ES2796301T3 - Nuevo péptido con cuatro epítopos CTL unidos - Google Patents

Abstract

Un péptido que consiste en 4 epítopos unidos, en el que los 4 péptidos de epítopo se seleccionan del grupo que consiste en los péptidos de epítopo CTL: el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 1 (PEP1); el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 2 (PEP2); el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 4 (PEP4); el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 5 (PEP5); el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 6 (PEP6); el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 7 (PEP7); el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 8 (PEP8); el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 9 (PEP9); el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: (PEP10); el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 13 (PEP13); el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 15 (PEP15); el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 17 (PEP17); y el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 18 (PEP18), unidos a través de engarces, el péptido que consiste en 4 epítopos unidos opcionalmente comprende otras secuencias 10 peptídicas que consisten en aminoácidos hidrófilos, y el péptido que consiste en 4 epítopos unidos tiene una o más características seleccionadas de las siguientes características (1) a (5): (1) el péptido comprende 3 péptidos de epítopo CTL seleccionados entre PEP1, PEP7, PEP8 y PEP13, y en el que PEP2 está dispuesto en el extremo C del péptido, excepto el péptido que comprende PEP7 y PEP8 en el extremo N dispuestos sucesivamente en tal orden desde el extremo N a través de un engarce; (2) el péptido comprende PEP4 en el extremo C; (3) el péptido comprende 3 péptidos de epítopo CTL seleccionados entre PEP1, PEP13, PEP15, PEP17 y PEP18, y en el que PEP10 está dispuesto en el extremo C del péptido; (4) el péptido comprende 2 péptidos de epítopo CTL, PEP1 y PEP7, y en el que PEP6 y PEP5 están dispuestos sucesivamente en el extremo C en tal orden desde el extremo N a través de un engarce; y (5) el péptido comprende 3 péptidos de epítopo CTL, PEP5, PEP6 y PEP18, y en el que PEP9 está dispuesto en el extremo C del péptido.

Description

DESCRIPCIÓN

Nuevo péptido con cuatro epítopos CTL unidos

Campo técnico

La presente invención se refiere a un nuevo péptido que es útil como péptido antigénico para el cáncer. De manera más particular, la presente invención se refiere a un nuevo péptido antigénico para el cáncer que tiene 4 péptidos unidos capaces de inducir respuestas CTL restringidas por HLA-A y a una composición farmacéutica que utiliza el mismo.

Técnica antecedente

El cáncer es la principal causa de muerte en Japón. Aproximadamente 350.000 pacientes mueren de cáncer cada año, y el cáncer sigue siendo una enfermedad grave hoy en día. Los enfoques de tratamiento para el cáncer que se han establecido son la resección quirúrgica, el tratamiento farmacológico contra el cáncer y la radioterapia. Sin embargo, tales estrategias de tratamiento son problemáticas en términos de, por ejemplo, recidiva, disminución de la calidad de vida (CV) y falta de opciones de tratamiento en el caso de cánceres en estadio avanzado que no pueden tratarse con las estrategias descritas anteriormente.

Durante un largo período de tiempo la inmunoterapia del cáncer (vacunas para el cáncer) se previó como una técnica terapéutica nueva, y los estudios clínicos sobre vacunas peptídicas para el cáncer se iniciaron en todo el mundo en 1990, cuando se identificaron péptidos de epítopos en antígenos tumorales humanos. Sin embargo, de acuerdo con los resultados del análisis de estudios clínicos realizados mediante la administración de un péptido solo o en combinación con otros agentes, la tasa de respuesta es tan baja como del 2,7 % entre 1.000 o más casos (Rosenberg SA y col., Nature Med., 2004, 10 (9): 909-15). Por lo tanto, se ha señalado la dificultad en la aplicación práctica.

Por otra parte, los estudios clínicos que implican el uso de vacunas peptídicas particulares para el cáncer han estado en marcha durante un largo período de tiempo en Japón, y los logros de tales estudios se han articulado de manera gradual. En los últimos años, se ha intentado una estrategia de administración de múltiples péptidos de cáncer en lugar de un solo tipo de péptido de cáncer, con el objetivo de mejorar el resultado del tratamiento. Por ejemplo, el tipo de HLA y las respuestas inmunitarias específicas de un paciente se examinan de antemano, para implementar un tratamiento del cáncer a medida utilizando vacunas peptídicas que comprende seleccionar múltiples péptidos adecuados a administrar y de las que se ha verificado los efectos antitumorales y de seguridad. Mediante la administración de vacunas peptídicas a medida solas o en combinación con fármacos contra el cáncer, más específicamente, se han logrado excelentes efectos clínicos y seguridad en los casos de tumor cerebral, cáncer de cuello uterino, cáncer de próstata y cáncer de páncreas (Terasaki, M. y col., J. Clin. Oncol., 2011, 29 (3): 337-44; Noguchi, M. y col., Cancer Immunol. Immunother., 2010, 59 (7): 1001-9; Yanagimoto, H. y col., Cancer Sci., 2007, 98 (4): 605-11).

La inmunidad celular que consiste en linfocitos T citotóxicos específicos de epítopo (en lo sucesivo en el presente documento, abreviado como "CTL"), que se consideran las principales células efectoras en el tratamiento del cáncer con vacunas peptídicas, es restrictivo por HLA. Por consiguiente, se ha intentado el desarrollo de vacunas peptídicas para el cáncer dirigidas exclusivamente a pacientes con un tipo particular de HLA, en concreto el tipo HLA-A2 o HLA-A24, debido al gran número de pacientes con los mismos.

Sin embargo, los japoneses con tales dos tipos de HLA representan aproximadamente el 40 % y el 60 %, respectivamente (Sette, A. y col., Immunogenetics, 1999, 50 (3-4): 201-12). De forma desventajosa, los pacientes con otros tipos de HLA no pueden obtener beneficios de las vacunas peptídicas para el cáncer. Además, el momento de inicio del tratamiento se pospondría debido al tipado de HLA realizado antes del inicio del tratamiento, y aumentaría la carga sobre los pacientes. Por consiguiente, es conveniente la investigación y el desarrollo de vacunas peptídicas para el cáncer que sean aplicables a todos los pacientes con cáncer sin tipado de HLA.

Con respecto al tratamiento del cáncer con vacunas peptídicas, además de las activaciones de los CTL como una de las inmunidades celulares, las inducciones de la producción de inmunoglobulinas, conocidas como inmunidad humoral, se sabe que son atribuibles al beneficio de supervivencia (Noguchi, M. y col., Cancer Biol. Ther., 2011, 10 (12):1266-79).

El documento EP 2966092 A1 desvela un péptido de antígeno de cáncer que tiene 5 epítopos CTL unidos para el tratamiento del cáncer. El documento US 2007/055049 A1 se refiere a péptidos inmunogénicos que se unen específicamente a glucoproteínas codificadas por alelos del HLA y que inducen la activación de linfocitos T útiles para suscitar una respuesta inmunitaria contra un antígeno deseado. Los documentos EP 2192407 A2 y EP 1767541 A1, Liao y col. (2013), Internat Immunopharmacol 16:444 y van der Burg y col. (2006), Adv Drug Deliv Rev 58:916 desvelan péptidos para vacunas para el cáncer.

Sumario de la invención

Objetos a lograr mediante la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar un péptido antigénico de cáncer que pueda administrarse como una vacuna peptídica para el cáncer a una amplia diversidad de pacientes con cáncer y que pueda inducir inmunoglobulinas de forma sólida, independientemente de los tipos de HLA de los pacientes.

Medios para lograr los objetos

Los presentes inventores obtuvieron un péptido que tiene 4 epítopos de CTL unidos mediante la unión, a través de engarces, de 4 péptidos seleccionados entre los péptidos de epítopo CTL informados como capaces de inducir una respuesta de c Tl restringida a supertipo HLA-A2, HLA-A24, HLA-A26 o HLA-A3 o una pluralidad de respuestas de CTL restringidas a HLA-A. Los presentes inventores han realizado estudios centrados en tal péptido que tiene 4 epítopos de CTL unidos para lograr los objetos anteriores. Como resultado, descubrieron que un péptido que tiene 4 epítopos de CTL unidos compuestos por 13 tipos particulares de péptidos seleccionados entre péptidos de epítopo de CTL procedentes de moléculas de antígenos tumorales conocidos podría administrarse a una amplia diversidad de pacientes con cáncer sin la necesidad de tipado de HLA e independientemente de los tipos de HLA de pacientes. Además, descubrieron que la administración de tal péptido que tiene 4 epítopos de CTL unidos podría inducir inmunoglobulinas de forma sólida, además de CTL específicos para los péptidos de epítopos CTL que componen tal péptido. Esto ha llevado a la finalización de la presente invención.

En concreto, la presente invención tiene las características especificadas en las reivindicaciones. Una divulgación adicional se refiere a:

[1] Un péptido que tiene 4 epítopos unidos, en el que los 4 péptidos de epítopo se seleccionan, opcionalmente de manera redundante, del grupo que consiste en péptidos de epítopo CTL: el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 1 (PEP1); el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 2 (PEP2); el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 4 (PEP4); el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 5 (PEP5); el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 6 (PEP6); el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 7 (PEP7); el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 8 (PEP8); el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 9 (PEP9); el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 10 (PEP10); el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 13 (PEP13); el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 15 (p Ep 15); el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 17 (PEP17); y el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 18 (PEP18), unidos a través de engarces, el péptido que tiene 4 epítopos unidos opcionalmente comprende otras secuencias peptídicas que consisten en aminoácidos hidrófilos, y el péptido que tiene 4 epítopos unidos tiene una o más características seleccionadas de las siguientes características (1) a (5):

(1) el péptido comprende PEP2 en el extremo C (excepto el péptido que comprende PEP7 y PEP8 en el extremo N dispuestos sucesivamente en ese orden desde el extremo N a través de un engarce);

(2) el péptido comprende PEP4 en el extremo C;

(3) el péptido comprende PEP10 en el extremo C;

(4) el péptido comprende PEP6 y PEP5 en el extremo C dispuestos sucesivamente en ese orden desde el extremo N a través de un engarce; y

(5) el péptido comprende PEP5, PEP6, PEP9 y PEP18.

[2] El péptido que tiene 4 epítopos unidos de acuerdo con [1], que comprende 4 péptidos no redundantes seleccionados entre PEP1, PEP2, PEP4, PEP5, PEP6, PEP7, PEP8, PEP9, PEP10, PEP13, PEP15, PEP17 y PEP18.

[3] El péptido que tiene 4 epítopos unidos de acuerdo con [1] o [2] que tiene una cualquiera de las características seleccionadas de las siguientes características (1) a (5):

(1) el péptido comprende 3 péptidos de epítopo CTL seleccionados entre PEP1, PEP7, PEP8 y PEP13, y PEP2 está dispuesto en el extremo C del péptido (excepto el péptido que comprende PEP7 y PEP8 en el extremo N dispuestos sucesivamente en tal orden desde el extremo N a través de un engarce);

(2) el péptido comprende 3 péptidos de epítopo CTL, PEP5, PEP6 y PEP9, y PEP4 está dispuesto en el extremo C del péptido;

(3) el péptido comprende 3 péptidos de epítopo CTL seleccionados entre PEP1, PEP13, PEP15, PEP17 y PEP18, y PEP10 está dispuesto en el extremo C del péptido;

(4) el péptido comprende 2 péptidos de epítopo CTL, PEP1 y PEP7, y PEP6 y PEP5 están dispuestos sucesivamente en el extremo C en tal orden desde el extremo N a través de un engarce; y

(5) el péptido comprende 3 péptidos de epítopo CTL, PEP5, PEP6 y PEP18, y PEP9 está dispuesto en el extremo C del péptido.

[4] El péptido que tiene 4 epítopos unidos de acuerdo con cualquiera de [1] a [3], que comprende una secuencia seleccionada de las siguientes secuencias, en las que "-(L)-" representa un engarce:

- PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP4;

- PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP4;

- PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP4;

- PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP4;

- PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP4;

- PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP4;

- PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP8-(L)-PEP2;

- PEP1-(L)-PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP2;

- PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP8-(L)-PEP2;

- PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP2;

- PEP8-(L)-PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP2;

- PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP2;

- PEP8-(L)-PEP13-(L)-PEP7-(L)-PEP2;

- PEP13-(L)-PEP7-(L)-PEP8-(L)-PEP2;

- PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP2;

- PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP2;

- PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP10

- PEP13-(L)-PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP10

- PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP18-(L)-PEP10

- PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP13-(L)-PEP10

- PEP18-(L)-PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP10

- PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP10

- PEP1-(L)-PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP10;

- PEP1-(L)-PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP10;

- PEP15-(L)-PEP1-(L)-PEP18-(L)-PEP10;

- PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP10;

- PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP15-(L)-PEP10;

- PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP1-(L)-PEP10;

- PEP15-(L)-PEP17-(L)-PEP13-(L)-PEP10

- PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP17-(L)-PEP10

- PEP17-(L)-PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP10

- PEP17-(L)-PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP10

- PEP13-(L)-PEP17-(L)-PEP15-(L)-PEP10

- PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP17-(L)-PEP10

- PEP6-(L)-PEP18-(L)-PEP5-(L)-PEP9;

- PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP18-(L)-PEP9;

- PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP6-(L)-PEP5; y

- PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP6-(L)-PEP5.

[5] El péptido que tiene 4 epítopos unidos de acuerdo con cualquiera de [1] a [4], en el que el engarce es un engarce aminoacídico.

[6] El péptido que tiene 4 epítopos unidos de acuerdo con cualquiera de [1] a [5], en el que el engarce aminoacídico es un dímero de arginina o un trímero de arginina compuesto por dos o tres restos de arginina unidos entre sí.

[7] El péptido que tiene 4 epítopos unidos de acuerdo con cualquiera de [1] a [6], en el que la otra secuencia peptídica que consiste en aminoácidos hidrófilos está unida al extremo N.

[8] El péptido que tiene 4 epítopos unidos de acuerdo con cualquiera de [1] a [7], en el que la otra secuencia peptídica que consiste en aminoácidos hidrófilos está compuesta por un trímero de arginina o un tetrámero de arginina compuesto por tres o cuatro restos de arginina unidos entre sí.

[9] El péptido que tiene 4 epítopos unidos de acuerdo con cualquiera de [1] a [8], que consiste en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 22, SEQ ID No : 23, SEQ ID n O: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65 o SEQ ID NO: 66.

[10] Un CTL obtenido estimulando linfocitos de sangre periférica utilizando el péptido que tiene 4 epítopos unidos de acuerdo con cualquiera de [1] a [9].

[11] Una composición farmacéutica que comprende, como principio activo, el péptido que tiene 4 epítopos unidos de acuerdo con cualquiera de [1] a [9] o el CTL de acuerdo con [10].

[12] Una composición farmacéutica que comprende dos o más péptidos seleccionados entre los péptidos que tienen 4 epítopos unidos de acuerdo con cualquiera de [1] a [9].

[13] La composición farmacéutica de acuerdo con [11] o [12], que es un agente inmunoterapéutico.

[14] Un procedimiento para el tratamiento del cáncer que comprende administrar el péptido que tiene 4 epítopos unidos de acuerdo con cualquiera de [1] a [9], el CTL de acuerdo con [10] o la composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de [11] a [13] a un paciente con cáncer.

Las Solicitudes de Patente Japonesas N.° 2013-218524 y 2014-155132 son documentos de prioridad de la presente solicitud.

Efectos de la invención

La presente invención puede proporcionar un péptido antígeno de cáncer que puede administrarse a una amplia diversidad de pacientes con cáncer como una vacuna peptídica para el cáncer y que puede inducir inmunoglobulinas de forma sólida, independientemente de los tipos de HLA de los pacientes.

El péptido que tiene 4 epítopos de CTL unidos de acuerdo con la presente invención puede administrarse a una amplia diversidad de pacientes con cáncer sin la necesidad de tipado de HLA. Los ejemplos de tales pacientes incluyen los que son pacientes positivos para HLA-A2, pacientes positivos para HLA-A24, pacientes positivos para HLA-A26 y pacientes positivos para supertipo HLA-A3. El péptido como se describió anteriormente puede utilizarse para el tratamiento y/o la prevención del cáncer o de enfermedades provocada de este modo de tales pacientes. Además, la expresión de los antígenos tumorales que constituyen el péptido que tiene 4 epítopos de CTL unidos de acuerdo con la presente invención se observa en una pluralidad de tipos de cánceres. Por consiguiente, el péptido que tiene 4 epítopos CTL unidos de acuerdo con la presente invención puede utilizarse como una composición farmacéutica (y más específicamente, como un agente inmunoterapéutico) para el tratamiento y/o la prevención de una diversidad de cánceres. Mediante la administración del péptido que tiene 4 epítopos unidos de acuerdo con la presente invención, además, se pueden inducir CTL específicos de péptidos de epítopo de CTL e inmunoglobulinas de manera más sólida, en comparación con la administración de una mezcla de una cantidad equivalente de péptidos de epítopo de CTL, y la inmunidad antitumoral se puede activar de manera más eficaz.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1-1 muestra los resultados de HPLC para los péptidos que tienen 4 epítopos unidos obtenidos en el Ejemplo 1 (TPV06, TPV10, TPV12, TPV21, TPV26, TPV30, TPV35, TPV37, TPV39, TPV40, TPV41, TPV43 y TPV45). La Fig. 1-2 es una continuación de la figura 1-1.

La Fig. 1-3 es una continuación de la figura 1-2.

La Fig. 1-4 es una continuación de la figura 1-3.

La Fig. 1-5 es una continuación de la figura 1-4.

La Fig. 1-6 es una continuación de la figura 1-5.

La Fig. 1-7 es una continuación de la figura 1-6.

La Fig. 2-1 muestra los resultados de espectrometría de masas (MS) para los péptidos que tienen 4 epítopos unidos obtenidos en el Ejemplo 1 (TPV39, TPV40, TPV41, TPV43 y TPV45).

La Fig. 2-2 es una continuación de la figura 2-1.

La Fig. 2-3 es una continuación de la figura 2-2.

La Fig. 3-1 muestra los resultados de la inducción de CTL específicos de epítopo en modelos de ratón a los que se ha administrado el péptido que tiene 4 epítopos unidos (*: no examinado). La Fig. 3-1 muestra además los resultados de la evaluación lograda escindiendo el péptido que tiene 4 epítopos unidos con inmunoproteasomas humanos e inspeccionando la escisión del extremo C del péptido de epítopo PEP2 o PEP10 identificado.

La Fig. 3-2 es una continuación de la figura 3-1.

La Fig. 3-3 es una continuación de la figura 3-2.

La Fig. 3-4 muestra los resultados de la inducción de CTL específicos de epítopo en modelos de ratón en los que se ha administrado el péptido que tiene 4 epítopos unidos que comprende una secuencia peptídica de restos de arginina en el extremo N o el péptido que tiene 4 epítopos unidos que comprende un trímero de arginina como un engarce péptido-péptido (*: no examinado). La Fig. 3-4 muestra además los resultados de la evaluación lograda escindiendo el péptido que tiene 4 epítopos unidos con inmunoproteasomas humanos e inspeccionando la escisión del extremo C del péptido de epítopo PEP2 o PEP10 identificado.

La Fig. 4-1 muestra los resultados del ensayo del título de anticuerpos IgG específicos de epítopo en sueros de modelos de ratón a los que se ha administrado el péptido que tiene 4 epítopos unidos.

La Fig. 4-2 es una continuación de la figura 4-1.

La Fig. 4-3 muestra los resultados del ensayo del título de anticuerpos IgG específicos de epítopo en sueros de modelos de ratón a los que se ha administrado el péptido que tiene 4 epítopos unidos que comprende una secuencia peptídica de restos de arginina en el extremo N o el péptido que tiene 4 epítopos unidos que comprende un trímero de arginina como un engarce péptido-péptido.

Realizaciones para llevar a cabo la invención

A continuación, la presente invención se describe con más detalle.

1. Péptido que tiene 4 epítopos de CTL unidos

En la presente invención, el "péptido que tiene 4 epítopos de CTL unidos" significa 4 péptidos seleccionados entre los péptidos de epítopo de CTL procedentes de la misma y/o de distintas moléculas de antígenos tumorales, unidas linealmente a través de engarces como una única molécula.

El "péptido de epítopo CTL procedente de moléculas de antígenos tumorales" es un péptido que es el resultado de la descomposición de antígenos tumorales dentro de las células tumorales, y está unido a la molécula de HLA de clase I y se presenta en la superficie celular. Por lo tanto, es reconocido por un CTL específico de tumor y/o puede inducir y/o activar CTL específicos de tumor. "Inducción de CTL específicos de tumor" se refiere a la diferenciación y/o proliferación de CTL que reconocen específicamente péptidos de epítopo de CTL procedentes de moléculas de antígenos tumorales in vitro o in vivo. Además, "activación de CTL específicos de tumor" se refiere a la producción de interferón-y ^{( I F N - y )} y/o la manifestación de actividad citotóxica mediante la liberación de sustancias citotóxicas o similares cuando el CTL reconoce un antígeno presentado por la molécula HLA de clase I. El "péptido de epítopo CTL procedente de una molécula de antígeno tumoral" utilizado en el presente documento se denomina ocasionalmente "péptido de epítopo CTL".

Como péptidos de epítopo CTL procedentes de moléculas de antígeno tumoral, se conocen los que se muestran a continuación:

PEP1: KLVERLGAA (SEQ ID NO: 1 [documento WO 2001/011044]);

PEP2: ASLDSDPWV (SEQ ID NO: 2 [documento WO 2002/010369]);

PEP3: ALVEFEDVL (SEQ ID NO: 3 [documento WO 2002/010369]);

PEP4: LLQAEAPRL (SEQ ID NO: 4 [documento WO 2000/12701]);

PEP5: DYSARWNEI (SEQ ID NO: 5 [documento JP H11-318455 A (1999)]);

PEP6: VYDYNCHVDL (SEQ ID NO: 6 [documento WO 2000/12701]);

PEP7: LYAWEPSFL (SEQ ID NO: 7 [documento JP 2000-000270A]);

PEP8: DYLRSVLEDF (SEQ ID NO: 8 [documento WO 2001/011044]);

PEP9: QIRPIFSNR (SEQ ID NO: 9 [documento WO 2008/007711]);

PEP10: ILEQSGEWWK (SEQ ID NO: 10 [documento WO 2009/022652]);

PEP11: VIQNLERGYR (SEQ ID NO: 11 [documento WO 2009/022652]);

PEP12: KLKHYGPGWV (SEQ ID NO: 12 [documento WO 1999/067288]);

PEP13: RLQEWCSVI (SEQ ID NO: 13 [documento WO 2002/010369]);

PEP14: ILGELREKV (SEQ ID NO: 14 [documento WO 2002/010369]);

PEP15: DYVREHKDNI (SEQ ID NO: 15 [documento WO 2005/071075]);

PEP16: HYTNASDGL (SEQ ID NO: 16 [documento WO 2001/011044]);

PEP17: NYSVRYRPGL (SEQ ID NO: 17 [documento JP 2000-000270 A]);

PEP18: RYLTQETNKV (SEQ ID NO: 18 [documento JP 2007-145715 A]); y

PEP19: TFDYLRSVL (SEQ ID NO: 19 [documento WO 2001/011044]).

PEP1, PEP2, PEP3, PEP4, PEP5, PEP8, PEP10, PEP12, PEP13, PEP14 y PEP15 están restringidos por HLA-A2 y los CTL pueden entonces inducirse y/o activarse. PEP2, PEP5, PEP6, ^{P E p 7 ,} PEP8, PEP12, PEP13, PEP15, PEP16, PEP17, PEP18 y PEP19 están restringidos por HLA-A24 y los CTL pueden entonces inducirse y/o activarse. PEP1, PEP2, PEP4, PEP5, PEP6, PEP9, PEP10, PEP11, PEP12, PEP13, PEP15 y PEP16 están restringidos por HLA-A3 y los CTL pueden entonces inducirse y/o activarse. Además, PEP2 y PEP6 están restringidos por HLA-A26 y los CTL pueden entonces inducirse y/o activarse. La expresión de genes que codifican tales péptidos de epítopo CTL se observa en una pluralidad de tipos de cáncer (Yang, D. y col., Cancer Res., 1999, 59: 4056-63; Harashima, N. y col., Eur. J. Immunol., 2001, 31 (2), 323-32).

Diversos tipos de péptidos que tienen 4 epítopos de CTL unidos que se obtienen uniendo linealmente 4 tipos de péptidos de epítopo de CTL seleccionados entre 13 tipos particulares de los péptidos de epítopo de CTL descritos anteriormente a través de engarces como una única molécula pueden servir como los "péptidos que tienen 4 epítopos de CTL unidos" de acuerdo con la presente invención. Se pueden inducir y/o activar tres o más CTL específicos para péptidos de epítopo de CTL de interés. Los péptidos que no pudieran evaluarse directamente en términos de inducción específica de péptido de epítopo CTL (es decir, PEP2 y PEp10) pueden someterse a un experimento de escisión con inmunoproteasomas (Ejemplo 3), para determinar la aparición de inducción de CTL específica de péptido de epítopo. En general, se sabe que las proteínas antigénicas que se incorporan en las células presentadoras de antígeno se escinden con proteasomas o inmunoproteasomas, y se sabe que tal procedimiento es indispensable para que las proteínas antigénicas incorporadas presenten antígenos mediados por HLA (por ejemplo, Rock ^{k L ,} York, I.A., Goldberg, A.L., Nat. Immunol., 2004, 5(7): 670-677). Es necesario que los péptidos de epítopo CTL se escindan en los sitios adecuados, para permitir que tales péptidos de epítopo se unan a los bolsillos de1 HLA. Es necesario determinar los aminoácidos C terminales de los péptidos de epítopo CTL como resultado de la escisión con proteasomas o inmunoproteasomas (Rock KL, York, I.A., Goldberg, A.L., Nat. Immunol., 2004, 5(7): 670-677). Se supuso que las células dendríticas presentarían los péptidos de epítopo CTL cuando los péptidos que tienen 4 epítopos unidos se administraran a seres humanos. Sobre la base de tal presunción, se analizaron in vitro los patrones de escisión de los péptidos que tienen 4 epítopos unidos utilizando inmunoproteasomas expresados en células dendríticas a niveles altos. Cuando los péptidos de epítopo CTL aparecen como resultado de la escisión con inmunoproteasomas, se puede determinar que se induce un CTL específico para tales péptidos de epítopo.

En la presente descripción, se seleccionan 4 tipos de péptidos de epítopo CTL seleccionados entre 13 tipos particulares de péptidos de epítopo CTL, opcionalmente de manera redundante, entre el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 1 (PEP1), el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 2 (PEP2), el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 4 (PEP4), el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 5 (PEP5), el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 6 (PEP6), el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 7 (PEP7), el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 8 (PEP8), el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 9 (PEp9), el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 10 (PEP10), el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 13 (PEP13), el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 15 (PEP15), el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 17 (PEP17) y el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 18 (PEP18).

En la presente invención, un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene la sustitución, inserción, deleción y/o adición de uno o de una pluralidad de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de PEP1, PEP2, PEP4, PEP5, PEP6, PEP7, PEP8, PEP9, PEP10, PEP13, PEP15, PEP17 o PEP18, y que tiene la capacidad de inducir CTL y la capacidad de inducir producciones de inmunoglobulinas equivalentes o superiores a las del péptido original, se puede utilizar como un "péptido de epítopo CTL". El término "pluralidad" utilizado en el presente documento se refiere a 1 a 3, y preferentemente a 1 o 2. Un ejemplo de tal péptido es un péptido obtenido por sustitución de aminoácidos que tienen propiedades similares a las del aminoácido original (es decir, un péptido obtenido por sustitución conservativa de aminoácidos).

El péptido que tiene 4 epítopos de CTL unidos de acuerdo con la presente invención comprende 4 péptidos de epítopo que se seleccionan, opcionalmente de manera redundante, entre PEP1, PEP2, PEP4, PEP5, PEP6, PEP7, PEP8, Pe P9, PEP10, PEP13, PEP15, PEP17 y PEP18, unidos linealmente a través de engarces.

Se puede utilizar cualquier engarce, con la condición de que se escinda tras la administración de un péptido que tiene 4 epítopos de CTL unidos a un organismo, y que los péptidos de epítopo CTL unidos se puedan separar entre sí. Los ejemplos del mismo incluyen un enlace éster, un enlace éter, un enlace amida, un engarce de cadena de azúcar, un engarce de polietilenglicol y un engarce aminoacídico. Los ejemplos de secuencias de aminoácidos utilizadas como engarces aminoacídicos incluyen un dímero de arginina, un trímero de arginina, un tetrámero de arginina, un dímero de lisina, un trímero de lisina, un tetrámero de lisina, un dímero de glicina, un trímero de glicina, un tetrámero de glicina, un pentámero de glicina, un hexámero de glicina, una alanina-alanina-tirosina (AAY), isoleucina-leucina-alanina (ILA) y arginina-valina-lisina-arginina (RVKR), siendo preferible un dímero o trímero de arginina.

Los péptidos de epítopo CTL a seleccionar y las disposiciones de los mismos se pueden determinar administrando un péptido que tiene 4 epítopos unidos obtenidos mediante la síntesis de epítopos en combinaciones dadas y en un orden dado, a ratones transgénicos para HLA-A humano y evaluando la presencia de inducción de CTL específicos para péptidos de epítopo CTL in vivo.

El péptido que tiene 4 epítopos unidos de acuerdo con la presente invención tiene las características que se especifican en la reivindicación 1. Una divulgación adicional se refiere a una o más características seleccionadas de las siguientes características (1) a (5):

(1) el péptido comprende PEP2 en el extremo C (excepto el péptido que comprende PEP7 y PEP8 en el extremo N dispuestos sucesivamente en ese orden desde el extremo N a través de un engarce);

(2) el péptido comprende PEP4 en el extremo C;

(3) el péptido comprende PEP10 en el extremo C;

(4) el péptido comprende PEP6 y PEP5 en el extremo C dispuestos sucesivamente en ese orden desde el extremo N a través de un engarce; y

(5) el péptido comprende PEP5, PEP6, PEP9 y PEP18.

Una divulgación adicional se refiere a una característica seleccionada de las siguientes características (1) a (5): (1) el péptido comprende 3 péptidos de epítopo CTL seleccionados entre PEP1, PEP7, PEP8 y PEP13 y, en el término C, PEP2 (excepto el péptido que comprende PEP7 y PEP8 en el extremo N dispuestos sucesivamente en tal orden desde el extremo N a través de un engarce);

(2) el péptido comprende 3 péptidos de epítopo CTL, PEP5, PEP6 y PEP9, y, en el término C, PEP4;

(3) el péptido comprende 3 péptidos de epítopo CTL seleccionados entre ^p E^p 1, PEP13, PEP15, PEP17 y PEP18 y, en el término C, PEP10;

(4) el péptido comprende 2 péptidos de epítopo CTL, PEP1 y PEP7, y PEP6 y PEP5 en el extremo C dispuestos sucesivamente en tal orden desde el extremo N a través de un engarce; y

(5) el péptido comprende 3 péptidos de epítopo CTL, PEP5, PEP6 y PEP18, y, en el término C, PEP9.

Una divulgación adicional se refiere a un péptido que tiene 4 epítopos unidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada entre las siguientes secuencias, en las que "-(L)-" representa un engarce:

- PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP4 (TPV01);

- PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP4 (TPV02);

- PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP4 (TPV03);

- PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP4 (TPV04);

- PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP4 (TPV05);

- PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP4 (TPV06);

- PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP8-(L)-PEP2 (TPV07);

- PEP1-(L)-PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP2 (TPV08);

- PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP8-(L)-PEP2 (TPV09);

- PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP2 (TPV10);

- PEP8-(L)-PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP2 (TPV11);

- PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP2 (TPV12);

- PEP8-(L)-PEP13-(L)-PEP7-(L)-PEP2 (TPV13);

- PEP13-(L)-PEP7-(L)-PEP8-(L)-PEP2 (TPV14);

- PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP2 (TPV15);

- PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP2 (TPV16);

- PEP 13-(L)-PEP 15-(L)-PEP 18-(L)-PEP 10 (TPV17);

- PEP13-(L)-PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP10 (TPV18);

- PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP18-(L)-PEP10 (TPV19);

- PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP13-(L)-PEP10 (TPV20);

- PEP18-(L)-PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP10 (TPV21);

- PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP10 (TPV22);

- PEP 1 -(L)-PEP1 5-(L)-PEP1 8-(L)-PEP10 (TPV23);

- PEP1-(L)-PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP10 (TPV24);

- PEP15-(L)-PEP1-(L)-PEP18-(L)-PEP10 (TPV25);

- PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP10 (TPV26);

- PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP15-(L)-PEP10 (TPV27);

- PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP1-(L)-PEP10 (TPV28);

- PEP15-(L)-PEP17-(L)-PEP13-(L)-PEP10 (TPV29);

- PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP17-(L)-PEP10 (TPV30);

- PEP17-(L)-PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP10 (TPV31);

- PEP17-(L)-PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP10 (TPV32);

- PEP13-(L)-PEP17-(L)-PEP15-(L)-PEP10 (TPV33);

- PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP17-(L)-PEP10 (TPV34);

- PEP6-(L)-PEP18-(L)-PEP5-(L)-PEP9 (TPV35);

- PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP18-(L)-PEP9 (TPV36);

- PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP6-(L)-PEP5 (TPV37); y

- PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP6-(L)-PEP5 (TPV38).

El péptido que tiene 4 epítopos CTL unidos de acuerdo con la presente invención puede comprender además una secuencia peptídica que consiste en aminoácidos hidrófilos. Dicha secuencia peptídica se añadir al extremo N y/o al extremo C del péptido que tiene 4 epítopos de CTL unidos, y preferentemente se añade al extremo N. Dicha secuencia peptídica consiste en de 1 a 15, preferentemente de 2 a 10, y más preferentemente de 3 a 5 aminoácidos hidrófilos seleccionados del grupo que consiste en arginina, histidina, lisina, treonina, tirosina, serina, asparagina, glutamina, ácido aspártico y ácido glutámico. Por ejemplo, como tal secuencia peptídica se puede utilizar un trímero de arginina (RRR) o un tetrámero de arginina (RRRR). Los ejemplos de péptidos que tienen 4 epítopos de CTL unidos que comprenden tales secuencias peptídicas añadidas a los mismos incluyen RRR-TPV06, RRRR-TPV06, TPV06-RRR, TPV06-RRRR, RRR-TPV10, RRRR-TPV10, TPV10-RRR, TPV10-RRRR, RRR-TPV12, RRRR-TPV12, TPV12-RRR,

,

, - , - y - , con - , - , - , - , KKK-TPV12, KKKK-TPV12, KKK-TPV21, KKKK-TPV21, KKK-TPV26, KKKK-TPV26, KKK-TPV30, KKKK-TPV30, HHH-TPV06, HHHH-TPV06, HHH-TPV10, HHHH-TPV10, HHH-TPV12, HHHH-TPV12, HHH-TPV21, HHHH-TPV21, HHH-TPV26, HHHH-TPV26, HHH-TPV30, HHHH-TPV30, RRKK-TPV12, RKRK-TPV12, RHRH-TPV12, RRHH-TPV12, KKHH-TPV12 y KHKH-TPV12 siendo preferibles, y RRR-TPV06, RRRR-TPV06, RRR-TPV10, RRRR-TPV10, RRR-TPV12, RRRR-TPV12, TRRR-TPV21, RRRR-TPV21, RRR-TPV26, RRRR-TPV26, RRR-TPV30 y RRRR-TPV30 siendo más preferibles. Se sabe que un péptido que comprende tal secuencia peptídica tiene una solubilidad mejorada en un disolvente acuoso (Abdelkrim Alileche y col., Peptides 38, 2012, 302-311; documento JP 2006-188507 A). Con la adición de tal secuencia peptídica al péptido que tiene 4 epítopos CTL unidos de acuerdo con la presente invención, se puede mejorar un grado de solubilidad del péptido que tiene 4 epítopos de CTL unidos en un disolvente acuoso.

En el péptido que tiene 4 epítopos unidos de acuerdo con la presente invención, los CTL específicos de péptido de epítopo CTL pueden inducirse y/o activarse en al menos tres tipos, y preferentemente cuatro tipos de péptidos de epítopo CTL de los 4 tipos unidos de péptidos de epítopo CTL. Además, se puede inducir la producción de una inmunoglobulina específica para cada péptido de epítopo CTL. En la presente invención, el término "inmunoglobulinas" se refiere a IgG, IgM, IgA o IgD.

El péptido que tiene 4 epítopos unidos de acuerdo con la presente invención puede ser una sal de adición de ácido o una sal de adición de base. Los ejemplos de ácidos que generalmente se utilizan para formar sales de adición de ácido incluyen ácidos orgánicos, tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido yodhídrico, ácido oxálico, ácido p-bromofenilsulfónico, ácido carboxílico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido acético y ácido trifluoroacético. Los ejemplos de sales de adición de bases incluyen sales inducidas a partir de bases inorgánicas, tales como hidróxido de amonio, hidróxido alcalino, hidróxido de metal alcalinotérreo, carbonato y bicarbonato.

2. Producción de un péptido que tiene 4 epítopos de CTL unidos

El péptido que tiene 4 epítopos de CTL unidos de acuerdo con la presente invención puede producirse mediante técnicas comunes, por ejemplo, síntesis peptídica, tal como síntesis en fase líquida o síntesis en fase sólida, o síntesis peptídica que implica el uso de un sintetizador de péptidos automatizado (Kelley y col., Genetics Engineering Principles and Methods, Setlow, J. K. eds., Plenum Press ^{n Y . ,} 1990, Vol. 12, pág. 1-19; Stewart y col., Solid-Phase Peptide Synthesis, 1989, W. H. Freeman Co.; Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 1985, 82: pág. 5132, "Shin Seikagaku Jikken Kouza (New Biochemical Experiment) 1, Protein IV, 1992, the Japanese Biochemical Society (ed.), Tokio Kagaku Doujin). La síntesis peptídica se lleva a cabo preparando aminoácidos en que los grupos funcionales a unir de los aminoácidos distintos de los grupos a-amino y grupos a-carboxilo están protegidos, y formando enlaces peptídicos entre los grupos a-amino y los grupos a-carboxilo de los aminoácidos. En general, un grupo carboxilo de un resto de aminoácido ubicado en el extremo C de un péptido está unido a una fase sólida a través de un espaciador o engarce adecuado. Se elimina selectivamente un grupo protector en el extremo amino del dipéptido obtenido anteriormente y se forma un enlace peptídico entre el extremo amino y el grupo a-carboxilo del resto de aminoácido posterior. Este procedimiento se continúa para producir un péptido con un grupo lateral protegido, y todos los grupos protectores se eliminan y se separan de la fase sólida al final. Los tipos de grupos protectores, los procedimientos para proteger el mismo y los procedimientos de unión a péptidos se describen en detalle en los documentos mencionados anteriormente.

Como alternativa, se puede producir un péptido mediante recombinación genética, presentación en fagos u otras técnicas, con el uso de un ácido nucleico que codifica el péptido que tiene 4 epítopos unidos de acuerdo con la presente invención.

Una técnica de recombinación genética comprende insertar ADN que codifica el péptido que tiene 4 epítopos unidos de acuerdo con la presente invención en un vector de expresión adecuado, introducir el vector en células hospedadoras adecuadas, cultivar las células y recuperar los péptidos diana de las células o del líquido extracelular. Los ejemplos de vectores incluyen, pero sin limitación, vectores plasmídicos, de fago, cósmido, de fagémido y de virus. Los vectores se introducen en las células hospedadoras, tales como células hospedadoras bacterianas (por ejemplo, E. coli y Bacillus subtilis), células de levadura, células de insecto, células animales (por ejemplo, células de mamíferos) y células vegetales. La transformación o transfección en tales células se lleva a cabo a través de, por ejemplo, el procedimiento de fosfato de calcio, electroporación, lipofección, el procedimiento de pistola de partículas o el procedimiento con PEG. Las células transformadas se cultivan en conformidad con una técnica convencional para el cultivo de organismos hospedadores. Para facilitar la recuperación del péptido de acuerdo con la presente invención, es preferible que un péptido generado a través de expresión se secrete de forma extracelular. Con este fin, el ADN que codifica una secuencia peptídica que permite la secreción del péptido a partir de las células se une al lado 5' terminal del ADN que codifica un péptido diana. Como alternativa, se puede recuperar un péptido diana acumulado en las células. En dicho caso, las células se rompen física o químicamente y se recupera un péptido diana a través de una técnica de purificación de proteínas.

El péptido así obtenido puede recuperarse o purificarse a través de una técnica convencional, por ejemplo, técnicas de cromatografía, tal como la cromatografía de filtración en gel, cromatografía en columna de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, cromatografía en columna de fase inversa, o HPLC, fraccionamiento en sulfato de amonio, ultrafiltración o inmunoadsorción.

3. Linfocitos T citotóxicos

Con el uso del péptido que tiene 4 epítopos unidos de acuerdo con la presente invención, Se pueden obtener CTL específicos de péptido de epítopo CTL que dañan células cancerosas in vitro y/o ex vivo. Se conoce un procedimiento para inducir CTL utilizando un péptido de epítopo CTL in vitro y/o ex vivo es conocido (por ejemplo, el documento JP 2006-14637 A), y tal técnica puede emplearse en la presente invención. Por ejemplo, células de adhesión en placa de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) obtenidas de individuos sanos o de pacientes con cáncer se cultivan en presencia de citocinas, tales como GM-CSF o IL-4, para inducir células dendríticas (las CD). Después de pulsar las células dendríticas con el péptido que tiene 4 epítopos unidos de acuerdo con la presente invención, se aplican rayos X a las mismas, para preparar células presentadoras de antígeno (estimulantes). Cuando no se pueden utilizar las CD, las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) obtenidas de individuos sanos o de los mismos pacientes con cáncer pueden pulsarse con el péptido que tiene 4 epítopos unidos de acuerdo con la presente invención, se pueden aplicar rayos X a los mismos y se puede utilizar las células. Posteriormente, se añaden células mononucleares de sangre periférica (CMSP) obtenidas de individuos sanos o células mononucleares de sangre periférica (CMSP) obtenidas de pacientes con cáncer o linfocitos en los ganglios linfáticos pertinentes (es decir, respondedores) y luego se cultivan en presencia de citocinas, tales como IL-2, IL-4 o IL-7. Después de eso, las células presentadoras de antígeno obtenidas mediante pulsado descritas anteriormente se estimulan nuevamente con la adición del péptido que tiene 4 epítopos unidos de acuerdo con la presente invención y se cultivan adicionalmente en presencia de citocinas, tales como ^{i L - 2 .}

Cualquier medio en el que los linfocitos T puedan sobrevivir puede utilizarse como el medio de cultivo celular utilizado para la inducción de c Tl . Por ejemplo, se puede utilizar medio preparado mediante la adición de diversas citocinas (por ejemplo, IL-2) y de suero de ternera fetal (STF) al medio RHAMa (medio LAK descrito en Kawai, K., Sasaki, T., Saijo-Kurita, K., Akaza, H., Koiso, K. y Ohno, T., Cancer Immunol. Immunother., 35, 225-229, 1992), medio AIMV (GIBCO BRL, Life Technologies, INC.) o medio RPMI 1640.

El cultivo puede realizarse en condiciones bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, la temperatura de cultivo es de 33 °C a 41 °C y preferentemente de 37 °C. Se puede utilizar como fase gaseosa un gas inerte que contiene aire u oxígeno de concentración adecuada y dióxido de carbono de concentración adecuada (por ejemplo, CO2 al 5 %) para ajustar el pH del medio a aproximadamente 7,4. El cultivo se realiza preferentemente durante 4 a 10 días, y más preferentemente 7 días u 8 días. Algunos CTL inducidos a través de tal cultivo son péptidos de epítopo CTL específicos para cada uno de al menos tres tipos, y preferentemente cuatro tipos, de péptidos de epítopo c Tl entre los cuatro tipos de péptidos de epítopo CTL que constituyen el péptido que tiene 4 epítopos unidos, y por lo tanto pueden dañar células cancerosas de forma específica.

4. Composición farmacéutica

El péptido que tiene 4 epítopos unidos de acuerdo con la presente invención puede utilizarse como principio activo de una composición farmacéutica utilizada para inmunoterapia contra el cáncer.

La composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede contener, como principio activo (o principios activos), uno o más de los péptidos que tienen 4 epítopos unidos. Al incluir una pluralidad de péptidos que tienen 4 epítopos unidos, se pueden esperar efectos más fuertes. Además, la composición farmacéutica resultante puede ejercer una mayor versatilidad, de modo que pueda administrarse como una vacuna peptídica para el cáncer a una variedad más amplia de pacientes con cáncer, independientemente de los tipos de HLA de los pacientes.

Los genes que codifican PEP1, PEP2, PEP4, PEP5, PEP6, PEP7, PEP8, PEP9, PEP10, PEP13, PEP15, PEP17 y PEP18 incluidos en el péptido que tiene 4 epítopos unidos de acuerdo con la presente invención se observa que se expresan en una pluralidad de tipos de cánceres sólidos y cánceres hemáticos. Los ejemplos de cánceres sólidos incluyen tumor cerebral, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de tiroides, cáncer de cuello uterino, cáncer de cuerpo uterino, cáncer de ovario, cáncer de esófago, cáncer gástrico, tumor del estroma gastrointestinal (TEGI), cáncer de páncreas, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer anal, cáncer renal, cáncer de hígado, cáncer de las vías biliares, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, melanoma maligno, cáncer de piel, cáncer de lengua, osteosarcoma, condrosarcoma, fibrosarcoma, liposarcoma, angiosarcoma, rabdomioblastoma y liomiosarcoma. Los ejemplos de cánceres hemáticos incluyen leucemia, linfoma maligno y mieloma. Por consiguiente, el péptido que tiene 4 epítopos unidos de acuerdo con la presente invención es útil para el tratamiento y/o la prevención de tales cánceres. La expresión "tratamiento y/o prevención del cáncer" utilizado en el presente documento se refiere a la prevención del desarrollo/recidiva del cáncer, supresión de la progresión/agravamiento del cáncer, o la mejora de las afecciones cancerosas.

La composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede contener materiales farmacéuticamente aceptables, tales como diversos vehículos orgánicos o inorgánicos comunes. Los ejemplos de vehículos farmacéuticos que pueden utilizarse incluyen estabilizantes, antibacterianos, tampones, agentes de isotonicidad, agentes quelantes, ajustadores de pH, tensioactivos, cargas, espesantes, aglutinantes, humectantes, disgregantes, agentes tensioactivos, lubricantes, agentes calmantes, diluyentes y excipientes que generalmente se utilizan en conformidad con la forma de administración de las preparaciones farmacéuticas pertinentes. Las preparaciones farmacéuticas se preparan preferentemente en forma de formulaciones complementadas con tales vehículos en conformidad con técnicas convencionales.

La composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede contener un adyuvante conocido que se utiliza en el momento de la administración de la vacuna. Los ejemplos de adyuvantes incluyen el adyuvante completo de Freund (ACF), adyuvante incompleto de Freund (AIF), alumbre, lípido A, monofosforil lípido A, preparaciones bacterianas tales como BCG (Bacilo de Calmette-Guerrin), ácidos nucleicos tales como CpG-ADN y ARNbc, preparaciones de componentes bacterianos tales como tuberculina, polímeros de origen natural, tales como hemocianina de lapa californiana y manano de levadura, muramil-tripéptido, muramil-dipéptido o un derivado de cualquiera de los mismos, alumbre, copolímeros de bloque no iónicos y citocinas tales como interleucina 2 (IL-2), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), interferón-a (IFN-a) e interferón-p (IFN-p). Estos adyuvantes se pueden utilizar solos o en combinaciones de dos o más. Los adyuvantes pueden administrarse simultáneamente con la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención en forma de una mezcla o como una emulsión.

Además del péptido que tiene 4 epítopos unidos, la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede comprender uno o más de un péptido de epítopo CTL conocido procedente de moléculas de antígenos tumorales, un péptido que contiene a los mismos, o un péptido que comprende los péptidos de epítopo CTL unidos entre sí (en lo sucesivo en el presente documento, denominados "péptidos de epítopo CTL conocidos procedentes de moléculas de antígenos tumorales"). Los ejemplos de péptidos de epítopo CTL conocidos procedentes de moléculas de antígenos tumorales, pero sin limitación, WT-1 p126-134, WT-1 p235-243 modificado (M236Y), NY-ESO-1 p157 165, gp100 p209-217 modificado (T210M), survivina-2B p80-88, Her-2/neu p63-71, VEGFR2 p169-177, MART-1 p26-35, Glipicano-3 p298-306 y SPARC p143-151. En este caso, el péptido que tiene 4 epítopos unidos de acuerdo con la presente invención y los péptidos de epítopo CTL conocidos procedentes de moléculas de antígenos tumorales pueden prepararse en forma de una preparación de agente único. Como alternativa, una preparación que comprende, como principio activo, el péptido que tiene 4 epítopos unidos de acuerdo con la presente invención, puede separarse de una preparación que comprende, como principio activo, los péptidos de epítopo CTL conocidos procedentes de moléculas de antígenos tumorales.

La forma de dosificación de la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se puede seleccionar en conformidad con la forma de administración. Los ejemplos representativos de formas de dosificación incluyen, pero sin limitación, preparaciones líquidas, emulsiones, preparaciones de liposomas, emulsiones lipídicas, complejos de inclusión de ciclodextrina, suspensiones, pomadas, cremas, agentes absorbidos por vía transdérmica, agentes absorbidos por vía transmucosa, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, fármacos en polvo, gránulos, gránulos finos y jarabes. De acuerdo con la vía de administración, tales formas de dosificación se clasifican además como, por ejemplo, preparaciones orales, preparaciones parenterales, preparaciones transnasales, preparaciones transvaginales, supositorios, formulaciones sublinguales, inhalantes, colirios o gotas para los oídos, y tales preparaciones se pueden combinar, moldear o preparar en conformidad con técnicas convencionales. Además de la aplicación en forma de preparaciones líquidas, tal preparación puede someterse a liofilización, para hacer que la preparación farmacéutica sea almacenable. Cuando se usa tal preparación farmacéutica, se puede disolver con la ayuda de, por ejemplo, un tampón que contenga agua y solución salina fisiológica, para la concentración de la misma a un nivel adecuado.

La composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede comprender, como principio activo, CTL inducidos in vitro y/o ex vivo con el uso del péptido que tiene 4 epítopos unidos de acuerdo con la presente invención. Dicha composición farmacéutica está preferentemente en forma de un agente parenteral.

5. Procedimientos de tratamiento

La composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se puede administrar a una amplia diversidad de pacientes de cáncer, tales como pacientes que son positivos para los tipos de HLA seleccionados del grupo que consiste en supertipo HLA-A2, HLA-A24, HLA-A26 y HLA-A3, y el tratamiento puede iniciarse sin realizar el tipado de HLA antes del tratamiento.

Cuando la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se administra a un paciente con cáncer, pueden inducirse y/o activarse los CTL específicos para al menos tres, y preferentemente cuatro tipos de péptidos de epítopo CTL que constituyen el péptido que tiene 4 epítopos unidos como principio activo de la composición farmacéutica. Además, se puede inducir la producción de inmunoglobulinas específicas para los péptidos de epítopo CTL de interés. El nivel de inducción de la producción de inmunoglobulinas tras la administración del péptido que tiene 4 epítopos unidos como principio activo es significativamente mayor que el nivel de inducción de la producción de inmunoglobulinas observado tras la administración de una mezcla de los péptidos de epítopo CTL que han de estar contenidos en el péptido que tiene 4 epítopos unidos, pero que no están unidos entre sí. Por consiguiente, el péptido que tiene 4 epítopos unidos de acuerdo con la presente invención puede tratar y/o prevenir el cáncer en un paciente con cáncer de forma eficaz.

La composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se puede administrar a través de, por ejemplo, administración oral, administración intravenosa, administración intraarterial, administración intramuscular, administración subcutánea, administración intracutánea, administración sublingual, administración intraperitoneal, administración intrarrectal, administración transdérmica, administración transmucosa, administración transnasal, administración transvaginal, administración transocular o aspiración. Cuando las preparaciones comprenden, como principios activos, una pluralidad de péptidos que tienen 4 epítopos unidos o péptidos de epítopo CTL conocidos procedentes de moléculas de antígenos tumorales, se preparan en forma de composiciones farmacéuticas separadas, tales composiciones farmacéuticas pueden administrarse simultáneamente o no simultáneamente a través de la misma vía o por vías distintas.

La dosificación de la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede ajustarse adecuadamente en conformidad con factores tales como el cuadro clínico/gravedad del cáncer a tratar, la edad del paciente o el peso corporal del paciente. Por ejemplo, una composición farmacéutica que contiene el péptido que tiene 4 epítopos unidos en una cantidad de 0,0001 mg a 1000 mg, preferentemente de 0,001 mg a 100 mg, y más preferentemente de 0,01 mg a 50 mg, puede administrarse repetidamente una vez cada varios días, varias semanas o varios meses. Cuando la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención comprende, como principios activos, CTL inducidos in vitro y/o ex vivo con el uso del péptido que tiene 4 epítopos unidos de acuerdo con la presente invención, es preferible administrar de 2 x 106 a 2 x 108 c Tl por kg de peso corporal todos los días a intervalos de 1 a 2 semanas.

La composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede administrarse a un paciente con cáncer en combinación con productos farmacéuticos que generalmente se utilizan para quimioterapia contra el cáncer. Los ejemplos de tales productos farmacéuticos incluyen: agentes alquilantes, tales como la ciclofosfamida, temozolomida y bendamustina; antimetabolitos, tal como el tegafur-uracilo, tegafur-gimeracil-oteracil potasio, metotrexato y gemcitabina; fármacos que contienen platino, tales como cisplatino y oxaliplatino; preparaciones de alcaloides vegetales, tales como irinotecán, eribulina, paclitaxel, docetaxel y vincristina; antibióticos carcinostáticos, tales como doxorrubicina, bleomicina y actinomicina D; fármacos dirigidos a moléculas, tales como imatinib, sunitinib, gefitinib, sorafenib, everólimus, trastuzumab, bevacizumab, rituximab, cetuximab, panitumumab y mogamulizumab; agentes de terapia hormonal, tales como bicalutamida, estramustina y exemestano; y agentes inmunoestimulantes, tales como lentinano, Picibanil y Krestina. Dichos productos farmacéuticos pueden administrarse simultáneamente o no simultáneamente con la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención, a través de la misma vía o a través de vías distintas.

A continuación, la presente invención se describe con mayor detalle con referencia a los ejemplos, aunque la presente invención no se limita a estos ejemplos.

Ejemplos

Ejemplo 1: Síntesis y purificación de péptidos

Los péptidos de epítopo CTL y los péptidos que tienen 4 epítopos unidos se sintetizaron utilizando un sintetizador de péptidos disponible en el mercado (Prelude, Protein Technologies, Inc.) mediante el procedimiento de síntesis en fase sólida (Fmoc). En concreto, se permitió que la resina de Alko-PEG adsorbiera aminoácidos con grupos activos protegidos, se inyectó una solución de desbloqueo, para eliminar grupos protectores, se inyectaron aminoácidos con grupos activos protegidos, y se les permitió reaccionar entre ellos, para sintetizar dipéptidos. Al repetir tal procedimiento, se sintetizaron los péptidos que comprenden las secuencias de interés. Los grupos protectores de los péptidos se eliminaron realizando una reacción en una solución desprotectora que contenía triisopropilsilano al 2,5 %, 2,5 % de agua y ácido trifluoroacético al 95 % durante 2 horas. Con la adición de éter frío al filtrado resultante, los péptidos se recuperaron en forma de precipitados. Los diversos péptidos sintéticos resultantes se purificaron utilizando la columna YMC-Pack Pro C18 (YMC Co., Ltd.) y el sistema de HPLC (Gilson) con una solución acuosa de TFA al 0,1 % y acetonitrilo como fase móvil. Después del procedimiento final de purificación, se analizaron la pureza y el peso molecular de los péptidos mediante los sistemas de LC-MS (sistema Waters Acquity UPLC, micro masa ZQ). Los péptidos se liofilizaron, se conservaron a temperatura fresca en oscuridad, y luego se sometieron a los ejemplos descritos a continuación. Las tablas 1-1 a 1-8 muestran los datos espectrales de MS de los péptidos que tienen 4 epítopos unidos (TPV01 a TPV45). Las Figs. 1-1 a 1-7 muestran los datos de LC de TPV06, TPV10, TPV12, TPV21, TPV26, TPV30, TPV35, TPV37, TPV39, TPV40, TPV41, TPV43 y TPV45. La Fig. 2-1 a 2-3 muestra los datos de MS de TPV39, TPV40, TPV41, TPV43 y TPV45.

Tabla 1-1

continuación

Tabla 1-2

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Tabla 1-3

Tabla 1-4

Tabla 1-5

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Tabla 1-6

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Tabla 1-7

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Tabla 1-8

continuación

La Tabla 2 muestra las secuencias de aminoácidos de los péptidos de epítopo CTL sintetizados, y las Tablas 3 y 4 muestran las secuencias de aminoácidos de los péptidos que tienen 4 epítopos unidos. Los péptidos que tienen 4 epítopos unidos mostrados en la Tabla 4 se preparan cada uno de ellos, en TPV12, TPV06 y TPV26 mostrados en las Tablas 3, añadiendo al extremo N una secuencia peptídica que consiste en restos de arginina y utilizando un trímero de arginina como engarce entre péptidos.

WT1 (SEQ ID NO: 20) se sintetizó como un péptido de control que se une a HLA-A2 y Her2 (SEQ ID NO: 21) se sintetizó como un péptido de control que se une a HLA-A24.

Tabla 2

Tabla 3

continuación

Tabla 4

"RRR-" y "RRRR-" son secuencias peptídicas añadidas a los extremos N, que comprenden 3 restos de arginina y 4 restos de arginina, respectivamente.

Ejemplo 2: Inducciones de CTL específicos de péptido de epítopo en modelo de ratón y detección de los CTL utilizando ELISPOT

Los péptidos que tienen 4 epítopos unidos se disolvieron en agua destilada (Otsuka Pharmaceutical Factory Inc.) a 2 mg/ml o 4 mg/ml, y la solución resultante se introdujo en la jeringa B Braun Injekt. Después de introducir una cantidad equivalente de adyuvante incompleto de Freund (AIF) en otra jeringa, estas jeringas se conectaron entre sí utilizando un conector de jeringa GP, y una solución de los péptidos que tienen 4 epítopos unidos se mezcló exhaustivamente con AIF para preparar una emulsión. La emulsión se administró semanalmente en cantidades de 100 pl cada vez, cerca de la base de la cola de ratones (ratones transgénicos HLA-A2.1 y transgénicos HLA-A24 (Taconic)), y las administraciones se llevaron a cabo dos veces en total. Se recogieron los ganglios linfáticos inguinales de los ratones 1 semana después de la administración final. Se ajustó una suspensión de células de ganglios linfáticos a 5 x 106 células/ml utilizando medio completo (RPMI-1640, SFB al 10 % inactivado por calor, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 pg/ml y 2-mercaptoetanol 50 pM), se añadieron el péptido de epítopo CTL diana (concentración final: 10 pg/ml), IL-15 recombinante de ratón (concentración final: 100 ng/ml) e lL-21 recombinante de ratón (concentración final: 100 ng/ml), estas células se sembraron en una placa de 24 pocillos a 1 ml/pocillo y se cultivaron en una incubadora a 37 °C, CO2 al 5 % durante 8 días. Después de eso, las células se recogieron y sembraron en una placa con anticuerpo anti-IFN-y inmovilizado incluida en el kit Murine IFN-y ELISpot (GEN-PROBE), a 1 x 105 células/pocillos. Posteriormente, los esplenocitos obtenidos del bazo del ratón singénico e irradiados con rayos X a 30 Gy se colocaron en la misma placa a 1 x 105 células/pocillo como células presentadoras de antígeno, se añadió el péptido de epítopo CTL diana o el péptido de control negativo (concentración final: 10 pg/ml) y se incubó en una incubadora a 37 °C, CO2 al 5 % durante una noche. Al día siguiente, las manchas que indican la existencia de células productoras de IFN-y se colorearon de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El número de manchas de células productoras de IFN-y se cuantificó utilizando un analizador ELISPOT (Immunospot S6, Cellular Technology Ltd.). La inducción de CTL específicos para péptidos de epítopo CTL se evaluó como positiva cuando el número de manchas de células productoras de IFN-y en los pocillos complementados con los péptidos de epítopo CTL diana fue significativamente mayor que la observada en los pocillos complementados con los péptidos de control negativo (prueba de t de Student, p < 0,05). Como péptido de control negativo se utilizó WT1 o Her2. Para visualizar el nivel de inducción de CTL, los resultados de la siguiente ecuación se designaron como "A" (el número promedio de manchas de células productoras de IFN-y en los pocillos complementados con los péptidos de epítopo CTL diana) - (el número promedio de manchas de células productoras de iFN-y en los pocillos complementados con los péptidos de control negativo). Los resultados se representan como positivos en el caso de 10 < A <100; medio positivos en el caso de 100 < A <200; y fuertemente positivos en el caso de 200 < A.

Las Figs. 3-1 a 3-4 muestran los resultados de la evaluación de la inducción de CTL específicos para péptidos de epítopo CTL. Cuando el péptido que tiene 4 epítopos unidos tiene una o más características seleccionadas entre las siguientes características <1> a <3>, como se muestra en las Fig. 3-1 a 3-4, se indujeron al menos 3 tipos de CTL de los 4 tipos de péptidos de epítopo CTL unidos.

<1> El péptido comprende PEP4 en el extremo C.

<2> El péptido comprende PEP6 y PEP5 en el extremo C dispuestos sucesivamente en tal orden desde el extremo N a través de un engarce.

<3> El péptido comprende PEP5, PEP6, PEP9 y PEP18.

Cuando se añadió adicionalmente una secuencia peptídica que consiste en restos de arginina al extremo N o cuando un engarce péptido-péptido era un trímero de arginina, como se muestra en la Fig. 3-4, los CTL se indujeron satisfactoriamente como se describe anteriormente.

En el caso de péptidos que tienen 4 epítopos unidos que tienen el orden de unión mostrado en CPV01 a CPV16, sin embargo, la inducción de CTL no se observó en tres o más péptidos, como se muestra en las Fig. 3-1 a 3-3.

En concreto, incluso si los péptidos que tienen 4 epítopos CTL unidos se componen de 4 tipos de péptidos de epítopo seleccionados de 13 tipos particulares de péptidos de epítopo (PEP1, PEP2, PEP4, PEP5, PEP6, ^{P e P 7 ,} PEP8, ^{P e P 9 ,} PEP10, PEP13, PEP15, PEP17 y PEP18) (es decir, CPV14, CPV15 y CPV16), la inducción de CTL no se observó en tres o más péptidos en los péptidos que tiene 4 epítopos CTL unidos.

Ejemplo 3: Predicción de la posición de escisión peptídica con inmunoproteasomas 20S humanos (i20S)

Las muestras de escisión de péptidos que tienen 4 epítopos unidos se prepararon de la manera descrita a continuación. En concreto, los péptidos que tienen 4 epítopos unidos se diluyeron a 66,7 pg/ml con un tampón de reacción (HEPES-KOH 20 mM, pH 7,8, MgAc22 mM, ditiotreitol 2 mM), y el resultante se distribuyó en tubos de reacción, en cantidades de 300 pl por tubo. Se añadieron inmunoproteasomas 20S humanos (R&D systems) a los mismos, en cantidades de 2 pg por tubo, las mezclas se agitaron y los resultantes se sometieron a continuación a incubación con agitación a 37 °C durante 1, 2 o 4 horas. Después de eso, se añadió ácido acético en cantidades de 30 pl por tubo, para finalizar las reacciones enzimáticas, y las muestras se liofilizaron inmediatamente en un congelador a -80 °C.

Posteriormente, las muestras de escisión obtenidas de los péptidos que tienen 4 epítopos unidos se aplicaron a los sistemas de LC/MS-MS (sistema Acquity UPLC, Waters; Synapt G2 HDMS, Waters), para realizar un análisis exhaustivo de los pesos moleculares de los fragmentos peptídicos. Con el uso de un programa informático analítico (MassLynx, ver. 4.1, SCN712, Waters), se analizaron las muestras y se identificaron los fragmentos peptídicos. Se evaluó que los péptidos que tienen 4 epítopos unidos eran escindibles al desarrollar cualquiera de los péptidos en los que se escinde el péptido de epítopo, un péptido que comprende restos de arginina añadidos al extremo N del péptido de epítopo o un péptido que comprende un dímero de arginina añadido al extremo N del péptido de epítopo, como resultado de la escisión con inmunoproteasomas.

Los resultados del análisis realizado con el uso de los inmunoproteasomas mostrados en las Fig. 3-1 a 3-4 demuestran que se precisa que dos tipos de péptidos de epítopo CTL, PEP2 y PEP10, estén ubicados en las posiciones más cercanas al extremo C del péptido que tiene 4 epítopos unidos, para determinar los aminoácidos C terminales de los péptidos de epítopo CTL de interés. Por consiguiente, es preferible que PEP2 o PEP10 estén unidos al extremo C del péptido que tiene 4 epítopos unidos.

Ejemplo 4: Preparación de perlas con péptidos de epítopo CTL inmovilizados

Los péptidos se inmovilizaron en microesferas xMAP Multi-Analyte COOH (Luminex Corporation; en lo sucesivo en el presente documento denominado "perlas") de la manera descrita a continuación. Las perlas se lavaron con tampón MES (MES-NaOH 0,1 M; pH 7,0) y el sobrenadante se eliminó después por centrifugación. Este procedimiento de lavado se repitió dos veces y las perlas se suspendieron en 75 pl de un tampón MES. Se añadió una solución de péptido de epítopo CTL (100 pl, 1 mg/ml) y 5 pl de EDC (clorhidrato de 1 -etil-3- (3-dimetilaminopropil)carbodiimida) 10 mg/ml a la suspensión de perlas, seguido de una mezcla exhaustiva. Después de eso, se realizó la reacción a 30 °C en oscuridad durante una noche. Después de la eliminación del sobrenadante por centrifugación al día siguiente, se añadieron 125 pl de Tris-HCl 1 M y se llevó la incubación a 30 °C en oscuridad durante 30 minutos. Después de que el sobrenadante se eliminara nuevamente, las perlas se lavaron dos veces con un tampón de lavado (PBS (-), Tween 20 al 0,05 %), y se suspendieron en Immunoblock (DS Pharma Biomedical Co., Ltd ). Así, se finalizó la inmovilización del péptido de epítopo CTL.

Ejemplo 5: Medición del título de anticuerpos IgG específicos para epítopos CTL

Los péptidos que tienen 4 epítopos unidos de acuerdo con la presente invención se disolvieron en agua destilada (Otsuka Pharmaceutical Factory Inc.) a 2 mg/ml, y la solución resultante se introdujo en una jeringa B Braun Injekt. Después de introducir una cantidad equivalente de AIF en otra jeringa, estas jeringas se conectaron entre sí utilizando un conector de jeringa GP y una solución de los péptidos que tienen 4 epítopos unidos se mezcló exhaustivamente con AIF para preparar una emulsión. La emulsión se administró semanalmente en cantidades de 100 pl cada una cerca de la base de la cola de ratones CBF1 (C57BL/6xBalb/c F1) y en total la administración se llevó a cabo tres veces. Se recogió sangre de los ratones una semana después de la administración final para obtener muestras de suero. Como muestras de control, se prepararon emulsiones utilizando mezclas de 4 tipos de péptidos seleccionados entre PEP1, PEP2, PEP4, PEP5, PEP6, PEP7, PEP8, PEP9, PEP10, PEP13, PEP15 y PEP18 (1 mg/ml cada uno), y las emulsiones resultantes se administraron en conformidad con la misma pauta que con el péptido que tiene 4 epítopos unidos (grupo al que se administró la mezcla).

Las perlas con péptido de epítopo CTL inmovilizado diluidas con Immunoblock se distribuyeron en pocillos de una placa de filtro de 96 pocillos. Las cuentas distribuidas se lavaron con un tampón de lavado y, posteriormente, se añadieron en cada pocillo 100 pl de las muestras de suero de ratón diluidas 200 veces con Immunoblock. La placa se incubó durante 90 minutos a 30 °C con un mezclado a 600 rpm. Después de lavar tres veces la placa con un tampón

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un péptido que consiste en 4 epítopos unidos, en el que los 4 péptidos de epítopo se seleccionan del grupo que consiste en los péptidos de epítopo c TL: el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 1 (PEP1); el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 2 (PEP2); el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 4 (PEP4); el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 5 (PEP5); el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 6 (PEP6); el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 7 (PEP7); el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 8 (PEP8); el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 9 (PEP9); el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 10 (PEP10); el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 13 (PEP13); el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 15 (PEP15); el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 17 (PEP17); y el péptido como se muestra en la SEQ ID NO: 18 (PEP18), unidos a través de engarces, el péptido que consiste en 4 epítopos unidos opcionalmente comprende otras secuencias peptídicas que consisten en aminoácidos hidrófilos, y el péptido que consiste en 4 epítopos unidos tiene una o más características seleccionadas de las siguientes características (1) a (5):

(1) el péptido comprende 3 péptidos de epítopo CTL seleccionados entre PEP1, PEP7, PEP8 y PEP13, y en el que PEP2 está dispuesto en el extremo C del péptido, excepto el péptido que comprende PEP7 y PEP8 en el extremo N dispuestos sucesivamente en tal orden desde el extremo N a través de un engarce;

(2) el péptido comprende PEP4 en el extremo C;

(3) el péptido comprende 3 péptidos de epítopo CTL seleccionados entre PEP1, PEP13, PEP15, PEP17 y PEP18, y en el que PEP10 está dispuesto en el extremo C del péptido;

(4) el péptido comprende 2 péptidos de epítopo CTL, PEP1 y PEP7, y en el que PEP6 y PEP5 están dispuestos sucesivamente en el extremo C en tal orden desde el extremo N a través de un engarce; y

(5) el péptido comprende 3 péptidos de epítopo CTL, PEP5, PEP6 y PEP18, y en el que PEP9 está dispuesto en el extremo C del péptido.

2. El péptido que consiste en 4 epítopos unidos de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dichos 4 epítopos unidos se seleccionan de manera redundante del grupo que consiste en PEP1, PEP2, PEP4, PEP5, PEP6, PEP7, PEP8, PEP9, PEP10, PEP13, PEP15, PEP17 y PEP18.

3. El péptido que consiste en 4 epítopos unidos de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende 4 péptidos no redundantes seleccionados entre PEP1, PEP2, PEP4, PEP5, PEP6, PEP7, PEP8, PEP9, PEP10, PEP13, PEP15, PEP17 y PEP18.

4. El péptido que consiste en 4 epítopos unidos de acuerdo con la reivindicación 1 o 3, que comprende una secuencia seleccionada de las siguientes secuencias, en las que "-(L)-" representa un engarce:

- PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP4;

- PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP4;

- PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP4;

- PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP4;

- PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP4;

- PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP4;

- PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP8-(L)-PEP2;

- PEP1-(L)-PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP2;

- PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP8-(L)-PEP2;

- PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP2;

- PEP8-(L)-PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP2;

- PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP2;

- PEP8-(L)-PEP13-(L)-PEP7-(L)-PEP2;

- PEP13-(L)-PEP7-(L)-PEP8-(L)-PEP2;

- PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP2;

- PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP2;

- PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP10;

- PEP13-(L)-PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP10;

- PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP18-(L)-PEP10;

- PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP13-(L)-PEP10;

- PEP18-(L)-PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP10;

- PEP18-(L)-PEP 15-(L)-PEP13-(L)-PEP10;

- PEP1-(L)-PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP10;

- PEP1-(L)-PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP10;

- PEP15-(L)-PEP1-(L)-PEP18-(L)-PEP10;

- PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP10;

- PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP15-(L)-PEP10;

- PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP1-(L)-PEP10;

- PEP15-(L)-PEP17-(L)-PEP13-(L)-PEP10;

- PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP17-(L)-PEP10;

- PEP17-(L)-PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP10;

- PEP17-(L)-PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP10;

- PEP13-(L)-PEP17-(L)-PEP15-(L)-PEP10;

- PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP17-(L)-PEP10;

- PEP6-(L)-PEP18-(L)-PEP5-(L)-PEP9;

- PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP18-(L)-PEP9;

- PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP6-(L)-PEP5; y

- PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP6-(L)-PEP5.

5. El péptido que consiste en 4 epítopos unidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el engarce es un engarce aminoacídico.

6. El péptido que consiste en 4 epítopos unidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el engarce aminoacídico es un dímero de arginina o un trímero de arginina compuesto por dos o tres restos de arginina unidos entre sí.

7. El péptido que consiste en 4 epítopos unidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la otra secuencia peptídica que consiste en aminoácidos hidrófilos está unida al extremo N y en el que la otra secuencia peptídica que consiste en aminoácidos hidrófilos está compuesta por un trímero de arginina o un tetrámero de arginina compuesto por tres o cuatro restos de arginina unidos entre sí.

8. El péptido que consiste en 4 epítopos unidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que consiste en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65 o SEQ ID NO: 66.

9. Una composición de CTL que comprende al menos 3 tipos de CTL obtenidos estimulando linfocitos de sangre periférica utilizando el péptido que consiste en 4 epítopos unidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que cada uno de los al menos 3 tipos de CTL es específico para un péptido de epítopo de CTL que constituye el péptido que consiste en 4 epítopos unidos.

10. Una composición farmacéutica que comprende, como principio activo, el péptido que consiste en 4 epítopos unidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o la composición de CTL de acuerdo con la reivindicación 9.

11. Una composición farmacéutica que comprende dos o más péptidos seleccionados entre los péptidos que consisten en 4 epítopos unidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

12. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, que es un agente inmunoterapéutico.

13. Un péptido para su uso en el tratamiento del cáncer, siendo dicho péptido el péptido que consiste en 4 epítopos unidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

14. Una composición de CTL de acuerdo con la reivindicación 9 para su uso en el tratamiento del cáncer.

15. Una composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12 para su uso en el tratamiento del cáncer.