ES2773889T3

ES2773889T3 - Hidroxilasa en la posición 4 de ácido pipecolínico y método para producir 4-hidroxiaminoácido usando la misma

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Publication number: ES2773889T3
Application number: ES15742961T
Authority: ES
Inventors: Makoto Hibi; Jun Ogawa; Ryoma Miyake; Hiroshi Kawabata
Original assignee: API Corp
Current assignee: API Corp
Priority date: 2014-01-31
Filing date: 2015-01-27
Publication date: 2020-07-15
Anticipated expiration: 2035-01-27
Also published as: JP6959379B2; EP3101123A4; JPWO2015115398A1; JP6729963B2; WO2015115398A1; US20180282709A1; CN112538467A; US9969988B2; CN105940103B; EP3101123A1; JP2020108389A; CN105940103A; US11136560B2; US20160348081A1; EP3101123B1

Abstract

Uso de la proteína 4-hidroxilasa de ácido pipecólico que tiene una actividad para reaccionar con ácido Lpipecólico en presencia de ácido 2-oxoglutárico e iones de hierro (II), para producir ácido trans-4-hidroxi-Lpipecólico, en el que la proteína 4-hidroxilasa de ácido pipecólico se selecciona del grupo que consiste en los siguientes (A), (B) y (C): (A) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 16 ó 18; (B) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 16 ó 18 excepto que se delecionan, sustituyen y/o añaden de uno a 100 aminoácidos, y que tiene actividad de 4-hidroxilasa de ácido pipecólico; y (C) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que no es menos del 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 16 ó 18, y que tiene actividad de 4-hidroxilasa de ácido pipecólico.

Description

DESCRIPCIÓN

Hidroxilasa en la posición 4 de ácido pipecolínico y método para producir 4-hidroxiaminoácido usando la misma Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para producir 4-hidroxiaminoácido, método que utiliza una 4-hidroxilasa de ácido pipecólico novedosa.

Técnica anterior

Las hidroxilasas de aminoácidos son enzimas útiles para la producción de productos intermedios de productos farmacéuticos y similares, y se ha informado de la presencia de prolina 4-hidroxilasa (documento no de patente 1), L-isoleucina dioxigenasa (documento no de patente 2), y similares. En cuanto a enzimas que tienen la capacidad de hidroxilar el ácido pipecólico, se ha informado que varios tipos de prolina hidroxilasas tienen la capacidad de hidroxilar la posición 3 o la posición 5 del ácido L-pipecólico (documento no de patente 3). Sin embargo, hasta el momento no se ha informado que ninguna enzima hidroxile la posición 4 del ácido pipecólico.

Las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 y 12 son las mismas que los números de registro de GenBank. EGU81245, XP_001827566, XP_002558179, XP_383389, ELA34460 y XP_659994, respectivamente, que son las secuencias de aminoácidos traducidas a partir de secuencias de ADN que codifican para proteínas supuestas basándose en la información de la secuencia genómica de la cepa Fusarium oxysporum Fo5176, cepa Aspergillus oryzae RIB40, cepa Penicillium chrysogenum Wisconsin 54-1255, cepa Gibberella zeae (otro nombre, Fusanum graminearum) PH-1, cepa Colletotrichum gloeosporioides Nara gc5 y cepa Aspergillus nidulans (otro nombre, Emericella nidulans) FGSC A4, respectivamente. Dado que todas estas proteínas se derivan de hongos, las proteínas, si existen, es probable que estén en un estado en el que han experimentado glicosilación después de su expresión. Sin embargo, no hay ningún informe que apoye su existencia basándose en el aislamiento real o similar, y las funciones de estas proteínas han sido desconocidas en absoluto.

Los 4-hidroxiaminoácidos ópticamente activos son sustancias útiles como productos intermedios de productos farmacéuticos y similares. Por ejemplo, el ácido (4S)-hidroxi-L-pipecólico puede usarse como precursor de un inhibidor de Rho cinasa (documento de patente 1) y el ácido (4S)-hidroxi-D-pipecólico puede usarse como precursor de CGS-20281, que es un inhibidor del receptor NMDA (documento no de patente 4). La (4R)-hidroxi-L-prolina puede usarse como precursor de acetato de icatibant, que es un inhibidor del receptor de bradicinina B2 (documento no de patente 5) y (4R)-hidroxi-D-prolina puede usarse como precursor de un inhibidor del factor Xa (documento de patente 2). Puede usarse L-homoserina como precursor de Omapatrilat, que es un inhibidor de la ECA (documento de patente 3) y puede usarse 4-hidroxi-L-leucina como precursor de ^sCY-635, que es un inhibidor de ciclofilina (documento no de patente 6).

Los ejemplos de métodos notificados previamente para la síntesis de un 4-hidroxiaminoácido ópticamente activo incluyen un método en el que se produce ácido (4S)-hidroxi-L-pipecólico o ácido (4S)-hidroxi-D-pipecólico mediante ciclación estereoselectiva de 3-butenol con una C-aminocarbonil nitrona o C-alcoxicarbonil nitrona ópticamente selectiva se ha notificado hasta ahora (documento no de patente 7). También se han notificado un método en el que se sintetiza (4R)-hidroxi-L-prolina a partir de L-prolina usando prolina 4-hidroxilasa derivada de la cepa de Dactilosporangium RH1 (documento no de patente 1) y un método en el que se sintetiza (4R)-hidroxi-D-prolina por medio de un a,p-dideshidroaminoácido (documento no de patente 8). También se han notificado un método en el que se sintetiza L-homoserina mediante fermentación usando una E. coli recombinante (documento de patente 4) y un método en el que se sintetiza 4-hidroxi-L-leucina a partir de L-leucina usando L-isoleucina dioxigenasa derivada de la cepa de Bacillus thuringiensis 2e2 (documento no de patente 2).

Sin embargo, se han demandado métodos de síntesis más eficientes dado que estos métodos presentan problemas tales como materiales costosos, grandes números de etapas, pequeños números de los tipos de compuestos a los que son aplicables los métodos y altas cargas de purificación.

Documentos de la técnica anterior

[Documentos de patente]

Documento de patente 1: solicitud de patente japonesa PCT traducida abierta a consulta por el público 2010-514720 Documento de patente 2: solicitud de patente japonesa PCT traducida abierta a consulta por el público 2009-526813 Documento de patente 3: JP 7-48259 A

Documento de patente 4: WO 2013/134625

[Documentos no de patente]

Documento no de patente 1: Shibasaki et al., Appl. Environ. Microbiol., 1999, 65, 4028

Documento no de patente 2: Hibi et al., Appl. Environ. Microbiol., 2011, 77, 6926

Documento no de patente 3: Klein et al., Adv. Synth. Catal., 2011, 353, 1375

Documento no de patente 4: Occhiato et al., SYNTHESIS, 2009, 3611

Documento no de patente 5: Bork et al., Nat. Rev. Drug Discov., 2008, 7, 801

Documento no de patente 6: Hopkins et al., Antimicrobial. Agents Chemother., 2010, 54, 660

Documento no de patente 7: Cordero et al., Eur. J. Org. Chem., 2006, 3235

Documento no de patente 8: Kimura et al., Bull. Chem. Soc. Jpn., 2002, 75, 2517

Sumario de la invención

Problemas que van a resolverse mediante la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar una 4-hidroxilasa de ácido pipecólico novedosa, y un método novedoso para producir de manera económica y sencilla un 4-hidroxiaminoácido, especialmente un 4-hidroxiaminoácido ópticamente activo.

Medios para resolver los problemas

Con el fin de resolver los problemas descritos anteriormente, los presentes inventores estudiaron intensamente un método para producir un 4-hidroxiaminoácido ópticamente activo. Como resultado, los presentes inventores descubrieron que la proteína FOXB_08233 derivada de la cepa de Fusarium oxysporum Fo5176, cuyo aislamiento como proteína no se ha notificado y cuya función se ha desconocido, y sus proteínas homólogas, tienen una actividad de 4-hidroxilasa de ácido pipecólico dependiente de ácido 2-oxoglutárico. Los presentes inventores descubrieron entonces que, al preparar transformantes usando ADN que codifican para estas proteínas y haciendo reaccionar las células transformantes preparadas, los productos tratados de las mismas y/o los líquidos de cultivo de las mismas con diversos aminoácidos, pueden obtenerse diversos 4-hidroxiaminoácidos ópticamente activos a una alta pureza óptica. La presente invención se logró basándose en estos descubrimientos.

Es decir, la presente invención puede resumirse de la siguiente manera.

[1] Una proteína 4-hidroxilasa de ácido pipecólico que tiene actividad para reaccionar con ácido L-pipecólico en presencia de ácido 2-oxoglutárico e iones de hierro (II), para producir ácido trans-4-hidroxi-L-pipecólico.

[2] La proteína 4-hidroxilasa de ácido pipecólico según [1], seleccionada del grupo que consiste en los siguientes (A), (B) y (C):

(A) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 16 ó 18;

(B) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 16 ó 18 excepto que se delecionan, sustituyen y/o añaden uno o varios aminoácidos, y que tiene actividad de 4-hidroxilasa de ácido pipecólico; y

(C) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que no es menos del 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 16 ó 18, y que tiene actividad de 4-hidroxilasa de ácido pipecólico.

[3] La proteína 4-hidroxilasa de ácido pipecólico según [2], que se produce como proteína recombinante por un huésped que no tiene capacidad de glicosilación.

[4] Un método para producir 4-hidroxiaminoácido, comprendiendo el método hacer reaccionar la proteína 4-hidroxilasa de ácido pipecólico según uno cualquiera de [1] a [3], una(s) célula(s) que comprende(n) la proteína, un producto tratado de la(s) célula(s) y/o un líquido de cultivo obtenido cultivando la(s) célula(s), con a-aminoácido para producir 4-hidroxiaminoácido.5

[5] El método para producir 4-hidroxiaminoácido según [4], en el que el a-aminoácido se representa mediante la siguiente fórmula general (I):

(en la que cada uno de R¹, R², R³, R⁴y R⁵representa un átomo de hidrógeno o alquilo C¹-C³, y alternativamente R²puede unirse a R⁵o al átomo de nitrógeno del grupo amino para formar una estructura de anillo),

y el 4-hidroxiaminoácido se representa mediante la siguiente fórmula general (II):

(en la que cada uno de R¹, R², R³, R⁴y R⁵representa un átomo de hidrógeno o alquilo C¹-C³, y alternativamente R²puede unirse a R⁵o al átomo de nitrógeno del grupo amino para formar una estructura de anillo).

[6] El método para producir 4-hidroxiaminoácido según [4], en el que el a-aminoácido es ácido pipecólico y el 4-hidroxiaminoácido es ácido 4-hidroxi-L-pipecólico.

[7] El método para producir 4-hidroxiaminoácido según uno cualquiera de [4] a [6], en el que la célula que comprende 4-hidroxilasa de ácido pipecólico es una célula transformada con un ADN que codifica para proteína 4-hidroxilasa de ácido pipecólico.

[8] El método para producir 4-hidroxiaminoácido según [7], en el que el ADN que codifica para proteína 4-hidroxilasa de ácido pipecólico se selecciona del grupo que consiste en los siguientes (D), (E) y (F):

(D) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 15 ó 17;

(E) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 15 ó 17 excepto que se sustituyen, delecionan y/o añaden una o varias bases, y que codifica para un polipéptido que tiene actividad de 4-hidroxilasa de ácido pipecólico; y

(F) un ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la cadena complementaria de la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 15 ó 17 en condiciones rigurosas, y que codifica para un polipéptido que tiene actividad de 4-hidroxilasa de ácido pipecólico.

[9] Un microorganismo transformado con un ADN que codifica para una proteína 4-hidroxilasa de ácido pipecólico seleccionada del grupo que consiste en los siguientes (D), (E) y (F):

[10] El microorganismo según [9], que se selecciona del grupo que consiste en los géneros Escherichia, Bacillus, Pseudomonas y Corynebacterium.

Efecto de la invención

Según la presente invención, pueden producirse de manera eficiente diversos 4-hidroxiaminoácidos. En particular, pueden producirse de manera eficiente a altas purezas ópticas 4-hidroxiaminoácidos ópticamente activos tales como ácido (4S)-hidroxi-L-pipecólico y ácido (4S)-hidroxi-D-pipecólico, que son útiles como productos intermedios de productos farmacéuticos.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un diagrama que muestra el resultado de análisis de CL-EM de un líquido de reacción obtenido haciendo reaccionar L-prolina con E. coli transformada con pFoPA4H.

La figura 2 es un diagrama que muestra el resultado de análisis de CL-EM de un líquido de reacción obtenido haciendo reaccionar L-leucina con E. coli transformada con pFoPA4H.

La figura 3 es un diagrama que muestra el resultado de análisis de CL-EM de un líquido de reacción obtenido haciendo reaccionar ácido L-pipecólico con E. coli transformada con pFoPA4H.

La figura 4 es un diagrama que muestra el resultado de análisis de CL-EM de un líquido de reacción obtenido haciendo reaccionar D-prolina con E. coli transformada con pEnPA4H.

La figura 5 es un diagrama que muestra el resultado de análisis de CL-EM de un líquido de reacción obtenido haciendo reaccionar ácido (S)-2-aminobutírico con E. coli transformada con pEnPA4H.

La figura 6 es un diagrama que muestra el resultado de análisis de 1H-RMN de un producto de reacción obtenido haciendo reaccionar ácido L-pipecólico con E. coli transformada con pFoPA4H (imagen de medio tono).

La figura 7 es un diagrama que muestra el resultado de análisis de 13C-RMN de un producto de reacción obtenido haciendo reaccionar ácido L-pipecólico con E. coli transformada con pFoPA4H (imagen de medio tono).

La figura 8 es un diagrama que muestra el resultado de análisis de CL-EM de un líquido de reacción obtenido haciendo reaccionar ácido (5S)-hidroxi-L-pipecólico con un extracto libre de células obtenido de E. coli transformada con pEnPA4H.

La figura 9 es un diagrama que muestra el resultado de análisis de CL-EM de un líquido de reacción obtenido haciendo reaccionar (3R)-hidroxi-L-prolina con un extracto libre de células obtenido de E. coli transformada con pAoPA4H (superior) y con un extracto libre de células obtenido de E. coli transformada con pEnPA4H (inferior), respectivamente.

Realizaciones para llevar a cabo la invención

La presente invención se describe a continuación en detalle.

<4-Hidroxilasa de ácido pipecólico y método para producir 4-hidroxiaminoácido usando la misma>

La 4-hidroxilasa de ácido pipecólico de la presente invención comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 16 ó 18, o una secuencia homóloga de la misma que tiene actividad de 4-hidroxilasa de ácido pipecólico.

Las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10 y 12 se derivan de la cepa de Fusarium oxysporum c8D, cepa de Aspergillus oryzae RIB40, cepa de Penicillium chrysogenum Wisconsin 54-1255, cepa de Gibberella zeae (otro nombre, Fusarium graminearum) PH-1, cepa de Colletotrichum gloeosporioides Nara gc5 y cepa de Aspergillus nidulans (otro nombre, Emericella nidulans) FGSC A4, respectivamente. Estas son las secuencias de aminoácidos de proteínas identificadas como 4-hidroxilasa de ácido pipecólico en la presente invención. Las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:16 y 18 son secuencias obtenidas mediante análisis de ADN recogidos directamente de muestras de suelos en Japón, y son las secuencias de aminoácidos de proteínas identificadas como 4-hidroxilasa de ácido pipecólico en la presente invención. Aunque la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16 muestra una homología del 97% con una proteína que se deriva de Variovorax paradoxus EPS y cuya función se desconoce (n.° de registro de GenBank YP_004156498), no hay ningún informe que describa su función. Además, aunque la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18 muestra una homología del 50% con una proteína que se deriva de Burkholderia sp A1 y cuya función se desconoce (n.° de registro de GenBank WP_029951026), no hay ningún informe que describa su función.

Ninguna de estas secuencias puede asumirse fácilmente que sea una hidroxilasa para ácido pipecólico basándose sólo en su información de secuencia. La presente invención las identificó como 4-hidroxilasas de ácido pipecólico por primera vez.

Puede usarse una pluralidad de tipos de 4-hidroxilasas de ácido pipecólico.

En la presente descripción, la actividad de 4-hidroxilasa de ácido pipecólico significa una actividad que añade un grupo hidroxilo al átomo de carbono en la posición 4 del ácido L-pipecólico en presencia de ácido 2-oxoglutárico e iones de hierro (II), para producir ácido trans-4-hidroxi-L-pipecólico. Una actividad de este tipo puede confirmarse permitiendo que, como enzima, la proteína de interés, una(s) célula(s) que expresa(n) la proteína o un producto tratado de la misma, actúen en un sistema de reacción que contiene ácido L-pipecólico como sustrato y ácido 2 oxoglutárico e iones de hierro (II) como cofactores, y después midiendo la producción de ácido trans-4-hidroxi-L-pipecólico tal como se describe en los ejemplos descritos más adelante.

Los ejemplos del homólogo de la 4-hidroxilasa de ácido pipecólico que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 16 ó 18 en la presente invención incluyen aquellos que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 16 ó 18 excepto que se delecionan, sustituyen y/o añaden uno o varios aminoácidos, siempre que los homólogos tengan actividad de 4-hidroxilasa de ácido pipecólico. En este caso, el término “uno o varios aminoácidos” significa, por ejemplo, de 1 a 100, preferiblemente de 1 a 50, más preferiblemente de 1 a 20, todavía más preferiblemente de 1 a 10, especialmente preferible de 1 a 5 aminoácidos. El homólogo puede ser una proteína que tiene una secuencia que no es menos del 80%, preferiblemente no menos del 90%, más preferiblemente no menos del 95%, idéntica a la secuencia de aminoácidos de longitud completa de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16 ó 18 siempre que el homólogo mantenga actividad de 4-hidroxilasa de ácido pipecólico.

La 4-hidroxilasa de ácido pipecólico que puede usarse en la presente invención puede obtenerse mediante purificación de los microorganismos descritos anteriormente, o puede obtenerse clonando un ADN que codifica para la 4-hidroxilasa de ácido pipecólico mediante un método conocido tal como PCR o hibridación, y permitiendo la expresión de la 4-hidroxilasa de ácido pipecólico en un huésped apropiado.

Los ejemplos del ADN que codifica para 4-hidroxilasa de ácido pipecólico incluyen ADN que comprenden la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 15 ó 17.

El ADN que codifica para 4-hidroxilasa de ácido pipecólico también puede ser un homólogo de un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 15 ó 17 siempre que el ADN codifique para una proteína que tiene actividad de 4-hidroxilasa de ácido pipecólico. Los ejemplos de un homólogo de este tipo incluyen aquellos que comprenden la secuencia de nucleótidos de SEQ ID n O:1, 3, 5, 7, 9, 11, 15 ó 17 excepto que se sustituyen, delecionan y/o añaden uno o varios nucleótidos.

En este caso, el término “uno o varios nucleótidos” significa, por ejemplo, de 1 a 300, preferiblemente de 1 a 150, más preferiblemente de 1 a 60, todavía más preferiblemente de 1 a 30, especialmente preferible de 1 a 15 nucleótidos.

El homólogo de ADN puede ser un ADN que se hibrida con la cadena complementaria de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 15 ó 17 en condiciones rigurosas, siempre que el homólogo de ADN codifique para una proteína que tiene actividad de 4-hidroxilasa de ácido pipecólico. Los ejemplos de las “condiciones rigurosas” en el presente documento incluyen condiciones en las que el lavado se lleva a cabo en presencia de 0,1xSSC (solución salina-citrato de sodio) y SDS al 0,1% (dodecil sulfato de sodio) a 60°C.

Los expertos en la técnica pueden obtener un homólogo de ADN de este tipo introduciendo de manera apropiada una(s) mutación/mutaciones de sustitución, deleción, inserción y/o adición en el ADN de SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 15 ó 17 mediante mutagénesis dirigida al sitio (Nucleic Acids Res. 10, pág. 6487 (1982); Methods in Enzymol. 100, pág. 448 (1983); Molecular Cloning, PCR A Practical Approach IRL Press pág. 200 (1991)) o similares.

La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 16 ó 18 o una parte de la misma, o la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 15 ó 17 o una parte de la misma, puede someterse a búsqueda de homología frente a una base de datos proporcionada por, por ejemplo, el banco de datos de Japón (DNA Databank of JAPAN, DDBJ), para obtener información de aminoácidos para la actividad de 4-hidroxilasa de ácido pipecólico, o información de secuencia de nucleótidos de un ADN que lo codifica.

En el método para producir 4-hidroxiaminoácido de la presente invención, puede usarse directamente 4-hidroxilasa de ácido pipecólico en la reacción. Sin embargo, se prefiere usar células que contienen 4-hidroxilasa de ácido pipecólico, un producto tratado de las células o un líquido de cultivo obtenido cultivando las células.

Las células que contienen 4-hidroxilasa de ácido pipecólico pueden ser células de un microorganismo que tienen intrínsecamente 4-hidroxilasa de ácido pipecólico. Sin embargo, se prefiere usar células transformadas con un gen que codifica para 4-hidroxilasa de ácido pipecólico.

Los ejemplos del producto tratado de las células que contienen 4-hidroxilasa de ácido pipecólico incluyen productos celulares tratados tales como aquellos obtenidos mediante tratamiento con un disolvente orgánico tal como acetona, dimetilsulfóxido (DMSO) o tolueno, o con un tensioactivo, aquellos obtenidos mediante liofilización y aquellos obtenidos mediante destrucción física o enzimática; fracciones enzimáticas de las células obtenidas como producto en bruto o producto purificado; y productos preparados inmovilizándolos en un portador tal como gel de poliacrilamida y gel de carragenano.

Al insertar el ADN aislado de ese modo que codifica para 4-hidroxilasa de ácido pipecólico en un vector de expresión conocido de una manera que permite la expresión de la 4-hidroxilasa de ácido pipecólico, se proporciona un vector que expresa 4-hidroxilasa de ácido pipecólico. Al transformar células huésped con este vector de expresión, puede obtenerse un transformante al que se le introduce un ADN que codifica para 4-hidroxilasa de ácido pipecólico. El transformante también puede obtenerse incorporando un ADN que codifica para 4-hidroxilasa de ácido pipecólico en el ADN cromosómico de un huésped mediante un método tal como recombinación homóloga de una manera que permite la expresión de la 4-hidroxilasa de ácido pipecólico.

Los ejemplos específicos del método para preparar el transformante incluyen un método en el que un ADN que codifica para 4-hidroxilasa de ácido pipecólico se introduce en un vector plasmídico, vector de fago o vector de virus que puede estar presente de manera estable en una célula huésped tal como una célula de microorganismos, y el vector de expresión construido se introduce en la célula huésped, o el ADN está directamente en el genoma del huésped, seguido por permitir la transcripción y traducción de la información genética. En este procedimiento, un promotor adecuado se liga preferiblemente en el sentido de 5' del ADN, y, además, se liga preferiblemente un terminador en el sentido de 3' del ADN. Un promotor y un terminador de este tipo no están limitados siempre que sean un promotor y un terminador que se sabe que actúan en la célula usada como huésped. Por ejemplo, “Fundamental Microbiology 8: Genetic Engineering, KYORITSU SHUPPAN CO., LTD.” describe detalles de vectores, promotores y terminadores que pueden usarse en microorganismos huésped.

El microorganismo huésped que va a transformarse para la expresión de 4-hidroxilasa de ácido pipecólico no está limitado siempre que el huésped en sí no afecte de manera negativa a la reacción de a-aminoácido, y los ejemplos específicos de los microorganismos huésped incluyen los siguientes microorganismos:

Bacterias que pertenecen a los géneros Escherichia, Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Brevibacterium, Corynebacterium, Streptococcus, Lactobacillus, y similares cuyos sistemas de vectores de huésped se han establecido.

Actinomicetos que pertenecen a los géneros Rhodococcus, Streptomyces, y similares cuyos sistemas de vectores de huésped se han establecido.

Levaduras que pertenecen a los géneros Saccharomyces, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Yarrowia, Trichosporon, Rhodosporidium, Hansenula, Pichia, Candida, y similares cuyos sistemas de vectores de huésped se han establecido.

Hongos que pertenecen a los géneros Neurospora, Aspergillus, Cephalosporium, Trichoderma, y similares cuyos sistemas de vectores de huésped se han establecido.

El procedimiento para la construcción del transformante, el método para la construcción de un vector recombinante adecuado para el huésped y el método para cultivar el huésped pueden llevarse a cabo según técnicas usadas comúnmente en los campos de biología molecular, ingeniería biológica e ingeniería genética (por ejemplo, métodos descritos en Molecular Cloning).

Lo siguiente son ejemplos específicos de microorganismos huésped preferidos, y métodos de transformación, vectores, promotores, terminadores, y similares preferidos para los microorganismos. La presente invención no se limita a estos ejemplos.

Para el género Escherichia, especialmente Escherichia coli, los ejemplos del vector plasmídico incluyen plásmidos pBR y pUC, y los ejemplos del promotor incluyen promotores derivados de lac (P-galactosidasa), trp (operón de triptófano), tac, trc (fusión de lac y trp) y fago X PL y PR. Los ejemplos del terminador incluyen terminadores derivados de trpA, fagos y ARN ribosómico rrnB.

Para el género Bacillus, los ejemplos del vector incluyen plásmidos pUB110 y plásmidos pC194. La integración en el cromosoma también es posible. Los ejemplos del promotor y el terminador incluyen aquellos de genes de enzimas tales como proteasa alcalina, proteasa neutra y a-amilasa.

Para el género Pseudomonas, los ejemplos del vector incluyen sistemas de vectores de huésped comunes establecidos en Pseudomonas putida, Pseudomonas cepacia, y similares; y un vector de amplia variedad de huéspedes (que contiene genes requeridos para replicación autónoma derivados de RSF1010 y similares) pKT240, que se basa en un plásmido implicado en la degradación de compuestos de tolueno, plásmido TOL (Gene, 26, 273 82 (1983)).

Para el género Brevibacterium, especialmente Brevibacterium lactofermentum, los ejemplos del vector incluyen vectores plasmídicos tales como pAJ43 (Gene 39, 281 (1985)). Los ejemplos del promotor y el terminador incluyen promotores y terminadores usados en E. coli.

Para el género Corynebacterium, especialmente Corynebacterium glutamicum, los ejemplos del vector incluyen vectores plasmídicos tales como pCS11 (JP 57-183799 A) ypCB101 (Mol. Gen. Genet. 196, 175 (1984)).

Para el género Saccharomyces, especialmente Saccharomyces cerevisiae, los ejemplos del vector incluyen plásmidos YRp, YEp, YCp y YIp. Los ejemplos de promotores y terminadores que pueden usarse incluyen aquellos de los genes de enzimas tales como alcohol deshidrogenasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, fosfatasa ácida, P-galactosidasa, fosfoglicerato cinasa y enolasa.

Para el género Schizosaccharomyces, los ejemplos del vector incluyen el vector plasmídico derivado de Schizosaccharomyces pombe descrito en Mol. Cell. Biol. 6, 80 (1986). En particular, pAUR224 está disponible comercialmente de Takara Shuzo Co., Ltd., y puede usarse fácilmente.

En cuanto al género Aspergillus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, y similares son las especies mejor estudiadas entre hongos. Los plásmidos y la integración en el cromosoma son aplicables a estas especies, y pueden usarse promotores derivados de proteasa y amilasa extracelulares (Trends in Biotechnology 7, 283-287 (1989)).

Entre los microorganismos descritos anteriormente, los ejemplos de microorganismos especialmente preferidos incluyen microorganismos que pertenecen a los géneros Escherichia, Bacillus, Pseudomonas y Corynebacterium que no tienen capacidad de glicosilación.

También se han establecido sistemas de huésped-vector distintos de los sistemas descritos anteriormente para diversos microorganismos, y esos sistemas pueden usarse según sea apropiado.

Se han establecido diversos sistemas de huésped-vector para plantas y animales además de microorganismos. En particular, sistemas para permitir la expresión de una gran cantidad de proteína foránea en un animal tal como un insecto incluyendo el gusano de seda (Nature 315, 592-594 (1985)), o en una planta tal como colza, maíz o patata; y se han establecido sistemas que usan sistemas de síntesis de proteínas libres de células tales como extractos libres de células de E. coli y gérmenes de trigo; y pueden usarse preferiblemente.

Al hacer reaccionar 4-hidroxilasa de ácido pipecólico, células que contienen la enzima, un producto tratado de las células o un líquido de cultivo de las células, con el sustrato de reacción a-aminoácido en presencia de ácido 2-oxoglutárico e iones de hierro (II), se produce 4-hidroxiaminoácido.

En este caso, el a-aminoácido como sustrato de reacción no está limitado siempre que tenga un átomo de hidrógeno que pueda sustituirse con un grupo hidroxilo en la posición 4. Los ejemplos del a-aminoácido incluyen compuestos representados por la siguiente fórmula general (I). Los ejemplos del 4-hidroxiaminoácido incluyen compuestos representados por la siguiente fórmula general (II). Cada uno del a-aminoácido y el 4-hidroxiaminoácido es preferiblemente un isómero L o un isómero D, pero también puede ser una mezcla racémica.

En las fórmulas generales (I) y (II), cada uno de R1, R2 y R5 representa un átomo de hidrógeno o alquilo C¹-C³, y cada uno de R3 y R4 representa un átomo de hidrógeno, alquilo C¹-C³o hidroxilo. Alternativamente, R2 puede unirse a R5 o al átomo de nitrógeno del grupo amino para formar una estructura de anillo.

Los ejemplos específicos del tipo del a-aminoácido incluyen valina, leucina, isoleucina, prolina (en la que R2 se une al átomo de nitrógeno del grupo amino para formar un anillo de cinco miembros), ácido a-aminobutírico, norvalina, norleucina, ácido pipecólico (en el que R2 se une a R5 para formar un anillo de seis miembros), 3-hidroxiprolina, ácido 3-hidroxipipecólico y ácido 5-hidroxipipecólico. El a-aminoácido es especialmente preferible ácido pipecólico.

La reacción se lleva a cabo en un medio acuoso que contiene: el a-aminoácido; ácido 2-oxoglutárico; iones de hierro (II); y la 4-hidroxilasa de ácido pipecólico o las células que la contienen, el producto tratado de las células o el producto de cultivo de las células; o se lleva a cabo en una mezcla del medio acuoso y un disolvente orgánico.

Los ejemplos del medio acuoso incluyen agua y tampones. En este caso, los tampones no están limitados siempre que la actividad de la 4-hidroxilasa de ácido pipecólico no se inhiba de ese modo. Los ejemplos de los tampones incluyen tampón fosfato y tampón MES (ácido 2-morfolinoetanosulfónico). Los ejemplos del disolvente orgánico incluyen aquellos en los que el sustrato de reacción es altamente soluble, tales como metanol, etanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, terc-butanol, acetona y dimetilsulfóxido. Otros ejemplos del disolvente orgánico incluyen acetato de etilo, acetato de butilo, tolueno, cloroformo y n-hexano, que son eficaces para la retirada de subproductos de reacción, y similares.

El sustrato de reacción, a-aminoácido, se usa habitualmente a una concentración de sustrato dentro del intervalo del 0,01% p/v al 90% p/v, preferiblemente del 0,1% p/v al 30% p/v. El sustrato de reacción puede añadirse de una vez cuando se inicia la reacción, pero se añade preferiblemente de manera continua o intermitente desde el punto de vista de reducir la influencia de la inhibición de sustrato de la enzima, si la hubiera, y aumentar la concentración del producto acumulado.

El número de moles del ácido 2-oxoglutárico requerido para la reacción es normalmente equivalente a, o mayor que, el del sustrato, preferiblemente equivalente a, o hasta 1,2 veces mayor que, el del sustrato. El ácido 2-oxoglutárico puede añadirse de una vez cuando se inicia la reacción, pero se añade preferiblemente de manera continua o intermitente desde el punto de vista de reducir la acción inhibidora en la enzima, si la hubiera, y aumentar la concentración del producto acumulado. Alternativamente, puede añadirse un compuesto económico que puede metabolizarse por el huésped, tal como glucosa o ácido L-glutámico, en lugar de ácido 2-oxoglutárico, para permitir el metabolismo del compuesto por el huésped, y puede usarse ácido 2-oxoglutárico producido durante este procedimiento para la reacción.

Los iones de hierro (II) requeridos para la reacción se usan dentro del intervalo de habitualmente 0,01 mmol/l a 100 mmol/l, preferiblemente de 0,1 mmol/l a 10 mmol/l. Los iones de hierro (II) se añaden habitualmente de una vez cuando se inicia la reacción. La adición adicional de iones de hierro (II) también es eficaz en casos en los que los iones de hierro (II) disminuyen durante la reacción debido a la oxidación a iones de hierro (III) o la formación de un precipitado. En casos en los que una cantidad suficiente de iones de hierro (II) ya están contenidos en la 4-hidroxilasa de ácido pipecólico, las células que contienen la enzima, el producto tratado de las células o el líquido de cultivo de las células, no se requiere la adición de iones de hierro (II).

La reacción se lleva a cabo a una temperatura de reacción de habitualmente 4°C a 60°C, preferiblemente de 10°C a 45°C, a un pH de habitualmente 3 a 11, preferiblemente de 5 a 8. El tiempo de reacción es habitualmente de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 72 horas.

La cantidad de las células y/o el producto celular tratado que van a añadirse al líquido de reacción es de la siguiente manera. En casos de adición de las células, las células se añaden al líquido de reacción de modo que la concentración celular es habitualmente de aproximadamente el 0,1% p/v a aproximadamente el 50% p/v, preferiblemente del 1% p/v al 20% p/v, en cuanto al peso celular húmedo. En los casos de usar el producto celular tratado, se determina la actividad específica de la enzima en el producto celular tratado, y se añade el producto celular tratado de modo que se logra la concentración celular descrita anteriormente.

Después de la finalización de la reacción, el 4-hidroxiaminoácido producido por el método de la presente invención puede someterse a separación de células microbianas, proteínas y/o similares en el líquido de reacción mediante centrifugación, tratamiento de membrana y/o similar, y luego a purificación mediante una combinación apropiada de, por ejemplo, extracción con un disolvente orgánico tal como 1-butanol o ferc-butanol, destilación, cromatografía en columna usando una resina de intercambio iónico, gel de sílice, o similar, cristalización en el punto isoeléctrico, y/o cristalización con monoclorhidrato, diclorhidrato, sal de calcio, o similar.

Ejemplos

La presente invención se describe a continuación en más detalle por medio de ejemplos, pero la presente invención no se limita a los ejemplos.

Ejemplo 1

<Construcción de plásmido que expresa el gen de 4-hidroxilasa de ácido pipecólico>

(1) Clonación de genes

Basándose en una secuencia génica que codifica para una proteína hipotética FOXB_08233 derivada de Fusarium oxysporum Fo5176, se diseñaron y sintetizaron cebadores BOF1 y BOR1 para amplificación de genes homólogos de longitud completa para la proteína hipotética FOXB_08233. Las secuencias de nucleótidos de los cebadores se muestran en SEQ ID NO:13 y 14.

Se cultivó Fusarium oxysporum c8D durante la noche en un medio líquido de dextrosa de patata (fabricado por Becton, Dickinson and Company, Japón). A partir de las células microbianas obtenidas, se preparó ADN cromosómico usando un kit DNeasy Blood & Tissue (fabricado por QIAGEN).

Usando ADN cromosómico preparado de ese modo derivado de cada cepa microbiana como molde, y los oligonucleótidos de SEQ ID NO:13 y 14 como cebadores, se llevó a cabo reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar un fragmento de ADN de aproximadamente 1 kpb. Se llevó a cabo la PCR usando ADN polimerasa Tks Gflex (fabricada por Takara Bio Inc.) según las condiciones descritas en la instrucción del fabricante. El programa de temperatura fue de la siguiente manera: se mantuvo la temperatura a 95°C durante 1 minuto, y luego se llevaron a cabo 35 ciclos de (98°C, 10 segundos; 56,5°C, 15 segundos; y 68°C, 40 segundos), seguido por mantener la temperatura a 72°C durante 3 minutos para completar la reacción. El resultado del análisis de la secuencia de ADN obtenida se muestra en SEQ ID NO:1, y la secuencia de aminoácidos codificada por esta secuencia de ADN se muestra en SEQ ID NO:2.

(2) Preparación del plásmido de expresión

Se digirió el fragmento de ADN obtenido en (1) con las enzimas de restricción SamHI y HindIII, y se introdujo en un vector plasmídico pQE80L (fabricado por QIAGEN) digerido con las enzimas de restricción SamHI y HindIII, usando un kit de conveniencia de ligamiento (fabricado por Nippon Gene Co., Ltd ). El plásmido obtenido se denomina a continuación en el presente documento pFoPA4H. Además, las secuencias de ADN de SEQ ID NO:3, 5, 7, 9 y 11 se sintetizaron mediante DNA2.0, Inc., y se insertaron en un plásmido de expresión pJexpress411 por el mismo fabricante. Los plásmidos obtenidos se denominan a continuación en el presente documento pAoPA4H, pPcPA4H, pGzPA4H, pCgPA4H y pEnPA4H.

Ejemplo 2

<Evaluación de la actividad de 4-hidroxilasa de ácido pipecólico>

Los seis tipos de plásmidos obtenidos en el ejemplo 1, pFoPA4H, pAoPA4H, pPcPA4H, pGzPA4H, pCgPA4H y pEnPA4H, se usaron para la transformación de E. coli (Escherichia coli) Rosetta 2 (DE3) (fabricada por Merck Millipore Corporation) según un método común. Se cultivó cada E. coli recombinante obtenida con agitación a 30°C usando medio LB líquido complementado con kanamicina 50 mg/l, cloranfenicol 15 mg/l e IPTG 1 mmol/l (isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido) durante 20 horas, y se recogieron las células bacterianas cultivadas.

Las células bacterianas obtenidas se sometieron a reacción a 20°C a pH 6 durante 21 horas en tampón MES 50 mmol/l (ácido 2-morfolinoetanosulfónico) complementado con ácido 2-oxoglutárico 15 mmol/l, ácido ascórbico 5 mmol/l, clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina 5 mmol/l, FeSO4'7H2O 0,5 mmol/l, ácido cítrico 3 mmol/l y 10 mmol/l de cada compuesto de sustrato.

Se analizaron los líquidos de reacción después de la reacción mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) en las siguientes condiciones.

Columna: CHIRALPAK AD-3 (4,6 x 250 mm, fabricada por Daicel Corporation)

Eluyente: hexano : etanol: ácido trifluoroacético = 95 : 5 : 0,1

Velocidad de flujo: 0,8 ml/min.

Temperatura: 30°C

Detección: UV 210 nm

Ejemplo 3

identificación de productos de reacción>

Cada líquido de reacción obtenido en el ejemplo 2 se derivatizó usando el método AccQTag de Waters, y se sometió a análisis de separación usando un cromatógrafo de líquidos de alto rendimiento-espectrómetro de masas (CL-EM) en las siguientes condiciones para medir productos de reacción de aminoácidos.

Columna: XBridge C185 |im (2,1 x 150 mm, fabricada por Waters Corporation)

Eluyente A: acetato de amonio (10 mmol/l, pH 5)

Eluyente B: metanol (de 0 a 0,5 min. (0% ^ 1%), de 0,5 a 18 min. (1% ^ 5%), de 18 a 19 min. (5% ^ 9%), de 19 a 29,5 min. (9% ^ 17%), de 29,5 a 40 min. (17% ^ 60%), de 40 a 43 min. (60%))

Velocidad de flujo: 0,3 ml/min.

Temperatura: 30°C

Detección: espectrómetro de masas

Para los líquidos de reacción obtenidos usando los seis tipos de E. coli, se muestran aminoácidos de sustrato para los que se encontró la aparición de un nuevo pico en el análisis de CL-EM en la tabla 1. Dado que se encontró que los pesos moleculares de estos nuevos productos de reacción eran 16 veces mayores en comparación con los pesos moleculares de sus sustratos, se piensa que todos los nuevos productos de reacción son compuestos producidos por la adición de un átomo de oxígeno a sus sustratos.

Tabla 1

(1) El resultado del análisis de CL-EM del líquido de reacción que contenía E. coli transformada con pFoPA4H y L-prolina se muestra en la figura 1. Dado que el pico del producto de reacción mostró el mismo tiempo de retención que el de una sustancia patrón para trans-4-hidroxi-L-prolina, se asumió que el producto de reacción era trans-4-hidroxi-L-prolina. Se obtuvo el mismo resultado en los casos en los que se usó E. coli transformada con pAoPA4H o pEnPA4H.

(2) El resultado del análisis de CL-EM del líquido de reacción que contenía E. coli transformada con pFoPA4H y L-leucina se muestra en la figura 2. Dado que el pico del producto de reacción mostró el mismo tiempo de retención que el de una sustancia patrón para 4-hidroxi-L-leucina, se asumió que el producto de reacción era trans-4-hidroxi-L-leucina. Se obtuvo el mismo resultado en los casos en los que se usó E. coli transformada con pAoPA4H, pPcPA4H, pGzPA4H, pCgPA4H o pEnPA4H.

(3) Se recogió un producto de reacción obtenido haciendo reaccionar ácido L-pipecólico con E. coli transformada con pFoPA4H mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) en las siguientes condiciones.

Columna: TSKgel Amide80 (7,8 x 300 mm, fabricada por Tosoh Corporation)

Eluyente: acetato de amonio (10 mmol/l, pH 5) : acetonitrilo = 15 : 85

Velocidad de flujo: 2,3 ml/min.

Temperatura: 40°C

Detección: UV 210 nm

Se recogió el eluato que contenía el producto de reacción, y se secó a presión reducida usando un evaporador centrífugo. Se suspendió el residuo resultante en agua pesada, y se sometió a medición del espectro de resonancia magnética.

Basándose en los valores de desplazamiento químico obtenidos como resultado de 1H-RMN (figura 6) y 13C-RMN (figura 7), la correlación obtenida como resultado de los análisis de HH-COSY y CH-HMQC, e información de una bibliografía (Molnar, T. et al., 2008, Bioorg. Med. Chem. Lett., 18, 6290), se identificó el producto de reacción como ácido trans-4-hidroxi-L-pipecólico.

El resultado del análisis de CL-EM del líquido de reacción que contenía E. coli transformada con pFoPA4H y ácido L-pipecólico se muestra en la figura 3. La elución del pico del producto de reacción, ácido trans-4-hidroxi-L-pipecólico, se produjo a los 10,9 minutos. Se obtuvo el mismo resultado en los casos en los que se usó E. coli transformada con pAoPA4H, pPcPA4H, pGzPA4H, pCgPA4H o pEnPA4H.

(4) El resultado del análisis de CL-EM del líquido de reacción que contenía E. coli transformada con pEnPA4H y D-prolina se muestra en la figura 4. Dado que el pico del producto de reacción mostró el mismo tiempo de retención que el de una sustancia patrón para cis-4-hidroxi-D-prolina, se asumió que el producto de reacción era cis-4-hidroxi-D-prolina.

(5) El resultado del análisis de CL-EM del líquido de reacción que contenía E. coli transformada con pEnPA4H y ácido (S)-2-aminobutírico se muestra en la figura 5. Dado que el pico del producto de reacción mostró el mismo tiempo de retención que el de una sustancia patrón para L-homoserina, se asumió que el producto de reacción era L-homoserina.

Ejemplo 4

<Evaluación de la actividad de 4-hidroxilasa de ácido pipecólico para hidroxilación a hidroxiaminoácido>

Usando extractos libres de células obtenidos de las células obtenidas en el ejemplo 2, se llevó a cabo la reacción a 20°C a pH 6 durante 21 horas en tampón MES 50 mmol/l complementado con ácido 2-oxoglutárico 15 mmol/l, ácido ascórbico 5 mmol/l, clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina 5 mmol/l, FeSO4'7H2O 0,5 mmol/l, ácido cítrico 3 mmol/l y 10 mmol/l de cada compuesto de sustrato. Se analizaron los líquidos de reacción después de la reacción mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) en las condiciones descritas en el ejemplo 2.

Para líquidos de reacción que usan dos tipos de extractos libres de células, se muestran hidroxiaminoácidos de sustrato para los que se encontró la aparición de un nuevo pico en el análisis de CL-EM en la tabla 2. Dado que se encontró que los pesos moleculares de estos nuevos productos de reacción eran 16 veces mayores en comparación con los pesos moleculares de sus sustratos, se cree que todos los nuevos productos de reacción son dihidroxiaminoácidos producidos por la adición de un átomo de oxígeno a hidroxiaminoácidos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Uso de la proteína 4-hidroxilasa de ácido pipecólico que tiene una actividad para reaccionar con ácido L-pipecólico en presencia de ácido 2-oxoglutárico e iones de hierro (II), para producir ácido trans-4-hidroxi-L-pipecólico, en el que la proteína 4-hidroxilasa de ácido pipecólico se selecciona del grupo que consiste en

los siguientes (A), (B) y (C):

(A) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10,

12, 16 ó 18;

(B) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10,

12, 16 ó 18 excepto que se delecionan, sustituyen y/o añaden de uno a 100 aminoácidos, y que tiene

actividad de 4-hidroxilasa de ácido pipecólico; y

(C) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que no es menos del 80% idéntica a la

secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 16 ó 18, y que tiene actividad de

4-hidroxilasa de ácido pipecólico.

2. Uso de la proteína 4-hidroxilasa de ácido pipecólico según la reivindicación 1, proteína que se produce

como proteína recombinante por un huésped que no tiene capacidad de glicosilación.

3. Método para producir 4-hidroxiaminoácido, comprendiendo dicho método hacer reaccionar dicha proteína 4-hidroxilasa de ácido pipecólico como se define en la reivindicación 1 ó 2, una(s) célula(s) que comprende(n)

dicha proteína, un producto tratado de dicha(s) célula(s) y/o un líquido de cultivo obtenido cultivando

dicha(s) célula(s), comprendiendo dichos producto tratado y líquido de cultivo dicha proteína, con aaminoácido para producir 4-hidroxiaminoácido, en el que dicho a-aminoácido se representa mediante la

siguiente fórmula general (I):

en la que cada uno de R1, R2 y R5 representa un átomo de hidrógeno o alquilo C¹-C³; cada uno de R3 y R4

representa un átomo de hidrógeno, alquilo C¹-C³o hidroxilo; y alternativamente R2 puede unirse a R5 o al

átomo de nitrógeno del grupo amino para formar una estructura de anillo, y dicho 4-hidroxiaminoácido se

representa mediante la siguiente fórmula general (II):

átomo de nitrógeno del grupo amino para formar una estructura de anillo.

4. Método para producir 4-hidroxiaminoácido según la reivindicación 3, en el que dicho a-aminoácido es ácido

pipecólico, y dicho 4-hidroxiaminoácido es ácido 4-hidroxi-L-pipecólico.

5. Método para producir 4-hidroxiaminoácido según la reivindicación 3 ó 4, en el que dicha célula que

comprende 4-hidroxilasa de ácido pipecólico es una célula transformada con un ADN que codifica para

proteína 4-hidroxilasa de ácido pipecólico.

6. Método para producir 4-hidroxiaminoácido según la reivindicación 5, en el que dicho ADN que codifica para

proteína 4-hidroxilasa de ácido pipecólico se selecciona del grupo que consiste en los siguientes (D), (E) y

(F):

un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 1 (E) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 15 ó 17 excepto que se sustituyen, delecionan y/o añaden de uno a 300 nucleótidos, y que codifica para un polipéptido que tiene actividad de 4-hidroxilasa de ácido pipecólico; y

(F) un ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la cadena complementaria de la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 15 ó 17 en condiciones rigurosas, donde el lavado se lleva a cabo en presencia de 0,1x SSC y SDS al 0,1% a 60°C, y que codifica para un polipéptido que tiene actividad de 4-hidroxilasa de ácido pipecólico.

Microorganismo transformado con un vector de expresión que comprende un ADN que codifica para y que expresa una proteína 4-hidroxilasa de ácido pipecólico seleccionada del grupo que consiste en los siguientes (D), (E) y (F):

(E) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 15 ó 17 excepto que se sustituyen, delecionan y/o añaden de uno a 300 nucleótidos, y que codifica para un polipéptido que tiene actividad de 4-hidroxilasa de ácido pipecólico; y

Microorganismo según la reivindicación 7, que se selecciona del grupo que consiste en los géneros Escherichia, Bacillus, Pseudomonas y Corynebacterium.

Proteína 4-hidroxilasa de ácido pipecólico que tiene una actividad para reaccionar con ácido L-pipecólico en presencia de ácido 2-oxoglutárico e iones de hierro (II), para producir ácido trans-4-hidroxi-L-pipecólico, en la que la proteína 4-hidroxilasa de ácido pipecólico se selecciona del grupo que consiste en los siguientes (A), (B) y (C):

(A) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 18;

(B) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 18 excepto que se delecionan, sustituyen y/o añaden de uno a 100 aminoácidos, y que tiene actividad de 4-hidroxilasa de ácido pipecólico; y

(C) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que no es menos del 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 18, y que tiene actividad de 4-hidroxilasa de ácido pipecólico.