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ES2788979T3 - Moléculas de unión a antígeno que comprenden un trímero de ligando de la familia de TNF - Google Patents

Moléculas de unión a antígeno que comprenden un trímero de ligando de la familia de TNF Download PDF

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ES2788979T3
ES2788979T3 ES15797922T ES15797922T ES2788979T3 ES 2788979 T3 ES2788979 T3 ES 2788979T3 ES 15797922 T ES15797922 T ES 15797922T ES 15797922 T ES15797922 T ES 15797922T ES 2788979 T3 ES2788979 T3 ES 2788979T3
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antigen
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Peter Bruenker
Christina Claus
Koller Claudia Ferrara
Sandra Grau-Richards
Christian Klein
Viktor Levitsky
Ekkehard Moessner
Joerg Thomas Regula
Pablo Umana
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F Hoffmann La Roche AG
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F Hoffmann La Roche AG
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Abstract

Una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia TNF que comprende (a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana, (b) un primer y un segundo polipéptido que se unen entre sí por un enlace disulfuro, en la que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido contiene un primer dominio constante de la cadena pesada (CH1) o constante de la cadena ligera (CL) y el segundo polipéptido contiene un dominio CL o CH1, respectivamente, en la que el segundo polipéptido se une al primer polipéptido por un enlace disulfuro entre el dominio CH1 y CL, y en la que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 que se conectan entre sí y al dominio CH1 o CL por un conector peptídico y en la que el segundo polipéptido comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 conectado por medio de un conector peptídico al dominio CL o CH1 de dicho polipéptido, y que comprende además (c) un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de manera estable.

Description

DESCRIPCIÓN
Moléculas de unión a antígeno que comprenden un trímero de ligando de la familia de TNF
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere a moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF novedosas que comprenden (a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana, (b) un primer y un segundo polipéptido que se unen entre sí por un enlace disulfuro, en las que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido contiene un primer dominio constante de la cadena pesada (CH1) o constante de la cadena ligera (CL) y el segundo polipéptido contiene un dominio CL o CH1, respectivamente, en las que el segundo polipéptido se une al primer polipéptido por un enlace disulfuro entre el dominio CH1 y CL, y en las que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID n O:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 y u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 o fragmentos de la misma que se conectan entre sí y al dominio CH1 o CL por un conector peptídico y en las que el segundo polipéptido comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 y u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 o un fragmento de la misma conectado por medio de un conector peptídico al dominio CL o CH1 de dicho polipéptido, y que comprende además (c) un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de manera estable. La invención se refiere además a procedimientos de producción de estas moléculas y a procedimientos de uso de las mismas.
ANTECEDENTES
Los ligandos que interactúan con moléculas de la superfamilia de receptores de TNF (factor de necrosis tumoral) tienen funciones fundamentales en la organización y función del sistema inmunitario. Aunque regulan funciones normales tales como respuestas inmunitarias, hematopoyesis y morfogénesis, los ligandos de la familia de TNF (también llamados citocinas) desempeñan un papel en la oncogénesis, rechazo de trasplante, choque septicémico, replicación vírica, resorción ósea, artritis reumatoide y diabetes (Aggarwal, 2003). La familia de ligandos de TNF comprende 18 genes que codifican 19 proteínas transmembranarias de tipo II (es decir, extremo N intracelular y extremo C extracelular), caracterizadas por la presencia de un dominio C terminal conservado acuñado como 'dominio de homología a TNF' (THD). Este dominio es responsable de la unión al receptor y por tanto es crítico para la actividad biológica de los miembros de la familia de ligandos de TNF. La identidad de secuencia entre miembros de la familia es de un ~20-30 % (Bodmer, 2002). Los miembros de la familia de ligandos de TNF ejercen su función biológica como trímeros no covalentes de autoensamblado (Banner et al, Cell 1993, 73, 431-445). Por tanto, los ligandos de la familia de TNF forman un trímero que se puede unir a y activar los correspondientes receptores de la superfamilia de TNFR.
4-1BB (CD137), un miembro de la superfamilia de receptores de TNF, se ha identificado por primera vez como una molécula con una expresión que se induce por la activación de linfocitos T (Kwon y Weissman, 1989). Posteriores estudios demostraron la expresión de 4-1BB en linfocitos T y B (Snell et al., 2011; Zhang et al., 2010), linfocitos NK (Lin et al., 2008), linfocitos NKT (Kim et al., 2008), monocitos (Kienzle y von Kempis, 2000; Schwarz et al., 1995), neutrófilos (Heinisch et al., 2000), mastocitos (Nishimoto et al., 2005) y células dendríticas así como células de origen no hematopoyético tales como células endoteliales y musculares lisas y (Broil et al., 2001; Olofsson et al., 2008). La expresión de 4-1 BB en tipos celulares diferentes es mayormente inducible y se controla por diversas señales estimuladoras, tales como el desencadenamiento por receptores de linfocitos T (TCR) o receptores de linfocitos B, así como la señalización inducida a través de moléculas coestimuladoras o receptores de citocinas proinflamatorias (Diehl et al., 2002; von Kempis et al., 1997; Zhang et al., 2010).
La expresión del ligando de 4-1BB (4-1BBL o CD137L) es más restringida y se observa en células presentadoras de antígenos (APC) profesionales tales como linfocitos B, células dendríticas (DC) y macrófagos. La expresión inducible de 4-1BBL es característica de los linfocitos T, incluyendo los subconjuntos de linfocitos T tanto ap como y§, y células endoteliales (revisado en Shao y Schwarz, 2011).
Se sabe que la señalización de CD137 estimula la secreción de IFNy y la proliferación de linfocitos NK (Buechele et al., 2012; Lin et al., 2008; Melero et al., 1998) así como promueve la activación de DC como se indica por un incremento en su supervivencia y capacidad para secretar citocinas y regular por incremento moléculas coestimuladoras (Choi et al., 2009; Futagawa et al., 2002; Wilcox et al., 2002). Sin embargo, CD137 se caracteriza mejor como una molécula coestimuladora que modula la activación inducida por TCR en ambos subconjuntos de linfocitos T CD4+ y CD8+. En combinación con el desencadenamiento por TCR, los anticuerpos específicos para 4-1BB agonistas potencian la proliferación de linfocitos T, estimulan la secreción de linfocinas y disminuyen la sensibilidad de los linfocitos T por la muerte celular inducida por activación (revisado en Snell et al., 2011).
En consonancia con estos efectos coestimuladores de los anticuerpos anti-4-1BB sobre los linfocitos T in vitro, su administración a ratones portadores de tumor da lugar a efectos antitumorales potentes en muchos modelos tumorales experimentales (Melero et al., 1997; Narazaki et al., 2010). Sin embargo, 4-1BB normalmente presenta su potencia como antitumoral solo cuando se administra en combinación con otros compuestos inmunomoduladores (Curran et al., 2011; Guo et al., 2013; Morales-Kastresana et al., 2013; Teng et al., 2009; Wei et al., 2013), reactivos quimioterápicos (Ju et al., 2008; Kim et al., 2009), vacunación específica de tumor (Cuadros et al., 2005; Lee et al., 2011) o radioterapia (Shi y Siemann, 2006). Los experimentos de disminución in vivo demostraron que los linfocitos T CD8+ desempeñan el papel más crítico en el efecto antitumoral de los anticuerpos específicos para 4-1BB. Sin embargo, dependiendo del modelo tumoral o politerapia, que incluye anti-4-1 Bb , se ha informado de contribuciones de otros tipos de células tales como DC, linfocitos NK o linfocitos T CD4+ (Melero et al., 1997; Murillo et al., 2009; Narazaki et al., 2010; Stagg et al., 2011).
Además de sus efectos directos sobre diferentes subconjuntos de linfocitos, los agonistas de 4-1BB también pueden inducir la infiltración y retención de linfocitos T activados en el tumor a través de la regulación por incremento mediada por 4-1BB de la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM1) y molécula de adherencia celular vascular 1 (VCAM1) en el endotelio vascular tumoral (Palazon et al., 2011).
El desencadenamiento de 4-1BB también puede revertir el estado de anergia de linfocitos T inducida por la exposición a antígeno soluble que puede contribuir a la alteración de la tolerancia inmunológica en el microentorno tumoral o durante infecciones crónicas (Wilcox et al., 2004).
Parece que las propiedades inmunomoduladoras de los anticuerpos agonistas anti-4-1BB in vivo requieren la presencia de la porción de Fc natural en la molécula de anticuerpo implicando de este modo la unión al receptor de Fc como un acontecimiento importante requerido para la actividad farmacológica de dichos reactivos como se ha descrito para los anticuerpos agonistas específicos para otros miembros inductores de apoptosis o inmunomoduladores de la superfamilia de TNFR (Li y Ravetch, 2011; Teng et al., 2009). Sin embargo, la administración sistémica de anticuerpos agonistas específicos para 4-1BB con el dominio Fc funcionalmente activo también induce la expansión de los linfocitos T CD8+ asociados con la toxicidad hepática (Dubrot et al., 2010) que se disminuye o se mejora significativamente en ausencia de receptores de Fc funcionales en ratones. En ensayos clínicos humanos (ClinicalTrials.gov, NCT00309023), los anticuerpos agonistas anti-4-1BB Fccompetentes (BMS-663513) administrados una vez cada tres semanas durante 12 semanas indujeron la estabilización de la enfermedad en pacientes con melanoma, carcinoma ovárico o de células renales. Sin embargo, el mismo anticuerpo dado en otro ensayo (NCT00612664) provocó hepatitis de grado 4 dando lugar a la finalización del ensayo (Simeone y Ascierto, 2012).
Conjuntamente, los datos preclínicos y clínicos disponibles demuestran claramente que existe una necesidad clínica de obtener agonistas de 4-1BB eficaces. Sin embargo, los candidatos a fármaco de nueva generación no solo se deben acoplar eficazmente 4-1BB en la superficie de células hematopoyéticas y endoteliales sino que también deben poder lograr esto a través de mecanismos distintos a la unión a receptores de Fc para evitar efectos secundarios incontrolables. Esto último se debe lograr a través de la unión preferente a y oligomerización en restos específicos de tumor o asociados a tumor.
Se han preparado proteínas de fusión compuestas de un dominio extracelular de un ligando de 4-1BB y un fragmento de anticuerpo monocatenario (Mueller et al., 2008; Hornig et al., 2012) o un único ligando de 4-1BB fusionado al extremo C de una cadena pesada (Zhang et al., 2007). El documento WO 2010/010051 divulga la generación de proteínas de fusión que consiste en tres ectodominios de ligando de TNF unidos entre sí y fusionados a una parte de anticuerpo. El documento AU 2011265482 B2 se refiere a una proteína de fusión de OX40L multimérica que se compone de tres polipéptidos de fusión de OX40L, de los que cada uno incluye un dominio OX40L, un dominio de trimerización (por ejemplo, un dominio de cremallera de isoleucina) y un dominio de dimerización, por ejemplo, un dominio Fc humano. Bremer, ISRN Oncology 2013,176(2) divulga varias construcciones con la capacidad de formar hexámeros o trímeros de ligandos de TNF.
Sin embargo, todavía existe la necesidad de obtener nuevas moléculas de unión a antígeno que combinen un resto que se pueda unir preferentemente a dianas específicas de tumor o asociadas a tumor con un resto que puede formar un trímero de ligando de TNF coestimulador y que tengan estabilidad suficiente para ser farmacéuticamente útiles. Las moléculas de unión a antígeno de la presente invención comprenden ambas y sorprendentemente proporcionan un ligando de TNF trimérico y por tanto biológicamente activo, aunque uno de los ectodominios del ligando de TNF de trimerización se localiza en otro polipéptido distinto a los otros dos ectodominios del ligando de TNF de la molécula.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
En un aspecto, la invención proporciona un molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF que comprende
(a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana,
(b) un primer y un segundo polipéptido que se unen entre sí por un enlace disulfuro, en la que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido contiene un primer dominio constante de la cadena pesada (CH1) o constante de la cadena ligera (CL) y el segundo polipéptido contiene un dominio CL o CH1, respectivamente, en la que el segundo polipéptido se une al primer polipéptido por un enlace disulfuro entre el dominio CH1 y CL, y en la que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 que se conectan entre sí y al dominio CH1 o CL por un conector peptídico y en la que el segundo polipéptido comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 conectado por medio de un conector peptídico al dominio CL o CH1 de dicho polipéptido, y que comprende además
(c) un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de manera estable.
En un aspecto particular, el miembro de la familia de ligandos de TNF coestimula la activación de linfocitos T humanos. Por tanto, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF comprende (a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana, (b) un primer y un segundo polipéptido que se unen entre sí por un enlace disulfuro, en la que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido contiene un primer dominio constante de la cadena pesada (CH1) o constante de la cadena ligera (CL) y el segundo polipéptido contiene un dominio CL o CH1, respectivamente, en la que el segundo polipéptido se une al primer polipéptido por un enlace disulfuro entre el dominio CH1 y CL, y en la que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 que se conectan entre sí y al dominio CH1 o CL por un conector peptídico y en la que el segundo polipéptido comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 conectado por medio de un conector peptídico al dominio CL o CH1 de dicho polipéptido, y que comprende además (c) un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de manera estable, en la que el miembro de la familia de ligandos de TNF coestimula la activación de linfocitos T humanos. Más en particular, el miembro de la familia de ligandos de TNF se selecciona de 4-1 BBL y OX40L.
En un aspecto, el miembro de la familia de ligandos de TNF es 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID n O:2, Se Q ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, Se Q ID NO:374 y SEQ ID NO:375, en particular la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:96. Más en particular, el ectodominio de un miembro de la familia de ligandos de TNF comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:96.
En otro aspecto, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención comprende
(a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana y
(b) un primer y un segundo polipéptido que se unen entre sí por un enlace disulfuro, en la que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:5, Se Q iD NO:97, Se Q ID NO:98 y SEQ ID NO:99 y por que el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4.
En un aspecto, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención comprende
(a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana y
(b) un primer y un segundo polipéptido que se unen entre sí por un enlace disulfuro, en la que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5 y por que el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6.
En otro aspecto, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención comprende
(a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana y
(b) un primer y un segundo polipéptido que se unen entre sí por un enlace disulfuro, en la que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5 y por que el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:183.
Aún en otro aspecto, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención comprende
(a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana y
(b) un primer y un segundo polipéptido que se unen entre sí por un enlace disulfuro, en la que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:97 y por que el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:184 o SEQ ID NO:185.
En otro aspecto, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención comprende
(a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana,
(b) un primer polipéptido que contiene un dominio CH1 o CL y un segundo polipéptido que contiene un dominio CL o CH1, respectivamente, en la que el segundo polipéptido se une al primer polipéptido por un enlace disulfuro entre el dominio CH1 y CL,
y en la que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID n O:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 que se conectan entre sí y al dominio CH1 o CL por un conector peptídico y por que el segundo polipéptido comprende solo un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de t Nf seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ iD NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 conectado por un conector peptídico al dominio CL o CH1 de dicho polipéptido.
En un aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF que comprende
(a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana,
(b) un primer polipéptido que contiene un dominio CH1 y un segundo polipéptido que contiene un dominio CL, en la que el segundo polipéptido se une al primer polipéptido por un enlace disulfuro entre el dominio CH1 y CL,
y en la que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID n O:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 que se conectan entre sí y al dominio CH1 por un conector peptídico y por que el segundo polipéptido comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1 b Bl que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, s Eq ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 conectado por medio de un conector peptídico al dominio CL de dicho polipéptido.
En otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF que comprende
(a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana,
(b) un primer polipéptido que contiene un dominio CL y un segundo polipéptido que contiene un dominio CH1, en la que el segundo polipéptido se une al primer polipéptido por un enlace disulfuro entre el dominio CH1 y CL,
y en la que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID n O:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 que se conectan entre sí y al dominio Cl por un conector peptídico y por que el segundo polipéptido comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 conectado por medio de un conector peptídico al dominio CH1 de dicho polipéptido.
La invención proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF que comprende al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana. En un aspecto particular, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF comprende una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana.
En otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención, en la que el antígeno de célula diana se selecciona del grupo que consiste en proteína de activación de fibroblastos (FAP), antígeno carcinoembrionario (CEA), proteoglucano de sulfato de condroitina asociado a melanoma (MCSP), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), CD19, CD20 y CD33.
En un aspecto particular, el antígeno de célula diana es la proteína de activación de fibroblastos (FAP).
En un aspecto, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en la que la molécula Fab que se puede unir específicamente a FAP comprende un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O:7 o SEQ ID NO:100, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:101, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:102, y un dominio VL que comprende (iv) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:103, (v) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:104, y (vi) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:12 o SEQ ID NO:105.
En un aspecto, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en la que la molécula Fab que se puede unir específicamente a FAP comprende un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8 y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9, y un dominio VL que comprende (iv) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10, (v) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:11 y (vi) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:12.
En un aspecto particular, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en la que la molécula Fab que se puede unir específicamente a FAP comprende un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:100, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:101, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:102, y un dominio VL que comprende (iv) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:103, (v) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:104, y (vi) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:105.
En un aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF como se define en el presente documento anteriormente, en la que la molécula Fab que se puede unir específicamente a FAP comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:17 o en la que el resto que se puede unir específicamente a FAP comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:106 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:107.
En otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de acuerdo con la invención, en la que un péptido que comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 conectados entre sí por un primer conector peptídico se fusiona en su extremo C al dominio CH1 o CL de una cadena pesada por un segundo conector peptídico y en la que un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 se fusiona en su extremo C al dominio CL o CH1 en una cadena ligera por un tercer conector peptídico.
En un aspecto particular, la invención se refiere a una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF como se define anteriormente, en la que el conector peptídico es (G4S)2, es decir, un conector peptídico de SEQ ID NO: 13. En un aspecto, el primer conector peptídico es (G4S)2, el segundo conector peptídico es GSPGSSSSGS (SEQ ID NO:57) y el tercer conector peptídico es (G4S)2. En otro aspecto, el primer, el segundo y el tercer conector peptídico es (G4S)2.
La invención se ocupa además de una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF como se define en el presente documento anteriormente, que comprende un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de manera estable.
En particular, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención que comprende (c) un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de manera estable comprende además (a) una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana, en la que cadena pesada de Fab se fusiona en el extremo C al extremo N de un dominio CH2 en el dominio Fc.
En otro aspecto, el dominio Fc es una IgG, en particular un dominio Fc de IgG1 o un dominio Fc de IgG4. Más en particular, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1. En un aspecto particular, el dominio Fc comprende una modificación que promueve la asociación de la primera y segunda subunidad del dominio Fc.
En otro aspecto, la invención se ocupa de una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF como se define en el presente documento anteriormente, que comprende
(c) un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de manera estable, en la que el dominio Fc comprende una o más sustituciones aminoacídicas que reducen la unión a un receptor de Fc, en particular hacia el receptor de Fcy.
En particular, el dominio Fc comprende sustituciones aminoacídicas en las posiciones 234 y 235 (numeración EU) y/o 329 (numeración EU) de las cadenas pesadas de IgG. Más en particular, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un ligando de la familia de TNF trimérico de acuerdo con la invención que comprende un dominio Fc de IgG1 con las sustituciones aminoacídicas L234A, L235A y P329G (numeración EU).
En otro aspecto, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en la que la molécula de unión a antígeno comprende
una primera cadena pesada y una primera cadena ligera, que comprenden ambas una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana,
un primer péptido que comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1 Bb L que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 conectados entre sí por un primer conector peptídico fusionado en su extremo C por un segundo conector peptídico a una segunda cadena pesada o ligera,
y un segundo péptido que comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF fusionado en su extremo C por un tercer conector peptídico a una segunda cadena ligera o pesada, respectivamente.
En otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en la que el primer péptido que comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1 BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, Se Q ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 conectados entre sí por un primer conector peptídico se fusiona en su extremo C por un segundo conector peptídico a un dominio CH1 que es parte de una cadena pesada, y el segundo péptido que comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF o un fragmento del mismo se fusiona en su extremo C por un tercer conector peptídico a un dominio CL que es parte de una cadena ligera.
Aún en otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en la que el primer péptido que comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1 Bb L que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, Se Q ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 conectados entre sí por un primer conector peptídico se fusiona en su extremo C por un segundo conector peptídico a un dominio CL que es parte de una cadena pesada, y el segundo péptido que comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 se fusiona en su extremo C por un tercer conector peptídico a un dominio CH1 que es parte de una cadena ligera.
En otro aspecto, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en la que el primer péptido que comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 conectados entre sí por un primer conector peptídico se fusiona en su extremo C por un segundo conector peptídico a un dominio Vh que es parte de una cadena pesada, y el segundo péptido que comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 se fusiona en su extremo C por un tercer conector peptídico a un dominio VL que es parte de una cadena ligera.
Se proporciona además una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en la que en el dominio CL adyacente al miembro de la familia de ligandos de TNF el aminoácido en la posición 123 (numeración EU) se ha reemplazado por arginina (R) y el aminoácido en la posición 124 (numeración EU) se ha sustituido con lisina (K), y en la que en el dominio CH1 adyacente al miembro de la familia de ligandos de TNF los aminoácidos en la posición 147 (numeración EU) y en la posición 213 (numeración EU) se han sustituido con ácido glutámico (E).
En otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF como se describe en el presente documento anteriormente, en la que la molécula de unión a antígeno comprende
(a) una primera cadena pesada y una primera cadena ligera, que comprenden ambas una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana,
(b) una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98 y SEQ ID NO:99, y
una segunda cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4.
En un aspecto, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en la que la molécula de unión a antígeno comprende
(a) una molécula Fab que se puede unir específicamente a FAP, y
(b) una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98 y SEQ ID NO:99, y
una segunda cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4.
En un aspecto particular, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF que comprende una molécula Fab que se puede unir específicamente a FAP. En un aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en la que la molécula de unión a antígeno comprende
(i) una primera cadena pesada que comprende el dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16 y una primera cadena ligera que comprende el dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO:17 o
una primera cadena pesada que comprende el dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:106 y una primera cadena ligera que comprende el dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de Se Q ID NO:107,
(ii) una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:113, SEQ ID n.°115, SEQ ID NO:139 y SEQ ID NO:148, y
(iii) una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:114 y SEQ ID NO:115.
En otro aspecto, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en la que la molécula de unión a antígeno comprende
(i) una primera cadena pesada que comprende el dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16 y una primera cadena ligera que comprende el dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO:17 o
una primera cadena pesada que comprende el dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:106 y una primera cadena ligera que comprende el dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de Se Q ID NO:107,
(ii) una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:119 y SEQ ID NO:173, y
(iii) una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:120 y SEQ ID NO:174.
En otro aspecto particular, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF como se describe en el presente documento anteriormente, en la que el antígeno de célula diana es CEA.
En un aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en la que la molécula Fab que se puede unir específicamente a CEA comprende un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:321, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:322, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:323, y un dominio VL que comprende (iv) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:324, (v) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:325, y (vi) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:326.
En otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en la que la molécula Fab que se puede unir específicamente a CEA comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:329 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:330.
En un aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF como se describe en el presente documento anteriormente, en la que la molécula de unión a antígeno comprende
(i) una primera cadena pesada que comprende el dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:329 y una primera cadena ligera que comprende el dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:330,
(ii) una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:111 y SEQ ID NO:113, y
(iii) una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112 y SEQ ID NO:114.
En otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en la que la molécula de unión a antígeno comprende
(i) una primera cadena pesada que comprende el dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:329 y una primera cadena ligera que comprende el dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:330,
(ii) una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:119 y SEQ ID NO:173, y
(iii) una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:120 y SEQ ID NO:174.
En otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF como se describe en el presente documento anteriormente, en la que el miembro de la familia de ligandos de TNF es OX40L. En un aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de t Nf , en la que el ectodominio de un miembro de la familia de ligandos de TNF comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54, en particular la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53.
En otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en la que el antígeno de célula diana es la proteína de activación de fibroblastos (FAP) y la molécula Fab que se puede unir específicamente a FAP comprende un dominio VH que comprende (i) c DR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7 o SEQ ID n O:100, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:101, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:102, y un dominio VL que comprende (iv) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:103, (v) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:104, y (vi) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:12 o SEQ ID NO:105.
En particular, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF como se describe en el presente documento, en la que la molécula de unión a antígeno comprende
(i) una primera cadena pesada que comprende el dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16 y una primera cadena ligera que comprende el dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO:17 o
una primera cadena pesada que comprende el dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:106 y una primera cadena ligera que comprende el dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de Se Q ID NO:107,
(ii) una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:355, y
(iii) una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:356.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un polinucleótido aislado que codifica una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF como se define en el presente documento anteriormente. La invención proporciona además un vector, en particular un vector de expresión, que comprende el polinucleótido aislado de la invención y una célula huésped que comprende el polinucleótido aislado o el vector de la invención. En algunos modos de realización la célula huésped es una célula eucariota, en particular una célula de mamífero.
En otro aspecto, se proporciona un procedimiento para producir la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención, que comprende las etapas de (i) cultivar la célula huésped de la invención en condiciones adecuadas para la expresión de la molécula de unión a antígeno, y (ii) recuperar la molécula de unión a antígeno. La invención también engloba una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF producido por el procedimiento de la invención.
La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
También se engloba por la invención la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención, o la composición farmacéutica de la invención, para su uso como medicamento. En un aspecto se proporciona la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención, o la composición farmacéutica de la invención, para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un individuo que necesite el mismo. En un modo de realización específico, se proporciona la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención, o la composición farmacéutica de la invención, para su uso en el tratamiento de cáncer. En cualquiera de los modos de realización anteriores, el individuo es preferentemente un mamífero, en particular un humano.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La figura 1 muestra los componentes para el ensamblaje de ligandos de 4-1BB humanos triméricos escindidos. La figura (1A) muestra el ligando dimérico que se fusiona en el extremo C a un dominio VL o VH o dominio CH1 o CL humano y la figura (1B) muestra el ligando monomérico fusionado a un dominio VL o VH o dominio CL o CH1 humano. La figura (1C) muestra el ligando dimérico que se fusiona en el extremo N a un dominio CH3 humano y la figura (1D) muestra el ligando monomérico fusionado en el extremo N a un dominio CH3 humano.
La figura 2 muestra las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de 4-1BBL, construcciones 1.1 a 1.10 de la invención. La preparación y producción de estas construcciones se describen en el ejemplo 1. Los dominios VH y VL son los del anticuerpo anti-FAP 28H1, el punto negro grueso representa la modificación de botón-en-ojal. * simboliza modificaciones aminoacídicas en el dominio CH1 y CL (llamados residuos cargados).
La figura 3 muestra los componentes para el ensamblaje de ligandos de 4-1 BB murinos triméricos escindidos. La figura (3A) muestra el ligando dimérico que se fusiona en el extremo C al dominio CL murino y la figura (3B) muestra el ligando monomérico fusionado en el extremo C al dominio CH1 murino. Componentes para el ensamblaje de ligando de 4-1 BB murino trimérico escindido dirigido a FAP. La figura (3C) muestra las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de 4-1BBL murino ensamblado como se describe con más detalle en el ejemplo 1.3.
La figura 4 muestra las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de 4-1BBL, construcciones 2.1 a 2.6 de la invención. La preparación y producción de estas construcciones se describen en el ejemplo 2. Los dominios VH y VL son los del anticuerpo anti-FAP 4B9, el punto negro grueso representa la modificación de botón-en-ojal. * simboliza modificaciones aminoacídicas en el dominio CH1 y CL (llamados residuos cargados).
La figura 5A y figura 5B muestran las variantes "no dirigidas" de las construcciones 1.1 y 1.2 que comprenden una molécula Fab DP47 en lugar de la molécula Fab anti-FAP. Las moléculas se denominan control A y control B, respectivamente. La preparación se describe en el ejemplo 1.4. La figura 5C es un dibujo de la construcción (kih) de Fc-4-1BB monomérica como se prepara en el ejemplo 3.
La figura 6 se refiere a la unión de una molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a FAP (trímero de 4-1BBL escindido de FAP, círculos negros) o molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB no dirigido a DP-47 (trímero de 4-1BBL escindido de DP47, círculos blancos) a PBMC humanas en reposo (indiferenciadas) o activadas. Específicamente, la unión a linfocitos T CD8+ humanos en reposo (indiferenciados) o activados se muestra en la figura (6A), a linfocitos T CD4+ humanos en reposo (indiferenciados) o activados en la figura (6B) y a linfocitos NK humanos en reposo (indiferenciados) o activados en la figura (6C). Se muestra la unión como la mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) del fragmento F(ab')2 de IgG de cabra específico de Fcy anti-IgG humana marcado con ficoeritrina de algas macrófitas rojas (R-PE) que se usa como anticuerpo de detección secundario. La MFI se midió por citometría de flujo y se corrigió el valor de referencia restando la MFI del control en blanco.
La unión de diferentes construcciones (kih) de Fc-ligando de 4-1BB humano trimérico escindido no dirigido o dirigido a FAP a linfocitos T que expresan 4-1BB humano de PBMC humanas preactivadas de PHA-L y proleucina y reactivadas anti-CD3 humano/anti-CD28 humano se muestra en la figura 7. La unión se detectó con el fragmento F(ab')2 de IgG de cabra específico de Fcy anti-IgG humana conjugado con fluorocromo R-ficoeritrina. Se muestra la mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) frente a la concentración de las construcciones sometidas a prueba 1.1 a 1.10 del ejemplo 1. Para una mejor visualización, las curvas de unión se dividen en cuatro diagramas diferentes con la construcción 1.1 ((kih) de Fc-ligando de 4-1BB humano trimérico escindido dirigido a FAP monovalente) y el control B ((kih) de Fc-ligando de 4-1 BB humano trimérico escindido no dirigido monovalente con residuos cargados y cruzados CH-CL) como curvas de comparación. Se realizó un seguimiento de la unión en linfocitos T CD3+ CD8+ (figura 7A) y linfocitos T CD3+ CD4+ (figura 7B). El nivel de expresión de 4-1BB en linfocitos T CD8 normalmente es mayor que en linfocitos T CD4. Todas las versiones se unen con una afinidad bastante similar a 4-1 BB humano.
La figura 8 muestra la unión de diferentes construcciones (kih) de Fc-ligando de 4-1BB humano trimérico escindido no dirigido o dirigido a FAP a linfocitos T CD4+ o CD8+ de PBMC recién obtenidas (figura 8A) o a PBMC humanas preactivadas de PHA-L y proleucina y reactivadas anti-CD3 humano/anti-CD28 humano que expresan 4-1BB humano (figura 8B). La unión se detectó con el fragmento F(ab')2 de IgG de cabra específico de Fcy anti-IgG humana conjugado con fluorocromo R-ficoeritrina. Se muestra la mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) frente a la concentración de las construcciones sometidas a prueba 2.1, 2.3, 2.4, 2.5 y 2.6 del ejemplo 2 y las moléculas de control control B, control C, control E y control F. Para una mejor visualización, las curvas de unión se dividen en dos diagramas diferentes con la construcción 2.1 ((kih) de Fc-ligando de 4-1BB humano trimérico escindido dirigido a FAP monovalente) y el control B ((kih) de Fc-ligando de 4-1BB humano trimérico escindido no dirigido monovalente con residuos cargados y cruzados CH-CL) como curvas de comparación. Se realizó un seguimiento de la unión en linfocitos T CD45+ CD3+ CD8+ (diagramas en la parte inferior) y linfocitos T CD45+ CD3+ CD4+ (diagramas en la parte superior). El nivel de expresión de 4-1BB en linfocitos T CD8 normalmente es mayor que en linfocitos T CD4. Todas las construcciones se unen con una afinidad bastante similar a 4-1BB humano, mientras que la construcción bivalente 2.3 y su control C no dirigido muestran una menor MFI. Esto se puede deber al impedimento estérico de la unión de 4-1BB y/o menor detección debida al anticuerpo de detección secundario inducido por el ligando de 4-1 BB escindido conjugado a Fc.
En la figura 9 se muestra la unión de moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1 BB dirigido a FAP (trímero de 4-1BBL escindido de FAP, círculos negros) o moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB no dirigido a DP47 (trímero de 4-1BBL escindido de DP47; círculos blancos) a esplenocitos de ratón activados. En particular, la unión a linfocitos T CD4+ de ratón activados se muestra en la figura (9A) y a linfocitos T CD8+ de ratón activados en la figura (9B). Un anticuerpo P329G LALA de IgG1 humana específico anti-CD137 de ratón (clon Lob12.3) se usó como control positivo (triángulos). La unión se caracteriza representando la MFI del fragmento F(ab')2 de IgG de cabra específico de Fcy anti-IgG humana marcado con R-PE que se usa como anticuerpo de detección secundario frente a la concentración en nM de las construcciones de trímero de 4-1BBL escindido sometidas a prueba. La MFI se midió por citometría de flujo y se corrigió el valor de referencia restando la MFI del control en blanco.
La figura 10 muestra la unión de moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB (círculos negros: molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a FAP, construcción 1.1, círculos blancos: molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB no dirigido a DP47, control A, a (A) línea celular MV-3 y (B) línea celular WM-266-4, de melanoma humano que expresa proteína de activación de fibroblastos (FAP). La unión se caracteriza representando la MFI del fragmento F(ab')2 de IgG de cabra específico de Fcy anti-IgG humana marcado con R-PE que se usa como anticuerpo de detección secundario frente a la concentración en nM de construcciones de trímero de 4-1 BBL escindido sometidas a prueba. La MFI se midió por citometría de flujo y se corrigió el valor de referencia restando la MFI del control en blanco.
En la figura 11 se muestra la unión de diferentes construcciones (kih) de Fc-ligando de 4-1 BB humano trimérico escindido no dirigido o dirigido a FAP a células MV-3 de melanoma humano que expresan FAP humana (figura 11 A) y/o células de fibroblastos embrionarios de ratones transfectados con NIHÁ3T3-clon 39 huFAP (figura 11B). La unión se detectó con fragmentos F(ab')2 de IgG de cabra específicos de Fcy anti-IgG humana conjugados con fluorocromo R-ficoeritrina o fluorocromo fluoresceína. Se muestra la mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) frente a la concentración de construcciones sometidas a prueba. Para una mejor visualización, las curvas de unión se distribuyeron en cuatro (figura 11A) o dos diagramas (figura 11B), mientras que la construcción 1.1 ((kih) de Fc-ligando de 4-1BB humano trimérico escindido dirigido a FAP monovalente) se usa como curva de comparación. Todas las construcciones se unen con una afinidad bastante similar a FAP humana excepto las construcciones dirigidas a FAP bivalentes (construcciones 1.5, 1.7 y 1.8). Mostraron una tendencia a tener valores de CE50 menores y mediana de la intensidad de fluorescencia menor. Esto se puede explicar con su selección bivalente (mayor avidez, menos moléculas se pueden unir al mismo tiempo debido a la ocupación de dos epítopos dando como resultado una menor MFI). Las diferencias estructurales también pueden explicar la diferencia entre la construcción 1.8 (selección bivalente completa) y las construcciones 1.5 y 1.7 (selección bivalente solo parcial).
En la figura 12 se muestra la unión de diferentes construcciones (kih) de Fc-ligando de 4-1BB humano trimérico escindido no dirigido o dirigido a FAP 2.1, 2.3, 2.4, 2.5 y 2.6 a células MV-3 (figura 12A) y células WM-266-4 (figura 12B) de melanoma humano que expresan FAP humana. La unión se detectó con los fragmentos F(ab')2 de IgG de cabra específico de Fcy anti-IgG humana conjugados con fluorocromo R-ficoeritrina. Se muestra la mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) frente a la concentración de construcciones sometidas a prueba. Para una mejor visualización, las curvas de unión se distribuyeron en dos diagramas, mientras que la construcción 2.1 ((kih) de Fc-ligando de 4-1 BB humano trimérico escindido dirigido a FAP monovalente) se usa como curva de comparación. Todas las construcciones se unen con una afinidad bastante similar a FAP humana excepto la construcción dirigida a FAP bivalente 2.3. Tiene una tendencia a mostrar menores valores de CE50 y menor mediana de la intensidad de fluorescencia. Esto se puede explicar con su selección bivalente, lo que da como resultado mayor avidez pero menos ocupación o moléculas fA p en la superficie celular dando como resultado una menor MFI.
La figura 13 muestra la unión de diferentes construcciones (kih) de Fc-ligando de 4-1BB de ratón trimérico escindido no dirigido o dirigido a FAP a linfocitos T CD4+ o CD8+ de esplenocitos recién obtenidos (figura 13A) o a esplenocitos de ratón activados con anticuerpos agonistas monoclonales anti-CD3 de ratón/anti-CD28 de ratón que expresan 4-1BB de ratón (figura 13B). La unión se detectó con fragmento F(ab')2 de IgG de cabra específico de Fcy anti-IgG de ratón conjugado con fluorocromo FITC. Se muestra la mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) frente a la concentración de construcciones sometidas a prueba. Se realizó un seguimiento de la unión en linfocitos T CD3+ CD8+ (diagrama izquierdo) y linfocitos T CD3+ CD4+ (diagrama derecho). El nivel de expresión de 4-1BB en linfocitos T CD8 normalmente es mayor que en linfocitos T CD4. Todas las construcciones se unen con una afinidad bastante similar a 4-1BB de ratón.
La unión de diferentes construcciones (kih) de Fc-ligando de 4-1BB de ratón trimérico escindido no dirigido o dirigido a FAP a células tumorales que expresan FAP humana se demuestra en la figura 14. La unión se detectó con fragmento F(ab')2 de IgG de cabra específico de Fcy anti-IgG de ratón conjugado con fluorocromo FITC. Se muestra la mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) frente a la concentración de construcciones sometidas a prueba. Se realizó un seguimiento de la unión en células MV-3 (figura 14A) y células WM-266-4 (figura 14B). Las construcciones (kih) de Fc-ligando de 4-1BB de ratón trimérico escindido dirigido a FAP M.1 y M.2 se unen con una afinidad bastante similar a FAP.
La figura 15 muestra un esquema que ilustra el principio general del ensayo de actividad de NFkB descrito en el ejemplo 6.1 usando una línea celular indicadora. Se muestra el ensayo de activación configurado con la línea celular indicadora HeLa que expresa 4-1BB humano. Una reticulación de 4-1BB expresado en las células indicadoras induce la activación de NFkB y la expresión de luciferasa mediada por NFkB. Después de la lisis de las células, la luciferasa puede catalizar la oxidación de luciferina a oxiluciferina. Esta reacción química se correlaciona positivamente con la fuerza de la expresión de luciferasa mediada por NFkB y se puede medir por la fuerza de emisión de luz (unidades de luz liberada). La proporción de células tumorales que expresan FAP con respecto a la línea celular indicadora HeLa-huCD137-NFkB-luc fue de 5 a 1.
En la figura 16 se muestra que la activación de la vía de señalización de NFkB por la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a FAP (construcción 1.1) es estrictamente dependiente de su unión a células diana que expresan FAP. Las células HeLa indicadoras de NFkB que expresan CD137 humano se cultivaron conjuntamente con las células tumorales indicadas que presentaban diferentes niveles de expresión de LAP en la superficie celular. La actividad de luciferasa se evaluó como se describe en el ejemplo 6.1 después de cultivar células en ausencia o presencia de moléculas que contienen 4-1BBL a las concentraciones indicadas durante 6 horas. Los círculos negros se refieren a la construcción 1.1. Los círculos blancos se refieren a la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB no dirigido a DP47 (control A). La línea celular NIH/3T3-clon 39 FAP humana se usó como células diana en la gráfica (A), la gráfica (B) muestra la activación con la línea celular MV3 como células diana y la gráfica (C) con la línea celular WM-266-4 como células diana. La actividad se caracteriza representando las unidades de luz liberada (URL) medida durante 0,5 s frente a la concentración en nM de las construcciones de trímero de 4-1BBL escindido sometidas a prueba. Las URL se emiten debido a la oxidación mediada por luciferasa de luciferina a oxiluciferina.
La figura 17 muestra la expresión y actividad de luciferasa inducida por activación de NFkB medidas con el ensayo descrito en el ejemplo 6.1. Los recuentos de luz liberada por segundos (CPS) se miden durante 0,5 s/pocillo y se representan frente a la concentración usada de construcciones (kih) de Fc-ligando de 4-1BB humano trimérico escindido no dirigido o dirigido a FAP. Las células indicadoras HeLa que expresan 4-1BB humano se incubaron durante 6 h en ausencia (figura 17A) o presencia de la línea celular de melanoma humano que expresa FAP humana de reticulación MV-3 (figura 17B) o WM-266-4 (figura 17C). Los CPS se midieron y se representaron frente a las concentraciones de diferentes construcciones (kih) de Fc-ligando de 4-1 BB humano trimérico escindido no dirigido o dirigido a FAP. La proporción celular es de una célula indicadora HeLa que expresa 4-1BB humano con respecto a cinco células tumorales. Para una mejor visualización, las curvas de activación se dividieron en cuatro diagramas de visualización diferentes con la construcción 1.1 ((kih) de Fc-ligando de 4-1BB humano trimérico escindido dirigido a FAP monovalente) y el control B ((kih) de Fcligando de 4-1BB humano trimérico escindido no dirigido monovalente con residuos cargados y cruzados CH-CL) como curvas de comparación. La figura 17A muestra la activación sin células tumorales que expresan FAP de reticulación, la figura 17B muestra la activación en presencia de células tumorales MV-3 que expresan FAP de reticulación y la figura 17C muestra la activación en presencia de células tumorales WM-266-4 que expresan FAP de reticulación.
La figura 18 muestra la expresión y actividad de luciferasa inducida por activación de NFkB medidas para las construcciones del ejemplo 2. Las unidades de luz liberada (URL) se miden durante 0,5 s/pocillo y se representan frente a la concentración usada de construcciones (kih) de Fc-ligando de 4-1 BB humano trimérico escindido no dirigido o dirigido a FAP. Las células indicadoras HeLa que expresan 4-1 BB humano se incubaron durante 6 h en ausencia o presencia de la línea celular de melanoma humano que expresa FAP humana de reticulación MV-3 o WM-266-4. Las URL se midieron y se representaron frente a las concentraciones de diferentes construcciones (kih) de Fc-ligando de 4-1 BB humano trimérico escindido no dirigido o dirigido a FAP 2.1, 2.3, 2.4, 2.5 y 2.6 y los controles B, C, E y F. La proporción celular es de una célula indicadora HeLa que expresa 4-1BB con respecto a cinco células tumorales. Para una mejor visualización, las curvas de activación se dividieron en dos diagramas de visualización diferentes con la construcción 2.1 ((kih) de Fc-ligando de 4-1BB humano trimérico escindido Fc dirigido a FAP monovalente).
En la figura 19 se muestra el ensayo de activación configurado con la línea celular indicadora T293-HEK que expresa 4-1BB de macaco cangrejero. Una reticulación de 4-1BB de macaco cangrejero expresado en las células indicadoras induce la activación de NFkB activación y la expresión de luciferasa mediada por NFkB. Después de la lisis de las células, la luciferasa puede catalizar la oxidación de luciferina a oxiluciferina. Esta reacción química se correlaciona positivamente con la fuerza de la expresión de luciferasa mediada por NFkB y se puede medir por la fuerza de emisión de luz (unidades de luz liberada).
La figura 20 muestra la expresión y actividad de luciferasa inducida por activación de NFKB. Las unidades de luz liberada (URL) se miden durante 0,5 s/pocillo y se representan frente a la concentración usada de construcciones (kih) de Fc-ligando de 4-1BB humano trimérico escindido no dirigido o dirigido a FAP. Las células indicadoras T293-HEK que expresan 4-1BB de macaco cangrejero se incubaron durante 6 h en ausencia o presencia de la línea celular de melanoma humano que expresa FAP humana de reticulación MV-3 o WM-266-4. Las URL se midieron y se representaron frente a las concentraciones de diferentes construcciones (kih) de Fc-ligando de 4-1BB humano trimérico escindido no dirigido o dirigido a FAP. La proporción celular es de una célula indicadora T293-HEK que expresa 4-1BB con respecto a cinco células MV-3 o dos WM-266-4. Para una mejor visualización, las curvas de activación se dividieron en dos diagramas diferentes con la construcción 2.1 como curva de comparación.
Figura 21: Este esquema ilustra el principio del ensayo de activación de linfocitos T descrito en el ejemplo 6.3. Se muestra el ensayo de activación esquemático configurado con linfocitos T CD8 específicos de HLA-A2-NLV y línea celular de melanoma humano HLA-A2+ FAP+ pulsada con NLV MV-3 en presencia de una concentración valorada diferente de las construcciones (kih) de Fc-ligando de 4-1BB humano trimérico escindido no dirigido o dirigido a FAP. Las células se incubaron durante 28 h, las últimas 4 h en presencia de Golgi-Stop que contiene monensina. La proporción de linfocitos T CD8 específicos de NLV con respecto a células tumorales MV-3 es de 1:8.
Las figuras 22A-E y 23A-E se refieren al ensayo de activación con linfocitos T CD8 específicos de HLA-A2-NLV y línea celular de melanoma humano HLA-A2+ FAP+ pulsada con NLV MV-3 en presencia de una concentración valorada diferente de diferentes construcciones (kih) de Fc-ligando de 4-1BB humano trimérico escindido no dirigido o dirigido a FAP como se prepara en el ejemplo 1. Para una mejor visualización, las curvas de expresión se dividieron en varios diagramas de visualización diferentes con la construcción 1.1 ((kih) de Fcligando de 4-1BB humano trimérico escindido dirigido a FAP monovalente) y el control B ((kih) de Fc-ligando de 4-1BB humano trimérico escindido no dirigido monovalente) como curvas de comparación. Los resultados se obtuvieron en cuatro experimentos similares independientes y muestran que la secreción de IFNy y expresión de CD137 prolongadas de linfocitos T CD8+ pulsados con NLV es estrictamente dependiente de la activación simultánea de los linfocitos T por medio del reconocimiento de complejos NLV-HLA-A2 (señal 1) y el desencadenamiento de 4-1BB por 4-1BBL escindido humano dirigido a FAP (señal 2). El efecto de la regulación por incremento de 4-1BB se muestra en las gráficas de la figura 22, mientras que el efecto de la expresión de INFy de linfocitos T CD8+ se presenta en las gráficas de la figura 23. Se muestra siempre la frecuencia en porcentaje de células positivas en la población de linfocitos T CD8+ total. Todas las variantes dirigidas a FAP indujeron una mejora en la activación similar de linfocitos T CD8 activados con péptido NLV mostrada en la figura 22 como regulación por incremento de 4-1BB (bucle de autorregulación positiva) y en la figura 23 como expresión de IFNy después de 24 h de estimulación. Las diferencias de las curvas entran en el intervalo de la desviación de error normal y no son significativas.
Las figuras 24 y 25 se refieren al ensayo de activación con linfocitos T CD8 específicos de HLA-A2-NLV y línea celular de melanoma humano HLA-A2+ FAP+ pulsada con NLV MV-3 en presencia de una concentración valorada de diferentes construcciones (kih) de Fc-ligando de 4-1BB humano trimérico escindido no dirigido o dirigido a FAP de Ejemplo 2. Para una mejor visualización, las curvas de expresión se dividieron en dos diagramas de visualización diferentes con la construcción 2.1 ((kih) de Fc-ligando de 4-1BB humano trimérico escindido dirigido a FAP monovalente) y el control B como curvas de comparación. Todas las construcciones (kih) de Fc-ligando de 4-1BB humano trimérico escindido dirigido a FAP muestran una mejora en la activación similar de linfocitos T CD8 específicos de HLA-A2-péptido NLV mostrada en la figura 24 como regulación por incremento de 4-1 BB (bucle de autorregulación positiva) y en la figura 25 como expresión de IFNy después de 24 h de estimulación. Las diferencias de las curvas entran en el intervalo de la desviación de error normal y no son significativas.
Figura 26: Este esquema ilustra el experimento como se describe en el ejemplo 6.4.
La figura 27 muestra la inducción de la proliferación de linfocitos T CD8+. Se muestra la frecuencia de linfocitos T CD8+ en proliferación frente a la concentración de construcciones sometidas a prueba.
La figura 28A se refiere al experimento FC de dosis única de la construcción 1.2 y el control B en ratones NOG sanos. Se muestra el descenso en la concentración de la construcción con el tiempo. La figura 28B muestra los resultados del experimento FC de dosis única de las construcciones 2.1,2.3, control B y control C en ratones NOG portadores de tumor humanizados con células madre. La figura 28C se refiere al experimento FC de dosis única que compara la construcción 2.1 y 2.3 en ratones NOG sanos.
La figura 29 muestra los componentes para el ensamblaje de ligandos de 4-1BB humanos triméricos escindidos. La figura (29A) muestra el ligando dimérico que se fusiona en el extremo C a un dominio CL humano con las mutaciones E123R y Q124K (residuos cargados) y la figura (29B) muestra el ligando de 4-1BB monomérico fusionado al dominio CH1 humano con las mutaciones K147E y K213E (residuos cargados). Componentes para el ensamblaje de molécula de unión a antígeno de ligando de 4-1BB humano trimérico escindido (71-254) dirigido a CD19 bivalente (construcción 3.3). La figura (29C) muestra el ligando dimérico que está fusionado al extremo C de la cadena de ojal de Fc de IgG1 humana. La figura (29D) muestra el ligando monomérico que está fusionado al extremo C de la cadena de botón de Fc de IgG1 humana.
La figura 30 muestra las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de 4-1BBL dirigido a CD19, construcciones 3.1 a 3.6 de la invención. La preparación y producción de estas construcciones se describen en el ejemplo 3. Los dominios VH y VL son los del anticuerpo anti-CD19 8B8-018, el punto negro grueso representa la modificación de botón-en-ojal. * simboliza modificaciones aminoacídicas en el dominio CH1 y CL (llamados residuos cargados).
En la figura 31A se ilustra la estrategia de aleatorización para las regiones CDR del clon original 8B8. Se muestran los dominios variables del clon original 8B8 y las regiones CDR (encuadradas) de acuerdo con la numeración de Kabat. (X) representa las posiciones aletorizadas. La figura 31B muestra la descripción esquemática de las estrategias de generación de colecciones. Se muestra la amplificación por PCR y la estrategia de clonación usada para la generación de la colección basada en 8B8 con A) regiones CDR1 y c DR2 aletorizadas en la cadena ligera y pesada o B) regiones CDR1 y CDR3 aletorizadas en la cadena ligera y región CDR3 en la cadena pesada. Se indican las respectivas enzimas usadas para la clonación en el fagémido.
La figura 32 muestra la alineación del clon anti-CD19 original 8B8 con las proteínas fijadoras maduradas en afinidad seleccionadas. Se muestran las secuencias del clon 8B8 y todas las proteínas fijadoras maduradas en afinidad seleccionadas. Las CDR de ambas cadenas pesada y ligera se enmarcan.
La figura 33 se refiere al análisis RPS del clon 8B8 original y sus variantes maduradas en afinidad. Se muestran los sensogramas del clon 8B8 y sus derivados madurados en afinidad que están desprovistos de los puntos calientes LCDR1 N27d y N28.
La figura 34 ilustra la configuración del ensayo que mide la unión simultánea de 4-1BBL escindido trimérico dirigido a CD19 a hu4-1BB y huCD19 (ejemplo 8.2).
Las gráficas en la figura 35 muestran la unión simultánea de las moléculas de unión a antígeno de fusión Fc-4-1BBL trimérico dirigido a CD19, construcciones 3.1, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6 y 4.4 (analito 1) a 4-1BB humano inmovilizado y CD19 humano (analito 2).
La figura 36 muestra la unión de diferentes construcciones (kih) de Fc-ligando de 4-1BB humano trimérico escindido Fc no dirigido o dirigido a CD19 a linfocitos T CD4 y CD8 que expresan 4-1BB de PBMC humanas preactivadas de PHA-L y proleucina y reactivadas anti-CD3 humano/anti-CD28 humano. La unión se detectó con el fragmento F(ab')2 de IgG de cabra específico de Fcy anti-IgG humana conjugado con fluorocromo R-ficoeritrina. Se muestra la mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) frente a la concentración de construcciones sometidas a prueba. Para una mejor visualización, las curvas de unión se dividen en tres diagramas diferentes con la construcción 3.4 y el control F (P329G LALA huIgG1 de control de isotipo) como curvas de comparación. Se realizó un seguimiento de la unión en linfocitos T CD45+ CD3+ CD8+ (figura 36A) y linfocitos T CD45+ CD3+ CD4+ (figura 36B). El nivel de expresión de 4-1BB en linfocitos T CD8 normalmente es mayor que en linfocitos T CD4. Todas las construcciones se unen con una afinidad bastante similar a 4-1BB humano.
La figura 37 muestra la unión de moléculas de unión a antígeno de (kih) de Fc-ligando de 4-1BB humano trimérico escindido no dirigido o dirigido a CD19 a líneas celulares de linfoma de linfocitos B que expresan CD19 humano: linfoma difuso de linfocitos B grandes no hodgkiniano SU-DHL-8 (37A), leucemia linfocítica precursora de linfocitos B aguda Nalm6 (37B), linfoma difuso linfoblástico de células grandes Toledo (37C) y linfoma difuso de linfocitos B grandes OCI-Ly18 (37D). La unión se detectó con los fragmentos F(ab')2 de IgG de cabra específico de Fcy anti-IgG humana conjugados con fluorocromo R-ficoeritrina. Se muestra la mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) frente a la concentración de construcciones sometidas a prueba. Para una mejor visualización, las curvas de unión se dividen en tres diagramas diferentes con la construcción 3.4 y el control F (P329G LALA huIgG1 de control de isotipo) como curvas de comparación. Todas las construcciones se unen con una afinidad bastante similar a CD19 humano.
La figura 38 se refiere a la expresión y actividad de luciferasa inducida por activación de NFkB de moléculas de unión a antígeno de (kih) de Fc-ligando de 4-1BB humano trimérico escindido no dirigido o dirigido a CD19. Las unidades de luz liberada (URL) se miden durante 0,5 s/pocillo y se representan frente a la concentración usada de construcciones (kih) de Fc-ligando de 4-1BB humano trimérico escindido no dirigido o dirigido a CD19 3.1 y 3.3 y moléculas de control B y C. Las células indicadoras HeLa que expresan 4-1BB humano se incubaron durante 7,5 h en ausencia o presencia de células Pfeiffer o SU-DHL-8 que expresan CD19 humano de reticulación. Las URL se midieron y se representaron frente a las concentraciones de diferentes construcciones (kih) de Fc-ligando de 4-1BB humano trimérico escindido no dirigido o dirigido a CD19. La proporción celular es de una célula indicadora HeLa que expresa 4-1 BB con respecto a 2,5 o cinco células tumorales.
La figura 39 muestra la unión de diferentes variantes humanizadas de IgG T84.66 en células de adenocarcinoma gástrico humanas que expresan CEA. En base a los datos, se seleccionó la variante humanizada 1 para incluirla en las moléculas de unión a antígeno de (kih) de Fc-ligando de 4-1BB humano trimérico dirigido a CEA.
La figura 40 muestra las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de 4-1BBL dirigido a CEA, construcciones 5.1 a 5.6 de la invención. La preparación y producción de estas construcciones se describen en el ejemplo 11. Los dominios VH y VL son los del anticuerpo anti-CEA T84.66-LCHA, el punto negro grueso representa la modificación de botón-en-ojal. * simboliza modificaciones aminoacídicas en el dominio CH1 y CL (llamados residuos cargados).
La figura 41A muestra una descripción esquemática de NA3B3A2 humano-avi His, el antígeno usado para evaluar la unión de moléculas de unión a antígeno de (kih) de Fc-4-1BBL escindido trimérico dirigido a CEA. La figura 41B ilustra la configuración del ensayo que mide la unión simultánea de 4-1BBL escindido trimérico dirigido a CEA a hu4-1BB y NA3B3A2 humano (ejemplo 12.1).
Las gráficas en la figura 42 muestran la unión simultánea de las moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc-4-1 BBL trimérico dirigido a CEA, construcciones 5.4, 5.6, 5.7 y 5.8 (analito 1) a 4-1 BB humano inmovilizado y NA3B3A2 humano (analito 2).
La unión de diferentes construcciones (kih) de Fc-ligando de 4-1BB humano trimérico escindido no dirigido o dirigido a CEA a linfocitos T CD4 y CD8 que expresan 4-1BB de PBMC humanas preactivadas de PHA-L y proleucina y reactivadas anti-CD3 humano/anti-CD28 humano se muestra en la figura 43. La unión se detectó con el fragmento F(ab')2 de IgG de cabra específico de Fcy anti-IgG humana conjugado con fluorocromo R-ficoeritrina. Se muestra la mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) frente a la concentración de construcciones sometidas a prueba. Para una mejor visualización, las curvas de unión se dividen en dos diagramas diferentes con la construcción 5.4 y el control F (P329G LALA huIgG1 de control de isotipo) como curvas de comparación. Se realizó un seguimiento de la unión en linfocitos T CD45+ CD3+ CD8+ (diagramas en la parte inferior) y linfocitos T CD45+ CD3+ CD4+ (diagramas en la parte superior). El nivel de expresión de 4-1BB en linfocitos T CD8 normalmente es mayor que en linfocitos T CD4. Todas las construcciones se unen con afinidad bastante similar a 4-1 BB humano.
La figura 44 muestra la unión de construcciones (kih) de Fc-ligando de 4-1BB humano trimérico escindido no dirigido o dirigido a CEA a la línea celular gástrica humana que expresa CEA humano MKN-45 (izquierda) y línea celular de adenocarcinoma colorrectal humana LS180 (derecha). La unión se detectó con los fragmentos F(ab')2 de IgG de cabra específico de Fcy anti-IgG humana conjugados con fluorocromo R-ficoeritrina. Se muestra la mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) frente a la concentración de construcciones sometidas a prueba.
La figura 45 se refiere a la expresión y actividad de luciferasa inducida por activación de NFkB de moléculas de unión a antígeno de (kih) de Fc-ligando de 4-1BB humano trimérico escindido no dirigido o dirigido a CEA. Las unidades de luz liberada (URL) se miden durante 0,5 s/pocillo y se representan frente a la concentración usada de construcciones (kih) de Fc-ligando de 4-1 BB humano trimérico escindido no dirigido o dirigido a CEA 5.4, 5.6, 5.7 y 5.8 y moléculas de control. Las células indicadoras HeLa que expresan 4-1BB humano se incubaron durante 6 h en ausencia o presencia de la línea celular de cáncer gástrico humana que expresa CEA humano de reticulación MKN-45. La proporción celular es de una célula indicadora HeLa que expresa 4-1BB con respecto a tres células tumorales.
En las figuras 46A y 46B se muestran los componentes para el ensamblaje del ligando de OX40 humano trimérico escindido dirigido a FAP monovalente (construcción 6.1). La figura 46A se refiere a un ligando dimérico fusionado al dominio CL de IgG1 humana, la figura 46B se refiere a un ligando monomérico fusionado al dominio CH1 de IgG1 humana. La figura 46C muestra la molécula de unión a antígeno que contiene el trímero OX40L dirigido a FAP, construcción 6.1. En la figura 46D se muestra PGLALA IgG1 humana "no dirigido", DP47 (control F).
La figura 47A muestra la unión de Ox40L humano trimérico escindido dirigido a FAP a células WM-266-4 positivas para FAP. Las células WM-266-4 expresan altos niveles de proteína de activación de fibroblastos humana (huFAP). Solo las construcciones (kih) de Fc-ligando de OX40 dirigido a FAP (cuadrado negro) pero no el control 5 (rombo negro) se unieron a células WM-266-4. Se muestra la unión como la mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) del fragmento F(ab')2 de IgG de cabra específico de Fcy anti-IgG humana marcado con isotiocianato de fluoresceína que se usa como anticuerpo de detección secundario. La MFI se midió por citometría de flujo. El eje x muestra la concentración de construcciones de anticuerpos. La figura 47B muestra la unión de la construcción (kih) de Fc-ligando de OX40 dirigido a FAP a células A549 NucLight Red negativas para Ox40 humano FAP humana. La construcción (kih) de Fc-ligando de OX40 dirigido a FAP no mostró unión a células tumorales A549 negativas para FAP negativas para OX40. Se muestra la unión como la mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) del fragmento F(ab')2 de IgG de cabra específico de Fcy anti-IgG humana marcado con FITC que se usa como anticuerpo de detección secundario. La MFI se midió por citometría de flujo y se corrigió el valor de referencia restando la MFI del control en blanco.
En la figura 48A se muestra la unión de FAP-Ox40L a linfocitos T CD4 humanos en reposo y activados. Ox40 no se expresa en linfocitos T CD4 humanos en reposo (lado izquierdo). En ausencia de células que expresan Ox40 humano no se observó unión (gráficas izquierdas). Después de la activación de PBMC humanas Ox40 se regula por incremento en linfocitos T CD4+ (lado derecho). FAP-Ox40F unido a linfocitos T CD4 activados Ox40+. Se muestra la unión como la mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) del fragmento F(ab')2 de IgG de cabra específico de Fcy anti-IgG humana marcado con FITC que se usa como anticuerpo de detección secundario. La MFI se midió por citometría de flujo y se corrigió el valor de referencia restando la MFI del control en blanco. El eje x muestra la concentración de construcciones de anticuerpos. La figura 48B muestra que Ox40 no se expresa en linfocitos T CD8 humanos en reposo (lado izquierdo). En ausencia de células que expresan Ox40 humano no se observó unión (gráficas izquierdas). Después de la activación de PBMc humanas Ox40 se regula por incremento en linfocitos T CD8+ (lado derecho). La expresión de Ox40 en linfocitos T CD8+ humanos es menor que en linfocitos T CD4+ y varía entre donantes y puntos temporales. La expresión de Ox40 fue baja en los linfocitos T CD8 representados. FAp-Ox40L unido a linfocitos T CD8 activados Ox40+. Se muestra la unión como la mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) del fragmento F(ab')2 de IgG de cabra específico de Fcy anti-IgG humana marcado con FITC que se usa como anticuerpo de detección secundario. La MFI se midió por citometría de flujo y se corrigió el valor de referencia restando la MFI del control en blanco. El eje x muestra la concentración de construcciones de anticuerpos.
En la figura 49 se demuestra la activación de la vía de señalización de NFkB por la molécula de unión a antígeno de OX40L humano trimérico escindido dirigido a FAP (FAP-OX40L) en células indicadoras HeLa_hOx40_NFkB_Luc 1. Se muestra la activación con (gráfica derecha) o sin (gráfica izquierda) reticulación por el anticuerpo secundario. Las células indicadoras se cultivaron durante 5 horas en presencia de FAP-OX40L a las concentraciones indicadas con o sin fragmento F(ab)2 de IgG de cabra específico de Fcy anti-huIgG1 policlonal secundario de reticulación en una proporción 1:2. La actividad de luciferasa se evaluó como se describe en el ejemplo 6.1. La actividad se caracteriza representando las unidades de luz liberada (URL) medidas durante 0,5 s frente a la concentración en nM de construcción sometida a prueba. Las URL se emiten debido a la oxidación mediada por luciferasa de luciferina a oxiluciferina.
La activación de NFkB por LAP-OX40L en células indicadoras HeLa_hOx40_NLKB_Luc 1 en presencia de células positivas para fA p se muestra en la figura 50A. Se muestra la activación de la vía de señalización de NFkB en las células indicadoras por FAP-OX40L en presencia de células NIH-3T3 de FAP humana que expresan FAP con baja expresión (proporción 3 células tumorales FAP+ con respecto a 1 célula indicadora). La actividad de luciferasa mediada por NFkB se caracterizó representando las unidades de luz liberada (URL), medidas durante 0,5 s, frente a la concentración en nM de los compuestos sometidos a prueba. Las URL se emiten debido a la oxidación mediada por luciferasa de luciferina a oxiluciferina. En los valores se corrige el valor de referencia restando las URL del control en blanco. Para una mejor comparación, las áreas bajo la curva de las respectivas curvas de respuesta a la dosis representadas se cuantificaron como marcador para la capacidad agonista de cada construcción. La comparación se ilustra en la figura 50B. El área se calculó usando GraphPad Prism. En los valores se corrige el valor de referencia restando el valor del control en blanco.
La figura 51 muestra la coestimulación mediada por OX40 de PBMC humanas en reposo desencadenada por TCR subóptimamente (ejemplo 15.5). La hiperreticulación de FAP-Ox40L por las células NIH/3T3-clon 39 huFAP presentes promovió fuertemente la supervivencia y proliferación en linfocitos T CD4 y CD8 humanos. Se muestra el recuento de acontecimientos de linfocitos T CD4+ (izquierda) y CD8+ (derecha) vitales. Se restan los valores de referencia de las muestras que contienen solo el anti-CD3 humano (clon V9, huIgG1), PBMC humanas en reposo y NIH/3T3-clon 39 huFAP. Por tanto, aquí se muestra el efecto de potenciación de la coestimulación de OX40 pero no el efecto de estimulación anti-CD3 subóptimo per se. En las figuras, en el fondo, se muestra el rescate de la estimulación por TCR subóptima de PBMC humanas en reposo con FAP-Ox40L inmovilizado en la superficie celular - proliferación.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Definiciones
A menos que se defina de otro modo, los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se usa en general en la técnica a la que la presente invención pertenece. Para los propósitos de interpretación de la presente memoria descriptiva, las siguientes definiciones se aplicarán y, cuando se apropiado, los términos usados en singular también incluirán el plural y viceversa.
Como se usa en el presente documento, el término "molécula de unión a antígeno" se refiere en su sentido más amplio a una molécula que se une específicamente a un determinante antigénico. Los ejemplos de moléculas de unión a antígeno son anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y proteínas de unión a antígeno del andamio.
Como se usa en el presente documento, el término "resto que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana" se refiere a un molécula polipeptídica que se une específicamente a un determinante antigénico. En un aspecto, el resto de unión a antígeno puede activar la señalización a través de su antígeno de célula diana. En un aspecto particular, el resto de unión a antígeno puede dirigir la entidad a la que se une (por ejemplo, el trímero de ligando de la familia de TNF) a un sitio diana, por ejemplo a un tipo específico de célula tumoral o estroma tumoral que porta el determinante antigénico. Los restos que se pueden unir específicamente a un antígeno de célula diana incluyen anticuerpos y fragmentos de los mismos como se define además en el presente documento. Además, restos que se pueden unir específicamente a un antígeno de célula diana incluyen proteínas de unión a antígeno del andamio como se define además en el presente documento, por ejemplo, dominios de unión que se basan en proteínas con repeticiones diseñadas o dominios de repetición diseñados (véase por ejemplo, el documento WO 2002/020565).
En relación con un anticuerpo o fragmento del mismo, el término "resto que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana" se refiere a la parte de la molécula que comprende el área que se une específicamente a y es complementaria a parte o la totalidad de un antígeno. Un resto que se puede unir a antígeno específicamente se puede proporcionar, por ejemplo, por uno o más dominios variables de anticuerpo (también llamadas regiones variables de anticuerpo). En particular, un resto que se puede unir a antígeno específicamente comprende una región variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo y una región variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo.
El término "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido más amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpos, incluyendo pero sin limitarse a anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoespecíficos y multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo siempre que presenten la actividad de unión a antígeno deseada.
El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones naturales o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, estando presentes en general dichas variantes en cantidades escasas. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos frente a diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige frente a un único determinante en un antígeno.
El término anticuerpo "monoespecífico" como se usa en el presente documento indica un anticuerpo que tiene uno o más sitios de unión de los que cada uno se une al mismo epítopo del mismo antígeno. El término "biespecífica" quiere decir que la molécula de unión a antígeno se puede unir específicamente a al menos dos determinantes antigénicos distintos. Típicamente, una molécula de unión a antígeno biespecífica comprende dos sitios de unión a antígeno, de los que cada uno es específico para un determinante antigénico diferente. En determinados modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica se puede unir simultáneamente a dos determinantes antigénicos, en particular dos determinantes antigénicos expresados en dos células distintas.
El término "valente" como se usa dentro de la solicitud actual indica la presencia de un número específico de sitios de unión en una molécula de unión a antígeno. Como tales, los términos "bivalente", "tetravalente" y "hexavalente" indican la presencia de dos sitios de unión, cuatro sitios de unión y seis sitios de unión, respectivamente, en una molécula de unión a antígeno.
Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo inalterado", y "anticuerpo completo" se usan en el presente documento de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo natural. "Anticuerpos naturales" se refieren a moléculas de inmunoglobulina naturales con estructuras variables. Por ejemplo, los anticuerpos de clase IgG naturales son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que se unen con disulfuro. Desde el extremo N al C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también llamada dominio pesado variable o dominio variable de la cadena pesada, seguida de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3), también llamados región constante de la cadena pesada. De forma similar, del extremo N al C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también llamada dominio ligero variable o dominio variable de la cadena ligera, seguida de un dominio constante de la cadena ligera (CL), también llamado región constante de la cadena ligera. La cadena pesada de un anticuerpo se puede asignar a uno de cinco tipos, llamados a (IgA), ó (IgD), £ (IgE), y (IgG), o p (IgM), de los que algunos se pueden dividir además en subtipos, por ejemplo, y1 (IgG1), y2 (IgG2), y3 (IgG3), y4 (IgG4), a l (IgA1) y a2 (IgA2). La cadena ligera de un anticuerpo se puede asignar a uno de dos tipos, llamados kappa (k) y lambda (A), en base a la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.
Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo inalterado que comprende una porción de un anticuerpo inalterado que se une al antígeno al que se une el anticuerpo inalterado. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen pero no se limitan a Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, fragmentos cross-Fab; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenarias (por ejemplo, scFv); y anticuerpos de dominio único. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpo, véase Hudson, et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Para una revisión de los fragmentos scFv, véase, por ejemplo, Plückthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, p. 269-315 (1994); véanse también el documento WO 93/16185; y las patentes de EE. UU. n.° 5.571.894 y 5.587.458. Para un análisis de los fragmentos Fab y F(ab')2 que comprenden residuos del epítopo de unión al receptor de rescate y que tienen un incremento en la semivida in vivo, véase la patente de EE. UU. n.° 5.869.046. Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos, véanse, por ejemplo, los documentos EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003); y Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993). También se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden todo o una porción del dominio variable de la cadena pesada o todo o una porción del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En determinados modos de realización, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.248.516 B1). Se pueden preparar fragmentos de anticuerpo por diversas técnicas, incluyendo pero sin limitarse a, digestión proteolítica de un anticuerpo inalterado, así como la producción por células huésped recombinantes (por ejemplo, E. coli o fago), como se describe en el presente documento.
La digestión con papaína de anticuerpos inalterados produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab" que contienen cada uno los dominios variables de la cadena pesada y ligera y también el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Como se usa en el presente documento, por tanto, el término "fragmento Fab" se refiere a un fragmento de anticuerpo que comprende un fragmento de la cadena ligera que comprende un dominio VL y un dominio constante de una cadena ligera (CL), y un dominio VH y un primer dominio constante (CH1) de una cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab en la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxílico del dominio CH1 de la cadena pesada incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra de anticuerpo. Fab'-SH son fragmentos Fab' en los que el/los residuo(s) de cisteína de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. El tratamiento con pepsina proporciona un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación con antígeno (dos fragmentos Fab) y una parte de la región Fc.
El término "fragmento cross-Fab" o "fragmento xFab" o "fragmento Fab de entrecruzamiento" se refiere a un fragmento Fab, en el que las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera se intercambian. Son posibles dos composiciones de cadena diferentes de una molécula Fab de entrecruzamiento y están comprendidas en los anticuerpos biespecíficos de la invención: por un lado, las regiones variables de la cadena pesada y ligera de Fab se intercambian, es decir, la molécula Fab de entrecruzamiento comprende una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena ligera (VL) y la región constante de la cadena pesada (CH1), y una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena pesada (VH) y la región constante de la cadena ligera (CL). Esta molécula Fab de entrecruzamiento también se denomina CrossFab (vlvh). Por otro lado, cuando las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de Fab se intercambian, la molécula Fab de entrecruzamiento comprende una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena pesada (VH) y la región constante de la cadena ligera (CL), y una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena ligera (VL) y la región constante de la cadena pesada (CH1). Esta molécula Fab de entrecruzamiento también se denomina CrossFab (clch1).
Un "fragmento Fab monocatenario" o "scFab" es un polipéptido que consiste en un dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo, un dominio constante 1 (CH1) de anticuerpo, un dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo, un dominio constante de la cadena ligera (CL) de anticuerpo y un conector, en el que dichos dominios de anticuerpo y dicho conector tienen uno de los siguientes órdenes en sentido de N terminal a C terminal: a) VH-CH1-conector-VL-CL, b) VL-CL-conector-VH-CH1, c) VH-CL-conector-VL-CH1 o d) VL-CH1 -conector-VH-CL; y en el que dicho conector es un polipéptido de al menos 30 aminoácidos, preferentemente de entre 32 y 50 aminoácidos. Dichos fragmentos Fab monocatenarios se estabilizan por medio del enlace disulfuro natural entre el dominio CL y el dominio CH1. Además, estas moléculas Fab monocatenarias se podrían estabilizar además por generación de enlaces disulfuro intercatenarios por medio de la inserción de residuos de cisteína (por ejemplo, la posición 44 en la cadena pesada variable y la posición 100 en la cadena ligera variable de acuerdo con la numeración de Kabat).
Un "fragmento Fab monocatenario de entrecruzamiento" o "x-scFab" es un polipéptido que consiste en un dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo, un dominio constante 1 (CH1) de anticuerpo, un dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo, un dominio constante de la cadena ligera (CL) de anticuerpo y un conector, en el que dichos dominios de anticuerpo y dicho conector tienen uno de los siguientes órdenes en sentido de N terminal a C terminal: a) VH-CL-conector-VL-CH1 y b) VL-CH1-conector-VH-CL; en el que VH y VL forman juntos un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno y en el que dicho conector es un polipéptido de al menos 30 aminoácidos. Además, estas moléculas x-scFab se podrían estabilizar además por generación de enlaces disulfuro intercatenarios por medio de la inserción de residuos de cisteína (por ejemplo, la posición 44 en la cadena pesada variable y la posición 100 en la cadena ligera variable de acuerdo con la numeración de Kabat).
Un "fragmento variable monocatenario (scFv)" es una proteína de fusión de las regiones variables de las cadenas pesada (Vh) y ligera (Vl) de un anticuerpo, conectada con un péptido conector corto de diez a aproximadamente 25 aminoácidos. Normalmente el conector es rico en glicina para su flexibilidad, así como en serina o treonina para su solubilidad, y puede conectar el extremo N de Vh con el extremo C de Vl, o bien viceversa. Esta proteína mantiene la especificidad del anticuerpo original, a pesar de la retirada de las regiones constantes y la introducción del conector. Los anticuerpos scFv se describen, por ejemplo, en Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96). Además, los fragmentos de anticuerpo comprenden polipéptidos monocatenarios que tienen las características de un dominio VH, a saber, que se pueden ensamblar conjuntamente con un dominio VL, o de un dominio VL, a saber, que se pueden ensamblar conjuntamente con un dominio VH a un sitio de unión a antígeno funcional y proporcionar de este modo la propiedad de unión a antígeno de los anticuerpos de longitud completa.
Las "proteínas de unión a antígeno del andamio" son conocidas en la técnica, por ejemplo, la fibronectina y proteínas con repeticiones de anquirina diseñadas (DARPins) se han usado como andamios alternativos para los dominios de unión a antígeno, véase, por ejemplo, Gebauer y Skerra, Engineered protein scaffolds as nextgeneration antibody therapeutics. Curr Opin Chem Biol 13:245-255 (2009) y Stumpp et al., Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today 13: 695-701 (2008). En un aspecto de la invención, una proteína de unión a antígeno del andamio se selecciona del grupo que consiste en CTLA-4 (Evibody), lipocalinas (anticalina), una molécula derivada de proteína A tal como dominio Z de proteína A (Affibody), n dominio A (Avimer/Maxibody), una transferrina sérica (trans-body); una proteína con repeticiones de anquirina diseñadas (DARPin), un dominio variable de la cadena ligera o cadena pesada de anticuerpo (anticuerpo de dominio único, sdAb), un dominio variable de la cadena pesada de anticuerpo (nanocuerpo, aVH), fragmentos Vnar, una fibronectina (AdNectin), un dominio de lectina de tipo C (tetranectina); un dominio variable de un nuevo receptor de antígeno de beta-lactamasa (fragmentos Vnar), a ubiquitina o cristalina gamma humana (moléculas Affilin); un dominio de tipo kunitz de inhibidores de proteasas humanas, microcuerpos tales como las proteínas de la familia knottin, aptámeros peptídicos y fibronectina (adnectina).
CTLA-4 (antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos 4) es un receptor de la familia de CD28 expresado principalmente en linfocitos T CD4+. Su dominio extracelular tiene un pliegue de Ig como un dominio variable. Los bucles correspondientes a CDR de anticuerpos se pueden sustituir con secuencia heteróloga para conferir diferentes propiedades de unión. Las moléculas CTLA-4 genomanipuladas para tener diferentes especificidades de unión también son conocidas como Evibodies (por ejemplo, documento US7166697B1). Los Evibodies tienen aproximadamente el mismo tamaño que la región variable aislada de un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo de dominio). Para detalles adicionales, véase Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001).
Las lipocalinas son una familia de proteínas extracelulares que transportan moléculas hidrófobas pequeñas tales como esteroides, bilinas, retinoides y lípidos. Tienen un estructura secundaria de lámina beta rígida con un número de bucles en el extremo abierto de la estructura cónica que se pueden genomanipular para unirse a diferentes antígenos diana. Las anticalinas tienen entre 160-180 aminoácidos de tamaño, y se derivan de lipocalinas. Para detalles adicionales, véanse Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000), documentos US7250297B1 y US20070224633.
Un Affibody es un andamio derivado de la proteína A de Staphylococcus aureus que se puede genomanipular para unirse al antígeno. El dominio consiste en un haz de tres hélices de aproximadamente 58 aminoácidos. Se han generado colecciones por aleatorización de residuos de superficie. Para detalles adicionales, véanse Protein Eng. Des. Sel. 17, 455-462 (2004) y el documento EP 1641818A1.
Las Avimers son proteínas multidominio derivadas de la familia de andamio de dominio A. Los dominios naturales de aproximadamente 35 aminoácidos adoptan una estructura unida a disulfuro definida. La diversidad se genera reordenando la variación natural presentada por la familia de dominios A. Para detalles adicionales, véanse Nature Biotechnology 23(12), 1556 - 1561 (2005) y Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909917 (junio 2007).
Una transferrina es una glucoproteína de transporte sérico monomérica. Las transferrinas se pueden genomanipular para unirse a diferentes antígenos diana por inserción de secuencias peptídicas en un bucle de superficie permisivo. Los ejemplos de andamios de transferrina genomanipulados incluyen el Trans-body. Para detalles adicionales, véase J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999).
Las proteínas con repeticiones de anquirina diseñadas (DARPins) se derivan de anquirina que es una familia de proteínas que median en la unión de proteínas integrales de la membrana al citoesqueleto. Una repetición de anquirina individual es un motivo de 33 residuos que consiste en dos hélices alfa y una vuelta beta. Se pueden genomanipular para unirse a diferentes antígenos diana aleatorizando residuos en la primera hélice alfa y una vuelta beta de cada repetición. Su interfase de unión se puede incrementar incrementando el número de modules (un procedimiento de maduración de la afinidad). Para detalles adicionales, véanse J. Mol. Biol.
332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) y J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007) y el documento US20040132028A1.
Un anticuerpo de dominio único es un fragmento de anticuerpo que consiste en un dominio de anticuerpo variable monomérico único. El primer dominio único se derivó del dominio variable de la cadena pesada de anticuerpo de camélidos (nanocuerpos o fragmentos VHH). Además, el término anticuerpo de dominio único incluye un dominio variable de la cadena pesada humano autónomo (aVH) o fragmentos VNAR derivados de tiburones.
La fibronectina es un andamio que se puede genomanipular para unirse a un antígeno. La adnectina consiste en una cadena principal de la secuencia de aminoácidos natural del 10.° dominio de las 15 unidades de repetición de fibronectina humana tipo III (FN3). Tres bucles en un extremo del sándwich beta se pueden genomanipular para permitir que una adnectina reconozca específicamente una diana terapéutica de interés. Para detalles adicionales, véanse Protein Eng. Des. Sel. 18, 435-444 (2005), documentos US20080139791, WO2005056764 y US6818418B1.
Los aptámeros peptídicos son moléculas de reconocimiento combinatorias que consisten en una proteína de andamio constante, típicamente tiorredoxina (TrxA) que contiene un bucle peptídico variable restringido insertado en el sitio activo. Para detalles adicionales, véase Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005).
Los microcuerpos se derivan de microproteínas naturales de 25-50 aminoácidos de longitud que contienen 3­ 4 puentes de cisteína (los ejemplos de microproteínas incluyen KalataBI y conotoxina y knottins). Las microproteínas tienen un bucle que se puede genomanipular para incluir hasta 25 aminoácidos sin afectar al pliegue total de la microproteína. Para detalles adicionales de dominios knottin genomanipulados, véase el documento WO2008098796.
Una "molécula de unión a antígeno que se une al mismo epítopo" como molécula de referencia se refiere a una molécula de unión a antígeno que bloquea la unión de la molécula de referencia a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más, y a la inversa, la molécula de referencia bloquea la unión de la molécula de unión a antígeno a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más.
El término "dominio de unión a antígeno" se refiere a la parte de una molécula de unión a antígeno que comprende el área que se une específicamente a y es complementaria a parte o la totalidad de un antígeno. Cuando un antígeno es grande, un molécula de unión a antígeno solo se puede unir a una parte particular del antígeno, parte que se denomina epítopo. Un dominio de unión a antígeno se puede proporcionar, por ejemplo, por uno o más dominios variables (también llamados regiones variables). Preferentemente, un dominio de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo y una región variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo.
Como se usa en el presente documento, el término "determinante antigénico" es sinónimo de "antígeno" y "epítopo" y se refiere a un sitio (por ejemplo, un tramo contiguo de aminoácidos o una configuración conformacional compuesta por diferentes regiones de aminoácidos no contiguos) en una macromolécula polipeptídica a la que se une un resto de unión a antígeno, formando un complejo de resto de unión a antígenoantígeno. Los determinantes antigénicos útiles se pueden encontrar, por ejemplo, en las superficies de células tumorales, en las superficies de células infectadas por virus, en las superficies de otras células afectadas, en la superficie de células inmunitarias, libres en suero sanguíneo y/o en la matriz extracelular (ECM). Las proteínas útiles como antígenos en el presente documento pueden ser cualquier forma natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. En un modo de realización particular, el antígeno es una proteína humana. Cuando se hace referencia a una proteína específica en el presente documento, el término engloba la proteína no procesada "de longitud completa" así como cualquier forma de la proteína que resulte del procesamiento en la célula. El término también engloba variantes naturales de la proteína, por ejemplo, variantes de ayuste o variantes alélicas.
Por "unión específica" se quiere decir que la unión es selectiva para el antígeno y se puede discriminar de las interacciones no deseadas o inespecíficas. La capacidad de una molécula de unión a antígeno para unirse a un antígeno específico se puede medir a través de un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) o bien otras técnicas familiares para un experto en la técnica, por ejemplo, técnica de resonancia de plasmón superficial (RPS) (analizado en un instrumento de BIAcore) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), y ensayos de unión tradicionales (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). En un aspecto, el grado de unión de una molécula de unión a antígeno a una proteína no relacionada es menor que aproximadamente un 10 % de la unión de la molécula de unión a antígeno al antígeno como se mide, por ejemplo, por RPS. En determinados modos de realización, una molécula que se une al antígeno tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 pM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0.1 nM, < 0.01 nM, o < 0.001 nM (por ejemplo, 10'8 M o menos, por ejemplo, de 10'8 M a 10'13 M, por ejemplo, de 10'9 M a 10'13 M).
"Afinidad" o "afinidad de unión" se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique de otro modo, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su compañero Y se puede representar en general por la constante de disociación (Kd), que es la proporción de las constantes de velocidad de disociación y asociación (kdis y kas, respectivamente). Por tanto, las afinidades equivalentes pueden comprender diferentes constantes de velocidad, siempre que la proporción de las constantes de velocidad permanezca igual. La afinidad se puede medir por procedimientos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento. Un procedimiento particular para medir la afinidad es la resonancia de plasmón superficial (RPS).
Un "antígeno de célula diana" como se usa en el presente documento se refiere a un determinante antigénico presentado en la superficie de una célula diana, por ejemplo una célula en un tumor tal como una célula cancerosa o una célula del estroma tumoral. En determinados modos de realización, el antígeno de célula diana es un antígeno en la superficie de una célula tumoral. En un modo de realización, el antígeno de célula diana se selecciona del grupo que consiste en proteína de activación de fibroblastos (FAP), antígeno carcinoembrionario (CEA), proteoglucano de sulfato de condroitina asociado a melanoma (MCSP), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), CD19, CD20 y CD33. En particular, el antígeno de célula diana es la proteína de activación de fibroblastos (FAP).
El término "proteína de activación de fibroblastos (FAP)", también conocido como prolil-endopeptidasa FAP o seprasa (EC 3.4.21), se refiere a cualquier FAP natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos) primates no humanos (por ejemplo, macacos cangrejeros) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. El término engloba FAP no procesada "de longitud completa" así como cualquier forma de FAP que resulte del procesamiento en la célula. El término también engloba variantes naturales de FAP, por ejemplo, variantes de ayuste o variantes alélicas. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno de la invención se puede unir específicamente a FAP humana, de ratón y/o de macaco cangrejero. La secuencia de aminoácidos de FAP humana se muestra en UniProt (www.uniprot.org) n.° de acceso Q12884 (versión 149, SEQ ID NO:20), o NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_004451.2. El dominio extracelular (ECD) de FAP humana se extiende de la posición aminoacídica 26 a 760. Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de un ECD de FAP humana marcada con His se muestran en SEQ ID NO 15 y 16, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de FAP de ratón se muestra en n.° de acceso UniProt P97321 (versión 126, SEQ ID NO:23), o NCBI RefSeq NP_032012.1. El dominio extracelular (ECD) de FAP de ratón se extiende de la posición aminoacídica 26 a 761. SEQ ID NO 24 y 25 muestran las secuencias de aminoácidos y nucleótidos, respectivamente, de un ECD de FAP de ratón marcada con His. SEQ ID NO 26 y 27 muestran las secuencias de aminoácidos y nucleótidos, respectivamente, de un ECD de FAP de macaco cangrejero marcada con His. Preferentemente, una molécula de unión anti-FAP de la invención se une al dominio extracelular de FAP. Las moléculas de unión anti-FAP ejemplares se describen en la solicitud de patente internacional n.° WO 2012/020006 A2.
El término "antígeno carcinoembrionario (CEA)", también conocido como molécula de adherencia celular relacionada con antígeno carcinoembrionario 5 (CEACAM5), se refiere a cualquier CEA natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos) primates no humanos (por ejemplo, macacos cangrejeros) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. La secuencia de aminoácidos de CEA humano se muestra en n.° de acceso UniProt P06731 (versión 151, SEQ ID NO:28). Se ha identificado CEA desde hace tiempo como un antígeno asociado a tumor (Gold y Freedman, J Exp Med., 121:439-462, 1965; Berinstein N. L., J Clin Oncol., 20:2197-2207, 2002). Originalmente clasificado como una proteína expresada solo en tejido fetal, ahora se ha identificado CEA en varios tejidos adultos normales. Estos tejidos son principalmente de origen epitelial, incluyendo células de los tubos gastrointestinal, respiratorio y genitourinario, y células de colon, cuello uterino, glándulas sudoríparas y próstata (Nap et al., Tumour Biol., 9(2-3): 145-53, 1988; Nap et al., Cancer Res., 52(8):2329-23339, 1992). Los tumores de origen epitelial, así como sus metástasis, contienen CEA como antígeno asociado a tumor. Aunque la presencia de CEA en sí no indica transformación en una célula cancerosa, la distribución de CEA es indicativa. En tejido normal, en general se expresa CEA en la superficie apical de la célula (Hammarstrom S., Semin Cancer Biol. 9(2):67-81 (1999)), haciéndolo inaccesible al anticuerpo en la circulación sanguínea. Al contrario que el tejido normal, CEA tiende a expresarse sobre toda la superficie de células cancerosas (Hammarstrom S., Semin Cancer Biol. 9(2):67-81 (1999)). Este cambio de patrón de expresión hace que CEA sea accesible a la unión de anticuerpo en células cancerosas. Además, la expresión de CEA se incrementa en células cancerosas. Además, el incremento en la expresión de CEA promueve un incremento en adherencias intercelulares, lo que puede dar lugar a metástasis (Marshall J., Semin Oncol., 30(a Suppl. 8):30-6, 2003). La prevalencia de la expresión de CEA en diversas entidades tumorales es en general muy alta. En concordancia con los datos publicados, los propios análisis realizados en muestras tisulares confirmaron su alta prevalencia, con aproximadamente un 95 % en carcinoma colorrectal (CCR), 90 % en cáncer pancreático, 80 % en cáncer gástrico, 60 % en carcinoma de pulmón no microcítico (CPNM, donde se coexpresa con HER3), y 40 % en cáncer de mama; se encontró baja expresión en carcinoma de pulmón microcítico y glioblastoma.
CEA se escinde fácilmente de la superficie celular y se propaga en la circulación sanguínea desde los tumores, directamente o bien por medio del sistema linfático. Debido a esta propiedad, el nivel de CEA sérico se ha usado como marcador clínico para el diagnóstico de cánceres y cribado para recidiva de cánceres, en particular cáncer colorrectal (Goldenberg D M., The International Journal of Biological Markers, 7:183-188, 1992; Chau I., et al., J Clin Oncol., 22:1420-1429, 2004; Flamini et al., Clin Cancer Res; 12(23):6985-6988, 2006).
El término "proteoglucano de sulfato de condroitina asociado a melanoma (MCSP)", también conocido como proteoglucano de sulfato de condroitina 4 (CSPG4) se refiere a cualquier MCSP natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos) primates no humanos (por ejemplo, macacos cangrejeros) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. La secuencia de aminoácidos de MCSP humano se muestra en n.° de acceso UniProt Q6UVK1 (versión 103, SEQ ID NO:29). El término "receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR)", también llamado protooncogén c-ErbB-1 o proteína tirosina cinasa receptora erbB-1, se refiere a cualquier EGFR natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos) primates no humanos (por ejemplo, macacos cangrejeros) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. La secuencia de aminoácidos de EGFR humano se muestra en n.° de acceso UniProt P00533 (versión 211, SEQ ID NO:30).
El término "CD19" se refiere al antígeno de linfocitos B CD19, también conocido como antígeno de superficie de linfocitos B B4 o antígeno de superficie de linfocitos T Leu-12 e incluye cualquier CD19 natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos) primates no humanos (por ejemplo, macacos cangrejeros) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. La secuencia de aminoácidos de CD19 humano se muestra en n.° de acceso Uniprot P15391 (versión 160, SEQ ID NO:31). El término engloba CD19 humano no procesado "de longitud completa" así como cualquier forma de CD19 humano que resulte del procesamiento en la célula siempre que el anticuerpo como se informa en el presente documento se una al mismo. CD19 es un receptor de superficie celular estructuralmente distinto expresado en la superficie de linfocitos B humanos, incluyendo, pero sin limitarse a, prelinfocitos B, linfocitos B en desarrollo temprano (es decir, linfocitos B inmaduros), linfocitos B maduros a través de la diferenciación terminal en células plasmáticas, y linfocitos B malignos. CD19 se expresa por la mayoría de leucemias linfocíticas agudas de prelinfocitos B (ALL), linfomas no hodgkinianos, leucemias linfocíticas crónicas de linfocitos B (CLL), leucemias prolinfocíticas, tricoleucemias, leucemias linfocíticas agudas comunes y algunas leucemias linfocíticas agudas de linfocitos nulos. La expresión de CD19 en células plasmáticas sugiere además que se puede expresar en tumores de linfocitos B diferenciados tales como mieloma múltiple. Por lo tanto, el antígeno CD19 es una diana para inmunoterapia en el tratamiento de linfoma no hodgkiniano, leucemia linfocítica crónica y/o leucemia linfocítica aguda.
"CD20" se refiere al antígeno de linfocitos B CD20, también conocido como miembro de la subfamilia A de 4 dominios que atraviesan la membrana 1 (MS4A1), antígeno de superficie de linfocitos B B1 o antígeno de superficie de leucocitos Leu-16, e incluye cualquier CD20 natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos) primates no humanos (por ejemplo, macacos cangrejeros) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. La secuencia de aminoácidos de CD20 humano se muestra en n.° de acceso Uniprot P11836 (versión 149, SEQ ID NO:32).
"CD33" se refiere al antígeno de superficie celular mieloide CD33, también conocido como SIGLEC3 o gp67, e incluye cualquier CD33 natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos) primates no humanos (por ejemplo, macacos cangrejeros) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. La secuencia de aminoácidos de CD33 humano se muestra en n.° de acceso Uniprot P20138 (versión 157, SEQ ID NO:33).
El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicado en unir la molécula de unión a antígeno al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural en general tienen estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones estructurales conservadas (FR) y tres regiones hipervariables (HVR). Véase, por ejemplo, Kindt et al., Kuby Immunology, 6.a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007). Un único dominio VH o Vl puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno.
El término "región hipervariable" o "HVR," como se usa en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables"). En general, los anticuerpos tetracatenarios naturales comprenden seis HVR; tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). Las HVR comprenden en general residuos aminoacídicos de los bucles hipervariables y/o de las "regiones determinantes de la complementariedad" (CDR), siendo las últimas las de la mayor variabilidad de secuencia y/o estando implicadas en el reconocimiento antigénico. Los bucles hipervariables ejemplares se producen en los residuos aminoacídicos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), y 96-101 (H3). (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987).) Las CDR ejemplares (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, y CDR-H3) se producen en los residuos aminoacídicos 24-34 de L1, 50-56 de L2, 89-97 de L3, 31-35B de H1, 50-65 de H2, y 95-102 de H3. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).) Las regiones hipervariables (HVR) también se denominan regiones determinantes de la complementariedad (CDR), y estos términos se usan en el presente documento de manera intercambiable en referencia a porciones de la región variable que forman las regiones de unión a antígeno. Esta región particular se ha descrito por Kabat et al., U.S. Dept, of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) y por Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), donde las definiciones incluyen la superposición o subconjuntos de residuos aminoacídicos cuando se comparan entre sí. No obstante, se pretende que la aplicación de cualquier definición para referirse a una CDR de un anticuerpo o variantes del mismo esté dentro del alcance del término como se define y se usa en el presente documento. Los residuos aminoacídicos apropiados que engloban las CDR como se define por cada una de las referencias citadas anteriormente se exponen a continuación en la tabla A como comparación. Los números de residuos exactos que engloba una c Dr particular variarán dependiendo de la secuencia y tamaño de la CDR. Los expertos en la técnica pueden determinar de forma rutinaria qué residuos comprende una CDR particular dada la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo.
TABLA A. Definiciones de CDR1
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1 La numeración de todas las definiciones de CDR en la tabla A está de acuerdo con las convenciones de numeración expuestas por Kabat et al. (véase a continuación).
2 "AbM" con una "b" minúscula como se usa en la tabla A se refiere a las CDR como se define por el programa informático de modelado de anticuerpos "AbM" de Oxford Molecular.
Kabat et al. también definieron un sistema de numeración para las secuencias de la región variable que es aplicable a cualquier anticuerpo. Un experto en la técnica puede asignar inequívocamente este sistema de "numeración de Kabat" a cualquier secuencia de la región variable, sin depender de ningún dato experimental más allá de la propia secuencia. Como se usa en el presente documento, "numeración de Kabat" se refiere al sistema de numeración expuesto por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). A menos que se especifique de otro modo, las referencias a la numeración de posiciones de residuos aminoacídicos específicas en una región variable de anticuerpo son de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat.
Con la excepción de CDR1 en VH, las CDR comprenden en general los residuos aminoacídicos que forman los bucles hipervariables. Las CDR también comprenden "residuos determinantes de la especificidad" o "SDR", que son los residuos que entran en contacto con el antígeno. Los SDR están contenidos dentro de regiones de las CDR llamadas Cd R abreviadas o a-CDR. Las a-CDR ejemplares (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 y a-CDR-H3) se producen en los residuos aminoacídicos 31-34 de L1, 50-55 de L2, 89-96 de L3, 31-35B de H1, 50-58 de H2 y 95-102 de H3. (Véase Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008).) A menos que se indique de otro modo, los residuos de HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo, residuos FR) se numeran en el presente documento de acuerdo con Kabat et al., supra.
Como se usa en el presente documento, el término "madurado en afinidad" en el contexto de moléculas de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpos) se refiere a una molécula de unión a antígeno que se deriva de una molécula de unión a antígeno de referencia, por ejemplo, por mutación, se une al mismo antígeno, preferentemente se une al mismo epítopo, que el anticuerpo de referencia; y tiene mayor afinidad por el antígeno que la molécula de unión a antígeno de referencia. La maduración de la afinidad en general implica la modificación de uno o más residuos aminoacídicos en una o más CDR de la molécula de unión a antígeno. Típicamente, la molécula de unión a antígeno madurada en afinidad se une al mismo epítopo que la molécula de unión a antígeno de referencia inicial.
"Región estructural" o "FR" se refiere a residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable en general consiste en cuatro dominios FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. En consecuencia, las secuencias de HVR y FR en general aparecen en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1 )-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
Una "región estructural humana aceptora" para los propósitos en el presente documento es una región estructural que comprende la secuencia de aminoácidos de una región estructural del dominio variable de la cadena ligera (VL) o una región estructural del dominio variable de la cadena pesada (VH) derivada de una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana, como se define a continuación. Una región estructural humana aceptora "derivada de" una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana puede comprender la misma secuencia de aminoácidos de la misma, o puede contener cambios en la secuencia de aminoácidos. En algunos modos de realización, el número de cambios de aminoácidos es de 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos o 2 o menos. En algunos modos de realización, la región estructural humana aceptora de VL es idéntica en secuencia a la secuencia de la región estructural de inmunoglobulina humana de VL o la secuencia de la región estructural consenso humana.
El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que una porción de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie diferente.
La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante poseído por su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varios de estos se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, ó, £, y y H, respectivamente.
Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos aminoacídicos de HVR no humanas y residuos aminoacídicos de FR humanas. En determinados modos de realización, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las HVR (por ejemplo, CDR) corresponden a las de un anticuerpo no humano, y todas o sustancialmente todas las FR corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender al menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que se ha sometido a humanización. Otras formas de "anticuerpos humanizados" englobadas por la presente invención son aquellas en las que la región constante se ha modificado o cambiado adicionalmente con respecto a la del anticuerpo original para generar las propiedades de acuerdo con la invención, en especial con respecto a la unión a C1q y/o unión al receptor de Fc (FcR).
Un anticuerpo "humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano o una célula humana o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias que codifican anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos.
El término "dominio Fc" o "región Fc" en el presente documento se usa para definir una región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. Una región Fc de IgG comprende un dominio CH2 de IgG y un dominio CH3 de IgG. El "dominio CH2" de una región Fc de IgG humana normalmente se extiende de un residuo aminoacídico aproximadamente en la posición 231 a un residuo aminoacídico aproximadamente en la posición 340. En un modo de realización, una cadena glucídica se une al dominio CH2. El dominio CH2 en el presente documento puede ser un dominio CH2 de secuencia natural o un dominio CH2 variante. El "dominio CH3" comprende el tramo de residuos C terminales a un dominio CH2 en una región Fc (es decir, de un residuo aminoacídico aproximadamente en la posición 341 a un residuo aminoacídico aproximadamente en la posición 447 de una IgG). La región CH3 en el presente documento puede ser un dominio CH3 de secuencia natural o un dominio CH3 variante (por ejemplo, un dominio CH3 con una "protuberancia" introducida ("botón") en una cadena del mismo y una correspondiente "cavidad" introducida ("ojal") en la otra cadena del mismo; véase la patente de EE. UU. n.° 5,821,333, incorporada expresamente en el presente documento por referencia). Dichos dominios CH3 variantes se pueden usar para promover la heterodimerización de dos cadenas pesadas de anticuerpo no idénticas como se describe en el presente documento. En un modo de realización, una región Fc de la cadena pesada de IgG humana se extiende de Cys226, o de Pro230, al extremo carboxilo de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C terminal (Lys447) de la región Fc puede o no estar presente. A menos que se especifique de otro modo en el presente documento, la numeración de residuos aminoacídicos en la región Fc o región constante es de acuerdo con el sistema de numeración EU, también llamado índice EU, como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD, 1991.
La tecnología de "botón-en-ojal" se describe, por ejemplo, en los documentos US 5.731.168; US 7.695.936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) y Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). En general, el procedimiento implica introducir una protuberancia ("botón") en la interfase de un primer polipéptido y una correspondiente cavidad ("ojal") en la interfase de un segundo polipéptido, de modo que la protuberancia se puede situar en la cavidad para promover la formación de heterodímeros y dificultar la formación de homodímeros. Las protuberancias se construyen reemplazando cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfase del primer polipéptido por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean cavidades compensadoras de tamaño idéntico o similar a las protuberancias en la interfase del segundo polipéptido reemplazando cadenas laterales de aminoácido grandes por otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). La protuberancia y la cavidad se pueden realizar alterando el ácido nucleico que codifica los polipéptidos, por ejemplo, por mutagénesis específica de sitio o por síntesis peptídica. En un modo de realización específico, una modificación de botón comprende la sustitución aminoacídica T366W en una de las dos subunidades del dominio Fc, y la modificación de ojal comprende las sustituciones aminoacídicas T366S, L368A y Y407V en la otra de las dos subunidades del dominio Fc. En otro modo de realización específico, la subunidad del dominio Fc que comprende la modificación de botón adicionalmente comprende la sustitución aminoacídica S354C, y la subunidad del dominio Fc que comprende la modificación de ojal adicionalmente comprende la sustitución aminoacídica Y349C.
La introducción de estos dos residuos de cisteína da como resultado la formación de un puente disulfuro entre las dos subunidades de la región Fc, estabilizando así además el dímero (Carter, J Immunol Methods 248, 7­ 15 (2001)). La numeración es de acuerdo con el índice EU de Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
Una "región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina" pretende incluir variantes alélicas naturales de la región Fc de una inmunoglobulina así como variantes que tienen alteraciones que producen sustituciones, adiciones o deleciones pero que no disminuyen sustancialmente la capacidad de la inmunoglobulina para mediar en las funciones efectoras (tales como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos). Por ejemplo, se pueden delecionar uno o más aminoácidos del extremo N o extremo C de la región Fc de una inmunoglobulina sin pérdida sustancial de la función biológica. Dichas variantes se pueden seleccionar de acuerdo con reglas generales conocidas en la técnica para tener un efecto mínimo sobre la actividad (véase, por ejemplo, Bowie, J. U. et al., Science 247:1306-10 (1990)).
El término "funciones efectoras" se refiere a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), unión a receptor de Fc, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), secreción de citocinas, captación de antígenos mediada por complejo inmunitario por células presentadoras de antígenos, regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B), y activación de linfocitos B.
Un "receptor de Fc activador" es un receptor de Fc que después del acoplamiento por una región Fc de un anticuerpo provoca acontecimientos de señalización que estimulan a la célula que porta el receptor para realizar funciones efectoras. Los receptores de Fc activadores incluyen FcYRIIIa (CD16a), FcyRI (CD64), FcYRIIa (CD32) y FcaRI (CD89). Un receptor de Fc activador particular es FcYRIIIa humano (véase n.° de acceso UniProt P08637 (versión 141)).
El término "miembro de la familia de ligandos de TNF" o "ligando de la familia de TNF" se refiere a una citocina proinflamatoria. Las citocinas en general, y en particular los miembros de la familia de ligandos de TNF, desempeñan un papel crucial en la estimulación y coordinación del sistema inmunitario. En la actualidad, se han identificado diecinueve citocinas como miembros de la superfamilia de ligandos de TNF (factor de necrosis tumoral) en base a similitudes de secuencia, funcionales y estructurales. Todos estos ligandos son proteínas transmembranarias de tipo II con un dominio extracelular C terminal (ectodominio), dominio intracelular N terminal y un dominio transmembranario único. El dominio extracelular C terminal, conocido como dominio de homología a TNF (THD), tiene una identidad de aminoácidos de un 20-30 % entre los miembros de la superfamilia y es responsable de la unión al receptor. El ectodominio de TNF también es responsable de que los ligandos de TNF forman complejos triméricos que se reconocen por sus receptores específicos.
Los miembros de la familia de ligandos de TNF se seleccionan del grupo que consiste en linfotoxina a (también conocido como LTA o TNFSF1), TNF (también conocido como TNFSF2), LTp (también conocido como TNFSF3), OX40L (también conocido como TNFSF4), CD40L (también conocido como CD154 o TNFSF5), FasL (también conocido como CD95L, CD178 o TNFSF6), CD27L (también conocido como CD70 o TNFSF7), CD30L (también conocido como CD153 o TNFSF8), 4-1BBL (también conocido como TNFSF9), TRAIL (también conocido como APO2L, CD253 o TNFSF10), RANKL (también conocido como CD254 o TNFSF11), TWEAK (también conocido como TNFSF12), APRIL (también conocido como CD256 o TNFSF13), BAFF (también conocido como CD257 o TNFSF13B), LIGHT (también conocido como CD258 o TNFSL14), TL1A (también conocido como VEGI o TNFSF15), G iTRL (también conocido como TNFSF18), EDA-A1 (también conocido como ectodisplasina A1) y EDA-A2 (también conocido como ectodisplasina A2). El término se refiere a cualquier ligando de la familia de TNF natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos), primates no humanos (por ejemplo, macacos cangrejeros) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. En modos de realización específicos de la invención, el miembro de la familia de ligandos de TNF se selecciona del grupo que consiste en OX40L, FasL, CD27L, TRAIL, 4-1BBL, CD40L y GITRL. En un modo de realización particular, el miembro de la familia de ligandos de TNF se selecciona de 4-1BBL y OX40L.
Se puede obtener información adicional, en particular secuencias, de los miembros de la familia de ligandos de TNF de bases de datos accesibles públicamente tales como Uniprot (www.uniprot.org). Por ejemplo, los ligandos de TNF humanos tienen las siguientes secuencias de aminoácidos: linfotoxina a humana (n.° de acceso UniProt P01374, SEQ ID NO:34), TNF humano (n.° de acceso UniProt P01375, SEQ ID NO:35), linfotoxina p humana (n.° de acceso UniProt Q06643, SEQ ID NO:36), OX40L humano (n.° de acceso UniProt P23510, SEQ ID NO:37), CD40L humano (n.° de acceso UniProt P29965, SEQ ID NO:38), FasL humano (n.° de acceso UniProt P48023, SEQ ID NO:39), CD27L humano (n.° de acceso UniProt P32970, SEQ ID NO:40), CD30L humano (n.° de acceso UniProt P32971, SEQ ID NO:41), 4-1BBL (n.° de acceso UniProt P41273, SeQ ID NO:42), TRAIL (n.° de acceso UniProt P50591, SEQ ID NO:43), RANKL (n.° de acceso UniProt O14788, SEQ ID NO:44), TWEAK (n.° de acceso UniProt O43508, SEQ ID NO:45), APRIL (n.° de acceso UniProt O75888, SEQ ID NO:46), BAFF (n.° de acceso UniProt Q9Y275, SEQ ID NO:47), LIGHT (n.° de acceso UniProt O43557, SEQ ID NO:48), TL1A (n.° de acceso UniProt 095150, SEQ ID NO:49), GITRL (n.° de acceso UniProt Q9UNG2, SEQ ID NO:50) y ectodisplasina A (n.° de acceso UniProt Q92838, SEQ ID NO:51).
Un "ectodominio" es el dominio de una proteína de membrana que se extiende en el espacio extracelular (es decir, el espacio fuera de la célula diana). Los ectodominios son normalmente las partes de las proteínas que inician el contacto con las superficies, lo que da lugar a la transducción de señales. El ectodominio de miembro de la familia de ligandos de TNF como se define en el presente documento por tanto se refiere a la parte de la proteína de ligando de TNF que se extiende en el espacio extracelular (el dominio extracelular), pero también incluye partes más pequeñas o fragmentos del mismo que son responsables de la trimerización y de la unión al correspondiente receptor de TNF. El término "ectodominio de un miembro de la familia de ligandos de TNF o un fragmento del mismo" por tanto se refiere al dominio extracelular del miembro de la familia de ligandos de TNF que forma el dominio extracelular o a partes del mismo que todavía pueden unirse al receptor (dominio de unión al receptor).
El término "miembro de la familia de ligandos de TNF coestimulador" o "ligando de la familia de TNF coestimulador" se refiere a un subgrupo de miembros de la familia de ligandos de TNF, que pueden coestimular la proliferación y producción de citocinas de linfocitos T. Estos ligandos de la familia de TNF pueden coestimular señales de TCR tras la interacción con sus correspondientes receptores de TNF y la interacción con sus receptores da lugar al reclutamiento de factores asociados a t Nf R (TRAF), que inician cascadas de señalización que dan como resultado la activación de linfocitos T. Los ligandos de la familia de TNF coestimuladores se seleccionan del grupo que consiste en 4-1BBL, OX40L, GITRL, CD70, CD30L y LIGHT, más en particular el miembro de la familia de ligandos de TNF coestimulador se selecciona de 4-1 BBL y OX40L.
Como se describe en el presente documento anteriormente, 4-1BBL es una proteína transmembranaria de tipo II y un miembro de la familia de ligandos de TNF. Se ha descrito que 4-1BBL completo o de longitud completa que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:42 forma trímeros en la superficie de las células. La formación de trímeros se permite por motivos específicos del ectodominio de 4-1BBL. Dichos motivos se designan en el presente documento como "región de trimerización". Los aminoácidos 50-254 de la secuencia de 4-1BBL humano (SEQ ID NO:52) forman el dominio extracelular de 4-1BBL, pero incluso fragmentos del mismo pueden formar los trímeros. En modos de realización específicos de la invención, el término "ectodominio de 4-1BBL o un fragmento del mismo" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:4 (aminoácidos 52-254 de 4-1BBL humano), SEQ ID NO:1 (aminoácidos 71-254 de 4-1BBL humano), SEQ ID NO:3 (aminoácidos 80-254 de 4-1BBL humano) y SEQ ID NO:2 (aminoácidos 85-254 de 4-1BBL humano) o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:96 (aminoácidos 71-248 de 4-1BBL humano), SEQ ID NO:375 (aminoácidos 52248 de 4-1BBL humano), SEQ ID NO:374 (aminoácidos 80-248 de 4-1BBL humano) y SEQ ID NO:373 (aminoácidos 85-248 de 4-1BBL humano), pero también otros fragmentos del ectodominio que se puede trimerizar se incluyen en el presente documento.
Como se describe en el presente documento anteriormente, OX40L es otra proteína transmembranaria de tipo II y otro miembro de la familia de ligandos de TNF. OX40L humano completo o de longitud completa tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:37. Los aminoácidos 51-183 de la secuencia de OX40L humano (SEQ ID NO:53) forman el dominio extracelular de OX40L, pero incluso fragmentos del mismo pueden formar los trímeros. En modos de realización específicos de la invención, el término "ectodominio de OX40L o un fragmento del mismo" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:53 (aminoácidos 51-183 de OX40L humano) o SEQ ID NO:54 (aminoácidos 52-183 de OX40L humano), pero también otros fragmentos del ectodominio que se pueden trimerizar se incluyen en el presente documento.
El término "conector peptídico" se refiere a un péptido que comprende uno o más aminoácidos, típicamente de aproximadamente 2 a 20 aminoácidos. Los conectores peptídicos son conocidos en la técnica o se describen en el presente documento. De forma adecuada, los péptidos conectores no inmunógenos son, por ejemplo, conectores peptídicos (G4S)n, (SG4)n o G4(SG4)n, en los que "n" es en general un número entre 1 y 10, típicamente entre 1 y 4, en particular 2, es decir, los péptidos seleccionados del grupo que consiste en GÜÍJÓS (SEQ ID NO:28), ÜOGGSOGGGS (SEQ ID NO:13), SGGGGSCGGG (SEQ ID NO:55) y GGGGSGGGGSGGGG
(SEQ ID NO:56), pero también incluyen las secuencias GSPGSSSSGS (SEQ ID NO:57), GSGSGSGS (SEQ ID
NO:58), GSGSGNGS (SEQ ID NO:59), GÜSGSGSG (SEQ ID NO:60), GGSGSG (SEQ ID NO:61), GGSG (SEQ
ID NO:62), GGSGNGSG (SEQ ID NO:63), OGNGSGSG (SEQ ID NO:64) y GGNGSÍi (SEQ ID NO:65). Los conectores peptídicos de interés particular son (G4S)i o -GGCGS (SEQ ID NO:128), (G4S)2 o üüGGSGGGGS
(SEQ ID NO:13)y GSPGSKSSGS (SEQ ID NO:57), más en particular (G4S)2 o GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 13) y GSPGSSSSGS (SEQ ID NO:57).
El término "aminoácido" como se usa dentro de la presente solicitud indica el grupo de carboxi-a-aminoácidos naturales que comprende alanina (código de tres letras: ala, código de una letra: A), arginina (arg, R), asparagina (asn, N), ácido aspártico (asp, D), cisteína (cys, C), glutamina (gln, Q), ácido glutámico (glu, E), glicina (gly, G), histidina (his, H), isoleucina (ile, I), leucina (leu, L), lisina (lys, K), metionina (met, M), fenilalanina (phe, F), prolina (pro, P), serina (ser, S), treonina (thr, T), triptófano (trp, W), tirosina (tyr, Y) y valina (val, V).
Una "proteína de fusión monocatenaria" como se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido monocatenario compuesto de uno o dos ectodominios de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF fusionados a una parte del resto de unión a antígeno o parte de Fc. La fusión se puede producir uniendo directamente el aminoácido N o C terminal del resto de unión a antígeno por medio de un conector peptídico al aminoácido C o N terminal del ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF.
Por "fusionado" o "conectado" se quiere decir que los componentes (por ejemplo, un polipéptido y un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF) se unen por enlaces peptídicos, directamente o bien por medio de uno o más conectores peptídicos.
"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia polipeptídica (porteica) de referencia se define como el porcentaje de residuos aminoacídicos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoacídicos en la secuencia polipeptídica de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, en caso necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación para propósitos de determinación del porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se puede lograr de diversas formas que están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, usando un programa informático públicamente disponible tal como el programa informático BLAST, b La ST-2, ALIGN, SAWI o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr una alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los propósitos en el presente documento, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 se creó por Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de EE. UU., Washington D.C., 20559, donde está registrado con el n.° de registro de derechos de autor de EE. UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está públicamente disponible de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 se debe compilar para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían. En situaciones donde se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B (que se puede parafrasear de forma alternativa como una secuencia de aminoácidos dada A que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula como sigue:
100 veces la fracción X/Y
donde X es el número de residuos aminoacídicos puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en esa alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos aminoacídicos en B. Se apreciará que si la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no igualará el % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. A menos que se establezca específicamente de otro modo, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente usando el programa de ordenador ALIGN-2.
En determinados modos de realización, se contemplan variantes de secuencia de aminoácidos de las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de TNF proporcionadas en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas de las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de TNF. Se pueden preparar variantes de secuencia de aminoácidos de las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de TNF introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica las moléculas, o por síntesis peptídica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Se puede realizar cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión a antígeno. Los sitios de interés para mutagénesis de sustitución incluyen las HVR y regiones estructurales (FR). Se proporcionan sustituciones conservadoras en la tabla B bajo el encabezado "sustituciones preferentes" y se describen además a continuación en referencia a las clases de cadenas laterales de aminoácidos (1) a (6). Se pueden introducir sustituciones aminoacídicas en la molécula de interés y cribar los productos para determinar una actividad deseada, por ejemplo, conservación/mejora de unión a antígeno, disminución en inmunogenicidad, o mejora en ADCC o CDC.
TABLA B
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Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con propiedades de cadena lateral comunes:
(1) hidrófobos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) ácidos: Asp, Glu;
(4) básicos: His, Lys, Arg;
(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;
(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Las sustituciones no conservadoras conllevarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.
El término "variantes de secuencia de aminoácidos" incluye variantes sustanciales en las que existen sustituciones aminoacídicas en uno o más residuos de la región hipervariable de una molécula de unión a antígeno original (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para estudio adicional tendrán modificaciones (por ejemplo, mejoras) en determinadas propiedades biológicas (por ejemplo, incremento en afinidad, reducción en inmunogenicidad) con relación a la molécula de unión a antígeno original y/o tendrán determinadas propiedades biológicas sustancialmente conservadas de la molécula de unión a antígeno original. Una variante de sustitución ejemplar es un anticuerpo madurado en afinidad, que se puede generar convenientemente, por ejemplo, usando técnicas de maduración de la afinidad basadasen presentación en fagos, tales como las descritas en el presente documento. En resumen, uno o más residuos de HVR se mutan y las moléculas de unión a antígeno variantes se presentan en fagos y se criban para determinar una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de unión). En determinados modos de realización, se pueden producir sustituciones, inserciones o deleciones dentro de una o más HVR siempre que dichas alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad de la molécula de unión a antígeno para unirse al antígeno. Por ejemplo, se pueden realizar alteraciones conservadoras (por ejemplo, sustituciones conservadoras como se proporciona en el presente documento) que no reduzcan sustancialmente la afinidad de unión en HVR. Un procedimiento útil para la identificación de residuos o regiones de un anticuerpo que se pueden dirigir para la mutagénesis se llama "mutagénesis por barrido de alanina" como se describe por Cunningham y Wells (1989) Science, 244:1081-1085. En este procedimiento, un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados tales como Arg, Asp, His, Lys, y Glu) se identifican y se reemplazan por un aminoácido neutro o cargado negativamente (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo con antígeno se ve afectada. Se pueden introducir otras sustituciones en las localizaciones de aminoácidos que demuestren sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. De forma alternativa, o adicionalmente, una estructura cristalina de un complejo antígeno-molécula de unión a antígeno para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y antígeno. Dichos residuos de contacto y residuos adyacentes se pueden dirigir o eliminar como candidatos para la sustitución. Se pueden cribar variantes para determinar si contienen las propiedades deseadas.
Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxiterminales que varían en longitud de un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuenciales de residuos aminoacídicos individuales o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF con un residuo metionilo N terminal. Otras variantes de inserción de la molécula incluyen la fusión al extremo N o C a un polipéptido que incrementa la semivida en suero de las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de TNF.
En determinados modos de realización, las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF proporcionadas en el presente documento se alteran para incrementar o disminuir el grado al que se glucosila el anticuerpo. Las variantes de glucosilación de las moléculas se pueden obtener convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que se crean o se retiran uno o más sitios de glucosilación. Cuando la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de TNF comprende una región Fc, se puede alterar el carbohidrato unido a la misma. Los anticuerpos naturales producidos por células de mamífero típicamente comprenden un oligosacárido biantenario ramificado que se une en general por un enlace N a Asn297 del dominio CH2 de la región Fc. Véase, por ejemplo, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). El oligosacárido puede incluir diversos carbohidratos, por ejemplo, manosa, N-acetilglucosamina (GlcNAc), galactosa y ácido siálico, así como una fucosa unida a un GlcNAc en el "tallo" de la estructura oligosacárida biantenaria. En algunos modos de realización, se pueden realizar modificaciones del oligosacárido en la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF para crear variantes con determinadas propiedades mejoradas. En un aspecto, se proporcionan variantes de moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF que tienen una estructura de carbohidrato que carece de fucosa unida (directa o indirectamente) a una región Fc. Dichas variantes de fucosilación pueden tener una mejora en la función de ADCC, véase por ejemplo, la publicación de patente de EE. UU. n.° US 2003/0157108 (Presta, L.) o el documento US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Otras variantes de las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención incluyen las que tienen oligosacáridos bisecados, por ejemplo, en las que un oligosacárido biantenario unido a la región Fc se biseca por GlcNAc. Dichas variantes pueden tener una reducción en la fucosilación y/o una mejora en la función ADCC, véase por ejemplo el documento WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); patente de EE. UU. n.° 6.602.684 (Umana et al.); y el documento US 2005/0123546 (Umana et al.). También se proporcionan variantes con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a la región Fc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener una mejora en la función CDC y se describen, por ejemplo, en los documentos WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); y WO 1999/22764 (Raju, S.).
En determinados modos de realización, puede ser deseable crear variantes genomanipuladas con cisteína de la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención, por ejemplo, "thioMAbs," en la que uno o más residuos de la molécula se sustituyen con residuos de cisteína. En modos de realización particulares, los residuos sustituidos se producen en sitios accesibles de la molécula. Al sustituir esos residuos con cisteína, los grupos tiol reactivos se posicionan de este modo en sitios accesibles del anticuerpo y se pueden usar para conjugar el anticuerpo a otros restos, tales como restos de fármaco o restos de conector-fármaco, para crear un inmunoconjugado. En determinados modos de realización, uno cualquiera o más de los siguientes residuos se pueden sustituir con cisteína: V205 (numeración de Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración EU) de la región Fc de la cadena pesada. Se pueden generar moléculas de unión a antígeno genomanipuladas con cisteína como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 7.521.541.
En determinados aspectos, las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF proporcionadas en el presente documento se pueden modificar además para contener restos no proteínicos adicionales que son conocidos en la técnica y están fácilmente disponibles. Los restos adecuados para la derivatización del anticuerpo incluyen pero no se limitan a polímeros solubles en agua. Los ejemplos no limitantes de polímeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o bien copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)/polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), poli(alcohol vinílico) y mezclas de los mismos. El polietilenglicol-propionaldehído puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede estar ramificado o no ramificado. El número de polímeros unidos al anticuerpo puede variar y, si se une más de un polímero, pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, el número y/o tipo de polímeros usados para la derivatización se puede determinar en base a consideraciones incluyendo, pero sin limitarse a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que se van a mejorar, si el derivado del anticuerpo biespecífico se usará en un tratamiento bajo condiciones definidas, etc. En otro aspecto, se proporcionan conjugados de un anticuerpo y un resto no proteínico que se pueden calentar selectivamente por exposición a radiación. En un modo de realización, el resto no proteínico es un nanotubo de carbono (Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda, e incluye, pero no se limita a, longitudes de onda que no dañan células normales, pero que calientan el resto no proteínico hasta una temperatura a la que las células próximas al anticuerpo-resto no proteínico se destruyen.
En otro aspecto, se pueden obtener inmunoconjugados de las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF proporcionadas en el presente documento. Un "inmunoconjugado" es un anticuerpo conjugado a una o más moléculas heterólogas, incluyendo pero sin limitarse a un agente citotóxico.
El término "polinucleótido" se refiere a una molécula o construcción de ácido nucleico, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm), ADN derivado de virus o ADN de plásmido (ADNp). Un polinucleótido puede comprender un enlace fosfodiéster convencional o un enlace no convencional (por ejemplo, un enlace amida, tal como se encuentra en los ácidos peptidonucleicos (PNA). El término "molécula de ácido nucleico" se refiere a uno cualquiera o más segmentos de ácido nucleico, por ejemplo, fragmentos de ADN o ARN, presentes en un polinucleótido.
Por molécula de ácido nucleico o polinucleótido "aislado" que entiende una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN, que se ha retirado de su entorno natural. Por ejemplo, un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido contenido en un vector se considera aislado para los propósitos de la presente invención. Otros ejemplos de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células huésped heterólogas o polinucleótidos purificados (parcial o sustancialmente) en solución. Un polinucleótido aislado incluye una molécula polinucleotídica contenida en células que contienen normalmente la molécula polinucleotídica, pero la molécula polinucleotídica está presente de forma extracromosómica o en una localización cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcritos de ARN in vivo o in vitro de la presente invención, así como formas de hebras positivas y negativas y formas bicatenarias. Los polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados de acuerdo con la presente invención incluyen además dichas moléculas producidas sintéticamente. Además, un polinucleótido o un ácido nucleico puede ser o puede incluir un elemento regulador tal como un promotor, sitio de unión a ribosoma o un finalizador de la transcripción.
Por un ácido nucleico o polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos, por ejemplo, un 95 % "idéntica" a una secuencia de nucleótidos de referencia de la presente invención, se entiende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia excepto en que la secuencia polinucleotídica puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos al menos un 95 % idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta un 5 % de los nucleótidos en la secuencia de referencia se puede delecionar o sustituir con otro nucleótido, o un número de nucleótidos hasta un 5 % de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia se puede insertar en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia se pueden producir en las posiciones terminales 5' o 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre residuos en la secuencia de referencia o bien en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Como una cuestión práctica, si cualquier secuencia polinucleotídica particular es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de nucleótidos de la presente invención, se puede determinar convencionalmente usando programas de ordenador conocidos, tales como los analizados anteriormente para polipéptidos (por ejemplo, ALIGN-2).
El término "casete de expresión" se refiere a un polinucleótido generado de forma recombinante o sintética, con una serie de elementos de ácido nucleico especificados que permiten la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula diana. El casete de expresión recombinante se puede incorporar en un plásmido, cromosoma, ADN mitocondrial, ADN de plástido, virus o fragmento de ácido nucleico. Típicamente, la porción de casete de expresión recombinante de un vector de expresión incluye, entre otras secuencias, una secuencia de ácido nucleico que se va a transcribir y un promotor. En determinados modos de realización, el casete de expresión de la invención comprende secuencias polinucleotídicas que codifican moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención o fragmentos de las mismas.
El término "vector" o "vector de expresión" es sinónimo de "construcción de expresión" y se refiere a una molécula de ADN que se usa para introducir y dirigir la expresión de un gen específico al que se asocia de forma funcional en una célula diana. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. El vector de expresión de la presente invención comprende un casete de expresión. Los vectores de expresión permiten la transcripción de grandes cantidades de ARNm estable. Una vez que el vector de expresión está dentro de la célula diana, la molécula de ácido ribonucleico o proteína que se codifica por el gen se produce por el mecanismo de transcripción y/o traducción celular. En un modo de realización, el vector de expresión de la invención comprende un casete de expresión que comprende secuencias polinucleotídicas que codifican moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención o fragmentos de las mismas.
Los términos "célula huésped", "línea de células huésped" y "cultivo de células huésped" se usan de manera intercambiable y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas", que incluyen la célula transformada primaria y la descendencia derivada de la misma independientemente del número de pasos. La descendencia puede no ser completamente idéntica en el contenido de ácido nucleico a una célula original, sino que puede contener mutaciones. La descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada o seleccionada en la célula transformada originalmente se incluye en el presente documento. Una célula huésped es cualquier tipo de sistema celular que se puede usar para generar las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención. Las células huésped incluyen células cultivadas, por ejemplo, células cultivadas de mamífero, tales como células CHO, células BHK, células NS0, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63, células PER, células PER.C6 o células de hibridoma, células de levadura, células de insecto y células vegetales, por nombras algunas, pero también células comprendidas dentro de un animal transgénico, planta transgénica o planta cultivada o tejido animal o vegetal cultivado.
Una "cantidad eficaz" de un agente se refiere a la cantidad que es necesaria para dar como resultado un cambio fisiológico en la célula o tejido al que se administra.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente, por ejemplo, una composición farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, en dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente, por ejemplo, elimina, disminuye, retrasa, minimiza o previene efectos adversos de una enfermedad.
Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domesticados (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, humanos y primates no humanos tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En particular, el individuo o sujeto es un ser humano.
El término "composición farmacéutica" se refiere a una preparación que está en tal forma que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se le administraría la formulación.
Un "excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una composición farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un excipiente farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, un estabilizante o un conservante.
El término "prospecto del envase" se usa para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, politerapia, contraindicaciones y/o advertencias sobre el uso de dichos productos terapéuticos.
Como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y variaciones gramaticales del mismo, tales como "tratar" o "que trata") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar la evolución natural del individuo que se está tratando, y que se puede realizar para la profilaxis o bien durante la evolución de una patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, prevención de la aparición o recidiva de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevención de metástasis, disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, mejora o atenuación del estado de la enfermedad y remisión o mejora del pronóstico. En algunos modos de realización, se usan las moléculas de la invención para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar la progresión de una enfermedad.
El término "cáncer" como se usa en el presente documento se refiere a enfermedades proliferativas, tales como linfomas, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, leucemia, leucemias linfocíticas, cáncer de pulmón, carcinoma de pulmón no microcítico (CPNM), carcinoma de pulmón bronquioloalveolar, cáncer de huesos, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de cabeza y cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer uterino, cáncer ovárico, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer colorrectal (CCR), cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer de mama triple negativo, cáncer uterino, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma de endometrio, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroidea, cáncer de la glándula paratiroidea, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de partes blandas, cáncer de uretra, cáncer de pene, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de riñón o uréter, carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis renal, mesotelioma, cáncer hepatocelular, cáncer biliar, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), tumores de la médula espinal, glioma del tronco encefálico, glioblastoma multiforme, astrocitomas, schwanomas, ependimomas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenoma hipofisario y sarcoma de Ewing, melanoma, mieloma múltiple, cáncer de linfocitos B (linfoma), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia linfocítica aguda (ALL), tricoleucemia, leucemia mieloblástica crónica, incluyendo las versiones resistentes de cualquiera de los cánceres anteriores, o una combinación de uno o más de los cánceres anteriores.
Moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF
La divulgación proporciona moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF novedosas con propiedades en particular ventajosas tales como producibilidad, estabilidad, actividad de unión, actividad biológica, eficacia en la selección y reducción en la toxicidad.
En un primer aspecto, la divulgación proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF que comprende
(a) al menos un resto que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana,
(b) un primer y un segundo polipéptido que se unen entre sí por un enlace disulfuro, en la que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF o dos fragmentos del mismo que se conectan entre sí por un conector peptídico y por que el segundo polipéptido comprende solo un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF o un fragmento del mismo, y
(c) un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de manera estable.
En un aspecto particular, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF comprende (a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana, (b) un primer y un segundo polipéptido que se unen entre sí por un enlace disulfuro, en la que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido contiene un primer dominio constante de la cadena pesada (CH1) o constante de la cadena ligera (CL) y el segundo polipéptido contiene un dominio CL o CH1, respectivamente, en la que el segundo polipéptido se une al primer polipéptido por un enlace disulfuro entre el dominio CH1 y CL, y en la que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 que se conectan entre sí y al dominio CH1 o CL por un conector peptídico y en la que el segundo polipéptido comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 conectado por medio de un conector peptídico al dominio CL o CH1 de dicho polipéptido, y que comprende además (c) un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de manera estable, en la que el miembro de la familia de ligandos de TNF coestimula la activación de linfocitos T humanos.
En otro aspecto particular, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF comprende (a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana y
(b) un primer y un segundo polipéptido que se unen entre sí por un enlace disulfuro, en la que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ iD NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 que se conectan entre sí y al dominio CH1 o CL por un conector peptídico y en la que el segundo polipéptido comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54, en la que los ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF son idénticos en todos los casos.
En un aspecto particular, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF comprende un miembro de la familia de ligandos de TNF que coestimula la activación de linfocitos T humanos que se selecciona de 4-1BBL y OX40L. Más en particular, el miembro de la familia de ligandos de TNF es 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375, en particular la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:96. En un aspecto, el ectodominio de un miembro de la familia de ligandos de TNF o fragmento del mismo comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:96, en particular la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:96. En un aspecto particular, el ectodominio de un miembro de la familia de ligandos de TNF o fragmento del mismo comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:96.
En otro aspecto, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención comprende
(a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana y
(b) un primer y un segundo polipéptido que se unen entre sí por un enlace disulfuro, en la que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:5, Se Q iD NO:97, Se Q ID NO:98 y SEQ ID NO:99 y por que el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en Se Q ID NO:1, SEQ ID NO:96, Se Q ID NO:3 y SEQ ID NO:4. En un aspecto particular, el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:97 y el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:96.
En un aspecto, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención comprende
(a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana y
(b) un primer y un segundo polipéptido que se unen entre sí por un enlace disulfuro, en la que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5 y por que el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6. En otro aspecto, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención comprende
(a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana y (b) un primer y un segundo polipéptido que se unen entre sí por un enlace disulfuro, en la que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5 y por que el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:183. Aún en otro aspecto, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención comprende
(a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana y (b) un primer y un segundo polipéptido que se unen entre sí por un enlace disulfuro, en la que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:97 y por que el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 184 o SEQ ID NO:185.
En otro aspecto, el miembro de la familia de ligandos de TNF es OX40L. En un aspecto particular, se proporciona molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en la que el ectodominio de un miembro de la familia de ligandos de TNF comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54, en particular la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53.
En un aspecto, la invención se refiere a una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF que comprende
(a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana y (b) un primer y un segundo polipéptido que se unen entre sí por un enlace disulfuro, en la que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:371 o SEQ ID:372 y por que el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54, respectivamente.
En un aspecto, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención comprende
(a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana, (b) un primer polipéptido que contiene un dominio CH1 o CL y un segundo polipéptido que contiene un dominio CL o CH1, respectivamente, en la que el segundo polipéptido se une al primer polipéptido por un enlace disulfuro entre el dominio CH1 y CL,
y en la que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 que se conectan entre sí y al dominio CH1 o CL por un conector peptídico y por que el segundo polipéptido comprende solo un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de t Nf seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ iD NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 conectado por medio de un conector peptídico al dominio CL o CH1 de dicho polipéptido.
En un aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF que comprende
(a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana, (b) un primer polipéptido que contiene un dominio CH1 y un segundo polipéptido que contiene un dominio CL, en la que el segundo polipéptido se une al primer polipéptido por un enlace disulfuro entre el dominio CH1 y CL,
y en la que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID n O:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 que se conectan entre sí y al dominio CH1 por un conector peptídico y por que el segundo polipéptido comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1 b Bl que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, s Eq ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 conectado por medio de un conector peptídico al dominio CL de dicho polipéptido.
En otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF que comprende
(a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana,
(b) un primer polipéptido que contiene un dominio CL y un segundo polipéptido que contiene un dominio CH1, en la que el segundo polipéptido se une al primer polipéptido por un enlace disulfuro entre el dominio CH1 y CL,
y en la que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 que se conectan entre sí y al dominio Cl por un conector peptídico y por que el segundo polipéptido comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 conectado por medio de un conector peptídico al dominio CH1 de dicho polipéptido.
En otro aspecto, la divulgación proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF que comprende
(a) una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana y
(b) un primer y un segundo polipéptido que se unen entre sí por un enlace disulfuro,
en la que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de t Nf seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID n O:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 que se conectan entre sí por un conector peptídico y por que el segundo polipéptido comprende solo un ectodominio de dicho de un miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54.
En particular, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF comprende una o dos moléculas Fab que se pueden unir específicamente a un antígeno de célula diana.
En un aspecto particular, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en la que el resto que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana es una molécula Fab o una molécula Fab de entrecruzamiento que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana. En particular, el resto que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana es un Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana.
Además, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF como se describe en el presente documento, en la que el antígeno de célula diana se selecciona del grupo que consiste en proteína de activación de fibroblastos (FAP), proteoglucano de sulfato de condroitina asociado a melanoma (MCSP), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), antígeno carcinoembrionario (CEA), CD19, CD20 y CD33.
En otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de acuerdo con la invención, en la que un péptido que comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID No :2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 conectados entre sí por un primer conector peptídico se fusiona en su extremo C al dominio CH1 de una cadena pesada por un segundo conector peptídico y en la que un ectodominio de dicho de un miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 se fusiona en su extremo C al dominio CL en una cadena ligera por un tercer conector peptídico.
En otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de acuerdo con la invención, en la que un péptido que comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID No :2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 conectados entre sí por un primer conector peptídico se fusiona en su extremo C al dominio CL de una cadena pesada por un segundo conector peptídico y en la que un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 se fusiona en su extremo C al dominio CH1 en una cadena ligera por un tercer conector peptídico.
En otro aspecto, la invención se refiere a una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de acuerdo con la invención, en la que un péptido que comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, Se Q ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 conectados entre sí por un primer conector peptídico se fusiona en su extremo C al dominio CL de una cadena ligera por un segundo conector peptídico y en la que un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 se fusiona en su extremo C al dominio CH1 de la cadena pesada por un tercer conector peptídico.
En un aspecto particular, la invención se refiere a una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF como se define anteriormente, en la que el conector peptídico es (G4S)2. En un aspecto, el primer conector peptídico es (G4S)2 (SEQ ID NO:13), el segundo conector peptídico es
(SEQ ID NO:57) y el tercer conector peptídico es (G4S)2 (SEQ ID NO:13). En particular, la invención se refiere a una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de TNF como se define anteriormente, en la que el primer conector peptídico es (G4S)2 (SEQ ID NO:13), el segundo conector peptídico es (G4S)2 (SEQ ID NO:13), y el tercer conector peptídico es (G4S)2 (SEQ ID No :13).
En otro aspecto, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF como se define en el presente documento anteriormente comprende un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de manera estable.
En particular, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención comprende (a) una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana, en la que la cadena pesada de Fab se fusiona en el extremo C al extremo N de un dominio CH2 en el dominio Fc y (c) un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de manera estable.
En otro aspecto, el dominio Fc es una IgG, en particular un dominio Fc de IgG1 o un dominio Fc de IgG4. Más en particular, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1. En un aspecto particular, el dominio Fc comprende una modificación que promueve la asociación de la primera y segunda subunidad del dominio Fc.
Modificaciones en el dominio Fc que reducen la unión al receptor de Fc y/o la función efectora
The dominio Fc de las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención consiste en un par de cadenas polipeptídicas que comprenden dominios de la cadena pesada de una molécula de inmunoglobulina. Por ejemplo, el dominio Fc de una molécula de inmunoglobulina G (IgG) es un dímero, del que cada unidad comprende los dominios constantes de la cadena pesada de IgG CH2 y CH3. Las dos subunidades del dominio Fc se pueden asociar de manera estable entre sí.
El dominio Fc confiere propiedades farmacocinéticas favorables a las moléculas de unión a antígeno de la invención, incluyendo una semivida en suero larga, lo que contribuye a una buena acumulación en el tejido diana y una proporción de distribución en tejido-sangre favorable. Al mismo tiempo, sin embargo, puede dar lugar a una selección indeseable de los anticuerpos biespecíficos de la invención para células que expresan receptores de Fc en lugar de para las células que portan antígenos preferentes. En consecuencia, en aspectos particulares, el dominio Fc de la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención presenta una reducción en la afinidad de unión a un receptor de Fc y/o reducción en la función efectora, en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural. En un aspecto, el Fc no se une sustancialmente a un receptor de Fc y/o no induce una función efectora. En un aspecto particular, el receptor de Fc es un receptor de Fcy. En un aspecto, el receptor de Fc es un receptor de Fc humano. En un aspecto específico, el receptor de Fc es un receptor de Fcy humano activador, más específicamente FcYRIIIa, FcyRI o FcYRIIa humano, lo más específicamente FcYRIIIa humano. En un aspecto, el dominio Fc no induce una función efectora. La reducción en la función efectora puede incluir, pero no se limita a, uno o más de los siguientes: reducción en la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), reducción en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), reducción en la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), reducción en la secreción de citocinas, reducción en la captación de antígenos mediada por inmunocomplejos por células presentadoras de antígenos, reducción en la unión a linfocitos NK, reducción en la unión a macrófagos, reducción en la unión a monocitos, reducción en la unión a células polimorfonucleares, reducción en la señalización directa que induce apoptosis, reducción en la maduración de células dendríticas o reducción en el cebado de linfocitos.
En determinados aspectos, se pueden introducir una o más modificaciones aminoacídicas en la región Fc de una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF proporcionada en el presente documento, generando de este modo una variante de la región Fc. La variante de la región Fc puede comprender una secuencia de la región Fc humana (por ejemplo, una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación aminoacídica (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones aminoacídicas.
En un aspecto particular, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF que comprende
(a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana,
(b) un primer y un segundo polipéptido que se unen entre sí por un enlace disulfuro, en la que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ iD NO:2, SEQ ID NOG, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 que se conectan entre sí por un conector peptídico y por que el segundo polipéptido comprende solo un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54, y
(c) un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de manera estable, en la que el dominio Fc comprende una o más sustituciones aminoacídicas que reducen la unión a un receptor de Fc, en particular hacia el receptor de Fcy.
En un aspecto, el dominio Fc de la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención comprende una o más mutaciones aminoacídicas que reducen la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc y/o función efectora. Típicamente, la misma o más mutaciones aminoacídicas están presentes en cada una de las dos subunidades del dominio Fc. En particular, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en una posición de E233, L234, L235, N297, P331 y P329 (numeración EU). En particular, el dominio Fc comprende sustituciones aminoacídicas en las posiciones 234 y 235 (numeración EU) y/o 329 (numeración EU) de las cadenas pesadas de IgG. Más en particular, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un ligando de la familia de TNF trimérico de acuerdo con la invención que comprende un dominio Fc con las sustituciones aminoacídicas L234A, L235A y P329G ("P329G LALA", numeración EU) en las cadenas pesadas de IgG. Las sustituciones aminoacídicas L234A y L235A se refieren a la llamada mutación LALA. La combinación "P329G LALA" de sustituciones aminoacídicas anula casi por completo la unión al receptor de Fcy de un dominio Fc de IgG1 humana y se describe en la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 2012/130831 A1 que también describe procedimientos de preparación de dichos dominios Fc mutantes y procedimientos para determinar sus propiedades tales como unión al receptor de Fc o funciones efectoras. "Numeración EU" se refiere a la numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
Los dominios Fc con reducción en la unión al receptor de Fc y/o función efectora también incluyen los de sustitución de uno o más de los residuos de dominio Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (patente de EE. UU. n.° 6.737.056). Dichos mutantes de Fc incluyen mutantes de Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones aminoacídicas 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el llamado mutante de Fc "DANA" con sustitución de los residuos 265 y 297 por alanina (patente de EE. UU. n.° 7.332.581).
En otro aspecto, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4. Los anticuerpos IgG4 presentan una reducción en la afinidad de unión a receptores de Fc y una reducción en las funciones efectoras en comparación con anticuerpos IgG1. En un aspecto más específico, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4 que comprende una sustitución aminoacídica en la posición S228 (numeración de Kabat), en particular la sustitución aminoacídica S228P. En un aspecto más específico, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4 que comprende las sustituciones aminoacídicas L235E y S228P y P329G (numeración EU). Dichos mutantes de dominio Fc de IgG4 y sus propiedades de unión al receptor de Fcy también se describen en el documento WO 2012/130831.
Se pueden preparar dominios Fc mutantes por deleción, sustitución, inserción o modificación de aminoácidos usando procedimientos genéticos o químicos bien conocidos en la técnica. Los procedimientos genéticos pueden incluir mutagénesis específica de sitio de la secuencia de ADN codificante, PCR, síntesis génica y similares. Los cambios nucleotídicos correctos se pueden verificar por ejemplo por secuenciación.
La unión a receptores de Fc se puede determinar fácilmente, por ejemplo, por ELISA, o por resonancia de plasmón superficial (RPS) usando instrumentación estándar tal como un instrumento BIAcore (GE Healthcare), y receptores de Fc tales como los que se pueden obtener por expresión recombinante. Un ensayo de unión de este tipo adecuado se describe en el presente documento. De forma alternativa, la afinidad de unión de dominios Fc o moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos que comprenden un dominio Fc para los receptores de Fc se puede evaluar usando líneas celulares conocidas por expresar receptores de Fc particulares, tales como linfocitos NK humanos que expresan el receptor de FcYlIIa.
La función efectora de un dominio Fc, o anticuerpos biespecíficos de la invención que comprenden un dominio Fc, se puede medir por procedimientos conocidos en la técnica. Un ensayo adecuado para medir la ADCC se describe en el presente documento. Otros ejemplos de ensayos in vitro para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés se describen en la patente de EE. UU. n.° 5.500.362; Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) y Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); patente de EE. UU. n.° 5.821.337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). De forma alternativa, se pueden emplear procedimientos de ensayos no radioactivos (véase, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radioactivo ACTI™ para citometría de flujo (CelITechnology, Inc. Mountain View, CA); y el ensayo de citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI)). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos (NK). De forma alternativa, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés se puede evaluar in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998).
En algunos modos de realización, se reduce la unión del dominio Fc a un componente del complemento, específicamente a C1q. En consecuencia, en algunos modos de realización en los que el dominio Fc se genomanipula para que tenga una reducción en la función efectora, dicha reducción en la función efectora incluye reducción en CDC. Se pueden llevar a cabo ensayos de unión a C1q para determinar si los anticuerpos biespecíficos de la invención se pueden unir a C1q y por tanto tienen actividad CDC. Véase, por ejemplo, ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo CDC (véase, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003); y Cragg y Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).
En un aspecto particular, el dominio Fc comprende una modificación que promueve la asociación de la primera y segunda subunidad del dominio Fc.
Modificaciones en el dominio Fc que promueven la heterodimerización
En un aspecto, las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención comprenden (a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana, (b) un primer y un segundo polipéptido que se unen entre sí por un enlace disulfuro, en la que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID No :2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 que se conectan entre sí por un conector peptídico y por que el segundo polipéptido comprende solo un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54, y (c) un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de manera estable, en la que el dominio Fc comprende una o más sustituciones aminoacídicas que reducen la unión a un receptor de Fc, en particular hacia el receptor de Fcy. Por tanto, comprenden diferentes restos, fusionados a una o a la otra de las dos subunidades del dominio Fc que están típicamente comprendidas en dos cadenas polipeptídicas no idénticas ("cadenas pesadas"). La coexpresión recombinante de estos polipéptidos y la posterior dimerización dan lugar a varias combinaciones posibles de los dos polipéptidos. Para mejorar el rendimiento y la pureza de las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF en producción recombinante, será por tanto ventajoso introducir en el dominio Fc de las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención una modificación que promueve la asociación de los polipéptidos deseados.
En consecuencia, el dominio Fc de las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención comprende una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc. El sitio de interacción proteína-proteína más extensa entre las dos subunidades de un dominio Fc de IgG humana es en el dominio c H3 del dominio Fc. Por tanto, dicha modificación está en particular en el dominio CH3 del dominio Fc.
En un aspecto específico, dicha modificación es una modificación llamada "botón-en-ojal", que comprende una modificación de "botón" en una de las dos subunidades del dominio Fc y una modificación de "ojal" en la otra de las dos subunidades del dominio Fc. Por tanto, en un aspecto particular, la invención se refiere a una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF como se describe en el presente documento anteriormente que comprende una molécula de IgG, en la que la parte de Fc de la primera cadena pesada comprende un primer módulo de dimerización y la parte de Fc de la segunda cadena pesada comprende un segundo módulo de dimerización que permite una heterodimerización de las dos cadenas pesadas de la molécula de IgG y el primer módulo de dimerización comprende botones y el segundo módulo de dimerización comprende ojales de acuerdo con la tecnología de botón en ojal.
La tecnología de botón en ojal se describe, por ejemplo, en los documentos US 5.731.168; US 7.695.936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) y Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). En general, el procedimiento implica introducir una protuberancia ("botón") en la interfase de un primer polipéptido y una correspondiente cavidad ("ojal") en la interfase de un segundo polipéptido, de modo que la protuberancia se puede situar en la cavidad para promover la formación de heterodímeros y dificultar la formación de homodímeros. Las protuberancias se construyen reemplazando cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfase del primer polipéptido por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean cavidades compensadoras de tamaño idéntico o similar a las protuberancias en la interfase del segundo polipéptido reemplazando cadenas laterales de aminoácido grandes por otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina).
En consecuencia, en un aspecto particular, en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc de las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención un residuo aminoacídico se reemplaza por un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande, generando de este modo una protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad que es posicionable en una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad, y en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc un residuo aminoacídico se reemplaza por un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño, generando de este modo una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad dentro del que la protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad es posicionable.
La protuberancia y la cavidad se pueden realizar alterando el ácido nucleico que codifica los polipéptidos, por ejemplo, por mutagénesis específica de sitio o por síntesis peptídica.
En un aspecto específico, en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc el residuo de treonina en la posición 366 se reemplaza por un residuo de triptófano (T366W), y en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc el residuo de tirosina en la posición 407 se reemplaza por un residuo de valina (Y407V). Más en particular, en la segunda subunidad del dominio Fc adicionalmente el residuo de treonina en la posición 366 se reemplaza por un residuo de serina (T366S) y el residuo de leucina en la posición 368 se reemplaza por un residuo de alanina (L368A). Más en particular, en la primera subunidad del dominio Fc adicionalmente el residuo de serina en la posición 354 se reemplaza por un residuo de cisteína (S354C), y en la segunda subunidad del dominio Fc adicionalmente el residuo de tirosina en la posición 349 se reemplaza por un residuo de cisteína (Y349C). La introducción de estos dos residuos de cisteína da como resultado la formación de un puente disulfuro entre las dos subunidades del dominio Fc. El puente disulfuro estabiliza además el dímero (Cárter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).
En un aspecto alternativo, una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc comprende una modificación que media en los efectos de conducción electrostática, por ejemplo, como se describe en la publicación PCT WO 2009/089004. En general, este procedimiento implica el reemplazo de uno o más residuos aminoacídicos en la interfase de las dos subunidades del dominio Fc por residuos aminoacídicos cargados de modo que la formación de homodímeros se vuelve electrostáticamente desfavorable pero la heterodimerización electrostáticamente favorable.
Modificaciones en los dominios CH1/CL
Para mejorar además el emparejamiento correcto, las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF pueden contener diferentes sustituciones aminoacídicas cargadas (llamadas "residuos cargados"). Estas modificaciones se introducen en los dominios CH1 y CL cruzados o no cruzados. En un aspecto particular, la invención se refiere a una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en la que en uno de los dominios CL el aminoácido en la posición 123 (numeración EU) se ha reemplazado por arginina (R) y el aminoácido en la posición 124 (numeración EU) se ha sustituido con lisina (K) y en la que en uno de los dominios CH1 los aminoácidos en la posición 147 (numeración EU) y en la posición 213 (numeración EU) se han sustituido con ácido glutámico (E).
Más en particular, la invención se refiere a una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en la que en el dominio CL adyacente al miembro de la familia de ligandos de TNF el aminoácido en la posición 123 (numeración EU) se ha reemplazado por arginina (R) y el aminoácido en la posición 124 (numeración EU) se ha sustituido con lisina (K), y en la que en el dominio CH1 adyacente al miembro de la familia de ligandos de TNF los aminoácidos en la posición 147 (numeración EU) y en la posición 213 (numeración EU) se han sustituido con ácido glutámico (E).
Moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF particulares
En otro aspecto, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en la que la molécula de unión a antígeno comprende
una primera cadena pesada y una primera cadena ligera, que comprenden ambas una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana,
un primer péptido que comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1 Bb L que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 conectados entre sí por un primer conector peptídico fusionado en su extremo C por un segundo conector peptídico a una segunda cadena pesada o ligera, y un segundo péptido que comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF fusionado en su extremo C por un tercer conector peptídico a una segunda cadena ligera o pesada, respectivamente.
En otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en la que el primer péptido que comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1 BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, Se Q ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 conectados entre sí por un primer conector peptídico se fusiona en su extremo C por un segundo conector peptídico a un dominio CH1 que es parte de una cadena pesada, y el segundo péptido que comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 se fusiona en su extremo C por un tercer conector peptídico a un dominio CL que es parte de una cadena ligera.
Aún en otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de t Nf , en la que el primer péptido que comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1 Bb L que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, Se Q ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 conectados entre sí por un primer conector peptídico se fusiona en su extremo C por un segundo conector peptídico a un dominio CL que es parte de una cadena pesada, y el segundo péptido que comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 que se fusiona en su extremo C por un tercer conector peptídico a un dominio CH1 que es parte de una cadena ligera.
En otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en la que el primer péptido que comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, Se Q ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 conectados entre sí por un primer conector peptídico se fusiona en su extremo C por un segundo conector peptídico a un dominio VH que es parte de una cadena pesada, y el segundo péptido que comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 se fusiona en su extremo C por un tercer conector peptídico a un dominio VL que es parte de una cadena ligera.
En un aspecto, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en la que en el dominio CL adyacente al miembro de la familia de ligandos de TNF el aminoácido en la posición 123 (numeración EU) se ha reemplazado por arginina (R) y el aminoácido en la posición 124 (numeración EU) se ha sustituido con lisina (K), y en la que en el dominio CH1 adyacente al miembro de la familia de ligandos de TNF los aminoácidos en la posición 147 (numeración EU) y en la posición 213 (numeración EU) se han sustituido con ácido glutámico (E). Estas modificaciones dan lugar a los llamados residuos cargados con propiedades ventajosas que evitan efectos indeseados tales como por ejemplo el emparejamiento incorrecto.
Además, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF como se describe en el presente documento, en la que el antígeno de célula diana se selecciona del grupo que consiste en proteína de activación de fibroblastos (FAP), proteoglucano de sulfato de condroitina asociado a melanoma (MCSP), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), antígeno carcinoembrionario (CEA), CD19, CD20 y CD33.
Moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF, en las que el antígeno de célula diana es FAP
En un aspecto particular, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en la que el antígeno de célula diana es la proteína de activación de fibroblastos (FAP).
En un aspecto, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en la que la molécula Fab que se puede unir específicamente a FAP comprende un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:100, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:101, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:102, y un dominio VL que comprende (iv) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:103, (v) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:104, y (vi) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:12 o SEQ ID NO:105.
En un aspecto particular, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención, en la que la molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana es una molécula Fab que se puede unir específicamente a FAP y comprende un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8 y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9, y un dominio VL que comprende (iv) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10, (v) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:11 y (vi) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:12.
En otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención, en la que la molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana es una molécula Fab que se puede unir específicamente a FAP y comprende un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:100, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:101 y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:102, y un dominio VL que comprende (iv) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:103, (v) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:104 y (vi) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:105.
En otro aspecto, la molécula Fab que se puede unir específicamente a FAP comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ iD NO:17.
En otro aspecto, la molécula Fab que se puede unir específicamente a FAP comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de Se Q ID NO:106 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ iD NO:107.
En un aspecto, la molécula Fab que se puede unir específicamente a FAP comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:17 o una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:106 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:107.
En un aspecto particular, la molécula Fab que se puede unir específicamente a FAP comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:17. En otro aspecto particular, la molécula Fab que se puede unir específicamente a FAP comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O:106 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:107. En un aspecto específico, el resto que se puede unir específicamente a FAP comprende un dominio VH que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O:106 y un dominio VL que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:107.
En otro aspecto, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención comprende
(a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:17, y
(b) un primer y un segundo polipéptido que se unen entre sí por un enlace disulfuro, en la que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98 y SEQ ID NO:99 y por que el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4.
En un aspecto particular, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención comprende
(a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:17, y
(b) un primer y un segundo polipéptido que se unen entre sí por un enlace disulfuro, en la que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:97 y el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:96.
En otro aspecto, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención comprende
(a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:106 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:107, y
(b) un primer y un segundo polipéptido que se unen entre sí por un enlace disulfuro, en la que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:5, Se Q iD NO:97, Se Q ID NO:98 y SEQ ID NO:99 y por que el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4.
En un aspecto particular, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención comprende
(a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:106 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:107, y
(b) un primer y un segundo polipéptido que se unen entre sí por un enlace disulfuro, en la que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:97 y el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:96.
En otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en la que la molécula de unión a antígeno comprende
una primera cadena pesada y una primera cadena ligera, que comprenden ambas una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana,
una segunda cadena pesada que comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF o fragmentos del mismo conectados entre sí por un primer conector peptídico que se fusiona en su extremo C por un segundo conector peptídico a un dominio CH1, y una segunda cadena ligera que comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF o un fragmento del mismo se fusiona en su extremo C por un tercer conector peptídico a un dominio CL, y en la que la molécula de unión a antígeno comprende
(i) una primera cadena pesada que comprende el dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16 y una primera cadena ligera que comprende el dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO:17 o
una primera cadena pesada que comprende el dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:106 y una primera cadena ligera que comprende el dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de Se Q ID NO:107,
(ii) una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:108, SEQ IDNO:111 y SEQ ID NO:113, y
(iii) una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112 y SEQ ID NO:114.
En otro aspecto particular, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, y en la que la molécula de unión a antígeno comprende
una primera cadena pesada y una primera cadena ligera, que comprenden ambas una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana,
una segunda cadena pesada que comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF o fragmentos del mismo conectados entre sí por un primer conector peptídico se fusiona en su extremo C por un segundo conector peptídico a un dominio CL, y una segunda cadena ligera que comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF o un fragmento del mismo que se fusiona en su extremo C por un tercer conector peptídico a un dominio CH1, y en la que la molécula comprende
(i) una primera cadena pesada que comprende el dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16 y una primera cadena ligera que comprende el dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO:17 o
una primera cadena pesada que comprende el dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:106 y una primera cadena ligera que comprende el dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de Se Q ID NO:107,
(ii) una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:119 y SEQ ID NO:173, y
(iii) una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:120 y SEQ ID NO:174.
Más en particular, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF que comprende
(a) una primera cadena pesada y una primera cadena ligera, que comprenden ambas una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana, en la que la primera cadena pesada comprende el dominio Vh que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:106 y la primera cadena ligera comprende el dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:107, y
(b) una segunda cadena pesada que comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF o fragmentos del mismo conectados entre sí por un primer conector peptídico se fusiona en su extremo C por un segundo conector peptídico a un dominio CL, y una segunda cadena ligera que comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF o un fragmento del mismo que se fusiona en su extremo C por un tercer conector peptídico a un dominio CH1, en la que la segunda cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:119 o SEQ ID NO:173, y la segunda cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:120 o SEQ ID NO:174. En particular, la segunda cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:119 y la segunda cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:120.
Además, la divulgación proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, que comprende
(a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana, y
(b) un primer y un segundo polipéptido que se unen entre sí por un enlace disulfuro, en la que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido contiene un dominio CH3 y el segundo polipéptido contiene un dominio CH3, respectivamente, y en la que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF o fragmentos del mismo que se conectan entre sí y al extremo C del dominio CH3 por un conector peptídico y en la que el segundo polipéptido comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF o un fragmento del mismo conectado por medio de un conector peptídico al extremo C del dominio CH3 de dicho polipéptido.
En otro aspecto, la invención se refiere a una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, seleccionada del grupo que consiste en:
a) una molécula que comprende una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:19, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:14 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:15;
b) una molécula que comprende una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:19, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:115 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:116;
c) una molécula que comprende una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:135, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:136, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:108 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:109;
d) una molécula que comprende una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:19, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:139 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:140;
e) una molécula que comprende dos cadenas ligeras que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:19, una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:121 y una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:122;
f) una molécula que comprende una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:19, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:108 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:110;
g) una molécula que comprende una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:145, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:19, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:115 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:116;
h) una molécula que comprende una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:19, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:148 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:149;
i) una molécula que comprende una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:19, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:111 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:112; y
j) una molécula que comprende una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:19, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:113 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:114.
En otro aspecto, la invención se refiere a una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, seleccionada del grupo que consiste en:
a) una molécula que comprende una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:164, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:125, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:115 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:116;
b) una molécula que comprende una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:164, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:125, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:117 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:118;
c) una molécula que comprende dos cadenas ligeras que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:125, una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:123 y una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:124;
d) una molécula que comprende una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:164, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:125, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:119 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:120;
e) una molécula que comprende una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:164, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:125, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:173 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:174; y
f) una molécula que comprende dos cadenas ligeras que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:125, una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:126 y una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:127.
En particular, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF que comprende una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:164, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:125, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:119 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:120.
En otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en la que el miembro de la familia de ligandos de t Nf es OX40L y en la que el antígeno de célula diana es la proteína de activación de fibroblastos (FAP) y el resto que se puede unir específicamente a FAP comprende un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:100, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:101, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:102, y un dominio VL que comprende (iv) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:103, (v) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:104, y (vi) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:12 o SEQ ID NO:105.
En un aspecto particular, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF comprende
(i) una primera cadena pesada que comprende el dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16 y una primera cadena ligera que comprende el dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO:17 o
una primera cadena pesada que comprende el dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:106 y una primera cadena ligera que comprende el dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de Se Q ID NO:107,
(ii) una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:355, y
(iii) una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:356.
Moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF, en las que el antígeno de célula diana es CEA
En un aspecto particular, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en la que el antígeno de célula diana es CEA.
En un aspecto, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en la que la molécula Fab que se puede unir específicamente a CD19 comprende un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:321, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:322, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:323, y un dominio VL que comprende (iv) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:324, (v) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:325, y (vi) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:326.
En un aspecto particular, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención, en la que la molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana es una molécula Fab que se puede unir específicamente a CEA y comprende un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O:321, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:322 y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:323, y un dominio VL que comprende (iv) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:324, (v) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:325 y (vi) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:326.
En otro aspecto, la molécula Fab que se puede unir específicamente a CEA comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de Se Q ID NO:327 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ iD NO:328.
En un aspecto, la molécula Fab que se puede unir específicamente a CEA comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:327 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:328.
En otro aspecto, la molécula Fab que se puede unir específicamente a CEA comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de Se Q ID NO:329 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ iD NO:330.
En un aspecto, la molécula Fab que se puede unir específicamente a CEA comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:329 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:330.
En otro aspecto, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención comprende
(a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:329 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:330, y
(b) un primer y un segundo polipéptido que se unen entre sí por un enlace disulfuro, en la que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ iD NO:5, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98 y SEQ ID NO:99 y por que el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4.
En un aspecto particular, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención comprende
(a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:329 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:330, y
(b) un primer y un segundo polipéptido que se unen entre sí por un enlace disulfuro, en la que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:97 y el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:96.
En otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en la que la molécula de unión a antígeno comprende
una primera cadena pesada y una primera cadena ligera, que comprenden ambas una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana,
una segunda cadena pesada que comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF o fragmentos del mismo conectados entre sí por un primer conector peptídico que se fusiona en su extremo C por un segundo conector peptídico a un dominio CH1, y una segunda cadena ligera que comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF o un fragmento del mismo se fusiona en su extremo C por un tercer conector peptídico a un dominio CL, y en la que la molécula de unión a antígeno comprende
(i) una primera cadena pesada que comprende el dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:329 y una primera cadena ligera que comprende el dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:330,
(ii) una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:111 y SEQ ID NO:113, y
(iii) una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112 y SEQ ID NO:114.
En otro aspecto particular, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, y en la que la molécula de unión a antígeno comprende
una primera cadena pesada y una primera cadena ligera, que comprenden ambas una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana,
una segunda cadena pesada que comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF o fragmentos del mismo conectados entre sí por un primer conector peptídico se fusiona en su extremo C por un segundo conector peptídico a un dominio CL, y una segunda cadena ligera que comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF o un fragmento del mismo que se fusiona en su extremo C por un tercer conector peptídico a un dominio CH1, y en la que la molécula comprende i) una primera cadena pesada que comprende el dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:329 y una primera cadena ligera que comprende el dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:330,
(ii) una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:119 y SEQ ID NO:173, y
(iii) una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:120 y SEQ ID NO:174.
Además, la divulgación proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, que comprende
(a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana, y
(b) un primer y un segundo polipéptido que se unen entre sí por un enlace disulfuro, en la que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido contiene un dominio CH3 y el segundo polipéptido contiene un dominio CH3, respectivamente, y en la que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF o fragmentos del mismo que se conectan entre sí y al extremo C del dominio CH3 por un conector peptídico y en la que el segundo polipéptido comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF o un fragmento del mismo conectado por medio de un conector peptídico al extremo C del dominio CH3 de dicho polipéptido.
En otro aspecto, la invención se refiere a una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, seleccionada del grupo que consiste en:
a) una molécula que comprende una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:333, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:334, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:115 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:116;
b) una molécula que comprende una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:333, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:334, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:117 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:118;
c) una molécula que comprende dos cadenas ligeras que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:334, una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:337 y una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:338;
d) una molécula que comprende una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:333, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:334, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:119 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:120;
e) una molécula que comprende una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:333, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:334, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:173 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:174; y
f) una molécula que comprende dos cadenas ligeras que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:334, una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:341 y una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:342.
En particular, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF que comprende una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:333, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:334, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:119 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:120.
Polinucleótidos
La invención proporciona además polinucleótidos aislados que codifican una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF como se describe en el presente documento o un fragmento del mismo.
Los polinucleótidos aislados que codifican moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de TNF de la invención se pueden expresar como un único polinucleótido que codifica toda la molécula de unión a antígeno o como múltiples (por ejemplo, dos o más) polinucleótidos que se coexpresan. Los polipéptidos codificados por polinucleótidos que se coexpresan se pueden asociar a través de, por ejemplo, enlaces disulfuro u otros medios para formar una molécula de unión a antígeno funcional. Por ejemplo, la porción de la cadena ligera de una inmunoglobulina se puede codificar por un polinucleótido separado de la porción de la cadena pesada de la inmunoglobulina. Cuando se coexpresan, los polipéptidos de la cadena pesada se asociarán con los polipéptidos de la cadena ligera para formar la inmunoglobulina.
En algunos aspectos, el polinucleótido aislado codifica toda la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de acuerdo con la invención como se describe en el presente documento. En particular, el polinucleótido aislado codifica un polipéptido comprendido en la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de t Nf de acuerdo con la invención como se describe en el presente documento.
En un aspecto, la presente invención se refiere a un polinucleótido aislado que codifica una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en el que el polinucleótido comprende (a) una secuencia que codifica una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana, (b) una secuencia que codifica un polipéptido que comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ IDNO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 que se conectan entre sí por un conector peptídico y (c) una secuencia que codifica un polipéptido que comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54.
En otro aspecto, se proporciona un polinucleótido aislado que codifica una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de 4-1BB, en el que el polinucleótido comprende (a) una secuencia que codifica una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana, (b) una secuencia que codifica un polipéptido que comprende dos ectodominios de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID No :2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, Se Q ID NO:374 y SEQ ID NO:375 que se conectan entre sí por un conector peptídico y (c) una secuencia que codifica un polipéptido que comprende un ectodominio de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ IDNO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375.
En otro aspecto, la invención se refiere a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que comprende dos fragmentos de 4-1 BBL que comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 90 %, 95 %, 98 % o 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:96, y a un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que comprende un fragmento de 4-1BBL que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 90 %, 95 %, 98 % o 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:96.
Además, se proporciona un polinucleótido aislado que codifica una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de OX40, en el que el polinucleótido comprende (a) una secuencia que codifica un resto que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana, (b) una secuencia que codifica un polipéptido que comprende dos ectodominios de OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 que se conectan entre sí por un conector peptídico y (c) una secuencia que codifica un polipéptido que comprende un ectodominio de OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54.
En otro aspecto, la invención se refiere a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que comprende dos fragmentos de 4-1 BBL que comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 90 %, 95 %, 98 % o 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54, y a un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que comprende un fragmento de 4-1 BBL que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 90 %, 95 %, 98 % o 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54.
En otros aspectos, la invención se refiere a los polinucleótidos que comprenden una secuencia que es al menos aproximadamente un 90 %, 95 %, 98 % o 100 % idéntica a las secuencias de ADNc específicas divulgadas en el presente documento. En un aspecto particular, la invención se refiere a un polinucleótido que comprende una secuencia que es idéntica a una de las secuencias de ADNc específicas divulgadas en el presente documento.
En otros aspectos, la molécula de ácido nucleico comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO:5, 6, 97, 98, 99, 183, 184 o 185. En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO:14, 15, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115,116, 117, 118, 119, 120, 173 o 174.
Todavía en otros aspectos, la molécula de ácido nucleico comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:66, 67, 68, 69, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 137, 138, 141, 142, 143, 144, 146, 147, 150, 151, 152, 153, 162, 163, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 175, 176, 177, 178, 203, 204, 207, 208, 211, 212, 215, 216, 273, 274, 277, 278, 281, 282, 285, 286, 289, 290, 293, 294, 297, 298, 301, 302, 305, 307, 308, 311, 312, 315, 316, 331, 332, 335, 336, 339, 340, 343, 344, 347, 348, 353 o 354.
En determinados aspectos, el polinucleótido o ácido nucleico es ADN. En otros modos de realización, un polinucleótido de la presente invención es ARN, por ejemplo, en forma en ARN mensajero (ARNm). El ARN de la presente invención puede ser monocatenario o bicatenario.
Procedimientos recombinantes
Las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención se pueden obtener, por ejemplo, por síntesis peptídica en estado sólido (por ejemplo, síntesis en fase sólida de Merrifield) o producción recombinante. Para la producción recombinante, uno o más polinucleótidos que codifican la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF o fragmentos polipeptídicos de la misma, por ejemplo, como se describe anteriormente, se aíslan e insertan en uno o más vectores para clonación y/o expresión adicionales en una célula huésped. Dicho polinucleótido se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales. En un aspecto de la invención, se proporciona un vector, preferentemente un vector de expresión, que comprende uno o más de los polinucleótidos de la invención. Se pueden usar procedimientos que son bien conocidos para los expertos en la técnica can para construir vectores de expresión que contienen la secuencia codificante de la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF (fragmento) junto con señales de control transcripcionales/traduccionales apropiadas. Estos procedimientos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación/recombinación genética in vivo. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); y Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989). El vector de expresión puede ser parte de un plásmido, virus, o puede ser un fragmento de ácido nucleico. El vector de expresión incluye un casete de expresión en el que el polinucleótido que codifica la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF o fragmentos polipeptídicos de la misma (es decir, la región codificante) se clona en asociación funcional con un promotor y/u otros elementos de control de la transcripción o traducción. Como se usa en el presente documento, una "región codificante" es una porción de ácido nucleico que consiste en codones traducidos en aminoácidos. Aunque un "codón de parada" (TAG, TGA o TAA) no se traduce en un aminoácido, se puede considerar que es parte de una región codificante, si está presente, pero cualquier secuencia flanqueante, por ejemplo promotores, sitios de unión a ribosomas, finalizadores transcripcionales, intrones, regiones no traducidas 5' y 3' y similares, no es parte de una región codificante. Dos o más regiones codificantes pueden estar presentes en una única construcción polinucleotídica, por ejemplo, en un único vector, o en construcciones polinucleotídicas separadas, por ejemplo, en vectores separados (diferentes). Además, cualquier vector puede contener una única región codificante, o puede comprender dos o más regiones codificantes, por ejemplo, un vector de la presente invención puede codificar uno o más polipéptidos, que se separan pos o cotraduccionalmente en las proteínas finales por medio de escisión proteolítica. Además, un vector, polinucleótido, o ácido nucleico de la invención puede codificar regiones codificantes heterólogas, fusionadas o bien no fusionadas a un polinucleótido que codifica la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención o fragmentos polipeptídicos de la misma, o variantes o derivados del mismo. Las regiones codificantes heterólogas incluyen, sin limitación, elementos o motivos especializados, tales como un péptido señal secretor o un dominio funcional heterólogo. Una asociación funcional es cuando una región codificante para un producto génico, por ejemplo, un polipéptido, se asocia con una o más secuencias reguladoras de tal forma que sitúa la expresión del producto génico bajo la influencia o control de la(s) secuencia(s) reguladora(s). Dos fragmentos de ADN (tales como una región codificante de polipéptido y un promotor asociado con la misma) se "asocian de forma funcional" si la inducción de la función promotora da como resultado la transcripción de ARNm que codifica el producto génico deseado y si la naturaleza del enlace entre los dos fragmentos de ADN no interfiere con la capacidad de las secuencias reguladoras de la expresión de dirigir la expresión del producto génico ni interfiere con la capacidad del molde de ADN para transcribirse. Por tanto, una región promotora se asociaría de forma funcional con un ácido nucleico que codifica un polipéptido si el promotor puede efectuar la transcripción de ese ácido nucleico. El promotor puede ser un promotor específico de célula que dirige la transcripción sustancial del ADN solo en células predeterminadas. Otros elementos de control de la transcripción, además de un promotor, por ejemplo potenciadores, operadores, represores y señales de finalización de la transcripción, se pueden asociar de forma funcional con el polinucleótido para dirigir la transcripción específica celular.
Los promotores adecuados y otras regiones de control de la transcripción se divulgan en el presente documento. Una variedad de regiones de control de la transcripción son conocidas por los expertos en la técnica. Estas incluyen, sin limitación, regiones de control de la transcripción, que funcionan en células de vertebrado, tales como, pero no limitadas a, segmentos promotores y potenciadores de citomegalovirus (por ejemplo, el promotor temprano inmediato, conjuntamente con intrón-A), virus de simio 40 (por ejemplo, el promotor temprano) y retrovirus (tales como, por ejemplo, el virus del sarcoma de Rous). Otras regiones de control de la transcripción incluyen las derivadas de genes de vertebrados tales como actina, proteína de choque térmico, hormona del crecimiento bovina y p-globina de conejo, así como otras secuencias que pueden controlar la expresión génica en células eucariotas. Las regiones de control de la transcripción adecuadas adicionales incluyen promotores y potenciadores específicos tisulares, así como promotores inducibles (por ejemplo, promotores inducibles de tetraciclinas). De forma similar, una variedad de elementos de control de la traducción son conocidos por los expertos en la técnica. Estos incluyen, pero no se limitan a sitios de unión a ribosomas, codones de iniciación y finalización de la traducción y elementos derivados de sistemas víricos (en particular un sitio de entrada al ribosoma interno o IRES, también denominado secuencia CITE). El casete de expresión también puede incluir otros rasgos característicos tales como un origen de replicación y/o elementos de integración cromosómica tales como repeticiones terminales largas (LTR) retrovíricas o repeticiones terminales invertidas (ITR) víricas adenoasociadas (AAV).
Las regiones codificantes de polinucleótidos y ácidos nucleicos de la presente invención se pueden asociar con regiones codificantes adicionales que codifican péptidos secretores o señal, que dirigen la secreción de un polipéptido codificado por un polinucleótido de la presente invención. Por ejemplo, si se desea la secreción de la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF o fragmentos polipeptídicos de la misma, el ADN que codifica una secuencia señal se puede situar hacia 5' del ácido nucleico que codifica una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención o fragmentos polipeptídicos de la misma. De acuerdo con la hipótesis de señal, las proteínas secretadas por células de mamífero tienen un péptido señal o secuencia líder secretora que se escinde de la proteína madura una vez que se ha iniciado la exportación de la cadena de proteína en crecimiento a través del retículo endoplásmico rugoso. Los expertos en la técnica saben que los polipéptidos secretados por células de vertebrado en general tienen un péptido señal fusionado al extremo N del polipéptido, que se escinde del polipéptido traducido para producir una forma secretada o "madura" del polipéptido. En determinados modos de realización, se usa el péptido señal natural, por ejemplo, un péptido señal de la cadena pesada o cadena ligera de inmunoglobulina, o un derivado funcional de esa secuencia que mantiene la capacidad para dirigir la secreción del polipéptido que se asocia de forma funcional con él. De forma alternativa, se puede usar un péptido señal de mamífero heterólogo, o un derivado funcional del mismo. Por ejemplo, la secuencia líder natural se puede sustituir con la secuencia líder del activador de plasminógeno tisular (TPA) humano o pglucuronidasa de ratón.
El ADN que codifica una secuencia proteica corta que se podría usar para facilitar la posterior purificación (por ejemplo, una marca histidina) o ayudar a marcar la proteína de fusión se puede incluir dentro de o en los extremos del polinucleótido que codifica una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención o fragmentos polipeptídicos de la misma.
En otro aspecto de la invención, se proporciona una célula huésped que comprende uno o más polinucleótidos de la invención. En determinados modos de realización, se proporciona una célula huésped que comprende uno o más vectores de la invención. Los polinucleótidos y vectores pueden incorporar cualquiera de los rasgos característicos, individualmente o en combinación, descritos en el presente documento en relación con polinucleótidos y vectores, respectivamente. En un aspecto, una célula huésped comprende (por ejemplo, se ha transformado o transfectado con) un vector que comprende un polinucleótido que codifica (parte de) una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención. Como se usa en el presente documento, el término "célula huésped" se refiere a cualquier tipo de sistema celular que se puede genomanipular para generar las proteínas de fusión de la invención o fragmentos de las mismas. Las células huésped adecuadas para replicar y para soportar la expresión de moléculas de unión a antígeno son bien conocidas en la técnica. Dichas células se pueden transfectar o traducir según sea apropiado con el vector de expresión particular y se pueden cultivar grandes cantidades de células que contienen vectores para sembrar fermentadores a gran escala para obtener cantidades suficientes de la molécula de unión a antígeno para aplicaciones clínicas. Las células huésped adecuadas incluyen microorganismos procariotas, tales como E. coli, o diversas células eucariotas, tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células de insecto, o similares. Por ejemplo, se pueden producir polipéptidos en bacterias en particular cuando no se necesita glucosilación. Después de la expresión, se puede aislar el polipéptido a partir de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y se puede purificar adicionalmente. Además de procariotas, los microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican polipéptidos, incluyendo cepas de hongos y levaduras con vías de glucosilación que se han "humanizado", dando como resultado la producción de un polipéptido con un patrón de glucosilación parcial o completamente humano. Véanse Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004), y Li et al., Nat Biotech 24, 210­ 215 (2006).
Las células huésped adecuadas para la expresión de polipéptidos (glucosilados) también se derivan de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus que se pueden usar conjuntamente con células de insecto, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda. También se pueden utilizar cultivos de células vegetales como huéspedes. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978, y 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas). También se pueden usar células de vertebrado como huéspedes. Por ejemplo, pueden ser útiles líneas celulares de mamífero que se adaptan para cultivar en suspensión. Otros ejemplos de líneas de células huésped útiles son línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293T como se describe, por ejemplo, en Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)), células de riñón de cría de hámster (BHK), células de Sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)), células de riñón de mono (CV1), células de riñón de mono verde africano (VERO-76), células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA), células de riñón canino (MDCK), células de hígado de rata búfalo (BRL 3A), células de pulmón humano (W138), células de hígado humano (Hep G2), células de tumor mamario de ratón (MMT 060562), células TRI (como se describe, por ejemplo, en Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)), células MRC 5 y células FS4. Otras líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHO-DHFR (Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)); y líneas celulares de mieloma tales como YO, NS0, P3X63 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de proteínas, véase, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003). Las células huésped incluyen células cultivadas, por ejemplo, células cultivadas de mamífero, células de levadura, células de insecto, células bacterianas y células vegetales, por nombrar solo algunas, pero también células comprendidas en un animal transgénico, planta transgénica o tejido animal o vegetal cultivado. En un modo de realización, la célula huésped es una célula eucariota, preferentemente una célula de mamífero, tal como una célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula de riñón embrionario humano (HEK) o una célula linfoide (por ejemplo, célula Y0, NS0, Sp20). Las tecnologías estándar son conocidas en la técnica por expresar genes exógenos en estos sistemas. Las células que expresan un polipéptido que comprende la cadena pesada o bien la ligera de una inmunoglobulina, se pueden genomanipular para expresar también la otra de las cadenas de inmunoglobulina de modo que el producto expresado es una inmunoglobulina que tiene tanto una cadena pesada como una ligera.
En un aspecto, un procedimiento de producción de una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención o fragmentos polipeptídicos de la misma, en la que el procedimiento comprende cultivar una célula huésped que comprende polinucleótidos que codifican la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención o fragmentos polipeptídicos de la misma, como se proporciona en el presente documento, en condiciones adecuadas para la expresión de la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención o fragmentos polipeptídicos de la misma, y recuperar la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención o fragmentos polipeptídicos de la misma de la célula huésped (o medio de cultivo de célula huésped).
En la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención, los componentes (al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana, un polipéptido que comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 y un polipéptido que comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1 BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54) no se fusionan genéticamente entre sí. Los polipéptidos se diseñan de modo que sus componentes (dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID No :2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 y otros componentes tales como CH o CL) se fusionan entre sí directamente o a través de una secuencia conectora. La composición y longitud del conector se pueden determinar de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica y se pueden someter a prueba para determinar su eficacia. Los ejemplos de secuencias conectoras entre diferentes componentes de las moléculas de unión a antígeno de la invención se encuentran en las secuencias proporcionadas en el presente documento. También se pueden incluir secuencias adicionales para incorporar un sitio de escisión para separar los componentes individuales de la proteína de fusión si se desea, por ejemplo una secuencia de reconocimiento de endopeptidasas.
En determinados modos de realización, los restos que se pueden unir específicamente a un antígeno de célula diana (por ejemplo, fragmentos Fab) que forman parte de la molécula de unión a antígeno comprenden al menos una región variable de inmunoglobulina que se puede unir a un antígeno. Las regiones variables pueden formar parte de y derivar de anticuerpos naturales o no naturales y fragmentos de los mismos. Los procedimientos para producir anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo Harlow y Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Los anticuerpos no naturales se pueden construir usando síntesis de péptidos en fase sólida, se pueden producir de forma recombinante (por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 4.186.567) o se pueden obtener, por ejemplo, cribando colecciones combinatorias que comprendan cadenas pesadas variables y cadenas ligeras variables (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.969.108 concedida a McCafferty).
Cualquier especie animal de inmunoglobulina se puede usar en la invención. Las inmunoglobulinas no limitantes útiles en la presente invención pueden ser de origen murino, de primate o humano. Si la proteína de fusión está destinada para uso humano, se puede usar una forma quimérica de inmunoglobulina en la que las regiones constantes de la inmunoglobulina son de un ser humano. Una forma humanizada o completamente humana de la inmunoglobulina también se puede preparar de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.565.332 para Winter). La humanización se puede lograr por diversos procedimientos incluyendo, pero sin limitarse a (a) injertar las CDR no humanas (por ejemplo, anticuerpo donante) en regiones estructurales y constantes humanas (por ejemplo anticuerpo receptor) con o sin retención de los residuos estructurales críticos (por ejemplo, los que son importantes para mantener buena afinidad de unión a antígeno o funciones de anticuerpo), (b) injertar solo las regiones determinantes de especificidad no humanas (SDR o a-CDR; los residuos críticos para la interacción anticuerpoantígeno) en regiones estructurales y constantes humanas, o (c) trasplantar todos los dominios variables no humanos, pero "enmascararlos" con una sección similar a humana por reemplazo de residuos de superficie. Los anticuerpos humanizados y procedimientos para prepararlos se revisan, por ejemplo, en Almagro y Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008), y se describen además, por ejemplo, en Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989); patentes de EE. UU. n.° 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 y 7.087.409; Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison y Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005) (que describen un injerto de SDR (a-CDR)); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) (que describe el "rebamizado"); Dall'Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005) (que describe el "reordenamiento de FR"); y Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005) y Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000) (que describe en enfoque de "selección guiada" al reordenamiento de FR). Las inmunoglobulinas particulares de acuerdo con la invención son inmunoglobulinas humanas. Los anticuerpos humanos y regiones variables humanas se pueden producir usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Los anticuerpos humanos se describen en general en van Dijk y van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) y Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008). Las regiones variables humanas pueden formar parte de y derivar de anticuerpos monoclonales humanos preparados por el procedimiento de hibridoma (véase, por ejemplo, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, p. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). Los anticuerpos humanos y regiones variables humanas también se pueden preparar administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos inalterados o anticuerpos inalterados con regiones variables humanas en respuesta a una exposición antigénica (véase, por ejemplo, Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)). Los anticuerpos humanos y regiones variables humanas también se pueden generar aislando las secuencias de regiones variables de clones de Fv seleccionadas de colecciones de presentación en fagos derivadas de seres humanos (véase por ejemplo, Hoogenboom et al., en Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001); y McCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)). Típicamente, los fagos presentan fragmentos de anticuerpo, como fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o bien como fragmentos Fab.
En determinados aspectos, los restos que se pueden unir específicamente a un antígeno de célula diana (por ejemplo, fragmentos Fab) comprendidos en las moléculas de unión a antígeno de la presente invención se genomanipulan para tener una protenciación en la afinidad de unión de acuerdo con, por ejemplo, los procedimientos divulgados en la publicación PCT WO 2012/020006 (véanse los ejemplos relativos a la maduración de la afinidad) o publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2004/0132066. La capacidad de las moléculas de unión a antígeno de la invención para unirse a un determinante antigénico específico se pueden medir a través de un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) o bien otras técnicas familiares para un experto en la técnica, por ejemplo, técnica de resonancia de plasmón superficial (Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), y ensayos de unión tradicionales (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). Se pueden usar ensayos de competencia para identificar una molécula de unión a antígeno que compite con un anticuerpo de referencia por unirse a un antígeno particular. En determinados modos de realización, una molécula de unión a antígeno competidora de este tipo se une al mismo epítopo (por ejemplo, un epítopo lineal o uno conformacional) que se une por la molécula de unión a antígeno de referencia. Los procedimientos ejemplares detallados para cartografiar un epítopo al que se une una molécula de unión a antígeno se proporcionan en Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", en Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ). En un ensayo de competencia ejemplar, el antígeno inmovilizado se incuba en una solución que comprende una primera molécula de unión a antígeno marcada que se une al antígeno y una segunda molécula de unión a antígeno no marcada que se somete a prueba para determinar su capacidad para competir con la primera molécula de unión a antígeno para unirse al antígeno. La segunda molécula de unión a antígeno puede estar presente en un sobrenadante de hibridoma. Como control, el antígeno inmovilizado se incuba en una solución que comprende la primera molécula de unión a antígeno marcada pero no la segunda molécula de unión a antígeno no marcada. Después de la incubación en condiciones permisivas para la unión del primer anticuerpo al antígeno, se retira el exceso de anticuerpo no unido, y se mide la cantidad de marcador asociado con el antígeno inmovilizado. Si la cantidad de marcador asociado con el antígeno inmovilizado se reduce sustancialmente en la muestra de prueba con relación a la muestra de control, entonces eso indica que la segunda molécula de unión a antígeno está compitiendo con la primera molécula de unión a antígeno para unirse al antígeno. Véase Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual cap. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
Las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de TNF de la invención preparadas como se describe en el presente documento se pueden purificar por técnicas conocidas en la técnica tales como cromatografía de líquidos de alto rendimiento, cromatografía de intercambio iónico, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad, cromatografía de exclusión por tamaño, y similares. Las condiciones reales usadas para purificar una proteína particular dependerán, en parte, de factores tales como carga neta, hidrofobia, hidrofilia, etc., y serán evidentes para los expertos en la técnica. Para la purificación por cromatografía de afinidad, se puede usar un anticuerpo, ligando, receptor o antígeno al que se une la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de TNF. Por ejemplo, para la purificación por cromatografía de afinidad de proteínas de fusión de la invención, se puede usar una matriz con proteína A o proteína G. La cromatografía de afinidad con proteína A o G y la cromatografía de exclusión por tamaño se pueden usar para aislar una molécula de unión a antígeno esencialmente como se describe en los ejemplos. La pureza de la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de TNF o fragmentos de la misma se puede determinar por cualquiera de una variedad de procedimientos analíticos bien conocidos incluyendo electroforesis en gel, cromatografía de líquidos de alta presión, y similares. Por ejemplo, se demostró que las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de TNF expresadas como se describe en los ejemplos estaban inalteradas y apropiadamente ensambladas como se demostró por SDS-PAGE reductora y no reductora.
Ensayos
Las moléculas de unión a antígeno proporcionadas en el presente documento se pueden identificar, cribar o caracterizar por sus propiedades físicas/químicas y/o actividades biológicas por diversos ensayos conocidos en la técnica.
1. Ensayos de afinidad
La afinidad de la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF proporcionada en el presente documento por el correspondiente receptor de TNF se puede determinar de acuerdo con los procedimientos expuestos en los ejemplos por resonancia de plasmón plasmón superficial (RPS), usando instrumentación estándar tal como un instrumento BIAcore (GE Healthcare), y receptores o proteínas diana tales como los que se pueden obtener por expresión recombinante. La afinidad de la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF por el antígeno de célula diana también se puede determinar por resonancia de plasmón plasmón superficial (RPS), usando instrumentación estándar tal como un instrumento BIAcore (GE Healthcare), y receptores o proteínas diana tales como los que se pueden obtener por expresión recombinante. Un modo de realización específico ilustrativo y ejemplar para medir la afinidad de unión se describe en el ejemplo 4. De acuerdo con un aspecto, KD SE MIDE POR RESONANCIA de plasmón superficial usando una máquina BIACORE® T100 (GE Healthcare) a 25 °C.
2. Ensayos de unión y otros ensayos
La unión de la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF proporcionada en el presente documento a las correspondientes células que expresan receptores se puede evaluar usando líneas celulares que expresan el antígeno diana o receptor particular, por ejemplo por citometría de flujo (FACS). En un aspecto, se usan células mononucleares de sangre periférica (PBMC) recién preparadas que expresan el receptor de TNF en el ensayo de unión. Estas células se usan directamente después del aislamiento (PBMC indiferenciadas) o después de la estimulación (PBMC activadas). En otro aspecto, los esplenocitos de ratón activados (que expresan la molécula de receptor de TNF) se usaron para demostrar la unión de la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de t Nf de la invención a las correspondientes células que expresan el receptor de TNF.
En otro aspecto, las líneas celulares de cáncer que expresan el antígeno de célula diana, por ejemplo FAP, se usaron para demostrar la unión de las moléculas de unión a antígeno al antígeno de célula diana.
En otro aspecto, se pueden usar ensayos de competencia para identificar una molécula de unión a antígeno que compite con un anticuerpo o molécula de unión a antígeno específico para unirse a la diana o al receptor de TNF, respectivamente. En determinados modos de realización, una molécula de unión a antígeno competidora de este tipo se une al mismo epítopo (por ejemplo, un epítopo lineal o uno conformacional) que se une por un anticuerpo anti-diana específico o un anticuerpo anti-receptor de TNF específico. Los procedimientos ejemplares para cartografiar un epítopo al que se une un anticuerpo se proporcionan en Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", en Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).
3. Ensayos de actividad
En un aspecto, se proporcionan ensayos para identificar moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF que se unen a un antígeno de célula diana específico y a un receptor de TNF específico que tiene actividad biológica. La actividad biológica puede incluir, por ejemplo, señalización agonista a través del receptor de TNF en células que expresan el antígeno de célula diana. También se proporcionan moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF identificadas por los ensayos por tener dicha actividad biológica in vitro.
En determinados aspectos, una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención se somete a prueba para determinar dicha actividad biológica. Los ensayos para detectar la actividad biológica de las moléculas de la invención son las descritas en el ejemplo 6. Además, los ensayos para detectar la lisis celular (por ejemplo, por medición de liberación de LDH), cinética de apoptosis inducida (por ejemplo, por medición de actividad de caspasa 3/7) o apoptosis (por ejemplo, usando el ensayo TUNEL) son bien conocidos en la técnica. Además, la actividad biológica de dichos complejos se puede evaluar evaluando sus efectos sobre la supervivencia, proliferación y secreción de linfocina de diversos subconjuntos de linfocitos tales como linfocitos NK, linfocitos NKT o linfocitos T y§ o evaluando su capacidad para modular el fenotipo y la función de células presentadoras de antígenos tales como células dendríticas, monocitos/macrófagos o linfocitos B.
Composiciones farmacéuticas, formulaciones y vías de administración
En otro aspecto, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF proporcionadas en el presente documento, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los procedimientos terapéuticos a continuación. En un modo de realización, una composición farmacéutica comprende cualquiera de las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF proporcionadas en el presente documento y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. En otro modo de realización, una composición farmacéutica comprende cualquiera de las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de t Nf proporcionadas en el presente documento y al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF disuelta o dispersada en un excipiente farmacéuticamente aceptable. La expresión "farmacéutica o farmacológicamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que son en general no tóxicas para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas, es decir no producen una reacción adversa, alérgica u otra reacción indeseable cuando se administran a un animal, tal como, por ejemplo, un ser humano, según sea apropiado. La preparación de una composición farmacéutica que contiene al menos una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF y opcionalmente un ingrediente activo adicional será conocida para los expertos en la técnica en vista de la presente divulgación, como se ejemplifica por Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a ed. Mack Printing Company, 1990, incorporado en el presente documento por referencia. En particular, las composiciones son formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Como se usa en el presente documento, "excipiente farmacéuticamente aceptable " incluye cualquiera y todos los disolventes, tampones, medios de dispersión, recubrimientos, tensioactivos, antioxidantes, conservantes (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotónicos, sales, estabilizantes y combinaciones de los mismos, como será conocido para un experto en la técnica.
Las composiciones parenterales incluyen las diseñadas para administración por inyección, por ejemplo, inyección subcutánea, intradérmica, intralesional, intravenosa, intraarterial, intramuscular, intratecal o intraperitoneal. Para inyección, las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención se pueden formular en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer o solución salina fisiológica. La solución puede contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. De forma alternativa, las proteínas de fusión pueden estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua libre de pirógenos estéril, antes de su uso. Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando las proteínas de fusión de la invención en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con diversos de los otros ingredientes enumerados a continuación, según se requiera. La esterilidad se puede lograr fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles. En general, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y/o los otros ingredientes. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones, suspensiones o emulsiones inyectables estériles, los procedimientos preferentes de preparación son técnicas de secado al vacío o liofilización que proporcionan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de un medio líquido previamente filtrado estéril del mismo. El medio líquido se debe tamponar adecuadamente si es necesario y el diluyente líquido se debe volver isotónico en primer lugar antes de la inyección con solución salina o glucosa suficiente. La composición debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. Se apreciará que la contaminación por endotoxinas se debe mantener al mínimo hasta un nivel seguro, por ejemplo, menos de 0,5 ng/mg de proteína. Los excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a: tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; glúcidos tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (PEG). Las suspensiones de inyección acuosas pueden contener compuestos que incrementan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol, dextrano, o similares. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados que incrementan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. Adicionalmente, se pueden preparar suspensiones de los compuestos activos como suspensiones de inyección oleosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleatos de etilo o triglicéridos, o liposomas.
Los ingredientes activos se pueden atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences (18.a ed. Mack Printing Company, 1990). Se pueden preparar preparaciones de liberación mantenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación mantenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el polipéptido, matrices que están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. En modos de realización particulares, la absorción prolongada de una composición inyectable se puede conseguir por el uso en las composiciones de agentes retardantes de la absorción, tales como, por ejemplo, monoestearato de aluminio, gelatina o combinaciones de los mismos.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables ejemplares en el presente documento incluyen además agentes de dispersión de fármacos intersticiales tales como glucoproteínas hialuronidasas activas a pH neutro solubles (sHASEGP), por ejemplo, glucoproteínas hialuronidasas a pH-20 solubles humanas, tales como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Determinadas sHASEGP ejemplares y procedimientos de uso, incluyendo rHuPH20, se describen en las publicaciones de patente de EE. UU. n.° 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, una sHASEGP se combina con una o más glucosaminoglucanasas adicionales, tales como condroitinasas.
Se describen formulaciones de anticuerpos liofilizadas ejemplares en la patente de EE. UU. n.° 6.267.958. Las formulaciones de anticuerpos acuosas incluyen las descritas en la patente de EE. UU. n.° 6.171.586 y documento WO 2006/044908, incluyendo estas últimas formulaciones un tampón acetato-histidina.
Además de las composiciones descritas previamente, las proteínas de fusión también se pueden formular como preparación de liberación lenta. Dichas formulaciones de acción prolongada se pueden administrar por implantación (por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. Por tanto, por ejemplo, las proteínas de fusión se pueden formular con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo como emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados escasamente solubles, por ejemplo, como sal escasamente soluble.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas de fusión de la invención se pueden fabricar por medio de procedimientos convencionales de mezclado, disolución, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de manera convencional usando uno o más vehículos, diluyentes, excipientes o coadyuvantes fisiológicamente aceptables que facilitan el procesamiento de las proteínas en preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente. La formulación apropiada depende de la vía de administración elegida.
Las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF se pueden formular en una composición en forma de ácido o base libre, neutra o salina. Las sales farmacéuticamente aceptables son sales que mantienen sustancialmente la actividad biológica del ácido o base libre. Estas incluyen las sales de adición de ácido, por ejemplo, las formadas con los grupos amino libres de una composición proteica, o que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o dichos ácidos orgánicos como ácido acético, oxálico, tartárico o mandélico. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico; o dichas bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina o procaína. Las sales farmacéuticas tienden a ser más solubles en disolventes acuosos y otros disolventes próticos que las correspondientes formas de base libre.
La composición en el presente documento también puede contener más de un ingrediente activo según sea necesario para la indicación particular que se está tratando, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se vean afectadas de forma adversa entre sí. Dichos ingredientes activos están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido.
Las formulaciones que se van a usar para la administración in vivo son, en general, estériles. La esterilidad se puede lograr fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles.
Procedimientos y composiciones terapéuticos
Cualquiera de las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF proporcionadas en el presente documento se puede usar en procedimientos terapéuticos.
Para su uso en procedimientos terapéuticos, las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención se pueden formular, dosificar y administrar en una forma consecuente con la buena práctica médica. Los factores que se deben tener en consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se está tratando, el mamífero particular que se está tratando, la afección clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el procedimiento de administración, la programación de la administración y otros factores conocidos por los médicos.
En un aspecto, se proporcionan moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención para su uso como medicamento. En otros aspectos, se proporcionan moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad, en particular para su uso en el tratamiento de cáncer. En determinados aspectos, se proporcionan moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención para su uso en un procedimiento de tratamiento. En un aspecto, la divulgación proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un individuo que necesite el mismo. En determinados aspectos, la divulgación proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF para su uso en un procedimiento de tratamiento de un individuo que tiene una enfermedad que comprende administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de fusión. En determinados aspectos, la enfermedad que se va a tratar es cáncer. Los ejemplos de cánceres incluyen tumores sólidos, cáncer de vejiga, carcinoma de células renales, cáncer cerebral, cáncer de cabeza y cuello, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer ovárico, cáncer uterino, cáncer cervicouterino, cáncer de endometrio, cáncer esofágico, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer gástrico, cáncer de próstata, neoplasia hemática, cáncer de piel, carcinoma de células escamosas, cáncer de hueso, y cáncer de riñón, melanoma, linfoma de linfocitos B, leucemia de linfocitos B, linfoma no hodgkiniano y leucemia linfocítica aguda. Por tanto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento de cáncer. El sujeto, paciente o "individuo" que necesita tratamiento es típicamente un mamífero, más específicamente un ser humano.
En otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento de enfermedades infecciosas, en particular para el tratamiento de infecciones víricas. En otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias tales como por ejemplo la enfermedad del lupus.
En un aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (CCECC), cáncer de mama, cáncer colorrectal (CCR), cáncer pancreático (CP), cáncer gástrico, carcinoma de pulmón no microcítico (CPNM) y mesotelioma, en la que el antígeno de célula diana es FAP.
En otro aspecto, la divulgación se refiere al uso de una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF en la fabricación o preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad en un individuo que necesite el mismo. En un aspecto, el medicamento es para su uso en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad que comprende administrar a un individuo que tiene la enfermedad una cantidad terapéuticamente eficaz del medicamento. En determinados modos de realización, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno proliferativo, en particular cáncer. Por tanto, en un aspecto, la divulgación se refiere al uso de una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención en la fabricación o preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer. Los ejemplos de cánceres incluyen tumores sólidos, cáncer de vejiga, carcinoma de células renales, cáncer cerebral, cáncer de cabeza y cuello, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer ovárico, cáncer uterino, cáncer cervicouterino, cáncer de endometrio, cáncer esofágico, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer gástrico, cáncer de próstata, neoplasia hemática, cáncer de piel, carcinoma de células escamosas, cáncer de hueso, y cáncer de riñón, melanoma, linfoma de linfocitos B, leucemia de linfocitos B, linfoma no hodgkiniano y leucemia linfocítica aguda. Otros trastornos de proliferación celular que se pueden tratar usando una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, neoplasias localizadas en el: abdomen, hueso, mama, aparato digestivo, hígado, páncreas, peritoneo, glándulas endocrinas (suprarrenal, paratiroidea, pituitaria, testículos, ovario, timo, tiroidea) ojo, cabeza y cuello, sistema nervioso (central y periférico), sistema linfático, aparato genital femenino, piel, tejidos blandos, bazo, región torácica y aparato genitourinario. También se incluyen afecciones o lesiones precancerosas y metástasis de cáncer. En determinados modos de realización, el cáncer se elige del grupo que consiste en cáncer de células renales, cáncer de piel, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer cerebral, cáncer de cabeza y cuello. Un experto en la técnica puede reconocer que en algunos casos la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF puede que no proporcione una cura sino que solo puede proporcionar un beneficio parcial. En algunos aspectos, un cambio fisiológico que tiene algún beneficio también se considera terapéuticamente beneficioso. Por tanto, en algunos aspectos, una cantidad de molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF que proporciona un cambio fisiológico se considera una "cantidad eficaz" o una "cantidad terapéuticamente eficaz".
En otro aspecto, la divulgación se refiere al uso de una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF como se describe en el presente documento en la fabricación o preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades infecciosas, en particular para el tratamiento de infecciones víricas o para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, por ejemplo enfermedad del lupus.
Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosificación apropiada de una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención (cuando se usa solo o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, la vía de administración, el peso corporal del paciente, el tipo de proteína de fusión, la gravedad y evolución de la enfermedad, si la proteína de fusión se administra con propósitos preventivos o terapéuticos, intervenciones terapéuticas previas o coincidentes, la anamnesis del paciente y respuesta a la proteína de fusión, y el criterio del médico especialista. El profesional responsable para su administración determinará, en cualquier caso, la concentración del/de los ingrediente(s) activo(s) en una composición y dosis apropiada(s) para el sujeto individual. En el presente documento se contemplan diversas pautas de dosificación que incluyen pero no se limitan a administraciones individuales o múltiples durante diversos puntos temporales, administración en bolo, e infusión pulsada.
La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF se administra adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, de aproximadamente 1 pg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1 mg/kg - 10 mg/kg) de molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF puede ser una dosificación candidata inicial para la administración al paciente, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas, o por infusión continua. Una dosificación diaria típica podría variar de aproximadamente 1 pg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento en general se mantendría hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de enfermedad. Una dosificación ejemplar de la proteína de fusión estaría en el intervalo desde aproximadamente 0,005 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. En otros ejemplos, una dosis también puede comprender de aproximadamente 1 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 5 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 50 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 100 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 200 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 350 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 500 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 200 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 350 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal, a aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal o más por administración, y cualquier intervalo derivable en los mismos. En ejemplos de un intervalo derivable de los números enumerados en el presente documento, se puede administrar un intervalo de aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 5 pg/kg de peso corporal a aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal etc., en base a los números descritos anteriormente. Por tanto, se pueden administrar al paciente una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas). Dichas dosis se pueden administrar de forma intermitente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de modo que el paciente recibe de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, o por ejemplo, aproximadamente seis dosis de la proteína de fusión). Se puede administrar una dosis de carga mayor inicial, seguido de una o más dosis menores. Sin embargo, otras pautas posológicas pueden ser útiles. La progresión de este tratamiento se sigue fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.
Las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención se usarán en general en una cantidad eficaz para lograr el propósito destinado. Para su uso para tratar o prevenir un estado de enfermedad, las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención, o composiciones farmacéuticas de las mismas, se administran o aplican en una cantidad terapéuticamente eficaz. La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de las capacidades de los expertos en la técnica, en especial en vista de la divulgación detallada proporcionada en el presente documento.
Para la administración sistémica, se puede estimar inicialmente una dosis terapéuticamente eficaz a partir de ensayos in vitro, tales como ensayos de cultivo celular. A continuación se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración en circulación que incluye la CI50 como se determina en cultivo celular. Se puede usar dicha información para determinar con más exactitud dosis útiles en seres humanos.
También se pueden estimar dosificaciones iniciales a partir de datos in vivo, por ejemplo, modelos animales, usando técnicas que son bien conocidas en la técnica. Un experto en la técnica podrá optimizar fácilmente la administración a seres humanos en base a datos en animales.
La cantidad e intervalo de dosificación se pueden ajustar individualmente para proporcionar niveles plasmáticos de las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF que sean suficientes para mantener un efecto terapéutico. Las dosificaciones de paciente habituales para administración por inyección varían de aproximadamente 0,1 a 50 mg/kg/día, típicamente de aproximadamente 0,5 a 1 mg/kg/día. Se pueden lograr niveles plasmáticos terapéuticamente eficaces administrando dosis múltiples cada día. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, por HPLC.
En los casos de administración local o captación selectiva, la concentración local eficaz de la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF puede no estar relacionada con la concentración plasmática. Un experto en la técnica podrá optimizar dosificaciones locales terapéuticamente eficaces sin experimentación excesiva.
Una dosis terapéuticamente eficaz de las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF descritas en el presente documento proporcionará en general beneficio terapéutico sin provocar toxicidad sustancial. La toxicidad y eficacia terapéutica de una proteína de fusión se pueden determinar por procedimientos farmacéuticos estándar en cultivo celular o animales de experimentación. Se pueden usar ensayos de cultivo celular y estudios en animales para determinar la DL50 (la dosis letal para un 50 % de una población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en un 50 % de una población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, que se puede expresar como la proporción DL50/DE50. Las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF que presentan índices terapéuticos grandes son preferentes. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de acuerdo con la presente invención presenta un índice terapéutico alto. Los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivo celular y estudios en animales se pueden usar en la formulación de un intervalo de dosificaciones adecuadas para su uso en seres humanos. Preferentemente, la dosificación se encuentra dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de una variedad de factores, por ejemplo, la forma de dosificación empleada, la vía de administración utilizada, la afección del sujeto, y similares. La formulación exacta, vía de administración y dosificación se pueden elegir por el médico individual en vista de la afección del paciente (véase, por ejemplo, Fingl et al., 1975, en: The Pharmacological Basis of Therapeutics, cap. 1, p. 1, incorporado en el presente documento por referencia en su totalidad).
El médico especialista para pacientes tratados con las proteínas de fusión de la invención sabrá cómo y cuándo finalizar, interrumpir o ajustar la administración debido a la toxicidad, disfunción orgánica y similares. A la inversa, el médico especialista también sabrá ajustar el tratamiento a niveles mayores si la respuesta clínica no fuera adecuada (excluyendo la toxicidad). La magnitud de una dosis administrada en el abordaje del trastorno de interés variará con la gravedad de la afección que se va a tratar, con la vía de administración, y similares. La gravedad de la afección, por ejemplo, se puede evaluar, en parte, por procedimientos de evaluación de pronóstico estándar. Además, la dosis y quizás la frecuencia de dosis también variarán de acuerdo con la edad, peso corporal, y respuesta del paciente individual.
Otros agentes y tratamientos
Las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención se pueden administrar en combinación con uno o más de otros agentes en tratamiento. Por ejemplo, se puede coadministrar una proteína de fusión de la invención con al menos un agente terapéutico adicional. El término "agente terapéutico" engloba cualquier agente que se puede administrar para tratar un síntoma o enfermedad en un individuo que necesita dicho tratamiento. Dicho agente terapéutico adicional puede comprender cualquier ingrediente activo adecuado para la indicación particular que se está tratando, preferentemente el que tiene actividades complementarias que no se ven afectadas de manera adversa entre sí. En determinados modos de realización, un agente terapéutico adicional es otro agente antineoplásico.
Dichos otros agentes están presentes de forma adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de proteína de fusión usada, el tipo de trastorno o tratamiento y otros factores analizados anteriormente. Las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF se usan en general en las mismas dosificaciones y con vías de administración como se describe en el presente documento, o aproximadamente de un 1 a un 99 % de las dosificaciones descritas en el presente documento, o en cualquier dosificación y por cualquier vía que se determine empírica/clínicamente que es apropiada.
Dichas politerapias indicadas anteriormente engloban la administración combinada (donde dos o más agentes terapéuticos se incluyen en la misma o en composiciones separadas), y la administración separada, caso en el que se puede producir la administración de la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención antes de, simultáneamente y/o después de la administración del coadyuvante y/o agente terapéutico adicional.
Artículos de fabricación
En otro aspecto de la invención, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una ficha técnica o prospecto del envase en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringuillas, bolsas con solución i.v., etc. Los recipientes se pueden formar de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es por sí misma o combinada con otra composición eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y puede tener una vía de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa con solución intravenosa o un vial que tiene un tapón que es perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de TNF de la invención.
La ficha técnica o prospecto del envase indica que la composición se usa para tratar la afección de elección. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de TNF de la invención; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende otro agente citotóxico u de otro modo terapéutico. El artículo de fabricación en este modo de realización de la invención puede comprender además un prospecto del envase que indique que las composiciones se pueden usar para tratar una afección particular.
De forma alternativa, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyectables (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.
Tabla C (secuencias):
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La información general con respecto a las secuencias de nucleótidos de las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulinas humanas se da en: Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Los aminoácidos de las cadenas de anticuerpos están numerados y se denominan de acuerdo con los sistemas de numeración EU de acuerdo con Kabat (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) como se define anteriormente.
EJEMPLOS
Los siguientes son ejemplos de procedimientos y composiciones de la invención. Se entiende que se pueden practicar otros modos de realización diversos, dada la descripción general proporcionada anteriormente.
Técnicas de ADN recombinante
Se usaron procedimientos estándar para manipular ADN como se describe en Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Se usaron los reactivos biológicos moleculares de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La información general con respecto a las secuencias de nucleótidos de las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina humana se proporciona en: Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta ed., publicación NIH n.° 91-3242.
Secuenciación de ADN
Se determinaron secuencias de ADN por secuenciación de doble hebra.
Síntesis génica
Se generaron segmentos de genes deseados por PCR usando moldes apropiados o bien se sintetizaron por Geneart AG (Ratisbona, Alemania) a partir de oligonucleótidos sintéticos y productos de PCR por síntesis génica automatizada. En casos donde no estaba disponible ninguna secuencia génica exacta, se diseñaron cebadores oligonucleotídicos en base a las secuencias de los homólogos más cercanos y se aislaron los genes por RT-PCR del ARN que se origina en el tejido apropiado. Se clonaron los segmentos génicos flanqueados por sitios de escisión de endonucleasas de restricción singulares en vectores de clonación/secuenciación estándar. Se purificó el ADN plasmídico de bacterias transformadas se determinó la concentración por espectroscopía UV. Se confirmó la secuencia de ADN de los fragmentos génicos subclonados por secuenciación de ADN. Se diseñaron segmentos génicos con sitios de restricción adecuados para permitir la subclonación en los respectivos vectores de expresión. Se diseñaron todas las construcciones con una secuencia de ADN del extremo 5' que codifica un péptido líder que se dirige a proteínas para su secreción en células eucariotas.
Técnicas de cultivo celular
Se usaron técnicas de cultivo celular estándar como se describe en Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. y Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.
Purificación de proteínas
Se purificaron proteínas a partir de sobrenadantes de cultivo celular filtrados en referencia a los protocolos estándar. En resumen, se aplicaron anticuerpos a una columna de proteína A Sepharose (GE Healthcare) y se lavaron con PBS. Se logró la elución de los anticuerpos a pH 2,8 seguido de neutralización inmediata de la muestra. Se separó la proteína agregada de los anticuerpos monoméricos por cromatografía de exclusión por tamaño (Superdex 200; GE Healthcare) en PBS o en histidina 20 mM, NaCl 150 mM, pH 6,0. Se combinaron las fracciones de los anticuerpos monoméricos, se concentró (si se requirió) usando, por ejemplo, un concentrador centrífugo MILLIPORE Amicon Ultra (30 MWCO), se congeló y se almacenó a -20 °C o -80 °C. Parte de las muestras se proporcionaron para posterior análisis de proteínas y caracterización analítica, por ejemplo, por SDS-PAGE, cromatografía de exclusión por tamaño (CET) o espectrometría de masas.
SDS-PAGE
El sistema de gel NuPAGE® Pre-Cast (Invitrogen Corp.) se usó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En particular, se usó un 10 % o un 4-12 % de geles NuPAGE® Novex® Bis-TRIS Pre-Cast (pH 6,4) y un MES NuPAGE® (geles reducidos, con aditivo de tampón de migración NuPAGE® Antioxidant) o tampón de migración MOPS (geles no reducidos).
Cromatografía de exclusión por tamaño analítica
Se realizó una cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) para la determinación de la agregación y del estado oligomérico de los anticuerpos por cromatografía HPLC. En resumen, se aplicaron anticuerpos purificados con proteína A a una columna Tosoh TSKgel G3000SW en NaCl 300 mM, KH2PO4/K2HPO450 mM, pH 7,5 en un sistema Agilent HPLC 1100 o a una columna Superdex 200 (GE Healthcare) en 2 x PBS en un sistema Dionex HPLC. Se cuantificó la proteína eluida por absorbancia UV e integración de áreas de picos. BioRad Gel Filtration Standard 151-1901 sirvió como patrón.
Espectrometría de masas
Esta sección describe la caracterización de los anticuerpos multiespecíficos con intercambio de VH/VL (VH/VL CrossMabs) con hincapié en su correcto ensamblaje. Las estructuras primarias esperadas se analizaron mediante espectrometría de masas con ionización por electronebulización (ESI-Em ) de los CrossMab inalterados desglucosilados y CrossMab desglucosilados/digeridos con plasmina o de forma alternativa desglucosilados/digeridos con LysC limitada.
Los CrossMab VH/VL se desglucosilaron con N-glucosidasa F en un tampón fosfato o Tris a 37 °C durante hasta 17 h a una concentración de proteína de 1 mg/ml. Las digestiones con plasmina o LysC limitada (Roche) se realizaron con 100 |jg de CrossMab VH/VL desglucosilados en un tampón Tris pH 8 a temperatura ambiente durante 120 horas y a 37 °C durante 40 min, respectivamente. Antes de la espectrometría de masas, las muestras se desalaron por medio de HPLC en una columna Sephadex G25 (GE Healthcare). La masa total se determinó por medio de EM-IEN en un sistema de EM maXis 4G UHR-QTOF (Bruker Daltonik) equipado con una fuente TriVersa NanoMate (Advion).
Determinación de la unión y afinidad de unión de anticuerpos multiespecíficos a los respectivos antígenos usando resonancia de plasmón superficial (RPS) (BIACORE)
La unión de los anticuerpos generados a los respectivos antígenos se investiga por resonancia de plasmón superficial usando un instrumento BIACORE (GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Suecia). En resumen, para las mediciones de la afinidad se inmovilizan anticuerpos de cabra contra IgG humana, JIR 109-005-098, en un chip CM5 por medio de acoplamiento de aminas para la presentación de los anticuerpos contra el antígeno respectivo. La unión se mide en un tampón HBS (HBS-P (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,005 %, ph 7,4), 25 °C (o de forma alternativa a 37 °C). Se añadió antígeno (R&D Systems o purificado internamente) en diversas concentraciones en solución. La asociación se midió por una inyección de antígeno de 80 segundos a 3 minutos; la disociación se midió lavando la superficie del chip con tampón HBS durante 3­ 10 minutos y se estimó el valor de KD usando un modelo de unión 1:1 de Langmuir. Los datos de control negativo (por ejemplo, curvas de tampón) se restan de las curvas de muestra para la corrección de la desviación de referencia intrínseca del sistema y para la reducción de la señal de ruido. El respectivo programa informático de evaluación de Biacore se usa para el análisis de sensogramas y para el cálculo de datos de afinidad.
Ejemplo 1
1.1 Preparación de moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB humano dirigido
Los diferentes fragmentos de la secuencia de ADN que codifica parte del ectodominio (aminoácidos 71-254, 52-254 y 80-254) del ligando de 4-1BB humano se sintetizaron de acuerdo con la secuencia P41273 de la base de datos Uniprot (SEQ ID NO:42).
Como componentes para el ensamblaje de una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de TNF, un polipéptido que comprende dos ectodominios de ligando de 4-1BB, separados por conectores (G4S)2, y fusionados al dominio CH1 o CL de IgG1 humana, se clonó como se representa en la figura 1A-(ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, CH1 o CL humano) o como se representa en la figura 1C (CH3 humano, conector (G4S)2, ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando de 4-1BB humano).
Un polipéptido que comprende un ectodominio de ligando de 4-1BB y fusionado al dominio CL o CH1 de IgG1 humana, se clonó como se describe en la figura 1B (ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, CL o CH1 humano) o como se representa en la figura 1D (CH3 humano, conector (G4S)2, ligando de 4-1 BB humano).
Los polipéptidos se subclonaron sin cambio de pauta de lectura con los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de IgG1 humana con conectores peptídicos opcionales, por ejemplo para la construcción 1 el polipéptido que codifica el ligando de 4-1BB dimérico fusionado a un dominio CH1 humano se subclonó sin cambio de pauta de lectura con los CH2 y CH3 de la cadena pesada de lgG1 humana en el botón (Merchant,
Zhu etal. 1998) usando un conector (G4S)2 de SEQ ID NO:13 o (GSPGSSSSGS) de SEQ ,D NO:57.
Las secuencias de ADN de la región variable de la cadena pesada y ligera que codifican una proteína fijadora específica para la proteína de activación de fibroblastos (fAp ), es decir, 28H1, se subclonaron sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal (Carter, J. Immunol. Methods (2001), 248, 7-15) o bien la cadena ligera constante de IgG1 humana. La generación y preparación de las proteínas fijadoras de FAP se describe en el documento WO 2012/020006 A2, que se incorpora en el presente documento por referencia.
La tabla 1 resume las características de las construcciones producidas. Las construcciones 1 a 10 difieren en su geometría, valencia para FAP, ectodominio de ligando de 4-1BB, entrecruzamiento del dominio CH1 y CL (tecnología CrossMab), mutaciones en los dominios CH1 y CL y diferentes conectores peptídicos en el polipéptido que comprende un ectodominio de ligando de 4-1BB (cadena de 4-1BBL monomérico).
Tabla 1: Características de las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de TNF producidas (trímeros de 4-1BBL escindido de FAP)
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Para evitar el emparejamiento incorrecto, en la mayoría de las construcciones un par de dominios CH1 y CL se reemplazó entre sí (entrecruzamiento de dominio) como se describe en el documento WO 2009/080253 A1.
Para mejorar además el emparejamiento correcto, se introdujeron diferentes sustituciones aminoacídicas cargadas en los dominios CH1 y CL cruzados o no cruzados como residuos cargados en las construcciones 2 a 4 y 6 a 10. En el dominio CL humano, se introdujeron las mutaciones E123R y Q124K, mientras que las mutaciones K147E y K213E se clonaron en el dominio CH1 humano.
Para todas las construcciones, la tecnología de heterodimerización de botones en ojales se usó con las mutaciones S354C/T366W en el dominio CH3 de la cadena de botón y las correspondientes mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V en el dominio CH3 de la cadena de ojal (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).
Las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala se han introducido en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores de Fc gamma de acuerdo con el procedimiento descrito en la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 2012/130831 A1.
Por ejemplo, en la construcción 1 la combinación de ligando-cadena de botón de Fc que contiene las mutaciones S354C/T366W en el primer dominio CH3, con anti-FAP dirigido-cadena de ojal de Fc que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V en el segundo CH3 dominio permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando de 4-1BB trimérico ensamblado y un Fab de unión a FAP (figura 2, gráfica 1.1).
La tabla 2 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a FAP monovalente (construcción 1.1).
Tabla 2: Secuencias de la molécula de fusión de (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB humano dirigido a FAP, construcción 1.1
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La tabla 3 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a FAP monovalente (construcción 1.2) con entrecruzamiento de CH1-CL y residuos cargados.
Tabla 3: Secuencias de la molécula de fusión de (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB humano dirigido a FAP, construcción 1.2
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La tabla 4 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a FAP monovalente, construcción 1.3 (trímero escindido de FAP con entrecruzamiento de CH1-CL en Fab anti-FAP y residuos cargados en las cadenas que contienen 4-1BBL).
Tabla 4: Secuencias de la molécula de fusión de (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB humano dirigido a FAP, construcción 1.3
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La tabla 5 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a FAP monovalente, construcción 1.4 (trímero escindido de FAP con Fab anti-FAP, ligando de 4-1BB monomérico fusionado a cadena de botón-CH1 y residuos cargados en las cadenas que contienen 4-1BBL).
Tabla 5: Secuencias de la molécula de fusión de (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB humano dirigido a FAP, construcción 1.4
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La tabla 6 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a FAP bivalente, construcción 1.5 (trímero escindido de FAP con 2 Fab anti-FAP, ligando de 4-1BB monomérico y dimérico fusionado al extremo C de cada cadena pesada, respectivamente).
Tabla 6: Secuencias de la molécula de fusión de (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB humano dirigido a FAP, construcción 1.5
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La tabla 7 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a FAP monovalente, construcción 1.6 (trímero escindido de FAP con Fab anti-FAP, ligando de 4-1BB monomérico fusionado a CL* por medio de un conector (G4S)).
Tabla 7: Secuencias de la molécula de fusión de (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB humano dirigido a FAP, construcción 1.6
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La tabla 8 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a FAP bivalente, construcción 7 (trímero escindido de FAP con doble anti-FAP en el extremo N de la cadena de ojal de Fc y residuos cargados en CH1 y CL cruzados fusionados a ligandos de 4-1BB).
Tabla 8: Secuencias de la molécula de fusión de (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB humano dirigido a FAP, construcción 1.7
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La tabla 9 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a FAP bivalente, construcción 1.8 (trímero escindido de FAP con ligandos de 4-1BB fusionados a CrossFab anti-FAP, con residuos cargados, en la cadena de botón).
Tabla 9: Secuencias de la molécula de fusión de (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB humano dirigido a FAP, construcción 1.8
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La tabla 10 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB (52-254) dirigido a FAP monovalente, construcción 1.9 (trímero escindido de FAP con los aminoácidos de ectodominio de 4-1BBL 52-254 y residuos cargados en cadenas de ligando). Tabla 10: Secuencias de la molécula de fusión de (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB humano dirigido a FAP, construcción 1.9
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La tabla 11 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB (80-254) dirigido a FAP monovalente, construcción 1.10 (trímero escindido de FAP con los aminoácidos de ectodominio de 4-1BBL 80-254 y residuos cargados en cadenas de ligando). Tabla 11: Secuencias de la molécula de fusión de (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB humano dirigido a FAP, construcción 10
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1.2 Producción de construcciones de fusión de Fc-ligando de 4-1BB trimérico escindido dirigido a FAP (28H1)
Las secuencias que codifican moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando de TNF dirigido se clonaron en un vector plasmídico, que conduce la expresión del inserto de un promotor MPSV y contiene una secuencia de polyA sintética localizada en el extremo 3' de CDS. Además, el vector contiene una secuencia OriP de EBV para el mantenimiento episómico del plásmido.
La molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de TNF dirigido se produjo cotransfectando células HEK293-EBNA con los vectores de expresión de mamífero usando polietilenimina. Las células se transfectaron con los correspondientes vectores de expresión en una proporción 1:1:1:1 (por ejemplo, "vector ligando dimérico-(CH1 o CL)-cadena de botón": "vector fusión de ligando monomérico-(CL o CH1)": "vector Fab anti-FAP-cadena pesada de ojal": "vector cadena ligera anti-FAP") para las construcciones 1,2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10. Para la construcción bivalente 5, se usó una proporción 1:1:1 ("vector cadena pesada de ojal": "vector cadena pesada de botón": "vector cadena ligera anti-FAP").
Para la producción en matraces de agitación de 500 ml, se sembraron 300 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la transfección. Para la transfección, las células se centrifugaron durante 10 minutos a 210 x g, y el sobrenadante se reemplazó por 20 ml de medio CD CHO precalentado. Los vectores de expresión (200 |jg de ADN total) se mezclaron en 20 ml de medio CD CHO. Después de la adición de 540 pl de PEI, la solución se agitó con vórtex durante 15 segundos y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de esto, las células se mezclaron con la solución de ADN/PEI, se transfirió a un matraz agitador 500 ml y se incubó durante 3 horas a 37 °C en un incubador con una atmósfera de CO2 al 5 %. Después de la incubación, se añadieron 160 ml de medio Excell complementado con L-glutamina 6 mM, 5 g/l de PEPSOY y ácido valproico 1,2 mM y las células se cultivaron durante 24 horas. Un día después de la transfección, se añadieron Feed 7 al 12 % y glucosa (concentración final 3 g/l). Después de cultivar durante 7 días, el sobrenadante se recogió por centrifugación durante 30-40 minutos a 400 x g. La solución se filtró de forma estéril (filtro 0,22 pm), complementado con acida de sodio hasta una concentración final de 0,01 % (p/v), y se mantuvo a 4 °C.
La molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de TNF dirigido se purificó se purificó de los sobrenadantes de cultivo celular por cromatografía de afinidad usando proteína A, seguido de cromatografía de exclusión por tamaño. Para la cromatografía de afinidad, el sobrenadante se cargó en una columna MabSelect Sure (CV = 5-15 ml, resina de GE Healthcare) equilibrada con tampón de fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM (pH 7,5). La proteína no unida se retiró lavando con al menos 6 volúmenes de columna del mismo tampón. La proteína unida se eluyó usando un gradiente lineal (20 VC) o bien una elución en etapas (8 VC) con tampón de citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 100 mM, glicina 100 mM (pH 3,0). Para el gradiente lineal, se aplicó una elución en etapas adicional de 4 volúmenes de columna.
El pH de fracciones recogidas se ajustó añadiendo 1/10 (v/v) de fosfato de sodio 0,5 M, pH 8,0. La proteína se concentró antes de cargarse en una columna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada con solución de histidina 20 mM, cloruro de sodio 140 mM, Tween20 al 0,01 % (v/v) de pH 6,0.
La concentración de proteína se determinó midiendo la densidad óptica (DO) a 280 nm, usando un coeficiente de extinción molar calculado en base a la secuencia de aminoácidos. La pureza y el peso molecular de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de TNF dirigido se analizó por SDS-PAGE en presencia y ausencia de un agente reductor (1,4-ditiotreitol 5 mM) y tinción con Coomassie SimpleBlue™ SafeStain (Invitrogen USA) o CE-SDS usando Caliper LabChip GXII (Perkin Elmer). El contenido en agregado de muestras se analizó usando una columna de exclusión por tamaño analítica TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) equilibrada en un tampón de migración de K2HPO425 mM, NaCl 125 mM, monoclorhidrato de L-arginina 200 mM, NaN3 al 0,02 % (p/v), pH 6,7 a 25 °C.
La tabla 12 resume el rendimiento y contenido en monómero final de las moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de 4-1BBL dirigido a FAP.
Tabla 12: Análisis bioquímico de las moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de 4-1BBL dirigido a FAP (28H1)
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1.3 Preparación de moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB murino dirigido
De forma similar a las moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen el trímero de ligando de 4-1BB humano dirigido, se prepararon las moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen el trímero de 4-1BBL dirigido a FAP murino.
La secuencia de ADN que codifica parte del ectodominio (aminoácidos 104-309) de ligando de 4-1BB murino se sintetizó de acuerdo con la secuencia Q3U1Z9-1 de la base de datos Uniprot (SEQ ID NO:70). Para la construcción M.1 las cisteínas en las posiciones 137, 160 y 246 se mutaron a serina por procedimientos de PCR estándar, mientras que para la construcción M.2 la cisteína en la posición 160 se mutó a serina (C160S).
El ligando murino se ensambló como se describe para el 4-1BBL humano y como se representa en la figura 3A y 3B. El 4-1BBL dimérico, separado por conectores (G4S)2, se fusionó al dominio CL de IgG1 murina (figura 3A) y el 4-1BBL monomérico se fusionó al dominio CH de IgG1 murina (figura 3B). El polipéptido que codifica el ligando de 4-1BB dimérico fusionado al dominio CL murino se subclonó sin cambio de pauta de lectura con los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de IgG1 murina para construir las construcciones como se representa en la figura 3C.
Para las construcciones murinas, las mutaciones Lys392Asp y Lys409Asp (DD) se introdujeron en la cadena pesada que contiene el 4-1BBL murino y las mutaciones Glu356Lys y Asp399Lys (KK) se introdujeron en la cadena pesada que contiene el Fab anti-FAP para obtener moléculas asimétricas (Gunasekaran K. et al., J Biol. Chem., 2010, Jun 18;285(25):19637-46).
Las mutaciones Asp265Ala y Pro329Gly (DAPG) se introdujeron en la región constante de las cadenas pesadas para anular la unión a los receptores de Fc gamma.
La tabla 13 muestra, respectivamente, las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB murino dirigido a FAP, construcción M.1.
Tabla 13: Secuencias de la construcción murina dirigida a FAP M.1
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La tabla 14 muestra, respectivamente, muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB murino no dirigido (DP47) control M.1.
Tabla 14: Secuencias de control murino no dirigido M.1
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La tabla 15 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB murino dirigido a FAP, construcción M.2.
Tabla 15: Secuencias de la construcción murina dirigida a FAP M.2
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La tabla 16 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB murino no dirigido a DP47, construcción de control M.2.
Tabla 16: Secuencias de control murino dirigido a FAP M.2
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Las moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB murino se produjeron y se purificaron como se describe en el presente documento anteriormente para las construcciones de 4-1BBL humano.
La tabla 17 resume el rendimiento y contenido en monómero final de la molécula de unión a antígeno de fusión de Fc que contiene un trímero de 4-1BBL murino no dirigido y dirigido a FAP.
Tabla 17: Resumen de la producción de las moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de 4-1BBL murino no dirigido y dirigido a FAP
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1.4 Preparación y purificación de moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen el trímero de ligando de 4-1BB humano no dirigido (moléculas de control)
Las moléculas de control s prepararon como se describe anteriormente para las construcciones dirigidas a FAP 1 y 2, con la única diferencia de que la proteína fijadora anti-FAP (VH-VL) se reemplazó por un control de línea germinal, denominado DP47, que no se une al antígeno. El control es una (kih) de Fc-ligando de 4-1 BB humano trimérico escindido monovalente no dirigido (control A, figura 5A) y para el control B, la construcción también contiene un entrecruzamiento de CH-CL con residuos cargados (figura 5B). Las secuencias de ADN de la región variable de la cadena pesada y ligera de la proteína fijadora de FAP se reemplazaron con las del control de línea germinal (DP47) y se subclonaron sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal o bien la cadena ligera constante de IgG1 humana.
Las moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB no dirigido se produjeron como se describe anteriormente para las construcciones dirigidas a FAP. Las células se transfectaron con los correspondientes vectores de expresión en una proporción 1:1:1:1 ("vector ligando dimérico-CH1 o CL*-cadena de botón": "vector fusión de ligando monomérico-CL o CH1*": "vector Fab DP47-cadena de ojal": "vector cadena ligera DP47").
La tabla 18 muestra, respectivamente, muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB murino no dirigido a DP47 control A.
Tabla 18: Secuencias de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB no dirigido a DP47 (trímero de 4-1BBL escindido de DP47) control A
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La tabla 19 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB no dirigido a DP47 con entrecruzamiento de CH1-CL y residuos cargados en los brazos que contienen el ligando de 4-1BB (control B).
Tabla 19: Secuencias de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB no dirigido a DP47 (trímero de 4-1BBL escindido de DP47) control B
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La tabla 20 resume el rendimiento y contenido en monómero final de las moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB no dirigido a DP47.
Tabla 20: Características de producción de moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de 4-1BBL no dirigido a DP47 (moléculas de control)
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Ejemplo 2
2.1 Preparación de moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a FAP (4B9)
Los diferentes fragmentos de la secuencia de ADN que codifica parte del ectodominio (aminoácido 71-254 y 71-248) del ligando de 4-1BB humano se sintetizaron de acuerdo con la secuencia P41273 de la base de datos Uniprot (SEQ ID NO:42).
2.1.1 Preparación de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB (71-254) dirigido a FAP (4B9) monovalente con dominios CH1-CL cruzados con residuos cargados (construcción 2.1)
Un polipéptido que contiene dos ectodominios de ligando de 4-1BB (71-254), separados por conectores (G4S)2, y fusionados al dominio CL de IgG1 humana, se clonó como se representa en la figura 1A: ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, CL humano.
Un polipéptido que contiene un ectodominio de ligando de 4-1BB (71-254) y fusionado al dominio CH1 de IgG1 humana, se clonó como se describe en la figura 1B: ligando de 4-1 BB humano, conector (G4S)2, CH humana. El polipéptido que codifica el ligando de 4-1BB dimérico fusionado al dominio CL humano se subclonó sin cambio de pauta de lectura con los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de IgG1 humana en el botón (Merchant, Zhu et al., 1998) usando un conector (g 4s )2, o de forma alternativa, (GSPGSSSSGS).
Para mejorar el emparejamiento correcto se han introducido las siguientes mutaciones en el CH-CL cruzado. En el ligando de 4-1BB dimérico fusionado a CL humano se introdujeron las mutaciones E123R y Q124K. En el ligando de 4-1BB monomérico fusionado a CH1 humano, las mutaciones K147E y K213E se clonaron en el dominio CH1 humano.
Las secuencias de ADN de la región variable de la cadena pesada y ligera que codifican una proteína fijadora específica para la proteína de activación de fibroblastos (FAP), clon 4B9, se subclonaron sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal o bien la cadena ligera constante de IgG1 humana.
La generación y preparación de las proteínas fijadoras de FAP se describe en el documento WO 2012/020006 A2, que se incorpora en el presente documento por referencia.
Las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala se han introducido en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores de Fc gamma de acuerdo con el procedimiento descrito en la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 2012/130831.
Para todas las construcciones, la tecnología de heterodimerización de botones en ojales se usó con las mutaciones S354C/T366W en la cadena de botón y las correspondientes mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V en la cadena de ojal.
La combinación de ligando dimérico-cadena de botón de Fc que contiene las mutaciones S354C/T366W, la fusión de CH1 monomérica, anti-FAP dirigido-cadena de ojal de Fc que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V y cadena ligera anti-FAP permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando de 4-1BB trimérico ensamblado y un Fab de unión a FAP (figura 4, construcción 2.1).
La tabla 21 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB humano (71-254) de FAP (4B9) monovalente que contiene entrecruzamiento de CH1-CL y residuos cargados (construcción 2.1).
Tabla 21: Secuencias de la molécula de fusión (kih) de Fc que contiene ligando de 4-1BB humano (71­ 254) dirigido a FAP(4B9) monovalente, construcción 2.1
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2.1.2 Preparación de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB (71-254) dirigido a FAP (4B9) monovalente con dominios CH1-CL cruzados sin residuos cargados (construcción 2.2)
Un polipéptido que contiene dos ectodominios de ligando de 4-1BB (71-254), separados por conectores (G4S)2, y fusionados al dominio CL de IgG1 humana, se clonó como se representa en la figura 1A: ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, CL humano.
Un polipéptido que contiene un ectodominio de ligando de 4-1BB (71-254) y fusionado al dominio CH1 de IgG1 humana, se clonó como se describe en la figura 1B: ligando de 4-1 BB humano, conector (G4S)2, CH1 humano. El polipéptido que codifica el ligando de 4-1BB dimérico fusionado al dominio CL humano se subclonó sin cambio de pauta de lectura con los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de IgG1 humana en el botón (Merchant, Zhu et al., 1998) usando un conector (g 4s )2, o de forma alternativa (GSPGSSSSGS).
Las secuencias de ADN de la región variable de la cadena pesada y ligera que codifican una proteína fijadora específica para la proteína de activación de fibroblastos (FAP), clon 4B9, se subclonaron sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal o bien la cadena ligera constante de IgG1 humana.
Las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala se han introducido en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores de Fc gamma (documento WO 2012/130831). La combinación de ligando dimérico-cadena de botón de Fc que contiene las mutaciones S354C/T366W, la fusión de CH1 monomérica, anti-FAP dirigido-cadena de ojal de Fc que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V y cadena ligera anti-FAP permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando de 4-1 BB trimérico ensamblado y un Fab de unión a FAP (figura 4, construcción 2.2).
La tabla 22 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB humano (71-254) de monovalente FAP (4B9) monovalente que contiene entrecruzamiento CH1-CL sin residuos cargados (construcción 2.2).
Tabla 22: Secuencias de la molécula de fusión (kih) de Fc que contiene ligando de 4-1BB humano (71­ 254) dirigido a FAP(4B9) monovalente, construcción 2.2
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2.1.3 Preparación de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB (71-254) dirigido a FAP (4B9) bivalente con los ligandos de 4-1BB diméricos y monoméricos fusionados en el extremo C de cada cadena pesada (construcción 2.3)
Un polipéptido que contiene dos ectodominios de ligando de 4-1BB (71-254), separados por conectores (G4S)2 se fusionó al extremo C de la cadena de ojal de Fc de IgG1 humana, como se representa en la figura 1C: ojal de Fc de IgG1 humana, conector (G4S)2, ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando de 4-1Bb humano. Un polipéptido que contiene un ectodominio de ligando de 4-1BB (71-254) y fusionado al extremo C de la cadena de botón de Fc de IgG1 humana como se describe en la figura 1D: botón de Fc de IgG1 humana, conector (G4S)2, ligando de 4-1BB humano.
El polipéptido que codifica el ligando de 4-1BB dimérico se subclonó sin cambio de pauta de lectura en el extremo C de los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de IgG1 humana en el ojal (Merchant, Zhu et al., 1998) usando un conector (G4S)2. El polipéptido que codifica el ligando de 4-1 BB monomérico se subclonó sin cambio de pauta de lectura en el extremo C de los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de IgG1 humana en el botón (Merchant, Zhu et al., 1998) usando un conector (G4S)2.
Las secuencias de ADN de la región variable de la cadena pesada y ligera que codifican una proteína fijadora específica para la proteína de activación de fibroblastos (FAP), clon 4B9, se subclonaron sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal, del botón o bien la cadena ligera constante de IgG1 humana.
Las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala se han introducido en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores de Fc gamma de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO 2012/130831.
La combinación de la cadena de ligando dimérico botón de huIgG1 anti-FAP que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V, la cadena de ligando monomérico botón de huIgGI anti-FAP que contiene las mutaciones S354C/T366W y la cadena ligera anti-FAP permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando de 4-1BB trimérico ensamblado y dos Fab de unión a FAP (figura 4, construcción 2.3).
La tabla 23 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a FAP (4B9) bivalente, construcción 2.3 (trímero escindido de FAP con 2 Fab anti-FAP, ligando de 4-1BB monomérico y dimérico fusionado al extremo C de cada cadena pesada, respectivamente).
Tabla 23: Secuencias de la molécula de fusión (kih) de Fc que contiene ligando de 4-1BB humano (71­ 254) dirigido a FAP(4B9) bivalente, construcción 2.3
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2.1.4. Preparación de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB (71-248) dirigido a FAP (4B9) monovalente con dominios CH1-CL cruzados con residuos cargados (construcción 2.4)
Un polipéptido que contiene dos ectodominios de ligando de 4-1BB (71-248), separados por conectores (G4S)2, y fusionados al dominio CL de IgG1 humana, se clonó como se representa en la figura 1A: ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, CL humano. Un polipéptido que contiene un ectodominio de ligando de 4-1BB (71-248) y fusionado al dominio CH de IgG1 humana, se clonó como se describe en la figura 1B: ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, CH humana.
El polipéptido que codifica el ligando de 4-1BB dimérico fusionado al dominio CL humano se subclonó sin cambio de pauta de lectura con los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de lgG1 humana en el botón (Merchant, Zhu et al., 1998) usando un conector (G4S)2, o de forma alternativa para mejorar el emparejamiento correcto se han introducido las siguientes mutaciones en el CH-CL cruzado. En el ligando de 4-1BB dimérico fusionado a CL humano, E123R y Q124K. En el ligando de 4-1BB monomérico fusionado a CH1 humano, K147E y K213E.
Las secuencias de ADN de la región variable de la cadena pesada y ligera que codifican una proteína fijadora específica para la proteína de activación de fibroblastos (FAP), clon 4B9, se subclonaron sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal o bien la cadena ligera constante de IgG1 humana.
Las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala se han introducido en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores de Fc gamma de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO 2012/130831.
La combinación de ligando dimérico-cadena de botón de Fc que contiene las mutaciones S354C/T366W, la fusión de CH1 monomérica, anti-FAP dirigido-cadena de ojal de Fc que contiene las mutaciones Y349C/T366S/F368A/Y407V y cadena ligera anti-FAP permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando de 4-1 BB trimérico ensamblado y un Fab de unión a FAP (figura 4, construcción 2.4).
La tabla 24 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB humano (71-248) de FAP (4B9) monovalente que contiene entrecruzamiento de CH1-CL con residuos cargados (construcción 2.4).
Tabla 24: Secuencias de la molécula de fusión (kih) de Fc que contiene ligando de 4-1BB humano (71­ 248) dirigido a FAP(4B9) monovalente, construcción 2.4
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2.1.5. Preparación de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB (71-248) dirigido a FAP (4B9) monovalente con dominios CH1-CL cruzados sin residuos cargados (construcción 2.5)
Un polipéptido que contiene dos ectodominios de ligando de 4-1BB (71-248), separados por conectores (G4S)2, y fusionados al dominio CL de IgG1 humana, se clonó como se representa en la figura 1A: ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, CL humano. Un polipéptido que contiene un ectodominio de ligando de 4-1BB (71-248) y fusionado al dominio CH de IgG1 humana, se clonó como se describe en la figura 1B: ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, CH humana.
El polipéptido que codifica el ligando de 4-1BB dimérico fusionado al dominio CL humano se subclonó sin cambio de pauta de lectura con los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de lgG1 humana en el botón
(Merchant, Zhu et al., 1998) usando un conector (G4S)2, o de forma alternativa (GSMjSSSSGS)
Las secuencias de ADN de la región variable de la cadena pesada y ligera que codifican una proteína fijadora específica para la proteína de activación de fibroblastos (FAP), clon 4B9, se subclonaron sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal o bien la cadena ligera constante de IgG1 humana.
Las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala se han introducido en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores de Fc gamma de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO 2012/130831.
La combinación de ligando dimérico-cadena de botón de Fc que contiene las mutaciones S354C/T366W, la fusión de CH1 monomérica, anti-FAP dirigido-cadena de ojal de Fc que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V y cadena ligera anti-FAP permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando de 4-1 BB trimérico ensamblado y un Fab de unión a FAP (figura 4, construcción 2.5).
La tabla 25 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB humano (71-248) de monovalente FAP (4B9) monovalente que contiene entrecruzamiento CH1-CL sin residuos cargados (construcción 2.5).
Tabla 25: Secuencias de la molécula de fusión (kih) de Fc que contiene ligando de 4-1BB humano (71­ 248) dirigido a FAP(4B9) monovalente, construcción 2.5
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2.1.6. Preparación de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB (71-248) dirigido a FAP (4B9) bivalente con los ligandos de 4-1BB diméricos y monoméricos fusionados en el extremo C de cada cadena pesada (construcción 2.6)
Un polipéptido que contiene dos ectodominios de ligando de 4-1BB (71-248), separados por conectores (G4S)2 se fusionó al extremo C de la cadena de ojal de Fc de IgG1 humana, como se representa en la figura 1C: ojal de Fc de IgG1 humana, conector (G4S)2, ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando de 4-1Bb humano. Un polipéptido que contiene un ectodominio de ligando de 4-1BB (71-248) y fusionado al extremo C de la cadena de botón de Fc de IgG1 humana como se describe en la figura 1D: botón de Fc de IgG1 humana, conector (G4S)2, ligando de 4-1BB humano.
El polipéptido que codifica el ligando de 4-1BB dimérico se subclonó sin cambio de pauta de lectura en el extremo C de los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de IgG1 humana en el ojal (Merchant, Zhu et al., 1998) usando un conector (G4S)2. El polipéptido que codifica el ligando de 4-1 BB monomérico se subclonó sin cambio de pauta de lectura en el extremo C de los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de IgG1 humana en el botón (Merchant, Zhu et al., 1998) usando un conector (G4S)2.
Las secuencias de ADN de la región variable de la cadena pesada y ligera que codifican una proteína fijadora específica para la proteína de activación de fibroblastos (fAp ), clon 4B9, se subclonaron sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal, del botón o bien la cadena ligera constante de IgG1 humana.
Las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala se han introducido en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores de Fc gamma de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO 2012/130831.
La combinación de la cadena de ligando dimérico botón de huIgG1 anti-FAP que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V, la cadena de ligando monomérico botón de huIgG1 anti-FAP que contiene las mutaciones S354C/T366W y la cadena ligera anti-FAP permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando de 4-1BB trimérico ensamblado y dos Fab de unión a FAP (figura 4, construcción 2.6).
La tabla 26 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a FAP (4B9) bivalente, construcción 2.6 (trímero escindido de FAP con 2 Fab anti-FAP, ligando de 4-1BB monomérico y dimérico fusionado al extremo C de cada cadena pesada, respectivamente).
Tabla 26: Secuencias de la molécula de fusión (kih) de Fc que contiene ligando de 4-1BB humano (71­ 248) dirigido a FAP(4B9) bivalente, construcción 2.6
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2.2 Preparación de moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen el trímero de ligando de 4-1BB humano no dirigido (moléculas de control)
Otras moléculas de control se prepararon como se describe en el ejemplo 1.4 anterior para el control A y B. Un control variante bivalente C se preparó de forma análoga a la construcción bivalente 2.3 y 2.6 y un control variante monovalente E se preparó de forma análoga a la construcción 2.5 (que contiene un trímero de ligando de 4-1BB (71-248)), con la única diferencia de que la proteína fijadora anti-FAP (VH-VL) se reemplazó por un control de línea germinal, denominado DP47, que no se une al antígeno.
La tabla 27 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-254) trimérico escindido no dirigido a DP47 bivalente control C. La tabla 28 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-248) trimérico escindido no dirigido a DP47 monovalente control E.
Tabla 27: Secuencias de la molécula de fusión (kih) de Fc que contiene ligando de 4-1BB humano (71­ 254) no dirigido a DP47 bivalente, control C
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Tabla 28: Secuencias de molécula de fusión (kih) de Fc que contiene ligando de 4-1BB humano (71-248) no dirigido monovalente, control E
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2.3 Preparación de IgG1 humana no dirigida como control F
Una molécula de control adicional usada en los ensayos fue una IgG1 humana, control de línea germinal, DP47 no dirigido, que contiene las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala, para anular la unión a los receptores de Fc gamma de acuerdo con el procedimiento descrito en la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 2012/130831).
La tabla 29 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de PGLALA huIgG1, DP47 no dirigido (control F).
Tabla 29: Secuencias de DP47 huIgG1 no dirigido (Control F)
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2.4 Producción de construcciones de fusión de Fc-ligando de 4-1BB trimérico escindido dirigido a FAP (4B9) monovalente y bivalente y moléculas de control
Las secuencias que codifican fusiones (kih) de Fc-ligando de 4-1BB trimérico escindido dirigido o no dirigido se clonaron en un vector plasmídico, que conduce la expresión del inserto de un promotor MPSV y contiene una secuencia de polyA sintética localizada en el extremo 3' de CDS. Además, el vector contiene una secuencia OriP de EBV para el mantenimiento episómico del plásmido.
La fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB trimérico escindido se produjo cotransfectando células HEK293-EBNA con los vectores de expresión de mamífero usando polietilenimina. Las células se transfectaron con los correspondientes vectores de expresión. Para las construcciones 2.1, 2.2., 2.4 y 2.5 y las correspondientes moléculas de control, se tomó una proporción 1:1:1:1 (por ejemplo, "vector ligando dimérico-CL-cadena de botón": "vector fusión de ligando monomérico-CH1": "vector Fab anti-FAP-cadena de ojal": "vector cadena ligera anti-FAP"). Para las construcciones 2.3 y 2.6 y su molécula de control, se tomó una proporción 1:1:1 ("vector cadena de ligando dimérico ojal de Fc huIgG1": "vector cadena de ligando monomérico botón de Fc huIgG1": "vector cadena ligera anti-FAP"). Las IgG humanas, usadas como control en el ensayo, se produjeron como para las construcciones biespecíficas (para transfección solo se usaron un vector para cadena ligera y un vector para cadena pesada).
Para la producción en matraces de agitación de 500 ml, se sembraron 300 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la transfección. Para la transfección, las células se centrifugaron durante 10 minutos a 210 x g, y el sobrenadante se reemplazó por 20 ml de medio CD CHO precalentado. Los vectores de expresión (200 pg de ADN total) se mezclaron en 20 ml de medio CD CHO. Después de la adición de 540 pl de PEI, la solución se agitó con vórtex durante 15 segundos y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de esto, las células se mezclaron con la solución de ADN/PEI, se transfirió a un matraz agitador 500 ml y se incubó durante 3 horas a 37 °C en un incubador con una atmósfera de CO2 al 5 %. Después de la incubación, se añadieron 160 ml de medio Excell complementado con L-glutamina 6 mM, 5 g/l de PEPSOY y ácido valproico 1,2 mM y las células se cultivaron durante 24 horas. Un día después de la transfección, se añadieron Feed 7 al 12 % y glucosa (conc. final 3 g/l). Después de cultivar durante 7 días, el sobrenadante se recogió por centrifugación durante 30-40 minutos al menos 400 x g. La solución se filtró de forma estéril (filtro 0,22 pm), complementado con acida de sodio hasta una concentración final de 0,01 % (p/v), y se mantuvo a 4 °C.
Las moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando de TNF dirigido y no dirigido y la IgG1 humana se purificaron de los sobrenadantes de cultivo celular por cromatografía de afinidad usando proteína A, seguido de cromatografía de exclusión por tamaño. Para la cromatografía de afinidad, el sobrenadante se cargó en una columna MabSelect Sure (CV = 5-15 ml, resina de GE Healthcare) equilibrada con tampón de fosfato de sodio (20 mM), citrato de sodio (20 mM) (pH 7,5). La proteína no unida se retiró lavando con al menos 6 volúmenes de columna del mismo tampón. La proteína unida se eluyó usando un gradiente lineal (20 VC) o bien una elución en etapas (8 VC) con tampón de citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 100 mM, glicina 100 mM (pH 3,0). Para el gradiente lineal, se aplicó una elución en etapas adicional de 4 volúmenes de columna.
El pH de fracciones recogidas se ajustó añadiendo 1/10 (v/v) de fosfato de sodio 0,5 M, pH 8,0. La proteína se concentró antes de cargarse en una columna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada con solución de histidina 20 mM, cloruro de sodio 140 mM, Tween20 al 0,01 % (v/v) de pH 6,0.
La concentración de proteína se determinó midiendo la densidad óptica (DO) a 280 nm, usando un coeficiente de extinción molar calculado en base a la secuencia de aminoácidos. La pureza y el peso molecular de la fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB trimérico dirigido se analizó por SDS-PAGE en presencia y ausencia de un agente reductor (5 mM 1,4-ditiotreitol) y tinción con Coomassie SimpleBlue™ SafeStain (Invitrogen USA) o CE-SDS usando Caliper LabChip GXII (Perkin Elmer). El contenido en agregado de muestras se analizó usando una columna de exclusión por tamaño analítica TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) equilibrada en un tampón de migración de K2HPO425 mM, NaCl 125 mM, monoclorhidrato de L-arginina 200 mM, NaN3 al 0,02 % (p/v), pH 6,7 a 25 °C.
La tabla 30 resume el rendimiento y contenido en monómero final de las moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB no dirigido y dirigido a FAP (4B9) y moléculas de control.
Tabla 30 Análisis bioquímico de moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a FAP (4B9) y no dirigido y moléculas de control
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Ejemplo 3
Preparación, purificación y caracterización de 4-1BB
Las secuencias de ADN que codifican los ectodominios de 4-1 BB humano, de ratón o macaco cangrejero (tabla 31) se subclonaron sin cambio de pauta de lectura con los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de IgG1 humana en el botón (Merchant, Zhu et al., 1998). Un sitio de escisión de proteasa AcTEV se introdujo entre un ectodominio de antígeno y el Fc de IgG1 humana. Una marca Avi para la biotinilación dirigida se introdujo en el extremo C de antígeno-botón de Fc. La combinación de antígeno-cadena de botón de Fc que contiene las mutaciones S354C/T366W, con una cadena de ojal de Fc que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V permite la generación de un heterodímero que incluye una única copia de la cadena de que contiene el ectodominio de 4-1 BB, creando por tanto una forma monomérica del antígeno unido a Fc (figura 5C). La tabla 32 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de las construcciones de fusión de Fc antígeno.
Tabla 31: Numeración de aminoácidos de ectodominios (ECD) de antígeno y su origen
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Tabla 32: secuencias de ADNc y de aminoácidos de las moléculas de fusión (kih) de Fc-antígeno monomérico
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Todas las secuencias que codifican moléculas de fusión Fc-4-1BB se clonaron en un vector plasmídico, que conduce la expresión del inserto de un promotor MPSV y contiene una secuencia señal de polyA sintética localizada en el extremo 3' de CDS. Además, el vector contiene una secuencia OriP de EBV para el mantenimiento episómico del plásmido.
Para preparación de las moléculas de fusión de Fc/antígeno monomérico biotinilado se contransfectaron células HEK293 EBNA en suspensión en crecimiento exponencial con tres vectores que codifican los dos componentes de proteína de fusión (cadenas de botón y ojal) así como BirA, una enzima necesaria para la reacción de biotinilación. Los correspondientes vectores se usaron en una proporción 2 : 1 : 0,05 ("ECD antígeno-AcTEVbotón de Fc" : "ojal de Fc" : "BirA").
Para la producción de proteínas en matraces de agitación de 500 ml, se sembraron 400 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la transfección. Para la transfección, las células se centrifugaron durante 5 minutos a 210 g, y el sobrenadante se reemplazó por 20 ml de medio CD CHO precalentado. Los vectores de expresión se suspendieron en 20 ml de medio CD CHO que contiene 200 |jg de ADN de vector. Después de la adición de 540 j l de polietilenimina (PEI), la solución se agitó con vórtex durante 15 segundos y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de esto, las células se mezclaron con la solución de ADN/PEI, se transfirió a un matraz agitador 500 ml y se incubó durante 3 horas a 37 °C en un incubador con una atmósfera de CO2 al 5 %. Después de la incubación, se añadieron 160 ml de medio F17 y las células se cultivaron durante 24 horas. El medio de producción se complementó con kifunensina 5 jM . Un día después de la transfección, se añadieron ácido valproico 1 mM y Feed 1 al 7 % con complementos al cultivo. Después de 7 días de cultivo, el sobrenadante celular se recogió separando por rotación las células durante 15 min a 210 g. La solución se filtró de forma estéril (filtro 0,22 jm ), complementado con acida de sodio hasta una concentración final de un 0,01 % (p/v), y se mantuvo a 4 °C.
Las proteínas secretadas se purificaron de los sobrenadantes de cultivo celular por cromatografía de afinidad usando proteína A, seguido de cromatografía de exclusión por tamaño. Para la cromatografía de afinidad, el sobrenadante se cargó en una columna HiTrap ProteinA HP (CV = 5 ml, GE Healthcare) equilibrada con 40 ml de fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM pH 7,5. La proteína no unida se retiró lavando con al menos 10 volúmenes de columna de tampón que contiene fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M (pH 7,5). La proteína unida se eluyó usando un gradiente de pH lineal de cloruro de sodio (de 0 a 500 mM) creado para 20 volúmenes de columna de citrato de sodio 20 mM, Tween-20 al 0,01 % (v/v), pH 3,0. A continuación la columna se lavó con 10 volúmenes de columna de citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 500 mM, Tween-20 al 0,01 % (v/v), pH 3.0.
El pH de fracciones recogidas se ajustó añadiendo 1/40 (v/v) de Tris 2 M, pH 8,0. La proteína se concentró y se filtró antes de cargarse en una columna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada con solución de MOPS 2 mM, cloruro de sodio 150 mM, acida de sodio al 0,02 % (p/v) de pH 7,4.
Para la determinación de la afinidad para el receptor humano, el ectodominio de 4-1BB humano también se subclonó sin cambio de pauta de lectura con una marca avi (GLNDIFEAQKIEWHE) y una hexahistidina.
La producción de proteínas se realizó como se describe anteriormente para la proteína de fusión a Fc. Las proteínas secretadas se purificaron de los sobrenadantes de cultivo celular por cromatografía con quelante, seguido de cromatografía de exclusión por tamaño. La primera etapa cromatográfica se realizó en un NiNTA Superflow Cartridge (5 ml, Qiagen) equilibrado en fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 500 nM, pH7,4. La elución se realizó aplicando un gradiente sobre 12 volúmenes de columna del 5 % al 45 % de tampón de elución (fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 500 nM, imidazol 500 mM, pH7,4). La proteína se concentró y se filtró antes de cargarse en una columna HiLoad Superdex 75 (GE Healthcare) equilibrada con solución de MOPS 2 mM, cloruro de sodio 150 mM, acida de sodio al 0,02 % (p/v) de pH 7,4 (tabla 33).
Tabla 33: Secuencias de molécula 4-1BB humano monomérico His
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Ejemplo 4
Caracterización bioquímica de molécula de unión a antígeno de fusión de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a FAP
La unión de moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1 BB dirigido a FAP a 4-1BB recombinante se evaluó por resonancia de plasmón superficial (RPS). Todos los experimentos de RPS se realizaron en un Biacore T100 a 25 °C con HBS-EP como tampón de migración (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,005 %, Biacore, Friburgo/Alemania).
La avidez de la interacción entre las moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1 BB dirigido a FAP o no dirigido y 4-1 BB recombinante (humano, macaco y murino) se determinó como se describe a continuación. Los datos demostraron que tanto las moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB dirigido así como las moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB de DP47 no dirigido se unen con avideces comparables a 4-1BB humano y de macaco cangrejero pero de forma insignificante al homólogo de ratón.
Las moléculas de fusión (kih) de Fc-4-1BB humano, de macaco cangrejero y murino biotinilado recombinante se acoplaron directamente en un chip SA usando la instrucción de acoplamiento estándar (Biacore, Friburgo/Alemania). El nivel de inmovilización fue de aproximadamente 30 UR. Las moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a FAP, o los controles no dirigidos DP47, se pasaron a un intervalo de concentración de 0,39 a 200 nM con un flujo de 30 pl/minutos a través de cubetas de flujo durante 120 segundos. Se realizó el seguimiento de la disociación durante 180 segundos. Las diferencias en el índice de refracción aparente se corrigieron restando la respuesta obtenida en una cubeta de flujo vacía de referencia.
Para la medición de la afinidad, el acoplamiento directo de alrededor de 7200 unidades de resonancia (UR) de anticuerpo específico anti-Fc humano se realizó en un chip CM5 a pH 5,0 usando el kit de acoplamiento de amina estándar (GE Healthcare). Las moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a FAP o no dirigido, a 50 nM se capturaron con un caudal de 30 pl/min durante 60 s en la cubeta de flujo 2. Una serie de diluciones (1,95 a 1000 nM) de 4-1BB humano-avi-His se pasó a ambas cubetas de flujo a 30 pl/min durante 180 s para registrar la fase de asociación. Se realizó el seguimiento de la fase de disociación durante 180 s y se desencadenó cambiando de la solución de muestra a HBS-EP. La superficie del chip se regeneró después de cada ciclo usando una inyección doble de 60 s de glicina-HCl 10 mM pH 2,1. Las diferencias en el índice de refracción aparente se corrigieron restando la respuesta obtenida en la cubeta de flujo de referencia 1. Para la interacción entre las moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1 BB y hu4-1 BB avi His, las constantes de afinidad se derivaron de las constantes de velocidad ajustando a una curva de unión de Langmuir 1:1 usando el programa informático Biaeval (GE Healthcare).
Tabla 34: Ajustes a unión de Langmuir 1:1 y constantes de afinidad
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Ejemplo 5
Caracterización funcional de las moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB dirigido
5.1 Unión en PBMC humanas indiferenciadas frente a activadas de las moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a FAP
Las placas leucoplaquetarias se obtuvieron del centro de donación de sangre de Zúrich. Para aislar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) recién obtenidas, la placa leucoplaquetaria se diluyó con el mismo volumen de DPBS (Gibco por Life Technologies, n.° cat. 14190326). A tubos de centrífuga de polipropileno de 50 ml (TPP, n.° cat. 91050) se les suministraron 15 ml de Histopaque 1077 (SIGMA Life Science, n.° cat. 10771, polisacarosa y diatrizoato de sodio, ajustado hasta una densidad de 1,077 g/ml) y la solución de placa leucoplaquetaria diluida se estratificó sobre Histopaque 1077. Los tubos se centrifugaron durante 30 min a 400 x g. A continuación, las PBMC se recogieron de la interfase, se lavó tres veces con DPBS y se resuspendió en medio de linfocitos T que consiste en medio RPMI 1640 (Gibco por Life Technology, n.° cat. 42401-042) suministrado con suero fetal bovino al 10 % (FBS, Gibco por Life Technology, n.° cat. 16000-044, Lot 941273, con irradiación gamma, sin micoplasma e inactivado con calor a 56 °C durante 35 min), GlutaMAX-I al 1 % (v/v) (GIBCO por Life Technologies, n.° cat. 35050 038), piruvato de sodio 1 mM (SlGMA, n.° cat. S8636), aminoácidos no esenciales MEM al 1 % (v/v) (SIGMA, n.° cat. M7145) y p-mercaptoetanol 50 pM (SIGMA, M3148).
Las PBMC se usaron directamente después del aislamiento o se estimularon para inducir la expresión de 4-1BB en la superficie celular de linfocitos T y NK cultivando durante 4 días en medio de linfocitos T complementado con 200 U/ml de proleucina (Novartis Pharma Schweiz AG, CHCLB-P-476-700-10340) y 2 pg/ml de PHA-L (SIGMA n.° cat. L2769) en una placa de cultivo tisular de 6 pocillos y a continuación 1 día en una placa de cultivo tisular de 6 pocillos recubierta con 10 ug/ml de anti-CD3 humano (clon OKT3, BioLegend, n.° cat. 317315) y 2 pg/ml de anti-CD28 humano (clon CD28.2, BioLegend, n.° cat.: 302928) en medio de linfocitos T a 37 °C y CO2 al 5 %.
Para determinar la unión de moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de 4-1BBL a PBMC humanas, se añadieron 0,1 x 106 PBMC indiferenciadas o activadas a cada pocillo de una placa de 96 pocillos para células en suspensión de fondo redondo (Greiner bio-one, cellstar, n.° cat. 650185). Las placas se centrifugaron 4 minutos con 400 x g y a 4 °C. El sobrenadante se desechó. Después de esto, las células se tiñeron en 100 pl/pocillo de DPBS que contiene LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit diluido a 1:1000, para excitación UV (Life Technologies, Molecular Probes, L-23105) o Fixable Viability Dye eF660 (eBioscience 65-0864-18) o LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit (Life Technologies, Molecular Probes, L-23101) durante 30 minutos a 4 °C en la oscuridad. Si se usó DAPI como tinción Live/Dead, esta etapa de tinción se omitió. Las células se lavaron una vez con 200 pl de tampón FACS frío (DPBS suministrado con FBS al 2 % (v/v), EDTA 5 mM pH8 (Amresco, n.° cat. E177) y acida de sodio 7.5 mM (Sigma-Aldrich S2002).
A continuación, se añadieron 50 pl/pocillo de tampón FACS frío a 4 °C que contiene diferentes concentraciones valoradas de moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de 4-1BBL y las células se incubaron durante 120 minutos a 4 °C, se lavó cuatro veces con 200 pl/pocillo de tampón FACS a 4 °C y se resuspendió. Las células se tiñeron además con 50 pl/pocillo de tampón FACS frío a 4 °C que contiene 0,67 pg/ml de PerCP-Cy5.5 anti-CD3 humano (clon UCHT1, IgGlK de ratón, BioLegend, n.° cat. 300430) o 0,16 pl de PE/Cy7 anti-CD3 humano (clon SP34-2, IgG1K de ratón, BD Pharmingen, n.° cat. 557749, lote 33324597), 0,67 pg/ml de AF488 anti-CD45 humano (clon HI30, IgGlK de ratón, BioLegend, n.° cat. 304017) o 0,12 pg/ml de F iTc anti-CD56 humano (clon NCAM16.2, IgG2bK de ratón, BD Pharmingen, n.° cat. 345811) o 1 pl de APC anti-CD56 humano (clon B159, IgGlK de ratón, BD Pharmingen, n.° cat. 555518, lote 3098894), 0,25 pg/ml de BV421 anti-CD4 humano (clon RPA-T4, IgG1K de ratón, BioLegend, n.° cat. 300532) o 0,23 pg/ml de bV421 anti-CD4 humano (clon OKT4, IgG2bK de ratón, BioLegend, n.° cat. 317434), 0,25 pl de APC anti-CD8a humano (clon RPA-T8, IgG1 K de ratón, BD Pharmingen, n.° cat. 555369) o 0,67 pF APC/Cy7 anti-CD8a humano (clon RPA-T8, IgG1K de ratón, BioLegend, n.° cat. 301016) o 0,83 ng/ml de BV711 anti-CD8a humano (clon RPA-T8, IgG1K ratón, BD Pharmingen, n.° cat. 301044) y 5 pg/ml de fragmento F(ab')2 de IgG de cabra específico de fragmento de Fcy anti-IgG humana AffiniPure conjugado con PE (Jackson ImmunoResearch, n.° cat. 109116098 o 109116170). Las células se lavaron dos veces con tampón FACS. Si las células se tiñeron con tintes de viabilidad fijable, se fijaron con 50 pl/pocillo de DPBS que contiene formaldehído al 1 % (Sigma, HT501320-9.5F). Las células se resuspendieron en tampón FACS y se adquirieron al día siguiente o al mismo día usando 5-Laser FSR-Fortessa (BD Bioscience con programa informático DIVA) o 3-Laser Miltenyi Quant Analyzer 10 (Mitenyi Biotec) y Flow Jo (FlowJo X 10.0.7). Si se usó tinción con DAPI para detectar células muertas, se resuspendieron en 80 pl/pocillo de tampón FACS que contiene 0,2 pg/ml DAPl (Santa Cruz Biotec, n.° cat. Sc-3598) y se adquirieron al mismo día usando 5-Laser FSR-Fortessa (BD Bioscience con programa informático DIVA).
Como se muestra en la figura 6, las moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB tanto dirigido a FAP como no dirigido no se unieron a linfocitos T CD4+ humanos en reposo y no mostraron unión detectable a linfocitos NK y linfocitos T CD8+ en reposo. Por el contrario, ambas construcciones se unieron fuertemente a linfocitos NK, T CD8+ o T CD4+ activados, aunque los últimos mostraron una intensidad aproximadamente 10 veces menor de fluorescencia específica en comparación con los linfocitos NK y una intensidad 20 veces disminuida de fluorescencia específica en comparación con linfocitos T CD8+.
Las figuras 7A y 7B muestran la unión de construcciones 1.1 a 1.10 como se preparan en el ejemplo 1 en linfocitos T CD3+ CD8+ humanos activados que expresan 4-1BB y linfocitos T CD3+ CD4+ humanos activados que expresan 4-1BB, respectivamente. La tabla 35 muestra los valores de CE50 medidos para las construcciones 1.1 a 1.10.
Tabla 35: unión en linfocitos T CD3+ CD8+ y linfocitos T CD3+ CD4+ humanos activados
Figure imgf000157_0002
Las figuras 8A y 8B muestran la unión de construcciones 2.1,2.3, 2.4, 2.5 y 2.6 como se prepara en el ejemplo 2 en CD4+ y c D8+ de sangre humana recién obtenida y en linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+ que expresan 4-1BB activados, respectivamente. Las ventanas de adquisición se establecieron en linfocitos T CD45+ CD3+ CD4+ o CD45+ CD3+ CD8+ vivos y las MFI del fragmento F(ab')2 de cabra específico de fragmento Fcy IgG anti-IgG humana AffiniPure conjugado con PE se representaron frente a la concentración valorada de variantes de fusión de Fc-ligando de 4-1BB trimérico escindido dirigido. La tabla 36 muestra los valores de CE50 medidos para las construcciones 2.1, 2.3, 2.4, 2.5 y 2.6.
Tabla 36: unión en linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+ que expresan 4-1BB activados
Figure imgf000157_0001
5.2 Unión de la molécula de unión a antígeno de fusión de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a FAP a esplenocitos de ratón activados
Se obtuvieron bazos de ratón en 3 ml de PBS y se generó una suspensión de células sueltas usando tubos gentleMACS (Miltenyi Biotec n.° cat. 130-096-334) y gentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec). Después de esto, los esplenocitos se filtraron a través de filtros de separación previa de 30 pm Pre(n.° cat. Miltenyi Biotec 130-041-407) y se centrifugó durante 7 min a 350 x g y 4 °C. El sobrenadante se aspiró y las células se resuspendieron en medio RPMI 1640 suministrado con f Bs al 10 % (v/v), GlutaMAX-I al 1 % (v/v), piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales MEM al 1 % (v/v), p-mercaptoetanol 50 pM y penicilina-estreptomicina al 10 % (SIGMA, n.° cat. P4333). Se cultivaron 106 células/ml durante 2 días en una placa de cultivo tisular de 6 pocillos recubierta con 10 pg/ml de IgG de hámster armenio anti-CD3s de ratón (clon 145-2C11, BioLegend, n.° cat. 100331) y 2 pg/ml de IgG de hámster sirio anti-CD28 de ratón (clon 37.51, BioLegend, n.° cat. 102102).
Se obtuvieron esplenocitos de ratón activados, se lavaron en DPBS, se contaron y 0,1 x 106 células se transfirieron a cada pocillo de una placa sin tratamiento de cultivo tisular de fondo en U de 96 pocillos. El sobrenadante se retiró y las células se tiñeron en 100 ul/pocillo de DPBS que contiene Fixable Viability Dye eF660 diluido a 1:5000 (Bioscience, n.° cat. 65-0864-18) durante 30 min a 4 °C. Las células se lavaron con PBS y se tiñeron en 50 ul de tampón FACS que contiene una concentración diferente de moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a FAP (trímero de 4-1BBL escindido de FAP), moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de ligando de 4­ 1 BB no dirigido (trímero de 4-1BBL escindido de DP47) o mAb P329G LALA IgG1 humana anti-CD137 de ratón (clon Lob.12.3, BioXcell, n.° catálogo: BE0169). Las células se incubaron durante 120 min a 4 °C. Las células se lavaron cuatro veces con tampón FACS y se tiñeron en 50 pl/pocillo de tampón FACS que contiene 10 pg/ml de Fc-Block de IgG de rata anti-CD16/CD32 de ratón purificado (BD Pharmingen, n.° cat. 553142 clon 2.4g 2), 5 pg/ml de FITC-IgG2bK de rata anti-CD8b de ratón (BioLegend, n.° cat. 126606, clon YTS156.7.7), 0,67 pg/ml de APC-Cy7-IgG2bK de rata anti-CD3 de ratón (BioLegend, n.° cat. 100222, clon 17A2), 0,67 pg/ml de PE-Cy7IgG2bK de rata anti-CD4 de ratón (BioLegend, n.° cat. 100422, clon GK1.5), 2 pg/ml de PerCp-Cy5.5-IgG2aK de ratón (C3H x BALB/c) anti-NK1.1 de ratón (BioLegend, n.° cat. 108728, clon PK136) y 10 pg/ml de fragmento F(ab')2 anti-IgG humana de cabra, específico de fragmento Fcy, policlonal AffiniPure conjugado con PE, con reactividad cruzada mínima para proteínas séricas bovinas, de ratón y conejo (Jackson ImmunoResearch, n.° cat. 109-116-170) durante 30 min a 4 °C. Las células se lavaron dos veces con 200 pl/pocillo de tampón FACS frío. Las células se fijaron con 50 pl/pocillo de DPBS que contiene formaldehído al 1 %. Las células se resuspendieron en tampón FACS y se adquirieron al día siguiente usando 5-Laser LSR-Fortessa (BD Bioscience con programa informático DIVA).
Como se muestra en la figura 9, las moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de ligando de hu4-1BB dirigido a FAP (trímero de hu4-1BBL escindido de FAP) y las moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de ligando de hu4-1BB no dirigido (trímero de hu4-1BBL escindido de DP47) no se unen a 4-1BB de ratón. Por lo tanto, no se puede someter a prueba la actividad en ratones inmunocompetentes. Para estudios del modo de acción in vivo, se tienen que usar modelos de ratón humanizados em ratones no inmunocompetentes o bien sustitutos que contienen trímeros de 4-1BBL de ratón como se muestra en la figura 3.
5.3 Unión a células tumorales que expresan FAP
Para ensayos de unión en células que expresan FAP, se usaron la línea celular de melanoma humano MV-3 (véase Ruiter et al., Int. J. Cancer 1991,48(1), 85-91), WM-266-4 (ATTC CRL-1676) o la línea celular NIH/3T3-clon 39 huFAP. Para generar la última línea celular, las células NIH/3T3 se transfectaron con FAP humana (NIH/3T3-clon 39 huFAP). Las células se generaron por transfección de células NIH/3T3 de fibroblastos embrionarios de ratón (ATCC CRL-1658) codificando el plásmido pETR4921 de expresión FAP humana bajo un promotor CMV. Las células se mantuvieron en presencia de 1,5 pg/ml de puromicina (InvivoGen, n.° cat.: ant-pr-5). Se añadieron 0,1 x 106 de células tumorales que expresan FAP a cada pocillo de placas de 96 pocillos de células en suspensión de fondo redondo (Greiner bio-one, cellstar, n.° cat. 650185). Las células se lavaron una vez con 200 pl de DPBS y los sedimentos se resuspendieron. Se añadieron 100 pl/pocillo de tampón DPBS frío a 4 °C que contiene Fixable Viability Dye eFluor 450 diluido a 1:5000 (eBioscience, n.° cat. 65-0863-18) o Fixable Viability Dye eFluor 660 (eBioscience, n.° cat. 65-0864-18) y las placas se incubaron durante 30 minutos a 4 °C. Las células se lavaron una vez con 200 pl de tampón DPBS frío a 4 °C y se resuspendieron en 50 pl/pocillo de tampón FACS frío a 4 °C (DPBS suministrado con FBS al 2 % (v/v), Ed Ta 5 mM pH 8 (Amresco, n.° cat. E177) y acida de sodio 7,5 mM (Sigma-Aldrich S2002) que contiene diferentes concentraciones de moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de 4-1BBL valoradas, seguido de incubación durante 1 hora a 4 °C. Después de lavar cuatro veces con 200 pl/pocillo, las células se tiñeron con 50 pl/pocillo de tampón FACS frío a 4 °C que contiene 30 pg/ml de fragmento F(ab')2 de cabra específico del fragmento Fcy anti-IgG humana AffiniPure conjugado con FITC (Jackson ImmunoResearch, n.° cat. 109-096­ 098) o 5 pg/ml de fragmento F(ab')2 de cabra específico del fragmento FgY anti-IgG humana AffiniPure conjugado con PE(Jackson ImmunoResearch, n.° cat. 109-116-098 o 109-116-170) durante 30 minutos a 4 °C. Las células se lavaron dos veces con 200 pl de tampón FACS a 4 °C y a continuación se resuspendieron en 50 pl/pocillo de DPBS que contiene formaldehído al 1 %. El mismo día o al día siguiente las células se resuspendieron en 100 pl de tampón FACS y se adquirieron usando 5-Laser LSR-Fortessa (BD Bioscience con programa informático DIVA) o 3-Laser Miltenyi Quant Analyzer 10 (Mitenyi Biotec) y Flow Jo (FlowJo X 10.0.7).
Como se muestra en la figura 10, la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a FAP (trímero de 4-1BBL escindido de FAP), construcción 1.1, pero no la construcción que contiene Fab-DP47 no dirigido (trímero de 4-1BBL escindido de DP47), control A, se unió eficazmente a (10A) células MV-3 o (10B) células WM-266-4 de melanoma que expresan la proteína de activación de fibroblastos (FAP) humana.
La figura 11A muestra la unión de las construcciones 1.1 a 1.10 como se preparan en el ejemplo 1 a células MV-3 de melanoma humano que expresan FAP humana y en la figura 11B la unión de la construcción 1.1, 1.2, 1.3 y 1.5 a células de fibroblastos embrionarios de ratones transfectadas con NIH/3T3-clon 39 huFAP que expresan human FAP humana se presenta. La tabla 37 muestra los valores de CE50 medidos para las construcciones 1.1 a 1.10.
Tabla 37: Unión a células tumorales que expresan FAP humana
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Figure imgf000159_0002
La figura 12 muestra la unión de diferentes construcciones (kih) de Fc-ligando de 4-1BB humano trimérico escindido dirigido a FAP (4B9) o no dirigido a células MV-3 (figura 12A) y células WM-266-4 (figura 12B) de melanoma humano que expresan FAP humana. Las construcciones 2.1,2.3, 2.4, 2.5 y 2.6 se prepararon como se describe en el ejemplo 2 y los controles se prepararon como se describe en el presente documento anteriormente. Las ventanas de adquisición se establecieron en células tumorales vivas y las MFI del fragmento F(ab')2 de cabra específico de fragmento Fcy anti-IgG humana AffiniPure conjugado con PE se representaron frente a la concentración valorada de construcciones de fusión de Fc-ligando de 4-1BB trimérico escindido dirigido. La tabla 38 muestra los valores de CE50 medidos.
Tabla 38: Unión a células tumorales que expresan FAP humana
Figure imgf000159_0001
5.4 Caracterización funcional de las moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB dirigido murino
5.4.1 Unión a esplenocitos de ratón activados
Se obtuvieron bazos de ratón en 3 ml de PBS y se generó una suspensión de células sueltas usando tubos gentleMACS (Miltenyi Biotec n.° cat. 130-096-334) y gentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec). Después de esto, los esplenocitos se filtraron a través de filtros de separación previa de 30 pm Pre(n.° cat. Miltenyi Biotec 130-041-407) y se centrifugó durante 7 min a 350 x g y 4 °C. El sobrenadante se aspiró y las células se resuspendieron en medio RPMI 1640 suministrado con f Bs al 10 % (v/v), GlutaMAX-I al 1 % (v/v), piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales MEM al 1 % (v/v), p-mercaptoetanol 50 pM.
Para la unión en esplenocitos de ratón recién obtenidos, las células se usaron directamente. Para inducir la expresión de 4-1BB de ratón en linfocitos T, los esplenocitos de ratón se activaron como sigue: Se cultivaron 106 células/ml durante 2 días en una placa de cultivo tisular de 6 pocillos recubierta con 10 pg/ml de IgG de hámster armenio anti-CD3s de ratón (clon 145-2C11, BioLegend, n.° cat. 100331) y 2 pg/ml de IgG de hámster sirio anti-CD28 de ratón (clon 37.51, BioLegend, n.° cat. 102102).
Los esplenocitos de ratón recién obtenidos o esplenocitos de ratón activados se recogieron, se lavaron en DPBS (Gibco Life Technologies, n.° cat. 14190-136), se contaron y 0,1 x 106 células se transfirieron a cada pocillo de una placa sin tratamiento de cultivo tisular de fondo en U de 96 pocillos (Greiner bio-one, cell star, n.° cat. 650185). El sobrenadante se retiró y las células se tiñeron en 100 ul/pocillo de DPBS frío a 4 °C que contiene LIVE/DeAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit diluido a 1:1000 (Life Technologies, L34957) 30 min a 4 °C. Las células se lavaron con DPBS frío y se tiñeron en 50 ul/pocillo de tampón FACS frío (DPBS suministrado con FBS al 2 % (v/v), EDTA 5 mM pH8 (Amresco, n.° cat. E177) y acida de sodio 7,5 mM (Sigma-Aldrich S2002)) que contiene diferente concentración de moléculas de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB de ratón o control de isotipo IgGlK de ratón (BioLegend, n.° cat. 400153, clon MOPC-21). Las células se incubaron durante 120 min a 4 °C, se lavaron cuatro veces con DPBS frío y se tiñeron en 50 pl/pocillo de tampón FACS frío que contiene 30 pg/ml de F(ab')2 de IgG de cabra específico de Fc-gamma anti-IgG de ratón conjugado con FITC (Jackson Immunoresearch, n.° cat. 115-096-071) durante 30 min a 4 °C. Después de esto, las células se lavaron dos veces con DPBS frío y se tiñeron con 50 pl/pocillo de tampón FACS suministrado con 10 pg/ml de Fc-Block de IgG de rata anti-CD16/CD32 de ratón purificado (BD Pharmingen, n.° cat. 553142 clon 2.4G2), 0,67 pg/ml de APC-Cy7 anti-CD8a de ratón (BioLegend, n.° cat.
100714, clon 53-6.7), 0,67 pg/ml de PerCP-Cy5.5 anti-CD3s de ratón (BioLegend, n.° cat. 100328, clon 145-2C11), 0,67 pg/ml de PE-Cy7 IgG2bK de rata anti-CD4 de ratón (BioLegend, n.° cat. 100422, clon GK1.5) durante 30 min a 4 °C. Las células se lavaron dos veces con 200 pl/pocillo de DPBS frío, se fijaron con 50 pl/pocillo de DPBS que contiene formaldehído al 1 % y se resuspendieron en tampón FACS. Las células se adquirieron usando 3-Laser MACSQuant Analyzer 10 (Miltenyi Biotech) y Flow Jo v10.0.7 (FlowJo LLC). Las ventanas de adquisición se establecieron en linfocitos T CD3+ CD8+ o CD3+ CD4+ y la mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) de F(ab')2 IgG de cabra específico de Fc-gamma anti-IgG de ratón conjugado de FITC se analizó y normalizó restando la MFI del control en blanco (sin adición de molécula de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB de ratón). La MFI se representó frente a la concentración de moléculas de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1 BB de ratón usadas para visualizar la unión a una molécula unida a célula con 4-1BB de ratón.
Como se puede ver en la figura 13, las construcciones de 4-1BBL murino M.1 y M.2 así como las correspondientes moléculas de control, control M.1 y control M.2, se unen con una afinidad bastante similar a 4-1BB de ratón. La tabla 39 muestra los valores de CE50 medidos para las construcciones M.1 y M.2 y las moléculas de control.
Tabla 39: unión en linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+ que expresan 4-1BB activados
Figure imgf000160_0002
5.4.2 Unión en células tumorales que expresan FAP
Para ensayos de unión en células que expresan FAP, se usaron las líneas celulares de melanoma humano MV-3 (véase Ruiter et al., Int. J. Cancer 1991, 48(1), 85-91) y WM-266-4 (ATTC CRL-1676) (el clon 28H1 específico anti-FAP presenta reacción cruzada ratón/humano). Se añadieron 0,1 x 106 de células tumorales que expresan FAP a cada pocillo de placas de 96 pocillos de células en suspensión de fondo redondo (Greiner bio-one, cellstar, n.° cat. 650185). Las células se lavaron una vez con 200 pl de DPBS frío y los sedimentos se resuspendieron en 100 pl/pocillo de tampón DPBS frío a 4 °C que contiene LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit diluido a 1:1000 (Life Technologies, L34957) y se incubaron durante 30 min a 4 °C. Las células se lavaron una vez con 200 pl de tampón DPBS frío y se resuspendieron en 50 pl/pocillo de tampón FACS frío (DPBS suministrado con Fb S al 2 % (v/v), EDTA 5 mM pH8 (Amresco, n.° cat. E177) y acida de sodio 7,5 mM (Sigma-Aldrich S2002)) que contiene moléculas de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB murino en una serie de concentraciones seguido de incubación durante 1 hora a 4 °C. Después de lavar cuatro veces con 200 pl DPBS/pocillo, las células se tiñeron con 50 pl/pocillo de tampón FACS frío a 4 °C que contiene 30 pg/ml de F(ab')2 de IgG de cabra específico de Fc-gamma anti-IgG de ratón conjugado con FITC (Jackson Immunoresearch, n.° cat. 115-096-071) durante 30 min a 4 °C. Las células se lavaron dos veces con 200 pl/pocillo de tampón DPBS frío, se fijaron con 50 pl/pocillo de DPBS que contiene formaldehído al 1 % y se resuspendieron en tampón FACS. Las células se adquirieron usando 3-Laser MACSQuant Analyzer 10 (Miltenyi Biotech) y Flow Jo v10.0.7 (FlowJo LLC). Las ventanas de adquisición se establecieron en células vivas y la mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) de F(ab')2 IgG de cabra específico de Fc-gamma anti-IgG de ratón conjugado de FITC se analizó y normalizó restando la MFI del control en blanco (sin adición de molécula de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1 BB de ratón). La MFI se representó frente a la concentración de moléculas de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB murino usadas para visualizar la unión a una molécula unida a célula con 4-1BB murino. Como se esperaba, las construcciones de 4-1BBL murino M.1 y M.2 se unen con una afinidad bastante similar a FAP mientras que las moléculas de control no se unen.
La figura 14 muestra la unión de las construcciones (kih) de Fc-ligando de 4-1BB murino trimérico escindido dirigido a FAP o no dirigido, M.1 y M.2, a células Mv -3 (figura 14A) y células WM-266-4 (figura 14B) de melanoma humano que expresan FAP humana. La tabla 40 muestra los valores de CE50 medidos.
Tabla 40: Unión a células tumorales que expresan FAP humana
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Ejemplo 6
Actividad biológica de las moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB dirigido
6.1. Activación de NF-kB en células HeLa que expresan 4-1 BB humano
Generación de células HeLa que expresan 4-1BB humano y NF-KB-luciferasa
La línea celular de carcinoma de cuello uterino HeLa (ATCC CCL-2) se transdujo con un plásmido basado en el vector de expresión pETR10829, que contiene la secuencia de 4-1 BB humano (n.° acceso Uniprot Q07011) bajo control de un promotor CMV y un gen de resistencia a puromicina. Las células se cultivaron en medio DMEM complementado con FBS al 10 % (v/v), GlutaMAX-I al 1 % (v/v) y 3 pg/ml de puromicina.
Las células HeLa transducidas con 4-1BB se sometieron a prueba para determinar la expresión de 4-1BB por citometría de flujo: Se resuspendieron 0,2x106 células vivas en 100 pl de tampón FACS que contiene 0,1 pg de clon 4B4-1 IgGK de ratón anti-4-1BB humano conjugado con PerCP/Cy5.5 (BioLegend n.° cat. 309814) o su control de isotipo (anticuerpo control de isotipo IgGlK de ratón conjugado con PerCP/Cy5.5, clon MOPC-21, BioLegend n.° cat.400150) y se incubaron durante 30 minutos a 4 °C. Las células se lavaron dos veces con tampón FACS, se resuspendieron en 300 pl de tampón FACS que contiene 0,06 pg de DAPI (Santa Cruz Biotec, n.° cat. Sc-3598) y se adquirieron usando 5-Laser LSR-Fortessa (BD Bioscience, programa informático DIVA). Se realizaron diluciones limitadas para generar clones individuales como se describe: las células HeLa transducidas con 4-1BB humano se resuspendieron en medio hasta una densidad de 10, 5 y 2,5 células/ml y 200 pl de suspensiones celulares se transfirieron a placas de 96 pocillos tratadas con cultivo tisular de fondo redondo (6 placas/concentración celular, TPP n.° cat. 92697). Los clones individuales se obtuvieron, se expandieron y se sometieron a prueba para determinar la expresión de 4-1BB como se describe anteriormente. El clon con la mayor expresión de 4-1BB (clon 5) se eligió para la posterior transfección con el vector de expresión de NF-KB-luciferasa 5495p Tranlucent HygB. El vector confiere a las células transfectadas resistencia a higromicina B y capacidad para expresar luciferasa bajo el control del elemento de respuesta de NF-kB (vector estructural Panomics, n.° cat. LR0051 con resistencia a HyB introducida). Las células HeLa clon 5 con 4-1BB humano se cultivaron hasta una confluencia de un 70 %. Se añadieron 50 pg (40 pl) de vector de expresión 5495p Tranlucent HygB (enzimas de restricción Asel y Salí) linealizado a una cuveta estéril de 0,4 cm Gene Pulser/MicroPulser (Biorad, n.° cat., 165-2081). Se añadieron 2,5x106 células HeLa clon 5 con 4-1BB humano en 400 pl de medio DMEM sin complemento y se mezcló con cuidado con la solución de plásmido. La transfección de células se realizó usando un sistema Gene Pulser Xcell Total System (Biorad, n.° cat. 165­ 2660) bajo los siguientes ajustes: pulso exponencial, capacitancia 500 pF, voltaje 160 V, resistencia ~ Inmediatamente después del pulso, las células transfectadas se transfirieron a un matraz de cultivo tisular de 75 cm2 (TPP, n.° cat. 90075) con 15 ml de medio DMEM caliente a 37 °C suministrado con FBS al 10 % (v/v) y GlutaMAX-I al 1 % (v/v). Al día siguiente, el medio de cultivo que contiene 3 pg/ml de puromicina y 200 pg/ml de higromicina B (Roche, n.° cat. 10843555001) se le añadió. Las células supervivientes se expandieron y la dilución limitada se realizó como se describe anteriormente para generar clones individuales.
Los clones se sometieron a prueba para determinar la expresión de 4-1BB como se describe anteriormente y para determinar la actividad NF-KB-luciferasa como sigue: Los clones se obtuvieron en medio de selección y se contaron usando un contador celular Vi-cell xr 2.03 (Beckman Coulter, n.° cat. 731050). Las células se establecieron hasta una densidad celular de 0,33x106 células/ml y 150 pl de esta suspensión celular se transfirieron a cada pocillo de una placa de cultivo tisular de fondo plano de 96 pocillos blanca estéril con tapa (Greiner bio-one, n.° cat. 655083) y, como control, a una placa de cultivo tisular de fondo plano de 96 pocillos normal (TPP n.° cat. 92096) para someter a prueba la supervivencia y densidad celular al día siguiente. Las células se incubaron a 37 °C y CO2 al 5 % durante la noche. Al día siguiente se añadieron 50 pl de medio que contiene diferentes concentraciones de factor de necrosis tumoral alfa humano recombinante (rhTNF-a, PeproTech, n.° cat. 300-01 A) a cada pocillo de una placa de 96 pocillos dando como resultado una concentración final de rhTNF-a de 100, 50, 25, 12,5, 6,25 y 0 ng/pocillo. Las células se incubaron durante 6 horas a 37 °C y CO2 al 5 % y a continuación se lavó tres veces con 200 pl/pocillo de DPBS. Se añadió tampón Reporter Lysis Buffer (Promega, n.° cat.: E3971) a cada pocillo (40 pl) y las placas se almacenaron durante la noche a -20 °C. Al día siguiente las placas de células congeladas y el tampón de detección (sistema Luciferase 1000 Assay System, Promega, n.° cat. E4550) se descongelaron hasta temperatura ambiente. Se añadieron 100 ul de tampón de detección a cada pocillo y la placa se midió lo antes posible usando un lector de microplacas SpectraMax M5/M5e y el programa informático SoftMax Pro (Molecular Devices). Las unidades medidas de luz liberada para 500 ms/pocillo (URL) sobre el control (sin rhTNF-a añadido) se tomaron como actividad de luciferasa. NF-KB-luc-4-1BB-HeLa clon 26 que presentaba la mayor actividad luciferasa y un nivel considerable de expresión de 4-1BB y se eligió para su uso adicional.
Activación de NF-kB en células HeLa que expresan 4-1BB humano cocultivadas con células tumorales que expresan FAP
Las células HeLa con 4-1BB humano de NF-KB-luciferasa se obtuvieron y se resuspendieron en medio DMEM suministrado con FBS al 10 % (v/v) y GlutaMAX-I al 1 % (v/v) hasta una concentración de 0,2 x 106 células/ml.
100 pl (2 x 104 células) de esta suspensión celular se transfirieron a cada pocillo de una placa de cultivo tisular de fondo plano de 96 pocillos blanca estéril con tapa (Greiner bio-one, n.° cat. 655083) y la placa se incubó a 37 °C y CO2 al 5 % durante la noche. Al día siguiente se añadieron 50 pl de medio que contiene concentraciones valoradas de moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a FAP (trímero de 4-1BBL escindido de FAP) o moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB no dirigido a DP47 (trímero de 4-1BBL escindido de DP47). Las células tumorales que expresan FAP (MV3, WM-266-4 o NIH/3T3-clon 39 huFAP) se resuspendieron en medio DMEM suministrado con FBS al 10 % (v/v) y GlutaMAX-I al 1 % (v/v) hasta una concentración de 2 x 106 células/ml.
Se añadieron suspensión de células tumorales que expresan FAP (50 pl, proporción final 1:5) o solo medio a cada pocilio y las placas se incubaron durante 6 horas a 37 °C y CO2 al 5 %. Las células se lavaron dos veces con 200 pl/pocillo de DPBS. Se añadieron 40 pl de tampón Reporter Lysis Buffer (Promega, n.° cat.: E3971) recién preparado a cada pocillo y las placas se almacenaron durante la noche a -20 °C. Al día siguiente las placas de células congeladas y el tampón de detección (sistema Luciferase 1000 Assay System, Promega, n.° cat. E4550) se descongelaron a temperatura ambiente. Se añadieron 100 pl de tampón de detección a cada pocillo y la actividad de luciferasa se midió lo más rápido posible usando un lector de microplacas SpectraMax M5/M5e y un programa informático SoftMax Pro Software (Molecular Devices) que cuenta la emisión de luz en URL (unidades de luz liberada durante 0,5 s/pocillo) o lector de placas Victor3 1420 Multilabel Counter (Perkin Elmer) y el programa informático Perkin Elmer 2030 Manager Software que cuenta la emisión de luz como recuentos por segundos (CPS) y se representó frente a la concentración de las construcciones sometidas a prueba.
La molécula de unión a antígeno de fusión de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a FAP (trímero de 4-1BBL escindido de FAP) desencadenó la activación de la vía de señalización de NFkB en la línea celular indicadora en presencia de células tumorales que expresan FAP. Por el contrario, la variante no dirigida de la misma molécula no desencadena un efecto de este tipo a cualquiera de las concentraciones sometidas a prueba (figura 16). Esta actividad de 4-1BBL dirigido fue estrictamente dependiente de la expresión de FAP en la superficie celular de células tumorales ya que no se pudo detectar activación de NF-kB tras el cultivo de la línea celular indicadora de NF-kB con células tumorales negativas para FAP incluso en presencia de una molécula de unión a antígeno de fusión de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a FAP. Las actividades como se miden para las construcciones 1.1 a 1.10 se muestran en la figura 17 y los datos como se miden para las construcciones 2.1,2.4 y 2.5 se presentan en la figura 18.
6.2. Activación de NFkB en células HEK T293 que expresan 4-1BB de macaco cangrejero
Generación de células HEK T293 que expresan 4-1BB de macaco cangrejero y NFKB-luciferasa
Para la producción de partículas similivíricas (VLP), se transfectó T293/17 de riñón embrionario humano (HEK) (ATCC CRL-11268) usando reactivo Lipofectamine® LTX con reactivo PLUS™ (Life Technologies, n.° cat.
15338100) con el vector pETR14372 que codifica un casete de gen indicador NFKB-luciferasa-IRIS-GFP (NFkB-Iuc-GFP) de acuerdo con el protocolo del fabricante. 6 horas después, se realizó el reemplazo de DMEM suministrado con medio FBS al 10 % y las VLP se obtuvieron 4 días después. Las células HEK 293T recién obtenidas se transdujeron a una confluencia de un 70-80 % con la pETR14372-VLP producida y 4 pg/ml de polibreno. Las células se cultivaron durante 24 h y se realizó un intercambio de medio. Las células HEK T293/17 transducidas se obtuvieron y una dilución limitada de 1 célula/pocillo se realizó para cribar clones individuales estables. Los clones individuales se estimularon con 25 ng/ml de TNF-a (PeproTech Inc. n.° cat. 300-01A) en el medio y se cribaron para una señal GFP positiva con el tiempo usando el sistema Incuyte Zoom Fluorescence Microscope System (Essen Bioscience). Después del registro de señal GFP, las células se sometieron a prueba para determinar la actividad de luciferasa usando el kit Nano Glo Luciferase Kit (Promega, N1120) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La actividad de luciferasa se midió usando el lector de placas Victor3 1420 Multilabel Counter (Perkin Elmer) y el programa informático Perkin Elmer 2030 Manager Software. La emisión de luz se contó en recuentos por segundos (CPS) durante 0,5 s/pocillo. El clon 61 mostró la mayor expresión de GFP y luciferasa después de la activación de TNF-a y se usó además para la generación de líneas celulares indicadoras.
Como se describe anteriormente, se produjeron nuevas VLP usando el vector pETR14879 que codifica 4-1BB de macaco cangrejero y una resistencia a puromicina y la línea celular HEK 293T NFKB-fluc-GFP clon 61 se transdujo a una confluencia de un 70-80 % con la pETR14879-VLP producida y 4 pg/ml de polibreno. Las células se cultivaron durante 24 h y se realizó un intercambio de medio. Cuatro días después de la transducción, las células se tiñeron con anticuerpo anti-4-1BB con reactividad cruzada humano de macaco cangrejero conjugado con PE (IgG1 k de ratón, clon MOPC-21, BioLegend, n.° cat. 309804) en DPBS que contiene FBS al 1 %, se clasificaron por FACS (ARIA, BD) y se sembraron con 5 células/pocillo en DMEM suministrado con medio FBS al 10 % que contiene 1 pg/ml de puromicina (InvivoGen, n.° cat. ant-pr). Los clones en crecimiento se sometieron a prueba como se describe para determinar la GFP y la actividad de luciferasa después de estimulación con TNF-a y la alta expresión de 4-1 BB de macaco cangrejero por citometría de flujo. Se eligieron los clones con doble positivo y se sometieron a prueba para determinar la actividad de luciferasa en presencia de la construcción dirigida a FAP monovalente 2.1 o el control B y células MV-3 o WM-266-4 que expresan FAP. Se eligió el clon 61-13 que expresa HEK T293/17-NF-KB-luc-GFP-cy4-1BB para usarse para otros experimentos.
Activación de NFkB de células indicadoras HEK T293/17 que expresan 4-1BB de macaco cangrejero cocultivadas con células tumorales que expresan FAP
Las células de clon 61-13 que expresan HEK T293/17-NFKB-luc-GFP-cy4-1BB se obtuvieron y se resuspendieron en medio DMEM suministrado con FBS al 10 % (v/v) y GlutaMAX-I al 1 % (v/v) hasta una concentración de 0,2 x 106 células/ml. 100 pl (2 x 104 células) de esta suspensión celular se transfirieron a cada pocilio de una placa de cultivo tisular de fondo plano de 96 pocilios blanca estéril con tapa (Greiner bio-one, n.° cat. 655083) y la placa se incubó a 37 °C y CO2 al 5 % durante la noche. Al día siguiente se añadieron 50 pl de medio que contiene diferentes concentraciones valoradas de moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a FAP o no dirigido. Las células tumorales que expresan FAP (MV3 y WM-266-4) se resuspendieron en medio hasta una concentración de 2 x 106 células/ml. La suspensión de célula tumoral que expresa FAP (50 pl) se añadió a cada pocillo y las placas se incubaron durante 6 horas a 37 °C y CO2 al 5 %. El principio del ensayo se muestra en la figura 19. Después de la incubación, las células se lavaron tres veces con 200 pl/pocillo de DPBS. Se añadieron 40 pl de tampón Reporter Lysis Buffer (Promega, n.° cat.: E3971) recién preparado a cada pocillo y las placas se almacenaron durante la noche a -20 °C. Al día siguiente las placas de células congeladas y el tampón de detección (sistema Luciferase 1000 Assay System, Promega, n.° cat. E4550) se descongelaron hasta temperatura ambiente. Se añadieron 100 pl de tampón de detección a cada pocillo y la actividad de luciferasa se midió lo más rápido posible usando un lector de microplacas SpectraMax M5/M5e (Molecular Devices) (tiempo de integración 500 ms, sin filtro que recoja toda la longitud de onda). La emisión de luz se contó en unidades de luz liberada (URL) durante 0,5 s/pocillo y se representó frente a la concentración de moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB no dirigido o dirigido a FAP sometidas a prueba. Los resultados para las construcciones del ejemplo 2 se muestran en la figura 20.
6.3. Ensayo basado en linfocitos T CD8+ específicos de antígeno
Aislamiento y cultivo de linfocitos T CD8 específicos de antígeno
Se obtuvo sangre recién obtenida de un voluntario infectado con HLA-A2+ CMV. Se aislaron PBMC como se describe anteriormente. Los linfocitos T CD8 se purificaron de PBMC usando un kit de aislamiento de linfocitos T CD8 humanos de selección negativa de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Miltenyi Biotec, n.° cat. 130-094-156). Se resuspendieron diez millones de linfocitos T CD8 aislados en 1 ml de DPBS estéril complementado con FBS al 1 % (v/v) junto con 50 pl pentámero de HLA-A2 con marcado PE que contiene el péptido NLVPMVATV derivado de Cm V (Prolmmune, n.° cat. F008-2B) y se incubaron durante 10 min a temperatura ambiente. Las células se lavaron dos veces con 3 ml de DPBS estéril suministrado con FBS al 1 % (v/v). Las células se resuspendieron en 1 ml de DPBS suministrado con FBS al 1 % (v/v) que contiene 1 pg/ml de FITC anti-CD8 humano (clon LT8, Abeam, n.° cat. Ab28010) y se incubaron durante 30 minutos a 4 °C. Las células se lavaron dos veces, se resuspendieron hasta una concentración de 5x106 células/ml en DPBS suministrado con FBS al 1 % (v/v), y se filtraron a través de un filtro celular de red de nailon de separación previa de 30 pm (Miltenyi Biotec, n.° cat. 130-041-407). Los linfocitos T CD8+ específicos de péptido NLV se aislaron por separación FACS usando un separador celular ARIA (BD Bioscience con programa informático DIVA) con los siguientes ajustes: 100 pm de boquilla y máscara separadora de pureza. Las células separadas se recogieron en un tubo de centrífuga de polipropileno de 15 ml (TPP, n.° cat. 91015) que contiene 5 ml de medio RPMI 1640 suministrado con FBS al 10 % (v/v), GlutaMAX-I 1 % (v/v) y 400 u/ml de proleucina. Las células separadas se centrifugaron durante 7 minutos a 350 x g a temperatura ambiente y se resuspendieron en el mismo medio hasta una concentración de 0,53 x 106 células/ml. Se añadieron 100 pl/pocillo de esta suspensión celular a cada pocillo de una placa alimentadora previamente preparada.
Se prepararon células para alimentador alogénicas irradiadas activadas con PHA-L a partir de PBMC como se describe previamente (Levitsky et al., 1998) y se distribuyeron en placas de cultivo de 96 pocillos a 2x105 células para alimentador por pocillo.
Después de un día de cultivo, 100 pl de medio/pocillo se retiraron del pocillo que contiene linfocitos T CD8+ separados y se reemplazó por medio RPMI 1640 nuevo complementado con FBS al 10 % (v/v) y GlutaMAX-I al 1 % (v/v) y 400 U/ml de proleucina, esto se repitió durante el cultivo de manera regular (cada 2-4 días). Tan pronto como las células comenzaron a proliferar, se transfirieron a una placa de cultivo tisular de fondo plano de 24 pocillos (TPP, 92024). Las células se expandieron/dividieron y se reactivaron con preparación celular alimentadora nueva de manera regular.
Ensayo de activación de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno
Se obtuvieron células MV3 y se lavaron con DPBS y 2 x 107 células se resuspendieron en 250 pl de diluyente C del kit PKH-26 Red Fluorescence Cell Linker Kit (Sigma, n.° cat. PKH26GL). 1 pl de solución de tinción PKH26-Red se diluyó con 250 pl de diluyente C y se añadió a la suspensión de células MV3 que a continuación se incubaron durante 5 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Esto se siguió de la adición de 0,5 ml de FBS y las células se incubaron durante 1 minuto y se lavaron una vez con medio de linfocitos T que consiste en medio RPMI 1640 complementado con FBS al 10 % (v/v), GlutaMAX-I al 1 % (v/v), piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales MEM al 1 % (v/v) y p-mercaptoetanol 50 pM. 1 x 106 células MV3/ml se resuspendieron en medio de linfocitos T y se separaron en tres tubos. Se añadió péptido NLVPMVATV sintético (obtenido de thinkpeptides) hasta una concentración final de 1x10'9 M o 1x10'8 M y las células se incubaron durante 90 min. Las células MV3 se lavaron una vez con medio de linfocitos T y se resuspendieron hasta una densidad de 0,5 x 106 células/ml, se distribuyeron (100 pl/pocillo) en una placa de suspensión celular de fondo redondo de 96 pocilios (Greiner bio-one, cellstar, n.° cat. 650185) y se incubaron durante la noche a 37 °C y CO2 al 5 %. El principio del ensayo se muestra en la figura 21.
Al día siguiente se añadieron 50 pl/pocillo de medio de linfocitos T que contiene diferentes concentraciones valoradas de moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB dirigido. Se obtuvieron los linfocitos T CD8 específicos de NLV, se añadió CFDA-SE (5(6)-carboxifluoresceindiacetato-N-succinimidiléster, SIGMA-Aldrich, n.° cat. 21888-25MG-F) hasta una concentración final de 40 nM y las células se incubaron en rotación durante 15 min a 37 °C. El marcaje se detuvo añadiendo FBS, las células se lavaron y se resuspendieron en medio de linfocitos T hasta una concentración final de 0,125 x 106 células/ml. 50 pl de esta suspensión de linfocitos T CD8 marcados con CFSE se añadieron a cada pocillo (proporción final E:T = 1:8). Las placas de células se incubaron durante 24 h, se retiraron 50 pl/pocillo y se añadieron 50 pl medio de linfocitos T que contiene 2,64 pl/ml de Golgi-Stop (inhibidor del transporte de proteína que contiene monensina, BD Bioscience, n.° cat. 554724) a cada pocillo (concentración final 0,66 pl/ml). Las células se incubaron durante 4 h y a continuación las placas se lavaron con 200 pl/pocillo de DPBS y se tiñeron con 100 pl/pocillo de DPBS a 4 °C que contiene Fixable Viability DyeeF450 diluido a 1:5000 (eBioscience, n.° cat. 65-0864) durante 30 minutos a 4 °C. Las placas de células se lavaron con 200 pl/pocillo de DPBS seguido de tinción con anticuerpos conjugados con tinte fluorescente: PerCP/Cy5.5 anti-CD137 humano (clon 4B4-1, IgGlK de ratón, BioLegend, n.° cat. 309814), BV605 anti-CD8humano (clon RPA-T8, IgGlK de ratón, BioLegend, n.° cat. 301012) o 0,67 pg/ml de APC/Cy7 anti-CD8a humano (clon RPA-T8, IgG1K de ratón, BioLegend, n.° cat. 301016) y PE/Cy7 anti-CD25 humano (clon BC96, IgGlK de ratón, BioLegend, n.° cat. 302612). Después de incubación durante 30 min a 4 °C, las células se lavaron dos veces con 200 pl/pocillo de tampón fAc S, se resuspendieron en 50 pl/pocillo de tampón FoxP3 Fix/Perm recién preparado (eBioscience n.° cat. 00-5123 y 00-5223) y se incubaron durante 30 min a 4 °C. Las placas se lavaron dos veces con 200 pl/pocillo de tampón Perm (DPBS suministrado con FBS al 2 % (v/v), saponina al 1 % (p/v) (Sigma Life Science, S7900) y acida de sodio al 1 % (p/v) (Sigma-Aldrich, S2002) y se tiñeron con 50 pl/pocillo de tampón Perm (eBioscience, n.° cat. 00-8333-56) que contiene 0,25 pg/ml de APC anti-IFNY humano (clon B27, IgG1K de ratón, BioLegend, n.° cat. 506510) o 0,33 pg/ml de BV510 anti-IFNY humano (clon 4S.B3, IgG1K de ratón, BioLegend, n.° cat.502543). Las placas se incubaron durante 1 h a 4 °C y se lavaron dos veces con 200 pl/pocillo de Perm-Buffer. Para la fijación, se añadieron 50 pl/pocillo de DPBS que contiene formaldehído al 1 %. El mismo día o al día siguiente, las células se resuspendieron en 100 pl/pocillo de tampón FACS y se adquirieron usando un citómetro de flujo 5-Laser Fortessa (Bd Bioscience con programa informático DIVA) o 3-Laser Miltenyi Quant Analyzer 10 (Miltenyi Biotec) y Flow Jo (FlowJo X 10.0.7).
Como se muestra en la figuras 22 y 23 para las construcciones 1.1 a 1.10 y en las figuras 24 y 25 para las construcciones 2.1, 2.3 y 2.4, los linfocitos T CD8+ específicos de antígeno, pero no los controles no estimulados, presentaron un incremento en los niveles de expresión de 4-1BB de superficie en presencia de una molécula de unión a antígeno de fusión de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a FAP (trímero de 4-1BBL escindido de FAP). Este efecto de 4-1BBL fue dependiente de la dosis y requirió selección de FAP ya que la adición de la molécula de control no dirigido no afectó al nivel de expresión de 4-1BB. Además, los linfocitos T activados a la mayor concentración peptídica (1x10‘8 M) mostraron una secreción mantenida de INFy en presencia de la molécula de unión a antígeno de fusión de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1Bb dirigido a FAP (trímero de 4-1BBL escindido de FAP). Conjuntamente, estos datos demuestran que la molécula de unión a antígeno de fusión de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a antígeno modula el fenotipo de superficie y la reactividad de linfocitos T específicos de antígeno de manera dependiente de la selección.
6.4. Comparación de moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc-4-1BBL de ratón dirigido a célula o no dirigido
Las moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB de ratón dirigido y no dirigido (trímero de 4-1BBL de ratón escindido de FAP y trímero de 4-1BBL de ratón escindido de DP47) se prepararon como se describe en el ejemplo 1.3.
Para comparar la bioactividad de las moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB de ratón dirigido a célula y no dirigido, se cultivaron conjuntamente esplenocitos de ratón recién obtenidos marcados con tinte de proliferación eFlour670 (eBioscience, n.° cat.65-0840-90) o marcados con tinte de proliferación CellTrace Violet Cell (Cell Tracer, n.° cat. C34557) durante 3-4 días en placas de fondo en U de cultivo tisular de 96 pocillos (TTP, n.° cat. 92097) con células NIH/3T3-clon 39 huFAP irradiadas 50 Gy adherentes (para la generación véase 5.3) en medio RPMI 1640 (Gibco, n.° cat. 42401-042) suministrado con FBS al 10 % (v/v), GlutaMAX-I al 1 % (v/v), piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales MEM al 1 % (v/v) y p-mercaptoetanolina 50 pM en presencia de 0,5 pg/ml de IgG de hámster sirio anti-CD3 de ratón (clon 145-2C11, BD, n.° cat. 553057) y la molécula candidata a fármaco indicada se añadió en un intervalo de concentraciones (figura 26). Después de tres o cuatro días, las células se lavaron con tampón FACS y se tiñeron durante 30 min a 4 °C en 25 ul de tampón FACS/pocillo que contiene BV711-ratIgG2a anti-CD8 de ratón (BioLegend, n.° cat. 100747, clon 53-6.7,) y BV421-ratIgG2a anti-CD4 de ratón (BioLegend, n.° cat. 100544, clon RM4-5) y 0,67 pg/ml de PE-IgG de hámster sirio anti-CD137 de ratón (4-1BB) (BioLegend, n.° cat. 106106, clon 17B5) y PErCP-Cy5.5 ratIgG2b anti-CD25 de ratón (BioLegend, n.° cat. 1019112). Las células se lavaron y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente en tampón Fix/Perm preparado (Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set, eBioscience, n.° cat. 00-5523-00). Las células se lavaron dos veces con tampón Perm recién preparado y se tiñeron conjuntamente con 25 pl/pocillo de tampón Perm que contiene anticuerpos marcados fluorescentemente frente al factor de transcripción de linaje citotóxico Eomes, es decir, anti-ratIgG2a Eomes de ratón AlexaFluor488 (eBioscience, n.° cat. 534875, clon Dan11mag) y, si no se tiñó CD137, frente a la molécula efectora citotóxica granzima B, es decir, granzimaB-PE anti-ratIgG2a de ratón (eBioscience, n.° cat. 128822, clon 16G6) durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, las células se lavaron dos veces, se resuspendieron en tampón FACS y se adquirieron usando el citómetro de flujo Laser Fortessa (BD Bioscience con programa informático DIVA) o 3-Laser MACSQuant Analyzer 10 (Miltenyi Biotech) y Flow Jo v10.0.7 (FlowJo LLC). Las ventanas de adquisición se establecieron en linfocitos T CD8+ y linfocitos T CD4+ vivos y la frecuencia de células en proliferación se determinó así como los niveles de expresión de CD25, Eomes y granzima B o CD137. La frecuencia de proliferación y las frecuencias e MFI de los marcadores de activación se representaron frente a las concentración de moléculas de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB de ratón usadas para visualizar la actividad funcional. Como se puede ver en la figura 27, un incremento en linfocitos T CD8+ en proliferación se pudo observar para las construcciones M.1 y M.2.
6.5. Cambios hepáticos en ratones tratados con anticuerpo anti-4-1BB murino Lob 12.3 (muIgGI Wt) o con la construcción M.2
Los ratones C57BL/6 portadores de MC38-muFAP (modelo de cáncer colorrectal murino) s.c. se trataron una vez por semana durante 3 semanas con anticuerpos anti-4-1BB murino agonistas dirigidos a FAP (estudio de eficacia 020-GA1401: “Experiment to show efficacy of 4-1BB targeted therapy in combination with a-PD-L1 in MC38-muFAP s.c. model in C57B6 mice.”). Los anticuerpos usados fueron Lob 12.3 muIgG1 Wt (con Fc "natural", clon Lob 12.3 de BioXcell, n.° catálogo: BE0169) o la construcción M.2 con mutación DAPG (Fc inactivo). Los dos anticuerpos se administraron una vez a la semana durante tres semanas consecutivas. Se sacrificaron cuatro animales/grupo 7 días después del último tratamiento y los hígados se examinaron microscópicamente.
Los cambios en los hígados se observaron solo en animales que recibieron Lob 12.3 muIgG1 Wt, consistiendo en focos de degeneración hepatocelular con acumulación de macrófagos positivos para F4/80 y una menor cantidad de populación mezclada de células inflamatorias (principalmente linfocitos) que con frecuencia muestra una distribución vasocéntrica. Ocasionalmente se indicó necrosis celular individual de hepatocitos, e infiltrados celulares mononucleares perivasculares en espacios portales. No se observaron hallazgos relacionados con tratamiento en el hígado de animales que recibieron la construcción M.2 (tabla 41).
Tabla 41: Incidencia de hallazgos histopatológicos (n=4/grupo)
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Se ha observado hepatitis, atribuida a reticulación por FcyR en el hígado, en pacientes tratados con Urelumab BMS-663513 (Ascierto et al. 2010)) y en ratón usando el sustituto de ratón. La ausencia se hallazgos hepáticos en animales tratados con un anticuerpo con Fc inactivo apoya esta hipótesis.
6.6. Determinación de parámetros farmacocinéticos de moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen el trímero de ligando de 4-1BB humano
Para someter a prueba si las moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen el trímero de ligando de 4-1BB humano de la invención son adecuadas para su uso farmacéutico, se determinaron los parámetros farmacocinéticos (datos FC) tales como aclaramiento, volumen de distribución o semivida de eliminación (t1/2) en ratones. Por tanto, los siguientes experimentos se llevaron a cabo:
Experimento A: FC de dosis única de la construcción 1.2 y el control B en ratones NOG sanos
Se mantuvieron ratones hembra NOG de una edad promedio de 8 a 10 semanas al inicio del experimento (adquiridos de Taconic, instalación SOPF) en condiciones sin patógenos específicos con ciclos diarios de 12 h de luz /12 h de oscuridad de acuerdo con las directrices acordadas (GV-Solas; Felasa; TierschG). Se revisó el protocolo de estudio experimental y se aprobó por el gobierno local (P 2011128). Después de su llegada, los animales se mantuvieron durante una semana para que se acostumbraran a su nuevo entorno y para su observación. Se llevó a cabo un seguimiento de salud continuo regularmente.
Se realizó un estudio farmacocinético de dosis única (FCDU) para evaluar la exposición de la construcción 1.2 y el control B. Se administró una administración en bolo de 2,5 mg/kg a ratones NOG y se tomaron muestras de sangre en puntos temporales seleccionados para la evaluación farmacocinética. Las muestras séricas de ratón se analizaron por ELISA. Se añadieron 4-1BB humano biotinilado, muestras de prueba, anticuerpo antihuCH1 marcado con digoxigenina y anticuerpo de detección anti-digoxigenina (POD) por etapas a una placa de microvaloración recubierta con estreptavidina de 96 pocillos y se incubó después de cada etapa durante 1 h a temperatura ambiente. La placa se lavó tres veces después de cada etapa para retirar sustancias no unidas. Finalmente, el complejo unido a peroxidasa se visualizó añadiendo solución de sustrato ABTS para formar un producto de reacción coloreado. La intensidad del producto de reacción se determinó fotométricamente a 405 nm (con longitud de onda de referencia a 490 nm) es proporcional a la concentración de analito en la muestra sérica. El intervalo de calibración de la curva estándar para las construcciones fue de 0,156 a 10 ng/ml, donde 3 ng/ml es el límite inferior de cuantificación (LLOQ). La figura 28A muestra la disminución en la concentración con el tiempo como se observa en este experimento.
Experimento B: FC de dosis única de las construcciones 2.1, 2.3, control B y control C en ratones NOG portadores de tumor humanizados con células madre
Se realizó un estudio farmacocinético de dosis única (FCDU) para evaluar la exposición de la construcción 2.1, 2.3, control B y control C. Los ratones hembra NSG transferidos con células madre humanas se suministraron por Jackson Laboratories. Los ratones se mantuvieron en condiciones sin patógenos específicos con ciclos diarios de 12 h de luz /12 h de oscuridad de acuerdo con las directrices acordadas (GV-Solas; Felasa; TierschG). Se revisó el protocolo de estudio experimental y se aprobó por el gobierno local (ZH193-2014). Después de su llegada, los animales se mantuvieron durante una semana para que se acostumbraran a su nuevo entorno y para su observación. Se llevó a cabo un seguimiento de salud continuo regularmente.
Se obtuvieron originalmente las células MKN45 humanas (carcinoma gástrico humano) de ATCC y después de su expansión se depositaron en el banco celular interno Glycart. Las células se cultivaron en DMEM que contiene FCS al 10 %. Las células se cultivaron a 37 °C en una atmósfera saturada de agua a CO2 al 5 %. Se usó el paso 9 in vitro para inyección subcutánea, a una viabilidad de un 97 %. Se genomanipularon fibroblastos humanos NIH-3T3 en Roche Nutley para expresar FAP humana. El clon 39 se usó en un número de paso in vitro 12 y a una viabilidad de un 98 %. Se inyectan por vía subcutánea 50 microlitros de suspensión celular (1x106 células MKN45 1x1063T3-huFAP) mezclados con 50 microlitros de Matrigel en la ijada de ratones anestesiados. Se administró una administración en bolo i.v. de 10 mg/kg a ratones humanizados cuando el tumor alcanzó un tamaño promedio de 190 mm3. Se tomaron muestras de sangre en puntos temporales seleccionados para la evaluación farmacocinética. Las muestras séricas de ratón se analizaron por ELISA. Se añadieron 4-1BB humano biotinilado, muestras de prueba, anticuerpo anti-huCH1 marcado con digoxigenina y anticuerpo de detección anti-digoxigenina (POD) por etapas a una placa de microvaloración recubierta con estreptavidina de 96 pocillos y se incubó después de cada etapa durante 1 h a temperatura ambiente. La placa se lavó tres veces después de cada etapa para retirar sustancias no unidas. Finalmente, el complejo unido a peroxidasa se visualiza añadiendo solución de sustrato ABTS para formar un producto de reacción coloreado. La intensidad del producto de reacción se determinó fotométricamente a 405 nm (con longitud de onda de referencia a 490 nm) es proporcional a la concentración de analito en la muestra sérica. El intervalo de calibración de la curva estándar para las construcciones fue de 0,156 a 10 ng/ml, donde 3 ng/ml es el límite inferior de cuantificación (LLOQ).
La figura 28B muestra la disminución en la concentración de las construcciones con el tiempo como se observa en este experimento.
Experimento C: FC de dosis única de la construcción 2.1 y 2.3 en ratones NOG sanos
Se mantuvieron ratones hembra NOG de una edad promedio de 8-10 semanas al inicio del experimento (adquiridos de Taconic, instalación SOPF) en condiciones sin patógenos específicos con ciclos diarios de 12 h de luz /12 h de oscuridad de acuerdo con las directrices acordadas (GV-Solas; Felasa; TierschG). Se revisó el protocolo de estudio experimental y se aprobó por el gobierno local (P 2011128). Después de su llegada, los animales se mantuvieron durante una semana para que se acostumbraran a su nuevo entorno y para su observación. Se llevó a cabo un seguimiento de salud continuo regularmente.
Se realizó un estudio farmacocinético de dosis única (FCDU) para evaluar la exposición de la construcción 2.1 y 2.3. Se administró una administración intravenosa rápida i.v. de 2,5 mg/kg a ratones NOG y se obtuvieron muestras de sangre en los puntos temporales seleccionados para la evaluación farmacocinética. Las muestras séricas de ratón se analizaron por ELISA. Se añadieron 4-1BB humano biotinilado, muestras de prueba, anticuerpo anti-huCH1 marcado con digoxigenina y anticuerpo de detección anti-digoxigenina (POD) por etapas a una placa de microvaloración recubierta con estreptavidina de 96 pocillos y se incubó después de cada etapa durante 1 h a temperatura ambiente. La placa se lava tres veces después de cada etapa para retirar sustancias no unidas. Finalmente, el complejo unido a peroxidasa se visualiza añadiendo solución de sustrato ABTS para formar un producto de reacción coloreado. La intensidad del producto de reacción se determina fotométricamente a 405 nm (con longitud de onda de referencia a 490 nm) es proporcional a la concentración de analito en la muestra sérica. El intervalo de calibración de la curva estándar para las construcciones fue de 0,156 a 10 ng/ml, donde 3 ng/ml es el límite inferior de cuantificación (LLOQ). La figura 28C muestra la disminución observada en la concentración con el tiempo.
Las construcciones sometidas a prueba 2.1 y 2.3 son lo suficientemente estables en el cuerpo y poseen parámetros FC en un intervalo adecuado para el desarrollo farmacéutico. También se puede concluir de los resultados que la construcción 2.1 es ligeramente más estable.
6.7. Prevalencia de FAP en tumores humanos
La prevalencia de FAP en tumores humanos se evaluó como se describe en el documento WO 2014/161845 para obtener una interpretación del posible uso clínico de construcciones dirigidas a FAP.
Se usó el anticuerpo anti-seprasa humana de rata (IgG2a, clon D8) de Vitatex (MABS1001) para inmunoteñir secciones de FFPEt de 2,5 pm de diversas indicaciones tumorales en Ventana Benchmark XT. Las secciones se sometieron a un tratamiento con CC1 estándar seguido de una incubación con anticuerpos durante 60 min a 37 °C a una concentración de 5 pg/ml en un diluyente de anticuerpo Dako (S3022) y se detectó la tinción positiva usando el sistema de detección Ultraview DAB (Ventana n.° 760-4456).
Se usó el anticuerpo de isotipo combinado de Abeam (ab18450) como control negativo. El infiltrado estromal FAP+ estuvo presente en tumores humanos de indicaciones diferentes, incluyendo carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello (CCECC), cáncer de mama, cáncer colorrectal (CCR), cáncer de páncreas (CP), cáncer gástrico, carcinoma de pulmón no microcítico (CPNM) y mesotelioma, lo que marca indicaciones clínicas potencialmente interesantes para las construcciones dirigidas a FAP (tabla 42).
Tabla 42: Prevalencia de FAP en tumores humanos
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Ejemplo 7
7.1. Preparación de moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a CD19 (8B8-018)
7.1.1 Preparación, purificación y caracterización de la fusión de Fc antígeno CD19 para la campaña de presentación en fagos
Para expresar y purificar el ectodominio de CD19 humano y de macaco cangrejero en un estado monomérico (CD19 humano, véase SEQ ID NO:31), el fragmento de a Dn respectivo se fusionó a un segmento génico de Fc de IgG1 humana que contiene las mutaciones de "botón" (humano: SEQ ID NO:186; macaco cangrejero: SEQ ID NO:188) y se transfectó con un homólogo "ojal de Fc" (SEQ ID NO:86) (Merchant et al. 1998). Se introdujo un sitio de escisión IgA (PTPPTP) entre un ectodominio de antígeno y la cadena de botón de Fc. Se introdujo una marca Avi para biotinilación dirigida en el extremo C de la cadena de botón de Fc-antígeno y se introdujeron las mutaciones H435R y Y436F en el ojal de Fc para propósitos de purificación (Jendeberg L. et al, J. Immunological methods, 1997). La combinación de cadena de botón de Fc-antígeno que contiene las mutaciones S354C/T366W (humano: SEQ ID NO:187; macaco cangrejero: SEQ ID NO:189), con una cadena de ojal de Fc que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V (SEQ ID NO:90) permite la generación de un fragmento de fusión de Fc heterodimérico que incluye una única copia del ectodominio de CD19 (de forma análoga a la construcción de 4-1BB en la figura 5C). La tabla 43 enumera las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la construcción de fusión de Fc antígeno.
Tabla 43: secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de fusión (KIH) de Fc-antígeno CD19 humano y de macaco cangrejero monomérico
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Para la producción de las moléculas de fusión Fc/antígeno monoméricas, las células CHO en suspensión en crecimiento exponencial se cotransfectaron con dos plásmidos que codifican los dos componentes de la proteína de fusión (cadenas de botón y ojal) usando procedimientos estándar.
La proteína secretada se purificó del sobrenadante de cultivo celular por cromatografía de afinidad usando proteína A, seguido de cromatografía de exclusión por tamaño. Para la cromatografía de afinidad, el sobrenadante se cargó en una columna MabSelect Sure (volumen (CV) = 5-15 ml, resina de GE Healthcare) equilibrada con tampón de fosfato de sodio (20 mM), citrato de sodio (20 mM), cloruro de sodio 0,5 M (pH 7,5). La proteína no unida se retiró lavando con al menos 6 volúmenes de columna del mismo tampón. La proteína unida se eluyó usando un gradiente lineal; etapa 1, 10 VC de tampón de elución del 0 al 60 % (tampón de citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 500 mM (pH 2,5)); etapa 2, 2 VC de tampón de elución del 60 al 100 %. Para el gradiente lineal, se aplicó una elución en etapas adicional de 2 volúmenes de columna con tampón de elución al 100 %.
El pH de fracciones recogidas se ajustó añadiendo 1/40 (v/v) de Tris 2 M, pH 8,0. La proteína se concentró y se filtró antes de cargarse en una columna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada con solución de MOPS 2 mM, cloruro de sodio 150 mM, acida de sodio al 0,02 % (p/v) de pH 7,4.
La tabla 44 resume el rendimiento y contenido en monómero final de la proteína de fusión (kih) de Fc-antígeno CD19 humano y de macaco cangrejero monomérico.
Tabla 44 - Análisis bioquímico de la proteína de fusión (kih) de Fc-antígeno CD19 humano y de macaco cangrejero monomérico
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Parte del antígeno purificado se biotiniló in vitro usando el kit BirA Biotin-Protein Ligase Standard Reaction kit (Avidity, n.° cat. BirA500) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El grado de biotinilación para la fusión que contiene CD19 humano fue de un 94 %, para la respectiva construcción de CD19 de macaco cangrejero de un 100 %. A continuación se usó la proteína biotinilada para selección, cribado y caracterización de clones derivados de 8B8 madurados en afinidad desprovistos de los puntos calientes de desamidación N27d y N28.
7.1.2 Generación del clon anti-CD198B8-018
7.1.2.1 Inmunización y generación de anticuerpos anti-CD19 humano de ratón (hibridomas)
Se inmunizaron ratones Balb/c seis veces y se reforzaron con células HEK293 transfectadas con CD19 (densidad de receptor media 35.000 por célula). Se realizó el seguimiento de la respuesta inmunitaria sometiendo a prueba muestras séricas con un ELISA basado en CD19-células en células NIH-3T3 transfectadas con CD19 humano. Se usaron células de bazo de ratones con valores suficientes de anticuerpo anti-CD19 humano para inmortalización por fusión con línea celular de mieloma de ratón P3X63 Ag8.653. Se llevaron a cabo tres fusiones y se cribaron sobrenadantes de hibridoma por ELISA basado en células en células NIH-3T3 transfectadas con CD19 humano y ensayo de unión FACS usando células Daudi (CD19+) y CD19-para anticuerpos específicos anti-CD19 humano (véase el ejemplo 1 del documento WO 2011/147834).
7.1.2.2 Cribado de hibridomas y evaluación funcional biológica celular de anticuerpo anti-CD19 ELISA basado en células para criba anticuerpos frente a CD19 humano
Se aplicó un ELISA basado en células para el cribado de hibridomas, y para identificar los hibridomas que secretan anticuerpos frente a CD19 humano. Se usaron células NIH3T3 transfectadas con CD19 humano como células positivas; se usaron células NIH3T3 no transfectadas como células de control negativo. Para la evaluación de los hibridomas positivos se cuantificó la proporción DO entre células NIH3T3 transfectadas y no transfectadas.
- Medio de cultivo: DMEM rico en glucosa (4,5 mg/ml), FCS al 10 %, Na-piruvato, NEAA, glutamina - Anticuerpos de control positivo: anticuerpo monoclonal anti-CD19 (IgG1) Pharmingen n.° cat. 555409 c = 1 mg/ml
- Anticuerpo de detección: conjugado HRP anti-IgG de ratón caprino (H+L) Bio-Rad, n.° cat. 170-06516 - Dilución 1: 2000 en 1x reactivo de bloqueo de ELISA
- Otros reactivos: fibronectina Roche, n.° cat. 838039 c = 1 mg/ml
- Glutardialdehído: solución madre al 25 % // Grade Agar Scientific n.° R102 concentración final: 0,05 % en PBS
- Reactivo de bloqueo de ELISA: 10x solución madre // Roche, n.° cat. 1112589
- Sustrato TMB: Roche, n.° cat. 11432559
- Solución de detención: H2SO4 1 M
- BioRad, n.° cat. 170-6516 Dilución 1: 2000 en 1x reactivo de bloqueo de ELISA
Día 1:
- Recubrimiento con fibronectina: 5 pg/cm2 en PBS; placa de 96 pocillos = 32 cm2; 160 pg/placa en 6 ml - PBS, 50 pl/pocillo
- incubar 45 min a t.a., aspirar solución de recubrimiento
- Sembrar 1,25 x 104 células/pocillo en 50 pl de medio de cultivo en una placa de 96 pocillos - incubar 40 horas a 37 °C
- añadir a la mitad superior de la placa: células NIH3T3 que expresan CD19
- añadir a la mitad inferior de la placa: células NIH3T3 no transfectadas
Día 3:
- Adición de como control positivo anticuerpo o muestras (sobrenadante o suero de ratón) en 50 pl de medio de cultivo
- incubar durante 2 h a 4 °C
- Retirar medio, fijar las células con 100 pl de glutardialdehído (0,05 % en PBS)
- Lavar dos veces con 200 pl de PBS
- Adición de anticuerpo de detección 1:2000, 50 pl/pocillo
- incubar 2 h a t.a.
- lavar tres veces con 200 |jl de PBS
- añadir 50 j l de TMB, incubar durante 30 min a t.a.,
- detener por adición de 25 j l de H2SO4 1 M; leer la extinción a 450 nm/620 nm
- Cálculo de resultados: proporción DO NIH3T3 CD19 : DO NIH3T3 no transfectadas
El anticuerpo seleccionado demostró unión específica a células NIH3T3 transfectadas con CD19 en comparación con células NIH3T3 no transfectadas (véase el ejemplo 2 del documento WO 2011/147834).
7.1.2.3 Humanización del anticuerpo anti-CD19
La especificidad de unión a CD19 del anticuerpo murino se transfirió a una estructura aceptora humana para eliminar potenciales problemas de inmunogenicidad que surgen de tramos de secuencia que el cuerpo humano reconocerá como exógenos. Esto se realizó injertando todas las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del anticuerpo murino (donante) en una estructura de anticuerpo humano (aceptor), y se llama injerto con CDR o humanización de anticuerpo.
La secuencia de aminoácidos murina se alineó con una colección de genes V de anticuerpo de línea germinal humana, y se separó de acuerdo con la identidad y homología de secuencia. Antes de seleccionar una secuencia aceptora particular, las llamadas estructuras de bucle canónicas del anticuerpo donante se tienen que determinar (Morea, V., et al., Methods, Vol 20, Issue 3 (2000) 267-279). Estas estructuras de bucle canónicas se determinan por el tipo de residuos presentes en las llamadas posiciones canónicas. Estas posiciones quedan (parcialmente) fuera de las regiones CDR, y se tienen que mantener funcionalmente equivalentes en las construcción final para mantener la conformación de CDR del anticuerpo original (donante). La secuencia de línea germinal humana VBASE_VH1_1 se eligió como la aceptora para la cadena pesada y la secuencia VBASE_VK2_5 se eligió para la cadena ligera.
7.1.2.4 Retirada de puntos calientes de desamidación
Se ha descubierto que el anticuerpo anti-CD19 humano humanizado natural tiene tres puntos calientes de desamidación en la HVR-L1 : NSNGNT (SEQ ID NO:190). Adicionalmente se ha descubierto que en la HVR-H2 está presente otro punto caliente de desamidación: KFNG (SEQ ID NO:191). Para abordar el punto caliente de desamidación en la HVR-H2 se ha introducido una mutación puntual de N (Asn) a Q (Gln) en la posición 64 (numeración de acuerdo con Kabat). Por tanto, el anticuerpo como se informa en el presente documento tiene una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos TEKFQGRVTM (SEQ ID NO:192).
Para abordar los puntos calientes de desamidación en la cadena ligera y para obtener un anticuerpo anti-CD19 humano humanizado con una mejora en la estabilidad de desamidación se introdujeron mutaciones individuales en la posición de Kabat 27d, 27e, 28 y 29 y una mutación doble en las posiciones 27e y 28 (numeración de acuerdo con Kabat). En total se han generado 9 variantes (var.1 a var.9) del anticuerpo humanizado natural (var.0) (véase la tabla 45).
Tabla 45: variantes de anticuerpo frente a CD19 natural humanizado
Kabat 2222 Kabat 6
posición 7789 posición 4
LC: de HC:
var.0:wt QSLENSNGNTYLNW TEKFNGKATM
var.1:N27dH QSLEHSNGNTYLNW TEKFQGRVTM
var.2:N27dQ QSLEQSNGNTYLNW TEKFQGRVTM
var.3:S27eA QSLENANGNTYLNW TEKFQGRVTM
var.4:S27eV QS LENVN GN T YLNW TEKFQGRVTM
var.5:S27eP QSLENPNGNTYLNW TEKFQGRVTM
var.6:N28Q QSLENSQGNTYLNW TEKFQGRVTM
var.7:G29A QSLENSNANTYLNW TEKFQGRVTM
var.8:G29V QSLENSNVNTYLNW TEKFQGRVTM var.9:S27eP/N28S Q S LENPSGN TYLNW TEKFQGRVTM
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Se ha descubierto que con una única mutación en la posición 27e de acuerdo con Kabat de S (serina) a P (prolina) se pueden abordar todos los puntos calientes de desamidación en la HVR-L1. Esta es una mutación no del residuo N (asparagina) propenso a desamidación sino de un residuo adyacente.
Por tanto, el anticuerpo como se informa en el presente documento tiene una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos LENPNGNT (SEQ ID NO:193). En un modo de realización, el anticuerpo anti-CD19 humano humanizado comprende una HVR-L1 que tiene la secuencia de aminoácidos LENPSGNT (SEQ ID NO:194).
Adicionalmente estos anticuerpos mantienen la reactividad cruzada para CD19 de macaco cangrejero como se muestra en la siguiente tabla 46.
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El anticuerpo anti-CD19 humano humanizado natural (var.0) muestra después de la purificación una desamidación de aprox. un 7,5 %. Después del almacenamiento durante dos semanas a pH 7,4 la cantidad de anticuerpo desaminado es incrementa en aprox. un 18,5 %. El anticuerpo variante con una mutación S27eP (var.5) muestra una desamidación de aprox. un 2 % y formación de succinimida en un 2 % después de la purificación. Durante el almacenamiento a pH 7,4 durante dos semanas solo está presente anticuerpo desaminado en aprox. un 7,5 %. Var. 5 se denomina clon 8B8-018 y se eligió para la preparación de moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF dirigido a CD19.
7.1.3 Preparación de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB (71-254) dirigido a CD19(8B8-018) monovalente con dominios CH1-CL cruzados con residuos cargados (construcción 3.1)
Un polipéptido que contiene dos ectodominios de ligando de 4-1BB (71-254), separados por conectores (G4S)2, y fusionados al dominio CL de IgG1 humana, se clonó como se representa en la figura 29A: ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, CL humano. Un polipéptido que contiene un ectodominio de ligando de 4-1BB (71-254) y fusionado al dominio CH de IgG1 humana, se clonó como se describe en la figura 29B: ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, CH humana.
El polipéptido que codifica el ligando de 4-1BB dimérico fusionado al dominio CL humano se subclonó sin cambio de pauta de lectura con los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de IgG1 humana en el botón (Merchant, Zhu et al., 1998). Para mejorar el emparejamiento correcto se han introducido las siguientes mutaciones en el CH-CL cruzado. En el ligando de 4-1BB dimérico fusionado a CL humano, E123R y Q124K. En el ligando de 4-1BB monomérico fusionado a CH1 humano, K147E y K213E.
Las secuencias de ADN de la región variable de la cadena pesada y ligera que codifican una proteína fijadora específica para CD19, clon 8B8-018, se subclonaron sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal o bien la cadena ligera constante de IgG1 humana. Las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala se han introducido en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores de Fc gamma de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO 2012/130831.
La combinación de ligando dimérico-cadena de botón de Fc que contiene las mutaciones S354C/T366W, la fusión de CH1 monomérica, anti-CD19 dirigido-cadena de ojal de Fc que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V y cadena ligera anti-CD19 permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando de 4-1BB trimérico ensamblado y un Fab de unión a CD19 (figura 30, construcción 3.1).
La tabla 47 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-254) trimérico escindido dirigido a CD19(8B8-018) monovalente con CH-CL cruzado y residuos cargados (construcción 3.1).
Tabla 47: secuencias de ADNc y de aminoácidos de la fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-254) trimérico escindido dirigido a CD19(8B8-018) monovalente que contiene cruces de CH-CL con residuos cargados (construcción 3.1). * para residuos cargados
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7.1.4 Preparación de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB (71-254) dirigido a CD19(8B8-018) monovalente con dominios CH1-CL cruzados sin residuos cargados (construcción 3.2)
Un polipéptido que contiene dos ectodominios de ligando de 4-1BB (71-254), separados por conectores (G4S)2, y fusionados al dominio CL de IgG1 humana, se clonó de forma análoga como se representa en la figura (29A), pero sin mutaciones aminoacídicas en el dominio CL: ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, CL humano. Un polipéptido que contiene un ectodominio de ligando de 4-1BB (71-254) y fusionado al dominio CH1 de IgG1 humana, se clonó de forma análoga como se representa en la figura (29B), pero sin mutaciones aminoacídicas en el dominio CH1: ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, CH1 humano.
Las secuencias de ADN de la región variable de la cadena pesada y ligera que codifican una proteína fijadora específica para CD19, clon 8B8-018, se subclonaron sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal o bien la cadena ligera constante de IgG1 humana.
Las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala se han introducido en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores de Fc gamma de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO 2012/130831. La combinación de ligando dimérico-cadena de botón de Fc que contiene las mutaciones S354C/T366W, la fusión de CH1 monomérica, anti-CD19 dirigido-cadena de ojal de Fc que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V y cadena ligera anti-CD19 permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando de 4-1BB trimérico ensamblado y un Fab de unión a CD19 (figura 30, construcción 3.2).
La tabla 48 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-254) trimérico escindido dirigido a CD19(8B8-018) monovalente que contiene un cruce de CH-CL cruzado sin residuos cargados (construcción 3.2).
Tabla 48: secuencias de ADNc y de aminoácidos de la fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-254) trimérico escindido dirigido a c D19(8B8-018) monovalente que contiene cruces de CH-CL sin residuos cargados (construcción 3.2).
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7.1.5 Preparación de la molécula unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB (71-254) dirigido a CD19(8B8-018) bivalente (construcción 3.3)
Un polipéptido que contiene dos ectodominios de ligando de 4-1BB (71-254), separados por conectores (G4S)2 se fusionó al extremo C de la cadena de ojal de Fc de IgG1 humana, como se representa en la figura 29C: ojal de Fc de IgG1 humana, conector (G4S)2, ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando de 4-1Bb humano. Un polipéptido que contiene un ectodominio de ligando de 4-1BB (71-254) y fusionado al extremo C de la cadena de botón de Fc de IgG1 humana como se describe en la figura 29D: botón de Fc de IgG1 humana, conector (G4S)2, ligando de 4-1BB humano.
Las secuencias de ADN de la región variable de la cadena pesada y ligera que codifican una proteína fijadora específica para CD19, clon 8B8-018, se subclonaron sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal, del botón o bien la cadena ligera constante de IgG1 humana. Las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala se han introducido en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores de Fc gamma de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO 2012/130831. La combinación de la cadena de ligando dimérico botón de huIgG1 anti-CD19 que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V, la cadena de ligando monomérico botón de huIgG1 anti-CD19 que contiene las mutaciones S354C/T366W y la cadena ligera anti-CD19 permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando de 4-1BB trimérico ensamblado y dos Fab de unión a CD19 (figura 30, construcción 3.3) .
La tabla 49 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-254) trimérico escindido dirigido a CD19(8B8-018) bivalente (construcción 3.3) .
Tabla 49: Secuencias de pares de bases de la fusión PGLALA (kih) de Fc-ligando de 4-1BB trimérico escindido dirigido a CD19(8B8-018) bivalente (construcción 3.3)
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7.1.6 Preparación de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB (71-248) dirigido a CD19(8B8-018) monovalente con dominios CH1-CL cruzados con residuos cargados (construcción 3.4)
Un polipéptido que contiene dos ectodominios de ligando de 4-1BB (71-248), separados por conectores (G4S)2, y fusionados al dominio CL de IgG1 humana, se clonó de forma análoga a lo representado en la figura 29A: ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, CL humano. Un polipéptido que contiene un ectodominio de ligando de 4-1BB (71-248) y fusionado al dominio CH de IgG1 humana, se clonó de forma análoga a la descrita en la figura 29B: ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, CH humana.
El polipéptido que codifica el ligando de 4-1BB dimérico fusionado al dominio CL humano se subclonó sin cambio de pauta de lectura con los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de IgG1 humana en el botón (Merchant, Zhu et al., 1998). Para mejorar el emparejamiento correcto se han introducido las siguientes mutaciones en el CH-CL cruzado. En el ligando de 4-1BB dimérico fusionado a CL humano, E123R y Q124K. En el ligando de 4-1BB monomérico fusionado a CH1 humano, K147E y K213E.
Las secuencias de ADN de la región variable de la cadena pesada y ligera que codifican una proteína fijadora específica para CD19, clon 8B8-018, se subclonaron sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal o bien la cadena ligera constante de IgG1 humana. Las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala se han introducido en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores de Fc gamma de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO 2012/130831. La combinación de ligando dimérico-cadena de botón de Fc que contiene las mutaciones S354C/T366W, la fusión de CH1 monomérica, anti-CD19 dirigido-cadena de ojal de Fc que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V y cadena ligera anti-CD19 permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando de 4-1BB trimérico ensamblado y un Fab de unión a CD19 (figura 30, construcción 3.4).
La tabla 50 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-248) trimérico escindido dirigido a CD19(8B8-018) monovalente con CH-CL cruzado y residuos cargados (construcción 3.4).
Tabla 50: secuencias de ADNc y de aminoácidos de la fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-248) trimérico escindido dirigido a CD19(8B8-018) monovalente que contiene cruces de CH-CL con residuos cargados (construcción 3.4). * residuos cargados
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7.1.7 Preparación de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB (71-248) dirigido a CD19(8B8-018) monovalente con dominios CH1-CL cruzados sin residuos cargados (construcción 3.5)
Un polipéptido que contiene dos ectodominios de ligando de 4-1BB (71-248), separados por conectores (G4S)2, y fusionados al dominio CL de IgG1 humana, se clonó de forma análoga como se representa en la figura (29A), pero sin mutaciones aminoacídicas en el dominio CL: ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, CL humano. Un polipéptido que contiene un ectodominio de ligando de 4-1BB (71-248) y fusionado al dominio CH1 de IgG1 humana, se clonó de forma análoga como se representa en la figura (29B), pero sin mutaciones aminoacídicas en el dominio CH1: ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, CH1 humano.
Las secuencias de ADN de la región variable de la cadena pesada y ligera que codifican una proteína fijadora específica para CD19, clon 8B8-018, se subclonaron sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal o bien la cadena ligera constante de IgG1 humana. Las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala se han introducido en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores de Fc gamma de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO 2012/130831.
La combinación de ligando dimérico-cadena de botón de Fc que contiene las mutaciones S354C/T366W, la fusión de CH1 monomérica, anti-CD19 dirigido-cadena de ojal de Fc que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V y cadena ligera anti-CD19 permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando de 4-1BB trimérico ensamblado y un Fab de unión a CD19 (figura 30, construcción 3.5).
La tabla 51 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-248) trimérico escindido dirigido a CD19(8B8-018) monovalente que contiene un cruce de CH-CL cruzado sin residuos cargados (construcción 3.5).
Tabla 51: secuencias de ADNc y de aminoácidos de la fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-248) trimérico escindido dirigido a c D19(8B8-018) monovalente que contiene cruces de CH-CL sin residuos cargados (construcción 3.5).
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7.1.8 Preparación de la molécula unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB (71-248) dirigido a CD19(8B8-018) bivalente (construcción 3.6)
Un polipéptido que contiene dos ectodominios de ligando de 4-1BB (71-248), separados por conectores (G4S)2 se fusionó al extremo C de la cadena de ojal de Fc de IgG1 humana, como se representa en la figura 29C: ojal de Fc de IgG1 humana, conector (G4S)2, ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando de 4-1Bb humano. Un polipéptido que contiene un ectodominio de ligando de 4-1BB (71-254) y fusionado al extremo C de la cadena de botón de Fc de IgG1 humana como se describe en la figura 29D: botón de Fc de IgG1 humana, conector (G4S)2, ligando de 4-1BB humano.
Las secuencias de ADN de la región variable de la cadena pesada y ligera que codifican una proteína fijadora específica para CD19, clon 8B8-018, se subclonaron sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal, del botón o bien la cadena ligera constante de IgG1 humana. Las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala se han introducido en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores de Fc gamma de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO 2012/130831. La combinación de la cadena de ligando dimérico botón de huIgG1 anti-CD19 que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V, la cadena de ligando monomérico botón de huIgG1 anti-CD19 que contiene las mutaciones S354C/T366W y la cadena ligera anti-CD19 permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando de 4-1BB trimérico ensamblado y dos Fab de unión a CD19 (figura 30, construcción 3.6) .
La tabla 52 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-248) trimérico escindido dirigido a CD19(8B8-018) bivalente (construcción 3.6) .
Tabla 52: secuencias de ADNc y de aminoácidos de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-248) trimérico escindido dirigido a CD19(8B8-018) bivalente (construcción 3.6)
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7.2 Preparación de moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a CD19 (madurado en afinidad derivado de 8B8) y las correspondientes moléculas de control
7.2.1 Generación de proteínas fijadoras anti-CD19 maduradas en afinidad derivadas de 8B8 desprovistas de puntos calientes
7.2.1.1 Selección de anticuerpos específicos para CD19 madurados en afinidad
La desamidación de los residuos de asparagina en las posiciones 27d y 28, localizados en CDR1 de la cadena ligera del clon 8B8 humanizado, da lugar a una reducción significativa en la actividad biológica. Por lo tanto, se generaron 2 colecciones de presentación en fagos en las que a) ambos residuos de asparagina en las posiciones 27d y 28 se eliminaron y b) CDR adicionales de cadena pesada y ligera se aletorizaron para seleccionar variantes de 8B8 con una mejora en afinidad.
7.2.1.2 Generación de colecciones de maduración de la afinidad de 8B8 desprovistas de puntos calientes de LCDR1
La generación de anticuerpos derivados de 8B8 madurados en afinidad sin los sitios de desamidación N27d y N28, localizados en LCDR1, se llevó a cabo por presentación en fagos usando protocolos estándar (Silacci et al, 2005). En una primera etapa, las secuencias de ADN de VL y VH del clon 8B8 original humanizado (SEQ ID NO:215 y SEQ ID NO:216) se clonaron en un fagémido que a continuación se usó como molde para aleatorización. En una etapa siguiente, se generaron dos colecciones para la selección de clones favorables por presentación en fagos. Para eliminar las posiciones de puntos calientes mencionadas anteriormente, se usó un cebador de aleatorización LCDR1 (SEQ ID NO:217) que solo permitió los aminoácidos S T Q E en las posiciones 27d y 28 para ambas colecciones. La colección de maduración 1 se aleatorizó en CDR1 y 2 tanto de la cadena ligera como de la pesada, mientras que la colección de maduración 2 se aleatorizó en CDR1 y 3 de la cadena ligera y en CDR3 de la cadena pesada. Las posiciones aletorizadas en las respectivas regiones CDR se muestran en la figura 31A. Para la generación de la colección de maduración 1, aletorizada en CDR1 y 2 tanto de la cadena ligera como de la pesada, se ensamblaron tres fragmentos por PCR de "ayuste por superposición de extensión" (SOE) y se clonaron en el vector de fago (figura 31B). Las siguientes combinaciones de cebadores se usaron para generar los fragmentos de colección: fragmento 1 (LMB3 (SEQ ID NO:222) y aleatoria inversa CD19 L1 (SEQ ID NO:217), fragmento 2 (aleatoria directa CD19 L2 (SEQ ID NO:218) y aleatoria inversa CD19 H1 (s Eq ID NO:219), y fragmento 3 (aleatoria directa CD19 H2 (SEQ ID NO:220) y constante inversa CD19 H3 (SEQ ID NO:221) (tabla 53). Después del ensamblaje de cantidades suficientes de fragmento aletorizado de longitud completa, se digirió NcoI/NheI junto con el vector de fagémido aceptor tratado de forma idéntica. Un exceso molar de 3 veces del inserto de colección se ligó con 10 pg de vector de fagémido. Se usaron ligaciones purificadas durante 20 transformaciones dando como resultado 2 x 109 transformantes. Se rescataron partículas de fagémido que presentaban la maduración de 8B8 de la colección de afinidad y se purificaron por purificación PEG/NaCl para usarse para las selecciones.
La generación de la segunda colección, aletorizada en CDR1 y 3 de la cadena ligera y en CDR3 de la cadena pesada, se realizó de forma similar. Las siguientes combinaciones de cebadores se usaron para generar los fragmentos de colección: fragmento 1 (LMB3 (SEQ ID NO:222) y aleatoria inversa CD19 L1 (Se Q ID NO:217), fragmento 2 (constante directa CD19 L1 (SEQ ID NO:223) y aleatoria inversa CD19 L3 (SEQ ID NO:224), y fragmento 3 (constante directa CD19 L3 (SEQ ID NO:225) y constante inversa CD19 H3 (SEQ ID NO:226) (tabla 54). Después del ensamblaje de cantidades suficientes de fragmento aletorizado de longitud completa, se digirió NcoI/KpnI junto con el vector de fagémido aceptor tratado de forma idéntica. Un exceso molar de 3 veces del inserto de colección se ligó con 20 ug de vector de fagémido. Se usaron ligaciones purificadas durante 40 transformaciones dando como resultado 2 x 109 transformantes. Se rescataron partículas de fagémido que presentaban la maduración de 8B8 de la colección de afinidad y se purificaron por purificación PEG/NaCl para usarse para las selecciones.
Tabla 53: Cebadores para la maduración de la afinidad de 8B8 y colección de retirada de puntos calientes L1 L2 / H1 H2
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Tabla 54: Cebadores para la maduración de la afinidad de 8B8 y colección de retirada de puntos calientes L1 L3 / H3
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7.2.1.3 Selección de clones derivados de 8B8 madurados en afinidad desprovistos de los puntos calientes de LCDR1 N27d y N28
Para la selección de clones madurados en afinidad desprovistos de los puntos calientes de N27d y N28, se realizaron dos enfoques de selección por presentación en fagos:
En el primer enfoque, la selección se ejecutó en la proteína de fusión de Fc-CD19 humano usando ambas colecciones de presentación en fagos. Se realizaron tandas de fijación en solución de acuerdo con el siguiente patrón: 1. unión de ~ 1012 partículas de fagémido a proteína Fc-CD19 biotinilada 30 nM durante 0,5 h en un volumen total de 1 ml, 2. captura de proteína Fc-CD19 biotinilada y partículas de fago específicamente unidas por adición de 5,4 x 107 perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina durante 10 min, 3. lavado de perlas usando 5x 1 ml de PBS/Tween20 y 5x 1 ml de PBS, 4. elución de partículas de fago por adición de 1 ml de TEA 100 mM durante 10 min y neutralización añadiendo 500 ul Tris/HCl 1 M pH 7,4, 5. reinfección de bacterias TG1 E. coli en crecimiento exponencial, y 6. infección con fago colaborador VCSM13 y posterior precipitación con PEG/NaCl de partículas de fagémido para usarse en posteriores tandas de selección. Las selecciones se llevaron a cabo durante 3 tandas usando concentraciones de antígeno decrecientes (30x10-9 M, 10x10-9 M, y 3x10-9 M). En la tanda 2 y 3, se realizó la captura de complejos antígeno:fago usando placas de neutravidina en lugar de perlas de estreptavidina. Las placas de neutravidina se lavaron con 5x PBS/Tween20 y 5x PBS. En la tanda 3, la placa de neutravidina se incubó durante la noche en 2 litros de PBS durante una selección de "disociación" antes de que se eluyera el fago de la placa. Además, se usó proteína Fc-CD19 de macaco cangrejero en la tanda 2 para enriquecer las proteínas fijadores con reactividad cruzada.
En el segundo enfoque de selección, se ejecutó la fijación del fago en células que expresan de forma transitoria ECD de CD19 humano o bien de macaco cangrejero en la superficie celular. Para la transfección transitoria de células HEK, se generaron plásmidos de expresión que albergan las secuencias de ADN (de 5' a 3') para los siguientes segmentos de proteína: una marca Flag, una marca SNAP, el ECD CD19 de origen humano o bien de macaco cangrejero, y la región transmembranaria del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR) (SEQ ID NO:227 y 228). La expresión de las respectivas proteínas (SEQ ID NO:229 y 230) en la superficie celular se confirmó por citometría de flujo usando un anticuerpo anti-Flag para la detección. Ambas colecciones se expusieron en la primera tanda de selección a células que expresan la proteína de fusión que contiene ECD CD19 humano o bien de macaco cangrejero. Para las posteriores tandas de fijación, se alternó la especie del ECD CD19 en consecuencia. Las células transfectadas de forma transitoria con una proteína de membrana no pertinente se usaron para el preaclarado.
Las tandas de fijación se realizaron de acuerdo con el siguiente patrón:
1. Transfección de células HEK con construcciones que expresan ECD CD19 o bien una proteína transmembranaria no pertinente de acuerdo con el procedimiento estándar descrito anteriormente,
2. Incubación de las células durante un total de 48 h a 37 °C en un incubador con una atmósfera de CO2 al 5 %, 3. Aislamiento de células por centrifugación (3 min a 250xg) y resuspensión de 1 x 107 células positivas para ECD CD19 y 1X107 células negativas en PBS/5 % BSA, respectivamente,
3. Preaclarado de fago inespecífico incubando la colección de fagos con 1x107 células negativas para CD19 durante 60 min a 4 °C usando un rotor de tubos con rotación suave,
4. Centrifugación de células a 250xg durante 3 min y transferencia de sobrenadante en un tubo recién preparado y adición de 1X107 células positivas para CD19 e incubación durante 60 min a 4 °C por rotación suave en un rotor de tubos,
5. Lavado de células por centrifugación durante 1 min a 250xg, aspiración del sobrenadante, y resuspensión en 1 ml de PBS (8 veces),
6. Elución de fago con 1 ml de TEA 100 mM, incubación durante 5 min a t.a., y neutralización del eluido con 500 ul de Tris-HCl 1 M, pH7,6,
7. Reinfección de bacterias TG1 E. coli en crecimiento exponencial, e
8. infección con fago colaborador VCSM13 y posterior precipitación con PEG/NaCl de partículas de fagémido para usarse en posteriores tandas de selección. Las selecciones se llevaron a cabo durante 3 tandas.
Para ambos enfoques de selección, las proteínas fijadoras específicas se identificaron por ELISA como sigue: Se recubrieron 100 ul de proteína Fc-CD19 biotinilada 30 nM en placas de neutravidina. Se añadieron sobrenadantes bacterianos que contenían Fab y se detectaron los Fab de unión por medio de sus marcas Flag usando un anticuerpo secundario anti-Flag/HRP.
Los clones que fueron positivos para ELISA en CD19 humano recombinante se sometieron a prueba además en un ELISA basado en células usando células que se transfectaron de forma transitoria con el plásmido de expresión que contiene ECD CD19 humano (SEQ ID NO:227). Este análisis se realizó como sigue: 48 h después de la transfección, se obtuvieron células HEK y se centrifugaron a 250xg durante 5 min. Las células se resuspendieron a continuación en PBS BSA helado al 2 % a 4 x 106 células/ml y se incubaron durante 20 min en hielo para bloquear los sitios de unión inespecíficos. Se distribuyeron 4 x105 células en 100 ul a cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se centrifugó a 250xg y 4 °C durante 3 min. El sobrenadante se separó por aspirado y 50 ul de sobrenadante bacteriano que contiene fragmentos Fab solubles se diluyó con 50 ul de PBS/BSA 2 % helado, se añadió a la placa, se mezcló con las células y se incubó durante 1 h a 4 °C. Después de esto, las células se lavaron 3 veces con PBS helado antes de que se añadieran 100 ul de PBS BSA 2 % por pocillo que contiene una dilución 1:2000 de anticuerpo anti-Fab-HRP. Después de un tiempo de incubación de 1 h, las células se lavaron de nuevo 3 veces con PBS helado. Para el desarrollo, se añadieron 100 ul de sustrato "1-Step Ultra TMB-ELISA" por pocillo. Después de un tiempo de incubación de 10 minutos, el sobrenadante se transfirió a una nueva placa de 96 pocillos que contiene 40 ul de H2SO41 M por pocillo y se midió la absorbancia a 450 nM. Los clones que presentaron señales significativas sobre el fondo se sometieron a un experimento de cribado cinético por análisis RPS usando ProteOn XPR36.
7.2.1.4 identificación de variantes derivadas de 8B8 maduradas en afinidad por RPS
Para caracterizar además los clones positivos para ELISA, se midió la disociación por resonancia de plasmón superficial y se comparó con el clon 8B8 humanizado original.
Para este experimento, se inmovilizaron 7000 UR de anticuerpo anti-Fab humano policlonal en todos los 6 canales de un chip GLM por acoplamiento con amina (acetato Na pH4,5, 25 pl/min, 240 s) (orientación vertical). Cada sobrenadante bacteriano que contiene anticuerpo se filtró y se diluyó 2 veces con PBS, y a continuación se inyectó durante 360 s a 25 pl/minuto para lograr niveles de inmovilización de entre 100 y 400 unidades de respuesta (UR) en orientación vertical. Inyección de Fc-CD19 monomérico: para mediciones cinéticas de una vez, el sentido de inyección se cambió a la orientación horizontal, se inyectaron simultáneamente series de dilución de tres veces de Fc-CD19 monomérico purificado (intervalos de concentración variables de entre 150 y 6 nM) a 50 pl/min a lo largo de los canales separados 1-4, con tiempos de asociación de 180 s, y tiempos de disociación de 300 s. Se inyectó un fragmento Fc de IgG humana (150 nM) en el canal 5 como control negativo para la unión específica a tampón Fc-CD19 monomérico (PBST) a lo largo del sexto canal para proporcionar un blanco "en-línea" como referencia. La regeneración se realizó por dos pulsos de glicina 10 mM pH 1,5 y NaOH 50 mM durante 30 s a 90 ul/min (orientación horizontal). Las constantes de velocidad de disociación (kdis) se calcularon usando un modelo de unión de Langmuir uno a uno sencillo en el programa informático ProteOn Manager v3.1 ajustando simultáneamente los sensogramas. Los clones que expresan Fab con las constantes de velocidad de disociación más lentas se identificaron (tabla 55). Cabe destacar que las constantes de velocidad de disociación de los clones 5A07 y 5B08 no se pudieron determinar debido a un ajuste inadecuado. No obstante, ambos clones se seleccionaron porque los resultados obtenidos sugirieron una disociación muy lenta. Los dominios variables de los correspondientes fagémidos se secuenciaron. De forma importante, ambos residuos de asparagina en LCDR1 (posición 27d y 28) se reemplazaron por una serina o una treonina, demostrando que se retiraron ambos sitios de desamidación. Se muestra una alineación en la figura 32. Las CDR de los mejores clones se enumeran en la tabla 56 (regiones variables de la cadena ligera) y tabla 57 (regiones variables de la cadena pesada) (clon 5H09: (Se Q ID NO:231-236); clon 7H07: (SEQ ID NO:237-242); clon 2B03: (SEQ ID NO:243-248); clon 2B11: (SEQ ID NO:249-254); clon 5A07: (SEQ ID NO:255 260); clon 5B08: (SEQ ID NO:261-266); clon 5D08: (SEQ ID NO:267-272).
Tabla 55: Constantes de disociación de clones seleccionados obtenidos en análisis de cribado con sobrenadante bacteriano
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Tabla 56: Secuencias de CDR de las cadenas ligeras de 8B8 seleccionadas
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Tabla 57: Secuencias de CDR de las cadenas pesadas de 8B8 seleccionadas
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7.2.2 Caracterización de anticuerpos derivados de 8B8 madurados en afinidad
7.2.2.1 Clonación de dominios de anticuerpo variables en vectores de expresión
Las secuencias de ADN de las regiones variables de la cadena pesada y ligera de las proteínas fijadoras anti-CD19 seleccionadas se subclonaron sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante o bien la cadena ligera constante de IgG1 humana. En la cadena pesada, se han introducido las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala para anular la unión a los receptores de Fc gamma de acuerdo con el procedimiento descrito en la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 2012/130831 A1.
Las secuencias de ADNc y de aminoácidos de las IgG anti-CD19 se muestran en la tabla 58 y tabla 59, respectivamente. Todas las secuencias que codifican anticuerpos se clonaron en un vector de expresión, que conduce la transcripción del inserto con un promotor MPSV quimérico y contiene una secuencia señal de polyA sintética localizada en el extremo 3' de CDS. Además, el vector contiene una secuencia OriP de EBV para el mantenimiento episómico del plásmido.
Tabla 58: secuencias de ADNc y de aminoácidos del clon 8B8 anti-CD19 en formato de IgG1 humana P329GLALA
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Tabla 59: secuencias de ADNc y de aminoácidos de clones anti-CD19 madurados en afinidad en formato de IgG1 humana P329GLALA
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7.2.2.2 Determinación de afinidad de anticuerpos seleccionados por RPS
Para la determinación exacta de las afinidades por RPS, los anticuerpos anti-CD19 seleccionados se produjeron cotransfectando células HEK293-EBNA con los vectores de expresión de mamífero usando polietilenimina. Las células se transfectaron con los correspondientes vectores de expresión en una proporción 1:1 ("vector cadena pesada": "vector cadena ligera") de acuerdo con el procedimiento estándar. 7 días después de la transfección, el valor de anticuerpo en el sobrenadante se midió y todos los valores se equilibraron a 10 pg/ml.
La afinidad (Kd) del anticuerpo original 8B8 así como sus derivados se midió por RPS usando un instrumento ProteOn XPR36 (Biorad) a 25 °C. Se inmovilizaron 7000 UR de anticuerpo anti-Fab humano policlonal en todos los 6 canales de un chip GLM por acoplamiento con amina (acetato Na pH4,5, 25 ul/min, 240 s) (orientación vertical). Se filtró cada sobrenadante de HEK que contiene anticuerpo, se diluyó con PBST (fosfato 10 mM, cloruro de sodio 150 mM pH 7,4, Tween 20 al 0,005 %) hasta una concentración de 10 ug/ml, y a continuación se inyectó durante 360 s a 25 pl/minuto para lograr niveles de inmovilización de entre 500 y 800 unidades de respuesta (UR) en orientación vertical. Inyección de Fc-CD19 monomérico: para mediciones cinéticas de una vez, el sentido de inyección se cambió a la orientación horizontal, se inyectaron simultáneamente series de dilución de tres veces de Fc-CD19 monomérico purificado (intervalos de concentración variables de entre 150 y 6 nM) a 50 pl/min a lo largo de los canales separados 1-4, con tiempos de asociación de 180 s, y tiempos de disociación de 300 s. Se inyectó un fragmento Fc de IgG humana (150 nM) en el canal 5 como control negativo para la unión específica a Fc-CD19 monomérico. Se inyectó el tampón (PBST) a lo largo del sexto canal para proporcionar un blanco "en línea" como referencia. Una visión general de los respectivos sensorgramas se muestra en la figura 33. La regeneración se realizó por dos pulsos de glicina 10 mM pH 1,5 y NaOH 50 mM durante 30 s a 90 ul/min (orientación vertical). Las constantes de velocidad de asociación (kas) y constantes de velocidad de disociación (kdis) se calcularon usando un modelo de unión de Langmuir uno a uno sencillo en el programa informático ProteOn Manager v3.1 ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (KD) se calculó como la proporción kdis/kas. Un resumen de los datos cinéticos y termodinámicos se muestra en la tabla 60. La constante de disociación de todos los clones madurados en afinidad se mejoró en comparación con su clon original 8B8.
Tabla 60: Resumen de los datos cinéticos y termodinámicos para la interacción entre huIgG1 anti-CD19 y CD19 humano
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7.2.2.3 Preparación y purificación de P329G LALA IgG1 anti-CD19
Los anticuerpos anti-CD19 seleccionados se produjeron cotransfectando células HEK293-EBNA con los vectores de expresión de mamífero usando polietilenimina. Las células se transfectaron con los correspondientes vectores de expresión en una proporción 1:1 ("vector cadena pesada": "vector cadena ligera").
Para la producción en matraces de agitación de 500 ml, se sembraron 400 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la transfección. Antes de la transfección, las células se centrifugaron durante 5 minutos a 210 x g, y el sobrenadante se reemplazó por medio CD CHO precalentado. Los vectores de expresión (200 pg de ADN total) se mezclaron en 20 ml de medio CD CHO. Después de la adición de 540 pl de PEI, la solución se agitó con vórtex durante 15 segundos y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de esto, las células se mezclaron con la solución de ADN/PEI, se transfirió a un matraz agitador 500 ml y se incubó durante 3 horas a 37 °C en un incubador con una atmósfera de CO2 al 5 %. Después de la incubación, se añadieron 160 ml de medio F17 y las células se cultivaron durante 24 horas. Un día después de la transfección, se añadieron ácido valproico 1 mM y Feed al 7 % con complementos. Después de cultivar durante 7 días, el sobrenadante se recogió por centrifugación durante 15 minutos a 210 x g. La solución se filtró de forma estéril (filtro 0,22 pm), complementado con acida de sodio hasta una concentración final de 0,01 % (p/v), y se mantuvo a 4 °C.
La purificación de moléculas de anticuerpo de los sobrenadantes de cultivo celular se llevó a cabo por cromatografía de afinidad usando proteína A como se describe anteriormente para la purificación de fusiones de Fc antígeno. La proteína se concentró y se filtró antes de cargarse en una columna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada con solución de histidina 20 mM, NaCl 140 mM de pH 6,0.
Se determinó la concentración de proteína de anticuerpos purificados midiendo la DO a 280 nm, usando el coeficiente de extinción molar calculado en base a la secuencia de aminoácidos. La pureza y el peso molecular de los anticuerpos se analizaron por CE-SDS en presencia y ausencia de un agente reductor (Invitrogen, USA) usando LabCH1pGXII (Caliper). El contenido en agregado de muestras de anticuerpo se analizó usando una columna de exclusión por tamaño analítica TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) equilibrada en un tampón de migración de K2HPO425 mM, NaCl 125 mM, monoclorhidrato de L-arginina 200 mM, NaN3 al 0,02 % (p/v), pH 6,7 a 25 °C (tabla 61).
Tabla 61: Análisis bioquímico de clones de IgG1 de P329G LALA anti-CD19
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Para la preparación de construcciones biespecíficas se eligió el clon 2B11 debido a que carece de los tres puntos calientes de desamidación.
La secuencia de ADN que codifica parte del ectodominio (aminoácido 71-254 y 71-248) del ligando de 4-1BB humano se sintetizó de acuerdo con la secuencia P41273 de la base de datos Uniprot.
7.2.3 Preparación de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB (71-254) dirigido a CD19 (8B8-2B11) monovalente con dominios CH1-CL cruzados con residuos cargados (construcción 4.1)
La construcción 4.1 se preparó como se describe para la construcción 3.1 (figura 30), pero usando las secuencias de ADN de las regiones variables de la cadena pesada y ligera que codifican una proteína fijadora específica para CD19, clon 8B8-2B11.
La tabla 62 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-254) trimérico escindido dirigido a CD19(8B8-2B11) monovalente con CH-CL cruzado y residuos cargados (construcción 4.1).
Tabla 62: secuencias de ADNc y de aminoácidos de la fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-254) trimérico escindido dirigido a CD19(8B8-2B11) monovalente que contiene cruces de CH-CL con residuos cargados (construcción 4.1). * para residuos cargados
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7.2.4 Preparación de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB (71-254) dirigido a CD19(8B8-2B11) monovalente con dominios CH1-CL cruzados sin residuos cargados (construcción 4.2)
La construcción 4.2 se preparó como se describe para la construcción 3.2 (figura 30), pero usando las secuencias de ADN de las regiones variables de la cadena pesada y ligera que codifican una proteína fijadora específica para CD19, clon 8B8-2B11.
La tabla 63 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-254) trimérico escindido dirigido a CD19(8B8-2B11) monovalente que contiene un cruce de CH-CL cruzado sin residuos cargados (construcción 4.2).
Tabla 63: secuencias de ADNc y de aminoácidos de la fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-254) trimérico escindido dirigido a CD19(8B8-2B11) monovalente que contiene cruces de CH-CL sin residuos cargados (construcción 4.2).
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7.2.5 Preparación de la molécula unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB (71-254) dirigido a CD19(8B8-2B11) bivalente (construcción 4.3)
La construcción 4.3 se preparó como se describe para la construcción 3.3 (figura 30), pero usando las secuencias de ADN de las regiones variables de la cadena pesada y ligera que codifican una proteína fijadora específica para CD19, clon 8B8-2B11.
La tabla 64 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-254) trimérico escindido dirigido a CD19 (8B8-2B11) bivalente (construcción 4.3).
Tabla 64: secuencias de ADNc y de aminoácidos de fusión PGLALA (kih) de Fc-ligando de 4-1BB trimérico escindido dirigido a CD19(8B8-2B11) bivalente (construcción 4.3)
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7.2.6 Preparación de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB (71-248) dirigido a CD19(8B8-2B11) monovalente con dominios CH1-CL cruzados con residuos cargados (construcción 4.4)
La construcción 4.4 se preparó como se describe para la construcción 3.4 (figura 30), pero usando las secuencias de ADN de las regiones variables de la cadena pesada y ligera que codifican una proteína fijadora específica para CD19, clon 8B8-2B11.
La tabla 65 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-248) trimérico escindido dirigido a CD19(8B8-2B11) monovalente con CH-CL cruzado y residuos cargados (construcción 4.4).
Tabla 65: secuencias de ADNc y de aminoácidos de la fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-248) trimérico escindido dirigido a CD19(8B8-2B11) monovalente que contiene cruces de CH-CL con residuos cargados (construcción 4.4). * residuos cargados
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7.2.7 Preparación de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB (71-248) dirigido a CD19(8B8-2B11) monovalente con dominios CH1-CL cruzados sin residuos cargados (construcción 4.5)
La construcción 4.5 se preparó como se describe para la construcción 3.5 (figura 30), pero usando las secuencias de ADN de las regiones variables de la cadena pesada y ligera que codifican una proteína fijadora específica para CD19, clon 8B8-2B11.
La tabla 66 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-248) trimérico escindido dirigido a CD19(8B8-2B1) monovalente que contiene un cruce de CH-CL cruzado sin residuos cargados (construcción 4.5).
Tabla 66: secuencias de ADNc y de aminoácidos de la fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-248) trimérico escindido dirigido a CD19(8B8-2B11) monovalente que contiene cruces de CH-CL sin residuos cargados (construcción 4.5).
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7.2.8 Preparación de la molécula unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB (71-248) dirigido a CD19(8B8-2B11) bivalente (construcción 4.6)
La construcción 4.6 se preparó como se describe para la construcción 3.6 (figura 30), pero usando las secuencias de ADN de las regiones variables de la cadena pesada y ligera que codifican una proteína fijadora específica para CD19, clon 8B8-2B11.
La tabla 67 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-248) trimérico escindido dirigido a CD19(8B8-2B11) bivalente (construcción 3.6).
Tabla 67: secuencias de ADNc y de aminoácidos de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-248) trimérico escindido dirigido a CD19(8B8-2B11) bivalente (construcción 4.6)
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7.3 Preparación de fusión de Fc-ligando de 4-1BB trimérico escindido no dirigido e IgG humana como moléculas de control
7.3.1 Preparación de moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen el trímero de ligando de 4-1BB humano no dirigido (moléculas de control)
Estas moléculas de control se prepararon como se describe anteriormente para la construcción dirigida a CD19 3.1 (denominada control B), 3.3 (denominada control C), 3.4 (denominada control D) y 3.5 (denominada control E) con la única diferencia de que la proteína fijadora anti-CD19 (VH-VL) se reemplazó por un control de línea germinal, denominado DP47, que no se une al antígeno (véase figura 30).
La tabla 68 muestra, respectivamente, las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la fusión (kih) de Fcligando de 4-1BB (71-254) trimérico escindido no dirigido a DP47 monovalente que contiene CH-CL cruzado con residuos cargados, control B.
La tabla 69 muestra, respectivamente, las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la fusión (kih) de Fcligando de 4-1BB (71-254) trimérico escindido no dirigido a DP47 bivalente, control C.
La tabla 70 muestra, respectivamente, las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la fusión (kih) de Fcligando de 4-1BB (71-248) trimérico escindido no dirigido a DP47 monovalente que contiene cruce de CH-CL con residuos cargados, control D.
La tabla 71 muestra, respectivamente, las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la fusión (kih) de Fcligando de 4-1BB (71-248) trimérico escindido no dirigido a DP47 monovalente sin residuos cargados en el cruce CH-CL, control E.
Tabla 68: secuencias de ADNc y de aminoácidos de la fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-254) humano trimérico escindido no dirigido a DP47 monovalente con cruces de CH-CL y con residuos cargados (control B). * residuos cargados
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Tabla 69: secuencias de ADNc y de aminoácidos de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-254) humano trimérico escindido no dirigido a DP47 bivalente (control C)
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Tabla 70: secuencias de ADNc y de aminoácidos de la fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-248) humano trimérico escindido no dirigido a DP47 monovalente con cruces de CH-CL y con residuos cargados (control D). * residuos cargados
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Tabla 71: secuencias de ADNc y de aminoácidos de la fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-248) humano trimérico escindido no dirigido a DP47 monovalente con cruces de CH-CL y sin residuos cargados (control E).
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7.3.2 Anticuerpos como moléculas de control
Se prepararon dos IgG1 humanas de control que contienen PGLALA.
La tabla 72 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de PGLALA huIgG1 anti-CD19 (clon 8B8-018), es decir, control G.
La tabla 73 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos del control de línea germinal DP47, PGLALA huIgG1 (control F).
Tabla 72: secuencias de ADNc y de aminoácidos de PGLALA huIgG1 anti-CD19(8B8-018) (control G)
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Tabla 73: secuencias de ADNc y de aminoácidos del control de línea germinal DP47, PGLALA huIgGI (control F)
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7.4 Producción de moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc-ligando de 4-1BB trimérico escindido dirigido a CD19 y sus moléculas de control
Las secuencias que codifican moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB trimérico escindido dirigido o no dirigido se clonaron en un vector plasmídico, que conduce la expresión del inserto de un promotor MPSV y contiene una secuencia de polyA sintética localizada en el extremo 3' de CDS. Además, el vector contiene una secuencia OriP de EBV para el mantenimiento episómico del plásmido.
La molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB trimérico escindido se produjo cotransfectando células HEK293-EBNA con los vectores de expresión de mamífero usando polietilenimina. Las células se transfectaron con los correspondientes vectores de expresión. Para las variantes 1,2,4,5 y sus controles B, D y E, en una proporción 1:1:1:1 ("vector ligando dimérico-CL- cadena de botón": "vector fusión de ligando monomérico-CH1": "vector Fab anti-CD19-cadena de ojal": "vector cadena ligera anti-CD19"). Para la variante 3, 6 y su control C, en una proporción 1:1:1 ("vector cadena de ligando dimérico ojal de Fc huIgG1": "vector cadena de ligando monomérico botón de Fc huIgG1": "vector cadena ligera anti-CD19"). Las IgG humanas, usadas como control en el ensayo, se produjeron como para la construcción biespecífica (para transfección solo se usaron un vector para cadena ligera y un vector para cadena pesada en una proporción 1:1).
Para la producción en matraces de agitación de 500 ml, se sembraron 300 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la transfección. Para la transfección, las células se centrifugaron durante 10 minutos a 210 x g, y el sobrenadante se reemplazó por 20 ml de medio CD CHO precalentado. Los vectores de expresión (200 |jg de ADN total) se mezclaron en 20 ml de medio CD CHO. Después de la adición de 540 j l de PEI, la solución se agitó con vórtex durante 15 segundos y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Después de esto, las células se mezclaron con la solución de ADN/PEI, se transfirió a un matraz agitador 500 ml y se incubó durante 3 horas a 37 °C en un incubador con una atmósfera de CO2 al 5 %. Después de la incubación, se añadieron 160 ml de medio Excell complementado con L-glutamina 6 mM, 5 g/l de PEPSOY y ácido valproico 1,2 mM y las células se cultivaron durante 24 horas. Un día después de la transfección, se añadió Feed al 12 % (aminoácido y glucosa). Después de cultivar durante 7 días, el sobrenadante se recogió por centrifugación durante 30-40 minutos al menos 400 x g. La solución se filtró de forma estéril (filtro 0,22 jm), complementado con acida de sodio hasta una concentración final de 0,01 % (p/v), y se mantuvo a 4 °C.
La molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB trimérico escindido, así como la IgG, se purificó se purificó de los sobrenadantes de cultivo celular por cromatografía de afinidad usando proteína A, seguido de cromatografía de exclusión por tamaño. Para la cromatografía de afinidad, el sobrenadante se cargó en una columna MabSelect Sure (CV = 5-15 ml, resina de GE Healthcare) equilibrada con tampón de fosfato de sodio (20 mM), citrato de sodio (20 mM) (pH 7,5). La proteína no unida se retiró lavando con al menos 6 volúmenes de columna del mismo tampón. La proteína unida se eluyó usando un gradiente lineal (20 VC) o bien una elución en etapas (8 VC) con tampón de citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 100 mM, glicina 100 mM (pH 3,0). Para el gradiente lineal, se aplicó una elución en etapas adicional de 4 volúmenes de columna.
El pH de fracciones recogidas se ajustó añadiendo 1/10 (v/v) de fosfato de sodio 0,5 M, pH 8,0. La proteína se concentró antes de cargarse en una columna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada con solución de histidina 20 mM, cloruro de sodio 140 mM, Tween20 al 0,01 % (v/v) de pH 6,0.
La concentración de proteína se determinó midiendo la densidad óptica (DO) a 280 nm, usando un coeficiente de extinción molar calculado en base a la secuencia de aminoácidos. La pureza y el peso molecular de la fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB trimérico dirigido se analizó por SDS-PAGE en presencia y ausencia de un agente reductor (5 mM 1,4-ditiotreitol) y tinción con Coomassie SimpleBlue™ SafeStain (Invitrogen USA). El contenido en agregado de muestras se analizó usando una columna de exclusión por tamaño analítica TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) equilibrada en un tampón de migración de K2HPO425 mM, NaCl 125 mM, monoclorhidrato de L-arginina 200 mM, NaNa al 0,02 % (p/v), pH 6,7 a 25 °C.
La tabla 74 resume el rendimiento y contenido en monómero final de las moléculas de antígeno de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB trimérico escindido dirigido a CD19.
Tabla 74: Análisis bioquímico de moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB trimérico escindido dirigido a CD19
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La tabla 75 resume el rendimiento y contenido en monómero final de la fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB trimérico escindido no dirigido a DP47, tanto monovalente (control B, D y E) como bivalente (control C). Tabla 75: Análisis bioquímico de la fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB trimérico escindido no dirigido a DP47
Figure imgf000214_0002
La tabla 76 resume el rendimiento y contenido en monómero final de PGLALA huIgG1 anti-CD19 (8B8-018) y línea germinal DP47 (control F).
Tabla 76: análisis bioquímico de PGLALA huIgG1 de control
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Ejemplo 8
Caracterización funcional de las moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a CD19
8.1 Resonancia de plasmón superficial (afinidad)
La unión de las moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc-ligando de 4-1BB trimérico escindido dirigido a CD19 (construcciones 3.4 y 3.6) a la (kih) de Fc-4-1BB recombinante y CD19 se evaluó por resonancia de plasmón superficial (RPS). Todos los experimentos de RPS se realizaron en un Biacore T200 a 25 °C con HBS-EP como tampón de migración (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,005 %, Biacore, Friburgo/Alemania).
Interacción con 4-1BB humano y de macaco cangrejero
El anticuerpo anti-Fab humano (Biacore, Friburgo/Alemania) se acopló directamente en un chip CM5 a pH 5,0 usando el kit de acoplamiento con amina estándar (Biacore, Friburgo/Alemania). El nivel de inmovilización fue de aproximadamente 8000 UR. Las fusiones de Fc-ligando de 4-1BB trimérico escindido dirigido a CD19 se capturaron durante 60 segundos a 2 y 5 nM (el control D también se inyectó). El 4-1BB humano recombinante o de macaco cangrejero avi His se pasó en un intervalo de concentraciones de 2,7 a 2000 nM (dilución de 3 veces) con un flujo de 30 pl/minutos a través de las cubetas de flujo durante 120 segundos. Se realizó el seguimiento de la disociación durante 180 segundos. Las diferencias en el índice de refracción aparente se corrigieron restando la respuesta obtenida en la cubeta de flujo de referencia. Aquí, los antígenos se pasaron sobre una superficie con anticuerpo anti-Fab humano inmovilizado, pero en el que se había inyectado HBS-EP en lugar de los anticuerpos.
Interacción con CD19 humano
El anticuerpo anti-Fab humano (Biacore, Friburgo/Alemania) se acopló directamente en un chip CM5 a pH 5,0 usando el kit de acoplamiento con amina estándar (Biacore, Friburgo/Alemania). El nivel de inmovilización fue de aproximadamente 8000 UR. Las fusiones de Fc-ligando de 4-1BB trimérico escindido dirigido a CD19, o anticuerpo de control (PGLALA huIgG1 anti-CD19(8B8-018)) se capturaron durante 60 segundos a 20 nM. (kih) de Fc-CD19 humano recombinante se pasó en un intervalo de concentraciones de 7,8 a 500 nM (dilución de 2 veces) con un flujo de 30 pl/minutos a través de las cubetas de flujo durante 120 segundos. Se realizó el seguimiento de la disociación durante 120/1800 segundos. Las diferencias en el índice de refracción aparente se corrigieron restando la respuesta obtenida en la cubeta de flujo de referencia. Aquí, los antígenos se pasaron sobre una superficie con anticuerpo anti-Fab humano inmovilizado, pero en el que se había inyectado HBS-EP en lugar de los anticuerpos.
Las constantes cinéticas se derivaron usando el programa informático de evaluación Biacore T200 (vAA, Biacore AB, Uppsala/Suecia), para ajustar las ecuaciones de velocidad para la unión de Langmuir 1:1 por integración numérica.
Las construcciones biespecíficas 3.4, 3.6 y control D se unen de forma similar a 4-1 BB. La tabla 77 muestra el promedio con desviación estándar (en paréntesis) de los dos experimentos (usando la solución de captura de construcción a 2 nM o bien 5 nM). Las construcciones biespecíficas 3.4 y 3.6 se unen a CD19 humano con una afinidad similar a la de IgG. Las constantes de afinidad para la interacción se determinaron por ajuste a una unión de Langmuir 1:1. Para las mediciones con hu4-1BB y cy4-1BB, se muestran el promedio y la desviación estándar (en paréntesis) (dos experimentos con solución de captura 2 o 5 nM).
Tabla 77: unión de la fusión de Fc-ligando de 4-1BB trimérico escindido dirigido a CD19 a 4-1BB (hu) humano recombinante, 4-1BB (cy) de macaco cangrejero y CD19 (hu) humano.
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8.2 Resonancia de plasmón superficial (unión simultánea)
La capacidad de unión simultánea de (kih) de Fc-4-1BB humano y CD19 humano se evaluó por resonancia de plasmón superficial (RPS). Todos los experimentos de RPS se realizaron en un Biacore T200 a 25 °C con HBS-EP como tampón de migración (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,005 %, Biacore, Friburgo/Alemania). (kih) de Fc-4-1BB humano biotinilado se acopló directamente a una cubeta de flujo de un chip de sensor de estreptavidina (SA). Se usaron niveles de inmovilización de hasta 250 unidades de resonancia (UR).
Las construcciones de 4-1BBL escindido trimérico dirigido a CD19 (construcciones 3.1, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 4.4) se pasaron en un intervalo de concentraciones de 200 nM con un flujo de 30 pl/minuto a través de las cubetas de flujo durante 90 segundos y la disociación se fijó a cero s. Se inyectó CD19 humano como segundo analito con un flujo de 30 pl/minuto a través de las cubetas de flujo durante 90 segundos a una concentración de 500 nM (figura 34A). Se realizó el seguimiento de la disociación durante 120 s. Las diferencias en el índice de refracción aparente se corrigieron restando la respuesta obtenida en una cubeta de flujo de referencia, donde no se inmovilizó proteína.
Como se puede ver en las gráficas de la figura 35, todas las construcciones biespecíficas pudieron unir simultáneamente 4-1BB humano y CD19 humano.
Ejemplo 9
Caracterización funcional de las moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a CD-19
9.1 Unión en PBMC humanas activadas de las moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a CD19
Para determinar la unión de moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de 4-1BBL a PBMC humanas, se usaron diferentes concentraciones valoradas de las moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de 4-1BBL dirigido a CD19 en el ensayo como se describe en el ejemplo 5.2.
Las figuras 36A y 36B muestran la unión de construcciones 3.1, 3.3, 3.4, 3.5 y 3.6 como se prepara en el ejemplo 7 en linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+ que expresan 4-1BB activados, respectivamente. Las ventanas de adquisición se establecieron en linfocitos T CD45+ CD3+ CD4+ o CD45+ CD3+ CD8+ vivos y las MFI del fragmento F(ab')2 de cabra específico de fragmento Fcy IgG anti-IgG humana AffiniPure conjugado con PE se representaron frente a la concentración valorada de variantes de fusión de Fc-ligando de 4-1BB trimérico escindido dirigido. La tabla 78 muestra los valores de CE50 medidos para las construcciones 3.1, 3.3.
3.4, 3.5 y 3.6 y moléculas de control.
Tabla 78: unión en linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+ que expresan 4-1BB activados
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9.2 Unión a células tumorales que expresan CD19
Para ensayos de unión en células tumorales que expresan CD19, se usaron las siguientes líneas celulares de linfoma que expresan CD19 humano: línea celular de linfoma difuso de linfocitos B grandes no hodgkiniano (B-NHL) SU-DHL-8 (DSMZ ACC573), línea celular de leucemia linfocítica precursora de linfocitos B aguda Nalm6 (Ds Mz ACC-128), línea celular de linfoma difuso linfoblástico de células grandes Toledo (ATCC CRL-2631) y línea celular de linfoma difuso de linfocitos B grandes OCI-Ly18 (DSMZ ACC-699). Los ensayos se preformaron como se describe para las líneas celulares tumorales MV-3 y WM-266-4 que expresan FAP en el ejemplo 5.3.
Las ventanas de adquisición se establecieron en células tumorales vivas y las MFI del fragmento F(ab')2 de cabra específico de fragmento Fcy IgG anti-IgG humana AffiniPure conjugado con PE se representaron frente a la concentración valorada de construcciones de fusión de Fc-ligando de 4-1BB trimérico escindido dirigido.
La figura 37A muestra la unión de las construcciones 3.1, 3.3, 3.4, 3.5 y 3.6 como se prepara en el ejemplo 7.1 a la línea celular de linfoma de linfocitos B no hodgkiniano grandes difuso (B-NHL) s U-DHL-8 y en la figura 37B se presenta la unión de las construcciones 3.1, 3.3, 3.4, 3.5 y 3.6 a la línea celular de leucemia linfocítica precursora de linfocitos B aguda Nalm6. La figura 37C muestra la unión de las construcciones 3.1, 3.3, 3.4, 3.5 y 3.6 a la línea celular de linfoma difuso linfoblástico de células grandes Toledo y la figura 37D muestra la unión de las construcciones 3.1, 3.3, 3.4, 3.5 y 3.6 a la línea celular de linfoma difuso de linfocitos B grandes OCI-Ly18. La tabla 79 muestra los valores de CE50 medidos para las construcciones 3.1, 3.3, 3.4, 3.5 y 3.6 y moléculas de control.
Tabla 79: Unión a células tumorales que expresan CD19
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Ejemplo 10
Actividad biológica de las moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a CD19
10.1 Activación de NF-kB en células HeLa que expresan 4-1 BB humano
Las células HeLa que expresan 4-1BB humano y NF-K B-luciferasa se generaron como se describe en el ejemplo 6.1.
Activación de NF-kB en células HeLa que expresan 4-1BB humano cocultivadas con células tumorales que expresan CD19
Las células HeLa con 4-1BB humano de NF-KB-luciferasa se obtuvieron y se resuspendieron en medio DMEM suministrado con FBS al 10 % (v/v) y GlutaMAX-I al 1 % (v/v) hasta una concentración de 0,2 x 106 células/ml.
100 pl (2 x 104 células) de esta suspensión celular se transfirieron a cada pocillo de una placa de cultivo tisular de fondo plano de 96 pocillos blanca estéril con tapa (Greiner bio-one, n.° cat. 655083) y la placa se incubó a 37 °C y CO2 al 5 % durante la noche. Al día siguiente se añadieron 50 pl de medio que contiene concentraciones valoradas de moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a CD19 (trímero de 4-1BBL escindido de CD19) o moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB no dirigido a DP47 (trímero de 4-1BBL escindido de DP47). Las líneas celulares de linfoma de linfocitos B que expresan CD19 (línea celular de linfoma difuso de linfocitos B grandes no hodgkiniano (B-NHL) SU-DHL-8 (d Sm Z ACC573) y línea celular de linfoma de linfocitos B no hodgkiniano humano Pfeiffer (ATCC CRL-2632)) se resuspendieron en medio DMEM suministrado con FBS al 10 % (v/v) y GlutaMAX-I al 1 % (v/v) hasta una concentración de 2 x 106 células/ml.
Se añadieron suspensión de células de linfoma de linfocitos B que expresan FAP (50 pl, proporción final 1:5) o solo medio a cada pocillo y las placas se incubaron durante 6 horas a 37 °C y CO2 al 5 %. Las células se lavaron dos veces con 200 pl/pocillo de DPBS. Se añadieron 40 pl de tampón Reporter Lysis Buffer (Promega, n.° cat.: E3971) recién preparado a cada pocillo y las placas se almacenaron durante la noche a -20 °C. Al día siguiente las placas de células congeladas y el tampón de detección (sistema Luciferase 1000 Assay System, Promega, n.° cat. E4550) se descongelaron a temperatura ambiente. Se añadieron 100 pl de tampón de detección a cada pocillo y la actividad de luciferasa se midió lo más rápido posible usando un lector de microplacas SpectraMax M5/M5e y un programa informático SoftMax Pro Software (Molecular Devices) que cuenta la emisión de luz en URL (unidades de luz liberada durante 0,5 s/pocillo) o lector de placas Victor3 1420 Multilabel Counter (Perkin Elmer) y el programa informático Perkin Elmer 2030 Manager Software que cuenta la emisión de luz como recuentos por segundos (CPS) y se representó frente a la concentración de las construcciones sometidas a prueba.
Las moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a CD19, construcciones 3.1 y 3.3, desencadenaron la activación de la vía de señalización de NF-kB en la línea celular indicadora en presencia de células de linfoma de linfocitos B que expresan CD19. Por el contrario, las moléculas de control no dirigidas no desencadenan un efecto de este tipo a cualquiera de las concentraciones sometidas a prueba (figura 38).
Ejemplo 11
11.1 Preparación de moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a CEA (T84.66-LCHA)
11.1.1 Humanización del clon anti-CEA T84.66
Se desarrollaron variantes humanizadas novedosas del anticuerpo murino T84.66 (Wagener et al., J Immunol 130, 2308 (1983), Neumaier et al., J Immunol 135, 3604 (1985)) por injerto de las CDR en secuencias aceptoras estructurales de línea germinal humana.
La humanización de un anticuerpo de origen no humano consiste esencialmente en trasplantar los residuos de CDR del anticuerpo no humano (donante) en la estructura de un anticuerpo humano (aceptor). Normalmente la estructura aceptora se selecciona alineando la secuencia del donante a una colección de secuencias aceptoras potenciales y eligiendo una que tenga homología razonable con el donante o bien que muestre aminoácidos similares en algunas posiciones críticas para la estructura y actividad. En el presente caso, la búsqueda de la estructura aceptora de anticuerpo se realizó alineando la secuencia de la proteína T84.66 de ratón (n.° acc. NCBI: CAA36980 para la cadena pesada (SEQ ID NO:317), y CAA36979 (SEQ ID NO:318) para la cadena ligera) a una colección de secuencias de línea germinal humana y escogiendo la secuencia humana que muestre alta identidad de secuencia. Aquí, la secuencia de IGHV1-69*08 de la base de datos IMGT se eligió como la secuencia aceptora estructural de la cadena pesada (n.° acc. IMGT Z14309, SEQ ID NO:319), y la secuencia de IGKV3-11*01 (n.° acc. IMGT X01668, SEQ ID n O:320) se eligió para que fuera el aceptor estructural para la cadena ligera. Sobre estas dos estructuras aceptoras, se injertaron las tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de los dominios variables de la cadena pesada y ligera de ratón. Puesto que la región estructural 4 (FR4) no es parte de la región variable del gen V de línea germinal, la alineación para esa posición se realizó individualmente. La secuencia de JH4 se eligió para la cadena pesada, y la secuencia de j K2 se eligió para la cadena ligera.
11.1.2 Unión de diferentes variantes humanizadas de IgG T84.66 a células
La unión de diferentes variantes humanizadas de IgG T84.66 se sometió a prueba en células de adenocarcinoma gástrico humano que expresan CEA (MKN45, DSMZ ACC 409).
Las células se obtuvieron, se contaron, se comprobó su viabilidad y se resuspendieron a 2x106 células/ml en tampón FACS (100 pl de PBS BSA al 0,1 %). Se incubaron 100 pl de suspensión celular (que contiene 0,2x106 células) en una placa de 96 pocillos de fondo redondo durante 30 min a 4 °C con concentraciones crecientes de IgG CEA (4 ng/ml- 60 pg/ml), se lavó dos veces con PBS BSA al 0,1 % frío, se reincubó durante otros 30 min a 4 °C con el anticuerpo secundario específico del fragmento Fcg anti-IgG humana caprino fragmento F(ab')2 AffiniPure conjugado con PE (Jackson Immuno Research Lab PE n.° 109-116-170), se lavó dos veces con PBS, BSA al 0,1 % frío y se analizó de inmediato por FACS usando un FACS CantoII (Software FACS Diva). Las curvas de unión y los valores de CE50 se obtuvieron y calcularon usando GraphPadPrism5.
La figura 39 muestra el patrón de unión diferente de variantes humanizadas seleccionadas de la IgG T84.66 a CEA humano, expresado en células MKN45. En base a los valores de unión CE50 calculados (tabla 80), la variante humanizada 1 se seleccionó para evaluación adicional.
Tabla 80: unión de diferentes variantes humanizadas de IgG T84.66 a células (valores de CE50, en base a las curvas de unión mostradas en la figura 39, calculados por gráfica Pad Prism).
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La variante humanizada 1 se denomina a continuación T84.66-LCHA. Las secuencias de aminoácidos de sus CDR y de VH y VL así como las secuencias de aminoácidos del dominio VH y VL del clon T84.66 quimérico original se muestran en la tabla 81.
Tabla 81: secuencias de aminoácidos de los dominios variables del clon CEA T84.66-LCHA y su anticuerpo original T84.66
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11.2 Preparación de moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a CEA (T84.66-LCHA)
Los diferentes fragmentos de la secuencia de ADN que codifica parte del ectodominio (aminoácido 71-254 y 71-248) del ligando de 4-1BB humano se sintetizaron de acuerdo con la secuencia P41273 de la base de datos Uniprot (SEQ ID NO:42).
11.2.1 Preparación de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB (71-254) dirigido a CEA (T84.66-LCHA) monovalente con dominios CH1-CL cruzados con residuos cargados (construcción 5.1)
Un polipéptido que contiene dos ectodominios de ligando de 4-1BB (71-254), separados por conectores (G4S)2, y fusionados al dominio CL de IgG1 humana, se clonó como se representa en la figura 29A: ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, CL humano. Un polipéptido que contiene un ectodominio de ligando de 4-1BB (71-254) y fusionado al dominio CH de IgG1 humana, se clonó como se describe en la figura 29B: ligando de 4-1 BB humano, conector (G4S)2, CH humana.
Para mejorar el emparejamiento correcto se han introducido las siguientes mutaciones en el CH-CL cruzado. En el ligando de 4-1BB dimérico fusionado a CL humano, E123R y Q124K. En el ligando de 4-1BB monomérico fusionado a CH1 humano, K147E y K213E.
Las secuencias de ADN de la región variable de la cadena pesada y ligera que codifican una proteína fijadora específica para CEA, clon T84.66-LCHA, se subclonaron sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal o bien la cadena ligera constante de IgG1 humana. Las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala se han introducido en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores de Fc gamma de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO 2012/130831.
La combinación de ligando dimérico-cadena de botón de Fc que contiene las mutaciones S354C/T366W, la fusión de CH1 monomérica, anti-CEA dirigido-cadena de ojal de Fc que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V y cadena ligera anti-CEA permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando de 4-1BB trimérico ensamblado y un Fab de unión a CEA (figura 40, construcción 5.1).
La tabla 82 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-254) trimérico escindido dirigido a CEA(T84.66-LCHA) monovalente con CH-CL cruzado y residuos cargados (construcción 5.1).
Tabla 82: secuencias de ADNc y de aminoácidos de la fusión (kih) de Fc-ligando 4-1BB (71-254) trimérico escindido dirigido a CEA(T84.66-LCHA) monovalente que contiene cruces de CH-CL con residuos cargados (construcción 5.1). * para residuos cargados
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11.2.2 Preparación de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB (71-254) dirigido a CEA (T84.66-LCHA) monovalente con dominios CH1-CL cruzados sin residuos cargados (construcción 5.2)
Un polipéptido que contiene dos ectodominios de ligando de 4-1BB (71-254), separados por conectores (G4S)2, y fusionados al dominio CL de IgG1 humana, se clonó de forma análoga como se representa en la figura (29A), pero sin mutaciones aminoacídicas en el dominio CL: ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, CL humano. Un polipéptido que contiene un ectodominio de ligando de 4-1BB (71-254) y fusionado al dominio CH1 de IgG1 humana, se clonó de forma análoga como se representa en la figura (29B), pero sin mutaciones aminoacídicas en el dominio CH1: ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, CH1 humano.
Las secuencias de ADN de la región variable de la cadena pesada y ligera que codifican una proteína fijadora específica para CEA, clon T84.66-LCHA, se subclonaron sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal o bien la cadena ligera constante de IgG1 humana.
Las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala se han introducido en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores de Fc gamma de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO 2012/130831. La combinación de ligando dimérico-cadena de botón de Fc que contiene las mutaciones S354C/T366W, la fusión de CH1 monomérica, anti-CEA dirigido-cadena de ojal de Fc que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V y cadena ligera anti-CEA permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando de 4-1BB trimérico ensamblado y un Fab de unión a CEA (figura 40, construcción 5.2).
La tabla 83 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-254) trimérico escindido dirigido a CEA(T84.66-LCHA) monovalente que contiene un cruce de CH-CL cruzado sin residuos cargados (construcción 5.2).
Tabla 83: secuencias de ADNc y de aminoácidos de la fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-254) trimérico escindido dirigido a CEA (T84.66-LCHA) monovalente que contiene cruces de CH-CL sin residuos cargados (construcción 5.2).
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11.2.3 Preparación de la molécula unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB (71-254) dirigido a CEA (T84.66-LCHA) bivalente (construcción 5.3)
Un polipéptido que contiene dos ectodominios de ligando de 4-1BB (71-254), separados por conectores (G4S)2 se fusionó al extremo C de la cadena de ojal de Fc de IgG1 humana, como se representa en la figura 29C: ojal de Fc de IgG1 humana, conector (G4S)2, ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando de 4-1Bb humano. Un polipéptido que contiene un ectodominio de ligando de 4-1BB (71-254) y fusionado al extremo C de la cadena de botón de Fc de IgG1 humana como se describe en la figura 29D: botón de Fc de IgG1 humana, conector (G4S)2, ligando de 4-1 BB humano.
Las secuencias de ADN de la región variable de la cadena pesada y ligera que codifican una proteína fijadora específica para CEA, clon T84.66-LCHA, se subclonaron sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal, del botón o bien la cadena ligera constante de IgG1 humana. Las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala se han introducido en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores de Fc gamma de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO 2012/130831. La combinación de la cadena de ligando dimérico botón de huIgG1 anti-CEA que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V, la cadena de ligando monomérico botón de huIgG1 anti-CEA que contiene las mutaciones S354C/T366W y la cadena ligera anti-CEA permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando de 4-1BB trimérico ensamblado y dos Fab de unión a CEA (figura 40, construcción 5.3).
La tabla 84 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-254) trimérico escindido dirigido a CEA (T84.66-LCHA) bivalente (construcción 5.3).
Tabla 84: secuencias de ADNc y de aminoácidos de fusión PGLALA (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71­ 254) trimérico escindido dirigido a CEA(T84.66-LCHA) bivalente (construcción 5.3)
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11.2.4 Preparación de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB (71-248) dirigido a CEA(T84.66-LCHA) monovalente con dominios CH1-CL cruzados con residuos cargados (construcción 5.4)
Un polipéptido que contiene dos ectodominios de ligando de 4-1BB (71-248), separados por conectores (G4S)2, y fusionados al dominio CL de IgG1 humana, se clonó de forma análoga a lo representado en la figura 29A: ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, CL humano. Un polipéptido que contiene un ectodominio de ligando de 4-1BB (71-248) y fusionado al dominio CH de IgG1 humana, se clonó de forma análoga a la descrita en la figura 29B: ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, CH humana.
El polipéptido que codifica el ligando de 4-1BB dimérico fusionado al dominio CL humano se subclonó sin cambio de pauta de lectura con los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de IgG1 humana en el botón (Merchant, Zhu e t al., 1998). Para mejorar el emparejamiento correcto se han introducido las siguientes mutaciones en el CH-CL cruzado. En el ligando de 4-1BB dimérico fusionado a CL humano, E123R y Q124K. En el ligando de 4-1BB monomérico fusionado a CH1 humano, K147E y K213E.
Las secuencias de ADN de la región variable de la cadena pesada y ligera que codifican una proteína fijadora específica para CEA, clon T84.66-LCHA, se subclonaron sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal o bien la cadena ligera constante de IgG1 humana. Las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala se han introducido en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores de Fc gamma de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO 2012/130831. La combinación de ligando dimérico-cadena de botón de Fc que contiene las mutaciones S354C/T366W, la fusión de CH1 monomérica, anti-CD19 dirigido-cadena de ojal de Fc que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V y cadena ligera anti-CD19 permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando 4-1BB trimérico ensamblado y un Fab de unión a CEA (figura 40, construcción 5.4).
La tabla 85 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-248) trimérico escindido dirigido a CEA(T84.66-LCHA) monovalente con CH-CL cruzado y residuos cargados (construcción 5.4).
Tabla 85: secuencias de ADNc y de aminoácidos de la fusión (kih) de Fc-ligando 4-1BB (71-248) trimérico escindido dirigido a CEA(T84.66-LCHA) monovalente que contiene cruces de CH-CL con residuos cargados (construcción 5.4). * residuos cargados
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11.2.5 Preparación de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1 BB (71-248) dirigido a CEA(T84.66-LCHA) monovalente con dominios CH1-CL cruzados sin residuos cargados (construcción 5.5)
Un polipéptido que contiene dos ectodominios de ligando de 4-1BB (71-248), separados por conectores (G4S)2, y fusionados al dominio CL de IgG1 humana, se clonó de forma análoga como se representa en la figura (29A), pero sin mutaciones aminoacídicas en el dominio CL: ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, CL humano. Un polipéptido que contiene un ectodominio de ligando de 4-1BB (71-248) y fusionado al dominio CH1 de IgG1 humana, se clonó de forma análoga como se representa en la figura (29B), pero sin mutaciones aminoacídicas en el dominio CH1: ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, CH1 humano.
Las secuencias de ADN de la región variable de la cadena pesada y ligera que codifican una proteína fijadora específica para CEA, clon T84.66-LCHA, se subclonaron sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal o bien la cadena ligera constante de IgG1 humana. Las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala se han introducido en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores de Fc gamma de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO 2012/130831. La combinación de ligando dimérico-cadena de botón de Fc que contiene las mutaciones S354C/T366W, la fusión de CH1 monomérica, anti-CEA dirigido-cadena de ojal de Fc que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V y cadena ligera anti-CEA permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando 4-1BB trimérico ensamblado y un Fab de unión a CD19 (figura 40, construcción 5.5).
La tabla 86 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-248) trimérico escindido dirigido a CEA(T84.66-LCHA) monovalente que contiene un cruce de CH-CL cruzado sin residuos cargados (construcción 5.5).
Tabla 86: secuencias de ADNc y de aminoácidos de la fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-248) trimérico escindido dirigido a CEA (T84.66-LCHA) monovalente que contiene cruces de CH-CL sin residuos cargados (construcción 5.5).
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11.2.6 Preparación de la molécula unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB (71-248) dirigido a CEA (T84.66-LCHA) bivalente (construcción 5.6)
Un polipéptido que contiene dos ectodominios de ligando de 4-1BB (71-248), separados por conectores (G4S)2 se fusionó al extremo C de la cadena de ojal de Fc de IgG1 humana, como se representa en la figura 29C: ojal de Fc de IgG1 humana, conector (G4S)2, ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando de 4-1Bb humano. Un polipéptido que contiene un ectodominio de ligando de 4-1BB (71-254) y fusionado al extremo C de la cadena de botón de Fc de IgG1 humana como se describe en la figura 29D: botón de Fc de IgG1 humana, conector (G4S)2, ligando de 4-1BB humano.
Las secuencias de ADN de la región variable de la cadena pesada y ligera que codifican una proteína fijadora específica para CEA, clon T84.66-LCHA, se subclonaron sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal, del botón o bien la cadena ligera constante de IgG1 humana. Las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala se han introducido en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores de Fc gamma de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO 2012/130831. La combinación de la cadena de ligando dimérico botón de huIgG1 anti-CEA que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V, la cadena de ligando monomérico botón de huIgG1 anti-CEA que contiene las mutaciones S354C/T366W y la cadena ligera anti-CEA permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando de 4-1 BB trimérico ensamblado y dos Fab de unión a CEA (figura 40, construcción 5.6).
La tabla 87 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-248) trimérico escindido dirigido a CEA (T84.66-LCHA) bivalente (construcción 5.6).
Tabla 87: secuencias de ADNc y de aminoácidos de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-248) trimérico escindido dirigido a CEA (T84.66-LCHA) bivalente (construcción 5.6)
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11.2.7 Preparación de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB (71-254) dirigido a CEA(T84.66) monovalente con dominios CH1-CL cruzados con residuos cargados (construcción 5.7)
Un polipéptido que contiene dos ectodominios de ligando de 4-1BB (71-254), separados por conectores (G4S)2, y fusionados al dominio CL de IgG1 humana, se clonó como se representa en la figura 29A: ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, CL humano. Un polipéptido que contiene un ectodominio de ligando de 4-1BB (71-254) y fusionado al dominio CH de IgG1 humana, se clonó como se describe en la figura 29B: ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, CH humana.
Para mejorar el emparejamiento correcto se han introducido las siguientes mutaciones en el CH-CL cruzado. En el ligando de 4-1BB dimérico fusionado a CL humano, E123R y Q124K. En el ligando de 4-1BB monomérico fusionado a CH1 humano, K147E y K213E.
Las secuencias de ADN de la región variable de la cadena pesada y ligera que codifican una proteína fijadora específica para CEA, clon T84.66, se subclonaron sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal o bien la cadena ligera constante de IgG1 humana. Las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala se han introducido en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores de Fc gamma de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO 2012/130831.
La combinación de ligando dimérico-cadena de botón de Fc que contiene las mutaciones S354C/T366W, la fusión de CH1 monomérica, anti-CD19 dirigido-cadena de ojal de Fc que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V y cadena ligera anti-CD19 permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando de 4-1BB trimérico ensamblado y un Fab de unión a CEA. La construcción 5.7 corresponde a la construcción 5.1 como se muestra en la figura 40.
La tabla 88 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-254) trimérico escindido dirigido a CEA(T84.66) monovalente con CH-CL cruzado y residuos cargados (construcción 5.7).
Tabla 88: secuencias de ADNc y de aminoácidos de la fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-254) trimérico escindido dirigido a CEA(T84.66) monovalente que contiene CH-CL cruzado con residuos cargados (construcción 5.7). * para residuos cargados
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11.2.8 Preparación de la molécula unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de 4-1BB (71-254) dirigido a CEA (T84.66) bivalente (construcción 5.8)
Un polipéptido que contiene dos ectodominios de ligando de 4-1BB (71-254), separados por conectores (G4S)2 se fusionó al extremo C de la cadena de ojal de Fc de IgG1 humana, como se representa en la figura 29C: ojal de Fc de IgG1 humana, conector (G4S)2, ligando de 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando de 4-1Bb humano. Un polipéptido que contiene un ectodominio de ligando de 4-1BB (71-254) y fusionado al extremo C de la cadena de botón de Fc de IgG1 humana como se describe en la figura 29D: botón de Fc de IgG1 humana, conector (G4S)2, ligando de 4-1BB humano.
Las secuencias de ADN de la región variable de la cadena pesada y ligera que codifican una proteína fijadora específica para CEA, clon T84.66, se subclonaron sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal, del botón o bien la cadena ligera constante de IgG1 humana. Las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala se han introducido en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores de Fc gamma de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO 2012/130831. La combinación de la cadena de ligando dimérico botón de huIgG1 anti-CEA que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V, la cadena de ligando monomérico botón de huIgG1 anti-CEA que contiene las mutaciones S354C/T366W y la cadena ligera anti-CEA permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando de 4-1BB trimérico ensamblado y dos Fab de unión a CEA. La construcción 5.8 corresponde a la construcción 5.3 como se muestra en la figura 40.
La tabla 89 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-254) trimérico escindido dirigido a CEA (T84.66) bivalente (construcción 5.8).
Tabla 89: secuencias de ADNc y de aminoácidos de fusión PGLALA (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71­ 254) trimérico escindido dirigido a CEA(T84.66) bivalente (construcción 5.8)
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11.3 Preparación de moléculas de fusión de Fc-ligando de 4-1BB trimérico escindido no dirigido e IgG humana como moléculas de control
11.3.1 Preparación de moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen el trímero de ligando de 4-1BB humano no dirigido (moléculas de control)
Estas moléculas de control se prepararon como se describe anteriormente para la construcción dirigida a CEA 3.1 (denominada control B), 3.3 (denominada control C), 3.4 (denominada control D) y 3.5 (denominada control E) con la única diferencia de que la proteína fijadora anti-CD19 (VH-VL) se reemplazó por un control de línea germinal, denominado DP47, que no se une al antígeno (véase figura 40). Las secuencias de ADNc y de aminoácidos de control B, la fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-254) trimérico escindido no dirigido a DP47 monovalente que contiene CH-CL cruzado con residuos cargados, se muestran en la tabla 68 anterior (véase el ejemplo 7.3.1). La tabla 69 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la fusión (kih) de Fcligando de 4-1BB (71-254) trimérico escindido no dirigido a DP47 bivalente, control C. La tabla 70 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-248) trimérico escindido no dirigido a DP47 monovalente que contiene cruce de CH-CL con residuos cargados, control D. La tabla 71 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB (71-248) trimérico escindido no dirigido a DP47 monovalente sin residuos cargados en el cruce CH-CL, control E.
11.3.2 Anticuerpos como moléculas de control
Un control adicional usado en los ensayos, llamado control F, fue una IgG1 humana, control de línea germinal, DP47 no dirigido, que contiene las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala, para anular la unión a los receptores de Fc gamma. Las secuencias de ADNc y de aminoácidos de control F se pueden encontrar en la tabla 73 anterior.
11.4 Producción de moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc-ligando de 4-1BB trimérico escindido dirigido a CEA y sus moléculas de control
Las secuencias que codifican moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB trimérico escindido dirigido o no dirigido se clonaron en un vector plasmídico, que conduce la expresión del inserto de un promotor MPSV y contiene una secuencia de polyA sintética localizada en el extremo 3' de CDS. Además, el vector contiene una secuencia OriP de EBV para el mantenimiento episómico del plásmido.
La fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB trimérico escindido se produjo cotransfectando células HEK293-EBNA con los vectores de expresión de mamífero usando polietilenimina. Las células se transfectaron con los correspondientes vectores de expresión. Para las variantes 1,2,4,5 y sus controles B, D y E, en una proporción 1:1:1:1 ("vector ligando dimérico-CL-cadena de botón": "vector fusión de ligando monomérico-CH1": "vector Fab anti-CEA-cadena de ojal": "vector cadena ligera anti-CEA"). Para la variante 3, 6 y su control C, en una proporción 1:1:1 ("vector cadena de ligando dimérico ojal de Fc huIgG1": "vector cadena de ligando monomérico botón de Fc huIgG1": "vector cadena ligera anti-CEA"). Las IgG humanas, usadas como control en el ensayo, se produjeron como para la construcción biespecífica (para transfección solo se usaron un vector para cadena ligera y un vector para cadena pesada en una proporción 1:1).
Para la producción en matraces de agitación de 500 ml, se sembraron 300 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la transfección. Para la transfección, las células se centrifugaron durante 10 minutos a 210 x g, y el sobrenadante se reemplazó por 20 ml de medio CD CHO precalentado. Los vectores de expresión (200 pg de ADN total) se mezclaron en 20 ml de medio CD CHO. Después de la adición de 540 pl de PEI, la solución se agitó con vórtex durante 15 segundos y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de esto, las células se mezclaron con la solución de ADN/PEI, se transfirió a un matraz agitador 500 ml y se incubó durante 3 horas a 37 °C en un incubador con una atmósfera de CO2 al 5 %. Después de la incubación, se añadieron 160 ml de medio Excell complementado con L-glutamina 6 mM, 5 g/l de PEPSOY y ácido valproico 1,2 mM y las células se cultivaron durante 24 horas. Un día después de la transfección, se añadió Feed al 12 % (aminoácido y glucosa). Después de cultivar durante 7 días, el sobrenadante se recogió por centrifugación durante 30-40 minutos al menos 400 x g. La solución se filtró de forma estéril (filtro 0,22 pm), complementado con acida de sodio hasta una concentración final de 0,01 % (p/v), y se mantuvo a 4 °C.
La fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB trimérico escindido, así como la IgG, se purificó se purificó de los sobrenadantes de cultivo celular por cromatografía de afinidad usando proteína A, seguido de cromatografía de exclusión por tamaño. Para la cromatografía de afinidad, el sobrenadante se cargó en una columna MabSelect Sure (CV = 5-15 ml, resina de GE Healthcare) equilibrada con tampón de fosfato de sodio (20 mM), citrato de sodio (20 mM) (pH 7,5). La proteína no unida se retiró lavando con al menos 6 volúmenes de columna del mismo tampón. La proteína unida se eluyó usando un gradiente lineal (20 VC) o bien una elución en etapas (8 VC) con tampón de citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 100 mM, glicina 100 mM (pH 3,0). Para el gradiente lineal, se aplicó una elución en etapas adicional de 4 volúmenes de columna.
El pH de fracciones recogidas se ajustó añadiendo 1/10 (v/v) de fosfato de sodio 0,5 M, pH 8,0. La proteína se concentró antes de cargarse en una columna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada con solución de histidina 20 mM, cloruro de sodio 140 mM, Tween20 al 0,01 % (v/v) de pH 6,0.
La concentración de proteína se determinó midiendo la densidad óptica (DO) a 280 nm, usando un coeficiente de extinción molar calculado en base a la secuencia de aminoácidos. La pureza y el peso molecular de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB trimérico dirigido se analizó por SDS-PAGE en presencia y ausencia de un agente reductor (5 mM 1,4-ditiotreitol) y tinción con Coomassie SimpleBlue™ SafeStain (Invitrogen USA) o CE-SDS usando Caliper LabChip GXII (Perkin Elmer). El contenido en agregado de muestras se analizó usando una columna de exclusión por tamaño analítica TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) equilibrada en un tampón de migración de K2HPO425 mM, NaCl 125 mM, monoclorhidrato de L-arginina 200 mM, NaN3 al 0,02 % (p/v), pH 6,7 a 25 °C.
La tabla 90 resume el rendimiento y contenido en monómero final de las moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB trimérico escindido dirigido a CEA.
Tabla 90: Análisis bioquímico de la fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB trimérico escindido dirigido a CEA.
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La tabla 91 resume el rendimiento y contenido en monómero final de las moléculas de fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB trimérico escindido no dirigido a DP47, tanto monovalente (control B, D y E) como bivalente (control C), y de la línea germinal DP47, PGLALA huIgG1 (control F).
Tabla 91: Análisis bioquímico de la fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB trimérico escindido no dirigido a DP47
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Ejemplo 12
Caracterización funcional de las moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a CEA
12.1 Resonancia de plasmón superficial (unión simultánea)
Producción de huNA3B3A2 como antígeno para construcciones de 4-1BBL escindido trimérico dirigido a CEA El antígeno usado para evaluar la unión por RPS a CEA fue una molécula híbrida compuesta de los dominios A3 y B3 de CEACAM5 humana (CEA) y los dominios N y A2 de CEACAM1 humana (b Gp 1 ) de forma similar a lo que se ha descrito para NABA (Durbin H. et al, Proc Natl Acad Sci USA. 1994, 10 mayo; 91(10):4313-7). El antígeno se denomina aquí NA3B3A2 y una descripción esquemática se puede encontrar en la figura 41 A . La tabla 92 muestra las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de NA3B3A2 hu-avi-His.
Tabla 92: Secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de NA3B3A2 hu-avi-His
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La producción de proteínas se realizó como se describe anteriormente para la proteína de fusión a Fc (ejemplo 7.1.1). Las proteínas secretadas se purificaron de los sobrenadantes de cultivo celular por cromatografía con quelante, seguido de cromatografía de exclusión por tamaño. La primera etapa cromatográfica se realizó en un NiNTA Superflow Cartridge (5 ml, Qiagen) equilibrado en fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 500 nM, pH7,4. La elución se realizó aplicando un gradiente sobre 12 volúmenes de columna del 5 % al 45 % de tampón de elución (fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 500 nM, imidazol 500 mM, pH7,4).
La proteína se concentró y se filtró antes de cargarse en una columna HiLoad Superdex 75 (GE Healthcare) equilibrada con histidina 20 mM, NaCl 140 mM, Tween-20 al 0,01 % pH 6,0. La tabla 93 resume el rendimiento y contenido en monómero final de NA3B3A2 humano-avi-His.
Tabla 93: Análisis bioquímico de NA3B3A2 humano-avi-His
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La capacidad de unión simultánea de (kih) de Fc-4-1 BB humano y NA3B3A2 humano se evaluó por resonancia de plasmón superficial (RPS). Todos los experimentos de RPS se realizaron en un Biacore T200 a 25 °C con HBS-EP como tampón de migración (HEp Es 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,005 %, Biacore, Friburgo/Alemania). (kih) de Fc-4-1BB humano biotinilado se acopló directamente a una cubeta de flujo de un chip de sensor de estreptavidina (SA). Se usaron niveles de inmovilización de hasta 250 unidades de resonancia (UR).
Las construcciones de 4-1BBL escindido trimérico dirigido a CEA (construcciones 5.4, 5.6, 5.7 y 5.8) se pasaron en un intervalo de concentraciones de 200 nM con un flujo de 30 pl/minuto a través de las cubetas de flujo durante 90 segundos y la disociación se fijó a cero segundos. Se inyectó NA3B3A2 humano como segundo analito con un flujo de 30 pl/minuto a través de las cubetas de flujo durante 90 segundos a una concentración de 500 nM (figura 41B). Se realizó el seguimiento de la disociación durante 120 segundos. Se corrigieron las diferencias en el índice de refracción aparente restando la respuesta obtenida en una cubeta de lectura de referencia, donde no se inmovilizó proteína.
Como se puede ver en las gráficas de la figura 42, todas las construcciones biespecíficas pudieron unir simultáneamente 4-1BB humano y NA3B3A2 humano.
12.2 Unión en PBMC humanas activadas de las moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a CEA
Para determinar la unión de moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de 4­ 1 BBL a PBMC humanas, se usaron diferentes concentraciones valoradas de las moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de 4-1BBL dirigido a CEA en el ensayo como se describe en el ejemplo 5.2.
La figura 43 muestra la unión de construcciones 5.4, 5.6, 5.7 y 5.8 como se prepara en el ejemplo 11 en linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+ que expresan 4-1BB activados, respectivamente. Las ventanas de adquisición se establecieron en linfocitos T CD45+ CD3+ CD4+ o CD45+ CD3+ CD8+ vivos y las MFI del fragmento F(ab')2 de cabra específico de fragmento Fcy IgG anti-IgG humana AffiniPure conjugado con PE se representaron frente a la concentración valorada de variantes de fusión de Fc-ligando de 4-1BB trimérico escindido dirigido. La tabla 94 muestra los valores de CE50 medidos para las construcciones 5.4, 5.6, 5.7 y 5.8 y moléculas de control.
Tabla 94: unión en linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+ que expresan 4-1BB activados
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12.3 Unión a células tumorales que expresan CEA
Para los ensayos de unión en células tumorales que expresan CEA, se usaron las siguientes líneas celulares de linfoma que expresan CEA humano: líneas celulares tumorales que expresan CEA línea celular de cáncer gástrico humano MKN-45 (ATCC TCP-1008) y línea celular de adenocarcinoma colorrectal humano LS180 (ATCC CL-187). Los ensayos se preformaron como se describe para las líneas celulares tumorales MV-3 y WM-266-4 que expresan FAP en el ejemplo 5.3.
Las ventanas de adquisición se establecieron en células tumorales vivas y las MFI del fragmento F(ab')2 de cabra específico de fragmento Fcy IgG anti-IgG humana AffiniPure conjugado con PE se representaron frente a la concentración valorada de construcciones de fusión de Fc-ligando de 4-1BB trimérico escindido dirigido.
La figura 44 muestra la unión de construcciones 5.7 como se prepara en el ejemplo 11.2.7 a la línea celular de cáncer gástrico humano que expresa CEA humano MKN-45 (izquierda) y línea celular de adenocarcinoma colorrectal humano LS180 (derecha). La tabla 95 muestra los valores de CE50 medidos para la línea celular gástrica humana que expresa CEA humano MKN-45.
Tabla 95: Unión a células tumorales que expresan CEA
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Ejemplo 13
Actividad biológica de las moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a CEA
13.1. Activación de NF-kB en células HeLa que expresan 4-1 BB humano
Las células HeLa que expresan 4-1 BB humano y NF-KB-luciferasa se generaron como se describe en el ejemplo 6.1.
Activación de NF-kB en células HeLa que expresan 4-1BB humano cocultivadas con células tumorales que expresan CEA humano
Las células HeLa con 4-1BB humano de NF-KB-luciferasa se obtuvieron y se resuspendieron en medio DMEM suministrado con FBS al 10 % (v/v) y GlutaMAX-I al 1 % (v/v) hasta una concentración de 0,2 x 106 células/ml.
100 pl (2 x 104 células) de esta suspensión celular se transfirieron a cada pocillo de una placa de cultivo tisular de fondo plano de 96 pocillos blanca estéril con tapa (Greiner bio-one, n.° cat. 655083) y la placa se incubó a 37 °C y CO2 al 5 % durante la noche. Al día siguiente se añadieron 50 pl de medio que contiene concentraciones valoradas de moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a CEA (trímero de 4-1BBL escindido de CEA) o moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB no dirigido a DP47 (trímero de 4-1BBL escindido de DP47). Las líneas celulares tumorales que expresan CEA, la línea celular de cáncer gástrico humano MKN-45 (ATCC TCP-1008) se resuspendió en medio DMEM suministrado con FBS al 10 % (v/v) y GlutaMAX-I al 1 % (v/v) hasta una concentración de 2 x 106 células/ml.
Se añadieron suspensión de células de linfoma de linfocitos B que expresan CEA (50 pl, proporción final 1:5) o solo medio a cada pocillo y las placas se incubaron durante 6 horas a 37 °C y CO2 al 5 %. Las células se lavaron dos veces con 200 pl/pocillo de DPBS. Se añadieron 40 pl de tampón Reporter Lysis Buffer (Promega, n.° cat.: E3971) recién preparado a cada pocillo y las placas se almacenaron durante la noche a -20 °C. Al día siguiente las placas de células congeladas y el tampón de detección (sistema Luciferase 1000 Assay System, Promega, n.° cat. E4550) se descongelaron a temperatura ambiente. Se añadieron 100 pl de tampón de detección a cada pocillo y la actividad de luciferasa se midió lo más rápido posible usando un lector de microplacas SpectraMax M5/M5e y un programa informático SoftMax Pro Software (Molecular Devices) que cuenta la emisión de luz en URL (unidades de luz liberada durante 0,5 s/pocillo) o lector de placas Victor3 1420 Multilabel Counter (Perkin Elmer) y el programa informático Perkin Elmer 2030 Manager Software que cuenta la emisión de luz como recuentos por segundos (CPS) y se representó frente a la concentración de las construcciones sometidas a prueba.
Las moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB dirigido a CEA, construcciones 5.7 y 5.8, desencadenaron la activación de la vía de señalización de NF-kB en la línea celular indicadora en presencia de células MKN-45 de línea celular de cáncer gástrico humano. Por el contrario, las moléculas de control no dirigidas no desencadenan un efecto de este tipo a cualquiera de las concentraciones sometidas a prueba (figura 45). La tabla 96 muestra los correspondientes valores de CE50.
Tabla 96: Unión a células tumorales que expresan CEA
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Ejemplo 14
14.1 Preparación de moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de ligando de Ox 40 dirigido a FAP
La secuencia de ADN que codifica parte del ectodominio (aminoácidos 51-183) del ligando de OX40 humano se sintetizó de acuerdo con la secuencia P23510 de la base de datos Uniprot. Para disminuir la heterogeneidad del ligando de Ox40 humano debido a glucosilación se mutaron residuos de asparagina en la posición 90 y 114 a ácido aspártico por mutagénesis dirigida a sitio (de acuerdo con Compaan D.M., Hymowitz S.G., Structure (2006) 14(8), 1321-30).
Un polipéptido que contiene dos ectodominios de ligando de OX40, separados por conectores (G4S)2, y fusionados al dominio CL de IgG1 humana, se clonó como se representa en la figura 46A: ligando de OX40 humano, conector (G4S)2, ligando de OX40 humano, conector (G4S)2, CL humano.
Un polipéptido que contiene un ectodominio de ligando de OX40 y fusionado al dominio CH de IgG1 humana, se clonó como se describe en la figura 46B: ligando de OX40 humano, conector (G4S)2, CH humana.
Para mejorar el emparejamiento correcto se han introducido las siguientes mutaciones en el CH-CL cruzado. En el ligando de 4-1BB dimérico fusionado a CL humano, E123R y Q124K. En el ligando de 4-1BB monomérico fusionado a CH1 humano, K147E y K213E.
La generación y preparación de las proteínas fijadoras de FAP se describe en el documento WO 2012/020006 A2, que se incorpora en el presente documento por referencia.
Las secuencias de ADN de la región variable de la cadena pesada y ligera que codifican una proteína fijadora específica para FAP, clon 28H11, se subclonaron sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal o bien la cadena ligera constante de IgG1 humana. Las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala se han introducido en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores de Fc gamma de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO 2012/130831.
Combinación de ligando dimérico-cadena de botón de Fc que contiene las mutaciones S354C/T366W, la fusión de CH1 monomérica, anti-FAP dirigido-cadena de ojal de Fc que contiene las mutaciones Y349C/T366S/F368A/Y407V y cadena ligera anti-FAP permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando de OX40 trimérico ensamblado y un Fab de unión a FAP (figura 46C, construcción 6.1).
La tabla 97 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc-ligando de OX40 (51-183) trimérico escindido dirigido a CEA(T84.66-LCHA) monovalente con CH-CL cruzado y residuos cargados (construcción 6.1).
Tabla 97: secuencias de ADNc y de aminoácidos de la fusión (kih) de Fc-ligando de OX40 trimérico escindido dirigido a FAP(28H1) monovalente que contiene cruces de CH-CL con residuos cargados (construcción 6.1). * para residuos cargados
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14.2 Preparación de IgG1 humana no dirigida como control F
Una molécula de control usada en los ensayos, llamada control F (figura 46D), fue una IgG1 humana, control de línea germinal, DP47 no dirigido, que contiene las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala, para anular la unión a los receptores de Fc gamma de acuerdo con el procedimiento descrito en la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 2012/130831). Su preparación se describe en el ejemplo 2.3. La tabla 29 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de PGLALA huIgG1, DP47 no dirigido (control F).
14.3 Producción de moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc-ligando de OX40 trimérico escindido dirigido a FAP y sus moléculas de control
Las secuencias que codifican fusiones (kih) de Fc-ligando de OX40 trimérico escindido dirigido o no dirigido se clonaron en un vector plasmídico, que conduce la expresión del inserto de un promotor MPSV y contiene una secuencia de polyA sintética localizada en el extremo 3' de CDS. Además, el vector contiene una secuencia OriP de EBV para el mantenimiento episómico del plásmido.
La fusión (kih) de Fc-ligando de Ox40 trimérico escindido se produjo cotransfectando células HEK293-EBNA con los vectores de expresión de mamífero usando polietilenimina. Las células se transfectaron con los correspondientes vectores de expresión. Para las variantes 1,2,4,5 y sus controles B, D y E, en una proporción 1:1:1:1 ("vector ligando dimérico-CL- cadena de botón": "vector fusión de ligando monomérico-CH1": "vector Fab anti-FAP-cadena de ojal": "vector cadena ligera anti-FAP"). Para la variante 3, 6 y su control C, en una proporción 1:1:1 ("vector cadena de ligando dimérico ojal de Fc huIgG1": "vector cadena de ligando monomérico botón de Fc huIgG1": "vector cadena ligera anti-FAP"). Las IgG humanas, usadas como control en el ensayo, se produjeron como para la construcción biespecífica (para transfección solo se usaron un vector para cadena ligera y un vector para cadena pesada en una proporción 1:1).
Para la producción en matraces de agitación de 500 ml, se sembraron 300 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la transfección. Para la transfección, las células se centrifugaron durante 10 minutos a 210 x g, y el sobrenadante se reemplazó por 20 ml de medio CD CHO precalentado. Los vectores de expresión (200 pg de ADN total) se mezclaron en 20 ml de medio CD CHO. Después de la adición de 540 pl de PEI, la solución se agitó con vórtex durante 15 segundos y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de esto, las células se mezclaron con la solución de ADN/PEI, se transfirió a un matraz agitador 500 ml y se incubó durante 3 horas a 37 °C en un incubador con una atmósfera de CO2 al 5 %. Después de la incubación, se añadieron 160 ml de medio Excell complementado con L-glutamina 6 mM, 5 g/l de PEPSOY y ácido valproico 1,2 mM y las células se cultivaron durante 24 horas. Un día después de la transfección, se añadió Feed al 12 % (aminoácido y glucosa). Después de cultivar durante 7 días, el sobrenadante se recogió por centrifugación durante 30-40 minutos al menos 400 x g. La solución se filtró de forma estéril (filtro 0,22 pm), complementado con acida de sodio hasta una concentración final de 0,01 % (p/v), y se mantuvo a 4 °C.
La molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc-ligando de OX40 trimérico escindido, así como la IgG, se purificó se purificó de los sobrenadantes de cultivo celular por cromatografía de afinidad usando proteína A, seguido de cromatografía de exclusión por tamaño. Para la cromatografía de afinidad, el sobrenadante se cargó en una columna MabSelect Sure (CV = 5-15 ml, resina de GE Healthcare) equilibrada con tampón de fosfato de sodio (20 mM), citrato de sodio (20 mM) (pH 7,5). La proteína no unida se retiró lavando con al menos 6 volúmenes de columna del mismo tampón. La proteína unida se eluyó usando un gradiente lineal (20 VC) o bien una elución en etapas (8 VC) con tampón de citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 100 mM, glicina 100 mM (pH 3,0). Para el gradiente lineal, se aplicó una elución en etapas adicional de 4 volúmenes de columna.
El pH de fracciones recogidas se ajustó añadiendo 1/10 (v/v) de fosfato de sodio 0,5 M, pH 8,0. La proteína se concentró antes de cargarse en una columna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada con solución de histidina 20 mM, cloruro de sodio 140 mM, Tween20 al 0,01 % (v/v) de pH 6,0.
La concentración de proteína se determinó midiendo la densidad óptica (DO) a 280 nm, usando un coeficiente de extinción molar calculado en base a la secuencia de aminoácidos.
La pureza y el peso molecular de la fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB trimérico dirigido se analizó por SDS-PAGE en presencia y ausencia de un agente reductor (5 mM 1,4-ditiotreitol) y tinción con Coomassie SimpleBlue™ SafeStain (Invitrogen USA) o CE-SDS usando Caliper LabChip GXII (Perkin Elmer). El contenido en agregado de muestras se analizó usando una columna de exclusión por tamaño analítica TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) equilibrada en un tampón de migración de K2HPO425 mM, NaCl 125 mM, monoclorhidrato de L-arginina 200 mM, NaN3 al 0,02 % (p/v), pH 6,7 a 25 °C.
La tabla 98 resume el rendimiento y contenido en monómero final de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc-ligando de Ox40 trimérico escindido dirigido a FAP, y de la línea germinal DP47, PGLALA huIgG1 (control F).
Tabla 98: Análisis bioquímico de la fusión (kih) de Fc-ligando de 4-1BB trimérico escindido dirigido a CEA.
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Ejemplo 15
Caracterización funcional de la molécula de unión a antígeno de fusión de Fc que contiene un trímero de ligando de OX40 dirigido
15.1 Unión a células tumorales que expresan FAP humana
La unión a FAP de superficie celular se sometió a prueba usando células WM-266-4 (ATCC CRL-1676). Se añadieron 0,5 x 105 células WM-266-4 que expresan FAP a cada pocillo de placas de 96 pocillos de células en suspensión de fondo redondo (Greiner bio-one, cellstar, n.° cat. 650185). Las células se tiñeron durante 120 minutos a 4 °C en la oscuridad en 50 pl/pocillo de tampón FACS frío a 4 °C (DPBS (Gibco por Life Technologies, n.° cat. 14190 326) con BSA (0,1 % v/p, Sigma-Aldrich, n.° cat. A9418) que contiene la construcción de anticuerpo anti-Ox40 valorada. Después de lavar tres veces con exceso tampón FACS en exceso, las células se tiñeron durante 45 minutos a 4 °C en la oscuridad en 25 pl/pocillo de tampón FACS frío a 4 °C que contiene fragmento F(ab')2 de IgG de cabra específico del fragmento Fcy anti-IgG humana AffiniPure conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Jackson ImmunoResearch, n.° cat. 109096098).
Las placas se resuspendieron finalmente en 90 pl/pocillo de tampón FACS que contiene 0,2 pg/ml de DAPI (Santa Cruz Biotec, n.° cat. Sc-3598) y se adquirieron el mismo día usando 5-Laser LSR-Fortessa (BD Bioscience con programa informático DIVA).
Como se muestra en la figura 47A, la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc-ligando de Ox40 trimérico escindido dirigido a FAP(28H1) monovalente (FAP-OX40L) pero no el control negativo F se unió eficazmente a células diana que expresan FAP humana. Los valores de CE50 de la unión a WM-266-4 positivas para FAP fueron [6,9 nM].
15.2 Unión a células tumorales negativas para OX40 y FAP
La falta de unión a células tumorales negativas para OX40 se sometió a prueba usando células A549 NucLight™ Red (Essenbioscience, n.° cat. 4491) que expresan la proteína fluorescente NucLight Red restringida al núcleo para permitir la separación de las células WM266-4 positivas para FAP humana no marcadas. Se transdujeron A549 originales (ATCC CCL-185) con Essen CellPlayer NucLight Red Lentivirus (Essenbioscience, n.° cat. 4476; EF1a, puromicina) a una MOI de 3 (TU/célula) en presencia de 8 pg/ml de polibreno siguiendo el protocolo de Essen estándar.
Se añadió una mezcla de 5 x 104 células WM266-4 no marcadas y células A549 NucLight™ Red no marcadas en tampón FACS a cada pocillo de una placas de 96 pocillos de suspensión celular de fondo redondo y se realizó el ensayo de unión como se describe en sección 15.1.
Como se muestra en la figura 47B, FAP-OX40L no se unió a células tumorales humanas negativas para FAP negativas para OX40.
15.3 Unión a células que expresan OX40 humano: leucocitos mononucleares en sangre periférica (PBMC) humanos indiferenciados y activados
Las placas leucoplaquetarias se obtuvieron del centro de donación de sangre de Zúrich. Para aislar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) recién obtenidas, la placa leucoplaquetaria se diluyó con el mismo volumen de DPBS (Gibco por Life Technologies, n.° cat. 14190326). A tubos de centrífuga de polipropileno de 50 ml (TPP, n.° cat. 91050) se les suministraron 15 ml de Histopaque 1077 (SIGMA Life Science, n.° cat. 10771, polisacarosa y diatrizoato de sodio, ajustado hasta una densidad de 1,077 g/ml) y la solución de placa leucoplaquetaria se estratificó sobre Histopaque 1077. Los tubos se centrifugaron durante 30 min a 400 x g, temperatura ambiente y con baja aceleración y sin descomposición. Después de esto, las PBMC se recogieron de la interfase, se lavó tres veces con DPBS y se resuspendió en medio de linfocitos T que consiste en medio RPMI 1640 (Gibco por Life Technology, n.° cat. 42401-042) suministrado con suero fetal bovino al 10 % (FBS, Gibco por Life Technology, n.° cat. 16000-044, Lot 941273, con irradiación gamma, sin micoplasma e inactivado con calor a 56 °C durante 35 min), GlutaMAX I al 1 % (v/v) (GIBCO por Life Technologies, n.° cat. 35050038), piruvato de sodio 1 mM (SIGMA, n.° cat. S8636), aminoácidos no esenciales MEM al 1 % (v/v) (SIGMA, n.° cat. M7145) y p-mercaptoetanol 50 pM (SIGMA, M3148).
Se usaron PBMC directamente después del aislamiento (unión a PBMC humanas en reposo) o se estimularon para recibir una expresión de Ox40 humano fuerte en la superficie celular de linfocitos T (unión en PBMC humanas activadas). Por lo tanto, se cultivaron PBMC indiferenciadas durante cuatro días en medio de linfocitos T suministrado con 200 U/ml de proleucina (Novartis) y 2 ug/ml de PHA-L (Sigma-Aldrich, L2769-10) en una placa de cultivo tisular de 6 pocillos y a continuación durante la noche en placas de cultivo tisular de 6 pocillos prerrecubiertas [4 ug/ml] de anti-CD3 humano (clon OKT3, eBioscience, n.° cat. 16-0037-85) y [2 ug/ml] de anti-CD28 humano (clon CD28.2, eBioscience, n.° cat. 16-0289-85] en medio de linfocitos T suministrado con 200 U/ml de proleucina a 37 °C y CO2 al 5 %.
Para la detección de Ox40 se mezclaron PBMC humanas indiferenciadas y PBMC humanas activadas. Para permitir la distinción de PBMC humanas indiferenciadas de activadas, las células indiferenciadas se marcaron antes del ensayo de unión usando el tinte de proliferación celular eFluor670 (eBioscience, n.° cat.65-0840-85).
Para el marcaje, las células se obtuvieron, se lavaron con DPBS precalentado (37 °C) y se ajustaron a una densidad celular de 1 x 107 células/ml en DPBS. Se añadió tinte de proliferación celular eFluor670 (eBioscience, n.° cat. 65-0840-85) a la suspensión de PBMC humanas indiferenciadas a una concentración final de 2,5 mM y una densidad celular final de 0,5 x 107 células/ml en DPBS. A continuación, las células se incubaron durante 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Para parar la reacción de marcaje, se añadieron 4 ml de FBS inactivado con calor y las células se lavaron tres veces con medio de linfocitos T. Una mezcla de dos a uno de 1 x 105 PBMC humanas marcadas con eFluor670 en reposo y 0,5 x 105 PBMC humanas activadas no marcadas se añadió a continuación a cada pocillo de placas de 96 pocillos de suspensión celular de fondo redondo (Greiner bio-one, cellstar, n.° cat. 650185).
Las células se tiñeron durante 120 minutos a 4 °C en la oscuridad en 50 pl/pocillo de tampón FACS frío a 4 °C que contiene las construcciones de anticuerpo anti-Ox40 valoradas. Después de lavar tres veces con tampón FACS en exceso, las células se tiñeron durante 45 minutos a 4 °C en la oscuridad en 25 pl/pocillo de tampón FACS frío a 4 °C que contiene una mezcla de anti-CD4 humano marcado fluorescentemente (clon RPA-T4, IgG1 k de ratón, BioLegend, n.° cat. 300532), anti-CD8 humano (clon RPa-T8, IgG1 k de ratón, BioLegend, Cat.-n.° 3010441) y fragmento F(ab')2 de IgG de cabra específico del fragmento Fcy anti-IgG humana AffiniPure conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Jackson ImmunoResearch, n.° cat. 109-096-098).
Las placas se resuspendieron finalmente en 90 pl/pocillo de tampón FACS que contiene 0,2 pg/ml de DAPI (Santa Cruz Biotec, n.° cat. Sc-3598) y se adquirieron el mismo día usando 5-Laser LSR-Fortessa (BD Bioscience con programa informático DIVA).
Como se muestra en las figuras 48A y 48 B, FAP-OX40L no se unió a linfocitos T CD4+ o linfocitos T CD8+ humanos en reposo, que fueron negativos para OX40. Por el contrario, FAP-OX40L se unió a linfocitos T CD8+ o CD4+ activados, que sí expresan OX40. La unión a linfocitos T CD4+ fue mucho más fuerte que a linfocitos T CD8+. Los linfocitos T CD8+ humanos activados expresan solo una fracción de los niveles de OX40 detectados en linfocitos T CD4+ activados. Los niveles de expresión para OX40 dependen de la cinética y fuerza de estimulación y condiciones se optimizaron aquí para la expresión de OX40 en linfocitos T CD4+ pero no para linfocitos T CD8+. Por tanto, solo se indujo una poca expresión de OX40 en linfocitos T CD8. El valor de CE50 de unión a linfocitos T CD4+ o CD8+ positivos para OX40 fue de [0,15 nM],
15.4 Activación de NFkB en células HeLa que expresan OX40 humano y gen indicador NFkB-luciferasa
La unión agonista de Ox40 a su ligando induce señalización hacia 3' por medio de la activación de factor nuclear kappa B (NF k B) (A. D. Weinberg e t al., J. Leukoc. Biol. 2004, 75(6), 962-972). La línea celular indicadora recombinante HeLa_hOx40_NFkB_Luc1 se generó para expresar Ox40 humano en su superficie. Adicionalmente, alberga un plásmido indicador que contiene el gen de la luciferasa bajo el control de un segmento potenciador sensible a NFkB. El desencadenamiento de Ox40 induce activación dependiente de la dosis de NFkB, que se transloca en el núcleo, donde se une en el potenciador sensible a NFkB del plásmido indicador para incrementar la expresión de la proteína luciferasa. La luciferasa cataliza la oxidación de luciferina dando como resultado oxiluciferina que emite luz. Esto se puede cuantificar por un luminómetro. Por tanto, la capacidad de las diversas moléculas anti-Ox40 para inducir la activación de NFkB en células indicadoras HeLa_hOx40_NFkB_Lucl se analizó como medida para la bioactividad.
Se obtuvieron células HeLa_hOx40_NFkB_Luc1 adherentes usando tampón de disociación celular (Invitrogen, n.° cat. 13151-014) durante 10 minutos a 37 °C. Las células se lavaron una vez con DPBS y se ajustaron a una densidad celular de 1,33x105 en medio de ensayo que comprende MEM (Invitrogen, n.° cat. 22561-021), FBS inactivado con calor al 10 % (v/v), piruvato de sodio 1 mM y aminoácidos no esenciales al 1 % (v/v). Las células se sembraron en una densidad de 0,2* 105 células por pocillo en una placa de cultivo tisular de fondo plano de 96 pocillos blanca estéril con tapa (Greiner bio-one, n.° cat. 655083) y se mantuvo durante la noche a 37 °C y CO2 al 5 % en un incubador (Hera Cell 150).
Al día siguiente, se estimularon HeLa_hOx40_NFkB_Luc1 durante 5 horas añadiendo medio de ensayo que contiene FAP-Ox40L valorada o control negativo F. Para someter a prueba el efecto de hiperreticulación en anticuerpos anti-Ox40, se añadieron 25 pl/pocillo de medio que contiene anticuerpo secundario fragmento F(ab')2 de IgG de cabra específico de Fcy anti-IgG humana (Jackson ImmunoResearch, 109- 006-098) en una proporción 1:2 (2 veces más anticuerpo secundario que anticuerpo primario). Después de la incubación, se aspiró el sobrenadante y las placas se lavaron dos veces con DPBS. La cuantificación de emisión de luz se realizó usando el sistema de ensayo Luciferase 100 y el tampón de lisis indicador (ambos de Promega, n.° cat. E4550 y n.° cat.: E3971) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, las células se lisaron durante 10 minutos a -20 °C por adición de 30 ul por pocillo 1x tampón de lisis. Las células se descongelaron durante 20 minutos a 37 °C antes de añadir 90 ul por pocillo de reactivo de ensayo de luciferasa proporcionado. La emisión de luz se cuantificó de inmediato con un
lector de microplacas SpectraMax M5/M5e (Molecular Devices, EE. UU.) usando 500 ms de tiempo de integración, sin ningún filtro que recoja todas las longitudes de onda. Se corrigieron las unidades de luz relativa emitida (URL) por luminiscencia basal de células HeLa_hOx40_NFkB_Lucl y se representaron frente a la concentración de anticuerpo primario logarítmica usando Prism4 (GraphPad Software, EE. UU.). Las curvas se ajustaron usando la respuesta a la dosis sigmoidal incorporada.
Como se muestra en la figura 49, la activación de NFkB dependiente de la dosis limitada ya se indujo por adición de FAP-Ox40L (lado izquierdo) a la línea celular indicadora. La hiperreticulación de FAP-Ox40L por anticuerpos secundarios específicos de anti-IgG humana incrementó la inducción de activación de luciferasa mediada por NFkB de manera dependiente de la concentración (lado derecho).
En consecuencia, se sometió a prueba la capacidad activadora de NFkB de FAP-Ox40L con hiperreticulación de las construcciones por líneas celulares tumorales FAP+.
La línea celular tumoral sometida a prueba fue NIH/3T3-clon 39 huFAP. Se generó NIH/3T3-clon 39 huFAP por la transfección de la línea celular NIH/3T3 de fibroblastos embrionarios de ratón (ATCC CRL- 1658) con el vector de expresión pETR4921 para expresar huFAP en 1,5 pg/ml de selección de puromicina. La expresión superficial de FAP se cuantificó usando el Quifikit (Dako n.° cat. K0078) de acuerdo con las instrucciones de fabricante. El anticuerpo primario usado para detectar la expresión de FAP en la superficie celular fue el clon de reactividad cruzada humano/ratón F11-24 (IgG1 de ratón, Calbiochem, n.° cat. OP188). La expresión superficial en NIH/3T3-clon 39 huFAP fue de aprox. 90000 huFAP por célula.
Como se describe en el presente documento anteriormente, se cultivaron células HeLa_hOx40_NFkB_Lucl adherentes durante la noche a una densidad celular de 0,2* 105 células por pocillo y se estimularon durante 5 horas con medio de ensayo que contiene FAP-Ox40L valorada. Para someter a prueba el efecto de hiperreticulación por unión de FAP en la superficie celular FAP se cocultivaron 25 pl/pocillo de medio que contiene células tumorales FAP+ NIH/3T3-clon 39 huFAP en una proporción 3 a 1 (tres veces tantas células tumorales FAP+ que células indicadoras por pocillo). Se cuantificó NFkB activado midiendo la emisión de luz usando el sistema de ensayo Luciferase 100 y tampón de lisis indicador (ambos de Promega, n.° cat. E4550 y n.° cat.: E3971.
Como se muestra en la figura 50A, la presencia de células tumorales que expresan FAP incrementó fuertemente la inducción de la activación de luciferasa mediada por NFkB cuando se añadió FAP -Ox40L. El área bajo la curva de las respectivas curvas de respuesta a la dosis representadas se cuantificó como marcador para la capacidad agonista de cada construcción. Como se muestra en la figura 50A, la presencia de FAP presentada en la superficie celular garantizó mayor reticulación y por tanto un mejor efecto agonista de FAP-Ox40F que la adición de un anticuerpo secundario específico de Fc.
15.5 Coestimulación mediada por OX40 de PBMC humanas en reposo desencadenada por TCR subóptimamente e hiperreticulación por FAP en superficie celular
Se mostró en el ejemplo 15.4 que la adición de células tumorales FAP+ puede incrementar fuertemente la actividad de NFkB inducida por OX40F dirigido a FAP en líneas celulares indicadoras positivas para Ox40 humano proporcionando una fuerte oligomerización de receptores OX40. Asimismo, se sometieron a prueba construcciones FAP-OX40L en presencia de células NIH/3T3-clon 39 huFAP para determinar su capacidad para rescatar la estimulación de TCR subóptima de células PBMC humanas en reposo.
Las preparaciones de PBMC humanas contienen (1) linfocitos T CD4+ y CD 8+ negativos para Ox40 en reposo y (2) células presentadoras de antígenos con diversas moléculas con receptor de Fcy en su superficie celular por ejemplo, linfocitos B y monocitos. El anticuerpo anti-CD3 humano del isotipo de IgG1 humana se puede unir con un parte Fc a las presentes moléculas con receptor de Fcy y mediar en la activación de TCR prolongada en linfocitos T CD4+ y CD8+ negativos para Ox40 en reposo. Estas células a continuación comienzan a expresar Ox40 dentro de varias horas. Los compuestos agonistas funcionales frente a Ox40 pueden señalizar por medio del receptor Ox40 presente en linfocitos T CD 8+ y CD4+ activados y soportar la estimulación mediada por TCR.
Se estimularon PBMC humanas marcadas con CFSE en reposo durante cinco días con una concentración subóptima de anticuerpo anti-CD3 en presencia de células NIH/3T3-clon 39 huFAP FAP+ irradiadas y FAP-Ox40L valorada. Los efectos sobre la supervivencia y proliferación de linfocitos T se analizaron a través del seguimiento de recuentos celulares totales y dilución CFSE en células vivas por citometría de flujo.
Se obtuvieron células NIH/3T3-clon 39 huFAP de fibroblastos embrionarios de ratón (véase el ejemplo 15.4) usando tampón de disociación celular (Invitrogen, n.° cat. 13151-014) durante 10 minutos a 37 °C. Las células se lavaron una vez con DPBS. Las células NIH/3T3-clon 39 huFAP se cultivaron a una densidad de 0,2*105 células por pocillo en medios de linfocitos T en una placa de cultivo tisular de adherencia de fondo redondo de 96 pocillos estéril (TPP, n.° cat. 92097) durante la noche a 37 °C y CO2 al 5 % en un incubador (Hera Cell 150).
Al día siguiente se irradiaron en un irradiador xRay usando una dosis de 4500 RAD para prevenir el posterior crecimiento excesivo de PBMC humanas por la línea celular tumoral.
Las PBMC humanas se aislaron por centrifugación con densidad de Ficoll como se describe en el ejemplo 15.3. Las células se marcaron a continuación con CFSE a una densidad celular de 1x106 células/ ml con CFDA-SE (Sigma- Aldrich, n.° cat. 2188) a una concentración final de [50 nM] durante 10 minutos a 37 °C. Después de esto, las células se lavaron dos veces con DPBS en exceso que contiene FBS (10 % v/v). Las células marcadas se dejaron en medio de linfocitos T a 37 °C durante 30 minutos. Después de esto, se retiró CFDA-SE no convertido por dos etapas de lavado adicionales con DPBS. Se añadieron PBMC humanas en reposo marcadas con CFSE a cada pocillo a una densidad de 0,5* 105 células por pocillo. Se añadieron anticuerpo anti-CD3 humano (clon V9, IgG1 humana, descrito en Rodrigues et al., Int J Cancer Suppl 7, 45-50 (1992) y patente de EE. UU. n.° 6,054,297) a una concentración final de [20 nM] y FAP-OX40L en las concentraciones indicadas. Las células se activaron durante cinco días a 37 °C y CO2 al 5 % en un incubador (Hera Cell 150). A continuación, las células se tiñeron en superficie con anticuerpos conjugados con tinte fluorescente anti-CD4 (clon RPA-T4, BioLegend, n.° cat. 300532) y CD8 (clon RPa-T8, BioLegend, n.° cat. 3010441) humanos durante 20 min a 4 °C. Después de una etapa de lavado con tampón FACS, las células se resuspendieron en 85 pl/pocillo de tampón FACS y se adquirieron usando un citómetro de flujo 5-Laser Fortessa (BD Bioscience con programa informático DIVA).
Como se muestra en la figura 51, la hiperreticulación de construcciones FAP-OX40L por las células NIH/3T3-clon 39 huFAP presentes promovió fuertemente la proliferación (véanse las gráficas de "Acontecimientos" en la parte superior) y la supervivencia (véanse las gráficas de "Proliferación" en la parte inferior) en linfocitos T c D4 y CD8 humanos estimulados con TCR. En línea con una menor expresión de OX40 en linfocitos T CD8+ humanos, el efecto agonista de FAP-OX40L fue menos fuerte en linfocitos T CD8+ que en linfocitos T CD4+.
Citas:
Ascierto, P. A., E. Simeone, M. Sznol, Y. X. Fu y I. Melero (2010), Clinical experiences with anti-CD137 and anti-PD 1 therapeutic antibodies. Semin Oncol 37:508-516.
Aggarwal B.B. (2003), Signalling pathways of the TNF superfamily: a double-edged sword. Nat. Rev. Immunol.
3(9),745-56.
Banner D. et al. (1993), Crystal structure of the soluble human 55 kd TNF receptor-human TNF beta complex: implications for TNF receptor activation. Cell 73, 431-445.
Bodmer J., Schneider P. y Tschopp, J. (2002), The molecular architecture of the TNF superfamily. Trends in Biochemical Sciences 27(1), 19-26.
Broll, K., Richter, G., Pauly, S., Hofstaedter, F. y Schwarz, H. (2001). CD137 expression in tumor vessel walls. High correlation with malignant tumors. Am J Clin Pathol 115, 543-549.
Buechele, C., Baessler, T., Schmiedel, B.J., Schumacher, C.E., Grosse-Hovest, L., Rittig, K. y Salih, H.R. (2012). 4-1BB ligand modulates direct and Rituximab-induced NK-cell reactivity in chronic lymphocytic leukemia. Eur J Immunol 42, 737-748.
Choi, B.K., Kim, Y.H., Kwon, P.M., Lee, S.C., Kang, S.W., Kim, M.S., Lee, M.J. y Kwon, B.S. (2009). 4-1BB functions as a survival factor in dendritic cells. J Immunol 182, 4107-4115.
Cuadros, C., Dominguez, A.L., Lollini, P.L., Croft, M., Mittler, R.S., Borgstrom, P. y Lustgarten, J. (2005). Vaccination with dendritic cells pulsed with apoptotic tumors in combination with anti-OX40 and anti-4-IBB monoclonal antibodies induces T cell-mediated protective immunity in Her-2/neu transgenic mice. Int J Cancer 116, 934-943.
Curran, M.A., Kim, M., Montalvo, W., Al-Shamkhani, A. y Allison, J.P. (2011). Combination CTFA-4 blockade and 4-1BB activation enhances tumor rejection by increasing T-cell infiltration, proliferation, and cytokine production. PLoS One 6, el9499.
Diehl, L., van Mierlo, G.J., den Boer, A.T., van der Voort, E., Fransen, M., van Bostelen, L., Krimpenfort, P., Melief, C.J., Mittler, R., Toes, R.E. y Offringa, R. (2002). In vivo triggering through 4-1BB enables Thindependent priming of CTL in the presence of an intact CD28 costimulatory pathway. J Immunol 168, 3755­ 3762.
Dubrot, J., Milheiro, F., Alfaro, C., Palazon, A., Martinez-Forero, I., Perez-Gracia, J.L., Morales- Kastresana, A., Romero-Trevejo, J.L., Ochoa, M.C., Hervas-Stubbs, S., et al. (2010). Treatment with anti-CD137 mAbs causes intense accumulations of liver T cells without selective antitumor immunotherapeutic effects in this organ. Cancer Immunol Immunother 59, 1223-1233.
Futagawa, T., Akiba, H., Kodama, T., Takeda, K., Hosoda, Y., Yagita, H. y Okumura, K. (2002). Expression and function of 4-1BB and 4-1BB ligand on murine dendritic cells. Int Immunol 14, 275-286.
Guo, Z., Cheng, D., Xia, Z., Luan, M., Wu, L., Wang, G. y Zhang, S. (2013). Combined TIM - 3 blockade and CD137 activation affords the long-term protection in a murine model of ovarian cancer. J Transl Med 11,215. Heinisch, I.V., Daigle, I., Knopfli, B. y Simon, H.U. (2000). CD137 activation abrogates granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-mediated anti-apoptosis in neutrophils. Eur J Immunol 30, 3441-3446.
Hornig, N., Kermer, V., Frey, K., Diebolder, P., Kontermann, R.E., Mueller, D. (2012), Combination of a bispecific antibody and costimulatory antibody-ligand fusion proteins for targeted cancer immunotherapy. J. Immunother.
35, 418-429.
Ju, S.A., Cheon, S.H., Park, S.M., Tam, N.Q., Kim, Y.M., An, W.G. y Kim, B.S. (2008). Eradication of established renal cell carcinoma by a combination of 5-fluorouracil and anti-4-1 BB monoclonal antibody in mice. Int J Cancer 122, 2784-2790.
Kienzle, G. y von Kempis, J. (2000). CD137 (ILA/4-1BB), expressed by primary human monocytes, induces monocyte activation and apoptosis of B lymphocytes. Int Immunol 12, 73-82.
Kim, D.H., Chang, W.S., Lee, Y.S., Lee, K.A., Kim, Y.K., Kwon, B.S. y Kang, C.Y. (2008). 4-1BB engagement costimulates NKT cell activation and exacerbates NKT cell ligand-induced airway hyperresponsiveness and inflammation. J Immunol 180, 2062-2068.
Kim, Y.H., Choi, B.K., Oh, H.S., Kang, W.J., Mittler, R.S. y Kwon, B.S. (2009). Mechanisms involved in synergistic anticancer effects of anti-4-1 BB and cyclophosphamide therapy. Mol Cancer Ther 8, 469-478. Kwon, B.S. y Weissman, S.M. (1989). cDNA sequences of two inducible T-cell genes. Proc Natl Acad Sci U S A 86, 1963-1967.
Lee, H., Park, H.J., Sohn, H.J., Kim, J.M. y Kim, S.J. (2011). Combinatorial therapy for liver metastatic colon cancer: dendritic cell vaccine and low-dose agonistic anti-4-1BB antibody costimulatory signal. J Surg Res 169, e43-50.
Levitsky, V., de Campos-Lima, P.O., Frisan, T. y Masucci, M.G. (1998). The clonal composition of a peptidespecific oligoclonal CTL repertoire selected in response to persistent EBV infection is stable over time. J Immunol 161, 594-601.
Li, F. y Ravetch, J.V. (2011). Inhibitory Fcgamma receptor engagement drives adjuvant and anti-tumor activities of agonistic CD40 antibodies. Science 333, 1030-1034.
Lin, W., Voskens, C.J., Zhang, X., Schindler, D.G., Wood, A., Burch, E., Wei, Y., Chen, L., Tian, G., Tamada, K., et al. (2008). Fc-dependent expression of CD137 on human NK cells: insights into "agonistic" effects of anti-CD137 monoclonal antibodies. Blood 112, 699-707.
Melero, I., Johnston, J.V., Shufford, W.W., Mittler, R.S. y Chen, L. (1998). NK1.1 cells express 4-1BB (CDw137) costimulatory molecule and are required for tumor immunity elicited by anti-4-1BB monoclonal antibodies. Cell Immunol 190, 167-172.
Melero, I., Shuford, W.W., Newby, S.A., Aruffo, A., Ledbetter, J.A., Hellstrom, K.E., Mittler, R.S. y Chen, L. (1997). Monoclonal antibodies against the 4-1BB T-cell activation molecule eradicate established tumors. Nat Med 3, 682-685.
Merchant, A.M., Zhu, Z., Yuan, J.Q., Goddard, A., Adams, C.W., Presta, L.G. y Carter, P. (1998). An efficient route to human bispecific lgG. Nat Biotechnol 16, 677-681.
Morales-Kastresana, A., Sanmamed, M.F., Rodriguez, I., Palazon, A., Martinez-Forero, I., Labiano, S., Hervas-Stubbs, S., Sangro, B., Ochoa, C., Rouzaut, A., et al. (2013). Combined immunostimulatory monoclonal antibodies extend survival in an aggressive transgenic hepatocellular carcinoma mouse model. Clin Cancer Res 19, 6151-6162.
Mueller, D., Frey, K., Kontermann, R.E. (2008), A novel antibody-4-1BBl fusion protein for targeted costimulation in cancer immunotherapy, J. Immunother. 31, 714-722.
Murillo, O., Dubrot, J., Palazon, A., Arina, A., Azpilikueta, A., Alfaro, C., Solano, S., Ochoa, M.C., Berasain, C., Gabari, I., et al. (2009). In vivo depletion of DC impairs the anti-tumor effect of agonistic anti-CD137 mAh. Eur J Immunol 39, 2424-2436.
Narazaki, H, Zhu, Y., Luo, L., Zhu, G. y Chen, L. (2010). CD137 agonist antibody prevents cancer recurrence: contribution of CD137 on both hematopoietic and nonhematopoietic cells. Blood 115, 1941-1948.
Nishimoto, H., Lee, S.W., Hong, H., Potter, K.G., Maeda-Yamamoto, M., Kinoshita, T., Kawakami, Y., Mittler, R.S., Kwon, B.S., Ware, C.F., et al. (2005). Costimulation of mast cells by 4-1BB, a member of the tumor necrosis factor receptor superfamily, with the high-affinity IgE receptor. Blood 106, 4241-4248.
Olofsson, P.S., Soderstrom, L.A., Wagsater, D., Sheikine, Y., Ocaya, P., Lang, F., Rabu, C., Chen, L., Rudling, M., Aukrust, P., et al. (2008). CD137 is expressed in human atherosclerosis and promotes development of plaque inflammation in hypercholesterolemic mice. Circulation 117, 1292-1301.
Palazon, A., Teijeira, A., Martinez-Forero, I., Hervas-Stubbs, S., Roncal, C., Penuelas, I., Dubrot, J., Morales-Kastresana, A., Perez-Gracia, J.L., Ochoa, M.C., et al. (2011). Agonist anti-CD137 mAb act on tumor endothelial cells to enhance recruitment of activated T lymphocytes. Cancer Res 71, 801-811.
Schwarz, H., Valbracht, J., Tuckwell, J., von Kempis, J. y Lotz, M. (1995). ILA, the human 4-1BB homologue, is inducible in lymphoid and other cell lineages. Blood 85, 1043-1052.
Shao, Z. y Schwarz, H. (2011). CD137 ligand, a member of the tumor necrosis factor family, regulates immune responses via reverse signal transduction. J Leukoc Biol 89, 21-29.
Shi, W. y Siemann, D.W. (2006). Augmented antitumor effects of radiation therapy by 4-1BB antibody (BMS-469492) treatment. Anticancer Res 26, 3445-3453.
Simeone, E. y Ascierto, P.A. (2012). Immunomodulating antibodies in the treatment of metastatic melanoma: the experience with anti-CTLA-4, anti-CD137, and anti-PD1. J Immunotoxicol 9, 241-247.
Snell, L.M., Lin, G.H., McPherson, A.J., Moraes, T.J. y Watts, T.H. (2011). T-cell intrinsic effects of GITR and 4-1BB during viral infection and cancer immunotherapy. Immunol Rev 244, 197-217.
Stagg, J., Loi, S., Divisekera, U., Ngiow, S.F., Duret, H., Yagita, H., Teng, M.W. y Smyth, M.J. (2011). Anti-ErbB-2 mAb therapy requires type I and II interferons and synergizes with anti-PD-1 or anti-CD137 mAb therapy. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 7142-7147.
Teng, M.W., Sharkey, J., McLaughlin, N.M., Exley, M.A. y Smyth, M.J. (2009). CD1d-based combination therapy eradicates established tumors in mice. J Immunol 183, 1911-1920.
von Kempis, J., Schwarz, H. y Lotz, M. (1997). Differentiation-dependent and stimulus-specific expression of ILA, the human 4-1BB-homologue, in cells of mesenchymal origin. Osteoarthritis Cartilage 5, 394-406.
Wei, H., Zhao, L., Li, W., Fan, K., Qian, W., Hou, S., Wang, H., Dai, M., Hellstrom, I., Hellstrom, K.E. y Guo, Y. (2013). Combinatorial PD-1 blockade and CD137 activation has therapeutic efficacy in murine cancer models and synergizes with cisplatin. PLoS One 8, e84927.
Wilcox, R.A., Chapoval, A.I., Gorski, K.S., Otsuji, M., Shin, T., Flies, D.B., Tamada, K., Mittler, R.S., Tsuchiya, H., Pardoll, D.M. y Chen, L. (2002). Cutting edge: Expression of functional CD137 receptor by dendritic cells. J Immunol 168, 4262-4267.
Wilcox, R.A., Tamada, K., Flies, D.B., Zhu, G., Chapoval, A.I., Blazar, B.R., Kast, W.M. y Chen, L. (2004). Ligation of CD137 receptor prevents and reverses established anergy of CD8+cytolytic T lymphocytes in vivo. Blood 103, 177-184.
Zhang, N., Sadun, R.E., Arias, R.S., Flanagan, M.L., Sachsman, S.M., Nien, Y, Khawli, L.A., Hu, P., Epstein, A.L. (2007). Targeted and untargeted CD137L fusion proteins for the immunotherapy of experimental solid tumors. Clin. Cancer Res. 13, 2758-2767.
Zhang, X., Voskens, C.J., Sallin, M., Maniar, A., Montes, C.L., Zhang, Y., Lin, W., Li, G., Burch, E., Tan, M., et al. (2010). CD137 promotes proliferation and survival of human B cells. J Immunol 184, 787-795.

Claims (39)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia TNF que comprende
(a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana,
(b) un primer y un segundo polipéptido que se unen entre sí por un enlace disulfuro, en la que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido contiene un primer dominio constante de la cadena pesada (CH1) o constante de la cadena ligera (CL) y el segundo polipéptido contiene un dominio CL o CH1, respectivamente, en la que el segundo polipéptido se une al primer polipéptido por un enlace disulfuro entre el dominio CH1 y CL, y en la que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 que se conectan entre sí y al dominio CH1 o CL por un conector peptídico y en la que el segundo polipéptido comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 conectado por medio de un conector peptídico al dominio CL o CH1 de dicho polipéptido,
y que comprende además
(c) un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de manera estable.
2. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la reivindicación 1, en la que el miembro de la familia de ligandos de TNF coestimula la activación de linfocitos T humanos.
3. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de las reivindicaciones 1 o 2, en la que el miembro de la familia de ligandos de TNF es 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375.
4. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el ectodominio de un miembro de la familia de ligandos de TNF comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:96.
5. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el ectodominio de un miembro de la familia de ligandos de TNF comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:96.
6. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende
(a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana y
(b) un primer y un segundo polipéptido que se unen entre sí por un enlace disulfuro, en la que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ iD NO:5, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98 y SEQ ID NO:99 y por que el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4.
7. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el antígeno de célula diana se selecciona del grupo que consiste en proteína de activación de fibroblastos (FAP), proteoglucano de sulfato de condroitina asociado a melanoma (MCSP), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGER), antígeno carcinoembrionario (CEA), CD19, CD20 y CD33.
8. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el antígeno de célula diana es la proteína de activación de fibroblastos (FAP).
9. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que la molécula Fab que se puede unir específicamente a FAP comprende un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:100, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:101, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:102, y un dominio VL que comprende (iv) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:103, (v) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:104, y (vi) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:12 o SEQ ID NO:105.
10. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que la molécula Fab que se puede unir específicamente a FAP comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:17 o en la que el resto que se puede unir específicamente a FAP comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:106 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:107.
11. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que el dominio Fc es una IgG, en particular un dominio Fc de IgG1 o un dominio Fc de IgG4.
12. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1 que comprende las sustituciones aminoacídicas en las posiciones 234 y 235 (numeración EU) y/o 329 (numeración EU).
13. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que la molécula de unión a antígeno comprende
una primera cadena pesada y una primera cadena ligera, que comprenden ambas una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana,
un primer péptido que comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 conectados entre sí por un primer conector peptídico fusionado en su extremo C por un segundo conector peptídico a una segunda cadena pesada o ligera, y un segundo péptido que comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID n O:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 fusionado en su extremo C por un tercer conector peptídico a una segunda cadena ligera o pesada, respectivamente.
14. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la que el primer péptido que comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 conectados entre sí por un primer conector peptídico se fusiona en su extremo C por un segundo conector peptídico a un dominio CH1 que es parte de una cadena pesada,
y el segundo péptido que comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1 BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 se fusiona en su extremo C por un tercer conector peptídico a un dominio CL que es parte de una cadena ligera.
15. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la que el primer péptido que comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 conectados entre sí por un primer conector peptídico se fusiona en su extremo C por un segundo conector peptídico a un dominio CL que es parte de una cadena pesada,
y el segundo péptido que comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1 BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375 u OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54 se fusiona en su extremo C por un tercer conector peptídico a un dominio CH1 que es parte de una cadena ligera.
16. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de las reivindicaciones 14 o 15, en la que en el dominio CL adyacente al miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL y OX40L el aminoácido en la posición 123 (numeración EU) se ha reemplazado por arginina (R) y el aminoácido en la posición 124 (numeración EU) se ha sustituido con lisina (K), y en la que en el dominio CH1 adyacente al miembro de la familia de ligandos de TNF seleccionado de 4-1BBL y OX40L los aminoácidos en la posición 147 (numeración EU) y en la posición 213 (numeración EU) se han sustituido con ácido glutámico (E).
17. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en la que la molécula de unión a antígeno comprende
(a) una primera cadena pesada y una primera cadena ligera, que comprenden ambas una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana,
(b) una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98 y SEQ ID NO:99, y una segunda cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4.
18. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que la molécula de unión a antígeno comprende
(i) una primera cadena pesada que comprende el dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16 y una primera cadena ligera que comprende el dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO:17 o
una primera cadena pesada que comprende el dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:106 y una primera cadena ligera que comprende el dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de Se Q ID NO:107,
(ii) una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:111 y SEQ ID NO:113, y
(iii) una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112 y SEQ ID NO:114.
19. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y 15, en la que la molécula de unión a antígeno comprende
(i) una primera cadena pesada que comprende el dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16 y una primera cadena ligera que comprende el dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO:17 o
una primera cadena pesada que comprende el dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:106 y una primera cadena ligera que comprende el dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de Se Q ID NO:107,
(ii) una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:119 y SEQ ID NO:173, y
(iii) una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:120 y SEQ ID NO:174.
20. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, 15 y 19, seleccionada del grupo que consiste en:
a) una molécula que comprende una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:164, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:125, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:115 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:116;
b) una molécula que comprende una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:164, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:125, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:117 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:118;
c) una molécula que comprende dos cadenas ligeras que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:125, una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:123 y una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:124;
d) una molécula que comprende una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:164, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:125, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:119 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:120;
e) una molécula que comprende una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:164, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:125, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:173 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:174; y
f) una molécula que comprende dos cadenas ligeras que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:125, una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:126 y una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:127.
21. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, 15, 19 y 20, que comprende una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:164, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:125, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:119 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:120.
22. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y 11 a 17, en la que el antígeno de célula diana es CEA.
23. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, 11 a 17, y 22, en la que la molécula Fab que se puede unir específicamente a CEA comprende un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:321, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:322, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:323, y un dominio VL que comprende (iv) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:324, (v) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:325, y (vi) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:326.
24. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, 11 a 17, 22 y 23, en la que la molécula Fab que se puede unir específicamente a CEA comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:329 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:330.
25. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, 11 a 17 y 22 a 24, en la que la molécula de unión a antígeno comprende
(i) una primera cadena pesada que comprende el dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:329 y una primera cadena ligera que comprende el dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:330,
(ii) una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:111 y SEQ ID NO:113, y
(iii) una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112 y SEQ ID NO:114.
26. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, 11 a 17 y 22 a 24, en la que la molécula de unión a antígeno comprende
(i) una primera cadena pesada que comprende el dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:329 y una primera cadena ligera que comprende el dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:330,
(ii) una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:119 y SEQ ID NO:173, y
(iii) una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:120 y SEQ ID NO:174.
27. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, 11 a 17, 22 a 24 y 26, que comprende una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:333, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:334, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:119 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:120.
28. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, 7 a 16 y 22 a 24, en la que el miembro de la familia de ligandos de TNF es OX40L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54.
29. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, 7 a 16, 22 a 24 y 28, en la que el ectodominio de un miembro de la familia de ligandos de TNF comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53.
30. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, 7 a 16, 22 a 24 y 28, que comprende
(a) al menos un resto que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana y
(b) un primer y un segundo polipéptido que se unen entre sí por un enlace disulfuro, en la que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:371 o SEQ ID:372 y por que el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54.
31. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, 7 a 16, y 28 a 30, en la que el antígeno de célula diana es la proteína de activación de fibroblastos (FAP) y la molécula Fab que se puede unir específicamente a FAP comprende un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:100, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:101, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:102, y un dominio VL que comprende (iv) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:103, (v) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:104, y (vi) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:12 o SEQ ID NO:105.
32. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, 7 a 16 y 28 a 31, en la que la molécula de unión a antígeno comprende
(i) una primera cadena pesada que comprende el dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16 y una primera cadena ligera que comprende el dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO:17 o
una primera cadena pesada que comprende el dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:106 y una primera cadena ligera que comprende el dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de Se Q ID NO:107,
(ii) una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:355, y
(iii) una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:356.
33. Un polinucleótido aislado que codifica la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32.
34. Un vector, en particular un vector de expresión, que comprende el polinucleótido aislado de la reivindicación 33.
35. Una célula huésped que comprende el polinucleótido aislado de la reivindicación 33 o el vector de la reivindicación 34.
36. Un procedimiento para producir la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32, que comprende las etapas de
(i) cultivar la célula huésped de la reivindicación 35 en condiciones adecuadas para la expresión de la molécula de unión a antígeno, y
(ii) recuperar la molécula de unión a antígeno.
37. Una composición farmacéutica que comprende la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32 y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
38. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32, o la composición farmacéutica de la reivindicación 37, para su uso como medicamento.
39. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32, o la composición farmacéutica de la reivindicación 37, para su uso en el tratamiento de cáncer.
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Families Citing this family (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010062960A2 (en) 2008-11-26 2010-06-03 Cedars-Sinai Medical Center METHODS OF DETERMINING RESPONSIVENESS TO ANTI-TNFα THERAPY IN INFLAMMATORY BOWEL DISEASE
KR20180023035A (ko) 2013-02-26 2018-03-06 로슈 글리카트 아게 이중특이적 t 세포 활성화 항원 결합 분자
US10633449B2 (en) 2013-03-27 2020-04-28 Cedars-Sinai Medical Center Treatment and reversal of fibrosis and inflammation by inhibition of the TL1A-DR3 signaling pathway
EP3022295A4 (en) 2013-07-19 2017-03-01 Cedars-Sinai Medical Center Signature of tl1a (tnfsf15) signaling pathway
TWI757803B (zh) 2014-11-14 2022-03-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 包含tnf家族配位三聚體之抗原結合分子
MA41460A (fr) 2015-02-03 2017-12-12 Oncomed Pharm Inc Agents de liaison à la tnfrsf et leurs utilisations
EP3277305B1 (en) 2015-03-31 2021-07-21 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding molecules comprising a trimeric tnf family ligand
AR106188A1 (es) * 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
WO2017055314A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-cd19xcd3 t cell activating antigen binding molecules
RS62258B1 (sr) 2015-10-02 2021-09-30 Hoffmann La Roche Bispecifična antitela specifična za pd1 i tim3
KR20180073561A (ko) * 2015-10-02 2018-07-02 에프. 호프만-라 로슈 아게 이중특이적 항-ceaxcd3 t 세포 활성화 항원 결합 분자
KR20180053674A (ko) 2015-10-02 2018-05-23 에프. 호프만-라 로슈 아게 공자극 tnf 수용체에 특이적인 이중특이성 항체
MA43019A (fr) * 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Anticorps anti-humain cd19 à affinité élevée
EP3374399A1 (en) 2015-11-11 2018-09-19 Opi Vi- IP Holdco LLC Composition and methods for anti-tnfr2 antibodies
ES2837428T3 (es) 2016-01-08 2021-06-30 Hoffmann La Roche Procedimientos de tratamiento de cánceres positivos para CEA usando antagonistas de unión al eje PD-1 y anticuerpos biespecíficos anti-CEA/anti-CD3
WO2017161342A1 (en) 2016-03-17 2017-09-21 Cedars-Sinai Medical Center Methods of diagnosing inflammatory bowel disease through rnaset2
WO2017194442A1 (en) * 2016-05-11 2017-11-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer and a tenascin binding moiety
EP3243836A1 (en) * 2016-05-11 2017-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG C-terminally fused tnf family ligand trimer-containing antigen binding molecules
EP3243832A1 (en) * 2016-05-13 2017-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer and pd1 binding moiety
CN109952370B (zh) 2016-10-19 2023-09-08 豪夫迈·罗氏有限公司 用于产生免疫缀合物的方法
JP7194104B2 (ja) 2016-10-26 2022-12-21 シーダーズ―シナイ メディカル センター 抗ｔｌ１ａモノクローナル抗体の中和
CN110087682B (zh) * 2016-12-19 2023-12-15 豪夫迈·罗氏有限公司 用靶向性4-1bb(cd137)激动剂的组合疗法
JP7247091B2 (ja) * 2016-12-20 2023-03-28 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３二重特異性抗体と４－１ｂｂ（ｃｄ１３７）アゴニストの併用療法
EP3565843A1 (en) 2017-01-03 2019-11-13 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecules comprising anti-4-1bb clone 20h4.9
US11566060B2 (en) 2017-01-05 2023-01-31 Kahr Medical Ltd. PD1-CD70 fusion protein and methods of use thereof
AU2018205888B2 (en) 2017-01-05 2021-09-02 Kahr Medical Ltd. A PD1-41BBL fusion protein and methods of use thereof
SI3565828T1 (sl) 2017-01-05 2022-04-29 Kahr Medical Ltd. SIRP1 alfa-41BBL fuzijski protein in postopki za njegovo uporabo
WO2018151820A1 (en) * 2017-02-16 2018-08-23 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules comprising a trimeric ligand and uses thereof
JP7196094B2 (ja) 2017-03-29 2022-12-26 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 共刺激ｔｎｆ受容体のための二重特異性抗原結合分子
JP7205995B2 (ja) 2017-03-29 2023-01-17 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 共刺激性ｔｎｆ受容体に対する二重特異性抗原結合分子
JP7426825B2 (ja) 2017-04-03 2024-02-02 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗ｐｄ－１抗体と突然変異ｉｌ－２とまたはｉｌ－１５とのイムノコンジュゲート
EP3606956B1 (en) 2017-04-04 2024-07-31 F. Hoffmann-La Roche AG Novel bispecific antigen binding molecules capable of specific binding to cd40 and to fap
US11285207B2 (en) 2017-04-05 2022-03-29 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific antibodies specifically binding to PD1 and LAG3
US11643473B2 (en) 2017-04-24 2023-05-09 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Antibody immune cell inhibitor fusion proteins
BR112019025792A2 (pt) 2017-06-07 2020-07-07 Spark Therapeutics, Inc. agentes de aperfeiçoamento para transfecção de células melhoradas e/ou produção de vetor raav
CN111246884A (zh) * 2017-11-01 2020-06-05 豪夫迈·罗氏有限公司 新颖的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子
EP3502140A1 (en) * 2017-12-21 2019-06-26 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of tumor targeted icos agonists with t-cell bispecific molecules
CN110573531B (zh) * 2018-01-15 2021-04-02 天境生物科技(上海)有限公司 经修饰的Cκ和CH1结构域
MX2020009468A (es) * 2018-03-13 2020-10-22 Hoffmann La Roche Terapias de combinacion de agonistas de 4-1bb con anticuerpos anti-cd20.
TWI841551B (zh) 2018-03-13 2024-05-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 使用靶向4-1bb (cd137)之促效劑的組合療法
BR112020016997A2 (pt) * 2018-04-13 2021-01-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Moléculas de ligação e de ácido nucleico isolada, vetor, célula hospedeira, métodos para produzir a molécula de ligação, para tratar um indivíduo com câncer e para regular positivamente ou prolongar a atividade de células t, composição farmacêutica e uso da molécula de ligação
KR102763158B1 (ko) 2018-04-25 2025-02-04 프로메테우스 바이오사이언시즈, 인크. 최적화된 항tl1a 항체
CN112424228B (zh) * 2018-07-04 2024-08-09 豪夫迈·罗氏有限公司 新型双特异性激动性4-1bb抗原结合分子
CA3104780A1 (en) * 2018-07-11 2020-01-16 Kahr Medical Ltd. Sirpalpha-4-1bbl variant fusion protein and methods of use thereof
US12286466B2 (en) * 2018-07-11 2025-04-29 Kahr Medical Ltd. PD1-4-1BBL variant fusion protein and methods of use thereof
EP3861026A1 (en) 2018-10-01 2021-08-11 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific antigen binding molecules comprising anti-fap clone 212
TWI839395B (zh) * 2018-10-09 2024-04-21 瑞士商Ｎｕｍａｂ治療公司 靶向cd137的抗體及其使用方法
US11608376B2 (en) 2018-12-21 2023-03-21 Hoffmann-La Roche Inc. Tumor-targeted agonistic CD28 antigen binding molecules
US20200385488A1 (en) 2019-06-04 2020-12-10 Molecular Partners Ag Multispecific proteins
CA3140668A1 (en) * 2019-06-12 2020-12-17 Obsidian Therapeutics, Inc. Ca2 compositions and methods for tunable regulation
CA3141039A1 (en) 2019-06-26 2020-12-30 Simon Auslaender Mammalian cell lines with sirt-1 gene knockout
BR112021026293A2 (pt) 2019-06-26 2022-03-03 Hoffmann La Roche Moléculas de ligação, anticorpos humanizados, ácido nucleico isolado, célula hospedeira, métodos para produzir a molécula de ligação ao antígeno, para tratar um indivíduo e suprarregular ou prolongar a atividade de células t citotóxicas, composição farmacêutica e uso da molécula
AR119382A1 (es) 2019-07-12 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos de pre-direccionamiento y métodos de uso
KR20220103721A (ko) 2019-10-24 2022-07-22 프로메테우스 바이오사이언시즈, 인크. Tnf 유사 리간드 1a(tl1a)에 대한 인간화 항체 및 그의 용도
AR121706A1 (es) 2020-04-01 2022-06-29 Hoffmann La Roche Moléculas de unión a antígeno biespecíficas dirigidas a ox40 y fap
WO2021209050A1 (en) * 2020-04-17 2021-10-21 Biocytogen Jiangsu Co., Ltd. Genetically modified non-human animal with human or chimeric tnfsf9 and/or 4-1bb
US20230212260A1 (en) 2020-05-15 2023-07-06 Apogenix Ag Multi-specific immune modulators
BR112022025856A2 (pt) 2020-06-19 2023-01-10 Hoffmann La Roche Anticorpo que se liga a cd3 e cd19, polinucleotídeo isolado, célula hospedeira, método de produção de um anticorpo que se liga a cd3 e cd19, composição farmacêutica, uso do anticorpo, método para tratar uma doença em um indivíduo e invenção
IL298921A (en) 2020-07-10 2023-02-01 Hoffmann La Roche Antibodies which bind to cancer cells and target radionuclides to said cells
KR20230066552A (ko) * 2020-07-24 2023-05-16 에프. 호프만-라 로슈 아게 항체-다량체-융합체의 발현 방법
MX2023008084A (es) 2021-01-12 2023-07-13 Hoffmann La Roche Anticuerpos split que se unen a celulas cancerosas y dirigen radionuclidos a dichas celulas.
WO2022152701A1 (en) 2021-01-13 2022-07-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy
EP4304723A1 (en) 2021-03-09 2024-01-17 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of pd-1-targeted il-2 variant immunoconjugates and fap/4-1bb binding molecules
WO2022243261A1 (en) 2021-05-19 2022-11-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Agonistic cd40 antigen binding molecules targeting cea
BR112023025020A2 (pt) * 2021-06-01 2024-02-20 Janssen Biotech Inc Anticorpos anti-idiotípicos contra anticorpos anti-cd79b
EP4148067A1 (en) * 2021-09-08 2023-03-15 F. Hoffmann-La Roche AG Method for the expression of an antibody-multimer-fusion
WO2023073225A1 (en) 2021-11-01 2023-05-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Treatment of cancer using a hla-a2/wt1 x cd3 bispecific antibody and a 4-1bb (cd137) agonist
WO2023088876A1 (en) 2021-11-16 2023-05-25 Apogenix Ag Multi-specific immune modulators
WO2023088889A1 (en) 2021-11-16 2023-05-25 Apogenix Ag CD137 ligands
CN118541382A (zh) 2021-12-14 2024-08-23 豪夫迈·罗氏有限公司 使用HLA-A2/MAGE-A4 x CD3双特异性抗体和4-1BB(CD137)激动剂治疗癌症
CN114349869B (zh) * 2021-12-20 2023-09-26 上海恩凯细胞技术有限公司 一种双特异性的nk细胞激动剂及制备方法和应用
CN114426585B (zh) * 2022-02-15 2023-10-03 广东香雪干细胞再生医学科技有限公司 融合蛋白及其表达细胞株与应用
CN116640226B (zh) * 2022-04-02 2024-04-26 广东东阳光药业股份有限公司 一种抑制宿主抗外源免疫细胞hvg反应的嵌合受体
CN114805564B (zh) * 2022-06-10 2023-06-06 郑州大学 特异性识别SARS-CoV-2 S蛋白NTD区域的单克隆抗体及应用
EP4587123A1 (en) 2022-09-15 2025-07-23 Avidicure IP B.V. Multispecific antigen binding proteins for tumor-targeting of nk cells and use thereof
WO2024094741A1 (en) 2022-11-03 2024-05-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with anti-cd19/anti-cd28 bispecific antibody
CN116574189A (zh) 2023-01-30 2023-08-11 北京智仁美博生物科技有限公司 针对人il-36r和/或人il-1r3的多种抗体及其用途
WO2024184287A1 (en) 2023-03-06 2024-09-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of an anti-egfrviii/anti-cd3 antibody and an tumor-targeted 4-1bb agonist
WO2024188966A1 (en) 2023-03-13 2024-09-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Treatment of cancer using an anti-hla-g/anti-cd3 bispecific antibody and a 4‑1bb (cd137) agonist
CN118894934A (zh) 2023-05-05 2024-11-05 北京智仁美博生物科技有限公司 抗人il-15的抗体及其用途
WO2025113643A1 (en) 2023-12-01 2025-06-05 Gilead Sciences Inc. Anti-fap-light fusion protein and use thereof
WO2025140212A1 (en) * 2023-12-26 2025-07-03 Laekna Therapeutics Shanghai Co., Ltd. Multispecific binding agents comprising anti-fibroblast activation protein (fap) antibodies and one or more monovalent ligand traps and uses thereof
WO2025191139A1 (en) * 2024-03-15 2025-09-18 Avidicure Ip B.V. Conjugates of her2-specific antigen binding proteins and cytokines
WO2025191133A1 (en) 2024-03-15 2025-09-18 Avidicure Ip B.V. Il-21 muteins, fusion proteins comprising the same and uses thereof
WO2025191136A1 (en) 2024-03-15 2025-09-18 Avidicure Ip B.V. Muteins of 4-1bb ligand extracellular domain, fusion proteins comprising the same and uses thereof

Family Cites Families (112)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL7802170A (nl) 1977-04-18 1978-10-20 Hitachi Metals Ltd Sierraad.
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
WO1990005144A1 (en) 1988-11-11 1990-05-17 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
CA2103059C (en) 1991-06-14 2005-03-22 Paul J. Carter Method for making humanized antibodies
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
FI941572L (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenetelmä
EP1997894B1 (en) 1992-02-06 2011-03-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
JP2002506353A (ja) 1997-06-24 2002-02-26 ジェネンテック・インコーポレーテッド ガラクトシル化糖タンパク質の方法及び組成物
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
WO1999022764A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
ATE531812T1 (de) 1997-12-05 2011-11-15 Scripps Research Inst Humanisierung von nager-antikörpern
AUPP221098A0 (en) 1998-03-06 1998-04-02 Diatech Pty Ltd V-like domain binding molecules
PT1071700E (pt) 1998-04-20 2010-04-23 Glycart Biotechnology Ag Modificação por glicosilação de anticorpos para melhorar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos
US7115396B2 (en) 1998-12-10 2006-10-03 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
EP1222292B1 (en) 1999-10-04 2005-08-31 Medicago Inc. Method for regulating transcription of foreign genes in the presence of nitrogen
PT2857516T (pt) 2000-04-11 2017-08-28 Genentech Inc Anticorpos multivalentes e utilizações dos mesmos
JP5291279B2 (ja) 2000-09-08 2013-09-18 ウニヴェルジテート・チューリッヒ 反復モジュールを含む反復タンパク質の集合体
CA2838062C (en) 2001-08-03 2015-12-22 Roche Glycart Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
NZ532526A (en) 2001-10-25 2007-01-26 Genentech Inc Compositions comprising a glycoprotein having a Fc region
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US7432063B2 (en) 2002-02-14 2008-10-07 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Methods for affinity maturation
EP2311867A1 (en) 2002-10-29 2011-04-20 Anaphore, Inc. Trimeric binding proteins for trimeric cytokines
WO2004069876A2 (en) 2003-02-06 2004-08-19 Micromet Ag Trimeric polypeptide construct to induce an enduring t cell response
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
AU2004253835B2 (en) 2003-07-04 2009-01-29 Affibody Ab Polypeptides having binding affinity for HER2
AU2003275958A1 (en) 2003-08-25 2005-03-10 Pieris Proteolab Ag Muteins of tear lipocalin
TR201809892T4 (tr) 2003-11-05 2018-07-23 Roche Glycart Ag Fc reseptörüne bağlanma afinitesi ve artırılmış efektör fonksiyonu bulunan antijen bağlayan moleküller.
BRPI0417302A (pt) 2003-12-05 2007-03-06 Compound Therapeutics Inc inibidores de receptores de fator de crescimento endotelial vascular do tipo 2
WO2005097832A2 (en) 2004-03-31 2005-10-20 Genentech, Inc. Humanized anti-tgf-beta antibodies
CA2885854C (en) 2004-04-13 2017-02-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-p-selectin antibodies
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
EP3088004B1 (en) 2004-09-23 2018-03-28 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
AU2011265482B2 (en) * 2005-05-06 2013-08-29 Providence Health & Services - Oregon Trimeric OX40L-immunoglobulin fusion protein and methods of use
AU2013263717B2 (en) 2005-05-06 2016-05-19 Providence Health & Services - Oregon Trimeric OX40L-immunoglobulin fusion protein and methods of use
EP1736482A1 (en) 2005-06-20 2006-12-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Medicale) Recombinant trimeric 4-1BBL
DE102005036542A1 (de) 2005-08-03 2007-02-08 Universität Stuttgart CTL-Prodrug
HRP20140331T1 (hr) 2006-08-14 2014-05-09 Xencor, Inc. Optimizirana antitijela usmjerena na cd19
EP1958957A1 (en) 2007-02-16 2008-08-20 NascaCell Technologies AG Polypeptide comprising a knottin protein moiety
EP2009022A1 (en) 2007-06-26 2008-12-31 Apogenix GmbH Trimeric death ligands with enhanced activity (tenascin)
GB0718843D0 (en) 2007-09-26 2007-11-07 Cancer Rec Tech Ltd Materials and methods relating to modifying the binding of antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
AU2009204501B2 (en) 2008-01-07 2015-02-12 Amgen Inc. Method for making antibody Fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
HRP20150425T1 (hr) * 2008-07-21 2015-06-05 Apogenix Gmbh Tnf sf jednolanäśane molekule
EP2337795A2 (en) * 2008-10-01 2011-06-29 Dako Denmark A/S Mhc multimers in cancer vaccines and immune monitoring
CA2769619C (en) 2009-08-17 2019-04-30 Roche Glycart Ag Targeted immunoconjugates
BR112012006326A2 (pt) 2009-09-29 2016-11-16 Roche Glycart Ag anticorpo biespecífico, composição farmacêutica, sequência de ácidos nucleicos, vetor de expressão, célula hospedeira procariótica ou eucariótica e invenção
PL2542590T5 (pl) 2010-03-05 2020-08-10 The Johns Hopkins University Kompozycje i sposoby dla ukierunkowanych immunomodulatorowych przeciwciał i białek fuzyjnych
WO2011147834A1 (en) 2010-05-26 2011-12-01 Roche Glycart Ag Antibodies against cd19 and uses thereof
US8552024B2 (en) 2010-08-13 2013-10-08 Hoffman-La Roche Inc. Azacyclic compounds
HUE036077T2 (hu) 2010-08-13 2018-06-28 Roche Glycart Ag Anti-FAP ellenanyagok és alkalmazásukra szolgáló eljárások
CN105440123B (zh) 2011-02-10 2020-10-09 罗切格利卡特公司 突变体白介素-2多肽
SI2691417T2 (sl) 2011-03-29 2025-05-30 Roche Glycart Ag FC variante protitelesa
CA2831820C (en) 2011-04-01 2021-05-25 Universitat Stuttgart Recombinant tnf ligand family member polypeptides with antibody binding domain and uses thereof
JP2013055204A (ja) 2011-09-02 2013-03-21 Toshiba Corp 半導体記憶装置
NZ701821A (en) 2012-04-30 2016-06-24 Biocon Ltd Targeted/immunomodulatory fusion proteins and methods for making same
SG11201408526SA (en) 2012-08-08 2015-03-30 Roche Glycart Ag Interleukin-10 fusion proteins and uses thereof
WO2014116846A2 (en) * 2013-01-23 2014-07-31 Abbvie, Inc. Methods and compositions for modulating an immune response
KR20180023035A (ko) * 2013-02-26 2018-03-06 로슈 글리카트 아게 이중특이적 t 세포 활성화 항원 결합 분자
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
EP2994487B1 (en) 2013-05-07 2019-10-09 F.Hoffmann-La Roche Ag Trimeric antigen binding molecules
WO2015117930A1 (en) 2014-02-06 2015-08-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Interleukine 10 immunoconjugates
UA117289C2 (uk) 2014-04-02 2018-07-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Мультиспецифічне антитіло
JP6666267B2 (ja) 2014-05-29 2020-03-13 メディミューン，エルエルシー Ｏｘ４０ｌ融合タンパク質およびその使用
SG10201913324PA (en) 2014-05-29 2020-03-30 Macrogenics Inc Tri-specific binding molecules and methods of use thereof
TWI757803B (zh) 2014-11-14 2022-03-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 包含tnf家族配位三聚體之抗原結合分子
EP3277305B1 (en) 2015-03-31 2021-07-21 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding molecules comprising a trimeric tnf family ligand
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
WO2017055314A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-cd19xcd3 t cell activating antigen binding molecules
MA43019A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Anticorps anti-humain cd19 à affinité élevée
EP3356420B1 (en) 2015-10-02 2023-11-01 F. Hoffmann-La Roche AG Multispecific antibodies
KR20180053674A (ko) 2015-10-02 2018-05-23 에프. 호프만-라 로슈 아게 공자극 tnf 수용체에 특이적인 이중특이성 항체
EP3359568B1 (en) 2015-10-07 2022-03-09 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific antibodies with tetravalency for a costimulatory tnf receptor
EP3231813A1 (en) 2016-03-29 2017-10-18 F. Hoffmann-La Roche AG Trimeric costimulatory tnf family ligand-containing antigen binding molecules
EP3243836A1 (en) 2016-05-11 2017-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG C-terminally fused tnf family ligand trimer-containing antigen binding molecules
WO2017194442A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer and a tenascin binding moiety
EP3243832A1 (en) 2016-05-13 2017-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer and pd1 binding moiety
JP6768917B2 (ja) 2016-07-08 2020-10-14 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ラボラトリ試料を処理するための装置、ラボラトリオートメーションシステム、およびラボラトリ試料をピペット操作するための方法
CN110087682B (zh) 2016-12-19 2023-12-15 豪夫迈·罗氏有限公司 用靶向性4-1bb(cd137)激动剂的组合疗法
JP7247091B2 (ja) 2016-12-20 2023-03-28 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３二重特異性抗体と４－１ｂｂ（ｃｄ１３７）アゴニストの併用療法
EP3565843A1 (en) 2017-01-03 2019-11-13 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecules comprising anti-4-1bb clone 20h4.9
JP7205995B2 (ja) 2017-03-29 2023-01-17 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 共刺激性ｔｎｆ受容体に対する二重特異性抗原結合分子
JP7196094B2 (ja) 2017-03-29 2022-12-26 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 共刺激ｔｎｆ受容体のための二重特異性抗原結合分子
EP3606956B1 (en) 2017-04-04 2024-07-31 F. Hoffmann-La Roche AG Novel bispecific antigen binding molecules capable of specific binding to cd40 and to fap
CN111246884A (zh) 2017-11-01 2020-06-05 豪夫迈·罗氏有限公司 新颖的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子
BR112020006443A2 (pt) 2017-11-01 2020-09-29 F. Hoffmann-La Roche Ag anticorpos biespecíficos, ácido nucleico isolado, vetor ou célula hospedeira, método para produzir um anticorpo biespecífico e para tratar um indivíduo, composição farmacêutica e uso do anticorpo
MX2020009468A (es) 2018-03-13 2020-10-22 Hoffmann La Roche Terapias de combinacion de agonistas de 4-1bb con anticuerpos anti-cd20.
TWI841551B (zh) 2018-03-13 2024-05-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 使用靶向4-1bb (cd137)之促效劑的組合療法
BR112020016997A2 (pt) 2018-04-13 2021-01-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Moléculas de ligação e de ácido nucleico isolada, vetor, célula hospedeira, métodos para produzir a molécula de ligação, para tratar um indivíduo com câncer e para regular positivamente ou prolongar a atividade de células t, composição farmacêutica e uso da molécula de ligação
CN112424228B (zh) 2018-07-04 2024-08-09 豪夫迈·罗氏有限公司 新型双特异性激动性4-1bb抗原结合分子
EP3861026A1 (en) 2018-10-01 2021-08-11 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific antigen binding molecules comprising anti-fap clone 212
EP3861025A1 (en) 2018-10-01 2021-08-11 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific antigen binding molecules with trivalent binding to cd40
WO2020208049A1 (en) 2019-04-12 2020-10-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecules comprising lipocalin muteins
BR112021026293A2 (pt) 2019-06-26 2022-03-03 Hoffmann La Roche Moléculas de ligação, anticorpos humanizados, ácido nucleico isolado, célula hospedeira, métodos para produzir a molécula de ligação ao antígeno, para tratar um indivíduo e suprarregular ou prolongar a atividade de células t citotóxicas, composição farmacêutica e uso da molécula
CA3162009A1 (en) 2020-01-09 2021-07-15 F. Hoffmann-La Roche Ag New 4-1bbl trimer-containing antigen binding molecules
AR121706A1 (es) 2020-04-01 2022-06-29 Hoffmann La Roche Moléculas de unión a antígeno biespecíficas dirigidas a ox40 y fap

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