ES2791338T3

ES2791338T3 - Célula

Info

Publication number: ES2791338T3
Application number: ES16726416T
Authority: ES
Inventors: Martin Pule; Shaun Cordoba; Simon Thomas; Khai Kong
Original assignee: UCL Business Ltd
Current assignee: UCL Business Ltd
Priority date: 2015-06-01
Filing date: 2016-05-31
Publication date: 2020-11-03
Anticipated expiration: 2036-05-31
Also published as: ZA201707334B; CN107667170B; JP2022066380A; IL255594B; KR102275460B1; MX2017014630A; RU2729158C2; NZ737662A; EP3303568B1; RU2017145074A; HK1246825A1; MX383118B; CL2017003057A1; BR112017023190A2; US11345734B2; JP2020115898A; GB201509413D0; CA2986956A1; KR20180012762A; AU2016272457A1

Abstract

Células que comprende un receptor de antígeno quimérico (RAQ) y una proteína truncada que comprende un dominio SH2 de una proteína que se une a un motivo de inhibición de inmunorreceptor a base de tirosinas (ITIM) fosforilado pero que no presenta un dominio de fosfatasa.

Description

DESCRIPCIÓN

Célula

Campo de la invención

La presente invención se refiere a proteínas de fusión y a proteínas truncadas que permiten manipular o modular las rutas de señalización que se propagan tras la activación de las células inmunitarias.

Antecedentes de la invención

La inmunoterapia adoptiva con células T autólogas implica el aislamiento de las células T a partir del paciente seguido de su estimulación, modificación y/o expansión ex vivo con el fin de generar una población de células T que muestra especificidades antitumorales. Una vez reinfusionadas en el paciente, dichas células son capaces de reconocer los antígenos expresados en el tumor y que median en el rechazo tumoral.

Este enfoque ya se ha demostrado en varios ensayos en diferentes contextos que presenta el potencial de ser un tratamiento potente, eficaz y duradero para el cáncer. Por ejemplo, los tumores controlados por el VEB, tal como la enfermedad linfoproliferativa secundaria al trasplante de un órgano sólido, puede tratarse eficazmente con células T específicas de v Eb expandidas ex vivo.

Una terapia similar para las neoplasias malignas no víricas implica linfocitos infiltrantes de tumor (LIT), que se aíslan a partir de fragmentos resecados de tumor y después se someten a estimulación y expansión con muestras de tumor autólogo. Los cultivos de células T expandidos que muestran reactividad tumoral a continuación pueden reinfusionarse en el paciente.

Al contrario que seleccionando y refinando las especificidades de las células T con la exposición repetida a antígenos, puede proporcionarse la especificidad antitumoral deseada a las células T mediante modificación génica e introducción de un receptor de células T (RCT) específico tumoral o un receptor de antígeno quimérico (RAQ). Estas células se expanden ex vivo con el fin de producir un número suficiente de células para conseguir respuestas clínicas significativas en el paciente.

Sin embargo, los enfoques detallados anteriormente adolecen de limitaciones. Por ejemplo, las células T transferidas adoptivamente pueden mostrar una persistencia y expansión in vivo limitadas debido a una señalización, falta de IL-2 o diferenciación insuficiente. A título de ejemplo adicional, las células T transferidas adoptivamente pueden sucumbir a los estímulos inhibitorios dentro del microambiente tumoral. Por ejemplo, pueden agotarse, experimentar muerte celular inducida por activación como consecuencia de la sobreactivación, o pueden causar efectos en dianas fuera del tumor.

Otro enfoque prometedor de la activación de la inmunidad antitumoral terapéutica es el bloqueo de los puntos de control inmunitario. Los puntos de control inmunitario se refieren a las diversas rutas inhibitorias del sistema inmunitario que resultan importantes para mantener la autotolerancia y modular la duración y amplitud de las respuestas inmunitarias fisiológicas en tejidos periféricos.

Es conocido que los tumores explotan determinadas rutas de punto de control inmunitario como mecanismo principal de resistencia inmunitaria, particularmente contra células T que son específicas para antígenos tumorales. Muchos de los puntos de control inmunitario resultan iniciados por interacciones de ligando-receptor, lo que implican que pueden resultar bloqueados por anticuerpos o modulados por formas recombinantes de ligandos o receptores. Los anticuerpos citotóxicos del antígeno 4 asociado a linfocitos T (CTLA4) son los primeros de dicha clase de inmunoterapéuticos en conseguir la autorización de la US Food and Drug Administration (FDA). Más recientemente, se han desarrollado bloqueantes de proteínas adicionales de punto de control inmunitario, tales como la proteína 1 de muerte celular programada (PD1), y se ha demostrado que potencian la inmunidad antitumoral. John et al. (John et al., Oncolmmunology, 2: 10, e26286, 2013) han dado a conocer que el bloqueo de la inmunosupresión de PD-1 refuerza la terapia de células T RAQ.

Un problema de la utilización de los inhibidores de punto de control inmunitario es que existe una multitud de rutas inhibitorias inducidas por una multitud de interacciones de ligando:receptor. La utilización de un anticuerpo o de una forma recombinante del ligando/receptor sólo bloqueará una de dichas rutas inhibitorias, dejando la posibilidad abierta de que el tumor pueda compensar el bloqueo de punto de control inmunitario específico utilizando otras moléculas.

Descripción resumida de aspectos de la invención

Los presentes inventores han desarrollado un sistema para modular y/o manipular las rutas de transducción de señales en células inmunitarias, tales como células T y células asesinas naturales (NK).

Las rutas de señalización intracelular resultan iniciadas y controladas por la modificación post-traduccional reversible de las proteínas. Los presentes inventores han determinado que las rutas de señalización activadoras e inhibidoras en las células T pueden resultar moduladas y/o manipuladas por proteínas de fusión o proteínas truncadas que comprenden dominios SH2 procedentes de proteínas de transducción de señales inmediatas de células T. En otras palabras, las rutas de señalización activadoras e inhibidoras en las células T pueden modularse y/o manipularse con proteínas de fusión o proteínas truncadas que comprenden dominios SH2 de proteínas que son capaces de unirse a motivos inmunorreceptores de activación a base de tirosinas fosforiladas (ITAM, por sus siglas en inglés) o motivos inmunorreceptores de inactivación a base de tirosinas fosforiladas (ITIM).

La invención proporciona una célula que comprende un receptor de antígeno quimérico (RAQ) y una proteína truncada que comprende un dominio SH2 de una proteína que se une a un motivo inmunorreceptor de inactivación a base de tirosinas (ITIM) pero que no presenta un dominio de fosfatasa.

En algunas realizaciones, la proteína truncada comprende el dominio SH2 de PTPN6 pero no presenta el dominio de fosfatasa de PTPN6.

En algunas realizaciones, la proteína truncada comprende el dominio SH2 de SHP-2 pero no presenta el dominio de fosfatasa de SHP-2.

En algunas realizaciones, la proteína truncada comprende la secuencia mostrada en SEC ID n° 6 o una o ambas secuencias mostradas en SEC ID n° 7 y n° 8.

En algunas realizaciones, la proteína truncada comprende o consiste en la secuencia mostrada en SEC ID n° 10, n° 11 o n° 12.

La invención proporciona además un constructo de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína truncada según la invención y una secuencia de ácidos nucleicos codificante de un receptor de antígeno quimérico.

La invención proporciona además un vector que comprende un constructo de ácidos nucleicos según la invención.

La invención proporciona además un conjunto de vectores que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína truncada según la invención y una secuencia de ácidos nucleicos codificante de un receptor de antígeno quimérico.

La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de células según la invención.

La invención proporciona además una composición farmacéutica según la invención para la utilización en el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad.

En algunas realizaciones, el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad comprende las etapas siguientes:

(i) provisión de una muestra que contiene células a partir de un sujeto,

(ii) transducción o transfección de las células con un constructo de ácidos nucleicos según la invención, un vector según la invención o un juego de vectores según la invención, y

(iii) administración de las células de (ii) en el sujeto.

En algunas realizaciones, la enfermedad es el cáncer.

La invención proporciona además un método para producir una célula según la invención, que comprende la etapa de introducir: un constructo de ácidos nucleicos según la invención, un vector según la invención o un juego de vectores según la invención, en la célula ex vivo.

En algunas realizaciones, la célula es de una muestra aislada a partir de un sujeto.

Descripción de las figuras

Figura 1 (a) - Diagrama de rutas de activación inmediata de células T. La activación de receptores de las células T resulta en la fosforilación de los ITAM. Los ITAM fosforilados resultan reconocidos por los dominios SH2 de ZAP70. Con el reconocimiento, ZAP70 resulta captado en la región yuxtamembranal y su dominio de quinasa seguidamente fosforila LAT. LAT fosforilado es posteriormente reconocido por los dominios SH2 de GRAP, GRB2 y PLC-y. (b) - Diagrama de rutas de inhibición inmediata de células T. La activación un inmunorreceptor inhibitorio tal como PD1 resulta en la fosforilación de los dominios ITIM. Estos resultan reconocidos por los dominios SH2 de PTPN6. Con el reconocimiento, PTPN6 resulta captado en la región yuxtamembranal y su dominio fosfatasa seguidamente desfosforila dominios ITAM, inhibiendo la activación inmunitaria.

Figura 2 - Diagrama de un sistema de señal de bloqueo - a) ZAP70 truncado que no comprende un dominio de quinasa resulta sobreexpresado. En consecuencia, compite con ZAP70 de longitud completa para los ITAM y reduce la señalización de ITAM. (B) Un PTPN6 truncado que no comprende un dominio de fosfatasa se sobreexpresa, compitiendo para PTPN6 de longitud completa, reduciendo la señalización de ITIM.

Figura 3 - Diagrama de un sistema de señalización de cruce: (a) SH2 de ZAP70 se fusiona con la PTPN6 fosfatasa; por lo tanto, actúa amortiguando la fosforilación de ITAM, ((b) SH2 de PTP6 se fusiona con la ZAP70 quinasa, resultando en la activación paradójica en respuesta a una señal inhibitoria.

Figura 4 - Diagrama de un sistema de señalización amplificada: (a) ZAP70 de longitud completa presenta un endodominio zeta de CD3 unido a su extremo amino-terminal de manera que se ensambla una cascada de ITAM. (b) PTPN6 de longitud completa presenta un endodominio PD1 unido a su extremo amino-terminal de manera que se ensambla una cascada de ITIM.

Figura 5 - Diagrama de ejemplos de un sistema de señalización de derivación: (a) ZAP70 fusionado con endodominio de CD28; (b) ZAP70 fusionado con endodominio de 41BB; (c) ZAP70 fusionado con AKT quinasa; (d) el dominio SH2 de PTPN6 se fusiona con el endodominio 41BB.

Figura 6 - Diagrama de un sistema ilustrativo de señales transcripcionales: a) se coexpresa una fusión ZAP-TeV con un factor de transcripción anclado a membrana que puede liberarse de la membrana mediante corte de su motivo de reconocimiento TeV. Se muestra lo anterior coexpresado con un RAQ de CD19. Por lo tanto, tras el reconocimiento de CD19 sobre una célula diana, la célula T resulta activada y, además, el factor de transcripción se activa. (b) Un sistema alternativo que utiliza alternativamente una fusión de PTPN6-TeV. En la presente memoria, el RAQ consiste en un endodominio portador de ITIM. Por lo tanto, con el reconocimiento de CD19 por el RAQ, el factor de transcripción se activa, aunque es independiente de la activación de las células T.

Figura 7 - diagrama de un sistema de señalización de castración: se muestran dos RAQ - uno reconoce CD19 y es activador, y uno que reconoce CD33 y es inhibitorio - estas especificidades se proporcionan únicamente a título ilustrativo (a) Y NO castración de señal; se capta una proteína de fusión SH2-Tev en el RAQ ITIM con su activación. Lo anterior resulta en la escisión de los ITAM respecto de un RAQ activador que se construye de manera que un sitio de corte TeV conecta el dominio transmembranal con el dominio ITAM. Por lo tanto, se inhibe el RAQ activador. (b) Y castración de señales: En la presente memoria, se cata una proteína de fusión SH2-TeV en un RAQ ITIM tras su activación. Lo anterior resulta en la liberación de un dominio de fosfatasa respecto de un RAQ activador que se construye de manera que se conecta una fosfatasa a su extremo carboxi-terminal mediante un dominio de corte TeV. Lo anterior resulta en la liberación de la inhibición constitutiva, permitiendo que el RAQ se active en presencia del antígeno afín.

Figura 8 - Se construyeron varias fusiones de diferentes dominios SH2 y dominio de quinasa AKT. ZAP-AKT, GRAP-AKT, GRB-AKT y PLC-y.

Figura 9(a) Tinción fosfo-AKT de células T transducidas con las diferentes fusiones de SH2/AKT con y sin activación con el anticuerpo mitogénico OKT3. (b) Tinción fosfo-AKT de células T transducidas con fusión ZAP-AKT, una fusión ZAP-AKT mejorada en la que ZAP y AKT se conectan mediante un conector flexible y un ZAP-AKT de control, en el que la sustitución R l90K elimina la capacidad de ZAP de unirse a los ITAM. Las células T se estimularon con OKT3 o no se estimularon con OKT3. Los gráficos de facs se superpusieron sobre los de las células T no transducidas.

Figura 10(a). Transferencia fosfo-AKT de células T activadas con cantidades crecientes de OKT3. (B) Microscopía de ZAP-AKT o células T de control no estimuladas, estimuladas con solo OKT3 o estimuladas con OKT3 e IL-2. Las células T ZAP-AKT estimuladas con solo OKT3 son similares a las células T no transducidas estimuladas con OKT3 e IL2.

Figura 11(a). Implementación del interruptor transcripcional de TeV directo. Se sustituye un endodominio de RAQ de CD19 con la proteasa TeV. También se coexpresa un factor de transcripción VP16/GAL4 anclado a membrana. Un informador de luciferasa detecta la actividad de VP16/GAL5. (b) Implementación con ZAP-TeV. Se coexpresa un RAQ de CD19 estándar con la fusión ZAP-TeV junto con el factor de transcripción anclado a membrana. Figura 12. Actividad de interruptores transcripcionales basados en ZAP-TeV y células T expresantes de control tras la exposición a dianas negativas para CD19 (izquierda) o positivas para c D l9 (derecha). La actividad se mide a partir de la producción de luz tras la adición de luciferasa. En orden, las condiciones sometidas a ensayo son: (a) RAQ aCD19 coexpresado con ZAP-TeV, (b) RAQ aCD19 coexpresado con (R190K) inactivo, (c) RAQ aCD19 coexpresado con ZAP-TeV y el factor de transcripción anclado a membrana, (d) RAQ aCD19 coexpresado con (R190K) ZAP-TEV inactivo coexpresado con el factor de transcripción anclado a membrana, (e) fusión RAQ aCD19 / TeV coexpresada con el factor de transcripción anclado a membrana, (f) factor de transcripción GAL4/VP16 constitutivamente activo.

Figura 13(a). Arquitectura generalizada de un RAQ: un dominio de unión reconoce el antígeno; el espaciado eleva el dominio de unión respecto de la superficie celular; el dominio transmembranal ancla la proteína a la membrana y el endodominio transmite señales. (b) a (d): diferentes generaciones y permutaciones de los endodominios RAQ: (B) los diseños iniciales transmitían señales de ITAM solas a través del endodominio FceR I-y o Cd3Z, mientras que diseños posteriores transmitían señales adicionales, una (c) o (d) dos señales coestimuladoras en cis.

Figura 14. Secuencias de proteína ilustrativas que incluyen secuencias de la presente invención.

Figura 15. Bloqueo de la señal de PD-1 utilizando células PBMC de SHP-1 truncada (PTPN6) o SHP-2 truncada, se cotransdujeron con PD1 y RAQ solo (FMC63) o un constructo bicistrónico que contenía RAQ y SHP-1 truncada o RAQ y SHP-2 truncada. Dichas células se cocultivaron durante 48 horas con células SupT1 transducidas con CD19, PDL1 o ambas y se midió la liberación de IFNy mediante ELISA.

Figura 16. Secuestro de la señal de PD-1 utilizando una fusión de dominios SHP-2 SH2 y Zap70 quinasa. Se cotransdujeron células PBMC con PD1 y RAQ solo (FMC63) o un constructo bicistrónico que contenía RAQ y una proteína de fusión que comprendía dominios SHP-2 SH2 y la ZAP70 quinasa. Dichas células se cocultivaron en una proporción 1:1 durante 24 horas con células SupT1 transducidas con CD19 o PDL1. Se midió la liberación de IFNy mediante ELISA (A) y la eliminación de las células SupT1 se cuantificó mediante FACS (B).

Descripción detallada

Las rutas de señalización de las células T pueden modularse y alterarse mediante, por ejemplo, los mecanismos indicados en la Tabla 1.

Tabla 1: aplicación de la modulación de señales

PROTEINA

La presente exposición proporciona una proteína truncada que comprende un dominio SH2.

La presente exposición proporciona además una proteína de fusión que comprende: (i) un dominio SH2 e (ii) un dominio heterólogo.

El dominio SH2 puede proceder de una proteína que se une a un motivo de activación de inmunorreceptor (ITAM) a base de tirosinas fosforiladas o proceder de una proteína que se une a un motivo de inhibición de inmunorreceptor (ITIM) a base de tirosinas fosforiladas.

Un ejemplo de una proteína que se une a un ITAM es ZAP70. Entre los ejemplos de proteínas que se unen a ITIM se incluyen PTPN6 y SHP-2.

Por lo tanto, la proteína de fusión de la exposición comprende un dominio SH2 y por lo menos un dominio adicional que no se encuentra presente en una proteína de tipo salvaje a partir de la que se deriva el dominio SH2.

DOMINIO DE HOMOLOGÍA 2 RESPECTO A SRC (SH2)

Las rutas de señalización intracelular resultan iniciadas y controladas por la modificación post-traduccional reversible de las proteínas, incluyendo la fosforilación, la ubiquitinilación y la acetilación.

Los dominios SH2 son dominios de proteína modulares que sirven como adaptadores y median en interacciones proteína-proteína mediante la unión a péptidos fosforilados en sus parejas de unión a proteína respectivas, con frecuencia receptores de superficie celular. Los dominios SH2 típicamente se unen a un residuo de tirosina fosforilada en el contexto de un motivo peptídico más largo dentro de una proteína diana, y los dominios SH2 representan la clase más grande de dominios de reconocimiento de pTyr conocidos. Aunque los dominios SH2 no presentan ninguna actividad catalítica intrínseca, se acoplan frecuentemente con dominios catalíticos independientes y, de esta manera, en respuesta a una señal de entrada específica, sirven para localizar dichos dominios catalíticos en localizaciones subcelulares particulares o en la vecindad de sustratos, activadores o inhibidores apropiados. Además, también pueden encontrarse dominios SH2 unidos a dominios proteicos adaptadores, de manera que pueden servir para la formación de grandes complejos multiproteína.

PROTEÍNA QUINASA 70 ASOCIADA A CADENA ZETA (ZAP70)

ZAP70 es una proteína normalmente expresada en proximidad a la membrana superficial de las células T y las células asesinas naturales. Es parte del receptor de células T (RCT) y desempeña una función crítica en la señalización de las células T. Su peso molecular es de 70 kDa y está compuesto de 2 dominios SH2 N-terminales y un dominio de quinasa C-terminal. Es un miembro de la familia de las proteína-tirosina quinasas.

La primera etapa en la activación de las células T es el reconocimiento de un péptido complejo de CMH sobre la célula diana por parte del RCT. Dicho suceso inicial causa la asociación estrecha de la Lck quinasa y la cola citoplasmática de CD3-zeta en el complejo de RCT. A continuación, Lck fosforila los residuos de tirosina en la cola citoplasmática de Cd3-zeta, que permite la captación de ZAP70. ZAP70 es una quinasa que contiene SH2 que desempeña una función crucial en la activación de las células T tras el acoplamiento del RCT. Los dominios SH2 en tándem en ZAP70 se unen a CD3 fosforilado que resulta en que ZAP70 es fosforilado y activado por Lck o por otras moléculas de ZAP70 en trans. A continuación, la ZAP70 activa es capaz de fosforilar corriente abajo las proteínas membranales, clave entre ellos es el conector de proteína de células T activadas (LAT). LAT es una proteína de andamiaje y su fosforilación sobre múltiples residuos permite que interactúe con otras varias proteínas que contienen dominio SH2, incluyendo Grb2, PLC-g y Grap, que reconocen los péptidos fosforilados en LAT y transmiten la señal de activación de las células T corriente abajo, resultando finalmente en un abanico de respuestas de células T. Dicho procedimiento se resume en la figura 1.

La proteína ZAP70 humana presenta el número de acceso de UniProtKB P43403. Dicha secuencia presenta 619 aminoácidos de longitud y se muestra en la SEC ID n° 1.

Secuencia de aminoácidos de ZAP70 (SEC ID n° 1)

MPDPAAHLPFFYGSISRAEAEEHLKLAGMADGLFLLRQCLRSLGGYVLSLVHDVRFHHFPIERQLNGTYA

IAGGKAHCGPAELCEFYSRDPDGLPCNLRKPCNRPSGLEPQPGVFDCLRDAMVRDYVRQTWKLEGEALEQ

AIISQAPQVEKLIATTAHERMPWYHSSLTREEAERKLYSGAQTDGKFLLRPRKEQGTYALSLIYGKTVYH

YLISQDKAGKYCIPEGTKFDTLWQLVEYLKLKADGLIYCLKEACPNSSASNASGAAAPTLPAHPSTLTHP

QRRIDTLNSDGYTPEPARITSPDKPRPMPMDTSVYESPYSDPEELKDKKLFLKRDNLLIADIELGCGNFG

SVRQGVYRMRKKQIDVAIKVLKQGTEKADTEEMMREAQIMHQLDNPYIVRLIGVCQAEALMLVMEMAGGG

PLHKFLVGKREEIPVSNVAELLHQVSMGMKYLEEKNFVHRDLAARNVLLVNRHYAKISDFGLSKALGADD

SYYTARSAGKWPLKWYAPECINFRKFSSRSDVWSYGVTMWEALSYGQKPYKKMKGPEVMAFIEQGKRMEC

PPECPPELYALMSDCWIYKWEDRPDFLTVEQRMRACYYSLASKVEGPPGSTQKAEAACA

La proteína de fusión de la exposición puede comprender un dominio SH2 de ZAP70. La proteína truncada de la exposición puede comprender o consistir en un dominio SH2 de ZAP70. A este respecto, la fusión o proteína truncada puede comprender o consistir en la secuencia mostrada en SEC ID n° 2.

Dominio SH2 completo de ZAP70 (SEC ID n° 2)

MPDPAAHLPFFYGSISRAEAEEHLKLAGMADGLFLLRQCLRSLGGYVLSLVHDVRFHHFPIERQLNGTYA

IAGGKAHCGPAELCEFYSRDPDGLPCNLRKPCNRPSGLEPQPGVFDCLRDAMVRDYVRQTWKLEGEALEQ

AIISQAPQVEKLIATTAHERMPWYHSSLTREEAERKLYSGAQTDGKFLLRPRKEQGTYALSLIYGKTVYH

YLISQDKAGKYCIPEGTKFDTLWQLVEYLKLKADGLIYCLKEACPNSSASNASGAAAPTLPAHPSTLTHP

ZAP70 presenta dos dominios SH2 en el extremo N-terminal de la secuencia, en los residuos 10-102 y 163-254 de la secuencia mostrada en SEC ID n° 1. La proteína truncada o la proteína de fusión de la invención puede comprender, por lo tanto, una o ambas secuencias mostradas en SEC ID n° 3 y n° 4.

SH2 1 de ZAP70 (SEC ID n° 3)

FFYGSISRAEAEEHLKLAGMADGLFLLRQCLRSLGGYVLSLVHDVRFHHFPIERQLNGTYAIAGGKAHCG

PAELCEFYSRDPDGLPCNLRKPC SH22 de ZAP70 (SEC ID n° 4)

WYHSSLTREEAERKLYSGAQTDGKFLLRPRKEQGTYALSLIYGKTVYHYLISQDKAGKYCIPEGTKFDTL

WQLVEYLKLKADGLIYCLKEAC

La proteína de fusión puede comprender una variante de SEC ID n° 2, n° 3 o n° 4 con una identidad de secuencia de por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99%, con la condición de que la secuencia variante es una secuencia de dominio SH2 presenta las propiedades requeridas. En otras palabras, la secuencia variante debería ser capaz de unirse a los residuos de tirosina fosforilados en la cola citoplasmática de Cd3-zeta que permite la captación de ZAP70. Los métodos de alineación de secuencias son bien conocidos de la técnica y se llevan a cabo utilizando programas de alineación adecuados. El % de identidad de secuencia se refiere al porcentaje de residuos aminoácidos o nucleótidos que son idénticos en las dos secuencias una vez se han alineado óptimamente. La homología o identidad de secuencias de nucleótidos y de proteínas pueden determinarse utilizando algoritmos estándares, tales como un programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool en el National Center for Biotechnology Information) utilizando parámetros por defecto, que se encuentra disponible públicamente en http://blast.ncbi.nlm.nih.gov. Entre otros algoritmos para determinar la identidad u homología de secuencias se incluyen: LALIGN (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/lalign/ and http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/lalign/nucleotide.html). A mAs (análisis de secuencias múltiplemente alineadas, en: http://www.compbio.dundee.ac.uk/Software/Amas/amas.html), FASTA (http://www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta/), Clustal Omega

(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/), SIM (http://web.expasy.org/sim/) y EMBOSS Needle (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html).

La proteína de fusión puede comprender el dominio SH2 de ZAP70 y el dominio de quinasa de ZAP70. Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender la secuencia mostrada en SEC ID n° 1 o una variante de la misma que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99%.

PROTEÍNA-TIROSINA FOSFATASA NO RECEPTORA TIPO 6 (PTPN6)

PTPN6 también es conocida como fosfatasa-1 que contiene la región 2 del dominio de homología de Src (SHP-1). Es un miembro de la familia de las proteína-tirosina fosfatasas.

La región N-terminal de PTPN6 contiene dos dominios SH2 en tándem que median en la interacción de PTPN6 y sus sustratos. La región C-terminal contiene un dominio de proteína-tirosina fosfatasa.

PTPN6 es capaz de unirse y propagar señales de varios receptores inmunitarios inhibitorios o receptores que contienen ITiM. Entre los ejemplos de dichos receptores se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, PD1, PDCDl, BTLA4, LILRB1, LAIR1, CTLA4, KIR2DL1, KIR2DL4, KIR2DL5, KIR3DL1 y KIR3DL3.

La proteína PTPN6 humana presenta el número de acceso de UniProtKB P29350. Dicha secuencia presenta 595 aminoácidos de longitud y se muestra en la SEC ID n° 5.

Secuencia de aminoácidos de PTPN6 (SEC ID n° 5)

MVRWFHRDLSGLDAETLLKGRGVHGSFLARPSRKNQGDFSLSVRVGDQVTHIRIQNSGDFYDLYGGEKFA

TLTELVEYYTQQQGVLQDRDGTI1HLKYPLNCSDPTSERWYHGHMSGGQAETLLQAKGEPWTFLVRESLS

QPGDFVLSVLSDQPKAGPGSPLRVTHIKVMCEGGRYTVGGLETFDSLTDLVEHFKKTGIEEASGAFVYLR

QPYYATRVNAADIENRVLELNKKQESEDTAKAGFWEEFESLQKQEVKNLHQRLEGQRPENKGKNRYKNIL

PFDHSRVILQGRDSNIPGSDYINANYIKNQLLGPDENAKTYIASQGCLEATVNDFWQMAWQENSRVIVMT

TREVEKGRNKCVPYWPEVGMQRAYGPYSVTNCGEHDTTEYKLRTLQVSPLDNGDLIREIWHYQYLSWPDH

GVPSEPGGVLSFLDQINQRQESLPHAGPIIVHCSAGIGRTGTIIVIDMLMENISTKGLDCDIDIQKTIQM

VRAQRSGMVQTEAQYKFIYVAIAQFIETTKKKLEVLQSQKGQESEYGNITYPPAMKNAHAKASRTSSKHK

EDVYENLHTKNKREEKVKKQRSADKEKSKGSLKRK

La proteína truncada de la invención puede comprender o consistir en un dominio SH2 de PTPN6. A este respecto, la proteína truncada puede comprender o consistir en la secuencia mostrada en SEC ID n° 6.

Dominio completo SH2 de PTPN6 (SEC ID n° 6)

MVRWFHRDLSGLDAETLLKGRGVHGSFLARPSRKNQGDFSLSVRVGDQVTHIRIQNSGDFYDLYGGEKFA

TLTELVEYYTQQQGVLQDRDGTI1HLKYPLNCSDPTSERWYHGHMSGGQAETLLQAKGEPWTFLVRESLS

QPGDFVLSVLSDQPKAGPGSPLRVTHIKVMCEGGRYTVGGLETFDSLTDLVEHFKKTGIEEASGAFVYLR

QPYY PTPN6 presenta dos dominios SH2 en el extremo N-terminal de la secuencia, en los residuos 4-100 y 110-213 de la secuencia mostrada en SEC ID n° 5. La proteína truncada de la invención puede comprender, por lo tanto, una o ambas secuencias mostradas en SEC ID n° 3 y n° 4.

SH2 1 de PTPN6 (SEC ID n° 7) WFHRDLSGLDAETLLKGRGVHGSFLARPSRKNQGDFSLSVRVGDQVTHIRIQNSGDFYDLYGGEKFATLT ELVEYYTQQQGVLQDRDGTI1HLKYPL

SH2 2 de PTPN6 (SEC ID n° 8) WYHGHMSGGQAETLLQAKGEPWTFLVRESLSQPGDFVLSVLSDQPKAGPGSPLRVTHIKVMCEGGRYTVG GLETFDSLTDLVEHFKKTGIEEASGAFVYLRQPY

La proteína puede comprender una variante de SEC ID n° 6, n° 7 o n° 8 con una identidad de secuencia de por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99%, con la condición de que la secuencia variante es una secuencia de dominio SH2 presenta las propiedades requeridas. En otras palabras, la secuencia variante debería ser capaz de unión a los residuos de tirosina fosforilada en la cola citoplasmática de por lo menos de PD1, PDCD1, BTLA4, LILRB1, LAIR1, CTLA4, KIR2DL1, KIR2DL4, KIR2DL5, KIR3DL1 o KIR3DL3 que permite la captación de PTPN6.

En determinadas realizaciones, la proteína puede comprender el dominio SH2 de PTPN6 y el dominio de fosfatasa de PTPN6. Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender la secuencia mostrada en SEC ID n° 5 o una variante de la misma que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99%.

SHP-2

SHP-2, también conocido como PTPN11, PTP-1D y PTP-2C es un miembro de la familia de la proteína tirosina fosfatasa (PTP). Al igual que PTPN6, SHP-2 presenta una estructura de dominio que consiste en dos dominios SH2 en tándem en su extremo N-terminal seguido de un dominio de proteína tirosina fosfatasa (PTP). En el estado inactivo, el dominio SH2 N-terminal se une al dominio PTP y bloquea el acceso de los potenciales sustratos al sitio activo. De esta manera, SHP-2 se encuentra autoinhibida. Tras la unión a los residuos fosfotirosilo diana, el dominio SH2 N-terminal se libera del dominio PTP, activando catalíticamente el enzima mediante liberación de la autoinhibición. La SHP-2 humana presenta el número de acceso de UniProtKB P35235-1. Dicha secuencia presenta 597 aminoácidos de longitud y se muestra en la SEC ID n° 9.

Secuencia de aminoácidos de SHP-2 (SEC ID n° 9)

MTSRRWFHPNITGVEAENLLLTRGVDGSFLARPSKSNPGDFTLSVRRNGAVTHIKIQNTGDYYDLYGGEK

FATLAELVQYYMEHHGQLKEKNGDVIELKYPLNCADPTSERWFHGHLSGKEAEKLLTEKGKHGSFLVRES

QSHPGDFVLSVRTGDDKGESNDGKSKVTHVMIRCQELKYDVGGGERFDSLTDLVEHYKKNPMVETLGTVL

QLKQPLNTTRINAAEIESRVRELSKLAETTDKVKQGFWEEFETLQQQECKLLYSRKEGQRQENKNKNRYK

NILPFDHTRVVLHDGDPNEPVSDYINANIIMPEFETKCNNSKPKKSYIATQGCLQNTVNDFWRMVFQENS

RVIVMTTKEVERGKSKCVKYWPDEYALKEYGVMRVRNVKESAAHDYTLRELKLSKVGQALLQGNTERTVW

QYHFRTWPDHGVPSDPGGVLDFLEEVHHKQESIVDAGPVVVHCSAGIGRTGTFIVIDILIDIIREKGVDC

DIDVPKTIQMVRSQRSGMVQTEAQYRFIYMAVQHYIETLQRRIEEEQKSKRKGHEYTNIKYSLVDQTSGD

QSPLPPCTPTPPCAEMREDSARVYENVGLMQQQRSFR

La proteína truncada de la invención puede comprender o consistir en un dominio SH2 de SHP-2. A este respecto, la proteína truncada puede comprender o consistir en el primer dominio SH2 de SHP-2, comprendiendo por ejemplo los aminoácidos 6 a 102 de SEC ID n° 9 o el segundo dominio SH2 de SHP-2, comprendiendo por ejemplo los aminoácidos 112 a 216 de SHP-2. La proteína truncada puede comprender o consistir en la secuencia mostrada en SEC ID n° 10, 11 o 12.

Primer dominio SH2 de SHP-2 (SEC ID n° 10)

WFHPNITGVEAENLLLTRGVDGSFLARPSKSNPGDFTLSVRRNGAVTHIKIQNTGDYYDLYGGEKFATLA

ELVQYYMEHHGQLKEKNGDVIELKYPL

Segundo dominio SH2 de SHP-2 (SEC ID n° 11)

WFHGHLSGKEAEKLLTEKGKHGSFLVRESQSHPGDFVLSVRTGDDKGESNDGKSKVTHVMIRCQELKYDV

GGGERFDSLTDLVEHYKKNPMVETLGTVLQLKQPL

Ambos dominios SH2 de SHP-2 (SEC ID n° 12)

WFHPNITGVEAENLLLTRGVDGSFLARPSKSNPGDFTLSVRRNGAVTHIKIQNTGDYYDLYGGEKFATLA

ELVQYYMEHHGQLKEKNGDVIELKYPLNCADPTSERWFHGHLSGKEAEKLLTEKGKHGSFLVRESQSHPG

DFVLSVRTGDDKGESNDGKSKVTHVMIRCQELKYDVGGGERFDSLTDLVEHYKKNPMVETLGTVLQLKQP

L

La proteína puede comprender una variante de SEC ID n° 10, n° 11 o n° 12 con una identidad de secuencia de por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99%, con la condición de que la secuencia variante sea una secuencia de dominio SH2 capaz de unión a un dominio que contiene ITIM. Por ejemplo, la secuencia variante puede ser capaz de unión a los residuos de tirosina fosforilada en la cola citoplasmática de PD1, PDCD1, BTLA4, LILRB1, LAIR1, CTLA4, KIR2DL1, KIR2DL4, KIR2DL5, KIR3DL1 o KIR3DL3.

DOMINIO HETERÓLOGO

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “dominio heterólogo” se refiere a cualquier dominio de proteína que no se encuentra presente en:

i) ZAP70 de tipo salvaje (ver la SEC ID n° 1) para proteínas de fusión que comprenden un dominio SH2 de ZAP70, ii) PTPN6 de tipo salvaje (ver la SEC ID n° 5) para proteínas de fusión que comprenden un dominio SH2 de PTPN6, o

iii) SHP-2 de tipo salvaje (ver la SEC ID n° 9) para proteínas de fusión que comprenden un dominio SH2 de SHP-2.

El dominio heterólogo puede ser, o puede ser derivable de (p.ej., puede ser parte de) una proteína diferente de ZAP70, SHP-2 o PTPN6.

Alternativamente, la proteína de fusión puede comprender una fusión de dominio SH2 de ZAP70 y un dominio de PTPN6, tal como el dominio de PTPN6 quinasa. Del mismo modo, la proteína de fusión puede comprender una fusión de dominio SH2 de PTPN6 y un dominio de ZAP70, tal como el dominio de ZAP70 quinasa.

SEÑAL AMPLIFICADA

La presente exposición proporciona una proteína de fusión que comprende: un dominio SH2 de una proteína de unión a iTa M y un dominio que contiene ITAM.

La presente exposición proporciona además una proteína de fusión que comprende: un dominio SH2 de una proteína de unión a ITIM y un dominio que contiene ITIM.

Estas moléculas de señalización “amplificadas” amplificarán una señal de excitación o inhibitoria dentro de una célula inmunitaria, tal como una célula T.

Tal como se muestra en la figura 4, la presencia de dichas moléculas conducirá a una concatenación de ITAM o ITM que conduce a una señal activadora o inhibidora aumentada, respectivamente.

La amplificación de una señal activadora resulta útil en situaciones en las que resulta deseable incrementar la sensibilidad de la célula inmunitaria (tal como una célula T-RAQ) al antígeno. Lo anterior puede ser el caso cuando, por ejemplo, el antígeno diana se expresa a niveles bajos sobre las células diana.

La amplificación de un sistema inhibidor en situaciones en las que resulta deseable reducir o evitar la activación de las células T. El documento n° WO2015/075469 describe un panel de pares de receptores de antígeno quimérico de “puerta lógica” que, al ser expresado por una célula, tal como una célula T, es capaz de detectar un patrón particular de la expresión de por lo menos dos antígenos diana A y B. La “puerta Y/n O” descrita en la presente solicitud comprende una pareja de RAQ, de manera que la célula T se induce únicamente en el caso de que se encuentre presente el antígeno A pero no el antígeno B sobre la célula diana. En dicha puerta Y/NO, un RAQ (que reconoce el antígeno A) presenta un endodominio activador que comprende un ITAM, mientras que el otro RAQ (que reconoce el antígeno B) presenta un endodominio inhibidor que puede comprender un ITIM. En presencia del antígeno A solo, la presencia de RAQ inhibidora no ligada resulta insuficiente para evitar la activación de las células T, de manera que se produce la activación. Sin embargo, en presencia de ambos antígenos, se forman zonas de membrana con concentraciones elevadas de RAQ tanto activadores como inhibidores. Debido a que ambos endodominios se encuentran concentrados, se bloquea o se reduce la activación de las células T.

La amplificación de la señal inhibidora utilizando una molécula de señalización amplificada de la presente invención podría utilizarse en una puerta Y para reducir o eliminar cualquier señalización residual que se produce en presencia de ambos antígenos, es decir, por la inhibición incompleta del RAQ activador por el RAQ inhibidor.

DOMINIO QUE CONTIENE ITAM

La proteína de fusión puede comprender un dominio SH2 de ZAP70 y un dominio que contiene dominio de activación de inmunorreceptor a base de tirosinas (ITAM).

Una fusión de ZAP70 de longitud completa con un dominio que contiene ITAM resulta en una estructura que amplifica una señal inmunitaria activadora. En la presente memoria, la proteína de fusión se capta en un endodominio de inmunorreceptor fosfo-ITAM. ZAP7U0 funciona normalmente propagando la señal, aunque además proporciona otro juego de ITAM que resultan fosforilados y captan más ZAP70. Lo anterior puede resultar útil para incrementar la fuerza de la señal y puede incrementar la sensibilidad a antígenos a baja densidad, por ejemplo. La fusión puede incluir solo el dominio SH2 de ZAP70 con un endodominio que contiene ITAm (p.ej., la fusión no contiene un dominio de ZAP70 quinasa). La proporción de dominios catalíticos de ZAP70 (dominios de quinasa) con ITAM puede modificarse para afectar a la cinética de activación en respuesta a la dinámica de las interacciones de receptor activadoras con una diana afín.

Un ITAM es una secuencia conservada de cuatro aminoácidos que se repite dos veces en las colas citoplasmáticas de determinadas proteínas de superficie celular del sistema inmunitario. El motivo contiene una tirosina separada de una leucina o isoleucina por cualesquiera dos otros aminoácidos, proporcionando la firma YxxL/I. Dos de dichas firmas están típicamente separadas por 6 a 8 aminoácidos en la cola de la molécula (YxxL/Ix(6-8)YxxL/I).

Los ITAM resultan importantes para la transducción de señales en las células inmunitarias. Por lo tanto, se encuentran en las colas de importantes moléculas de señalización celular, tales como las cadenas CD3 y Z del complejo de receptores de células T, las cadenas alfa y beta de CD79 del complejo de receptores de células B, y determinados receptores de Fc. Los residuos de tirosina dentro de dichos motivos resultan fosforilados tras la interacción de las moléculas de receptor con sus ligandos y forman sitios de acoplamiento para otras proteínas que participan en las rutas de señalización de la célula.

Es conocido que varias proteínas contienen endodominios con uno o más motivos ITAM. Entre los ejemplos de dichas proteínas se incluyen la cadena epsilón de CD3, la cadena gamma de CD3 y la cadena delta de CD3, entre otras. El motivo ITAM puede reconocerse fácilmente como una tirosina separada de una leucina o isoleucina por cualesquiera otros dos aminoácidos, proporcionando la firma YxxL/I. Típicamente, aunque no siempre, dos de dichos motivos están separados por 6 a 8 aminoácidos en la cola de la molécula (YxxL/Ix(6-8)YxxL/I). Por lo tanto, el experto en la materia puede encontrar fácilmente proteínas existentes que contienen uno o más ITAM para transmitir una señal de activación. Además, dado que el motivo es simple y no resulta necesaria una estructura secundaria compleja, el experto en la materia puede diseñar polipéptidos que contienen ITAM artificiales para transmitir una señal de activación (ver el documento n° WO 2000/063372, que se refiere a moléculas de señalización sintéticas).

El dominio que contiene ITAM puede ser o comprender un endodominio CD3-zeta. Convenientemente, el dominio que contiene ITAm puede comprender la secuencia mostrada en SEC ID n° 13 o una variante de la misma que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% que conserva la capacidad de resultar fosforilada y captar ZAP70.

SEC ID n° 13 (endodominio CD3-zeta)

RVKF S RSADAPAYQQGQNQLYNE LNLGRRE EYDVLDKRRGRDPEMGGKP RRKKPQE GLYHELQKDKMAEA

YSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKliTYDALHKQALFFR

A título de ejemplo, la proteína de fusión puede ser o puede comprender la secuencia mostrada en SEC ID n° 14, que contiene un dominio ZAP70-SH2 fusionado con un endodominio CD3-zeta.

SEC ID n° 14

MRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMA

EAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSMPDPA

AHLPFFYGSISRAEAEEHLKLAGMADGLFLLRQCLRSLGGYVLSLVHDVRFHHFPIERQLNGTYAIAGGK

AHCGPAELCEFYSRDPDGLPCNLRKPCNRPSGLEPQPGVFDCLRDAMVRDYVRQTWKLEGEALEQAIISQ

APQVEKLIATTAHERMPWYHSSLTREEAERKLYSGAQTDGKFLLRPRKEQGTYALSLIYGKTVYHYLISQ

DKAGKYCIPEGTKFDTLWQLVEYLKLKADGLIYCLKEACPNSSASNASGAAAPTLPAHPSTLTHPQRRID

TLNSDGYTPEPARITSPDKPRPMPMDTSVYESPYSDPEELKDKKLFLKRDNLLIADIELGCGNFGSVRQG

VYRMRKKQIDVAIKVLKQGTEKADTEEMMREAQIMHQLDNPYIVRLIGVCQAEALMLVMEMAGGGPLHKF

LVGKREEIPVSNVAELLHQVSMGMKYLEEKNFVHRDLAARNVLLVNRHYAKISDFGLSKALGADDSYYTA

RSAGKWPLKWYAPECINFRKFSSRSDVWSYGVTMWEALSYGQKPYKKMKGPEVMAFIEQGKRMECPPECP

PELYALMSDCWIYKWEDRPDFLTVEQRMRACYYSLASKVEGPPGSTQKAEAACA

Convenientemente, la proteína de fusión puede comprender la secuencia mostrada en SEC ID n° 14 o una variante de la misma que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99%.

DOMINIO QUE CONTIENE ITIM

La proteína de fusión puede comprender un dominio SH2 de PTPN6 y un dominio que contiene dominio de inhibición de inmunorreceptor a base de tirosinas (ITIM).

Una fusión de PTPN6 de longitud completa con un dominio que contiene ITIM resulta en una estructura que amplifica una señal inmunitaria inhibidora. En la presente memoria, la proteína de fusión se capta en un endodominio de inmunorreceptor fosfo-ITIM. PTPN6 funciona normalmente propagando la señal, aunque además proporciona otro juego de ITIM que resultan fosforilados y captan más PTPN6. La fusión puede incluir solo el dominio s H2 de PTPN6 con un endodominio que contiene ITIM (p.ej., la fusión no contiene un dominio de PTPN6 fosfatasa). La proporción de dominios catalíticos de PTPN6 (dominios de fosfatasa) con ITIM puede modificarse para afectar a la cinética de activación en respuesta a la dinámica de las interacciones de receptor inhibidoras con una diana afín.

Un ITIM es una secuencia conservada de aminoácidos (S/I/V/LxYxxI/V/L) que se encuentra en las colas citoplasmáticas de muchos receptores inhibitorios del sistema inmunitario. Tras la interacción de receptores inhibitorios que poseen ITIM con su ligando, su motivo ITIM resulta fosforilado por enzimas de las Src quinasas, permitiendo que capten PTPN6 mediante interacciones entre el dominio SH2 de PTPN6 y los dominios ITIM fosforilados.

Entre los endodominios que contienen ITIM se incluyen los de CD22, LAIR-1, la familia de receptores inhibitorios asesinos (KIR), LILRB1, CTLA4, PD-1, BTLA, por ejemplo.

Los endodominios ITIM de PDCD1, BTLA4, LILRB1, LAIR1, CTLA4, KIR2DL1, KIR2DL4, KIR2DL5, KIR3DL1 y KIR3DL3 se muestran en SEC ID n° 15 a 24, respectivamente.

SEC ID n°15: endodominio PDCD1

CS RA ARGTI CAR RTQQP LKEÜPSAVFVF SVIKf GELDFQWPEKTPEPP VPC VPEQTE YATI VFPSGMGTS£PARRGS ADGF RS AQF L ftF ED GHC & WF L

SEC ID n° 16: BTLA4

KLQRR HKRTQSQQGLQEN SS GQSFFVRN KKVRRAP L S E GP HS LGC YNPMMEDGIS YTT LRFP EWNIF RTG

DAESSEMQRPPPDCDDTVTYSALHKRQVGDYEHVIPDFPEDEGIHYSELI QFGVGERPQAQENVDYVILKH SEC ID n° 17: LILRB1

LRHKRQGKBWTSTGPKADFQHPAQAUGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEEN LYAAVKRTQ?EÜGVEMDTR&P

RDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTEÍDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTL

RREATEPPPSQEGPS p a v p s i y a t l a i r

SEC ID n* 18: LAIR1

HRQNQIKQGPPRSrtDEEQKP QQRP DL A Vl) V LERTADKATVNGLPEKDFETDTSALAAGSSCiFVTYAQLDH HALTORTARAVSPÜ &TKFMAE&IT YAAVARH

SEC ID n° 19: CTLA4

F L LW E Lfc A V£ S G LF F Y5 F LL T A VSLS KML KK R 5 P LT TG V Y VKMPP T EP ECE KQFQP Y F IP IH

SEC ID n" 20: KIR2DL1 GN£RHLHVLIGrSWHPFAILLFFLLHRWCANKKNAWMDQEPAjGMRTVNREDSDEQDPQEVTYTQL.NH CVFTQRKITRP SQFPKTPPCD11VYTELPNAESREKVVSCP

SEC ID n" 21: KIR2DL4

GIARHLHAVI R ¥SVh Z ILFCILRFFLLHRlíC$KKKENAAVMHQEPAGHRTVN]RED$DEQDPQEVTYAQLD HCIFTQWITÍSSQRSKRFSTDTSVCIELPHAEPRALSPAHEHHSQALMGSSRETTALSQTGLaSfíHVPft

AGI SEC ID n“ 22: KIR2DL5

^tG^{ihrh lhili}G^tSvaii^{lfiilf ffl lh}C^gCS^nkkhaavmdQ^epaG^dftvwredS^ddQ^dpQ^evtyaQ^ldHCVFTGTKITSFSQRFKTFFTDT'IMYMELFHAKPRSLaFAHKHHSQALRGSSRETTALSQNRVASSHVFA

AGI SEC ID n° 23: KIR3DL1

KJPRH.LH1LIGTEVVIILFILLLFFLLHLWCSNKKNAAVMDQE PAGMRTAtlSEDSJEQDPEEVTYAQ_DH

CVFTQRKITRP SQRPETPPTDTILYCELPHAKFRSKVVSCP SEC ID n" 24: KIR3DL3

KDPGHSRHL ti VLIGTS'W11PFAILLFFLLHRWCANKKMAVVMDQEPAGNRTVNREDSDEQDPQEVTYAQ

LHHCVFTQRKITRP SQRPKTPPTDTSV

El dominio que contiene ITIM puede ser o puede comprender un endodominio PDCD1, BTLA4, LILRB1, LAIR1, CTLA4, KIR2DL1, KlR2DL4, KIR2d L5, KIR3DL1 o KIR3DL3. Convenientemente, el dominio que contiene ITIM puede comprender la secuencia mostrada en cualquiera de las SEC ID n° 15 a 24 o una variante de las mismas con una identidad de secuencias de por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% que conserva la capacidad de resultar fosforiladas por Src quinasas y amplificar una señal inmunitaria inhibitoria.

A título de ejemplo, la proteína de fusión puede ser o puede comprender la secuencia mostrada en SEC ID n° 25, que contiene un dominio PTPN6-SH2 fusionado con un endodominio PD1.

SEC ID n" 25

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Convenientemente, la proteína de fusión puede comprender la secuencia mostrada en SEC ID n° 25 o una variante de la misma que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99%.

SEÑAL CRUZADA

La presente exposición proporciona una proteína de fusión que comprende: un dominio SH2 de una proteína de unión a iTa M y un dominio de fosfatasa.

La presente exposición proporciona además una proteína de fusión que comprende: un dominio SH2 de una proteína de unión a ITIM y un dominio de quinasa.

Estas moléculas de señalización “amplificadas” amplificarán una señal de excitación o inhibitoria dentro de una célula inmunitaria, tal como una célula T. Al recibir una célula T una señal de excitación, por ejemplo, tras el reconocimiento de un antígeno diana por un RAQ, o péptido de CMH por un RCT, la presencia del primer tipo de molécula cruzada resultará en que la célula interpretará la señal de excitación como una señal inhibitoria.

La amortiguación o revisación de la activación de las células T puede resultar útil en una diversidad de situaciones, por ejemplo puede utilizarse para células T expresantes de RAQ en las que hay un nivel elevado de expresión del antígeno diana sobre la célula diana. Puede utilizarse para evitar la sobreactivación de las células T que puede conducir al agotamiento de las células T y/o a la muerte celular inducida por activación. La prevención de que una célula resulta activada excesivamente o con excesiva rapidez también puede evitar o reducir los efectos secundarios patológicos del tratamiento de RAQ-células T, tal como el síndrome de liberación de citoquinas (SLC).

La situación inversa es que una célula T reciba una señal inhibitoria, por ejemplo, tras la ligación de PD1 y la presencia del segundo tipo de molécula cruzada resulta en que la célula interpreta la señal inhibitoria como una señal de excitación.

La reducción o reversión de la inhibición de las células T ayudará a la célula a superar los estímulos inhibitorios dentro del microambiente tumoral hostil y, por lo tanto, deberían incrementar la persistencia y expansión in vivo de las células T.

La proteína de fusión puede comprender un dominio SH2 de PTPN6 y un dominio de quinasa de ZAP70. La presente proteína de fusión puede comprender un dominio SH2 de ZAP70 fusionado con un dominio de PTPN6 quinasa.

En el caso de que la proteína comprenda un dominio SH2 de ZAP70 fusionado con el dominio de fosfatasa de PTPN6, en el caso de que la célula T reciba una señal de excitación, la interpreta como una señal inhibitoria debido a que el dominio de PTPN6 fosfatasa resulta captado en el ITAM activado mediante el dominio SH2 de ZAP70.

En el caso de que la proteína comprenda un dominio SH2 de PTPN6 fusionado con el dominio de quinasa de ZAP70, en el caso de que la célula T reciba una señal inhibitoria, la interpreta como una señal de excitación debido a que el dominio de ZAP70 quinasa resulta captado en el ITIM activado mediante el dominio de PTPN6. Una fusión entre el dominio SH2 de PTPN6 y dominio de ZAP70 quinasa resultará en la competición para ITIM fosforilados con PTPN6 de tipo salvaje, bloqueando las señales inhibitorias, aunque además transmitirá una señal de activación paradójica. Lo anterior puede presentar una aplicación en la superación de las señales de bloqueo del punto de control en un microambiente tumoral.

Las secuencias de los dominios humanos de ZAP70 quinasa, PTPN6 fosfatasa y SHP-2 fosfatasa se muestran en SEC ID n° 26, n° 27 y n° 28, respectivamente.

SEC ID n° 26 - dominio quinasa de ZAP70

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ASKVEGPPGSTQKAEAACA

SEC ID n° 27 - dominio fosfatasa de PTPN6 FWEEPESlOKQEVKMLHQRLEGQRPEMKGKMRlfimiLPPDHSRVILQGHDSinPGSimWAMYIKlíQLLG

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SEC ID n° 28 - dominio fosfatasa de SHP-2 WBÉPlíIljQQQECKLLYSftJíEGQFtQÉHKÍJKHft'iníHILFFDHTftVVLtíDGDPNEPVSD'Y] NAMII MPEFETECNNSKPKKSYlATQGCLQNTVNDFWfiMVPQEHSftVIVMTTKEVERGKSKCVKYWPDEYALJÍE YGVMRVRNVKES-AAHDYTLRELKLSKVGQALLCfGNTEETVWQYf IFRTWPDHGVFSDI’GGVLDM ,EiBVH

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El dominio de ZAP70 quinasa, el dominio de PTNP6 fosfatasa o el dominio de SHP-2 fosfatasa pueden ser o pueden comprender la secuencia mostrada en SEC ID n° 26, SEC ID n° 27 o SEC ID n° 28, respectivamente, o una variante de las mismas que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% que conserva la capacidad de fosforilar o desfosforilar proteínas corriente abajo de la misma manera que los dominios de quinasa/fosfatasa de tipo salvaje.

Se muestran ejemplos de proteína de fusión que comprende un dominio SH2 de PTPN6 fusionado con un dominio quinasa de ZAP70, un dominio SH2 de ZAP70 fusionado con un dominio quinasa de PTPN6, y un dominio SH2 de Sh P-2 fusionado con un dominio quinasa de ZAP70 en SEC ID n° 29, SEC ID n° 30 y SEC ID n° 61, respectivamente.

SEC ID n° 29 - fusión de dominio SH2 de PTPN6:dominio quinasa de ZAP70

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SEC ID n° 30 - fusión de dominio SH2 de ZAP70:dominio fosfatasa de PTPN6

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SEC ID n° 61 - dominios SH2 duales de SHP-2 fusionados con dominio quinasa de ZAP70

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YSL

La proteína de fusión puede ser o puede comprender la secuencia mostrada en SEC ID n° 29, SEC ID n° 30 o SEC ID n° 61 o una variante de las mismas que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99%.

DOMINIO DE SEÑALIZACIÓN HETERÓLOGO

La presente proteína de fusión puede comprender (i) un dominio SH2 de ZAP70, PTPN6 o SHP-2 e (ii) un dominio de señalización heterólogo.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “dominio de señalización heterólogo” se refiere a un dominio de señalización que no se encuentra presente en la proteína ZAP70, PTPN6 o SHP-2 de tipo salvaje. De esta manera, en donde la proteína de fusión comprende un dominio SH2 de ZAP70, comprende un dominio de señalización que no es el dominio de ZAP70 quinasa. Alternativamente, en el caso de que la proteína de fusión comprende un dominio SH2 de PTPN6, comprende un dominio de señalización que no es el dominio de PTPN6 fosfatasa.

SEÑAL DE DERIVACIÓN

El dominio de señalización heterólogo puede ser de una molécula de señalización que no se activa habitualmente con un receptor que contiene ITAM. En otras palabras, el dominio de señalización heterólogo puede ser de una molécula de señalización que no participa en la propagación de la señal inmunitaria n° 1 tras la unión del antígeno al RCT. La señal inmunitaria n° 1 resulta suficiente para inducir la eliminación de las células T de células diana afines, pero no activa por completo las células T para la proliferación y supervivencia.

La presente exposición proporciona una proteína de fusión que comprende: (i) un dominio SH2 de una proteína que se une a un ITAm , y (ii) un dominio de señalización heterólogo.

Una fusión entre, por ejemplo, ZAP70 y otra molécula de señalización no típicamente activada con un receptor que contiene ITAM puede actuar derivando la señal de una ruta a otra. Un ejemplo es la coestimulación. Una fusión entre ZAP70 y el endodominio de CD28 puede transmitir una señal coestimuladora de CD28, así como una señal activadora de ITAM. De manera similar, una fusión entre ZAP70 y el endodominio 41BB o OX40 puede transmitir una señal coestimuladora de 41BB o OX40. También pueden captarse otras rutas, por ejemplo, una fusión entre ZAP70 y el dominio de AKT quinasa puede resultar en la transmisión de una señal de AKT al fosforilarse ITAM. Entre otros ejemplos puede incluirse el dominio de quinasa de JAK. De esta manera, una célula T puede interpretar una señal simple de reconocimiento de antígeno como transmisora de una señal coestimuladora e incluso de tipo citoquina.

Dichas proteínas de fusión pueden resultar útiles en, por ejemplo, enfoques en los que las estimulaciones ex vivo repetidas de células T pueden resultar en poblaciones que no presentan antígenos de superficie coestimuladores y que presentan una capacidad proliferativa limitada in vivo, dando como resultado una persistencia y eficacia limitadas. La pérdida de antígenos de superficie coestimuladores que conducen a la activación de las células T únicamente a través del RCT se ha asociado a un mayor grado de muerte celular inducida por activación que impactaría negativamente sobre la eficacia y persistencia in vivo. El efecto puede revertirse mediante la activación de 4-1BB y OX40 expresados en superficie, que demuestra que coestimulación puede evitar la muerte celular inducida por activación y puede permitir una mayor expansión de las células T específicas tumorales.

La presente exposición proporciona una proteína de fusión que comprende: (i) un dominio SH2 de una proteína que se une a un ITIM, y (ii) un dominio de señalización heterólogo.

Por ejemplo, puede fusionarse un dominio SH2 de PTPN6 o un dominio SH2 de SHP-2 con un endodominio coestimulador de manera que una célula T interpreta una señal inhibidora como una coestimuladora.

El dominio de señalización heterólogo puede proceder de, por ejemplo, CD28, 41BB o OX40.

CD28 proporciona una potente señal coestimuladora - es decir, una señal inmunitaria 2 que induce la proliferación de las células T. CD28 es el receptor para las proteínas CD80 (B7.1) y CD86 (B7.2).

41BB (CD137) es una glucoproteína transmembranal de tipo 2 perteneciente a la superfamilia de TNF, expresada sobre las células T activadas. El entrecruzamiento de 41BB potencia la proliferación de las células T, la secreción de IL-2, la supervivencia y la actividad citolítica.

OX40 (CD134) es una molécula coestimuladora secundaria, que se expresa 24 a 72 horas después de la activación; su ligando, OX40L, tampoco se expresa sobre las células presentadoras de antígeno en reposo, aunque sí se expresa después de su activación. La expresión de OX40 es dependiente de la activación total de la célula T; sin CD28, se retrasa la expresión de OX40 y los niveles son cuatro veces inferiores. La señalización a través de OX40 resulta necesaria para la supervivencia prolongada de las células T después de la activación y proliferación iniciales.

Los dominios de señalización de CD28, 41BB y OX40 (endodominios) se muestran como SEC ID n° 31, n° 32 y n° 33, respectivamente.

SEC ID n° 31 - endodominio de CD28

MRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS

SEC ID n° 32 - endodominio de 41BB

MKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL

SEC ID n° 33 - endodominio de OX40

MRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI

El dominio de señalización heterólogo puede ser o puede comprender la secuencia mostrada en SEC ID n° 31; SEC ID n° 32 o SEC ID n° 33, respectivamente, o una variante de las mismas que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99%.

El dominio de señalización heterólogo puede ser o puede comprender un dominio de señalización inhibitorio.

Por ejemplo, el dominio de señalización inhibitorio puede comprender el endodominio de CD148 o CD45. CD148 y CD45 se ha demostrado que actúan naturalmente sobre las tirosinas fosforiladas corriente arriba de la señalización de RCT.

CD148 es una proteína tirosina fosfatasa de tipo receptor que regula negativamente la señalización de RCT mediante la interferencia con la fosforilación y la función de PLCy I y LAT.

CD45 presente sobre todas las células hematopoyéticas es una proteína tirosina fosfatasa que es capaz de regular la transducción de señales y las respuestas funcionales, nuevamente mediante fosforilación de PLC y1.

Un dominio de señalización inhibitorio puede comprender la totalidad o parte de una tirosina fosfatasa de tipo receptor. La fosfatasa puede interferir con la fosforilación y/o la función de elementos que participan en la señalización de las células T, tal como PLCy I y/o LAT.

El dominio de señalización inhibitorio puede ser o comprender el endodominio de ICOS, CD27, BTLA, CD30, GITR o HVEM.

El dominio de señalización inhibitorio puede comprender la secuencia mostrada en SEC ID n° 34 a n° 39 o una variante de la misma que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 80%.

SEC ID n° 34 - endodominio de ICOS

CWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL SEC ID n° 35 - endodominio de CD27 QRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP SEC ID n° 36 - endodominio de BTLA

RRHQGKQNELSOTAGREINLVDAHLE£EQTEASTRQHSQVLLSETGIYDHDPDLCFRMQEGSEVYSNPCL

EEMKPG¹VYA£LHHSVIGPMSRLARNVKERPTEYASICVES

SEC ID n° 37 - endodominio de CD30

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SEC ID n° 38 - endodominio de GITR QLGLHIWQLRSQCMWPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLWV SEC ID n° 39 - endodominio de HVEM CVKRRKPRGDVVKVIVSVQRKRQEAEGEATVIEALQAPPDVTTVAVEETIPSFTGRSPNH

Una secuencia de variante puede presentar una identidad de secuencia de por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% respecto a la SEC ID n° 34 a n° 39, con la condición de que la secuencia proporcione un dominio de señalización intracelular eficaz.

Convenientemente, la proteína de fusión puede ser o puede comprender cualquiera de las secuencias mostradas en SEC ID n° 40 a n° 45.

(SEC ^{D n ° 401 - endodommio de 0 )26 fusionado con el extremo amiioterminal de 7AP de lonqftiid completa}

MRSKRSRLLHSDYMWKTPRRPGPTRKHYQPYAPFRDFAAYR5SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHPDPAAH

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LYALMSDCWIYKWEDRPDFLTVEQRMRACYYSLASKVEGPPGSTQKAEAACA

fSEC D n° 411 - endo do mino de 41BB fusionado con extremo ammoterminal de ZAP de lontptud completa WKHGFKKLLYIFKQPFMRPVGTTQEEDGCSCFFPEEEEGGCEL5GGGGSGGGGSGGGGSGGGGfiMPDPAA

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fSEC P n° 421 - endo do minio de 0X 40 fusionado con extremo amáiaterminal de ZAP de lontjtud completa

MRDQFIíPPDAHKFPGGGSFFTPIQEEQADAHSTLAKISGGGGSGGGG5GGGGSGGGGSMPEÍPAAHLPFFY

CSI£RAEAEEHLKLAGríADGLFLLRQCLRSLÜCYVl,£LVHEVRFHHFPIERQLKÜTYAIAGGKAHCGFAE

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IATTAHERMPKYH£5LTREEAEFK1Y$G*Q"DÜKFLLRFRKEQGTYAlSLIYGEÍTVYHYLISQDKAGKYC

IPEGTKFDTLHOLVEYLKLKADGLIYCLKEñCFHSSAfiMASGAAAFTIJAHPSTLTE1PQRHIDTLNSDGY

TPEPAHITSPDKPRPMPMDTSVYE£FYSDPEE1JÍDKKLFLKRDNLLIAD1ELGCGNFGSVRQGVYRMRKK

QlL>VA!1KVLKQGTEKADTEEKMREAQ1HHQLJWFY1 VRLilGVCQAEALMLVKEMACGGFLHKFLVGKKíE

IPVSNVAELLEQVSFlGlíKYL.EEKNFVHRDLAARÍÍVLLVHRRYAKI3DFGL£KALGADDSYYTARSAGKNP LKWYAPECiRFRKFSSRSDVMSYGVrnWEALSYGQRPYKKMRGPEVMAF1eqgkrkecffecfpelyalm sdcwiykwedrpdflíveorkRacyyslaskvegppG3tqkaeaaca

fSEC ID m° 431 - endodomnio de CD28 fusionado can extremo aminatemirial de dominio SH2 de PTPNG

MRSKRSRLLH£DYMNMTFRRPGPTRKHYQPYAPPPDFAAYRSSGGG6SGGGGSGGGGSGGGGSMVRWFKR

DLSGLDAETLIXGRGVHGSFLARPSRKíIQGDFSLS1VRVGDQVTHIRIQNSÜDFYDLYGGEKFATLTELVE

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fSEC D n ° 441 - e ndo do minio de 41 BB fusionado con extremo a man oterminal de dominio SH2 de PTPNG MKAGRKKLLYIe’KQPE’MRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSMVRtfFH

RDLSGLDAETLLKGlRGVEGSFLARPSRKHQGDFSLSVF¡VGDQVTHIRIQNSGDFYDLYGGEKFATLTELV

EYYTQGQGVLQDRDGT11HLK3CP1NCSDPTSERWYF1GIB1SGGQAETLIiQftKGEPWTFLVRESLSQFGDFV

_{LSVLSDQPRAGPGSPLRVTHIKVMCEGGRYTVGGLETFDSLrDLVEHFKKTGIEEA3GAFVYUlQPY}

fSEC P n° 451 - endo do minio de 0X 40 fusionado con extremo amáiaterminal de dominio SH2 de PTPNG

MRDQRUPDAHKFF GGGSFRTP1QEEGADARSTLAK1SGGGGSSGGGSGGGÜSGGGGSMVRKFBRDLSGL

DAETLLKGRGVHGSFLARF5RKNQGDFSLSVRVGDQVTFjIRIQNSGEFYDLYGGEKFATLTELVEYYTQQ

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GPKAGFGSFLKVTHIKVMCEGGRYTVGGEE'IFPSLTDLVERFKKTGIEEASGlAFVYLRQPY

Convenientemente, la proteína de fusión puede comprender la secuencia mostrada en cualquiera de SEC ID n° 40 a n° 45 o una variante de las mismas que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99%.

DOMINIO DE QUINASA

El dominio de señalización heterólogo puede ser un dominio de quinasa. Por ejemplo, el dominio de señalización heterólogo puede comprender un dominio de quinasa AKT o un dominio de quinasa JAK.

Akt, también conocida como proteína quinasa B (PKB), es una proteína quinasa específica de serina/treonina que desempeña un papel clave en múltiples procesos celulares, tales como el metabolismo de la glucosa, la apoptosis, la proliferación celular, la transcripción y la migración celular.

Tras la activación de los RCT, las células T secretan IL2, que promueve la supervivencia y la proliferación. Sin embargo, dicha secreción es transitoria y las células T que resultan activadas y expandidas in vitro se vuelven dependientes de IL2 exógeno para la supervivencia. Mediante el incremento de la fosforilación por AKT tras la fosforilación de ITAM asociada a la activación de RCT o RAQ, puede reducirse o eliminarse la dependencia de las células T activadas respecto de IL2 exógeno y potenciarse su proliferación y supervivencia.

El dominio de quinasa Akt se muestra en SEC ID n° 46.

SEO ID n° 46 - dominio de quinasa Akt

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IVWQHVYEKKLSP PFK PQVTSETDTRYFDE EFTAQMITITPPDQDD5MECVD SERRPKFTQFSYSASGTA

El dominio de señalización heterólogo puede ser o puede comprender la secuencia mostrada en SEC ID n° 46, o una variante de la misma que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99%, con la condición de que la secuencia proporcione un dominio de quinasa eficaz.

A título de ejemplo, la proteína de fusión puede ser o puede comprender cualquiera de las secuencias mostradas en SEC ID n° 47 a n° 49 y n° 62 que contienen un dominio ZAP70-SH2 fusionado directamente con un dominio de quinasa Akt, un dominio ZAP70-SH2 fusionado con un dominio de quinasa Akt mediante un conector, un ZAP70 mutado para ser no funcional y fusionado con un dominio de quinasa Akt y un dominio dual SHP-2 SH2 fusionado con un dominio de quinasa Akt, respectivamente.

SEC ID n° 47 - dominio ZAP70-SH2 fusionado directametne con un dominio de quinasa Akt MPDFAAHLPFFYGS15 RAEAEEHUCLAGMADGLFLLRQCLRSLGGYVLSLVHDVRFHHFPIERQLNGTYA IRGGKAíiCGPAELCEFYSRDPDGIiPCNiatKPCNRPSGLEPQPGVFDCLRDAMVRDYVRQTWKlEGEAIiEQ A11SQAPCVSKLIATTAELERMPWYilSSLPREEAERKLYSGAQTDGKFLLRPRKEQGTYALSLIYGKTVYJi YLISQPKAGKYCIFEGXKE’DTLHQLVEYLKLKADGLIYCLKEñCFNSSASNñSGAAAFTlíftHPSTLTHF AEEMEV5IAKFK EIRVTHNEETYLKLLGKGXFGKVILVKEKATGRYYAMKILKKEVIVAKDEVAHTLTEWR

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SEC ID n° 48 - dominio ZAP70-SH2 fusionado con un dominio de quinasa Akt mediante un conector MFDPAAtiLF?FYGS3£RAEASEHLKLAÜMADGLFLLRQCLASlGGYVLSLVtiDVRFHHFPIERQLtiGTYA

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SEC ID n° 49 - ZAP70 mutado para ser no funcional y fusionado con un dominio de quinasa Akt MRDFAA HLF7FYG£ISRAEAEEHLKLAGMADGLFLLRQCLRSLGGYVL3LVHDVRFHHFFIERGLNúTYA rñúúKAtiCG?AELCEFYSRD?DÚLFCHLRKPCNRP3CLEPÜPúVFDCLRDAMVRDYVRCTWKLEGE.ALZQ AI3SQAPQVEKlIATTAHERMRtfSHSSLTREÉAERKLYSGftQTDGKFLLKPRKEQGrYALSLIYGKTVYH YLISQDKAGKYCI?EG PKFDTLWQLVEYLKLKADGLIYCLKEACPWSSASHASGAAAPTLFALLPSTLTHP AEEMEVSLAKPK KRVTMNEFEYLKLLGKGTFGKVILVKEKATGRYYAMKILKKEVIVAKDEVAHTLTENR VI.QNSRtiPFLTALKYSFQTHDRLCFVMEYANGGELFFHLSRERWSEDRARFYGAEIVSALDYLKSEENV

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SEC ID n° 62 - dominio SH2 de SHP-2 dual fusionado con un dominio de quinasa Akt

WFHPNITGVEAENLLLTRGVDGSFLAFPSKSNPGDFILSVFRNGAVTHIKICNTGDYYDLYGGEKFATLA

ELVQYYMEE1KGQLKEKNGDVIELKYFLNCADPTSERNFKGHLSGKEAEKLLTSKGEÍ tiG 3FLVRESQSKPG DFVLSVRTGDDKGESMDGKSKVTHVMIRCQELKYDVGGGERFDSLTDLVEHYKKNPtWETLGTVLQLKQP LNTTRINAEEMEV5LAKPKHRVTMNEFEYLKLLGKGTFGKVILVKEKATGFtYYAMEÍILKKEVIVAROEVA RTLTENRVLQfíSRHPFLTALKYSFQTBDRLCFVMEYANGGELFFHLSRERVFSEDRARFYGAEIVSALDY

LH 5EKNWYRDLKLENLMLDKDGHIKITDFGLCEÍEGIKDGATMKTFCGTPEYLAPEVLEDNDYGPAVDWH

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QHRFFAGIVWQHVYEKKLSFPFKFQVT⁵ETDTRYFDEEFTAQMITITFPDQDDSMECVDSEPRPHFFQF ^S

YSASGTA

La proteína de fusión puede comprender la secuencia mostrada en cualquiera de SEC ID n° 47 a n° 49 o n° 62, o una variante de las mismas que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99%.

La quinasa Janus (JAK) es una familia de tirosina quinasas no receptoras intracelulares que transducen las señales mediadas por citoquinas mediante la ruta JAK-STAT. Los cuatro elementos de la familia de JAK son: quinasa Janus 1 (JAK1), quinasa Janus 2 (JAK2), quinasa Janus 3 (JAK3) y tirosina quinasa 2 (TYK2).

SEC ID n° SO - dominio que contiene quinasa de JAK2

RNE□LIFNESLGQGIFIRIFKGVPREVCDYGQLRETEVLLKVLDKABRNYSESFFEAASUMEKLSHRHLV

LNYGVCVCGDENILVQEFVKFG5LDTYLEÍKHKNCINILWKLEVAKQLAWAMHFLEENTLIKGNVCAKNIL

LI REEDRKTGNPPFIKLEDPGl ⁵¹TVLPKDILQERIPWVPPECIENPKNLNLATDKVÍSFGTTLWEICSGG

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IMTECWNNNVNQRPSFRDLALRVDQIRDNM

DOMINIO DE PROTEASA

La presente exposición proporciona además una proteína de fusión que comprende: (i) un dominio SH2 de una proteína que se une a un It A m o una proteína que contiene ITIM y (ii) un dominio de proteasa.

El dominio de proteasa puede ser cualquier proteasa que es capaz de cortar en una secuencia de reconocimiento específica. De esta manera, el dominio de proteasa puede ser cualquier proteasa que permita la separación de un único polipéptido en dos polipéptidos diferentes mediante corte en una secuencia diana específica.

El dominio de proteasa puede ser un dominio de proteasa del virus del grabado del tabaco (TeV, por sus siglas en inglés).

La proteasa del TeV es una cisteína proteasa altamente específica de secuencia que es una proteasa de tipo quimiotripsina. Es muy específica para su sitio diana de corte y, por lo tanto, se utiliza frecuentemente para el corte controlado de proteínas de fusión tanto in vitro como in vivo. El sitio de corte de TeV de consenso es ENLYFQ\S (donde ‘V denota el enlace peptídico cortado). Las células de mamífero, tales como las células humanas, no expresan la proteasa de TeV endógenamente.

De acuerdo con lo anterior, el sitio de reconocimiento de corte de TeV se muestra en SEC ID n° 51.

SEC ID n° 51 - sitio de corte de TeV

ENLYFQS

El dominio de proteasa de TeV se muestra en SEC ID n° 52.

SEC ID n” 52

SLFÉíGPRDYNPlSSTlCHLTNESDGH ¹'TSLYGIGfGPF¹¹TMKHLFRRNMGTLLVQS^lhGVFKVKNTTTL QQHLIDGRDM111RKPKDF?FFFQKLKFREFQREERICLVTTNFQTKSMSSMVSDTSCrFPS$DGIFtiKH

WIQ-TEDGQCGSPLVSTRDGFIVG1HSASNFTNTNNYFTSVPFNFMELLTNQEAQQWV⁵GWRLNADSVLWG

GHKVFMSKPEEPFQPVKEATQLMNELVYSQ

De acuerdo con lo anterior, el dominio de proteasa puede ser o puede comprender la secuencia mostrada en SEC ID n° 52, o una variante de la misma que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99%, con la condición de que la secuencia proporcione una función de proteasa eficaz.

A título de ejemplo, la proteína de fusión puede ser o puede comprender la secuencia mostrada en SEC ID n° 53 o n° 54, que contiene un dominio ZAP70-SH2 fusionado con una secuencia de proteasa de TeV o un dominio PTPN6-SH2 fusionado con una secuencia de proteasa de TeV, respectivamente.

SEC ID n° 53

MPDFAAHLFFFYGSI5RAEAEEHLKLAJGMADGLFLLRQCLFSLGGYVLSLVHDVRFHHFPIERQLNGTYA

IAGGKAHCGPAELCEFYSRDPDGLPCNLEKFCNRPSGLEPQPGVJDCLHDAMVRDTÍVRQTWKIEGEALEQ

AIISQAPQVEKLIATTAHERMPWYHSSLT'FEEAERKLYBGAQTDGFFLLRPRKEQGTYALEEIYGKTVYH

YLISQDKAGKYCIFEGTKFDTLWQLVEYLKLKADGLIYCLKEACFHSSASHASGAAAFTLFAflPSTLTHF

SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS8LFKGPRDYHPISSTICHLrNESDGHTTSLTGIGFGPF11TWF¡fLFRFN

NGTLLVQSLHGVFKVKNTTTLQCHLIDGRDMI11HMPKDFPPFPQKLKFREPQREERICLVTTNFQTKSM

S3MVSDTSCTFPS3DGIFHKHWIQTKDGQCGSPLVSTRDGFIVG1HSASKFTWTHNYFTSVPKNFMELLT

NQEAQQWVSGHRIMMSVLWGGHKVFMSKP-EEFFQPVKEATQLMNELVYSQ

SEC ID n° 54

MVRWFHRDLSGIDAETLLKGRGVHGSFLARPSRKHOGDFSL£VRVGDQVTHIRIQNSGDFYDLYGGEKFA

TLTELVEYYTQQQGVLfflDRDGT11ÜLKYPLHC3DPTSERHYHGHMSGGQAETLLQAKGEPMTFLVRE3LS _{QPGDFVLSVL$DQPKAGPGSPL.AVTHIKVMCEGGRYTVGGLETPDSLTDLVEHFKKrGIEEASGAFVYLR}

QPYTSGGGGSSL7FGFRDYNPISSTICHLINESDGHTTaLYGIGFGPF11TNKHIFItltNTíGTLLVQSLHG WKVKHTTIT.QDEJLIDGPDMIiíRMPKDFPPFFÚTtTjKFREPQREERICJ..VTTHFQTKSMSSHVSDT5CIF

PSSDGIFWKHUIQTKD3QCGSPLVSTRTGFIVG1HSA5NFTNTNNYFTSVFKNFMELLTNQEAQQWVSGH

RLHADSVLWGGHKVFMSFPEEPFQPVKEATQLMNELVYSQ

La proteína de fusión puede comprender la secuencia mostrada en SEC ID n° 53 o n° 54, o una variante de las mismas que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99%.

El dominio SH2 y el dominio heterólogo de la proteína de fusión pueden estar separados por un conector a fin de separar espacialmente el dominio SH2 y el dominio heterólogo.

SEÑAL TRANSCRIPCIONAL

Una proteína de fusión que comprende una proteasa, tal como se indica en la sección anterior, puede coexpresarse en una célula con una proteína anclada a membrana que presenta un sitio de corte de proteasa. El corte de la proteína anclada a membrana en el sitio de proteasa liberará la parte distal a la membrana de la proteína.

La proteína anclada a membrana puede ser, por ejemplo, un factor de transcripción anclado a membrana. Al producirse el corte, el transcrito resulta liberado de su anclaje y es libre de transitar hasta el núcleo.

Una fusión entre el dominio SH2 de ZAP70 o el dominio SH2 de PTPN6 y un dominio de proteasa resultará en la captación proximal a membrana de la proteasa después de la fosforilación de ITAM o ITIM, respectivamente.

La fosforilación de los dominios ITAM o ITIM resulta en la captación de SH2 de ZAP70 o SH2 de PTPN6 fusionado con el dominio de proteasa, respectivamente, en la zona proximal a membrana. Lo anterior resulta en que el factor de transcripción es cortado de su anclaje y transferido al núcleo. Lo anterior puede presentar muchas aplicaciones: por ejemplo, con la activación, la célula T puede programarse para expresar factores de transcripción que actúan evitando la diferenciación de la célula T. Por ejemplo, con la activación, la célula T puede programarse para expresar una citoquina, tal como IL2, IL7 o IL15, que puede actuar para estimular la proliferación y la supervivencia de la célula T, o IL12 que puede convertir un microambiente tumoral hostil en uno que favorece el rechazo inmunitario de un tumor.

En particular, se proporciona una célula que coexpresa:

(i) una proteína de fusión que comprende un dominio SH2 de una proteína que se une a un ITAM fosforilado, y (ii) un factor de transcripción anclado a membrana,

en la que el factor de transcripción, al ser liberado del anclaje a membrana, incrementa la expresión de IL2, IL7 y/o IL15 en la célula.

Se proporciona además una célula que coexpresa:

(i) una proteína de fusión que comprende un dominio SH2 de una proteína que se une a un ITIM fosforilado, y (ii) un factor de transcripción anclado a membrana,

en la que el factor de transcripción, al ser liberado del anclaje a membrana, incrementa la expresión de IL2 en la célula.

Sitio de reconocimiento de proteasa

El sitio de reconocimiento de reconocimiento de proteasa puede ser cualquier secuencia de aminoácidos que permita que el dominio de proteasa de la proteína de fusión corte específicamente el factor de transcripción anclado a membrana entre el anclaje de membrana y el factor de transcripción. Por ejemplo, en una realización, el dominio de proteasa es un dominio de proteasa de TeV y sitio de reconocimiento de proteasa es un sitio de reconocimiento de proteasa de TeV.

Anclaje de membrana

El anclaje de membrana puede ser cualquier secuencia, señal o dominio que sea capaz de localizar el factor de transcripción y el sitio de reconocimiento de proteasa proximal a una membrana. Por ejemplo, el anclaje de membrana puede ser una señal de miristilación o un dominio transmembranal.

Convenientemente, un dominio transmembranal puede ser cualquier estructura proteica que sea termodinámicamente estable en una membrana. Lo anterior es típicamente una hélice alfa que comprende varios residuos hidrofóbicos. El dominio transmembranal de cualquier proteína transmembrana puede utilizarse para suministrar la parte transmembranal. La presencia y envergadura de un dominio transmembranal de una proteína puede ser determinado por el experto en la materia utilizando el algoritmo TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/). Además, dado que el dominio transmembranal de una proteína es una estructura relativamente simple, es decir, una secuencia polipeptídica que se predice que forma una hélice alfa hidrofóbica de longitud suficiente para atravesar toda la membrana, también puede utilizarse un dominio TM de diseño artificial (el documento n° US 7052906 B1 describe componentes transmembranales sintéticos).

El dominio transmembranal puede derivarse de CD28, que proporciona una buena estabilidad.

Factor de transcripción

El factor de transcripción puede ser cualquier factor de transcripción seleccionado para estimular una respuesta deseada después de la fosforilación de los motivos ITAM o ITIM relevantes.

El factor de transcripción puede ser natural o artificial. Los factores de transcripción artificiales pueden derivarse de, por ejemplo, TALEN, ensamblajes de dedos de cinc o CrispR/CAS9, coexpresándose este último con un ARNm guía.

Preferentemente, el factor de transcripción contendrá una señal de localización nuclear para ayudar a su transporte hasta la nucleasa después del corte por el dominio de proteasa.

A título de ejemplo, la secuencia de ácido nucleico (ii) (que codifica una proteína que comprende un factor de transcripción anclado a membrana que comprende: (I) un anclaje a membrana, (ii) un sitio de reconocimiento de proteasa, y (iii) un factor de transcripción) puede codificar una proteína que consiste en, o que comprende, la secuencia mostrada en SEC ID n° 55, que contiene un dominio RQR8, un dominio transmembranal CD4-Endotox1, un sitio de reconocimiento de proteasa de TeV y un factor de transcripción VP16-GAL4.

SEC ID n" 55

MGTSLLCWMALCLLGADHADACPYSNPSLCSGGGGSELPTQGTFSNVSTNVSPAKPTTTACPYSNPSLCS

GGGGSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDMALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFC

VRCRHRRRQAERMAQIKRWSEKKTAQAPHRFQKTCSPISGGGGSENLYFQMPKKKRKVAPPTDVSLGDE

LHLDGEDVAMAHADALDDFDLDMLGDGDSPGPGFTPHDSAPYGALDMADFEFEQMFTDALGIDEYGGSGG

GSMQILVASDATMKLLSSIEQACDICRLKKLKCSKEKPKCAKCLKNNWECRYSPKTKRSPLTRAHLTEVE

SRLERLEQLFLLIFPREDLDMILKMDSLQDIKALLTGLFVQDNVNKDAVTDRLASVETDMPLTLRQHRIS

ATSSSE£5SNKGQRQLTV

Convenientemente, la proteína puede comprender la secuencia mostrada en SEC ID n° 55 o una variante de la misma que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99%.

RECEPTOR

La presente exposición proporciona además un constructo de ácidos nucleicos que comprende: (a) una secuencia de ácido nucleico codificante de una proteína de fusión según el primer aspecto adicional de la presente exposición que comprende un dominio SH2 de PTPN6 o una proteína truncada según el tercer aspecto adicional de la presente exposición, y (b) una secuencia de ácido nucleico codificante de un receptor que comprende un endodominio que contiene ITIM.

SEÑAL DE CASTRACIÓN

Una proteína de fusión que comprende una proteasa, tal como se ha indicado anteriormente, puede coexpresarse en una célula con un receptor diana que comprende un sitio intracelular de corte de proteasa. El corte del receptor diana en el sitio de proteasa liberará una parte intracelular distal respecto a la membrana del receptor diana.

El receptor diana puede ser, por ejemplo, un receptor de células T (RCT) o un receptor de antígeno quimérico (RAQ).

El receptor puede comprender un endodominio activador o coestimulador situado en el extremo de la parte intracelular de la proteína. El corte en el sitio de corte de proteasa a continuación elimina el endodominio activador o coestimulador del RAQ diana, reduciendo o bloqueando la activación de las células T mediada por el receptor diana.

Alternativamente, el receptor diana puede comprender un endodominio inhibitorio situado en el extremo de la parte intracelular de la proteína. El corte en el sitio de corte de proteasa a continuación elimina el endodominio inhibitorio del RAQ diana, “activando” el potencial de activación de las células T mediado por el receptor diana.

El endodominio inhibitorio puede comprender, por ejemplo, un endodominio CD148 o CD45 o un endodominio que contiene ITIM de una proteína, tal como PD1, PDCD1, BTLA4, LILRB1, LAIR1, CTLA4, KIR2DL1, KIR2DL4, KIR2DL5, KIR3DL1 o KIR3DL3.

A título de ejemplo, el receptor diana puede comprender la secuencia mostrada en SEC ID n° 56, que contiene un RAQ contra CD33 que contiene un endodominio iTlM de PD-1.

SEC ID n" 56

MAVPTQVIGLLLLWLTDARCDIQMTQSPSSL5ASTCDRVTITCMSEDIYFNLVWYQQKFGKAFKLLIYD

TNRLADGVPSRFSGSGSGTQYTLTISSLQPEDFATYYCQHYKNYPLTFGQGTKLEIKASGGGGSGGGGSG

GGG5GGGG5R5EVQLVE5GGGLVQPGG5LRLSCAASGFTLSNYGMHWIRQAPGKGLEWVSSISLNGGSTY

YRD5VKGRFTISRDNAKSTLYLQMN5LRAEDTAVYYCAAQDAYTGGYFDYWGQGTLVTVSSMDFATTTKF

VLRTPSPVHPTGTSQPÜRfEDCRPRGSVXGTGLDFACOIYVGWGGLLGSLVLLVWVLAVíCSRMRGTI

GARRTGQPLKEDPEAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFP5GMGT5SPARRG5ADG

PRSAQPLRPEDGHCSWPL

Convenientemente, la proteína puede comprender la secuencia mostrada en SEC ID n° 56 o una variante de la misma que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99%.

En donde el receptor comprende un sitio de corte de proteasa entre un dominio transmembranal y un endodominio activador, la proteína de fusión de señal de castración puede utilizarse para inhibir el receptor. Por ejemplo, podría construirse un primer RAQ en el que su endodominio se encuentre separado del dominio transmembranal por un sitio de corte de proteasa. Un segundo RAQ que reconozca un antígeno diferente podría comprender un endodominio que contiene ITIM. El reconocimiento del antígeno afín del segundo receptor resultaría en la captación de la proteína de fusión de señal de castración en la membrana y el posterior corte en el sitio de reconocimiento de proteasa. Dicho corte separaría el endodominio activador respecto del primer receptor y evitaría la activación y propagación de la señal a partir de dicho receptor.

Lo anterior resultaría en una puerta lógica de tipo “Y/NO”, en la que se transmitiría una señal sostenida únicamente en el caso de que el primer RAQ resulte activado aisladamente (es decir, en el caso de que el primer RAQ se una a su antígeno afín pero el segundo RAQ no se une a su antígeno afín). Dichas 'puertas lógicas' pueden resultar útiles, por ejemplo, debido a que es relativamente raro que la presencia (o ausencia) de un único antígeno describa eficazmente un cáncer, lo que puede conducir a una falta de especificidad. La utilización como diana de la expresión de antígenos sobre las células normales conduce a toxicidad en la diana, fuera del tumor. En algunos cánceres, un tumor se define mejor a partir de la presencia de un antígeno (típicamente un antígeno específico de tejido) y la ausencia de otro antígeno que sí se encuentra presente sobre células normales. Por ejemplo, las células de leucemia mieloide aguda (LMA) expresan CD33. Las células madre normales expresan CD33, aunque expresan además CD34, mientras que las células de LMA son típicamente negativas para CD34. La utilización como diana de CD33 solo para tratar la l Ma se asocia a toxicidad significativa, ya que reduce el número de células madre normales. Sin embargo, la utilización como diana específica de células positivas para CD33, pero no positivas para CD34 evitaría dicha considerable toxicidad fuera de diana.

En la Tabla 2 se muestran potenciales parejas de antígenos para dicha puerta 'Y/NO'.

TABLA 2

A título de ejemplo, el receptor que comprende un sitio de corte de proteasa entre un dominio transmembranal y un endodominio activador puede ser la secuencia mostrada en SEC ID n° 57, que contiene un RAQ contra CD19 con un endodominio CD3-zeta escindible.

SEC ID n"57

MSLPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNVÍYQQKPDGTVKLLIY

HTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEirKAGGGGSGGGGS

GGGGSGGGG5EVKLQESGPGLVAESQSLSVICTVSGVSLPDYGVSWIRQPFRKGLEWLGVIWGSETTYYN

SALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMMSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDPTTTPAPRP

PTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIFWVLWVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRCRHR

RRQAERMAQIKRWSEKKTAQAPHRFQKTCSPISGGGGSENLYFQMRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNE

LNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGL

STATKDTYDALHMQALPP?;

Convenientemente, el receptor puede comprender la secuencia mostrada en SEC ID n° 57 o una variante de la misma que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99%.

En el caso de que el receptor comprenda un endodominio activador fusionado con un endodominio inhibitorio mediante un sitio de corte de proteasa, puede utilizarse una proteína de fusión de señal de castración para activar los dominios de señalización artificiales. Por ejemplo, podría construirse un primer RAQ en el que su endodominio comprende un endodominio activador fusionado con un dominio inhibitorio mediante un sitio de corte de proteasa. Un segundo RAQ que reconozca un antígeno diferente podría comprender un endodominio que contiene ITIM. El reconocimiento del antígeno afín del segundo receptor resultaría en la captación de la proteína de fusión de señal de castración en la membrana y el posterior corte del endodominio inhibidor respecto del endodominio activador del primer receptor. El corte, y de esta manera la separación, del dominio inhibitorio respecto del dominio activador permitiría la activación del primer RAQ tras la unión de antígeno y, por lo tanto, la activación de la señalización mediante el primer receptor.

Lo anterior resultaría en una puerta lógica de tipo “Y” en la que la señalización productiva sólo se produciría en el caso de activación de tanto el primer como el segundo receptor. Dichas 'puertas lógicas' resultan útiles, por ejemplo, debido a que la mayoría de cánceres no pueden diferenciarse de los tejidos normales a partir de un único antígeno. Por lo tanto, se produce considerable toxicidad “en la diana fuera del tumor”, en la que tejidos normales resultan dañados por la terapia. Para algunos cánceres, la utilización como diana de la presencia de dos antígenos del cáncer puede resultar más selectiva y, por lo tanto, más eficaz que utilizar como diana uno solo. Por ejemplo, la leucemia linfocítica crónica de células B (lLC-B) es una leucemia común que actualmente se trata utilizando como diana CD19. Lo anterior trata el linfoma, aunque también agota todo el comportamiento de células B de manera que el tratamiento presenta un considerable efecto tóxico. La LLC-B presenta un fenotipo inusual en el aspecto de que se coexpresan CD5 y CD19. Mediante la utilización como diana de sólo las células que expresan CD5 y CD19, resultaría posible reducir considerablemente la toxicidad en la diana fuera del tumor.

En la Tabla 3 se muestran potenciales parejas de antígenos para dicha puerta lógica 'Y'.

Tabla 3

A título de ejemplo, el receptor que comprende un endodominio activador fusionado con un dominio inhibitorio mediante un sitio de corte de proteasa puede ser la secuencia mostrada en SEC ID n° 58, que contiene un RAQ contra CD19 con un endodominio CD3-zeta y un endodominio de CD148 escindible.

SEC ID n" 58

MSLPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIY

htsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqcgntlpytfgggtkleitkaggggsggggs

GGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYN

SALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDPTTTPAPRP

PTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIFWVLWVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRRVKF

SRSADAPAYQQGQNQLYHELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEI

GMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRENLYFQMAVFGCIFGALVIVTVGGFIFWRKKR

KDAKNHEVSFSQIKPKKSKLIRVENFEAYFKKQQADSNCGFAEEYEDLKLVGISQPKYAAELAENRGKNR

YNNVLPYDISRVKLSVQTHSTDDYINANYMPGYHSKKDFIATQGPLPNTLKDFWRMVWEKNVYAIIMLTK

CVEQGRTKCEEYWPSKQAQDYGDITVAMTSEIVLPEWTIRDFTVKNIQTSESHPLRQFHFTSWPDHGVPD

TTDLLINFRYLVRDYMKQSPPESPILVHCSAGVGRTGTFIAIDRLIYQIENENTVDVYGIVYDLRMHRPL

MVQTEDQYVFLNQCVLDIVRSQKDSKVDLIYQNTTAMTIYENLAPVTTFGKTNGYIA

Convenientemente, el receptor puede comprender la secuencia mostrada en SEC ID n° 58 o una variante de la misma que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99%.

SEÑAL DE BLOQUEO

La presente exposición proporciona una proteína truncada que comprende un dominio SH2 de una proteína que se une a un motivo de activación de inmunorreceptor basado en tirosinas (ITAM) fosforilado pero que no presenta un dominio de quinasa.

Por ejemplo, la proteína truncada puede comprender el dominio SH2 de ZAP70 pero no presentar el dominio de quinasa de ZAP70. En otras palabras, la presente exposición proporciona una proteína truncada que: (i) comprende la secuencia mostrada en SEC ID n° 2, pero no comprende la secuencia mostrada en SEC ID n° 26.

La sobreexpresión del dominio SH2 de ZAP70 resulta en la competición con ZAP70 de longitud completa/de tipo salvaje. Debido a que ZAP70 truncado no puede propagar señales, se reduce la transmisión de la señal en proporción a la relación entre ZAP70 de tipo salvaje y la proteína truncada. Lo anterior puede resultar útil para reducir la fuerza de la activación de las células T, por ejemplo para evitar la sobreactivación de las células T que puede resultar en el agotamiento de las células T, la muerte celular inducida por activación y, en un contexto clínico, puede resultar en tormentas de citoquinas.

Una proteína truncada de la invención comprende un dominio SH2 de una proteína que se une a un motivo de inhibición de inmunorreceptor basado en tirosinas (ITIM) fosforilado pero que no presenta un dominio de fosfatasa. Por ejemplo, la proteína truncada puede comprender el dominio s H2 de PTPN6 pero no presentar el dominio de PTPN6 fosfatasa. En otras palabras, una proteína truncada de la invención puede comprender la secuencia mostrada en SEC ID n° 6, pero no comprende la secuencia mostrada en SEC ID n° 27.

En dicho caso, la señalización de ITIM puede estar reducida en proporción a la relación entre PTPN6 de tipo salvaje y la proteína truncada. Lo anterior puede resultar útil para reducir las señales inhibitorias, tales como la señalización de PD1. Lo anterior puede presentar aplicación en el caso de que las células T presenten como diana un tumor que sobreexpresa PDL1 (o receptores inhibitorios similares) para evadir el rechazo inmunitario.

La utilización de una señal de bloqueo o una señal cruzada tal como se ha indicado anteriormente, ofrece una ventaja significativa respecto a los enfoques de bloqueo de punto de control inmunitario tradicionales, que típicamente bloquean la interacción de un único ligando/receptor, tal como PD-L1/PD1, con un anticuerpo. Tal como se ha explicado anteriormente, la clase de receptores inmunitarios inhibitorios contiene muchos elementos con redundancias y patrones de expresión que fluctúan con el estado de las células T. La utilización de un anticuerpo o un ligando/receptor recombinante puede bloquear eficazmente un receptor inhibitorio, aunque no afectará a las señales inhibitorias transmitidas desde el resto. La edición genómica de receptores inhibitorios individuales (Menger et al., Cancer Res. 76(8):2087-93, 15 de abril de 2016) presenta limitaciones similares. Las estrategias de fusiones entre receptores inhibitorios individuales y dominios coestimuladores también adolece de limitaciones similares (Liu et al., Cancer Res. 76(6):1578-90, 15 de marzo de 2016).

El método de la presente exposición bloqueará (y, dependiendo de la estrategia, reinterpretará) señales inhibitorias transmitidas mediante un ITIM. Por lo tanto, una clase entera de señales inhibitorias resulta modulada. Se proporciona una lista de receptores inhibitorios que señalizan a través de los ITIM en la Tabla II de Odorizzi y Wherry, J. Immunol.

188:2957-2965, 2012. Entre ellos se incluyen: PD1, BTLA, 2B4, CTLA-4, GP49B, Lair-1, Pir-B, PECAM-1, CD22, Siglec 7, Siglec 9, KLRG1, ILT2, CD94-NKG2A y CD5.

ÁCIDO NUCLEICO

En un aspecto, la presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica una proteína truncada según la presente invención.

Tal como se utilizan en la presente memoria, los términos “polinucleótido”, “nucleótido” y “ácido nucleico” pretenden ser sinónimos entre sí.

El experto en la materia entenderá que numerosos polinucleótidos y ácidos nucleicos diferentes pueden codificar el mismo polipéptido como consecuencia de la degeneración del código genético. Además, debe entenderse que el experto en la materia puede, utilizando técnicas rutinarias, realizar sustituciones de nucleótidos que no afectan a la secuencia polipeptídica codificada por los polinucleótidos indicados en la presente memoria a fin de reflejar el uso de los codones de cualquier organismo huésped particular en el que deben expresarse los polipéptidos.

Los ácidos nucleicos según la invención pueden comprender ADN o ARN. Pueden ser de cadena sencilla o de doble cadena. También pueden ser polinucleótidos que incluyen dentro de los mismos nucleótidos sintéticos o modificados. Se conocen de la técnica varios tipos diferentes de modificación de los oligonucleótidos. Entre ellos se incluyen esqueletos metilfosfonato y fosforotioato, adición de cadenas de acridina o polilisina en los extremos 3' y/o 5' de la molécula. Para los fines de la utilización tal como se indica en la presente memoria, debe entenderse que los polinucleótidos pueden modificarse mediante cualquier método disponible la técnica. Dichas modificaciones pueden llevarse a cabo con el fin de potenciar la actividad in vivo o periodo de vida de los polinucleótidos de interés.

Los términos “variante”, “homólogo” o “derivado” en relación a una secuencia de nucleótidos incluyen cualquier sustitución, variación, modificación, reemplazamiento, deleción o adición de un ácido nucleico, o más de uno, de la secuencia o a la secuencia.

CONSTRUCTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS

En un aspecto, la presente invención proporciona un constructo de ácidos nucleicos que codifica una proteína truncada de la presente invención con otra proteína. El constructo de ácidos nucleicos puede comprender: una secuencia de ácidos nucleicos codificante de una proteína truncada de la presente invención y un ácido nucleico codificante de otra proteína.

La presente invención proporciona un constructo de ácidos nucleicos que coexpresa una proteína truncada de la presente invención con un receptor de antígeno quimérico. El constructo de ácidos nucleicos comprende: (i) una secuencia de ácido nucleico codificante de una proteína truncada de la presente invención, y (ii) un ácido nucleico codificante de un receptor de antígeno quimérico.

El receptor de antígeno quimérico (RAQ) puede ser un RAQ activador que comprende un endodominio que contiene ITAM, tal como CD3 zeta. El RAQ puede ser un RAQ inhibitorio que comprende un endodominio de “apagado de ligación”, tal como se indica en el documento n° WO2015/075469, que puede comprender la totalidad o parte del endodominio de una tirosina fosfatasa de tipo receptor, tal como CD148 o CD45. El rAq puede ser un RAQ inhibitorio que comprende un endodominio de “apagado de ligación”, tal como se indica en el documento n° WO2015/075470, que puede comprender un dominio ITIM.

Las proteínas truncadas de la invención pueden utilizarse junto con una célula que expresa una combinación de “puerta lógica” de dos o más RAQ. Una puerta O comprende dos RAQ activadores tal como se indica en el documento n° WO2015/075468. Una puerta Y comprende un RAQ activador y un RAQ inhibidor de “apagado de ligación” tal como se indica en el documento n° WO2015/075469. Y la puerta Y comprende un RAQ activador y un RAQ inhibidor de “apagado de ligación” tal como se indica en el documento n° WO2015/075470.

De esta manera, la presente invención proporciona un constructo de ácidos nucleicos que comprende:

(i) una secuencia de ácido nucleico codificante de una proteína truncada de la invención,

(ii) un primer receptor de antígeno quimérico (RAQ), y

(lii) un segundo receptor de antígeno quimérico.

En referencia al aspecto de señal de transcripción de la exposición, se proporciona un constructo de ácidos nucleicos que comprende: (i) una secuencia de ácido nucleico codificante de una proteína de fusión que comprende un dominio SH2 y un dominio de proteasa, y (ii) una secuencia de ácido nucleico codificante de un factor de transcripción anclado a membrana que comprende: un anclaje a membrana, un sitio de reconocimiento de proteasa y un factor de transcripción.

En referencia al aspecto de señal de castración de la exposición, se proporciona un constructo de ácidos nucleicos que comprende: (i) una secuencia de ácido nucleico codificante de una proteína de fusión que comprende un dominio SH2 y un dominio de proteasa (p.ej., un dominio de TeV) y (ii) una secuencia de ácido nucleico codificante de un receptor que comprende un sitio de corte de proteasa.

Por ejemplo, la presente exposición proporciona un constructo de ácidos nucleicos que comprende: (a) una secuencia de ácido nucleico codificante de una proteína de fusión que comprende: (i) dominio SH2 de PTPN6, y (ii) un dominio de proteasa (p.ej., un dominio de TeV), (b) una secuencia de ácido nucleico codificante de un receptor que comprende un sitio de corte de proteasa, y (c) una secuencia de ácido nucleico codificante de un receptor que comprende un endodominio que contiene ITIM.

El receptor puede ser un receptor de células T (RCT) o un receptor de antígeno quimérico (RAQ).

Convenientemente, la proteína codificada por la secuencia de ácido nucleico (b) puede ser un receptor de células T (RCT) o un receptor de antígeno quimérico (RAQ) que comprende: (i) un sitio de corte de proteasa entre un dominio transmembranal y un endodominio activador, o (ii) un endodominio activador fusionado con un endodominio inhibidor mediante un sitio de corte de proteasa.

En el caso de que el constructo de ácidos nucleicos de la invención produzca polipéptidos discretos, tal como en el caso de que coexprese una proteína de la invención y una RAQ, puede comprender además una secuencia de ácido nucleico que habilita la expresión de ambas proteínas. Por ejemplo, puede comprender una secuencia codificante de un sitio de corte entre las dos secuencias de ácidos nucleicos. El sitio de corte puede ser autoescindible, de manera que al producir el polipéptido naciente, resulta inmediatamente cortado en dos proteínas sin necesidad de ninguna actividad de corte externa.

Se conocen diversos sitios de autoescisión, incluyendo el péptido autoescindible 2a del virus de la fiebre aftosa (VFA), que presenta la secuencia mostrada:

SEC ID n° 59

RAEGRGSLLTCGDVEENPGP

o

SEC ID n° 60

QCTNYALLKLAGDVESNPGP

La secuencia coexpresante puede ser una secuencia interna de entrada al ribosoma. La secuencia coexpresante puede ser un promotor interno.

RECEPTOR DE ANTÍGENO QUIMÉRICO (RAQ)

Los RAQ, que se muestran esquemáticamente en la figura 13, son proteínas transmembranales de tipo I quiméricas que conectan un dominio extracelular de reconocimiento de antígeno (ligante) con un dominio de señalización intracelular (endodominio). El ligante es típicamente un fragmento variable de cadena sencilla (scFv) derivado de un anticuerpo monoclonal (mAb), aunque puede estar basado en otros formatos que comprenden un sitio de unión a antígeno de tipo anticuerpo. Habitualmente resulta necesario un dominio espaciador para aislar el ligante respecto de la membrana y para permitir una orientación adecuada. Un dominio espaciador común utilizado es Fc de IgG1. Pueden resultar suficientes espaciadores más compactos, p.ej., el tallo de CD8a e incluso únicamente la bisagra de IgG1 solo, según el antígeno. Un dominio transmembranal ancla la proteína en la membrana celular y conecta el espaciador con el endodominio.

Los diseños de RAQ iniciales presentaban endodominios derivados de las partes intracelulares de la cadena y de FceRI o CD3Z. En consecuencia, dichos receptores de primera geneción transmiten la señal inmunitaria n° 1, que resulta suficiente para inducir la eliminación por células T de células diana afines, aunque no consigue activar por completo las células T para la proliferación y supervivencia. Para superar dicha limitación, se han construido endodominios compuestos: la fusión de la parte intracelular de una molécula coestimuladora de células T con CD3Z resulta en receptores de segunda generación que pueden transmitir una señal activadora y coestimuladora simultáneamente después del reconocimiento de antígeno. El dominio coestimulador utilizado más comúnmente es el de CD28. Lo anterior, suministra la señal coestimuladora más potente; es decir, una señal inmunitaria n° 2 que induce la proliferación de las células T. Se han descrito algunos receptores que incluyen endodominios de la familia de receptores de TNF, tales como los estrechamente relacionados OX40 y 41BB, que transmiten señales de supervivencia. Ahora se han descrito RAQ de tercera generación todavía más potentes que presentan endodominios capaces de transmitir señales de activación, proliferación y supervivencia.

Pueden transferirse ácidos nucleicos codificantes de RAQ a células T utilizando, por ejemplo, vectores retrovíricos. Pueden utilizarse vectores lentivíricos. De esta manera, puede generarse un gran número de células T específicas de cáncer para la transferencia celular adoptiva. En el caso de que el RAQ se una al antígeno diana, lo anterior resulta en la transmisión de una señal activadora a la célula T sobre la que se expresa. De esta manera, el RAQ dirige la especificidad y la citotoxicidad de la célula T para las células tumorales que expresan el antígeno diana.

Por lo tanto, los RAQ típicamente comprenden: (i) un dominio de unión a antígeno, (ii) un espaciador, (iii) un dominio transmembranal, y (iii) un dominio intracelular que comprende o se asocia a un dominio de señalización.

DOMINIO DE UNIÓN A ANTÍGENO

El dominio de unión a antígeno es la parte del RAQ que reconoce el antígeno. Se conocen de la técnica numerosos dominios de unión a antígeno, incluyendo los basados en el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo, miméticos de anticuerpo y receptores de células T. Por ejemplo, el dominio de unión a antígeno puede comprender: un fragmento variable de cadena sencilla (scFv) derivado de un anticuerpo monoclonal, un ligando natural del antígeno diana, un péptido con suficiente afinidad para la diana, un anticuerpo de dominio único, un ligante único artificial, tal como un Darpin (proteína de repetición de anquirina de diseño) o una cadena sencilla derivado de un receptor de célula T.

El dominio de unión a antígeno puede comprender un dominio que no se basa en el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo. Por ejemplo, el dominio de unión a antígeno puede comprender un dominio basado en una proteína/péptido que es un ligando soluble para un receptor de superficie de célula tumoral (p.ej., un péptido soluble, tal como una citoquina o una quimioquina), o un dominio extracelular de un ligando anclado a membrana o un receptor para el que la contrapartida de la pareja de unión se expresa sobre la célula tumoral.

El dominio de unión a antígeno puede estar basado en un ligando natural del antígeno.

El dominio de unión a antígeno puede comprender un péptido de afinidad de una biblioteca combinatorial o una proteína/péptido de afinidad de diseño de novo.

DOMINIO ESPACIADOR

Los RAQ comprenden una secuencia espaciadora para conectar el dominio de unión a antígeno con el dominio transmembranal y separan espacialmente el dominio de unión a antígeno respecto del endodominio. Un espaciador flexible permite que el dominio de unión a antígeno se oriente en direcciones diferentes para facilitar la unión.

En aspectos de la presente invención que requieren dos RAQ, el primer y el segundo RAQ pueden comprender diferentes moléculas espaciadoras. Por ejemplo, la secuencia espaciadora puede comprender, por ejemplo, una región Fc de IgG1, una bisagra de IgG1 o un tallo de CD8 humano o el tallo de CD8 de ratón. El espaciador puede comprender alternativamente una secuencia conectora alternativa que presenta una longitud y/o propiedades espaciadoras de dominio similares, tales como región Fc de IgG1, una bisagra de IgG1 o un tallo de c D8. Puede alterarse un espaciador de IgG1 humano para eliminar los motivos de unión a Fc.

Todos los dominios espaciadores mencionados anteriormente forman homodímeros. Sin embargo, el mecanismo no se encuentra limitado a la utilización de receptores homodiméricos y debe funcionar con receptores monoméricos con la condición de que el espaciador sea suficientemente rígido. Un ejemplo de dicho espaciador es CD2 o CD22 truncado.

Debido a que los RAQ son típicamente homodímeros (ver la figura 13a), el emparejamiento cruzado puede resultar en un receptor de antígeno quimérico heterodimérico. Lo anterior resulta indeseable por diversos motivos, por ejemplo: (1) el epítopo puede no encontrarse al mismo “nivel” sobre la célula diana de manera que un RAQ de emparejamiento cruzado puede ser capaz de solo unirse a un antígeno, ((2) el VH y el VL de los dos scFv diferentes podrían intercambiarse y cualquiera de ellos no conseguir el reconocimiento, o peor, podrían reconocer un antígeno inesperado y no predicho. Para las puertas “Y” e “Y/NO” indicadas anteriormente, el espaciador del primer RAQ puede ser suficientemente diferente del espaciador del segundo RAQ para evitar el emparejamiento cruzado, aunque suficientemente similar para la colocalización. Pueden utilizarse parejas de secuencias espaciadoras ortólogas. Son ejemplos de tallos de CD8 murinos y humanos, o alternativamente dominios espaciadores que son monoméricos, por ejemplo, el ectodominio de CD2.

Se muestran ejemplos de parejas espaciadoras que se colocalizan en la tabla a continuación:

DOMINIO TRANSMEMBRANAL

El dominio transmembranal es la secuencia del RAQ que atraviesa la membrana.

Un dominio transmembranal puede ser cualquier estructura proteica que sea termodinámicamente estable en una membrana. Lo anterior es típicamente una hélice alfa que comprende varios residuos hidrofóbicos. El dominio transmembranal de cualquier proteína transmembranal puede utilizarse para suministrar la parte transmembranal de la invención. La presencia y envergadura de un dominio transmembranal de una proteína puede ser determinado por el experto en la materia utilizando el algoritmo TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/). Además, dado que el dominio transmembranal de una proteína es una estructura relativamente simple, es decir, una secuencia polipeptídica que se predice que forma una hélice alfa hidrofóbica de longitud suficiente para atravesar toda la membrana, también puede utilizarse un dominio TM de diseño artificial (el documento n° US 7052906 B1 describe componentes transmembranales sintéticos).

El dominio transmembranal puede derivarse de CD28, que proporciona una buena estabilidad del receptor.

ENDODOMINIO ACTIVADOR

El endodominio es la parte de transmisión de señales del RAQ. Puede ser parte o estar asociado al dominio intracelular del RAQ. Tras el reconocimiento del antígeno, los receptores se agregan, CD45 y CD148 nativos resultan excluidos de la sinapsis y se transmite una señal a la célula. El componente del endodominio utilizado más comúnmente es el de CD3-zeta, que contiene 3 ITAM. Lo anterior transmite una señal de activación a la célula T tras la unión del antígeno. CD3-zeta puede no proporcionar una señal de activación totalmente competente y puede requerirse una señalización coestimuladora adicional. Por ejemplo, puede utilizarse CD28 y OX40 quiméricos con CD3-Zeta para transmitir una señal proliferativa / de supervivencia, o pueden utilizarse los tres juntos.

En el caso de que un Raq comprenda un endodominio activador, puede comprender el endodominio CD3-Zeta solo, el endodominio CD3-Zeta con el de CD28 o OX40, o el endododominio de CD28 y OX40 y el endodominio CD3-Zeta.

Cualquier endodominio que contenga un motivo ITAM puede actuar como un endodominio de activación en la presente invención. En la presente memoria se describen endodominios adecuados que contienen un motivo ITAM.

DOMINIO INHIBITORIO

En realizaciones indicadas anteriormente como puerta “Y”, el primer RAQ puede comprender un endodominio activador fusionado con un endodominio inhibitorio mediante un sitio de corte de proteasa. De esta manera, el endodominio inhibitorio inhibe la activación de las células T por el primer RAQ en ausencia de activación del segundo RAQ. Con la activación del segundo RAQ, el ITIM en el endodominio del segundo RAQ resulta fosforilado y la proteína de fusión de PTPN6/dominio de proteasa es captado en la membrana. Lo anterior resulta en el corte del primer RAQ entre el endodominio activador y el endodominio inhibitorio, habilitando de esta manera la activación de la célula T.

Los endodominios inhibitorios pueden comprender cualquier secuencia que inhibe la señalización de células T por el RAQ activador en el caso de que se encuentre en el mismo endodominio.

El endodominio inhibitorio puede ser o comprender una tirosina fosfatasa, tal como una tirosina fosfatasa de tipo receptor. Un endodominio inhibitorio puede ser o comprender cualquier tirosina fosfatasa que sea capaz de inhibir la señalización de RCT al colocalizarse con el endodominio activador del RAQ. Un endodominio inhibitorio puede ser o comprender cualquier tirosina fosfatasa con una velocidad catalítica suficientemente rápida para los ITAM fosforilados que permita la inhibición de la señalización de RCT al colocalizarse con el endodominio activador del RAQ.

VECTOR

La presente invención proporciona además un vector, o kit de vectores, que comprende una o más secuencias o uno o más constructos de ácidos nucleicos según la presente invención. Dicho vector puede utilizarse para introducir una o más secuencias o constructos de ácidos nucleicos en una célula huésped de manera que exprese las proteínas codificadas por la secuencia o constructo de ácidos nucleicos.

El vector puede ser, por ejemplo, un plásmido o un vector vírico, tal como un vector retrovírico o un vector lentivírico, o un vector a base de transposón o ARNm sintético.

El vector puede ser capaz de transfectar o transducir una célula T.

CÉLULA

La presente invención se refiere además a una célula inmunitaria que comprende la proteína truncada, ácido nucleico y/o constructo de ácidos nucleicos de la presente invención.

La célula puede ser una célula inmunitaria citolítica.

Las células inmunitarias citolíticas pueden ser células T o linfocitos T que son un tipo de linfocitos que desempeñan un papel crucial en la inmunidad mediada por células. Pueden distinguirse de otros linfocitos, tales como células B y células asesinas naturales (células NK), por la presencia de un receptor de célula T (RCT) sobre la superficie celular. Existen diversos tipos de célula T, tal como se resume posteriormente.

Las células T ayudantes (células TH) ayudan a otros glóbulos blancos en los procesos inmunitarios, incluyendo la maduración de las células B en células plasmáticas y células B de memoria, y la activación de células T citotóxicas y macrófagos. Las células TH expresan CD4 sobre su superficie. Las células TH resultan activadas al ser presentadas con antígenos peptídicos por moléculas del CMH de clase II sobre la superficie de células presentadoras de antígenos (CPA). Estas células pueden diferenciarse en varios subtipos, incluyendo TH1, TH2, t H3, TH17, TH9 o TFH, que secretan diferentes citoquinas para facilitar diferentes tipos de respuesta inmunitaria.

Las células T citolíticas (células TC, o CTL) destruyen las células infectadas por virus y las células tumorales, y también participan en el rechazo del trasplante. Las CTL expresan CD28 en su superficie. Estas células reconocen sus dianas mediante la unión a antígenos asociados al CMH de clase I, que se encuentra presente sobre la superficie de todas las células nucleadas. Mediante IL-10, la adenosina y otras moléculas secretadas por las células T reguladoras, las células CD8+ pueden resultar inactivadas en un estado anérgico, evitando las enfermedades autoinmunitarias, tales como la encefalomielitis autoinmune experimental.

Las células T de memoria son un subgrupo de células T específicas de antígeno que persisten a largo plazo después de la resolución de una infección. Se expanden rápidamente hasta un gran número de células T efectoras tras la reexposición a su antígeno afín, proporcionando de esta manera al sistema inmunitario “memoria” frente a infecciones pasadas. Las células T de memoria comprenden tres subtipos: células T de memoria centrales (células TCM) y dos tipos de células T de memoria efectoras (células TEM y células TEMRA). Las células de memoria pueden ser CD4+ o CD8+. Las células T de memoria típicamente expresan la proteína de superficie celular CD45RO.

Las células T reguladoras (células Treg), anteriormente conocidas como células T supresoras, resultan cruciales para el mantenimiento de la tolerancia inmunitaria. Su función principal es cerrar la inmunidad mediada por células T hacia el final de la reacción inmunitaria y suprimir las células T autorreactivas que escapan al proceso de selección negativa en el timo.

Se han descrito dos clases principales de células Treg CD4+: las células Treg naturales y las células Treg adaptativas.

Las células Treg naturales (también conocidas como células Treg CD4+CD25+FoxP3+) aparecen en el timo y se han relacionado con interacciones entre las células T en desarrollo y las células dendríticas tanto mieloides (CD11c+) como plasmacitoides (CD123+) que han sido activadas con TSLP. Las células Treg naturales pueden distinguirse de otras células T por la presencia de una molécula intracelular denominada FoxP3. Las mutaciones del gen de FOXP3 pueden evitar el desarrollo de células T reguladoras, causando la enfermedad autoinmunitaria fatal IPEX.

Las células Treg adaptativas (también conocidas como células Tr1 o células Th3) pueden originarse durante una respuesta inmunitaria normal.

Las células asesinas naturales (o células NK) son un tipo de células citolíticas que forman parte del sistema inmunitario innato. Las células NK proporcionan respuestas rápidas a las señales innatas de células infectadas víricamente de una manera independiente del CMH.

Las células NK (pertenecientes al grupo de las células linfoides innatas) se definen como linfocitos granulares grandes (LGG) y constituyen el tercer tipo de células diferenciadas a partir del progenitor linfoide común que genera linfocitos B y T. Es conocido que las células NK se diferencian y maduran en la médula ósea, ganglios linfáticos, bazo, amígdalas y timo, en donde a continuación entran en la circulación.

Las células de la invención pueden ser cualquiera de los tipos celulares indicados anteriormente.

Las células T o NK que expresan las moléculas de la invención pueden crearse ex vivo a partir de la propia sangre periférica de un paciente (1° parte) o en el contexto de un trasplante de células madre hematopoyéticas procedentes de la sangre periférica de un donante (2° parte) o de sangre periférica procedente de un donante no relacionado (3° parte).

Alternativamente, las células T o NK que expresan las moléculas de la invención pueden derivarse de la diferenciación ex vivo de células progenitoras inducibles o células progenitoras embrionarias en células T. Alternativamente, puede utilizarse una línea de células T inmortalizadas que conservan su función lítica y podrían actuar como un terapéutico.

En la totalidad de dichas realizaciones, las células se generan mediante la introducción de ADN o ARN codificante del componente receptor y del componente de señalización por uno de entre varios medios, incluyendo la transducción con un vector vírico, o la transfección con ADN o ARN.

Las células de la invención puede ser una célula T o NK ex vivo procedente de un sujeto. La célula T o NK puede proceder de una muestra de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Las células T o NK pueden activarse y/o expandirse antes de transducirse con ácido nucleico de la invención, por ejemplo mediante tratamiento con un anticuerpo monoclonal anti-CD3.

La célula T o NK de la invención puede prepararse mediante:

(i) aislamiento de una muestra que contiene células T o NK de un sujeto o de otras fuentes indicadas anteriormente, y

(ii) transducción o transfección de las células T o NK con una o más secuencias de ácidos nucleicos según la invención.

A continuación, las células T o NK pueden purificarse, por ejemplo, seleccionarse basándose en la expresión del dominio de unión a antígeno del polipéptido de unión a antígeno.

La presente invención proporciona además una célula que comprende una proteína truncada de la invención y un receptor de antígeno quimérico (RAQ).

De esta manera, la presente invención proporciona una célula que comprende:

(ii) un primer receptor de antígeno quimérico (RAQ), y

(iii) un segundo receptor de antígeno quimérico.

En referencia al aspecto de señal de transcripción de la exposición, se proporciona una célula que comprende: (i) una proteína de fusión que comprende un dominio SH2 y un dominio de proteasa, y (ii) un factor de transcripción anclado a membrana que comprende: un anclaje a membrana, un sitio de reconocimiento de proteasa y un factor de transcripción.

En referencia al aspecto de señal de castración de la exposición, se proporciona una célula que comprende: (i) una proteína de fusión que comprende un dominio SH2 y un dominio de proteasa y (ii) un receptor que comprende un sitio de corte de proteasa.

El receptor puede ser, por ejemplo, un receptor de células T (RCT) o un receptor de antígeno quimérico (RAQ), que comprende: (i) un sitio de corte de proteasa entre un dominio transmembranal y un endodominio activador, o (ii) un endodominio activador fusionado con un endodominio inhibidor mediante un sitio de corte de proteasa.

COMPOSICIÓN

La presente invención se refiere además a una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de células de la invención. La composición farmacéutica puede comprender adicionalmente un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender opcionalmente uno o más polipéptidos y/o compuestos farmacéuticamente activos adicionales. Dicha formulación puede encontrarse, por ejemplo, en una forma adecuada para la infusión intravenosa.

MÉTODO DE TRATAMIENTO

Las células de la presente invención pueden ser capaces de eliminar células diana, tales como células de cáncer. Las células de la presente invención pueden utilizarse para el tratamiento de una infección, tal como una infección vírica.

Las células de la invención pueden utilizarse además para el control de respuestas inmunitarias patogénicas, por ejemplo, en enfermedades autoinmunitarias, alergias y rechazo del injerto contra el huésped.

Las células de la invención pueden utilizarse para el tratamiento de una enfermedad cancerosa, tal como el cáncer de vejiga, el cáncer de mama, el cáncer de colon, el cáncer endometrial, el cáncer renal (células renales), la leucemia, el cáncer de pulmón, el melanoma, el linfoma no de Hodgkin, el cáncer pancreático, el cáncer de próstata y el cáncer de tiroides.

Las células de la invención pueden utilizarse para tratar: cánceres de la cavidad oral y la faringe, que incluye cáncer de lengua, boca y faringe; cánceres del sistema digestivo, que incluye los cánceres esofágico, gástrico y colorrectal; cánceres de hígado y el árbol biliar, que incluye carcinomas hepatocelulares y colangiocarcinomas; cánceres del sistema respiratorio, que incluye cánceres broncogénicos y cánceres de laringe; cánceres de hueso y articulaciones, que incluye osteosarcoma; cánceres de piel, que incluye melanoma; cáncer de mama; cánceres del tracto genital, que incluye cáncer uterino, ovárico y cervical en mujeres; cáncer de próstata y testicular en hombres; cánceres del tracto renal, que incluye carcinoma de células renales y carcinomas de células transicionales de los uréteres o la vejiga; cánceres de cerebro, incluyendo gliomas, glioblastoma multiforme y meduloblastomas; cánceres del sistema endocrino, incluyendo cáncer de tiroides, carcinoma adrenal y cánceres asociados a múltiples síndromes de neoplasma endocrino; linfomas, incluyendo el linfoma de Hodgkin y linfoma no de Hodgkin; mieloma múltiple y plasmacitomas; leucemias tanto agudas como crónicas, mieloide o linfoide; y cánceres de otros sitios no especificados, incluyendo el neuroblastoma.

El tratamiento con las células de la invención puede ayudar a evitar la fuga o liberación de células tumorales que se produce con frecuencia con los enfoques estándares.

A continuación, se describe adicionalmente la invención mediante ejemplos, que pretenden servir para ayudar al experto ordinario en la materia a llevar a cabo la invención y no pretenden en modo alguno limitar el alcance de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1. Sometimiento de la ruta de activación de las células T a señales aumentadas o no fisiológicas

Se sometieron a ensayo varios dominios SH2 que participan en la activación temprana de señales de células T a fin de determinar si las señales de activación de células T podían someterse o “secuestrarse”, de manera que, al activar una célula T, la señal pudiese modularse o retransmitirse.

Los inventores generaron varios constructos quiméricos de AKT mediante la unión del dominio de quinasa de Akt a dominios SH2 de Zap70, Grap, Grb2 y PLCy (figura 8).

En células T no transducidas (NT), se detectaban niveles muy bajos de fosforilación de la AKT endógena tras el tratamiento con OKT3 para inducir el entrecruzamiento y activación del RCT (figura 10b: panel superior). Sin embargo, en células que expresaban el constructo Zap-AKT, se observaron niveles significativos de fosfo-AKT (figura 10b: panel inferior).

El conector para la activación de las células T (LAT) es una diana corriente abajo de ZAP70 y se une a varias proteínas que contienen SH2, tales como Grb2, Grap y PLCy. Se anticipó que los dominios SH2 de cada una de dichos ligantes LAT también permitiría secuestrar la señal de activación de CD3-zeta. Sin embargo, éste no fue el caso.

No se observó fosforilación dependiente de RCT del dominio de quinasa AKT a niveles superiores a los observados para las células T NT al unir el dominio de quinasa AKT a los dominios SH2 de Grb2, Grap o PLCy (figura 9a).

Lo anterior demuestra que dicho sistema de secuestro de la señalización de las células T requiere específicamente el dominio SH2 en tándem de una molécula de señalización de células T muy temprana, tal como Zap70 o proteína tirosina fosfatasa no receptora tipo 6 (PTPN6).

Ejemplo 2. Control transcripcional

La proteasa de TeV se fusionó con el dominio SH2 de Zap70. También se generó un factor de transcripción unido a membrana, de la manera siguiente: Se clonó RQR8 en el mismo marco del factor de transcripción VP16/GAL4 separado por un sitio de corte de TeV. Dicha proteína de fusión permite la liberación del factor de transcripción VP16/GAL4 (que contiene una señal de localización nuclear) tras el corte del TeV.

Dichas proteínas se expresaron en una célula T que también expresa un receptor de antígeno quimérico específico de CD19. Para demostrar que resulta necesario el enfoque de ZAP70-TeV, se coexpresó el factor de transcripción con un RAQ CD19 cuyo endodominio fue sustituido por TeV (figura 11).

Las células T se expusieron a dianas negativas y positivas para CD19. Se midió la activación transcripcional mediante un casete de luciferasa que responde a GALv/Vp16. Sólo la condición en que se coexpresaba un RAQ CD19 estándar

Claims

REIVINDICACIONES

i . Células que comprende un receptor de antígeno quimérico (RAQ) y una proteína truncada que comprende un dominio SH2 de una proteína que se une a un motivo de inhibición de inmunorreceptor a base de tirosinas (ITIM) fosforilado pero que no presenta un dominio de fosfatasa.
2. Célula según la reivindicación 1, en la que la proteína truncada comprende el dominio SH2 de PTPN6 pero no presenta el dominio de fosfatasa de PTPN6.
3. Célula según la reivindicación 1, en la que la proteína truncada comprende el dominio SH2 de SHP-2 pero no presenta el dominio de fosfatasa de SHP-2.
4. Célula según la reivindicación 1, en la que la proteína truncada comprende la secuencia mostrada en SEC ID n° 6 o una o ambas secuencias mostradas en SEC ID n° 7 y n° 8.
5. Célula según la reivindicación 1, en la que la proteína truncada comprende o consiste en la secuencia mostrada en SEC ID n° 10, n° 11 o n° 12.
6. Constructo de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína truncada según se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores y una secuencia de ácido nucleico codificante de un receptor de antígeno quimérico.
7. Vector que comprende un constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 6.
8. Conjunto de vectores que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína truncada según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y una secuencia de ácido nucleico codificante de un receptor de antígeno quimérico.
9. Composición farmacéutica que comprende una pluralidad de células según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
10. Composición farmacéutica según la reivindicación 9, para la utilización en el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad.
11. Composición farmacéutica para la utilización según la reivindicación 10, en la que el método de tratamiento y/o prevención comprende las etapas siguientes:

(i) provisión de una muestra que contiene células a partir de un sujeto,

(ii) transducción o transfección de las células con un constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 6, un vector según la reivindicación 7 o conjunto de vectores según la reivindicación 8, y

(iii) administración de las células de (ii) en el sujeto.
12. Composición farmacéutica para la utilización según la reivindicación 10 o 11, en la que dicha enfermedad es cáncer.
13. Método para producir una célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende la etapa de introducir: un constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 6, un vector según la reivindicación 7 o un conjunto de vectores según la reivindicación 8, en la célula ex vivo.
14. Método según la reivindicación 13, en el que la célula es de una muestra aislada a partir de un sujeto.