proteína a-galactosidasa A.
El vector comprende la molécula de ácido nucleico descrita anteriormente. Esto significa que el vector contiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína a-galactosidasa A funcional, de modo que, cuando se expresa esta secuencia, la célula en la que está contenido el vector produce una proteína a-galactosidasa A funcional.
La secuencia de la SEQ ID NO. 1 es una secuencia de nucleótidos A de a-galactosidasa A con optimización de codones. Esta secuencia no se ha sometido a optimización de codones de una manera normal. En su lugar, los codones se han seleccionado basándose en los codones usados para las proteínas que se expresan a un alto nivel en el hígado. La razón para esto es que el vector normalmente se expresa en el hígado. Se ha descubierto que este proceso especial de optimización de codones produce una secuencia de nucleótidos que proporciona una expresión sorprendentemente alta.
La secuencia de nucleótidos que codifica una proteína a-galactosidasa A tiene preferentemente una longitud de entre 1265 y 1315 nucleótidos. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína agalactosidasa A funcional tiene una longitud de entre 1270 y 1310 nucleótidos. En otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína a-galactosidasa A funcional tiene una longitud de entre 1275 y 1305 nucleótidos. En realizaciones particulares, la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína a-galactosidasa A funcional tiene una longitud de entre 1280 y 1300 nucleótidos.
Preferentemente, el vector comprende además un promotor. El promotor causa la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína a-galactosidasa A funcional. Puede usarse cualquier promotor apropiado, tal como HLP, LP1, HCR-hAAT, ApoE-hAAT y LSP. Estos promotores se describen con más detalle en las siguientes referencias: HLP: McIntosh J. et al., Blood 25 de abril de 2013, 121(17):3335-44; LP1: Nathwani et al., Blood. 1 de abril de 2006, 107(7): 2653-2661; HCR-hAAT: Miao et al., Mol Ther. 2000;1: 522-532; ApoE-hAAT: Okuyama et al., Human Gene Therapy, 7, 637-645 (1996); y LSP: Wang et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 30 de marzo de 1999, 96(7): 3906-3910. También se describe un promotor preferido en el documento WO 2011/005968. Otro promotor preferido tiene la secuencia de la SEQ ID NO. 2 y se denomina HLP2. El promotor que tiene la SEQ ID NO. 2 es un promotor específico del hígado que se ha descubierto que proporciona una expresión particularmente buena en el hígado. Aunque da una buena expresión, este promotor también es relativamente pequeño, lo que permite un empaquetado más eficiente del vector. Preferentemente, el promotor es un promotor específico del hígado.
La SEQ ID NO. 3 es la secuencia de nucleótidos de una construcción de vector que incluye un promotor y una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína a-galactosidasa A funcional. Por lo tanto, la molécula de ácido nucleico de la invención puede comprender una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de la s Eq ID NO. 3. En otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos tiene al menos un 91 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO. 3. En realizaciones particulares, la secuencia de nucleótidos tiene al menos un 92 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO. 3. En realizaciones adicionales, la secuencia de nucleótidos tiene al menos un 93 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO. 3. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos tiene al menos un 94 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO. 3. En otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos tiene al menos un 95 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO. 3. En realizaciones particulares, la secuencia de nucleótidos tiene al menos un 96 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO. 3. En realizaciones adicionales, la secuencia de nucleótidos tiene al menos un 97 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO. 3. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos tiene al menos un 98 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO. 3. En otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos tiene al menos un 99 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO. 3. En realizaciones particulares, la secuencia de nucleótidos tiene la secuencia de la SEQ ID NO. 3.
El vector puede ser cualquier vector apropiado para expresar la proteína a-galactosidasa A, incluyendo vectores virales y no virales. Los vectores virales incluyen un parvovirus, un adenovirus, un retrovirus, un lentivirus o un virus del herpes simple. El parvovirus puede ser un virus asociado a adenovirus (AAV). El vector preferentemente es un vector viral adenoasociado recombinante (rAAV) o un vector lentiviral. Más preferentemente, el vector es un vector rAAV.
Un vector de acuerdo con la invención puede ser un vector de liberación de genes. Dicho vector de liberación de genes puede ser un vector de liberación de genes viral o un vector de liberación de genes no viral.
Por consiguiente, la presente invención proporciona vectores de liberación de genes basados en parvovirus animales, en particular, dependovirus tales como a Av de simio o humano infeccioso y sus componentes (por ejemplo, un genoma de parvovirus animal) para su uso como vectores para la introducción y/o expresión de una proteína agalactosidasa A en una célula de mamífero. De esta manera, el término "parvoviral", tal y como se usa en el presente documento, incluye dependovirus tales como cualquier tipo de AAV.
Los virus de la familia Parvoviridae son virus animales de ADN pequeños. La familia Parvoviridae puede dividirse en dos subfamilias: Parvovirinae, que infecta a vertebrados, y Densovirinae, que infecta a insectos. Los miembros de la subfamilia Parvovirinae se denominan en el presente documento parvovirus e incluyen el género Dependovirus. Como puede deducirse del nombre de su género, los miembros de la familia Dependovirus son especiales ya que normalmente necesitan la coinfección con un virus auxiliar, tal como adenovirus o herpesvirus, para realizar una infección productiva en un cultivo celular. El género Dependovirus incluye AAV, que normalmente infecta a seres humanos (por ejemplo, serotipos 1, 2, 3A, 3B, 4, 5 y 6) o primates (por ejemplo, serotipos 1 y 4), y virus relacionados que infectan a otros animales de sangre caliente (por ejemplo, virus adenoasociados bovinos, caninos, equinos y ovinos). Se describe más información sobre parvovirus y otros miembros de la familia Parvoviridae en Kenneth I. Berns, "Parvoviridae: The Viruses and Their Replication," Capítulo 69 en Fields Virology (3a Ed. 1996). Por comodidad, la presente invención se ejemplifica y se describe adicionalmente en el presente documento tomando como referencia AAV. Sin embargo, debe entenderse que la invención no se limita a AAV, sino que puede aplicarse igualmente a otros parvovirus.
La organización genómica de todos los serotipos de AAV conocidos es muy similar. El genoma de AAV es una molécula de ADN monocatenaria, lineal, que tiene menos de aproximadamente 5.000 nucleótidos (nt) de longitud. Unas repeticiones terminales invertidas (ITR) flanquean las secuencias de nucleótidos codificantes únicas de las proteínas de replicación no estructurales (Rep) y las proteínas estructurales (VP). Las proteínas VP (VP1, -2 y -3) forman la cápsida. Los 145 nt terminales son autocomplementarios y se organizan de forma que pueda formarse un dúplex intramolecular energéticamente estable que forma una horquilla con forma de T. Estas estructuras en horquilla funcionan como origen para la replicación de ADN viral, actuando como cebadores para el complejo de la ADN polimerasa celular. Después de la infección por AAV de tipo silvestre (wt) de células de mamífero, se expresan los genes de Rep (es decir, los que codifican proteínas Rep78 y Rep52) a partir del promotor P5 y el promotor P19, respectivamente, y las dos proteínas Rep intervienen en la replicación del genoma viral. Un acontecimiento de corte y empalme en el o Rf de Rep tiene como resultado la expresión de exactamente cuatro proteínas Rep (es decir, Rep78, Rep68, Rep52 y Rep40). Sin embargo, se ha demostrado que el ARNm no sometido a corte y empalme, que codifica proteínas Rep78 y Rep52, en las células de mamífero, es suficiente para la producción del vector de AAV. También son suficientes las proteínas Rep78 y Rep52 para la producción del vector de AAV en las células de insecto.
En un AAV adecuado para uso como vector de terapia génica, el genoma del vector típicamente comprende un ácido nucleico de la invención que se empaquetará para liberarse en una célula diana. De acuerdo con esta realización particular, la secuencia de nucleótidos heteróloga se localiza entre las ITR virales en cualquier extremo del genoma del vector. En realizaciones preferidas adicionales, se eliminan del genoma de plantilla (y, por lo tanto, del ADN del virión producido a partir del mismo) los genes cap de parvovirus (por ejemplo, AAV) y los genes rep de parvovirus (por ejemplo, AAV). Esta configuración maximiza el tamaño de la secuencia o secuencias de ácido nucleico que puede llevar la cápsida del parvovirus.
De acuerdo con esta realización particular, el ácido nucleico se localiza entre las ITR virales en cualquier extremo del sustrato. Es posible que un genoma parvoviral funcione solo con una ITR. Por lo tanto, en un vector de terapia génica de la invención basado en un parvovirus, el genoma del vector está flanqueado por al menos una ITR, pero, más normalmente, por dos ITR de AAV (generalmente una en cada lado del genoma del vector, es decir, una en el extremo 5' y la otra en el extremo 3'). Puede haber secuencias intermedias entre el ácido nucleico en el genoma del vector y una o más de las ITR.
Preferentemente, la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína a-galactosidasa A funcional (para la expresión en las células de mamífero) se incorporará en un genoma parvoviral localizado entre dos ITR regulares o localizado en cualquier lado de una ITR obtenida por ingeniería genética con dos regiones D. Las secuencias que pueden usarse en la presente invención para la producción de vectores de terapia génica de AAV pueden derivar del genoma de cualquier serotipo de AAV. En general, los serotipos de AAV tienen secuencias genómicas de homología significativa a nivel de los aminoácidos y a nivel del ácido nucleico, proporcionan un conjunto idéntico de funciones genéticas, producen viriones que son esencialmente física y funcionalmente equivalentes, y se replican y ensamblan por mecanismos prácticamente idénticos. Si se desea más información sobre la secuencia genómica de los diversos serotipos de AAV y una visión general de las similitudes genómicas, véase, por ejemplo, la base de datos GenBank Número de Registro U89790; GenBank, número de registro J01901; GenBank, número de registro AF043303; GenBank, número de registro AF085716; Chiorini et al, 1997; Srivastava et al, 1983; Chiorini et al, 1999; Rutledge et al, 1998; y Wu et al, 2000. En la presente invención puede usarse AAV de serotipo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9. Sin embargo, Los serotipos 1, 5 u 8 de AAV son fuentes preferidas de secuencias de AAV para uso en el contexto de la presente invención. Las secuencias de los serotipos de AAV pueden mutarse o modificarse por ingeniería genética cuando se van a usar en la producción de vectores de terapia génica.
Preferentemente, las secuencias de ITR de AAV para su uso en el contexto de la presente invención proceden de AAV1, AAV2, AAV4 y/o AAV6. Asimismo, las secuencias codificantes de Rep (Rep78 y Rep52) preferentemente derivan de AAV1, AAV2, AAV4 y/o AAV6. Las secuencias codificantes de las proteínas de la cápsida VP1, VP2 y VP3 para uso en el contexto de la presente invención, sin embargo, pueden proceder de cualquiera de los 42 serotipos conocidos, más preferentemente de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 o AAV9 o de partículas de tipo AAV creadas recientemente obtenidas, por ejemplo, por técnicas de barajado y bibliotecas de cápsidas de AAV.
Las secuencias de ITR y Rep de AAV están particularmente conservadas entre la mayoría de serotipos. Las proteínas Rep78 de diversos serotipos de AAV, por ejemplo, tienen una identidad mayor del 89 % y la identidad de las secuencias de nucleótidos totales a nivel del genoma entre AAV2, AAV3A, AAV3B y AAV6 es de aproximadamente un 82 % (Bantel-Schaal et al, 1999). Además, se sabe que las secuencias de Rep y las ITR de muchos serotipos de AAV complementan de forma cruzada (es decir, sustituyen funcionalmente) eficazmente a las secuencias correspondientes de otros serotipos en la producción de partículas de AAV en células de mamífero. El documento US 2003148506 revela que las secuencias Rep e ITR de AAV también complementan de forma cruzada eficazmente otras secuencias de Rep e ITR de AAV en células de insectos.
Se sabe que las proteínas VP de AAV determinan el tropismo celular del virión de AAV. Las secuencias que codifican la proteína VP están significativamente menos conservadas que los genes y las proteínas Rep entre diferentes serotipos de AAV. La capacidad de las secuencias de Rep e ITR de complementar de forma cruzada las secuencias correspondientes de otros serotipos permite la producción de partículas de AAV seudotipificadas que comprenden proteínas de la cápsida de un serotipo (por ejemplo, AAV1, 5 u 8) y las secuencias de Rep y/o ITR de otros serotipo de AAV (por ejemplo, AAV2). Estas partículas de rAAV seudotipificadas forman parte de la presente invención.
En el contexto de la presente invención también pueden usarse secuencias de "AAV" modificadas, por ejemplo, para la producción de vectores de terapia génica de AAV. Estas secuencias modificadas, por ejemplo, incluyen secuencias que tienen al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o más de identidad de secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos (por ejemplo, puede usarse una secuencia que tiene aproximadamente un 75-99 % de identidad de secuencia de nucleótidos) con una ITR, Rep o VP de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 o AAV9 en lugar de las secuencias de ITR, Rep o VP de AAV.
Aunque es similar a los otros serotipos de AAV en muchos aspectos, AAV5 difiere de otros serotipos de AAV de simio y humanos en mayor medida que otros serotipos de simio y humanos conocidos. En vista de esto, la producción de rAAV5 puede diferir de la producción de otros serotipos en células de insecto. Cuando se emplean métodos de la invención para producir rAAV5, se prefiere que uno o más construcciones que comprenden, colectivamente en el caso de más de una construcción, una secuencia de nucleótidos que comprende una ITR de AAV5, una secuencia de nucleótidos comprenda una secuencia codificante de Rep de AAV5 (es decir, una secuencia de nucleótidos comprende una Rep78 de AAV5). Estas secuencias de ITR y Rep pueden modificarse cuando se desee para obtener una producción eficaz de vectores de AAV5 o vectores de AAV5 seudotipificados. Por ejemplo, puede modificarse el codón de iniciación de las secuencias de Rep, pueden modificarse o eliminarse sitios de corte y empalme de VP y/o puede modificarse el codón de iniciación de VP1 y nucleótidos cercanos para mejorar la producción de vectores de AAV5.
Por lo tanto, la cápsida viral usada en la invención puede proceder de cualquier parvovirus, bien de un parvovirus autónomo o de un dependovirus, como se ha descrito anteriormente. Preferentemente, la cápsida viral es una cápsida de AAV (por ejemplo, la cápsida de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5 o AAV6). En general, se prefiere la cápsida de AAV1 o AAV6. La elección de la cápsida de parvovirus puede basarse en varias consideraciones conocidas en la técnica, por ejemplo, el tipo de célula diana, el nivel de expresión deseado, la naturaleza de la secuencia de nucleótidos heteróloga a expresar, asuntos relacionados con la producción viral, y similares. Por ejemplo, la cápsida de AAV1 y AAV6 puede emplearse ventajosamente para el músculo esquelético; AAV1, AAV5 y AAV8 para el hígado y células del sistema nervioso central (por ejemplo, cerebro); AAV5 para células de las vías respiratorias y pulmón o cerebro; AAV3 para células de médula ósea; y AAV4 para células particulares en el cerebro (por ejemplo, células epiteliales coroideas).
Está dentro de las competencias técnicas del experto en la materia seleccionar el virus, subtipo de virus o serotipo de virus más apropiado. Algunos subtipos o serotipos pueden ser más apropiados que otros para un cierto tipo de tejido.
Por ejemplo, la expresión específica de hígado de un ácido nucleico de la invención puede inducirse ventajosamente por la transducción mediada por AAV de células hepáticas. El hígado es susceptible de transducción mediada por AAV y pueden usarse diferentes serotipos (por ejemplo, AAV1, AAV5 o AAV8). La transducción del músculo puede realizarse mediante la administración de un AAV que codifica un ácido nucleico a través del torrente sanguíneo. Por lo tanto, es aplicable la administración intravenosa o intraarterial.
Un vector de terapia génica de parvovirus preparado de acuerdo con la invención puede ser una partícula "híbrida" en la que las TR virales y la cápsida viral son de parvovirus diferentes. Preferentemente, las TR y la cápsida virales son de diferentes serotipos de AAV. Asimismo, el parvovirus puede tener una cápsida "quimérica" (por ejemplo, que contiene secuencias de diferentes parvovirus, preferentemente diferentes serotipos de AAV) o una cápsida "dirigida" (por ejemplo, un tropismo dirigido).
En el contexto de la invención, se entiende que "al menos una secuencia de nucleótidos de ITR parvoviral" significa una secuencia palindrómica, que comprende principalmente secuencias complementarias dispuestas simétricamente también denominadas regiones "A," "B" y "C". La ITR funciona como un origen de replicación, un sitio que tiene un papel "cis" en la replicación, es decir, que es un sitio de reconocimiento para proteínas de replicación de acción en trans tales como, por ejemplo, Rep 78 (o Rep68), que reconocen las secuencias palindrómicas y específicas internas al palíndromo. Una excepción a la simetría de las secuencias de ITR es la región "D" de la ITR. Esta es especial (al no tener un complemento dentro de una ITR). El mellado del ADN monocatenario tiene lugar en la unión entre las regiones A y D. Es la región en la que se inicia la síntesis de ADN. La región D normalmente se sitúa en un lado del palíndromo y proporciona direccionalidad a la etapa de replicación del ácido nucleico. Un parvovirus que se replica en una célula de mamífero típicamente tiene dos secuencias de ITR. Es, sin embargo, posible modificar por ingeniería genética una ITR de manera que los sitios de unión estén en las dos cadenas de las regiones A y las regiones D estén localizadas simétricamente, una en cada lado del palíndromo. En una plantilla de ADN bicatenario circular (por ejemplo, un plásmido), después procede la replicación del ácido nucleico, asistida por Rep78 o Rep68, en las dos direcciones y una sola ITR es suficiente para la replicación parvoviral de un vector circular. Por lo tanto, En el contexto de la presente invención puede usarse una secuencia de nucleótidos de ITR. Preferentemente, sin embargo, se usan dos, u otro número par, de ITR regulares. De la forma más preferente, se usan dos secuencias de ITR. Una ITR parvoviral preferida es una ITR de AAV. Por razones de seguridad, puede ser deseable construir un vector parvoviral (AAV) que no pueda propagarse adicionalmente después de la introducción inicial en una célula. Dicho mecanismo de seguridad para limitar la propagación de un vector indeseable en un receptor puede proporcionarse usando AAV con una ITR quimérica como se describe en el documento US 2003148506.
Los expertos en la materia apreciarán que la proteína o proteínas Rep virales usadas para producir un vector de AAV de la invención pueden seleccionarse teniendo en cuenta la fuente de las ITR virales. Por ejemplo, la ITR de AAV5 típicamente interacciona más eficazmente con la proteína Rep de AAV5, aunque no es necesario que el serotipo de iTr y de la proteína o proteínas Rep sean iguales.
La o las ITR usadas en la invención típicamente son funcionales, es decir, pueden resolverse completamente y preferentemente son secuencias de AAV, siendo preferidos los serotipos 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Las TR de AAV resolubles de acuerdo con la presente invención no necesitan tener una secuencia de ITR de tipo silvestre (por ejemplo, una secuencia de tipo silvestre puede alterarse por inserción, eliminación, truncamiento o mutaciones de sentido erróneo), siempre que la ITR medie las funciones deseadas, por ejemplo, el empaquetamiento viral, la integración y/o el rescate de provirus, y similares.
Ventajosamente, mediante el uso de un vector de terapia génica en comparación con enfoques previos, la restauración de la síntesis de proteínas, es decir, síntesis de a-galactosidasa A, es una característica que las células transducidas adquieren permanentemente o durante un periodo de tiempo sostenido, evitando de esta manera la necesidad de administración continua para conseguir un efecto terapéutico.
Por consiguiente, los vectores de la invención, por lo tanto, representan una herramienta para el desarrollo de estrategias para la liberación in vivo de una secuencia de nucleótidos de a-galactosidasa A, mediante la modificación por ingeniería genética del ácido nucleico dentro de un vector de terapia génica que transduce eficazmente un tipo celular apropiado, tal como células hepáticas.
El vector puede ser un vector de monocatenario o un vector autocomplementario. En algunas realizaciones, el vector es un vector monocatenario. En otras realizaciones, el vector es un vector autocomplementario.
El vector puede comprender además una cola de poli A. Preferentemente, esta está situada cadena abajo de la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína a-galactosidasa A funcional. Preferentemente, La cola de poli A es una cola de poli A de la hormona del crecimiento bovina. Preferentemente, esta tiene entre 250 y 270 nucleótidos de longitud.
El vector puede comprender otros elementos para permitir la expresión de la proteína a-galactosidasa A funcional. Dichos elementos son bien conocidos por los expertos en la materia.
Preferentemente, los ácidos nucleicos descritos anteriormente están aislados.
Estaría dentro de las competencias de un experto en la materia producir las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente. Esto podría hacerse, por ejemplo, usando la síntesis química de una secuencia dada.
Además, una persona experta podría determinar fácilmente si un ácido nucleico expresa una proteína funcional. Para los expertos en la materia serán evidentes métodos adecuados. Por ejemplo, un método in vitro adecuado implica insertar el ácido nucleico dentro de un vector, tal como un vector lentiviral o un vector de AAV, transducir células hospedadoras, tales como células 293T o HeLa, con el vector, y ensayar la actividad de a-galactosidasa A. Como alternativa, un método in vivo adecuado implica transducir un vector que contiene el ácido nucleico en ratones con enfermedad de Fabry y ensayar el plasma de los ratones para determinar la presencia de a-galactosidasa A funcional. Métodos adecuados se describen con más detalle a continuación.
El ácido nucleico puede ser cualquier tipo de ácido nucleico compuesto por nucleótidos. El ácido nucleico debe poder expresarse de manera que se produzca una proteína. Preferentemente, el ácido nucleico es ADN o ARN.
La invención también proporciona una célula hospedadora que comprende una cualquiera de las moléculas de ácido nucleico o vectores descritos anteriormente. Preferentemente, el vector es capaz de expresar la secuencia de nucleótidos de a-galactosidasa A en el hospedador. El hospedador puede ser cualquier hospedador adecuado.
Como se usa en el presente documento, el término "hospedador" se refiere a organismos y/o células que portan una molécula de ácido nucleico o un vector de la invención, así como organismos y/o células que son adecuadas para usarse en la expresión de un gen o proteína recombinante. No se pretende limitar la presente invención a ningún tipo particular de célula u organismo. De hecho, se contempla que en la presente invención encontrará utilidad como hospedador cualquier organismo y/o célula adecuada. Una célula hospedadora puede estar en forma de una sola célula, una población de células similares o diferentes, por ejemplo, en forma de un cultivo (tal como un cultivo líquido o un cultivo en un sustrato sólido), un organismo o parte del mismo.
Una célula hospedadora de acuerdo con la invención puede permitir la expresión de una molécula de ácido nucleico de la invención. Por lo tanto, la célula hospedadora puede ser, por ejemplo, una bacteria, una levadura, una célula de insecto o una célula de mamífero.
Además, la invención proporciona un animal transgénico no humano que comprende células que comprenden la molécula de ácido nucleico que codifica una proteína a-galactosidasa A funcional descrita anteriormente o un vector descrito anteriormente. Preferentemente, el animal es un mamífero no humano, especialmente un primate. Como alternativa, el animal puede ser un roedor, especialmente un ratón; o puede ser canino, felino, ovino o porcino.
En un aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico o un vector de la invención y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. El uno o más excipientes incluyen vehículos, diluyentes y/u otros agentes medicinales, agentes farmacéuticos o adyuvantes, etc.
La invención también proporciona la molécula de ácido nucleico o un vector como se han descrito anteriormente para su uso en un método de tratamiento de la enfermedad de Fabry que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la molécula de ácido nucleico o un vector como se han descrito anteriormente a un paciente que padece la enfermedad de Fabry. Preferentemente, el paciente es un ser humano.
Cuando la enfermedad de Fabry se "trata" en el método anterior, esto significa que se mejoran uno o más síntomas de la enfermedad de Fabry. Esto no significa que se eliminen completamente los síntomas de la enfermedad de Fabry de manera que ya no se presenten nunca más en el paciente, aunque en algunos métodos, esto puede ocurrir. El método de tratamiento da como resultado que uno o más de los síntomas de la enfermedad de Fabry sean menos graves que antes del tratamiento.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad que es eficaz, en las dosificaciones y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado, tal como la elevación del nivel de agalactosidasa A funcional en un sujeto (para llevar la producción de a-galactosidasa A funcional hasta un nivel suficiente para mejorar los síntomas de la enfermedad de Fabry).
La liberación de un ácido nucleico o vector de la invención en una célula hospedadora in vivo puede dar como resultado un aumento de a-galactosidasa A funcional en el hospedador, por ejemplo, a un nivel que mejore uno o más síntomas de la enfermedad de Fabry.
El nivel de a-galactosidasa A natural en un sujeto que padece enfermedad de Fabry varía dependiendo de la gravedad de la enfermedad de Fabry. Los pacientes con una forma grave de la enfermedad tienen niveles de a-galactosidasa A menores de aproximadamente un 1 % del nivel encontrado en un sujeto sano normal (denominado en el presente documento "un nivel normal"). Se ha descubierto que, cuando se usa el método de tratamiento descrito el presente documento, puede provocar un aumento en el nivel de a-galactosidasa A funcional de al menos aproximadamente un 1 % de los niveles normales. En algunas divulgaciones, el método de tratamiento de la invención provoca un aumento en el nivel de a-galactosidasa A funcional de al menos aproximadamente un 2 %, al menos aproximadamente un 3 %, al menos aproximadamente un 4 %, al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 % o al menos aproximadamente un 25 % de los niveles normales. En una divulgación particular, el método de tratamiento provoca un aumento en el nivel de a-galactosidasa A funcional de al menos aproximadamente un 30 % de los niveles normales.
En una divulgación, el método de tratamiento de la invención provoca un aumento en el nivel de a-galactosidasa A funcional hasta, como máximo, los niveles normales.
La actividad de a-galactosidasa A funcional puede medirse de una forma relativamente fácil y los expertos en la materia conocen bien los métodos para medir la actividad de a-galactosidasa A. La actividad de la a-galactosidasa se puede medir convenientemente en la sangre usando una mancha de sangre como se describe en Clin. Biochem. 45(15): 1233-8 (2012). El principio de este método es que a pH ácido, la a-galactosidasa hidroliza el sustrato, 4-metilumbeliferil-a-D-galactopiranósido, a 4-metilumbeliferona y galactosa. La adición de un tampón alcalino detiene la reacción enzimática y hace que la 4-metilumbeliferona emita fluorescencia a una longitud de onda diferente del sustrato no hidrolizado, permitiendo de este modo su medición en presencia de un gran exceso de sustrato no hidrolizado. En los leucocitos, habitualmente más del 95 % de la actividad total de la a-galactosidasa es a-galactosidasa A, mientras que en plasma y células cultivadas, la isoenzima, a-galactosidasa B puede contribuir significativamente a la actividad total de la a-galactosidasa, la a-galactosidasa A puede medirse en presencia de a-galactosidasa B haciendo uso del aumento de la termolabilidad de la isoenzima A y, en plasma, la a-galactosidasa B puede inhibirse mediante la adición de a-NAc galactosamina. Una ventaja clave de este método es que solo se requieren 5 ul de manchas de sangre completa seca en papel de filtro. Esto ofrece la ventaja de medir los niveles de a-galactosidasa en tiempo real a medida que el experimento en ratones Fabry Ko continúa después de la administración del vector.
Como alternativa, la actividad de a-galactosidasa A en plasma puede evaluarse en una hemorragia terminal en ratones después de la transferencia génica. Este método se basa en el hecho de que a pH ácido, la a-galactosidasa hidroliza el sustrato, 4-metilumbeliferil-a-D-galactopiranósido, a 4-metilumbeliferona y galactosa, como anteriormente. Además, la a-galactosidasa también se puede medir usando un ensayo de transferencia de Western estándar o inmunoensayos estándar (de tipo ELISA) que muestran niveles de antígeno.
Además, la invención proporciona la molécula de ácido nucleico que codifica una proteína a-galactosidasa A funcional como se ha descrito anteriormente, o un vector como se ha descrito anteriormente para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de la enfermedad de Fabry.
Además, la divulgación proporciona el uso de la molécula de ácido nucleico que codifica una proteína a-galactosidasa A funcional como se ha descrito anteriormente, o un vector como se ha descrito anteriormente en la fabricación de un medicamento para tratar la enfermedad de Fabry.
La divulgación también proporciona un método para la liberación de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína a-galactosidasa A funcional a un sujeto, método que comprende administrar a dicho sujeto una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína a-galactosidasa A funcional como se ha descrito anteriormente o un vector como se ha descrito anteriormente.
En la descripción anterior, el término "identidad" se usa para hacer referencia a la similitud de dos secuencias. para los fines de esta invención, en el presente documento se define que, para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de nucleótidos, las secuencias se alinean con fines de una comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en la secuencia de una primera secuencia de ácido nucleico para un alineamiento óptimo con una segunda secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico). Después se comparan los restos de nucleótido en las posiciones de nucleótidos. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo resto de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. La identidad porcentual entre las dos secuencias está en función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, identidad % = número de posiciones idénticas/número de posiciones total (es decir, posiciones solapantes) x 100). Preferentemente, las dos secuencias tienen la misma longitud.
Puede realizarse una comparación de secuencias a lo largo de las longitudes enteras de las dos secuencias que se están comparando o sobre fragmentos de las dos secuencias. Típicamente, la comparación se realizará sobre toda la longitud de las dos secuencias que se están comparando. Sin embargo, la identidad de la secuencia puede realizarse sobre una región de, por ejemplo, aproximadamente veinte, aproximadamente cincuenta, aproximadamente cien, aproximadamente doscientos, aproximadamente quinientos, aproximadamente 1000 o aproximadamente 2000 o más restos de ácido nucleico contiguos.
El experto en la materia será consciente del hecho de que se dispone de varios programas informáticos diferentes para determinar la homología o la identidad entre dos secuencias. En realizaciones preferidas, la identidad entre dos secuencias se analiza usando el paquete de software Clone Manager Professional versión 9 (preferentemente, versión 9.4). Esta herramienta de análisis es producida por Sci-Ed Software (Scientific & Educational Software, 11010 Lake Grove Blvd, Ste 100, PMB 122, Morrisville, NC 27560, EE. UU. - http://www.scied.com/index.htm). La configuración usada para comparar las secuencias es preferentemente la siguientes: alineamiento: alineamiento global del ADN; parámetros: ambas hebras; matriz de puntuación: lineal (emparejamiento erróneo 2, OpenGap 4, ExtGap 1). Como alternativa, los siguientes métodos, tales como Fast Scan -MaxScore y Fast Scan MaxQual, también se pueden usar con el mismo software usando la configuración local.
También se pueden usar otros métodos para determinar la identidad de secuencia. Por ejemplo, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o de ácido nucleico se puede determinar usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software Accelrys GCG (disponible en http://www.accelrys.com/products/gcg/), usando una matriz Blosum 62 o una matriz PAM250, y un "gap weight" (penalización por creación de hueco) de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y una "length weight" (penalización por extensión de hueco) de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
Un experto en la materia apreciará que todos los aspectos de la invención, estén relacionados con, por ejemplo, el ácido nucleico, el vector, la célula hospedadora o el uso, son igualmente aplicables a todos los demás aspectos de la invención. En particular, ciertos aspectos del método de tratamiento, por ejemplo, la administración del ácido nucleico o vector, pueden haberse descrito con más detalle que en algunos de los otros aspectos, por ejemplo, en relación con el uso del ácido nucleico o vector para tratar la enfermedad de Fabry. Sin embargo, el experto en la materia apreciará cuando se ha proporcionado más información detallada para un aspecto particular de la invención que, esta información es, en general, igualmente aplicable a otros aspectos de la invención. Además, el experto en la materia también apreciará que la descripción en relación con el método de tratamiento es igualmente aplicable al uso del ácido nucleico o vector en el tratamiento de la enfermedad de Fabry.
Descripción detallada de la invención
La invención se describirá ahora con más detalle a modo de ejemplo con referencia a las figuras en las que:
La figura 1 muestra un análisis en gel alcalino que ilustra que los vectores scAAV8 que expresan la a-galactosidasa A de tipo silvestre (wt) (carril izquierdo al lado de la escalera) y a-galactosidasa A con optimización de codones (codop) (carril derecho) están ambos completamente empaquetados, sin genomas parciales detectables. Estos vectores fueron seudotipificados con la cápsida del serotipo 8 en la que el gen de a-galactosidasa A wt o con optimización de codones estaba bajo el control de un promotor HLP específico del hígado.
La figura 2 ilustra que un vector scAAV que comprende a-galactosidasa A con optimización de codones (scAAV-GLA-codop), cuando se transduce en células de carcinoma hepático HUH7 a una multiplicidad de infección (MOI) de 1x107 gv/célula, no afecta a los niveles endógenos de transcrito de a-galactosidasa A (panel superior izquierdo), pero expresa altos niveles de ARNm de a-galactosidasa con optimización de codones (panel superior derecho). scAAV-GLA-codop se transdujo en células HUH7 a MOI crecientes, causando una expresión creciente y específica de dosis del transcrito de a-galactosidasa A (panel inferior).
La figura 3 ilustra que los vectores scAAV que expresan a-galactosidasa A (a-gal A) de tipo silvestre (WT-GLA) y con optimización de codones (codop-GLA) se usaron para transducir células HUH7 por duplicado. Se muestra que el vector GLA-codop media una expresión más alta de la proteína GLA.
La figura 4 muestra la actividad de la a-galactosidasa A en ratones Fabry adultos (de 3 meses de edad) o en ratones recién nacidos de 1 semana, 2 semanas o 3 semanas, después de una inyección en la vena de la cola en embolada única de 4e10 gv/ratón (=~2x1012 gv/kg) o 4e11 gv/ratón (=~2x1013 gv/kg) de scAAV-GLA-codop seudotipificado con AAV8. Las actividades se determinaron a los 3 meses después de la transferencia génica cuando se espera que la expresión del transgén haya alcanzado su máximo. Los datos se recopilaron en el momento de una hemorragia terminal (niveles plasmáticos).
La figura 5 muestra la actividad de la a-galactosidasa A en ratones Fabry adultos (de 3 meses de edad) o en ratones recién nacidos de 1 semana, 2 semanas o 1 mes, después de una inyección en la vena de la cola en embolada única de 4e10 gv/ratón (=~2x1012 gv/kg) o 4e11 gv/ratón (=~2x1013 gv/kg) de scAAV-GLA-codop seudotipificado con AAV8. Las actividades se determinaron a los 3 meses después de la transferencia génica cuando se espera que la expresión del transgén haya alcanzado su máximo. Los datos se recopilaron en "tiempo real" usando manchas de sangre.
La figura 6 muestra el análisis por transferencia Western de hígado de animales transducidos. La a-galactosidasa A se expresó a un nivel alto después de la transducción con una dosis de 4e11 gv/ratón pero no después de la transducción con una dosis de 4e10 gv/ratón.
La figura 7 muestra el análisis por transferencia Western de la expresión de a-galactosidasa A en riñón, glóbulos blancos (GB) y corazón de animales transducidos.
La figura 8 muestra las microfotografías electrónicas de depósitos de glucoesfingolípidos en los riñones de ratones con inactivación para a-GLA después de inyección i.p. en fase temprana de vector. A) no tratados, B) ratones tratados con AAV a la edad de una semana con dosis bajas (2e12 gv/kg) y C) dosis altas (2e13 gv/kg). Los ratones tratados se sacrificaron 5 meses después de la inyección i.p. (aumentos: x5000 y x2000).
La figura 9 muestra las microfotografías electrónicas de depósitos de glucoesfingolípidos en los riñones de ratones con inactivación para a-GLA después de inyección i.p. en fase intermedia de vector. A) no tratados, B) ratones tratados con AAV a la edad de 3 semanas con dosis bajas (2e12 gv/kg) y C) dosis altas (2e13 gv/kg). Los ratones tratados se sacrificaron un mes después de la inyección i.p. (aumentos: x5000 y x2000).
La figura 10 muestra las microfotografías electrónicas de depósitos de glucoesfingolípidos en los riñones de ratones con inactivación para a-GLA después de inyección i.v. en fase intermedia de vector. A) no tratados, B) ratones tratados con AAV a la edad de un mes con dosis bajas (2e12 gv/kg) y C) dosis altas (2e13 gv/kg). Los ratones tratados se sacrificaron 10 meses después de la inyección i.v. (aumentos: x5000, x2000 y x200).
La figura 11 muestra las microfotografías electrónicas de depósitos de glucoesfingolípidos en los riñones de ratones con inactivación para a-GLA después de inyección i.v. en fase tardía de vector. A) no tratados, B) ratones tratados con AAV a la edad de 3 meses con dosis bajas (2e12 gv/kg) y C) dosis altas (2e13 gv/kg). Los ratones tratados se sacrificaron 13 meses después de la inyección i.v. (aumentos: x5000, x2000 y x200).
Sumario
El objetivo primordial del programa de investigación de los inventores es establecer una cura para la enfermedad de Fabry que sea segura, efectiva y ampliamente disponible. En pos de este objetivo, los inventores han desarrollado un enfoque de transferencia génica de AAV dirigida al hígado con una secuencia única de a-galactosidasa A con optimización de codones.
Las ventajas de la presente invención son que:
1. Una sola infusión en vena periférica de AAV que codifica a-galactosidasa A puede dar como resultado la expresión a largo plazo de a-galactosidasa A en pacientes con enfermedad de Fabry. La expresión estable a largo plazo de la a-galactosidasa A después de la transferencia génica mediada por AAV, servirá para:
a. ejercer un beneficio clínico más pronunciado de lo que es posible con la terapia enzimática sustitutiva (TES), lo que mejora las posibilidades de prevenir el daño al órgano terminal y mejora la esperanza de vida de los pacientes con enfermedad de Fabry;
b. eliminar la necesidad de una infusión regular de por vida de a-galactosidasa A, mejorando de este modo la calidad de vida; y
c. dar como resultado un ahorro potencial para el Servicio Nacional de salud a partir de una reducción/eliminación de la necesidad de costosas TES
2. Expresión más potente del casete de expresión con optimización de codones que da como resultado un beneficio terapéutico del uso de dosis más bajas del vector AAV
3. Niveles plasmáticos superiores continuos de a-galactosidasa A después de la transferencia génica mediada por AAV y, por tanto, mejores perspectivas de corrección de la patología dentro del sistema nervioso central y 4. La expresión de la a-galactosidasa A en el hígado reducirá el riesgo de desarrollar anticuerpos neutralizantes para esta proteína, lo cual ocurre entre el 55-88 % de los pacientes después de la TES.
Los inventores han observado que la transferencia génica mediada por scAAV8 en ratones de modelo de Fabry adultos (de 3 meses de edad) y recién nacidos (de 2 días de edad) da como resultado niveles de a-gal A que son sustancialmente más altos que los niveles fisiológicos asociados con la captación de esta enzima en los órganos principales, aumentando de este modo la posibilidad de mejorar el fenotipo de la enfermedad en pacientes con enfermedad de Fabry. No se han observado respuestas inmunológicas a la proteína después de la expresión transgénica mediada por el hígado, incluso en animales que recibieron el vector a una edad temprana y, en consecuencia, tenían niveles bajos de expresión de a-gal A, lo que, de la forma más probable, refleja la pérdida del genoma del vector AAV mantenido episómicamente a medida que el hígado continúa creciendo hasta alcanzar el tamaño adulto.
Materiales y métodos
Los vectores scAAV8 que expresan a-galactosidasa A de tipo silvestre (WT-GLA) y con optimización de codones (codop-GLA) se transdujeron en células HUH7, una línea celular de carcinoma hepático para evaluar la potencia. En resumen, las células HUH7 cultivadas en DMEM con FBS al 10 % y sembradas en placas a 5X104 células por pocillo en una placa de cultivo de 6 pocilios se lavaron dos veces con medio OPTIMEM (Life Technologies) y a continuación se transdujeron con vector de AAV. Después de 72 horas, las células se recogieron para la extracción de ADN, ARN o proteína. La extracción de ADN se realizó usando un kit de tejido y sangre DNEasy (Qiagen), y se calculó el número de copias del genoma usando un método de QPCR y cebadores específicos del transgén, así como un gen de mantenimiento celular (GAPDH o beta-actina de ratón o ser humano). Se configuró una curva patrón durante QPCR que permitió el cálculo del número de copias del genoma del vector de AAV. El número de copias del genoma del hospedador se calculó determinando la concentración de ADN genómico después de la extracción, y suponiendo que el contenido de ADN de cada célula era 6,6 pg. Dividiendo estos dos valores, se calculó la copia del genoma del vector por célula hospedadora. La extracción de ARN se realizó usando Trizol (Life Technologies) y se llevó a cabo usando las instrucciones del fabricante, y el ADNc generado usando Superscript II (Life Technologies). La QRTPCR se realizó usando cebadores específicos para la forma endógena o con optimización de codones de a-galactosidasa A. Para la transferencia de Western, las células se extrajeron en tampón RIPA con proteasa y se añadieron inhibidores de fosfatasa (Sigma-Aldrich).
Análisis por microscopía electrónica
La ultraestructura del parénquima renal de ratón se evaluó mediante microscopía electrónica de alta resolución en diversos puntos temporales después de la transferencia génica de la a-galactosidasa A con optimización de codones. El vector se administró a una dosis baja (2e12 gv/kg) o a una dosis alta (2e13 gv/kg).
Figure imgf000011_0001
Los ratones fueron sacrificados en diversos puntos temporales después de la transferencia génica. Los riñones se extirparon y se fijaron en formalina tamponada neutra al 1o %, la solución de metil-Carnoy y los bloques pequeños se fijaron con glutaraldehído al 2,5 % y paraformaldehído al 2 %, seguidos de una fijación posterior en tetróxido de osmio al 1 %, y se incluyeron en Epon usando un procedimiento estándar. Los bloques incluidos en Epon se cortaron a 80 nm con una cuchilla de diamante. A continuación, las secciones ultrafinas se tiñeron doblemente con acetato de uranilo y citrato de plomo para microscopía electrónica. Las mismas caras del bloque se cortaron a 1 pm con una cuchilla de zafiro sustituyendo a una cuchilla de diamante. Las secciones se examinaron en un microscopio electrónico H-7650.
Resultados
Una evaluación inicial ha mostrado que la transducción de hepatocitos con un vector de AAV que codifica agalactosidasa A con optimización de codones bajo el control de un promotor específico del hígado dio como resultado la expresión de a-galactosidasa A transgénica a un nivel 4 veces mayor que el observado con una construcción idéntica que contiene ADNc de a-galactosidasa de tipo silvestre, lo que resultó inesperado basándose la técnica anterior (figuras 2 y 3).
Los ratones de modelo de Fabry se criaron a partir de ratones C57BL/6 macho hemicigóticos (0/-) y ratones hembra homocigóticos (-/-) obtenidos de Kulkarni (T. Ohshima et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 94 (l997) ), págs. 2540­ 2544). Los ratones Fabry adultos (de 3 meses de edad) recibieron una única inyección en embolada en la vena caudal de 4e10 gv/ratón (=~2x1012 gv/kg) o 4e11 gv/ratón (=~2x1013 gv/kg) de scAAV-GLA-codop seudotipificado con AAV8 basándose en un ensayo de PCR y ensayos de cuantificación basados en gel validados. A los ratones recién nacidos de 1 semana, 2 semanas o 3 semanas se les administró la misma dosis de vector, que se inyectó por vía intraperitoneal. Las muestras de sangre se recogieron de la vena caudal cada 2 semanas a partir de ese momento. Las actividades de la a-galactosidasa A se determinaron mediante un ensayo funcional como se ha descrito anteriormente en el momento de una hemorragia terminal (niveles plasmáticos) que se realizó a los 3 meses de la transferencia génica cuando se espera que la expresión del transgén haya alcanzado su máximo (figura 4). El nivel de actividad de a-galactosidasa A también se evaluó en "tiempo real" usando el método de las manchas de sangre (figura 5), ya que esto requiere volúmenes de muestras más pequeños (habitualmente 20 pl de sangre).
Se observó un alto nivel de a-galactosidasa A activa funcional en todas las cohortes (N=4 animales/grupo) de ratones, independientemente de si el vector se administró en ratones adultos (3 meses = 3M) o en el período postnatal temprano entre las semanas 1-3 (inyección en embolada única a 1W, 2W, 3W). Los niveles de actividad fueron mayores en los animales que recibieron 2x1012 gv/kg de vector a los 3 meses con una media ± SD = 544 nmol/h/ml. Los niveles en los animales inyectados con la misma dosis de vector, pero 1 semana después del nacimiento fueron 7 veces más bajos a 80 nmol/h/ml. Esto es casi 4 veces mayor que los niveles normales en seres humanos, que tiene un intervalo de 4,0-21,9 nmol/h/ml. En los ratones Fabry homocigotos, se observaron niveles de actividad de 0-0,9 nmol/h/ml,

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos con optimización de codones que codifica una proteína a-galactosidasa A funcional en la que la secuencia de nucleótidos tiene al menos un 95 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO. 1, en la que los codones de la secuencia de nucleótidos se han seleccionado basándose en los codones usados para las proteínas que se expresan a un alto nivel en el hígado.
2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que la secuencia de nucleótidos tiene al menos un 98 % o un 99 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO. 1.
3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la secuencia de nucleótidos tiene la secuencia de la SEQ ID NO. 1.
4. Un vector para expresar la proteína a-galactosidasa A, comprendiendo el vector la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. El vector de la reivindicación 4, que comprende además un promotor específico del hígado.
6. El vector de la reivindicación 4 o la reivindicación 5, en el que el vector es un vector de AAV.
7. El vector de cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en el que el vector es un vector monocatenario.
8. El vector de cualquiera de las reivindicaciones 4-7, en el que el vector comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO. 3.
9. El vector de cualquiera de las reivindicaciones 4-8, en el que el vector comprende una secuencia de nucleótidos que tiene la secuencia de la SEQ ID NO. 3.
10. Una célula hospedadora que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 4-9.
11. Un animal transgénico no humano que comprende células que comprenden la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 4-9.
12. Una composición farmacéutica que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 4-9, y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
13. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 4-9 para su uso en un método de tratamiento de la enfermedad de Fabry que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la molécula de ácido nucleico o el vector a un paciente que padece la enfermedad de Fabry.
14. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 4-9 para su uso en terapia.
15. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 4-9 para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Fabry.
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