ES2786083T3

ES2786083T3 - Anticuerpos terapéuticos CD47

Info

Publication number: ES2786083T3
Application number: ES13863325T
Authority: ES
Inventors: William Frazier; Pamela Manning; Gerhard Frey; Hwai Wen Chang
Original assignee: Arch Oncology Inc
Current assignee: Arch Oncology Inc
Priority date: 2012-12-12
Filing date: 2013-12-12
Publication date: 2020-10-08
Anticipated expiration: 2033-12-12
Also published as: US20150274826A1; HK1216647A1; US20140363442A1; BR112015013431A2; US10676524B2; RU2015122228A; IL239339A0; US20180057592A1; AU2013359167B2; WO2015191861A1; EP2931751B1; AU2013359167A1; CN105102479B; EP2931751A2; US20180051081A1; NZ708445A; US10669336B2; CN105102479A; WO2014093678A3; WO2014093678A2

Abstract

Un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD47 humano, de rata, ratón, cerdo y perro, en donde el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena ligera (LCDR 1-3) y tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena pesada (HCDR 1-3), en donde: LCDR 1 comprende la secuencia de aminoácidos RSSQSLVHSNGNTYLH (SEQ ID NO: 1); LCDR 2 comprende la secuencia de aminoácidos KVSYRFS (SEQ ID NO: 2); y LCDR 3 comprende la secuencia de aminoácidos SQNTHVPRT (SEQ ID NO: 3); HCDR 1 comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTNYYVF (SEQ ID NO: 4); HCDR 2 comprende la secuencia de aminoácidos DINPVNGDTNFNEKFKN (SEQ ID NO: 5); y HCDR 3 comprende la secuencia de aminoácidos GGYTMDY (SEQ ID NO: 6).

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos terapéuticos CD47

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos que se unen a CD47, que incluye CD47 humano y otros, y su uso en el tratamiento de afecciones y trastornos, tales como lesión por isquemia-reperfusión (IRI) y cánceres, mediados por este receptor.

Descripción de la técnica relacionada

CD47 es un receptor de la superficie celular compuesto por un dominio set IgV extracelular, un dominio transmembrana que abarca 5 membranas y una cola citoplasmática que se empalma alternativamente. Se unen dos ligandos a CD47: trombospondina-1 (TSP1) y la proteína del receptor reguladora de señales alpha (SIRPalpha). La unión de TSP1 a CD47 activa la proteína G heterotrimérica Gi, lo que conduce a la supresión de los niveles de AMP cíclico intracelular (cAMP). Además, la vía TSP1-CD47 se opone a los efectos beneficiosos de la vía del óxido nítrico en todas las células vasculares. La vía del óxido nítrico (NO) consta de cualquiera de las tres enzimas (sintasas de óxido nítrico, NOS I, NOS II y NOS III) que generan gas bioactivo NO que utiliza arginina como sustrato. El NO puede actuar dentro de la célula en la que se produce, o en las células vecinas, para activar la enzima soluble guanilil ciclasa que produce la molécula mensajera GMP cíclico (cGMP). El funcionamiento adecuado de la vía NO-cGMP es esencial para proteger el sistema cardiovascular contra el estrés, que incluye, pero no se limita a, aquellos que dan como resultado heridas, inflamación, hipertensión, síndrome metabólico, isquemia y lesión por isquemia-reperfusión (IRI). En el contexto de estos estrés celulares, la inhibición de la vía NO-cGMP por el sistema TSP1-CD47 agrava los efectos del estrés. Este es un problema particular en el sistema cardiovascular donde tanto cGMP como cAMP desempeñan un papel protector importante. Hay muchos casos en los que la isquemia y la lesión por reperfusión provocan o contribuyen a la enfermedad, traumatismo y los malos resultados de los procedimientos quirúrgicos.

SIRPalpha se expresa en células hematopoyéticas, que incluye macrófagos y células dendríticas. Cuando coopera con CD47 en una célula diana fagocítica potencial, la fagocitosis se ralentiza o previene. La interacción CD47-SIRPalpha envía eficazmente una señal de "no me comas" al fagocito. Por tanto, el bloqueo de la interacción SIRPalpha-CD47 con un anticuerpo monoclonal en este contexto terapéutico puede proporcionar una terapia anticancerígena eficaz al favorecer, es decir, aumentar, la absorción y eliminación de células cancerosas por el sistema inmune del huésped. Este mecanismo es eficaz tanto en leucemias como en muchos tipos de tumores sólidos.

La patente de EE.UU. 8,236,313 contempla anticuerpos que podrían ser útiles en el campo de la isquemia y el flujo sanguíneo para invertir y/o prevenir la isquemia tisular y el daño celular y tisular relacionado y asociado, que incluye anticuerpos que bloquean a CD47. No se describen realmente anticuerpos.

La patente de EE.UU. 8,101,719 describe anticuerpos humanizados que se unen a CD47 para uso en el tratamiento de trastornos hematológicos. Los objetos de la invención incluyen anticuerpos anti-CD47 humanizados y pequeños fragmentos de anticuerpos que presentan antigenicidad reducida mientras conservan su actividad de unión a CD47 y actividad inductora de apoptosis. Dichos anticuerpos y pequeños fragmentos se contemplan para uso en el tratamiento de trastornos hematológicos tales como diversos tipos de leucemias, linfoma maligno, anemia aplásica, síndromes mielodisplásicos y policitemia vera. No se describen otras propiedades de estos anticuerpos.

La publicación internacional PCT WO 2011/143624 describe anticuerpos monoclonales anti-CD47 quiméricos y humanizados para uso como reactivos para el diagnóstico e inmunoterapia de enfermedades asociadas con CD47 en humanos, particularmente en la terapia contra el cáncer, por ejemplo para aumentar la fagocitosis de células cancerosas que expresan CD47. Los anticuerpos preferidos no se activan, es decir, bloquean la unión del ligando, pero no señalan. Los anticuerpos humanizados B6H12 y 5F9 descritos se unieron a CD47 humano soluble; B6H12 también se unió a CD47 humano en la superficie de células YB2/0 transfectadas con CD47 humano. Los anticuerpos humanizados B6H12 y 5F9 permitieron la fagocitosis de las células HL-60 marcadas con CFSE por los macrófagos derivados de sangre periférica o de médula ósea de ratón in vitro respectivamente. El B6H12 humanizado utilizó los marcos VH-3-7 y VK3-11 humanos.

El documento de EE.UU. 2013/0142786 describe anticuerpos anti-CD47 no activadores que aumentan la fagocitosis de las células que expresan CD47.

La publicación internacional PCT WO 2013/119714 describe anticuerpos anti-CD47 que no provocan un nivel significativo de hemaglutinación de glóbulos rojos humanos.

La publicación internacional PCT WO 99/40940 describe ligandos de CD47 y agentes que se unen a estos ligandos. El documento WO 99/40940 también describe el uso de anticuerpos monoclonales específicos para CD47, trombospondina, Tp47, SIRPa y fragmentos de los mismos, particularmente para el tratamiento o la profilaxis de diversas enfermedades inflamatorias, autoinmunes y alérgicas, así como en el tratamiento del rechazo del injerto y/o la leucemia linfocítica crónica.

La publicación internacional PCT WO 2008/060785 describe el papel desempeñado por la trombospondina-1 (TSP1) en el bloqueo de los efectos del óxido nítrico (NO) en el sistema vascular. Este documento informa que los efectos de la TSP1 están mediados por CD47. Además se describen métodos para prevenir la isquemia tisular mediante el bloqueo de la interacción TSP1-CD47. Los anticuerpos CD47 se describen como agentes ejemplares.

Subramanian et col. (Blood, 15 de marzo de 2006, Vol. 107(6); páginas 2548-2556) describen las especies e interacciones específicas de tipo celular entre CD47 y SIRPa humana. Este documento describe la actividad de unión de dos anticuerpos a CD47: CIKm1 de ICN (Costa Mesa, CA); y B6H12 de ATCC (HB-9711), contra CD47 que expresan los glóbulos rojos de diferentes especies. Ninguno de los anticuerpos se pudo unir a CD47 de rata. B6H12 tampoco se pudo unir a CD47 en los glóbulos rojos de cerdo.

Isenberg et col. (Surgery, 1 de noviembre de 2008, Vol. 144(5); páginas 752-761) describe el tratamiento de la isquemia-reperfusión hepática inducida en ratones con anticuerpos CD47.

Roberts et col. (Matrix Biology, 10 de diciembre de 2011, Vol. 31(3); páginas 162-169) describe el papel de la trombospondina-1 en la inducción de la señalización al unirse a CD47 y la regulación de la dinámica cardiovascular, hemostasia, inmunidad y la homeostasis mitocondrial. Existe una necesidad de anticuerpos contra el CD47 humano que bloqueen selectivamente la unión de TSP1 a CD47 para favorecer los efectos beneficiosos de la señalización de óxido nítrico-cGMP y la señalización de cAMP en el sistema cardiovascular en entornos en los que la IRI desempeña un papel en la patogénesis. Estas situaciones/enfermedades incluyen, trasplante de órganos, lesión renal aguda, cirugía de derivación cardiopulmonar, hipertensión pulmonar, enfermedad de células falciformes, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, resecciones quirúrgicas y cirugía reconstructiva, reinserción de dedos/partes del cuerpo, injerto de piel y traumatismo. También existe una necesidad de anticuerpos que bloqueen la unión de SIRPalpha a CD47, proporcionando así terapias novedosas contra el cáncer. También se espera que dichos anticuerpos que también tienen la capacidad de matar selectivamente o inducir la muerte celular de células transformadas o cancerosas proporcionen un beneficio terapéutico adicional.

Compendio de la invención

Los compuestos de anticuerpos de la presente invención satisfacen estas necesidades. Se unen a epítopos en el dominio IgV extracelular de CD47, inhibiendo la unión de TSP1 y SIRPalpha a CD47 y la activación del receptor, mientras que inducen poca o ninguna actividad agonista. Ciertos otros anticuerpos de la presente invención también proporcionan un efecto de inducción de muerte celular o tóxico para el tumor que es específico para las células cancerosas activadas o transformadas además de favorecer (aumentar) la eliminación fagocítica de las células tumorales. En vista de estas propiedades, los compuestos de anticuerpos de la presente invención deberían ser terapéuticamente útiles en el tratamiento de muchas formas de IRI y tanto de cánceres de sangre como de tumores sólidos.

Además, los presentes compuestos de anticuerpos poseen un número de otras propiedades deseables, que incluyen amplia reactividad con CD47 de una amplia variedad de especies de mamíferos, incluida la de humanos, ratones, ratas, cerdos y perros, lo que hace que estos anticuerpos sean útiles tanto en humanos como en medicina veterinaria. Esta característica además es ventajosa en que facilita estudios preclínicos que incluyen, pero no se limitan a, estudios de seguridad y eficacia, en una variedad de especies de mamíferos y, por lo tanto, el desarrollo de dichos anticuerpos como la terapéutica humana y veterinaria.

Por consiguiente, la presente invención proporciona:

[1] Un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD47 humano, de rata, ratón, cerdo y perro, en donde el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena ligera (LCDR 1-3) y tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena pesada (HCDR 1 -3), en donde:

LCDR 1 comprende la secuencia de aminoácidos RSSQSLVHSNGNTYLH (SEQ ID NO: 1);

LCDR 2 comprende la secuencia de aminoácidos KVSYRFS (SEQ ID NO: 2); y

LCDR 3 comprende la secuencia de aminoácidos SQNTHVPRT (SEQ ID NO: 3);

HCDR 1 comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTNYYVF (SEQ ID NO: 4);

HCDR 2 comprende la secuencia de aminoácidos DINPVNGDTNFNEKFKN (SEQ ID NO: 5); y

HCDR 3 comprende la secuencia de aminoácidos GGYTMDY (SEQ ID NO: 6).

[2] El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo de [1], que es quimérico o humanizado.

[3] El anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de cualquiera de uno de [1] o [2], que comprende una región variable de la cadena ligera (LCVR) y una región variable de la cadena pesada (HCVR), en donde dicha LCVR y dicha HCVR comprenden, respectivamente, secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consisten en:

SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 57;

SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 58;

SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 59;

SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 60;

SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 61;

SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 62;

SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 63;

SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 64;

SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 65;

SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 66;

SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 67;

SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 68;

SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 69;

SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 70;

SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 71;

SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 72;

SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 73;

SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 74;

SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 75;

SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 76;

SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 77;

SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 78;

SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 79;

SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 80; y

SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 81.

[4] Un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de la cadena ligera (LCVR) y una región variable de la cadena pesada (HCVR), en donde dicha LCVR y dicha HCVR comprenden, respectivamente, secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consisten en :

SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 57;

SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 58;

SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 61;

SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 64;

SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 66;

SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 68;

SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 69;

SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 75;

SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 77;

SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 78;

SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 79;

SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 80; y

SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 81.

[5] Un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de la cadena ligera (LCVR) y una región variable de la cadena pesada (HCVR), en donde dicha LCVR y dicha HCVR comprenden, respectivamente, secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consisten en :

SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 59;

SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 60;

SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 62;

SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 63;

SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 65;

SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 67;

SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 70;

SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 71;

SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 72;

SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 73;

SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 74; y

SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 76.

[6] Una composición farmacéutica, que comprende dicho anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de uno cualquiera de [1]-[5], y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable.

[7] Un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de uno cualquiera de las reivindicaciones [1]-[5] para uso en terapia humana.

[8] El anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de uno cualquiera de [1]-[5] para uso en el tratamiento de la lesión por isquemia-reperfusión, o una enfermedad autoinmune o inflamatoria, en un humano.

[9] El anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de [8], que comprende una región variable de la cadena ligera (LCVR) y una región variable de la cadena pesada (HCVR), en donde dicha LCVR y dicha HCVR comprenden, respectivamente, secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en:

SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 57;

SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 58;

SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 61;

SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 64;

SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 66;

SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 68;

SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 69;

SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 75;

SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 77;

SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 78;

SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 79;

SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 80; y

SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 81.

[10] El anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de [8] o [9], en donde dicha lesión por isquemia-reperfusión se produce en el trasplante de órganos, lesión renal aguda, cirugía de derivación cardiopulmonar, hipertensión pulmonar, enfermedad de células falciformes, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, resecciones quirúrgicas y cirugía reconstructiva, reinserción de un apéndice u otra parte del cuerpo, injerto de piel o traumatismo.

[11] El anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de [8] o [9], en donde dicha enfermedad autoinmune o inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en artritis, esclerosis múltiple, psoriasis, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal, lupus, enfermedad de Grave y tiroiditis de Hashimoto, y espondilitis anquilosante.

[12] El anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de uno cualquiera de [1]-[5] para uso en el tratamiento de un cáncer susceptible.

[13] El anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de [12], que comprende una región variable de la cadena ligera (LCVR) y una región variable de la cadena pesada (HCVR), en donde dicha LCVR y dicha HCVR comprenden, respectivamente, secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en:

SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 59;

SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 60;

SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 62;

SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 63;

SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 65;

SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 67;

SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 70;

SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 71;

SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 72;

SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 73;

SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 74; y

SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 76.

[14] El anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de [12] o [13], que favorece la fagocitosis y/o la muerte de las células de dicho cáncer susceptible.

[15] El anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de uno cualquiera de [12]-[14], en donde dicho cáncer susceptible se selecciona del grupo que consiste en una leucemia, un linfoma, cáncer de ovarios, cáncer de mama, cáncer endometrial, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer gástrico, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, cáncer de bronquios, cáncer de huesos, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de hígado y conductos biliares, cáncer de esófago, cáncer renal, cáncer de tiroides, cáncer de cabeza y cuello, cáncer testicular, glioblastoma, astrocitoma, melanoma, síndrome mielodisplásico y un sarcoma.

[16] El anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de [15], en donde:

dicha leucemia se selecciona del grupo que consiste en leucemia linfocítica aguda (linfoblástica), leucemia mieloide aguda, leucemia mielógena, leucemia linfocítica crónica, mieloma múltiple, leucemia de células plasmáticas y leucemia mieloide crónica;

dicho linfoma se selecciona del grupo que consiste en linfoma de Hodgkin y linfoma no Hodgkin que incluye linfoma de células B, linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular, linfoma de células del manto, linfoma de células B de la zona marginal, linfoma de células T y macroglobulinemia de Waldenstrom; y

dicho sarcoma se selecciona del grupo que consiste en osteosarcoma, sarcoma de Ewing, leiomiosarcoma, sarcoma sinovial, sarcoma alveolar de partes blandas, angiosarcoma, liposarcoma, fibrosarcoma, rabdomiosarcoma y crondrosarcoma.

[17] El anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, para uso de [8], que comprende además administrar a dicho paciente un tratamiento terapéutico antitumoral seleccionado del grupo que consiste en cirugía, radiación, un agente antitumoral o antineoplásico, y combinaciones de cualquiera de los anteriores.

En la presente memoria se describe pero no está dentro del alcance de la invención reivindicada:

[18] Uso de dicho anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de uno cualquiera de [1]-[5] para tratar la lesión por isquemia-reperfusión, o una enfermedad autoinmune o inflamatoria, en un humano o animal de compañía/mascota, animal de trabajo, animal deportivo, animal de zoológico u otro animal valioso mantenido en cautiverio.

[19] El uso de [18], en donde dicho anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región variable de la cadena ligera (LCVR) y una región variable de la cadena pesada (HCVR), en donde dicha LCVR y dicha HCVR comprenden, respectivamente, secuencias de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en:

SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 57;

SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 58;

SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 61;

SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 64;

SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 66;

SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 68;

SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 69;

SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 75;

SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 77;

SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 78;

SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 79;

SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 80; y

SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 81.

[20] Uso de dicho anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de uno cualquiera de [1]-[5] para tratar un cáncer susceptible.

[21] El uso de [20], en donde dicho anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región variable de la cadena ligera (LCVR) y una región variable de la cadena pesada (HCVR), en donde dicha LCVR y dicha HCVR comprenden, respectivamente, secuencias de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en:

SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 59;

SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 60;

SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 62;

SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 63;

SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 65;

SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 67;

SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 70;

SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 71;

SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 72;

SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 73;

SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 74; y

SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 76.

[22] Uso de dicho anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de uno cualquiera de [1]-[5] para la fabricación de un medicamento para tratar la lesión por isquemia-reperfusión, o una enfermedad autoinmune o inflamatoria, en un humano o animal de compañía/mascota, animal de trabajo, animal deportivo, animal de zoológico u otro animal valioso mantenido en cautiverio.

[23] El uso de [22], en donde dicho anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región variable de la cadena ligera (LCVR) y una región variable de la cadena pesada (HCVR), en donde dicha LCVR y dicha HCVR comprenden, respectivamente, secuencias de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en:

SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 57;

SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 58;

SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 61;

SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 64;

SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 66;

SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 68;

SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 69;

SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 75;

SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 77;

SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 78;

SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 79;

SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 80; y

SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 81.

[24] El uso de [22] o [23], en donde dicha lesión por isquemia-reperfusión se produce en el trasplante de órganos, lesión renal aguda, cirugía de derivación cardiopulmonar, hipertensión pulmonar, enfermedad de células falciformes, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, resecciones quirúrgicas y cirugía reconstructiva, reinserción de un apéndice u otra parte del cuerpo, injerto de piel y traumatismo.

[25] El uso de [22] o [23], en donde dicha enfermedad autoinmune o inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en artritis, esclerosis múltiple, psoriasis, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal, lupus, enfermedad de Grave y tiroiditis de Hashimoto, y espondilitis anquilosante.

[26] Uso de dicho anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de uno cualquiera de [1]-[5] para la fabricación de un medicamento para tratar un cáncer susceptible.

[27] El uso de [26], en donde dicho anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región variable de la cadena ligera (LCVR) y una región variable de la cadena pesada (HCVR), en donde dicha LCVR y dicha HCVR comprenden, respectivamente, secuencias de amino ácidos seleccionadas del grupo que consiste en:

SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 59;

SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 60;

SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 62;

SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 63;

SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 65;

SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 67;

SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 70;

SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 71;

SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 72;

SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 73;

SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 74; y

SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 76.

[28] Un método para tratar la isquemia o lesión por isquemia-reperfusión en un paciente en necesidad del mismo, que comprende administrar a dicho paciente una cantidad eficaz de dicho anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de uno cualquiera de [1]-[5], o un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que compite con dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo de uno cualquiera de [1]-[5] para unirse a CD47.

[29] El método de [28], en donde dicho paciente está a punto de ser sometido, o está sufriendo, isquemia o lesión por isquemia-reperfusión.

[30] El método de [28] o [29], en donde dicho paciente es un humano.

[31] El método de [28] o [29], en donde dicho paciente es un animal de compañía/mascota, animal de trabajo, animal deportivo, animal de zoológico u otro animal valioso mantenido en cautiverio.

[32] El método de uno cualquiera de [28]-[29], en donde dicha isquemia se produce porque dicho paciente se someterá o se está sometiendo a una cirugía seleccionada del grupo que consiste en cirugía de tegumento, cirugía de tejidos blandos, cirugía de tejidos compuestos, cirugía estética, resecciones quirúrgicas, cirugía reconstructiva, cirugía de injerto de piel y cirugía de reinserción de extremidades.

[33] El método de [32], en donde dicho injerto de piel es un autoinjerto.

[34] El método de uno cualquiera de [28]-[31], en donde dicha isquemia se produce porque dicho paciente se someterá o se está sometiendo a una cirugía de trasplante de órganos.

[35] El método de uno cualquiera de [28]-[31], en donde dicha lesión por isquemia-reperfusión se produce en el trasplante de órganos, lesión renal aguda, cirugía de derivación cardiopulmonar, hipertensión pulmonar, enfermedad de células falciformes, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, resección quirúrgica, cirugía reconstructiva, reinserción de un apéndice u otra parte del cuerpo, o injerto de piel.

[36] El método de uno cualquiera de [28]-[35], en donde dicho anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno del mismo, o anticuerpo monoclonal competidor o fragmento de unión a antígeno del mismo, se administra antes, durante o después de que dicho sujeto se someta a isquemia o cirugía, o una combinación de cualquiera de estos períodos de tiempo.

[37] El método de uno cualquiera de [28]-[36], que comprende además administrar a dicho paciente una cantidad eficaz de un donante de óxido nítrico, precursor, o ambos; un agente tópico que genera óxido nítrico; un agente que activa la guanilil ciclasa soluble; un agente que inhibe las fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicos; o cualquier combinación de cualquiera de los anteriores.

[38] El método de [37], en donde:

dicho donante o precursor de óxido nítrico se selecciona del grupo que consiste en NO gas, dinitrato de isosorbida, nitrito, nitroprusiato, nitroglicerina, 3-morfolinosidnonimina (SIN-1), S-nitroso-N-acetilpenicilamina (SNAP), dietilentriamina/NO (DETA/NO), S-nitrosotioles, Bidil® y arginina; y

dicho agente que inhibe las fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicos se selecciona del grupo que consiste en sildenafil, tadalafil, vardenafil, udenafil y avanafil.

[39] Un método para aumentar la perfusión tisular en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de uno cualquiera de [1]-[5], o un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que compite con dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo de uno cualquiera de [1]-[5] para unirse a CD47.

[40] El método de [39], en donde dicho sujeto tiene, o está en riesgo de desarrollar, al menos una enfermedad o afección seleccionada del grupo que consiste en lesión por isquemia-reperfusión, infarto de miocardio, isquemia miocárdica, accidente cerebrovascular, isquemia cerebral, anemia de células falciforme e hipertensión pulmonar.

[41] El método de [39], en donde dicho sujeto tiene, o está en riesgo de desarrollar, al menos una enfermedad o afección seleccionada del grupo que consiste en hipertensión, aterosclerosis, vasculopatía, isquemia secundaria a diabetes y enfermedad vascular periférica.

[42] El método de [39], en donde surge la necesidad de aumentar la perfusión tisular porque dicho sujeto ha tenido, está teniendo o tendrá una cirugía seleccionada del grupo que consiste en cirugía de tegumento, cirugía de tejido blando, cirugía de tejido compuesto, cirugía de injerto de piel, resección de un órgano sólido y reinserción o de un apéndice o de otra parte del cuerpo.

[43] El método de [42], en donde dicho injerto de piel es un autoinjerto.

[44] El método de [39], en donde surge la necesidad de aumentar la perfusión tisular porque dicho sujeto ha tenido, está teniendo o tendrá una cirugía de trasplante de órganos.

[45] El método de uno cualquiera de [39]-[44], que comprende además administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de un donante de óxido nítrico, precursor, o ambos; un agente tópico que genera óxido nítrico; un agente que activa la guanilil ciclasa soluble; un agente que inhibe las fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicos; o cualquier combinación de cualquiera de los anteriores.

[46] El método de [45], en donde:

[47] Un método para trasplantar un órgano donante de un donante de órganos a un receptor de órganos, que comprende cualquier etapa única, cualquier combinación de etapas o todas las etapas seleccionadas del grupo que consiste en las etapas i)-iii):

i) administrar a dicho donante de órganos antes, durante, tanto antes como durante, después, o cualquier combinación de los mismos, de la donación de dicho órgano donante una cantidad eficaz de dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo de uno cualquiera de [1]-[5], y/o un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que compite con dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo de uno cualquiera de [1]-[5] para unirse a CD47;

ii) poner en contacto dicho órgano donante antes, durante, tanto antes como durante, después, o cualquier combinación de los mismos, del trasplante con dicho receptor de órganos, y una cantidad eficaz de dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo de uno cualquiera de [1]-[5], y/o un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que compite con dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo de uno cualquiera de [1]-[5] para unirse a CD47; y

iii) administrar a dicho receptor de órganos antes, durante, tanto antes como durante, después, o cualquier combinación de los mismos, del trasplante de dicho órgano donante a dicho receptor de órganos, una cantidad eficaz de dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo de uno cualquiera de [1]-[5], y/o un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que compite con dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo de uno cualquiera de [1]-[5] para unirse a CD47.

[48] El método de la reivindicación 47, en donde dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo de uno cualquiera de [1]-[5], o anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que compite con dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno de uno cualquiera de [1]-[5] para la unión a CD47, reduce la lesión por isquemia-reperfusión en dicho órgano donante.

[49] El método de [47] o [48], que comprende además administrar a dicho donante de órganos, dicho órgano donante, dicho receptor de órganos, o cualquier combinación de los mismos, una cantidad eficaz de un donante de óxido nítrico, precursor, o ambos; un agente tópico que genera óxido nítrico; un agente que activa la guanilil ciclasa soluble; o un agente que inhibe las fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicos; o cualquier combinación de cualquiera de los anteriores.

[50] El método de [49], en donde:

[51] Un método para tratar una enfermedad autoinmune o inflamatoria en un paciente en necesidad del mismo, que comprende administrar a dicho paciente una cantidad eficaz de dicho anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de uno cualquiera de [1]-[5], o un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que compite con dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo de uno cualquiera de [1]-[5] para unirse a CD47.

[52] El método de [51], en donde dicha enfermedad autoinmune o inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en artritis, esclerosis múltiple, psoriasis, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal, lupus, enfermedad de Grave y tiroiditis de Hashimoto, y espondilitis anquilosante.

[53] El método de [51] o [52], en donde dicho paciente es un humano.

[54] El método de [51] o [52], en donde dicho paciente es un animal de compañía/mascota, animal de trabajo, animal deportivo, animal de zoológico u otro animal valioso mantenido en cautiverio.

[55] El método de uno cualquiera de [51]-[54], que comprende además administrar a dicho paciente una cantidad eficaz de un donante de óxido nítrico, precursor, o ambos; un agente tópico que genera óxido nítrico; un agente que activa la guanilil ciclasa soluble; un agente que inhibe las fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicos; o cualquier combinación de cualquiera de los anteriores.

[56] El método de [55], en donde:

[57] Un método para tratar un cáncer susceptible en un humano o animal de compañía/mascota, animal de trabajo, animal deportivo, animal de zoológico u otro animal valioso mantenido en cautiverio en necesidad del mismo, que comprende administrar al mismo una cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo de uno cualquiera de [1]-[5], o un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que compite con dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo de uno cualquiera de [1]-[5] para la unión a CD47, y que presenta actividad citotóxica.

[58] El método de [57], en donde dicho cáncer susceptible se selecciona del grupo que consiste en una leucemia, un linfoma, cáncer de ovarios, cáncer de mama, cáncer endometrial, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer gástrico, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, cáncer de bronquios, cáncer de huesos, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de hígado y conductos biliares, cáncer de esófago, cáncer renal, cáncer de tiroides, cáncer de cabeza y cuello, cáncer testicular, glioblastoma, astrocitoma, melanoma, síndrome mielodisplásico y un sarcoma.

[59] El método de [58], en donde:

[60] El método de uno cualquiera de [57]-[59], en donde dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo de uno cualquiera de [1]-[5], o dicho anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que compite con dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo de uno cualquiera de [1]-[5] para unirse a CD47 y que presenta actividad citotóxica, aumenta la fagocitosis de las células de dicho cáncer susceptible.

[61] El método de [60], en donde dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo de uno cualquiera de [1]-[5], o dicho anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que compite con dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo de uno cualquiera de [1]-[5] para la unión a CD47 que presenta actividad citotóxica y aumenta la fagocitosis de las células de dicho cáncer susceptible inhibe la unión de CD47 a SIRPalpha.

[62] El método de uno cualquiera de [57] a [61], en donde dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo de uno cualquiera de [1]-[5], o dicho anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que compite con dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo de uno cualquiera de [1]-[5] para unirse a CD47 y que presenta actividad citotóxica, es directamente tóxico para las células de dicho cáncer susceptible.

[63] Un anticuerpo monoclonal humanizado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD47 humano.

[64] Un anticuerpo monoclonal humanizado o quimérico, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD47 humano, de rata, ratón, cerdo o perro, bloquea la unión de SIRPalpha a CD47, y que presenta las actividades duales de:

i) inducir la muerte de células cancerosas, y

ii) aumentar la fagocitosis de dichas células cancerosas.

[65] Un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que compite con dicho anticuerpo monoclonal humanizado o quimérico o fragmento de unión a antígeno del mismo de 64 para unirse a CD47 humano, de rata, ratón, cerdo o perro, y que presenta dichas actividades duales.

[66] Una composición farmacéutica, que comprende dicho anticuerpo monoclonal humanizado o quimérico, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de [64], o dicho anticuerpo monoclonal competidor, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de [65], y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable.

[67] Un anticuerpo monoclonal humanizado o quimérico, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD47 humano, de rata, ratón, cerdo o perro, bloquea la unión de SIRPalpha a CD47, y que presenta las actividades duales de:

i) inducir la muerte de células cancerosas, y

ii) aumentar la fagocitosis de dichas células cancerosas, o

un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que compite con dicho anticuerpo monoclonal humanizado o quimérico o fragmento de unión a antígeno del mismo para unirse a CD47 humano, de rata, ratón, cerdo o perro, y que presenta dichas actividades duales,

para uso en terapia humana o terapia de animales de compañía/mascotas, animales de trabajo, animales deportivos, animales de zoológico o terapia de otros animales valiosos mantenidos en cautiverio.

[68] Un anticuerpo monoclonal humanizado o quimérico, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD47 humano, de rata, ratón, cerdo o perro, bloquea la unión de SIRPalpha a CD47, y que presenta las actividades duales de:

i) inducir la muerte de células cancerosas, y

ii) aumentar la fagocitosis de dichas células cancerosas, o

para uso en el tratamiento de lesiones por isquemia-reperfusión, o una enfermedad autoinmune o inflamatoria, en un humano o animal de compañía/mascota, animal de trabajo, animal deportivo, animal de zoológico u otro animal valioso mantenido en cautiverio.

[69] El anticuerpo monoclonal humanizado o quimérico o fragmento de unión a antígeno del mismo, o el anticuerpo monoclonal competidor o fragmento de unión a antígeno del mismo, de [68], en donde dicha lesión por isquemiareperfusión se produce en el trasplante de órganos, lesión renal aguda, cirugía de derivación cardiopulmonar, hipertensión pulmonar , enfermedad de células falciformes, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, resecciones quirúrgicas y cirugía reconstructiva, reinserción de un apéndice u otra parte del cuerpo, injerto de piel o traumatismo.

[70] El anticuerpo monoclonal humanizado o quimérico o fragmento de unión a antígeno del mismo, o el anticuerpo monoclonal competidor o fragmento de unión a antígeno del mismo, de [68], en donde dicha enfermedad autoinmune o inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en artritis, esclerosis múltiple, psoriasis, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal, lupus, enfermedad de Grave y tiroiditis de Hashimoto, y espondilitis anquilosante.

[71] Un anticuerpo monoclonal humanizado o quimérico, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD47 humano, de rata, ratón, cerdo o perro, bloquea la unión de SIRPalpha a CD47, y que presenta las actividades duales de:

i) inducir la muerte de células cancerosas, y

ii) aumentar la fagocitosis de dichas células cancerosas, o

para uso en el tratamiento de un cáncer susceptible.

[72] El anticuerpo monoclonal humanizado o quimérico o fragmento de unión a antígeno del mismo, o el anticuerpo monoclonal competidor o fragmento de unión a antígeno del mismo, de [71], en donde dicho cáncer susceptible se selecciona del grupo que consiste en una leucemia, un linfoma, cáncer de ovarios, cáncer de mama, cáncer endometrial, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer gástrico, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, cáncer de bronquios, cáncer de huesos, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de hígado y conductos biliares, cáncer de esófago, cáncer renal, cáncer de tiroides, cáncer de cabeza y cuello, cáncer testicular, glioblastoma, astrocitoma, melanoma, síndrome mielodisplásico y un sarcoma.

[73] El anticuerpo monoclonal humanizado o quimérico o fragmento de unión a antígeno del mismo, o anticuerpo monoclonal competidor o fragmento de unión a antígeno del mismo, de [72], en donde:

[74] Uso de un anticuerpo monoclonal humanizado o quimérico, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD47 humano, de rata, ratón, cerdo o perro, bloquea la unión de SIRPalpha a CD47, y que presenta las actividades duales de:

i) inducir la muerte de células cancerosas, y

ii) aumentar la fagocitosis de dichas células cancerosas, o

para tratar la lesión por isquemia-reperfusión, o una enfermedad autoinmune o inflamatoria, en un humano o animal de compañía/mascota, animal de trabajo, animal deportivo, animal de zoológico u otro animal valioso mantenido en cautiverio.

[75] Uso de un anticuerpo monoclonal humanizado o quimérico, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD47 humano, de rata, ratón, cerdo o perro, bloquea la unión de SIRPalpha a CD47, y que presenta las actividades duales de:

i) inducir la muerte de células cancerosas, y

ii) aumentar la fagocitosis de dichas células cancerosas, o

para tratar un cáncer susceptible.

[76] El uso de [75], en donde dicho cáncer susceptible se selecciona del grupo que consiste en una leucemia, un linfoma, cáncer de ovarios, cáncer de mama, cáncer endometrial, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer gástrico, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, cáncer de bronquios, cáncer de huesos, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de hígado y conductos biliares, cáncer de esófago, cáncer renal, cáncer de tiroides, cáncer de cabeza y cuello, cáncer testicular, glioblastoma, astrocitoma, melanoma, síndrome mielodisplásico y un sarcoma.

[77] El uso de [76], en donde:

[78] Uso de un anticuerpo monoclonal humanizado o quimérico, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD47 humano, de rata, ratón, cerdo o perro, bloquea la unión de SIRPalpha a CD47, y que presenta las actividades duales de:

i) inducir la muerte de células cancerosas, y

ii) aumentar la fagocitosis de dichas células cancerosas, o

para la fabricación de un medicamento para tratar la lesión por isquemia-reperfusión, o una enfermedad autoinmune o inflamatoria, en un humano o animal de compañía/mascota, animal de trabajo, animal deportivo, animal de zoológico u otro animal valioso mantenido en cautiverio.

[79] El uso de [78], en donde dicha lesión por isquemia-reperfusión se produce en el trasplante de órganos, lesión renal aguda, cirugía de derivación cardiopulmonar, hipertensión pulmonar, enfermedad de células falciformes, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, resecciones quirúrgicas y cirugía reconstructiva, reinserción de un apéndice u otro parte del cuerpo, injerto de piel y traumatismo.

[80] El uso de [78], en donde dicha enfermedad autoinmune o inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en artritis, esclerosis múltiple, psoriasis, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal, lupus, enfermedad de Grave y tiroiditis de Hashimoto, y espondilitis anquilosante.

[81] Uso de un anticuerpo monoclonal humanizado o quimérico, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD47 humano, de rata, ratón, cerdo o perro, bloquea la unión de SIRPalpha a CD47, y que presenta las actividades duales de:

i) inducir la muerte de células cancerosas, y

ii) aumentar la fagocitosis de dichas células cancerosas, o

para la fabricación de un medicamento para tratar un cáncer susceptible.

[82] El uso de [81], en donde dicho cáncer susceptible se selecciona del grupo que consiste en una leucemia, un linfoma, cáncer de ovarios, cáncer de mama, cáncer endometrial, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer gástrico, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, cáncer de bronquios, cáncer de huesos, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de hígado y conductos biliares, cáncer de esófago, cáncer renal, cáncer de tiroides, cáncer de cabeza y cuello, cáncer testicular, glioblastoma, astrocitoma, melanoma, síndrome mielodisplásico y sarcoma.

[83] El uso de [82], en donde:

[84] Un método para tratar la isquemia o lesión por isquemia-reperfusión en un paciente en necesidad del mismo, que comprende administrar a dicho paciente una cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal humanizado o quimérico, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD47 humano, de rata, ratón, cerdo, o perro, bloquea la unión de SIRPalpha a CD47, y que presenta las actividades duales de:

i) inducir la muerte de células cancerosas, y

ii) aumentar la fagocitosis de dichas células cancerosas, o

una cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que compite con dicho anticuerpo monoclonal humanizado o quimérico o fragmento de unión a antígeno del mismo para unirse a CD47 humano, de rata, ratón, cerdo o perro, y que presenta dichas actividades duales.

[85] El método de [84], en donde dicho paciente está a punto de ser sometido, o está sufriendo, isquemia o lesión por isquemia-reperfusión.

[86] El método de [84] u [85], en donde dicho paciente es un humano.

[87] El método de [84] u [85], en donde dicho paciente es un animal de compañía/mascota, animal de trabajo, animal deportivo, animal de zoológico u otro animal valioso mantenido en cautiverio.

[88] El método de uno cualquiera de [84]-[87], en donde dicha isquemia se produce porque dicho paciente se someterá o se está sometiendo a una cirugía seleccionada del grupo que consiste en cirugía de tegumento, cirugía de tejidos blandos, cirugía de tejidos compuestos, cirugía estética, resecciones quirúrgicas, cirugía reconstructiva, cirugía de injerto de piel y cirugía de reinserción de extremidades.

[89] El método de [88], en donde dicho injerto de piel es un autoinjerto.

[90] El método de uno cualquiera de [84]-[87], en donde dicha isquemia se produce porque dicho paciente se someterá o se está sometiendo a una cirugía de trasplante de órganos.

[91] El método de uno cualquiera de [84]-[87], en donde dicha lesión por isquemia-reperfusión se produce en el trasplante de órganos, lesión renal aguda, cirugía de derivación cardiopulmonar, hipertensión pulmonar, enfermedad de células falciformes, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, resección quirúrgica, cirugía reconstructiva , reinserción de un apéndice u otra parte del cuerpo, o injerto de piel.

[92] El método de uno cualquiera de [84]-[91], en donde dicho anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno del mismo, o anticuerpo monoclonal competidor o fragmento de unión a antígeno del mismo, se administra antes, durante o después de que dicho sujeto se someta a isquemia o cirugía, o una combinación de cualquiera de estos períodos de tiempo.

[93] El método de uno cualquiera de [84]-[92], que comprende además administrar a dicho paciente una cantidad eficaz de un donante de óxido nítrico, precursor o ambos; un agente tópico que genera óxido nítrico; un agente que activa la guanilil ciclasa soluble; un agente que inhibe las fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicos; o cualquier combinación de cualquiera de los anteriores.

[94] El método de [93], en donde:

[95] Un método para aumentar la perfusión tisular en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal humanizado o quimérico, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD47 humano, de rata, de ratón, de cerdo o de perro, bloquea la unión de SIRPalpha a CD47, y que presenta las actividades duales de:

i) inducir la muerte de células cancerosas, y

ii) aumentar la fagocitosis de dichas células cancerosas, o

[96] El método de [95], en donde dicho sujeto tiene, o está en riesgo de desarrollar, al menos una enfermedad o afección seleccionada del grupo que consiste en lesión por isquemia-reperfusión, infarto de miocardio, isquemia miocárdica, accidente cerebrovascular, isquemia cerebral, anemia falciforme e hipertensión pulmonar.

[97] El método de [95], en donde dicho sujeto tiene, o está en riesgo de desarrollar, al menos una enfermedad o afección seleccionada del grupo que consiste en hipertensión, aterosclerosis, vasculopatía, isquemia secundaria a diabetes y enfermedad vascular periférica.

[98] El método de [97], en donde surge la necesidad de aumentar la perfusión tisular porque dicho sujeto ha tenido, está teniendo, o tendrá, una cirugía seleccionada del grupo que consiste en cirugía de tegumento, cirugía de tejido blando, cirugía de tejido compuesto, cirugía de injerto de piel, resección de un órgano sólido y reinserción o de un apéndice o de otra parte del cuerpo.

[99] El método de [98], en donde dicho injerto de piel es un autoinjerto.

[100] El método de [95], en donde surge la necesidad de aumentar la perfusión tisular porque dicho sujeto ha tenido, está teniendo o tendrá una cirugía de trasplante de órganos.

[101] El método de uno cualquiera de [95]-[100], que comprende además administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de un donante de óxido nítrico, precursor, o ambos; un agente tópico que genera óxido nítrico; un agente que activa la guanilil ciclasa soluble; un agente que inhibe las fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicos; o cualquier combinación de cualquiera de los anteriores.

[102] El método de [101], en donde:

[103] Un método para trasplantar un órgano donante de un donante de órganos a un receptor de órganos, que comprende cualquier etapa única, cualquier combinación de etapas o todas las etapas seleccionadas del grupo que consiste en las etapas i)-iii):

i) administrar a dicho donante de órganos antes, durante, tanto antes como durante, después, o cualquier combinación de los mismos, de la donación de dicho órgano donante una cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal humanizado o quimérico, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD47 humano, de rata, ratón, cerdo o perro, bloquea la unión de SIRPalpha a CD47 y presenta las actividades duales de:

a) inducir la muerte de células cancerosas, y

b) aumentar la fagocitosis de dichas células cancerosas, o

una cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que compite con dicho anticuerpo monoclonal humanizado o quimérico o fragmento de unión a antígeno del mismo para unirse a CD47 humano, de rata, ratón, cerdo o perro, y que presenta dichas actividades duales;

ii) poner en contacto dicho órgano donante antes, durante, tanto antes como durante, después, o cualquier combinación de los mismos, del trasplante con dicho receptor de órganos y una cantidad eficaz de dicho anticuerpo monoclonal humanizado o quimérico, fragmento de unión a antígeno del mismo o anticuerpo monoclonal competidor o fragmento de unión a antígeno del mismo; y

iii) administrar a dicho receptor de órganos antes, durante, tanto antes como durante, después, o cualquier combinación de los mismos, del trasplante de dicho órgano donante a dicho receptor de órganos, una cantidad eficaz de dicho anticuerpo monoclonal humanizado o quimérico, fragmento de unión a antígeno del mismo, o el anticuerpo monoclonal competidor o el fragmento de unión al antígeno del mismo.

[104] El método de [103], en donde dicho anticuerpo monoclonal humanizado o quimérico, fragmento de unión a antígeno del mismo, o anticuerpo monoclonal competidor o fragmento de unión a antígeno del mismo, reduce la lesión por isquemia-reperfusión en dicho órgano donante.

[105] El método de [103] o [104], que comprende además administrar a dicho donante de órganos, dicho órgano donante, dicho receptor de órganos, o cualquier combinación de los mismos, una cantidad eficaz de un donante de óxido nítrico, precursor, o ambos; un agente tópico que genera óxido nítrico; un agente que activa la guanilil ciclasa soluble; un agente que inhibe las fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicos; o cualquier combinación de cualquiera de los anteriores.

[106] El método de [105], en donde:

[107] Un método para tratar una enfermedad autoinmune o inflamatoria en un paciente en necesidad del mismo, que comprende administrar a dicho paciente una cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal humanizado o quimérico, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD47 humano, de rata, ratón, cerdo, o perro, bloquea la unión de SIRPalpha a CD47, y que presenta las actividades duales de:

i) inducir la muerte de células cancerosas, y

ii) aumentar la fagocitosis de dichas células cancerosas, o

[108] El método de [107], en donde dicha enfermedad autoinmune o inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en artritis, esclerosis múltiple, psoriasis, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal, lupus, enfermedad de Grave y tiroiditis de Hashimoto, y espondilitis anquilosante.

[109] El método de [107] o [108], en donde dicho paciente es un humano.

[110] El método de [107] o [108], en donde dicho paciente es un animal de compañía/mascota, animal de trabajo, animal deportivo, animal de zoológico u otro animal valioso mantenido en cautiverio.

[111] El método de uno cualquiera de [107]-[110], que comprende además administrar a dicho paciente una cantidad eficaz de un donante de óxido nítrico, precursor, o ambos; un agente tópico que genera óxido nítrico; un agente que activa la guanilil ciclasa soluble; un agente que inhibe las fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicos; o cualquier combinación de cualquiera de los anteriores.

[112] El método de [111], en donde:

[113] Un método para tratar un cáncer susceptible en un humano o animal de compañía/mascota, animal de trabajo, animal deportivo, animal de zoológico u otro animal valioso en cautiverio en necesidad del mismo, que comprende administrar al mismo una cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal humanizado o quimérico, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD47 humano, de rata, ratón, cerdo o perro, bloquea la unión de SIRPalpha a CD47, y que presenta las actividades duales de:

i) inducir la muerte de células cancerosas, y

ii) aumentar la fagocitosis de dichas células cancerosas, o

administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que compite con dicho anticuerpo monoclonal humanizado o quimérico o fragmento de unión a antígeno del mismo para unirse al CD47 humano, de rata, ratón, cerdo o perro, que bloquea la unión de SIRPalpha a CD47, y que presenta dichas actividades duales.

[114] El método de [113], en donde dicho cáncer susceptible se selecciona del grupo que consiste en una leucemia, un linfoma, cáncer de ovarios, cáncer de mama, cáncer endometrial, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer gástrico, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, cáncer de bronquios, cáncer de huesos, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de hígado y conductos biliares, cáncer de esófago, cáncer renal, cáncer de tiroides, cáncer de cabeza y cuello, cáncer testicular, glioblastoma, astrocitoma, melanoma, síndrome mielodisplásico y sarcoma.

[115] El método de [114], en donde:

[116] El uso o método de [17], en donde dicho agente antitumoral o antineoplásico es una molécula química pequeña o un terapéutico biológico.

[117] El uso o método de [116], en donde dicha molécula química pequeña o terapéutico biológico se selecciona del grupo que consiste en un agente alquilante; un antimetabolito; un producto natural; un agente misceláneo utilizado en terapia contra el cáncer; una hormona; un antagonista; un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo; una citocina; un oligonucleótido antisentido; y un siRNA.

[118] Un método para potenciar el efecto terapéutico de un activador de guanilil ciclasa soluble, que comprende la administración a un paciente en necesidad del mismo:

i) una cantidad eficaz de un activador de guanilil ciclasa soluble, y

ii) un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo, o anticuerpo competidor o fragmento de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones [1]-[5] o [64]-[65] en una cantidad eficaz para mejorar dicho efecto terapéutico de dicho activador de guanilil ciclasa soluble.

[119] El método de [118], en donde dicho efecto terapéutico comprende el tratamiento de la lesión por isquemiareperfusión, o una enfermedad autoinmune o inflamatoria, en un humano o animal de compañía/mascota, animal de trabajo, animal deportivo, animal de zoológico u otro animal valioso mantenido en cautiverio.

[120] El método de [119], en donde dicha lesión por isquemia-reperfusión se produce en el trasplante de órganos, lesión renal aguda, cirugía de derivación cardiopulmonar, hipertensión pulmonar, enfermedad de células falciformes, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, resecciones quirúrgicas y cirugía reconstructiva, reinserción de un apéndice u otro parte del cuerpo, injerto de piel o traumatismo.

[121] El método de [119], en donde dicha enfermedad autoinmune o inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en artritis, esclerosis múltiple, psoriasis, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal, lupus, enfermedad de Grave y tiroiditis de Hashimoto, y espondilitis anquilosante.

[122] Uso de dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo, o anticuerpo competidor o fragmento de unión a antígeno del mismo, de uno cualquiera de [1]-[5] o [64]-[65] para la fabricación de un medicamento para mejorar el efecto terapéutico de un activador de guanilil ciclasa soluble.

[123] El uso de [122], en donde dicho efecto terapéutico comprende el tratamiento de la lesión por isquemiareperfusión, o una enfermedad autoinmune o inflamatoria, en un humano o animal de compañía/mascota, animal de trabajo, animal deportivo, animal de zoológico u otro animal valioso mantenido en cautiverio.

[124] El uso de [123], en donde dicha lesión por isquemia-reperfusión se produce en el trasplante de órganos, lesión renal aguda, cirugía de derivación cardiopulmonar, hipertensión pulmonar, enfermedad de células falciformes, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, resecciones quirúrgicas y cirugía reconstructiva, reinserción de un apéndice u otro parte del cuerpo, injerto de piel y traumatismo.

[125] El uso de [123], en donde dicha enfermedad autoinmune o inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en artritis, esclerosis múltiple, psoriasis, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal, lupus, enfermedad de Grave y tiroiditis de Hashimoto, y espondilitis anquilosante.

[126] Un método para aumentar el nivel de cGMP en células vasculares, que comprende administrar a dichas células:

i) una cantidad eficaz de un activador de guanilil ciclasa soluble, y

ii) un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo, o anticuerpo competidor o fragmento de unión a antígeno del mismo, de uno cualquiera de [1]-[5] o [64]-[65] en una cantidad eficaz para aumentar el nivel de cGMP en dichas células vasculares.

[127] El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo, o anticuerpo competidor o fragmento de unión a antígeno del mismo, de uno cualquiera de [1 ]-[5] o [64]-[65], que es un isotipo IgG seleccionado del grupo que consiste en el isotipo IgG 1, isotipo IgG2, isotipo IgG3 e isotipo IgG4.

[128] Una composición farmacéutica, que comprende dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo, o anticuerpo competidor o fragmento de unión a antígeno del mismo, de [127], y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable.

[129] El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo, o anticuerpo competidor o fragmento de unión a antígeno del mismo, de [127] para uso en terapia humana o terapia de animales de compañía/mascotas, animales de trabajo, animales deportivos, animales de zoológico o terapia de otros animales valiosos mantenidos en cautiverio.

[130] El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al antígeno del mismo, o anticuerpo competidor o fragmento de unión al antígeno del mismo, de [127] para uso en el tratamiento de la lesión por isquemia-reperfusión, o una enfermedad autoinmune o inflamatoria, en un humano o animal de compañía/mascota, animal de trabajo, animal deportivo, animal de zoológico u otro animal valioso mantenido en cautiverio.

[131] El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo, o anticuerpo competidor o fragmento de unión a antígeno del mismo, de [127] para uso en el tratamiento de un cáncer susceptible.

[132] Uso de dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo, o anticuerpo competidor o fragmento de unión a antígeno del mismo, de [127] para tratar la lesión por isquemia-reperfusión, o una enfermedad autoinmune o inflamatoria, en un humano o animal de compañía/mascota, animal de trabajo, animal deportivo, animal de zoológico u otro animal valioso mantenido en cautiverio.

[133] Uso de dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo, o anticuerpo competidor o fragmento de unión a antígeno del mismo, de [127] para tratar un cáncer susceptible.

[134] Uso de dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo, o anticuerpo competidor o fragmento de unión a antígeno del mismo, de [127] para la fabricación de un medicamento para tratar la lesión por isquemia-reperfusión, o una enfermedad autoinmune o inflamatoria, en un humano o animal de compañía/mascota, animal de trabajo, animal deportivo, animal de zoológico u otro animal valioso mantenido en cautiverio.

[135] Uso de dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo, o anticuerpo competidor o fragmento de unión a antígeno del mismo, de [127] para la fabricación de un medicamento para tratar un cáncer susceptible.

Se describe expresamente en la presente memoria el uso de los anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de [127]-[135] en cualquiera de los métodos, usos, composiciones o cualquier otra realización descrita en la presente memoria.

[136] El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo, o anticuerpo competidor o fragmento de unión a antígeno del mismo, de uno cualquiera de [1]-[5] o [64]-[65], en donde:

i) cuando dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo, o anticuerpo competidor o fragmento de unión a antígeno del mismo, es el isotipo IgG 1 humana, se modifica la región constante del IgG 1 humana en el aminoácido Asn297 para evitar la glicosilación; y/o en el aminoácido Leu234 y/o Leu235 para alterar las interacciones del receptor Fc; y/o para mejorar la unión a FcRn; y/o para alterar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y/o la citotoxicidad dependiente del complemento; y/o para inducir la heterodimerización, además de manera opcional mediante la introducción de un enlace disulfuro;

ii) cuando dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo, o anticuerpo competidor o fragmento de unión a antígeno del mismo, es el isotipo IgG2 humana, se modifica la región constante del IgG2 humana en el aminoácido Asn297 para evitar la glicosilación; y/o para mejorar la unión a FcRn; y/o para alterar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y/o la citotoxicidad dependiente del complemento; y/o para inducir la heterodimerización, además de manera opcional mediante la introducción de un enlace disulfuro;

iii) cuando dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo, o anticuerpo competidor o fragmento de unión a antígeno del mismo, es el isotipo IgG3 humana, se modifica la región constante del IgG3 humana en el aminoácido Asn297 para evitar la glicosilación; y/o en el aminoácido 435 para prolongar la vida media; y/o para mejorar la unión a FcRn; y/o para alterar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y/o la citotoxicidad dependiente del complemento; y/o para inducir la heterodimerización, además de manera opcional mediante la introducción de un enlace disulfuro;

iv) cuando dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo, o anticuerpo competidor o fragmento de unión a antígeno del mismo, es el isotipo IgG4 humana, se modifica la región constante del IgG4 humana dentro de la región bisagra para evitar o reducir el intercambio de cadena; y/o en el aminoácido 235 para alterar las interacciones del receptor Fc; y/o en el aminoácido Asn297 para evitar la glicosilación; y/o para mejorar la unión a FcRn; y/o para alterar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos; y/o la citotoxicidad dependiente del complemento; y/o para inducir la heterodimerización, además de manera opcional mediante la introducción de un enlace disulfuro.

[137] El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo, o anticuerpo competidor o fragmento de unión a antígeno del mismo, de [136], en donde:

i) cuando dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo, o anticuerpo competidor o fragmento de unión a antígeno del mismo, es el isotipo IgG1 humana, se modifica la región constante del IgG1 humana en el aminoácido Asn297 para evitar la glicosilación mediante la modificación de Asn297^Ala (N297A) o Asn297^Gln (N297Q); y/o en el aminoácido Leu234 mediante la modificación de Leu234^Ala (L234A) y/o Leu235 mediante la modificación de Leu235^Glu (L235E) o Leu235^Ala (L235A) o en ambos aminoácidos 234 y 235 mediante la modificación de Leu234^Ala y Leu235^Ala para alterar las interacciones del receptor Fc; y/o para mejorar la unión a FcRn mediante la modificación de Met252^Tyr, Ser254^Thr, Thr256^Glu, Met428^Leu o Asn434^Ser; y/o para alterar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y/o la citotoxicidad dependiente del complemento; y/o para inducir la heterodimerización mediante la modificación de Thr366^Trp, y además de manera opcional mediante la introducción de un enlace disulfuro mediante la modificación de Ser354^Cys y Tyr349^Cys en los dominios CH3 opuestos;

ii) cuando dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo, o anticuerpo competidor o fragmento de unión a antígeno del mismo, es el isotipo IgG2 humana, se modifica la región constante del IgG2 humana en el aminoácido Asn297 para evitar la glicosilación mediante la modificación de Asn297^Ala o Asn297^Gln; y/o para mejorar la unión a FcRn mediante la modificación de Met252^Tyr, Ser254^Thr, Thr256^Glu, Met428^Leu o Asn434^Ser; y/o para alterar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y/o la citotoxicidad dependiente del complemento; y/o para inducir la heterodimerización mediante la modificación de Thr366^Trp, y además de manera opcional mediante la introducción de un enlace disulfuro mediante la modificación de Ser354^Cys y Tyr349^Cys en los dominios CH3 opuestos;

iii) cuando dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo, o anticuerpo competidor o fragmento de unión a antígeno del mismo, es el isotipo IgG3 humana, se modifica la región constante del IgG3 humana en el aminoácido Asn297 para evitar la glicosilación mediante la modificación de Asn297^Ala o Asn297^Gln; y/o en el aminoácido 435 para prolongar la vida media mediante la modificación de Arg435^His; y/o para mejorar la unión a FcRn mediante la modificación de Met252^Tyr, Ser254^Thr, Thr256^Glu, Met428^Leu o Asn434^-Ser; y/o para alterar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y/o la citotoxicidad dependiente del complemento; y/o para inducir la heterodimerización mediante la modificación de Thr366^Trp, y además de manera opcional mediante la introducción de un enlace disulfuro mediante la modificación de Ser354^Cys y Tyr349^Cys en los dominios CH3 opuestos;

iv) cuando dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo, o anticuerpo competidor o fragmento de unión a antígeno del mismo, es el isotipo IgG4 humana, se modifica la región constante del IgG4 humana dentro de la región bisagra para evitar o reducir el intercambio de cadenas mediante la modificación de Ser228^-Pro; y/o en el aminoácido 235 para alterar las interacciones del receptor Fc mediante la modificación de Leu235^Glu, o mediante la modificación dentro de la bisagra y en el aminoácido 235 modificando Ser228^-Pro y Leu235^Glu; y/o en el aminoácido Asn297 para evitar la glicosilación mediante la modificación de Asn297^Ala; y/o para mejorar la unión a FcRn mediante la modificación de Met252^Tyr, Ser254^Thr, Thr256^Glu, Met428^Leu o Asn434^Ser; y/o para alterar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y/o la citotoxicidad dependiente del complemento; y/o para inducir la heterodimerización mediante la modificación de Thr366^Trp, y además de manera opcional mediante la introducción de un enlace disulfuro mediante la modificación de Ser354^Cys y Tyr349^Cys en los dominios CH3 opuestos.

Se describe expresamente en la presente memoria el uso de los anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de [136]-[137] en cualquiera de los métodos, usos, composiciones o cualquier otra realización descrita en la presente memoria.

Breve descripción de los dibujos

Los anteriores y otros aspectos, características y ventajas de la presente invención se comprenderán mejor a partir de las siguientes descripciones detalladas tomadas en conjunto con los dibujos que se acompañan, todos los cuales se proporcionan solo a modo de ilustración, y no son limitativos de la presente invención, en la que:

Figura 1, paneles A, B, C y D, muestra las curvas de unión de especies cruzadas a los RBC humanos, de ratón, de rata y porcinos, respectivamente, generadas utilizando diversas concentraciones de anticuerpos purificados de los clones Cl 1, Cl 1.1, Cl 13 y Cl 13.1 como se describe en el Ejemplo 3. Los clones Cl 1 y Cl 13 son como se describe en la Tabla 3. Los clones Cl 1.1 y Cl 13.1 son mutantes Fc de los clones Cl 1 y Cl 13, respectivamente, modificados para reducir la función efectora. Cada uno tiene una mutación Asn297^Gln (N297Q) en el dominio Fc (Sazinsky et al. (2008) PNAS 105(51): 20167-20172) Todos estos clones presentan unión dependiente de la concentración a todas las especies de RBC ensayados.

Los RBC se incuban durante 60 minutos en hielo con diversas concentraciones de anticuerpos purificados de los clones Cl 1, Cl 1.1, Cl 13 y Cl 13.1. Luego, se lavan las células con PBS frío que contiene EDTA, se incuban durante una hora adicional en hielo con anticuerpo antihumano de burro marcado con FITC, se lavan y se analiza la unión del anticuerpo utilizando un clasificador de células Aria BD FACS (Becton Dickinson) o un citómetro de flujo Accuri C6 (Becton Dickinson).

Figura 2, muestra la actividad citotóxica de ciertos clones humanizados evaluados reduciendo la viabilidad celular de las células cancerosas Jurkat humanas. Las células Jurkat JE6.1 se colocan en placas, en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos a una densidad de 2x104 células/ml en medio de Dulcoco modificado de Iscoves que contiene suero fetal bovino al 5% (v/v) inactivado por calor, e incubado con 5 pg/ml de anticuerpos humanizados purificados (Clones 13, 14 y 24), mAb 1F7 de ratón (control positivo), y un control IgG, durante 72 horas a 37°C. Luego se cuantifica la densidad celular utilizando el reactivo WST1 como se describe por el fabricante (Roche Applied Science, Indianápolis, IN; Catálogo #05015944001). Los clones 13 y 14 producen citotoxicidad con una actividad similar a la de mAb 1F7, mientras el clon 24 no reduce la viabilidad celular.

Figura 3, muestra la inversión de la inhibición por TSP1 de la producción de cGMP estimulada por NO por anticuerpos humanizados de la presente invención. Como se describe en el Ejemplo 5, se incuban las células Jurkat JE6.1 durante la noche en medio sin suero y luego se incuban con los anticuerpos humanizados de la presente invención o el mAb quimérico de control, y con o sin TSP1, seguido de tratamiento con o sin un donante de NO. Se lisan las células 5 minutos después y se mide cGMP. Ninguno de los presentes clones de anticuerpos humanizados ensayados, o el mAb quimérico de control, tiene un efecto sobre los niveles basales de cGMP. El anticuerpo quimérico de control invierte la inhibición de TSP1, al igual que los clones humanizados 1,9, 11 y 24 descritos en la presente memoria (Cl 1; Cl 9; Cl 11; Cl 24, respectivamente). PBS: solución salina tamponada con fosfato; TSP o TSP1: trombospondina-1; DEA: dietilamina NONOato; quim: anticuerpo quimérico >VxP037-01 LC (SEQ ID NO: 7))/>VxP037-01 HC (SEQ ID NO: 57).

Figura 4, muestra la inversión de la inhibición por TSP1 de la producción de cGMP estimulada por NO por anticuerpos humanizados de la presente invención. Como se describe en el Ejemplo 5, se incuban las células Jurkat JE6.1 durante la noche en medio sin suero y luego se incuban con los Clones 1 y 13 de los anticuerpos humanizados purificados de la presente invención, o PBS como control, y con o sin TSP1, seguido de tratamiento con o sin donante de NO. Se lisan las células 5 minutos después y se mide cGMP. Los clones de anticuerpos humanizados o el PBS no tienen efecto sobre los niveles basales de cGMP. Los clones humanizados 1 y 13 invierten la inhibición de TSP1, mientras que el PBS no tiene ningún efecto. PBS: solución salina tamponada con fosfato; TSP o TSP1: trombospondina-1; DEA: dietilamina NONOato.

Figura 5, muestra que el tratamiento de un riñón donante con el Clon 1 (Cl 1) en el momento de la extracción del órgano es eficaz para reducir la IRI y el daño renal in vivo en un modelo de trasplante de riñón de rata evaluado midiendo la creatinina sérica. Se utiliza un modelo de trasplante renal de rata singénica con IRI con receptores nefrectomizados bilateralmente para evaluar el efecto del Clon 1 del anticuerpo monoclonal anti-CD47 sobre la función del injerto después del trasplante. Se utilizan ratas Lewis macho que pesan 275-300 g como animales donantes y receptores. Se enjuagan los riñones de los donantes con 50 pg del Clon 1 purificado o vehículo (solución salina tamponada con fosfato, pH 7,2), se almacenan a 4°C en la solución de preservación de la Universidad de Wisconsin (WU) durante 6 horas y luego se trasplantan. Dos días después del trasplante, se evalúa la función renal midiendo la creatinina sérica circulante. El tratamiento de riñones de los donantes con el Clon 1 da como resultado una mejora de la función renal en comparación con los controles medidos por una reducción en la creatinina sérica.

Figura 6, muestra que el Clon 13 (Cl 13) del anticuerpo humanizado purificado reduce la carga tumoral in vivo en un modelo de leucemia promielocítica aguda (APL) de ratón singénico. Se inyectan células de APL murinas (B6APL1) por vía intravenosa en ratones C57BL/6 distribuidos al azar en tres grupos (5-10 ratones por grupo): Grupo 1: sin APL; Grupo 2: APL sin tratamiento; Grupo 3: APL tratadas con el Cl 13 del mAb anti-CD47. El tratamiento con anticuerpos se inicia el día de la inoculación del tumor (día 0) y se proporciona en dosis únicas de 10 pg/dosis (0,4 mg/kg) mediante inyección intraperitoneal en los días 0, 3 y 6. Se evalúan las células APL circulantes (que representan la carga tumoral) el día 25 después de la inoculación del tumor mediante citometría de flujo (células CD34+/CD117+). Los ratones tratados con Cl 13 han reducido la carga tumoral en comparación con los ratones no tratados a los 25 días después de la inoculación del tumor, lo que demuestra la actividad antitumoral de este clon humanizado.

Descripción detallada de la invención

Se proporciona la siguiente descripción detallada de la invención para ayudar a los expertos en la técnica a practicar las diversas realizaciones de la presente invención descritas en la presente memoria, que incluyen todos los métodos, usos, composiciones, etc., descritos en la presente memoria.

Los compuestos de anticuerpos de la presente invención se unen a epítopos en el dominio IgV extracelular de CD47, inhibiendo la unión de TSP1 y SIRPalpha a CD47 y la activación del receptor, mientras que inducen poca o ninguna actividad agonista. Ciertos anticuerpos de la presente invención proporcionan un efecto inductor de muerte celular tóxico para tumores que es específico para células activadas o transformadas, además de aumentar la eliminación fagocítica de células tumorales, es decir, actividad dual. En vista de estas propiedades, los compuestos de anticuerpos de la presente invención deberían ser terapéuticamente útiles en el tratamiento de muchas formas de IRI y tanto de cánceres de sangre como de tumores sólidos.

Los presentes compuestos de anticuerpos también poseen un número de otras propiedades deseables, que incluyen una amplia reactividad con CD47 de una amplia variedad de especies de mamíferos, incluida la de humanos, ratones, ratas, cerdos y/o perros, es decir, cualquiera de estas especies de mamíferos individuales, o diversas combinaciones de las mismas, que hacen que estos anticuerpos sean útiles tanto en medicina humana como veterinaria. Esta amplia reactividad es más ventajosa porque facilita estudios preclínicos que incluyen, pero no se limitan a, estudios de seguridad y eficacia, en una variedad de especies de mamíferos y, por lo tanto, el desarrollo de dichos anticuerpos como terapéutica humana y veterinaria

Definiciones

Un anticuerpo de longitud completa como existe de forma natural es una molécula de inmunoglobulina que comprende dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces disulfuro. La porción aminoterminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100-110 o más aminoácidos responsables principalmente del reconocimiento del antígeno a través de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) contenidas en ella. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente de la función efectora.

Las CDR están intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco ("FR"). Cada región variable de la cadena ligera (LCVR) y región variable de la cadena pesada (HCVR) se compone de 3 CDR y 4 FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las 3 CDR de la cadena ligera se denominan como "LCDR1, LCDR2 y LCDR3" y las 3 CDR de la cadena pesada se denominan como "HCDR1, HCDR2 y HCDR3". Las CDR contienen la mayoría de los residuos que forman interacciones específicas con el antígeno. La numeración y el posicionamiento de los residuos de aminoácidos de la CDR dentro de las regiones LCVR y HCVR están de acuerdo con la conocida convención de numeración de Kabat. Aunque las CDR de la cadena ligera y las CDR de la cadena pesada descritas en la presente memoria están numeradas 1, 2 y 3, respectivamente, no es necesario que se empleen en las regiones variables de cadena ligera y pesada del compuesto de anticuerpo correspondiente en ese orden numérico, es decir, pueden estar presente en cualquier orden numérico en una región variable de la cadena ligera o pesada, respectivamente.

Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda, y se caracterizan por una región constante particular como se conoce en la técnica. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, y definen el isotipo de un anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD o IgE, respectivamente. Los anticuerpos IgG se pueden dividir además en subclases, p. ej., IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4. Cada tipo de la cadena pesada se caracteriza por una región constante particular con una secuencia bien conocida en la técnica. Los anticuerpos monoclonales y otros compuestos de anticuerpos útiles en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria pueden ser cualquiera de estos isotipos. Además, cualquiera de estos isotipos puede comprender modificaciones de aminoácidos como sigue.

En algunas realizaciones, la región constante del anticuerpo es del isotipo IgG1 humana.

En algunas realizaciones, la región constante de IgG1 humana se modifica en el aminoácido Asn297 (numeración de Kabat) para evitar la glicosilación del anticuerpo. Por ejemplo, esta modificación puede ser Asn297^Ala (N297A) o Asn297^Gln (N297Q) (Sazinsky et al. (2008) PNAS 105(51):20167-20172).

En algunas realizaciones, la región constante del anticuerpo se modifica en el aminoácido Leu234 (numeración de Kabat) para alterar las interacciones del receptor Fc. Por ejemplo, esta modificación puede ser Leu234^ Ala (L234A).

En algunas realizaciones, la región constante del anticuerpo se modifica en el aminoácido Leu235 (numeración de Kabat) para alterar las interacciones del receptor Fc. Por ejemplo, esta modificación puede ser Leu235^Glu (L235E) o Leu235^Ala (L235A).

En algunas realizaciones, la región constante del anticuerpo se altera tanto en el aminoácido 234 como en el 235. Por ejemplo, estas modificaciones pueden ser Leu234^Ala y Leu235^Ala (L234A/L235A) (índice EU de Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest).

En algunas realizaciones, la región constante del anticuerpo es del isotipo IgG2 humana.

En algunas realizaciones, la región constante de IgG2 humana se modifica en el aminoácido Asn297 (numeración de Kabat) para evitar la glicosilación del anticuerpo. Por ejemplo, esta modificación puede ser Asn297^Ala (N297A) o Asn297^Gln (N297Q).

En algunas realizaciones, la región constante del anticuerpo es del isotipo IgG3 humana.

En algunas realizaciones, la región constante de IgG3 humana se modifica en el aminoácido Asn297 (numeración de Kabat) para evitar la glicosilación del anticuerpo. Por ejemplo, esta modificación puede ser Asn297^Ala (N297A) o Asn297^Gln (N297Q).

En algunas realizaciones, la región constante de IgG3 humana se modifica en el aminoácido 435 para prolongar la vida media. Por ejemplo, esta modificación puede ser Arg435^His (R435H) (índice EU de Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest).

En algunas realizaciones, la región constante del anticuerpo es del isotipo IgG4 humana.

En algunas realizaciones, la región constante de IgG4 humana se modifica dentro de la región bisagra para evitar o reducir el intercambio de cadena. Por ejemplo, esta modificación puede ser Ser228^-Pro (S228P) (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30(1): 105-108).

En otras realizaciones, la región constante de IgG4 humana se modifica en el aminoácido 235 para alterar las interacciones del receptor Fc. Por ejemplo, esto puede ser Leu235^Glu (L235E).

En algunas realizaciones, la región constante de IgG4 humana se modifica dentro de la bisagra y en el aminoácido 235. Por ejemplo, esto puede ser Ser228^-Pro y Leu235^Glu (S228P/L235E).

En algunas realizaciones, la región constante de IgG4 humana se modifica en el aminoácido Asn297 (numeración de Kabat) para evitar la glicosilación del anticuerpo. Por ejemplo, esto puede ser Asn297^Ala (N297A). (Índice EU de Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest).

En algunas realizaciones, la región constante de IgG humana se modifica para mejorar la unión a FcRn. Ejemplos de mutaciones en Fc que mejoran la unión a FcRn son Met252^Tyr, Ser254^Thr, Thr256^Glu (M252Y, S254T y T256E, respectivamente) (Numeración de Kabat, Dall'Acqua et al. (2006) J. Biol. Chem 281(33) 23514-23524), o Met428^Leu y Asn434^Ser (M428L, N434S) (Zalevsky et al. (2010) Nature Biotech. 28(2): 157-159) (índice EU de Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest).

En algunas realizaciones, la región constante de IgG humana se modifica para alterar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), p. ej., las modificaciones de aminoácidos descritas en Natsume et al. (2008) Cancer Res. 68(10): 3863-72; Idusogie et al. (2001) J. Immunol.

166(4): 2571-5; Moore et al. (2010) mAbs 2(2): 181-189; Lazar et al. (2006) PNAS 103(11): 4005-4010; Shields et al. (2001) J. Biol. Chem 276(9): 6591-6604; Stavenhagen et al. (2007) Cancer Res. 67(18): 8882-8890; Stavenhagen et al. (2008) Advan. Enzyme Regul. 48: 152-164; Alegre et al. (1992) J. Immunol. 148: 3461-3468; revisado en Kaneko and Niwa (2011) Biodrugs 25(1): 1-11.

En algunas realizaciones, la región constante de IgG humana se modifica para inducir la heterodimerización. Por ejemplo, tiene una modificación de aminoácidos dentro del dominio CH3 en Thr366, que cuando se reemplaza con un aminoácido más voluminoso, tal como Trp (T366W), se puede emparejar preferentemente con un segundo dominio CH3 que tiene modificaciones de aminoácidos con aminoácidos menos voluminosos en las posiciones Thr366, Leu368 y Tyr407, p. ej., Ser, Ala y Val, respectivamente (T366S/L368A/Y407V). La heterodimerización a través de las modificaciones CH3 se puede estabilizar además mediante la introducción de un enlace disulfuro, por ejemplo, cambiando Ser354 a Cys (S354C) y Tyr349 a Cys (Y349C) en dominios CH3 opuestos (revisado en Carter (2001) Journal of Immunological Methods 248: 7-15).

Como se emplea en la presente memoria, el término "anticuerpo monoclonal" (mAb) como se aplica a los presentes compuestos de anticuerpos se refiere a un anticuerpo que se deriva de una única copia o clon que incluye, por ejemplo, cualquier clon eucariota, procariota o fago, y no al método por el cual se produce. Los mAb de la presente invención existen preferiblemente en una población homogénea o sustancialmente homogénea, y pueden ser quiméricos o humanizados. Los mAb completos contienen dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras.

Los "fragmentos de unión a antígeno" de dichos anticuerpos monoclonales pueden ser deseables para ciertas aplicaciones debido a su pequeño tamaño y la consiguiente distribución tisular superior, e incluyen, por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos Fd, fragmentos Fv de cadena sencilla (ScFv) y anticuerpos de un solo brazo que comprenden una cadena ligera y una cadena pesada. Los fragmentos de unión a antígeno preferidos son aquellos que se unen al antígeno reconocido por el anticuerpo intacto. También se pueden obtener fragmentos de Fc. Los anticuerpos monoclonales y fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención se pueden producir, por ejemplo, mediante tecnologías recombinantes, tecnologías de presentación en fagos, tecnologías sintéticas, p. ej., injerto de CDR, o combinaciones de dichas tecnologías u otras tecnologías conocidas en la técnica, que incluye la digestión proteolítica de anticuerpos intactos.

"Compuestos de anticuerpos" se refiere a los mAb y Fab, y anticuerpos competidores, descritos en la presente memoria que se unen específicamente a CD47 de diversas especies, que incluye CD47 humano, de rata, ratón, cerdo y perro, y que presentan las propiedades descritas en la presente memoria. Por tanto, el término "mAb" como se emplea en la presente memoria con respecto a los anticuerpos abarcados por la presente invención incluye los Fab y los anticuerpos competidores. Los compuestos de anticuerpos adicionales que presentan propiedades funcionales similares según la presente invención se pueden generar por métodos convencionales. Por ejemplo, los ratones se pueden inmunizar con CD47 humano o fragmentos de los mismos, los anticuerpos resultantes se pueden recuperar y purificar, y la determinación de si poseen propiedades de unión y funcionales similares o iguales a los compuestos de anticuerpos descritos en la presente memoria se puede evaluar mediante los métodos descritos en los Ejemplos 3 y 4, a continuación. Los fragmentos de unión a antígeno también se pueden preparar por métodos convencionales. Los métodos para producir y purificar anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno son bien conocidos en la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo, en Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., capítulos 5-8 y 15, ISBN 0-87969-314-2.

La expresión "anticuerpos humanizados" se refiere a anticuerpos monoclonales y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que incluye los compuestos de anticuerpos descritos en la presente memoria, que tienen propiedades de unión y funcionales según la invención similares a las descritas en la presente memoria, y que tienen regiones marco que son sustancialmente humanas o completamente humanas que rodean a las CDR derivadas de un anticuerpo no humano. "Región marco" o "secuencia marco" se refiere a una cualquiera de las regiones marco 1 a 4. Los anticuerpos humanizados y fragmentos de unión a antígeno abarcados por la presente invención incluyen moléculas en donde una cualquiera o más de las regiones marco 1 a 4 son sustancialmente o completamente humanas, es decir, en donde está presente cualquiera de las posibles combinaciones de regiones marco 1 a 4 individuales sustancialmente o completamente humanas. Por ejemplo, esto incluye moléculas en las que la región marco 1 y la región marco 2, la región marco 1 y la región marco 3, la región marco 1, 2 y 3, etc., son sustancialmente o completamente humanas. Los marcos sustancialmente humanos son aquellos que tienen al menos el 80% de identidad de secuencia con una secuencia marco de la línea germinal humana conocida. Preferiblemente, los marcos sustancialmente humanos tienen al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia, a una secuencia marco descrita en la presente memoria, o para una secuencia marco de la línea germinal humana conocida.

Las CDR abarcadas por la presente invención incluyen no solo las descritas específicamente en la presente memoria, sino también secuencias CDR que tienen identidades de secuencia de al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97 %, al menos 98%, o al menos 99% de identidad de secuencia a una secuencia CDR descrita en la presente memoria. Alternativamente, las CDR abarcadas por la presente invención incluyen no solo las descritas específicamente en la presente memoria, sino también las secuencias CDR que tienen 1, 2, 3, 4 o 5 cambios de aminoácidos en las posiciones correspondientes en comparación con las secuencias CDR descritas en la presente memoria. Dicha secuencia CDR idéntica, o modificada con aminoácidos, se une preferiblemente al antígeno reconocido por el anticuerpo intacto.

Como se emplea en la presente memoria, la expresión "identidad de secuencia" significa el porcentaje de nucleótidos o residuos de aminoácidos idénticos en las posiciones correspondientes en dos o más secuencias cuando las secuencias se alinean para maximizar la coincidencia de secuencias, es decir, teniendo en cuenta las brechas e inserciones. La identidad se puede calcular fácilmente mediante métodos conocidos, que incluyen pero no se limitan a los descritos en: Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M. and Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; and Carillo, H. and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988) Los métodos para determinar la identidad están diseñados para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias ensayadas. Además, los métodos para determinar la identidad están codificados en programas informáticos disponibles públicamente.

La alineación óptima de secuencias para comparación se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, mediante los algoritmos de alineación de homología, mediante la búsqueda del método de similitud o mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, PASTA, y TFASTA en el paquete GCG Wisconsin, disponible de Accelrys, Inc., San Diego, California, Estados Unidos de América), o mediante inspección visual. Véase en general, (Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990) and Altschul et al. Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)).

Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en (Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; & Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990) El software para realizar el análisis de BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica. Este algoritmo implica primero identificar pares de secuencias de alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de búsqueda, que tanto coinciden como satisfacen alguna puntuación de valor umbral positivo T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se denomina como el umbral de puntuación de palabras en la vecindad.

Estos aciertos de palabras de la vecindad iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largos que las contengan. Los aciertos de palabras son entonces prolongados en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia para que, en la medida de lo posible se pueda aumentar la puntuación de alineación acumulativa. Las puntuaciones acumulativas se calculan utilizando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre; 0) y N (puntuación sanción para residuos no coincidentes; siempre; 0). Para secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineación acumulativa cae por la cantidad X de su valor máximo conseguido, la puntuación acumulativa va a cero o por debajo debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuación negativa, o se alcanza el final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, un valor de corte de 100, M=5, N= -4 y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62.

Además de calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias. Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad de que se produciría una coincidencia entre dos nucleótidos o secuencias de aminoácidos por casualidad. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico de ensayo se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación de la secuencia de ácido nucleico de ensayo a la secuencia de ácido nucleico de referencia es en una realización menor que aproximadamente 0,1, en otra realización menor que aproximadamente 0,01, y todavía en otra realización menor de aproximadamente 0,001.

Los marcos completamente humanos son aquellos que son idénticos a una secuencia marco de la línea germinal humana conocida. Las secuencias marco de la línea germinal humana se pueden obtener de ImMunoGeneTics (IMGT) mediante su sitio web o de The Immunoglobulin FactsBook by Marie-Paule Lefranc and Gerard Lefranc, Academic Press, 2001, ISBN 012441351. Por ejemplo, los marcos de la cadena ligera de la línea germinal se pueden seleccionar del grupo que consiste en: A11, A17, A18, A19, A20, A27, A30, LI, L1I, L12, L2, L5, L15, L6, L8, O12, O2, y O8, y las regiones marco de la cadena pesada de la línea germinal se pueden seleccionar del grupo que consiste en: VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-20, VH3-72, VHI-46, VH3-9, VH3-66, VH3-74, VH4-31, VHI-18, VHI-69, VI-13-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-48, VH4-39, VH4-59 y VH5-5I.

Los anticuerpos humanizados además de los descritos en la presente memoria que presentan propiedades funcionales similares según la presente invención se pueden generar utilizando varios métodos diferentes. En un enfoque, las CDR del compuesto del anticuerpo parental se injertan en un marco humano que tiene una identidad de secuencia alta con el marco del compuesto del anticuerpo parental. La identidad de secuencia del nuevo marco será generalmente al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% idéntica a la secuencia del marco correspondiente en el compuesto del anticuerpo parental. En el caso de los marcos que tienen menos de 100 residuos de aminoácidos, se pueden cambiar uno, dos o tres residuos de aminoácidos. Este injerto puede dar como resultado una reducción en la afinidad de unión en comparación con la del anticuerpo parental. Si este es el caso, el marco se puede retromutar al marco parental en ciertas posiciones basadas en los criterios específicos descritos por Queen et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88:2869. Referencias adicionales que describen métodos útiles en la humanización de anticuerpos de ratón incluyen las patentes de EE.UU. N° 4,816,397; 5,225,539; y 5,693,761; programas informáticos ABMOD y ENCAD como se describe en Levitt (1983) J. Mol. Biol. 168: 595-620; y el método de Winter y colaboradores (Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-327; y Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1534-1536.

La identificación de los residuos a considerar para la retromutación se puede llevar a cabo como sigue.

Cuando un aminoácido cae bajo la siguiente categoría, el aminoácido marco de la secuencia de la línea germinal humana que se está utilizando (el "marco aceptor") se reemplaza por un aminoácido marco de un marco del compuesto de anticuerpo parental (el "marco donante"): (a) el aminoácido en la región marco humana del marco aceptor es inusual para los marcos humanos en esa posición, mientras que el aminoácido correspondiente en la inmunoglobulina del donante es típico para los marcos humanos en esa posición; (b) la posición del aminoácido es inmediatamente adyacente a una de las CDR; o (c) cualquier átomo de la cadena lateral de un aminoácido marco está a aproximadamente 5-6 ángstrom (de centro a centro) de cualquier átomo de un aminoácido de CDR en un modelo de inmunoglobulina tridimensional.

Cuando cada uno de los aminoácidos en la región del marco humana del marco aceptor y un aminoácido correspondiente en el marco donante es generalmente inusual para marcos humanos en esa posición, dicho aminoácido se puede reemplazar por un aminoácido típico para marcos humanos en esa posición. Este criterio de retromutación permite recuperar la actividad del compuesto anticuerpo parental.

Otro enfoque para la generación de anticuerpos de ingeniería humana que presentan propiedades funcionales similares a los compuestos de anticuerpos descritos en la presente memoria implica la mutación de manera aleatoria de aminoácidos dentro de las CDR injertadas sin cambiar el marco, y cribar las moléculas resultantes para la afinidad de unión y otras propiedades funcionales que son tan buenas o mejores que las de los compuestos de anticuerpos parentales. También se pueden introducir mutaciones únicas en cada posición de aminoácidos dentro de cada CDR, seguido de la evaluación de los efectos de dichas mutaciones en la afinidad de unión y otras propiedades funcionales.

Las mutaciones únicas que producen propiedades mejoradas se pueden combinar para evaluar sus efectos en combinación entre sí.

Además, es posible una combinación de ambos de los enfoques anteriores. Después del injerto de CDR, uno puede retromutar regiones marco específicas además de introducir cambios de aminoácidos en las CDR. Esta metodología se describe en Wu et al. (1999) J. Mol. Biol. 294: 151 -162.

También se puede emplear el método descrito en el Ejemplo 1 a continuación.

Aplicando las enseñanzas de la presente invención, una persona experta en la técnica puede utilizar técnicas comunes, p. ej., mutagénesis dirigida al sitio, para sustituir los aminoácidos dentro de las secuencias marco y las CDR descritas actualmente y así generar secuencias de aminoácidos de la región variable adicionales derivadas de secuencias presentes. Se pueden introducir hasta todos los aminoácidos de origen natural en un sitio de sustitución específico, que incluye las sustituciones conservadoras de aminoácidos que conocen bien los expertos en la materia. Los métodos descritos en la presente memoria se pueden utilizar luego para cribar estas secuencias de aminoácidos de la región variable adicional para identificar las secuencias que tienen las funciones in vitro y/o in vivo indicadas De esta manera, se pueden identificar secuencias adicionales adecuadas para preparar anticuerpos de ingeniería humana y las porciones de unión a antígeno de los mismos de acuerdo con la presente invención. Preferiblemente, la sustitución de aminoácidos dentro de los marcos está restringida a una, dos o tres posiciones dentro de una cualquiera o más de las 4 regiones marco de la cadena ligera y/o la cadena pesada descritas en la presente memoria. Preferiblemente, la sustitución de aminoácidos dentro de las CDR está restringida a una, dos o tres posiciones dentro de una cualquiera o más de las 3 CDR de la cadena ligera y/o la cadena pesada. También son posibles combinaciones de los diversos cambios dentro de estas regiones marco y CDR descritas anteriormente.

Que las propiedades funcionales de los compuestos de anticuerpos generados al introducir las modificaciones de aminoácidos discutidas anteriormente se ajustan y son comparables a las presentadas por las moléculas específicas descritas en la presente memoria se pueden confirmar mediante los métodos descritos en los Ejemplos a continuación.

Los términos "se une específicamente", "unirse específicamente", "unión específica" y similares aplicados a los presentes compuestos de anticuerpos se refieren a la capacidad de un agente de unión específico (tal como un anticuerpo) para unirse a una especie molecular diana en preferencia a la unión a otras especies moleculares con las que se mezclan el agente de unión específico y la especie molecular diana. Se dice que un agente de unión específico reconoce específicamente una especie molecular diana cuando se puede unir específicamente a esa diana.

"Afinidad de unión" es un término que se refiere a la fuerza de unión de una molécula a otra en un sitio de la molécula. Si una molécula particular se unirá o se asociará específicamente con otra molécula particular, se dice que estas dos moléculas presentan afinidad de unión entre sí. La afinidad de unión está relacionada con la constante de asociación y la constante de disociación para un par de moléculas, pero no es crítico para los métodos en la presente memoria que estas constantes se midan o determinen. Más bien, las afinidades como se emplean en la presente memoria para describir las interacciones entre las moléculas de los métodos descritos son generalmente afinidades aparentes (a menos que se especifique lo contrario) observadas en estudios empíricos, que se pueden utilizar para comparar la fuerza relativa con la que una molécula (p. ej., un anticuerpo u otro compañero de unión específico) se unirá a otras dos moléculas (p. ej., dos versiones o variantes de un péptido). Los conceptos de afinidad de unión, constante de asociación y constante de disociación son bien conocidos.

El término "epítopo" se refiere a una disposición específica de los aminoácidos situados en un péptido o proteína a la que se une un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Los epítopos a menudo consisten en una agrupación de moléculas de superficie químicamente activas, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos pueden ser lineales, es decir, que implican la unión a una única secuencia de aminoácidos, o conformacionales, es decir, que implican la unión a dos o más secuencias de aminoácidos en diversas regiones del antígeno que pueden no ser necesariamente contiguas.

Los anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que "compiten" con las moléculas descritas en la presente memoria son aquellos se unen a CD47 humano en el(los) sitio(s) que es(son) idéntico(s) o que se solapan con el(los) sitio(s) en el(los) que se une(n) la(s) molécula(s) presente(s). Los anticuerpos monoclonales competidores o fragmentos de unión a antígeno de los mismos se pueden identificar, por ejemplo, mediante un ensayo de competición de anticuerpos. Por ejemplo, una muestra del dominio extracelular CD47 humano purificado o parcialmente purificado se puede unir a un soporte sólido. Luego, se añaden un compuesto de anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la presente invención y un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo sospechoso de ser capaz de competir con dicho compuesto de anticuerpo de la invención. Una de las dos moléculas está marcada. Si el compuesto marcado y el compuesto no marcado se unen a sitios separados y discretos en CD47, el compuesto marcado se unirá al mismo nivel esté o no presente el compuesto competidor sospechoso. Sin embargo, si los sitios de interacción son idénticos o se solapan, el compuesto no marcado competirá y la cantidad de compuesto marcado unido al antígeno disminuirá. Si el compuesto no marcado está presente en exceso, muy poco, si lo hay, se unirá al compuesto marcado. Para los fines de la presente invención, los anticuerpos monoclonales competidores o fragmentos de unión a antígeno de los mismos son aquellos que disminuyen la unión de los presentes compuestos de anticuerpos a CD47 en aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95% o aproximadamente 99%. Los detalles de los procedimientos para llevar a cabo dichos ensayos de competición son bien conocidos en la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo, en Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., páginas 567-569, ISBN 0-87969-314-2. Dichos ensayos se pueden hacer cuantitativos utilizando anticuerpos purificados. Se establece una curva estándar titulando un anticuerpo contra sí mismo, es decir, se utiliza el mismo anticuerpo tanto como marcador como competidor. Se titula la capacidad de un anticuerpo monoclonal competidor no marcado o fragmento de unión a antígeno del mismo para inhibir la unión de la molécula marcada a la placa. Los resultados se representan gráficamente y se comparan las concentraciones necesarias para lograr el grado deseado de inhibición de la unión.

Los anticuerpos competidores descritos en la presente memoria pueden poseer aproximadamente ± 30%, aproximadamente ± 20%, aproximadamente ± 10%, aproximadamente ± 5%, o actividad biológica idéntica a la de los compuestos de anticuerpos descritos en la presente memoria como se determina por los métodos descritos en los Ejemplos 3-7.

El término "que trata" (o "trata" o "tratamiento") significa ralentizar, interrumpir, detener, controlar, parar, reducir o invertir la progresión o gravedad de un signo, síntoma, trastorno, afección o enfermedad, pero no necesariamente implica una eliminación total de todos los signos, síntomas, afecciones o trastornos relacionados con la enfermedad. El término "que trata" y similares se refiere a una intervención terapéutica que mejora un signo, síntoma, etc., de una enfermedad o afeccción patológica después de que ha comenzado a desarrollarse.

Se pueden tratar los acontecimientos agudos y las afecciones crónicas. En un acontecimiento agudo, se administra un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo al inicio de un síntoma, trastorno, afección, enfermedad o procedimiento, y se suspende cuando finaliza el acontecimiento agudo, o en el caso de un trasplante de órgano al órgano, en el momento de la extracción del órgano y/o al receptor del trasplante en el momento del trasplante de órgano. Por el contrario, un síntoma, trastorno, afección o enfermedad crónica se trata durante un período de tiempo más prolongado.

El término "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad o dosis de un compuesto de anticuerpo de la presente invención que, tras la administración de una única o de múltiples dósis a un paciente u órgano, proporciona el tratamiento o prevención deseado. Las cantidades terapéuticamente eficaces de los presentes compuestos de anticuerpos pueden comprender una cantidad en el intervalo de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 150 mg/kg, más preferiblemente de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, e incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg por dosis única administrada a un órgano extraído o a un paciente. El proveedor de servicios médicos puede determinar una cantidad terapéuticamente eficaz para cualquier paciente individual monitorizando el efecto de los compuestos de anticuerpos en un biomarcador, tal como los biomarcadores séricos de lesión del órgano tratado, que incluyen, pero no se limitan al hígado, riñón, pulmón, intestino, páncreas y corazón, cambios en las presiones de la arteria pulmonar, expresión de CD47 en la superficie celular en tejidos tumorales o no tumorales, regresión tumoral, células tumorales circulantes o células madre tumorales, etc. El análisis de los datos obtenidos por estos métodos permite la modificación del régimen de tratamiento durante la terapia para que se administren cantidades óptimas de compuestos de anticuerpos de la presente invención, bien empleados solos o en combinación entre sí, o en combinación con otro agente terapéutico, o ambos, y para que la duración del tratamiento se pueda determinar también. De esta manera, el régimen de dosificación/tratamiento se puede modificar durante el curso de la terapia para que se administren las cantidades más bajas de compuestos de anticuerpos utilizados solos o en combinación que presenten una eficacia satisfactoria, y para que la administración de dichos compuestos se continúe solo mientras es necesario para tratar con éxito al paciente.

Los compuestos de anticuerpos de la presente invención se pueden utilizar como medicamentos en medicina humana y veterinaria, administrados por una variedad de rutas. Las aplicaciones veterinarias incluyen el tratamiento de animales de compañía/mascotas, tales como gatos y perros; animales de trabajo, tales como perros guía o de servicio, y caballos; animales deportivos, tales como caballos y perros; animales de zoológico, tales como primates, gatos tales como leones y tigres, osos, etc .; y otros animales valiosos mantenidos en cautiverio.

Lo más preferiblemente, dichas composiciones son para administración parenteral, por ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, etc., administración por infusión, inyección, implantación, etc., como es bien conocido en la técnica. Dichas composiciones farmacéuticas se pueden preparar por métodos bien conocidos en la técnica. Véase, p. ej., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a edición (2005), Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, PA, y comprende uno o más compuestos de anticuerpos descritos en la presente memoria, y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente o veterinariamente aceptable, p. ej., fisiológicamente aceptable.

Terapias de combinación

Combinaciones de compuestos de anticuerpos

Se debería observar que en todos los métodos terapéuticos descritos en la presente memoria, los anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención que se unen a CD47, se pueden utilizar solos, o en cualquier combinación apropiada entre sí, para lograr la mayor eficacia del tratamiento.

Otras combinaciones terapéuticas para tratar las indicaciones relacionadas con IRI

Además de administrar las combinaciones de compuestos de anticuerpos como se ha descrito inmediatamente arriba, los métodos de la presente invención, por ejemplo, aquellos relacionados con el tratamiento de las indicaciones relacionadas con IRI, pueden comprender además administrar a un paciente en necesidad del mismo una cantidad eficaz de un donante de óxido nítrico, precursor o ambos; un agente tópico que genera óxido nítrico; un agente que activa la guanilil ciclasa soluble; un agente que inhibe las fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicos; o cualquier combinación de cualquiera de los anteriores.

En estos métodos, el donante o precursor de óxido nítrico se puede seleccionar de NO gas, dinitrato de isosorbida, nitrito, nitroprusiano, nitroglicerina, 3-morfolinosidnonimina (SIN-1), S-nitroso-N-acetilpenicilamina (SNAP), Dietilentriamina/NO (DETA/NO), S-nitrosotioles, Bidil® y arginina.

El agente que activa la guanilil ciclasa soluble puede ser un activador químico no basado en NO (óxido nítrico) de la guanilil ciclasa soluble que aumente los niveles de cGMP en las células vasculares. Dichos agentes se unen a la guanilil ciclasa soluble en una región distinta del motivo de unión al NO, y activan en cualquier caso la enzima del NO local o el estrés por oxígeno reactivo (ROS). Ejemplos no limitantes de activadores químicos de la guanilil ciclasa soluble incluyen nitratos orgánicos (Artz et al. (2002) J. Biol. Chem 277: 18253-18256); protoporphyrin IX (Ignarro et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 79: 2870-2873); YC-1 (Ko et al. (1994) Blood 84: 4226-4233); BAY 41-2272 and BAY 41-8543 (Stasch et al. (2001 Nature 410 (6825): 212-5), CMF-1571 and A-350619 (revisado en Evgenov et al. (2006) Nat. Rev. Drug. Discov. 5: 755-768); Ba Y 58-2667 (Cinaciguat; Frey et al. (2008) Journal of Clinical Pharmacology 48(12): 1400-10); BAY 63-2521 (Riociguat; Mittendorf et al. (2009) Chemmedchem 4(5): 853-65) Los activadores de la guanilil ciclasa solubles adicionales se describen en Stasch et al. (2011) Circulation 123: 2263-2273; Derbyshire and Marletta (2012) Ann. Rev. Biochem. 81: 533-559, y Nossaman et al. (2012) Critical Care Research and Practice, Volumen 2012, ID del artículo 290805, páginas 1-12.

El agente que inhibe las fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicos se puede seleccionar de sildenafil, tadalafil, vardenafil, udenafil y avanafil.

Otras combinaciones terapéuticas para tratar las indicaciones de cáncer

Además de lo anterior, los métodos de la presente invención, por ejemplo aquellos relacionados con el tratamiento de las indicaciones de cáncer, pueden comprender además tratar al paciente mediante cirugía, radiación y/o administrar a un paciente en necesidad del mismo una cantidad eficaz de una pequeña molécula química o fármaco biológico que incluye, pero no se limita a, un péptido, polipéptido, proteína, ácido nucleico terapéutico, etc., utilizado convencionalmente, o actualmente en desarrollo, para tratar afecciones tumorales. Esto incluye anticuerpos distintos de los descritos en la presente memoria, citocinas, oligonucleótidos antisentido, siRNA, etc.

Como es bien conocido por los expertos en la técnica, las terapias de combinación a menudo se emplean en el tratamiento del cáncer porque las terapias o procedimientos de agente único pueden no ser suficientes para tratar o curar la enfermedad o afección. Los tratamientos convencionales contra el cáncer a menudo implican cirugía, tratamiento de radiación, la administración de una combinación de fármacos citotóxicos para lograr efectos aditivos o sinérgicos, y combinaciones de cualquiera o todos estos enfoques. Las combinaciones de quimioterapéutica y terapia biológica especialmente útiles emplean fármacos que funcionan a través de diferentes mecanismos de acción, aumentando el control o la muerte de las células cancerosas, reduciendo la probabilidad de resistencia a los fármacos durante la terapia y minimizando las posibles toxicidades superpuestas permitiendo el uso de dosis reducidas de fármacos individuales.

Clases de agentes antitumorales/antineoplásicos convencionales útiles en las terapias de combinación abarcadas por la presente invención se describen, por ejemplo, en Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, duodécima edición (2010) L.L. Brunton, B.A. Chabner y B. C. Knollmann Eds., Sección VIII, "Chemotherapy of Neoplastic Diseases", Capítulos 60-63, pp. 1665-1770, McGraw-Hill, NY, e incluyen, por ejemplo, agentes alquilantes; antimetabolitos; productos naturales; una variedad de agentes diversos; hormonas y antagonistas; y anticuerpos monoclonales.

El término "tumor" se refiere a todo crecimiento y proliferación de células neoplásicas, ya sean malignas o benignas, y todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos. Los términos "cáncer", "canceroso" y "tumor" no son mutuamente excluyentes como se emplean en la presente memoria.

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen la afección fisiológica en mamíferos que se caracteriza normalmente por un crecimiento/proliferación celular aberrante. Ejemplos de cánceres incluyen, pero no se limitan a, carcinomas, linfomas, blastomas, sarcomas y leucemias.

El término "cáncer susceptible", como se emplea en la presente memoria, se refiere a un cáncer, cuyas células expresan CD47 y que responden al tratamiento con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, o un anticuerpo competidor o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la presente invención. Cánceres susceptibles ejemplares incluyen, pero no se limitan a, leucemias, que incluyen leucemia linfocítica aguda (linfoblástica), leucemia mieloide aguda, leucemia mielógena, leucemia linfocítica crónica, mieloma múltiple, leucemia mieloide crónica y leucemia de células plasmáticas; linfomas, que incluye linfoma de Hodgkin y linfoma no Hodgkin, que incluye linfoma de células B, linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular, linfoma de células del manto, linfoma de células B de la zona marginal, linfoma de células T y macroglobulinemia de Waldenstrom; cáncer de ovarios; cáncer de mama; cáncer endometrial; cáncer de colon; cáncer de recto; cáncer de vejiga; cáncer de pulmón; cáncer de bronquios; cáncer de huesos; cancer de prostata; cáncer de páncreas; cáncer gástrico; cáncer de hígado y conductos biliares; cáncer de esófago; cáncer renal; cáncer de tiroides; cáncer de cabeza y cuello; cancer testicular; glioblastoma; astrocitoma; melanoma; síndrome mielodisplásico; y sarcomas que incluyen, pero no se limitan a, osteosarcoma, sarcoma de Ewing, leiomiosarcoma, sarcoma sinovial, sarcoma alveolar de partes blandas, angiosarcoma, liposarcoma, fibrosarcoma, rabdomiosarcoma y crondrosarcoma.

El término "directamente tóxico" se refiere a la capacidad de ciertos anticuerpos humanizados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos en la presente memoria para matar células transformadas/cancerosas a través de un mecanismo celular autónomo sin participación de células del complemento u otras, que incluye pero no se limita a, células T, neutrófilos, células asesinas naturales, macrófagos o células dendríticas.

Los términos "directamente tóxico", "citotoxicidad directa", y similares, e "induce la muerte celular", "que induce la muerte celular", y similares, también se utilizan indistintamente en la presente memoria para significar que la adición de un compuesto de anticuerpo de la presente invención a las células cancerosas cultivadas provoca que estas células presenten características cuantificables asociadas con la muerte celular, que incluye una cualquiera o más de las siguientes:

1. Unión de anexina V (en presencia del ión calcio) a las células como se ha detectado por citometría de flujo o microscopía de fluorescencia confocal;

2. Absorción del compuesto fluorescente yoduro de propidio (como se ha ensayado por citometría de flujo);

3. Absorción del colorante azul de tripán (puntuado con el microscopio de luz);

4. Pérdida del potencial de membrana mitocondrial como se ha emsayado por uno de varios de los colorantes fluorescentes potenciométricos disponibles, tal como DiIodo-C6 o JC1;

5. Conversión de un derivado de colorante de tetrazolio (tal como resazurina, ensayos basados en formazán (MTT, WST1);

6. Medida cinética de la tasa de crecimiento del cultivo celular evaluado contando células vivas (exclusión de azul de tripano); y/o

7. Velocidad de incorporación de precursores de nucleótidos marcados en el DNA (utilizando un análogo de nucleótido con una etiqueta de epítopo o nucleótido radiactivo para la cuantificación).

La cantidad de citotoxicidad/muerte celular inducida por el presente mAb humanizado o quimérico se puede comparar con la inducida por mAb 1F7, y se espera que sea comparable o mayor a concentraciones equivalentes (Manna and Frazier (2003) J. Immunol. 170: 3544-3553; Manna and Frazier (2004) Cancer Res. 64: 1026-1036; Riss et al. (2013) Cell Viability Assays, NCI/NIH guidance manual, disponible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK144065).

Lo anterior es un enlace a un manual de NCI/NIH que describe numerosos tipos de ensayos de viabilidad celular que se pueden utilizar para evaluar la citotoxicidad de anticuerpos/inducción de muerte celular: Assay Guidance Manual (Internet), "Cell Viability Assays", Terry L Riss, PhD, Richard A Moravec, BS, Andrew L Niles, MS, Helene A Benink, PhD, Tracy J Worzella, MS and Lisa Minor, PhD. Contributor Information, publicada el 1 de mayo, 2013.

La "fagocitosis" de las células cancerosas se refiere a la engullición y digestión de dichas células por los macrófagos, y la digestión o degradación final de estas células cancerosas y su liberación extracelularmente o intracelularmente para someterse a un procesado adicional. Los anticuerpos monoclonales anti-CD47 bloquean la unión de SIRPalpha a CD47, la señal de "no me comas" que se expresa altamente en las células cancerosas en comparación con las células normales, inducen la fagocitosis de los macrófagos de células cancerosas. La unión de SIRPalpha a CD47 en las células cancerosas permitiría que estas células escapen de la fagocitosis de los macrófagos.

Se mide la fagocitosis de células tumorales mediante los macrófagos aislados de sangre de ratón o humana in vitro esencialmente como se ha descrito por Willingham et al. (2012) Proc Natl Acad Sci EE.UU. 109(17): 6662-7 and Tseng et al. (2013) Proc Natl Acad Sci EE.UU. 110(27): 11103-8.

Para el ensayo de fagocitosis in vitro, se colocan en placas 103-105 macrófagos (células efectoras) por pocillo en placas de cultivo de tejidos (ya sea tratadas para favorecer la adherencia de los macrófagos para el análisis por microscopía confocal o no tratadas para permitir su suspensión preparada para el análisis de citometría de flujo) y se deja adherir y luego se incuban en medio libre de suero antes del ensayo. Las líneas de células cancerosas (células diana), que pueden ser o de origen tumoral hematológico o sólido, se marcan con 2,5 pM de éster succinimidilcarboxifluoresceína (CFSE) según el protocolo del fabricante (Sigma-Aldrich) y se añaden a una proporción de 1:1 a 1:4 de células efectoras a células diana. Se añaden diversas concentraciones de anticuerpos anti-CD47 o de control (0,1-10 pg/ml) y se incuban durante 2 h a 37°. Los macrófagos se lavan repetidamente y posteriormente se captan imágenes utilizando la microscopía y se cuenta el número de células cancerosas que son fagocitadas por los macrófagos. Se calcula el índice fagocítico como el número de células cancerosas fagocitadas marcadas con CFSE por 100 macrófagos. Alternativamente, los macrófagos también se pueden marcar con un anticuerpo específico marcado fluorescentemente para el macrófago y se puede evaluar el número de células fagocitadas utilizando citometría de flujo de dos colores.

Se espera que los mAb anti-CD47 humanizados y quiméricos descritos en la presente memoria aumentaran el índice fagocítico desde un nivel bajo de fagocitosis (0-20 células diana por 100 macrófagos) a un nivel mucho más alto (50 200+ células diana por 100 macrófagos), depende tanto de la concentración como de la afinidad del anticuerpo utilizado, así como de la capacidad del anticuerpo para bloquear la interacción en la célula diana de CD47 con SIPRalpha en el macrófago. Los anticuerpos preferidos de la presente invención tienen un índice fagocítico de al menos 40, más preferiblemente de al menos 50, células diana por 100 macrófagos.

Los términos "favorecer", "que favorece" y similares se utilizan en la presente memoria como sinónimos de "aumentar", "que aumenta", etc.

"Isquemia" se refiere a un fenómeno vascular en el cual una disminución en el suministro de sangre a un órgano, tejido o parte del cuerpo es provocada, por ejemplo, por constricción u obstrucción de uno o más vasos sanguíneos. La isquemia a veces da como resultado la vasoconstricción o trombosis o embolia. La isquemia puede conducir a una lesión isquémica directa, daño tisular debido a la muerte celular provocada por un suministro reducido de oxígeno. La isquemia se puede producir de manera aguda, como durante la cirugía, o a causa del traumatismo en el tejido provocado en accidentes, lesiones y situaciones de guerra, o después de la extracción de órganos destinados para el trasplante posterior, por ejemplo. También se puede producir de forma subaguda, como se encuentra en la enfermedad vascular periférica aterosclerótica, donde el estrechamiento progresivo de los vasos sanguíneos conduce a un flujo sanguíneo inadecuado a los tejidos y órganos.

Cuando un tejido está sometido a isquemia, se inicia una secuencia de acontecimientos químicos que pueden conducir finalmente a disfunción celular y necrosis. Si la isquemia se termina con la restauración del flujo sanguíneo, se produce una segunda serie de acontecimientos perjudiciales que producen lesiones adicionales. Por tanto, siempre que hay una disminución o interrupción transitoria del flujo sanguíneo en un sujeto, la lesión resultante implica dos componentes: la lesión directa que se produce durante el intervalo isquémico y la lesión indirecta o reperfusión que sigue.

"Accidente cerebrovascular isquémico" puede ser provocado por varios tipos diferentes de enfermedades. El problema más común es el estrechamiento de las arterias en el cuello o la cabeza. Esto está provocado con mayor frecuencia por aterosclerosis o el depósito gradual de colesterol. Si las arterias pasan a estar demasiado estrechas, las células sanguíneas se pueden acumular en ellas y formar coágulos de sangre (trombos). Estos coágulos de sangre pueden bloquear la arteria donde se forman (trombosis) o se pueden desalojar y quedar atrapados en las arterias más cercanas al cerebro (embolia). El accidente cerebrovascular se puede producir cuando la placa aterosclerótica se separa parcialmente de la pared del vaso y obstruye el flujo de sangre a través del vaso sanguíneo.

"Reperfusión" se refiere a la restauración del flujo sanguíneo al tejido que está isquémico, debido a la disminución del flujo sanguíneo. La reperfusión es un procedimiento para tratar el infarto u otra isquemia, permitiendo que se recupere el tejido isquémico viable, limitando así además la necrosis. Sin embargo, la reperfusión puede dañar aún más el tejido isquémico, provocando lesiones por reperfusión.

Además de la lesión inmediata que se produce durante la privación del flujo sanguíneo, la "lesión isquémica/reperfusión" implica lesión tisular que se produce después de que se restaure el flujo sanguíneo. La comprensión actual es que gran parte de esta lesión es provocada por productos químicos, radicales libres y agentes biológicos activos liberados por los tejidos isquémicos.

“Donante de óxido nítrico, precursor u agente tópico que genera óxido nítrico" se refiere a un compuesto o agente o que suministra NO o que se puede convertir en NO mediante procesos enzimáticos o no enzimáticos. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, NO gas, dinitrato de isosorbida, nitrito, nitroprusiano, nitroglicerina, 3-morfolinosidnonimina (SIN-1), S-nitroso-N-acetilpenicilamina (SNAP), Dietilentriamina/NO (DETA/NO), S-nitrosotioles, Bidil® y arginina.

"Guanilil ciclasa soluble (sGC)" es el receptor para el óxido nítrico en el músculo liso vascular. En el sistema cardiovascular, el óxido nítrico se genera endógenamente por la óxido nítrico sintetasa endotelial de la L-arginina, y activa la guanilil ciclasa soluble en las células adyacentes del músculo liso vascular para aumentar los niveles de cGMP, que induce la relajación vascular. El óxido nítrico se une al resto hemo normalmente reducido de la guanilil ciclasa soluble, y aumenta la formación de cGMP a partir de GTP, que conduce a una disminución en el calcio intracelular, vasodilatación y efectos antiinflamatorios. La oxidación del hierro hemo en la sGC disminuye la capacidad de respuesta de la enzima al óxido nítrico y favorece la vasoconstricción. La vía del óxido nítrico-sGC-cGMP, por lo tanto, desempeña un papel importante en las enfermedades cardiovasculares. Se ha demostrado que los compuestos que contienen nitrógeno, tal como la azida de sodio, nitrito de sodio, hidroxilamina, nitroglicerina y el nitroprusiato de sodio, estimulan la sGC, lo que provoca un aumento de la cGMP y la relajación vascular. A diferencia de los estimuladores de la sGC, que se unen a la sGC reducida, los activadores de la sGC activan la enzima sGC oxidada o deficiente en hemo que no responde al óxido nítrico, es decir, estimulan la sGC independiente del estado redox. Mientras que los estimuladores de la sGC pueden mejorar la sensibilidad de la sGC reducida al óxido nítrico, los activadores de la sGC pueden aumentar la actividad de la enzima sGC incluso cuando la enzima se oxida y, por lo tanto, es menor o no responde al óxido nítrico. Por tanto, los activadores de la sGC no están basados en óxido nítrico. Obsérvense los análisis de Nossaman et al. (2012) Critical Care Research and Practice, Volumen 2012, artículo 290805 y Derbyshire and Marletta (2012) Ann. Rev. Biochem. 81: 533-559.

"Un agente que activa la guanilil ciclasa soluble" se refiere, por ejemplo, a nitratos orgánicos (Artz et al. (2002) J. Biol. Chem 277: 18253-18256); protoporphyrin IX (Ignarro et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.Uu .79: 2870-2873); YC-1 (Ko et al. (1994) Blood 84: 4226-4233); BAY 41-2272 y BAY 41-8543 (Stasch et al. (2001 Nature 410(6825): 212-5), c Mf -1571 y A-350619 (revisado en Evgenov et al. (2006) Nat. Rev. Drug. Discov. 5: 755-768); BAY 58-2667 (Cinaciguat; Frey et al. (2008) Journal of Clinical Pharmacology 48(12): 1400-10); BAY 63-2521 (Riociguat; Mittendorf et al. (2009) Chemmedchem 4(5): 853-65) Los activadores de la guanilil ciclasa solubles adicionales se describen en Stasch et al. (2011) Circulation 123: 2263-2273; Derbyshire and Marletta (2012) Ann. Rev. Biochem. 81: 533-559 y Nossaman et al. (2012) Critical Care Research and Practice, Volumen 2012, ID del artículo 290805, páginas 1-12.

Ejemplos de "un agente que inhibe las fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicos" incluyen sildenafil, tadalafil, vardenafil, udenafil y avanafil.

Los términos singulares "un", y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Del mismo modo, la palabra "o" pretende incluir "y" a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, que comprende A o B significa que incluye A, o B, o A y B.

El término "aproximadamente" como se emplea en la presente memoria es una palabra flexible con un significado similar a "alrededor de" o "casi". El término "aproximadamente" indica que no se reivindica la exactitud, sino más bien una variación contemplada. Por tanto, como se emplea en la presente memoria, el término "aproximadamente" significa dentro de 1 o 2 desviaciones estándar del valor específicamente recitado, o ± un rango de hasta 20%, hasta 15%, hasta 10%, hasta 5%, o hasta 4%, 3%, 2% o 1% en comparación con el valor específicamente recitado.

El término "que comprende", como se emplea en una reivindicación en la presente memoria, es de extremo abierto, y significa que la reivindicación debe tener todas las características específicamente recitadas en ella, pero que no hay impedimento para que características adicionales que no se reciten también estén presentes. El término "que comprende" deja abierta la reivindicación para la inclusión de componentes no especificados incluso en grandes cantidades. El término "que consiste esencialmente en” en una reivindicación significa que la invención necesariamente incluye los componentes enumerados, y está abierta a componentes no enumerados que no afectan materialmente a las propiedades básicas y novedosas de la invención. Una reivindicación “que consiste esencialmente en” ocupa un término medio entre las reivindicaciones cerradas que están escritas en un formato cerrado "que consiste en" y las reivindicaciones completamente abiertas que se redactan en un formato “que comprende”. Estos términos se pueden utilizar indistintamente en la presente memoria si, y cuando, esto pueda ser necesario.

Además, el uso del término "que incluye", así como otras formas relacionadas, tal como "incluye" e "incluido", no es limitante.

CD47 y lesión por isquemia-reperfusión (IRI)

Después de períodos de isquemia tisular, el inicio del flujo sanguíneo provoca daño denominado como "lesión por isquemia-reperfusión" o IRI. La IRI contribuye a malos resultados en muchos procedimientos quirúrgicos donde la IRI se produce debido a la necesidad de detener el flujo sanguíneo durante un período de tiempo, en muchas formas/causas de traumatismo en el que el flujo sanguíneo se interrumpe y después se restaura mediante intervención terapéutica y en procedimientos necesarios para el trasplante de órganos, procedimientos de derivación cardio/pulmonar, reinserción de partes del cuerpo cortadas, cirugías reconstructivas y cosméticas y otras situaciones que implican detener y reiniciar el flujo sanguíneo. La isquemia en sí misma provoca muchos cambios fisiológicos que, por ellos mismos, finalmente conducirían a necrosis de células y tejidos y la muerte. La reperfusión plantea su propio conjunto de acontecimientos dañinos que incluyen la generación de especies reactivas de oxígeno, trombosis, inflamación y daño mediado por citocinas. Las vías que están limitadas por el sistema TSP1-CD47 son precisamente aquellas que serían más beneficiosas para combatir el daño de la IRI. Por tanto, el bloqueo de la vía TSP1-CD47, como con los anticuerpos descritos en la presente memoria, proporcionará un funcionamiento más robusto de estas vías protectoras endógenas.

Los anticuerpos anti-CD47 humanizados, fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención se pueden utilizar en los métodos descritos en la patente de EE.UU. 8,236,313.

CD47 y cáncer

El CD47 ha sido identificado como una novedosa diana terapéutica en cánceres hematológicos (Majeti et al. (2009) Celda 138(2): 286-99, así como en tumores sólidos tales como los cánceres de colon, próstata, seno y cerebro (Willingham et al. (2012) Proc Natl Acad Sci EE.UU. 109(17): 6662-7. Muchos cánceres humanos sobreregulan la expresión de CD47 en la superficie celular y aquellos que expresan los niveles más altos de CD47 son los más agresivos y los más letales para los pacientes. Se cree que la expresión de CD47 aumentada protege a las células cancerosas de la eliminación fagocítica enviando una señal de "no me comas" a los macrófagos a través de SIRPalpha, un receptor inhibidor que previene la fagocitosis de las células que portan a CD47 (Jaiswal et al. (2009) Cell 138(2): 271-851; Chao et al. (2010) Science Translational Medicine 2(63): 63ra94) Por tanto, el aumento de la expresión de CD47 por muchos cánceres les proporciona una capa de "egoísmo" que ralentiza su eliminación fagocítica por parte de los macrófagos y las células dendríticas. Los mAb anti-CD47 (mAbCD47) que bloquean la interacción CD47/SIRPalpha mejoran la fagocitosis de las células cancerosas in vitro y contribuyen al control de la carga tumoral en modelos tumorales de xenoinjerto de humano a ratón publicados. Sin embargo, existen mecanismos por los cuales los mAb CD47 pueden atacar las células transformadas que aún no han sido explotadas en la guerra contra el cáncer.

Frazier et al. han demostrado que un mAbCD47 antihumano particular (clon 1F7) tiene un efecto tóxico para tumores directo sobre las leucemias de células T humanas (Manna and Frazier (2003) A. J. Immunol. 170: 3544-53) y varios cánceres de seno (Manna and Frazier (2004) A. Cancer Research 64(3): 1026-36) Otros grupos han descrito dichos hallazgos en tipos adicionales de leucemia (Uno et al. (2007) Oncol. Rep. 17(5): 1189-94; Mateo et al. (1999) Nat. Med. 5: 1277-84) El mAb 1F7 mata las células tumorales que portan a CD47 sin la acción del complemento o la muerte celular mediada por las células NK, las células T o los macrófagos. En su lugar, el mAb 1F7 actúa a través de un mecanismo no apoptótico que implica un ataque directo dependiente de CD47 en la mitocondria, descarga su potencial de membrana y destruye la capacidad de generación de ATP de la célula que conduce a la muerte celular rápida. Cabe destacar que el mAb 1F7 no mata los leucocitos en reposo, que también expresan CD47, sino solo aquellas células que se "activan" por transformación. Por tanto, las células circulantes normales, todas las cuales expresan CD47, se salvan mientras que las células cancerosas se matan selectivamente por el mAbCD47 tóxico para el tumor (Manna and Frazier (2003) A. J. Immunol. 170: 3544-53). Este mecanismo se puede considerar como un ataque proactivo, selectivo y directo sobre las células tumorales a diferencia del mecanismo pasivo de favorecer (aumentar) la fagocitosis simplemente bloqueando la unión CD47/SIRPalpha. De manera importante, el mAb 1F7 también bloquea la unión de SIRPalpha a CD47 y, por tanto, puede actuar a través de dos mecanismos: (1) citotoxicidad tumoral directa, que induce la muerte celular y (2) favorecer (aumentar) la fagocitosis de las células tumorales muertas y agonizantes. Un único mAb que puede cumplir ambas funciones puede ser superior a uno que solo bloquea la unión CD47/SIRPalpha. De hecho, se ha demostrado que la combinación de un mAbCD47 de bloqueo para favorecer la fagocitosis con el mAb anti-CD20 citotóxico, Rituximab, es más eficaz que cualquier mAb solo para erradicar el linfoma no Hodgkin humano en un modelo de ratón con xenoinjerto (Chao et al. (2010) Cell 142 (5): 699-713) Sin embargo, el Rituximab mata lisando las células cancerosas, lo que conduce a un perfil de efectos secundarios severos (Hansel et al. (2010) Nat Rev Drug Discov. 9(4): 325-38). Por el contrario, el mAb 1F7 tóxico para tumores no provoca lisis celular rápida, sino que provoca la presentación de fosfatidilserina en la superficie celular, lo que favorece (aumenta) así la eliminación fagocítica también mediante este mecanismo.

Los anticuerpos que bloquean CD47 y evitan su unión a SIRPalpha ("mAb bloqueantes") han demostrado eficacia en el tumor humano en modelos de tumores de ratón (xenoinjerto). Dicho bloqueo de los mAbCD47 que presentan esta propiedad favorece (aumenta) la fagocitosis de las células cancerosas por los macrófagos, lo que puede reducir la carga tumoral (Majeti et al. (2009) Cell 138(2): 286-99) y puede conducir finalmente a la generación de una respuesta inmune adaptativa al tumor (Tseng et al. (2013) Proc Natl Acad Sci EE.UU. 110(27): 11103-8). Estos mAb bloqueantes no tienen acción citotóxica directa contra las células cancerosas, a diferencia de los mAb de la presente invención, como se ejemplifica por varios de los clones descritos en el Ejemplo 4 en la presente memoria, y por lo tanto abarcados por la presente invención.

De manera interesante e importante, se ha demostrado en un modelo de xenoinjerto de linfoma no Hodgkin que la eficacia del bloqueo de los mAbCD47 se puede mejorar mediante el tratamiento simultáneo con otro mAb (en ese caso, Rituxan®/Rituximab) que se une a CD20 en la célula cancerosa y que tiene actividad citotóxica hacia esa célula cancerosa (Chao et al. (2010) Cell 142(5): 699-713) Ese estudio demuestra el potencial de un beneficio terapéutico aumentado que resulta de combinar la citotoxicidad directa con el bloqueo CD47/SIRPalpha. Por tanto, es razonable esperar que un único compuesto de anticuerpo anti-mAbCD47 que combine ambas propiedades, es decir, que bloquee la unión de SIRPalpha y también que induzca/favorezca la muerte de las células cancerosas, un "anticuerpo de doble acción", será una entidad terapéutica más eficaz que un mAbCD47 con cualquier propiedad única solamente.

Una ventaja adicional de dicho mAb de doble acción es que la muerte celular inducida dará como resultado la aparición en la superficie de la célula agonizante/muerta de moléculas adicionales (p. ej., fosfatidilserina o calreticulina) que pueden ser reconocidas por los receptores profagocíticos en los macrófagos, por tanto favorece aún más la eliminación fagocítica de la célula cancerosa más allá de lo que se podría lograr simplemente bloqueando la interacción CD47-SIRPalpha.

Por lo tanto, se espera completamente que dichos compuestos de anticuerpos mAbCD47 de doble acción abarcados por la presente invención que tengan funciones tanto de bloqueo como citotóxicas proporcionen beneficios terapéuticos aumentados en comparación con los anticuerpos que presentan solo una función única.

Indicaciones terapeuticas

Condiciones autoinmunes/inflamatorias y relacionadas con la IRI

La administración de un mAb CD47 o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en la presente memoria se puede utilizar para tratar un número de enfermedades y afecciones en las que la IRI es una característica contribuyente, y para tratar diversas enfermedades autoinmunes e inflamatorias. Estas incluyen: trasplante de órganos en el que un mAb o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención se administra al donante antes de la extracción del órgano, al órgano donante extraído, a la solución de preservación del órgano, al paciente receptor, o a cualquier combinación de los mismos; injerto de piel; resecciones quirúrgicas o reconstrucción tisular en la que dicho mAb o fragmento se administra o localmente mediante inyección al tejido afectado o por vía parenteral al paciente; reinserción de partes del cuerpo; tratamiento de lesiones traumáticas; hipertensión pulmonar; enfermedad de células falciformes (crisis); infarto de miocardio; accidente cerebrovascular; isquemia inducida quirúrgicamente; enfermedad renal aguda/insuficiencia renal; cualquier otra afección en la que se produce la IRI y contribuye a la patogénesis de la enfermedad; y enfermedades autoinmunes/inflamatorias, que incluyen artritis, esclerosis múltiple, psoriasis, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal, lupus, enfermedad de Grave y tiroiditis de Hashimoto, y espondilitis anquilosante

Los mAb CD47 y fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención también se pueden utilizar para aumentar la perfusión tisular en un sujeto en necesidad de dicho tratamiento. Dichos sujetos se pueden identificar mediante procedimientos de diagnóstico que indican una necesidad de aumentar la perfusión tisular. Además, puede surgir la necesidad de aumentar la perfusión tisular porque el sujeto ha tenido, está teniendo o tendrá una cirugía seleccionada de cirugía de tegumento, cirugía de tejidos blandos, cirugía de tejidos compuestos, cirugía de injerto de piel, resección de un órgano sólido, cirugía de trasplante de órgano, o reinserción o un apéndice u otra parte del cuerpo.

Cánceres susceptibles

Los mAb y fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos actualmente eficaces como terapéuticos contra el cáncer se pueden administrar a pacientes, preferiblemente por vía parenteral, con cánceres hematológicos susceptibles y tumores sólidos que incluyen, pero no se limitan a, leucemias, que incluyen leucemia linfocítica aguda (linfoblástica), leucemia mieloide aguda, leucemia mielógena, leucemia linfocítica crónica, mieloma múltiple, leucemia mieloide crónica y leucemia de células plasmáticas; linfomas, que incluye linfoma de Hodgkin y linfoma no Hodgkin, que incluye linfoma de células B, linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular, linfoma de células del manto, linfoma de células B de la zona marginal, linfoma de células T y la macroglobulinemia de Waldenstrom; cáncer de ovarios; cáncer de mama; cáncer endometrial; cáncer de colon; cáncer de recto; cáncer de vejiga; cáncer de pulmón; cáncer de bronquios; cáncer de huesos; cáncer de prostata; cáncer de páncreas; cáncer gástrico; cáncer de hígado y conductos biliares; cáncer de esófago; cáncer renal; cáncer de tiroides; cáncer de cabeza y cuello; cáncer testicular; glioblastoma; astrocitoma; melanoma; síndrome mielodisplásico; y sarcomas que incluyen, entre otros, osteosarcoma, sarcoma de Ewing, leiomiosarcoma, sarcoma sinovial, sarcoma alveolar de partes blandas, angiosarcoma, liposarcoma, fibrosarcoma, rabdomiosarcoma y crondrosarcoma.

En ciertos casos, puede ser ventajoso administrar el mAb directamente al cáncer mediante inyección en el tumor. Dado que la expresión de CD47 está sobreregulada en muchos cánceres, también puede ser deseable utilizar uno o más de los mAb descritos como agentes de diagnóstico por imagen cuando se marcan con trazadores radiactivos u otros trazadores conocidos por los expertos en la técnica de imágenes in vivo de cánceres/tumores.

Intercambiabilidad de anticuerpos: uso de todos los clones mAb 1-24 como terapéuticos contra el cáncer y/o en indicaciones de IRI

Los diferentes anticuerpos descritos en la presente memoria se han clasificado o como citotóxicos o no citotóxicos, y son útiles o para indicaciones de cáncer o indicaciones de isquemia-reperfusión como los ligandos de CD47 que son responsables por su papel en el cáncer (SIRPalpha) y la IRI (trombospondina-1) se evita que se unan a CD47 por anticuerpos de ambas clases.

Por lo tanto, dependiendo del predominio del mecanismo patogénico particular en una enfermedad, afección, aplicación terapéutica o cáncer particular, los anticuerpos de cualquier clase pueden ser eficaces en un contexto terapéutico particular y, por tanto, se pueden utilizar de manera intercambiable, en lugar de uno el otro o en combinación entre sí, según sea apropiado, para lograr el efecto terapéutico deseado.

Obsérvense las discusiones adicionales y los datos que evidencian la intercambiabilidad de anticuerpos, en los Ejemplos 4 y 5 a continuación, respectivamente.

Terapias de combinación

Se debería observar que los métodos terapéuticos abarcados en la presente memoria incluyen el uso de los anticuerpos descritos en la presente memoria solos, y/o en combinaciones entre sí, y/o con fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y/o con anticuerpos competidores que presentan también actividad biológica/terapéutica apropiada, es decir, todas las combinaciones posibles de estos compuestos de anticuerpos.

Además, los presentes métodos terapéuticos también abarcan el uso de estos anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, anticuerpos competidores, etc., y combinaciones de los mismos además en combinación con: (1) uno cualquiera o más de los donantes de óxido nítrico, precursores, o agentes tópicos que generan óxido nítrico, y/o agentes que activan la guanilil ciclasa soluble, y/o agentes que inhiben las fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicos descritos en la presente memoria, o (2) uno cualquiera o más tratamientos terapéuticos antitumorales seleccionados de cirugía, radiación, agentes antitumorales o antineoplásicos, y combinaciones de cualquiera de estos, o (3) equivalentes de cualquiera de los anteriores de (1) o (2) como sería evidente para un experto en la técnica, en combinación(es) apropiada(s) para lograr el efecto terapéutico del tratamiento deseado para la indicación particular.

Los siguientes ejemplos ilustran diversos aspectos de la presente invención, pero no se deben considerar como limitantes de la invención solo a estas realizaciones particularmente descritas. Los materiales y métodos empleados en los ejemplos a continuación son para fines ilustrativos y no pretenden limitar la práctica de la presente invención a los mismos. Cualesquiera materiales y métodos similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria, como sería evidente para un experto en la materia, se pueden utilizar en la práctica o ensayo de la presente invención.

Ejemplo 1

Producción de anticuerpos CD47

Los anticuerpos humanizados descritos en la presente memoria comprenden marcos derivados del genoma humano. La coleción abarca la diversidad encontrada en las secuencias de la línea germinal humana, que produce anticuerpos funcionalmente expresados in vivo. Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) en las regiones variables de la cadena ligera y pesada del anticuerpo quimérico no humano diana VxP037-01 LC/VxP037-01 HC (SEQ ID NO: 7/SEQ ID NO: 57) se determinan siguiendo las reglas comúnmente aceptadas descritas, por ejemplo, en "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains", en: Antibody Engineering Lab Manual, Eds. S. Duebel and R. Kontermann, Springer-Verlag, Heidelberg (2001)). Se sintetizan los fragmentos CDR y se combinan con grupos de marcos para generar dominios variables de longitud completa. Luego se combinan los dominios variables humanizados con una señal de secreción y los dominios constantes kappa humana e IgG1 humana, y se clonan en un sistema de expresión de mamífero (p. ej., OptiCHO System, Lifetechnologies, Carlsbad, CA) para generar una biblioteca de variantes de IgG1 humanizada. Se secuencia una alícuota de la biblioteca para garantizar una alta diversidad e integridad de los marcos de lectura de los clones individuales. Luego se vuelven a disponer alícuotas minipreparadas de la biblioteca de variantes humanizadas como clones únicos en placas de 96 pocillos (p. ej., Kit Miniprep de 96 pocillos, Qiagen Hilden, Alemania) y se transfectan en células CHO (Lipofectamine transfection protocol as recommended by Lifetechnologies, Carlsbad, CA). Las células CHO transfectadas se cultivan en medio DMEM con FBS al 10% (ambas de Lifetechnologies, Carlsbad, CA) a 37°C bajo CO2 al 5%. Se expresan las variantes humanizadas como moléculas IgG1 de longitud completa y se secretan en el medio.

Se criba luego el sobrenadante del cultivo celular que contiene las variantes de IgG humanizadas para su unión al antígeno diana. Simultáneamente, se determina la concentración de cada variante para calcular la actividad específica para cada clon. Se compara la actividad específica de cada clon con la actividad específica del clon quimérico VxP037-01LC/VxP037-01HC (SEQ ID NO: 7/SEQ ID NO: 57) expresada en la misma placa y normalizada. Los mejores resultados de cada placa se vuelven a disponer y se vuelven a cribar para la confirmación. Se seleccionan los candidatos finales por la actividad específica, actividad funcional, nivel de expresión y diversidad de secuencia, así como otros criterios, como se describe a continuación.

Ejemplo 2

Las CDR del anticuerpo CD47

Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena ligera y la cadena pesada, las cadenas ligeras y pesadas completas, y las secuencias de nucleótidos codificantes respectivas de los anteriores anticuerpos de ingeniería humana se enumeran a continuación en la sección titulada "Secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos."

Las secuencias de aminoácidos de las CDR de la cadena ligera y la cadena pesada se muestran en las Tablas 1 y 2, respectivamente.

Tabla 1. CDRs de la cadena ligera

Tabla 2. CDRs de la cadena pesada

Ejemplo 3

Unión de anticuerpos a CD47 de diferentes especies

Se determina la reactividad cruzada entre especies de anticuerpos humanizados de la presente invención utilizando glóbulos rojos (RBC) recién aislados, que presentan a CD47 en su superficie, de humano, ratón, rata, cerdo y perro según los métodos descritos en Kamel et al. (2010) Blood. Transfus 8(4): 260-266.

Se recogen los sobrenadantes que contienen anticuerpos secretados de células CHO transfectadas transitoriamente con plásmidos que codifican clones de anticuerpos y se utilizan como se recogen, o además se purifican los anticuerpos de los sobrenadantes utilizando métodos estándar. Se cultivan las células CHO transfectadas en medio F-12 que contiene suero bovino fetal al 10% inactivado por calor (BioWest; S01520). Se determina la concentración de anticuerpo en los sobrenadantes utilizando un ELISA cuantitativo. Se recubren las placas ELISA con un anticuerpo FC anti-humano de burro (Sigma; Catálogo #12136) en 10 pg/ml durante la noche a 4°C (Promega; Catálogo #W4031). Se lavan las placas con PBS y luego se bloquean con solución de bloqueo de caseína (ThermoScientific; Catálogo #37532) durante 60 minutos a temperatura ambiente. Se lavan de nuevo las placas con PBS, se añaden los sobrenadantes del cultivo de tejidos y se incuban las placas durante 60 minutos a temperatura ambiente. Luego, se lavan las placas tres veces con PBS y se incuban con IgG anti-humana de cabra conjugada con peroxidasa (Jackson Immunoresearch Labs; Catálogo #109-035-003) durante 60 minutos a temperatura ambiente. Se lavan las placas tres veces con PBS, y se añade el sustrato de peroxidasa 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (Sigma; Catálogo #T4444). Las reacciones terminan mediante la adición de HCl a 0,7N, y se determina la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de placas modelo Infinite M200 de Tecan.

Se incuban los RBC durante 60 minutos en hielo con los sobrenadantes del cultivo de tejidos que contienen los anticuerpos humanizados secretados a una concentración de 10 ng/ml en una solución de solución salina tamponada con fosfato, pH 7,2, EDTA 2,5 mM (PBS E), o con diversas concentraciones de anticuerpos purificados. Luego, se lavan las células con PBS E frío, y se incuban durante una hora adicional en hielo con anticuerpo antihumano de burro marcado con FITC (Jackson Immuno Research Labs, West Grove, PA; Catálogo #709-096-149) en PBS E. Luego se lavan las células con PBS E, y se analiza la unión del anticuerpo utilizando un clasificador de células BD FACSAria (Becton Dickinson) o un citómetro de flujo Accuri C6 (Becton Dickinson). Se cuantifica la unión de anticuerpos mediante la comparación de los valores medios de fluorescencia con relación a los del anticuerpo quimérico >VxP037-01 LC (SEQ ID NO: 7))/>VxP037-01 HC (SEQ ID NO: 57). Se divide el valor medio de fluorescencia para cada anticuerpo por el valor medio de fluorescencia para el anticuerpo quimérico.

Los resultados obtenidos de los sobrenadantes se muestran en la Tabla 3, donde "Quimera" representa el anticuerpo quimérico >VxP037-01LC (SEQ ID NO: 7))/>VxP037-01HC (SEQ ID NO: 57), el clon 1 representa >pVxK7b-037-hum01-LC (SEQ ID NO: 8)/>pVxK7b-037-hum01-HC (SEQ ID NO: 58), el clon 2 representa >pVxK7b-037-hum02-LC (SEQ ID n O: 9)/>pVxK7b-037-hum02-HC (SEQ ID n O: 59), y así sucesivamente para los clones restantes 3-24.

Tabla 3

Unión de anticuerpos humanizados a CD47 en la superficie de los glóbulos rojos de diferentes especies de mamíferos

La Figura 1 muestra las curvas de unión de especies cruzadas a los RBC humanos, de ratón, de rata y porcinos (paneles A, B, C y D, respectivamente, generadas utilizando diversas concentraciones de anticuerpos purificados de los clones Cl 1, Cl 1.1, Cl 13 y Cl 13.1 Los clones Cl 1 y Cl 13 son como se describe anteriormente en la Tabla 3. Los clones Cl 1.1 y Cl 13.1 son mutantes Fc de los clones Cl 1 y Cl 13, respectivamente, modificados para reducir la función efectora. Cada uno tiene una mutación Asn297^Gln (N297Q) en el dominio Fc (Sazinsky et al. (2008) PNAS 105(51): 20167-20172) Todos estos clones presentan unión dependiente de la concentración a todas las especies de RBC ensayados.

Estos datos demuestran que todos los clones de mAb CD47 humanizados descritos en la presente memoria se unen bien a CD47 de una variedad de especies de mamíferos diferentes, confirmando la reactividad cruzada entre especies útil de estos anticuerpos.

Ejemplo 4

Ensayo de viabilidad celular

El fin de este experimento es identificar clones de anticuerpos de la presente invención que presenten, y no presenten, actividad citotóxica. Para uso en indicaciones cardiovasculares, que incluye el trasplante y otras aplicaciones relacionadas con la IRI, el mAb terapéutico idealmente debería carecer de actividad citotóxica. Por el contrario, los anticuerpos útiles en el tratamiento del cáncer idealmente deberían presentar toxicidad contra las células transformadas/cancerosas. Se espera que esta propiedad adicional de toxicidad selectiva para las células cancerosas tenga ventajas en comparación con los mAb que solo evitan la unión de SIRPalpha a CD47.

Sin embargo, como se observó anteriormente en la sección titulada "Intercambiabilidad de anticuerpos", aunque los anticuerpos descritos en la presente memoria se han clasificado o como citotóxicos o no citotóxicos, son útiles o para indicaciones de cáncer o indicaciones de isquemia-reperfusión ya que los ligandos de CD47 que son responsables por su papel en el cáncer (SIRPalpha) y la IRI (trombospondina-1) evitan que se unan a CD47 por anticuerpos de ambas clases. Obsérvese, a modo de ejemplo, el Ejemplo 5 a continuación, que emplea anticuerpos tanto citotóxicos como no citotóxicos.

El método empleado se describe en Vistica et al. (1991) Cancer Res. 51: 2515-2520.

Se cultivan células Jurkat JE6.1 (ATCC, Manassas, VA; Catálogo #TIB-152) en medio de Dulbeccco modificado de Iscove que contiene suero bovino fetal al 5% (v/v) inactivado por calor (BioWest; Catálogo #S01520), 100 unidades/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina (Sigma; Catálogo #P4222) a densidades menores que 1 x 106 células/ml. Para el ensayo de viabilidad celular, las células se colocan en placas, en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos a una densidad de 2 x 104 células/ml en medio de Dulbecco modificado de Iscoves que contiene suero bovino fetal al 5% (v/v) inactivado por calor (BioWest; Catálogo #S01520), 100 unidades/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina (Sigma; #P4222) junto con los anticuerpos humanizados como se describe en la presente memoria a una concentración final de 10 ng/ml, preparada como se describe anteriormente en el Ejemplo 3, en la Tabla 3, o a una concentración de 5 pg/ml utilizando anticuerpos purificados en la Figura 2. Se incuban las células durante 72 horas a 37°C en una atmósfera de CO2 al 5% (v/v). Luego se cuantifica la densidad celular utilizando el reactivo WST1 (Roche Applied Science, Indianápolis, IN; Catálogo #05015944001) según las instrucciones del fabricante. Se cuantifica el efecto de los anticuerpos sobre el crecimiento celular en comparación con el crecimiento de células que no contienen anticuerpos añadidos (PBS; porcentaje de muerte promedio=0).

Los resultados utilizando los sobrenadantes se muestran en la Tabla 4. Los valores en la tabla representan la media de 3 experimentos separados. La "quimera" y los números de los clones son como se describe anteriormente en el Ejemplo 3. 1F7 es el mAbCD47 antihumano, descrito anteriormente, que tiene un efecto directo y tóxico para tumores sobre las leucemias de células T humanas (Manna and Frazier (2003) A. J. Immunol. 170: 3544-53) y varios cánceres de seno (Manna and Frazier (2004) A. Cancer Research 64(3): 1026-36).

Los resultados utilizando los clones purificados 13, 14 y 24 se muestran en la Figura 2.

Tabla 4

Citotoxicidad de los mAbCD47 humanizados en células T humanas transformadas, Jurkat JE6.1

Estos datos demuestran que la mayoría de los presentes clones de anticuerpos humanizados no son significativamente citotóxicos hacia las células T Jurkat. Sin embargo, algunos de los clones tienen una citotoxicidad significativa, similar al mAbCD47 anti-humano, 1F7, de ratón previamente identificado (Manna and Frazier, J. Immunol. (2003) 170(7): 3544-53.

Los siguientes clones, indicados en la Tabla 2 con un "Sí", se consideran citotóxicos: 2, 3, 5, 6, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17 y 19.

Los siguientes clones se consideran no tóxicos: 1,4, 7, 9, 11, 12, 18, 20, 21,22, 23 y 24. Los resultados utilizando los clones purificados 13, 14 y 24 se muestran en la Figura 2, también se indica que los clones 13 y 14 son citotóxicos con actividad similar a 1F7, mientras que el clon 24 no reduce la viabilidad celular.

Ejemplo 5

Regulación de la señalización de óxido nítrico

El fin de este experimento es demostrar que los clones de anticuerpos humanizados no citotóxicos (números 1, 9, 11 y 24) y citotóxicos (número 13) de la presente invención presentan la capacidad de invertir la inhibición mediada por TSP1 de la síntesis de cGMP estimulada por NO como, por ejemplo, la descrita previamente utilizando anticuerpos monoclonales de ratón contra CD47 como se describe por Isenberg et al. (2006) J. Biol. Chem 281: 26069-80. Este es un ejemplo de intercambiabilidad de anticuerpos en la presente invención, discutido anteriormente en la descripción detallada y en el Ejemplo 4.

El método empleado para medir cGMP es como se ha descrito por el fabricante (Kit de ensayo fluorescente CatchPoint Cyclic-GMP, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Se utilizan las células Jurkat JE6.1 (ATCC, Manassas, VA; Catálogo #TIB-152) ya que estas células conservan la vía de señalización NO-cGMP cuando crecen en cultivo y presentan una respuesta inhibitoria robusta y reproducible a la ligación de TSP1 a CD47. Las células se cultivan en medio de Dulbeccco modificado de Iscove que contiene suero bovino fetal al 5% (v/v) inactivado por calor (BioWest; Catálogo #S01520), 100 unidades/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina (Sigma; Catálogo #P4222) a densidades inferiores a 1 x 106 células/ml. Para el ensayo de cGMP, las células se colocan en placas, en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos a una densidad de 1 x105 células/ml en medio de Dulbecco modificado de Iscoves que contiene suero bovino fetal al 5% (v/v) inactivado por calor (BioWest; Catálogo #S01520), 100 unidades/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina (Sigma; #P4222) durante 24 horas y luego se transfirieron a medio sin suero durante la noche.

Los anticuerpos humanizados como se describen en la presente memoria, purificados a partir de transfecciones transitorias en células CHO como se describe anteriormente en el Ejemplo 3, así como el anticuerpo quimérico de control, se añaden luego a una concentración final de 20 ng/ml, seguido 15 minutos después de 0 o 1 pg/ml de TSP1 humana (Athens Research and Technology, Atenas, GA, Catálogo # 16-20-201319). Después de 15 minutos adicionales, se añade el donante de NO, dietilamina NONOato (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, Catálogo #82100), a la mitad de los pocillos a una concentración final de 1 pM. Cinco minutos después, se lisan las células con el tampón suministrado en el kit cGMP, y se ensayan alícuotas de cada pocillo para el contenido de cGMP.

Como se muestra en las Figuras 3 y 4, ninguno de los presentes clones de anticuerpos humanizados ensayados, o el mAb de control quimérico, tiene un efecto sobre los niveles basales de cGMP. Como se esperaba, el anticuerpo quimérico (>VxP037-01 LC (SEQ ID NO: 7))/>VxP037-01 HC (SEQ ID NO: 57) invierte la inhibición de TSP1.

Los clones humanizados 1, 9, 11, 13 y 24 de la presente invención también invierten significativamente la inhibición de TSP1, lo que demuestra que tienen la capacidad de aumentar la señalización de NO (Figuras 3 y 4), lo que sugiere su utilidad para proteger el sistema cardiovascular contra el estrés, que incluye, pero no se limita a, aquellos que dan como resultado heridas, inflamación, hipertensión, síndrome metabólico, isquemia y lesión por isquemia-reperfusión (IRI).

Ejemplo 6

Reducción de la lesión por isquemia-reperfusión in vivo

El fin de este experimento es demostrar que un clon de anticuerpo humanizado descrito en la presente memoria, es decir, el clon 1, que se muestra que regula la señalización de óxido nítrico in vitro en el Ejemplo 5, es eficaz para reducir la IRI y el daño renal in vivo en un modelo de trasplante renal de rata. La IRI contribuye significativamente a demorar la función del injerto y la inflamación conduce a la pérdida del injerto, y se ve agravado por el sistema trombospondina-1/CD47 a través de la inhibición de la señalización de óxido nítrico.

Se utiliza un modelo de trasplante renal de rata singénica de IRI con receptores nefrectomizados bilateralmente para evaluar el efecto del Clon 1 del anticuerpo monoclonal anti-CD47 sobre la función del injerto después del trasplante como se describe en Schumacher et al. (2003) Microsurg. 23: 389-394 and Karatzas et al. (2007) Microsug. 27: 668 672.

Se obtienen ratas Lewis macho que pesan 275-300 g de Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Los riñones de los donantes se enjuagan con 50 pg de Clon 1 purificado o vehículo (solución salina tamponada con fosfato, pH 7,2), y se almacenan a 4°C en la solución de preservación de la Universidad de Wisconsin (UW) durante 6 horas antes del trasplante. Dos días después del trasplante, se evalúa la función renal midiendo la creatinina sérica mediante una metodología estándar.

Como se muestra en la Figura 5, la perfusión del Clon 1 mAbCD47 de los riñones de los donantes da como resultado la función renal mejorada en comparación con los controles medidos mediante una reducción en la creatinina sérica.

Ejemplo 7

Actividad antitumoral in vivo

El fin de este experimento es demostrar que un clon de anticuerpo humanizado descrito en la presente memoria, es decir, el Clon 13, que mostró presentar actividad citotóxica y redujo la viabilidad celular in vitro en el Ejemplo 4, reduce la carga tumoral in vivo en un modelo de leucemia de ratón.

Se determina la actividad antitumoral del Clon13 anti-mAbCD47 (Cl 13; número de clon como se describe anteriormente en el Ejemplo 3) en un modelo murino singénico de leucemia promielocítica aguda (APL) como se describe en Ramirez et al. (2009) Blood 113: 6206-6214.

Se inyectan las células APL murinas (B6APL1) por vía intravenosa en ratones C57BL/6 distribuidos al azar en tres grupos (5-10 ratones por grupo): Grupo 1: sin APL; Grupo 2: APL sin tratamiento; Grupo 3: APL con tratamiento del Cl 13 del anti-mAbCD47. Se inicia el tratamiento con anticuerpos el día de la inoculación del tumor (día 0) y se proporciona en dosis únicas de 10 pg/dosis (0,4 mg/kg) en solución salina tamponada con fosfato, pH 7,2, mediante inyección intraperitoneal los días 0, 3 y 6.

Se evalúa la carga tumoral el día 25 después de la inoculación de células tumorales. Se analizan las muestras de sangre de cada ratón para el recuento de glóbulos blancos utilizando un hemocitómetro automatizado, y se cuantifican las células APL circulantes (que representan la carga tumoral) por citometría de flujo (células CD34+/CD117+). Como se muestra en la Figura 6, los ratones tratados con el Cl 13 han reducido la carga tumoral en comparación con los ratones no tratados a los 25 días después de la inoculación del tumor, lo que demuestra así la actividad antitumoral de este clon humanizado.

Secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos

Secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera

>VxP037-0lLC: Las secuencias de aminoácidos subrayadas representan las CDR

D W M TO T PL SL SV SL G D O A SISC RSSOSLVH SNG NTY LHW YLOKPGOSPKLLIYK VSYRF

SGVPD RFSGSG SGTDFTLKISRV EAED LGV YFCSO NTHVPRTFG OG (SEQ ID NO :7) >pVxK7b-037-hum01-LC

DIVM TQTPLSLPV TPGEPASISCRSSQSLV HSN GN TYLHW YQ QKPGK APK LLIYKV SY RF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRV EAED VG VY YCSQN THV PRTFGQG (SEQ ID NO:8) >pVxK7b-037-hum02-LC

DVVM TQSPLSLPVTLGQ PASISCRSSQSLV HSNGN TYLHW YQ QK PGQ APRLLIYK VSY RF SGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQ PD DFA TYY CSQ NTH VPRTFG QG (SEQ ID NO:9) >pVxK7b-037-hum03-LC

DVVM TQSPLSLPVTLGQ PASISCRSSQSLV HSNGN TYLHW YQ QK PGK APK LLIYK VSY RF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRV EAED VG VY YCSQN THV PRTFGQG (SEQ ID NO: 10) >pVxK7b-037-hum04-LC

DIQM TQSPSSLSASVG DRVTITCRSSQ SLVH SN GNTYLH W Y LQK PG QSPQ LLIYK VSY RF SGIPARFSGSG SG TEFTLTISSLQSEDFA VY YCSQN THV PRTFGQ G (SEQ ID N O :l 1) >pVxK7b-037-hum05-LC

DIVM TQTPLSLPV TPGEPASISCRSSQSLV HSN GN TYLHW YLQ KPG QSPQLLIY KVSYRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRV EAED VG VY YCSQN THV PRTFGQG (SEQ ID NO: 12) >pVxK7b-037-hum06-LC

DIQM TQ SPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSNGNTYLHW YLQKPGQSPQLLIYKVSYRF SG IPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCSQNTHVPRTFGQG (SEQ ID NO: 13) >pVxK7b-037-hum07-LC

DIVM TQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHW YLQKPGQSPQLLIYKVSYRF SG VPDRFSGSGSGTDFTLKJSRVEAEDVGVYYCSQNTHVPRTFGQG (SEQ ID NO: 14) >pVxK7b-037-hum08-LC

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DV VM TQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHW YQQKPGKAPKLLIYKVSYRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPRTFGQG (SEQ ID NO: 16) >pVxK7b-037-huml0-LC

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EIVLTQSPA TLSVSPGERATLSCRSSQSLVHSNGNTYLHW YQQKPGQAPRLLIYKVSYRF SG VPSRFSGSGSGTDFTFTISSLEAEDAATYYCSQNTHVPRTFGQG (SEQ ID NO: 18) >pVxK7b-037-huml2-LC

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DIVM T QTPLSLPVTPGEP ASIS CRSS Q SLVHSN GNTYLH W Y QQ KPGKAPKLLIYKV SYRF SG VPD RFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPRTFGQG (SEQ ID NO:20) >pVxK7b-037-huml4-LC

DV VM TQ SPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHW YQQKPGKAPKLLIYKVSYRF SG VPD RFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPRTFGQG (SEQ ID NO:21) >pVxK7b-037-hum 15-LC

AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSNGNTYLHW YQQKPGQAPRLLIYKVSYRF SG VPSRFSG SG SGTEFTLTISSLQPDDFATYYCSQNTHVPRTFGQG (SEQ ID NO:22) >pVxK7b-037-hum 16-LC

AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSNGNTYLHW YQQKPGQAPRLLIYKVSYRF SG VPD RFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPRTFGQG (SEQ ID NO:23) >pVxK7b-037-hum 17-LC

AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSNGNTYLHW YQQKPGQAPRLLIYKVSYRF SG VPD RFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPRTFGQG (SEQ ID NO:24) >pVxK7b-037-huml8-LC

EIVLTQSPATLSVSPGERATLSCRSSQSLVHSNGNTYLHW YQQKPGQAPRLLIYKVSYRF SG VPSRFSGSGSGTDFTFTISSLEAEDAATYYCSQNTHVPRTFGQG (SEQ ID NO:25) >pVxK7b-037-hum 19-LC

DV VM TQ SPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHW YQQKPGKAPKLLIYKVSYRF SG VPD RFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPRTFGQG (SEQ ID NO:26) >pVxK7b-037-hum20-LC

DIVM TQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHW YLQKPGQSPQLLIYKVSYRF SG VPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPRTFGQG (SEQ ID NO:27) >pVxK7b-037-hum21-LC

AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSNGNTYLHW YQQKPGQAPRLLIYKVSYRF SG VPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPRTFGQG (SEQ ID NO:28) >pVxK7b-037-hum22-LC

EIVLTQSPATLSVSPGERATLSCRSSQSLVHSNGNTYLHW YQQKPGQAPRLLIYKVSYRF SGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLEAEDAATYYCSQNTHVPRTFGQG (SEQ ID NO:29) >pVxK7b-037-hum23-LC

DIVM TQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHW YQQKPGKAPKLLIYKVSYRF SG VPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPRTFGQG (SEQ ID NO:30) >pVxK7b-037-hum24-LC

AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSNGNTYLHW YQQKPGQAPRLLIYKVSYRF SGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCSQNTHVPRTFGQG (SEQ ID NO:31)

Secuencias de ácidos nucleicos de la región variable de la cadena ligera

>VxP037-01LC GATGTTGTTATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGTCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCC ATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGG TACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCTACCGATTT T CT GGGGTCCC AGAC AGGTT CAGT GGCAGT GGAT CAGGGAC AGATTT C AC ACT CAAGAT C AGCAGAGT GGAGGCT GAGGAT CT GGGAGTTT ATTT CT GCTCT CAAAAT AC ACAT GTT CC TCGGACGTTCGGCCAAGGAG (SEQ ID NO:32)

>pVxK7b-037-hum01-LC GATATTGTGATGACCCAGACTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCC AT CTCCT GC AGAT CT AGT C AGAGCCTT GT AC AC AGT AAT GGAAAC ACCT ATTT ACATT GG TATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATAAAGTTTCCTACCGATTT T CT GGGGTCCC AGACAGGTT CAGT GGCAGT GGGT CAGGCACT GATTT CACACT GAAAAT C AGC AGGGT GGAGGCT GAGG AT GTT GGAGTTT ATT ACT GTT CTC AAAAT AC AC AT GTT CCT CGGACGTTCGGCCAAGGG (SEQ ID NO:33)

>pVxK7b-037-hum02-LC GATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCC AT CTCCTGC AGATCT AGTCAGAGCCTT GTACAC AGTAAT GGAAAC ACCT ATTT ACATT GG TACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATAAAGTTTCCTACCGATTT T CT GGGGT C CCATCAAGGTT C AGCGGC AGT GGATCT GGGAC AGAATT C ACT CT C ACC AT C AGC AGCCT GC AGCCT GAT GATTTT GC AACTT ATT ACT GTT CT CAAAATAC ACAT GTTCCT CGGACGTTCGGCCAAGGG (SEQ ID NO:34)

>pVxK7b-037-hum03-LC GATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCC AT CTCCT GC AGAT CT AGT C AGAGCCTT GT AC AC AGT AAT GGAAAC ACCT ATTT ACATT GG T AT CAGC AGAAACCAGGGAAAGCTCCT AAGCTCCT GATCT AT AAAGTTT CCT ACCGATTT T CT GGGGTCCC AGACAGGTT CAGT GGCAGT GGGT CAGGCACT GATTT CACACT GAAAAT C AGC AGGGT GGAGGCT GAGG AT GTT GGAGTTT ATT ACT GTT CTC AAAAT AC AC AT GTT CCT CGGACGTTCGGCCAAGGG (SEQ ID NO:35)

>pVxK7b-037-hum04-LC GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC AT CACTT GCAGAT CT AGTCAGAGCCTT GT ACAC AGT AAT GGAAAC ACCT ATTT ACATT GG T ACCT GC AG AAGCC AGGGC AGT CT CC AC AGCTCCT GAT CT AT AAAGTTT CCT ACCGATTT TCT GGGATC CCAGCCAGGTT C AGT GGC AGT GGGT CT GGGACAGAGTT C ACT CT CACCAT C AGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTTCTCAAAATACACATGTTCCT CGGACGTTCGGCCAAGGG (SEQ ID NO:36)

>pVxK7b-037-hum05-LC GATATTGTGATGACCCAGACTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCC AT CTCCT GC AGATCT AGT C AGAGCCTT GT AC AC AGT AAT GGAAACACCT ATTT ACATT GG T ACCT GCAGAAGCC AGGGCAGT CT CCACAGCT CCT GAT CTATAAAGTTT CCTACCGATTT T CT GGGGTCCCAGAC AGGTT CAGT GGCAGT GGGT CAGGC ACT GATTT CACACT GAAAAT C AGCAGGGT GGAGGCT GAGGAT GTT GGAGTTT ATT ACT GTT CTC AAAAT AC AC AT GTT CCT CGGACGTTCGGCCAAGGG (SEQ ID NO:37)

>pVxK7b-037-hum06-LC GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC AT C ACTT GCAGAT CTAGTC AGAGCCTT GT ACACAGT AATGGAAAC ACCTATTT ACATT GG T ACCT GCAGAAGCC AGGGCAGT CT CC ACAGCTCCT GAT CT AT AAAGTTTCCT ACCGATTT TCT GGGATC CC AGCC AGGTT CAGT GGCAGT GGGT CT GGGAC AGAGTT C ACT CT C ACC AT C AGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTTCTCAAAATACACATGTTCCT CGGACGTTCGGCCAAGGG (SEQ ID NO:38)

>pVxK7b-037-hum07-LC GATATTGTGATGACCCAGACTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCC AT CTCCT GC AGATCT AGT C AGAGCCTT GT ACACAGT AAT GG AAAC ACCT ATTT ACATT GG T ACCT GCAGAAGCC AGGGCAGT CT CCACAGCT CCT GAT CT ATAAAGTTT CCT ACCGATTT TCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACTGAAAATC AGC AGGGT GGAGGCT GAGGAT GTT GGAGTTT ATT ACT GTT CTC AAAAT AC ACAT GTT CCT CGGACGTTCGGCCAAGGG (SEQ ID NO:39)

>pVxK7b-037-hum08-LC GATATTGTGATGACCCAGACTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCC ATCTCCTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGG T AT CAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCT AAGCTCCT GATCT AT AAAGTTT CCT ACCGATTT T CTGGGGTCCC AGACAGGTT CAGT GGCAGT GGGT CAGGCACT GATTT CACACT GAAAAT C AGC AGGGT GGAGGCT GAGGAT GTT GGAGTTT ATT ACT GTT CT C AAAAT AC ACAT GTT CCT CGGACGTTCGGCCAAGGG (SEQ ID NO:40)

>pVxK7b-037-hum09-LC GATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCC ATCTCCTGCAGATCTAGTCAGAGCCTT GTACACAGTAAT GGAAACACCT ATTT ACATT GG TAT CAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCT AAGCTCCT GATCT AT AAAGTTT CCT ACCGATTT T CT GGGGT CCCAGACAGGTT CAGT GGCAGT GGGT CAGGCACT GATTT CACACT GAAAAT C AGC AGGGT GGAGGCT GAGGAT GTT GGAGTTT ATT ACT GTT CT C AAAATAC AC AT GTT CCT CGGACGTTCGGCCAAGGG (SEQ ID NO:41)

>pVxK7b-037-huml0-LC GATATTGTGATGACCCAGACTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCC AT CTCCTGC AGATCT AGT C AG AGC CTT GT AC AC AGT AAT GGAAACACCT ATTT ACATT GG TACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATAAAGTTTCCTACCGATTT T CT GGGGTCCC AGACAGGTT CAGT GGCAGT GGGT CAGGCACT GATTT CACACT GAAAAT C AGC AGGGT GGAGGCT GAGGAT GTT GGAGTTT ATT ACT GTT CTC AAAAT AC ACAT GTT CCT CGGACGTTCGGCCAAGGG (SEQ ID NO:42)

>pVxK7b-037-huml 1-LC

G AAATT GT GTT GACACAGT CTCCAGC CACCCT GT CT GT GT CT C C AGGGGAAAG AGC CACC CT CT CCT GC AGAT CT AGT C AGAGCCTT GT ACACAGT AAT GGAAACACCT ATTT ACATT GG TACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATAAAGTTTCCTACCGATTT T CT GGGGT CCCCT CGAGGTT CAGT GGCAGT GGAT CT GGGACAGATTT CACCTTT ACC AT C AGT AGCCT GGAAGCT GAAGAT GCT GC AAC AT ATT ACT GTT CT C AAA AT ACAC AT GTTCCT CGGACGTTCGGCCAAGGG (SEQ ID NO:43)

>pV xK7b-037-hum 12-LC

GAT ATT GT GAT GACCCAGACTCCACT CT CCCTGCCCGTC ACCCCT GGAGAGCCGGCCT CC AT CTCCT GC AGAT CT AGT CAGAGCCTT GT ACAC AGT AAT GGAAAC ACCT ATTT AC ATT GG T AT CAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCT AAGCTCCT GATCT AT AAAGTTT CCT ACCGATTT T CT GGGGT CCC AGAC AGGTT C AGT GGC AGT GGGT C AGGC ACT GATTT CACACT GAAAAT C AGCAGGGT GGAGGCT GAGGAT GTT GGAGTTT ATT ACT GTT CT C AAAAT AC AC AT GTTCCT CGGACGTTCGGCCAAGGG (SEQ ID NO:44)

>pVxK7b-037-huml3-LC GATATTGTGATGACCCAGACTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCC AT CTCCT GC AGAT CT AGT CAGAGCCTT GT ACAC AGT AAT GGAAAC ACCT ATTT AC ATT GG T AT CAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCT AAGCTCCT GAT CT AT AAAGTTT CCT ACCGATTT T CT GGGGTCCC AGAC AGGTT C AGT GGC AGT GGGT C AGGC ACT GATTT CACACT GAAAAT C AGC AGGGT GGAGGCT GAGGAT GTT GGAGTTT ATT ACT GTT CT C AAAAT AC AC AT GTTCCT CGGACGTTCGGCCAAGGG (SEQ ID NO:45)

>p VxK7b-037-hum 14-LC

GAT GTT GT GAT GACT CAGTCTCCACT CTCCCT GCCCGT CACCCTTGGACAGCCGGCCTCC AT CT CCT GC AGAT CT AGT CAGAGCCTT GT ACAC AGT AAT GGAAAC ACCT ATTT AC ATT GG TAT CAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCT AAGCTCCT GATCT AT AAAGTTT CCT ACCGATTT T CT GGGGT CCC AGAC AGGTT C AGT GGC AGT GGGT C AGGC ACT GATTT CACACT GAAAAT C AGC AGGGT GGAGGCT GAGGAT GTT GGAGTTT ATT ACT GTT CT C AAAAT AC AC AT GTT CCT CGGACGTTCGGCCAAGGG (SEQ ID NO:46)

>p VxK7b-037-hum 15-LC

GCCAT CC AGTT GACCCAGT CT CC AT CCT CCCT GT CT GC AT CT GT AGGAGACAGAGT C ACC AT CACTT GC AGAT CT AGT C AG AGCCTT GTAC AC AGT AAT GGAAAC ACCT ATTT AC ATT GG T ACC AGC AGAAACCT GGCC AGGCT CCCAGGCTCCT C AT CTAT AAAGTTT CCT AC CGATTT TCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATC AGC AGCCTGC AGCCT GAT GATTTT GC AACTT ATT ACT GTT CT C AAAAT AC ACAT GTT CCT CGGACGTTCGGCCAAGGG (SEQ ID NO:47)

>pVxK7b-037-huml6-LC

GCCAT CC AGTT GACCCAGT CT CC AT CCT CC CT GT CT GC AT CT GT AGGAGAC AGAGT C ACC AT CACTT GCAGAT CT AGT CAGAGCCTT GT ACACAGT AAT GGAAACACCT ATTT AC ATT GG T ACC AGC AGAAACCT GGCC AGGCT CCCAGGCTCCT C AT CTAT AAAGTTTCCT ACCGATTT T CT GGGGTCCC AGAC AGGTT CAGT GGCAGT GGGT CAGGC ACT GATTT CACACT GAAAAT C AGC AGGGT GGAGGCT GAGGAT GTT GG AGTTT ATT ACT GTT CTC AAAAT AC AC AT GTT CCT CGGACGTTCGGCCAAGGG (SEQ ID NO:48)

>p VxK7b-037-hum 17-LC

GCCAT CC AGTTGACCCAGT CT CC AT CCT CCCT GT CTGC ATCT GT AGGAGAC AGAGT C ACC AT CACTT GCAGAT CT AGT C AGAGCCTT GT ACAC AGT AAT GGAAACACCT ATTT AC ATT GG TACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATAAAGTTTCCTACCGATTT T CTGGGGTC CC AGAC AGGTT CAGT GGCAGT GGGT CAGGC ACT GATTT CAC ACT GAAAAT C AGC AGGGT GGAGGCT GAGGAT GTT GG AGTTT ATT ACT GTT CTC AAAAT AC AC AT GTT CCT CGGACGTTCGGCCAAGGG (SEQ ID NO:49)

>pVxK7b-037-huml8-LC

GAAATT GT GTT GAC AC AGT CT CC AGCC ACCCT GT CT GT GT CT CC AGGGGAAAGAGC CAC C CTCTCCTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGG T ACC AGC AGAAACCT GGCC AGGCT CCCAGGCT CCT C AT CT AT AAAGTTT CCT ACCGATTT TCTGGGGTCCCCTCGAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACCTTTACCATC AGT AGCCT GGAAGCT GAAGAT GCT GC AAC AT ATT ACT GTT CT CAAAAT AC ACAT GTT CCT CGGACGTTCGGCCAAGGG (SEQ ID NO:50)

>pVxK7b-037-huml9-LC GATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCC AT CT C CT GC AGAT CT AGTC AGAGCCTT GT AC AC AGT AAT GGAAAC AC CT ATTT ACATT GG T AT CAGC AGAAACCAGGGAAAGCTCCT AAGCTCCT GATCT AT AAAGTTT CCT ACCGATTT TCT GGGGTCCC AG AC AGGTT CAGT GGC AGT GGGT C AGGC ACT GATTT C AC ACT G AAAAT C AGC AGGGT GGAGGCT GAGGAT GTT GGAGTTT ATT ACT GTT CT CAAAAT AC AC AT GTT CCT CGGACGTTCGGCCAAGGG (SEQ ID NO:51)

>pVxK7b-037-hum20-LC GATATTGTGATGACCCAGACTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCC AT CTC CT GC AGAT CT AGTC AGAGCCTT GT AC AC AGT AAT GGAAAC ACCT ATTT ACATT GG T ACCT GC AGAAGCC AGGGCAGT CT CCACAGCT CCT GAT CT AT AAAGTTT CCT ACCGATTT T CTGGGGTCCCAGACAGGTT CAGT GGCAGT GGGT CAGGC ACT GATTT CAC ACTGAAAAT C AGC AGGGT GGAGGCT GAGGAT GTT GGAGTTT ATT ACT GTT CTC AAAAT AC ACAT GTT CCT CGGACGTTCGGCCAAGGG (SEQ ID NO:52)

>pVxK7b-037-hum21-LC

GC C AT CC AGTT GACCC AGT CT CC ATCCT CC CT GT CT GC AT CT GT AGGAGACAGAGTCACC ATCACTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGG TACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATAAAGTTTCCTACCGATTT TCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACTGAAAATC AGC AGGGT GGAGGCT GAGGAT GTT GGAGTTT ATT ACT GTT CTC AAAAT ACAC AT GTTCCT CGGACGTTCGGCCAAGGG (SEQ ID NO:53)

>pVxK7b-037-hum22-LC GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACC CTCTCCT GCAGAT CT AGT C AGAGCCTT GT AC AC AGT AAT GGAAACACCT ATTT AC ATT GG TACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATAAAGTTTCCTACCGATTT TCT GGGGT CCC CT CGAGGTTC AGT GGC AGT GGAT CT GGGACAGATTT CACCTTT ACC AT C AGT AGCCT GGAAGCT GAAGAT GCT GC AAC AT ATTACT GTT CTC AAAATAC ACAT GTT CCT CGGACGTTCGGCCAAGGG (SEQ ID NO:54)

>pVxK7b-037-hum23-LC GATATTGTGATGACCCAGACTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCC AT CTCCT GCAGAT CT AGT C AGAGCCTT GT AC AC AGT AAT GGAAACACCT ATTT AC ATT GG T AT CAGC AGAAAC CAGGGAAAGCT C CT AAGCTC CT GAT CT AT AAAGTTT CCT ACCGATTT T CT GGGGTCCC AGACAGGTT C AGT GGC AGT GGGT CAGGCACT GATTT CAC ACT GAAAAT C AGC AGGGT GGAGGCT G AGGAT GTT GGAGTTT ATT ACT GTT CT C AAAAT AC AC AT GTT CCT CGGACGTTCGGCCAAGGG (SEQ ID NO:55)

>pVxK7b-037-hum24-LC GCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC AT CACTT GCAGAT CT AGTC AGAGCCTT GT ACACAGT AAT GGAAAC AC CT ATTT AC ATT GG T ACC AGC AGAAACCT GGCCAGGCTCCC AGGCT CCT CAT CT AT AAAGTTT CCT ACCGATTT TCT GGGGT CCC AT C AAGGTT C AGCGGC AGT GGAT CT GGGACAGAATT C ACT CT CACCATC AGC AGCCTGCAGCCT GATGATTTTGC AACTT ATT ACTGTT CTCAAAATAC ACAT GTTCCT CGGACGTTCGGCCAAGGG (SEQ ID NO:56)

Secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada

>VxP037-01HC EVQLQQFGAELVKPGASMKLSCKASGYTFTNYYVFWVKQRPGQGLEWIGDINPVNGDTNF NEKFKNKATLTVDKSSTTTYLQLSSLTSEDSAVYYCTRGGYTMDYWGQG (SEQ ID NO:57) >pVxK7b-037-hum01-HC QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYTFTNYYVFWVRQARGQRLEWIGDINPVNGDTNF NEKFKNRVTISADKSISTAYLQ WSSLKASDTAMYYCARGGYTMDYWGQG (SEQ ID NO:58) >pVxK7b-037-hum02-HC QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYTFTNYYVFWVRQARGQRLEWIGDINPVNGDTNF NEKFKNRVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGGYTMDYWGQG (SEQ ID NO:59) >pVxK7b-037-hum03-HC EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGYTFTNYYVFWVRQARGQRLEWIGDINPVNGDTNF NEKFKNRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYTMDYWGQG (SEQ ID NO:60) >pVxK7b-037-hum04-HC QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYTFTNYYVFWVRQAPGKGLEWVSDINPVNGDTNF NEKFKNRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYTMDYWGQG (SEQ ID NO:61) >pVxK7b-037-hum05-HC QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYTFTNYYVFWVRQAPGKGLEWVSDINPVNGDTNF NEKFKNRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYTMDYWGQG (SEQ ID NO:62) >pVxK7b-037-hum06-HC QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYTFTNYYVFWVRQARGQRLEWIGDINPVNGDTNF NEKFKNRLTISKDTSKNQW LTM TNM DPVDTATYYCARGGYTMDYW GQG (SEQ ID NO:63) >pVxK7b-037-hum07-HC QVQLQESGPGLVKPGATVKISCKVSGYTFTNYYVFWVRQARGQRLEWIGDINPVNGDTNF NEKFKNRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYTMDYWGQG (SEQ ID NO:64) >pVxK7b-037-hum08-HC QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGYTFTNYYVFWIRQSPSRGLEWLGDINPVNGDTNF NEKFKNRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGYTMDYWGQG (SEQ ID NO:65) >pVxK7b-037-hum09-HC QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYTFTNYYVFWVRQARGQRLEWIGDINPVNGDTNF NEKFKNRLTISKDTSKNQW LTM TNM DPVDTATYYCARGGYTMDYW GQG (SEQ ID NO:66) >pVxK7b-037-humlO-HC QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYTFTNYYVFWYRQARGQRLEWIGDINPVNGDTNF NEKFKNRLTISKDTSKNQW LTM TNM DPVDTATYYCARGGYTMDYW GQG (SEQ ID NO:67) >pVxK7b-037-huml 1-HC QVQLQESGPGLVKPGATVKISCKVSGYTFTNYYVFWVRQARGQRLEWIGDINPVNGDTNF NEKFKNRVTIT ADKST ST A YMELS SLRSEDT A VYY C ARGGYTMD Y WGQG (SEQ ID NO:68) >pVxK7b-037-hum 12-HC QVQLQESGPGLVKPGATVKISCKVSGYTFTNYYVFWVRQARGQRLEWIGDINPVNGDTNF NEKFKNRVTIT ADKST ST A YMELS SLRSEDT A VYY C ARGGYTMD Y WGQG (SEQ ID NO:69) >pVxK7b-037-hum 13-HC

E V QLV Q S GAEVKKPGESLRIS CKGSGYTFTNYYVF WIRQ SP SRGLEWLGDINP VN GDTNF NEKFKNRVTIT ADKST ST A YMELS SLRSEDT A VYYC ARGGYTMD Y WGQG (SEQ ID NO:70) >pVxK7b-037-hum 14-HC QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYTFTNYYVFWVRQARGQRLEWIGDINPVNGDTNF NEKFKNRVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGGYTMDYWGQG (SEQ ID NO:71) >pVxK7b-037-huml5-HC

Q V QLQESGPGLVKP SQTL SLT CTV S GYTFTNYYVF WVRQ ARGQRLE WIGDINP VN GDTNF NEKFKNRLTISKDTSKNQW LTM TNM DPVDTATYYCARGGYTMDYW GQG (SEQ ID NO:72) >pVxK7b-037-huml6-HC QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYTFTNYYVFWVRQARGQRLEWIGDINPVNGDTNF NEKFKNRVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGGYTMDYWGQG (SEQ ID NO:73) >pVxK7b-037-hum 17-HC EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTNYYVFWIRQPPGKGLEWIGDINPVNGDTNF NEKFKNRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYTMDYWGQG (SEQ ID NO:74) >pVxK7b-037-huml8-HC EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGYTFTNYYVFWIRQSPSRGLEWLGDINPVNGDTNF NEKFKNRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYTMDYWGQG (SEQ ID NO:75) >pVxK7b-037-hum 19-HC EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGYTFTNYYVFWIRQSPSRGLEWLGDINPVNGDTNF NEKFKNRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYTMDYWGQG (SEQ ID NO:76) >pVxK7b-037-hum20-HC QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGYTFTNYYVFWVRQAPGQGLEWMGDINPVNGDTNF NEKFKNRVTIT ADKSTST AYMELS SLRSEDT AVYY C ARGGYTMDYWGQG (SEQ ID NO:77) >pVxK7b-037-hum21-HC

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYTFTNYYVFW VRQARGQRLEW IGDINPVNGDTNF NEKFKNRLTISKDTSKNQW LTM TNM DPVDTATYYCARGGYTM DYW GQG (SEQ ID NO:78) >pVxK7b-037-hum22-HC QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYTFTNYYVFWVRQARGQRLEWIGDINPVNGDTNF NEKFKNRLTISKDTSKNQW LTM TNM DPVDTATYYCARGGYTM DYW GQG (SEQ ID NO:79) >pVxK7b-037-hum23-HC QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYTFTNYYVFWVRQARGQRLEWIGDINPVNGDTNF NEKFKNRLTISKDTSKNQW LTM TNM DPVDTATYYCARGGYTM DYW GQG (SEQ ID NO:80) >pVxK7b-037-hum24-HC QVQLQESGPGLVKPGATVKISCKVSGYTFTNYYVFWVRQARGQRLEWIGDINPVNGDTNF NEKFKNRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYTMDYW GQG (SEQ ID NO:81)

Secuencias de ácidos nucleicos de la región variable de la cadena pesada

>VxP037-01HC GAGGTCCAGCTGCAGCAGTTTGGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAATGAAGTTG TCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTATGTATTCTGGGTGAAACAGAGG CCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGACATTAATCCTGTCAATGGTGATACTAACTTC AATGAGAAATTCAAGAACAAGGCCACACTGACTGTAGACAAGTCCTCCACCACAACATAC TTGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAAGAGGGGGT TATACTATGGACTACTGGGGTCAAGGA (SEQ ID NO:82)

>pVxK7b-037-hum01-HC CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTC ACCTGCACTGTCTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTATGTATTCTGGGTGCGACAGGCT CGTGGACAACGCCTTGAGTGGATAGGTGACATTAATCCTGTCAATGGTGATACTAACTTC AATGAGAAATTCAAGAACAGAGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTAC CTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGAGGGGGT TATACTATGGACTACTGGGGCCAGGGA (SEQ ID NO:83)

>pVxK7b-037-hum02-HC

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTC ACCTGCACTGTCTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTATGTATTCTGGGTGCGACAGGCT CGTGGACAACGCCTTGAGTGGATAGGTGACATTAATCCTGTCAATGGTGATACTAACTTC AATGAGAAATTCAAGAACAGAGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTAC CTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGAGGGGGT TATACTATGGACTACTGGGGCCAGGGA (SEQ ID NO:84)

>pVxK7b-037-hum03-HC

GAAGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAGGATC TCCTGTAAGGGTTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTATGTATTCTGGGTGCGACAGGCT CGTGGACAACGCCTTGAGTGGATAGGTGACATTAATCCTGTCAATGGTGATACTAACTTC AATGAGAAATTCAAGAACAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTAC ATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGGGGT TATACTATGGACTACTGGGGCCAGGGA (SEQ ID NO:85)

>pVxK7b-037-hum04-HC

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTC ACCTGCACTGTCTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTATGTATTCTGGGTCCGCCAGGCT CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCAGTGACATTAATCCTGTCAATGGTGATACTAACTTC AATGAGAAATTCAAGAACAGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCC CTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGGGGGT TATACTATGGACTACTGGGGCCAGGGA (SEQ ID NO:86)

>pVxK7b-037-hum05-HC

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTC ACCTGCACTGTCTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTATGTATTCTGGGTCCGCCAGGCT CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCAGTGACATTAATCCTGTCAATGGTGATACTAACTTC AATGAGAAATTCAAGAACAGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCC CTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGGGGGT TATACTATGGACTACTGGGGCCAGGGA (SEQ ID NO:87)

>pVxK7b-037-hum06-HC

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTC ACCTGCACTGTCTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTATGTATTCTGGGTGCGACAGGCT CGTGGACAACGCCTTGAGTGGATAGGTGACATTAATCCTGTCAATGGTGATACTAACTTC AATGAGAAATTCAAGAACAGACTCACCATCTCCAAGGACACCTCCAAAAACCAGGTGGTC CTTACAATGACCAACATGGACCCTGTGGACACAGCCACGTATTACTGTGCAAGAGGGGGT TATACTATGGACTACTGGGGCCAGGGA (SEQ ID NO:88)

>pVxK7b-037-hum07-HC

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTGGGGCTACAGTGAAAATC TCCTGCAAGGTTTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTATGTATTCTGGGTGCGACAGGCT CGTGGACAACGCCTTGAGTGGATAGGTGACATTAATCCTGTCAATGGTGATACTAACTTC AATGAGAAATT CAAGAACAGAGT CACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTAC ATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGGGGT TATACTATGGACTACTGGGGCCAGGGA (SEQ ID NO:89)

>pVxK7b-037-hum08-HC

CAGATCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTACGCTGGTGAAACCCACACAGACCCTCACGCTG ACCTGCACCTTCTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTATGTATTCTGGATCAGGCAGTCC CCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGTGACATTAATCCTGTCAATGGTGATACTAACTTC AATGAGAAATTCAAGAACAGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTAT CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGGGGGT TATACTATGGACTACTGGGGCCAGGGA (SEQ ID NO:90)

>pVxK7b-037-hum09-HC

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTC ACCTGCACTGTCTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTATGTATTCTGGGTGCGACAGGCT CGTGGACAACGCCTTGAGTGGATAGGTGACATTAATCCTGTCAATGGTGATACTAACTTC AATGAGAAATTCAAGAACAGACT CACCAT CT CCAAGGACAC CT CCAAAAAC CAGGTGGTC CTTACAATGACCAACATGGACCCTGTGGACACAGCCACGTATTACTGTGCAAGAGGGGGT TATACTATGGACTACTGGGGCCAGGGA(SEQ ID NO:91)

>p VxK7b-037-hum 10-HC

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTC ACCTGCACTGTCTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTATGTATTCTGGGTGCGACAGGCT CGTGGACAACGCCTTGAGTGGATAGGTGACATTAATCCTGTCAATGGTGATACTAACTTC AATGAGAAATTCAAGAACAGACTCACCATCTCCAAGGACACCTCCAAAAACCAGGTGGTC CTTACAATGACCAACATGGACCCTGTGGACACAGCCACGTATTACTGTGCAAGAGGGGGT TATACTATGGACTACTGGGGCCAGGGA (SEQ ID NO:92)

>pVxK7b-037-huml 1-HC

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTGGGGCTACAGTGAAAATC TCCTGCAAGGTTTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTATGTATTCTGGGTGCGACAGGCT CGTGGACAACGCCTTGAGTGGATAGGTGACATTAATCCTGTCAATGGTGATACTAACTTC AATGAGAAATTCAAGAACAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTAC ATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGGGGT TATACTATGGACTACTGGGGCCAGGGA (SEQ ID NO:93)

>p VxK7b-037-hum 12-HC

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTGGGGCTACAGTGAAAATC TCCTGCAAGGTTTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTATGTATTCTGGGTGCGACAGGCT CGTGGACAACGCCTTGAGTGGATAGGTGACATTAATCCTGTCAATGGTGATACTAACTTC AATGAGAAATTCAAGAACAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTAC ATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGGGGT TATACTATGGACTACTGGGGCCAGGGA (SEQ ID NO:94)

>p VxK7b-037-hum 13-HC

GAAGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAGGATC TCCTGTAAGGGTTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTATGTATTCTGGATCAGGCAGTCC CCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGTGACATTAATCCTGTCAATGGTGATACTAACTTC AATGAGAAATTCAAGAACAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTAC ATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGGGGT TATACTATGGACTACTGGGGCCAGGGA (SEQ ID NO:95)

>pVxK7b-037-huml4-HC

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTC ACCTGCACTGTCTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTATGTATTCTGGGTGCGACAGGCT CGTGGACAACGCCTTGAGTGGATAGGTGACATTAATCCTGTCAATGGTGATACTAACTTC AATGAGAAATT CAAGAACAGAGT CACCATCT CAGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTAC CTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGAGGGGGT TATACTATGGACTACTGGGGCCAGGGA (SEQ ID NO:96)

>p V xK7b-037-hum 15-HC

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTC ACCTGCACTGTCTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTATGTATTCTGGGTGCGACAGGCT ü ü T b ü A U M Ü ü U U T ' i ' Ü A b T b b A T A Ü b ' i ' Ü A Ü A T T M T Ü Ü T b T U M T b ü T ü A T A U T A A U T T U AATGAGAAATTCAAGAACAGACTCACCATCTCCAAGGACACCTCCAAAAACCAGGTGGTC CTTACAATGACCAACATGGACCCTGTGGACACAGCCACGTATTACTGTGCAAGAGGGGGT TATACTATGGACTACTGGGGCCAGGGA (SEQ ID NO:97)

>pVxK7b-037-huml6-HC

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTC ACCTGCACTGTCTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTATGTATTCTGGGTGCGACAGGCT CGTGGACAACGCCTTGAGTGGATAGGTGACATTAATCCTGTCAATGGTGATACTAACTTC AATGAGAAATTCAAGAACAGAGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTAC CTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGAGGGGGT TATACTATGGACTACTGGGGCCAGGGA (SEQ ID NO:98)

>p VxK7b-037-hum 17-HC

GAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCTACAGTGAAAATC TCCTGCAAGGTTTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTATGTATTCTGGATCCGCCAGCCC CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGTGACATTAATCCTGTCAATGGTGATACTAACTTC AATGAGAAATTCAAGAACAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTAC ATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGGGGT TATACTATGGACTACTGGGGCCAGGGA (SEQ ID NO:99)

>pVxK7b-037-huml8-HC

GAAGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAGGATC TCCTGTAAGGGTTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTATGTATTCTGGATCAGGCAGTCC CCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGTGACATTAATCCTGTCAATGGTGATACTAACTTC AATGAGAAATTCAAGAACAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTAC ATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGGGGT TATACTATGGACTACTGGGGCCAGGGA (SEQ ID NO: 100)

>p VxK7b-037-hum 19-HC

GAAGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAGGATC TCCTGTAAGGGTTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTATGTATTCTGGATCAGGCAGTCC CCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGTGACATTAATCCTGTCAATGGTGATACTAACTTC AATGAGAAATTCAAGAACAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTAC ATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGGGGT TATACTATGGACTACTGGGGCCAGGGA(SEQ ID NO: 101)

>pVxK7b-037-hum20-HC

CAGATCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTACGCTGGTGAAACCCACACAGACCCTCACGCTG ACCTGCACCTTCTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTATGTATTCTGGGTGCGACAGGCC CCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGTGACATTAATCCTGTCAATGGTGATACTAACTTC AATGAGAAATTCAAGAACAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTAC ATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGGGGT TATACTATGGACTACTGGGGCCAGGGA (SEQ ID NO: 102)

> p V x K 7 b - 037 - h u m21 - HC

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTC ACCTGCACTGTCTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTATGTATTCTGGGTGCGACAGGCT CGTGGACAACGCCTTGAGTGGATAGGTGACATTAATCCTGTCAATGGTGATACTAACTTC AATGAGAAATTCAAGAACAGACTCACCATCTCCAAGGACACCTCCAAAAACCAGGTGGTC CTTACAATGACCAACATGGACCCTGTGGACACAGCCACGTATTACTGTGCAAGAGGGGGT TATACTATGGACTACTGGGGCCAGGGA (SEQ ID NO:103)

>pVxK7b-037-hum22-HC

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTC ACCTGCACTGTCTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTATGTATTCTGGGTGCGACAGGCT CGTGGACAACGCCTTGAGTGGATAGGTGACATTAATCCTGTCAATGGTGATACTAACTTC AATGAGAAATTCAAGAACAGACTCACCATCTCCAAGGACACCTCCAAAAACCAGGTGGTC CTTACAATGACCAACATGGACCCTGTGGACACAGCCACGTATTACTGTGCAAGAGGGGGT TATACTATGGACTACTGGGGCCAGGGA (SEQ ID NO: 104)

>pVxK7b-037-hum23-HC CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTC ACCTGCACTGTCTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTATGTATTCTGGGTGCGACAGGCT CGTGGACAACGCCTTGAGTGGATAGGTGACATTAATCCTGTCAATGGTGATACTAACTTC AATGAGAAATTCAAGAACAGACTCACCATCTCCAAGGACACCTCCAAAAACCAGGTGGTC CTTACAATGACCAACATGGACCCTGTGGACACAGCCACGTATTACTGTGCAAGAGGGGGT TATACTATGGACTACTGGGGCCAGGGA (SEQ ID NO: 105)

>pVxK7b-037-hum24-HC CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTGGGGCTACAGTGAAAATC TCCTGCAAGGTTTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTATGTATTCTGGGTGCGACAGGCT CGTGGACAACGCCTTGAGTGGATAGGTGACATTAATCCTGTCAATGGTGATACTAACTTC AATGAGAAATTCAAGAACAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTAC ATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGGGGT TATACTATGGACTACTGGGGCCAGGGA (SEQ ID NO: 106)

Secuencias completas de aminoácidos de cadena ligera

>VxP037-01-LC-Pro representa el dominio variable de la cadena ligera de longitud completa la secuencia de aminoácidos del dominio constante. La secuencia de aminoácidos subrayada = marco 4 el dominio constante. Todas las secuencias de la cadena ligera humanizadas contienen el mismo dominio constante como VxP037-01 -LC-Pro. Sin embargo, esto no se muestra en las restantes secuencias de aminoácidos de cadena ligera humanizada.

>VxP037-01-LC-Pro DVVMTQTPLSLSVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVS YRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSONTHVPRTFGOGTKVEIKRTV AAPSVFIFPPSDEOLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVOWKVDNALOSGNSOESVTEOD SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 107)

Secuencias completas de ácido nucleico de cadena ligera

La secuencia del ácido nucleico subrayada codifica la secuencia de la proteína subrayada en >VxP037-01-LC-Pro, anteriormente.

>VxP037-01-LC-DNA GATGTTGTTATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGTCTGTCAGTCTTGGAGATCAAG CCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTA TTT AC ATTGGT ACCTGC AG AAGCC AGGCC AGT CTCC AAAGCTCCTG AT CT AC AAA GTTTCCTACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGA C AG ATTT C AC ACT C A AG AT C AGC AG AGT GG AGGCT G AGG AT CTGGG AGTTT ATTT CTGCTCTCAAAATACACATGTTCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGA AATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAG CAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCA GAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCC AGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGC ACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAA GTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAG TGTTGA (SEO ID NO: 108)

Secuencias completas de aminoácidos de cadena pesada

>VxP037-01-HC-Pro representa el dominio variable de la cadena pesada de longitud completa la secuencia de aminoácidos del dominio constante. La secuencia de aminoácidos subrayada = marco 4 el dominio constante. Todas las secuencias de la cadena pesada humanizadas contienen el mismo dominio constante como >VxP037-01 -HC-Pro. Sin embargo, esto no se muestra en las restantes secuencias de aminoácidos de cadena pesada humanizada. >VxP037-01-HC-Pro EVQLQQFGAELVKPGASMKLSCKASGYTFTNYYVFWVKQRPGQGLEWIGDINPVN GDTNFNEKFKNKATLTVDKSSTTTYLQLSSLTSEDSAVYYCTRGGYTMDYWGQGJL

YTYSSASTKGPSVFPFAPSSKSTSGGTAAEGCEYKDYFPEPYTYSWNSGAETSGVHTF P AVLO S S GL Y SLS S V VT VP S S SLGT OT YICN VNHKP SNTKVDKKVEPKS CDKTHT CPP CPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEOYNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG OPREPOVYTLPPSRDELTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGOPENNYKTTPPVL

DSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK (SEO ID

NO: 109)

Secuencias completas de ácido nucleico de cadena pesada

La secuencia del ácido nucleico subrayada codifica la secuencia de la proteína subrayada en >VxP037-01-HC-Pro, anteriormente.

>VxP037-01-HC-DNA

G AGGTCC AGCTGC AGC AGTTT GGGGCT GAACT GGT GAAGC CT GGGGCTTC AAT GAAGTT GT CCT GC AAGGCTT CTGGCT AC ACCTT C ACC AACT ACT AT GT ATT CT GGGT GAAAC AGAG GCCT GGACAAGGCCTT GAGT GGATT GGAGACATT AAT CCT GT CAAT GGT GAT ACT AACTT CAATGAGAAATTCAAGAACAAGGCCACACTGACTGTAGACAAGTCCTCCACCACAACAT ACTT GCAACTCAGCAGCCT GACATCT GAGGACT CT GCGGT CT ATT ACT GT AC AAGAGGGG GTTATACTATGGACTACTGGGGCCAGGGAACGCTGGTCACCGTCAGCTCAGCCTCCACCA AGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGG CCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAG GCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACT CCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCA ACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGT GACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGT CTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCAC AT GCGTGGT GGT GGACGT GAGCCACGAAGACCCT GAGGTCAAGTTC AACT GGTACGT GG ACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCAC GTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGT ACAAGTGCAAGGTCAGCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAA GCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCT GACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCG CCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTG CTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG C AGCAGGGGAACGT CTT CT C AT GCT CCGT GAT GC AT GAGGCT CT GC ACAACCACT AC ACG CAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA ÍSEO ID NO: 110)

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD47 humano, de rata, ratón, cerdo y perro, en donde el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena ligera (LCDR 1-3) y tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena pesada (HCDR 1 -3), en donde:

LCDR 1 comprende la secuencia de aminoácidos RSSQSLVHSNGNTYLH (SEQ ID NO: 1);

LCDR 2 comprende la secuencia de aminoácidos KVSYRFS (SEQ ID NO: 2); y

LCDR 3 comprende la secuencia de aminoácidos SQNTHVPRT (SEQ ID NO: 3);

HCDR 1 comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTNYYVF (SEQ ID NO: 4);

HCDR 3 comprende la secuencia de aminoácidos GGYTMDY (SEQ ID NO: 6).

2. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, que es quimérico o humanizado.

3. El anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 1, que comprende una región variable de la cadena ligera (LCVR) y una región variable de la cadena la pesada (HCVR), en donde dicha LCVR y dicha HCVR comprenden, respectivamente, secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consisten en:

SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 57;

SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 58;

SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 59;

SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 60;

SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 61;

SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 62;

SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 63;

SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 64;

SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 65;

SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 66;

SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 67;

SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 68;

SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 69;

SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 70;

SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 71;

SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 72;

SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 73;

SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 74;

SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 75;

SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 76;

SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 77;

SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 78;

SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 79;

SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 80; y

SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 81,

en donde cada una de las SEQ ID NO: 7-31 de la LCVR comprende además un dominio constante que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 117 y,

en donde cada una de las SEQ ID NO: 57-81 de la HCVR comprende un dominio constante seleccionado de entre SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, y SEQ ID NO: 121.

4. Una composición farmacéutica, que comprende dicho anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 1, y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable.

5. El anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 1, para uso en terapia humana.

6. El anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 1, para uso en el tratamiento de la lesión por isquemia-reperfusión, o una enfermedad autoinmune o inflamatoria, en un sujeto humano.

7. El anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, para uso según la reivindicación 6, en donde dicha lesión por isquemia-reperfusión se produce en el trasplante de órganos, lesión renal aguda, cirugía de derivación cardiopulmonar, hipertensión pulmonar, enfermedad de células falciformes, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, resecciones quirúrgicas y cirugía reconstructiva, reinserción de un apéndice u otra parte del cuerpo, injerto de piel o traumatismo.

8. El anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, para uso según la reivindicación 6, en donde dicha enfermedad autoinmune o inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en artritis, esclerosis múltiple, psoriasis, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal, lupus, enfermedad de Grave y Tiroiditis de Hashimoto y espondilitis anquilosante.

9. El anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 1 para uso en el tratamiento o reducción de un cáncer susceptible.

10. El anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, para uso según la reivindicación 9 que favorece la fagocitosis de dicho cáncer susceptible.

11. El anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, para uso según la reivindicación 10, en donde dicho cáncer susceptible se selecciona del grupo que consiste en una leucemia, un linfoma, cáncer de ovarios, cáncer de mama, cáncer endometrial, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer gástrico, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, cáncer de bronquios, cáncer de huesos, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de hígado y conductos biliares, cáncer de esófago, cáncer renal, cáncer de tiroides, cáncer de cabeza y cuello, cáncer testicular, glioblastoma, astrocitoma, melanoma, síndrome mielodisplásico y un sarcoma.

12. El anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, para uso según la reivindicación 11, en donde:

13. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo, para uso según la reivindicación 5, que comprende además administrar a dicho paciente un tratamiento terapéutico antitumoral seleccionado del grupo que consiste en cirugía, radiación, un agente antitumoral o antineoplásico, y combinaciones de cualquiera de los anteriores.