ES2783898T3 - Parvovirus atenuado vivo - Google Patents

Abstract

Parvovirus canino (CPV) atenuado vivo recombinante, caracterizado por que el genoma de dicho parvovirus comprende un gen de la cápside que codifica un aminoácido distinto de Isoleucina en la posición de aminoácido 219 de la proteína de la cápside VP2 y un aminoácido distinto de Glutamina en la posición de aminoácido 386 de la proteína de la cápside VP2, y en donde dicho genoma lleva una mutación atenuante en la región no estructural desde la posición 2061 a la 2070 de la SEQ ID NO: 1 y en donde dicha proteína de la cápside VP2 es distinta de la del serotipo 2 de CPV.

Description

DESCRIPCIÓN

Parvovirus atenuado vivo

La invención se refiere a parvovirus atenuados vivos, sus usos, vacunas que comprende tales parvovirus atenuados vivos, así como métodos para su producción.

El Parvovirus pertenece a la familia de los virus de ADN de cadena sencilla. Los parvovirus pueden causar enfermedad en diversos animales tales como gatos, perros y cerdos. Debido a que los virus requieren células que se dividan activamente para replicarse, el tipo de tejido infectado varía con la edad del animal. El tracto gastrointestinal y el sistema linfático pueden estar afectados a cualquier edad, conduciendo a vómitos, diarrea e inmunosupresión, pero la hipoplasia cerebelar solamente se observa en gatos que se infectan en el útero o al menos con dos semanas de vida, y la enfermedad del miocardio se observa en cachorros infectados entre las tres y ochos semanas de vida. El parvovirus canino (CPV) es una enfermedad particularmente mortal en cachorros, mortal aproximadamente en el 80 %, que causa daño en el tracto gastrointestinal y deshidratación, así como un síndrome cardiaco en muchos cachorros jóvenes. Se propaga por contacto con heces de perros infectados. Los síntomas incluyen letargo, diarrea grave, fiebre, vómitos, pérdida de apetito y deshidratación. El parvovirus porcino causa una enfermedad reproductora en cerdo conocida como SMEDI, lo cual significa nacido muerto, momificación, muerte embrionaria e infertilidad. La panleucopenia felina, comúnmente conocida como moquillo felino, es una infección vírica que afecta a los gatos, causada por el parvovirus felino (FPV), un pariente cercano del parvovirus canino. La panleucopenia felina es común en gatitos y causa fiebre, bajo recuento de glóbulos blancos, diarrea, y muerte. La infección del feto de gato y gatitos de menos de dos semanas de vida causa hipoplasia cerebelar. El virus de la enteritis de visón es similar en efecto a la panleucopenia felina, excepto que no causa hipoplasia cerebelar. Un parvovirus diferente causa Enfermedad de Aleutian en visones y otros mustélidos, caracterizada por linfadenopatía, esplenomegalia, glomerulonefritis, anemia y muerte. El diagnóstico más grave de parvovirus es por ELISA. Perros, gatos y cerdos frecuentemente son vacunados frente a parvovirus.

A nivel de ADN, se sabe que los parvovirus caninos, felinos y porcinos tienen un genoma altamente homólogo. El parvovirus canino CPV2 es un virus que es responsable de una enteritis aguda y a veces mortal en perros (Kelly, Aust. Vet. J. 54; 593, 1978; Appel y col., Vet. Rec. 105; 156-159, 1979). El virus, el cual apareció primero alrededor de 1977, probablemente surgió de un virus muy estrechamente relacionado en gatos, el virus de la panleucopaenia felina (FPLV) por un número pequeño de mutaciones en la proteína única de la cápside; un salto de especie que puede haber implicado paso intermedio en otros carnívoros tales como visones o mapaches (Truyen y col., Virology 215, 186-189, 1996).

Ya en 1979 aparecieron las primeras variantes de CPV2, llamadas CPV2a, y rápidamente fueron seguidas por la aparición de CPV2b en 1984. (Parrish y col., Science 230, 1.046-1.048, 1985, y J. Virol. 65; 6.544-6.552, 1991). El virus tipo 2 original ya ha desparecido del campo habiéndose reemplazado por los tipos 2a y 2b, aunque las proporciones relativas de estos dos tipos varía de país en país (Truyen y col., supra; Chinchkar y col., Arch. Virol.

151, 1.881-1.887, 2006; Pereira y col., Infect. Genet. Evol. 3, 399-409, 2007). Los cambios de aminoácidos en la proteína de la cápside (VP2), los cuales caracterizan el cambio desde 2 a 2a y a 2b, están muy limitados. Substituciones en las posiciones 87 (Met a Leu), 300 (Ala a Gly), 305 (Asp a Tyr) y 555 (Val a Ile) se dieron en la evolución de 2 a 2a y 426 (Asn a Asp) y 555 (Ile a Val) en el surgimiento de 2b a partir de 2a (Parrish y col., supra; Truyen y col., J. Virol. 69, 4.702-4.710, 1995). Recientemente, se ha informado que las cepas 2a carecen de la sustitución de Val a Ile en la posición 555 (Wang y col., Virus Genes 31, 171-174, 2005; Martella y col., Virus Genes 33, 11-13, 2006). Tal parece que un cambio único de aminoácido puede diferenciar las secuencias de VP2 de CPV2a y CPV2b.

Más recientemente han surgido cepas en Italia en las que el aminoácido en la posición 426 (Asn en 2a y Asp en 2b) ha llegado a ser un residuo de ácido glutámico (Glu) (Buonavoglia y col., J. Gen. Virol. 82, 3.021-3.025, 2001; Martella y col., J. Clin. Microbiol. 42, 1.333-1.336, 2004). El hecho de que estas variantes Glu 426, llamadas virus CPV2c, estén circulando y coexistiendo con otros tipos de CPV en Italia y otros países europeos (Decaro y col., J. Vet. Med. B. Infect. Dis. Vet. Public Health 53, 468-472, 2006) y que también se hayan aislado en países tan geográficamente diversos como Vietnam y Escocia (Nakamura y col., Arch Virol. 149, 2.261-2.269, 2004, Spibey y col., Vet. Microbiol 128, 48-55, 2008) sugiere que tienen una ventaja en al menos una proporción de la población canina.

La evolución relativamente rápida del parvovirus canino ha dado como resultado la pérdida y, a continuación, la recuperación del rango de hospedador felino (Truyen y col., 1996 supra), y esta capacidad recuperada de replicarse en gatos puede explicar bien el reemplazamiento del virus tipo 2 original con las variantes 2a, 2b y 2c. A finales de los años 70 y comienzos de los años 80 vacunas de FPL tanto vivas como inactivadas se usaron para proteger a los perros frente a la enfermedad de CPV debido a los antígenos compartidos que estimulaban la protección cruzada, sin embargo, el nivel de protección que proporcionaban era malo y la duración de la inmunidad era corta. Estas vacunas se reemplazaron por vacunas de CPV atenuadas vivas, las cuales proporcionaron buena protección y mayor duración de la inmunidad. Actualmente las vacunas atenuadas vivas se derivan de o bien aislados de CPV2b 0 el virus tipo 2 original. Puesto que el virus tipo 2 se ha reemplazado completamente en el campo por los virus 2a, 2b y ahora 2c ha habido una preocupación sobre el nivel de protección proporcionado por las vacunas tipo 2 atenuadas (Pratelli y col., Clin. Diag. Lab. Immunol. 8, 612-615, 2001; Truyen, Vet. Microbiol. 69, 47-50, 1999). Sin embargo, basándose en estudios con anticuerpos monoclonales disponibles cada nueva variante antígena ha perdido al menos un epítopo neutralizante en comparación con la variante antigua (Strassheim y col., Virology 198, 175-184, 1994; Pereira y col., supra). Previamente se ha demostrado que la vacuna con CPV2 atenuado vivo es capaz de proteger a los perros frente a las exposiciones en campo a 2a y 2b (Greenwood y col., Vet. Record. 136, 63-67, 1995) aunque estudios de neutralización cruzada conducidos in vitro que usan suero cultivado frente a diversos tipos antígenos muestran diferencias marcadas (Pratelli y col., supra).

Recientemente, se demostró que la vacuna tipo 2 atenuada viva (Nobivac-Intervet) era capaz de proteger a los perros de la exposición a la variante de CPV más reciente, CPV2c (Spibey y col., Vet. Microbiol 128, 48-55, 2008). No obstante, existe una necesidad en el campo de las vacunas que combinen la inducción de un nivel suficiente de inmunidad en animales, en particular gatos, perros y cerdos frente a infección con parvovirus con un comportamiento altamente atenuado. Un alto nivel de atenuación en sinónimo de seguridad, especialmente en animales jóvenes y viejos.

Es un objetivo de la presente invención proporcionar nuevos parvovirus vivos que están atenuados, aunque son aún inmunógenos. Tales virus proporcionan una base para vacunas seguras.

La invención es como se define en las reivindicaciones.

A este respecto, una realización de la presente invención se refiere a parvovirus caninos atenuados vivos (CPV) que comprenden un aminoácido distinto de Isoleucina en la posición de aminoácido 219 de la proteína de la cápside VP2 y un aminoácido distinto de una Glutamina en la posición de aminoácido 386 de la proteína de la cápside VP2 y en el que el virus lleva una mutación atenuante en la región no estructural de la posición 2061 a 2060 de la SEQ ID NO: 1 y en el que dicha proteína de la cápside VP2 es distinta de la del serotipo de CPV 2. El CPV no es el CPV que está presente en la vacuna con parvovirus canino Nobivac Parvo C. Una secuencia comprendida en este CPV (el CPV de la vacuna con parvovirus canino Nobivac Parvo C) está dada en SEQ ID NO: 1.

Sorprendentemente se encontró, que estos dos sitios, en la posición de aminoácido 219 y 386 del gen de la cápside, juegan un papel importante en la atenuación del virus. Hasta ahora se asumía que principalmente los aminoácidos fuera de la región de la cápside están implicados en la virulencia/atenuación del virus.

La localización de la Isoleucina en la posición de aminoácido 219 de la proteína de la cápside VP2 y una Glutamina en la posición de aminoácido 386 de la proteína de la cápside VP2 es idéntica en tanto parvovirus caninos como felinos, sin reparar en el serotipo.

Se descarta específicamente de la presente invención el CPV que está presente en la vacuna con parvovirus canino Nobivac Parvo C (Intervet Schering-Plough Animal Health) que comprende la secuencia dada en ^s E^q ID NO: 1. Por tanto, la presente invención se refiere a un parvovirus canino atenuado (CPV) como se define en las reivindicaciones, que comprende un gen de la cápside que codifica un aminoácido distinto de isoleucina en la posición de aminoácido 219 de la proteína de la cápside VP2 y/o un aminoácido distinto de glutamina en la posición de aminoácido 386 de la proteína de la cápside VP2, a condición de que ese PV no comprenda la secuencia presentada en la SEQ ID NO: 1.

Simplemente para indicar la localización de la Isoleucina en la posición de aminoácido 219 y la Glutamina en la posición de aminoácido 386, a continuación, se muestran los dos aminoácidos (en caracteres en negrita) en un ejemplo del contexto secuencial encontrado en la mayoría de las cepas CPV y FPV.

yfqwdrtlipshtgtsg (Isoleucina 219 = en negrita)

yafgrqhgqkttttget (Glutamina 386 = en negrita)

Dependiendo de la cepa que se use como material de partida para la sustitución de uno o ambos aminoácidos según la invención, puede ser que una sustitución sencilla del aminoácido en la posición 219 o 386 no sea suficiente para, por ejemplo, hacer al virus seguro en animales muy jóvenes. Si se requiere una atenuación adicional, se prefiere la sustitución de tanto el aminoácido en la posición 219 como 386.

Por lo tanto, la invención se refiere a un parvovirus canino (CPV) atenuado vivo como se define en las reivindicaciones que comprende un gen de la cápside que codifica un aminoácido distinto de Isoleucina en la posición de aminoácido 219 de la proteína de la cápside VP2 y un aminoácido distinto de Glutamina en la posición de aminoácido 386 de la proteína de la cápside VP2.

Una forma más preferida de esta realización se refiere a un parvovirus canino (CPV) atenuado vivo, que comprende un gen de la cápside que codifica una Valina en la posición de aminoácido 219 de la proteína de la cápside y/o una Lisina en la posición de aminoácido 386 de la proteína de la cápside.

Una forma incluso más preferida de esta realización se refiere a un parvovirus canino (CPV) atenuado vivo, que comprende un gen de la cápside que codifica una Valina en la posición de aminoácido 219 de la proteína de la cápside y una Lisina en la posición de aminoácido 386 de la proteína de la cápside.

Si se prefiere una atenuación adicional más, puede ser interesante usar un parvovirus que ya tiene otra mutación atenuante como el material de partida para la introducción de una sustitución de aminoácido según la invención. Preferentemente, dicha mutación atenuante se localiza fuera de la región de la cápside. Esto permitiría el reemplazamiento de un fragmento de ADN de una parte de la región de no cápside de un virus según la invención con una región de no cápside homóloga de una cepa de parvovirus que lleva una atenuación es esa región. Los parvovirus que llevan una atenuación en una parte de la región de no cápside son, por ejemplo, la vacuna con parvovirus canino comercialmente disponible Nobivac Parvo C (Intervet Schering-Plough Anima1Health).

La ventaja de tal planteamiento es, que tales virus tendrían un nivel de atenuación incluso mayor. Por tanto, una forma aún más preferida de esta realización se refiere a un parvovirus atenuado vivo según la invención, en el que el parvovirus es un parvovirus recombinante en el que un fragmento de ADN de una parte de la región de no cápside de dicho parvovirus se reemplaza por un fragmento de ADN homólogo de una parte de la región no de cápside provedente de un segundo parvovirus, en el que el fragmento de ADN homólogo de dicho segundo parvovirus lleva una mutación atenuante.

Un fragmento de ADN homólogo de un segundo parvovirus es un fragmento de ADN que tiene la misma función que el fragmento de ADN del parvovirus según la invención, pero difiere de ese fragmento de ADN en que lleva una mutación que conduce a un comportamiento atenuado del virus. Simplemente como ejemplo, si un fragmento de ADN comprende una mutación atenuante en un fragmento de ADN entre dos sitios de restricción específicos, y estos dos sitios de restricción también están presentes en la misma localización en un virus que no tiene esa mutación, el fragmento de restricción que lleva la mutación se considerará homólogo al mismo fragmento del virus que no tiene esa mutación.

La invención se refiere a un parvovirus atenuado vivo como se define en las reivindicaciones en el que el parvovirus canino lleva una mutación atenuante en la región no estructural, en la región desde la posición 2.061 a 2.070.

Se entenderá que el parvovirus canino atenuado vivo según la invención, independientemente de la presencia adicional de cualquier atenuación adicional, tal como, por ejemplo, una región no de cápside atenuada, puede obtenerse de todos los parvovirus en los que la puede realizarse la transición de isoleucina/X1 y/o glutamina/X2 según la invención en la proteína de la cápside, y, por tanto, al menos a partir de todos los miembros secuenciados ahora de CPV y FPV. (X1 y X2 son aminoácidos distintos de isoleucina y glutamina, respectivamente).

También se entenderá que se incluyen en la invención virus híbridos que comprenden una cápside de CPV y una cadena principal no capsídica de FPV.

Cuando se va a desarrollar una vacuna para la protección de un canino contra infección por parvovirus, el parvovirus preferido para su uso en dicha vacuna sería un parvovirus canino.

Especialmente, cuando una vacuna se dirige específicamente a la protección de los perros contra CPV, el gen de la cápside del virus según la invención codificaría preferentemente una proteína de la cápside del serotipo de CPV 2a, 2b o 2c.

Como se ha mencionado anteriormente, la parte no de cápside del parvovirus puede ser de origen CPV o FPV. Por lo tanto, una forma aún más preferida de esta realización se refiere a CPV atenuado vivo según la invención, en el que el parvovirus codifica una proteína de la cápside del serotipo de CPV 2a, 2b o 2c.

Otra realización de la presente invención se refiere a vacunas para la protección de animales frente a infección con parvovirus, en la que tales vacunas comprenden un parvovirus canino atenuado vivo según la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Una cantidad adecuada de parvovirus según la invención, para su uso en una vacuna estará en muchos casos dentro del intervalo de 10³ a 10⁹ TCID⁵⁰, dependiendo del nivel de atenuación y las características de replicación del virus. Una dosis infecciosa del virus que está por debajo de 10³ TCID⁵⁰ se considerará en muchos casos que es demasiado baja, puesto que el virus tardará mucho tiempo en replicarse a un nivel suficientemente alto para desencadenar el sistema inmune. Cantidades que superasen el 10⁹ TCID⁵⁰ no serían atractivas, únicamente por razones comerciales.

Una dosis muy adecuada estaría en el intervalo de 10⁵ a 10⁸ TCID⁵⁰, incluso mejor entre 10⁶ a 10⁸ TCID^50.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica. Simplemente como ejemplo; tal vehículo puede ser tan simple como agua estéril o una solución tampón tal como PBS.

Las vacunas según la invención se pueden administrar de diversas maneras. Puesto que la vacuna comprende un virus atenuado vivo, muchas maneras de administración, tal como administración oral, intranasal, intramuscular y subcutánea son viables. Una vía de administración preferida es la administración subcutánea.

Animales susceptibles a la infección por parvovirus tales como perros son frecuentemente vacunados frente a varias otras enfermedades a la vez. Por lo tanto, sería practico combinar una vacuna según la invención con un antígeno adicional de un virus o microorganismo patógeno a perros y gatos o información genética codificadora de dicho antígeno.

Por tanto, otra realización de la invención se refiere a una vacuna de combinación que comprende una vacuna según la invención y un antígeno adicional de un virus o microorganismo patógeno a animales o información genética codificadora de un polipéptido inmunogénico de dicho virus o microorganismo.

El antígeno adicional de un virus o un microorganismo puede ser el virus o microorganismo completo (en una forma atenuada viva o en una forma inactivada) o un polipéptido inmunogénico u otra parte inmunogénica de ese virus o microorganismo tal como, por ejemplo, un (lipo-)polisacárido, capaz de inducir una respuesta inmune protectora. Preferiblemente, el virus o microorganismo patógeno a animales se selecciona entre el grupo de Ehrlichia canis, Babesia gibsoni, Babesia vogeli, Babesia rossi, Leishmania donovani-complex, adenovirus canino, coronavirus canino, virus del moquillo canino, Leptospira interrogans serovar canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona, Leptospira grippotyphosa, Leptospira bratislava, virus de la hepatitis canina, virus paragripal canino, virus de la rabia, Hepatozoon canis, Borrelia burgdorferi, Bordetella bronchiseptica, virus de1Herpes felino, calicivirus felino, panleucopenia felina y Chlamydophila felis.

Las vacunas que comprende virus atenuados vivos deben ser almacenadas a baja temperatura, o tienen que estar en una forma liofilizada. Las vacunas liofilizadas se pueden mantener bajo condiciones de enfriamiento moderado o incluso a temperatura ambiente. Con frecuencia, la vacuna se mezcla con establizadores, por ejemplo, para proteger a las proteínas propensas a degradación de ser degradadas, para aumentar la semivida de la vacuna, o para mejorar la eficacia de la liofilización. Estabilizadores útiles son entre otros SPGA, carbohidratos, por ejemplo, sorbitol, manitol, trehalosa, almidón, sacarosa, dextrano o glucosa, proteínas tales como albúmina o caseína o productos de degradación de los mismos, y tampones, tales como fosfatos de metales alcalinos.

Por lo tanto, preferiblemente, la vacuna (de combinación) según la invención está en una forma liofilizada. Además, la vacuna se puede suspender en un diluyente fisiológicamente aceptable. Tales tampones pueden ser, por ejemplo, agua estéril, un tampón y similares.

No hace falta decir, que los diluyentes y compuestos para la emulsión o estabilización de virus también están incorporados en la presente invención.

Además, otra realización de la invención se refiere a métodos para la fabricación de una vacuna (de combinación) según la invención en la que estos métodos comprenden la mezcla de un parvovirus canino atenuado vivo según la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Otra realización más de la invención se refiere a parvovirus canino atenuado vivo según la invención para su uso como un medicamento. Más específicamente, esta realización se refiere a parvovirus canino atenuado vivo según la invención para su uso en el tratamiento de la infección por parvovirus.

De nuevo, otra realización de la presente invención se refiere al uso de un parvovirus canino atenuado vivo según la invención para el tratamiento de infección por parvovirus.

Finalmente, otra realización de la presente invención se refiere a métodos como se definen en las reivindicaciones para la preparación de un mutante de parvovirus canino (CPV) según la invención, en la que dichos métodos comprenden el intercambio de un fragmento de ADN codificador de al menos parte de la proteína de la cápside de parvovirus que tiene en la posición de aminoácido 219 un codón que codifica Isoleucina y/o que tiene en la posición de aminoácido 386 un codón que codifica Glutamina, por un fragmento de ADN codificador de al menos parte de la proteína de la cápside del parvovirus que tiene en la posición de aminoácido 219 un codón que codifica un aminoácido distinto de Isoleucina y/o que tiene en la posición de aminoácido 386 un codón que codifica un aminoácido distinto de Glutamina y el reemplazo de un fragmento de ADN de una parte de la región no de cápside de dicho parvovirus por un fragmento de a Dn homólogo de una parte de la región no de cápside procedente de un segundo parvovirus, en el que dicho fragmento de ADN homólogo de dicho segundo parvovirus lleva una mutación atenuante en la región no estructural de la posición 2061 a la 2070 de la SEQ ID NO: 1.

Tal intercambio de ADN se puede hacer usando técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida, intercambio de fragmentos de restricción y similares. Hay varias maneras de realizar la sustitución de isoleucina 219 una X1 o glutamina 386 una X2. Tales cambios se podrán introducir por síntesis química o PCR seguida de recombinación del fragmento nuevamente sintetizado con ADN vírico.

Ejemplos

Ejemplo 1:Producción del Clonde parvoviruscanino 630att

Materialesde partida

Virus

Cepas de E. coli

Las cepas de E. coli JC811 obtenidas a partir del centro de reserva genético de E. coli (EEUU) y cepa DL795 (Kramel Biotech UK) se seleccionaron para la propagación de plásmido de clones infecciosos completos.

Síntesis de ADN

La síntesis de ADN a medida se realizó por Eurofins MWG GmbH. El fragmento de ADN sintetizado se suministró en el plásmido de clonación pBluescript.

La construcción del clon 630att de parvovirus canino fue un proceso multietapas y está descrito en el presente documento en sus etapas separadas.

1) Construcción de un clon molecular infeccioso de NobivacParvo C (p154att)

El ADN vírico de forma replicativa (RF) se obtuvo a partir de células A72 infectadas con células infectadas por Nobivac Parvo C usando un método de preparación “Hirt” modificado (Parrish y col 1988, Virology 166, 293-307). El ADN vírico se digirió con un número de enzimas de restricción y el genoma se ensambló en pBluescript usando metodología de clonación rutinaria. El esquema de clonación está representado en la figura 1 a 4. El ADN de RF de CPV 154att primero se sometió a “relleno de extremo” usando la ADN polimerasa de T4. A continuación, se digirió el ADN con EcoRI y Spel. Estas enzimas cortaron una vez en las posiciones 1.099 y 3.459 respectivamente. La digestión dio como resultado tres fragmentos marcados A, B y C en orden de su tamaño. Los fragmentos se separaron por electroforesis en gel y, a continuación, el fragmento EcoRI/Spel (fragmento A) se clonó en el plásmido pBluescript que se había preparado por digestión con las mismas enzimas (véase la figura 1). El fragmento terminal EcoRI (fragmento C) del producto de digestión de ADN de RF, a continuación, se clonó en pBluescript digerido con EcoRI y EcoRV para producir pCPV C (véase la figura 2).

Los fragmentos de parvovirus canino A y C se subclonaron juntos dentro del mismo plásmido. Los plásmidos pCPV A y pCPV C se digirieron con Spel y EcoRI. El inserto de CPV se purificó del pCPV A y la porción de vector se tomó del pCPV C. A continuación, la ligación dio como resultado un plásmido en el que se “reunieron” los fragmentos A y C (véase la figura 3).

A continuación, se clonó el fragmento terminal Spel (fragmento B) del producto de digestión de ADN de RF de CPV dentro del pCPV AC. El plásmido pCPV AC se digirió con SpeI y una enzima Hincll que corta dejando un extremo romo. Los fragmentos se ligaron y clonaron. (véase la figura 4).

El plásmido resultante se llamó p154att.

La confirmación de que se había ensamblado un clone completo se consiguió mediante la transfección del ADN del plásmido a las células A72 dando como resultado la producción de virus infecciosos.

Se realizó el análisis de secuencia de ADN del clon del plásmido; se mostró que esta secuencia era idéntica a la determinada a partir del ADN vírico extraído de células infectadas, como se muestra más a continuación.

2) Construcción de 2/2cHíbridoD9

El ADN vírico se obtuvo a partir de tanto células infectadas por Nobivac parvo C como por separado de células infectadas por CPV2c “Jes”. Las preparaciones de ADN vírico se digirieron cada una con una única enzima de restricción para producir 2 fragmentos de ADN de cada una. Las digestiones enzimáticas se hicieron de tal manera que el fragmento a la izquierda del genoma de Nobivac y el fragmento a la derecha del genoma de “Jes” compartían >200 pb de secuencia solapante. Los fragmentos del extremo izquierdo de Nobivac y del extremo derecho de “Jes” se separaron, purificaron y mezclaron (Figura 7).

La transfección de las células A72 y CrFK con estos fragmentos solapantes permitió que el virus infeccioso se produjera por recombinación natural. Los virus resultantes se clonaron por dilución limitante y se llamaron 2/2c híbrido D9.

3) Construcción del Clon630.

El clon 630 se desarrolló a partir del clon de plásmido infeccioso p154att y ADN preparado a partir del 2/2c híbrido D9.

La enzima de restricción PacI corta el genoma de CPV en dos lugares alrededor de las posiciones 561 y 4.651; los extremos alejados derecho e izquierdo del genoma. Por lo tanto, el plásmido p154att se digirió con Pacl y el fragmento Pacl de alrededor 4 kpb que contenía más del 80 % del genoma se separó del vector y las secuencias terminales y se reemplazó con el obtenido a partir del ADN del 2/2c híbrido D9. El plásmido resultante se llamó p630. Esto está ilustrado en la Figura 5.

Como se predijo, la transfección de las células A72 o CrFK con p630 da como resultado la generación de virus infeccioso, este virus se llama 630.

El virus 2/2c híbrido D9 tipo 630 mantenía un bajo nivel de patogenicidad.

4) Construcción del Clon630att

El virus 630 mostró algunas señales clínicas de bajo nivel cuando se inyectó en perros.

Una parte del gen de la cápside se sintetizó químicamente incorporando cambios de aminoácidos observados en Nobivac parvo C pero no se encontró que se diera en cepas de campo. A continuación, este fragmento se sustituyó por la misma región en el plásmido p630 para crear el plásmido p630att; esto está ilustrado en la Figura 6.

Se sintetizó la secuencia de ADN correspondiente a la de entre las posiciones 3.356 y 4.029 en el genoma de CPV. La secuencia de ADN exacta, proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 2, se muestra a continuación

1 agatctqaqa cattqqqttt ttatccatgq aaaccaacca taccaactcc

atqqaqatat tattttcaat qqqataqaac attaqtacca tctcatactq

101 qaactaqtqq cacaccaaca aatatatacc atqqtacaqa tccaqatqat

qttcaatttt atactattqa aaattctqtq ccaqtacact tactaaqaac

201 aqqtqatqaa tttqctacaq qaacattttt ttttqattqt aaaccatqta

qactaacaca tacatqqcaa acaaataqaq cattqqqctt accaccattt

301 ctaaattctt tqcctcaaqc tqaaqqaqgt actaactttg gttatatagg

agttcaacaa gataaaagac gtggtgtaac tcaaatggga aatacaaact

401 atattactga agctactatt atgagaccag ctgaggttgg ttatagtgca

ccatattatt cttttgaggc gtctacacaa gggccattta aaacacctat

501 tgcagcagga cgggggggag cgcaaacaga tgaaaatcaa gcagcagatg

gtgatccaag atatgcattt ggtagacaac atggtaaaaa aactaccaca

601 acaggagaaa cacctgagag atttacatat atagcacatc aagatacagg

aagatatcca gaaggagatt gg

Los sitios de la enzima de restricción BgI II y Xcml están mostrados en negrita y subrayados.

La secuencia se liberó del plásmido en el que se proporcionó por digestión con BgI II y Xcml. Los fragmentos de ADN se separaron por electroforesis en gel de agarosa y el fragmento de 672 pb se aisló y se purificó.

La transfección de las células A72 o CrFK con p630att dio como resultado la generación de virus infeccioso (630att) que cuando se administra a cachorros no da señales clínicas.

En un estudio comparativo, se compararon una vacuna que comprendía el clon 630 y una vacuna que comprendía el clon 630att.

Se vacunaron subcutáneamente cinco perros MDA negativos 10⁸⁰ a 10⁸³ TCID⁵⁰ del clon 630 por 1 ml. Esto condujo a señales leves a moderadas en todos los perros. El cambio de peso durante el periodo de 5 días fue de -6 % en promedio en los 5 perros, de la siguiente manera a partir de la tabla de a continuación.

Se vacunaron subcutáneamente perros MDA negativos 10⁸⁰ a 10⁸³ TCID⁵⁰ del Clon 630att por 1 ml.

En este grupo, no se observaron síntomas clínicos, aumentos de temperatura, leucopaenia, diarrea o vómitos. Además, hubo una ganancia sustancial de peso en este grupo, de la siguiente manera a partir de la tabla de a continuación.

Por lo tanto, se concluyó que las vacunas basadas en el clon 630att verdaderamente se comportan atenuadas cuando se comparan con el clon 630, y tienen un excelente perfil de seguridad.

Ejemplo 2: generación de un virus recombinante que tiene una mutación atenuante fuera del gen de la cápside

La cepa 154att se obtuvo a partir de un Nobivac Parvo C comercialmente disponible (Intervet Schering-Plough Animal Health) y la cepa Jess era un aislado de campo de un virus tipo 2c.

Los virus se cultivaron en células de riñón caninas o felinas adherentes (por ejemplo, A72 y CrFK) usando medio M6B8 que contenía suero fetal bovino al 5 %. El ADN de forma replicativa (RF) se preparó a partir de cultivos de célula infectada usando una modificación del método “Hirt” estándar (McMaster y col. 1891).

El ADN de RF preparado a partir de la cepa 154att se digirió con la enzima de restricción Pstl y los fragmentos se separaron por electroforesis en gel de agarosa. La banda de 3.055 pares de bases (pb) (correspondiente al extremo a la izquierda del CPV) se escindió del gel y se purificó usando columnas de extracción en gel Qiagen Qiaquick. El ADN de RF aislado de las células infectadas por CPV Jess se digirió con la enzima de restricción Xmnl. De nuevo se separaron los fragmentos de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa seguido de una purificación de una banda de aproximadamente 2.750 pb (correspondiente al extremo a la derecha del CPV que incluye la secuencia de la cápside) usando columnas de extracción en gel Qiagen Qiaquick.

Los fragmentos de 3.055 pb y 2.750 pb purificados de 154att y Jess se combinaron y se sometieron a transfección dentro de células A72 y CrFK en cultivo. Las transfecciones se realizaron usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen) con aproximadamente 3 |jg de cada fragmento, siguiendo las instrucciones del fabricante.

Después de la transfección, las células se sometieron a subcultivo y a seguimiento mediante el ensayo de hemaglutinación (HA). El virus se detectó por HA en el subcultivo 4. La determinación de la secuencia de ADN de los virus híbridos se realizó usando los protocolos de secuenciación de ADN estándares que usan o bien modelos de fragmento de PCR o ADN de RF. El virus se purificó mediante dilución limitante en células caninas o felinas susceptibles adherentes.

Ejemplo3: Virus recombinante construido a partir delADNvíricoclonado

El virus recombinante se generó a partir de fragmentos clonados. El genoma de la cepa 154att de virus se clonó dentro del vector de clonación estándar pBluescript (Stratagene inc.). Para mantener las secuencias terminales palindrómicas intactas el plásmido se propagó en el hospedador bacteriano DL795 que es defectuoso en un número de sistemas de recombinación. La clonación de genomas de parvovirus se ha descrito en la bibliografía y las técnicas requeridas son conocidas por algunos expertos en la técnica. El clon de 154att obtenido (p154att) se digirió con la enzima de restricción Pac I de manera que no se permitió que la digestión llegara a finalización, es decir, la digestión de la enzima de restricción era solamente parcial. A continuación, los fragmentos digeridos se sometieron a digestión con la enzima de restricción Xmn I. A continuación, los fragmentos de ADN digeridos se separaron por electroforesis en gel de agarosa y el fragmento indicado en el diagrama de más adelante se escindió del gel y se purificó usando columnas de extracción en gel Qiagen Qiaquick. Los sitios Pac a la derecha y Xmn I flanquean la región de la cápside en el genoma de parvovirus.

El gen de la cápside de 154att se reemplazó por el gen de la cápside de una cepa virulenta de CPV como sigue. El sitio Xmn I y el Pac I a la derecha indicados en la figura 8 caen fuera de las fronteras del gen de la cápside. La secuencia de aproximadamente 110 pb entre el sitio Pac I y el extremo del gen de la cápside difiere significativamente entre la cepa 154att y los aislados virulentos. Hasta ahora no hay cambios de secuencia registrados en la secuencia corta (-55 pb) entre el sitio Xmn I y el comienzo del gen de la cápside. Por lo tanto, para limitar el intercambio de material justo a la secuencia de la cápside; se sintetizó químicamente la secuencia de la cápside de CPV virulenta y se mantuvo la secuencia específica a vacuna entre el sitio PacI y la señal de parada de la cápside.

A continuación, se muestra la secuencia químicamente sintetizada que contiene el gen de la cápside de CPV. La secuencia como se muestra a continuación se proporciona en el presente documento como SEQ ID NO: 3.

AGAGGCAGAC CTGAGAGC CATCTTTACTTCT GAACAAT TGGAAGAAGATTT TCGAGA

Xmn I CGACTTGGATTAAGGTACGATGGCACCTCCGGCAAAGAGAGCCAGGAGAGGTAAGGGTGT GTTAGTAAAGTGGGGGGAGAGGAAAGATTTAATAACTTAACTAAGTATGTGTTTTTTTAT AGGACTTGTGCCTCCAGGTTATAAATATCTTGGGCCTGGGAACAGTCTTGACCAAGGAGA ACCAACTAACCCTTCTGACGCCGCTGCAAAAGAACACGACGAAGCTTACGCTGCTTATCT TCGCTCTGGTAAAAACCCATACTTATATTTCTCGCCAGCAGATCAACGCTTTATAGATCA AACTAAGGACGCTAAAGATTGGGGGGGGAAAATAGGACATTATTTTTTTAGAGCTAAAAA GGCAATTGCTCCAGTATTAACTGATACACCAGATCATCCATCAACATCAAGACCAACAAA ACCAACTAAAAGAAGTAAACCACCACCTCATATTTTCATTAATCTTGCAAAAAAAAAAAA AGCCGGTGCAGGACAAGTAAAAAGAGACAATCTTGCACCAATGAGTGATGGAGCAGTTCA ACCAGACGGTGGTCAACCTGCTGTCAGAAATGAAAGAGCAACAGGATCTGGGAACGGGTC TGGAGGCGGGGGTGGTGGTGGTTCTGGGGGTGTGGGGATTTCTACGGGTACTTTCAATAA TCAGACGGAATTTAAATTTTTGGAAAACGGATGGGTGGAAATCACAGCAAACTCAAGCAG ACTTGTACATTTAAATATGCCAGAAAGTGAAAATTATAGAAGAGTGGTTGTAAATAATTT GGATAAAAC TGCAGT TAACGGAAACAT GGC TT TAGAT GATAC T CATGCACAAAT TGTAAC ACCTTGGTCATTGGTTGATGCAAATGCTTGGGGAGTTTGGTTTAATCCAGGAGATTGGCA ACTAATTGTTAATACTATGAGTGAGTTGCATTTAGTTAGTTTTGAACAAGAAATTTTTAA TGTTGTTTTAAAGACTGTTTCAGAATCTGCTACTCAGCCACCAACTAAAGTTTATAATAA TGATTTAACTGCATCATTGATGGTTGCATTAGATAGTAATAATACTATGCCATTTACTCC AGCAGCTATGAGATCTGAGACATTGGGTTTTTATCCATGGAAACCAACCATACCAACTCC ATGGAGATATTATTTTCAATGGGATAGAACATTAATACCATCTCATACTGGAACTAGTGG CACACCAACAAATATATACCATGGTACAGATCCAGATGATGTTCAATTTTATACTATTGA AAATTCTGTGCCAGTACACTTACTAAGAACAGGTGATGAATTTGCTACAGGAACATTTTT TTTTGATTGTAAACCATGTAGACTAACACATACATGGCAAACAAATAGAGCATTGGGCTT ACCACCATTTCTAAATTCTTTGCCTCAAGCTGAAGGAGGTACTAACTTTGGTTATATAGG AGTTCAACAAGATAAAAGACGTGGTGTAACTCAAATGGGAAATACAAACTATATTACTGA AGCTACTATTATGAGACCAGCTGAGGTTGGTTATAGTGCACCATATTATTCTTTTGAGGC GTCTACACAAGGGCCAT TTAAAACACCTAT TGCAGCAGGACGGGGGGGAGCGCAAACAGA TGAAAATCAAGCAGCAGATGGTGATCCAAGATATGCATTTGGTAGACAACATGGTCAAAA AACTACCACAACAGGAGAAACACCTGAGAGATTTACATATATAGCACATCAAGATACAGG

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Parvovirus canino (CPV) atenuado vivo recombinante, caracterizadoporque el genoma de dicho parvovirus comprende un gen de la cápside que codifica un aminoácido distinto de Isoleucina en la posición de aminoácido 219 de la proteína de la cápside VP2 y un aminoácido distinto de Glutamina en la posición de aminoácido 386 de la proteína de la cápside VP2, y en donde dicho genoma lleva una mutación atenuante en la región no estructural desde la posición 2061 a la 2070 de la SEQ ID NO: 1 y en donde dicha proteína de la cápside VP2 es distinta de la del serotipo 2 de CPV.

2. Parvovirus canino (CPV) atenuado vivo según la reivindicación 1, caracterizadoporque comprende un gen de la cápside que codifica una Valina en la posición de aminoácido 219 de la proteína de la cápside y/o una Lisina en la posición de aminoácido 386 de la proteína de la cápside.

3. Parvovirus canino (CPV) atenuado vivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizadoporque dicho parvovirus codifica una proteína de la cápside de los serotipos 2a, 2b o 2c de CPV.

4. Parvovirus canino (CPV) atenuado vivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizadoporque dicho parvovirus codifica una proteína de la cápside que tiene una Metionina o una Leucina en la posición de aminoácido 87, una Alanina o una Glicina en la posición de aminoácido 300, un Ácido aspártico o una Tirosina en la posición de aminoácido 305, un Ácido aspártico o un Ácido glutámico en la posición de aminoácido 426 y/o una Isoleucina o una Valina en la posición de aminoácido 555.

5. Parvovirus canino (CPV) atenuado vivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizadoporque dicho parvovirus codifica una proteína de la cápside que tiene al menos uno de los aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en una Leucina en la posición 87, una Glicina en la posición 300, una Tirosina en la posición 305, un Ácido glutámico en la posición 426 y una Isoleucina en la posición 555.

6. Vacuna para la protección de animales frente a infección con parvovirus, caracterizadaporque dicha vacuna comprende un parvovirus canino (CPV) atenuado vivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

7. Vacuna de combinación para la protección de animales frente a patógenos, caracterizadaporque dicha vacuna de combinación comprende una vacuna según la reivindicación 6 y un antígeno adicional de un virus o de un microorganismo patógeno a animales o información genética codificadora de una proteína inmunogénica de dichos virus o microorganismo.

8. Vacuna de combinación según la reivindicación 7, caracterizada porque dichos virus o microorganismo patógeno a animales se seleccionan entre el grupo que consiste en Ehrlichia canis, Babesia gibsoni, Babesia vogeli, Babesia rossi, complejo Leishmania donovani, adenovirus canino, coronavirus canino, virus del moquillo canino, Leptospira interrogans serovar canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona, Leptospira grippotyphosa, Leptospira bratislava, virus de la hepatitis canina, virus paragripal canino, virus de la rabia, Hepatozoon canis, Borrelia burgdorferi, Bordetella bronchiseptica, virus del herpes felino, calicivirus felino, panleucopenia felina y Chlamydophila felis.

9. Método para la fabricación de una vacuna según la reivindicación 6 o una vacuna de combinación según las reivindicaciones 7 u 8, caracterizadoporque dicho método comprende la mezcla de un parvovirus canino (CPV) atenuado vivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

10. Parvovirus canino (CPV) atenuado vivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso como medicamento.

11. Parvovirus canino (CPV) atenuado vivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso en el tratamiento de infección por parvovirus.

12. Método para la preparación de un mutante del parvovirus canino (CPV) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizadopor que el método comprende la etapa de alteración mediante técnicas de ADN recombinante de un codón en la posición de aminoácido 219 que codifica Isoleucina y un codón en la posición de aminoácido 386 que codifica Glutamina, en un codón en la posición de aminoácido 219 que codifica un aminoácido distinto de Isoleucina y/o un codón que codifica un aminoácido distinto de Glutamina en la posición de aminoácido 386 y reemplazo de un fragmento de ADN de una parte de la región no de la cápside de dicho parvovirus por un fragmento de a Dn homólogo de una parte de la región no de la cápside procedente de un segundo parvovirus, en donde dicho fragmento de ADN homólogo de dicho segundo parvovirus lleva una mutación atenuante en la región no estructural de la posición 2061 a la 2070 de la SEQ ID NO:1.

13. Método para la preparación de un mutante del parvovirus canino (CPV) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizadoporque el método comprende el intercambio de un fragmento de ADN codificador de al menos parte de la proteína de la cápside del parvovirus que tiene en la posición de aminoácido 219 un codón que codifica Isoleucina y que tiene en la posición de aminoácido 386 un codón que codifica Glutamina, por un fragmento de ADN codificador de la misma parte de la proteína de la cápside del parvovirus que tiene ahora en la posición de aminoácido 219 un codón que codifica un aminoácido distinto de Isoleucina y/o que tiene en la posición de aminoácido 386 un codón que codifica un aminoácido distinto de Glutamina y reemplazo de un fragmento de ADN de una parte de la región no de la cápside de dicho parvovirus por un fragmento de ADN homólogo de una parte de la región no de la cápside procedente de un segundo parvovirus, en el que dicho fragmento de ADN homólogo de dicho segundo parvovirus lleva una mutación atenuante en la región no estructural de la posición 2061 a la 2070 de la SEQ ID NO:1.