ES2791778T3 - Mitigación del daño tisular y la fibrosis a través de anticuerpos anti-LTBP4 - Google Patents

Abstract

Un agente que inhibe la proteólisis de la proteína 4 de unión a TGFβ latente (LTBP4) para su uso en el tratamiento de un paciente que padece una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular de cinturas, distrofia muscular de Becker, miopatía, fibrosis quística, fibrosis pulmonar, miocardiopatía, lesión pulmonar aguda, lesión muscular aguda y lesión miocárdica aguda, en donde el agente es un anticuerpo aislado que se une específicamente a un péptido que consiste en la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 6.

Description

DESCRIPCIÓN

Mitigación del daño tisular y la fibrosis a través de anticuerpos anti-LTBP4

La presente invención se realizó con apoyo gubernamental en virtud de la subvención número HL61322, otorgada por los National Institutes of Health (NIH). El gobierno posee ciertos derechos sobre la presente invención.

Campo

La divulgación se refiere a composiciones y métodos para mitigar el daño tisular y la fibrosis en un paciente a través de la proteína de unión al factor beta de crecimiento transformante latente (LTBP4).

Listado De Secuencias

La presente solicitud contiene, como parte separada de la divulgación, un listado de secuencias en forma legible por ordenador (nombre de archivo: 46577_SeqListing.txt; creado: miércoles, 1 de agosto de 2012; 217,614 bytes -archivo de texto ASCII).

Antecedentes

Las proteínas de la superfamilia beta del factor de crecimiento transformante (TGF) son reguladores clave de la fibrosis en todos los órganos parenquimatosos [Kisseleva et al., Proc Am Thorac Soc. 5: 338-42 (2008)]. La distrofia muscular de Duchenne (DMD) se caracteriza por una fibrosis progresiva que se acompaña de un aumento de la señalización de TGFp [Bernasconi et al., J Clin Invest. 96: 1137-44 (1995); Chen et al., Neurology 65: 826-34 (2005)]. En la DMD, la fibrosis no solo contribuye directamente a la disfunción muscular sino que también inhibe la regeneración. La DMD se caracteriza por la fragilidad de la membrana muscular que conduce a una pérdida progresiva de miofibra. Con la progresión de la enfermedad, el músculo de DMD es sustituido por fibrosis. Aunque el músculo es altamente regenerativo, la regeneración en la DMD no es suficiente para desplazar la degeneración que conduce a debilidad muscular. Los esteroides glucocorticoides se usan para retrasar la progresión en la DMD, pero el uso de esteroides es complicado por los efectos secundarios, que incluyen osteoporosis y aumento de peso (Bushby et al., 2010). Las terapias experimentales para la DMD incluyen enfoques para aumentar la expresión de distrofina, modular la respuesta inflamatoria, promover el crecimiento muscular y reducir la fibrosis [Bushby et al., Lancet 374: 1849-56 (2009)].

En los últimos años, los compuestos biológicos, tales como los anticuerpos, han demostrado eficacia para tratar enfermedades crónicas. Por ejemplo, los anticuerpos dirigidos contra el TNFa (infliximab) o el receptor anti-TNF (etanercept) ahora se usan ampliamente para la artritis reumatoide y otros trastornos relacionados. Aunque inicialmente se desarrollaron por su actividad anticancerosa, el anticuerpo anti-VEGF ahora se usa para tratar la degeneración macular (bevacizumab). Por tanto, el uso a largo plazo con compuestos biológicos puede ser efectivo y seguro. Consistente con los enfoques terapéuticos que comprenden la administración de un compuesto biológico, tal como un anticuerpo, es el hecho de que los anticuerpos se detectan fácilmente en la matriz del músculo distrófico, tal como el músculo de pacientes con DMD.

Una serie de enfoques, incluyendo, aunque sin limitaciones, inhibición de angiotensina, ya sea a través de la enzima convertidora o del receptor de angiotensina, la inhibición de la aldosterona y la inhibición por anticuerpos dirigidos contra TGFp se han probado o se están probando para reducir la fibrosis en la DMD. [Cohn et al., Nat Med. 13: 204­ 10 (2007); Rafael-Fortney et al., Circulation. 124: 582-8 (2011); Nelson et al., Am J Pathol. 178: 2611-21 (2011)]. Una limitación importante de estos enfoques es que estos medicamentos son sistémicamente activos y a menudo tienen efectos no deseados, tal como la reducción de la presión arterial. Dada la hipotensión relativa de los pacientes con DMD, los pacientes con DMD especialmente avanzada, dichos enfoques están limitados.

El documento WO 2012/006181 desvela LTBP4 de longitud completa en el contexto del uso de un inhibidor de ARN para evitar una disminución en la expresión de LTBP4. El documento US 2011/0151490 desvela métodos para detectar cánceres determinando el nivel de expresión de (entre otras cosas) LTBP4. El documento WO 2004/083241 desvela complejos y fusiones de BTC (nunca definida, pero probablemente betacelulina) y varias otras proteínas, incluyendo LTBP4, para encontrar agentes que modulen el complejo en el tratamiento de diversas afecciones, incluida la fibrosis.

Sumario

En el presente documento se desvelan composiciones de acuerdo con las reivindicaciones. Las composiciones de acuerdo con la divulgación modulan la actividad y/o proteólisis de la proteína 4 de unión a TGFp latente (LTBP4). Las composiciones se usan para tratar a un paciente con distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular de cinturas, distrofia muscular de Becker, miopatía, fibrosis quística, fibrosis pulmonar, miocardiopatía, lesión pulmonar aguda, lesión muscular aguda o lesión miocárdica aguda.

El agente es un anticuerpo.

En aspectos adicionales de la divulgación, los métodos desvelados en el presente documento comprenden además administrar una cantidad efectiva de un segundo agente, en el que el segundo agente se selecciona del grupo que consiste en un modulador de una respuesta inflamatoria, un promotor del crecimiento muscular, un agente quimioterapéutico y un modulador de la fibrosis.

Otro aspecto de la divulgación se refiere a un método para tratar a un paciente que tiene una enfermedad relacionada con el factor de crecimiento transformante beta (TGFp), que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de un agente que regula por aumento la actividad de la proteína de unión a TGFp latente 4 (LTBP4).

Otro aspecto de la divulgación proporciona un método para retrasar el inicio o prevenir una enfermedad relacionada con el factor de crecimiento transformante beta (TGFp), que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de un agente que regula por aumento la actividad de la proteína de unión a TGFp latente 4 (LTBP4).

En algunas realizaciones de los métodos, LTBP4 interactúa con una proteína de la superfamilia TGFp y en otras realizaciones adicionales, la proteína de la superfamilia TGFp se selecciona del grupo que consiste en TGFp, un factor de crecimiento y diferenciación (GDF), activina, inhibina y una proteína morfogenética ósea. En realizaciones específicas, el GDF es miostatina.

En algunas realizaciones, se proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a un péptido que comprende una cualquiera de las secuencias establecidas en las SEQ ID NO: 2-5. En realizaciones adicionales, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a un péptido que es al menos un 70 % idéntico a un péptido que comprende una cualquiera de las secuencias establecidas en las SEQ ID NO: 2-5, en el que el anticuerpo conserva la capacidad de unirse específicamente a LTBP4 y disminuir la susceptibilidad de LTBP4 a la proteólisis.

En otro aspecto, se proporciona una formulación farmacéutica que comprende una cantidad efectiva, tal como una cantidad terapéuticamente efectiva, de un anticuerpo de la divulgación y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Un aspecto adicional de la divulgación proporciona un kit que comprende una cantidad efectiva, tal como una cantidad terapéuticamente efectiva, de un anticuerpo de la divulgación, un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable e instrucciones de uso.

En algunas realizaciones, la formulación o el kit de la divulgación comprende además una cantidad efectiva, tal como una cantidad terapéuticamente efectiva, de un segundo agente, en el que el segundo agente se selecciona del grupo que consiste en un modulador de una respuesta inflamatoria, un promotor del crecimiento muscular, un agente quimioterapéutico y un modulador de la fibrosis.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 representa un modelo para la acción de LTBP4 (proteína 4 de unión a TGFp latente). El LTBP4 se une directamente a las proteínas miembros de la familia TGFp. En la matriz extracelular, el complejo de proteína LTBP4 y TGFp forma el gran complejo latente. Con la proteólisis, el LTBP4 sufre un cambio conformacional que libera TGFp, haciendo que esté disponible para liberar y unirse a receptores de TGFp en las células vecinas. La unión de TGFp a su receptor da como resultado la señalización de TGFp en las células.

La figura 2 representa la estructura génica de LTBP4. Un polimorfismo de inserción y deleción en Ltbp4 altera la región rica en prolina en ratones. El N-terminal de LTBP se une a la matriz extracelular (MEC). La proteína LTBP4 está compuesta por múltiples repeticiones del factor de crecimiento epidérmico (EGF) intercaladas con motivos que contienen 8 restos de cisteína (8-Cys). La tercera repetición de 8 cys se une a TGFp directamente. La región rica en prolina (rectángulo horizontal marcado) separa el dominio de unión a la matriz del resto de la proteína. El ratón 129 está protegido contra la distrofia muscular debido a la inserción de 12 aminoácidos en la región rica en prolina. La distrofia muscular en cepas D2 de ratones es más grave. Las ratas, perros, vacas y los seres humanos albergan cada uno una deleción más grande de la región rica en prolina de LTBP4.

La figura 3 representa los resultados de estudios que utilizan fragmentos de LTBP4 humano y de ratón que se expresaron y digirieron. El LTBP4 humano se escinde más fácilmente que el LTBP4 murino. Las posiciones de aminoácidos indicadas para TP y TP2E se basan en la secuencia de la isoforma humana de LTBP4 (SEQ ID NO: 1).

La figura 4 representa los resultados de los estudios que utilizan un anticuerpo de bloqueo diseñado para reconocer y unirse a la región rica en prolina (Y) de LTBP4. Cuando se incuba con los lisados celulares que expresan LTBP4, la presencia del anticuerpo inhibe la escisión por plasmina. Un anticuerpo inespecífico no inhibió la escisión.

La figura 5 representa que la región rica en prolina del LTBP4 humano se escinde más fácilmente que el LTBP4 murino.

La figura 6 muestra los resultados de un estudio que usa un anticuerpo de bloqueo que inhibe la escisión de LTBP4 de longitud completa. Un anticuerpo de bloqueo inespecífico no mostró efecto. Los ensayos se realizaron por triplicado con una inhibición significativa de la proteólisis observada.

La figura 7 muestra los resultados de un estudio en el que se cruzó un transgén artificial bacteriano que expresa LTBP4 humano (hLTBP4 Tg) en el modelo mdx de ratón de distrofia muscular de Duchenne. (A) Los ratones hLTBP4/mdx tienen fibrosis aumentada en sus músculos, según se determina en gran medida mediante histología y cuantificación directa. Cuando se cuantificó, el área fibrótica se incrementó en ratones hLTBP4/mdx en comparación con los ratones mdx de la camada. (B) Los ratones hLTBP4/mdx tienen una fuerza de agarre reducida. La fuerza de agarre se comparó entre ratones hLTBP4/mdx y ratones mdx para determinar si el gen humano de LTBP4 empeora la enfermedad muscular observada en ratones mdx. Los ratones hLTBP4/mdx son más débiles que sus hermanos mdx (*). La fuerza de agarre se midió utilizando los protocolos estándar Treat NMD.

La figura 8 muestra que LTBP4 forma un complejo con miostatina. Las células HEK293 se transfectaron con LTBP4 y miostatina marcada con epítopo. LTBP4 se precipitó con dos anticuerpos anti-LTBP4 diferentes (carriles 3 y 5) y, a continuación, el precipitado se inmunotransfirió con anticuerpo anti-myc. La miostatina no procesada se detectó en el inmunoprecipitado (flecha). La banda superior en los carriles 1 y 2 que migra por encima de 50 KDa es c-myc endógena, que tiene 63 KDa.

La figura 9 representa los resultados de experimentos que prueban los efectos de la cardiotoxina tanto en ratones de tipo salvaje como en ratones transgénicos que expresan LTBP4 humano. A) Los ratones transgénicos mostraron una lesión aumentada después de la lesión por cardiotoxina vista como un mayor infiltrado inflamatorio de células mononucleares y fibrosis y depósito de grasa en el músculo lesionado. B) Los niveles de la proteína LTBP4 aumentan después de la lesión.

La figura 10 muestra que los anticuerpos anti-LTBP4 mitigan la lesión muscular in vivo. En comparación con los ratones a los que se inyectó PBS, los ratones tratados con anticuerpos LTBP4-831 mostraron una nucleación central reducida (panel A) y una fibrosis reducida (panel B) después de la inyección de cardiotoxina.

La figura 11 muestra que el aumento de la señalización de TGFp está asociado con una mayor infiltración de macrófagos en el músculo hLTBP4/mdx en comparación con el músculo mdx. A) Los músculos se tiñeron con anticuerpos contra macrófagos activados usando el anticuerpo F4/80. B) El músculo hLTBP4/mdx muestra un aumento en la proteína LTBP4 escindida en comparación con mdx, mientras que se ve poca proteína LTBP4 en los músculos de tipo salvaje y hLTBP4 en ausencia de lesión o distrofia muscular. C) La escisión proteolítica y un cambio conformacional en LTBP4 se asocia con la liberación de TGFp.

Descripción detallada

La superfamilia del factor de crecimiento transformante beta (TGFp) consiste en más de 40 miembros, incluido TGFp, activinas, inhibinas, factores de diferenciación del crecimiento y proteínas morfogenéticas óseas (BMP). Todos los miembros de esta familia comparten elementos de secuencia comunes y motivos estructurales. Son reguladores multifuncionales de la división, diferenciación, migración, adhesión, organización y muerte celular, estimulación de la producción de matriz extracelular (MEC), homeostasis tisular y embriogénesis [Massague et al., Genes Dev 19: 2783-810 (2005); Javelaud et al., Int J Biochem Cell Biol 36: 1161-5 (2004); Moustakas et al., Immunol Lett 82: 85-91 (2002)]. Entre estas proteínas, El TGFp tiene un papel crucial en la homeostasis de los tejidos y la interrupción de la vía del TGFp se ha implicado en muchas enfermedades humanas, incluyendo cáncer, autoinmunes, enfermedades fibróticas y cardiovasculares [Ruiz-Ortega et al., Cardiovascular Research 74: 196 - 206 (2007)].

El TGFp se sintetiza como una proteína inactiva, llamada TGFp latente, que consiste en una región principal y un péptido asociado a la latencia (LAP). Esta proteína interactúa con las proteínas de unión a TGFp latente (por ejemplo, LTBP4) y está anclada en la matriz extracelular (MEC). El TGFp se activa después de la proteólisis de LTBp4, lo que da como resultado la liberación de TGFp. Específicamente, y como se desvela en el presente documento, la región rica en prolina de LTBP4 es susceptible a la proteólisis por una proteasa y esta proteólisis conduce a la liberación y activación de TGFp.

A continuación, el TGFp activo une sus receptores y funciones de manera autocrina y paracrina para ejercer sus actividades biológicas y patológicas a través de vías de señalización independientes y dependientes de Smad [Lan, Int J Biol Sci 7(7): 1056-1067 (2011); Derynck et al., Nature.425: 577-84 (2003)].

Por tanto, la inhibición de la proteólisis de LTBP4 inhibirá la liberación de TGFp unido y el secuestro resultante del TGFp inhibirá los efectos de señalización aguas abajo del TGFp, lo que da como resultado la mitigación de la enfermedad relacionada con TGFp.

Los ejemplos de trabajo y los datos experimentales desvelados en el presente documento demuestran que la región rica en prolina de LTBp4 es susceptible a la proteólisis. Estos resultados apoyan la terapéutica y las terapias dirigidas a modular la proteólisis de LTBP4 en un paciente que tiene una enfermedad relacionada con el TGFp. Los resultados experimentales desvelados en el presente documento también demuestran que la proteólisis de LTBP4 puede ser inhibida por anticuerpos. Se espera que la inhibición de la proteólisis de LTBP4 utilizando enfoques farmacológicos proporcione un enfoque eficaz para el tratamiento de enfermedades relacionadas con TGFp.

Los resultados experimentales desvelados en el presente documento demuestran adicionalmente que un fragmento de LTBP4 humano es más susceptible a la proteólisis que la secuencia de LTBP4 de ratón. Por consiguiente, un fenómeno dilucidado en el ratón se refleja en seres humanos y se espera que la inhibición de la proteólisis de LTPB4 proporcione un tratamiento eficaz para las enfermedades relacionadas con el TGFp.

A menos que se defina de otro modo en el presente documento, los términos científicos y técnicos empleados en la divulgación tendrán los significados que un experto en la materia entiende y usa habitualmente. A no ser que el contexto requiera otra cosa, se entenderá que los términos en singular incluirán las formas en plural de los mismos y los términos en plural incluirán el singular. Específicamente, tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones, las formas en singulares "un" y "uno/una" incluyen la referencia en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Como se usa en la divulgación, el término "tratar" o "tratamiento" se refiere a una intervención realizada con la intención de prevenir el desarrollo adicional o alterar la patología de una enfermedad o infección. Por consiguiente, "tratamiento" se refiere tanto a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas. Como es evidente, cuando "tratamiento" se usa junto con una forma del término separado "profilaxis" se entiende que "tratamiento" se refiere al significado más limitado de alterar la patología de una enfermedad o afección. "Prevenir" se refiere a una medida preventiva tomada con un sujeto que no tiene una afección o enfermedad. Un agente terapéutico puede disminuir directamente la patología de una enfermedad o hacer que la enfermedad sea más susceptible al tratamiento por otro u otros agentes terapéuticos, por ejemplo, el sistema inmunitario del huésped. El tratamiento de pacientes que sufren síntomas clínicos, bioquímicos o subjetivos de una enfermedad puede incluir aliviar uno o más de dichos síntomas o reducir la predisposición a la enfermedad. La mejoría después del tratamiento puede manifestarse como una disminución o eliminación de uno o más de tales síntomas.

Tal y como se usa en el presente documento, la frase "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad de un compuesto terapéutico (es decir, una cantidad terapéuticamente efectiva), profiláctico (es decir, una cantidad profilácticamente efectiva) o mitigador de síntomas (es decir, una cantidad efectiva mitigadora de síntomas) (por ejemplo, agente o segundo agente) suficiente para modular la proteólisis de la proteína 4 de unión a TGFp latente (LTBP4), tal como sería apropiado para una realización de la divulgación a la hora de obtener la respuesta o efecto terapéutico, profiláctico o atenuante de los síntomas deseado, incluyendo el alivio de uno o más de tales síntomas de enfermedad o la reducción de la predisposición a la enfermedad.

Tal y como se usa en el presente documento, "hibridación" significa el emparejamiento de cadenas sustancialmente complementarias de compuestos poliméricos. Un mecanismo de emparejamiento implica enlaces de hidrógeno, que puede ser de Watson-Crick, Hoogsteen o enlace de hidrógeno de Hoogsteen invertido, entre bases de nucleótidos complementarias (nucleótidos) de las cadenas de compuestos poliméricos. Por ejemplo, la adenina y la timina son nucleótidos complementarios que se emparejan mediante la formación de enlaces de hidrógeno. La hibridación se puede producir en varias circunstancias.

Un compuesto antisentido es "específicamente hibridable" cuando la unión del compuesto al ácido nucleico diana interfiere con la función normal del ácido nucleico diana para causar una modulación de la función y/o actividad, y hay un grado suficiente de complementariedad para evitar la unión inespecífica del compuesto antisentido a secuencias de ácido nucleico no diana en condiciones en las que se desea una unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de aplicaciones in vivo, tales como tratamiento terapéutico, y en condiciones en las que se realizan ensayos en el caso de ensayos in vitro.

Tal y como se usa en el presente documento, la frase "condiciones de hibridación rigurosas" o "condiciones rigurosas" se refiere a condiciones en las que un compuesto (por ejemplo, agente) desvelado en el presente documento hibridará con su secuencia diana, pero con un número mínimo de otras secuencias. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias y en el contexto de esta divulgación, "condiciones rigurosas" en las que los compuestos poliméricos se hibridan con una secuencia diana están determinados por la naturaleza y composición de los compuestos poliméricos y por la aplicación o aplicaciones implicadas. En general, las condiciones de hibridación rigurosas comprenden concentraciones bajas (<0,15 M) de sales con cationes inorgánicos tales como Na⁺⁺ o K⁺⁺ (es decir, fuerza iónica baja), temperaturas superiores a 20 °C-25 ° C por debajo de la T^m del complejo compuesto polimérico:secuencia diana y la presencia de desnaturalizantes, tales como formamida, dimetilformamida, dimetilsulfóxido, o el detergente dodecilsulfato de sodio (SDS). Un ejemplo de un conjunto de condiciones de hibridación de alta rigurosidad es 0,1X de tampón de cloruro de sodio-citrato de sodio (SSC)/0,1 % (p/v) SDS a 60 °C durante 30 minutos.

"Complementario", tal y como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de emparejamiento preciso entre dos nucleótidos en una o dos cadenas poliméricas. De acuerdo con las reglas de emparejamiento de bases de Watson-Crick (A se une a T o U; G se une a C; donde A, G, C, T y U son los monofosfatos de ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos convencionales). "Específicamente hibridable" y "complementario" son términos que se usan para indicar un grado suficiente de apareamiento preciso o de complementariedad sobre un número suficiente de nucleótidos de forma que se produzca una unión estable y específica entre el compuesto polimérico y un ácido nucleico diana. Por lo tanto, los términos permiten brechas de emparejamiento de bases, pero no en la medida en que impida la unión estable y específica.

En la técnica se entiende que la secuencia de un compuesto polimérico no necesita ser el 100 % complementaria a la de su ácido nucleico diana para que sea específicamente hibridable. Por otra parte, un polinucleótido puede hibridarse sobre uno o más segmentos de modo que los segmentos intermedios o adyacentes no estén implicados en el suceso de hibridación (por ejemplo, una estructura de bucle, emparejamiento erróneo o estructura de horquilla). Los compuestos poliméricos de la presente divulgación comprenden al menos aproximadamente un 70 % o al menos aproximadamente un 75 % o al menos aproximadamente un 80 % o al menos aproximadamente un 85 % o al menos aproximadamente un 90 % o al menos aproximadamente un 95 % o al menos aproximadamente un 99 % de complementariedad de secuencia a una región diana, dentro de la secuencia de ácido nucleico diana a la que se dirigen. Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de 20 nucleótidos del compuesto antisentido son complementarios a una región diana y, por lo tanto, se hibridarían específicamente, representaría el 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, los nucleótidos no complementarios restantes pueden estar agrupados o intercalados con nucleótidos complementarios y no tienen que ser contiguos entre sí o con nucleótidos complementarios. Como tal, un compuesto antisentido que tiene 18 nucleótidos de longitud que tiene 4 (cuatro) nucleótidos no complementarios que están flanqueados por dos regiones de complementariedad completa con el ácido nucleico diana tendría un 77,8 % de complementariedad global con el ácido nucleico diana y, por lo tanto, estaría dentro del alcance de la presente divulgación. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico diana puede determinarse mediante el uso de software y algoritmos de comparación de secuencias de rutina, por ejemplo, programas BLAST (herramientas básicas de búsqueda de alineación local) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica [Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990); Zhang y Madden, Genome Res., 7: 649-656 (1997)]. El porcentaje de homología, la identidad o la complementariedad de secuencia se pueden determinar mediante, por ejemplo, el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), usando configuraciones predeterminadas, que utiliza el algoritmo de Smith y Waterman [Adv. Appl. Math., 2: 482-489 (1981)].

Tal y como se usa en el presente documento, el término "(T^m)" significa temperatura de fusión y se refiere a la temperatura, bajo una fuerza iónica, un pH y concentración de ácido nucleico definidos, a la que el 50 % de los polinucleótidos complementarios a la secuencia diana hibridan con la secuencia diana en equilibrio. Normalmente, las condiciones rigurosas serán aquellas en las que la concentración de sal es al menos aproximadamente de 0,01 a 1,0 M de concentración de iones de sodio (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3 y la temperatura es de al menos aproximadamente 30 °C para polinucleótidos cortos (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos). También pueden lograrse condiciones rigurosas con la adición de agentes desestabilizantes, tales como formamida.

Tal y como se usa en el presente documento, la "modulación" de una actividad significa un aumento (estimulación) o una disminución (inhibición) de esa actividad. Por ejemplo y sin limitación, una modulación de la proteólisis puede significar un aumento de la proteólisis o una disminución de la proteólisis.

PROTEÍNA 4 DE UNIÓN A TGFp LATENTE (LTBP4)

La presente divulgación se refiere, en parte, a Ltbp4, codificando el gen la proteína de unión a TGFp latente (LTBP4; número de acceso de GenBank NP_001036009.1; SQ ID NO: 1), que se identificó en un cribado genético como un modificador genético principal de la distrofia muscular [Heydemann et al., J Clin Invest. 119: 3703-12 (2009)]. Este cribado genético se realizó utilizando ratones que carecían de la proteína asociada a la distrofina, Y-sarcoglicano (ratones nulos para Sgcg). Se seleccionó el modelo Sgcg de distrofia muscular de cinturas (LGMD) porque había amplia evidencia por la LGMD humana de la importancia de los modificadores genéticos que afectan a la gravedad de esta enfermedad [McNally et al., Am J Hum Genet. 59:1040-7 (1996)]. Sorprendentemente, se descubrió que los modificadores identificados para la distrofia muscular mediada por sarcoglicanos modifican de manera similar la DMD. La interrupción del complejo de glucoproteína distrofina, ya sea en la DMD o en las LGMD asociadas a sarcoglicano, conduce a una membrana muscular frágil, descomposición mejorada de miofibras y reemplazo de tejido muscular normal por fibrosis. En estadios tempranos de la patología, el reemplazo fibrótico es mínimo, pero en el paciente con DMD avanzada, el músculo es reemplazado casi por completo por fibrosis.

El LTBP4 se encuentra en el cromosoma humano 19q13.1-q13.2, y es una proteína de la matriz extracelular que se une y secuestra TGFp (Figura 1). El LTBP4 modifica la distrofia muscular murina a través de un polimorfismo en el gen Ltbp4. Hay dos variantes comunes del gen Ltbp4 en ratones. La mayoría de las cepas de ratones, incluyendo el ratón mdx, tienen el alelo de inserción en Ltbp4 (Ltbp4^I/I). La inserción de 36 pares de bases (12 aminoácidos) en la región rica en prolina de LTBP4 codificada por Ltbp4" conduce a una enfermedad más leve. La deleción de 36 pb/12aa en la región rica en prolina se asocia con una enfermedad más grave (Ltbp4D/D)(Figura 2). Se descubrió que el genotipo Ltbp4 se correlacionaba fuertemente con dos aspectos diferentes de la patología de la distrofia muscular, es decir, fuga de membrana y fibrosis, y estas características definen la patología de DMD.

Para evaluar la fuga de la membrana muscular, se usó colorante azul de Evans (EBD), que puede formar complejos con seroalbúmina y, por lo tanto, es una medida de la permeabilidad de la membrana. El EBD se inyecta por vía intraperitoneal y los músculos de los animales inyectados se extirpan aproximadamente 8-40 horas más tarde. La fuga de la membrana muscular se evaluó determinando la cantidad de EBD en múltiples grupos musculares diferentes, incluyendo el cuádriceps y otros músculos esqueléticos. El contenido de hidroxiprolina se midió para cuantificar la fibrosis, y este ensayo también se realizó en múltiples grupos musculares diferentes. Se descubrió que el genotipo Ltbp4 representaba casi el 40 % de la variación en la fuga de membrana en el músculo cuádriceps [Swaggart et al., Physiol Genomics 43: 24-31 (2011)]. De forma análoga, el genotipo Ltbp4 también se correlacionó altamente con la fibrosis en los músculos esqueléticos de las extremidades, donde también representaba una cantidad significativa de la variación. Ltbp4 es un modificador genético inusualmente fuerte y actúa tanto en la fragilidad de la membrana como en la fibrosis. Por consiguiente, la presente divulgación identifica al LTBP4 como una diana para la terapia porque estabilizará la membrana plasmática además de reducir la fibrosis en pacientes que lo necesitan.

Como se ha tratado anteriormente, el LTBP4 es una proteína asociada a la matriz que se une y secuestra el TGFp. El TGFp en esta forma es el complejo latente grande, lo que requiere más proteólisis para volverse completamente activo. Se espera que el TGFp latente unido a la matriz sea la forma menos activa con respecto al acoplamiento al receptor y, por lo tanto, representa una etapa ideal para inhibir la liberación de TGFp. LTBP4, el cuarto miembro de la familia de proteínas transportadoras de LTBP, está altamente expresado en el corazón, el músculo, los pulmones y el colon [Saharinen et al., J Biol Chem. 273: 18459-69 (1998)]. La proteína LTBP4, como otros miembros de esta familia, puede ser proteolizada con plasmina, lo que da como resultado la liberación de TGFp [Saharinen et al., J Biol Chem. 273: 18459-69 (1998); Ge, et al., J Cell Biol. 175: 111-20 (2006)]. La inserción/deleción de 12 aminoácidos altera la susceptibilidad de LTBP4 a la proteólisis, lo que a su vez altera la liberación de TGFp y su capacidad para unir receptores de TGFp y activar la señalización. En el presente documento se desvela que la inhibición de la escisión de LTBP4 mantendrá el TGFp inactivo y limitará los efectos aguas abajo de la liberación de TGFp.

AGENTES

La divulgación contempla el tratamiento de un paciente que tiene una enfermedad relacionada con el TGFp que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de un agente que modula la proteólisis de LTBP4.

El término "agente" en este contexto se refiere a un anticuerpo, un péptido y combinaciones de los mismos.

Anticuerpos

El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio e incluye anticuerpos completamente ensamblados, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), fragmentos de anticuerpos que pueden unirse al antígeno (por ejemplo, Fab', F'(ab)², Fv, anticuerpos monocatenarios, diacuerpos), cuerpos de camello y péptidos recombinantes que comprenden lo anterior, siempre que presenten la actividad biológica deseada. Los fragmentos de anticuerpos pueden producirse usando técnicas de ADN recombinante o mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos y se describen más adelante. Los ejemplos no limitantes de anticuerpos monoclonales incluyen inmunoglobulinas murinas, quiméricas, humanizadas, humanas y de ingeniería humana, anticuerpos, proteínas de fusión quiméricas que tienen secuencias derivadas de inmunoglobulinas, o muteínas o derivados de las mismas, cada uno de ellos se describe más adelante. Se contemplan multímeros o agregados de moléculas intactas y/o fragmentos, incluyendo anticuerpos químicamente derivados. Se contemplan anticuerpos de cualquier clase o subclase de isotipo.

La expresión "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos salvo por las posibles mutaciones que tienen lugar de manera natural que pueden estar presentes en pequeñas cantidades. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos, dirigiéndose contra un único sitio antigénico. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que normalmente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra determinantes diferentes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante del antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque se sintetizan en un cultivo homogéneo, no contaminado por otras inmunoglobulinas con diferentes especificidades y características.

El modificador "monoclonal" indica la naturaleza del anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo por ningún método concreto. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para su uso de acuerdo con la divulgación pueden prepararse por el método de hibridoma descrito en primer lugar por Kohler et al., Nature 256:495 (1975) o pueden prepararse mediante métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos número 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden ser recombinantes, quiméricos, humanizados, humanos, Human Engineered™, o fragmentos de anticuerpos, por ejemplo.

Los anticuerpos descritos en el presente documento se tratan en el Ejemplo 3. En ciertas realizaciones, se contempla una variante de un anticuerpo de la divulgación. Por "variante" se entiende un anticuerpo que comprende una o más sustituciones de aminoácidos, deleciones de aminoácidos o adiciones de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos de referencia. Las variantes incluyen, aunque sin limitación, anticuerpos que tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de un anticuerpo proporcionado en el presente documento, siempre que la variante de anticuerpo conserve la capacidad de bloquear y/o inhibir la proteólisis de LTBP4.

En realizaciones adicionales, un anticuerpo anti-LTBP4 descrito en el presente documento se une específicamente al menos a un péptido seleccionado del grupo que consiste en péptidos que tienen una secuencia establecida en las SEQ ID NO: 2-5, o un péptido seleccionado del grupo que consiste en péptidos que tienen una secuencia al menos un 70 % idéntica a un péptido que tiene una secuencia establecida en las SEQ ID NO: 2-5. En realizaciones adicionales, un anticuerpo anti-LTBP4 descrito en el presente documento se une al menos a un epítopo de LTBP4 con una afinidad de 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10'1° M, 10'11 M o 10'12 M o menos (menor significa mayor afinidad de unión) u, opcionalmente, se une a todo el LTBP4 con una afinidad de 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 1°'10 M, 10'11 M o 10'12 M o menos. En otras realizaciones, un anticuerpo descrito en el presente documento "se une específicamente" a LTBP4 con al menos 2-50 veces, 10-100 veces, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 25 veces, 50 veces o 100 veces, o 20-50 %, 50-100 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 % afinidad más alta en comparación con la unión a una proteína no diana.

Los anticuerpos descritos a continuación en el presente documento son adecuados para su uso en los métodos descritos en el presente documento. También se contemplan anticuerpos adicionales, siempre que el anticuerpo posea la propiedad de modular la proteólisis o de regular por aumento la actividad de LTBP4. Dichos anticuerpos pueden, por ejemplo, humanizarse de acuerdo con técnicas conocidas y modificarse y/o formularse para permitir la liberación y el contacto intracelular con LTBP4.

Péptidos

La divulgación proporciona péptidos que tienen la capacidad de actuar como sustrato para una proteasa (es decir, "un péptido sustrato de proteasa"). La proteasa, como se describe en el presente documento, significa una proteasa que puede escindir el LTBP4. En una realización, la proteasa es una serina proteasa. En realizaciones adicionales, la proteasa se selecciona del grupo que consiste en plasmina, leucocito elastasa, elastasa pancreática, quimasa de mastocitos humanos, tripsina, quimiotripsina, pepsina y papaína.

Un experto en la materia puede determinar fácilmente la capacidad de un péptido para actuar como sustrato para una proteasa. A modo de ejemplo no limitante, un péptido puede probarse in vitro incubando una proteína LTBP4 marcada (o un fragmento marcado de la misma) con un péptido candidato y una serina proteasa. El marcador puede ser cualquier marcador detectable conocido en la técnica y en una realización es un marcador radiactivo. Después de la incubación y posterior electroforesis en gel, se puede determinar si la proteína LTBP4 (o fragmento de la misma) era refractaria a la proteólisis en función del tamaño de la proteína en el gel. Si la proteína LTBP4 no estaba protegida de la proteólisis por el péptido, la banda radioactiva en el gel será más pequeña de lo que cabría esperar para una proteína LTBP4 de longitud completa. Por tanto, mientras que las secuencias peptídicas desveladas en el presente documento se contemplan para su uso de acuerdo con los métodos de la divulgación, también se contemplan péptidos adicionales, con la condición de que sean capaces de actuar como sustrato para una proteasa de una manera que los convierta en un inhibidor de la proteólisis de LTBP4.

El uso de uno o más péptidos o anticuerpos de la divulgación, cada uno de los cuales tiene la capacidad de actuar como un sustrato para una proteasa (péptido) o para actuar como un inhibidor de la proteólisis (anticuerpo), se espera que regule por aumento la actividad de LTBP4 en comparación con la actividad de LTBP4 en ausencia de uno o más péptidos. En este contexto, la regulación por aumento de la actividad de LTBP4 es el resultado de su protección contra la proteólisis a través de la acción de uno o más péptidos y/o anticuerpos de la divulgación. El efecto aguas abajo de esta regulación por aumento de la actividad de LTBP4 es la regulación por disminución concomitante de la señalización de TGFp. El LTBP4 intacto continuará uniendo y secuestrando el TGFp y así evitará su liberación y los posteriores efectos aguas abajo. Por tanto, en diversas realizaciones, la regulación por aumento de la actividad de LTBP4 se mide cuantificando la señalización de TGFp. Los expertos en la técnica conocen métodos para cuantificar la señalización de TGFp e incluyen la determinación de la señalización de Simad a partir de una muestra biológica obtenida de un paciente. Se contempla que, en algunas realizaciones, la señalización de Smad en un paciente al que se administra uno o más agentes y/o agentes adicionales de la divulgación se reduce en al menos aproximadamente el 1 % y hasta aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 40 % o aproximadamente el 50 % en relación con un paciente no tratado de esta manera. En realizaciones adicionales, la señalización de Smad en un paciente al que se administra uno o más agentes y/o agentes adicionales de la divulgación se reduce en al menos aproximadamente el 10 % y hasta aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 99 % o más en relación con un paciente no tratado de esta manera. En realizaciones específicas, la señalización de Smad en un paciente al que se está administrando uno o más agentes y/o agentes adicionales de la divulgación se reduce en al menos aproximadamente el 1 %, aproximadamente el 2 %, aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 99 % o más en relación con un paciente no tratado de esta manera.

Los péptidos descritos anteriormente (es decir, inhibidores peptídicos de la proteólisis LTBP4) se exponen en el Ejemplo 3 y la Tabla 1. Por tanto, en ciertas realizaciones, el péptido comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 2-5 o una variante de cualquiera de los anteriores. Por "variante" se entiende un péptido que comprende una o más sustituciones de aminoácidos, deleciones de aminoácidos o adiciones de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos de referencia (por ejemplo, una cualquiera de las SEQ ID NO: 2-5). Las variantes incluyen, aunque sin limitación, péptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos el 70%, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a cualquiera de las secuencias de aminoácidos proporcionadas en el presente documento mientras conserva la capacidad de actuar como sustrato para una proteasa.

En un aspecto, el péptido consiste en 35 aminoácidos o menos. En diversas realizaciones, el péptido comprende 15­ 35 restos de aminoácidos (por ejemplo, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 o 35 restos de aminoácidos). También se contempla que un péptido descrito en el presente documento que comprende una o más deleciones es adecuado en el contexto de la divulgación siempre que el péptido pueda actuar como un sustrato para una proteasa. En algunas realizaciones, los aminoácidos se eliminan de la secuencia de aminoácidos, en el N-terminal y/o en el C-terminal. Dichos fragmentos de péptidos pueden comprender 3-14 restos de aminoácidos (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 restos de aminoácidos).

Opcionalmente, el péptido comprende una o más sustituciones de aminoácidos (con referencia a cualquiera de las secuencias de aminoácidos proporcionadas en el presente documento) que no destruyen la capacidad del péptido para actuar como un sustrato para una proteasa. Las sustituciones de aminoácidos incluyen, aunque sin limitación, aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran las afinidades de unión y/o (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales en un péptido. En un aspecto, la sustitución es una sustitución conservadora, en la que un resto de aminoácido se reemplaza con un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica e incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina e histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico y ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina y cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina y triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina e isoleucina) y cadenas laterales con carácter aromático (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano e histidina). Se apreciará, sin embargo, que un responsable de la práctica no se limita a sustituciones conservadoras, siempre que el péptido resultante conserve la capacidad de actuar como sustrato, total o parcialmente, para una proteasa. La divulgación también abarca péptidos sustratos de proteasa que comprenden aminoácidos atípicos que no son de origen natural, que son bien conocidos en la técnica. Los aminoácidos individuales pueden tener estereoquímica L o D cuando sea apropiado, aunque la estereoquímica L se emplea normalmente para todos los aminoácidos en el péptido.

La divulgación incluye además variantes de péptido sustrato de proteasa que comprenden uno o más aminoácidos insertados dentro de una secuencia de aminoácidos proporcionada en el presente documento y/o unida al extremo N o al extremo C. En algunas realizaciones, el péptido comprende además uno o más aminoácidos que facilitan la síntesis, manipulación o uso del péptido que incluye, aunque sin limitación, una o dos lisinas en el N-terminal y/o C-terminal para aumentar la solubilidad del péptido. Las proteínas de fusión adecuadas incluyen, aunque sin limitación, proteínas que comprenden un péptido unido a otro polipéptido, un fragmento de polipéptido, o aminoácidos que generalmente no se reconocen como parte de la secuencia de la proteína. En algunas realizaciones, un péptido de fusión comprende las secuencias de aminoácidos completas de dos o más péptidos o, como alternativa, comprende porciones (fragmentos) de dos o más péptidos. Además de todo o parte de los péptidos descritos en el presente documento, una proteína de fusión incluye opcionalmente todo o parte de cualquier péptido adecuado que comprende una actividad/función biológica deseada. De hecho, en algunas realizaciones, un péptido está operativamente unido a, por ejemplo, uno o más de los siguientes: un péptido con una semivida en circulación larga, una proteína marcadora, un péptido que facilita la purificación del péptido sustrato de proteasa, una secuencia peptídica que promueve la formación de proteínas multiméricas o un fragmento de cualquiera de los anteriores. En una realización, dos o más péptidos sustrato de proteasa se fusionan, unidos mediante un dominio de multimerización o unidos mediante un enlace químico para generar un complejo de péptido sustrato de proteasa. Los péptidos sustrato de proteasa pueden ser iguales o diferentes.

Los "derivados" también se contemplan en la divulgación e incluyen péptidos sustrato de proteasa que se han modificado químicamente de alguna manera distinta de la adición, deleción o sustitución de aminoácidos. En este sentido, un péptido proporcionado en el presente documento está unido químicamente con polímeros, lípidos, otros restos orgánicos y/o restos inorgánicos. Los derivados se preparan en algunas situaciones para aumentar la solubilidad, absorción o semivida circulante. Varias modificaciones químicas eliminan o atenúan cualquier efecto secundario indeseable del agente. En este sentido, la divulgación proporciona péptidos sustrato de proteasa modificados covalentemente para incluir uno o más enlaces poliméricos solubles en agua. Los polímeros útiles conocidos en la técnica incluyen, aunque sin limitación, polietilenglicol, polioxietilenglicol, polipropilenglicol, monometoxi-polietilenglicol, dextrano, celulosa, poli-(N-vinilpirrolidona)-polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, un copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol) y alcohol polivinílico, así como mezclas de cualquiera de los anteriores. Para una discusión más detallada sobre las uniones de polímeros solubles en agua, véanse las patentes de Estados Unidos números 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192; y 4,179,337. En otras realizaciones, un derivado peptídico incluye un resto dirigido específico para un tipo de célula, tejido y/u órgano particular. Como alternativa, el péptido está unido a uno o más restos químicos que facilitan la purificación, detección, multimerización y/o caracterización de la actividad peptídica.

Los derivados también incluyen péptidos que comprenden aminoácidos modificados o no proteinógenos o un grupo enlazador modificado [véase, por ejemplo, Grant, Synthetic Peptides: A User's Guide, Oxford University Press (1992)]. Los aminoácidos modificados incluyen, por ejemplo, aminoácidos en los que el grupo amino y/o carboxilo está reemplazado por otro grupo. Los ejemplos no limitantes incluyen aminoácidos modificados que incorporan tioamidas, ureas, tioureas, acilhidrazidas, ésteres, olefinas, sulfonamidas, amidas de ácido fosfórico, cetonas, alcoholes, amidas de ácido borónico, benzodiazepinas y otros heterociclos aromáticos o no aromáticos [véase Estiarte et al., Burgers Medicinal Chemistry, 6a edición, Volumen 1, Parte 4, John Wiley & Sons, New York (2002)]. Los aminoácidos modificados a menudo están conectados al péptido con al menos uno de los grupos funcionales mencionados anteriormente en lugar de un enlace amida. Los aminoácidos no proteinógenos incluyen, aunque sin limitación, a p-alanina (p-Ala), norvalina (Nva), norleucina (Nle), ácido 4-aminobutírico (Y-Abu), ácido 2-aminoisobutírico (Aib), ácido 6-aminohexanoico (£-Ahx), ornitina (orn), hidroxiprolina (Hyp), sarcosina, citrulina, ácido cisteico (Coh), ciclohexilalanina, metioninasulfóxido (Meo), metioninasulfona (Moo), éster de homoserinametilo (Hsm), propargilglicina (Eag), 5-fluorotriptófano (5Fw), 6-fluorotriptófano (6Fw), 3',4'-dimetoxifenil-alanina (Ear), 3',4'-difluorofenilalanina (Dff), 4'-fluorofenilalanina (Pff), 1-naftilalanina (1Ni), 1-metiltriptófano (1Mw), penicilamina (Pen), homoserina (HSe), ácido a-amino isobutírico, t-butilglicina, t-butiladenina, fenilglicina (Phg), benzotienilalanina (Bta), L-homo-cisteína (L-Hcys), N-metil-fenilalanina (NMF), 2-tienilalanina (Thi), 3,3-difenilalanina (Ebw), homofenilalanina (Hfe), s-bencil-L-cisteína (Ece) y ciclohexilalanina (Cha). Estos y otros aminoácidos no proteinógenos pueden existir como isómeros D o L y los isómeros D de aminoácidos proteinógenos también se pueden encontrar en derivados.

Los ejemplos de enlazadores modificados incluyen, aunque sin limitación, el enlazador flexible 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanodiamina (Ttds), glicina, ácido 6-aminohexanoico, beta-alanina y combinaciones de Ttds, glicina, ácido 6-aminohexanoico y beta-alanina.

Los péptidos sustrato de proteasa se elaboran de diversas maneras. En algunas realizaciones, los péptidos se sintetizan mediante técnicas de síntesis en fase sólida, incluidas las descritas en Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1963); Davis et al., Biochem. Intl. 10: 394-414 (1985); Larsen et al., J. Am. Chem. Soc. 115: 6247 (1993); Smith et al., J. Peptide Protein Res. 44:183 (1994); O'Donnell et al., J. Am. Chem. Soc. 118: 6070 (1996); Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman (1969); Finn et al., The Proteins, 3a ed., vol. 2, pp. 105-253 (1976); y Erickson et al., The Proteins, 3a ed., vol. 2, pág. 257-527 (1976). Como alternativa, el péptido sustrato de proteasa se expresa de forma recombinante mediante la introducción de un ácido nucleico que codifica un péptido sustrato de proteasa en las células huésped que se cultivan para expresar el péptido. Dichos péptidos se purifican del cultivo celular usando técnicas estándar de purificación de proteínas.

La divulgación también abarca un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo o péptido sustrato de proteasa. Los métodos para preparar moléculas de ADN y/o ARN son bien conocidos en la técnica. En un aspecto, una molécula de ADN/ARN que codifica un anticuerpo o péptido sustrato de proteasa proporcionado en el presente documento se genera usando técnicas de síntesis química y/o usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Si se desea, una secuencia codificante de anticuerpo y/o péptido sustrato de proteasa se incorpora en un vector de expresión. Un experto en la materia apreciará que cualquiera de los diversos vectores de expresión conocidos en la técnica son adecuados en el contexto de la divulgación, tales como, aunque sin limitación, plásmidos, complejos de plásmido-liposoma y vectores virales. Cualquiera de estos vectores de expresión se prepara utilizando técnicas estándar de ADN recombinante descritas en, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates y John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y. (1994). Opcionalmente, el ácido nucleico está operativamente unido a una o más secuencias reguladoras, tal como un promotor, activador, potenciador, señal cap, señal de poliadenilación u otra señal implicada en el control de la transcripción o la traducción.

Como con todos los agentes de unión y ensayos de unión, un experto en esta técnica reconoce que los diversos restos a los que un agente de unión no debe unirse de manera detectable para ser biológicamente (por ejemplo, terapéuticamente) eficaces serían exhaustivos y poco prácticos para enumerar. Por tanto, cuando se habla de un péptido, la expresión "se une específicamente" se refiere a la capacidad de un péptido para unirse (o inhibir) una proteasa implicada en la escisión de LTBP4 con mayor afinidad que la que se une a una proteína de control no diana que no es la proteasa. Por ejemplo, el péptido puede unirse a la proteasa con una afinidad que es, al menos, 5, 10, 15, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000 o 10.000 veces mayor que la afinidad por una proteína de control. En algunas realizaciones, el péptido se une a la proteasa con mayor afinidad de la que se une a un "anti-diana", una proteína u otra sustancia de origen natural en seres humanos en la que la unión del péptido puede provocar efectos adversos. Varias clases de péptidos son potenciales anti-dianas. Debido a que se espera que los péptidos sustrato de proteasa ejerzan su actividad en la matriz extracelular, Las proteínas de la MEC se contemplan como anti-dianas.

La divulgación también contempla específicamente los péptidos que provocan una respuesta inmunitaria a LTBP4 en los métodos para modular LTBP4 que implican el sistema inmunitario del huésped. Por tanto, en algunos aspectos, se proporciona una composición que comprende un péptido de la divulgación para su uso como vacuna en un individuo. Las vacunas a menudo incluyen un adyuvante. Las composiciones que comprenden uno o más péptidos descritos en el presente documento también pueden contener un adyuvante o administrarse con un adyuvante. Por tanto, el adyuvante puede administrarse con las composiciones peptídicas o como parte de las composiciones peptídicas, antes de las composiciones peptídicas o después de las composiciones peptídicas.

Diversos adyuvantes son adecuados para su uso en combinación con la composición peptídica para provocar una respuesta inmunitaria al péptido. Los adyuvantes preferentes aumentan la respuesta intrínseca a un antígeno sin causar cambios conformacionales en el antígeno que afectan a la forma cualitativa de la respuesta. Los adyuvantes para su uso en los métodos desvelados en el presente documento incluyen, aunque sin limitación, hemocianina de lapa californiana (KLH), formas de alumbre (véase más adelante) y 3 monofosforil lípido A des-O-acilado (MPL o 3-DMP) [véase el documento GB 2220211]. Otros adyuvantes adecuados incluyen QS21, que es un glucósido triterpenoide o saponina aislado de la corteza del árbol Quillaja Saponaria Molina que se encuentra en América del Sur (véase Kensil et al., en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell y Newman, Plenum Press, NY, 1995); la patente de Estados Unidos n.° 5,057,540] y CpG [Bioworld Today, Nov. 15, 1998]. Todavía se describen otros adyuvantes adecuados en el siguiente párrafo.

Una clase de adyuvantes adecuados, mencionados brevemente anteriormente, son sales de aluminio (alumbre), tales como el hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y sulfato de aluminio. Dichos adyuvantes se pueden usar con o sin otros agentes inmunoestimulantes específicos tales como MPL o 3-DMP, QS21, aminoácidos poliméricos o monoméricos tales como ácido poliglutámico o polilisina. Otra clase de adyuvantes adecuados son las formulaciones de emulsión de aceite en agua [tal como el escualeno o el aceite de cacahuete], opcionalmente en combinación con estimulantes inmunológicos, tales como monofosforil lípido A [véase Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)]. Dichos adyuvantes se pueden usar con o sin otros agentes inmunoestimulantes específicos, tales como péptidos de muramilo (por ejemplo, N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (tr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetil-muramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2- (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-(hidroxifosforiloxi)) etilamida (MTP-PE), N-acetilglucosaminil-N-acetilmuramil-L-Al-D-isoglu-L-Aladipalmitoxipropilamida (DTP-DPP) theramide™) u otros componentes de la pared celular bacteriana. Las emulsiones de aceite en agua adicionales incluyen (a) MF59 (documento WO 90/14837), que contiene escualeno al 5 %, Tween 80 al 0,5 % y Span 85 al 0,5 % (que opcionalmente contiene varias cantidades de MTP-PE) formulado en partículas submicrométricas usando un microfluidizador tal como el microfluidizador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton Mass.), (b) SAF, que contiene escualano al 10 %, Tween 80 al 0,4 %, polímero L121 bloqueado con plurónico al 5 % y tr-MDP, ya sea microfluidizado en una emulsión submicrométrica o agitado vorticialmente para generar una emulsión de mayor tamaño de partícula y (c) sistema adyuvante Ribi (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, Mont.) que contiene escualeno al 2 %, Tween 80 al 0,2 % y uno o más componentes de la pared celular bacteriana del grupo que consiste en monofosforil lípido A (MPL), trehalosa dimicolato (TDM) y esqueleto de la pared celular (CWS), preferentemente MPL+CWS (Detox™). Otra clase de adyuvantes preferidos son los adyuvantes de saponina, tal como Stimulon™ (QS21, Aquila, Worcester, Mass.) o partículas generadas a partir de los mismos, tales como ISCOM y (complejos inmunoestimulantes) e ISCOMATRIX. Otros adyuvantes incluyen el adyuvante completo de Freund (CFA) y el adyuvante incompleto de Freund (IFA). Cualquiera de los adyuvantes adecuados puede incluir una citocina, tal como una interleucina (IL-1, IL-2 o IL-12), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF) o combinaciones de citocinas.

Se puede administrar un adyuvante con una composición peptídica de la divulgación como una composición única, o se puede administrar antes, junto con o después de la administración de una composición peptídica de la divulgación. El inmunógeno y el adyuvante se pueden empaquetar y suministrar en el mismo vial o se pueden empaquetar en viales separados y mezclarse antes de su uso. El inmunógeno y el adyuvante se empaquetan normalmente con una etiqueta que indica la aplicación terapéutica prevista, tal como una aplicación terapéutica. Si el inmunógeno y el adyuvante se empaquetan por separado, el embalaje generalmente incluye instrucciones para mezclar antes de usar. La elección de un adyuvante y/o vehículo depende de la estabilidad de la vacuna que contiene el adyuvante, la vía de administración, la pauta de dosificación, la eficacia del adyuvante para las especies que se vacunan, y, en seres humanos, un adyuvante farmacéuticamente aceptable es aquel que ha sido aprobado o puede ser aprobado para la administración humana por los organismos reguladores pertinentes. Por ejemplo, El adyuvante completo de Freund no es adecuado para la administración humana, mientras que el alumbre, MPL y QS21 son adecuados. Opcionalmente, se pueden usar dos o más adyuvantes diferentes de manera simultánea, tales como el alumbre con MPL, el alumbre con QS21, MPL con QS21, y el alumbre, QS21 y MPL juntos. También, Se puede usar el adyuvante incompleto de Freund [Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1998)], opcionalmente en combinación con cualquiera de alumbre, QS21 y MPL y todas sus combinaciones.

Tal y como se usa en el presente documento, el término "polinucleótido diana" abarca ADN, ARN (que comprende pre-ARNm y ARNm) transcrito a partir de dicho ADN y también ADNc derivado de dicho ARN, secuencias codificantes, secuencias no codificantes, polinucleótidos sentido o polinucleótidos antisentido. La hibridación específica de un compuesto oligomérico con su ácido nucleico diana interfiere con la función normal del ácido nucleico diana. Esta modulación de la función de un ácido nucleico o polinucleótido diana por compuestos que se hibridan específicamente con él generalmente se denomina modulación o inhibición antisentido. Las funciones del ADN a interferir incluyen, por ejemplo, la replicación y la transcripción. Las funciones del ARN que se va a interferir incluyen todas las funciones vitales, tales como, por ejemplo, y sin limitación, la translocación del ARN al sitio de traducción de la proteína, la traducción de la proteína a partir del ARN, corte y empalme del ARN para producir una o más especies de ARNm, actividad catalítica que puede verse implicada o facilitada por el ARN, y/o traducción para expresar un polipéptido codificado. El efecto general de dicha modulación (por ejemplo, inhibición) con la función del polinucleótido diana es la modulación de la expresión de un producto codificado o actividad del polinucleótido en sí.

La interferencia de ARN "ARNi" está mediada por moléculas de ARN bicatenario (ARNds) que tienen una homología específica de secuencia con sus secuencias de ácido nucleico diana [Caplen et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 98: 9742-9747 (2001)]. En determinadas realizaciones de la presente divulgación, los mediadores son dúplex de "ARN interferente pequeño" (ARNip) de 5-25 nucleótidos. Los ARNip derivan del procesamiento de ARNds por una enzima RNasa conocida como Dicer [Bernstein et al., Nature 409: 363-366 (2001)]. Los productos dúplex de ARNip se reclutan en un complejo de ARNip de múltiples proteínas denominado RISC (complejo de silenciamiento inducido por ARN). Los ARN interferentes pequeños que pueden usarse de acuerdo con la presente divulgación pueden sintetizarse y usarse de acuerdo con procedimientos que son bien conocidos en la técnica y que serán familiares para el experto en la materia. Los ARNip para su uso en los métodos de la presente divulgación comprenden adecuadamente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 nucleótidos (nt). En realizaciones no limitantes, los ARNip comprenden de aproximadamente 5 a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 nt o de aproximadamente 20-25 nucleótidos.

Se proporcionan métodos para inhibir la expresión de polinucleótidos diana que incluyen aquellos en los que la expresión del polinucleótido diana se inhibe en al menos aproximadamente un 5 % y hasta aproximadamente un 10 %, 20 %, 50 % o 100 %, al menos aproximadamente un 5 % y hasta aproximadamente un 30 %, 60 %, 70% o 90%, o al menos un 10 % y hasta aproximadamente un 50 %, 60%, 70%, 80%, 90 % o 100 %. En realizaciones adicionales, la expresión del polinucleótido diana se inhibe en al menos aproximadamente el 5 %, al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 15 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 45 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 55 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o el 100 % en comparación con la expresión de polinucleótidos diana en ausencia de un ácido nucleico inhibidor. En otras palabras, los métodos de inhibición de la expresión o actividad de un polinucleótido de acuerdo con la divulgación dan como resultado esencialmente cualquier grado de inhibición de la expresión de un polinucleótido diana.

El grado de inhibición se determina in vivo a partir de una muestra de fluido corporal o de una muestra de biopsia o mediante técnicas de imagen bien conocidas en la técnica. Como alternativa, el grado de inhibición se determina en un ensayo de cultivo celular, generalmente como una medida predecible de un grado de inhibición que puede esperarse in vivo como resultado del uso de un tipo específico de ácido nucleico inhibidor específico.

Faltas de exones

Los ácidos nucleicos inhibidores también se contemplan para su uso en las faltas de exones. En general, las faltas de exones es un método en el que los ácidos nucleicos inhibidores están diseñados para modular el corte y empalme de un gen de interés, lo que da como resultado transcritos de ARNm que son capaces de producir algún nivel de producto génico con alguna función. Los ácidos nucleicos inhibidores tienen, en diversas realizaciones, secuencias cortas de ácido nucleico diseñadas para unirse selectivamente a secuencias específicas de ARNm o pre-ARNm para generar pequeñas regiones bicatenarias del ARNm diana. Al unirse a estas regiones y formar cadenas dobles en sitios clave donde normalmente se unirían al espliceosoma o las proteínas del espliceosoma, los exones mutados (desplazamiento del marco) faltan y el resto del pre-ARNm se edita correctamente en el marco, aunque más corto.

Las faltas de exones se describen generalmente en Hoffman et al. [The American J. of Path. 179(1): 12-22 (2011)], Lu et al. [The American Soc. of Gene and Cell Therapy 19(1): 9-15 (2011)] y las patentes de Estados Unidos número 8,084,601,7,960,541 y 7,973,015.

COMPOSICIONES

Cualquiera de los agentes y/o agentes adicionales descritos en el presente documento (o ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los agentes y/o agentes adicionales descritos en el presente documento) también se proporciona en una composición. En este sentido, el agente y/o agente adicional se formula con un vehículo fisiológicamente aceptable (es decir, farmacológicamente aceptable), tampón o diluyente, como se describe adicionalmente en el presente documento. Opcionalmente, el péptido está en forma de una sal fisiológicamente aceptable, que está abarcado por la divulgación. "Sales fisiológicamente aceptables" significa cualquier sal que sea farmacéuticamente aceptable. Algunos ejemplos de sales apropiadas incluyen acetato, trifluoroacetato, clorhidrato, bromhidrato, sulfato, citrato, tartrato, glicolato y oxalato.

ENFERMEDADES RELACIONADAS CON TGFp

Las enfermedades relacionadas con el TGFp contempladas para el tratamiento de acuerdo con la divulgación incluyen distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular de cinturas, distrofia muscular de Becker, miopatía, fibrosis quística, fibrosis pulmonar, miocardiopatía, lesión pulmonar aguda, lesión muscular aguda y lesión miocárdica aguda.

Tal y como se usa en el presente documento, "miocardiopatía" se refiere a cualquier enfermedad o disfunción del miocardio (músculo cardíaco) en la que el corazón está anormalmente agrandado, engrosado y/o endurecido. Como resultado, la capacidad del músculo cardíaco para bombear sangre generalmente se debilita, lo que a menudo conduce a insuficiencia cardíaca congestiva. La enfermedad o trastorno puede ser, por ejemplo, inflamatoria, metabólica, tóxica, infiltrativa, fibrótica, hematológica, genética, o de origen desconocido. Tales miocardiopatías pueden resultar de una falta de oxígeno. Otras enfermedades incluyen aquellas que resultan de una lesión miocárdica que implica daño al músculo o al miocardio en la pared del corazón como resultado de una enfermedad o traumatismo. La lesión miocárdica puede atribuirse a muchas cosas, tales como, aunque sin limitación, miocardiopatía, infarto de miocardio o cardiopatía congénita. El trastorno cardíaco puede ser de origen pediátrico. La miocardiopatía incluye, aunque sin limitación, miocardiopatía (miocardiopatía dilatada, hipertrófica, restrictiva, arritmogénica, genética, idiopática y no clasificada), miocardiopatía dilatada esporádica, miocardiopatía dilatada ligada al cromosoma X (XLDC), insuficiencia cardíaca aguda y crónica, insuficiencia cardíaca derecha, insuficiencia cardíaca izquierda, insuficiencia cardíaca biventricular, defectos cardíacos congénitos, fibrosis miocárdica, estenosis de la válvula mitral, insuficiencia de la válvula mitral, estenosis de la válvula aórtica, insuficiencia de la válvula aórtica, estenosis de la válvula tricúspide, insuficiencia de la válvula tricúspide, estenosis de la válvula pulmonar, insuficiencia de la válvula pulmonar, defectos valvulares combinados, miocarditis, miocarditis aguda, miocarditis crónica, miocarditis vírica, insuficiencia cardíaca diastólica, insuficiencia cardíaca sistólica, insuficiencia cardíaca diabética y enfermedades de acumulación.

PROTEÍNAS DE TGFp

La divulgación proporciona composiciones y métodos dirigidos a modular la actividad, incluyendo la expresión, de LTBP4, que es una proteína que interactúa con las proteínas TGFp. La divulgación contempla la modulación de la actividad de cualquier proteína que interactúa con LTBP4 y, en diversas realizaciones, la proteína TGFp se selecciona del grupo que consiste en un factor de crecimiento y diferenciación (GDF), activina, inhibina y una proteína morfogenética ósea. Las proteínas TGFp son conocidas en la técnica y se tratan, por ejemplo, y sin limitación, en Schmierer et al. (Nature Reviews Molecular Cell Biology 8: 970-982 (2007)]. Además, las isoformas de las proteínas TGFp se contemplan e incluyen, aunque sin limitación, TGFp 1, TGFp 2, TGFp 3, GDF 8 y GDF 11. La práctica de los métodos de la divulgación en los que a un paciente se le administra uno o más agentes y, opcionalmente, se espera que agentes adicionales produzcan la modulación de la actividad de una proteína TGFp en al menos aproximadamente 1 % con respecto a un paciente no tratado así. En realizaciones adicionales, la actividad de una proteína TGFp en un paciente al que se le administra uno o más agentes y/o agentes adicionales se modula en al menos aproximadamente un 1 % y hasta uno cualquiera de aproximadamente 2 %, aproximadamente el 5 %, aproximadamente 10 % o aproximadamente 15 % de actividad de TGFp en relación con un paciente no tratado de esta manera. En otras realizaciones adicionales, la actividad de una proteína TGFp en un paciente al que se le administra uno o más agentes y, opcionalmente, agentes adicionales se modulan en al menos aproximadamente un 10% y hasta uno cualquiera de aproximadamente 15 %, aproximadamente el 20%, aproximadamente 25 % o aproximadamente 30 % de actividad de TGFp en relación con un paciente no tratado de esta manera. En realizaciones adicionales, la actividad de una proteína TGFp en un paciente al que se le administra uno o más agentes y/o agentes adicionales se modula en al menos aproximadamente un 10% y hasta uno cualquiera de aproximadamente 40 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 99 % o más de la actividad de TGFp en relación con un paciente no tratado de esta manera. En realizaciones específicas, la actividad de una proteína TGFp en un paciente al que se le administra uno o más agentes y opcionalmente agentes adicionales se modulan en al menos aproximadamente 1 %, aproximadamente 2 %, aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 99 % de actividad de TGFp o más en relación con un paciente no tratado de esta manera. La actividad proteica puede cuantificarse mediante métodos generalmente conocidos por los expertos en la materia.

(SEGUNDOS) AGENTES ADICIONALES

En diversas realizaciones de la divulgación, se contempla que se administre un segundo agente con el agente que modula la actividad de LTBP4 modulando la proteólisis de LTBP4. Los ejemplos no limitantes del segundo agente son un modulador de una respuesta inflamatoria, un promotor del crecimiento muscular, un agente quimioterapéutico y un modulador de la fibrosis. Adicionalmente, los métodos desvelados en el presente documento pueden, en diversas realizaciones, abarcar uno o más de dichos agentes, o uno o más de dichos agentes en composición con cualquier otro agente o agentes activos.

Agentes quimioterapéuticos

Los agentes quimioterapéuticos contemplados para su uso incluyen, aunque sin limitación, agentes alquilantes, incluyendo: mostazas nitrogenadas, tales como mecloretamina, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalán y clorambucilo; nitrosoureas, tales como carmustina (BCNU), lomustina (CCNU) y semustina (metil-CCNU); etileniminas/metilmelamina, tales como trietilenomelamina (TEM), trietileno, tiofosforamida (tiotepa), hexametilmelamina (HMM, altretamina); sulfonatos de alquilo tales como busulfán; triazinas, tales como dacarbazina (DTIC); antimetabolitos que incluyen análogos de ácido fólico, tales como metotrexato y trimetrexato, análogos de pirimidina, tales como 5-fluorouracilo, fluorodesoxiuridina, gemcitabina, arabinósido de citosina (AraC, citarabina), 5-azacitidina, 2,2'-difluorodesoxicitidina, análogos de purina, tales como 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, azatioprina, 2'-desoxicoformicina (pentostatina), eritrohidroxinoniladenina (EHNA), fosfato de fludarabina y 2-clorodesoxiadenosina (cladribina, 2-CdA); productos naturales que incluyen medicamentos antimitóticos, tales como paclitaxel, alcaloides de la vinca, incluida vinblastina (VLB), vincristina y vinorelbina, taxotere, estramustina y fosfato de estramustina; epipodofilotoxinas, tales como etopósido y tenipósido; antibióticos, tales como actinomicina D, daunomicina (rubidomicina), doxorrubicina, mitoxantrona, idarrubicina, bleomicinas, plicamicina (mitramicina), mitomicina C y actinomicina; enzimas tales como L-asparaginasa; modificadores de la respuesta biológica, tales como interferón alfa, IL-2, G-CSF y GM-CSF; agentes diversos que incluyen complejos de coordinación de platino, tales como cisplatino y carboplatino, antracenodionas, tales como mitoxantrona, urea sustituida, tal como hidroxiurea, derivados de metilhidrazina, incluyendo N-metilhidrazina (MH) y procarbazina, supresores corticosuprarrenales, tales como mitotano (o,p'-DDD) y aminoglutetimida; hormonas y antagonistas, incluidos los antagonistas de los adrenocorticosteroides, tales como prednisona y sus equivalentes, dexametasona y aminoglutetimida; progestina tal como caproato de hidroxiprogesterona, acetato de medroxiprogesterona y a acetato de megestrol; estrógenos tales como dietilbestrol y equivalentes de etinilestradiol; un antiestrógeno tal como tamoxifeno; andrógenos que incluyen propionato de testosterona y fluoximesterona/equivalentes; antiandrógenos tal como flutamida, análogos de la hormona liberadora de gonadotropina y leuprolida; y antiandrógenos no esteroideos tales como flutamida.

Moduladores de la fibrosis

Un "modulador de fibrosis" como se usa en el presente documento es sinónimo de agente antifibrótico. La expresión "agente antifibrótico" se refiere a un compuesto químico que tiene actividad antifibrótica (es decir, previene o reduce la fibrosis) en mamíferos. Esto tiene en cuenta la formación anormal de tejido conjuntivo fibroso, que generalmente se compone de colágeno. Estos compuestos pueden tener diferentes mecanismos de acción, algunos reducen la formación de colágeno u otra proteína, otros potencian el catabolismo o la eliminación de colágeno en el área afectada del cuerpo. Todos estos compuestos que tienen actividad en la reducción de la presencia de tejido fibrótico se incluyen en el presente documento, sin tener en cuenta el mecanismo particular de acción por el cual cada uno de esos medicamentos funciona. Los agentes antifibróticos útiles en los métodos y composiciones de la divulgación incluyen los descritos en la patente de Estados Unidos número 5,720,950. Los agentes antifibróticos adicionales contemplados por la divulgación incluyen, aunque sin limitación, agonistas del receptor de interferón de tipo II (por ejemplo, interferón gamma); pirfenidona y análogos de pirfenidona; agentes antiangiogénicos, tales como antagonistas de VEGF, antagonistas de receptor VEGF, antagonistas de bFGF, antagonistas del receptor de bFGF, antagonistas de TGFp, antagonistas del receptor de TGFp; agentes antiinflamatorios, antagonistas de IL-1, tales como IL-1Ra, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ECA), bloqueadores de los receptores de angiotensina y antagonistas de la aldosterona.

Moduladores de una respuesta inflamatoria

Un modulador de una respuesta inflamatoria incluye los siguientes agentes. En una realización de la divulgación, el modulador de una respuesta inflamatoria es un agonista del receptor beta2-adrenérgico (por ejemplo, albuterol). El término agonista del receptor beta2-adrenérgico se usa en el presente documento para definir una clase de fármacos que actúan sobre el receptor p2-adrenérgico, causando así la relajación del músculo liso que resulta en la dilatación de los conductos bronquiales, vasodilatación en músculo e hígado, relajación del músculo uterino y liberación de insulina. En una realización, el agonista del receptor beta2-adrenérgico para su uso de acuerdo con la divulgación es albuterol, un medicamento inmunosupresor que se usa ampliamente en forma de inhalación para asmáticos. Se cree que el albuterol ralentiza la progresión de la enfermedad al suprimir la infiltración de macrófagos y otras células inmunitarias que contribuyen a la pérdida de tejido inflamatorio. El albuterol también parece tener algunos efectos anabólicos y promueve el crecimiento del tejido muscular. El albuterol también puede suprimir la degradación de proteínas (posiblemente mediante la inhibición de calpaína).

En la DMD, la pérdida de distrofina conduce a roturas en la membrana de la célula muscular y desestabiliza la óxido nítrico sintasa neuronal (nNOS), una proteína que normalmente genera óxido nítrico (NO). Se cree que al menos parte de la degeneración muscular observada en pacientes con DMD puede ser el resultado de la producción reducida de óxido nítrico sintasa neuronal asociada a la membrana muscular. Esta reducción puede conducir a una regulación deteriorada de la respuesta de vasoconstricción y eventual daño muscular.

En una realización, los moduladores de una respuesta inflamatoria adecuada para su uso en las composiciones de la divulgación son inhibidores del factor nuclear Kappa-B (NF-^kB). NF-^kB es un importante factor de transcripción que modula las respuestas celulares inmunitarias, inflamatorias y proliferativas. NF-kB funciona en macrófagos activados para estimular la inflamación y la necrosis muscular y en las fibras musculares esqueléticas para limitar la regeneración a través de la inhibición de las células progenitoras musculares. La activación de este factor en la DMD contribuye a la patología de enfermedades. Por tanto, NF-kB desempeña un papel importante en la progresión de la distrofia muscular y la vía de señalización IKK/NF-kB es un objetivo terapéutico potencial para el tratamiento de una enfermedad relacionada con TGFp. Los inhibidores de NF-kB (por ejemplo, IRFI 042, un análogo de la vitamina E) potencian la función muscular, disminuyen el nivel sérico de creatina quinasa (CK) y la necrosis muscular y potencian la regeneración muscular. Adicionalmente, la inhibición específica de la señalización mediada por NF-kB por IKK tiene beneficios similares.

En una realización adicional, el modulador de una respuesta inflamatoria es un antagonista del factor alfa de necrosis tumoral. El TNF-a es una de las citocinas clave que desencadena y mantiene la respuesta de inflamación. En una realización específica de la divulgación, el modulador de una respuesta inflamatoria es el antagonista del TNF-a infliximab.

Los antagonistas de TNF-a para su uso de acuerdo con la divulgación incluyen, además de infliximab (Remicade™), un anticuerpo monoclonal quimérico que comprende los dominios VK y VH murinos y los dominios Fc constantes humanos. El fármaco bloquea la acción del TNF-a al unirse a él y evitar que señale a los receptores de TNF-a en la superficie de las células. Otro antagonista de TNF-a para su uso de acuerdo con la divulgación es adalimumab (Humira™). Adalimumab es un anticuerpo monoclonal completamente humano. Otro antagonista de TNF-a para su uso de acuerdo con la divulgación es etanercept (Enbrel™). Etanercept es una proteína de fusión dimérica que comprende un receptor de TNF humano soluble unido a una porción Fc de una IgGl. Es una molécula grande que se une al TNF-a y, de este modo, bloquea su acción. Etanercept imita los efectos inhibidores de los receptores de TNF solubles naturales, pero como proteína de fusión tiene una semivida muy extendida en el torrente sanguíneo y, por lo tanto, un efecto inhibidor más profundo y duradero.

Otro antagonista de TNF-a para su uso de acuerdo con la divulgación es pentoxifilina (Trental™), nombre químico 1-(5-oxohexil)-3,7-dimetilxantina. La dosis habitual en forma de comprimido de liberación controlada es un comprimido (400 mg) tres veces al día con las comidas.

Posología: Remicade se administra por infusión intravenosa, normalmente a intervalos de 2 meses. La dosis recomendada es de 3 mg/kg administrada como infusión intravenosa seguida de dosis similares adicionales a las 2 y 6 semanas después de la primera infusión, a continuación, cada 8 semanas a partir de entonces. Para pacientes que tienen una respuesta incompleta, se puede considerar ajustar la dosis hasta l0 mg/kg o tratar con una frecuencia de cada 4 semanas. Humira se comercializa en jeringas precargadas de 0,8 ml (40 mg) y también en dispositivos de pluma precargada, ambos inyectados por vía subcutánea, normalmente por el paciente en casa. Etanercept puede administrarse a una dosis de 25 mg (dos veces por semana) o 50 mg (una vez a la semana).

En otra realización de la divulgación, el modulador de una respuesta inflamatoria es ciclosporina. La ciclosporina A, la forma principal del fármaco, es un péptido no ribosómico cíclico de 11 aminoácidos producido por el hongo Tolypocladium inflatum. Se cree que la ciclosporina se une a la proteína citosólica ciclofilina (inmunofilina) de los linfocitos inmunocompetentes (especialmente los linfocitos T). Este complejo de ciclosporina y ciclofilina inhibe la calcineurina, que, en circunstancias normales, es responsable de activar la transcripción de la interleucina-2. También inhibe la producción de linfocinas y la liberación de interleucina y, por lo tanto, conduce a una función reducida de los linfocitos T efectores. No afecta a la actividad citostática. También tiene un efecto sobre las mitocondrias, evitando que se abra el poro mitocondrial PT, inhibiendo así la liberación de citocromo c (un potente factor de estimulación apoptótica). La ciclosporina se puede administrar a una dosis de 1-10 mg/kg/día.

Un promotor del crecimiento muscular

En algunas realizaciones de la divulgación, se administra a un paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un promotor del crecimiento muscular. Los promotores del crecimiento muscular contemplados por la divulgación incluyen, aunque sin limitación, factor de crecimiento 1 similar a la insulina (IGF-1), Akt/proteína quinasa B, clenbuterol, creatina, decorina (véase la publicación de patente de Estados Unidos número 20120058955), un esteroide (por ejemplo y sin limitación, un corticoesteroide o un esteroide glucocorticoide), testosterona y un antagonista de miostatina.

Antagonista de miostatina

Otra clase de promotores del crecimiento muscular adecuados para su uso en las combinaciones de la divulgación son los antagonistas de miostatina. La miostatina, también conocida como factor de crecimiento/diferenciación 8 (GDF-8), es un miembro de la superfamilia del factor de crecimiento transformante p (TGFp) implicado en la regulación de la masa del músculo esquelético. La mayoría de los miembros de la familia TGF-p-GDF se expresan ampliamente y son pleiotrópicos; sin embargo, la miostatina se expresa principalmente en el tejido del músculo esquelético, donde controla negativamente el crecimiento del músculo esquelético. La miostatina se sintetiza como una preproproteína inactiva que se activa por escisión proteolítica. La proteína precursora se escinde para producir una proteína COOH-terminal de aproximadamente 109 aminoácidos que, en forma de homodímero de aproximadamente 25 kDa, es la forma activa madura. El dímero maduro parece circular en la sangre como un complejo latente inactivo unido al propéptido. Como se usa en el presente documento, la expresión "antagonista de miostatina" define una clase de agentes que inhibe o bloquea al menos una actividad de miostatina, o, como alternativa, bloquea o reduce la expresión de miostatina o su receptor (por ejemplo, por interferencia con la unión de miostatina a su receptor y/o la transducción de la señal de bloqueo resultante de la unión de miostatina a su receptor). Dichos agentes, por lo tanto, incluyen agentes que se unen a la miostatina misma o a su receptor.

Los antagonistas de miostatina para su uso de acuerdo con la divulgación incluyen anticuerpos contra GDF-8; anticuerpos contra receptores de GDF-8; receptores solubles de GDF-8 y fragmentos de los mismos (por ejemplo, los polipéptidos de fusión ActRIIB como se describe en la publicación de patente de Estados Unidos número 2004/0223966, incluidos receptores solubles de ActRIIB en los que ActRIIB se une a la porción Fc de una inmunoglobulina); el propéptido GDF-8 y sus formas modificadas (por ejemplo, como se describe en el documento WO 2002/068650 o la patente de Estados Unidos n.° 7,202,210, incluidas las formas en las que el propéptido GDF-8 se une a la porción Fc de una inmunoglobulina y/o la forma en la que GDF-8 está mutado en un resto de aspartato (asp), por ejemplo, asp-99 en el propéptido GDF-8 murino y asp-100 en el propéptido GDF-8 humano); un inhibidor de molécula pequeña de GDF-8; folistatina (por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 6,004,937, incorporado en el presente documento como referencia) o proteínas que contienen dominio de folistatina (por ejemplo, ^gA^s P-1 u otras proteínas como se describe en la patente de Estados Unidos número 7,192,717 y la patente de Estados Unidos número 7,572,763, cada uno incorporado en el presente documento como referencia); y moduladores de la actividad metaloproteasa que afectan a la activación de GDF-8, como se describe en la publicación de patente de Estados Unidos número 2004/0138118.

Los antagonistas de miostatina adicionales incluyen anticuerpos contra miostatina que se unen e inhiben o neutralizan la miostatina (incluida la proproteína de miostatina y/o la proteína madura, en forma monomérica o dimérica). Los anticuerpos contra miostatina son anticuerpos derivados de mamíferos o no mamíferos, por ejemplo, un anticuerpo IgNAR derivado de tiburones, o anticuerpos humanizados, o que comprenden un fragmento funcional derivado de anticuerpos. Dichos anticuerpos se describen, por ejemplo, en los documentos WO 2005/094446 y WO 2006/116269. Los anticuerpos contra miostatina también incluyen los anticuerpos que se unen a la proproteína de miostatina y evitan la escisión en la forma activa madura. Los antagonistas de anticuerpos adicionales incluyen los anticuerpos descritos en la patente de Estados Unidos número 6,096,506 y la patente de Estados Unidos número 6,468,535. En algunas realizaciones, el inhibidor de GDF-8 es un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo que bloquea la unión de GDF-8 a su receptor. Otras realizaciones incluyen el anticuerpo monoclonal murino JA-16 (como se describe en la patente de Estados Unidos número 7,320,789 (Depósito ATCC N.° PTA-4236); derivados humanizados de los mismos y anticuerpos monoclonales anti-GDF-8 completamente humanos (por ejemplo, Myo29, Myo28 y Myo22, núm. de depósito ATCC PTA-4741, PTA-4740 y PTA-4739, respectivamente, o derivados de los mismos) como se describe en la patente de Estados Unidos número 7,261,893.

En otras realizaciones adicionales, los antagonistas de miostatina incluyen receptores solubles que se unen a miostatina e inhiben al menos una de sus actividades. La expresión "receptor soluble" en el presente documento incluye versiones truncadas o fragmentos del receptor de miostatina que se unen específicamente a la miostatina bloqueando o inhibiendo de ese modo la transducción de señal de la miostatina. Las versiones truncadas del receptor de miostatina, por ejemplo, incluyen los dominios solubles de origen natural, así como las variaciones producidas por la proteólisis de los extremos N o C. El dominio soluble incluye todo o parte del dominio extracelular del receptor, ya sea solo o unido a péptidos adicionales u otros restos. Debido a que la miostatina se une a los receptores de activina (incluido el receptor de activina de tipo IEB (ActRHB) y el receptor de activina de tipo HA (ActRHA)), los receptores de activina pueden formar la base de los antagonistas de los receptores solubles. También se pueden usar proteínas de fusión de receptores solubles, incluido Fc del receptor soluble (véase el número de publicación de patente de Estados Unidos número 2004/0223966 y el documento WO 2006/012627).

Otros antagonistas de miostatina basados en los receptores de miostatina son los inhibidores de ALK-5 y/o ALK-7 (véanse, por ejemplo, los documentos WO 2006/025988 y WO 2005/084699). Como una citocina TGF-p, las señales de miostatina a través de una familia de receptores transmembrana de serina/treonina quinasa individuales. Estos receptores se pueden dividir en dos clases, los receptores de quinasa de tipo I o similar a activina (ALK) y los receptores de tipo II. Los receptores ALK se distinguen de los receptores de tipo II en los que los receptores ALK (a) carecen de la cola intracelular rica en serina/treonina, (b) poseen dominios de serina/treonina quinasa que son altamente homólogos entre los receptores de tipo I y (c) comparten un motivo de secuencia común llamado dominio GS, que consisten en una región rica en restos de glicina y serina. El dominio GS está en el extremo amino terminal del dominio de quinasa intracelular y se cree que es crucial para la activación por el receptor de tipo II. Varios estudios han demostrado que la señalización de TGF-p requiere los receptores ALK (de tipo I) y de tipo II. Específicamente, el receptor e tipo II fosforila el dominio GS del receptor de tipo 1 para TGFp ALK5, en presencia de TGFp. El ALK5, a su vez, fosforila las proteínas citoplasmáticas smad2 y smad3 en dos serinas carboxilo terminales. Generalmente, se cree que en muchas especies, los receptores de tipo II regulan la proliferación celular y los receptores de tipo I regulan la producción de la matriz. Se han descrito varios inhibidores del receptor ALK5 (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos número 6,465,493, la patente de Estados Unidos número 6,906,089, la publicación de patente de Estados Unidos números 2003/0166633, 2004/0063745 y 2004/0039198). Por tanto, los antagonistas de miostatina para su uso de acuerdo con la divulgación pueden comprender el dominio de unión a miostatina de un receptor ALK5 y/o ALK7.

Otros antagonistas de miostatina incluyen antagonistas de ligandos solubles que compiten con la miostatina para unirse a los receptores de miostatina. La expresión "antagonista de ligando soluble" en el presente documento se refiere a péptidos solubles, polipéptidos o peptidomiméticos capaces de unirse de manera no productiva a los receptores de miostatina (por ejemplo, el receptor de activina de tipo HB (ActRHA)) y, por lo tanto, bloquear competitivamente la transducción de señales del receptor de miostatina. Los antagonistas de ligandos solubles incluyen variantes de miostatina, también conocidos como "análogos de miostatina" que tienen homología con la miostatina, pero no su actividad. Dichos análogos incluyen truncados (tales como truncamientos, sustituciones, deleciones y otras alteraciones N o C-terminales en la secuencia de aminoácidos, tales como variantes que tienen sustituciones no aminoacídicas).

Los antagonistas de miostatina adicionales contemplados por la divulgación incluyen ácidos nucleicos inhibidores como se describe en el presente documento. Estos antagonistas incluyen polinucleótidos antisentido o sentido que comprenden una secuencia polinucleotídica monocatenaria (ya sea a Rn o ADN) capaz de unirse a secuencias de ARNm (sentido) o ADN (antisentido) diana. Por tanto, la interferencia de ARN (ARNi) producida por la introducción de ARN interferente pequeño específico (ARNip), también puede usarse para inhibir o eliminar la actividad de miostatina.

En realizaciones específicas, los antagonistas de miostatina incluyen, aunque sin limitación, folistatina, el prodominio de miostatina, el prodominio de factor 11 de crecimiento y diferenciación (GDF-11), proteínas de fusión prodominio, anticuerpos antagonistas o fragmentos de anticuerpos que se unen a la miostatina, anticuerpos antagonistas o fragmentos de anticuerpos que se unen al receptor IEB de tipo activina, receptor IHB soluble de tipo activina, proteínas de fusión de receptor IEB soluble de tipo activina, análogos solubles de miostatina (ligandos solubles), polinucleótidos, moléculas pequeñas, peptidomiméticos y agentes de unión a miostatina. Otros antagonistas incluyen los inmunógenos peptídicos descritos en la patente de Estados Unidos número 6,369,201 y el documento Wo 2001/05820 y los multímeros e inmunoconjugados de miostatina capaces de provocar una respuesta inmunitaria y, por lo tanto, bloquear la actividad de la miostatina. Otros antagonistas incluyen los inhibidores de proteínas de miostatina descritos en el documento WO 2002/085306, que incluyen el receptor truncado de activina de tipo II, el prodominio de miostatina y folistatina. Otros inhibidores de miostatina incluyen los liberados en el cultivo de las células que sobreexpresan miostatina (véase el documento WO 2000/43781), proteínas de miostatina dominantes negativas (véase el documento WO 2001/53350), incluida la proteína codificada por el alelo piamontés y péptidos de miostatina maduros que tienen un truncamiento C-terminal en una posición en o entre las posiciones de aminoácidos 335 a 375. Los péptidos pequeños descritos en la publicación de patente de Estados Unidos número 2004/0181033 que comprenden la secuencia de aminoácidos WMCPP, también son adecuados para su uso en las composiciones de la divulgación.

CRITERIOS DE VALORACIÓN TERAPÉUTICOS

En diversos aspectos de la divulgación, el uso del agente o agentes y agente o agentes adicionales como se describe en el presente documento proporciona uno o más beneficios relacionados con criterios de valoración terapéuticos específicos en relación con un paciente que no recibe el agente o agentes y/o agente o agentes adicionales.

En realizaciones en las que la enfermedad relacionada con TGFp es una enfermedad relacionada con el músculo (por ejemplo, una distrofia muscular o miocardiopatía), los criterios de valoración terapéuticos incluyen, aunque sin limitación, período de tiempo hasta que un paciente no sea ambulatorio, capacidad ambulatoria medida por, por ejemplo, y sin limitación, la distancia de caminata de seis minutos que se ha demostrado que se correlaciona con los SNP de LTBP4 humanos [véase, por ejemplo, Hersh et al., Am J Respir Crit Care Med. 173(9): 977-84 (2006)], la salud relativa del corazón según lo determinado por, por ejemplo, ecocardiografía, formación de imágenes mediante resonancia magnética (RM), mecánica muscular, función pulmonar y/o cantidad de fibrosis tisular.

Con respecto al período de tiempo hasta que un paciente no sea ambulatorio, se contempla que, en algunas realizaciones, un paciente al que se le administra uno o más agentes y, opcionalmente, el agente o agentes adicionales permanecen ambulatorios al menos 1 día y hasta cualquiera de aproximadamente 5, aproximadamente 10, aproximadamente 30, aproximadamente 60 o aproximadamente 90 días más que un paciente no tratado de esta manera. En realizaciones adicionales, un paciente al que se le administra uno o más agentes y agente o agentes adicionales opcionales permanece ambulatorio al menos aproximadamente 1 mes y hasta cualquiera de aproximadamente 2, aproximadamente 4, aproximadamente 6, aproximadamente 8, aproximadamente 10 o aproximadamente 12 meses más que un paciente no tratado de esta manera. Todavía otras realizaciones de la divulgación contemplan que un paciente al que se le administra uno o más agentes y, opcionalmente, agente o agentes adicionales permanecen ambulatorios al menos aproximadamente 1 año y hasta cualquiera de aproximadamente 1,5, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10 o más años más que un paciente no tratado de esta manera.

En realizaciones en las que la enfermedad relacionada con TGFp es un cáncer, los criterios de valoración terapéuticos incluyen, entre otros, una reducción en el volumen del tumor (es decir, el tamaño del tumor medido por la cantidad de espacio ocupado por él expresado en unidades tradicionales de volumen (por ejemplo, centímetros cúbicos) o como un porcentaje del tejido u órgano dentro del cual se encuentra (por ejemplo, el volumen tumoral del cáncer de próstata es el porcentaje de la próstata ocupado por el tumor)) y/o una reducción en la metástasis. Con respecto a la reducción en el volumen tumoral y/o una reducción en la metástasis, se contempla que en algunas realizaciones el volumen del tumor o la cantidad de metástasis se reduce en un paciente al que se le administra uno o más agentes y, opcionalmente, agente o agentes adicionales en aproximadamente 1 % en relación con un paciente no tratado de esta manera. En realizaciones adicionales, el volumen del tumor o la cantidad de metástasis se reduce en un paciente al que se le administra uno o más agentes y, opcionalmente, agente o agentes adicionales en al menos aproximadamente 1 % y hasta cualquiera de aproximadamente 2 %, aproximadamente 5 %, aproximadamente el 10 % o aproximadamente el 15 % en relación con un paciente no tratado de esta manera. En otras realizaciones adicionales, el volumen del tumor o la cantidad de metástasis se reduce en un paciente al que se le administra uno o más agentes y, opcionalmente, agente o agentes adicionales en al menos aproximadamente el 10 % y hasta cualquiera de aproximadamente 15 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente el 25 % o aproximadamente el 30 % en relación con un paciente no tratado de esta manera. En realizaciones adicionales, el volumen del tumor o la cantidad de metástasis se reduce en un paciente al que se le administra uno o más agentes y, opcionalmente, agente o agentes adicionales en al menos aproximadamente 10% y hasta cualquiera de aproximadamente 40 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente el 99 % o más en relación con un paciente no tratado de esta manera. En realizaciones específicas, el volumen del tumor o la cantidad de metástasis se reduce en un paciente al que se le administra uno o más agentes y, opcionalmente, agente o agentes adicionales en al menos aproximadamente un 1 %, aproximadamente 2 %, aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente el 99 % o más en relación con un paciente no tratado de esta manera. Los métodos para medir el volumen tumoral así como la cantidad de metástasis son conocidos en la técnica.

En realizaciones en las que la enfermedad relacionada con TGFp es una enfermedad viral, los criterios de valoración terapéuticos se refieren a la carga viral en el paciente. Los métodos para determinar la carga viral son bien conocidos en la técnica y pueden cuantificarse utilizando métodos tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR), amplificación específica de la sonda o por el método de ADN ramificado (ADNb). En diversas realizaciones, la carga viral de un paciente al que se está administrando uno o más agentes y, opcionalmente, agente o agentes adicionales de la divulgación se reducen en al menos aproximadamente un 1 % y hasta cualquiera de aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente el 40 % o aproximadamente el 50 % en relación con un paciente no tratado de esta manera. En realizaciones adicionales, la carga viral de un paciente al que se está administrando uno o más agentes y, opcionalmente, agente o agentes adicionales de la divulgación se reducen en al menos aproximadamente un 10% y hasta cualquiera de aproximadamente 20%, aproximadamente 50%, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente el 99 % o más en relación con un paciente no tratado de esta manera. En realizaciones específicas, la carga viral de un paciente al que se le está administrando uno o más agentes y/o agente o agentes adicionales de la divulgación se reduce en al menos aproximadamente un 1 %, aproximadamente 2 %, aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente el 99 % o más en relación con un paciente no tratado de esta manera.

En general, un criterio de valoración terapéutico logrado mediante la práctica de los métodos de la divulgación es una reducción en la cantidad de fibrosis en un paciente al que se está administrando uno o más agentes y, opcionalmente, agente o agentes adicionales de la divulgación. Las cantidades relativas de fibrosis en un paciente pueden cuantificarse mediante biopsia de tejido y la posterior histología, por ejemplo, cuantificando la absorción de colorante azul de Evans como una medida de miofibra o daño celular [Heydemann et al., Neuromuscular Disorders 15(9-10): 601-9 (2005)], y/o la cuantificación del contenido de hidroxiprolina como se ha descrito previamente [Swaggart et al., Physiol Genomics 43: 24-31 (2011)]. En diversas realizaciones, la cantidad de fibrosis en un paciente al que se está administrando uno o más agentes y, opcionalmente, agente o agentes adicionales de la divulgación se reducen en al menos aproximadamente un 1 % y hasta cualquiera de aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente el 40 % o aproximadamente el 50 % en relación con un paciente no tratado de esta manera. En realizaciones adicionales, la cantidad de fibrosis en un paciente al que se está administrando uno o más agentes y, opcionalmente, agente o agentes adicionales de la divulgación se reducen en al menos aproximadamente un 10 % y hasta aproximadamente 20 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente el 99 % o más en relación con un paciente no tratado de esta manera. En realizaciones específicas, la cantidad de fibrosis en un paciente al que se está administrando uno o más agentes y/o agente o agentes adicionales de la divulgación se reduce en al menos aproximadamente un 1 %, aproximadamente 2 %, aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente el 99 % o más en relación con un paciente no tratado de esta manera.

Un experto en la técnica puede determinar de forma rutinaria la cantidad de fibrosis en un paciente. Por ejemplo, y sin limitación, la cantidad de fibrosis se puede determinar tomando una biopsia muscular de un paciente, seccionando el músculo en portaobjetos y evaluando la cantidad de fibrosis revelada por las técnicas de tinción conocidas en la técnica (por ejemplo, tinción con hematoxilina y eosina (H&E) y/o tinción tricrómica de Masson). Como alternativa, o además, la cantidad de fibrosis se puede determinar in vivo utilizando imágenes de resonancia magnética (MRI).

DOSIFICACIÓN/ADMINISTRACIÓN/KITS

Un régimen de administración particular para un sujeto particular dependerá, en parte, del agente y el agente adicional opcional utilizado, la cantidad del agente y el agente adicional opcional administrado, la vía de administración, la dolencia particular que se está tratando y la causa y el alcance de cualquier efecto secundario. La cantidad de agente y agente adicional opcional administrada a un sujeto (por ejemplo, un mamífero, tal como un ser humano) es suficiente para lograr la respuesta deseada. La dosis generalmente depende de diversos factores, incluyendo el agente particular y/o agente adicional empleado, la edad y el peso del sujeto, así como la existencia y la gravedad de cualquier enfermedad o trastorno en el sujeto. El tamaño de la dosis se determinará también según la vía, el momento y la frecuencia de administración. Por consiguiente, el médico puede valorar la dosis y modificar la vía de administración para obtener un efecto terapéutico óptimo y los expertos en la técnica conocen las técnicas convencionales de determinación de rango. Simplemente a modo de ilustración, en algunas realizaciones, el método comprende administrar, por ejemplo, desde aproximadamente 0,1 pg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. En otras realizaciones, la dosis puede variar desde 1 pg/kg hasta aproximadamente 75 mg/kg; o de 5 pg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg; o de 10 pg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis comprende aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg (por ejemplo, aproximadamente 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,3 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 3,5 mg/kg, 4 mg/kg, 4,5 mg/kg, 5 mg/kg, 5,5 mg/kg, 6 mg/kg, 6,5 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg o 10 mg/kg) de agente y agente adicional opcional. En realizaciones en las que se administran un agente y un agente adicional, se contempla que las dosis anteriores representan la cantidad de cada agente administrado o, en realizaciones adicionales, la dosis representa la dosis total administrada. Dada la naturaleza crónica de muchos trastornos relacionados con TGFp, se prevé que un sujeto recibirá el agente y/o agente adicional durante un curso de tratamiento que durará semanas, meses o años, y puede requerir una o más dosis diarias o semanales. Las dosis también se contemplan para dosificación una vez al día, dos veces al día (BID) o tres veces al día (TID). Se puede formular una dosis unitaria en forma de cápsula o comprimido. En otras realizaciones, el agente y el agente adicional opcional se administran para tratar una afección aguda (por ejemplo, lesión muscular aguda o lesión miocárdica aguda) durante un período de tratamiento relativamente corto, por ejemplo, de uno a 14 días.

Los métodos adecuados para administrar una composición fisiológicamente aceptable, tal como una composición farmacéutica que comprende un agente y un agente adicional opcional descritos en el presente documento, son bien conocidos en la técnica. Aunque se puede usar más de una vía para administrar un agente y/o agente adicional, una vía particular a menudo puede proporcionar un camino más inmediato y más eficaz que otra vía. En función de las circunstancias, se aplica o instila una composición farmacéutica en las cavidades corporales, se absorbe a través de la piel o las membranas mucosas, se ingiere, se inhala y/o se introduce en la circulación. En algunas realizaciones, una composición que comprende un agente y/o agente adicional se administra por vía intravenosa, intraarterial o intraperitoneal para introducir un agente y un agente adicional opcional en la circulación. La administración no intravenosa también es apropiada, particularmente con respecto a la terapéutica de bajo peso molecular. En determinadas circunstancias, es deseable administrar una composición farmacéutica que comprenda el agente y/o agente adicional por vía oral, vía tópica, vía sublingual, vía vaginal, vía rectal; por inyección intracerebral (intraparenquimatosa), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraportal, intralesional, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutánea, intranasal, medios uretrales o enterales; por sistemas de liberación sostenida; o mediante dispositivos de implantación. Si se desea, el agente y/o agente adicional se administra regionalmente por vía intraarterial o intravenosa a una región de interés, por ejemplo, a través de la arteria femoral para la administración en la pierna. En una realización, la composición se administra por implantación de una membrana, esponja u otro material apropiado dentro o sobre el cual se ha absorbido o encapsulado el agente deseado y el agente adicional opcional. Cuando se usa un dispositivo de implantación, el dispositivo en un aspecto se implanta en cualquier tejido adecuado y la administración del agente deseado y/o agente adicional, en diversas realizaciones, se efectúa mediante difusión, bolo de liberación programada o administración continua. En otras realizaciones, el agente y el agente adicional opcional se administran directamente al tejido expuesto durante los procedimientos quirúrgicos o el tratamiento de la lesión, o se administran mediante transfusión de productos sanguíneos. Los enfoques de administración terapéutica son bien conocidos por los expertos en la técnica, algunos de los cuales se describen más detalladamente, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos n.° 5,399,363.

En algunas realizaciones que facilitan la administración, el agente y el agente adicional opcional en una realización se formulan en una composición fisiológicamente aceptable que comprende un vehículo (es decir, vehículo, adyuvante, tampón o diluyente). El vehículo particular empleado está limitado solo por consideraciones químicofísicas, tales como solubilidad y falta de reactividad con el agente y/o agente adicional, por la vía de administración y por el requisito de compatibilidad con el organismo receptor. Los vehículos fisiológicamente aceptables son bien conocidos en la técnica. Las formas farmacéuticas ilustrativas adecuadas para uso inyectable incluyen, aunque sin limitación, soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles (por ejemplo, véase la patente de Estados Unidos n.° 5,466,468). Las formulaciones inyectables se describen adicionalmente en, por ejemplo, Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J. B. Lippincott Co., Philadelphia. Pa., Banker and Chalmers. eds., páginas 238-250 (1982) y ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4a ed., páginas 622-630 (1986).

Una composición farmacéutica que comprende un agente y un agente adicional opcional como se proporciona en el presente documento se coloca opcionalmente dentro de recipientes/kits, junto con material de embalaje que proporciona instrucciones sobre el uso de tales composiciones farmacéuticas. Generalmente, tales instrucciones incluyen una expresión tangible que describe la concentración de reactivo, así como, en ciertas realizaciones, cantidades relativas de ingredientes excipientes o diluyentes que pueden ser necesarios para reconstituir la composición farmacéutica.

La divulgación, por lo tanto, incluye administrar a un sujeto uno o más agentes, en combinación con uno o más agentes adicionales, cada uno administrado de acuerdo con un régimen adecuado para ese medicamento. Las estrategias de administración incluyen administración concurrente (es decir, administración sustancialmente simultánea) y administración no concurrente (es decir, administración en diferentes momentos, en cualquier orden, ya sea superpuesto o no) del agente y uno o más agentes adicionales. Se apreciará que los diferentes componentes se administran opcionalmente en la misma o en composiciones separadas y por la misma vía o diferentes vías de administración.

Se pretende que la totalidad del documento se considere una divulgación unificada y se deberá entender que todas las combinaciones de rasgos descritas en el presente documento están incluidas, incluso si la combinación de características no se encuentran juntas en la misma oración o párrafo o sección de el presente documento. Por ejemplo, cuando se describe la terapia de proteínas, se contemplan específicamente realizaciones que implican terapia con polinucleótidos (usando polinucleótidos/vectores que codifican la proteína), y lo contrario también es cierto. Con respecto a los elementos descritos como uno o más miembros de un conjunto, deberá entenderse que todas las combinaciones comprendidas en el conjunto están incluidas.

Ejemplos

Ejemplo 1

Relación estructura-función entre la región rica en prolina de LTBP4 y la susceptibilidad proteolítica Los datos proporcionados en este ejemplo muestran que la región rica en prolina de LTBP4 contribuye a su susceptibilidad proteolítica.

LTBP4 se une a TGFp en la matriz extracelular (MEC), donde sirve como sitio de almacenamiento de TGFp fácilmente disponible. Se identificó una deleción de 36 nucleótidos en el dominio rico en prolina de LTBP4 murino que se asocia con características patogénicas mejoradas de distrofia muscular en ratones. Esta región en el LTBP4 murino está asociada con una susceptibilidad variable a la proteólisis. El análisis de comparación de secuencias entre LTBP4 de ratón y humano revela una deleción aún más grande en la región rica en prolina del LTBP4 humano. Por tanto, consistente con la deleción murina asociada con características patogénicas y proteólisis variable [véase Heydemann et al., J Clin Invest. 119(12): 3703-12 (2009)], se contempló que la mayor deleción de la región rica en prolina del LTBP4 humano se asoció con una mayor susceptibilidad a la escisión proteolítica.

Para investigar esta posibilidad, una porción de la región codificante de LTBP4 humano se ligó en un vector de expresión para expresar la región rica en prolina. El fragmento TP (los aminoácidos 483-565 de la proteína LTBP4 humana (SEQ ID NO: 1)) se expresó y migró como una proteína de 3,5 KDa, aunque su masa molecular predicha es de 8,9 KDa. También se expresó un segundo fragmento, el fragmento TP2E (aminoácidos 357-586 de la proteína LTBP4 humana (SEQ ID NO: 1)). Su masa molecular prevista es de 24,5 KDa, sin embargo, migró electroforéticamente como una proteína de 31 KDa. El TP2E incluía los dos dominios similares a EGF que flanquean la región rica en prolina de LTBP4 junto con la región rica en 8 cisteínas en la región inmediatamente amino terminal de la región rica en prolina. Cada uno de TP2E y TP murinos contenían 44 aminoácidos adicionales en comparación con las secuencias humanas, lo que refleja la región más grande rica en prolina. El TP2E murino migra electroforéticamente como una proteína de 35 KDa, mientras que su masa molecular calculada es de 30,58 KDa. Susceptibilidad a la proteólisis in vitro

Los fragmentos de TP2E humanos y de ratón se expresaron in vitro usando un ensayo acoplado de transcripcióntraducción (Sistema de transcripción/traducción in vitro acoplado Promega TnT®Quick) y los fragmentos expresados se marcaron usando 35S-cisteína. Se realizaron experimentos de respuesta a la dosis y curso de tiempo con elastasa y plasmina, que son ambas serina proteasas que cortan LTBP4, para determinar la digestión diferencial de los fragmentos TP2E humanos y de ratón. Los datos de estos experimentos mostraron que el fragmento TP2E humano se escinde más fácilmente que la secuencia de LTBP4 de ratón (Figura 3).

Efectos de los fragmentos más pequeños de LTBP4 sobre la señalización de TGFp

Se generó un anticuerpo contra la región rica en prolina de LTBP4 humano para inhibir la escisión de LTBP4. Este anticuerpo se probó y se confirmó que reconocía y se unía al LTBP4 humano de longitud completa por inmunotransferencia. A continuación, se optimizaron las condiciones para la digestión del LTBP4 humano de longitud completa por plasmina y se probó la inhibición de la proteólisis usando el anticuerpo. Los datos en la figura 4 muestran que el anticuerpo anti-LTBP4 inhibió específicamente la digestión de proteínas en comparación con un anticuerpo no relacionado generado en la misma especie (Figura 4).

Ejemplo 2

Efecto de la expresión de LTBP4 humano en fenotipos musculares y cardíacos

El LTBP4 desempeña un papel crítico en la secreción y activación de TGFp en el músculo cardíaco, el músculo esquelético y los pulmones. El LTBP4 humano tiene una deleción mayor en la región rica en prolina en comparación con un LTBP4 murino mutante, con LTBP4 murino de tipo salvaje usado como referencia. Por tanto, se contempla que el LTBP4 humano está asociado con un aumento de la señalización de TGFp patogénico y, por tanto, se asociará con una enfermedad más grave en ratones con distrofia muscular.

Ratones transgénicos que expresan LTBP4 humano

Se generó un ratón que albergaba el gen de LTBP4 humano de acuerdo con protocolos estándar [véase, por ejemplo, Heintz, Nat Rev Neurosci. 2 (12):861-70 (2001)]. Un cromosoma artificial bacteriano (BAC) que incluía el gen de LTBP4 humano completo; los ratones BAC transgénicos positivos (Tg+) se denominan hLTBP4 Tg+. Para generar los ratones hLTBP4 Tg+, se usó un solo clon BAC no modificado (número de clon CDT-2166J9) para inyectar un ovocito fertilizado utilizando una metodología convencional [véase, por ejemplo, Heintz, Nat Rev Neurosci. 2 (12):861-70 (2001)]. La secuencia humana de este BAC (número de acceso de Genbank AC010412.9; SEQ ID NO: 7) contiene 155085 pb del cromosoma 19. El gen de LTBP4 abarca desde 19891 hasta 57891 pb de este clon. Se evaluaron once líneas fundadoras por PCR y se descubrió que contenían el LTBP4 humano de longitud completa, incluidas las regiones promotoras. Se eligieron seis líneas para la reproducción para garantizar que estos ratones pasaran el BAC en su línea germinal. Por RT-PCR, se determinó que el ARNm de LTBP4 humano se expresaba en el músculo cardíaco y esquelético de los ratones transgénicos. Actualmente, no hay anticuerpo que distingue el LTBP4 humano del LTBP4 de ratón; el LTBP4 humano y de ratón son un 98 % similares. En general, la expresión de LTBP4 puede estar ligeramente elevada en ratones hLTBP4 Tg+ en comparación con los controles hermanos. Los ratones hLTBP4 Tg+ son exteriormente normales y se reproducen normalmente. El examen histológico mostró histología extremadamente normal en el cerebro, los riñones, los pulmones, el corazón y el músculo. Resulta interesante que, las fibras musculares esqueléticas de hLTBP4 Tg+ fueron significativamente más grandes que los ratones transgénicos de los hermanos control. Se contempla que incluso una sobreexpresión modesta de LTBP4 puede ser suficiente para unir a otros miembros de la superfamilia de TGFp, tal como la miostatina, y el secuestro de miostatina inhibiría la actividad de la miostatina y se esperaría que produjera fibras musculares más grandes.

El animal hLTBP4 Tg+ se criará con el modelo mdx de ratón de distrofia muscular de Duchenne y se evaluará el fenotipo y la capacidad de señalización de TGFp. Se generarán diez ratones de cada genotipo (hLTBP4 Tg+/mdx, mdx, hLTBP4 y WT). Se evaluará la función neuromuscular básica utilizando los protocolos SHIRPA. SHIRPA es una combinación de pruebas neurológicas que evalúan la función neuromuscular [Rafael et al., Mamm Genome.

11(9): 725-8 (2000)]. Por ejemplo, y sin limitación, la fuerza de agarre, la capacidad para correr, la maniobra del alambre y la varilla giratoria son pruebas básicas que se utilizarán para evaluar la función muscular. Además, la función cardíaca se evaluará mediante ecocardiografía y se realizará una histología para evaluar la fibrosis y la permeabilidad de la membrana mediante la captación de colorante azul de Evans. Todos los análisis se realizarán en ratones macho a las 8 semanas de edad. También se envejecerá una cohorte de ratones para examinar el efecto en los ratones en un momento o puntos posteriores. Los fibroblastos también se aislarán de estos ratones para determinar su nivel de señalización SMAD utilizando métodos como se ha descrito previamente [Heydemann et al., J Clin Invest. 119(12): 3703-12 (2009)]. Se espera que la inserción del LTBP4 humano dé como resultado un aumento de la señalización SMAD y la mejora del fenotipo mdx.

Ejemplo 3

Péptidos LTBP4 y generación de anticuerpos

Los anticuerpos se generaron usando múltiples péptidos diferentes, incluidas las secuencias de LTBP4 de ratón y humano (véase la Tabla 1, más adelante). Cada uno de los péptidos en la Tabla 1 reacciona de forma cruzada a la proteína humana como se determina por inmunotransferencia. También se contempla para su uso de acuerdo con la divulgación un péptido LTBP4 más largo, FLPTHRLEPRPEPRPDPRPGPELPLPSIPAWTGPEIPESGPSS (SEQ ID NO: 6). También se generarán anticuerpos monoclonales humanizados dirigidos contra LTBP4.

T l 1. P i LTBP4 iliz r l n r i n ni r . "E i " in i l f n l ni r .

La Tabla 1 muestra que cada anticuerpo reconoció una proteína del tamaño del LTBP4 humano, según lo determinado por inmunotransferencia. Los datos en la tabla también indican que el anticuerpo generado contra la secuencia humana (SEQ ID NO: 3) protege al LTBP4 frente a la proteólisis in vitro (Figura 6, descrita más adelante) y, dada la reactividad cruzada, también se espera que los otros anticuerpos anti-hLTBP4 protejan a hLTBP4 de la proteólisis. Los ensayos de inmunosorción ligada a enzimas (ELISA) también se realizarán para comparar la afinidad relativa de los anticuerpos con cada péptido usando suero y anticuerpos purificados.

La proteólisis de LTBP4 puede inhibirse con los anticuerpos LTBP4

Se contempló que el polimorfismo de inserción/deleción en Ltbp4 murino tratado anteriormente indicaba que la región rica en prolina es importante, ya que la presencia o ausencia de 12 aminoácidos adicionales en esta región explica su capacidad para reducir la fuga de membrana y suprimir la fibrosis, dos actividades que se atribuyeron a la capacidad de LTBP4 para secuestrar el TGFp. Esta posición es consistente con la sensibilidad diferencial a la proteólisis de las diversas formas de LTBP4 y la actividad de TGFp asociada en forma de pSMAD nuclear [Heydemann et al., J Clin Invest. 119: 3703-12 (2009)].

Para demostrar que la región rica en prolina del LTBP4 humano era susceptible a la proteólisis, los dominios proteicas se expresaron usando transcripción y traducción in vitro de acuerdo con los métodos descritos previamente [Heydemann et al., J Clin Invest. 119(12): 3703-12 (2009)]. Según el diseño, solo se marcó el extremo carboxi de estas proteínas expresadas. Los fragmentos expresados se expusieron a plasmina. El LTBP4 murino con la inserción de 12 aminoácidos fue en gran medida resistente a la proteólisis, mientras que el LTBP4 murino delecionado para los 12 aminoácidos se degradó fácilmente (Figura 5, carriles central y derecho). El LTBP4 humano se degradó más fácilmente (Figura 5, carriles izquierdos). Se obtuvieron resultados similares con elastasa. Se contempla que esta región (es decir, la región incluida en las secuencias TP y TP2E) es un objetivo general de la serina proteasa. Se generaron anticuerpos que se dirigieron a la región rica en prolina y se descubrió que estos anticuerpos inhibían la escisión de LTBP4 in vitro (Figura 6). Un anticuerpo inespecífico generado a partir de la misma especie no mostró efecto de bloqueo. Se han generado anticuerpos anti-LTBP4 adicionales y los fragmentos Fab se purificarán y probarán porque se espera que estos fragmentos sean más útiles para la administración in vivo. La proteína LTBP4 de longitud completa, producida a partir de células cultivadas, también es susceptible a la proteólisis de plasmina (Figura 6). Con la lesión muscular, tal como la lesión que se produce en la DMD, se espera que la liberación de proteasas en la matriz extracelular dé como resultado la escisión de LTBP4. Las fuentes de estas proteasas in vivo pueden ser células inflamatorias, fibroblastos o las miofibras. Se demostró que el aumento de la escisión de LTBP4 se correlaciona con un aumento de la fibrosis, aumento de la fuga de la membrana muscular, aumento de la debilidad muscular y aumento de la señalización de TGFp [Heydemann et al., J Clin Invest. 119(12): 3703-12 (2009)]. Se demostró que la reducción de la señalización de TGFp mejora el resultado en la distrofia muscular [Cohn et al., Nat Med. 13(2): 204-10 (2007); Goldstein et al., Hum Mol Genet. 20(5): 894-904 (2011)]. Este ejemplo demuestra que la proteólisis de la región rica en prolina de LTBP4 puede ser inhibida por los anticuerpos proporcionados en el presente documento.

Ejemplo 4

Ratones transgénicos que albergan Ltbp4 humano

Se aisló y caracterizó un cromosoma artificial bacteriano humano (BAC) que portaba el gen de LTBP4 humano de longitud completa. Este BAC se inyectó en ratones y se caracterizaron varias líneas de ratones transgénicos. Se criaron ratones transgénicos con LTBP4 humanos (hLTBP4-BAC) en ratones mdx. El LTBP4 BAC humano en el fondo normal dio como resultado un mayor diámetro de miofibra, un signo de hipertrofia. Cuando el LTBP4 BAC humano estaba en el fondo de mdx, dio como resultado una fibrosis mejorada en el músculo esquelético y cardíaco, así como una menor fuerza de agarre, en relación con los ratones de control que no portaban el transgén (Figura 7). Esto apoya la observación de que la secuencia de LTBP4 humano, con su mayor deleción en la región rica en prolina, potencia el fenotipo de distrofia muscular. Estos ratones se usarán adicionalmente para evaluar si los anticuerpos dirigidos contra el LTBP4 humano pueden reducir la fibrosis por distrofia muscular y la fuga de la membrana muscular.

Ejemplo 5

Estudios in vivo

Se llevan a cabo estudios a corto plazo en ratones distróficos (es decir, mdx y distrofia muscular de cinturas (LGMD)) para determinar la seguridad y la eficacia de la inhibición de la escisión de LTBP4 in vivo. Los animales se tratan de 3 a 8 semanas de edad con inyecciones de anticuerpos, tres veces a la semana, administradas mediante inyección intraperitoneal. Se determina la capacidad de respuesta a la dosis. Se realizan ecocardiografía, pletismografía, extirpación muscular y mecánica muscular ex vivo se realizan en animales tanto tratados como controles. Se estudian los tejidos diana, incluyendo el corazón, el diafragma, el cuádriceps, los glúteos/isquiotibiales, el gastrocnemio/sóleo, los tríceps y los músculos abdominales, de acuerdo con protocolos previamente identificados [Heydemann et al., Neuromuscul Disord. 15: 601-9 (2005); Heydemann, et al., J Clin Invest. 119: 3703-12 (2009); Swaggart et al., Physiol Genomics. 43: 24-31 (2011)]. También se determina la señalización de TGFp.

Se realizan estudios a largo plazo en ratones distróficos para determinar la seguridad y la eficacia del tratamiento. Una vez que se ha determinado la dosificación, se tratan cohortes de ratones desde las 3 semanas hasta 1 año de edad. Se realiza un análisis similar de la eficacia, como se ha tratado anteriormente (es decir, ecocardiografía, pletismografía, extirpación muscular y mecánica muscular ex vivo). El análisis de otros órganos, incluyendo los pulmones, el colon, los riñones, el cerebro y otros tejidos, está incluido. Los ratones que son nulos para LTBP4 desarrollan miocardiopatía, fibrosis pulmonar y cáncer de colon. Debido a que el LTBP4 no se ablaciona en estos estudios, no se esperan estos defectos de miocardiopatías, de fibrosis pulmonar y cáncer de colon, consistente con los resultados de los estudios genéticos descritos anteriormente. No obstante, también se analizan tejidos que no son diana.

Se espera que los estudios descritos anteriormente muestren que la inhibición de la escisión de LTBP4 in vivo da como resultado una disminución de la señalización de TGFp, que además se espera que conduzca a una disminución de la permeabilidad de la membrana, así como a una disminución de la fibrosis en los músculos de los ratones distróficos. Estos resultados se manifestarán mediante una mejora o falta de disminución en los criterios de valoración terapéuticos como se describe en el presente documento, estableciendo así que el bloqueo de la proteólisis de LTBP4 es una terapéutica sólida en el tratamiento de enfermedades relacionadas con la proteína de la superfamilia TGFp.

Ejemplo 6

LTBP4 interactúa con miostatina in vitro

La capacidad de LTBP4 para interactuar directamente con miostatina, un miembro de la superfamilia TGF-p, también se investigó. Los métodos utilizados para investigar la interacción fueron los siguientes. El LTBP4 de longitud completa se clonó en un vector de expresión (pcDNA3.1, Life Technologies (Invitrogen), Grand Island, NY) y el marcador del epítopo Xpress (Life Technologies (Invitrogen), Grand Island, NY) se añadió a su extremo 5'/ amino terminal. La miostatina de longitud completa, que codifica el propéptido y las regiones maduras, se marcó en su extremo 3'/carboxi terminal con el marcador del epítopo myc. Ambos plásmidos se introdujeron en células HEK293 (riñón embrionario humano 293). Las células se lisaron y las proteínas se transfirieron o inmunoprecipitaron con el anticuerpo 28200 o, en un experimento separado, el anticuerpo 28199 (véase la Tabla 1). Ambos anticuerpos policlonales de conejo están dirigidos a la región rica en prolina de LTBP4. A continuación, el material inmunoprecipitado se transfirió con el anticuerpo anti-myc, mostrando que la miostatina se asocia con LTBP4 (Figura 8).

Este ejemplo muestra que el LTBP4 puede interactuar directamente con miostatina. Los resultados indican que, inhibiendo la proteólisis de LTBP4 de acuerdo con la presente divulgación, se puede secuestrar la miostatina y evitar su activación y la señalización aguas abajo resultante. Como la miostatina es un regulador negativo conocido del crecimiento muscular, se espera que la inhibición de la señalización de miostatina produzca un mayor crecimiento muscular y una mayor fuerza muscular.

Ejemplo 7

La expresión de LTBP4 humano en ratones conduce a un daño mejorado después de la lesión por cardiotoxina

Se generaron ratones para que expresaran el gen de LTBP4 humano en un cromosoma artificial bacteriano y estos ratones transgénicos se denominaron ratones hLTBP4 Tg+. La proteína LTBP4 humana se proteoliza más fácilmente debido a su región rica en prolina más corta. Este aumento de la proteólisis conduce a un daño mayor en el músculo debido a una mayor liberación de TGFp. Se inyectó cardiotoxina en el músculo tibial anterior de ratones transgénicos normales (WT con CTX) y hLTBP4 (hLTBP4 Tg+ con CTX). Los ratones transgénicos mostraron una lesión aumentada después de la lesión por cardiotoxina vista como un mayor infiltrado inflamatorio de células mononucleares y fibrosis y depósito de grasa en el músculo lesionado (Figura 9A), similar a lo que se ve en la distrofia muscular.

En el músculo normal (WT) y hLTBP4 se inyectó cardiotoxina para inducir lesiones. La inmunotransferencia con un anticuerpo anti-LTBP4 mostró niveles aumentados de proteína LTBP4 inducida por lesión tanto en el músculo transgénico normal como en el hLTBP4 (Figura 9B). También se descubrió que el músculo hLTBP4 estaba asociado con una mayor señalización de TGFp vista como SMAD fosforilada localizada nuclearmente.

Los resultados mostraron que la expresión de la proteína LTBP4 humana en el músculo conduce a un daño muscular mejorado después de una lesión por cardiotoxina.

Ejemplo 8

Los anticuerpos anti-LTBP4 mitigan la lesión muscular in vivo

Para probar si el anticuerpo anti-LTBP4 mitigaba la lesión del músculo esquelético en la distrofia muscular, se llevaron a cabo experimentos usando ratones hLTBP4/mdx. Se inyectó cardiotoxina, que se sabe que causa necrosis de las células del músculo esquelético, en el músculo tibial anterior para inducir una lesión aumentada. Este modelo de lesión se resuelve en 2 semanas porque se usa una inyección de bajo volumen de 10 pl. Los ratones hLTBP4/mdx (8 semanas de edad) se pretrataron el día 0 con (i) PBS o (ii) anticuerpo contra el anticuerpo LTBP4

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un agente que inhibe la proteólisis de la proteína 4 de unión a TGFp latente (LTBP4) para su uso en el tratamiento de un paciente que padece una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular de cinturas, distrofia muscular de Becker, miopatía, fibrosis quística, fibrosis pulmonar, miocardiopatía, lesión pulmonar aguda, lesión muscular aguda y lesión miocárdica aguda, en donde el agente es un anticuerpo aislado que se une específicamente a un péptido que consiste en la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 6.

2. El agente para su uso de la reivindicación 1, en donde el uso comprende además administrar una cantidad efectiva de un segundo agente seleccionado del grupo que consiste en un inhibidor de una respuesta inflamatoria, un promotor del crecimiento muscular y un inhibidor de la fibrosis, en donde el inhibidor de una respuesta inflamatoria es un agonista del receptor beta2-adrenérgico, un inhibidor del factor nuclear kappa-B (NF-kB), un antagonista del factor alfa de necrosis tumoral (TNF-a), o ciclosporina.

3. Un anticuerpo aislado que se une específicamente a un péptido que consiste en la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 6.

4. Una formulación farmacéutica que comprende una cantidad efectiva del anticuerpo de la reivindicación 3 y un vehículo o un diluyente farmacéuticamente aceptables.

5. La formulación de la reivindicación 4 que comprende una cantidad efectiva del anticuerpo de la reivindicación 3 y que además comprende una cantidad efectiva de un segundo agente, en donde el segundo agente se selecciona del grupo que consiste en un inhibidor de una respuesta inflamatoria, un promotor del crecimiento muscular, un agente quimioterapéutico y un inhibidor de la fibrosis, en donde el inhibidor de una respuesta inflamatoria es un agonista del receptor beta2-adrenérgico, un inhibidor del factor nuclear kappa-B (NF-^kB), un antagonista del factor alfa de necrosis tumoral (TNF-a) o ciclosporina.

6. La formulación de la reivindicación 5, en la que el segundo agente es el promotor del crecimiento muscular seleccionado del grupo que consiste en el factor 1 de crecimiento similar a la insulina (IGF-1), Akt/proteína quinasa B, clenbuterol, creatina, decorina, un esteroide y testosterona.

7. La formulación de la reivindicación 5, en la que el segundo agente se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo para el factor 8 de crecimiento y diferenciación (GDF-8), un anticuerpo para un receptor de GDF-8, un receptor soluble de GDF-8, un propéptido de GDF-8, folistatina y una proteína que contiene dominio de folistatina.

8. La formulación de la reivindicación 5, en la que el segundo agente es el inhibidor de fibrosis seleccionado del grupo que consiste en pirfenidona, un inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina (ECA), un antagonista de TGFp, un antagonista de VEGF, un antagonista del receptor de VEGF, un antagonista del receptor de TGFp, un bloqueador del receptor de angiotensina y un antagonista de la aldosterona.

9. Una formulación de la reivindicación 4 para su uso en el tratamiento de un paciente que padece una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular de cinturas, distrofia muscular de Becker, miopatía, fibrosis quística, fibrosis pulmonar, miocardiopatía, lesión pulmonar aguda, lesión muscular aguda y lesión miocárdica aguda.