ES2789073T3 - Método de fabricación de una proteína terapéutica - Google Patents
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Abstract
Un método de fabricación de una proteína terapéutica, que comprende: transfectar una célula auxótrofa para colesterol y auxótrofa para glutamina con (i) un ácido nucleico que codifica una proteína que restaura la biosíntesis de colesterol en la célula; (ii) un ácido nucleico que codifica una proteína que restaura la biosíntesis de glutamina en la célula; (iii) un ácido nucleico que comprende un gen de resistencia a antibióticos aminoglucosídicos; y (iv) un ácido nucleico que codifica la proteína terapéutica.
Description
DESCRIPCIÓN
Método de fabricación de una proteína terapéutica
Antecedentes de la invención
La producción de proteínas terapéuticas usando sistemas de expresión de células de mamíferos es cada vez más importante dentro de la industria de la biotecnología. Se han descrito diversos sistemas de cultivo y transfección, pero cada uno tiene limitaciones significativas.
El documento US 2010/0028940 se refiere a métodos para usar vectores marcadores de selección para generar sistemas de expresión génica estables. Se divulgan, entre otros, métodos que comprenden transfectar células que son auxótrofas para el colesterol con un vector que codifica la 3-cetoesteroide reductasa (KSR).
El documento US 2012/0231500 se refiere a la expresión transitoria de polipéptidos heterólogos en líneas celulares de mamíferos. La línea celular puede comprender un ácido nucleico que codifica el antígeno nuclear 1 del virus de Epstein-Barr y un ácido nucleico que codifica una glutamina sintetasa exógena.
Se puede acceder a un resumen de una disertación de D. Sampey, Development, characterization and optimization of a novel mammalian protein expression system en https://rum.lib.umd.edu/handle/1903/19298; la defensa oral fue en diciembre de 2016.
Sumario de la invención
La invención descrita en el presente documento se basa, en parte, en el descubrimiento de que la combinación de células auxótrofas para colesterol y auxótrofas para glutamina con marcadores de selección adicionales puede aprovecharse en métodos de fabricación de proteínas terapéuticas, para evitar complicaciones inesperadas de fabricación asociadas con células auxótrofas para colesterol (p. ej., baja productividad). La invención, según se reivindica, se refiere a un método de fabricación de una proteína terapéutica, que comprende: transfectar una célula auxótrofa para colesterol y auxótrofa para glutamina con (i) un ácido nucleico que codifica una proteína que restaura la biosíntesis de colesterol en la célula; (ii) un ácido nucleico que codifica una proteína que restaura la biosíntesis de glutamina en la célula; (iii) un ácido nucleico que comprende un gen de resistencia a antibióticos aminoglucosídicos; y (iv) un ácido nucleico que codifica la proteína terapéutica.
En una realización, la célula es una célula NSO.
En algunas realizaciones, la proteína terapéutica es un anticuerpo. En algunas realizaciones, la proteína terapéutica es una proteína de fusión. En algunas realizaciones, la proteína terapéutica es una proteína de fusión que contiene Fc.
En algunas realizaciones, en la etapa de transfección, la célula se transfecta con ácidos nucleicos (iii) que codifican una cadena ligera de anticuerpo y una cadena pesada de anticuerpo. En algunas realizaciones, el ácido nucleico (i) codifica una 3-cetoesteroide reductasa. En algunas realizaciones, el ácido nucleico (ii) codifica una glutamina sintetasa.
En algunas realizaciones, un primer vector de expresión comprende ácidos nucleicos (i) y (iv) y un segundo vector de expresión comprende ácidos nucleicos (ii). En algunas realizaciones, un primer vector de expresión comprende ácido nucleico (i) y un segundo vector de expresión comprende ácidos nucleicos (ii) y (iii). En algunas realizaciones, la transfección del primer vector de expresión se realiza antes de la transfección del segundo vector de expresión. En algunas realizaciones, la transfección del primer vector de expresión se realiza simultáneamente con la transfección del segundo vector de expresión.
En algunas realizaciones, la célula se cultiva (p. ej., después de la transfección de ácido nucleico (i)) en ausencia de colesterol introducido de manera exógena. En algunas realizaciones, la célula se cultiva (p. ej., después de la transfección de ácido nucleico (ii)) en ausencia de glutamina introducida de manera exógena. En algunas realizaciones, la célula se cultiva (p. ej., durante y/o después de la transfección de ácido nucleico (ii)) en presencia de un inhibidor de la glutamina sintetasa (p. ej., sulfoximina de metionina). En algunas realizaciones, la célula se cultiva (p. ej., durante y/o después de la transfección de ácido nucleico (i)) en presencia de un inhibidor de la 3-cetoesteroide reductasa.
En algunas realizaciones, la célula se cultiva en ausencia de colesterol introducido de manera exógena y en ausencia de glutamina introducida de manera exógena. En algunas realizaciones, la célula se cultiva en ausencia de colesterol introducido de manera exógena, en ausencia de glutamina introducida de manera exógena y en presencia de un inhibidor de la glutamina sintetasa (p. ej., sulfoximina de metionina). En algunas realizaciones, la célula se cultiva (p. ej., después de la transfección de ácido nucleico (i)) en ausencia de colesterol introducido de manera exógena y la célula se cultiva (p. ej., después de la transfección de ácido nucleico (ii)) en ausencia de glutamina introducida de
manera exógena.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico (ii) codifica una glutamina sintetasa, una dihidrofolato reductasa (DHFR) o uno o más genes de resistencia a antibióticos (p. ej., neomicina, blasticidina, higromicina, puromicina, zeocina, ácido micofenólico).
En algunas realizaciones, un primer vector de expresión comprende ácidos nucleicos (i) y (iv) y un segundo vector de expresión comprende ácidos nucleicos (ii). En algunas realizaciones, un primer vector de expresión comprende ácido nucleico (i) y un segundo vector de expresión comprende ácidos nucleicos (ii) y (iv). En algunas realizaciones, la transfección del primer vector de expresión se realiza antes de la transfección del segundo vector de expresión. En algunas realizaciones, la transfección del primer vector de expresión se realiza simultáneamente con la transfección del segundo vector de expresión.
En algunas realizaciones, la célula se cultiva (p. ej., después de la transfección de ácido nucleico (i)) en ausencia de colesterol introducido de manera exógena. En algunas realizaciones, la célula se cultiva (p. ej., durante y/o después de la transfección de ácido nucleico (i)) en presencia de un inhibidor de la 3-cetoesteroide reductasa. En algunas realizaciones, la célula se cultiva en ausencia de colesterol introducido de manera exógena.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico (ii) codifica el gen de resistencia a la neomicina de Tn5 que codifica un aminoglucósido 3'-fosfotransferasa (APH 3' II).
En algunas realizaciones, tanto el primer como el segundo vector de expresión contienen HC y LC, un vector contiene KSR y el otro vector contiene GS u otro gen de resistencia a antibióticos. En algunas realizaciones, hay tres vectores separados (p. ej., para selección triple), en donde los tres vectores contienen HC y LC; un primer vector contiene KSR, un segundo vector contiene GS y un tercer vector contiene cualquier gen de resistencia a antibióticos, p. ej., NEO. En algunas realizaciones, la célula se cultiva (p. ej., después de la transfección de ácido nucleico (i)) en ausencia de colesterol introducido de manera exógena. En algunas realizaciones, la célula se cultiva (p. ej., durante y/o después de la transfección de ácido nucleico (ii)) en presencia de un antibiótico aminoglucosídico (p. ej., G418). En algunas realizaciones, la célula se cultiva (p. ej., durante y/o después de la transfección de ácido nucleico (i)) en presencia de un inhibidor de la 3-cetoesteroide reductasa.
En algunas realizaciones, la célula se cultiva en ausencia de colesterol introducido de manera exógena. En algunas realizaciones, la célula se cultiva en ausencia de colesterol introducido de manera exógena y en presencia de un antibiótico aminoglucosídico (p. ej., G418).
En algunas realizaciones, el ácido nucleico (ii) codifica el gen de resistencia a la blasticidina de Bacillus cereus (que codifica blasticidina-S desaminasa).
En algunas realizaciones, la célula se cultiva en ausencia de colesterol introducido de manera exógena y en presencia de un antibiótico de nucleósido peptidílico, un antibiótico aminoglucosídico (p. ej., blasticidina).
En algunas realizaciones, el ácido nucleico (ii) codifica una higromicina B fosfotransferasa.
En algunas realizaciones, la célula se cultiva (p. ej., después de la transfección de ácido nucleico (i)) en ausencia de colesterol introducido de manera exógena. En algunas realizaciones, la célula se cultiva (p. ej., durante y/o después de la transfección de ácido nucleico (ii)) en presencia de un antibiótico aminoglucosídico (p. ej., higromicina B). En algunas realizaciones, la célula se cultiva (p. ej., durante y/o después de la transfección de ácido nucleico (i)) en presencia de un inhibidor de la 3-cetoesteroide reductasa.
En algunas realizaciones, la célula se cultiva en ausencia de colesterol introducido de manera exógena y en presencia de un antibiótico de nucleósido peptidílico, un antibiótico aminoglucosídico (p. ej., higromicina B).
En algunas realizaciones, el ácido nucleico (ii) codifica una puromicina N-acetil-transferasa.
En algunas realizaciones, la célula se cultiva (p. ej., durante y/o después de la transfección de ácido nucleico (ii)) en presencia de un antibiótico aminonucleosídico (p. ej., puromicina). En algunas realizaciones, la célula se cultiva (p. ej., durante y/o después de la transfección de ácido nucleico (i)) en presencia de un inhibidor de la 3-cetoesteroide reductasa.
En algunas realizaciones, la célula se cultiva en ausencia de colesterol introducido de manera exógena y en presencia de un antibiótico de nucleósido peptidílico, un antibiótico aminonucleosídico (p. ej., puromicina).
En algunas realizaciones, el ácido nucleico (ii) codifica un producto del gen Sh ble.
En algunas realizaciones, la célula se cultiva (p. ej., durante y/o después de la transfección de ácido nucleico (ii)) en
presencia de un antibiótico de glucopéptido quelado con cobre (p. ej., zeocina).
En algunas realizaciones, el ácido nucleico (ii) codifica el gen de la xantina-guanina fosforribosiltransferasa (Ecogpt). En algunas realizaciones, la célula se cultiva (p. ej., durante y/o después de la transfección de ácido nucleico (ii)) en presencia de MPA.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico (ii) codifica el gen de la xantina-guanina fosforribosiltransferasa (Ecogpt). La invención presenta un método de fabricación de una proteína terapéutica, comprendiendo el método: cultivar una célula auxótrofa para colesterol y auxótrofa para glutamina; transfectar la célula con (i) un ácido nucleico que codifica una proteína que es capaz de restaurar la biosíntesis de colesterol en la célula (p. ej., KSR); (ii) un ácido nucleico que codifica una proteína que es capaz de restaurar la biosíntesis de glutamina en la célula (p. ej., glutatión sintetasa); (iii) un nucleico que comprende un gen de resistencia a antibióticos aminoglucosídicos que codifica una proteína que es capaz de proporcionar resistencia a G418 (p. ej., gen de resistencia a neomicina); y (iv) un ácido nucleico que codifica la proteína terapéutica (p. ej., un anticuerpo, p. ej., una cadena pesada y una cadena ligera); cultivar la célula en condiciones adecuadas para la expresión de la proteína terapéutica; y aislar y/o purificar la proteína terapéutica. En algunas realizaciones, se transfecta en primer lugar ácido nucleico (iii) y durante y/o después de la transfección, se añade G418 al medio de cultivo celular. En algunas realizaciones, se transfecta en primer lugar ácido nucleico (iii) y durante y/o después de la transfección, se añade G418 al medio de cultivo celular; y se transfecta en segundo lugar ácido nucleico (ii) y durante y/o después de la transfección el colesterol está ausente del medio de cultivo celular. En algunas realizaciones, se transfecta en primer lugar ácido nucleico (iii) y durante y/o después de la transfección, se añade G418 al medio de cultivo celular; y se transfecta en segundo lugar ácido nucleico (ii) y durante y/o después de la transfección el colesterol está ausente del medio de cultivo celular (p. ej., colesterol añadido de manera exógena); y se transfecta en tercer lugar ácido nucleico (i) y durante/después de la transfección la glutamina está ausente del medio de cultivo celular (p. ej., glutamina añadida de manera exógena) (opcionalmente, se añade sulfoximina de metionina (MSX) al medio de cultivo celular).
En algunas realizaciones, se transfectan simultáneamente ácido nucleico (ii) y (i), en donde se añade G418 al medio de cultivo celular y el medio de cultivo celular no contiene colesterol (p. ej., colesterol añadido de manera exógena). En algunas realizaciones, se transfectan simultáneamente ácidos nucleicos (i), (ii), (iii) y (iv), en donde el G418 se añade al medio de cultivo celular y el medio de cultivo celular no contiene colesterol (p. ej., colesterol añadido de manera exógena) y no contiene glutamina (p. ej., glutamina añadida de manera exógena) (opcionalmente se añade sulfoximina de metionina (MSX) al medio de cultivo celular). En algunas realizaciones, se incorpora ácido nucleico (iv) en la misma secuencia de ácido nucleico (p. ej., vector) que cada uno de (i), (ii) y (iii). En algunas realizaciones, se incorpora ácido nucleico (iv) en la misma secuencia de ácido nucleico (p. ej., vector) que cada uno de (i) y (ii); (i) y (iii); o (ii) y (iii). En algunas realizaciones, el ácido nucleico (iv) codifica la cadena pesada y ligera de un anticuerpo terapéutico. En algunas realizaciones, la cadena ligera se incorpora en la misma secuencia de ácido nucleico (p. ej., vector) que cada uno de (i) y (ii); (i) y (iii); (ii) y (iii); o (i), (ii) y (iii). En algunas realizaciones, la cadena pesada se incorpora en la misma secuencia de ácido nucleico (p. ej., vector) que cada uno de (i) y (ii); (i) y (iii); (ii) y (iii); o (i), (ii) y (iii). En algunas realizaciones, la cadena ligera y la cadena pesada se incorporan en la misma secuencia de ácido nucleico (p. ej., vector) que cada uno de (i) y (ii); (i) y (iii); (ii) y (iii); o (i), (ii) y (iii).
En algunas realizaciones, cualquiera de los ácidos nucleicos (i), (ii), (iii) y (iv) se incorporan en un único ácido nucleico (p. ej., un único vector). Por ejemplo, en algunas realizaciones, los ácidos nucleicos (i) y (ii); (i) y (iii); (i) y (iv); (i), (ii) y (iii); (i), (ii), (iii) y (iv); (ii) y (iii); o (ii) y (iv); (iii) y (iv); se incorporan en un único ácido nucleico. En algunas realizaciones, el ácido nucleico (iv) comprende dos ácidos nucleicos separados, uno que codifica una cadena pesada y otro que codifica una cadena ligera de un anticuerpo terapéutico. En algunas realizaciones, la cadena pesada se incorpora en otro ácido nucleico, p. ej., (i), (ii) o (iii). En algunas realizaciones, la cadena ligera se incorpora en otro ácido nucleico, p. ej., (i), (ii) o (iii).
En una realización, la célula es una célula NSO.
En algunas realizaciones, la proteína terapéutica es un anticuerpo. En algunas realizaciones, la proteína terapéutica es una proteína de fusión. En algunas realizaciones, la proteína terapéutica es una proteína de fusión que contiene Fc.
En algunas realizaciones, en la etapa de transfección, la célula se transfecta con ácidos nucleicos (iv) que codifican una cadena ligera de anticuerpo y una cadena pesada de anticuerpo. En algunas realizaciones, el ácido nucleico (i) codifica una 3-cetoesteroide reductasa. En algunas realizaciones, el ácido nucleico (ii) codifica una glutamina sintetasa. En algunas realizaciones, el ácido nucleico (iii) codifica el gen de resistencia a la neomicina.
En algunas realizaciones, un primer vector de expresión comprende ácido nucleico (i) y (iv) y un segundo vector de expresión comprende ácidos nucleicos (ii). En algunas realizaciones, un primer vector de expresión comprende ácido nucleico (i) y un segundo vector de expresión comprende ácidos nucleicos (ii) y (iv). En algunas realizaciones, la
transfección del primer vector de expresión se realiza antes de la transfección del segundo vector de expresión. En algunas realizaciones, la transfección del primer vector de expresión se realiza simultáneamente con la transfección del segundo vector de expresión.
En algunas realizaciones, la célula se cultiva (p. ej., después de la transfección de ácido nucleico (i)) en ausencia de colesterol introducido de manera exógena. En algunas realizaciones, la célula se cultiva (p. ej., después de la transfección de ácido nucleico (ii)) en ausencia de glutamina introducida de manera exógena. En algunas realizaciones, la célula se cultiva (p. ej., durante y/o después de la transfección de ácido nucleico (ii)) en presencia de un inhibidor de la glutamina sintetasa (p. ej., sulfoximina de metionina). En algunas realizaciones, la célula se cultiva (p. ej., durante y/o después de la transfección de ácido nucleico (i)) en presencia de un inhibidor de la 3-cetoesteroide reductasa.
En algunas realizaciones, la célula se cultiva en ausencia de colesterol introducido de manera exógena y en ausencia de glutamina introducida de manera exógena. En algunas realizaciones, la célula se cultiva en ausencia de colesterol introducido de manera exógena, en ausencia de glutamina introducida de manera exógena y en presencia de un inhibidor de la glutamina sintetasa (p. ej., sulfoximina de metionina). En algunas realizaciones, la célula se cultiva (p. ej., después de la transfección de ácido nucleico (i)) en ausencia de colesterol introducido de manera exógena y la célula se cultiva (p. ej., después de la transfección de ácido nucleico (ii)) en ausencia de glutamina introducida de manera exógena.
Breve descripción de las figuras
La FIG. 1 representa un protocolo ilustrativo de los métodos descritos en el presente documento.
La FIG. 2 representa la secuencia de aminoácidos de referencia del NCBI de la 3-cetoesteroide reductasa (NP_057455) (SEQ ID NO: 1).
La FIG. 3 representa la secuencia de ARNm de referencia del NCBI de HSD17p7 (NM_016371.3) (SEQ ID NO: 2).
La FIG.4 representa la secuencia de aminoácidos de referencia del NCBI de la glutamina sintetasa (NP_002056.2) (SEQ ID NO: 3).
La FIG. 5A-E representa la secuencia de ARNm de referencia del NCBI de la glutamina sintetasa (NM_002065.6) (SEQ ID NO: 4).
La FIG. 6 representa la secuencia de aminoácidos de referencia del NCBI de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (NP_000782.1) (SEQ ID NO: 5).
La FIG. 7A-B representa la secuencia de ARNm de referencia del NCBI de DHFR (NM_000791.3) (SEQ ID NO: 6).
La FIG. 8 representa la estabilidad de las proteínas producidas usando el sistema de cultivo celular 3-KSR. La FIG.
8 enumera el título final de proteínas en el sobrenadante de células 3-KSR para 10 clones de células 3-KSR diferentes. Cuatro clones (3-261,3-330, 3-351,3-497) demostraron título de proteínas elevado. Sin embargo, como se muestra adicionalmente en la FIG. 8 , el clon de 3-KSR 3-351, demostró una disminución de la productividad específica de célula.
La FIG. 9 es un gráfico de líneas que representa la selección celular usando Neo (G418 100 pg/ml o 200 pg/ml). El gráfico representa la viabilidad celular frente a los días después la recuperación.
La FIG. 10 es un gráfico de líneas que representa la selección celular usando glutatión sintetasa (GS) (reduce la concentración de glutamina de 2 mM a 0 mM o de 0,5 mM a 0 mM, respectivamente). El gráfico representa la viabilidad celular frente a los días después la recuperación.
La FIG. 11 es un gráfico de líneas que representa la selección celular usando 3-KSR, neo y GS como selección triple. El gráfico representa la viabilidad celular frente a los días después la recuperación. El gen neo puede conferir resistencia a G418. La concentración de G418 en NSO es de 100 pg/ml y 200 pg/ml; reducen la concentración de glutamina de 2 mM a 0 mM o de 0,5 mM a 0 mM. También se puede usar un inhibidor de MSX para inhibir la actividad de GS.
Descripción detallada de la invención
En determinados sistemas de producción de proteínas recombinantes, tales como sistemas de células hospedadoras NSO, la auxotrofía para colesterol se aprovecha incorporando un gen de 3-cetoesteroide reductasa (3-KSR) en el vector que codifica la proteína terapéutica y se seleccionan células recombinantes eliminando el colesterol del medio de cultivo (documento US 2010/0028940). Sin embargo, los inventores de la presente divulgación descubrieron inesperadamente que este sistema puede adolecer de baja productividad (p. ej., producto proteico por célula al día) y títulos de proteínas bajos debido a la dificultad de amplificación en esta línea celular (véase, p. ej., FIG. 8). En otros sistemas de células hospedadoras NSO, la auxotrofía para glutamina se aprovecha incorporando un gen de glutamina sintetasa (GS) en el vector que codifica la proteína terapéutica y las células transfectadas se seleccionan eliminando la glutamina del medio de cultivo. Además, se puede añadir un inhibidor de GS al medio de cultivo para impulsar la selección hacia la incorporación de múltiples copias del gen GS y, por lo tanto, el gen que codifica la proteína de interés (Barnes et al. Cytotechnology. 2000. Advances in animal cell recombinant protein production: GS-NS0 expression system Feb; 32 (2): 109-23). Cada sistema tiene limitaciones diferentes. Se describen en el presente documento métodos alternativos de fabricación de productos terapéuticos en, p. ej., un sistema de células hospedadoras NSO.
Una célula "auxótrofa para glutamina" como se usa en el presente documento se define como una célula que no sintetiza glutamina o no sintetiza suficiente glutamina para ser capaz de sobrevivir y crecer en medio de cultivo celular sin glutamina.
Una célula "auxótrofa para colesterol" como se usa en el presente documento se define como una célula que no sintetiza colesterol o no sintetiza suficiente colesterol para ser capaz de sobrevivir y crecer en medio de cultivo celular sin colesterol.
"Restaurar la biosíntesis de glutamina", como se usa en el presente documento, significa aumentar el nivel de biosíntesis de glutamina en una célula (desde el nivel en una célula auxótrofa para glutamina), al menos hasta un nivel que permita a la célula sobrevivir y crecer en medio de cultivo celular sin glutamina.
"Restaurar la biosíntesis de colesterol", como se usa en el presente documento, significa aumentar el nivel de biosíntesis de colesterol en una célula (desde el nivel en una célula auxótrofa para colesterol), al menos hasta un nivel que permita a la célula sobrevivir y crecer en medio de cultivo celular sin colesterol.
"Sobrevivir y crecer" o "supervivencia y crecimiento", como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de una célula o cultivo de células para mantener más de 60 % de viabilidad celular durante el crecimiento en fase logarítmica, medida mediante exclusión con azul tripano.
3-cetoesteroide reductasa (KSR)
La enzima 3-cetoesteroide reductasa está codificada por el gen HSD17p7 y actúa como una 3-cetoesteroide reductasa en la biosíntesis del colesterol (Marijanovic et al., Mol Endocrinol. septiembre de 2003; 17 (9): 1715-25). Véase FIG. 2 (SEQ ID NO: 1) y FIG. 3 (SEQ ID NO: 2), respectivamente, para la secuencia de aminoácidos (NP_057455) y ARNm (NM_016371.3) de referencia del NCBI.
Glutamina sintetasa (GS)
La enzima glutamina sintetasa codificada por el gen de glutamina sintetasa cataliza la síntesis de glutamina a partir de glutamato y amoníaco (Eisenberg et al., Biochimica et Biophysica Acta, 2000, vol. 1477, 122-145). Se han encontrado varias variantes de transcrito con cortes y empalmes alternativos para este gen. Véase FIG. 4 (SEQ ID NO: 3) y FIG. 5 (SEQ ID NO: 4), respectivamente, para la secuencia de aminoácidos (NP_002056.2) y ARNm (NM_002065.6) de referencia del NCBI.
Dihidrofolato reductasa (DHFR)
La enzima DHFR está codificada por el gen DHFR y convierte dihidrofolato en tetrahidrofolato, una lanzadera de grupo metilo necesaria para la síntesis de novo de purinas, ácido timidílico y determinados aminoácidos. Se han encontrado varias variantes de transcrito con cortes y empalmes alternativos para este gen. Véase FIG. 6 (SEQ ID NO: 5) y FIG.
7 (SEQ ID NO: 6), respectivamente, para la secuencia de aminoácidos (NP_000782.1) y ARNm (NM_000791.3) de referencia del NCBI.
Marcadores de selección de genes de resistencia a antibióticos
Los genes de resistencia a antibióticos son marcadores de selección positiva usados habitualmente en el cultivo de células de mamíferos (véase, p. ej., Antibody Expression and Production, editor Mohamed Al-Rubeai, Springer Netherlands, Springer Science Business Media B.V., ISBN 978-94-007-1256-0; Cell Line Development, Mohamed Al-Rubeai 11 de agosto de 2009 Springer Science & Business Media). Los genes de resistencia a antibióticos ilustrativos incluyen, pero sin limitación, genes que confieren resistencia al gen de resistencia a neomicina, blasticidina, higromicina, puromicina, zeocina, ácido micofenólico. Un experto en la materia conocería genes de resistencia a antibióticos adecuados e inhibidores correspondientes para su uso en selección celular.
En el método de la invención, se usa un gen de resistencia a antibióticos aminoglucosídicos.
Tabla 1. Marcadores de selección de antibióticos ilustrativos
continuación
Vectores, células hospedadoras y producción de proteínas terapéuticas
Las proteínas terapéuticas para su uso en la invención se pueden producir a partir de una célula hospedadora. Una célula hospedadora se refiere a un vehículo que incluye los componentes celulares necesarios, p. ej., orgánulos, que se necesitan para expresar los polipéptidos y construcciones descritos en el presente documento a partir de sus ácidos nucleicos correspondientes. Los ácidos nucleicos se pueden incluir en vectores de ácido nucleico que pueden introducirse en la célula hospedadora mediante técnicas convencionales conocidas en este campo (p. ej., transformación, transfección, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, microinyección directa, infección, etc.). La elección de los vectores de ácido nucleico depende en parte de las células hospedadoras para usar. En general, son células hospedadoras preferidas las de origen procariota (p. ej., bacteriano) o eucariota (p. ej., de mamífero).
Construcción de vector de ácido nucleico y células hospedadoras
Una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de una proteína terapéutica para su uso en la invención puede prepararse mediante diversos métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero sin limitación, mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida) y mutagénesis por PCR. Se puede obtener una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína terapéutica para su uso en la invención usando técnicas convencionales, p. ej., síntesis génica. Como alternativa, una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína terapéutica de tipo silvestre puede mutarse para contener sustituciones de aminoácidos específicas usando técnicas convencionales en este campo, p. ej., mutagénesis QuikChange™. Las moléculas de ácido nucleico pueden sintetizarse usando un sintetizador de nucleótidos o técnicas de PCR.
Se pueden insertar secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína terapéutica para su uso en la invención en un vector capaz de replicar y expresar las moléculas de ácido nucleico en células hospedadoras procariotas o eucariotas. Muchos vectores están disponibles en la técnica y pueden usarse para el fin de la invención. Cada vector puede contener diversos componentes que pueden ajustarse y optimizarse con respecto a compatibilidad con la célula hospedadora particular. Por ejemplo, los componentes del vector pueden incluir, pero sin limitación, un origen de replicación, un gen marcador de selección, un promotor, un sitio de unión al ribosoma, una secuencia señal, la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de interés y una secuencia de terminación de la transcripción.
En un ejemplo, los vectores para su uso en la invención incluyen: un vector que comprende un promotor débil para un gen de selección (p. ej., 3-cetoesteroide reductasa y glutamina sintetasa) y un fuerte promotor para el gen que codifica la proteína de interés (p. ej., un anticuerpo, p. ej., cadena pesada y ligera de un anticuerpo). Los vectores pueden ser linealizados o superenrollados que presentan mejor eficacia de transfección. En algunas realizaciones, se emplea optimización de codones del vector para minimizar el uso de codones infrecuentes en la secuencia codificante y mejorar los rendimientos de producción de proteínas. Se describen vectores ilustrativos para su uso en la invención en Wurm (2004) Nature Biotechnology, vol. 22; número 11: 1393-1398).
En algunas realizaciones, se usan células de mamífero como células hospedadoras. El fenotipo auxótrofo para glutamina y auxótrofo para colesterol puede ser inducido por la manipulación genética de una célula no auxótrofa para glutamina y no auxótrofa para colesterol, incluyendo, por ejemplo, mutación o supresión de un gen necesario para la biosíntesis de glutamina endógena, tal como glutamina sintetasa. Los expertos en la técnica conocen bien métodos habituales de ingeniería genética, p. ej., mutagénesis dirigida, nucleasas de dedos de cinc, ARNhp, transposones, Véase, p. ej., Cytotechnology. Abril de 2007; 53 (1-3): 65-73. Las células de mieloma murino denominadas NSO son células auxótrofas para glutamina y auxótrofas para colesterol conocidas (véase, p. ej., Barnes et al. Cytotechnology.
2000. Advances in animal cell recombinant protein production: GS-NS0 expression system feb; 32 (2): 109-23; y documento US 2010/0028940.
Los ejemplos adicionales de tipos celulares de mamífero que pueden manipularse para usarlos como células hospedadoras incluyen, pero sin limitación, células de riñón embrionario humano (HEK) (p. ej., HEK293, HEK 293F), de ovario de hámster chino (CHO), HeLa, COS, PC3, Vero, MC3T3, NS0, VERY, BHK, MDCK, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D), CRL7030 y HsS78Bst. En otras realizaciones, se usan células E. coli como células hospedadoras para la invención. Los ejemplos de cepas de E. coli incluyen, pero sin limitación, E. coli 294 (ATCC® 31.446), E. coli A 1776 (ATCC® 31.537, E. coli BL21 (DE3) (ATCC® BAA-1025) y E. coli RV308 (ATCC® 31.608). Diferentes células hospedadoras tienen características y mecanismos específicos para el procesamiento y la modificación posteriores a la traducción de productos génicos. Se pueden seleccionar líneas celulares o sistemas hospedadores adecuados para garantizar la modificación y el procesamiento correctos de la proteína terapéutica expresada. Los vectores de expresión descritos anteriormente pueden introducirse en células hospedadoras adecuadas usando técnicas convencionales en este campo, p. ej., transformación, transfección, electroporación, precipitación de fosfato de calcio y microinyección directa. Una vez que los vectores se introducen en células hospedadoras para la producción de proteínas, las células hospedadoras se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados según sea adecuado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Se conocen en la técnica métodos para la expresión de proteínas terapéuticas, véase, por ejemplo, Paulina Balbas, Argelia Lorence (eds.) Recombinant Gene Expression: Reviews and Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press; 2a ed. 2004 (20 de julio de 2004) y Vladimir Voynov y Justin A. Caravella (eds.) Therapeutic Proteins: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) Humana Press; 2a ed. 2012 (28 de junio de 2012).
Producción, recuperación y purificación de proteínas
Se pueden cultivar células hospedadoras usadas para producir una proteína terapéutica para su uso en la invención en medios conocidos en la técnica y adecuados para el cultivo de las células hospedadoras seleccionadas. Los ejemplos de medios adecuados para células hospedadoras de mamífero incluyen medio esencial mínimo (MEM), medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), medio de expresión Expi293™, DMEM con suero bovino fetal complementado (FBS) y RPMI-1640. Los ejemplos de medios adecuados para células hospedadoras bacterianas incluyen caldo de cultivo Luria (LB) más los complementos necesarios, tales como un agente de selección, p. ej., ampicilina. Las células hospedadoras se cultivan a temperaturas adecuadas, tales como de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 39 °C, p. ej., de 25 °C a aproximadamente 37 °C, preferentemente 37 °C, y niveles de CO2 adecuados, tales como de 5 a 10 % (preferentemente 8 %). El pH del medio es, en general, de aproximadamente 6,8 a 7,4, p. ej., 7,0, dependiendo principalmente del organismo hospedador. Si se usa un promotor inducible en el vector de expresión de la invención, se induce expresión de proteínas en condiciones adecuadas para la activación del promotor. Se conocen en la técnica condiciones convencionales de cultivo celular para la producción de una proteína terapéutica, p. ej., véase Butler, Cell Culture and Upstream Processing, Taylor y Francis; 1a edición (25 de mayo de 2007).
La recuperación de proteínas implica normalmente romper la célula hospedadora, generalmente por medios tales como choque osmótico, sonicación o lisis. Una vez que las células se han roto, se pueden eliminar los residuos celulares mediante centrifugación o filtración. Las proteínas se pueden purificar adicionalmente. Un anticuerpo para su uso en la invención puede purificarse por cualquier método conocido en la técnica de purificación de proteínas, por ejemplo, por afinidad de proteína A, otra cromatografía (p. ej., cromatografía en columna de intercambio iónico, afinidad y exclusión por tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial o mediante cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas. (véase Process Scale Purification of Antibodies, Uwe Gottschalk (ed.) John Wiley & Sons, Inc., 2009). En algunos casos, una proteína terapéutica se puede conjugar con secuencias marcadoras, tales como un péptido, para facilitar la purificación. Un ejemplo de una secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido de hexahistidina (marcador de His), que se une a la columna de afinidad de agarosa funcionalizada con níquel con afinidad micromolar. Otros marcadores peptídicos útiles para purificación incluyen, pero sin limitación, el marcador de hemaglutinina "HA", que corresponde a un epítopo procedente de la proteína hemaglutinina de la gripe.
Composiciones y preparaciones farmacéuticas
El método de la invención se puede usar para fabricar composiciones farmacéuticas que incluyen una o más proteínas terapéuticas descritas en el presente documento. Además de una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína terapéutica, las composiciones farmacéuticas pueden contener uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables, que pueden formularse mediante métodos conocidos por los expertos en la materia.
Los vehículos y excipientes aceptables en las composiciones farmacéuticas no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas. Los vehículos y excipientes aceptables pueden incluir tampones, antioxidantes, conservantes, polímeros, aminoácidos y carbohidratos. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar por vía parenteral en forma de una formulación inyectable. Las composiciones farmacéuticas para inyección (es decir, inyección intravenosa) se pueden formular usando una solución estéril o cualquier líquido farmacéuticamente aceptable como vehículo. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitación, agua estéril, solución salina fisiológica y medios de cultivo celular (p. ej., medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), medio de Eagle modificado con a (a-MEM), medio F-12). Se conocen en la técnica métodos de formulación, véase, p. ej., Banga (ed.) Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing and Delivery Systems (2a ed.) Taylor & Francis Group, CRC Press (2006).
La composición farmacéutica se puede formar en una forma de dosis unitaria según sea necesario. La cantidad de componente activo, p. ej., una o más proteínas terapéuticas de la invención incluidas en las preparaciones farmacéuticas es tal que se proporciona una dosis adecuada dentro del intervalo designado (p. ej., una dosis dentro del intervalo de 0,01-500 mg/kg de peso corporal).
Proteínas terapéuticas
Las proteínas terapéuticas que pueden prepararse mediante los métodos descritos en el presente documento incluyen cualquier proteína terapéutica recombinante de interés o biosimilar de la misma, incluyendo, pero sin limitación, anticuerpos (p. ej., anticuerpos monoclonales, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos multiespecíficos), proteínas de fusión (p. ej., fusión de Fc), anticoagulantes, factores sanguíneos, proteínas morfogenéticas óseas, armazones proteicos modificados por ingeniería genética, enzimas, factores de crecimiento, hormonas, factores liberadores de hormonas, interferones, interleucinas y trombolíticos. Las proteínas terapéuticas incluyen proteínas tanto glucosiladas (p. ej., proteínas que tienen al menos una cadena de oligosacáridos) como no glucosiladas.
Los anticuerpos monoclonales ilustrativos incluyen, pero sin limitación, adalimumab, infiliximab, palivizumab, cetuximab, natalizumab, eculizumab, ustekinumab, golimumab, ofatumab, canakinumab, belimumab, alirocumab, mepolizumab, necitumumab, nivolumab, dinutuximab, secukinumab, evolocumab, blinatumomab, pembrolizumab, ramucirumab, vedolizumab, siltuximab, obinutuzumab, trastuzumab, raxibacumab, pertuzumab, brentuximab, ipilimumab, denosumab, tocilizumab, ofatumumab, canakinumab, certolizumab, catumaxomab, ranibizumab, panitumumab, bevacizumab, cetuximab, efalizumab, omalizumab, tositumomab, ibritumomab, alemtuzumab, gemtuzumab, basiliximab, daclizumab, rituximab y abciximab.
Las proteínas de fusión ilustrativas incluyen, pero sin limitación, alefacept, entanercept, abatacept, belatacept, aflibercept, ziv-aflibercept, rilonacept, romiplostim, apocept, trebananib, blisibimod y dulaglutida.
Ejemplos
Ejemplo 1. Fabricación de anticuerpos terapéuticos que utilizan una célula auxótrofa doble
El siguiente ejemplo describe métodos de fabricación de proteínas terapéuticas, tales como anticuerpos, que comprenden la expresión de la proteína terapéutica de interés en una célula auxótrofa para colesterol y auxótrofa para glutamina. El método permite convenientemente el aumento en la amplificación y el número de copias del gen de interés y la producción en ausencia de colesterol, que es muy insoluble en soluciones acuosas y con el que es muy difícil trabajar. El método ilustrativo se describe adicionalmente en la FIG. 1.
Las células auxótrofas para glutamina y auxótrofas para colesterol, tales como células NSO, se transfectan con un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una 3-cetoesteroide reductasa (3-KSR). Durante y después de esta primera transfección, las células se mantienen en medio de cultivo sin colesterol para seleccionar las células que expresan el primer vector, produciendo de este modo un cultivo de células auxótrofas para glutamina que expresan 3-KSR. Estas células se transfectan simultánea o posteriormente con un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una glutamina sintetasa (GS) y la proteína de interés, p. ej., la cadena pesada y ligera de un anticuerpo terapéutico. Durante y después de esta segunda transfección, las células se mantienen en medio de cultivo celular sin glutamina para seleccionar las células que expresan el segundo vector. Para seleccionar adicionalmente las células que han incorporado múltiples copias del segundo vector, el medio de cultivo celular durante y/o después de la segunda transfección se complementa con un inhibidor de la glutamina sintetasa tal como sulfoximina de metionina (MSX). Las células productoras de anticuerpos de 3-KSR-GS finales pueden mantenerse en un medio sin colesterol, evitando problemas de fabricación asociados con colesterol, y presentan un alto nivel de productividad procedente de la selección de MSX.
Ejemplo 2: Ensayo de viabilidad celular:
El siguiente ejemplo describe un ensayo de azul tripano para determinar la viabilidad celular como un sustituto de células que presentan supervivencia y crecimiento adecuados.
Claims (15)
1. Un método de fabricación de una proteína terapéutica, que comprende: transfectar una célula auxótrofa para colesterol y auxótrofa para glutamina con (i) un ácido nucleico que codifica una proteína que restaura la biosíntesis de colesterol en la célula; (ii) un ácido nucleico que codifica una proteína que restaura la biosíntesis de glutamina en la célula; (iii) un ácido nucleico que comprende un gen de resistencia a antibióticos aminoglucosídicos; y (iv) un ácido nucleico que codifica la proteína terapéutica.
2. El método de la reivindicación 1, que comprende transfectar la célula auxótrofa para colesterol y auxótrofa para glutamina con al menos uno de un primer, segundo y tercer vector, en donde el primer vector comprende el ácido nucleico que codifica una proteína que restaura la biosíntesis de colesterol; el segundo vector comprende el ácido nucleico que codifica una proteína que restaura la biosíntesis de glutamina y el ácido nucleico que codifica la proteína terapéutica; y el tercer vector comprende el ácido nucleico que comprende el gen de resistencia a antibióticos aminoglucosídicos.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, que comprende además cultivar la célula auxótrofa para colesterol y auxótrofa para glutamina en ausencia de colesterol añadido de manera exógena durante o después de la transfección con el ácido nucleico que codifica la proteína que restaura la biosíntesis de colesterol.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende además cultivar la célula auxótrofa para colesterol y auxótrofa para glutamina en ausencia de glutamina añadida de manera exógena durante o después de la transfección con el ácido nucleico que codifica una proteína que restaura la biosíntesis de glutamina.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende además cultivar la célula auxótrofa para colesterol y auxótrofa para glutamina reduciendo la concentración de glutamina de 2 mM a 0 mM o de 0,5 mM a 0 mM después de la transfección con el ácido nucleico que codifica una proteína que restaura la biosíntesis de glutamina.
6. El método de la reivindicación 1, que comprende además cultivar la célula auxótrofa para colesterol y auxótrofa para glutamina en presencia de un inhibidor de la 3-cetoesteroide reductasa durante o después de la transfección con el ácido nucleico que codifica una proteína que restaura la biosíntesis de colesterol.
7. El método de la reivindicación 1, que comprende además cultivar la célula auxótrofa para colesterol y auxótrofa para glutamina en presencia de un inhibidor de la glutamina sintetasa durante o después de la transfección con el ácido nucleico que codifica una proteína que restaura la biosíntesis de colesterol.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende además cultivar la célula auxótrofa para colesterol y auxótrofa para glutamina en presencia de un antibiótico aminoglucosídico durante o después de la transfección con el ácido nucleico que comprende el gen de resistencia a antibiótico aminoglucosídico.
9. El método de la reivindicación 8, que comprende cultivar la célula auxótrofa para colesterol y auxótrofa para glutamina en presencia de G418 a una concentración de 100 pg/ml o 200 pg/ml.
10. El método de la reivindicación 1, en donde el gen de resistencia a aminoglucósidos comprende un gen de resistencia a la neomicina y el método comprende transfectar la célula con un ácido nucleico que codifica el gen de resistencia a la neomicina.
11. El método de la reivindicación 1, en donde el método comprende además recuperar la proteína terapéutica de la célula y medir la viabilidad de la célula después de dicha recuperación.
12. El método de la reivindicación 1, en donde la proteína que restaura la biosíntesis de colesterol comprende 3-cetoesteroide reductasa y el método comprende transfectar la célula auxótrofa para colesterol y auxótrofa para glutamina con un ácido nucleico que codifica 3-cetoesteroide reductasa.
13. El método de la reivindicación 1, en donde la proteína capaz de restaurar la biosíntesis de glutamina comprende glutamina sintetasa y el método comprende transfectar la célula con un ácido nucleico que codifica glutamina sintetasa.
14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde la proteína terapéutica comprende un anticuerpo, una proteína de fusión, un anticoagulante, un factor sanguíneo, una proteína morfogenética ósea, un armazón proteico modificado por ingeniería genética, una enzima, un factor de crecimiento, una hormona, un factor liberador de hormonas, una interleucina o una proteína trombolítica, y el método comprende transfectar la célula con un ácido nucleico que codifica un anticuerpo, una proteína de fusión, un anticoagulante, un factor sanguíneo, una proteína morfogenética ósea, un armazón proteico modificado por ingeniería genética, una enzima, un factor de crecimiento, una hormona, un factor liberador de hormonas, una interleucina o una proteína trombolítica.
15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde la célula auxótrofa para colesterol y auxótrofa para glutamina es una célula NSO.
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