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ES2790527T3 - Composiciones de vacunas contra el síndrome reproductivo y respiratorio porcino y las enfermedades asociadas al circovirus porcino - Google Patents

Composiciones de vacunas contra el síndrome reproductivo y respiratorio porcino y las enfermedades asociadas al circovirus porcino Download PDF

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ES2790527T3
ES2790527T3 ES16804176T ES16804176T ES2790527T3 ES 2790527 T3 ES2790527 T3 ES 2790527T3 ES 16804176 T ES16804176 T ES 16804176T ES 16804176 T ES16804176 T ES 16804176T ES 2790527 T3 ES2790527 T3 ES 2790527T3
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Meng-Ju Tsai
Pao-Yen Lai
Wei-I Chou
Hsiu-Kang Chang
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REBER GENETICS CO Ltd
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Abstract

Una proteína de fusión que comprende: (a) un dominio de unión a células presentadoras de antígeno (APC) ubicado en el N-terminal de la proteína de fusión, en la que el dominio de unión a APC es el dominio Ia de unión a exotoxina A de Pseudomonas (PE); (b) un péptido de translocación que tiene de 34-112 residuos de aminoácidos de longitud, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, 2, 3 o 6, ubicado en el C-terminal del dominio de unión a APC; (c) un antígeno de fusión que comprende: (i) un antígeno ORF7 del virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV); (ii) un antígeno ORF1b del PRRSV; (iii) un antígeno ORF6 del PRRSV; y (iv) un antígeno ORF5 del PRRSV; (d) una señal de exportación nuclear que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, ubicada en el C-terminal del antígeno de fusión o entre el péptido de translocación y el antígeno de fusión; y (e) una secuencia de retención del retículo endoplásmico, ubicada en el C-terminal del antígeno de fusión cuando la señal de exportación nuclear está ubicada entre el péptido de translocación y el antígeno de fusión, o ubicada en el C-terminal de la señal de exportación nuclear cuando la señal de exportación nuclear está ubicada en el C-terminal del antígeno de fusión; en la que el antígeno de fusión no comprende secuencias de proteínas de ORF7, ORF6, ORF5 y ORF1b de longitud completa.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones de vacunas contra el síndrome reproductivo y respiratorio porcino y las enfermedades asociadas al circovirus porcino
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a vacunas, y más específicamente a vacunas de subunidades.
Antecedentes de la invención
Los virus que infectan las células inmunes (tales como células T, células B, células dendríticas, monocitos o macrófagos) incluyen el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV), el circovirus porcino tipo II (PCV2) y el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV). Las células inmunes no pueden evocar respuestas de inmunización sino que transportan los virus. Los animales que han sido infectados por estos virus se pueden infectar fácilmente por otros patógenos. El virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV) produce grandes pérdidas en la cría de animales cada año. El PRRSV no solo puede infectar a los cerdos, sino también a los patos. En general, los animales infectados por el virus no tienen síntomas significativos, pero la inmunidad de los animales infectados se reduce. Este virus infecta macrófagos (en el alveolar y el bazo), microglia cerebral y monocitos, y puede existir en la sangre y los órganos de los animales infectados. Esto conduce a una disminución del aumento de peso y un aumento en la tasa de mortalidad debido a la infección secundaria.
La Patente de los Estados Unidos No. 7,595,054 describe un antígeno de fusión usado como una vacuna de subunidad, en la que una unidad estructural de antígeno seleccionado de una región de ORF1b o una región de ORF7 se fusiona entre un polipéptido de exotoxina A de Pseudomonas que carece del dominio citotóxico III, esto es, PE (A III) y una secuencia de retención del retículo endoplásmico.
Una composición de la vacuna denominada "PRRSFREE™" por Reber Genetics Co. Ltd. comprende cuatro antígenos PRRS separados, que se designan como D, M, R y P, respectivamente. Estos cuatro antígenos PRRS se expresaron respectivamente por cuatro vectores separados usando el diseño descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 7,595,054, y se encontraron eficaces para inducir respuestas inmunes humorales y mediadas por células en animales.
Los documentos EP 1882478 A1, US 2008/0008722 A1 y CN 101104641 B describen cada uno una vacuna de subunidades del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) PE-PQGAB-K3, que comprende dominios de unión y translocación de exotoxina A de Pseudomonas (PE), partes N-terminales de las proteínas estructurales ORF5 del PRRSV y ORF6, y un dominio terminal carboxilo que comprende KDEL-KDEL-KDEL (K3). El documento US 2004/247617 A1 describe un antígeno de fusión que comprende una unidad estructural ligando capaz de unirse a un receptor en una célula diana, un dominio de translocación de PE, una unidad estructural antigénica y una unidad estructural carboxilo terminal que permite la retención del antígeno de fusión en la membrana del retículo endoplasmático (ER) de la célula diana.
El documento US 2014/0154285 describe proteínas de fusión para su uso como potenciadores inmunogénicos para inducir respuestas de células T específicas de antígeno.
El documento US 2008/0206271 A1 describe un antígeno de fusión que comprende una unidad estructural ligando capaz de unirse a un receptor en una célula diana, dominio II de translocación PE, una unidad estructural antigénica y una unidad estructural carboxilo terminal que comprende la secuencia de aminoácidos de KDEL.
El documento EP 2789627 A1 describe una vacuna de subunidades de circovirus porcino tipo 2.
Resumen de la invención
En un aspecto, la invención se refiere a una proteína de fusión del virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV) que comprende:
(a) un dominio de unión a células presentadoras de antígeno (APC) ubicado en el N-terminal de la proteína de fusión, en el que la unión a APC es un dominio Ia de unión a exotoxina A de Pseudomonas (PE);
(b) un péptido de translocación que tiene de 34-112 residuos de aminoácidos de longitud, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, 2, 3 o 6, ubicada en el C-terminal del dominio de unión a APC;
(c) un antígeno de fusión que comprende:
(i) un antígeno ORF7 del virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV);
(ii) un antígeno ORF1b del PRRSV;
(iii) un antígeno ORF6 del PRRSV; y
(iv) un antígeno ORF5 del PRRSV;
(d) una señal de exportación nuclear que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, ubicado en el C-terminal del antígeno de fusión o entre el péptido de translocación y el antígeno de fusión;
en la que el antígeno de fusión no comprende secuencias de proteínas ORF7, ORF6, ORF5 y ORF1b de longitud completa; y
(e) una secuencia de retención del retículo endoplásmico, ubicada en el C-terminal del antígeno de fusión cuando la señal de exportación nuclear está ubicada entre el péptido de translocación y el antígeno de fusión, o ubicada en el C-terminal de la señal de exportación nuclear cuando la señal de exportación nuclear está ubicada en el C-terminal del antígeno de fusión.
En una realización de la invención, el antígeno ORF7 u ORF1b está ubicado en el N-terminal del antígeno ORF6, y el antígeno ORF5 está ubicado en el C-terminal del antígeno ORF6.
En otra realización de la invención, el antígeno ORF6 está ubicado en el N-terminal del antígeno ORF5 sin un puente o un enlazante entre los antígenos ORF6 y ORF5.
En otra realización de la invención, el antígeno de fusión comprende dos repeticiones en tándem del antígeno ORF7. En otra realización de la invención, el antígeno ORF5 está ubicado en el terminal C del antígeno ORF6.
En otra realización de la invención, el antígeno ORF6 comprende la secuencia de aminoácidos de la parte N-terminal del ORF6 del PRRSV y el antígeno ORF5 comprende la secuencia de aminoácidos de la parte N-terminal del ORF5 del PRRSV, y el antígeno de fusión no comprenden las secuencias de aminoácidos de la parte C-terminal del ORF6 y ORF5.
En otra realización de la invención, el antígeno ORF1b comprende la secuencia de aminoácidos de la parte C-terminal de ORF1b NSP 10 y la secuencia de aminoácidos de la parte N-terminal de ORF1b NSP 11, y el antígeno de fusión carece de las secuencias de aminoácidos de la parte N-terminal y C-terminal del ORF1b.
En otra realización, la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 o 28.
En otra realización de la invención, la secuencia de retención del retículo endoplásmico comprende la secuencia de aminoácidos KDEL (SEQ ID NO: 15) sin una repetición en tándem de los aminoácidos KDEL.
En otra realización de la invención, el dominio de unión a APC es un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o 32.
En otra realización de la invención, la señal de exportación nuclear y la secuencia de retención de ER forman un péptido de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.
En otro aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende:
(i) la proteína de fusión PRRSV de la invención; y
(ii) una proteína de fusión de circovirus porcino tipo 2 (PCV2), que comprende:
(a) un dominio de unión a la célula presentadora de antígeno (APC) o un dominio de unión al receptor CD91, ubicado en el N-terminal de la proteína de fusión, en el que el dominio de unión a APC o el dominio de unión al receptor CD91 se selecciona del grupo que consiste en dominio III de proteína-1 asociada a receptor (RAP1), proteína asociada a receptor de alfa-2-macroglobulina (A2M), HIV-Tat, proteínas de choque térmico y dominio Ia de unión a exotoxina A de Pseudomonas;
(b) un péptido de translocación que tiene de 34-112 residuos de aminoácidos de longitud, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, 2, 3 o 6, ubicada en el C-terminal del dominio de unión a APC o el dominio de unión al receptor CD91; y
(c) un antígeno ORF2 del PCV2;
(d) una señal de exportación nuclear que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, ubicada entre el antígeno ORF2 del PCV2 y la secuencia de retención del retículo endoplásmico o entre el péptido de translocación y el antígeno ORF2 del PCV2; y
(e) una secuencia de retención del retículo endoplásmico, ubicada en el C-terminal de la proteína de fusión del PCV2 cuando la señal de exportación nuclear está ubicada entre el péptido de translocación y el antígeno ORF2 del PCV2, o ubicada en el C-terminal de la señal de exportación nuclear cuando la señal de exportación nuclear está ubicada en el C-terminal del antígeno ORF2 del PCV2;
en la que el antígeno ORF2 del PCV2 comprende la secuencia de aminoácidos de la parte C-terminal de la proteína del o Rf 2 del PCV2, y la proteína de fusión del PCV2 no comprende la secuencia de aminoácidos de la parte N-terminal de la proteína del Or F 2 del PCV2.
En otra realización de la invención, el dominio de unión a APC o el dominio de unión a receptor CD91 está libre de la secuencia de aminoácidos del dominio I de unión a exotoxina A de Pseudomonas (PE).
En otra realización de la invención, el péptido de translocación tiene de 34-46 residuos de aminoácidos de longitud. En otra realización de la invención, el péptido de translocación tiene de 34-61 residuos de aminoácidos de longitud. Además, en otro aspecto, la invención se refiere a una proteína de fusión de la invención para su uso en la inducción de respuestas humorales y mediadas por células específicas de antígenos contra el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV) en un sujeto que lo necesite.
Aún en otro aspecto, la invención se refiere a una composición de la invención para su uso en la inducción de respuestas humorales y mediadas por células específicas de antígeno contra el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV) y el circovirus porcino tipo 2 (PCV2) en un sujeto que lo necesite.
El antígeno de fusión de la invención comprende neutralización y epítopos protectores en ORF7, ORF6, ORF5 y ORF1b sin comprender la secuencia proteica ORF7, ORF6, ORF5 y ORF1b de longitud completa.
El antígeno ORF7 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, 22, o 23.
El antígeno ORF1b comprende la secuencia de aminoácidos de la parte C-terminal de ORF1b NSP 10 y la parte N-terminal de ORF1b NSP 11 y carece de las partes N-terminal y C-terminal de ORF1b. Es decir, el antígeno de fusión comprende la secuencia de aminoácidos de la parte C-terminal de ORF1b NSP 10 y la parte N-terminal de ORF1b NSP 11 y no comprende la secuencia de aminoácidos de las partes N-terminal y C-terminal de ORF1b.
El antígeno ORF6 comprende la secuencia de aminoácidos de la parte N-terminal del ORF6 del PRRSV y el antígeno ORF5 comprende la secuencia de aminoácidos de la parte N-terminal del ORF5 del PRRSV, y el antígeno de fusión no comprende las secuencias de aminoácidos de la parte C-terminal del ORF6 y ORF5. En otras palabras, el antígeno ORF6 se selecciona de la secuencia de aminoácidos de la parte N-terminal del ORF6 del PRRSV, y el antígeno ORF5 se selecciona de la secuencia de aminoácidos de la parte N-terminal del ORF5 del PRRSV.
En otra realización de la invención, la secuencia de aminoácidos de la parte N-terminal del ORF6 del PRRSV es SEQ ID NO: 34, y la secuencia de aminoácidos de la parte N-terminal del ORF5 del PRRSV es 35.
Además, en otra realización de la invención, la secuencia de aminoácidos de la parte N-terminal del ORF6 del PRRSV es SEQ ID NO: 36, y la secuencia de aminoácidos de la parte N-terminal del ORF5 del PRRSV es 37. El antígeno ORF1b comprende la secuencia de aminoácidos de la parte C-terminal de ORF1b NSP 10 y la secuencia de aminoácidos de la parte N-terminal de ORF1b NSP 11, y el antígeno de fusión carece de las secuencias de aminoácidos de la parte N-terminal y C-terminal de la ORF1b. En una realización de la invención, el antígeno ORF1b tiene menos de 200 residuos de aminoácidos de longitud y comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25. En otra realización de la invención, el antígeno ORF1b comprende una secuencia de aminoácidos a partir del residuo de aminoácidos 1046 al residuo de aminoácidos 1210 del ORF1b del PRRSV. En una realización de la invención, el aminoácido C-terminal de la SEQ ID NO: 13 es alanina.
Estos y otros aspectos serán evidentes a partir de la siguiente descripción de la realización preferida tomada junto con los siguientes dibujos. Los dibujos adjuntos ilustran una o más realizaciones de la invención y, junto con la descripción escrita, sirven para explicar los principios de la invención. Siempre que sea posible, se usan los mismos números de referencia en todos los dibujos para referirse a los mismos elementos o elementos similares de una realización.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1A es un dibujo esquemático que muestra una exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa (PE) de longitud completa, y un fragmento parcial de PE.
Las figuras 1B-C muestran mapas vectoriales.
La figura 1D es un dibujo esquemático que muestra cuatro plásmidos separados que se usan para la preparación de una composición de la vacuna que se denomina PRRSFREE. La composición de la vacuna PRRSFEE comprende cuatro proteínas de fusión de PE individuales separadas. Cada proteína de fusión PE individual en la composición de la vacuna PRRSFREE comprende un fragmento PE (aIII) (PE407), una unidad estructural antigénica única (designada como M, P, R o D) y una secuencia de retención endoplásmica (K3). El término "D" o "DGD" representa un antígeno de la nucleoproteína PRRSV ORF7. El término "R" o "RSAB" representa un antígeno de fusión del ORF6 del PRRSV/proteína de membrana y ORF5/proteína de envoltura principal sin una secuencia puente/enlazante en el medio. El término "M" o "M12" representa un antígeno de PRRSV ORF1b, es un antígeno de fusión artificial de proteínas no estructurales de PRRSV NSP 10 y NSP 11. El término "P" o "PQAB" representa un antígeno de fusión del ORF6 del PRRSV/proteína de membrana y ORF5/proteína de envoltura principal sin una secuencia puente/enlazante en el medio. El término "PE (aMI)" representa un fragmento de PE sin el dominio citotóxico III. El término "PE407" representa un polipéptido de exotoxina A de Pseudomonas (PE) desde el aminoácido 1 hasta el aminoácido 407.
La figura 1E es un dibujo esquemático que muestra un plásmido que se usa para la preparación de una proteína de fusión de PE llamada PEDr Mp-NESK o PRRSFREE 4-en-una. La proteína de fusión Pe-DRMP-NESK comprende un fragmento PE(aIII) (PE313), un polipéptido de fusión único que comprende cuatro unidades estructurales de antígeno (designado como DRMP), una señal de exportación nuclear (NES) y una secuencia de retención endoplásmica (K) .
La figura 1F es un dibujo esquemático que muestra un plásmido que codifica una proteína de fusión que comprende un fragmento PE(aIII) (PE313), una unidad estructural de antígeno única (designada como PCV2), una señal de exportación nuclear (NES) y una secuencia de retención endoplásmica (K) .
La figura 2A es un gráfico que muestra respuestas inmunes mediadas por células (CMI) específicas de antígeno en ratones inmunizados con PBS, o la composición de la vacuna PRRSFREE 4-en-1 o PRRSFREE.
La figura 2B es un gráfico que muestra las respuestas de anticuerpos específicos de antígeno (IgG) para ratones inmunizados con PBS o PBS, o la composición de la vacuna PRRSFREE 4-en-1 o PRRSFREE.
La figura 3A es un gráfico que muestra la respuesta CMI específica del antígeno PRRSFREE para ratones inmunizados con PBS o diferentes vacunas combinadas PRRS/PCV2.
La figura 3B es un gráfico que muestra la respuesta CMI específica del antígeno ORF2 del PCV2 para ratones inmunizados con PBS o diferentes vacunas combinadas PRRS/ORF2 del PCV2.
La figura 4A es un gráfico que muestra la respuesta del anticuerpo específico de antígeno PRRSFREE (IgG) para ratones inmunizados con PBS o diferentes vacunas combinadas PRRS/PCV2.
La figura 4B es un gráfico que muestra la respuesta del anticuerpo específico de antígeno (IgG) ORF2 del PCV2 para ratones inmunizados con PBS o diferentes vacunas combinadas PRRS/PCV2.
La figura 5 es un gráfico que muestra respuestas de CMI específicas de antígeno PRRSFREE en ratones inmunizados con (1) una proteína de fusión que comprende una fusión de dos antígenos (una fusión de los antígenos D y R en PE313-DR-NESK), o (2) una combinación de dos proteínas de fusión separadas, cada proteína de fusión comprende una fusión de dos antígenos (una fusión de D y R en PE313-DRMP-NESK, o una fusión de M y P en PE313-MP-NESK), o (3) una proteína de fusión que comprende un fusión de cuatro antígenos (una fusión de D, R, M y P en PE313-DRMP-NESK).
La figura 6 es un dibujo esquemático que muestra diversas proteínas de fusión usadas para inmunizar cerdos contra la infección por PRRSV.
La figura 7 es un gráfico que muestra IFN-y secretado por PBMC de cerdos vacunados después de la estimulación con los respectivos antígenos PRRSV.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se describe más particularmente en los siguientes ejemplos que tienen la intención de ser solo ilustrativos. Diversas realizaciones de la invención se describen ahora en detalle.
Definiciones
El término "una célula presentadora de antígeno (APC) o célula accesoria" se refiere a una célula que muestra antígenos extraños antígenos extraños en complejo con los principales complejos de histocompatibilidad (MHC) en sus superficies. Las células T pueden reconocer estos complejos usando sus receptores de células T (TCR). Estas células procesan los antígenos y los presentan a las células T. Los principales tipos de células presentadoras de antígeno profesionales son las células dendríticas (DC), los macrófagos, que también son CD4+ y, por lo tanto, también son susceptibles a la infección por el HIV; monocitos y ciertas células B.
El término "un dominio de unión a la célula presentadora de antígeno (APC)" se refiere a un dominio (que es un polipéptido) que se puede unir a una célula presentadora de antígeno (APC). El dominio de unión a APC puede ser un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a la secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1 y 8-11. Un dominio de unión a APC es un ligando que reconoce y se une a un receptor en APC.
El grupo de diferenciación 91 (CD91) es una proteína que forma un receptor en la membrana de las células y está implicada en la endocitosis mediada por el receptor.
El término "PEt" se refiere a un péptido de translocación (o un dominio de translocación) con 34-112 residuos de aminoácidos de longitud. PEt puede comprender la secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 2-4 y 6. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de PEt puede ser un fragmento de a.a. 280 - a.a. 313 (SEQ ID NO: 4), a.a. 268 - a.a. 313 (SEQ ID NO: 3), a.a. 253 - a.a. 313 (SEQ ID NO: 2), o a.a. 253 - a.a. 364 (SEQ ID NO: 6) de PE. Es decir, la secuencia de aminoácidos de PEt puede contener cualquier región del dominio II de PE (a.a. 253 a a.a. 364; SEQ ID NO: 6) siempre que comprenda a.a. 280-a.a. 313 (SEQ ID NO: 4) secuencia esencial (esto es, el fragmento esencial).
El PE407 (SEQ ID NO. 7) se describe en la patente anterior (US 7,335,361 B2) como PE (A III).
El "péptido de translocación" puede translocar un antígeno en el citoplasma de una célula diana.
El término "una secuencia de retención del retículo endoplásmico (ER)" se refiere a un péptido cuya función es ayudar a la translocación de un antígeno desde el citoplasma al ER y retiene el antígeno en la luz del ER. Una secuencia de retención ER comprende la secuencia de Lys Asp Glu Leu (KDEL; SEQ ID NO: 15) o RDEL. Una secuencia de retención de ER puede comprender la secuencia KDEL, RDEL, KDELKDELKDEL (K3; SEQ ID NO: 16), KKDLRDELKDEL (K3; SEQ ID NO: 17), KKDELRDELKDEL (K3; SEQ ID NO: 18) o KKDELRVELKDEL (K3; SEQ ID NO: 19).
Una señal de exportación nuclear (NES) se refiere a una secuencia de aminoácidos corta de 4 residuos hidrófobos en una proteína que se dirige a la exportación del núcleo celular al citoplasma a través del complejo de poros nucleares mediante transporte nuclear. La NES está reconocida y sujeta a exportaciones. El espaciado más común de los residuos hidrófobos es LxxKLxxLxLx (SEQ ID NO. 13), donde "L" es leucina, "K" es lisina y "x" es cualquier aminoácido de origen natural. Por ejemplo, una NES artificial puede comprender la secuencia Leu Gln Lys Leu Glu Leu Glu Leu Ala (LQKKLEELELA; SEQ ID NO: 14).
El término "NESK" se refiere a un péptido de fusión de una NES y una señal de retención de ER (esto es, una NES fusionada a una señal de retención de ER). Es un péptido artificial que posee la función de una señal de exportación nuclear (NES) y una secuencia de retención ER. De este modo, puede exportar un antígeno desde el núcleo celular al citoplasma a través del complejo de poros nucleares, y ayudar a la translocación de un antígeno desde el citoplasma a ER y retener el antígeno en la luz de la ER. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de NESK puede ser LQKKLEELELAKDEL (SEQ ID NO: 12).
Las vacunas de subunidades son vacunas que usan solo una parte del virus que causa la enfermedad. Esta estrategia se usa con mayor frecuencia cuando una parte del virus es responsable de crear la enfermedad. La parte responsable de crear la enfermedad es una proteína, que llamamos antígeno.
Un antígeno puede ser una proteína, polipéptido o péptido patogénico que es responsable de una enfermedad causada por el patógeno, o es capaz de inducir una respuesta inmunológica en un huésped infectado por el patógeno. El antígeno puede ser un antígeno de fusión de una fusión de dos o más antígenos seleccionados de una o más proteínas patógenas. Por ejemplo, un antígeno de fusión de los fragmentos ORF6 y ORF5 del PRRSV, o una fusión de proteínas antigénicas de los patógenos de PRRSV y PCV2.
Un epítopo es una parte del antígeno. Un epítopo protector significa que cuando el epítopo se combina con un anticuerpo, ayuda en el funcionamiento del anticuerpo en lugar de ir contra él.
La presencia de epítopos neutralizantes o neutralizantes es la base estructural de las vacunas profilácticas. Los epítopos neutralizantes son críticos para la unión/entrada de células virales.
Como se usa en este documento, "un antígeno ORF7 del virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV)" es un péptido que se selecciona de una parte de ORF7 del PRRSV y contiene epítopos protectores. Como se usa en este documento, "un antígeno ORF1b del PRRSV" es un péptido que se selecciona de una parte de ORF1b del PRRSV y contiene epítopos protectores.
Como se usa en este documento, "un antígeno ORF6 del PRRSV" es un péptido que se selecciona de una parte del ORF6 del PRRSV y contiene epítopos protectores.
Como se usa en este documento, "un antígeno ORF5 del PRRSV" es un péptido que se selecciona de una parte del ORF5 del PRRSV y contiene epítopos protectores.
El término "PRRSFREE" se refiere a una composición de la vacuna que comprende las cuatro proteínas de fusión PE407-M-K3, PE407-P-K3, PE407-R-K3 y PE407-D-K3.
Los términos "M12" y "M" son intercambiables. El término "M12" como se usa en este documento se refiere a un antígeno de fusión de la fusión de PRRSV NSP 10 (secuencia de dominio C-terminal) y NSP 11 (secuencia de dominio N-terminal).
Los términos "PQAB" y "P" son intercambiables. El término "T" como se usa en este documento se refiere a un antígeno de fusión de la fusión de la parte N-terminal del ORF6 del PRRSV y la parte N-terminal de ORF5 sin una secuencia puente/enlazante entre las secuencias de ORF6 y ORF5.
Los términos "RSAB" y "R" son intercambiables. El término "R", como se usa en este documento, se refiere a un antígeno de fusión de la fusión de la parte N-terminal del ORF6 del PRRSV y la parte N-terminal de ORF5 sin una secuencia de puente/conector entre las secuencias de ORF6 y ORF5.
Los términos "DGD" y "D" son intercambiables. El término "D" como se usa en este documento se refiere a un antígeno que comprende dos repeticiones de la parte C-terminal del ORF7 del PRRSV.
El término "tratar" o "tratamiento" se refiere a la administración de una cantidad eficaz de la proteína de fusión a un sujeto que lo necesita, que tiene cáncer o infección, o un síntoma o predisposición a dicha enfermedad, con el fin de curar, aliviar, reducir, remediar, mejorar o prevenir la enfermedad, los síntomas o la predisposición a esta. Dicho tema puede ser identificado por un profesional de la salud en base a los resultados de cualquier método de diagnóstico apropiado.
El término "una cantidad eficaz" se refiere a la cantidad de un compuesto activo que se requiere para conferir un efecto terapéutico sobre el sujeto tratado. Las dosis eficaces variarán, como reconocen los expertos en el arte, dependiendo de la ruta de administración, el uso de excipientes y la posibilidad de uso conjunto con otro tratamiento terapéutico.
Ejemplos
Métodos
Síntesis de los antígenos de fusión DRMP y MDPR
Las secuencias de ADN que codifican los antígenos de fusión DRMP (SEQ ID NO: 52), MDPR (SEQ ID NO: 53) y el antígeno ORF2 del PCV2 (SEQ ID NO: 20) se sintetizaron respectivamente y se clonaron adicionalmente en los plásmidos pTAC-2- PE313-NESK o pTAC-2-RAPl-PEt268-313-K3. Todas las secuencias sintetizadas fueron optimizadas para el crecimiento de E. coli. Los respectivos cebadores directo e inverso se usaron en PCR para la amplificación de ADN DRMP o MDPR. El fragmento de ADN amplificado fue digerido por EcoRI y XhoI, luego fue ligado al vector indicado. La proteína de fusión PE313-PCV2-NESK se clonó de manera similar.
La tabla 1 muestra las secuencias de los cebadores directo e inverso usados para la clonación en plásmidos. Las letras en negrita indican el sitio de corte EcoRI; las letras en cursiva indican el sitio de corte SalI; las letras en cursiva y negrita indican el sitio de corte XhoI; las letras subrayadas indican la secuencia del antígeno.
Tabla 1
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Ejemplo 1
Construcción de vectores de expresión
La figura 1A muestra que PE contiene 3 dominios (I, II y III). PE407 es la región desde a.a. 1 hasta a.a 407 de PE. PE107 no contiene el dominio III citotóxico y, por lo tanto, contiene los dominios I y II. PE313 es la región desde a.a. 1 hasta a.a. 313 de PE. Por lo tanto, PE313 contiene solo el dominio la y una región N-terminal parcial del dominio II de PE.
Las figuras 1B-C muestran construcciones de vectores de expresión, cada uno de los cuales comprende un dominio de unión a células presentadoras de antígeno (APC), un péptido de translocación, un antígeno, con (panel inferior) o sin (panel superior) una señal de exportación nuclear (NES) ; y una secuencia de retención del retículo endoplásmico (ER) (panel superior, K3 o panel inferior, K), estando ubicada la secuencia de retención ER en el C-terminal de la proteína de fusión. Los plásmidos pTac-2-PE313-NESK, pTac-2-PE407-K3, pTac-2-RAP1-PE268-313-NESK y pTac-2-RAP1-PE268-313-K3 se generaron de la siguiente manera: Los fragmentos NdeIPE313-(Ec°RIXh°I)-NESKXhDI, NdeIPE407JEcoRI,:xhoI)-K3Xh°I, NdeIRAP1 -(EcoRI)-PE268-313-(EcoRI)’ XhoI)-NESKXh°I y NdeIRAP1-(EcoRI>-PE268-313-(Ec°RI Xh°I)-K3Xh°I fueron sintetizados por un método de PCR y luego ligados en un enlace posterior de pUC18 con el gen de resistencia a la kanamicina para obtener los respectivos plásmidos.
Un ADN diana que codifica un antígeno o un antígeno de fusión de un patógeno de interés puede insertarse luego en los plásmidos antes mencionados para generar un vector de expresión para la expresión de una proteína de fusión. Por ejemplo, se sintetizó un fragmento de ADN que codifica un antígeno de ORF2 de circovirus porcino tipo 2 (PCV2) (SEQ iD NO: 20) y se insertó en los plásmidos pTac-2-PE313-NESK para generar el vector de expresión PE313-PCV2-NESK (Figura 1F).
Se sintetizaron los siguientes fragmentos de ADN diana:
(i) un ADN diana que codifica un antígeno que comprende dos repeticiones de la parte C-terminal del ORF7 del PRRSV. El antígeno se designa como "DGD" o "D".
(ii) un ADN diana que codifica un antígeno de fusión de la fusión de PRRSV NSP 10 (secuencia de dominio C-terminal) y NSP 11 (secuencia de dominio N-terminal). El antígeno se designa como "M12" o "M".
(iii) un ADN diana que codifica un antígeno de fusión a partir de la fusión de la parte N-terminal del ORF6 del PRRSV y la parte N-terminal de ORF5 sin una secuencia puente/enlazante entre las secuencias ORF6 y ORF5. El antígeno se designa como "RSAB" o "R".
(iv) un ADN diana que codifica un antígeno de fusión a partir de la fusión de la parte N-terminal del ORF6 del PRRSV y la parte N-terminal de ORF5 sin una secuencia puente/enlazante entre las secuencias ORF6 y ORF5. El antígeno se designa como "PQAB" o "P".
Los fragmentos de ADN diana anteriores se insertaron en el plásmido mostrado en el panel superior de la figura 1B para generar proteínas de fusión PE407-M-K3. PE407-P-K3, PE407-R-K3 y PE407-D-K3, respectivamente (Figura 1D). Se sintetizó un fragmento de ADN diana que codifica un antígeno de fusión que comprende los cuatro antígenos D, R, M y P mencionados anteriormente (tales como DRMP, MDPR, etc.) y se insertó en los plásmidos pTac-2-PE313-NESK para generar un vector de expresión que expresa la proteína de fusión PE-DRMP-NESK (Figura 1E), que se designa como (también "PRRSFREE 4-en-1").
Ejemplo 2
Expresión de proteínas
Las células E. coll BL21 que albergan plásmidos para la expresión de proteínas de fusión se cultivaron respectivamente en caldo Luria Bertani que contiene 25 ppm de kanamicina a 37 °C. Cuando el cultivo alcanza la fase logarítmica temprana (A600 = 0.1 a 0.4), se agregó isopropil-1-tio-p-D-galactopiranosido (IPTG) con una concentración final de 0.5 a 2 mM para la inducción. Las células se recogieron después de la inducción después de 4 horas y se almacenaron inmediatamente a -70 °C. Las proteínas de fusión se purificaron mediante extracción con urea como se describió anteriormente (Liao et al., 1995. Appl. Microbiol. Biotechnol. 43: 498-507) y luego fueron replegados por el método de diálisis contra 50X. volumen de solución reguladora TNE (Tris 50 mM, NaCl 50 mM y EDTA 1mM) a 4 °C, durante la noche. Las proteínas replegadas se sometieron a análisis SDS-PAGE y análisis cuantitativos realizados usando el kit de ensayo de proteínas Bradford (Pierce). Los resultados indicaron que la mayoría de las proteínas replegadas eran monómeros en una condición no reducida, lo que indica que las proteínas de fusión se replegaron fácilmente y no se agregaron.
Ejemplo 3
Ensayo de inmunogenicidad de vacunas subunidades de PRRSV
Los ratones se vacunaron con 200 |il de vacuna de subunidades de PRRSV que contenía 30 |ig/inyección de PRRSFREE 4-en-1 o PRRSFREE y adyuvante ISA206 a través de inyección s.c. una vez por semana durante 2 semanas. El grupo de control (placebo) fue inyectado con PBS.
Se sacrificaron todos los ratones 14 días después de la última inmunización, y se recogieron los bazos. Los esplenocitos se aislaron y se cultivaron en una placa de 96 pocillos (105 células/100 |il/pocillo) con o sin la proteína estimulante del antígeno recombinante a 37 °C, durante 72 h. Dependiendo de la vacuna usada en la inmunización, la proteína de antígeno recombinante estimulante usada fue los antígenos PRRSFREE, el antígeno de fusión quimérico PRRSFRKE-4 en uno o el antígeno ORF2 del PCV2 para detectar la respuesta inmune mediada por células específica de antígeno. Se recogió el sobrenadante del cultivo celular y se determinó el interferón gamma (IFN-y) en el sobrenadante mediante el par de anticuerpos de ratón IFN-y (Invitrogen).
Dependiendo de la vacuna usada para la inmunización, los antígenos PRRSFREE, o el antígeno de fusión 4 en uno PRRSFREE, o el antígeno ORF2 del PCV2 se recubrieron en placas ELISA para detectar la respuesta inmune humoral. Después del recubrimiento, las placas se lavaron y bloquearon antes de agregar suero de ratones diluido. Luego se lavaron las placas, se hibridaron con anticuerpo secundario conjugado con HRP seguido de la adición de sustrato TMB. Después de que se detuvo la reacción, el lector de ELISA detectó el resultado.
Ejemplo 4
Respuesta inmune mediada por células (CMI) y respuesta inmune humoral
La figura 2A muestra que la concentración de IFN-y en los grupos vacunados fue mayor que la del grupo control, lo que indica que se indujo una respuesta de CMI en las vacunas. Además, la concentración de IFN-y del grupo que recibió la vacuna 4-en-1 PRRSFREE fue dramáticamente más alta que la del grupo tratado con PRRSFREE. El resultado demuestra que la vacuna PRRSFREE 4-en-1, que estaba compuesta por un solo antígeno fusionado, puede inducir sorprendentemente una respuesta CMI más fuerte que las vacunas PRRSFREE compuestas por cuatro antígenos separados.
La figura 2B muestra que los grupos inmunizados con vacunas tenían títulos de anticuerpos específicos de antígeno más altos que el grupo control. Los ratones vacunados con la vacuna PRRSFREE 4-en-1 tenían un título de anticuerpos más alto que el grupo inmunizado con la vacuna PRRSFREE. El resultado muestra que PRRSFREE 4-en-1 puede inducir una respuesta inmune humoral más fuerte que la vacuna PRRSFREE.
Los datos en las figuras 2A-B indican que PRRSFREE 4-en-1, que contiene una proteína de fusión que comprende un solo antígeno de fusión con fusión de antígenos D, M, P y R, puede provocar una respuesta inmune celular y humoral más fuerte que la vacuna PRRSFREE, que contiene cuatro antígenos individuales separados (esto es, los cuatro antígenos M, M, P, R no están fusionados) con cada antígeno en una proteína de fusión respectiva.
Ejemplo 5
Vacunas combinadas con vacuna de subunidad ORF2 de circovirus porcino tipo 2 (PCV2). Los ratones se vacunaron con vacunas combinadas PBS, PRRSFREE 4-en-uno más PE-PCV2-NESK, o Pr Rs FREE más PE-PCV2-NESK de acuerdo con el programa de inmunización. como se describió anteriormente. La vacuna combinada PRRSFREE 4 en uno más PE-PCV2-NESK contiene proteínas de fusión PE-DRMP-NESK (Figura ID) y PE-PCV2-NESK (Figura IF). La vacuna combinada PRRSFREE más PE-PCV2-NESK contiene 5 proteínas de fusión separadas: (1) PE-DGD-K3, PE-M12-K3, PE-PQAB-K3, PE-RSAB-K3 (Figura ID), y PE-PCV2-NESK (Figura IF). Ejemplo 6
Vacunas combinadas con la vacuna de subunidades ORF2 del PCV2
La figura 3A muestra antígeno específico de PRRSV (antígeno de fusión 4 en 1 PRRSFREE y antígenos PRRSFREE) y la figura 3B muestra respuestas de CMI específicas de PCV2-ORF2. Los datos indican que el grupo de ratones inmunizados con la combinación del antígeno de fusión PRRSFREE 4 en 1 y la vacuna de la subunidad del ORF2 del PCV2 mostró una respuesta CMI más fuerte que la del grupo de ratones inmunizados con la combinación de PRRSFREE (4 antígenos separados) y vacuna de subunidades del ORF2 del PCV2.
La figura 4A muestra respuestas de anticuerpos específicos del antígeno del PRRSV. Se usó un método ELISA para medir los títulos de anticuerpos específicos a antígenos. Para el grupo tratado con la combinación de PE-DRMP-NESK y PE-PCV2-NESK (esto es, dos proteínas de fusión), se usó el antígeno de fusión DRMP para medir el título de anticuerpo específico de antígeno. Para el grupo tratado con la combinación de PRRSFREE y PE-PCV2-NESK (esto es, 5 proteínas de fusión), se usaron cuatro antígenos D, R, M y P para medir el título de anticuerpos específicos de antígeno. Los datos indican que el grupo de ratones inmunizados con la combinación de antígeno de fusión PRRSFREE 4-en-1 y la vacuna de la subunidad ORF2 del PCV2 mostró una respuesta humoral específica de antígeno de fusión PRRSFREE 4-en-1 más fuerte que la del grupo de ratones inmunizados con la combinación de PRRSFREE (4 antígenos separados) y la vacuna de la subunidad del ORF2 del PCV2 (Figura 4A).
La figura 4B muestra respuestas de anticuerpos específicos de antígeno PCV2-ORF2. Sorprendentemente, los ratones inmunizados con la combinación de PRRSFREE (4 antígenos separados) y la vacuna de la subunidad del ORF2 del PCV2 (PE-PCV2-NESK) tenían un título de anticuerpos específico de PCV2 más alto que el grupo inmunizado con la combinación del antígeno de fusión PRRSFREE 4-en-1 (PE-DRMP-NESK) y la vacuna de la subunidad del ORF2 del PCV2 (PE-PCV2-NESK). Los resultados indican que hubo una respuesta inmune humoral específica de antígeno específico de PRRSV y específica de PCV2 entre las dos vacunas combinadas de PRRSV/PCV2.
Está claro que ambos enfoques son eficaces para inducir CMI y respuestas inmunes humorales. La vacuna combinada PRRSV/PCV2 que comprende 2 proteínas de fusión (PE-DRMP-NESK y PE-PCV2-NESK) muestra una mejor eficacia en tres de las cuatro respuestas inmunes examinadas. Este estudio demuestra que la vacuna combinada PRRSV/PCV2 compuesta por el antígeno de fusión quimérico PRRSV y el antígeno ORF2 del PCV2 es una mejor opción que la compuesta por 5 antígenos individuales. Sin embargo, ambos enfoques son útiles para inducir respuestas inmunes en un animal.
Ejemplo 7
Fusión de dos antígenos v. Fusión de 4 antígenos
Se inyectaron tres grupos de ratones hembra C57BL/6 de 6 semanas de edad (3 ratones por grupo) por vía subcutánea con (1) 15 |ig de proteína PE-DR-NESK, (2) una combinación de proteínas 15 |ig de PE-DR-NESK y 15 |ig PE-MP-NESK, o (3) 30 |ig de PE-DRMP-NESK, en 200 |il de ISA206 al 50% a intervalos semanales tres veces. Los ratones se sacrificaron 1 semana después de la última inmunización y se recogieron los esplenocitos. Los esplenocitos se estimularon con 4 antígenos PRRSV (M12, DgD, PQAB y RSAB, 2.5 |ig/ml de cada uno) durante 72 horas, y se detectaron IFN-y en los sobrenadantes libres de células de cada grupo usando el kit ELISA. La figura 5 muestra que los ratones inmunizados con PE-DRMP-NESK mostraron la mayor respuesta de CMI entre tres grupos. Ejemplo 8
Inmunidad celular en cerdos
A los cerdos SPF de cinco semanas de edad (2-4 cerdos por grupo) se les inyectó por vía intramuscular una de las siguientes vacunas: (1) PRRSFREE, (2) PE-DRMP-NESK, (3) PE-MDPR-NESK, (4) RAP1-PE268-313-DRMP-K3, (5) RAP1-PE268-313-MDPR-K3 en 2 ml de ISA206 al 50% o (6) p BS como placebo, dos veces a intervalos semanales. La figura 6 muestra diseños de estas vacunas. El antígeno en cada inyección fue de 300 |ig en 2 ml de ISA206 al 50%. Se recogieron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de cerdos vacunados en la semana 3 después de la última inmunización. Dependiendo de la vacuna usada en la inmunización, los PBMC se estimularon con antígenos PRRSFREE (M12, DgD, PQAB y RSAB, 2.5 ug/ml de cada uno), PE-DRMP-NESK, PE-MDPR-NESK, RAP1-PE268-313-DRMP-K3, o RAP1-PE268-313-MDPR-K3 durante 72 horas, luego se detectaron IFN-y en los sobrenadantes libres de células de cada grupo usando el kit ELISA. La figura 7 muestra IFN-y secretado por PBMC de cerdos vacunados después de la estimulación. Se observó que las vacunas que comprenden antígenos de fusión podrían inducir una mayor secreción de IFN-y que el grupo placebo.
Ejemplo 9
Estudios de viremia en cerdos
A los cerdos SPF de cinco semanas de edad (2-4 cerdos por grupo) se les inyectó por vía intramuscular una de las siguientes vacunas: (1) PRRSFREE, (2) PE-DRMP-NESK, (3) PE-MDPR-NESK, (4) RAP1-PE268-313-DRMP-K3, (5) RAP1-PE268-313-MDPR-K3 en 2 ml de IsA206 al 50% o (6) PbS como placebo, dos veces a intervalos semanales. El antígeno en cada inyección fue de 300 |ig en 2 ml de ISA206 al 50%. Los cerdos vacunados fueron desafiados intranasalmente con 2 X 105 TCID50 de PRRSV a las tres semanas después de la última inmunización. Se recogieron muestras de sangre semanalmente. Los ARN virales se extrajeron de los sueros y se cuantificaron usando PCR en tiempo real SYBR® Green de una sola etapa para determinar los niveles de viremia. Los resultados experimentales indicaron que las vacunas que comprenden antígenos de fusión podrían reducir la carga del virus. La tabla 2 muestra las SEQ ID NOs. de péptidos usados para fabricar diversas proteínas de fusión.
Tabla 2
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína de fusión que comprende:
(a) un dominio de unión a células presentadoras de antígeno (APC) ubicado en el N-terminal de la proteína de fusión, en la que el dominio de unión a APC es el dominio Ia de unión a exotoxina A de Pseudomonas (PE);
(b) un péptido de translocación que tiene de 34-112 residuos de aminoácidos de longitud, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, 2, 3 o 6, ubicado en el C-terminal del dominio de unión a APC;
(c) un antígeno de fusión que comprende:
(i) un antígeno ORF7 del virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV);
(ii) un antígeno ORF1b del PRRSV;
(iii) un antígeno ORF6 del PRRSV; y
(iv) un antígeno ORF5 del PRRSV;
(d) una señal de exportación nuclear que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, ubicada en el C-terminal del antígeno de fusión o entre el péptido de translocación y el antígeno de fusión; y
(e) una secuencia de retención del retículo endoplásmico, ubicada en el C-terminal del antígeno de fusión cuando la señal de exportación nuclear está ubicada entre el péptido de translocación y el antígeno de fusión, o ubicada en el C-terminal de la señal de exportación nuclear cuando la señal de exportación nuclear está ubicada en el C-terminal del antígeno de fusión;
en la que el antígeno de fusión no comprende secuencias de proteínas de ORF7, ORF6, ORF5 y ORF1b de longitud completa.
2. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que el antígeno ORF7 u ORF1b está ubicada en el N-terminal del antígeno ORF6, y el antígeno ORF5 está ubicado en el C-terminal del antígeno ORF6.
3. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que el antígeno de fusión comprende dos repeticiones en tándem del antígeno ORF7.
4. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que el antígeno ORF5 está ubicado en el C-terminal del antígeno ORF6.
5. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que el antígeno ORF6 comprende la secuencia de aminoácidos de la parte N-terminal del ORF6 del PRRSV y el antígeno ORF5 comprende la secuencia de aminoácidos de la parte N-terminal del ORF5 del PRRSV, y el antígeno de fusión no comprenden las secuencias de aminoácidos de la parte C-terminal de ORF6 y ORF5.
6. La proteína de fusión de la reivindicación 5, en la que el antígeno ORF1b comprende la secuencia de aminoácidos de la parte C-terminal de ORF1b NSP 10 y la secuencia de aminoácidos de la parte N-terminal del ORF1b NSP 11, y el antígeno de fusión carece de las secuencias de aminoácidos de la parte N-terminal y C-terminal del ORF1b.
7. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 o 28.
8. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que el péptido de translocación tiene de 34-61 residuos de aminoácidos de longitud.
9. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la secuencia de retención del retículo endoplásmico comprende la secuencia de aminoácidos KDEL (SEQ ID NO: 15) sin una repetición en tándem de los aminoácidos KDEL.
10. La proteína de fusión de la reivindicación 9, en la que la señal de exportación nuclear y la secuencia de retención ER forman un péptido de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.
11. Una composición que comprende:
(i) la proteína de fusión de la reivindicación 1; y
(ii) una proteína de fusión de circovirus porcino tipo 2 (PCV2), que comprende:
(a) un dominio de unión a la célula presentadora de antígeno (APC) o un dominio de unión al receptor CD91, ubicado en el N-terminal de la proteína de fusión, en el que el dominio de unión a APC o el dominio de unión al receptor CD91 se selecciona del grupo que consiste en dominio III de proteína-1 asociada al receptor (RAP1), proteína asociada a receptor de alfa-2-macroglobulina (A2M), HIV-Tat, proteínas de choque térmico y dominio la de unión a exotoxina A de Pseudomonas;
(b) un péptido de translocación que tiene una longitud de 34-112 residuos de aminoácidos, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, 2, 3 o 6, ubicada en el C-terminal del dominio de unión a APC o el dominio de unión al receptor CD91; y
(c) un antígeno ORF2 del PCV2;
(d) una señal de exportación nuclear que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, ubicada entre el antígeno ORF2 del PCV2 y la secuencia de retención del retículo endoplásmico o entre el péptido de translocación y el antígeno ORF2 del PCV2; y
(e) una secuencia de retención del retículo endoplásmico, ubicada en el C-terminal de la proteína de fusión del PCV2 cuando la señal de exportación nuclear está ubicada entre el péptido de translocación y el antígeno ORF2 del PCV2, o ubicada en el C-terminal de la señal de exportación nuclear cuando la señal de exportación nuclear está ubicada en el C-terminal del antígeno ORF2 del PCV2;
en la que el antígeno ORF2 del PCV2 comprende la secuencia de aminoácidos de la parte C-terminal de la proteína del o Rf 2 del PCV2, y la proteína de fusión del PCV2 no comprende la secuencia de aminoácidos de la parte N-terminal de la proteína del Or F 2 del PCV2.
12. La composición de la reivindicación 11, en la que la proteína de fusión de circovirus porcino tipo 2 (PCV2) comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31.
13. Una proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en la que el antígeno de fusión comprende:
(i) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, 23 o 33;
(ii) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24;
(iii) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; y
(iv) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26.
14. Una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de fusión como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 para su uso en la inducción de respuestas humorales y mediadas por células específicas de antígeno contra el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV) en un sujeto en necesidad de los mismos.
15. Una composición según la reivindicación 11 o 12 para su uso en la inducción de respuestas humorales y mediadas por células específicas de antígeno contra PRRSV y PCV2 en un sujeto que lo necesite.
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